JPH03501524A - ヒト免疫不全症ウイルスの検定 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 α９　ＨＩＶのエンベロープタンパク質と反応性であるモノクローナル抗体。

ｃｌｏ　細胞が保温段階後に固定される請求項１記載の方法。

顛　メタノールおよびホルムアルデヒドからなる群から選択される化合物で細胞 が固定される請求項１６記載の方法。

ｆｉｌ＝ＨＩＶに感染され得る細胞を皿に播種し、該皿に試料からの細胞を播種 し、 前記細胞を保温し、 前記細胞をＨＩＶタンパク質と反応性である一次抗体に暴露し、 前記保温された細胞を前記−次抗体と反応性であるマーカー複合抗体に暴露し、 前記細胞のマークされたフォーカスを数え、そして試料細胞がＨＩＶに感染され たかどうかを示すマーカー陽性細胞の存在を決定する、 ことからなる細胞がＨＩＶに感染されたかどうかを決定するための方法。

α傷　請求項１８記載の方法において、体液からの試料細胞を使用することから なるＨＩＶに対して体液を検定する方法。

翰　前記体液が血液、精液および尿からなる群から選択される請求項１９記載の 方法。

明　細　書 ヒト免疫不全症ウィルスの検定 本発明は、エイズ（ＡＩＤＳ）診断方法および抗エイズ剤治療をモニターする方 法に関し、そしてより詳しくはヒト免疫不全症ウィルスを検定する方法に関する 。

本発明の背景 エイズは比較的最近認識された疾患である。今日まで数千の症例が報告され、そ してこの疾患は、その伝染病の速い拡張と該疾患の高い死亡率のために多くの関 心を引き出した。多数の性交相手を有する男性同性愛者、違法な静脈注射薬物の 使用者、血友病者、輸血を受けた人々および上記の危険率の高いグループに属す る人々と親密な性交渉をもった人々の間の圧倒的な流行は、この疾患が感染性の ものの伝染により広がることを強く示唆する。ヒトの体内における大患の第一の 標的はＴ細胞の特定の亜集団である。エイズ患者の厳しい免疫不全症はリンパ球 集団におけるヘルパーＴ細胞（Ｔ４細胞）の異常に低い比率から生じ、このよう にしてその中にＢ細胞による抗体の産生がある多くのＴ４ヘルパー機能の利用可 能性を減少させる。

レトロウィルス感染が動物系において弱められた免疫機能を導くことは知られて いる。これらの非動物系にヒトの応答を対比して、Ｔ細胞への指向性を有するヒ トレトロウィルスはヒトエイズの病因の候補と考えられた。

ヒトＴリンパ球指向性ウィルス（ＨＴ　Ｌ　Ｖ　）のファミリーのい（つかの構 成員は単離されている。これらの単離体の一つはＴ細胞リンパ腫の侵害物を有す る患者から得られた。ＨＴＬＶ−１と表されるこのウィルスは成人Ｔ細胞白血病 ／リンパ腫（ＡＴＬＬ）の病原と病因学的に関連されてきた。ＨＴＬＶ−１の試 験管内感染はＴ細胞の機能を変えることができ、そしていくつかの場合にはＴ細 胞の死滅を導く。ＨＴＬＶファミリーのもう一つの構成員は毛状細胞白血病のＴ 細胞変異型を有する患者から単離され、そしてＨＴＬＶ−ＩＩと表された。ＨＴ Ｉ。

Ｖ−１およびＨＴ　Ｔ、　Ｖ　−ＩＩの単離はエイズ患者の培養Ｔ細胞から報告 されていた。もう一つのレトロウィルスの単離は、しばしばエイズに進行し、そ してそれ故に「前エイズ」と呼ばれる症候群である持続的な全身性のリンパ節疾 患を有する同性愛患者から報告された。ＨＴＬＶ−１のプロウィルスＤＮＡは、 ２人のエイズ患者の細胞ＤＮＡ中に検出され、そして何人かの患者の血清はＨＴ ＬＶ−１の抗原と反応することが示された。エイズとＨＴＬＶ−Ｉタンパク質に 対する血清抗体との間の相関は弱い。

エイズの第一の原因、は、公知のＨＴＬＶ亜群との限定された交差反応性を有す るヒトＴリンパ球しｌ・ロウイルス変異型であることが今や見出されている。こ れらの新しい変異型はＨＴＬＶ−Ｉ［Ｉ、またはごく最近ではＨＩ　Ｖと表され る。

エイズとヒト免疫不全症ウィルス（ＨＩ　Ｖ）とは血液産物により伝染されるこ とが知られているから、ＨＩＶによる血液の汚染を検出する方法は、血液を受け 取る人の安全性を保証するために必要とされる。そのような試験方法はできるだ け感度が高くそして特異的であるべきであり、そしてまた通常の環境で容易に実 施されるべきである。新鮮なまたは培養された血液細胞中のウィルスマーカー例 えば逆転写酵素、ウィルス抗原または核酸配列に対する試験は遅く、そして現在 では大規模なスクリーニングには適していない。一方、ＨＩＶ感染個体は１種ま たはそれ以上のＨＩＶタンパク質に対する抗体に一般的に血清陽性であるから、 ウィルス抗体または抗原に対する血清学的試験は上記目的には十分に適している 。

後天性免疫不全症候群の原因であるＨ　Ｉ　Ｖの定量的測定は、現在困難な操作 である。患者からのＨＩＶの第一の単離は、Ｐ　ＨＡ−または同種−刺激ヒＩ・ リンパ芽細胞培養物中で通常行われる。この操作は次に終末点希釈を用い適合さ れて、感染性ウィルスの定量的（ＩＤ５０）評価が得られた。しかしながら、多 くの研究のために、菌数検定（ｅｎｕａｅｒａ目ｏｎ　ａｓｓａｙ）または「プ ラーク」検定は非常に望ましいものになるであろう。

プラーク試験は、ＨＴＬＶ−１保有細胞系において１、　、Ｑ、　１３０５　（ １９８７）　にハラダ（Ｈａｒａｄａ）等により記載されていた。この検定法は ＨＩ　ＶのＬＡＶ／ＨＴＬＶＩｌＩＢ株に対して定量的でそして有用であるが、 通常のヒトリンパ芽培養物を使用するより感度が低（、そして野生型ＨＩＶ単離 体には作用しない。さらに、そのような細胞から回収されたウィルスは、ＨＴＬ Ｖ−１誘導遺伝子配列との組換えにより変更される可能性を有し、従って最初に 投入したＨＩＶ株の真の遺伝子構造をあいまいにする可能性がある。

