JP2888980B2 - Hiv免疫療法 - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】 背景 この出願は、1991年8月22日に出願された米国特許出
願No.07/458,562の一部継続出願である。
願No.07/458,562の一部継続出願である。
本発明は、一般には、ヒト免疫不全ウィルス(HIV−
1)感染症の予防ならびに治療に有効な物質および方法
に関する。より具体的には、本発明は、HIV−1感受性
あるいはHIV−1感染動物、特にヒト、の受動免疫に有
用なモノクローナル抗体に関する。
1)感染症の予防ならびに治療に有効な物質および方法
に関する。より具体的には、本発明は、HIV−1感受性
あるいはHIV−1感染動物、特にヒト、の受動免疫に有
用なモノクローナル抗体に関する。
HIV−1のin vivoにおける感染過程は、最近のMcCune
の論文、Cell,64,pp.351−363(1991)に紹介されてい
る。すなわち、HIV−1は、T−細胞、単球/マクロフ
ァージおよびCD4受容体を発現する神経細胞などの様々
な細胞系に感染する。体内でのCD4+細胞の大部分は「休
眠状態」あるいは静止状態にあり、特定のシグナルにの
み反応して分裂するので、HIV−1による感染は、CD4+
細胞が転写の過程では不活性ウィルスを含むという結果
をもたらす。能動免疫を含む、感染動物の免疫系の刺激
は、免疫系のポリクローナルな活性化、および休眠CD4+
細胞の細胞周期のS期への移行の信号という結果に表れ
るであろう。増殖中の細胞は、ウィルス粒子を活発に産
生し、感染の拡散を誘発する。HIV−1感染動物の免疫
系の刺激によるこの好ましくない効果を考慮すれば、HI
V−1感染の予防あるいは治療の最も有効な方法は、感
受性あるいは感染動物に抗HIV−1抗体を投与するとい
う、能動免疫にあるといえる。
の論文、Cell,64,pp.351−363(1991)に紹介されてい
る。すなわち、HIV−1は、T−細胞、単球/マクロフ
ァージおよびCD4受容体を発現する神経細胞などの様々
な細胞系に感染する。体内でのCD4+細胞の大部分は「休
眠状態」あるいは静止状態にあり、特定のシグナルにの
み反応して分裂するので、HIV−1による感染は、CD4+
細胞が転写の過程では不活性ウィルスを含むという結果
をもたらす。能動免疫を含む、感染動物の免疫系の刺激
は、免疫系のポリクローナルな活性化、および休眠CD4+
細胞の細胞周期のS期への移行の信号という結果に表れ
るであろう。増殖中の細胞は、ウィルス粒子を活発に産
生し、感染の拡散を誘発する。HIV−1感染動物の免疫
系の刺激によるこの好ましくない効果を考慮すれば、HI
V−1感染の予防あるいは治療の最も有効な方法は、感
受性あるいは感染動物に抗HIV−1抗体を投与するとい
う、能動免疫にあるといえる。
Jackson et al.,Lancet,2,pp.647−652(1988)は、
後天性免疫不全症候群(AIDS、HIV−1感染により進行
性の免疫系欠陥の症候群)を患ったヒト患者へ、血漿の
形態で抗HIV−1抗体を一回投与すると、一時的に、症
状の軽減、Tリンパ球の一過性の増加、日和見感染の頻
度減少、および患者の血漿あるいはリンパ球から培養で
きるHIV−1の割合の減少という結果が見られる旨の報
告をしている。Karpas et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.US
A,85,pp.9234−9237(1988)も参照のこと。さらに、Em
ini et al.,Nature,355,pp.728−730(1982)は、HIV−
1に曝す以前の動物、チンパンジーへのHIV−1に特異
的に反応する抗体の投与をした結果、ウィルス感染の発
症を防止するとの結果を報告している。これら研究は、
HIV−1中和能力を有する抗体が、HIV−1感染の予防/
治療において有用であることを示唆するものである。
後天性免疫不全症候群(AIDS、HIV−1感染により進行
性の免疫系欠陥の症候群)を患ったヒト患者へ、血漿の
形態で抗HIV−1抗体を一回投与すると、一時的に、症
状の軽減、Tリンパ球の一過性の増加、日和見感染の頻
度減少、および患者の血漿あるいはリンパ球から培養で
きるHIV−1の割合の減少という結果が見られる旨の報
告をしている。Karpas et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.US
A,85,pp.9234−9237(1988)も参照のこと。さらに、Em
ini et al.,Nature,355,pp.728−730(1982)は、HIV−
1に曝す以前の動物、チンパンジーへのHIV−1に特異
的に反応する抗体の投与をした結果、ウィルス感染の発
症を防止するとの結果を報告している。これら研究は、
HIV−1中和能力を有する抗体が、HIV−1感染の予防/
治療において有用であることを示唆するものである。
HIV−1の主要な外被タンパク質であるgp120は、細胞
性CD4受容体に結合し、ウィルスの細胞内への侵入を促
進する。糖タンパク質のいくつかのエピトープは、中和
抗体の作製と関連付けられてきている。Ho et al.,Scie
nce,239,pp.1021−1023(1988)は、gp120のアミノ酸25
4−275は、HIV−1の三つの異なる単離株を含むグルー
プ特異的中和の能力を有するポリクローナル抗血清を導
くことを報告している。Haigwood et al.,Vaccines 90,
pp.313−320(1990)およびHo et al.,J.Virol.,65
(1),pp.489−493(1991)によれば、gp120にあるア
ミノ酸の一次構造からは構成されていないエピトープで
ある、立体構造依存性エピトープは、ウィルスの種々の
株を中和する抗体を誘導しうることを報告している。HI
V−1 gp120のいわゆる「主要中和決定基」(PND)は、g
p120の「V3ループ」に集中している。Putney et al.,Sc
ience,234,pp.1392−1395(1986);Rusche et al.,Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA,85,pp.3198−3202(1988);Goud
smit et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85,pp.4478−448
2(1988);Palker et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85,
pp.1932−1936(1988);Holley et al.,Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA,85,pp.6800−6804(1991)を参照のこと。V
3ループは、領域両側面に位置するシステイン残基間の
ジスルフィド結合により作られた超可変領域からなる。
たとえば、HIV−1MNのV3ループは、gp120の302と336の
位置の間にあるシステイン残基間のジスルフィド結合に
より形成されている。
性CD4受容体に結合し、ウィルスの細胞内への侵入を促
進する。糖タンパク質のいくつかのエピトープは、中和
抗体の作製と関連付けられてきている。Ho et al.,Scie
nce,239,pp.1021−1023(1988)は、gp120のアミノ酸25
4−275は、HIV−1の三つの異なる単離株を含むグルー
プ特異的中和の能力を有するポリクローナル抗血清を導
くことを報告している。Haigwood et al.,Vaccines 90,
pp.313−320(1990)およびHo et al.,J.Virol.,65
(1),pp.489−493(1991)によれば、gp120にあるア
ミノ酸の一次構造からは構成されていないエピトープで
ある、立体構造依存性エピトープは、ウィルスの種々の
株を中和する抗体を誘導しうることを報告している。HI
V−1 gp120のいわゆる「主要中和決定基」(PND)は、g
p120の「V3ループ」に集中している。Putney et al.,Sc
ience,234,pp.1392−1395(1986);Rusche et al.,Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA,85,pp.3198−3202(1988);Goud
smit et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85,pp.4478−448
2(1988);Palker et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85,
pp.1932−1936(1988);Holley et al.,Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA,85,pp.6800−6804(1991)を参照のこと。V
3ループは、領域両側面に位置するシステイン残基間の
ジスルフィド結合により作られた超可変領域からなる。
たとえば、HIV−1MNのV3ループは、gp120の302と336の
位置の間にあるシステイン残基間のジスルフィド結合に
より形成されている。
種々のHIV−1単離物からのV3ループの一連のアミノ
酸残基を含む組換えおよび合成タンパク質断片が、単離
あるいは種特異性中和抗体をマウスから得られること
を、Lasky et al.,Science,233,pp.209−212(1986);P
alker et al.,supra;Matsushita et al.,J.Virol.62,p
p.2107−2114(1988);およびJavaherian et al.,Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA,86,pp.6768−6772(1989)で報告
されている。さらに最近の研究[Putney et al.,supra
およびLaRosa et al.,Science, 249,pp.932−935(199
0)]では、V3ループのβターン構造が、分離株特異性
抗体によって部位認識されることが実証されている。Sc
ott et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87,pp.8597−8601
(1990)は、PNDも、ヒトにおいて種特異性抗体を誘導
できることを報告している。PNDの超可変性は、エピト
ープにより生成された種特異性中和活性を説明するもの
であろう。
酸残基を含む組換えおよび合成タンパク質断片が、単離
あるいは種特異性中和抗体をマウスから得られること
を、Lasky et al.,Science,233,pp.209−212(1986);P
alker et al.,supra;Matsushita et al.,J.Virol.62,p
p.2107−2114(1988);およびJavaherian et al.,Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA,86,pp.6768−6772(1989)で報告
されている。さらに最近の研究[Putney et al.,supra
およびLaRosa et al.,Science, 249,pp.932−935(199
0)]では、V3ループのβターン構造が、分離株特異性
抗体によって部位認識されることが実証されている。Sc
ott et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87,pp.8597−8601
(1990)は、PNDも、ヒトにおいて種特異性抗体を誘導
できることを報告している。PNDの超可変性は、エピト
ープにより生成された種特異性中和活性を説明するもの
であろう。
いくつかの研究が、組み換えgp120に対して調製され
た抗体、精製gp120あるいはV3領域からの合成ペプチド
が、種々のHIV−1分離株を中和することを示唆してい
る。Javaherian et al.,Science,250,pp.1590−1593(1
990)、およびWeisst et al.,Nature,324,pp.572−575
(1986)それぞれは、単離MN株のPNDおよび単離IIIB株
から誘導された組み換えgp120それぞれに対応するペプ
チドで免疫処置されたウサギからのポリクローナル血清
による、MNおよび単離IIIB株双方の中和を記している。
Haynes et alの米国特許第5019,387号も参照のこと。
た抗体、精製gp120あるいはV3領域からの合成ペプチド
が、種々のHIV−1分離株を中和することを示唆してい
る。Javaherian et al.,Science,250,pp.1590−1593(1
990)、およびWeisst et al.,Nature,324,pp.572−575
(1986)それぞれは、単離MN株のPNDおよび単離IIIB株
から誘導された組み換えgp120それぞれに対応するペプ
チドで免疫処置されたウサギからのポリクローナル血清
による、MNおよび単離IIIB株双方の中和を記している。
Haynes et alの米国特許第5019,387号も参照のこと。
Akerblom et al.,AIDS.4,pp.953−960(1990)には、
IIIBおよび11個の主要HIV−1単離株を中和するモノク
ローナル抗体調製物が記載されている。PCT出願公開公
報No.WO91/11198も参照のこと。しかしながら、主要単
離株の分離株相同性は決定されておらず、11個の単離株
は、IIIB類似と思われる。Durda et al.,AIDS Res.Hum.
Retrov.,6.pp.1115−1123(1990)には、MN−およびIII
B−双方に感染した細胞によるシンチウム形成を阻害す
るが、逆転写酵素活性と相関する結果を得ることが知ら
れている分析法である「LAN捕獲免疫測定法」によって
検定した結果、MNウィルムの感染を中和しないことを報
告している。1990年12月13日公開のScott et al.,のPCT
出願公開公報No.WO90/15078には、MN株のPNDあるいは
「MN様」単離ウィルス株を発現するワクチニヤ・ウィル
スで感染した細胞によるシンシチウム形成を阻害するモ
ノクローナル抗体が記されている。標準的な逆転写酵
素、p24もしくはMT−2分析法による、活性HIV−1の複
数の株を中和する、「広範に中和する」抗体の存在は全
く実証されていない。PCT出願公開公報No.WO88/09181な
らびにWO91/09625、さらにLiou et al.,J.Immunol.,143
(12),pp.3967−3975(1989)も参照のこと。
IIIBおよび11個の主要HIV−1単離株を中和するモノク
ローナル抗体調製物が記載されている。PCT出願公開公
報No.WO91/11198も参照のこと。しかしながら、主要単
離株の分離株相同性は決定されておらず、11個の単離株
は、IIIB類似と思われる。Durda et al.,AIDS Res.Hum.
