PT85149B - Processo para a preparacao de anticorpos monoclonais humanos para o virus associado com linfadenopatia - Google Patents
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Description
GENETIC SYSTEMS CORPORATION
PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE ANTICORPOS WNOCLONAIS HUMANOS PARA O VÍRUS ASSOCIADO COM LINFADENOPÀTIA
Aspecto técnico
A presente invenção refere-se geralmente à utilização de técnicas imunológicas para fornecer novos materiais utilizáveis em diagnósticos e tratamento das infecções virais e em estudos bioquímicos e histológicos mais particularmente a presente invenção refere-se à produção e caracterização de anticorpos monoclonais humanos aptos a reagirem com vírus associado à linfadenopatia, LAV/HTLV-III.
Antecedentes técnicos
A síndroma de imunodeficiência adquirida (SIDA) é uma deficiência transmissível de imunidade celular caracterizada por infecções oportunísticas e certas malignidades raras. Os grupos de risco dominantes da SIDA incluem seres do sexo masculino activos homossexuais, consumidores de drogas endovenosas e receptores de transfusões de produtos do sangue e os parceiros heterossexuais e crianças filhas de indivíduos de grupos de alto risco, que sugerem o envolvimento de um agente infeccioso transmitido através de contacto íntimo ou com produtos dd sangue.
Indícios recentes indicam que o agente infeccioso responsável pela transmissão da doença é um novo retrovírus linfotrópico, conhecido como vírus associado à linfaden£ patia (LAV) (Barre*-Sinoussi et al., Science 225 : 840 (1984)) e designado por vírus linfotrópico de células T humanas (HTLV-III), retrovírus associado à SIDA (ARV), vírus associado à imunodeficiência (IDAV) ou vírus de imunodeficiência humana (HIV).
Dados ainda mais recentes indicam que o vírus
LAV, HTLV-III, ARV e IDAV partilham características importantes diversas que incluem a homologia nucleotídica substancial (Wain-Hobson et al., Cell 40 í 9 (1985); Muesing et al., Nature 313 : 450 (1985); Sanchez-Pescador et al., Science 227 : 484 (1985)) e devem ser considerados como réplicas do mesmo vírus ainda que possam existir diferenças de estirpe para estirpe entre as diversas réplicas de vírus. A.dícionalmente à homologia nucleotídica substancial que exibem, as réplicas são similares relativamente à morfologia, citOpatologia, necessidades relativamente à actividade da transcriptase inversa óptima e, finalmente, a algumas propriedades antigénicas (Levy, Supra; Schupbach et al., Science 224 : 503 (1984)).
A transmissão do vírus da SIDA através dos produtos do sangue (sangue, soro sanguíneo, plasma e suas fracçoes) tornam importante a investigação dos produtos do sangue para se determinar se os dadores foram expostos ao vírus ou são potenciais portadores deste. Com esta finalidade diversos produtos que utilizam antigénios do vírus nos ensaios de ELISA são correntemente marcados. Indíviduos cujo sangue f
contém anticorpos para 1AV/HTLV-III, são designados por sero^ positivos”. 0 sangue destes dadores seropositivos pode ser eliminado dos estoques de sangue após detecçao portanto com intenção de auxiliar a prevenção cLa disseminação da doença.
Ausência duma resposta de anticorpos para LAV/ /HTLV-III nem sempre é indicadora duma ausência de contaminação dos produtos derivados do sangue. Amostras de sangue provenientes de indivíduos negativos a anticorpos e que não evidenciaram sinais manifestações clínicas proporcionaram a cultura do vírus (Salahuddin, S.Z., et al., lancet ii:1418 (1984)). Há uma necessidade técnida de um sistema de ensaio de captura de antigénios para impedir que estes produtos do sangue, negativos a anticorpos, infectados entrem no estoque de sangue. Anticorpos monoclonais reactivos com os componentes virais podem fornecer a base para tal sistema de detecção de antigénios.
Becentemente, foi mencionado num relatório a existência de anticorpos monoclonais murinos reactivos com a proteína nuclear p24 de LAV/HTLV-III e os seus precursores proteicos e um anticorpo murino reactivo com o invólucro glicoproteíco gp41 (di Llarzo Veronese et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82 : 5199 (1985); di Marzo Veronese et al., Science 229 : 1402 (1985)). Chassagne et al., (J. Immunol, 136 .· 1442 (1986)) também descreveram um anticorpo monoclonal murino específico para p24 e os seus precursores. Estes anticorpos têm sido utilizados experimentalmente para investigar 0 processo dos precursores de proteínas nucleares, nas células infectadas, para as proteínas virais finais.
Ainda que seja possível detectar os indivíduos
positivos aos anticorpos e detectar os positivos aos antigénios, ainda não foi encontrado qualquer tratamento eficaz ou medida preventiva para a doença. Com a dissaiainação da SIDA que começa a alcançar um extraordinário desenvolvimento senão proporções epide'micas, a extensão com que o vírus pode ser transmitido, que é uma pergunta ainda em suspenso, exige a necessidade de se encontrar uma composição com efeitos profiláticos e/ou terapêuticos.
Pê3crição da invenção
De um modo resumido, a presente invenção descreve (1) anticorpos monoclonais humanos capazes de reagirem com o determinante antigénico de LAV/HTLV-III; (2) linhas de células imortalizadas que produzem estes anticorpos monoclonais humanos; e (3) processos para a utilização destes anticorpos monoclonais humanos por exemplo, na determinação da pre sença de IAV/HTIiV-III em amostras biológicas. Um outro método aqui descrito, inclui um processo para a separação de determinantes ariágmlcos específicos de LAV/HTLV-III de uma mistura. Além disso descrevem-se composições farmacêuticas que incorporam uma quantidade eficaz e terapêutica de um anticorpo monoclonal humano capaz de reagir com um determinante antigénico de IiAV/HTLV-III e um veículo ou diluente compatíveis fisiologicamente. As composições que possuem estas características sao particularmente úteis para um método para reduzir significativamente as infecções produzidas por IAV/HTLV-III em animais de sangue quente.