その他のレトロウィルスでの従来の研究は、プラスチック皿に付着性の鋭敏で単 層の細胞での感染中心検定によるウィルス感染細胞の検定が非常に高い感度の定 量検出・方法であることを示した。さらにウィルス感染のフォーカス領域（ｆｏ ｃａｌ　ａｒｅａ）は、ウィルス特異的なモノクローナル抗体またはポリクロー ナル抗体を用いて同定され得、従って、ある種のウィルス−細胞の組合せで入手 することが困難であるかまたは不可能である感染の各部位でのフォーカス細胞変 性効果の必要条件を排除する。最後にもし、検出が生細胞においてなされるなら ば、生物学的にクローン化されたウィルスを異種の集団から直接得ることができ る。適当なプラスチック付着性標的細胞が無かったのでそのようなアプローチは ＨＩＶに関して可能ではなかった。

ガｏ　（Ｇａｌｌｏ）等は米国特許第４５２０１１３号において、ウェスタンプ ロット技術に基づいたストリップラジオイムノアッセイ、またはエリザ（ＥＬＩ ＳＡ）　、即ち酵素結合イムノソルベントアッセイのいずれかにより血清中のエ イズに対する抗体を検出する方法を開示している。

フォーカルイムノアッセイ（Ｆｏｃａｌ　ｉｎｍｕｎｏａｓｓａｙ、ＦＩ＾）は 公知の検定技術であるが、しかしそれは、適当な標的細胞、特定の抗ＨＩＶ抗体 、およびＨＩＶに対する試験研究を行うために必要な操作の詳細が無かったので 、細胞の不在下でＨＩＶ感染細胞またはＨＩＶを検定するためには使用されなか った。

実験室でのＨＩＶ感染研究のために使用されるほとんどの細胞系は液体培地中の 懸濁培養物として成長する。

この場合において、稀な感染細胞は培養物中に浮遊し、感染は無作為に広がる。

これは、感染細胞のレベルが免疫蛍光分析または逆転写酵素分析により検出され るには十分に広がったときに検出され得るのみである。これには初期感染の低い レベルに対して通常約２ないし４週間かかる。

本発明の要約 従来技術の欠点、例えば上記したようなことを克服することが本発明の一つの目 的である。

ＨＩＶ感染細胞を検定することが本発明のもう一つの目的である。

無細胞）ＩＩＶを試験することが本発明のその他の目的である。

エイズを診断するための改良され、より正確で、単純で、そしてより迅速な試験 を提供することが本発明のさらに別の目的である。

ヒトから得られた試料中の）ＩＩＶまたはＨＩＶ感染細胞のレベルをモニターす ることが本発明のさらに別の目的である。

実験室条件で作製された試料中のＨＩＶまたはＨＩＶ感染細胞のレベルをモニタ ーすることが本発明の別の目的である。

抗ＨＩＶモノクローナル抗体を作製する方法を提供することが本発明のさらに別 の目的である。

ＨＩＶの検定に使用するための感受性標的細胞を選択することが本発明のさらに 他の目的である。

本発明に係る検定は単層で成長する感受性標的細胞中でのＨＩＶ感染の局部領域 またはフォーカス（ｆｏｃ＋＋ｓ、　ｆｏｅｉ）を検出するための、ＨＩＶ特異 的、抗体を用いるフォーカルイムノアッセイ（Ｆ　Ｉ　Ａ）および間接免疫学的 検定例えば免疫細胞化学、オートラジオグラフィーまたは免疫蛍光法である。

本発明に係る試験は定量的で、そして非常に感度が高い。実験室のＨＩＶ株に関 し、たった１個のＨＩＶ感染細胞が１００万個の非感染細胞を含む試料中で検出 可能であり、そしてより高いパーセンテージの感染細胞は正確に定量され得る。

本方法はエイズ患者においてＨＩＶ発現のレベルに関し薬剤治療の効果のモニタ ーを可能にし、並びにまだ徴候を示していないＨＩＶ抗体陽性者においてＨＩＶ 発現の定量手段を提供することを可能にする。本発明に係る試験は迅速であり、 完了するまで２ないし４日を要するのみで、これは現在利用可能な試験に比べ主 要な利点である。

本発明に係る試験は、無細胞ＨＩＶに対するよりＨＩＶ感染細胞に対してより感 受性である。にもかかわらず、ウィルス感染の個々のフォーカスを数えることが できるから、本試験は無細胞ウィルスと作用し、そしてより定量的にウィルス中 和抗体を測定するために使用され得る。

本発明の効力を試験するために、ＨＩＶまたは）（ＩＶ感染細泡の種々の希釈物 を、ＨＩＶ感染に感受性の細胞を前もって播種した（ｓｅｅ＋ｊ）皿に設置した 。短時間の培養後、細胞をＨＩＶタンパク質と反応性である抗体またはＨＩ　Ｖ のＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＢ株（７）ｇｐ　１２０ｘンベロープタンパク質に対す るモノクローナル抗体に暴露し、使用された一次抗体と反応性であるマーカー複 合抗体に暴露し、そしてその皿を次に適当な手段、例えば蛍光顕微鏡または光学 顕微鏡により検査し、そして皿あたりのマーカー陽性細胞のフォーカスの数を計 測した。

ＨＩＶ感染の存在および／または範囲を試験する本発明に係る方法は、ＨＩＶま たはＨＩＶ感染細胞の添加を除いて上記と同様の段階を包含する。

適当な標的細胞を得るために、ヒーラ細胞をＣＤ４遺伝子およびネオマイシン耐 性遺伝子含有のレトロウィルスベクターに感染させた。感染後、この細胞をネオ マイシン類似体、０４１８の存在下で成長させ、そして耐性クローンを選択した 。分析された１８種のクローンの中で、４種がモノクローナル抗体０ＫＴ４を用 いる膜免疫蛍光法により検出可能な細胞表面ＣＤ４を発現することが見出され、 そして１種のクローンＨＴ４−６０が引き続く研究において使用された。ＡＴＣ Ｃ番号ＣＲＬ−９６３１゜ 図面の簡単な説明 第１図はＨＩＶタンパク質の免疫沈降を示す。

