JPH11502414A - ｇＣ１ｑレセプター、このレセプターに結合するＨＩＶ−１のｇｐ１２０領域、ならびに関連ペプチドおよび標的抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ｇＣ１ｑ−ＲのＨＩＶ−１ｇｐ１２０に対する結合部位を基本とした免疫原およびペプチド、ならびにＨＩＶ−１ｇｐ１２０のｇＣ１ｑ−Ｒに対する結合部位を基本とした免疫原およびペプチドを開示する。ｇＣ１ｑ−Ｒのｇｐ１２０に対する結合部位の配列を、配列番号２に示す。ＨＩＶ−１ｇｐ１２０のｇＣ１ｑ−Ｒに対する結合部位の配列を、配列番号３に示す。こうした免疫原ならびにペプチドのすべてに対する抗体および結合性分子、ならびにそうした抗体の体内での製造についても開示する。

Description

【発明の詳細な説明】 ｇＣ１ｑレセプター、このレセプターに結合するＨＩＶ−１のｇｐ１２０領域、 ならびに関連ペプチドおよび標的抗体発明の分野 本発明は、（１）ＨＩＶ−１のｇｐ１２０領域に結合し、ｇＣ１ｑレセプタ ー（ｇＣ１ｑ−Ｒ）を基本とするペプチド、ならびにこうしたペプチドに対する 抗体、（２）ｇＣ１ｑ−Ｒに結合するＨＩＶ−１ｇｐ１２０関連ペプチド、なら びにこうしたペプチドに対する抗体に関するものである。発明の背景 Ｃ１ｑは、補体古典経路のＣ１複合体の一成分である（R.B．Sim and K.B.M ．Reid，Immunology Today，1991; 12: 307-311）。Ｃ１ｑの生物学的機能は多 岐にわたっており、補体経路を開始させてオプソニン化や細胞溶解を生じさせた り、Ｃ１ｑレセプターを発現している細胞の種類に応じて、いくつかの異なった 機能を媒介したりしている。Ｃ１ｑは、単球／マクロファージでのＦｃＲおよび ＣＲ１依存性食作用を増強し（D.A．Bobak et al.，Eur．J．Immunol．1988; 18 :2001-2007; D.A．Bobak et al.，J．Immunol．1987; 138: 1150-1156）、Ｂ細 胞による免疫グロブリンの産生を刺激し（K.R．Young et al.，J．Immunol．199 1; 146: 3356-3364）、血小板を活性化してαllb/β₃インテグリン、Ｐ−セレク チン、プロ凝固活性を発現させ（E.I.B．Peerschke et al.，J．Exp．Med．1993 ; 178: 579-587; E.I.B．Peerschke et al.，J．Immunol．1994; 152: 5896-590 1）、マクロファージの腫瘍細胞傷害性を活性化し（R.W．Leu et al.，J．Immun ol．1990; 144: 2281-2286）、そして、Ｔ細胞の増殖に際して、抗増殖作用を発 揮する（A．Chen et al.，J．Immunol．1994; 153: 1430-1440）。 Ｃ１ｑ分子の球状ヘッドと結合する３３キロダルトン（ｋＤ）のレセプター （ｇＣ１ｑ−Ｒと称される）が最近特定され、クローニングされ、配列決定され た(B．Ghebrehiwet et al.，J．Exp．Med. 1994; 197:1809-1821; E.I.B. Peerschke et al.，J．Immunol．1994; 152: 5896-1901; A．Chen et al.，J．I mmunol．1994; 153: 1430-1440)。別の６０ｋＤのレセプター（ｃＣ１ｑ−Ｒと 称される）は、Ｃ１ｑのアミノ末端のコラーゲン様領域に結合する(B．Ghebrehi wet，Behring Inst．Mitt．1989; 84: 204-215; A．Chen et al.，J．Immunol． 1994; 153: 1430-1440)。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）での増幅によってｇ Ｃ１ｑ−ＲｍＲＮＡが検出され、免疫化学的方法によってｇＣ１ｑ−Ｒタンパク 質の発現が検出されたことから、このレセプターが、数多くの各種の細胞、たと えばＢ細胞、Ｔ細胞、単球／マクロファージ、好中球、好酸球、肝細胞、神経細 胞、平滑筋細胞に存在していることがわかった。しかし、ｇＣ１ｑ−ＲがＨＩＶ −１ｇｐ１２０に結合して、ＨＩＶの感染性を中和することは知られていなかっ た。 ヘルパー／インデューサーＴ細胞の表面に主に発現されるＣＤ４抗原が、Ｈ ＩＶ−１ｇｐ１２０の主たるレセプターであることは定説となっている(P.J．Ma ddon et al.，Cell 1986; 47: 333-385; J.S．McDougal et al.，Science 1986; 231: 382-385)。ＨＩＶ−１は、ＣＤ４⁺Ｔ細胞以外にも、単球／マクロファー ジ、Ｂ細胞、大腸上皮細胞および神経グリア細胞といった、細胞表面ＣＤ４が検 出不能であったり、細胞表面ＣＤ４を発現していても極めて低レベルであるよう ないくつかの他の細胞にも結合し、感染する能力を有している。標的細胞へのＨ ＩＶ−１の感染に関しては、いくつかの他のレセプター、たとえば、ヒト大腸上 皮細胞、シュワン細胞、およびオリゴデンドロサイトの表面上に存在するガラク トシルセラミド（Gal-Cer）(N．Yahl et al.，Virology 1994; 204: 550-557; J .M．Harouseetal.，Science 1991; 253: 320-323)、Ｂ細胞上に存在するlgMアイ ソタイプのヒト免疫グロブリンのＶ_H３遺伝子の産物（分子量、９５ＯｋＤ）(L ．Berberian et al.，Science 1993; 261: 1588-159)、活性化Ｔ細胞およびＢ細 胞上に存在するＣＤ２６（分子量、１１０ｋＤ）(C．Callebaut et al.，Scienc e 1993; 262: 2045-2050)、ならびに主にマクロファージ上に存在する膜関連Ｃ 型レクチン（分子量、４６ｋＤ）(B.M．Curtis et al.，Proc．Natl．Acad．Sci ．USA 1992; 89: 8356-8360)が関連していることも示唆されている。 本発明は、ＣＤ４非発現性細胞上に存在している、ＨＩＶ−１ｇｐ１２０に 対する細胞性の結合性タンパク質あるいはレセプターを見いだす研究の過程でな されたものである。この目的で、P．J．Nara(AIDS Res．Hum．Retroviruses 198 7; 3: 283-302)から入手したＣＥＭ−ＳＳ細胞（細胞表面ＣＤ４を高レベルで発 現するＴ細胞）、ならびにアメリカン・タイプカルチャー・コレクション（米国 メリーランド州ロックビル）から入手したＤＡＫＩＫＩ細胞（ＣＤ４陰性Ｂ細胞 ）のライゼートをドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけ、分離されたタンパク質をニトロセルロース膜上でブ ロッティングしてウェスタン免疫ブロット法を行った。ＣＥＭ−ＳＳならびにＤ ＡＫＩＫＩのライゼートの双方で、組換え体ｇｐ１２０あるいはＨＩＶ−１感染 細胞から誘導したｇｐ１２０が、３２−３３ｋＤのタンパク質バンドと反応して いることが見いだされ、このバンドは、抗ヒトＣＤ４モノクローナル抗体と反応 性の５５ｋＤのタンパク質バンドとは異なっていた。 この新規なｇｐ１２０結合性タンパク質をＮ末端アミノ酸配列決定によって 特定できるよう、このタンパク質を精製するために、大量のＤＡＫＩＫＩ細胞ラ イゼートを調製した。ｇｐ１２０結合性タンパク質を、プレップ・セル・モデル ４９１（Prep Cell Model 491）（バイオラッド・ラボラトリース社（Bio-Rad L aboratories Inc.）、米国カリフォルニア州ハーキュリース）を使用した分離用 電気泳動によって部分的に精製した。次に、サンプルを二次元ゲル電気泳動にか け、ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜にブロッティングしてウェス タン免疫ブロット法を行い、ｇｐ１２０と反応するタンパク質スポットを特定し 、Ｎ末端アミノ酸配列決定を行った。ｇｐ１２０反応性タンパク質のＮ末端の最 初の１５個のアミノ酸は、ｐ３２としてすでに特定されているタンパク質（分子 量、３２ｋＤ）（A.R．Krainer ら(Cell 1991; 66: 383-394)ならびにB．Honore ら(Gene 1993; 134: 282-287)によって、ヒトプレｍＲＮＡスプライシング因子 と同時に精製されたもの）のＮ末端配列と同一であることがわかった。さらなる 実験を行ったところ、ウサギ抗ｐ３２免疫グロブリン（大腸菌で発現させたｐ３ ２を精製したものを免疫原として使用することによって生成）でＤＡＫ ＩＫＩ細胞が染色されうることが明らかとなり、ＤＡＫＩＫＩ細胞の細胞表面に ｐ３２が存在することが示された。ＤＡＫＩＫＩ細胞が、細胞表面に免疫蛍光法 で検出可能なＣＤ４を発現していないにもかかわらず、組換えＨＩＶ−１ｇｐ１ ２０に結合することも示された。これらの知見を総合すると、ｐ３２が、ＨＩＶ −１ｇｐ１２０にとって、また別の表面結合性タンパク質であることがわかる。 その後、ｐ３２が、ｇＣ１ｑ−Ｒと同一の配列を有することが決定された(B.B． Ghebrehiwet et al.，J．Exp．Med．1994; 179: 1809-182)。 ｇＣ１ｑ−Ｒの前駆物質あるいはプレプロタンパク質は、２８２個のアミノ 酸を有しており、機能的で成熟したタンパク質は、２０９個のアミノ酸を有して いる。この成熟タンパク質は、配列番号１のアミノ酸残基番号７４（ロイシン） から２８２（グルタミン）までの間のペプチド部分を含んでいる。成熟ｇＣ１ｑ −Ｒタンパク質は、高度に帯電しており、酸性である。このタンパク質は、Ｎ− グリコシル化部位となりうる部位を、１１４、１３６、ならびに２２３のアミノ 酸の位置に３カ所有している。その結果、ｇＣ１ｑ−ＲのＳＤＳ−ＰＡＧＥでの 見かけの分子量は、アミノ酸組成から計算される２４．３ｋＤでなく、３２ｋＤ となっている。成熟タンパク質は、１８６の位置に、１個のみシステイン残基を 有しているので、タンパク質内に、イントラ鎖ジスルフィド結合はない。