Retrov.,6.pp.1115−1123(1990)には、MN−およびIII
B−双方に感染した細胞によるシンチウム形成を阻害す
るが、逆転写酵素活性と相関する結果を得ることが知ら
れている分析法である「LAN捕獲免疫測定法」によって
検定した結果、MNウィルムの感染を中和しないことを報
告している。1990年12月13日公開のScott et al.,のPCT
出願公開公報No.WO90/15078には、MN株のPNDあるいは
「MN様」単離ウィルス株を発現するワクチニヤ・ウィル
スで感染した細胞によるシンシチウム形成を阻害するモ
ノクローナル抗体が記されている。標準的な逆転写酵
素、p24もしくはMT−2分析法による、活性HIV−1の複
数の株を中和する、「広範に中和する」抗体の存在は全
く実証されていない。PCT出願公開公報No.WO88/09181な
らびにWO91/09625、さらにLiou et al.,J.Immunol.,143
(12),pp.3967−3975(1989)も参照のこと。
前記文献では、現在まで開発されたHIV−1 PNDとの反
応性を有するモノクローナル抗体が、様々なグループ反
応性を示すことを示唆しておるものの、広範な中和活性
を有しているとは思われない。これら研究によって示さ
れた分離株およびグループ特異的反応性の異なるパター
ンは、アミノ酸配列およびgp120のループ領域の立体構
造に関連するものと思われる。
応性を有するモノクローナル抗体が、様々なグループ反
応性を示すことを示唆しておるものの、広範な中和活性
を有しているとは思われない。これら研究によって示さ
れた分離株およびグループ特異的反応性の異なるパター
ンは、アミノ酸配列およびgp120のループ領域の立体構
造に関連するものと思われる。
いくつかの研究により、CD4受容体のみが、ウィルス
感染に原因する細胞性受容体を意味するものでないこと
を示唆している。これらの研究結果は、CD4+細胞への感
染を阻害する前述した抗体の患者への投与では、生体の
HIV−1感染に対してはCD4+細胞に限定された防御のみ
を提供する可能性を示している。Cheng−Mayer et al.,
Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,pp.3526−3530(1988)
は、神経膠細胞CD4分子以外の受容体を含む神経膠細胞
のHIV−1感染を報告している。さらに、Takeda et a
l.,Science,242,pp.580−583(1988)は、抗体/HIV−1
複合体が、受容体媒介エンドサイトーシスによって単球
を感染でき、またウィルス増殖を向上させることを示し
ている。同様の抗体依存性の感染増大が、Halsted et a
l.,Nature,265,pp.739−741(1977);Peiris et al.,Na
ture,289,pp.189−191(1981);およびSchlesinger e
t al.,J.Immunol.,127,pp.659−665(1981)にも記載さ
れている。
感染に原因する細胞性受容体を意味するものでないこと
を示唆している。これらの研究結果は、CD4+細胞への感
染を阻害する前述した抗体の患者への投与では、生体の
HIV−1感染に対してはCD4+細胞に限定された防御のみ
を提供する可能性を示している。Cheng−Mayer et al.,
Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,pp.3526−3530(1988)
は、神経膠細胞CD4分子以外の受容体を含む神経膠細胞
のHIV−1感染を報告している。さらに、Takeda et a
l.,Science,242,pp.580−583(1988)は、抗体/HIV−1
複合体が、受容体媒介エンドサイトーシスによって単球
を感染でき、またウィルス増殖を向上させることを示し
ている。同様の抗体依存性の感染増大が、Halsted et a
l.,Nature,265,pp.739−741(1977);Peiris et al.,Na
ture,289,pp.189−191(1981);およびSchlesinger e
t al.,J.Immunol.,127,pp.659−665(1981)にも記載さ
れている。
過去の研究の結果、特定の動物ウィルスは、補体、特
にClqによって、抗体非依存型機構を通じて不活化され
ることを示している。Weiss et al.,Eds.,Cold Spring
Harbour Labora−tory,New York,pp.1219−1220(198
2)中のWeiss,Molecular Biology of Tumor Viruses,RN
A Tumor Virusesu;Welsh et al.,Virology,74,pp.432−
440(1976);Bartholomew et al.,J.Exp.Med.,147,pp.
844−853(1978);Copper et al.,J.Exp.Med.,144,pp.9
70−984(1976);Sherwin et al.,Int.J.Cancer,21,pp.
6−11(1978)を参照のこと。Banapour et al.,Virolog
y,152,pp.268−271(1986)には、非加熱血清分画が、H
IV−1の力価や、あるいは抹消血液中の単核細胞に感染
する能力に対しては何等の効果も持たない旨が記載され
ているものの、Spear et al.,J.Virol.,64(12),pp.58
69−5873(1990)は、補体とHIV−1血清陽性患者から
集められた血清の組み合わせによって処理したHIV−1
の感染力が低減したことを報告している。
にClqによって、抗体非依存型機構を通じて不活化され
ることを示している。Weiss et al.,Eds.,Cold Spring
Harbour Labora−tory,New York,pp.1219−1220(198
2)中のWeiss,Molecular Biology of Tumor Viruses,RN
A Tumor Virusesu;Welsh et al.,Virology,74,pp.432−
440(1976);Bartholomew et al.,J.Exp.Med.,147,pp.
844−853(1978);Copper et al.,J.Exp.Med.,144,pp.9
70−984(1976);Sherwin et al.,Int.J.Cancer,21,pp.
6−11(1978)を参照のこと。Banapour et al.,Virolog
y,152,pp.268−271(1986)には、非加熱血清分画が、H
IV−1の力価や、あるいは抹消血液中の単核細胞に感染
する能力に対しては何等の効果も持たない旨が記載され
ているものの、Spear et al.,J.Virol.,64(12),pp.58
69−5873(1990)は、補体とHIV−1血清陽性患者から
集められた血清の組み合わせによって処理したHIV−1
の感染力が低減したことを報告している。
つまり、当該技術分野においては、HIV−1に対して
特異的な免疫学的反応性を有する(例えば、ネズミ由来
抗体、ヒト型化抗体、および免疫学的に活性な抗体の断
片を含む)新規のモノクローナル抗体の開発が必要とさ
れているのである。理想的には、かような抗体は、適切
なHIV−1感染宿主細胞となる培養細胞(例えば、H9細
胞)を用いての標準的な逆転写酵素、p24、MT−2、お
よびシンシチウム形成分析法により決定された、複数の
HIV−1株(例えば、IIIBおよびMN)の効果的な中和能
力を有することで特徴付けられる。感染あるいは非感染
患者の受動免疫での予測された用途を鑑みれば、かよう
な、モノクローナル抗体は、HIV−1粒子の補体依存性
(すなわち、介在性)ウィルス感染ならびにHIV−1感
染細胞の抗体依存性細胞溶解に有効に関与する能力を有
することが望ましい。
特異的な免疫学的反応性を有する(例えば、ネズミ由来
抗体、ヒト型化抗体、および免疫学的に活性な抗体の断
片を含む)新規のモノクローナル抗体の開発が必要とさ
れているのである。理想的には、かような抗体は、適切
なHIV−1感染宿主細胞となる培養細胞(例えば、H9細
胞)を用いての標準的な逆転写酵素、p24、MT−2、お
よびシンシチウム形成分析法により決定された、複数の
HIV−1株(例えば、IIIBおよびMN)の効果的な中和能
力を有することで特徴付けられる。感染あるいは非感染
患者の受動免疫での予測された用途を鑑みれば、かよう
な、モノクローナル抗体は、HIV−1粒子の補体依存性
(すなわち、介在性)ウィルス感染ならびにHIV−1感
染細胞の抗体依存性細胞溶解に有効に関与する能力を有
することが望ましい。
簡単な概要 本発明は、配列番号:1に示したアミノ酸配列、グリシ
ン−プロリン−グリシン−アルギニン(G−P−G−
R)、を含むHIV−1 gp120もしくはgp160タンパク質部
分と特異的に反応し、さらに標準的な逆転写酵素、p2
4、MT−2、およびシンシチウム形成分析法により決定
された、活性HIV−1株MNおよびIIIBによる培養液中のH
9細胞の感染を中和する能力により特徴付けられるモノ
クローナル抗体を産生する。本発明の生成物は、HIV−
1粒子の補体依存性ウィルス溶解および/またはHIV−
1感染細胞の抗体依存性細胞溶解を誘導する能力により
さらに特徴付けられる。
ン−プロリン−グリシン−アルギニン(G−P−G−
R)、を含むHIV−1 gp120もしくはgp160タンパク質部
分と特異的に反応し、さらに標準的な逆転写酵素、p2
4、MT−2、およびシンシチウム形成分析法により決定
された、活性HIV−1株MNおよびIIIBによる培養液中のH
9細胞の感染を中和する能力により特徴付けられるモノ
クローナル抗体を産生する。本発明の生成物は、HIV−
1粒子の補体依存性ウィルス溶解および/またはHIV−
1感染細胞の抗体依存性細胞溶解を誘導する能力により
さらに特徴付けられる。
本発明のモノクローナル抗体は、好ましくはIgG抗体
であり、殊にHIV−1感受性もしくはHIV−1感染した動
物、特にヒトの抗HIV−1治療の目的での使用に好適で
ある。免疫学的有効な量のモノクローナル抗体の投与に
より、HIV−1感染患者もしくはHIV−1感染の危険があ
る患者に、HIV−1ウィルス感染に対する受動免疫を高
める効果を有すること、さらには、好ましくは、HIV−
1粒子の補体依存性ウィルス溶解および/または患者の
HIV−1感染細胞の抗体依存性細胞溶解に効果を高めう
ることが望ましい。
であり、殊にHIV−1感受性もしくはHIV−1感染した動
物、特にヒトの抗HIV−1治療の目的での使用に好適で
ある。免疫学的有効な量のモノクローナル抗体の投与に
より、HIV−1感染患者もしくはHIV−1感染の危険があ
る患者に、HIV−1ウィルス感染に対する受動免疫を高
める効果を有すること、さらには、好ましくは、HIV−
1粒子の補体依存性ウィルス溶解および/または患者の
HIV−1感染細胞の抗体依存性細胞溶解に効果を高めう
ることが望ましい。
キメラ抗体、抗体断片、および、特に、特許請求した
モノクローナル抗体を基にした二価抗体は、本発明の範
疇にあるものであり、同様に、原核生物もしくは真核生
物細胞中に生成された組み換え抗体関連生成物も含むも
のである。
モノクローナル抗体を基にした二価抗体は、本発明の範
疇にあるものであり、同様に、原核生物もしくは真核生
物細胞中に生成された組み換え抗体関連生成物も含むも
のである。
例えば、FabおよびF(ab′)2断片のような抗体断
片は、本発明の抗体の可変領域に関する構造(配列)情
報が決定され次第、大腸菌、酵母、昆虫および哺乳類細
胞などの宿主細胞を使用して培養基中で生成可能であ
る。可変領域に関する配列情報もまた、CDR−移植した
抗体の調製を可能にする。さらに、キメラ抗体(例え
ば、マウス/ヒト抗体)は、形質転換したマウスミエロ
ーマ細胞あるいはハイブリドーマ細胞を用いて調製で
き、また、二価抗体もハイブリッド・ハイブリドーマ細
胞によって生成されうる。
片は、本発明の抗体の可変領域に関する構造(配列)情
報が決定され次第、大腸菌、酵母、昆虫および哺乳類細
胞などの宿主細胞を使用して培養基中で生成可能であ
る。可変領域に関する配列情報もまた、CDR−移植した
抗体の調製を可能にする。さらに、キメラ抗体(例え
ば、マウス/ヒト抗体)は、形質転換したマウスミエロ
ーマ細胞あるいはハイブリドーマ細胞を用いて調製で
き、また、二価抗体もハイブリッド・ハイブリドーマ細
胞によって生成されうる。
本発明の範疇には、抗HIV−1治療における、本発明
の生成物と他の免疫学的薬剤および/または化学治療薬
の組み合わせの使用も含む。混合投与に適した薬剤とし
ては、補体、HIV−1タンパクの様々な中和および非中
和領域に結合する抗体、およびAZTのような化学薬剤を
含む。
の生成物と他の免疫学的薬剤および/または化学治療薬
の組み合わせの使用も含む。混合投与に適した薬剤とし
ては、補体、HIV−1タンパクの様々な中和および非中
和領域に結合する抗体、およびAZTのような化学薬剤を
含む。
下記の詳細な説明において述べるように、本発明のモ
ノクローナル抗体は、gp120が本来の立体構造を持つよ
うに、活性HIV−1による適当な宿主の免疫処置によっ
て得られる。
ノクローナル抗体は、gp120が本来の立体構造を持つよ
うに、活性HIV−1による適当な宿主の免疫処置によっ
て得られる。
