JP2005034154A - 完全ヒト抗体の調製 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 抗原を認識する完全ヒト抗体を調製する方法であって、以下:
(a)未処置のヒトドナーから一群のリンパ球を提供する工程;
(b)インビトロで、該抗原を用いて該リンパ球を免疫する工程;
(c)該免疫されたリンパ球をヘテロミエローマ細胞株と融合して、トリオーマ細胞を形成する工程;
(d)該抗原を認識する抗体を産生するトリオーマ細胞を同定する工程;および
(e)工程(d)において同定された該トリオーマ細胞によって産生された該抗体を収集する工程、
を包含する、方法。
【選択図】 なし
Description
ヒト化モノクローナル抗体は、ウイルス疾患に対する治療目的で、首尾よく使用されている(非特許文献1参照)。これらの疾患は、伝統的に、感染性疾患(例えば、RSウイルス(RSV)による感染)である。しかし、最近、抗体は、多くの他の障害の治療において次第に使用されるようになっており、これらの障害としては、自己免疫障害および悪性腫瘍様転移性乳癌、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球白血病および急性骨髄性白血病が挙げられる(非特許文献1および非特許文献22を参照)。血管形成術の間の器官の拒絶または血液凝集に対する予防的な使用もまた、達成されている。
抗原を認識する完全ヒト抗体を調製する方法であって、以下:
(a)未処置のヒトドナーから一群のリンパ球を提供する工程;
(b)インビトロで、該抗原を用いて該リンパ球を免疫する工程;
(c)該免疫されたリンパ球をヘテロミエローマ細胞株と融合して、トリオーマ細胞を形成する工程;
(d)該抗原を認識する抗体を産生するトリオーマ細胞を同定する工程;および
(e)工程(d)において同定された該トリオーマ細胞によって産生された該抗体を収集する工程、
を包含する、方法。
項目1に記載の方法であって、工程(b)の前に、前記リンパ球から、CD8+細胞およびCD56+細胞を除去する工程をさらに包含する、方法。
項目1または2に記載の方法であって、工程(d)の前に、第2抗原を用いて、工程(c)の前記トリオーマ細胞をスクリーニングする工程、それによって、前記抗原および該第2抗原の両方を認識する抗体を産生する細胞を選択する工程、をさらに包含する、方法。
項目1〜3のいずれか一項に記載の方法であって、前記抗体が、約30nM以下のKdで前記抗原を認識する、方法。
項目1〜4のいずれか一項に記載の方法であって、前記抗体が、IgG抗体である、方法。
項目1〜5のいずれか一項に記載の方法であって、前記抗体が、IgG1抗体である、方法。
項目1〜6のいずれか一項に記載の方法であって、工程(d)の前記トリオーマ細胞が、細胞培養物中において、少なくとも約3ヶ月間、前記抗体を産生し得る、方法。
項目1〜7のいずれか一項に記載の方法であって、工程(d)の前記トリオーマ細胞が、細胞培養物中において、少なくとも約6ヶ月間、前記抗体を産生し得る、方法。
項目1〜8のいずれか一項に記載の方法であって、工程(d)の前記トリオーマ細胞が、細胞培養物中において、少なくとも約9ヶ月間、前記抗体を産生し得る、方法。
項目1〜9のいずれか一項に記載の方法であって、工程(d)の前記トリオーマ細胞が、細胞培養物中において、少なくとも約12ヶ月間、前記抗体を産生し得る、方法。
項目1〜10のいずれか一項に記載の方法であって、前記抗原が、HIV抗原である、方法。
項目11に記載の方法であって、前記抗原が、gp120由来である、方法。
項目12に記載の方法であって、前記抗原が、gp120のコレセプター結合領域を含む、方法。
項目1〜13のいずれか一項に記載の方法であって、前記抗原が、T−ヘルパー配列を含む、方法。
単離された完全ヒト抗体、またはその抗原結合フラグメントであって、該抗体が、HIVの少なくとも2つの株を認識する、抗体またはフラグメント。
項目15に記載の抗体またはフラグメントであって、HIVの少なくとも2つの株のgp120を認識する、抗体またはフラグメント。
項目16に記載の抗体またはフラグメントであって、gp120のコレセプター結合領域を認識する、抗体またはフラグメント。