ｇＣ１ ｑ−Ｒは、Ｂ細胞、Ｔ細胞、単球／マクロファージ、好酸球、好中球、血小板、 上皮細胞、繊維芽細胞、肝細胞といった多岐にわたる各種の細胞に見いだされる 。 ｇＣ１ｑ−Ｒが、複数の免疫ならびに生理学上の機能に関与していることか らすると、ｇＣ１ｑ−ＲとＨＩＶ−１ｇｐ１２０との間の相互作用によって、Ｈ ＩＶ−１感染者の呈する免疫ならびに生理学上の機能不全のいくつかに説明がつ く可能性がある。また、各種の組織や器官の多岐にわたる各種のＣＤ４非発現性 ヒト細胞を感染させる能力をＨＩＶ−１が有していることも、こうしたことの結 果である。ｇＣ１ｑ−ＲとＨＩＶ−１ｇｐ１２０との間の相互作用に介入するこ とは、ＨＩＶ−１病と闘っていくうえでの新たな戦略となるものである。以下に 、こうした発明戦略にもとづくいくつかの発明を記載する。発明の開示 本発明は、ｇＣ１ｑ−ＲのＨＩＶ−１ｇｐ１２０に対する結合部位を基本と する免疫原およびペプチド、ならびに、ＨＩＶ−１ｇｐ１２０のｇＣ１ｑ−Ｒに 対する結合部位を基本とする免疫原およびペプチドを包含するものである。ｇＣ １ｑ−Ｒのｇｐ１２０に対する結合部位の配列を、配列番号２に示す。ＨＩＶ− １ｇｐ１２０のｇＣ１ｑ−Ｒに対する結合部位の配列を、配列番号３に示す。本 発明は、こうした免疫原ならびにペプチドのすべてに対する抗体ならびに結合性 分子、そして、こうした抗体の体内での（endogenousな）生成を誘導することに も関するものである。本発明の他の観点ならびに実施態様を、以下にさらに説明 する。図面の簡単な説明 図１は、全長の成熟形態のｇＣ１ｑ−Ｒ（１個目−２０９個目のアミノ酸） 、ならびに３種の切断形態のｇＣ１ｑ−Ｒを大腸菌中で発現させるのに使用した ベクターｐＴ７−７の制限マップである。ｇＣ１ｑ−Ｒ（δ１−５７）は、ｇＣ １ｑ−Ｒ（５８個目−２０９個目のアミノ酸）を表し、ｇＣ１ｑ−Ｒ（Ｃ）は、 ｇＣ１ｑ−Ｒ（９５個目−２０９個目のアミノ酸）を表し、ｇＣ１ｑ−Ｒ（Ｎ） は、（１個目−９４個目のアミノ酸）を表す。 図２は、ＥＬＩＳＡによって測定したＨＩＶ−１ｇｐ１２０のｇＣ１ｑ−Ｒ への結合を示す。Ｙ軸は、ＨＩＶ−１ｇｐ１２０のｇＣ１ｑ−Ｒに対する反応性 を、４５０nmでのＯＤ表し、Ｘ軸は、ＨＩＶ−１ｇｐ１２０の溶液中の濃度であ る。 図３Ａは、ＣＥＭ−ＳＳ細胞での、ｇＣ１ｑ−ＲによるＨＩＶ−１ＩＩＩＢ の感染性の中和を示す。図中、Ｖｎは、２つの試験ウェルでのシンシチウムの平 均数、Ｖｏは、２つの対照ウェルでのシンシチウムの平均数である。 図３Ｂは、ＣＥＭ−ＳＳ細胞での、ｇＣ１ｑ−ＲによるＨＩＶ−１ＭＮの感 染性の中和を示す。図中、Ｖｎは、２つの試験ウェルでのシンシチウムの平均数 、Ｖｏは、２つの対照ウェルでのシンシチウムの平均数である。 図３Ｃは、ＣＥＭ−ＳＳ細胞での、ｇＣ１ｑ−ＲによるＨＩＶ−１ＲＦの感 染性の中和を示す。図中、Ｖｎは、２つの試験ウェルでのシンシチウムの平均数 、Ｖｏは、２つの対照ウェルでのシンシチウムの平均数である。 図４は、ＨＩＶ−１ＩＩＩＢに感染したＨ９細胞と、ＣＤ４⁺のＨｅＬａ細 胞の融合の、ｇＣ１ｑ−Ｒによる抑制を示す。 図５は、ＨＩＶ−１ＩＩＩＢに感染したＨ９細胞への、精製した大腸菌発現 ｇＣ１ｑ−Ｒの結合をフローサイトメトリーによって測定したものである。 図６は、ＥＬＩＳＡにおいて、ＨＩＶ−１ｇｐ１２０のｇＣ１ｑ−Ｒへの結 合に、Ｃ１ｑが及ぼす影響を示す。黒丸を結んだ線は、Ｃ１ｑについてのもので あり、黒四角を結んだ線は、ｇＣ１ｑ−Ｒについてのものである。Ｙ軸は、ｇｐ １２０のｇＣ１ｑ−Ｒとの反応性を、４５０nmでのＯＤとして示し、Ｘ軸は、Ｃ １ｑならびにｇＣ１ｑ−Ｒの溶液中での濃度を示す。 図７は、ＥＬＩＳＡにおける、固相抗原とした各種形態の大腸菌発現ｇＣ１ ｑ−Ｒとの、ＨＩＶ−１ｇｐ１２０の反応性を示す。黒四角を結んだ線は、全長 の成熟形態のｇＣ１ｑ−Ｒ（１個目−２０９個目のアミノ酸）についてのもので ある。黒丸を結んだ線は、Ｎ末端の５７個のアミノ酸の欠失した、切断ｇＣ１ｑ −Ｒ（５８個目−２０９個目のアミノ酸）についてのものである。黒三角を結ん だ線は、Ｎ末端構築物のｇＣ１ｑ−Ｒ（１個目−９４個目のアミノ酸）について のものである。黒逆三角形を結んだ線は、Ｃ末端構築物のｇＣ１ｑ−Ｒ（９５個 目−２０９個目のアミノ酸）についてのものである。Ｙ軸は、ＨＩＶ−１ｇｐ１ ２０の各種形態のｇＣ１ｑ−Ｒとの反応性を、４５０nmでのＯＤとして示し、Ｘ 軸は、ｇｐ１２０の溶液中での濃度を示す。 図８は、抗体９９−１２−１の、ｇＣ１ｑ−ＲペプチドであるＬＭ１２ＤＮ に対する結合を示す。黒四角を結んだ線は、ペプチドＬＭ１２ＤＮについてのも のであり、黒丸を結んだ線は、ペプチドＴＤ１８ＥＥについてのものである。Ｙ 軸は、９９−１２−１の両ペプチドとの反応性を、４５０nmでのＯＤとして示し 、Ｘ軸は、９９−１２−１の溶液中での濃度を示す。 図９は、抗ｇＣ１ｑ−Ｒモノクローナル抗体９９−１２−１による、ｇＣ１ ｑ−ＲのＨＩＶ−１ｇｐ１２０との結合との競合を示す。 図１０は、抗ＨＩＶ−１ｇｐ１２０抗体であるＧ３−２９９ならびに６２０ ５による、ＨＩＶ−１ｇｐ１２０のｇＣ１ｑ−Ｒとの結合との競合を示す。黒丸 を結んだ線は、ＨＩＶ−１ｇｐ１２０のＣ４領域に対する抗体であるＧ３−２９ ９についてのもので、黒四角を結んだ線は、ＨＩＶ−１ｇｐ１２０のＣ５領域の ペプチド（ＨＸＢ２Ｒのアミノ酸残基番号４９７−５１１、配列番号１０）に対 して特異的なポリクローナルヒツジ抗体である６２０５についてのものであり、 黒三角を結んだ線は、組換え型の可溶性ＣＤ４（ｒｓＣＤ４）についてのもので ある。 図１１は、ＨＩＶ−１ｇｐ１２０のＣ４領域のペプチドであるＲＣ１２ＬＴ 、ＴＧ１２ＮＮ、ならびにＲＣ１６ＧＧとの、ｇＣ１ｑ−Ｒの反応性を示す。黒 三角を結んだ線は、ＲＣ１６ＧＧについてのものであり、黒丸を結んだ線は、Ｔ Ｇ１２ＮＮについてのものであり、黒四角を結んだ線は、ＲＣ１２ＬＴについて のものである。Ｙ軸は、ｇＣ１ｑ−Ｒの各種ペプチドとの反応性を、４５０nmで のＯＤとして示し、Ｘ軸は、ｇＣ１ｑ−Ｒの溶液中での濃度を示す。発明の実施と利用 Ａ． ｇＣ１ｑ−Ｒペプチド ｇＣ１ｑ−Ｒの完全なヌクレオチド配列ならびに推定アミノ酸配列を、配列 番号１に示す。大腸菌で発現させ、以下に記載する免疫感作をはじめとする各種 実施例で使用した組換えｇＣ１ｑ−Ｒは、配列番号１のアミノ酸残基番号７４か ら始まるＣ末端部分の全体である。この部分は、ｇＣ１ｑ−Ｒの可溶性成熟タン パク質に相当し、この部分を調べた。Ｎ末端部分は、プレプロタンパク質中の疎 水性膜アンカーである可能性がある。 後述の実施例１０に記載するように、抗ｇＣ１ｑ−Ｒモノクローナル抗体で ある９９−１２−１（配列番号２のペプチドに結合する）によって、ｇｐ１２０ のｇＣ１ｑ−Ｒへの結合が完全に阻害されることから、配列番号１のアミノ酸残 基番号２３９−２５０をカバーするペプチド部分が、ｇｐ１２０に対しての活性 結合部位であると特定された。 ｇｐ１２０のｇＣ１ｑ−Ｒに対する活性結合部位を、独立したペプチド（以 下では「ｇｐ１２０結合部位」と称する）として発現させたり、ｇｐ１２０結合 部位を含む任意のもっと長いペプチド（たとえば、全ｇＣ１ｑ−Ｒ配列を表すよ うなペプチド）として発現させたりすること（後述の実施例１を参照のこと）も 、ｇｐ１２０結合部位あるいはこうしたもっと長いペプチドを、他のタンパク質 、たとえば鍵穴リンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）をはじめとする免疫原性を増 大させるようなキャリア分子と結合させることも、また、ｇｐ１２０結合部位を 免疫原的立体配置を生じるペプチドあるいは分子と結合させてその免疫原性を増 大させることも、また、ｇｐ１２０結合部位と構造的あるいは免疫学的に均等な ペプチド（以下では、そうしたペプチドのすべてを「ｇｐ１２０結合部位ペプチ ド」と称する）を、同一目的で使用することも可能である。 ｇｐ１２０結合部位ペプチドは、診断目的の検定で、ＨＩＶ−１ｇｐ１２０ 、ＨＩＶのビリオン、あるいはＨＩＶ−１感染細胞を検出ないし定量するうえで 有用である。こうした診断目的の検定では、固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ） のような標準的な検定フォーマットを使用することができる。ＥＬＩＳＡでは、 ｇｐ１２０結合部位ペプチドを、不活性な固相支持体あるいは磁性ビーズに、直 接、または架橋剤あるいは特異結合物質を介して間接的に固定しておくことがで き、体液試験サンプルは、コーティングしておいた固相支持体とともにインキュ ベートする。ｇｐ１２０結合部位ペプチドと反応性であるような、遊離したＨＩ Ｖ−１ｇｐ１２０分子あるいはｇｐ１２０分子を有するＨＩＶ−１ビリオンは、 この支持体に結合することになる。結合したＨＩＶ−１ｇｐ１２０分子、あるい はＨＩＶ−１ビリオンは、その後、モノクローナルあるいはポリクローナル抗Ｈ ＩＶ抗体で検出し、さらに、酵素を結合させた二次検出用抗体と反応させて、呈 色反応によって定量することができる。また、補足されたｇｐ１２０分子あるい はビリオンを、もっと別の方法、たとえば蛍光、化学発光、放射能の計数、ある いはＰＣＲによって検出することもできる。 ｇｐ１２０結合部位ペプチドは、患者の血液サンプルをはじめとする各種検 体中のＨＩＶ−１感染細胞を、直接ないし間接的な免疫化学的方法によって検出 したり定量したりする際にも使用することができる。たとえば、こうした検定の 一例では、感染細胞をｇｐ１２０結合部位ペプチドと接触させてから、このペプ チドと結合する抗体で標識する。こうした検出用抗体は、蛍光プローブと、直接 ないし間接的に結合させることができ、その後、蛍光顕微鏡下で細胞を観察した り、フローサイトメトリー法を使用することによって免疫蛍光を検出する。また 、ｇｐ１２０結合部位ペプチドを、酵素、放射性核種、蛍光プローブあるいはビ オチンで、直接標識することもできる。細胞に結合させた標識ペプチドは、すで に十分確立されている方法によって、同様にして検出することができる。 