第２図はＨＩＶ（ＬＡＶ株）感染ＨＴ４−６Ｃ細胞の種々のフォーカスを示す。

、第３図はＨＴ４−６０細胞におけるＨＩＶ感染のフォーカスを示す。

第４図は感染後の種々の時間でＦＩＡにより、および間接免疫蛍光法により検出 されたＨＩＶ感染リンパ様細胞の相関関係を示す。

第５図はＨＴ４−６ＣＣ細胞層を感染するために使用された感染Ａ３．０１細胞 培養物からのＨＩＶ（ＬＡＶ株）のＦＩＡを示す。

本発明の詳細な記載 本発明は、プラスチック皿上の単層で成長する感受性標的細胞中でのＨＩＶ感染 の局部領域を検出するための、ＨＩＶ特異的抗体を用いるフォーカルイムノアッ セイ（Ｆ　Ｉ　Ａ）および間接イムノアッセイ技術を用いる。

試験すべき試料の変化する希釈物は、ＨＩＶまたはＨＩＶ感染細胞を含有するこ とが未知であろうとなかろうと、ＨＩＶ感染に感受性である細胞に予め１日程種 した皿内に設置される。あらゆる適当な成長培地が使用され得る。単−型の細胞 に限定されないけれども、ＨＩＶ感染に感受性である細胞の選択は重要である。

しかしながら、感受性標的細胞は試験する皿、好ましくはプラスチックからなる 皿に付着して成長するであろうものでなければならない。適当な標的細胞は以下 の実施例において記載される。

２ないし４日後、成長培地は除去され、そして細胞は例えばメタノールもしくは ホルムアルデヒドまたはその他の慣用の適当な固定剤により約５分ないし約１０ 分間５固定されてもよい。この固定された細胞を例えば慣用の水性緩衝液で所望 によりすすいだ後、ＨＩＶタンパク質に反応性である適当な希釈および容量の抗 体に細胞を暴露する。

抗ＨＩＶ抗体の選択は再び重要な考慮であり、そして高い程度の感受性を有する 固定されたまたは生きている細胞中のＨＩＶを検出することができるものの中か ら抗ＨＩＶ抗体を選択することが必要である。適当な材料は実施例において記載 される。

抗体への暴露３０分後、細胞を洗浄する。そのように処理した細胞を次に一次抗 体と反応性であるマーカー複合抗体に暴露する。抗体はあらゆる適当なマーカー 材例えば市販の供給源から購入され得るフル第１／セインイソチオシアネート（ Ｆ　Ｉ　ＴＣ）と複合され得るが、明らかにその他の材料を使用してもよい。

例えば約３０分間さらに保温した後、皿を再び例えば水性緩衝液で洗浄する。次 に、細胞を例えばメタノールまたは２％ホルマリンで固定するか、または適当な 化学物質と反応させ、複合抗体を可視化する。さらに所望により洗浄および液体 を除去した後、皿を使用したマーカーのタイプに応じて例えば蛍光または光学顕 微鏡での検査に供する。

本発明の検定において使用する感受性標的細胞を開発するたとが必要だった。感 受性標的細胞は、プラスチック皿に付着して成長するであろうものが開発された 。これを遂行するために、ＨＩＶレセプター分子Ｔ４をコード化するＣＤ４遺伝 子をヒトのガン細胞系ヒーラに移入した。１８種の異なるＴ４陽性ヒーラ細胞ク ローンが誘導され、モしてＨＩＶ感染に対してスクリーニングされた。多くが陰 性で、そして陽性クローンの中には異なるレベルのＨＩＶ感染性が見られた。最 良のクローンが次の実験のために選択された。

抗ＨＩＶ抗体は以下のように選択された。最初に、ＨＩＶエンベロープタンパク 質ｇｌ）１２０に特異的な種々のマウスモノクローナル抗体が作製されたが、こ れは高い感度でメタノール固定または生きている感染細胞中のいくつかの）ＨＩ Ｖ株を検出することができた。これらのモノクローナル抗体はＦＩＡの操作の詳 細の最初の開発および最良の標的細胞クローンの選択において使用された。しか しながら、これらの抗体が野生型ＨＩＶ株並びにヒトエイズ患者の血清を検出し ないかもしれないということが心配されたので、ヒトエイズ患者の血清をＦＩＡ におけるＨＩＶ検出のために使用した。最初にこれは、エイズ患者の血清が抗Ｈ ＩＶに比べ多くの抗体を含有しているので問題だった。しかしながら、血清の広 範囲の吸着ま１＝は低いバックグラウンドの患者の選択により、非特異的な反応 性は解消され、そしてそのような血清は試験におい有効だった。

ＨＩＶのエンベロープタンパク質と反応性であるモノクローナル抗体が作製され た。これらの抗体は、ＨＩ　Ｖ感染細胞またはヴイリオンからのエンベロープタ ンパク質を免疫沈降させ、そしてＨＩＶｇｒ）１２０をコード化するツクシ；、 アウイルスに感染させた細胞とのそれらの反応性により１ｉｉｐ１２０に特異的 であることが示された。

本発明に係る検出方法における第二段階は、第一段階で使用されたヒトまたはマ ウス免疫グロブリンと反応性であるマーカー複合抗体を用いる。これらのマーカ ー複合抗体は市販の供給源、例えばペンンルベニア州ウェスト・チェスターのカ ッペル・ラボラトリーズ（Ｃａｐｐｅｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｌｅｓ）から購入 することができる。

約３０分間さらに保温後、皿を緩衝液で２回洗浄１１、そしてメタノールまたは ２％ホルマリンで再び固定するか、またはマーカー特異的染色を顕色するために 操作した。さらに１回の水性洗浄の後、液体を除去し、そして皿を適当な手段例 えば蛍光顕微鏡もしくは光学顕微鏡またはオートラジオグラフィーにより検査し た。

皿あたりのマーカー陽性細胞のフォーカスの数を次に数えた。通常これらのフォ ーカスはときどき多重の核（約２ないし３０以上）を有する１個またはそれ以上 の細胞を含有する小さい領域内の約１ないし約３０個の細胞からなる。約１００ 万ないし約５００万個のリンパ球または単球が単一の皿中に設置されるから、本 検定は試験される１００万ないし５００％個の細胞あたりおよそ１個の感染細胞 を検出し得る。

、本発明の検定を成功させるように処理されたその他の変数は、標的播種の濃度 （３５日皿あたり５Ｘ１０’）、感染とフォーカス検出との間の日数（２ないし ４日）、固定の種類、および観察の方法を包含する。