Como se referiu antes, um aspecto da presente invenção proporciona um método para a determinação da presen- 5 7 ça, numa amostra biológica, de LAV/HTLV-III. 0 método envolve de modo geral
a) a incubação do anticorpo monoclonal humano capaz de reagir como determinante antigénico de LAV/HTLV-III numa amostra biológica; e
b) detecção da presença de imunocomplexos for- mados entre um anticorpo monoclonal e a amostra biológica e deste modo determinar a presença LAV/HTLV-III. Podem-se utilizar anticorpos monoclonais marcados ou não marcados. 0 método ê aplicável para detectar LAV/HTLV-III numa grande variedade de amostras biológicas incluindo secreções corporais, fluídos cor porais e espécimes de tecidos.
Como se referiu antes, um outro aspecto da presente invenção proporciona um processo para a separação de determinantes antigênicos específicos de LAV/HTLV-III duma mistu ra contendo esses mesmos determinantes antigênicos de LAV/HTLV-III.
processo compreende:
a) a imobilização de um anticorpo monoclonal hu mano capaz de reagir com determinantes antigênicos específicos dum substracto;
b) o contacto cora uma mistura que contenha deter minantes antigênicos de LAV/HTLV-III com o anticorpo imobilizado, sob condições apropriadas de tal modo que se formam imunocomplexos entre o anticorpo e os determinantes antigênicos específicos; e
c) a separação dos imunocomplexos duma mistura. Outros aspectos da presente invenção tornar-se-
-ão evidentes apôs referência à descrição detalhada, seguinte e aos desenhos, apensos.
Breve descrição dos desenhos
A figura 1 representa a origem de inserções LAV em PENV-3.
/
A figura 2 representa a sequência de aminoácidos de ENV-3.
A melhor forma para realizar a presente invenção
Antes de se descrever a presente invenção pode ser útil para a sua compreensão descrever definições de certos termos que aqui se irão utilizar.
Vírus associado a Dinfadenopatia (1AV) : um retrovírus linfotrópico-T humano. Relativamente à presente invenção considera-se que um vírus é o mesmo ou um equivalente a LAV-se substancialmente preenche os seguintes critérios:
(a) o vírus apresenta tropismo para linfócitos-T, especialmente para células auxiliares T (CD4+, cie acordo com a nomenclatura internacional definida por Bernard et al., eds., Leucocyte Typing, New York: Springer Verlag (1984));
(b) o vírus é citopático para células CD4+ infectadas (mais do que para células transformadas que são HTLV-I e II);
(c) o vírus codifica uma DNA polímerase depen-
2+ dente de RNA (transcriptase inversa) que é dependente de ?iíg (concentração óptima 5 mM, pH óptimo 7,8 não inibido pela actinomicina D) e que pode utilizar (dT )^2-18 coino um iniciador para a transcrição inversa do seu 3' 1TR;
(d) o vírus associa-se num gradiente de sucrose para uma densidade aproximadamente de 1,16;
(e) o vírus pode ser marcado com (¾) uridina;
(f) o vírus é distinto, por meio de critérios de sequência nucleotídica imunológicos, dos restantes membros ϊ
- 7 f w da família dos vírus HTLV-I/II (por meio deste critério o vírus HTLV-III não é considerado um membro da família de
HTLV-I/II);
(g) o vírus possui substancialmente reactividade imunológicamente cruzada com proteínas que codificam as regiões gag e env de LAV; e (h) o vírus partilha uma homologia nucleotídica substancial (78-100%) e homologia de sequência de aminoácidos (90-100%) com LAV.
Subcomité de Retrovírus Humanos do comité internacional da Taxonomia de Vírus recomendou a designação de vírus de imunodeficiência humana(HIV) (Science 232 : 697 (1986)). Portanto, para efeito da presente invenção, são considerados como equivalentes LAV/HTLV-III e HIV.
De acordo com a presente invenção, é proporcionada uma nova célula híbrida para reconhecimento específico de proteínas e precursores proteínicos de vírus de imunodeficiência humana, LAV/HTLV-III. As células possuem um cromossoma identificável em que o DNA do germe possui um re-arranjo para codificar um anticorpo que tem um sítio de ligação para um epitope comum a alguns ou a todos os isolados clínicos de vírus de imunodeficiência humana mas que não se encontrem em outros retrovírus tais como HTLV-I e HTLV-II. Esses anticorpos monoclonais humanos podem ser utilizados numa gran de variedade de vias que incluem a diagnose e a terapêutica.
A preparação de anticorpos monoclonais pode ser realizada por meio da imortalizaçao da expressão de sequências de ácidos nucleicos que codificam anticorpos específicos para o epitope ou antigénios de LAV/HTLV-III. Tipi/
- 8 ί * camente, os anticorpos monoclonais são produzidos por meio da transformação por vírus Epstein-Barr derivados de células (EBV) de células linf ocí&as-B obtidas de dadores humanos que estiveram em contacto com LAV/HTLV-III. As linhas de células que segregam anticorpos produzidos deste modo sao caracterizadas por um desenvolvimento contínuo de células linfoblastóides que possuem um cariotipo diplóide, são positivas ao antigénio nuclear Epstein-Barr e segregam anticorpos monoclonais de qualquer dos isotipos IgG, IgM, IgA ou IgD que inclui vários subtipos tais como IgGl, IgG2, IgG 3 e IgG4. 0 processo de trensfcrmação ccndizíâo porlcélulasestá descrito em dea talhe na patente de invenção norte-americana n9 4 464 465 que se incorpora aqui como referência. Os anticorpos monoclonais podem ser utilizados intactos ou sob a forma de fragmentos tais como ?ν, Fab, Fíab’^, mas de um modo geral utiliz-am-se intactos.