ｇｐ１２０結合部位ペプチド、あるいはｇｐ１２０結合部位ペプチドと任意 の誘導体生成物、たとえば、トキシン（たとえば、リシンＡ、ジフテリアトキシ ン、緑膿菌エキソトキシンＡ、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質）、高 エネルギー放射性核種（たとえば、ヨウ素１３１、インジウム１１１、イットリ ウム９０）、細胞傷害物質（たとえば、ドキソルビシン）、細胞膜活性分子（た とえば、ホスホリパーゼ、補体、サポニン）との複合体、あるいはｇｐ１２０結 合部位ペプチドのマイクロキャリア（たとえば、リポソーム）は、ＨＩＶ−１疾 患の治療、あるいはＨＩＶ−感染症の予防に使用することができる。ｇＣ１ｑ− Ｒの成熟タンパク質の全配列に対応するペプチドは、いくつかの多岐にわたるＨ ＩＶ−１の系統の in vitroでの感染性を中和し、ＣＤ４陽性細胞とＨＩＶ−１ ＩＩＩＢ感染細胞とのシンシチウムの形成を抑制する。たとえば、後述の実施例 ５および６を参照されたい。投与したｇｐ１２０結合部位ペプチドも、ｇｐ１２ ０と結合してＨＩＶ−１を中和し、ＨＩＶ−１が他の細胞に細胞同士の融合（シ ンシシウムの形成）によって感染するのを防止するものと予測される。こうした 投与は、ＨＩＶ−１疾患の治療の役目をはたすはずであるし、また、ＨＩＶ−１ との接触の前あるいは直後に、ＨＩＶ−１による感染を防止する目的で予防的に 投与することもできる。予防目的で使用する場合には、ｇｐ１２０結合部位ペプ チドは、ハイリスクグループ、たとえば、静注ドラッグユーザーやヘルスケアの 従事者に予防手段として投与することが可能である。また、ｇｐ１２０結合部位 ペプチドを、注射針による創傷の直後に使用して感染を予防したり、出産前ある いは出産直後に使用して、ＨＩＶ−１の母子感染を防止することもできる。 ｇｐ１２０結合部位ペプチドは、固相支持体に結合させることができる。こ うして加工した支持体は、ＨＩＶ−１感染者の体外で、遊離状態のＨＩＶ−１ビ リオンならびにＨＩＶ−１感染細胞を感染者から除去して、ウイルス負荷を低減 する際に使用することができる。 Ｂ． ｇＣ１ｑ−Ｒペプチドに対する抗体 ｇＣ１ｑ−Ｒに対するモノクローナルあるいはポリクローナル抗体は、後述 の実施例２に記載したような周知の方法で容易に作製することができる。こうし たモノクローナル抗体は、免疫原として、一価あるいは多価のｇＣ１ｑ−Ｒ、ま たはｇｐ１２０結合部位ペプチドを使用することによって生成することができる 。ｇＣ１ｑ−Ｒペプチド（あるいはｇｐ１２０結合部位ペプチド）は、免疫感作 ならびに融合の後にハイブリドーマをスクリーニングする際にも使用することが できる。また、ｇｐ１２０結合部位ペプチドの任意のもの、あるいはｇｐ１２０ のＣ４領域の関連部分と結合しうる均等なペプチドを、１種あるいは２種以上の タンパク質キャリアと組み合わせて使用して、免疫原を作製することもできる。 タンパク質キャリアとして好適なものとしては、ＫＬＨ、破傷風トキソイド、無 菌化ウシ型結核菌（ＢＣＧ）がある。組換え型タンパク質抗原、たとえば、ワク シニアウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、アデノウイルス、あるいはインフルエンザ ウイルス由来の組換え型タンパク質抗原も使用することができる。これらのキャ リアは、化学的にｇｐ１２０結合部位ペプチドに結合することも、キャリアペプ チド全体を組替え宿主細胞によって発現させることもできる。ポリクローナル抗 体は、ｇｐ１２０結合部位ペプチドあるいは均等なペプチドを免疫原として使用 することによって、動物（たとえば、齧歯類、ヒツジ、ヤギ、モルモット、ウサ ギ、ヒト以外の霊長類）中で作製することができる（後述の実施例３を参照され たい。） ｇＣ１ｑ−Ｒのｇｐ１２０結合部位ペプチドに特異的なモノクローナルある いはポリクローナル抗体は、ｇｐ１２０結合部位ペプチドをコードするデオキシ オリゴヌクレオチドをＤＮＡ免疫原として、動物を免疫感作することによっても 生成することができる（J..J．Donnelly et al.，J．Immunol．Meth．1994; 176: 145-152）。ｇＣ１ｑ−Ｒをコードする特異的なオリゴヌクレオチドは、発 現ならびに遺伝子ターゲティングを増強する目的で、他の発現ベクター（たとえ ば、ワクシニアウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウ イルス、あるいはアデノウイルス）とともに構築することができる。また、直接 的な筋内注射、ＤＮＡでコーティングした高速金微小プロジェクタイルのような 機械的手段による表皮のトランスフェクション、化学的手段（たとえばリン酸カ ルシウム）あるいは電気的手段によるex-vivoでのトランスフェクションを用い て、オリゴヌクレオチドを宿主細胞に挿入し、抗原を発現させて特異的な抗体反 応を誘導することもできる。 こうしたモノクローナルあるいはポリクローナル抗体は、数多くの用途を有 している。こうした抗体は、上述したような免疫蛍光法の方式をはじめとする各 種の方法を使用して、ｇＣ１ｑ−Ｒレセプターを発現している細胞、たとえばＢ 細胞、Ｔ細胞、単球／マクロファージ、好中球、好酸球、繊維芽細胞、血小板、 内皮および平滑筋細胞を検出する際に使用することができる。ｇＣ１ｑ−Ｒと反 応性のモノクローナル抗体９９−１２−１は、ｇＣ１ｑ−Ｒとの結合に際して、 ｇｐ１２０と競合することが示された（後述の実施例１１に記載した実験を参照 のこと）。したがって、これらもＨＩＶ−１疾患の治療に使用することができ、 ＨＩＶ−１との接触の前あるいは直後に予防目的で投与した場合には、ＨＩＶ− １の感染の防止に使用することができる。 ＨＩＶ−１疾患の治療あるいはヒトへの感染の防止に使用する場合には、キ メラ抗体、ヒト化抗体、あるいはヒト抗体のかたちで使用するのが好ましい。組 換え法によって昨出されたキメラ抗体は、当業界では周知であり、動物の可変領 域とヒトの定常領域とを有している。ヒト化抗体は、キメラ抗体より多くのヒト ペプチド配列を有している。ヒト化抗体では、抗原との結合ならびに特異性に関 わりのある相補性決定領域（ＣＤＲ）のみが動物抗体に対応するアミノ酸配列を 有しており、分子の残りの部分の実質的にすべてがヒト由来であり、アミノ酸配 列がヒト抗体と対応している。L．Riechmann et al.，Nature 1988; 332: 323-3 27; G．Winter、米国特許番号5,225,539; C．Queen et al.，国際特許番号 WO90/07861を参照されたい。 ヒト抗体は、いくつかの異なった方法、たとえば、ヒト免疫グロブリン発現 ライブラリー（ストラタジーン社（Stratagene Corp）、米国カリフォルニア州 ラジョラ）を使用して、ヒト抗体の各種フラグメント（Ｖ_H，Ｖ_L，Ｆ_V，Ｆ_d、Ｆ_ab 、あるいは（Ｆ_ab‘）₂）を作製し、これらのフラグメントを使用して、キメ ラ抗体の作出に使用するのと類似した方法を使用することによりヒト抗体全体を 構築することによって作製することができる。ヒト抗体は、ジェンファーム・イ ンターナショナル（GenPharm International）（米国カリフォルニア州、マウン テンビュー）によって製造された、ヒト免疫グロブリンゲノムを有するトランス ジェニックマウス中で生成することもできる。動物は、ｇｐ１２０結合部位ペプ チドで免疫感作する。ｇｐ１２０結合部位ペプチドに対するヒト抗体は、免疫原 の接種を受けたワクチン被接種動物中に見いだされる。ハイブリドーマあるいは ＥＢＶでトランスフォームしたＢ細胞の株化細胞は、ドナーのＢ細胞から生成す ることができる。ヒト抗体は、抗ｇｐ１２０結合部位抗体の重鎖ならびに軽鎖を コードしているｍＲＮＡを使用することにより、コンビナトリアル・ライブラリ ーの方法によっても生成することができ（T.A．Collet et al.，Proc．Natl．Ac ad．Sci．USA 1992; 89: 10026-10030）。これらのｍＲＮＡは、上述のようにし て、ワクチン被接種動物のＢ細胞から得ることができる。 また、重鎖と軽鎖のＦ_v領域が連結している単一ペプチド鎖結合分子を作出 することもできる（J.S．Huston et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 1983; 8 5: 5879-5883）。全体あるいは一部がヒト由来である抗体は、いずれも、全体が 齧歯類由来のモノクローナル抗体より免疫原性が低く、フラグメントならびに単 一鎖抗体の場合も、免疫原性が低い。したがって、これらのタイプの抗体は、い ずれも、免疫応答あるいはアレルギー応答を生じる危険性が低い。その結果、こ うした抗体の方が、全体が動物由来の抗原よりは、ヒトへの in vivoでの投与に 適しており、特に、長期にわたる反復投与が必要な場合には、こうした抗体の方 が適切である。 ｇｐ１２０結合部位ペプチドに対する抗体は、動物（たとえばマウス）に投 与して、抗イディオタイプモノクローナル抗体を生成させることができる。抗イ ディオタイプは、もともとの抗原に類似している可能性があり、したがって、免 疫原として使用して、ｇｐ１２０結合部位ペプチドに対する抗体を生成させたり 、ｇＣ１ｑ−Ｒとして使用して、ＨＩＶ−１による感染を防止したりすることが できる。 Ｃ． ｇＣ１ｑ−Ｒに結合するＨＩＶ−１ｇｐ１２０ペプチド 配列番号３に示す、ＨＸＢ２Ｒ系統のＨＩＶ−１ｇｐ１２０のアミノ酸残基 番号４４４−４５９の配列を有する組換えペプチドは、実施例１３で後述する方 法によって、ｇＣ１ｑ−Ｒと結合することが示された。このペプチド部分は、ｇ ｐ１２０上のＣ４と称される領域に位置している（C.K．Leonard et al.，J．Bi ol．Chem．1990; 265: 10373-10382）。このペプチドを、以下では、「ｇＣ１ｑ −Ｒ結合部位ペプチド」と称する。ｇＣ１ｑ−Ｒとの結合能力を有するこのペプ チド、または、このペプチドあるいは均等なペプチドを含むもっと長いペプチド は、こうしたｇｐ１２０の領域を標的とするモノクローナルあるいはポリクロー ナル抗体を作出する際に、免疫原として使用することができる。 