項目15に記載の抗体またはフラグメントであって、配列番号2〜17からなる群より選択される、少なくとも2つの配列を認識する、抗体またはフラグメント。
項目15〜18のいずれか一項に記載の抗体またはフラグメントであって、前記抗体が、IgGである、抗体またはフラグメント。
項目15〜18のいずれか一項に記載の抗体またはフラグメントであって、前記抗体が、IgG1である、抗体またはフラグメント。
項目15〜20のいずれか一項に記載の抗体またはフラグメントを含む、組成物。
項目21に記載の組成物であって、薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤をさらに含む、組成物。
HIV感染を予防、処置、または改善するための方法であって、該方法が、有効量の項目21に記載の組成物を、それが必要な被験体に投与する工程を包含する、方法。
項目23に記載の方法であって、前記被験体が、AIDSに罹患している、方法。
少なくとも2つの異なる抗原を認識する完全ヒト抗体を調製する方法であって、以下:
(a)未処置のヒトドナーから一群のリンパ球を提供する工程;
(b)インビトロで、第1抗原を用いて該リンパ球を免疫する工程;
(c)該免疫されたリンパ球をヘテロミエローマ細胞株と融合して、トリオーマ細胞を形成する工程;
(d)該トリオーマ細胞を第2抗原を用いてスクリーニングして、該第1抗原および該第2抗原の両方を認識する抗体を産生する細胞を同定する工程;ならびに
(e)工程(d)において同定された該トリオーマ細胞によって産生された該抗体を収集する工程、
を包含する、方法。
項目25に記載の方法であって、前記第1抗原および前記第2抗原が、微生物由来である、方法。
項目25に記載の方法であって、前記第1抗原および前記第2抗原が、微生物の2つの異なる株由来である、方法。
項目27に記載の方法であって、前記微生物が、HIVである、方法。
項目28に記載の方法であって、前記第1抗原および前記第2抗原が、gp120由来である、方法。
抗原を用いてリンパ球のインビトロ免疫の効率を増加する方法であって、以下:
(a)リンパ球の集団を提供する工程;
(b)該集団からCD8+細胞およびCD56+細胞を除去する工程;ならびに
(c)インビトロで、該リンパ球の集団を該抗原と接触させる工程、
を包含する、方法。
項目30に記載の方法であって、前記CD8+細胞および前記CD56+細胞が、CD8およびCD56に特異的な磁気ビーズを使用することによって除去される、方法。
インビトロ細胞集団であって、以下:
(a)未処置のヒトドナーから末梢血単核細胞を提供する工程;
(b)該末梢血単核細胞からCD8+細胞およびCD56+細胞を除去する工程;ならびに
(c)インビトロで、工程(b)の該細胞を抗原と接触させて、該抗原を認識する抗体を該細胞により産生させる工程、
を包含する、方法によって調製されたインビトロ細胞集団。
抗体産生細胞であって、該抗体産生細胞が、項目32に記載の細胞集団をクローン条件下で培養し、そして前記抗原を認識する抗体を産生するクローンを単離することによって調製される、抗体産生細胞。
項目33に記載の抗体産生細胞であって、HIV gp120を認識する抗体を産生する、抗体産生細胞。
項目34に記載の抗体産生細胞であって、HIVの異なる株由来の少なくとも2つのgp120分子を認識する抗体を産生する、抗体産生細胞。
HIV感染を予防、処置、または改善することが必要な被験体において、HIV感染を予防、処置、または改善するための、項目21に記載の組成物。
項目36に記載の組成物であって、前記被験体が、AIDSに罹患している、組成物。
本発明は、予め決定された抗原を、この抗原にすでに曝露されたヒトドナーに依存せずに認識する、完全ヒト抗体を調製する方法を提供する。この目的で、ネイティブなヒトドナー由来のリンパ球が、インビトロで、目的の抗原に接触され、そしてこの抗原に対する抗体を産生する細胞が同定される。リンパ球は、インビボではなくインビトロで免疫されるので、どの抗原、または抗原のどの部分が、この抗体によって認識されるかを制御することが可能である。従って、この方法は、生命を脅かす微生物に対する抗体の調製において、特に有用である。なぜなら、この方法は、生命を脅かす微生物で、ヒトは言うまでもなく、動物を免疫する必要がないからである。
(a)未処置の(naive)ヒトドナーから得られた、リンパ球の群を提供する工程;