Alternativamente as linhas de células que produzem anticorpos podem ser produzidas por meio duma fusão de células entre células de mieiorna humano marcado com um fármaco apropriado, mieloma de murganho ou células linfoblasto'ides humanas com linfócitos-B humanos, para se obter linhas de células híbridas humanas.
A linha de células da presente invenção tem outras utilidades sem ser dirigir a produção de anticorpos monoclonais humanos, a linha de células pode ser fundida com outras células, tais como células de mieloma humano marcadas por um fármaco apropriado, células de mieloma de murganho ou células linfoblastóides humanas, para produzirem hibridomas e deste modo proporcionarem a transferência de genes que co- 9 dificam anticorpos monoclonais. De modo alternativo a linha de células pode ser utilizada como fonte de cromossomas que codificam imunoglobulina.^ que podem ser replicados e transferidos para células por meio de outras técnicas diferentes da fusão. Além disso os genes que codificam anticorpos monoclonais podem ser replicados e utilizados de acordo com técnicas de recombinação de DNA para a produção de imunoglobulinas específicas numa variedade de hospedeiros. Particularmente por meio de preparaçao de bibliotecas de cDNA, a partir de RNA mensageiro, um clone de DNA simples que se codifica para a imunoglobulina e isento de intrões pode ser replicado e colocado no vector de expressão apropriado procariótico ou eucariótico e subsequentemente transformado num hospedeiro para ultimar a produção em série.
As linhss de células linfoblastóides ou híbridas podem ser clonadas e sondadas de acordo com técnicas convencionais e detectados anticorpos nos sobrenadantes celulares que são capazes de se ligarem com proteínas de vírus LAV/ /HTLV-III, proteínas de fusão recombinante ou péptidos sintéticos. As linhas de células híbridas apropriadas podem em seguida ser ampliadas in vitro ou injectadas numa cavidade peritoneal de um hospedeiro apropriado para produzirem líquido ascítico. Devido a possuírem um anticorpo da presente invenção, que se sabe ser específico para vírus LAV/HTLV-III os sobrenadantes podem ser sondados por meio de um ensaio de oposição numa concorrência com os anticorpos monoclonais restritos.
Deste modo, as linhas de células híbridas podem ser produzidas rapidamente a partir duma variedade de ori- 10 / gens fundamentadas na acessibilidade dos presentes anticorpos específicos para um antigénio especial.
Os anticoroos monoclonais da presente invenção são particularmente úteis pela sua especificidade para gp41, proteinas de fusão expressas e antigénios sintéticos da região envolvente de LAV/HTLV-III.
Os anticorpos monoclonais podem ainda encontrar uma grande variedade de utilização in vitro. Por exemplo, os anticorpos monoclonais podem ser utilizados em ensaios de imunofluorescência indirecta para se verificar se está presente numa cultura de linfócitos infectada. Proteínas virais ou fracções de proteínas virais podem ser removidas de preparações purificadas de vírus desintegrados ou de misturas complexas constituídas por estas proteínas.
Estas proteínas virais específicas podem ser removidas por ligação dos anticorpos xmonoclonais a um material de suporte tal como tubos poliméricos, partículas esféricas, partículas de polissacáridos e equivalentes. Os métodos para a ligação são muito conhecidos da técnica, ver por exemplo Schall e Tenoso, Immunoassays ·. Clinicai Laboratory Techniques for the 1980's: 127 (1980) Alan R. Liss Inc. As mièturas são combinadas com o anticorpo imobilizado sob condições que permitem a ocorrência da ligação. Os complexos de imunidade são separados da restante mistura por métodos para o suporte. Estes métodos são métodos convencionais conhecidos, As proteínas virais isoladas podem ser libertadas em seguida do anticorpo por utilização de condições desfavoráveis à formação de imunocomplexos.
Para fim de diagnósticos, anticorpos monoclo- 11 nais podem ser eventualmente marcados. Tipicamente, os ensaios diagnóstico abrangem a detecção da formação dum complexo através da ligação do anticorpo monoclonal com um antigénio LAV/HTLV-III. Quando nao estão marcados os anticorpos podem ser utilizados em ensaios de aglutinação. Além disso, anticorpos não marcados podem ser utilizados em associação com outros anticorpos marcados (anticorpos secundários) que são reactivos com o anticorpo monoclonal tais como anticorpos específicos imunoglobulinas. Alternativamente, os anticorpos monoclonais podem ser marcados directamente. Podem-se utilizar uma grande variedade de marcadores tais como radionucleótidos, agentes fluorescentes, enzimas, substratos de enzimas, co-factores de enzimas, inibidores de enzimas, ligandos (particularmente haptenos), etc. Existem inúmeras variedades de imunoensaios e, por exemplo, alguns incluem os que estão descritos nas patentes de invenção norte-americana n$s 3 817 827; 3 850 752; 3 901 654; 3 935 074; 3 984 533; 3 996 345; 4 034 074 e 4 098 876 que aqui se incorporam todos como referências.
Usualmente os anticorpos monoclonais da presente invenção, são utilizados nos imunoensaios ligados a enzima, onde os referidos anticorpos, ou anticorpos secundários de uma espécie diferente, são ligados com uma enzima quando uma amostra biológica contendo antigénios LAV/HTLV-III, tais como soro de sangue humano ou sobrenadantes de culturas de células de vírus, está associada com os referidos anticorpos, a ligação ocorre entre anticorpos e aquelas moléculas que exibem o epitope desejado. Tais proteínas ou partículas virais podem em seguida ser separadas dos reagentes não liga- 12
dos e ser adicionado um anticorpo secundário marcado com uma enzima. Por conseguinte pode ser determinada a presença do complexo anticorpo-enzima especifieamente ligado ao antigénio. Também podem ser utilizadas outras técnicas convencionais conhecidas dos técnicos nesta matéria.