配列番号３に示す配列を有する組換えペプチド、またはこのペプチドあるい はｇＣ１ｑ−Ｒとの結合能力を有する均等なペプチドを含むもっと長いペプチド 、またはこのペプチドを基本とするもっと別の免疫原（たとえば、これらのペプ チドを好適なキャリアタンパク質、たとえばＫＬＨ、破傷風トキソイド、あるい はＢＣＧと結合させることによって作製したもの、または、これらのペプチドを 免疫原構造、たとえば、欠陥あるいは弱毒化形態のＢ型肝炎ウイルス、アデノウ イルス、あるいなインフルエンザウイルスの一部として含むもの）を、上述のＨ ＩＶ−１に対するワクチンとして使用することができる。こうしたキャリアは、 ｇｐ１２０結合部位ペプチドに化学的に結合させることも、また、キャリアペプ チド全体を組換え宿主細胞から発現することも可能である。これらをワクチンと して使用した場合には、抗体が体内で（endogenousに）生成することとなり、生 成した抗体は、ｇｐ１２０のｇＣ１ｑ−Ｒ結合部位と結合して、ＨＩＶ−１を中 和するか、あるいはまた、ＨＩＶ−１感染細胞に結合して、細胞同士の融合に よるウイルスの伝搬を防止したり、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）ある いは補体媒介性細胞傷害（ＣＭＣ）によって感染細胞を殺すこととなる。 ｇｐ１２０のｇＣ１ｑ−Ｒに対する結合部位に対して特異的なモノクローナ ルあるいはポリクローナル抗体は、ＤＮＡ免疫原である、ｇＣ１ｑ−Ｒ結合部位 ペプチドをコードするデオキシオリゴヌクレオチドで動物を免疫感作することに よっても作製することができる（J..J．Donnelly et al.，J．Immunol．Meth．1 994; 176: 145-152）。ｇｐ１２０のこの部分をコードしている特異的オリゴヌ クレオチドは、発現ならびに遺伝子ターゲティングを増強する目的で、他の発現 ベクター（たとえば、ワクシニアウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、サイトメガロウ イルス、レトロウイルス、あるいはアデノウイルス）とともに構築することがで きる。また、直接的な筋内注射、表皮をトランスフェクションするＤＮＡでコー ティングした高速金微小プロジェクタイルのような機械的手段、化学的手段（た とえばリン酸カルシウム）電気的手段によるex-vivo トランスフェクションを用 いて、オリゴヌクレオチドを宿主細胞に挿入し、抗原を発現させて特異的な抗体 の反応を誘導することもできる。 Ｄ． ＨＩＶ−１ｇｐ１２０ペプチドに対する抗体 ｇＣ１ｑ−Ｒ結合部位ペプチドを表す配列番号３に対するモノクローナル抗 体は、動物（たとえば齧歯類ならびにヒト以外の霊長類）を、ｇｐ１２０あるい はそうしたペプチド、または上述の免疫原で免疫感作することによって、通常の 方法で作製することができる。ポリクローナル抗体も、上述したような周知の方 法を使用することによって作製することができる。 （ｇｐ１２０のＣ４領域中の）ｇＣ１ｑ−Ｒ結合部位ペプチドに対するモノ クローナルあるいはポリクローナル抗体も、この領域あるいはもっと長い領域を コードするオリゴヌクレオチドを、上述のようなＤＮＡ免疫原あるいはワクチン として用いることによって、動物あるいはヒトで作製することができる。 こうしたモノクローナルあるいはポリクローナル抗体は、診断目的の検定で 、ＨＩＶ−１ｇｐ１２０、ＨＩＶ−１ビリオン、あるいはＨＩＶ−１感染細胞を 検出あるいは定量する際に使用することができる。こうした診断目的の検定に際 しては、ＥＬＩＳＡのような標準的な検定方式を使用することができる。ＥＬＩ ＳＡは、不活性固相支持体あるいは磁性ビーズ上に、ＨＩＶ−１ｇｐ１２０のペ プチドでなく、抗ＨＩＶ−１ｇｐ１２０抗体を固定する以外は、ｇｐ１２０結合 部位ペプチドに関して上述したのと同様の構成とする。その後、体液試験サンプ ルを、コーティングした支持体とともにインキュベートすると、支持体には、抗 体と反応性のＨＩＶ−１ｇｐ１２０、あるいはｇｐ１２０を有するＨＩＶ−１ビ リオンが結合する。結合したビリオンあるいはｇｐ１２０は、別のモノクローナ ルあるいはポリクローナル抗ＨＩＶ−１抗体で検出し、さらに、酵素を結合させ た検出用二次抗体と反応させて、呈色反応によって定量することができる。補足 されたｇｐ１２０あるいはＨＩＶ−１ビリオンは、もっと別の方法、たとえば蛍 光、化学発光、放射能の計数、あるいはＰＣＲによって検出することもできる。 これらの抗体は、患者の血液サンプル中のＨＩＶ−１感染細胞を、直接ない し間接的な免疫化学的方法によって検出したり定量したりする際にも使用するこ とができる。また、これらの抗体は、酵素、放射性核種、蛍光プローブあるいは ビオチンで、直接標識することもできる。細胞に結合した標識抗体は、すでに十 分確立されている方法によって検出すればよい。 ＨＩＶ−１のｇｐ１２０領域のＣ４領域中に位置しているｇＣ１ｑ−Ｒ結合 部位に対する抗体は、ＨＩＶ−１疾患の治療あるいはＨＩＶ−１の感染予防に使 用しうる可能性も有するものである。これらの抗体は、独自に使用することも、 他の抗ＨＩＶ−１中和抗体、組換え可溶性ＣＤ４、抗レトロウイルス薬、あるい はサイトカインと組み合わせて使用することもできる。こうした抗体がｇｐ１２ ０に結合すると、ｇｐ１２０のｇＣ１ｑ−Ｒとの結合が抑制され、その結果、標 的細胞の感染が防止されるので、こうした抗体には中和作用があるものと想定で きる。これらの抗体は、ＨＩＶ−１感染症の治療あるいは防止に使用する場合に は、キメラ抗体、ヒト化抗体、あるいはヒト抗体のかたちで使用するのが好まし い。こうしたかたちの抗体の製法は、上述したとおりである。また、ｇＣ１ｑ− Ｒ結合部位ペプチドで、ヒト免疫グロブリンゲノムを有するトランスジェニック マウスを免疫感作して、ヒト抗体を製造することもできる。また、ｇｐ１２０の Ｃ４領域に対するヒト抗体は、ＨＩＶ−１の感染者、あるいはｇＣ１ｑ−Ｒ結合 部位ペプチドを含む免疫原の接種を受けたワクチン被接種者中に見いだされる。 これらのドナーのＢ細胞から、ハイブリドーマあるいはＥＢＶでトランスフォー ムしたＢ細胞の株化細胞を作ることもできる。ヒト抗体は、抗Ｃ４抗体の重鎖な らびに軽鎖をコードしているｍＲＮＡを使用することにより、コンビナトリアル ・ライブラリーの方法によって生成することができ（T.A．Collet et al.，proc ．Natl．Acad．Sci．USA 1992; 89: 10026-10030）。これらのｍＲＮＡは、上述 のようにして、ＨＩＶ−１感染者あるいはワクチン被接種者のＢ細胞から得るこ とができる。 このモノクローナルあるいはポリクローナル抗体は、細胞傷害物質をターゲ ティングして感染細胞を殺す際にも使用することができ、その際には、複合体の かたちとすることも、マイクロキャリア（リポソーム）のかたちとすることもで きる。複合させる物質は、たとえば、トキシン、細胞傷害物質、膜活性酵素ある いは化学物質、ならびに高エネルギー放射性核種とすることができる。 ｇｐ１２０上のｇＣ１ｑ−Ｒ結合部位に対する抗体は、固相支持体に結合さ せることができる。こうして加工した支持体は、ＨＩＶ−１感染者の体外で、遊 離状態のＨＩＶ−１ビリオンならびにＨＩＶ−１感染細胞を感染者から除去して 、ウイルス負荷を低減する際に使用することができる。 ｇｐ１２０上のｇＣ１ｑ−Ｒ結合部位に対する抗体は、各種の特異性を有す る別の抗体（たとえば、細胞表面マーカーあるいはＨＩＶ−１抗原）と組み合わ せることによって修飾することもできる。こうした二重特異性抗体は、化学的に 複合化することによって生成することも（S.A．Kostelny et al.，J．Immunol． 1992; 148: 1547-1553; A．Mabondzo et al.，J．lnf．Dis．1992; 166: 93-99 ）、２種のハイブリドーマを融合させることによって生成することもできる（S. M．Chamow et al.，J．Immunol．1994; 153: 4268-4280）。 ｇＣ１ｑ−Ｒ結合部位ペプチドに対する抗体は、動物（たとえばマウス）に 注射して、抗イディオタイプモノクローナル抗体を生成させることができる。抗 イディオタイプは、ターゲティングした抗体の生成に使用したもともとの抗原に 類似している可能性があり、したがって、免疫原として使用して、ｇＣ１ｑ−Ｒ 結合部位に対する抗体を生成させることができる。 本発明をいかに実施し、使用するか、そして本発明がいかに有用であるかを 実証する実施例を、以下に示す。 実施例１：ｇＣ１ｑ−Ｒタンパク質の大腸菌内での発現 Ａ． ＲＮＡの単離とｃＤＮＡの調製 ５ｘ１０⁶個のＤＡＫＩＫＩ細胞から、ＲＮＡ−ＺＯＬ抽出法を製造業者（ バイオテックス（Biotecx）、米国テキサス州ヒューストン）の指示通りに行う ことによって、全ＲＮＡを単離した。１０μｇのＲＮＡを鋳型として使用して、 ５０mMのＴｒｉｓ・ＨＣｌ（pH８．３）、ならびに２０単位のＲＮＡＳＩＮ（プ ロメガ（Promega）、米国ウィスコンシン州マディソン）、それぞれ０．５mMの ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰならびにｄＧＴＰ、１０μＭのオリゴｄＴ、なら びに２単位のＡＭＶ逆転写酵素（ギブコＢＲＬ（Gibco BRL）、米国メリーラン ド州ゲイサーズバーグ）を含む逆転写反応混合物中で、ｃＤＮＡの最初のストラ ンドを調製した。反応は、４２°Ｃにて１時間行った。 Ｂ． 成熟全長ｇＣ１ｑ−Ｒタンパク質（配列番号１の７４番目のロイシン から２８２番目のグルタミンまで）をコードするｇＣ１ｑ−ＲｃＤＮＡを増幅す るためのＰＣＲ ＰＣＲで使用する２種のプライマーの配列は、ｇＣ１ｑ−ＲｃＤＮＡ遺伝子 に基づいて決め（A.R．Krainer et al.，Cell 1991; 66: 383-394）、プライマ ー番号１には、Ｎｄｅｌ制限部位を加え、プライマー番号２には、Ｐｓｔｌ制限 部位を加えた（プライマー番号１、配列番号４、TACATATGCTGCACACCGACGGAGAC； プライマー番号２、配列番号５、GCCCTGCAGCATCTGTCTGCTCTA）。ＰＣＲ反応は、 ５０mMのＫＣｌ、１０mMＴｒｉｓ・ＨＣｌ（pH８．