本発明で特に説明を行っているのは、寄託のためにAm
erican Type Culture Collection,Rockville,Maryland
に1991年4月9日に受領され、A.T.C.C.受託No.HB10726
が付与されたハイブリドーマ細胞系HB10726によって産
生された(NM01と称する)マウス・モノクローナル抗体
である。
erican Type Culture Collection,Rockville,Maryland
に1991年4月9日に受領され、A.T.C.C.受託No.HB10726
が付与されたハイブリドーマ細胞系HB10726によって産
生された(NM01と称する)マウス・モノクローナル抗体
である。
本発明の各種の態様と利点が、下記の詳細な説明での
本発明の実施例および実例の記述、図面に関する説明を
考慮すれば明らかになろう。すなわち、図1は、本発明
のモノクローナル抗体および抗体陽性ADS患者からの免
疫血清を使用した免疫ブロット法により、非感染H9細
胞、HIV−1MNおよびHIV−1IIIBウィルスのタンパク質の
オートラジオグラムをまとめたものである。図2には、
本発明の抗体と種々の異なるHIV−1株のV3ループ領域
に対応するペプチドとの免疫反応性試験の結果をグラフ
で示している。図3Aから3C、4、5および6Aから6Bに
は、本発明のモノクローナル抗体の生存HIV−1株によ
るH9細胞の感染中和に関する能力を、逆転写酵素、p2
4、MT−2、およびシンシチウム形成分析法のそれぞれ
で解析した結果をグラフで示している。図7は、本発明
の抗体でのウィルス感染の中和能に対するペプチド阻害
の決定のための分析法の結果をグラフで示している。図
8Aから、B、9Aから、F、および10AからFは、本発明
のモノクローナル抗体と補体との組み合わせで処理され
たHIV−1粒子の電子顕微鏡写真である。図11および12
には、本発明のモノクローナル抗体、MN−01のL鎖およ
びH鎖それぞれの可変領域のアミノ酸配列、ならびに異
なる抗HIV−1モノクローナル抗体のL鎖およびH鎖の
アミノ酸配列を記している。
本発明の実施例および実例の記述、図面に関する説明を
考慮すれば明らかになろう。すなわち、図1は、本発明
のモノクローナル抗体および抗体陽性ADS患者からの免
疫血清を使用した免疫ブロット法により、非感染H9細
胞、HIV−1MNおよびHIV−1IIIBウィルスのタンパク質の
オートラジオグラムをまとめたものである。図2には、
本発明の抗体と種々の異なるHIV−1株のV3ループ領域
に対応するペプチドとの免疫反応性試験の結果をグラフ
で示している。図3Aから3C、4、5および6Aから6Bに
は、本発明のモノクローナル抗体の生存HIV−1株によ
るH9細胞の感染中和に関する能力を、逆転写酵素、p2
4、MT−2、およびシンシチウム形成分析法のそれぞれ
で解析した結果をグラフで示している。図7は、本発明
の抗体でのウィルス感染の中和能に対するペプチド阻害
の決定のための分析法の結果をグラフで示している。図
8Aから、B、9Aから、F、および10AからFは、本発明
のモノクローナル抗体と補体との組み合わせで処理され
たHIV−1粒子の電子顕微鏡写真である。図11および12
には、本発明のモノクローナル抗体、MN−01のL鎖およ
びH鎖それぞれの可変領域のアミノ酸配列、ならびに異
なる抗HIV−1モノクローナル抗体のL鎖およびH鎖の
アミノ酸配列を記している。
実 施 例 下記の実施例は、ハイブリドーマ細胞HB10726の作
製、配列番号:1のアミノ酸配列G−P−G−Rを含むペ
プチドならびにHIV−1 gp120(もしくは、その前駆体で
あるgp160)に免疫学的な反応性を有するモノクローナ
ル抗体の該細胞からの単離、および該モノクローナル抗
体の特性に関する本発明の実例を示すものである。
製、配列番号:1のアミノ酸配列G−P−G−Rを含むペ
プチドならびにHIV−1 gp120(もしくは、その前駆体で
あるgp160)に免疫学的な反応性を有するモノクローナ
ル抗体の該細胞からの単離、および該モノクローナル抗
体の特性に関する本発明の実例を示すものである。
より詳細には、実施例1は、ハイブリドーマ細胞HB10
726の産生ならびに該細胞からのモノクローナル抗体MN
−01の単離に関するものである。実施例2は、抗体MN−
01によって認識されるウィルスエピトープの解明に関す
る。実施例3には、各種のHIV−1分離株とモノクロー
ナル抗体との反応特性が記されてる。実施例4は、逆転
写酵素およびp24分析法によって実証された、様々な活
性HIV−1株によるH9細胞の感染を中和する能力につい
ての抗体MN−01の反応特性に関する。実施例5は、MT−
2およびシンシチウム形成分析法によってさらに実証さ
れた、活性HIV−1分離株の感染を中和する能力につい
ての、抗体のスクリーニングに関する。実施例6は、モ
ノクローナル抗体NM−01のHIV−1感染中和特性のペプ
チド阻害に関する。
726の産生ならびに該細胞からのモノクローナル抗体MN
−01の単離に関するものである。実施例2は、抗体MN−
01によって認識されるウィルスエピトープの解明に関す
る。実施例3には、各種のHIV−1分離株とモノクロー
ナル抗体との反応特性が記されてる。実施例4は、逆転
写酵素およびp24分析法によって実証された、様々な活
性HIV−1株によるH9細胞の感染を中和する能力につい
ての抗体MN−01の反応特性に関する。実施例5は、MT−
2およびシンシチウム形成分析法によってさらに実証さ
れた、活性HIV−1分離株の感染を中和する能力につい
ての、抗体のスクリーニングに関する。実施例6は、モ
ノクローナル抗体NM−01のHIV−1感染中和特性のペプ
チド阻害に関する。
実施例7では、モノクローナル抗体NM−10のHIV−1
の補体依存性溶解を活性化する能力に関する解析がなさ
れている。実施例8は、モノクローナル抗体NM−01と培
養基中での感受性細胞のHIV−1感染に関する補体とを
組み合わせることによる効果の決定に関する。実施例9
には、モノクローナル抗体NM−01のH鎖およびL鎖可変
領域のDNAおよび推定アミノ酸配列が記載され、また、
モノクローナル抗体NM−10のキメラ/ヒト型化体の調製
に関する。
の補体依存性溶解を活性化する能力に関する解析がなさ
れている。実施例8は、モノクローナル抗体NM−01と培
養基中での感受性細胞のHIV−1感染に関する補体とを
組み合わせることによる効果の決定に関する。実施例9
には、モノクローナル抗体NM−01のH鎖およびL鎖可変
領域のDNAおよび推定アミノ酸配列が記載され、また、
モノクローナル抗体NM−10のキメラ/ヒト型化体の調製
に関する。
実施例1 ハイブリドーマ細胞系HB10726は、OiとHerzenberg,Se
lected Methods Cell Immunology,pp.351−372(1979)
およびGodding,J.Immunol.Meth.,39,pp.285−308(198
0)などに記されたような標準的な免疫学的技法を用い
て産生されたものであり、その詳細を以下に説明する。
lected Methods Cell Immunology,pp.351−372(1979)
およびGodding,J.Immunol.Meth.,39,pp.285−308(198
0)などに記されたような標準的な免疫学的技法を用い
て産生されたものであり、その詳細を以下に説明する。
活性HIV−1MNの精製 300mlのHIV−1MN感染H9細胞培養液を回収し、1500rpm
で5分間、4℃にて遠心分離し、細胞をペレット状にし
た。ウィルスを含んだ上清を分取して保存する一方で、
沈澱物は2100rpmで20分間、再度遠心分離した。二回目
に得られた上清は回収して、先に得られた上清と合わ
せ、この合わせた上清をSW27ローターを用いて、25000r
pmで90分間、4℃にて超遠心分離し、ウィルス粒子をペ
レット状にした。残った上清液は、廃棄した。ウィルス
ペレットは、約10mlのTNE緩衝液(100mM NaCl、10mM Tr
is−HCl、pH7.7、1mM EDTA)に再懸濁した。超遠心用遠
沈管には、下層に10mlの50%ショ糖TEN、中層に10mlの2
5%ショ糖TNE、そして上層に10mlのウィルス試料を含む
ようにし、そして25000rpmで90分間、4℃にて超遠心分
離した。ウィルスは、ショ糖TNE層間に白帯状に沈澱
し、パストゥールピペットで回収した。ウィルスに、20
ml TNE/15mM EDTA(100mM NaCl、10mM Tris−HCl、pH7.
7、15mM EDTA)を添加し、ウィルス試料を25000rpmで90
分間、4℃にて再度遠心分離した。得られたペレットに
は、精製された活性HIV−1MNが含まれていた。
で5分間、4℃にて遠心分離し、細胞をペレット状にし
た。ウィルスを含んだ上清を分取して保存する一方で、
沈澱物は2100rpmで20分間、再度遠心分離した。二回目
に得られた上清は回収して、先に得られた上清と合わ
せ、この合わせた上清をSW27ローターを用いて、25000r
pmで90分間、4℃にて超遠心分離し、ウィルス粒子をペ
レット状にした。残った上清液は、廃棄した。ウィルス
ペレットは、約10mlのTNE緩衝液(100mM NaCl、10mM Tr
is−HCl、pH7.7、1mM EDTA)に再懸濁した。超遠心用遠
沈管には、下層に10mlの50%ショ糖TEN、中層に10mlの2
5%ショ糖TNE、そして上層に10mlのウィルス試料を含む
ようにし、そして25000rpmで90分間、4℃にて超遠心分
離した。ウィルスは、ショ糖TNE層間に白帯状に沈澱
し、パストゥールピペットで回収した。ウィルスに、20
ml TNE/15mM EDTA(100mM NaCl、10mM Tris−HCl、pH7.
7、15mM EDTA)を添加し、ウィルス試料を25000rpmで90
分間、4℃にて再度遠心分離した。得られたペレットに
は、精製された活性HIV−1MNが含まれていた。
免疫処置およびハイブリドーマ調製 100μgの活性HIV−1MNを、腹腔内注射による3匹の
2ヶ月齢Balb/cマウスそれぞれを免疫処置するために使
用した。各マウスは3週間後に30μgのウィルスを注射
され、さらに3週間後に100μgのウィルス調製物を注
射された。2回目の注射を終えて3日後にマイスを犠牲
にし、脾臓細胞をP3−X63−Ag8−U1細胞(A.T.C.C.寄託
番号CRL1597)と融合することにより、ハイブリドーマ
細胞系を調製した。ハイブリドーマ細胞系は、慢性的に
感染したH9細胞(10匹)、急性的に感染したH9細胞(9
匹)、および感染したH9細胞膜(3匹)で免疫処置した
マウスの脾臓からも調製された。慢性的に感染したH9細
胞とは、感染後2〜3週間後に逆転写酵素分析法(RT)
で100,000cpm〜150,000cpmの計測値を示す細胞を指し、
一方で急性的に感染したH9細胞とは、感染後10〜12日後
にRで200,000cpm〜250,000cpmの計測値を示す細胞を指
す。
2ヶ月齢Balb/cマウスそれぞれを免疫処置するために使
用した。各マウスは3週間後に30μgのウィルスを注射
され、さらに3週間後に100μgのウィルス調製物を注
射された。2回目の注射を終えて3日後にマイスを犠牲
にし、脾臓細胞をP3−X63−Ag8−U1細胞(A.T.C.C.寄託
番号CRL1597)と融合することにより、ハイブリドーマ
細胞系を調製した。ハイブリドーマ細胞系は、慢性的に
感染したH9細胞(10匹)、急性的に感染したH9細胞(9
匹)、および感染したH9細胞膜(3匹)で免疫処置した
マウスの脾臓からも調製された。慢性的に感染したH9細
胞とは、感染後2〜3週間後に逆転写酵素分析法(RT)
で100,000cpm〜150,000cpmの計測値を示す細胞を指し、
一方で急性的に感染したH9細胞とは、感染後10〜12日後
にRで200,000cpm〜250,000cpmの計測値を示す細胞を指
す。
ハイブリドーマ細胞は、下記の方法によって調製され
る。免疫処置したマウスからの脾臓細胞を集めて、800g
で5分間、遠心した。細胞のペレットから上清を吸引
し、細胞108個当たり1mlの温かい(37℃)50%PEG−150
0をペレットに1分間にわたって添加した(0.25mlを添
加し、ピペットの先端で15秒間ゆっくりと撹拌し、この
操作を繰り返す)。この混合物を、さらに数分間にわた
って、細胞を壊さないように、同じピペットの先端で撹
拌した。1mlの「不完全培地」〔25mM HEPES(Sigma C
o.)、10,000U/mlのペニシリン、および10,000mg/mlの
ストレプトマイシンを補ったRPMI640(JRH Bioscience
s)〕を1分間にわたって同様の方法(15秒毎に、0.25m
lずつ)で添加し、さらに1mlを同じ時間にわたって添加
した。次に、7mlの不完全培地を2〜3分間にわたって
(20秒毎に、1mlずつ)撹拌し、細かい細胞の懸濁液と
した。最終懸濁液は、臨床用遠心機の「5」をセット
し、500gで5分間遠心し、上清を除去した。沈澱物を、
「完全培地」〔15%ウシ胎児血清(FBS)を補った上記
「不完全培地」〕中で(撹拌機またはピペットで溶液を
吸い上げたり吸い出したりするのではなく)試験管をゆ
っくり反転させることにより、培地1ml当たり細胞が2
×106個の濃度になるまで懸濁する。96ウェルプレート
の1ウェル当たりに、この懸濁液の0.1ml(総細胞多数
2×105個)を分注した。プレート板を、37℃、7%CO2