ＨＩＶ感染細胞の検出を行うために、ＲＴ４−６Ｃ細胞の単層培養物が使用され てＨＩＶのＬＡＶ株に試験管内で感染させたＡ　３．０１ヒトＴリンパ球を検出 した。ＲＴ４−６Ｃ細胞を１日前に播種した皿内に、感染Ａ　３．０１培養物か らの細胞を設置した。次の日、懸濁細胞を除去し、そして培地を変えた。３日後 、感染細胞のフォーカスを、フォーカルイムノフルオレッセンスアッセイ（Ｆｏ ｃａｌ　ｉｍ＋＊ｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｏｃｅ　ａｓｓａｙ）により）（Ｉ 　Ｖエンベロープタンパク質と反応性であるモノクローナル抗体９０２を用いて 同定した。感染ＨＴ４−６Ｃ細胞の多重フォーカスが見られた。免疫蛍光細胞は しばしば多核であったが、しかし第２Ａおよび２Ｂ図において示されたように、 ＩＯないし２０個の単核細胞のクラスターにまとまっても見られた。ＨＩ　ｖｇ 染染液核細胞クラスターの観察は、ＨＩＶのＬＡＶ株が細胞から細胞への融合な しでＲＴ４−６Ｃ細胞内に広がり得るであろうことを示唆した。

同様の検定は、試験管内リンパ様細胞系での成長に予め適合しなかった患者のＨ ＩＶ単離体で感染させた３日間ＰＨＡ刺激したヒトリンパ球を用いて行われた。

この場合、第２Ｃ図に示したように、フォーカスはポリクローナルヒト抗ＨＩＶ エイズ患者の血清を用いて検出され、そして観察されたフォーカスは通常多核巨 大細胞が単独でまたは２もしくは３つが一緒のグループで存在していた。

フォーカルイムノフルオレッセンスアッセイはまた、第２Ｄ図に示したように、 メタノール固定せずに生きている感染ＨＴ４−６０細胞を用いて成功裡に行われ た。

これらの条件下で、フォーカスは、たとえ蛍光多核巨大細胞が見られたとしても 、あまり明瞭ではなく、そして少なかった。可視光でのこれらの培養物の検査は 、ＦＩＡ法の多重の洗浄段階の間に大きな合胞細胞が皿から除去されることを示 唆した。残りの蛍光細胞は単核であるように見え、そして各フォーカスからの細 胞は生物学的にクローン化された生きているＨＩｖの供給源であるはずだった。

ＨＩＶ感染Ａ３．０１リンパ球懸濁培養物は無細胞ＨＩＶビイリオンおよび生き ている感染された細胞から生じる細胞随伴ＨＩＶの両方を含有していたから、Ｈ ＩＶのどの源がＲＴ４−６Ｃ細胞中でＦＩＡにより検出されたフォーカスに感受 性であるかを決定することは興味深かった。細胞懸濁物のＦＩＡ分析は、最初の フォーカスの１％だけが第３図に示したように、無細胞上清液での感染後に検出 可能であることを示唆した。従って、フォーカスの９９％が細胞随伴ＨＩＶであ るはずで、そしてこれらのフォーカスは、その細胞が懸濁液中でドウンス・ホモ ジナイゼーション（Ｄｏｕｎｃｅ　ｈｏａｉｏｇｅｎｌｘａｔｊｏｎ）により死 滅されるならばほとんど除去された。

ＲＴ４−６Ｃ細胞においてＦＩＡの感度を試験するために、本検定はリンパ球懸 濁培養物におけるＨＩＶ感染の広がりを検出する能力に対してＨＩＶ感染Ａ　３ ．　Ｏｌ細胞またはＰＨＡ芽細胞の間接免疫蛍光法（ＩＦ）と比較された。免疫 蛍光検定は、非特異的蛍光試薬を有する細胞のバックグラウンドのために０．１ ％より低い発生率の感染細胞を計測することはできなかった。しかしながら、Ｆ ＩＡはＯ，ＯＯＯ１％の細胞（３５ｍ皿に播種された３×１０＠細胞あたり３個 のフォーカス）と低いレベルのＨＩＶ感染を検出することができた。

２種類の検定法が比較され得る範囲において、いずれかの検定法において検出さ れた細胞のパーセンテージの間にはすぐれた相関があった、第４八および４Ｂ図 参照。

従って、ＦＩＡは細胞発現ウィルスタンパク質のほとんどまたは全てを検出する ように見えた。しかしながら、より古い（１１日）ＰＨＡ芽細胞培養物において 、ＦＩＡと免疫蛍光検定とは異なっていた。このとき培養物は、免疫蛍光法によ り数えらたがしかしＦＩＡによっては数えられなかった死んだあるいは死につつ あるＨＩＶ感染リンパ球を蓄積しているように見えた。

これらの実験において、逆転写酵素もまた感染されたＡ　３．０１およびＰＨＡ 芽細胞培養物の上清液中で測定された。両方の場合においてＦＩＡは逆転写酵素 よりはるかに良好な感度であることが見出された。Ａ３．０１細胞においてＲＴ は１％以上の細胞が感染された後だけが陽性で、一方芽細胞における逆転写酵素 は０．１％以上の細胞が感染されたときに陽性だった。

異なるＨＩＶ単離体でのその他の実験において、ＦＩＡおよび免疫蛍光検定は常 に一致するとは限らなかった。

全ての場合においてＦＩＡは逆転写酵素または免疫蛍光法のいずれかよりもより 良好な感度だった。しかしながら、ＦＩＡにより数えられた細胞の数は免疫蛍光 法により数えられた細胞の５ないし１００％にわたった。また、ある種の慢性の 感染細胞系、例えばＨＴＬＶＩ［［Ｂに感染したＨ９細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ ８５４３）において細胞の１ないし５％だけがＦＩＡにより陽性と数えられた。

これらの細胞は非常に低いレベルの無細胞の感染性ＨＩＶを産生じた。

第３図に示した最初の実験は、ＲＴ４−ＱＣ細胞におけるＦＩＡが無細胞ＨＩＶ による感染を検出することができることをも示唆した。さらにＨＴ４−８Ｃ細胞 上での希釈滴定は一つのヒツト反応曲線（ｈｉｔ　ｋ！ｎｅｔ！ｅ　ｃｕｒｖｅ ）を得、即ち第５図に示したように２倍の希釈は検出されたフォーカスにおいて ２倍の減少を示した。従って、各々のフォーカスは単一のヴイリオンによる感染 を示すように見えた。