(b)これらのリンパ球を、インビトロで、抗原で免疫する工程;
(c)免疫されたリンパ球を、ヘテロミエローマ細胞株と融合させて、トリオーマ細胞を形成する工程;
(d)抗原を認識する抗体を産生するトリオーマ細胞を同定する工程;および
(e)工程(d)において同定されたトリオーマ細胞から産生される抗体を収集する工程。
(a)ネイティブなヒトドナー由来のリンパ球の群を提供する工程;
(b)このリンパ球を、第1抗原で、インビトロで免疫する工程;
(c)免疫されたリンパ球を、ヘテロミエローマ細胞株と融合させて、トリオーマ細胞を形成する工程;
(d)このトリオーマ細胞を第2抗原でスクリーニングして、第1抗原と第2抗原との両方を認識する抗体を産生するトリオーマ細胞を同定する工程;および
(e)工程(d)において同定されたトリオーマ細胞によって産生された抗体を収集する工程。
(a)リンパ球の集団を提供する工程;
(b)この集団からCD8+細胞およびCD56+細胞を除去する工程;ならびに
(c)このリンパ球の集団をインビトロで抗原と接触させる工程。
(a)未処置のヒトドナー由来のリンパ球を提供する工程;
(b)このリンパ球からCD8+細胞およびCD56+細胞を取り除く工程;および、
(c)インビトロで工程(b)の細胞を抗原と接触させて、この抗原を認識する抗体を産生する細胞を得る工程。
本発明は、すでに抗原に曝されているヒトドナーに依存することなく、所定の抗原を認識する完全ヒト抗体を調製する方法を提供する。このために、未処置のヒトドナー由来のリンパ球が、インビトロで、目的の抗原で免疫され、この抗原に対する抗体を産生する細胞が、同定および選択される。このリンパ球は、インビボではなくインビトロで免疫されるので、どの抗原またはどの抗原の一部がその抗体によって認識されるのかを制御することが可能である。好ましい抗原は、HIVのgp120、特に、gp120のコレセプター結合領域である。
「完全ヒト抗体」は、排他的にヒト配列を含む抗体である。この抗体は、好ましくは、モノクローナル抗体である。
本発明は、ヒトを含めた任意の動物を免疫する必要なしに、完全ヒト抗体を調製するための方法を提供する。この抗体を作製するために、未処置のヒトドナー由来のリンパ球を、インビトロで目的の抗原と接触させる。次いで、免疫化リンパ球を、クローン条件下で培養し、そして所望の抗体を産生するクローンを同定する。抗体のクローニングおよび特徴付けを容易にするために、この免疫化細胞を、必要に応じて、EBVで感染し得る。あるいは、またはそれに加えて、この免疫化細胞をまた、長期にわたる安定な抗体産生のために、融合パートナー(特に、ヘテロミエローマ細胞株)に融合し得る。
本発明の別の局面は、本発明に従って調製された完全ヒト抗体を含む組成物を提供する。好ましくは、この抗体は、高い親和性でその抗原に結合する。Kdは、好ましくは約100nM以下、より好ましくは約30nM以下、さらにより好ましくは約10nM以下、なおさらに好ましくは約3nM以下、そして最も好ましくは約1nM以下である。特に、抗体は、少なくとも2つの関連する抗原(例えば、抗原性のバリエーションのみに起因して異なる微生物抗原、または同じ遺伝子の対立遺伝子によってコードされるタンパク質)を認識し得る。
hr=時間
min=分
sec=秒
μM=マイクロモル濃度
mM=ミリモル濃度
M=モル濃度
ml=ミリリットル
μl=マイクロリットル
mg=ミリグラム
μg=マイクログラム
Mab=モノクローナル抗体
huMab=ヒトモノクローナル抗体
DMEM=ダルベッコ改変イーグル培地
MEM=改変イーグル培地
PBS=リン酸緩衝化生理食塩水
HANKS=ハンクス平衡塩溶液
FBS=胎仔ウシ血清
HIV=ヒト免疫不全ウイルス
HTLV=ヒトT細胞白血病ウイルス
HCV=C型肝炎ウイルス
HBsAg=B型肝炎表面抗原
ALT=アラニントランスフェラーゼ
PBMC=末梢血単核細胞
LeuLeuOMe=L−ロイシル−L−ロイシンメチルエステル
(材料および方法)
(培養材料)
この開示において使用した培養培地は、他に示されない限り、1×非必須アミノ酸(Life Technologies,Grand Island,NY)、10%胎仔ウシ血清(FBS;Life Technologies)ならびに50mg/mlのゲンタマイシンおよびカナマイシン(China Chemical & Pharmaceutical,Taipei,Taiwan)を補充したRPMI−1640(HyQTM;HyClone,Logan,UT)であった。