の条件下でインキュベートした。融合の日を0日目とし
た。
る。免疫処置したマウスからの脾臓細胞を集めて、800g
で5分間、遠心した。細胞のペレットから上清を吸引
し、細胞108個当たり1mlの温かい(37℃)50%PEG−150
0をペレットに1分間にわたって添加した(0.25mlを添
加し、ピペットの先端で15秒間ゆっくりと撹拌し、この
操作を繰り返す)。この混合物を、さらに数分間にわた
って、細胞を壊さないように、同じピペットの先端で撹
拌した。1mlの「不完全培地」〔25mM HEPES(Sigma C
o.)、10,000U/mlのペニシリン、および10,000mg/mlの
ストレプトマイシンを補ったRPMI640(JRH Bioscience
s)〕を1分間にわたって同様の方法(15秒毎に、0.25m
lずつ)で添加し、さらに1mlを同じ時間にわたって添加
した。次に、7mlの不完全培地を2〜3分間にわたって
(20秒毎に、1mlずつ)撹拌し、細かい細胞の懸濁液と
した。最終懸濁液は、臨床用遠心機の「5」をセット
し、500gで5分間遠心し、上清を除去した。沈澱物を、
「完全培地」〔15%ウシ胎児血清(FBS)を補った上記
「不完全培地」〕中で(撹拌機またはピペットで溶液を
吸い上げたり吸い出したりするのではなく)試験管をゆ
っくり反転させることにより、培地1ml当たり細胞が2
×106個の濃度になるまで懸濁する。96ウェルプレート
の1ウェル当たりに、この懸濁液の0.1ml(総細胞多数
2×105個)を分注した。プレート板を、37℃、7%CO2
の条件下でインキュベートした。融合の日を0日目とし
た。
HAT選択およびハイブリドーマの最初のスクリーニング 融合して24時間後(1日目)、0.1ml HAT培地(10-4M
ヒポキサンチン、5×10-7Mアミノプテリン、および1.6
×10-5Mチミジン)を各ウェルに添加した。2、3、
5、8、11、14、17および21日目に、各ウェルから0.1m
lの培地を除去し、新鮮な0.1ml HAT培地と交換した。2
〜5日目にあっては、ウェルには死んだ細胞しか含まれ
て居ないように見えた。5〜10日目の間に、ハイブリド
ーマが出現し始めた。ハイブリドーマ細胞は、細胞片の
中にあって、非常に屈光性の細胞のコロニーとして視覚
的に容易に認識できた。
ヒポキサンチン、5×10-7Mアミノプテリン、および1.6
×10-5Mチミジン)を各ウェルに添加した。2、3、
5、8、11、14、17および21日目に、各ウェルから0.1m
lの培地を除去し、新鮮な0.1ml HAT培地と交換した。2
〜5日目にあっては、ウェルには死んだ細胞しか含まれ
て居ないように見えた。5〜10日目の間に、ハイブリド
ーマが出現し始めた。ハイブリドーマ細胞は、細胞片の
中にあって、非常に屈光性の細胞のコロニーとして視覚
的に容易に認識できた。
ハイブリドーマ・スクリーニング ハイブリドーマ上清のスクリーニングのために、様々
な分析法が利用されている。HIV−1との反応性を有す
る抗体を分泌するハイブリドーマは当初、ハイブリドー
マ培養物上清を用いたELISAによる、非感染およびMN−
感染H9細胞から調製されたスクリーニング用の膜によっ
て同定されていた。この当初のスクリーニングは、ELIS
Aのデータに生存感染細胞への抗体の結合に関するデー
タを加味した、蛍光抗体法および放射線免疫検定法に引
き継がれた。
な分析法が利用されている。HIV−1との反応性を有す
る抗体を分泌するハイブリドーマは当初、ハイブリドー
マ培養物上清を用いたELISAによる、非感染およびMN−
感染H9細胞から調製されたスクリーニング用の膜によっ
て同定されていた。この当初のスクリーニングは、ELIS
Aのデータに生存感染細胞への抗体の結合に関するデー
タを加味した、蛍光抗体法および放射線免疫検定法に引
き継がれた。
ELISA用の細胞膜を、感染あるいは非感染H9細胞から
調製した。細胞は、1mM EDTAを含んだ、pH7.4の、250mM
ショ糖/10mM Tris−HCl緩衝液に懸濁した。懸濁液は、
氷浴中に置いたDounceのホモジェナイザーで、トリパン
ブルー排除試験にて生存細胞が確認されなくなるまで、
均質化した。混合物は、50gにて、2分間、遠心分離し
た。得られたペレットを、再度均質化および遠心分離し
た。二つの上清を合わせ、20,000gにて、20分間、遠心
分離した。ペレットを同じ緩衝液中で再度均質化し、20
分間遠心分離し、そして得られたペレットを7mlの元の2
50mMショ糖−EDTA緩衝液中で再懸濁した。この溶液を、
1mM EDTAを含んだ、2Mショ糖/10mM Tris−HCl緩衝液上
に重層し、80,000gにて、1時間、遠心分離した。その
結果得られた不明確な白い界面を回収し、250mMショ糖
緩衝液中で再懸濁した。タンパク含量をBCA分析法(Pie
ce Che−mical Company)で決定した。懸濁液を等分に
分割して、−70℃で保存した。
調製した。細胞は、1mM EDTAを含んだ、pH7.4の、250mM
ショ糖/10mM Tris−HCl緩衝液に懸濁した。懸濁液は、
氷浴中に置いたDounceのホモジェナイザーで、トリパン
ブルー排除試験にて生存細胞が確認されなくなるまで、
均質化した。混合物は、50gにて、2分間、遠心分離し
た。得られたペレットを、再度均質化および遠心分離し
た。二つの上清を合わせ、20,000gにて、20分間、遠心
分離した。ペレットを同じ緩衝液中で再度均質化し、20
分間遠心分離し、そして得られたペレットを7mlの元の2
50mMショ糖−EDTA緩衝液中で再懸濁した。この溶液を、
1mM EDTAを含んだ、2Mショ糖/10mM Tris−HCl緩衝液上
に重層し、80,000gにて、1時間、遠心分離した。その
結果得られた不明確な白い界面を回収し、250mMショ糖
緩衝液中で再懸濁した。タンパク含量をBCA分析法(Pie
ce Che−mical Company)で決定した。懸濁液を等分に
分割して、−70℃で保存した。
ELISA法のために、400ng/ウェルの濃度の細胞膜を96
穴ウェルプレートに添加し、25℃で、一晩乾燥した。プ
レートを0.5%Triton−X(登録商標)/燐酸緩衝液生
理食塩水(PBS)で洗浄し、5%ウシ胎児血清(FBS)/P
BSでブロックし、再度洗浄した。ハイブリドーマ上清
(40μl)を、50μlのPBSで希釈し、ウェルに添加し
て、4℃で、一晩反応させた。洗浄後、セイヨウワサビ
ペルオキシダーゼ(HRP)(Zymed)で標識したウサギ抗
マウスIgG(H+L)を、ウェルに添加し、25℃で、2
時間反応した。ウェルを0.5%Triton−X(登録商標)/
PBSで洗浄し、吸光度を405および650nmで測定する前
に、ABTS(Bio−Rad基質キット)の存在下で、20分間イ
ンキュベートした。
穴ウェルプレートに添加し、25℃で、一晩乾燥した。プ
レートを0.5%Triton−X(登録商標)/燐酸緩衝液生
理食塩水(PBS)で洗浄し、5%ウシ胎児血清(FBS)/P
BSでブロックし、再度洗浄した。ハイブリドーマ上清
(40μl)を、50μlのPBSで希釈し、ウェルに添加し
て、4℃で、一晩反応させた。洗浄後、セイヨウワサビ
ペルオキシダーゼ(HRP)(Zymed)で標識したウサギ抗
マウスIgG(H+L)を、ウェルに添加し、25℃で、2
時間反応した。ウェルを0.5%Triton−X(登録商標)/
PBSで洗浄し、吸光度を405および650nmで測定する前
に、ABTS(Bio−Rad基質キット)の存在下で、20分間イ
ンキュベートした。
ELISAにおいて非感染細胞膜および感染細胞膜双方に
陽性としてスクリーニングされた、慢性的に感染した細
胞および急性的に感染した細胞で免疫処置されたマウス
の脾臓細胞から生じたハイブリドーマの上清は、ハイブ
リドーマから産生された抗体愛がHIV−1特異性でなか
ったことを示した。感染細胞膜で免疫処置したマウスの
脾臓細胞から生じた1039個のハイブリドーマの内、5個
のハイブリドーマの上清が、感染細胞膜と強く反応し、
非感染細胞膜とはかすかにしか反応しなかった。これら
ハイブリドーマ細胞系からの上清に関してウエスターン
ブロット法を実施したところ、産生された三つのモノク
ローナル抗体の内の一つがHIV−1 p55に結合し、他の一
つがHIV−1 p55とp24に結合し、さらに最後の一つがウ
エスターンブロットにてバンドを生じないことが判明し
た(データ示さず)。
陽性としてスクリーニングされた、慢性的に感染した細
胞および急性的に感染した細胞で免疫処置されたマウス
の脾臓細胞から生じたハイブリドーマの上清は、ハイブ
リドーマから産生された抗体愛がHIV−1特異性でなか
ったことを示した。感染細胞膜で免疫処置したマウスの
脾臓細胞から生じた1039個のハイブリドーマの内、5個
のハイブリドーマの上清が、感染細胞膜と強く反応し、
非感染細胞膜とはかすかにしか反応しなかった。これら
ハイブリドーマ細胞系からの上清に関してウエスターン
ブロット法を実施したところ、産生された三つのモノク
ローナル抗体の内の一つがHIV−1 p55に結合し、他の一
つがHIV−1 p55とp24に結合し、さらに最後の一つがウ
エスターンブロットにてバンドを生じないことが判明し
た(データ示さず)。
1187個のハイブリドーマが、活性HIV−1MN株で免疫処
置したマウスの脾臓細胞から生じた。さらにスクリーニ
ングを実施するために、4つの上清中の抗体が、感染細
胞膜と強く反応し、非感染細胞膜とはかすかにしか反応
しなかったというELISAの結果を基にして、4つのハイ
ブリドーマ細胞系を選択した。ELISAの結果を、非感染
細胞と感染細胞から得られた数値の比率として表1に記
した。
置したマウスの脾臓細胞から生じた。さらにスクリーニ
ングを実施するために、4つの上清中の抗体が、感染細
胞膜と強く反応し、非感染細胞膜とはかすかにしか反応
しなかったというELISAの結果を基にして、4つのハイ
ブリドーマ細胞系を選択した。ELISAの結果を、非感染
細胞と感染細胞から得られた数値の比率として表1に記
した。
4つのハイブリドーマの上清を限界希釈クローニング
の試料とし、放射性免疫検定法(RIA)によってスクリ
ーニングした。125I(R∝M IgG−125I)でラベルした
ウサギ抗マウスIgGを、Sephadex G−50カラム(NEN−Du
pont)にて精製した。非感染H9細胞、あるいはHIV−1MN
株で感染したH9細胞(150μl中に7.5×105個の細胞)
を15ml容量のチューブに入れた。各ハイブリドーマから
の50μlの上清を非感染細胞および感染細胞が入ってい
るチューブに加え、混合物を、4℃で、一晩インキュベ
ートした。細胞を、2ml PBS/50%Tween−20(登録商
標)で2度洗浄し、洗浄と洗浄の間に、撹拌を行った。
PBS/5%FBS中の50μlのR∝M IgG−125I(750,000cp
m)を加え、混合物を4℃で、再度一晩インキュベート
した。インキュベーション後、細胞をPBS/50%Tween−2
0(登録商標)で3度洗浄した。細胞を殺菌するため
に、100μlのPBS/5%Triton−X(登録商標)を加え、
シンチレーション容器の標識物質の移動を助けるため
に、100μlの1M水酸化ナトリウムを加えた。試料は計
測され、RIAの結果を下記表1に非感染細胞のcpm値に対
する感染細胞のcpm値との間の比率として示した。
の試料とし、放射性免疫検定法(RIA)によってスクリ
ーニングした。125I(R∝M IgG−125I)でラベルした
ウサギ抗マウスIgGを、Sephadex G−50カラム(NEN−Du
pont)にて精製した。非感染H9細胞、あるいはHIV−1MN
株で感染したH9細胞(150μl中に7.5×105個の細胞)
を15ml容量のチューブに入れた。各ハイブリドーマから
の50μlの上清を非感染細胞および感染細胞が入ってい
るチューブに加え、混合物を、4℃で、一晩インキュベ
ートした。細胞を、2ml PBS/50%Tween−20(登録商
標)で2度洗浄し、洗浄と洗浄の間に、撹拌を行った。
PBS/5%FBS中の50μlのR∝M IgG−125I(750,000cp
m)を加え、混合物を4℃で、再度一晩インキュベート
した。インキュベーション後、細胞をPBS/50%Tween−2
0(登録商標)で3度洗浄した。細胞を殺菌するため
に、100μlのPBS/5%Triton−X(登録商標)を加え、
シンチレーション容器の標識物質の移動を助けるため
に、100μlの1M水酸化ナトリウムを加えた。試料は計
測され、RIAの結果を下記表1に非感染細胞のcpm値に対
する感染細胞のcpm値との間の比率として示した。
次に、4つのハイブリドーマ細胞系を蛍光抗体法によ
りスクリーニングした。2mlの非感染H9細胞もしくはHIV
−1感染H9細胞(約1×106個/ml)を、10ml容量の無菌
遠沈管に、10mlのPBS(Ca++もしくはMg++含まず)と共
に入れた。細胞を10mlのPBSで遠沈管を満たし、撹拌
し、100rpmで5分間遠心し、約100μlの「乳状の」細
胞懸濁液以外を吸引することにより、一度洗浄した。層
流状態にある間、51mmの10ウェル・スライド(Cell Lin
e Association)を、細胞懸濁液で各ウェルを溢れさ
せ、ピペットの先端で溢れた懸濁液を吸い上げることに
より、懸濁液で覆った。懸濁液で覆われたスライドを風
乾し、常温下で、10分間、メタノール中に固定した。4
つのハイブリドーマのそれぞれからの上清を、非感染細
胞および感染細胞のスライド試料の反応性に関して、非