Também podem ser fornecidos conjuntos para serem utilizados na detecção de infecção por LAV/HTLV-III ou para a presença de antigénio LAV/HTLV-III. Assim a composição do anticorpo monoclonal referido, da presente invenção, pode ser fornecida, usualmente numa forma liofilizada, quer isoladamente, quer em conjunto com anticorpos específicos para outros epitopes de LAV/HTLV-III. Os anticorpos que podem estar ou não ligados com um marcador são incluídos com agentes tampão, tais como tris, fosfato, carbonato etc., agentes estabilizantes, biocidas, proteínas inertes, por exemplo albulina de soro bovino ou equivalentes. Geralmente estes materiais estarão presentes em quantidade inferior a 5% em peso, relacionado com a quantidade de anticorpo activo e usu?.lmente uma quantidade total de pelo menos 0,001$ em peso, relacionado ainda com a concentração de anticorpo. Frequentemente será adequado incluir uma carga inerte ou um excipiente para diluir os ingredientes activos esteando esse excipiente presente em cerca de 1$ a 99$ em peso da composição total. Quando se utiliza um anticorpo secundário capaz de se ligar com o anticorpo monoclonal, este geralmente é incluído numa ampola em separado. 0 anticorpo secundário está tipicamente conjugado com um marcador e apresentado de uma forma análoga às formulações dos anticorpos descritas antes.
Como se referiu antes, a detecção de antigénios é utilizável no diagnóstico de infecção presente provocada por vírus 1AV/HTLV-III. A presença do vírus pode ser realizada em várias amostras biológicas. As amostras biológicas podem ser constituídas por soro sanguíneo, saliva, se'men, amostras de biópsia de tecidos (cérebro, pele, nódulos de tecido linfático, baço, etc.), sobrenadantes de culturas celulares, vírus desintegrados, sistemas de expressão bacterianos e outros, mas não estão limitados a estas. A presença de vírus é verificada por meio de incubação de anticorpo monoclonal humano conjuntamente com a amostra biológica, sob condições que conduzem à formação de imunocomplexos seguida da detecção do complexo formado. Num outro aspecto, a‘formação do complexo é detectada através da utilização de um anticorpo secundário capaz de se ligar com um anticorpo monoclonal que, tipicamente, está conjugado com um marcador e formulado de modo análogo às formulações de anticorpo descritas antes.
Os técnicos nesta matéria sabem que os anticorpos monoclonais da presente invenção também poderão encontrar utilidade por várias vias adicionais, tais como cromatograf ia de afinidade, purificação de vários antigénios de LAV/EíTLV-III de ocorrência natural, assim como expressados por sistemas de expressão diversos (isto é, E. coli, vacina, células de ovários, hamster chinês e outras), reagentes de coloração histológica e equivalentes. Vêr, geralmente, Immunological Methods, Vols I e II, Eds. Lefkovits, I e Pernis, V., Academic. Press, New York (1979 e 1981); e Handbook of Experimental Immunology, Ed. tfeir, D., Slackwell Scientific Publications, St. Louis, LIO (1978), que se incorporam aqui como referências.
- 14 / *
Para terapêutica são úteis os anticorpos com propriedades biológicas adequadas para agentes terapêuticos. Alternativamente os anticorpos podem-se ligar a uma tóxina, para formar uma imunotóxina ou com material radioactivo ou fármaco constituindo um medicamento radioactivo ou um medicamento. Os métodos para a preparação de imunotóxinas e radiornedicamentos de anticorpos são métodos bem conhecidos (ver por exemplo, Câncer Treatment Reports 68 í 317 (1984)). Os anticorpos conjugados sao misturados com veículos compatíveis do ponto de vista fisiológico, tais como água estéril, soro fisiológico, soro fisiológico tamponado. Mas podem também utilizar-se agentes adjuvantes tais como o hidróxido de alumínio.
Outros aspectos e vantagens da presente invenção tornar-se-ão evidentes a partir das descrições de experiências que se seguem, uma vez que descrevem a presente invenção através do exemplo. Este exemplo é proporcionado para esclarecimento e não para limitação da presente invenção.
Exemplo
Este exemplo demonstra métodos para a produção de anticorpos monoclonais humanos, que reagem com proteínas de vírus de LAV e para a caracterização destes anticorpos através da utilização de pêptidos sintéticos e proteínas de fusão expressas por bactérias, em imunoensaios ligados a enenzimas e imunomarcações.
Como fonte de células B humanas utiliza-se uma amostra de sangue periférico obtida a partir de um dador de sangue SIDA-positivo, em estado de saúde. As células mononucleares separam-se do sangue por técnicas de centrifugação /
f
convencionais em Eicoll-Paque e lavam-se duas vezes com solução de fluoreto de sódio tamponada com fosfato, isenta de c.ílcio-magnésio (PBS).
Utilizando-se um processo de ”E-rosetting” modificado esvaziaram-se as células mononucleares das células T. Hdpidamente faz-se de novo a suspensão das células numa concentração de 1 x 10 células por mililitro.' (células/ml) de PBS contendo 20$ de soro fetal de vitela (PCS) à temperatura de 4°C. Em seguida, colocou-se um mililitro desta suspensão num tubo de fundo redondo de poliestireno de 17 por 100 mm g a que se adicionou 1 x 10 de glóbulos vermelhos de carneiro, tratados com brometo de 2-amino-isotioronio proveniente de uma solução a 10$ (v/v) de meio de Iscove modificado por Dulbecco (meio de Iscove). A suspensão foi misturada muito cuidadosamente durante 5/10 minutos à temperatura de 4°G e as células provenientes do processo de E-rosetting” foram, em seguida, removidas por centrifugação em meio Ficoll-Paque durante oito minutos a 2500 x g, à temperatura de 4°C. Recolheram-se as células mononucleares de sangue periférico negativas de E-rosetãd (E-PBMC) ligadas na interfase e lavaram-se uma vez com meio de Iscove e fez-se de novo a suspensão no mesmo meio contendo 15$ (v/v) de PCS, L-glutamina (2 mmol/1), penicilina (100 Ul/ml), estreptomicina (100 /ug/ml), hipoxantina (1 x 10-Sl), aminopterina (4 x 10-¾ e timidina (1,6 x 10-¾). Este meio será aqui posteriormente referido como meio HAT.