本系の感度を試験するために、比較はＨＴ４−６Ｃ。

ＡｌＯ２およびＰＨＡ芽細胞上での無細胞ビイリオンの滴・定で行われた。そり 結果は、Ａ３．０１．適合ＨＩｖ１ＬＡＹ株がＨＴ４−６Ｃ，Ａ３．Ｏｌおよび ＰＨＡ芽細胞上で類似の効率で検出されることを示した。Ａ　３．０１細胞中で 成長するように適合されなかった野生型ＨＩＶ単離体の場合には、ＨＴ　４−６ 　Ｃ細胞はＰＨＡ芽細胞培養物において観察された感染性の０．１ないし１％だ けを検出した。これらの同様なウィルス単離体はＡ　３．０１細胞培養物におい て全く検出されなかった。

無細胞ＨＩＶの検出のための最適条件はＨＩＶ（ＬＡ■）および野生型ＨＩＶ単 離体とは異なっているように見えた。ポリブレンおよびＤＥＡＥデキストランは 、試験管内でのレトロウィルス感染の効率を高めるために頻繁に使用された、ト ヨシｖ　（Ｔｏｙｏｓｈｉｍａ）等、■匡し■３ｉ、　４１４　（１９６９）参 照。ＨＴ４−６Ｃ細胞に関し、ＨＩＶのＬＡＶ株による感染はＤＥＡＥデキスト ランの存在下または不在下で同等に有効であり、驚くべきことにポリブレンは感 染を阻害するように見えた。対照的に、野生型ＨＩＶ単離体は細胞がＤＥＡＥデ キストランで前処理されたときだけ検出され、処理しないおよびポリプレン不在 下での感染は成功しなかった。

野生！１１ＨＩＶヴイリオンによるＨＴ　４−６　Ｃ細胞の初期の感染が相対的 に効率が良（ない原因は不明である。

これはこれらの細胞上で発現されたＴ４レセプター分子の不十分な量に起因する のかもしれない。これに関し、ＣＤ４発現ベクターに感染された１８種のその他 のヒーラクローンが試験され、モしてＨＴ　Ｖ検出の感度における多くの変化が 見出された。また、Ｔ４以外のその他のレセプター分子そして膜脂質組成物でさ えもより効果的なＨＩ　Ｖ感染に寄与することができることも可能である。

ＨＩＶ感染細胞の検出における高い感受性のために、本発明のフォーカルイムノ アッセイはエイズ患者から得られたリンパ球中にＨＩ　Ｖ感染を検出するために 使用された。患者の細胞は通常のＰＨＡ芽細胞と共培養され、そして培養液と細 胞はＦＩＡまたは逆転写酵素により種々の時間でＨＩＶに対して検出が行われた 、表１参照。

表１　通常のリンパ球と共培養されたエイズ患者のリンパ球においてＨＩＶ感染 を検出するためのフォーカルイムノフルオレッセンスアッセイおよび逆転写酵素 （ＲＴ）アッセイの使用 フォーカス／１０藝細胞 患者　日０４　７　１０　１４　１８　２１　２４１・・・フォーカルイムノフ ルオレッセンスアッセイによる陽性に対するいき値は、新たに単離されたフィコ ール−ハイバークバンド形成の抹消血単核細胞３Ｘ１０ｓ個または培養細胞の場 合には０．２５ないし１．２５Ｘ１０’個の細胞を含有するリンパ球培養懸濁物 ０．０５ないし０゜２５艷のいずれかに４日前に感染させたＨＴ４−６Ｃ細胞の ３５■皿あたり３個のフォーカスより大きかった。

陽性の逆転写酵素（ＲＴ）は、前に記載された３０分アッセイ（２３）における ３、５μ！培養懸濁液あたりＤＥ８１紙結合性材料中に混入した２　００　ｃ　 ｐｍ”Ｐ−ｄＴＴＰより大きかった。ＲＴに対して陽性の培養物はＦＩＡに対し て示された値に下線をひいて示した。

２・・・これらの実験において８人の患者の培養物が２４日を通して試験された 全ての時間においてＦＩＡおよびＲＴの両方により陰性だった。

３・・・ｎｔ＝試験しなかった；空欄の値はＦＩＡ（＜２０フオーカス／１０６ 細胞）およびＲＴにより陰性だった。

４・・・培養物は、１０％ウシ胎児血清含有のＲＰＭ１１６４０ｉ０Ｊ、１０μ ｇＰＨＡ／＋ｎ／、およびエイズ患者からのフィコール−ハイバークバンド形成 の抹消血単核細胞を４ないし５Ｘ１０’個および上記培地中に１０　ｕｇ／−で Ｐ　ＨＡを含む２Ｘ１０’細胞／−での培養により３日前に試験管内で刺激した 健常者の血液からの同様な単核細胞を４ないし５Ｘ１０”個を加えた５Ｘ１０− ５Ｍの２メルカプトエタノールを含む２５ａｌ直立フラスコから構成された。培 養物は２ないし３日毎に５％ＩＬ−２−陽性培養培地〔エレクトロヌクレオニク ス（Ｅｌｅｃｔｒ。

ｎｕｅｌｅｏｎｌｃｓ）、メリーランド州ロツクヴイレ〕で培養し、そして７日 毎に４ＸＩＯ’個の新しい３日間Ｐ　ＨＡ、刺激された健常者のリンパ球が添加 された。

ＦＩＡによるこれらの培養物の分析は最初の１４ないし１８日間は難しくなかっ たが、しかしこの期間の後これらの培養物中の細胞はＨＴ４−６Ｃ細胞に対して 完全に毒性となり、そしてこの作用を避けるためにより少量のリンパ球を各ＨＴ ４−６Ｃ皿に添加し、従ってＦＩＡの感度が低下した。

５・・・エイズ患者はエリザおよびウェスタンプロットの両方によりＨＩＶ抗体 に対して陽性だったメリーランド州ベセスダのＮＩＨのＮＩＡＩＤＩ　１階エイ ズ患者クリニックから無作為に選択された。

試験管内での培養に先立ちＦＩＡにより直接分析されたとき試験された患者のリ ンパ球のいずれも陽性ではなかった。それ故に試験された細胞の数に基づいて、 これら患者の細胞集合体には、１００万個の細胞あたりＦＩＡ・陽性細胞が１個 より少なく含まれていた。しかしながら、多くの場合、通常のＰＨＡ芽細胞の存 在下で数日間の試験管内典培養はＦＩＡにより検出可能なレベルまでのＨＩＶ発 現の増幅を導いた。はとんどの場合において、ＦＩＡによる検出は逆転写酵素の 出現よりわずかに先行した。しかしながら、この動力学の相違はこれらのアッセ イ条件下では通常小さかった。