希釈および1:50の濃度(0.02%スキム・ミルクに希釈し
た上清)にて試験した。15μlの非希釈あるいは希釈し
た上清をスライドの各ウェルに添加した。スライドを37
℃で、30分間インキュベートし、5分間撹拌しながらPB
S中に浸した。スライドを迅速に蒸留水ですすぎ、層流
風乾した。0.02%スキム・ミルク中で1:80に希釈した、
16μlのヤギ抗マウスIgG(H+L)F(ab)2断片(C
appel Biomedical)を各ウェルに添加した。スライドを
再度37℃で、30分間インキュベートし、PBS中に浸し
た。スライドをPBS中の0.01%エバンスブルー溶液で5
秒間すすぎ、蒸留水で2度すすいだ。スライドを蛍光抗
体法によって試験し、スクリーニングの結果を表2に示
し、表2において、マウスIgG(MIgG)、5C5抗体(抗−
IIIB)および(感染細胞膜、抗感染細胞、あるいは非感
染細胞によって免疫処置されたマウスの脾臓から生じた
ハイブリドーマからの)Grp.5上清は、対照抗体であ
る。
りスクリーニングした。2mlの非感染H9細胞もしくはHIV
−1感染H9細胞(約1×106個/ml)を、10ml容量の無菌
遠沈管に、10mlのPBS(Ca++もしくはMg++含まず)と共
に入れた。細胞を10mlのPBSで遠沈管を満たし、撹拌
し、100rpmで5分間遠心し、約100μlの「乳状の」細
胞懸濁液以外を吸引することにより、一度洗浄した。層
流状態にある間、51mmの10ウェル・スライド(Cell Lin
e Association)を、細胞懸濁液で各ウェルを溢れさ
せ、ピペットの先端で溢れた懸濁液を吸い上げることに
より、懸濁液で覆った。懸濁液で覆われたスライドを風
乾し、常温下で、10分間、メタノール中に固定した。4
つのハイブリドーマのそれぞれからの上清を、非感染細
胞および感染細胞のスライド試料の反応性に関して、非
希釈および1:50の濃度(0.02%スキム・ミルクに希釈し
た上清)にて試験した。15μlの非希釈あるいは希釈し
た上清をスライドの各ウェルに添加した。スライドを37
℃で、30分間インキュベートし、5分間撹拌しながらPB
S中に浸した。スライドを迅速に蒸留水ですすぎ、層流
風乾した。0.02%スキム・ミルク中で1:80に希釈した、
16μlのヤギ抗マウスIgG(H+L)F(ab)2断片(C
appel Biomedical)を各ウェルに添加した。スライドを
再度37℃で、30分間インキュベートし、PBS中に浸し
た。スライドをPBS中の0.01%エバンスブルー溶液で5
秒間すすぎ、蒸留水で2度すすいだ。スライドを蛍光抗
体法によって試験し、スクリーニングの結果を表2に示
し、表2において、マウスIgG(MIgG)、5C5抗体(抗−
IIIB)および(感染細胞膜、抗感染細胞、あるいは非感
染細胞によって免疫処置されたマウスの脾臓から生じた
ハイブリドーマからの)Grp.5上清は、対照抗体であ
る。
ハイブリドーマ細胞系HB10726は、RIAおよび蛍光抗体
法のデータからして抗体を産生する見込みが最もあると
して選択された。この細胞系は、ELISAにおいては最も
高い結合率を示さなかったが、ELISAが乾燥細胞膜への
結合性を示すのに対し、RIAと蛍光抗体法の結果が生存
感染細胞への結合性を示すことからRIAのデータが最も
重要である。この細胞系は2回サブクローニングされ、
この細胞が産性したモノクローナル抗体をNM−01と命名
した。マウスの腹腔にこの細胞を標準手段によって注射
し、モノクローナル抗体NM−01を腹水からプロテインA
アフィニティーカラム精製(Pierce)によって濃縮し
た。
法のデータからして抗体を産生する見込みが最もあると
して選択された。この細胞系は、ELISAにおいては最も
高い結合率を示さなかったが、ELISAが乾燥細胞膜への
結合性を示すのに対し、RIAと蛍光抗体法の結果が生存
感染細胞への結合性を示すことからRIAのデータが最も
重要である。この細胞系は2回サブクローニングされ、
この細胞が産性したモノクローナル抗体をNM−01と命名
した。マウスの腹腔にこの細胞を標準手段によって注射
し、モノクローナル抗体NM−01を腹水からプロテインA
アフィニティーカラム精製(Pierce)によって濃縮し
た。
抗体NM−01のアイソタイプは、型特異的血清(Bio−R
ad)によってIgG2bと決定された。この抗体(1.8mg/m
l)は、15%FBSでRPMI1640培地に希釈され、以下の実施
例にて使用された。
ad)によってIgG2bと決定された。この抗体(1.8mg/m
l)は、15%FBSでRPMI1640培地に希釈され、以下の実施
例にて使用された。
実施例2 モノクローナル抗体NM−01によって認識されるウィル
スエピトープを特定するために、最初にこの抗体を、精
製されたMNおよびIIIBウィルス粒子の蛋白との反応性に
関するウエスターンブロット分析法を試み、次に、HIV
−1 gp120のV3ループ領域のアミノ酸配列に対応する重
複しているペプチドとの反応性に関するELISA法により
スクリーニングを行った。
スエピトープを特定するために、最初にこの抗体を、精
製されたMNおよびIIIBウィルス粒子の蛋白との反応性に
関するウエスターンブロット分析法を試み、次に、HIV
−1 gp120のV3ループ領域のアミノ酸配列に対応する重
複しているペプチドとの反応性に関するELISA法により
スクリーニングを行った。
ウエスターンブロット分析 感染H9細胞の培養上清から精製されたMNおよびIIIBウ
ィルス粒子を、1.3%SDS/3%β−メルカプトエタノール
中で可溶化し、0.1%SDS/10%ポリアクリルアミドゲル
中で電気泳動の試料とした。ニトロセルロース紙へタン
パク質を移した後、細片をブロッキング緩衝液(0.02M
Tris−HCl,pH7.4,0.1M塩化ナトリウム,0.05%標準ヤギ
血清および5%脱脂乾燥乳)中で、4℃で、モノクロー
ナル抗体NM−01と共に一晩インキュベートし、pH7.4の
0.02M Tris−HCl、0.1M塩化ナトリウム、および0.3%Tw
een(登録商標)で洗浄した。細片は、次に、ビオチン
化ヤギ抗マウスIgG(Zymed)と共に1時間インキュベー
トし、洗浄し、125I−ストレプトアビジン(Amersham,A
rling−ton Heights,IL)でさらに1時間、4℃で、反
応させた。モノクローナル抗体NM−01の反応性は、オー
トラジオグラフィーによって観察した。
ィルス粒子を、1.3%SDS/3%β−メルカプトエタノール
中で可溶化し、0.1%SDS/10%ポリアクリルアミドゲル
中で電気泳動の試料とした。ニトロセルロース紙へタン
パク質を移した後、細片をブロッキング緩衝液(0.02M
Tris−HCl,pH7.4,0.1M塩化ナトリウム,0.05%標準ヤギ
血清および5%脱脂乾燥乳)中で、4℃で、モノクロー
ナル抗体NM−01と共に一晩インキュベートし、pH7.4の
0.02M Tris−HCl、0.1M塩化ナトリウム、および0.3%Tw
een(登録商標)で洗浄した。細片は、次に、ビオチン
化ヤギ抗マウスIgG(Zymed)と共に1時間インキュベー
トし、洗浄し、125I−ストレプトアビジン(Amersham,A
rling−ton Heights,IL)でさらに1時間、4℃で、反
応させた。モノクローナル抗体NM−01の反応性は、オー
トラジオグラフィーによって観察した。
オートラジオグラフィーの結果を図1に示し、図1に
おいて、レーン1と3は非感染H9細胞を含んだゲル、レ
ーン4はHIV−1MN感染H9細胞を含み、レーン2と5はHI
V−1MNウィルスを含み、およびレーン6と7はHIV−1
IIIBウィルスを含む。抗体NM−01はレーン1、2および
6のタンパク質と反応し、HIV−1血清陽性患者の血清
はレーン3〜5および7のタンパクと反応した。
おいて、レーン1と3は非感染H9細胞を含んだゲル、レ
ーン4はHIV−1MN感染H9細胞を含み、レーン2と5はHI
V−1MNウィルスを含み、およびレーン6と7はHIV−1
IIIBウィルスを含む。抗体NM−01はレーン1、2および
6のタンパク質と反応し、HIV−1血清陽性患者の血清
はレーン3〜5および7のタンパクと反応した。
モノクローナル抗体NM−01は、見かけの分子量約120k
Dを有するMNならびにIIIBウィルス蛋白との反応性を示
したが、その他のいかなるウィルス抗原のバンドとも反
応せず、この抗体がgp120のエピトープを認識すること
を示唆した。
Dを有するMNならびにIIIBウィルス蛋白との反応性を示
したが、その他のいかなるウィルス抗原のバンドとも反
応せず、この抗体がgp120のエピトープを認識すること
を示唆した。
ELISAによるエピトープ解析 抗体NM−01により認識されるgp120の特異的エピトー
プを同定するために、抗体をgp120のV3ループ領域に対
応する重複しているペプチドとの反応性に関してELISA
によってスクリーニングした。Multiple Peptide Syste
ms,San Diego,CAによって合成したペプチドは、HIV−1
MNgp120のアミノ酸302−316、312−326および322−336
に対応していた。
プを同定するために、抗体をgp120のV3ループ領域に対
応する重複しているペプチドとの反応性に関してELISA
によってスクリーニングした。Multiple Peptide Syste
ms,San Diego,CAによって合成したペプチドは、HIV−1
MNgp120のアミノ酸302−316、312−326および322−336
に対応していた。
3つのペプチド(ウェル当たり、250ng/50μl 0.1Mホ
ウ酸緩衝液、pH8.0)を2枚のImmulonプレート(Dynate
ch)にて、37℃で、一晩インキュベートした。プレート
をPBSで洗浄し、PBS/0.1%Tween(登録商標)/0.1%ウ
シ血清アルブミン(BSA)で、室温で、1時間かけてブ
ロックした。ブロッキング剤を除去し、100μl培地中
で希釈した異なる量の抗体NM−01またはマウスIgG(MIg
G)をプレートに添加した。抗体を、室温で、2時間、
反応させた。プレートを水道水で10回洗浄した。1:1000
に希釈したHRP接合ウサギ抗マウス第二抗体を、PBS/0.0
5%Tween(登録商標)/0.5%BSAに入れ、ウェル毎にそ
の100μlを添加した。プレートを室温で、1時間イン
キュベートし、そして水道水で10回洗浄した。ABTS基異
質(Bio−Rad)を添加し、20分間後に、650nmでプレー
トの吸光度測定を行った。
ウ酸緩衝液、pH8.0)を2枚のImmulonプレート(Dynate
ch)にて、37℃で、一晩インキュベートした。プレート
をPBSで洗浄し、PBS/0.1%Tween(登録商標)/0.1%ウ
シ血清アルブミン(BSA)で、室温で、1時間かけてブ
ロックした。ブロッキング剤を除去し、100μl培地中
で希釈した異なる量の抗体NM−01またはマウスIgG(MIg
G)をプレートに添加した。抗体を、室温で、2時間、
反応させた。プレートを水道水で10回洗浄した。1:1000
に希釈したHRP接合ウサギ抗マウス第二抗体を、PBS/0.0
5%Tween(登録商標)/0.5%BSAに入れ、ウェル毎にそ
の100μlを添加した。プレートを室温で、1時間イン
キュベートし、そして水道水で10回洗浄した。ABTS基異
質(Bio−Rad)を添加し、20分間後に、650nmでプレー
トの吸光度測定を行った。
配列番号:2〜4にはペプチドのアミノ酸配列が示され
ており、表3には抗体MIgGとHT培地を陰性対照とした重
複したペプチドを用いた分析法の結果を示した。
ており、表3には抗体MIgGとHT培地を陰性対照とした重
複したペプチドを用いた分析法の結果を示した。
V3ループのアミノ酸302−316もしくは322−336に対応
するペプチドとモノクローナル抗体NM−10との検出され
うる反応性は認められなかったが、アミノ酸312−326の
ペプチドへのこの抗体の結合は明らかである。対照抗体
のマウスIgGはペプチドと結合しなかった。
するペプチドとモノクローナル抗体NM−10との検出され
うる反応性は認められなかったが、アミノ酸312−326の
ペプチドへのこの抗体の結合は明らかである。対照抗体
のマウスIgGはペプチドと結合しなかった。
実施例3 HIV−1MNgp120のV3ループ領域にモノクローナル抗体N
M−01が結合するという証明は、他のHIV−1分離株との
反応性の程度に関する研究をさらに促進した。HIV−1
分離株IIIB、RF、CDC4、NY/5、Z6、Z2およびELIのV3ル
ープ領域に相当するペプチドとの反応性に関してELISA
法によって抗体をスクリーニングした。ペプチドのアミ
ノ酸配列を下記表4、および配列番号:5〜12にそれぞれ
示した。
M−01が結合するという証明は、他のHIV−1分離株との
反応性の程度に関する研究をさらに促進した。HIV−1
分離株IIIB、RF、CDC4、NY/5、Z6、Z2およびELIのV3ル
ープ領域に相当するペプチドとの反応性に関してELISA
法によって抗体をスクリーニングした。ペプチドのアミ
ノ酸配列を下記表4、および配列番号:5〜12にそれぞれ
示した。
ペプチド結合分析 ペプチド(250ng/0.1Mホウ酸緩衝液、pH8.0、America
n Bio−thchnologies,Canbridge,MAにより合成)を2枚
のImmulonプレート(Dynatech)にて、4℃で、一晩イ
ンキュベートした。プレートをPBSで洗浄し、0.1%Twee