A transformação orientada por células de E-PBLIC foi realizada por co-culturas destas células com uma linha de células transformante. A linha de células transformante /
era uma linha de células linfoblastóides humanas, positivas ao antigénio nuclear Epstein-Barr (EBNA), derivada de uma linha de células linfoblastóides 1500 (GM) submetidas a mutagénese por metano-sulfonato de etilo (E?£S) seguida de selecção na presença de 30 jug/ml de 6-tioguanina para tornar as células deficientes em hipoxantina-guanina-fosforibosil-trans. ferase (HGPRT) e portanto sensíveis ao meio HAT. Esta linha de células é designada por linha de células 1A2 e foi depositada na American Type Culture Collection (A.T.C.C.) em 29 de Março de 1982 sob o número da A.T.C.C. de registo CBL 8119. Fez-se a suspensão das 1A2 na fase de crescimento logarítmico em meio HAT e em seguida combinaram-se com E”PBMC. A mistura de células foi plaqueada em oito placas microtituladoras com noventa e seis cavidades de fundo redondo (Costar 3799), a uma concentração de 72.000 células por cavidade, num volume de 200 p.1 por cavidade e incubadas à temperatura de 37°C numa atmosfera humidificada contendo 6$ de dióxido de carbono. As culturas foram alimentadas durante cinco dias e, após oito dias de plaqueamento, substituiu-se metade do sobrenadante com meio HAT recente. As cavidades foram observadas em cada um dos outros dias, num microscópio de inversão para se assinalar a proliferação de células. Catorze dias após o plaqueamento observou-se que 100$ das cavidades continham células em proliferação e, portanto no dia vinte e um, a maior parte das cavidades continha células com uma densidade suficiente para se removerem e ensaiar os sobrenacLantes para a presença de anticorpo anti-LAV.
As fracções sobrenadantes foram sondadas para a presença de anticorpo anti-LAV por meio de uma técnica padrão
ELISA.
Rapidamente cobriram-se placas de Immulon II com vírus totais desagregados em tampão de carbonato-hidrogeno a pH 9,6 e incubaram-se durante a noite à temperatura de 4°C. Lavaram-se com solução de cloreto de sódio tamponada com fosfato a 0,05% θ Tween 20 (PBS-Tween) e, em seguida, marcaram-se em Blotto (PBS), pH 7,2, contendo 5% p/v de leite em pó não gordo 0,01% de anti-espuma A Sigma v/v e Timerosal 0,01% p/v, durante 60 minutos, à temperatura ambiente. A seguir as placas foram lavadas três vezes com PBS-Tween e deixadas a secar. As fracções sobrenadantes das cavidades com clones desenvolvidos foram adicionadas às placas marcadas revestidas e em seguida incubadas à temperatura de 37°C durante 45 minutos seguida, ainda, de lavagem por três vezes com PBS-Tween. Adicionou-se, na proporção de 10 jul/cavidade, anti-IgG humano marcado com peroxidase desenvolvido na cabra na diluição 1 : 2 000 em PBS-Tween (Antibodies Inc.). A incubação durou 45 minutos à temperatura de 37°C seguida de lavagem, como se referiu antes. Adicionaram-se às placas substrato de enzima 0-fenilenodiamina e peróxido de hidrogénio e incubaram-se durante 30 minutos à temperatura ambiente, na ausência da luz. A reacção foi detida com HgSO^, 3N e quantificada utilizando-se um leitor de microplacas automático.
A análise dos sobrenadantes da cultura conduziu à identificação de uma cavidade (LT1/41-H1) que continha anticorpos. anti-LAV. Esta fracção sobrenadante foi em seguida caracterizada por imunoraarcação, imunoprecipitação e ELISA com proteínas de fusão. Os anticorpos deste clone foram determinados como sendo reactivos com gp41 por meio de marcação /
- 13 e ENV-3, péptido 39 ® péptido 79 por meio de ELISA. A linha de células LT1/41-H1 foi depositada na ATCC sob o número de acesso CRL-9128.
Estes antigénios são importantes porque são da região de LAV/HTLV-III que é consistentemente reconhecida pelo soro dos dadores de anticorpos positivos e está presente através do desenvolvimento da doença (Sarngadharan et al., Science 224 : 506 (1984); Safai et al., Lancet 1984-1, 1438 (1984)).
I A proteína ENV-3 é uma proteína de fusão expres.
sa bacteriologicamente por pENV-3 (ATCC, n9 de acesso 53072) que é a região de LAv de 7178 a 7698 pares de bases (numeração de acordo com Wain-Hobson et al., Cell 44 : 9 (1985) figuras 1 e 2).
péptido 39 é um polipéptido sintético definido como a região que codifica do par de bases 7516 até ao par de bases 7593 θ que possui a sequência dos aminoácidos seguinte, onde os oligopéptidos incluídos na sequência seguinte incluirão epitopes lineares na tal sequência:
arg-ile-leu-ala-val-glu-ahg-tyh-leu-lysASP-GLN-GLN-LEU-LEU-GLY-ILE-TRP-GLY-CYS SER-GLY-LYS-LEU-ILE-CYS-X, na qual X representa o grupo OH ou NHg.