HIV−1/2、HTLV−I/II、HCV、HBsAgついてネガティブスクリーニングされた、正常レベルのアラニントランスフェラーゼ(ALT)のを含む健康な血液ドナーからの軟膜を、Tainan Blood Center、Chinese Blood Services Foundation(Tainan,Taiwan)から入手した。末梢血単核細胞(PBMC)を、Ficoll−Paque(Amersham Bioscience AB,Uppsala,Sweden)での密度遠心分離(400×g)によって単離した。次いでこれらの細胞を、PBSで2回洗浄して、100×g遠心分離によって回収した。
PBMCを、まず、CD45RO MACSマイクロビーズ(Miltenyi Biotec,Auburn CA)で磁性標識し、次いでVarioMACS(Miltenyi Biotec)機器を用いて分離した。まとめると、細胞を、超常磁性MACSマイクロビーズで特異的に標識した。磁性標識後、これらの細胞を、強い永久磁石に置いた分離カラムに通した。磁化可能なカラムマトリクスは、高勾配磁場を作るように働いた。磁性標識した細胞をカラム内に保持し、通過した未標識細胞から分離した。磁場からカラムを取り出した後、保持された細胞を溶出した。溶出したCD45RO+細胞を、100×g遠心分離によって回収して、すぐに使用した。
CD45RO+T細胞を、1×非必須アミノ酸、10%ヒト血清、50mg/mlゲンタマイシン/カナマイシン、50mM 2−メルカプトエタノールおよび10mg/mlヤマゴボウマイトジェン(PWM;Sigma Chemicals)を補充したRPMI−1640中、2×106細胞/mlの密度で、組織培養フラスコ中で培養した。24時間のインキュベーション後、細胞を遠心分離して、そして400×g遠心分離によって除去した。最終的に、CD45RO+T細胞置換因子(すなわち、培地上清)を、培地上清を回収することによって調製し、0.45mmフィルタで濾過して、−20℃で凍結保存した。
細胞傷害性細胞集団(これは、インビトロでの免疫を阻害する)の除去を、L−ロイシル−L−ロイシンメチルエステル(LeuLeuOMe)処理または磁性細胞枯渇を使用することによって実行した。LeuLeuOMe処理を、以前に記載された(Ohlinら、1989;Chinら、1994;Chinら、1995)ように、PBMC(107細胞/ml)の懸濁液に、250mM L−ロイシル−L−ロイシンメチルエステルヒドロ−ブロミド(Sigma,St,Louis,MO)を添加することによって実行した。磁性枯渇を、上記の磁性細胞精製の節に記載したように、モノクローナル抗マウスCD8抗体および抗CD56抗体(Miltenyi Biotech)に結合体化されたコロイド超常磁性マイクロビーズを用いて実行した。
PBMC、特に細胞傷害性細胞枯渇PBMCを、2工程免疫プロトコルを使用して、インビトロで免疫した。一次免疫を、ペプチド抗原(TT−V3B(MN))10nM、50mM 2−メルカプトエタノール、10%熱不活化ヒト血清、0.05ng/ml rIL2(Calbiochem、San Diego、CA)および25%(v/v)T細胞置換因子を含む培地中で、6日間細胞をインキュベートすることによって実施した。7日目に、一次免疫から細胞を収集し、そして40% Ficoll−Paqueを通して遠心分離した。二次免疫について、3×107細胞を、5mg/mlのCD40L(CD154;Vinci−Biochem、Vinci、Italy)で一晩免疫したフラスコ中で、ペプチド抗原と混合した。これらの細胞を、5%ヒト血清、50mM 2−メルカプトエタノールおよび10nMペプチド抗原を補充した培地中で、3〜5日間培養した。
インビトロ免疫した細胞に、EBVを感染させた。簡潔には、107個のリンパ球を、EBV生成マーモセット細胞株B95−8(American Type Culture Collection、ATCC CRL 1612;Dr.L.−F.Shu.Tri Services General Hospital、Taipeiの厚意により提供された)由来の1mlのEBV含有上清と共に、時々再懸濁しながら、37℃で2時間インキュベートした。感染細胞を、支持細胞(104/ウェル)としての、マイトマイシン(Kyowa Hakkou Kogyo、Toyoko、Japan)処理したPBMCと一緒に、96ウェルプレート中に105/ウェルで播種した。