３）、１．５mMＭｇＣｌ₂、 ０．０１％ゼラチン、それぞれ０．２mMのｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰならび にｄＧＴＰ、それぞれ０．５mMのプライマー、２μｌの逆転写反応混合物、なら びに１単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ユナイテッド・ステーツ・バイオケミ カルズ（United States Biochemicals）、米国オハイオ州クリーブラン ド）中で実施した。ＰＣＲは、ジーン・アンプ９６００（GeneAmp 9600）（パー キンエルマー（Perkin Elmer）、米国コネティカット州ノーウォーク）で、９４ °Ｃ（１分）、５５°Ｃ（２分）、７２°Ｃ（２分）を４０サイクル繰り返すこ とによって行った。 Ｃ． ｇＣ１ｑ−Ｒ発現ベクターの構築と全長成熟組換えタンパク質の大腸 菌での発現 ｇＣ１ｑ−ＲｃＤＮＡ断片を、２種の制限酵素ＮｄｅｌならびにＰｓｔｌに よる消化によって、ｐＴ７−７ベクター（ユナイテッド・ステーツ・バイオケミ カルズ）にクローニングした（図１）。宿主の大腸菌の系統は、ＢＬ２１であっ た。クローニングした遺伝子は、強力なＴ７プロモーターの制御下におかれ、１ mM ＩＰＴＧでの誘導によって発現された。 Ｄ． 端部の切断されたｇＣ１ｑ−Ｒ組換えタンパク質の発現 Ｎ末端部が切断された組換えｇＣ１ｑ−Ｒ（ｇＣ１ｑ−Ｒ（Ｃ）と称する） を、図１に示すようにして生成した。Ｎ末端部をコードしている遺伝子セグメン トは、ＥｃｏＲｌならびにＢｓｔＸｌによる制限消化によってｐＴ７−７／ｇＣ １ｑ−Ｒ発現ベクターから除去した。ｇＣ１ｑ−Ｒ（Ｃ）は、配列番号１の１６ ８番目のフェニルアラニンから２８２番目のグルタミンまでのペプチドセグメン トを含んでいる。ベクターの両端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑化し、Ｔ４Ｄ ＮＡリガーゼで再度ライゲーションした。ペプチドｇＣ１ｑ−Ｒ（Ｃ）は、全長 のｇＣ１ｑ−Ｒと同様にして、ＢＬ２１細胞中で発現させた。 Ｃ末端部が切断された組換えｇＣ１ｑ−Ｒ（ｇＣ１ｑ−Ｒ（Ｎ）と称する） を、図１に示すようにして生成した。ｇＣ１ｑ−Ｒ（Ｎ）は、配列番号１の７４ 番目のロイシンから１６７番目のアスパラギンまでのペプチドセグメントを含ん でいる。Ｃ末端部をコードしている遺伝子セグメントは、ＢｓｔＸｌならびにＰ ｓｔｌによる消化によってｐＴ７−７／ｇＣ１ｑ−Ｒ発現ベクターから除去した 。ベクターの両端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑化し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで 再度ライゲーションした。ペプチドｇＣ１ｑ−Ｒ（Ｎ）は、全長のｇＣ１ｑ−Ｒ と同様にして、ＢＬ２１細胞中で発現させた。 Ｎ末端の５７個のアミノ酸が切断された組換えｇＣ１ｑ−Ｒ（ｇＣ１ｑ−Ｒ （δ１−５７）と称する）を、図１に示すようにして生成した。ｇＣ１ｑ−Ｒ（ δ１−５７）は、配列番号１の１３１番目のバリンから２８２番目のグルタミン までのペプチドセグメントを含んでいる。この遺伝子セグメントは、まず、ＰＣ Ｒによって合成された。ＰＣＲでは、全長ｇＣ１ｑ−ＲｃＤＮＡ、鋳型、２種の プライマー（プライマー番号２（配列番号５）、ならびにAAGAATTCCGGTCACTTTCA ACATTの配列を有するプライマー番号３（配列番号６））を使用した。ＰＣＲの 反応条件は、増幅サイクルを２５サイクルに減らした以外は上記と同様とした。 ＰＣＲで増幅したＤＮＡセグメントは、ＥｃｏＲｌならびにＰｓｔｌの部位を利 用してｐＴ７−７にクローニングした。ペプチドｇＣ１ｑ−Ｒ（δ１−５７）は 、全長のｇＣ１ｑ−Ｒと同様にして、ＢＬ２１細胞中で発現させた。 Ｅ． 大腸菌からのｇＣ１ｑ−Ｒの生成と精製 ｇＣ１ｑ−Ｒを発現する大腸菌を培養し、Ｔｒｉｓバッファー中で超音波処 理することによって回収した。ライゼートを遠心し、上清を、２０ mM ＨＥＰＥ Ｓ、０．１M ＫＣｌ、０．５％グリセロール、０．２mM ＥＤＴＡ、ならびに１m M ジチオトレイトールを含有するバッファー（pH８．０）に対して透析した。透 析したサンプルを、予め平衡化しておいたファストＱ（Fast Q）イオン交換カラ ム（ファルマシアバイオテクノロジー（Pharmacia Biotechnology）、米国ニュ ージャージー州ピスケイタウェイ）に加えた。結合したタンパク質を、２０mM ＨＥＰＥＳならびに１M ＫＣｌを含有するバッファー（pH８．５）で溶出させた 。ＳＤＳ−ＰＡＧＥでｇＣ１ｑ−Ｒについて、そしてウェスタン免疫ブロット法 で組換えｇｐ１２０との反応性について陽性であった分画を集めた。プールした 分画をセファクリル２００ゲル濾過カラム（ファルマシアバイオテクノロジー） でさらに精製した。最終物質について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで純度を測定し、ＥＬ ＩＳＡでｇｐ１２０との結合活性を測定した（後述の実施例４を参照されたい） 。 実施例２： ｇＣ１ｑ−Ｒペプチドに対するモノクローナル抗体の作製 １２週齢のオスのＢＡＬＢ／ｃＪマウス（ジャクソン・ラボラトリーズ（Ja ckson Laboratories）来国メイン州バーハーバー）に、完全フロイントアジュバ ント（ディフコ・ラボラトリーズ（Difco Laboratories）、米国ミシガン州デト ロイト）と混合した１００μｇの精製大腸菌発現ｇＣ１ｑ−Ｒを２００μｌのＰ ＢＳに溶解て皮下注射した。その１カ月後に、１００μｇの同一抗原を不完全フ ロイントアジュバントに混合して皮下注射し、その３日後にマウスを死亡させた 。それぞれの融合体について、免疫感作マウスの脾臓から単一細胞の懸濁液を調 製し、Ｓｐ２／０骨髄腫細胞との融合に用いた。５Ｘ１０⁸個のＳｐ２／０細抱 と５ｘ１０⁸個の脾臓細胞を、５０％のポリエチレングリコール（分子量１４５ ０）（コダック（Kodak）、米国ニューヨーク州ロチェスター）ならびに５％の ジメチルスルホキシド（シグマケミカル社（Sigma Chemical Co.）、米国ミズー リ州セントルイス）を含有する培養液中で融合させた。その後、細胞を、１０％ ウシ胎児血清、１００単位／mlのペニシリン、１００μg／mlのストレプトマイ シン、０．１mM ヒポキサンチン、０．４μMアミノプテリン、ならびに１６μM チミジンを加えたアイスコーブ培地（ギブコ（Gibco）、米国ニューヨーク州グ ランドアイランド）で、１．５ｘ１０⁵個の脾臓細胞／懸濁液２００μｌとなる よう調整した。９６穴のマイクロカルチャープレートの約２０個のウェルのそれ ぞれに、２００μｌの細胞懸濁液を加えた。約１０日後に、培養上清を回収して 、１ウェルあたり５０ｘ１０³個のＤＡＫＩＫＩ細胞でプレコートしたイムロン １（Immulon 1)マイクロテストプレート（ダイナテック・ラボラトリーズ（Dyna techLaboratories）、米国バージニア州アレキサンドリア）を用いたＥＬＩＳＡ でスクリーニングを行った。ＤＡＫＩＫＩ細胞を、表面に多量のｇＣ１ｑ−Ｒを 発現しているかどうかについて調べた。略述すると乾燥ＤＡＫＩＫＩ細胞でプレ コートしたマイクロテストプレートに、ブロット（ＢＬＯＴＴＯ）（ノンファッ ト乾燥ミルク）のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）への５％溶液２００μｌを加 え、非特異的サイトをブロックした、１時間後に、ウェルをＰＢＳＴバッファー （０．０５％トゥイーン２０を含有するＰＢＳ）で洗浄した。各融合ウェルの５ ０μｌの培養上清を集め、５０μｌのブロットと混合し、次に、マイ クロテストプレートの各ウェルに加えた。１時間インキュベートした後、各ウェ ルをＰＢＳＴで洗浄した。次に、細胞に結合したマウスの抗体を、ブロットに１ ：１，０００で希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）複合ヤ ギ抗マウスｌｇＧ（ジャクソン・イムノリサーチ・ラボラトリーズ（Jackson Im munoResearch Laboratories）、米国ペンシルバニア州ウェストグローブ）との 反応によって検出した。０．１％３’，３’，５’，５’テトラメチルベンジジ ン（シグマ）ならびに０．０００３％過酸化水素を含有するペルオキシダーゼ基 質溶液をウェルに加えて、呈色反応させた。反応は、各ウェルあたり５０μｌの ２M Ｈ₂ＳＯ₄を加えることによって停止させた。反応混合物の４５０nmでの光学 濃度（ＯＤ）を、バイオテックＥＬＩＳＡリーダー（BioTek ＥＬＩＳＡ reader ）（バイオテック・インストラメント（BioTek Instrument）、バーモント州ウ ィヌースキ）で読みとった。 陽性であったウェルの培養上清は、組換えｇＣ１ｑ−Ｒとの反応性について も、ＥＬＩＳＡで調べた。略述すると、イムロン２（Immulon 2）（ダイナテッ ク・ラボラトリーズ）マイクロテストプレートのウェルに、５０μｌの１μｇ／ mlの大腸菌発現ｇＣ１ｑ−Ｒを室温で一晩加えておき、プレートを振ってコーテ ィング溶液を除去した後、２００μｌのブロットを１時間にわたって各ウェルに 加えて、非特異的サイトをブロッキングした。結合したマウス抗体を上述のよう にして検出した。陽性であったウェルの細胞を、希釈度を限定することによって クローニングした。このクローンを、再度ＥＬＩＳＡでｇＣ１ｑ−Ｒとの反応性 について調べた。選択したハイブリドーマをスピナーフラスコで培養し、使用済 みの培養上清を集め、プロテインＡでのアフィニティクロマトグラフィーによる 抗体の精製を行った。ｇＣ１ｑ−Ｒに対してこうして生成したモノクローナル抗 体の１つである９９−１２−１を、ｇＣ１ｑ−Ｒとの結合に関してＨＩＶ−１ｇ ｐ１２０と競合するかどうかを決定するために調べた（後述の実施例１１を参照 のこと）。 