n(登録商標)/0.1%BSA/PBSで、25℃で、2時間ブロッ
キングし、そしてモノクローナル抗体NM−01と共に、37
℃で、1時間インキュベートした。水道水で洗浄後、プ
レートをHRP−標識ウサギ抗マウス二次抗体で、25℃
で、1時間、次に、ABTS基質(Bio−Rad)で、20分間イ
ンキュベートした。反応性を、650〜405nmの吸光度測定
により決定した。分析結果を図2に示した。
n Bio−thchnologies,Canbridge,MAにより合成)を2枚
のImmulonプレート(Dynatech)にて、4℃で、一晩イ
ンキュベートした。プレートをPBSで洗浄し、0.1%Twee
n(登録商標)/0.1%BSA/PBSで、25℃で、2時間ブロッ
キングし、そしてモノクローナル抗体NM−01と共に、37
℃で、1時間インキュベートした。水道水で洗浄後、プ
レートをHRP−標識ウサギ抗マウス二次抗体で、25℃
で、1時間、次に、ABTS基質(Bio−Rad)で、20分間イ
ンキュベートした。反応性を、650〜405nmの吸光度測定
により決定した。分析結果を図2に示した。
モノクローナル抗体NM−01は、MN(黒塗円)、III
B(白抜円)、RF(白抜三角)およびCDC4(黒塗三角)
単離物からのループペプチドと反応した。IIIB、RFおよ
びCDC4ペプチドへの抗体の結合は、MNペプチドとの結合
と同等であった。またモノクローナル抗体NM−01は、NY
/5ペプチド(星印)とは小さな反応性しか示さなかっ
た。モノクローナル抗体NM−01は、配列番号:13に示し
たRF様ペプチドにも反応するものと推定される。これに
対して、Z6(黒塗四角)、Z2(白抜逆三角)およびELI
(白抜四角)単離物からのループペプチドとは、ほとん
ど反応しなかった。これら結果は、モノクローナル抗体
NM−01が、特に、配列番号:1に示したアミノ酸配列G−
P−G−Rを有する複数のHIV−1単離物のgp120のV3ル
ープのエピトープを認識することを示すものである。
B(白抜円)、RF(白抜三角)およびCDC4(黒塗三角)
単離物からのループペプチドと反応した。IIIB、RFおよ
びCDC4ペプチドへの抗体の結合は、MNペプチドとの結合
と同等であった。またモノクローナル抗体NM−01は、NY
/5ペプチド(星印)とは小さな反応性しか示さなかっ
た。モノクローナル抗体NM−01は、配列番号:13に示し
たRF様ペプチドにも反応するものと推定される。これに
対して、Z6(黒塗四角)、Z2(白抜逆三角)およびELI
(白抜四角)単離物からのループペプチドとは、ほとん
ど反応しなかった。これら結果は、モノクローナル抗体
NM−01が、特に、配列番号:1に示したアミノ酸配列G−
P−G−Rを有する複数のHIV−1単離物のgp120のV3ル
ープのエピトープを認識することを示すものである。
MN様およびIIIB様V3ループペプチドと反応し、RF様ペ
プチドとは反応しない、他の抗HIV−1 gp120モノクロー
ナル抗体、モノクローナル抗体BAT123が、Liou et al.,
supraに記載されている(該文献の第3972頁の図5Aを参
照)。これら報告されている反応性は、先のパラグラフ
にて記載したモノクローナル抗体NM−01の反応性とは異
なる。抗体NM−01とBAT123の双方共に、IIIBペプチドに
は比較的良く結合するが、NM−01と同様のMNペプチドへ
の結合を得るためには、BAT123は約50倍高い濃度が必要
とされる。さらに、NM−01は表4および配列番号:7に示
したRF様ペプチドと反応するが、BAT123は、たとえ抗体
濃度を10,000μg/mlにしても、RF様ペプチドには結合し
ない。
プチドとは反応しない、他の抗HIV−1 gp120モノクロー
ナル抗体、モノクローナル抗体BAT123が、Liou et al.,
supraに記載されている(該文献の第3972頁の図5Aを参
照)。これら報告されている反応性は、先のパラグラフ
にて記載したモノクローナル抗体NM−01の反応性とは異
なる。抗体NM−01とBAT123の双方共に、IIIBペプチドに
は比較的良く結合するが、NM−01と同様のMNペプチドへ
の結合を得るためには、BAT123は約50倍高い濃度が必要
とされる。さらに、NM−01は表4および配列番号:7に示
したRF様ペプチドと反応するが、BAT123は、たとえ抗体
濃度を10,000μg/mlにしても、RF様ペプチドには結合し
ない。
実施例4 逆転写酵素法によって測定した活性HIV−1株MN、III
BならびにRF、およびp24分析法によって測定した活性HI
V−1株MNならびにIIIBによるH9細胞の感染を中和する
能力に関して、モノクローナル抗体NM−01を試験した。
BならびにRF、およびp24分析法によって測定した活性HI
V−1株MNならびにIIIBによるH9細胞の感染を中和する
能力に関して、モノクローナル抗体NM−01を試験した。
逆転写酵素およびp24分析 モノクローナル抗体NM−01の希釈液を、96ウェルプレ
ートにて、40TCID50のMN生存ウィルスおよび100TCID50
のIIIB活性ウィルスと共に、37℃で、1時間半インキュ
ベートした。HIV−1IIIBのgp120に結合するモノクロー
ナル抗体0.5β(AIDS Research and Reference Reagent
Program Catalog,National Institute of Allergy and
Infectious Diseases)を、逆転写酵素法において、陽
性および陰性対照の双方に用いた。H9細胞(2.5×10
4個)を各ウェルに添加し、プレートをさらに1時間、3
7℃で、インキュベートした。H9細胞懸濁液をRPMI1640/
15%FBSで希釈し、24ウェルプレートにて、37℃で、イ
ンキュベートした。ウィルス生成に関して、7日目に、
Poiesz,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77,pp.7415−7
419(1980)の記載に従って逆転写酵素法を、また、5
日目にp24分析法を行った(Dupont HIV−1 p24 Core Pr
ofile ELISA)。分析結果を図3Aから3Bおよび図4にそ
れぞれ示した。
ートにて、40TCID50のMN生存ウィルスおよび100TCID50
のIIIB活性ウィルスと共に、37℃で、1時間半インキュ
ベートした。HIV−1IIIBのgp120に結合するモノクロー
ナル抗体0.5β(AIDS Research and Reference Reagent
Program Catalog,National Institute of Allergy and
Infectious Diseases)を、逆転写酵素法において、陽
性および陰性対照の双方に用いた。H9細胞(2.5×10
4個)を各ウェルに添加し、プレートをさらに1時間、3
7℃で、インキュベートした。H9細胞懸濁液をRPMI1640/
15%FBSで希釈し、24ウェルプレートにて、37℃で、イ
ンキュベートした。ウィルス生成に関して、7日目に、
Poiesz,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77,pp.7415−7
419(1980)の記載に従って逆転写酵素法を、また、5
日目にp24分析法を行った(Dupont HIV−1 p24 Core Pr
ofile ELISA)。分析結果を図3Aから3Bおよび図4にそ
れぞれ示した。
モノクローナル抗体NM−01(図3Aの黒塗円)は、10〜
100μg/mlの濃度で、逆転写酵素法によって測定したと
ころ、活性MNウィルスの感染を完全に中和した。さら
に、1μg/ml未満の濃度での抗体の使用では、ウィルス
感染阻害は50%であった(ID50)。これらの知見は、感
染中和効果が認められなかったモノクローナル抗体0.5
β(図3Aの白抜円)の結果とは対照的である。モノクロ
ーナル抗体NM−01(図3B)は、約0.1μg/mlの濃度にお
いて感染阻害率50%(ID50)で、IIIB生存ウィルスを中
和した。モノクローナル抗体0.5βは、モノクローナル
抗体NM−01よりやや効果的にIIIBウィルスを中和した
(図3B)。同様の結果が、HIV−1 MNおよびIIIBに関す
るp24分析法において得られた。図4参照。逆転写酵素
分析において、モノクローナル抗体NM−01は、約0.05μ
g/mlのID50で、活性RFウィルスも阻害した(図3C)。こ
れらのデータは、モノクローナル抗体NM−01が、HIV−
1の少なくとも三つの異種菌株による感染を中和するこ
とを示している。
100μg/mlの濃度で、逆転写酵素法によって測定したと
ころ、活性MNウィルスの感染を完全に中和した。さら
に、1μg/ml未満の濃度での抗体の使用では、ウィルス
感染阻害は50%であった(ID50)。これらの知見は、感
染中和効果が認められなかったモノクローナル抗体0.5
β(図3Aの白抜円)の結果とは対照的である。モノクロ
ーナル抗体NM−01(図3B)は、約0.1μg/mlの濃度にお
いて感染阻害率50%(ID50)で、IIIB生存ウィルスを中
和した。モノクローナル抗体0.5βは、モノクローナル
抗体NM−01よりやや効果的にIIIBウィルスを中和した
(図3B)。同様の結果が、HIV−1 MNおよびIIIBに関す
るp24分析法において得られた。図4参照。逆転写酵素
分析において、モノクローナル抗体NM−01は、約0.05μ
g/mlのID50で、活性RFウィルスも阻害した(図3C)。こ
れらのデータは、モノクローナル抗体NM−01が、HIV−
1の少なくとも三つの異種菌株による感染を中和するこ
とを示している。
実施例5 逆転写酵素法およびp24分析法により実証された生存H
IV−1感染の中和に関して、生存MNおよびIIIBウィルス
を用いたMT−2法、および生存MN、IIIBおよびRFウィル
スを用いたシンシチウム形成分析法において、さらにモ
ノクローナル抗体NM−01の効果を研究した。
IV−1感染の中和に関して、生存MNおよびIIIBウィルス
を用いたMT−2法、および生存MN、IIIBおよびRFウィル
スを用いたシンシチウム形成分析法において、さらにモ
ノクローナル抗体NM−01の効果を研究した。
MT−2分析法 MT−2分析法は、Richman,AIDS Research and Refere
nce Reagent Program,Courier No.90−01,pp.6−9(19
90)の記載に若干の修正を加えた方法にて行った。活性
MNウィルスおよび活性IIIBウィルスは、モノクローナル
抗体NM−01の希釈液と共に、96ウェルプレートにて、4
℃で、1時間半インキュベートした。MT−2細胞(8×
105)をウェルに添加し、プレートを37℃で、3日間イ
ンキュベートした。各細胞の生死を観るために、Mosman
n,J.Immunol.Metn.,65,pp.55−63(1983)ならびにPaul
wels,et al.,J.Virol,Meth.,22,pp.309−321(1988)の
記載に従ったMTT色素還元を行った。MT−2分析法の結
果は、逆転写酵素法ならびにp24分析法の結果を確認す
るものであり、その結果を図5に示し、IIIB(100TCID
50)の阻害率を白抜円で、およびMN(40TCID50)の阻害
率を黒塗円で示した。
nce Reagent Program,Courier No.90−01,pp.6−9(19
90)の記載に若干の修正を加えた方法にて行った。活性
MNウィルスおよび活性IIIBウィルスは、モノクローナル
抗体NM−01の希釈液と共に、96ウェルプレートにて、4
℃で、1時間半インキュベートした。MT−2細胞(8×
105)をウェルに添加し、プレートを37℃で、3日間イ
ンキュベートした。各細胞の生死を観るために、Mosman
n,J.Immunol.Metn.,65,pp.55−63(1983)ならびにPaul
wels,et al.,J.Virol,Meth.,22,pp.309−321(1988)の
記載に従ったMTT色素還元を行った。MT−2分析法の結
果は、逆転写酵素法ならびにp24分析法の結果を確認す
るものであり、その結果を図5に示し、IIIB(100TCID
50)の阻害率を白抜円で、およびMN(40TCID50)の阻害
率を黒塗円で示した。
モノクローナル抗体NM−01は、活性MN単離物および活
性IIIB分離株の感染をそれぞれ2.0μg/mlおよび0.1μg/
mlのID50で中和した。
性IIIB分離株の感染をそれぞれ2.0μg/mlおよび0.1μg/
mlのID50で中和した。
シンシチウム形成分析法 結合阻害分析法は、Johnson & Walker,Eds.,Techniq
ues in HIV−1 Research,Stockton Press,New York,NY,
pp.92−97(1990)に記載された方法の修正法によって
行った。すなわち、MNウィルスもしくはIIIBウィルスの
いずれかによって慢性的に感染させたH9細胞を、モノク
ローナル抗体NM−01の希釈液と共に、37℃で、1時間イ
ンキュベートした。次にC8166細胞を各ウェルに添加
し、37℃で、2時間インキュベートした。三つのリンパ
球細胞の直径より大きなシンシチウムを計測し、抗体欠
乏下で処理した対照感染H9細胞において得られたシンシ
チウムと比較した。シンシチウム形成分析法の結果は、
逆転写酵素法およびp24分析法の結果を確認するもので