チェセブロ（Ｃｈｅｓｅｂｒｏ）等、　■■■■１．２２２（１９７８）は、感 受性アッセイによるレトロウィルス感染細胞の検出が個々の細胞による感染性ウ ィルス放出の速度に非常に依存していることを既に見出していた。ウィルスを徐 々に放出する細胞は有効には検出されず、一方ウイルスを迅速に放出する細胞は 迅速に検出される。この状態はＨＩＶに感染した細胞に対しても当てはまるよう に見える。

エイズ患者からの抹消血単核細胞の従来の研究は、ＨＩＶ遺伝子配列を含有する 細胞は患者の半分において、１０’個の細胞あたり約１個の頻度でその場でのハ イプツト形成（ｉｎ　５ｉｔｕ　ｈｙｂｒ［ｄｌｘａｔｉｏｎ）により検出され 得ることを示した。細胞あたりのウィルス産生の比率が十分に高いならば、その ような頻度はＦＩＡによるこれらの細胞の検出の感度内に容易におさまるであろ う。患者から直接採取した細胞のＦｌΔアッセイが首尾一貫して陰性だった（即 ち、１０＠個の細胞あたり１個より少ない陽性細胞）が、しかし試験管内での共 培養の後に陽性になったという発見は、ウィルス放出の速度は患者の抹消血単核 細胞において非常に低いが、しかし試験管内での共培養の間に高められることを 示唆した。この結果は、エイズ患者の血液細胞のその場でのハイプツト形成によ り観察された非常に少ないＨＩＶ遺伝子コピー数の評価と一致する。低いウィル ス発現はレトロウィルス疾患では通常見られないが、しかしながらビスナレンチ ウィルスによる中枢神経系の「潜伏性」感染は、非常に少ないウィルス遺伝子数 の存在および低レベルのウィルスタンパク質および感染された細胞における感染 性と関連している。この疾患では発現の調節機構が不明であるが、しかし低い発 現は生体内での長期のウィルス維持に重要であると信じられている。おもしろい ことに、ＨＩＶに関する結果と同様に、ビスナウィルスの低い発現は細胞が試験 管内で培養された場合に逆転された。

第１図に示された結果を得るために、ＨＩＶ（ＬＡＶ株）感染Ａ　３．０１細胞 を５ｉ３−システィンで１２０マイクロキュリー／−および２Ｘ１０’細胞／１ ｎｌに、透析したウシ胎児血清を含むシスティン非含有培地中３７℃で８時間標 識した。ＮＩＨ／３Ｔ３細胞をワクシニア発現ＨＩＶｇｐ”’　またはワタシニ ア発現インフルエンザ（ＨＡ）（１８）にｌＯの多重度で感染させ、そして２０ 時間の後に細胞を３ＳＳ−メチオニンで１００マイクロキユリー／ｍ／にメチオ ニン非含有培地中３７℃で２時間標識した。

標識の後、細胞を前洗浄し、そしてハイプリドーマ組織培養上清１−またはヒト エイズ患者の血清３μｌと保温した溶菌物の９Ｘ１０’細胞同等物またはＮＰ４ ０−溶菌培養上清液０．１０　Ｊを用いて免疫沈降のために操作した。次いで、 登録商標セファロースプロティンＡ〔ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｌａ）　） の１０％懸濁液０，１−を添加し、ゆっくり揺らしながら３０分間保温し、そし てビーズを次に溶菌緩衝液で３回洗浄し、チェセブロ等、■Ｕｌｉ！ＬＬ　且、 １１３１（１９８１）により記載されたように８％ポリアクリルアミドゲルでの ５ＤＳ−ＰＡＧＥおよび次に蛍光写真法により溶出および分析した。

第１列には分子量マーカーが示され、第２列はＨＩＶ感染Ａ　３．０１細胞の上 清を含むヒト抗ＨＩＶエイズ患者の血清を示す。第３列はＨＩＶ感染Ａ　３．０ １細胞の上清を含むモノクローナル抗体９０２を示す。第４列はＨＩＶ感染Ａ　 ３．０１細胞の溶菌物を含むヒト抗ＨＩＶを示す。

第５列はＨＩＶ感染Ａ　３．０１細胞の溶菌物を含むモノクローナル抗体９０２ を示す。第６列は未感染Ａ　３．　Ｏ１細胞の溶菌物を含むヒト抗ＨＩＶを示す 。第７列は未感染Ａ３．０１細胞の溶菌物を含むモノクローナル抗体９０２を示 す。第８列はワクシニアＨＩＶｇｌ）１６０感染ＮＩＨ／３Ｔ３細胞の溶菌物を 含むモノクローナル抗体９０２を示す。第９列はワタシニアＨＩＶｇｐ１６０感 染ＮＩＨ／３Ｔ３細胞の溶菌物を含むモノクローナル抗体９０７を示す。第１０ 列はワクシニア−インフルエンザＨＡ感染ＮＩＨ／３Ｔ３細胞の溶菌物を含むモ ノクローナル抗体９０２を示す。ＨＩＶエンベロープタンパク質ｇｐ１６０およ びｇｐ１２０、および主要ＨＩＶコアータンパク質ｐ２４の位置は右側に示され ている。

ＨＩＶエンベロープタンパク質に特異的なモノクローナル抗体を産生ずるハイブ リドーマは　）ｌ　ＩＶ　ｇｐ１６０（ＩＢ）を発現するワクシニアウィルスｌ Ｘ１０’ＰＦＵで最初に尾部を傷つけて、モして３ないし５週間後に腹膜腔内注 射により免疫された（Ｂｉｏ、Ａ（２Ｒ）　Ｘ＾、　ＢＹ）マウスの膵臓細胞か ら得られた。二次播種の３日後、膵臓細胞をＮＳＩ細胞と融合させた。