実施例３： ｇＣ１ｑ−Ｒに対するポリクローナル抗体の製造 約１５週齢の２匹のオスのニュージーランドシロウサギを、１００μｇの精 製大腸菌発現ｇＣ１ｑ−Ｒを１００μｇを完全フロイントアジュバント（ディフ コ・ラボラトリーズ）と混合して皮下注射することにより、免疫感作した。２週 間後、これらのウサギに、同量の抗原を、不完全フロイントアジュバントと混合 して再度注射した。２週間後に、同様の免疫感作を行った。免疫感作した動物か ら血清を集め、集めた血清について、結合した抗体の検出に際して、ブロットに １：２，０００で希釈したＨＲＰ複合化ロバ抗ウサギｌｇＧ（ジャクソン・イム ノリサーチ・ラボラトリーズ）を使用した以外は上述のとおりにＥＬＩＳＡを行 って、ｇＣ１ｑ−Ｒとの反応性について調べた。高い血清学的応答を示した方の 動物を、血清の採取に使用した。ポリクローナルウサギ抗ｇＣ１ｑ−Ｒ免疫グロ ブリンの精製を、ｇＣ１ｑ−Ｒ結合アフィゲル（Affigel）１０２（バイオラッ ド・ラボラトリーズ）を用いたアフィニティカラムによって行った。 実施例４： ＥＬＩＳＡでの、ＨＩＶ−１ III Ｂｇｐ１２０の、大腸菌で 発現ｇＣ１ｑ−Ｒとの結合 イムロン２プレートのウェルを、１００μｌの大腸菌発現ｇＣ１ｑ−Ｒ（０ ．１M酢酸ナトリウムバッファー（pH６）中５μg／ml溶液）でコーティングし、 室温で一晩インキュベートした。ブロッキング用バッファーＰＢＳＴＢ（２％ウ シ血清アルブミンを含有するＰＢＳＴ）で、ウェルを室温にて１時間処理し、Ｐ ＢＳＴで洗浄した後、バキュロウイルスで発現させたＨＩＶ−１ III Ｂｇｐ１ ２０（アメリカン・バイオテクノロジー社（American Biotechnologies，Inc.） 、米国マサチューセッツ州ケンブリッジ）の連続希釈液１００μｌ（２μg／ｍ ｌ−０．０１６μg／ｍｌ）を対応する２つのウェルに加え、室温で１時間反応 させた。その後、前述したようにして、各ウェルを洗浄した。結合したｇｐ１２ ０は、１：２０００に希釈した、ＨＲＰと複合させた抗ＨＩＶ−１ｇｐ１２０Ｖ ３領域齧歯類モノクローナル抗体ＢＴ１２３で検出した。抗体は、配列番号７に 示すｇｐ１２０中のペプチドセグメント（ＨＸＢ２Ｒ系統のアミノ酸残基番号３ ０８−３２２）と反応するかどうか、ならびにｇＣ１ｑ−Ｒとｇｐ１２０との結 合を抑制しないかどうかについて調べた。１００μｌの希釈複合体を各ウェルに 加え、室温にて１時間反応させた。次にウェルを洗浄し、ペルオキシダーゼの 基質の溶液２００μｌを各ウェルに加えて、３０分間にわたって呈色させた。５ ０μｌの２M Ｈ₂ＳＯ₄を加えて反応を停止させ、バイオテックＥＬＩＳＡリーダ ーで、４５０nmでのＯＤを読みとった。ｇｐ１２０を加えていない対照のウェル から、ｇｐ１２０を加えた試験ウェルのＯＤを差し引くことによって、特異的反 応性が得られた。 結果を図２に示す。図からわかるように、ｇｐ１２０の濃度が上昇すると、 一定量の固定化組換えｇＣ１ｑ−Ｒとのｇｐ１２０の結合が、Ｓ字型カーブを描 いて上昇する。このことから、ｇｐ１２０のｇＣ１ｑ−Ｒへの結合が、用量依存 性であることがわかる。抗ｇｐ１２０Ｖ３領域抗体ＢＴ１２３が、ｇＣ１ｑ−Ｒ と結合したｇｐ１２０と反応しうることからは、ｇＣ１ｑ−Ｒのｇｐ１２０との 結合は、配列番号７に示すｇｐ１２０のＶ３領域に関与するものではないことが わかる。 実施例５： ＨＩＶ−１の中和検定 ｇＣ１ｑ−Ｒが有している、ＨＩＶ−１の感染性を抑制する活性を調べるた めに、標的としてＣＥＭ−ＳＳ細胞を使用したシンシチウム形成マイクロ検定を P.L．Naraら（AIDS Res．Hum．Retroviruses 1987; 3: 283-302）の記載にした がって実施した。略述すると、希釈した大腸菌発現ｇＣ１ｑ−Ｒ５０μｌを、２ ００シンシチウム形成単位（ＳＦＵ）のＨＩＶ−１ III Ｂ、ＨＩＶ−１ＭＮ、 あるいはＨＩＶ−１ＲＦを含有するウイルス培養上清５０μｌと混合し、室温で １時間インキュベートした。混合物を、ＤＥＡＥ−デキストランで処理したＣＥ Ｍ−ＳＳ細胞５ｘ１０⁴個の入ったマイクロカルチャーウェルに加え、細胞培養 を、５％ＣＯ₂中に、３７°Ｃにて３ないし４日間おいた。シンシチウムは、倒 立顕微鏡下で数えた。中和活性は、感染の５０％の抑制（すなわちＶｎ／Ｖｏ＝ ５０％、ここでＶｎは、試験ウェルのＳＦＵ、Ｖｏは、試験抗体を含まない対照 ウェルのＳＦＵ）に必要な濃度として定義されるＩＣ₅₀のかたちで表現した。 結果を図３Ａ、３Ｂ、ならびに３Ｃに示す。これらの図から、ｇＣ１ｑ−Ｒ が、ＨＩＶ−１ III Ｂ、ＭＮ、ならびにＲＦのそれぞれを、４．３、１３．５ 、ならびに１．６５μg／mlのＩＣ₅₀で中和したことがわかる。こうした中和の データからは、ｇＣ１ｑ−Ｒが、各種のＨＩＶ−１単離物の感染性を広範に抑制 しうるものであることが示唆される。 実施例６： シンシチウム形成を抑制する活性についての検定 細胞同士の融合によるＨＩＶ−１の伝搬にｇＣ１ｑ−Ｒが及ぼす影響を、Ｈ ＩＶ−１に感染したＨ９細胞ならびにＣＤ４発現性ＨｅＬａ細胞（ＨｅＬａ−Ｃ Ｄ４⁺）を使用して調べた。これらの細胞は、接触すると融合して、培養中でシ ンシチウムを形成する細胞である。ＨｅＬａは、ヒトの癌の株化細胞で、ＨｅＬ ａ−ＣＤ４⁺は、ゲノム内に、トランスフェクションによって導入されたＣＤ４ ＤＮＡを有しており、細胞表面にＣＤ４抗原を発現する。本研究で使用した方法 は、P.J．Madden et al.，Cell 1986; 47: 333-348に記載されている方法に類似 したものである。略述すると、ＨｅＬａ−ＣＤ４⁺細胞を、２４穴のマイクロカ ルチャープレートのウェルに、１ウェルあたり１ｘ１０⁵個の細胞となるよう播 いた。この培養を３６時間インキュベートしたところ、その時点で、単層の上皮 細胞は、ほぼコンフルエントな状態となった。１ｘ１０⁴個の感染Ｈ９細胞を、 この準コンフルエントなＨｅＬａ−ＣＤ４⁺細胞に加えたところ、細胞は接触を 生じて融合し、８時間後には、多核の巨大な細胞（シンシチウム）が形成された 。これらのシンシチウムのうち６個以上の核を有するものは、特定、計数が容易 であり、シンシチウム形成の量的測定手段として用いることができた。シンシチ ウムの形成に及ぼす精製した大腸菌発現ｇＣ１ｑ−Ｒの影響を調べるにあたって は、各種の濃度のｇＣ１ｑ−ＲをＨ９細胞と混合し、ＨｅＬａ−ＣＤ４⁺細胞に 加えた。１ウェルあたりの最終合計容量は１mlとした。５％ＣＯ₂中で、３７° Ｃにて８時間インキュベートした後に、ウェルをＲＰＭＩ−１６４０培養液で洗 浄し、メタノールで固定し、風乾し、メチレンブルーの０．１％メタノール溶液 で染色した。細胞は１００倍の倍率で調べ、シンシチウム（６個以上の核のもの ）の数を、４カ所のランダムに選択した区域について測定し、平均を求めた。対 照のウェルと比べて、ｇＣ１ｑ−Ｒを加えたウェルでシンシチウムの数がどのく らい減っているかから、シンシチウム形成の抑制率（％）を計算した。 図４に示す結果から、組換えｇＣ１ｑ−Ｒが、２１μg／mlのＩＣ₅₀で、 ＨＩＶ−１ III Ｂに感染したＨ９細胞とＨｅＬａ−ＣＤ４⁺細胞との間の融合を 抑制することがわかる。 実施例７： フローサイトメトリーによって測定されるｇＣ１ｑ−ＲのＨ ＩＶ−１ III Ｂ感染Ｈ９細胞との結合 ＨＩＶ−１ III Ｂに感染したＨ９細胞の表面に発現されたｇｐ１２０への 、精製大腸菌発現ｇＣ１ｑ−Ｒの結合を、間接免疫蛍光フローサイトメトリーに よって調べた。感染細胞のＰＢＳＢ（１％ウシ血清アルブミンを加えたリン酸緩 衝生理食塩水、pH７．４）への１０ｘ１０⁶個／mlの溶液５０μｌを、氷上で、 一連の濃度の精製大腸菌発現ｇＣ１ｑ−Ｒと混ぜた。次に、細胞を、同じバッフ ァー中で、３００ｘｇでの５分間の遠心分離を行うことによって1回洗浄した。 次に、細胞ペレットを同じバッファー５０μｌに再度懸濁し、５μg／mlのアフ ィニティ精製ウサギ抗ｇＣ１ｑ−Ｒ５０μｌを加えて、氷上で３０分間反応させ た。次に、細胞を上記と同様にして洗浄し、フルオレセイン複合化ロバ抗ウサギ ｌｇＧ（ジャクソン・イムノリサーチ・ラボラトリーズ）（１：４０に希釈）５ ０μｌを加え、氷上でさらに３０分間反応させた。次に、細胞を洗浄し、１％パ ラホルムアルデヒド中で固定し、コールターＥＰＩＣセルアナライザー（コール ター・エレクトロニクス（Coulter Electronics）、米国フロリダ州ハイアリー ）で分析した。対照では、ウサギ抗ｇＣ１ｑ−Ｒおよび／またはフルオレセイン 複合化ロバ抗ウサギｌｇＧのみを使用した。恣意的に１０％に設定した対照の細 胞結合率から試験対象の細胞結合率を差し引くことによって、特異的な細胞染色 を計算した。結合について調べるにあたっては、陰性対照として、非感染Ｈ９細 胞も調べた。 結果から、ＨＩＶ−１ III Ｂに感染したＨ９細胞に対して、組換えｇＣ１ ｑ−Ｒが用量依存的に結合するのに対し（図５）、非感染Ｈ９細胞の場合はそう ではないことが示された。 実施例８： ＥＬＩＳＡにおいて、ＨＩＶ−１ｇｐ１２０のｇＣ１ｑ−Ｒ への結合にＣ１ｑが及ぼす影響 天然のリガンドであるｇＣ１ｑが、ｇｐ１２０との間で、ｇＣ１ｑ−Ｒに対 する同一の結合部位を共有しているかどうかを調べるために、ＨＩＶ−１ｇｐ１ ２０のｇＣ１ｑ−Ｒへの結合にＣ１ｑが及ぼす影響をＥＬＩＳＡによって調べた 。イムロン２マイクロテストプレートのウェルを、精製大腸菌発現ｇＣ１ｑ−Ｒ の０．１M酢酸ナトリウムバッファーへの５μg／ml溶液５０μｌでコーティング し、室温で一晩インキュベートした。次に、ウェルを、２００μｌのブロッキン グ／希釈用バッファーＰＢＳＴＢで、室温にて１時間ブロッキングした。ウェル をＰＢＳＴで洗浄した後、各ウェルに、５０μｌの０．２μg／mlのバキュロウ イルスで発現させたＨＩＶ−１ III Ｂｇｐ１２０を、一連の希釈度の大腸菌発 現ｇＣ１ｑ−Ｒ、あるいはヒト血清由来の精製Ｃ１ｑ（クイデル（Quidel）、米 国カリフォルニア州サンディエゴ）の存在下および不在下で加え、ウェルを室温 でさらに１時間インキュベートし、洗浄した。ＨＲＰ複合化モノクローナル抗体 ＢＡＴ１２３のブロッキング／希釈用バッファーへの希釈度１：２０００の希釈 液５０μｌを、室温で１時間にわたって各ウェルに加えた。