あり、その結果を図6Aに示し、IIIB(100TCID50)の阻
害率を白抜円で、MN(40TCID50)の阻害率を黒塗円で示
した。モノクローナル抗体NM−01は、MN感染H9細胞によ
るシンシチウム形成を2μg/mlのID50で、さらにIIIB感
染H9細胞によるシンシチウム形成を3μg/mlのID50で阻
害した。
ues in HIV−1 Research,Stockton Press,New York,NY,
pp.92−97(1990)に記載された方法の修正法によって
行った。すなわち、MNウィルスもしくはIIIBウィルスの
いずれかによって慢性的に感染させたH9細胞を、モノク
ローナル抗体NM−01の希釈液と共に、37℃で、1時間イ
ンキュベートした。次にC8166細胞を各ウェルに添加
し、37℃で、2時間インキュベートした。三つのリンパ
球細胞の直径より大きなシンシチウムを計測し、抗体欠
乏下で処理した対照感染H9細胞において得られたシンシ
チウムと比較した。シンシチウム形成分析法の結果は、
逆転写酵素法およびp24分析法の結果を確認するもので
あり、その結果を図6Aに示し、IIIB(100TCID50)の阻
害率を白抜円で、MN(40TCID50)の阻害率を黒塗円で示
した。モノクローナル抗体NM−01は、MN感染H9細胞によ
るシンシチウム形成を2μg/mlのID50で、さらにIIIB感
染H9細胞によるシンシチウム形成を3μg/mlのID50で阻
害した。
モノクローナル抗体BAT123の対応するシンシチウム形
成阻害の結果が、WO88/09181の表IIIに示されている。2
5μgのモノクローナル抗体NM−01が、MN感染細胞によ
るシンシチウム形成の約85%を阻害するのに対し、BAT1
23の25μgが、51%を阻害することが報告されており、
さらに、25μgのモノクローナル抗体NM−01が、IIIB感
染細胞によるシンシチウム形成の約85%を阻害するのに
対し、BAT123が、77.8%を阻害することが報告されてい
る。25μgのBAT123は、RF感染細胞によるシンシチウム
形成を51%阻害することも報告されている。モノクロー
ナル抗体NM−01も、RF感染細胞によるシンシチウム形成
を阻害する(図6B参照)。先のパラグラフにて記した分
析にて、25μgのNM−01が、RF感染細胞によるシンシチ
ウム形成の約59%を阻害した。モノクローナル抗体NM−
01は、RF感染細胞によるシンシチウム形成を、4μg/ml
のID50にて阻害する。
成阻害の結果が、WO88/09181の表IIIに示されている。2
5μgのモノクローナル抗体NM−01が、MN感染細胞によ
るシンシチウム形成の約85%を阻害するのに対し、BAT1
23の25μgが、51%を阻害することが報告されており、
さらに、25μgのモノクローナル抗体NM−01が、IIIB感
染細胞によるシンシチウム形成の約85%を阻害するのに
対し、BAT123が、77.8%を阻害することが報告されてい
る。25μgのBAT123は、RF感染細胞によるシンシチウム
形成を51%阻害することも報告されている。モノクロー
ナル抗体NM−01も、RF感染細胞によるシンシチウム形成
を阻害する(図6B参照)。先のパラグラフにて記した分
析にて、25μgのNM−01が、RF感染細胞によるシンシチ
ウム形成の約59%を阻害した。モノクローナル抗体NM−
01は、RF感染細胞によるシンシチウム形成を、4μg/ml
のID50にて阻害する。
以上をまとめると、実施例4および5の逆転写酵素、
p24、MT−2およびシンシチウム形成阻害分析法の結果
は、モノクローナル抗体NM−01が、10μg/ml以下の濃度
にあっては、複数のHIV−1株の結合と感染性を中和す
ることを示すものである。
p24、MT−2およびシンシチウム形成阻害分析法の結果
は、モノクローナル抗体NM−01が、10μg/ml以下の濃度
にあっては、複数のHIV−1株の結合と感染性を中和す
ることを示すものである。
実施例6 モノクローナル抗体NM−01が、gp120 V3ループの部位
に結合することによって、HIV−1 MNおよびIIIBの感染
を阻止することを確認するために、V3ループペプチド
が、この抗体による感染中和能力を無効にする試験に供
した。
に結合することによって、HIV−1 MNおよびIIIBの感染
を阻止することを確認するために、V3ループペプチド
が、この抗体による感染中和能力を無効にする試験に供
した。
モノクローナル抗体NM−01を、100TCID50の活性IIIB
ウィルスを添加する前に、MN、IIIBおよびZ6株のV3ルー
プに対応するペプチド(これらペプチドの配列を上記表
4に示した)の濃度を変化させながら、37℃で、30分間
インキュベートした。H9細胞を添加し、1時間後に、実
施例4にて記したように、完全培地にて7日間、細胞を
生育させた後、逆転写酵素活性を測定した。分析結果を
図7に示した。
ウィルスを添加する前に、MN、IIIBおよびZ6株のV3ルー
プに対応するペプチド(これらペプチドの配列を上記表
4に示した)の濃度を変化させながら、37℃で、30分間
インキュベートした。H9細胞を添加し、1時間後に、実
施例4にて記したように、完全培地にて7日間、細胞を
生育させた後、逆転写酵素活性を測定した。分析結果を
図7に示した。
モノクローナル抗体NM−01は、最も低いペプチド濃度
の場合には、IIIB感染を完全に中和したが、この中和能
は、抗体とループ・ペプチドとの前インキュベーション
の際に、MN(黒塗円)ならびにIIIB(白抜円)ループ・
ペプチドの濃度を累進的に増加させると、類心的に抑制
された。モノクローナル抗体NM−01によって認識される
アミノ酸の配列を持たないZ6株(黒塗菱形)のV3ループ
に対応するペプチドの同様の濃度においては、検出可能
な効果は見られなかった。これら結果は、モノクローナ
ル抗体NM−01がgp120 V3領域の特定部分と反応すること
により、HIV−1の感染を妨げていることを示唆してい
る。
の場合には、IIIB感染を完全に中和したが、この中和能
は、抗体とループ・ペプチドとの前インキュベーション
の際に、MN(黒塗円)ならびにIIIB(白抜円)ループ・
ペプチドの濃度を累進的に増加させると、類心的に抑制
された。モノクローナル抗体NM−01によって認識される
アミノ酸の配列を持たないZ6株(黒塗菱形)のV3ループ
に対応するペプチドの同様の濃度においては、検出可能
な効果は見られなかった。これら結果は、モノクローナ
ル抗体NM−01がgp120 V3領域の特定部分と反応すること
により、HIV−1の感染を妨げていることを示唆してい
る。
実施例7 モノクローナル抗体NM−01が、補体経路を活性化で
き、さらに、HIV−1ウィルス粒子を破壊できるか否か
を決定するための研究をさらに行った。この場合、ウサ
ギ血清を、補体源として使用した。
き、さらに、HIV−1ウィルス粒子を破壊できるか否か
を決定するための研究をさらに行った。この場合、ウサ
ギ血清を、補体源として使用した。
モノクローナル抗体NM−01と補体によるHIV−1の溶解 HIV−1 IIIB株で感染したH9細胞を、細胞毒性試験培
地(Cedar−lane Lab.社)にて洗浄した。細胞を、40μ
g/mlのモノローナル抗体を含有している細胞毒性試験培
地と抗体を含まぬ培地のいずれかに再懸濁した。4℃
で、2時間、インキュベーションした後、ウサギ抗体
(low−tox−MA;Cedarlane Lab.社)を、1:6に希釈して
添加した。細胞懸濁液を、4℃で、20分間、そして、37
℃で、45分間、インキュベーションした。細胞を、2%
グルタルアルデヒド/0.1M燐酸緩衝液ならびに1%四酸
化オスミウム/0.1M燐酸緩衝液で二重に固定した。エポ
キシ樹脂に包理した後、薄層部分を切断し、酢酸ウラニ
ルおよび酢酸鉛で二重染色した。図8、9および10は、
この薄層部分の電子顕微鏡写真である。
地(Cedar−lane Lab.社)にて洗浄した。細胞を、40μ
g/mlのモノローナル抗体を含有している細胞毒性試験培
地と抗体を含まぬ培地のいずれかに再懸濁した。4℃
で、2時間、インキュベーションした後、ウサギ抗体
(low−tox−MA;Cedarlane Lab.社)を、1:6に希釈して
添加した。細胞懸濁液を、4℃で、20分間、そして、37
℃で、45分間、インキュベーションした。細胞を、2%
グルタルアルデヒド/0.1M燐酸緩衝液ならびに1%四酸
化オスミウム/0.1M燐酸緩衝液で二重に固定した。エポ
キシ樹脂に包理した後、薄層部分を切断し、酢酸ウラニ
ルおよび酢酸鉛で二重染色した。図8、9および10は、
この薄層部分の電子顕微鏡写真である。
ウサギ血清のみ(図8B)およびモノクローナル抗体NM
−01のみでは、HIV−1の組織に関して検出可能な効果
は認められなかった。HIV−1をモノクローナル抗体NM
−01と補体とで処理することにより、エンベロープが粉
砕された無数のウィルス粒子の出現および電子密度の高
いコアー部分(図8A)の欠損が観察された。典型的な実
験例では、その大部分が内部コアの欠損を抱えている約
90%の溶解したウィルス粒子を示していた。ビリオンの
残りの10%は、無傷あるいは外皮エンベロープが部分的
に粉砕されたものである。高倍率にすると、図9AからF
および10AからFそれぞれの成熟あるいは不完全ウィル
ス粒子の溶解の一連の顕微鏡写真に見られる。このよう
にHIV−1の直接溶解によって生じた崩壊が認められ
る。
−01のみでは、HIV−1の組織に関して検出可能な効果
は認められなかった。HIV−1をモノクローナル抗体NM
−01と補体とで処理することにより、エンベロープが粉
砕された無数のウィルス粒子の出現および電子密度の高
いコアー部分(図8A)の欠損が観察された。典型的な実
験例では、その大部分が内部コアの欠損を抱えている約
90%の溶解したウィルス粒子を示していた。ビリオンの
残りの10%は、無傷あるいは外皮エンベロープが部分的
に粉砕されたものである。高倍率にすると、図9AからF
および10AからFそれぞれの成熟あるいは不完全ウィル
ス粒子の溶解の一連の顕微鏡写真に見られる。このよう
にHIV−1の直接溶解によって生じた崩壊が認められ
る。
実施例8 次に、モノクローナル抗体NM−01と補体との組み合わ
せを、そのHIV−1感染に関する効果について決定する
ために分析した。
せを、そのHIV−1感染に関する効果について決定する
ために分析した。
組織培養感染用量の決定 HIV−1 IIIB感染H9細胞を、細胞毒性試験培地(Cedar
lane Lab.社)にて二度洗浄し、2μg/mlのモノクロー
ナル抗体NM−01または対照IgG2bを含んだ細胞毒性試験
培地に再懸濁した。4℃で、2時間、インキュベーショ
ンした後、試料は等分され、ウサギ補体あるいは熱不活
化ウサギ血清(Cedarlane Lab.社)を、1:6に希釈して
添加した。細胞を、4℃で、20分間、そして、37℃で、
45分間、インキュベーションし、培地で洗浄し、50%FB
S/RPMI1640に再懸濁し、そして震盪した。上清あるいは
ウィルス分離株は、10倍希釈し、その25μlをH9細胞
(1x105/25μl)に添加する前に、引き続き2回希釈し
た。37℃で、3時間、インキュベーションした後、露出
した細胞は、10%FBS/RPMI1640で希釈され、そして37℃
に維持した。ウィルス感染は、6日後に逆転写酵素分析
法により決定された。H9細胞画分の50%組織培養感染用
量(TCID50)を、50%感染を示した希釈度によって決定
した。その実験を結果を表5に示した。
lane Lab.社)にて二度洗浄し、2μg/mlのモノクロー
ナル抗体NM−01または対照IgG2bを含んだ細胞毒性試験
培地に再懸濁した。4℃で、2時間、インキュベーショ
ンした後、試料は等分され、ウサギ補体あるいは熱不活
化ウサギ血清(Cedarlane Lab.社)を、1:6に希釈して
添加した。細胞を、4℃で、20分間、そして、37℃で、
45分間、インキュベーションし、培地で洗浄し、50%FB
S/RPMI1640に再懸濁し、そして震盪した。上清あるいは
ウィルス分離株は、10倍希釈し、その25μlをH9細胞
(1x105/25μl)に添加する前に、引き続き2回希釈し
た。37℃で、3時間、インキュベーションした後、露出
した細胞は、10%FBS/RPMI1640で希釈され、そして37℃
に維持した。ウィルス感染は、6日後に逆転写酵素分析
法により決定された。H9細胞画分の50%組織培養感染用
量(TCID50)を、50%感染を示した希釈度によって決定
した。その実験を結果を表5に示した。
モノクローナル抗体NM−01のみでも、HIVIIIBの感染
を中和することができるが、モノクローナル抗体NM−01
と補体による治療では、HIVIIIBの感染は10倍以下にま
で低下した。これら知見は、モノクローナル抗体NM−01
と補体双方にHIV−1を曝すことは、顕著なウィルス感
染の低下と関連し、さらにHIV−1治療におけるモノク
ローナル抗体NM−01による補体依存性ウィルス溶解への
役割を支持するものである。
を中和することができるが、モノクローナル抗体NM−01
と補体による治療では、HIVIIIBの感染は10倍以下にま
で低下した。これら知見は、モノクローナル抗体NM−01
と補体双方にHIV−1を曝すことは、顕著なウィルス感
染の低下と関連し、さらにHIV−1治療におけるモノク
ローナル抗体NM−01による補体依存性ウィルス溶解への
役割を支持するものである。
実施例9 モノクローナル抗体NM−01のH鎖とL鎖の可変領域