Quadro 1 representa uma comparação do péptido 39 com. lisado de vírus total no ensaio de ELISA para a detecção de anti-corpos para LAV/HTLV-III.
f
- 19 QUADRO 1
COMPARAÇÃO DE UM PÉPTIDO 39 COM LIoADO DE VÍRUS TOTAIS NUM
ENSAIO ELISA PARA A DETECÇÃO DE ANTICORPOS PARA LAV
ELISA Utilizando
Positiva Lisado de Vírus Seropositivo (2)
| Soro | Diagnose Total (1) | Qonf.irmados (2) | Pe'D.39 | |
| 155 | LAS3 e/ou homossexual | 1,069 | sim | 1,167 |
| 124 | LAS e/ou homossexual | 1,189 | sim | 1,073 |
| 138 | LAS e/ou homossexual | 1,302 | sim | 0,514 |
| 133 | LAS e/ou homossexual | 1,250 | sim | 1,036 |
| 134 | LAS e/ou homossexual | 1,050 | sim | 1,691 |
| 153 | LAS e/ou homossexual | 2,000 | sim | 1,314 |
| 157 | LAS e/ou homossexual | 1,349 | sim | 1,326 |
| Y-l/ | LAS e/ou homossexual | 2,000 | sim | 1,305 |
| 501 | LAS e/ou homossexual | 1,109 | sim | 1,167 |
| 1892 | heterossexual saudável | n.d. | n.d.4 | 0,045 |
| 639 | heterossexual | 0,123 | não | 0,038 |
saudável seropositivo i /
Preparado como descrito no pedido de paten te de invenção número de série 83/248OO registado em 15 de Setembro de 1983.
Os antigénios LAV radiomarcados foram desagregados em tampão RIPA (Gilead et al., Nature (1976) 264 : 263) e em seguida feitos reagir com soro humano. Os complexos de imunidade resultantes foram separados por meio de ligação a Staplylococcus aureus a doentes (Kessler J. Immunology (1975) 155 í 1617) seguida de lavagens múltiplas. Os antigénios imunoprecipitados foram analisados por meio de electroforese sobre gel de poliacrilamida-SDS (Laemmli, Nature (1970) 227 : 680) seguido por fluorografia. A presença quer de um p25 ou gp43 foi considerada necessariamente como suficiente para confirmar uma amostra como seropositivo.
LAS » Síndrome de linfadenopatia (SLA)
N.D. ss não determinado.
péptido 79 definiu-se como a região que codifica desde cerca do par de bases 7543 até 7593 e que inclui qualquer oligopéptido que codifica para epitopes lineares com a seguinte sequência de aminoácidos:
Y-LYS -ASP-GL N-GL N-LEU-LEU-GLY-ILE-TRP-GLYCYS-SER-GLY-LYS-LEU-ILE-CYS-X, na qual X representa um grupo OH ou NHg e Y representa TYR ou CYS.
quadro 2 descreve os resultados de um ensaio ELISA para a detecção de anticorpos para LAV/HTLV-III utilizando 0 péptido 79.
QUADRO 2
PÊPTIDO 79 NUM ENSAIO ELISA PARA A DETECÇÃO
DE ANTICORPOS PARA LAV
Seropositivos
Serum No.Confirmados 79
| 127 | sim | 2,346 |
| 130 | sim | 1,8θ8 |
| 124 | sim | 1,086 |
| 125 | sim | 2,266 |
| 128 | sim | 1,144 |
| 134 | sim | 1,316 |
| 135 | sim | ,381 |
| 153 | sim | 1,039 |
| 154 | sim | ND |
| 155 | sim | 1,584 |
| 157 | sim | 1,162 |
| 120 | sim | 1,546 |
| 121 | sim | 2,084 |
| 132 | sim | 1., 386 |
| 138 | sim | ,312 |
| 133 | sim | ,597 |
| 131 | sim | 1,150 |
| 501 | sim | 1,768 |
| 129 | sim | ,562 |
| Y1 | sim | ND |
| N3 | não | ,224 |
| NI 2 | não | ,174 |
| N4 | não | ,172 |
| 639 | não | ,153 |
| 641 | não | ,140 |
| NI 3 | não | ,226 |
| N14 | não | ,162 |
| NI 6 | não | _____,.183. |
| Corte Pracção de amostras seropositivos confirmados, | 0,30 detectadas |
como positivas.
Marcação de Western
A caracterização por meio de um ensaio de ”imunomarcação de Western” foi realizada em fracções sobrenadantes de clones utilizando-se vírus LAV purificados e proteínas de fusão recombinantes como antigénios. Estes antigénios foram primeiro separados por meio de electroforese em gel gra diente (7,0 - 15,0$) e transferidos por meio de electroforese para membranas de nitrocelulose (NCM) durante quatro horas, a 25V, em fosfato de sódio 25m?í de pH 7,0. Após transferência as NC1T foram bloqueadas em PBS-Tween durante^una :hoía‘rà. tampe ratura ambiente. As NCM foram incubadas com anti-IgG humano marcado com peroxidase de rábano desenvolvido na cabra diluídas em PBS-Tween, durante uma hora à temperatura de 4°C. Em seguida, fez-se uma lavagem com PBS-Tween e depois imergiu-se numa solução, para desenvolvimento de coloração, de peroxidase de rábano (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) durante vinte minutos. A reacção foi detida por meio de imersão em água desionizada. Comparou-se a reactivid^de dos anticorpos monoclonais a uma reacção dum soro positivo padrão com vírus desagregados purificados como um controlo positivo.