次に、プレートを洗 浄し、上述のようにして、ペルオキシダーゼ基質溶液を加えて呈色させた。ｇｐ １２０を加えていない対照ウェルのＯＤから、ｇｐ１２０を加えた試験ウェルの ＯＤを差し引くことによって、特異的反応性を求めた。 結果を図６に示す。図中、黒丸を結んだ線は、Ｃ１ｑについてのものであり 、黒四角を結んだ線は、ｇＣ１ｑ−Ｒについてのものである。Ｃ１ｑが、ｇｐ１ ２０のｇＣ１ｑ−Ｒとの結合と競合しないのに対し、ｇＣ１ｑ−Ｒは、予想通り 、ｇｐ１２０のｇＣ１ｑ−Ｒとの結合と競合した。こうした結果から、ｇｐ１２ ０のｇＣ１ｑ−Ｒへの結合が、ｇｐ１２０のＣ１ｑへの結合部位とは異なった部 位で生じており、それらの部位が相互に妨害しあうことはないことがわかる。こ のことは、ＨＩＶ−１の感染者あるいはＨＩＶ−１に接触した人々にｇＣ１ｑ− Ｒを投与した際に、血中に豊富に存在するＣ１ｑが、ビリオンあるいは感染細胞 上のＨＩＶ−１ｇｐ１２０へのｇＣ１ｑ−Ｒの結合を妨害することがないという 点で、極めて重要な知見である。また、ｇＣ１ｑ−ＲがＣ１ｑとｇｐ１２０の両 方に同時に結合しうることも、ｇＣ１ｑ−Ｒが、補体古典経路の活性化を媒介し て、ＨＩＶ−１ビリオンならびにＨＩＶ−１感染細胞を溶解しうる可能性がある という点で、重要である。 実施例９： ＨＩＶ−１ｇｐ１２０のｇＣ１ｑ−Ｒの各種組換え構築物との 反応性 ｇＣ１ｑ−ＲのＨＩＶ−１ｇｐ１２０に対する結合部位を特定する目的で、 ｇＣ１ｑ−Ｒの各種の長さの組換え構築物を、ＥＬＩＳＡ用に作成した。イムロ ン２μテストプレートのウェルを、精製した大腸菌発現全長ｇＣ１ｑ−Ｒ（１個 目−２０９個目のアミノ酸）、ｇＣ１ｑ−Ｒ（５８個目−２０９個目のアミノ酸 ）、ｇＣ１ｑ−Ｒ（１個目−９４個目のアミノ酸）、あるいはｇＣ１ｑ−Ｒ（９ ５個目−２０９個目のアミノ酸）の０．１M酢酸ナトリウムバッファー（pH６） への５μg／ml溶液１００μｌでコーティングし、室温で一晩インキュベートし た。ウェルを、ブロッキング／希釈用バッファーＰＢＳＴＢで、室温にて１時間 処理し、ＰＢＳＴで洗浄した後、１００μｌの一連の希釈度のバキュロウイルス 発現ＨＩＶ−１ III Ｂｇｐ１２０（アメリカン・バイオテクノロジース）（２ μg／ml−０．０１６μg／ml）を対応するウェル（それぞれ２つのウェル）に加 え、室温にて１時間反応させた。次に、ウェルを上述のようにして洗浄した。１ ００μｌの希釈度１：２０００のＨＲＰ複合化モノクローナル抗体ＢＡＴ１２３ を室温にて１時間にわたって加えることによって、結合したｇｐ１２０を検出し た。次に、ウェルを洗浄し、各ウェルに２００μｌのペルオキシダーゼ基質溶液 を加えて、３０分間にわたって呈色させた。５０μｌの２M Ｈ₂ＳＯ₄を加えるこ とによって反応を停止させ、バイオテックＥＬＩＳＡリーダーを用いて、４５０ nmでのＯＤを測定した。ｇｐ１２０を加えていない対照ウエルのＯＤから、ｇｐ １２０を加えた試験ウェルのＯＤを差し引くことによって、特異的反応性を求め た。 結果を図７に示す。図中、黒四角を結んだ線は、全長のｇＣ１ｑ−Ｒ（１個 目−２０９個目のアミノ酸）、黒丸を結んだ線は、ｇＣ１ｑ−Ｒ（５８個目−２ ０９個目のアミノ酸）、黒三角を結んだ線は、ｇＣ１ｑ−Ｒ（１個目−９４個目 のアミノ酸）、黒逆三角形を結んだ線は、ｇＣ１ｑ−Ｒ（９５個目−２０９個目 のアミノ酸）についてのものである。ｇｐ１２０は、ｇＣ１ｑ−Ｒ（１個目−２ ０９個目のアミノ酸）、ｇＣ１ｑ−Ｒ（５８個目−２０９個目のアミノ酸）、な らびにｇＣ１ｑ−Ｒ（９５個目−２０９個目のアミノ酸）には結合するものの、 ｇＣ１ｑ−Ｒ（１個目−９４個目のアミノ酸）には結合しない。このように、結 果からは、ｇＣ１ｑ−Ｒのｇｐ１２０との結合部位が、Ｃ末端部分に存在するこ とが示唆された。この観察結果は、ｇｐ１２０との結合部位が、Ｃ１ｑとの結合 部位とは異なった部位で生じているという図６に示した結果と一致した。Ｃ１ｑ との結合部位は、配列番号８に示す、ｇＣ１ｑ−ＲのＮ末端のペプチドセグメン トにマッピングされている（B．Ghebrehiwet et al.，J．Exp．Med．1994; 179: 1809-1821）。このペプチドセグメントは、配列番号１のアミノ酸残基番号７６ −９３と等しい。 実施例１０： ｇＣ１ｑ−Ｒ上での、９９−１２−１との結合部位のペプチ ドマッピング ｇＣ１ｑ−Ｒ上で、９９−１２−１との結合に関与するエピトープをマッピ ングするために、マルチピン・ペプチド合成法を使用した（H.M．Geysen et al. ，Science 1987; 235: 1184-1190）。ｇＣ１ｑ−Ｒの配列全体をカバーする４１ 個の１２マーのペプチド（隣り合ったペプチドは、互いに、アミノ酸７個ずつ重 複している）を、９６穴のマイクロテストプレートに対応するかたちで並んだプ ラスピック製のピン上に、それぞれ独立に、連続して並ぶように合成した。この ペプチドのセットは、オーストラリア国ビクトリア州クレイトンのチロン・マイ モトープス社（Chiron Mimotopes PTY．LTD.）に注文して合成したものである。 このマルチピン・ペプチド・システムを使用したエピトープのマッピングの 手順は、製造業社の指示マニュアルにほぼ沿ったものとした。略述すると、まず ピンを、ＰＢＳに２％ウシ血清アルブミンおよび０．１％トゥイーン２０を加え たプレコートバッファーで、室温にて１時間処理した。次に、ピンを、抗体９９ −１２−１のプレコートバッファーへの２μg／ml溶液の入った９６穴のマイク ロテストプレートの個々のウェルにさし込んだ。インキュベーションは、室温に て１時間行った。ピンをＰＢＳＴ中で洗浄し（１０分ごとに３回洗浄）、次に、 １：４０００に希釈したＨＲＰ複合化ヤギ抗マウスｌｇＧ（Ｆｃ）（ジャクソン ・イムノリサーチ・ラボラトリーズ）１００μｌの入った９６穴のマイクロテス トプレートのウェル中で、室温にて１時間インキュベートした。上記と同様にし てピンを洗浄した後、ペルオキシダーゼ基質溶液であるジアンモニウム ２，２ ‘−アジノ−ビス［３−エチルベンズチアゾリン−ｂ−スルホネート］（ＡＢＴ Ｓ）ならびにＨ₂Ｏ₂（キルケガード・アンド・ペリー・ラボラトリーズ社（Kirk egaad & Perry Laboratories Inc.）、米国メリーランド州、ゲイサーズバーグ ）の入ったウェルに、室温で３０分間さし込んで、呈色反応させた。プレートを 、バイオテックＥＬＩＳＡ・プレートリーダーで、４９２nmのバックグラウンド 吸収波長に対して、４０５nmで読みとった。呈色を示したウェルは、ｇＣ１ｑ− Ｒ由来のペプチドが、そのウェル中で、９９−１２−１と反応性を有していたこ とを示す。 エピトープのマッピングの結果からは、９９−１２−１が、配列番号２のペ プチドと結合することがわかる。 ９９−１２−１の結合性エピトープを確認するために、配列番号２のＬＭ１ ２ＤＮの９９−１２−１との結合をＥＬＩＳＡで調べた。Ｃ１ｑの結合部位とし てすでに特定されている（B．Ghebrehiwet et al.，J．Exp．Med．1994; 179: 1 809-1821）配列番号８のペプチド（ペプチドＴＤ１８ＥＥ）を、陰性対照として 使用した。ペプチドＬＭ１２ＤＮならびにＴＤ１８ＥＥは、自動化ペプチド合成 装置（アプライド・バイオシステムス社（Applied Biosystems，Inc.）、米国カ リフォルニア州フォスターシティ）で、製造業者のマニュアルに記載された９− フルオレニルメトキシカルボニル合成プロトコール使用して合成した。ペプチド のＥＬＩＳＡに際しては、イムロン２マイクロテストプレートのウェルを、１μ g／mlのペプチドＬＭ１２ＤＮあるいはＴＤ１８ＥＥ５０μｌでコーティングし 、室温で一晩インキュベートした。プレートを振ってコーティング溶液を除去し た後、２００μｌのＰＢＳＴＢを各ウェルに加えて、室温で１時間にわたって非 特異的部位を飽和させた。次に、ＰＢＳＴでウェルを洗浄した。９９−１２−１ のＰＢＳＴＢへの一連の希釈液５０μｌを、室温で１時間にわたってウェル（ ２つのウェル）に加えた。プレートを再度洗浄した。１：２０００の希釈度のＨ ＲＰ複合化ヤギ抗マウスｌｇＧ（Ｆｃ）（ジャクソン・イムノリサーチ・ラボラ トリーズ）５０μｌを、各ウェルに、室温で１時間にわたって加えた。ウェルを 洗浄した後、上述のようにしてペルオキシダーゼ基質を加え、呈色反応を進行さ せた。ＥＬＩＳＡリーダーを使用して、４５０nmでプレートを読みとった。対照 ウェルのＯＤから、９９−１２−１を加えた試験ウェルのＯＤを差し引くことに よって、特異的反応性を求めた。 結果を図８に示す。図中、黒四角を結んだ線は、ペプチドＬＭ１２ＤＮにつ いてのものであり、黒丸を結んだ線は、ペプチドＴＤ１８ＥＥについてのもので ある。９９−１２−１は、ペプチドＬＭ１２ＤＮ（配列番号２）に対しては用量 依存的に結合するものの、ペプチドＴＤ１８ＥＥ（配列番号８）に対しては結合 しない。 実施例１１： ＥＬＩＳＡでの、抗ｇＣ１ｑ−Ｒモノクローナル抗体９９− １２−１による、ＨＩＶ−１ｇｐ１２０のｇＣ１ｑ−Ｒへの結合との競合 イムロン２マイクロテストプレートのウェルを、精製大腸菌発現ｇＣ１ｑ− Ｒの０．１M酢酸ナトリウムバッファー（pH６）への５μg／ml溶液５０μｌでコ ーティングし、室温で一晩インキュベートした。次に、ウェルを、２００μｌの ブロッキング／希釈用バッファ−ＰＢＳＴＢで、室温にて１時間ブロッキングし 、ＰＢＳＴで洗浄した。各ウェルに、５０μｌの０．２μg／mlのバキュロウイ ルスで発現させたＨＩＶ−１ III Ｂｇｐ１２０を、９９−１２−１のブロッキ ング／希釈用バッファーへの一連の希釈度の希釈液の存在下および不在下で加え 、ウェルを室温でさらに１時間インキュベートし、洗浄した。ＨＲＰ複合化モノ クローナル抗体ＢＡＴ１２３のブロッキング／希釈用バッファーへの希釈度１： ２０００の希釈液５０μｌを各ウェルに加え、室温で１時間にわたってインキュ ベートした。次に、プレートを洗浄し、上述のようにして、ペルオキシダーゼ基 質溶液を加えて呈色させた。９９−１２−１による、ｇｐ１２０のｇＣ１ｑ−Ｒ への結合の抑制率を、９９−１２−１が存在するウェルと、そうでないウェルの ＯＤの差として計算した。 