JPH0768276B2 - Ｈｉｖのｃｄ４結合領域に特異的な抗体 - Google Patents

Ｈｉｖのｃｄ４結合領域に特異的な抗体

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JPH0768276B2 JP2507112A JP50711290A JPH0768276B2 JP H0768276 B2 JPH0768276 B2 JP H0768276B2 JP 2507112 A JP2507112 A JP 2507112A JP 50711290 A JP50711290 A JP 50711290A JP H0768276 B2 JPH0768276 B2 JP H0768276B2
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Description

【発明の詳細な説明】 発明の技術分野 後天性免疫不全症候群（AIDS）はウイルスによって引き
起こされるが、このウイルスは、時代に応じて、ヒトＴ
リンパ球刺激ウイルスIII型（HTLV−III）と呼ばれた
り、リンパ節症関連ウイルス（LAV）と呼ばれてきた。
現在では、このウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス１型
（HIV−１）として知られている。
HIV−１は、Ｔヘルパー／インデューサーリンパ球（以
降、Ｔ細胞と呼ぶ）に感染し、これらを枯渇させること
によって、免疫系に障害を与える。Ｔ細胞が重要である
のは、Ｔ細胞が、Ｂ細胞による抗体の産生、細胞障害Ｔ
リンパ球（キラーＴ細胞）の成熟、マクロファージおよ
びナチュラルキラー細胞の成熟および活性、ならびに免
疫系のエフェクター機能を調節するためである。
Ｔ細胞の感染は、HIV−１が担うエピトープとＴ細胞表
面上に位置する受容体部位との相互作用によって生じ
る。Ｔ細胞上のこの受容体部位は、CD4抗原として知ら
れるタンパク分子である。HIV−１上のエピトープは、
外層エンヴェロープの糖タンパクgp120（分子量約120,0
00ダルトン）に担われている。この糖タンパクgp120
は、HIV感染Ｔ細胞中で作られる前駆体の糖タンパクgp1
60が、膜透過部分のgp41（分子量約4,1000ダルトン）と
gp120とに開裂する際に生じる。糖タンパクgp41は、ヴ
ィリオンの膜の脂質二重層と感染細胞の脂質二重層にわ
たり、その露出部分は引共有結合を介してgp120と会合
している。糖タンパクgp120には、標的細胞と融合する
部位があるが、その標的細胞によってウイルスの遺伝情
報が細胞中にもとらされる。
CD4抗原は、HIV−１のための細胞表面受容体と同定され
ているので、CD4抗原の溶解型（sCD4）は、ウイルスの
感染性を阻止し得ることが繰り返し示されてきた。溶解
型CD4はHIV−１の多様な変異体を阻害し、このことは、
これらすべてのウイルスが比較的よく保存されたCD4結
合領域を共有することを意味する。ラスキーらは、gp12
0とCD4との相互作用を阻害し得る、gp120特異的ウサギ
のモノクローナル抗体を同定した。文献［Cell,50:995
−985（1987）］参照。
このモノクローナル抗体によって認識されるエピトープ
は、HIV−１と遠縁のHIV−２が顕著な相同性を共有する
アミノ酸残基413〜456中の保存領域にマッピングされて
きた。gp120の領域はCD4への結合に重要であると思われ
る。しかし、エンヴェロープの糖タンパクgp120のCD4結
合領域は、HIV−１感染者には免疫原性を示さないよう
である。HIV−１またはHIV−２に感染した患者からの血
清間で、エンヴェロープタンパクに対する抗原の交差反
応性が非常に小さいからである。文献［Clavel,R.et a
l.,Science,233:343−346（1986）］参照。
発明の概要 この発明は、Ｔ細胞のCD4受容体に結合するHIV−１のエ
ンヴェロープ糖タンパクgp120の領域内に位置するエピ
トープ、およびこのエンピトープに結合する抗体に関す
る。このエピトープは、GP120のアミノ酸残基423〜437
に位置している。エピトープと反応する抗体は、HIV−
１のさまざまな株によってＴ細胞の感染を抑制し得る。