体細胞ハイブリダイゼーションを、以前に記載されたような電気融合(Chinら、1994;Chinら、1995)によって実施した。簡潔には、リンパ芽球細胞を、24ウェル組織培養プレート(Nalge Nunc International、Roskilde、DK)において、等張培地(280mM ソルビトール、0.5mM 酢酸マグネシウム、0.1mM 酢酸カルシウムおよび1mg/ml BSA;pH6.9〜7.1)中で、1個のヒトリンパ芽球細胞に対して2個のヘテロミエローマ(heteromyeloma)細胞の比率で、ヘテロミエローマ(Chinら、2001)細胞と融合させた。BTX Electro Cell Manipulator Mode 200を使用して、細胞融合を、38V(200V/cm)で30秒間実施し、その後、285V(1500V/cm)で15マイクロ秒の持続時間の3回のパルスを実施した。これらの細胞を、融合後20〜30分間マイクロキュベット中に放置し、次いで、10% FCSを補充した培養培地中に穏やかに再懸濁した。抗原特異的ハイブリッドを選択し、そしてChinら、2001に記載されるようにクローニングした。
表1および2に示されるような合成ペプチドを、ELISAについてのアッセイ抗原として使用した。これらのペプチドの各々を凍結乾燥し、そしてSulfo−MBS(Pierce、Rockford、IL)を架橋剤として使用する、2工程反応によって、BSAと結合体化した。最初に、BSAを、2mlの蒸留水で再構成して、10mg/ml溶液を得た。200μlの再構成BSAを、試験管中で、100μlのSulfo−MBS溶液(2mg/ml)と混合し、そして室温で1時間攪拌した。マレイミド活性化BSA(約100μl)を、Sephadex G−10カラムで精製して、過剰な架橋剤を除去した。その後、結合体化緩衝液中のスルフヒドリル含有ペプチド(4mg/ml)500μlを添加し、そしてこの混合物を、室温で2時間インキュベートした。反応生成物を透析し、次いで、さらなる使用のために凍結乾燥した。ELISAについて、結合体(2mg/ml)を、100μl/ウェルで96ウェルマイクロタイタープレートに添加し、そしてこれらのプレートを、抗原の免疫のために、4℃で一晩インキュベートした。
抗原特異的ELISAを、最初に、1mg/mlバキュロウイルス発現組換えHIV−1 IIIBまたはMN gp120(ImmunoDiagnostics、Woburn、MA)、5mg/ml ヒトトランスフェリン(Sigma)、10mg/ウェルのウシ血清アルブミン(BSA;Sigma)または破傷風トキソイド(ADImmune Corporation、Taichung、Taiwan)を、マイクロタイタープレート上に室温で一晩コーティングすることによって、実施した。培養物上清を、0.5M 塩化ナトリウムおよび0.1% Tween−20を含む10mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH8.0)中で所望のレベルにまで希釈した。コーティングしたプレートを、希釈した培養物上清と共にインキュベートし、洗浄し、ヒトIgGおよびIgMに対するペルオキシダーゼ標識したヤギ抗体(Zymed Labratories、So.San Francisco、CA)と共にインキュベートし、そして100μlの発色性基質であるo−フェニレンジアミン(phenylaenediamine)(OPD)(Sigma)の添加によって、発色させた(15分間)。この反応を、1Mの硫酸を添加することによって、30分後に停止させ、そして吸光度を490nmで読み取った。
huMAbの特異性を、競合的阻害ELISAによって確認した。簡潔には、0.1〜100mMのペプチド抗原を、希釈緩衝液(0.5M塩化ナトリウムおよび0.1% Tween 20(pH8.0))中にて、4℃で一晩、1nMの目的のhuMAbと共にインキュベートした。この混合物を、組換えgp120でコーティングしたELISAプレートに移した。37℃で2時間のインキュベーション後、プレートに結合したgp120特異的huMAbの量を、ヒトIgGに特異的なペルオキシダーゼ標識ヤギ抗体(Zymed Labratories、So.San Francisco、CA)を使用して評価した。