Imuno prec ipitação
Extracto de vírus para precipitação por radioimunoensaio foram preparados a partir de células CEM (ATCC n^ CCL119) infectadas com uma réplica LAV 1 de LAV/HTLV-III adaptada a crescimento líquido por meio de passagem contínua em culturas de tecidos. Quando o efeito citopático precoce
- 23 7<
era evidente, as células foram transferidas para meio de mareagem que continha metionina (50 ^iCi/ml) ou ^/^Z-glucosamina (25 juCi/ml) e, em seguida, incubadas, durante vinte e quatro horas, até que a maior parte das células estivessem lisadas para libertar os vírus na fraeçao sobrenadante da cul tura. Os vírus foram reunidos (uma hora a 100.000 x g) a partir da fraeção sobrenadante da cultura isenta de células e prepararam-se extractos detergentes em tampão R-.RIPA (tampão de cloreto de sódio tamponado com fosfato contendo 1% de Triton x-100, 1% de ácido desoxícólico, 0,1% de SDS e 1% de aprotinina). Extractos idênticos foram preparados a partir de células nao infectadas após lavagem uma vez com PBS. Realizaram-se os ensaios de imunoprecipitação com volume de extracto de 100 >U1 incubado com sobrenadante de cultura durante uma hora sobre gelo. Em cada tubo adicionou-se 100 ,ul de imunoprecipitina; BRL, fez-se de novo a suspensão em P-RIPA, con tendo 0,1% de ovalbumina e incubaram-se durante mais trinta minutos. Os complexos ligados foram lavados e separados por meio de SDS-PAGE (gel gradiente 7,0 - 15,0%). A seguir à electrofirese, as células foram fixadas e mergulhadas em Enhace (NEN) secos expostos a um filme Kodak EX-5.
Pez-se reagir um soro positivo de referência que imunoprecipitou todas as proteínas virais de LAV/HTLV-III com extracto marcado com metionina como um controlo positivo e um controlo negativo.
Imunoensaio ligado a enzima anticorpo LT1/41-H1 foi ainda caracterizado por meio de ELISA. Em substituição de vírus completos desa-
gregados como antigénio, utilizaram-se, nos métodos descritos antes, proteínas de fusão exoressas bacteriologicamente e péptidos sintéticos.
Enasaio de imunofluorescência indirecta
3ealizaram-se ensaios de imunofluorescência indirecta com células fixadas em acetona e células vivas. As tiras fixadas com acetona foram preparadas a partir de células CEM infectadas com LAV que foram incubadas com sobrenadante de cultura, durante uma hora à temperatura de 37°C enquanto as células vivas foram incubadas com sobrenadante de cultura durante uma hora, à temperatura de 4°C antes de serem colocadas em placas e fixadas. Em ambos os métodos foram detectadas as células reactivas com anti-IgG humano marcado com isotiocianato de fluoresceína (Antibodies Inc«).
Os ensaios de neutralização foram realizados em anticorpos monoclonais por mero de uma série de diluição de vírus em 100 jul de sobrenadante de anticorpos ou soro de con trolo. Um conjunto de diluições a 1 í 5 de vírus por preparado utilizando-se uma placa microtituladora com noventa e seis cavidades. Testados com anticorpo LT1/41-H1 foram inactivados por calor soro seropositivo LAV, com actividade de neutralização conhecida (diluição num meio 1 : 10), soro humano normal (diluição em meio a 1 : 10), sobrenadante de uma linha de células produtoras anticorpos monoclonais irrelevantes e meio de controlo. Antes de serem utilizadas estas preparações foram filtradas com um filtro de 0,45 /1. Para iniciar as diluições em série utilizou-se cultura de tecido com uma concentração em vírus de aproximadamente 2,5 x 10^ (TCID). Os
anticorpos e os vírus foram incubados durante uma hora, à tem peratura de 37°C. Uma segunda placa com 96 cavidades foi preparada com células CEM-F colocadas numa placa numa proporção de 1 x 10 células por cavidade em 150 jal e, em seguida, inoculadas com 50 /il por cavidade (cerca de 1 x ÍO^- de TCID na primeira coluna) de uma mistura de vírus-anticorpos. A segunda placa foi então incubada à temperatura de 37°C, durante 24 a 48 horas, altura em que se removeu o sobrenadante. Adicionou-se meio fresco (200 /11) e a placa foi incubada durante mais sete a catorze dias com reposição de meio cada vinte e quatro a quarenta e oito horas. As células foram colhidas nos dias sete, dez e catorze e ensaiadas para a expressão do vírus por meio de imunofluorescência.
A clonagem das células produtoras de anticorpos específicos das cavidades LT1/41-H1, foi realizada submetendo as células a vários ciclos de clonagem de diluição limitante, até que todas as fracçoes sobrenadantes clonais, analisadas pelos métodos referidos antes, resultassem em anticorpos capa zes de imunomarcar e imuno-precipitar gp41 e fornecerem reacções positivas com pENV-3, pêptido 39 e pêptido 79, por meio de ELISA. Durante a clonagem utilizaram-se células alimentadas como se referiu antes para a sub-cultura. A linha de células humanas transformada clonada obtida por estes meios era uma linha de células contínua (imortal) a qual segrega um anticorpo. monoclonal humano com as características referidas an tes. Neste exemplo, a linha de células e o anticorpo que ela produz são designados do mesmo modo.
Realizou-se a neutralização por um método alternado. Utilizou-se sobrenadante de cultura numa concentração de f
- 26 cinco vezes, com um Amicon-Centricon micro-concentrador ou não concentrado. Uma série de diluições foi realizada com a diluição inicial de 1 : 5 seguida de uma série cie diluições, de duas vezes, utilizando-se 25 jul de sobrenadante de cultura concentrada ou não concentrada diluída num meio (RPiU 1640, soro de vitela fetal a 15%, soro humano inactivado pelo calor a 40%). As séries assim realizadas adicionou-se vírus (1 x 10^ - 1 x 10^ unidades infecciosas de cultura de tecido/ /ml) diluídos cem meio, 1 : 400 ou 1 : 600 num volume total de 50/11. As amostras foram incubadas durante quarenta e cinco minutos à temperatura de 37°C numa câmara humidificada.
A infectividade foi ensaiada por meio da capacidade do vírus tratado para infectar células MT-2, uma linha de células que transporta HTLV-I, susceptível à infecção por LAV/HTLV-III. As células MT-2 foram colocadas em placas de 96 cavidades de fundo plano Costar, a uma concentração de 1 x 10^ células por 100 /11 de meio por cavidade. A olaca foi incubada durante quarenta e cinco minutos à temperatura de 37°C e em seguida adicionada com 20 /11 de vírus, tratado em cada cavidade. Após cinco a sete dias as células MT-2 foram examinadas para a formação de sincícios que indicavam a infecção por LAV/HTLV-III.