すなわち、本発明は、HIV−１のgp120のCD4結合領域中
のアミノ酸配列INMWQKVGKAMYAPに結合し、HIV−Ｉの異
なる複数の株によるＴ細胞の感染を抑制するモノクロー
ナル抗体を提供する。また、本発明は、細胞障害剤、抗
ウイルス剤、または血液−脳関門の通過を容易にする薬
剤と結合した上記本発明のモノクローナル抗体を含む免
疫複合体を提供する。さらに、本発明は、抗体生産細胞
と骨髄種細胞とを融合することにより得られ、上記本発
明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを提
供する。
この発明の抗体（および関連抗体）は、AIDS（AIDS関連
複合体、ARC）に対する治療薬もしくはワクチンとして
使用可能であり、またはHIV感染者であるが無症候の個
人を治療するために使用することができる。また、HIV
−１感染細胞に薬剤を運搬する目的の免疫複合体を作成
するため、こういった抗体を、細胞障害薬または抗ウイ
ルス薬に結合させるか、そういった薬剤を含む微小担体
（例えば、リポソーム）に複合させることができる。治
療薬の標的に対する運搬も、この発明の抗体に由来する
両特異的抗体を用いて行うことができる。両特異的な抗
体には、標的に運ばれるべき薬剤に対する別の特異性が
ある。
治療を目的とした場合、この発明の抗体は、マウスまた
は他の動物からそのまま得られた抗体として生体内で使
用することができる。抗体はヒト由来のものが好まし
い。また、その抗体は、動物／ヒトのキメラ抗体の形態
で作成することもできる。
この発明のモノクローナル抗体の他の用途としては、診
断のために使用される抗イディオタイプの開発、抗体の
スクリーニング、または薬剤のスクリーニングなども可
能である。
図面の簡単な説明 図面の詳細な説明 図1Aおよび1Bはそれぞれ、シンシチウム形成試験によっ
て測定された、７種類の抗CD4結合領域抗体による、異
なったHTLV−III単離物の中和を示す。
図2A、2Bおよび2Cはそれぞれ、H9細胞を用いた感染性検
定法によって測定された、７種類の抗CD4結合領域抗体
による、異なったHTLV−III単離物の中和を示す。
図３は、２つのHTLV−III株で行われたHIV−１結合阻害
試験の結果を示す。
図４は、AIDS患者またはAIDS関連複合体（ARC）患者、
無症候性HIV−１血清型陽性者、およびペプチドT35Sを
有する血清型陰性対照者からのヒト血清の免疫反応性を
示す。
図５は、HTLV−III B、HTLV−III MNまたはHTLV−RFに
感染されたH9細胞に露呈した際、免疫複合体Ｇ−３−51
9−PAP−Ｓの細胞障害効果を示す。
図６は、免疫複合体の細胞障害効果を特異性を示すヒス
トログラムである。
発明の詳細な説明 この発明のモノクローナル抗体の反応エピトープは、Ｔ
細胞のCD4受容体に結合する領域内のgp120上に位置して
いる。CD4受容体結合エピトープは、アミノ酸配列IINMW
QKVGKAMYAPを有するセグメントを含む。この配列は、gp
120の残基423〜437に相当する。このエピトープに体す
る抗体は、強い感染性のHIVを阻害する。例えば、この
エピトープに特異的であったモノクローナル抗体はすべ
て、数種のHIV−１株を阻害する。さらに、このエピト
ープは、各HIV−１株の間で高度に保存されている。そ
の結果、これらエピトープの１種類以上に特異的な抗体
は、HIV−１のさまざまな株を阻害し得る。
このエピトープに対する抗体は、体細胞融合法によって
作成することができる。一般には、文献［G.Kohler and
C.Milstein,Nature,256,725（1975）およびFung et a
l.,Biotechnology5:940−946（1987）］参照。すなわ
ち、マウスなどの動物がHIVのgp120によって免疫化され
る。このgp120は、この目的のウイルス溶解物から精
製、または部分的精製が可能である。gp120の精製は、g
p120に対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラ
フィーによっつ行うことができる。免疫化の後、Ｂ細胞
の免疫動物から採取し、骨髄腫細胞などの悪性細胞と融
合させる。
エピトープに結合する抗体を産生するハイブリドーマ
は、スクリーニング手法によって同定することができ