試験されるべきhuMAbを、96ウェルU底プレート(Nagle Nunc International)中、20μl/ウェルで、40μlのIL−2培養培地/ウェルと合わせた。huMAbを、所望の場合、最初に希釈し得る。次いで、14μlのHIV−1 MNまたはIIIBウイルス(500〜2500 TCID50)を各ウェルに添加し、そして37℃で1時間インキュベーシトした。その後、100μlのPBMC(500,000個の生存細胞を含む)を各ウェルに添加し、そして37℃で一晩インキュベートした。次いで、この培養物を、同じ培地で3回洗浄して、培地からウイルスを除去した。(PBMCの添加から)4日目に、25μlの培養物上清を、非放射性方法(RetroSysTM Innovagen AB、Lund、Sweden)による、逆転写酵素(RT)活性の測定のために、新たな96ウェルプレートの対応するウェルに移した。RT活性の減少を、ネガティブコントロール(huMabと同じ様式で希釈された、ヒト骨髄腫IgG1k(The Binding Site Limited、Birmingham、UK))に対して計算した。
(ペプチド抗原の調製)
HIV−1 gp120のV3ループに対応する合成ペプチドを、表1に示す。
(CD8+集団およびCD56+集団の除去は、抗原応答体の増加を生じた)
細胞傷害性細胞集団または阻害細胞集団の除去は、インビトロの抗原応答性において不可欠な役割を果たすので(Ohlinら、1989;1992)、細胞傷害性細胞の除去において有用であり得る異なる試薬の影響を、インビトロの免疫研究において比較した。これらの試薬としては、LeuLeuOMe、抗CD8抗体を使用する磁気細胞枯渇、抗CD56抗体を使用する磁気細胞枯渇、ならびに抗CD8抗体および抗CD56抗体の組み合わせを使用する磁気細胞枯渇が挙げられる。従って、末梢血単核細胞(PBMC)を、各試薬に供したか、またはコントロールとして、さらなる試薬に供しなかった(nil)。4つの異なるドナーからのPBMCを試験した。インビトロ免疫を、ペプチド抗原TT−V3B(MN)に対する一次免疫および二次免疫を含めて、材料および方法において記載したように実施した。免疫した細胞の寿命を延長させるため、これらの細胞を、次いで、上記のようにEBVに感染させた。各処理の効力を、特異的効率(すなわち、抗原TT−V3B(MN)に特異的な抗体を分泌した、培養プレート中のウェルの数)に基づいて評価した。
特異的抗体産生を含むウェルの数/EBV活性化およびインビトロ免疫の後に増殖するリンパ芽球細胞を含むウェルの数
*リンパ芽球細胞を含むウェルを、以下の場合に、特異的抗体産生としてスコアした:
1.組換えgp120(IIIB)に対するELISA OD値が、ネガティブコントロールのOD値の、少なくとも5倍高かった場合;
2.反応性指数(RI)>2の場合(ここで、RI=[ODgp120(IIIB)−ODgp120(IIIB)に対する培地コントロール]/[ODBSA−ODBSAに対する培地コントロール])。
(複数の抗原を認識する抗体の調製)
HIV処置の分野における主要な未解決の問題の1つは、広範なHIV改変体を中和する単一の試薬を如何にして開発するかである。コレセプター結合領域を認識する、今日までに報告された抗体のほとんどは、株特異的である。他方、本発明は、コレセプター結合領域中のコンフォメーションエピトープを認識する抗HIV抗体の産生を導く、免疫のための新規方法を提供する。従って、これらの抗体は、HIVの複数の株を認識する。この方法は、他の抗原/微生物も同様に認識する、広いスペクトルの抗体を調製するために使用され得る。
(ヒトIgG1を安定に分泌する特異的トリオーマ細胞株の、生成および特徴付け)