Claims (25)
1. - Anticorpo monoclonal humano, caracterizado pelo facto de ser capaz de reagir com um determinante antigénico de LAV/HTVL-III e de bloquear a ligação de um anticorpo produzido pela linha de células LT1/41-H1, com o referido determinante antigénico.
2. - Anticorpo monoclonal humano, caracterizado pelo facto de ligar um epitope ao invólucro da glicoproteína gp*+l.
3. - Anticorpo monoclonal humano de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de o epitope ser caracterizado por o pêptido codificado por pENV-3.
*+.- Anticorpo monoclonal humano de acordo com a reivindica-28- ção 2, caracterizado pelo facto de o epítope ser definido pelo péptido 39.
5. - Anticorpo monoclonal humano de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de o epítope ser definido pelo pe£ | tido 79.
6. - Linha de células imortalizada, caracterizada pelo facto de produzir um anticorpo monoclonal humano capaz de reagir com um determinante antigénico de LAV/HTLVlH e de ser um híbrido de lin fõcitos-B humanos capaz de produzir anticorpos para um .determinante antigénio de LAL/HTLV-III e de uma célula escolhida entre um grupo constituído por células de mieloma humano, células de mielom_a murino e células linfoblastoides humanas.
>
7. - Linhas de células imortalizada, caracterizada pelo facto de produzir um anticorpo monoclonal humano capaz de reagir com um determinante antigénico de LAV/HTLV-III e de incorporar células de linfõcitos-3 capaz de produzirem anticorpos para um determinante antigénico de LAV/HTLV-III, transformado com células transformadas de virus Epstein-Barr.
8. - Linha de células LT1/41-H1, caracterizado pelo facto de estar depositada na ATCC sob o numero de aceitação CRL 9128.
9. - Anticorpo monoclonal caracterizado pelo facto de ser pro duzido por uma linha de células de acordo com a reivindicação 8.
10. - Anticorpo monoclonal humano de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de ser marcado com um marcador capaz de fornecer um sinal detectãvel.
11. - Processo para a determinação da presença, em uma amostra bi.ologica, de LAV/HTLV-III, caracterizado pelo facto:
de se incubar um anticorpo monoclonal humano capaz de reagir com um determinante antigénico de LAV/HTLV-III e com uma amostra biológica; e de se detectar a presença de imunocomplexos formados en tre o referido anticorpo monoclonal e a referida amostra biológica e de se determinar deste modo a presença de LAV/HTLV-III.
12. - Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo facto de o referido anticorpo monoclonal impedir a ligação entre um anticorpo produzido pela linha de células LTl/ui-Hl e o re. ferido determinante antigénico.
13. - Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo facto de o anticorpo monoclonal ligar um epitope ao envÓlucro de glicoproteína gpbl.
/
14. - Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo facto de o anticorpo monoclonal ser produzido por uma linha de células LT1/41-H1.
15. - Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo facto de o anticorpo monoclonal ser um anticorpo marcado.
16. - Processo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo facto de o marcador referido ser escolhido entre um grupo constituído por radionucleótidos, compostos fluorescentes, enzimas, substratos enzimãticos, cofactores enzimãticos, inibidores de enzimas e ligandos.
17. - Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo facto de a fase de detecção consistir em uma reacção enzima tica,emissão de fluorescência ou de radioactividade, lise celular ou emissão de luminescência.
18. - Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo facto de a amostra biológica s_er escolhida entre um grupo constituído por secreções corporais, fluidos corporais e espécimes de tecidos.
19. - Processo para a preparação de uma composição farmacêuti ca, caracterizado pelo facto de se misturar uma quantidade terapêuf -31ticamente efectiva de um anticorpo monoclonal capaz de reagir com um determinante antigénico de LAV/HTLV-III e um veículo e/ou diluen te aceitável do ponto de vista fisiológico.
20. - Processo para a preparação de uma composição farmaceuti. ca de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo facto de o referido anticorpo monoclonal impedir a ligação de um anticorpo pro. duzido por uma linha de células LT1/41-H1 ao referido determinante antigenico.
21. - Processo para a preparação de uma composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo facto de o anticorpo monoclonal ligar um epitope ao invólucro de uma glicoproteína gp4-l.
I
22. - Processo para a preparação de uma composição farmaceuti ca de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo facto de o anticorpo monoclonal ser produzido por uma linha de células LT1/U1-Hl.
23.- Processo para separar determinantes antigénicos específicos de LAV/HTLV-III de interesse, a partir de uma mistura que con tém determinantes antigénicos de LAV/HTLV-III, da qual uma fracção contém os determinantes antigénicos específicos, caracterizado pelo facto:
de se imobilizar um anticorpo monoclonal capaz de reagir, em um substrato, com determinantes antigénicos específicos;
de se fazer contactar a mistura que contém os determinantes antigénicos de LAV/HTLV-III, sob certas condições, com o anticorpo imobilizado de tal modo que se formam imunocomplexos entre o anticorpo e os determinantes antigénicos específicos; e de se separar da mistura os imunocomplexos.
24.- Processo de acordo com a reivindicação 23, carac- terizado pelo facto de o anticorpo monoclonal impedir a ligação de um anticorpo, produzido por uma linha de células LT1/41-H1, ao referido determinante antigénico.
25.- Processo de acordo com a reivindicação 23, carac- terizado pelo facto de o anticorpo monoclonal ligar um epitope ao invólucro de uma glicoproteína gp41.
26.- Processo de acordo com a reivindicação 23, carac- terizado pelo facto de o anticorpo monoclonal ser produzido por uma linha de células LT1/41-H1.
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