を、PCRによってクローニングし、配列決定した。NM−1
0 H鎖とL鎖可変領域のDANおよび推定アミノ酸配列を、
配列番号:14および15、ならびに配列番号:16および17に
それぞれ示した。配列番号:16のヌクレオチド1−21な
らびに334−363は、NM−01 L鎖配列を増幅するためのPC
Rプライマーと対応し、配列番号:14のヌクレオチド1−
27ならびに385−402は、NM−10 H鎖配列を増幅するため
のPCRプライマーと対応する。
を、PCRによってクローニングし、配列決定した。NM−1
0 H鎖とL鎖可変領域のDANおよび推定アミノ酸配列を、
配列番号:14および15、ならびに配列番号:16および17に
それぞれ示した。配列番号:16のヌクレオチド1−21な
らびに334−363は、NM−01 L鎖配列を増幅するためのPC
Rプライマーと対応し、配列番号:14のヌクレオチド1−
27ならびに385−402は、NM−10 H鎖配列を増幅するため
のPCRプライマーと対応する。
NM−01のH鎖とL鎖可変領域の最初の120個のアミノ
酸残基は、図11および12にもそれぞれ示し、図中、囲い
をしたアミノ酸は、抗体の結合特異性を決定する抗体の
相補性決定領域(CDRs)である。図において、H鎖もし
くはL鎖の各アミノ酸配列は、Liou et al.,supraにて
報告されたモノクローナル抗体BAT123の可変領域に対応
アミノ酸配列と比較した。MN−10のH鎖可変領域は、BA
T123のそれとは、全120個のアミノ酸の内、44個のアミ
ノ酸において相違している。両抗体のL鎖可変領域は、
24個のアミノ酸において相違している。重要なことは、
NM−01分子のH鎖(V−H)における三つのCDRsが、BA
T123のそれと、44から50%相違しており、一方で、L鎖
(V−L)における三つのCDRsの配列が、22から45%異
なっていることである。それ故、NM−01とBAT123の構造
の解析から、両者が互いに異なる抗体であることは明ら
かである。
酸残基は、図11および12にもそれぞれ示し、図中、囲い
をしたアミノ酸は、抗体の結合特異性を決定する抗体の
相補性決定領域(CDRs)である。図において、H鎖もし
くはL鎖の各アミノ酸配列は、Liou et al.,supraにて
報告されたモノクローナル抗体BAT123の可変領域に対応
アミノ酸配列と比較した。MN−10のH鎖可変領域は、BA
T123のそれとは、全120個のアミノ酸の内、44個のアミ
ノ酸において相違している。両抗体のL鎖可変領域は、
24個のアミノ酸において相違している。重要なことは、
NM−01分子のH鎖(V−H)における三つのCDRsが、BA
T123のそれと、44から50%相違しており、一方で、L鎖
(V−L)における三つのCDRsの配列が、22から45%異
なっていることである。それ故、NM−01とBAT123の構造
の解析から、両者が互いに異なる抗体であることは明ら
かである。
配列番号:14および16に記載されたDNA配列情報を基
に、NM−01抗体のヒト型化は、Tempest et al.,BIO/TEC
HNOLOGY,9,266−271,(1991)およびRiechmann et al.,
Nature,322,323−327(1988)の方法に従って、調製で
きるであろう。すなわち、モノクローナル抗体NM−01の
L鎖とH鎖の六つのCDRsをコードするDNA配列は、適切
なヒトH鎖またはL鎖の骨格領域をコードするDNA構築
物に導入されるであろう。その結果、H鎖およびL鎖可
変領域を完全にコードする構築物は、モノクローナル抗
体NM−01への結合特異性を有するヒト型化抗体を産生す
るために、ヒト定常領域をコードするDNAで宿主にて共
発現される。
に、NM−01抗体のヒト型化は、Tempest et al.,BIO/TEC
HNOLOGY,9,266−271,(1991)およびRiechmann et al.,
Nature,322,323−327(1988)の方法に従って、調製で
きるであろう。すなわち、モノクローナル抗体NM−01の
L鎖とH鎖の六つのCDRsをコードするDNA配列は、適切
なヒトH鎖またはL鎖の骨格領域をコードするDNA構築
物に導入されるであろう。その結果、H鎖およびL鎖可
変領域を完全にコードする構築物は、モノクローナル抗
体NM−01への結合特異性を有するヒト型化抗体を産生す
るために、ヒト定常領域をコードするDNAで宿主にて共
発現される。
本願発明は、好適な実施例に関して記述してきたが、
修正や変更が当業者によってなされるものと考えられ
る。それ故、請求した発明の範疇と等価の発明をすべて
包含する添付した請求の範囲を希求する次第である。
修正や変更が当業者によってなされるものと考えられ
る。それ故、請求した発明の範疇と等価の発明をすべて
包含する添付した請求の範囲を希求する次第である。
フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.6,DB名) C12N 15/06 - 15/08 C12P 21/08 C12N 5/16 - 5/28 A61K 39/395 WPZ(DIALOG) BIOSIS(DIALOG) MEDLINE(STN)
Claims (14)
- 【請求項1】配列番号:1に示したアミノ酸配列を必須的
に含むHIV−1gp120またはgp160のアミノ酸配列に特異的
に結合する能力、および逆転写酵素、p24、MT−2およ
びシンシチウム形成分析において、活性HIV−1株MNお
よびIII BによるH9細胞の感染をin vitroにて中和する
能力を有する、ことを特徴とするモノクローナル抗体。 - 【請求項2】前記モノクローナル抗体が、HIV−1粒子
の補体依存性ウィルス溶解を介在できる請求項1に記載
のモノクローナル抗体。 - 【請求項3】前記モノクローナル抗体が、HIV−1感染
細胞の抗体依存性細胞細胞毒性を介在できる請求項1に
記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項4】前記モノクローナル抗体が、キメラ抗体で
ある請求項1乃至3のいずれかに記載のモノクローナル
抗体。 - 【請求項5】前記モノクローナル抗体が、マウス由来抗
体である請求項1乃至4のいずれかに記載のモノクロー
ナル抗体。 - 【請求項6】前記モノクローナル抗体が、IgG抗体であ
る請求項1乃至5のいずれかに記載のモノクローナル抗
体。 - 【請求項7】請求項1乃至6のいずれかに記載のモノク
ローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞系。 - 【請求項8】A.T.C.C.受託番号HB10726を有するハイブ
リドーマ細胞系。 - 【請求項9】請求項8に記載のハイブリドーマ細胞系に
よって産生されたモノクローナル抗体、NM−01。 - 【請求項10】薬剤組成物であって、免疫学的に有効な
量の請求項1乃至6または9のいずれかに記載のモノク
ローナル抗体、および薬学的に許容された希釈剤、補助
剤、あるいは担体を含む、ことを特徴とする薬剤組成
物。 - 【請求項11】前記薬剤組成物が、免疫学的に有効な量
の補体をさらに含む請求項10に記載の薬剤組成物。 - 【請求項12】前記補体が、血清の形態である請求項11
に記載の薬剤組成物。 - 【請求項13】請求項1に記載のモノクローナル抗体の
可変領域断片。 - 【請求項14】前記抗体断片が、マウス由来のモノクロ
ーナル抗体の断片である請求項13に記載の抗体断片。
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ATE238420T1 (de) * | 1993-08-24 | 2003-05-15 | Nissin Food Products Ltd | Rekombinanter humanisierter antikörper gegen menschlichen immunschwächevirus |
US5618922A (en) * | 1994-07-25 | 1997-04-08 | Nissin Shokuhin Kabushiki Kaisha | NM03 antibody materials and methods |
US6780847B2 (en) | 1995-04-27 | 2004-08-24 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Glycosylation-resistant cyanovirins and related conjugates, compositions, nucleic acids, vectors, host cells, methods of production and methods of using nonglycosylated cyanovirins |
US6987096B1 (en) | 1995-04-27 | 2006-01-17 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Antiviral proteins and peptides, DNA coding sequences therefor, and uses thereof |
US5843882A (en) | 1995-04-27 | 1998-12-01 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Antiviral proteins and peptides |
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US7048935B2 (en) | 1995-04-27 | 2006-05-23 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Cyanovirin conjugates and matrix-anchored cyanovirin and related compositions and methods of use |
US6193982B1 (en) | 1995-04-27 | 2001-02-27 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health & Human Services | Anti-cyanovirin antibody with an internal image of gp120, a method of use thereof, and a method of using a cyanovirin to induce an immune response to gp120 |
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CN1339319A (zh) * | 2000-08-18 | 2002-03-13 | 清华大学 | 一种治疗艾滋病的药物及其制备方法 |
CA2441287C (en) | 2001-03-22 | 2014-06-10 | The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Glycosylation-resistant cyanovirins and related conjugates, compositions, nucleic acids, vectors, host cells, methods of production and methods of using nonglycosylated cyanovirins |
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CA1339857C (en) * | 1987-05-29 | 1998-05-05 | Cecily Rou-Yun Sun | Monoclonal antibodies to gp120 which neutraleze hiv-1 |
EP0339504A3 (en) * | 1988-04-26 | 1990-09-12 | The Du Pont Merck Pharmaceutical Company | Human immunodeficiency virus (hiv) env-coded peptide capable of eliciting hiv-inhibiting antibodies in mammals |
PT94276A (pt) * | 1989-06-05 | 1991-02-08 | Anticorpo monoclonal capaz de neutralizar o prototipo mn de hiv | |
JP2989862B2 (ja) * | 1990-07-02 | 1999-12-13 | 財団法人化学及血清療法研究所 | モノクローナル抗体 |
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1992
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- 1992-08-24 DE DE69227500T patent/DE69227500T2/de not_active Expired - Fee Related
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