上清液は、ＨＩＶエンベロープおよびｇａｇタンパク質を長期にわたり発現する メタノール固定化８Ｅ５細胞上での間接免疫蛍光法によりスクリーニングされた 。６種の陽性クローンが１匹のマウスから得られ、そしてそれらは５ＤＳ−ＰＡ ＧＥゲル内でのＬ鎖移動での相違に基づいて少なくとも２種の異なるクローン（ 抗体９０２および９０７）を表出していることがわかった。全ての抗体はＩｇＧ ＋　サブクラスのものであり、そして熱およびホルマリン固定化ｓ　ｔ　ａｐｈ Ａ　（Ｃｏｗａｎ　Ｉ株）にではな（、溶菌緩衝液中でセファロースプロティン 八に傘で結合した。すべての抗体はＨＩＶｇｐ１６０またはｇｐ１２０を発現す るワクシニアに感染させたメタノール固定化ＣＶ−１細胞での間接免疫蛍光法に おける反応性に基づいてＨＩＶｇｐ＋＊＊　に特異的だった。インフルエンザＨ Ａを発現するワクシニアに感染させたＣＶ−１細胞に対して反応性は観察されな かった。さらに、これらの抗体は間接免疫蛍光法において生きている、およびメ タノール固定化されたＡ３．０１細胞およびＨＩＶ（ＬＡＶ株）に感染したＭＯ ＬＴ−４細胞、）（ＩＶ（ＨＴＬＶＩＢ株）に感染したＨ９細胞、および８Ｅ５ 細胞と反応したが、しかしＡ、　３．０１細胞、ＭＯＬＴ−４およびＨ９細胞、 またはこれまで試験されたその他の全てのＨ１■単離体に感染したＡ　３．０１ 細胞もしくはＰＨＡ芽細胞とは反応しなかった。

第２八図は１（ＩＶｇｐ１２０に特異的なモノクローナル抗体９０２を用いて間 接免疫蛍光法により検出されたＨＩＶＣＬＡＶ株）感染ＨＴ４−ｉ３ｃ細胞ノフ ォーカスを示す。示された範囲はいくつかの多核の巨大細胞およびいくつかの単 核細胞を含むＨＩＶ感染細胞の単一のフォーカスを有する。

第２Ｂ図はＨＩ　Ｖ陽性単核細胞および６個の核を含む１つの巨大細胞の一領域 を示す）ｉｌＶ（ＬＡＶ）感染ＨＴ４−６Ｃ細胞のフォーカスを示す。

第２０および２Ｂ図はヒトエイズ患者の血清およびＦＩＴＣ抗ヒトＩｇにより検 出されたＨＩＶ（５８８Ｂ患者単離体）感染ＨＴ４−６Ｃ細胞のフォーカスを示 す。

両方のフォーカスは）（ＩＶ抗原を発現する単一の多核巨大細胞からなる。野生 型ＨＩＶ単離体では、ＨＩＶを発現する単核ＨＴ４−６Ｃ細胞がまれに観察され ただけである。

第２ＥａはＦＩＡを用いて生きている細胞単層上で検出されたＨＩＶ（ＬＡＶ株 ）感染ＨＴ４−６Ｃ細胞ノフォ細胞スフオーカス核細胞が観察されず、モしてＦ ＩＡ操作の多数回の洗浄の間に除去されたように見えることは注意されるべきで ある。

これらの図面のために行われたフォーカルイムノアッセイの詳細を以下に示す： 　！５ｘｌ　Ｏ’　ＩＴＪ−ＱＣ細胞を、１０％ウシ胎児血清を加えたＲＰＭ１ １６４０　２．５Ｊを含む３５−プラスチック組織培養ウェル中に播種した。

次の日、多数のＨＩＶ感染Ａ　３．０１またはＰ）１八芽細胞をウェルに添加し た。１８時間後、懸濁１．た細胞を除去し、そしてＩＴＪ−６Ｃ細胞を加え、そ してさらに３日間成長させた。培地を次に除去し、付着した細胞をメタノールで ５分間固定し、ＰＢＳですすぎ、そして間接免疫蛍光法を行った。ウェルを、ハ イブリドーマ組織培養液（抗体９０２）０．１５ｍ／または未感染ＨＴ４−６０ 細胞に対して低いバックグラウンドが選択されたヒトエイズ患者の１／３００希 釈物０．１５２のいずれかと共に室温で２０分間保温した。細胞を次にＰＢＳ２ −ですすぎ、マウスまたはヒトのいずれかの免疫グロブリンに特異的なＦＩＴＣ 複合ヤギまたはヒツジ抗体の１／１８０希釈物０．１５　ｍ／と３０分間保温し 、ＰＢＳで再びすすぎ、そしてジットボン（Ｓｔｔｂｏｎ）等、■■江■ＨＬ１ １０（１９８５）に前に記載されたように倒立顕微鏡で即座に試験するか、また はメタノールで５分間再び固定し、そして０．００２Ｍ　ＥＤＴＡを含むＰＢＳ 中４℃で次の実験のために保存した。生きている感染細胞上でのＦＩＡは最初の メタノールでの固定が省略されたほかは・同様だった。

第２Ｆ図は、二次抗体がペルオキシダーゼ複合ヤギ抗マウスＩｇであり、そして ペルオキシダーゼ染色が過酸化水素とジアミノベンジジンを用いて顕色されたこ とを・除いて第２Ａ図におけるものと同様にＦＩＡにより検出すｉ’ＬりＨＩ　 Ｖ　（ＬＡＶ）感染）ＩＴＪ−ＱＣＣ細胞ラフオーカス示す。フォーカスは低出 力光学顕微鏡により視覚化された。

第３図において、ＩＴＪ−６Ｃ細胞におけるＨＩＶ感染のフォーカスは、種々の 処理後ＨＩＶ感染Ａ　３．０１細胞の感染４日後にＦＩＡにより検出された。示 されたデータは一次抗体としてモノクローナル９０２を用いて得られたが、同様 の結果はヒト抗ＨＩＶ血清、続いてＦＩＴＣ複合ヒツジ抗ヒト免疫グロブリンを 用いても得られた。Ａ　３．０１懸濁培養物４１ＨＩＶ（ＬＡＶ株）　＋７）１ ／１Ｏ希釈物に感染６日後に用いられた。感染された細胞は直接播種されるか、 または遠心分離により２回洗浄し、それらの最初の濃度（３Ｘ１０１１細胞／１ ｎりに再懸濁し、そして次に：引き続く細胞分裂を防ぐために１００００ｒａｄ のＸ線照射、細胞外部のウィルスを不活性化するために０．１５＋ＪＮａＣ１を 含む２ＱＩＭＥＤＴＡ中の０．０２％トリプシンと共に１０分間の消化、または 細胞を直接死滅させるためにドウンス・ホモジナイゼーシａンで処理した。これ らの試料並びに未処理の対照細胞を次にＩＴＪ−６Ｃ培養物中にＦＩＡによる分 析のために設置した。