長期抗体産生のために、上記実施例においてインビトロで生成された抗体産生細胞を不死化するために、これらの細胞を、ヘテロミエローマ細胞株と融合させた。(2年より長きにわたって)安定なヒトトリオーマ細胞株を、クローニングおよびスクリーニングの後に確立した。この細胞株から産生されたモノクローナル抗体を、LTC−gp120−IgG1kと称する。このhuMabは、k軽鎖を有するIgG1アイソタイプのものであり、そして生産性は、1mg/(106細胞×24時間)であった。図1は、LTC−gp120−IgG1kの特異性を実証する。この抗体は、gp120(IIIB)およびgp120(MN)の両方と強力に反応したが、無関係の抗原(例えば、破傷風トキソイド、トランスフェリンおよびBSA)とは、バックグラウンドレベルのみの反応性を示した。さらに、この抗体は、IIIBまたはMNのいずれかに起源する変性gp120との、かなり減少した反応性を示した。変性タンパク質中の線状エピトープのみが認識され得るので、これらの結果は、LTC−gp120−IgG1kが、いくつかのHIV−1株のgp120中に共通に見出されるコンフォメーションエピトープと反応することを示す。実際、DサブタイプおよびO1サブタイプ以外、このhuMabは、表1に列挙される全てのHIV−1株のV3コンセンサスペプチドを認識する。さらに、DサブタイプおよびO1サブタイプのペプチドについて観察された応答の減少は、これらのペプチドのC4領域の一部を付加することによって、レスキューされ得、huMabがコレセプター結合部位に結合することを確認した。抗体の特異性もまた、図4に示されるように、競合的ELISAを用いて確認した。
Claims (35)
- 抗原を認識する完全ヒト抗体を調製する方法であって、以下:
(a)未処置のヒトドナーから一群のリンパ球を提供する工程;
(b)インビトロで、該抗原を用いて該リンパ球を免疫する工程;
(c)該免疫されたリンパ球をヘテロミエローマ細胞株と融合して、トリオーマ細胞を形成する工程;
(d)該抗原を認識する抗体を産生するトリオーマ細胞を同定する工程;および
(e)工程(d)において同定された該トリオーマ細胞によって産生された該抗体を収集する工程、
を包含する、方法。 - 請求項1に記載の方法であって、工程(b)の前に、前記リンパ球から、CD8+細胞およびCD56+細胞を除去する工程をさらに包含する、方法。
- 請求項1または2に記載の方法であって、工程(d)の前に、第2抗原を用いて、工程(c)の前記トリオーマ細胞をスクリーニングする工程、それによって、前記抗原および該第2抗原の両方を認識する抗体を産生する細胞を選択する工程、をさらに包含する、方法。
- 請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法であって、前記抗体が、約30nM以下のKdで前記抗原を認識する、方法。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法であって、前記抗体が、IgG抗体である、方法。
- 請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法であって、前記抗体が、IgG1抗体である、方法。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法であって、工程(d)の前記トリオーマ細胞が、細胞培養物中において、少なくとも約3ヶ月間、前記抗体を産生し得る、方法。
- 請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法であって、工程(d)の前記トリオーマ細胞が、細胞培養物中において、少なくとも約6ヶ月間、前記抗体を産生し得る、方法。
- 請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法であって、工程(d)の前記トリオーマ細胞が、細胞培養物中において、少なくとも約9ヶ月間、前記抗体を産生し得る、方法。
- 請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法であって、工程(d)の前記トリオーマ細胞が、細胞培養物中において、少なくとも約12ヶ月間、前記抗体を産生し得る、方法。
- 請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法であって、前記抗原が、HIV抗原である、方法。
- 請求項11に記載の方法であって、前記抗原が、gp120由来である、方法。