る。こういったスクリーニング手法では、ハイブリド細
胞が最初に、好ましくは酵素結合免疫吸着検定法（ELIS
A）またはウエスターン法を用いてgp120に対する抗体の
産生の可否について試験される。この決定法を各ハイブ
リド細胞に行い、その後の解析のために陽性のハイブリ
ド細胞を選別する。最後に、最も高い反応性を示すもの
を選別する。さまざまな株の中で交差反応性に関して、
ウイルス感染細胞表面の免疫蛍光染色、代謝的に放射線
標識されたウイルスを用いた放射線免疫沈澱法によっ
て、これらの抗体を試験することができる。Fungの上記
文献を参照。
上記の方法によってgp120と反応性のある抗体を同定し
た後、これら抗体を中和活性に関して試験することがで
きる。この活性は、２つの検定法によって測定されるこ
とが好ましいが、最初の方法はウイルス中和法であっ
て、文献［Ho,D.D.et al.,Science,239:1021−1023（19
88）］に記載されている。この検定法では、H9細胞中の
HIV−１感染性の抑制の程度が測定される。第２の中和
法は、文献［Nara,P.L.et al.,AIDS Res.Hum.Retroviru
ses,3:283−302（1987）］に記載されたようなシンシチ
ウムの阻害の程度に基づくものである。HIV−１および
抗体が、CD4＋CEM−SS細胞を播種した穴に添加される。
HIVが感染したCEM−SS細胞は、細胞表面上にgp120をよ
く発現するようになり、隣接のCD4＋CEM−SS細胞とシン
シチウムを形成する。モノクローナル抗体によるHIV−
１の中和は、シンシチウムの形成阻害となって現れる。
次いで、HIV−１阻害抗体が結合するエピトープが同定
される。これは、さまざまな領域に相当し、５つのアミ
ノ酸が互いに重なりあうペプチドを調製することによっ
て行うことができる。続いて、これらのペプチドとの反
応性を、ELISAなどの標準的な免疫検定法で調べること
ができる。特に、これらの抗体は、アミノ酸配列IINMWQ
KVGKAMYAPを有する、gp120のI15P領域との反応性に関し
て調べることができる。
この発明のモノクローナル抗体の治療的用途としては、
生体内での免疫療法および生体外での免疫療法が挙げら
れる。この発明のモノクローナル抗体を使った直接の生
体内療法では、体内、好ましくは静注によってこの抗体
を投与することである。脳で感染細胞を処置する必要の
ある場合、抗体をある種の親油性物質などの薬剤に結合
させることができ、これによって薬剤が血液−脳関門を
通過できるようになる。この発明の抗体は、HIV−１の
さまざまな株および分離物によってＴ細胞の感染を抑制
できるので、これらは、患者群が遭遇するウイルスのさ
まざまなタイプに対して有効な防御を可能とする。
確立された遺伝子工学的手法を用いれば、動物由来およ
びヒト由来の部分を有する抗体を創製することができ
る。こういったキメラ抗体は、動物由来の抗原結合（可
変）領域およびヒト抗体由来の一定領域を含む。動物
は、マウスまたはラットなど他の囓歯類であり得る。こ
のキメラ抗体の可変領域がマウス由来であって、一定領
域がヒト由来であれば、一般にキメラ抗体は、「純粋
な」マウス由来のモノクローナル抗体より免疫原性が弱
くなるので、おそらく治療の用途に一層適するであろ
う。
キメラ抗体は、成分の抗体鎖をコードするキメラDNA構
造体によって産生され得る。文献［V.T.Oi et al.,Bio
Techniques4（４）:214−221（1986）;L.K.Sun et al.,
Hybridoma5（1986）］参照。こういったDNA構造体は、
ヒトの不変領域をコードするDNAに結合したHIV−１中和
抗体の短鎖または長鎖の可変領域の機能的に再配列した
遺伝子をコードするDNAを含む。骨髄腫などのリンパ球
様細胞、または短鎖および長鎖のためのDNA構造体をト
ランスフェクトしたハイブリドーマは、抗体鎖を発現
し、これらを会合することができる。
もう一つ別の、実質的に非免疫原的な療法は、ヒトのモ
ノクローナル抗体を使用するものである。不死化抗体産
生Ｂ細胞系を得る好ましい方法は、HIV−１感染者から
のＢ細胞をエプシュタインバールウイルスでトランスフ
ォーメイションすることである。トランスフォーメイシ