第４Ａおよび４Ｂ図は感染後の種々の時間で、ＦＩＡによりおよび間接免疫蛍光 法により検出されたＨ　Ｉ　Ｖ感染リンパ様細胞の相関関係を示す。リンパ球芽 細胞はＰＨＡ刺激３日後のエイズ患者のＨＩＶ単離体（５８８８Ｐ）に感染させ た。Ａ、　３．０１細胞はＨＩＶ（ＬＡＶ株）に感染させた。感染細胞は試験管 内で培養され、そしてＩＴＪ−６Ｃ細胞上でＦＩＡにより、またはメタノール固 定リンパ様細胞上で間接免疫蛍光法により、モノクローナル抗体９０２およびＨ ＩＶ　ＬＡＶに対するＦＩＴＣ複合抗マウスＩｇおよびＨＩＶ−５８８ＢＰに対 するＦＩＴＣ複合抗ヒトＩｇを用いて種々の日数後検定された。

第５図において、感染Ａ　３．０１細胞培養物からのＨＩＶ　（ＬＡＶ株）は、 ＩＴＪ−６Ｃ細胞単層ヲ感染スルタめに使用された。感染はポリブレンまたはＤ ＥＡＥデキストランを含まない培養培地３−に示された希釈物０．５−を添加す ることにより行われた。２４時間後、培地を変え、そしてＦＩＡを感染４日後に 行った。

実施例Ｉ 薬剤治療の効果をエイズ患者において、該患者から血液を採取し、モして上記方 法に従ってＨＩＶ感染細胞の存在を試験することによりモニターした。治療途中 のＨ■、■感染細胞数の減少はこの疾患に対する該薬Ｍの効果が陽性であること を示す。

実施例■ ＨＩＶ発現は徴候のないＨＩＶ抗体陽性患者において、本発明の方法に従ってこ れらの患者の血液中のＨＩＶの存在を試験することにより定量され得る。

実施例■ 血清中のＨＩＶ中和活性は、中和抗体を試験すべき血清の連続的希釈物を、ＦＩ Ａにおけるフォーカスの計測可能な数を与えるのに適当なＨＩＶの希釈物と混合 することにより測定される。３７℃で１時間の混合物の保温の後、混合物は、上 記のＦＩＡを可いて残りのＨＩＶ感染性に対し滴定される。血清との保温による 感染性ＨＩＶの除去は血清抗体によるＨＩＶの中和を意味する。

特定の実施態様のこれまでの記載は本発明の一般的な性質を十分に表しているで あろうから、他人が現在の知識を適用することにより、一般的概念を逸脱せずに 特定の実施態様のような種々の施用のために容易に変更および／または採用する ことができ、そしてそれ故にそのような採用および変更は、開示された実施態様 の同等の意味および範囲内であると理解されたい。本明細書で使用される表現法 または専門用語は記載のためのものであって、限定のためのものではないと理解 されるべきである。

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Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）感染に感受性である細胞を皿に播種し 、 該皿にＨＩＶ感染を試験すべき試料を添加し、前記細胞を保温し、 前記細胞をＨＩＶタンパク質と反応性である一次抗体に暴露し、 前記細胞を前記一次抗体と反応性であるマーカー複合抗体に暴露し、そして 皿あたりのマーカー陽性細胞のフォーカスの数を数えて該皿中の感染された細胞 の数を決定する、ことからなるヒト免疫不全症ウイルスを検定するための方法。 （２）一次抗体と反応性である抗体が検出可能なマーカーと複合されている請求 項１記載の方法。 （３）マーカーがフルオレセインイソチオシアネートである請求項２記載の方法 。 （４）マーカーが西洋ワサビペルオキシダーゼである請求項２記載の方法。 （５）ＨＩＶ抗体に感受性である細胞がＴ４陽性であるヒーラ細胞である請求項 １記載の方法。 （１６）ＨＩＶ抗体に感受性である細胞がＴ４陽性である脳細胞である請求項１ 記載の方法。 （７）一次抗体がモノクローナル抗体である請求項１記載の方法。 （８）一次抗体がＨＩＶのエンベロープタンパク質と反応往である請求項１記載 の方法。 （９）皿の措置とフォーカスの計測との間の時間が約２日置いし約４日である請 求項１記載の方法。 （１０）ＨＩＶ感染に感受性である細胞を皿に播種し、試料からの細胞を該皿に 播種し、 前記細胞をＨＩＶタンパク質と反応性である一次抗体に暴露し、 前記細胞を前記一次抗体と反応性であるマーカー複合抗体に暴露し、そして マーカー陽性細胞のフォーカスの数を数えて前記試料中の感染された細胞の数を 決定する、ことからなる試料中のＨＩＶ感染細胞を検出するための方法。 （１１）請求項１０記載の方法に従うてエイズ患者からの試料細胞を検定し、薬 剤がエイズ患者の細胞に影響を与えるかどうかを決定することからなるエイズ患 者への薬剤治療の効果をモニターする方法。 （１２）請求項１０記載の方法に従ってＨＩＶ抗体陽性患者からの試料細胞をＨ ＩＶに対して検定することからなる、前記試料細胞中のＨＩＶ発現を定量する方 法。 （１３）ＨＩＶレセプター分子Ｔ４をコード化するＣＤ４遺伝子がその中に移入 されるヒトのガン細胞系からなるＨＩＶに対するフォーカルイムノアッセイにお いて使用するための標的細胞。 （１４）プラスチック皿に付着して成長し得る請求項１３記載の標的細胞。 （１５）ＨＩＶのエンベロープタンパク質と反応性であるモノクローナル抗体。 （１６）細胞が保温段階後に固定される請求項１記載の方法。 （１７）メタノールおよびホルムアルデヒドからなる群から選択される化合物で 細胞が固定される請求項１６記載の方法。 （１８）ＨＩＶに感染され得る細胞を皿に播種し、該皿に試料からの細胞を播種 し、 前記細胞を保温し、 前記細胞をＨＩＶタンパク質と反応性である一次抗体に暴露し、 前記保温された細胞を前記一次抗体と反応性であるマーカー複合抗体に暴露し、 前記細胞のマークされたフォーカスを数え、そして試料細胞がＨＩＶに感染され たかどうかを示すマーカー陽性細胞の存在を決定する、 ことからなる細胞がＨＩＶに感染されたかどうかを決定するための方法。 （１９）請求項１８記載の方法において、体液からの試料細胞を使用することか らなるＨＩＶに対して体液を検定する方法。 （２０）前記体液が血液、精液および尿からなる群から選択される請求項１９記 載の方法。