- 請求項12に記載の方法であって、前記抗原が、gp120のコレセプター結合領域を含む、方法。
- 請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法であって、前記抗原が、T−ヘルパー配列を含む、方法。
- 単離された完全ヒト抗体、またはその抗原結合フラグメントであって、該抗体が、HIVの少なくとも2つの株を認識する、抗体またはフラグメント。
- 請求項15に記載の抗体またはフラグメントであって、HIVの少なくとも2つの株のgp120を認識する、抗体またはフラグメント。
- 請求項16に記載の抗体またはフラグメントであって、gp120のコレセプター結合領域を認識する、抗体またはフラグメント。
- 請求項15に記載の抗体またはフラグメントであって、配列番号2〜17からなる群より選択される、少なくとも2つの配列を認識する、抗体またはフラグメント。
- 請求項15〜18のいずれか一項に記載の抗体またはフラグメントであって、前記抗体が、IgGである、抗体またはフラグメント。
- 請求項15〜18のいずれか一項に記載の抗体またはフラグメントであって、前記抗体が、IgG1である、抗体またはフラグメント。
- 請求項15〜20のいずれか一項に記載の抗体またはフラグメントを含む、組成物。
- 請求項21に記載の組成物であって、薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤をさらに含む、組成物。
- HIV感染を予防、処置、または改善するための方法であって、該方法が、有効量の請求項21に記載の組成物を、それが必要な被験体に投与する工程を包含する、方法。
- 請求項23に記載の方法であって、前記被験体が、AIDSに罹患している、方法。
- 少なくとも2つの異なる抗原を認識する完全ヒト抗体を調製する方法であって、以下:
(a)未処置のヒトドナーから一群のリンパ球を提供する工程;
(b)インビトロで、第1抗原を用いて該リンパ球を免疫する工程;
(c)該免疫されたリンパ球をヘテロミエローマ細胞株と融合して、トリオーマ細胞を形成する工程;
(d)該トリオーマ細胞を第2抗原を用いてスクリーニングして、該第1抗原および該第2抗原の両方を認識する抗体を産生する細胞を同定する工程;ならびに
(e)工程(d)において同定された該トリオーマ細胞によって産生された該抗体を収集する工程、
を包含する、方法。 - 請求項25に記載の方法であって、前記第1抗原および前記第2抗原が、微生物由来である、方法。
- 請求項25に記載の方法であって、前記第1抗原および前記第2抗原が、微生物の2つの異なる株由来である、方法。
- 請求項27に記載の方法であって、前記微生物が、HIVである、方法。
- 請求項28に記載の方法であって、前記第1抗原および前記第2抗原が、gp120由来である、方法。
- 抗原を用いてリンパ球のインビトロ免疫の効率を増加する方法であって、以下:
(a)リンパ球の集団を提供する工程;
(b)該集団からCD8+細胞およびCD56+細胞を除去する工程;ならびに
(c)インビトロで、該リンパ球の集団を該抗原と接触させる工程、
を包含する、方法。 - 請求項30に記載の方法であって、前記CD8+細胞および前記CD56+細胞が、CD8およびCD56に特異的な磁気ビーズを使用することによって除去される、方法。
- インビトロ細胞集団であって、以下:
(a)未処置のヒトドナーから末梢血単核細胞を提供する工程;
(b)該末梢血単核細胞からCD8+細胞およびCD56+細胞を除去する工程;ならびに
(c)インビトロで、工程(b)の該細胞を抗原と接触させて、該抗原を認識する抗体を該細胞により産生させる工程、
を包含する、方法によって調製されたインビトロ細胞集団。 - 抗体産生細胞であって、該抗体産生細胞が、請求項32に記載の細胞集団をクローン条件下で培養し、そして前記抗原を認識する抗体を産生するクローンを単離することによって調製される、抗体産生細胞。
- 請求項33に記載の抗体産生細胞であって、HIV gp120を認識する抗体を産生する、抗体産生細胞。
- 請求項34に記載の抗体産生細胞であって、HIVの異なる株由来の少なくとも2つのgp120分子を認識する抗体を産生する、抗体産生細胞。
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