図９には、９９−１２−１が、ｇｐ１２０のｇＣ１ｑ−Ｒへの結合を用量依 存的に抑制するものであることが示されており、このことからは、９９−１２− １が、ｇＣ１ｑ−Ｒ中の、ｇｐ１２０との相互作用上不可欠な部位に結合するも のであることが示唆される。この部位は、実施例１０にも記載したように、配列 番号２にマッピングされている。 実施例１２： ＥＬＩＳＡでの、抗体Ｇ３−２９９ならびに６２０５による 、ｇＣ１ｑ−ＲのＨＩＶ−１ｇｐ１２０への結合との競合 ＨＩＶ−１ｇｐ１２０上でのｇＣ１ｑ−Ｒ結合部位の特定作業を支援するた めに、競合ＥＬＩＳＡを設計して、各種の抗ＨＩＶ−１ｇｐ１２０抗体ならびに 組換え可溶性ＣＤ４（ｒｓＣＤ４）が、ｇｐ１２０のｇＣ１ｑ−Ｒへの結合に及 ぼす影響を調べた。 イムロン２マイクロテストプレートのウェルを、精製大腸菌発現ｇＣ１ｑ− Ｒの０．１M酢酸ナトリウムバッファー（pH６）への５μg／ml溶液５０μｌでコ ーティングし、室温で一晩インキュベートした。次に、ウェルを、２００μｌの ブロッキング／希釈用バッファーＰＢＳＴＢで、室温にて１時間ブロッキングし た。各ウェルに、５０μｌの０．２μg／mlのバキュロウイルスで発現させたＨ ＩＶ−１ III Ｂｇｐ１２０を、各種抗ＨＩＶ−１ｇｐ１２０抗体あるいはｒｓ ＣＤ４（バイオジェン（Biogen）、米国マサチューセッツ州ボストン）のブロッ キング／希釈用バッファーへの一連の希釈度の希釈液の存在下および不在下で加 え、ウェルを室温でさらに１時間インキュベートした。調べたｇｐ１２０抗体は 、以下のもの、すなわち、マウスモノクローナル抗体Ｇ３−２９９（配列番号に ９に示すＣ４領域（ＨＸＢ２Ｒ系統のアミノ酸残基番号４２３−４３７）に対す るもの）；ヒツジ抗ＨＩＶ−１ｇｐ１２０Ｃ５領域抗体６２０５（配列番号に１ ０に示す、ＨＸＢ２Ｒ系統のアミノ酸残基番号４９７−５１１）に対するもの） ；ＢＡＴ０８５（配列番号１１に示すＨＸＢ２Ｒ系統のアミノ酸残基番号１６９ −１８３のＶ２領域に対するもの）であった。Ｇ３−２９９とＢＡＴ０８５の特 性は、すでに記載されている（N.C．Sun et al.，J．Virol．1989; 63: 3579-35 85; M.S.C．Fung et al.，J．Virol．1992; 66: 848-856）。抗体６２０５は 、インターナショナル・エンザイムス（International Enzymes）（カリフォル ニア州フォールブロック）から購入した。プレートを洗浄した後、ＨＲＰ複合化 モノクローナル抗体ＢＡＴ１２３のブロッキング／希釈用バッファーへの希釈度 １：２０００の希釈液５０μｌを各ウェルに加え、室温で１時間にわたってイン キュベートした。次に、プレートを洗浄し、上述のようにして、ペルオキシダー ゼ基質溶液を加えて呈色させた。各種の抗ＨＩＶ−１ｇｐ１２０抗体あるいはｒ ｓＣＤ４による、ｇｐ１２０のｇＣ１ｑ−Ｒへの結合の抑制率を、競合物質が存 在するウェルと、そうでないウェルのＯＤの差として計算した。 結果を図１０に示す。図中、黒丸を結んだ線は、ＨＩＶ−１ｇｐ１２０のＣ ４領域に対する抗体であるＧ３−２９９についてのもので、黒四角を結んだ線は 、ポリクローナルなヒツジ抗ｇｐ１２０Ｃ５領域抗体である６２０５についての ものであり、黒三角を結んだ線は、ｒｓＣＤ４についてのものである。図からわ かるように、Ｇ３−２９９が、ｇｐ１２０のｇＣ１ｑ−Ｒへの結合と極めて効果 的に競合し、６２０５が穏やかに競合するのに対して、ｒｓＣＤ４は、競合しな い。Ｖ２領域に対する抗体ＢＡＴ０８５も、結合を抑制しない。実施例４と実施 例１２の結果を総合すると、ｇＣ１ｑ−Ｒ結合部位がＣ４ならびにＣ５領域付近 に存在していることがわかる。この部位は、ＣＤ４結合部位とは異なるものであ る。この重要な知見からは、ＨＩＶ−１による感染の治療に際して、ｇＣ１ｑ− ＲとｒｓＣＤ４の両方を適用しうることが示唆される。このことによって、ＣＤ ４陽性の標的細胞とＣＤ４陰性の標的細胞の両方の感染予防の有効性が拡大する 可能性がある。 実施例１３： ＨＩＶ−１ｇｐ１２０上での、ｇＣ１ｑ−Ｒ結合ドメインの ペプチドマッピング ＨＩＶ−１ｇｐ１２０上で、ｇＣ１ｑ−Ｒとの結合ドメインのペプチドエピ トープを特定するために、上述のマルチピン・ペプチド合成法を再度使用した。 ＨＩＶ−１ＭＮｇｐ１２０の配列全体をカバーする９４個の１２マーのペプチド （隣り合ったペプチドは、互いに、アミノ酸７個ずつ重複している）を、チロン ・マイモトープス・ペプチド・システムス（Chiron Mimotopes Peptide Systems ）で、９６穴のマイクロテストプレートに対応するかたちで並んだプラスピック 製のピン上に合成した。ＨＩＶ−１ＭＮｇｐ１２０のアミノ酸配列は、ロスアラ モス・ナショナル・ラボラトリー（Los Alamos National Laboratory）のデータ ベースに基づくものである（G．Myers et al.，Human Retroviruses and AIDS， 1992）。エピトープマッピングの手順は、上述の実施例１０で記載したものと同 様である。 プラスチックピン上のペプチドとの反応には、精製した大腸菌発現ｇＣ１ｑ −Ｒ（５μg／ml）を使用した。ピンを洗浄した後、結合したｇＣ１ｑ−Ｒを、 室温での１時間にわたるアフィニティ精製したウサギ抗ｇＣ１ｑ−Ｒイムノグロ ブリンとの反応によって検出した。上記と同様にしてピンを洗浄した後、ＨＲＰ と複合化したロバ抗ウサギｌｇＧ（ジャクソン・イムノリサーチ・ラボラトリー ズ）と反応させた。呈色の手順は、上述した手順と同様とした。 ＨＩＶ−１ｇｐ１２０上の、ｇＣ１ｑ−Ｒとの結合エピトープの確認は、Ｅ ＬＩＳＡで、結合領域をカバーする互いに重複する複数の合成ペプチドをコーテ ィング抗原として使用することによって行った。ＨＩＶ−１ＨＸＢ２Ｒｇｐ１２ ０の互いに重複するペプチドであるＲＣ１６ＧＧ（アミノ酸残基番号４４４−４ ５９、配列番号３）；ＲＣ１２ＬＴ（アミノ酸残基番号４４４−４５５、配列番 号１２）；ならびにＴＧ１２ＮＮ（アミノ酸残基番号４５０−４６１、配列番号 １３）を、アメリカン・バイオテクノロジー社から購入した。イムロン２マイク ロテストプレートのウェルを、２μg／mlの対応ペプチド１００μｌでコーティ ングし、室温で一晩インキュベートした。次に、ウェルを、ブロッキング／希釈 用バッファーＰＢＳＴＢ２００μｌで、室温にて１時間処理した。次に、ＰＢＳ Ｔでウェルを洗浄した。各種濃度の精製した大腸菌発現ｇＣ１ｑ−Ｒをウェル（ ウェル２つ）に加え、室温で１時間反応させた。次に、プレートを、上記と同様 にして洗浄した。１００μｌのアフィニティ精製ウサギ抗ｇＣ１ｑ−Ｒイムノグ ロブリン（２μg／ml）を室温で１時間にわたって各ウェルに加えた。希釈した ＨＲＰ複合化ロバ抗ウサギｌｇＧを、室温で、さらに１時間にわたって加え、ウ ェルを洗浄した。上述のようにしてペルオキシダーゼ基質を加え、呈色反応を進 行させた。 結果を図１１に示す。図中、黒四角を結んだ線は、ＲＣ１２ＬＴについての ものであり、黒丸を結んだ線は、ＴＧ１２ＮＮについてのものであり、黒三角を 結んだ線は、ＲＣ１６ＧＧについてのものである。図からわかるように、ＲＣ１ ６ＧＧのみがgＣ１ｑ−Ｒと反応した。この結果は、ｇｐ１２０上のｇＣ１ｑ− Ｒ結合部位が、ｇｐ１２０のＣ４領域中に位置する配列番号３に示すペプチドセ グメントに位置している事実と符合する。抗体Ｇ３−２９９が、実施例１２に示 すように、ｇｐ１２０のｇＣ１ｑ−Ｒとの結合と効果的に競合しうるのは、おそ らく、Ｇ３−２９９との結合部位（配列番号９）と、ｇＣ１ｑ−Ｒとの結合部位 （配列番号３）が近接しているからである。 本明細書に記載した用語、表現、実施例は、単に例としてあげたものであっ て、本発明がこれらによって限定されるということではなく、本発明の範囲は、 以下の請求の範囲によってのみ規定され、請求の範囲の内容のすべての均等物を 包含するものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ｃ１２Ｐ 21/02 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｃ Ａ，ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ， ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｅ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 サン，セシリー・アール．・ワイ. アメリカ合衆国 テキサス州 77401 ベ ルエア ウェルフォード ドライブ 4901 (72)発明者 キム，ヤング・ウー・ アメリカ合衆国 ニュージャージー州 08536 プレインズボロ ソーロー ドラ イブ 125 (72)発明者 ユー，リミング アメリカ合衆国 テキサス州 77025 ヒ ューストン マーティンシャー 4106

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 配列番号２の配列を有するペプチド。 ２． ペプチドの免疫原性を増大させるキャリアに結合された請求の範囲第１項 に記載のペプチド。 ３． キャリアがＫＬＨである請求の範囲第２項に記載のペプチド。 ４． 配列番号２のペプチドをコードするオリゴヌクレオチド。 ５． デオキシリボヌクレオチドである請求の範囲第４項に記載のオリゴヌクレ オチド。 ６． 請求の範囲第１項に記載のペプチドを標的とする結合性分子あるいは抗体 。 ７． モノクローナル抗体である請求の範囲第６項に記載の結合性分子あるいは 抗体。 ８． モノクローナル抗体９９−１２−１。 ９． モノクローナル抗体９９−１２−１を産生する細胞株。 １０． 配列番号３の配列を有するペプチド。 １１． ペプチドの免疫原性を増加させるキャリアに結合された請求の範囲第１ ０項に記載のペプチド。 １２． キャリアがＫＬＨである請求の範囲第１０項に記載のペプチド。 １３． 配列番号３のペプチドをコードするオリゴヌクレオチド。 １４． デオキシリボヌクレオチドである請求の範囲第１３項に記載のオリゴヌ クレオチド。