ョンされたＢ細胞クローンは、gp120およびそのエピト
ープペプチドを用いた特異的反応性によってスクリーニ
ングすることが可能である。さらに一つの好ましい方法
は、バクテリオファージλ発現ベクター（例えば、カリ
フォルニア州ラジョラのストラトサイト社によるImmuno
ZapTM）を使って、ヒトのモノクローナル発現ライブラ
リーを作成することである。これは、文献［Alting−Me
es et al.,Strategies in Molecuuar Biology,No.1,Vo
l.3,（Jan.1990）］に記載されている。本質的にこの方
法では、リンパ球集団からの免疫がグリブリン可変領域
遺伝子の増幅、これに続く大腸菌中のライブラリーの作
成を行う。その際、大腸菌の中で長鎖の可変領域遺伝子
が、単独、または短鎖の可変領域遺伝子と組み合わさっ
て発現される。抗原（この発明のペプチドなど）は、抗
原に対する結合領域を産生するクローンを同定するため
のスクリーニングに使用される。抗原特異的可変領域の
遺伝子が同定されると、これらを、上記のキメラ抗体の
産生に使用した方法に類似の方法によって、望ましいヒ
トの一定領域遺伝子に結合させることができる。
この発明のさらに別の実施態様では、細胞障害薬または
抗ウイルス薬の運搬を助けるために本発明のモノクロー
ナル抗体を使用することができ、これは、ある毒素に結
合した抗体またはその断片を含む免疫複合体を形成する
ことによって使用可能である。細胞障害薬の例として
は、細胞障害ステロイド類、ゲロニン、アブリン、リシ
ン、およびホスホリパーゼ類が挙げられる。抗ウイルス
薬の例としては、インターフェロン、アジドチミジンお
よびリバビリンが挙げられる。この発明の抗体とともに
用いられる特に好ましい毒素は、アメリカヤマゴボウの
抗ウイルスタンパク（PAP−Ｓ）である。この免疫複合
体は、抗体と毒素を化学的に結合させるか、組換えDNA
技術によって形成することが可能である。
モノクローナル抗体のもう一つの形態は、両特異的なハ
イブリド抗体であり、この抗体は、２つの異なった抗原
結合部分（すなわち、異なった特異性）を有する。一方
の抗原結合部分はこの発明のモノクローナル抗体由来の
ものであり、他の抗原結合部分は特定部位を標的とする
薬剤に対して特異性をもつものであり得る。例えば、他
方の特異性は、CD4分子になどの、ヒトＴ細胞またはマ
クロファージの表面エピトープに関する場合がある。こ
れらの両特異的抗体は、HIV−１感染細胞へＴ細胞また
はマクロファージを運搬するために用いることができ
る。
両特異的抗体は、両特異性を有する、単一抗体、ハイブ
リド抗体または抗体断片（文献［M.Brennan,“A Chemic
al Technique for the Preparation of Bispecific Ant
ibodies from Fab′ Fragments of Mouse Monoclonal I
gGl",Biotechniques4:424−27（1986）］参照）か、ま
たはこの抗体は、それぞれが異なった特異性を有する２
つの抗体のヘテロ凝集体であり得る。
この発明の抗体は、集団中でさまざまな株のHIV−１に
対して交差保護が可能であるため、受動免疫に特に適し
ている。この方法では、無症候性（AIDSまたはARCの症
候を呈さない）の患者、または血清適陰性であるが高リ
スク群の患者に、感染を抑制する処置が行われる。対象
の例としては、HIV−１キャリアーの母親によって感染
される胎児またはその母親の新生児、およびAIDS患者ま
たは汚染された血液を吸う健常な職員が挙げられる。ま
た、治療のための薬剤は、この発明のモノクローナル抗
体、キメラモノクローナル抗体、または両特異的モノク
ローナル抗体であり得る。
この発明のモノクローナル抗体は、既知の技術を使って
抗イディオタイプ抗体を調製するためにも用いられる。
これには、無症候性のHIV−１感染者またはAIDSもしく
はARC患者が、HIV−１株のgp120のペプチドセグメント
と抗原的に関連のある特定のペプチドセグメントに反応
性を示す抗体を産生するか否かを決定するために、診断
的検定法としての用途がある。こういった診断的決定法
であれば、サンドイッチ法またはタンデム検定法など数
種の既知タイプの手法があり得る。
その抗イディオタイプ抗体は、モノクローナル抗体、そ
の他のCD4結合領域に反応性を示す薬剤を単離するため
の薬剤スクリーニング法にも使用可能なので、治療面で
極めて有用である。
この発明の中和抗体は、アミノ酸配列IINMWQKVGKAMYPを
有するgp120のCD4結合領域に位置するエピトープを認識
する。このペプチドは、gp120の＃423残基から＃437残
基を示す。アミノ酸残基＃422〜432を含み、文献［Lask
y et al.,Cell,50:975−985（1987）］においてもモノ
クローナル抗体5C2E5とかつて同定された、11個のアミ
ノ酸のペプチドは、この発明のモノクローナル抗体とは
反応しなかった。
この発明のモノクローナル抗体を免疫応答により誘起で
きるペプチドは、互いに結合させて、より大きな多価の
オリゴペプチドが形成可能である。このペプチドを化学
合成によって製造することもできる。または、これらペ
プチドは、これらをコードするDNA配列が合成される
か、HIV−1DNAから単離されて適当な発現系で実現され
るような組換えDNA技術によって製造することもでき
る。
これらペプチドは、HIV−１に対する免疫応答を引き起
こすために、個々に、または組み合わせて使用すること
することもできる。この目的で、一般に宿主1kgあたり
１μｇないし20mgの範囲の濃度で投与するためのワクチ
ン組成物にペプチドを調製することもできる。水、生理
食塩水またはリン酸緩衝液（PBS）といった生理学的に
許容性のある担体を、配合物中で使用することが可能で
ある。水酸化アルミニウムゲルなどのアジュバントも使
用することができる。投与経路は、筋肉内、腹腔内、ま
たは静脈内とすることができる。それら組成物は、通常
１ないし４週間間隔で必要な回数だけ何回も投与するこ
とができる。
この発明を、以下の実施例によって詳述する。
実施例１ gp120のCD4係合領域に対して反応性を示すモ
ノクローナル抗体の生産および試験 A.材料および方法 1.抗体生産およびスクリーニング HTLV−III Bのエンヴェローブ糖タンパクであるgp120
を、H9/HTLV−III B細胞抽出物から調製した。H9/HTLV
−III B細胞を、10mM Tris−HCl（pH7.5）、120mM Na
Cl、1mM MnCl2、0.5％Triton X−100および0.1mM フッ化フェニルメチルスルホニルからなる溶解緩衝液で
溶解した。抽出物を、56℃で１時間、熱で不活化し、レ
ンチルセファロース（シグマ社、ミズリー州セントルイ
ス）と反応させた。結合分画を溶出させ、gp120に対す
るマウスのモノクローナル抗体が結合したアフィゲル−
10（BAT123）とともにインキュベーションした。文献
［Fung al.,Biotechnology,5:940−946（1987）］参
照。ウイルスのgp120分画を溶出させ、免疫原として使
用した。５匹のBALB/cマウスをフロインド完全アジュバ
ンド中のタンパク25μｇで免疫し、１カ月間隔をおいて
同じアジュバント中にタンパク25μｇでさらに３回免疫
した。この最終の追加免疫化の３日後、マウスを解剖し
て脾臓細胞を分離し、Fungら（上掲）の記載通りにSP2/
0骨髄腫細胞と融合させた。ハイブリッドを、増殖培地
に0.1mM ヒポキサンチン、0.4μＭアミノプテリンおよ
び16μＭチミジンを補充することによって選択した。２
週間後、上清をマイクロタイタープレートの穴から回収
した。10日後、各穴には約10個のハイブリッドコロニー
が存在していた。コーチング抗原としてペプチドT35Sお
よびgp120を用いたELISAによる連続的スクリーニングで
は、約140,000個のハイブリドーマが存在すると推定さ
れた。ペプチドT35Sは、Laskyら（上掲）が記載する通
りのCD4結合領域を含む合成ペプチドである。さらに特
徴を調べるために選択されたハイブリドーマからのモノ
クローナル抗体は、マウスの腹水中で生産され、プロテ
インＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製
された。両スクリーニング法で強い陽性反応を与える合
計７つの増殖体を、限界希釈によってクローン化し、そ
の上清を、コーチング抗原としてT35Sを用いてELISAに
よってスクリーニングした。これら７つのモノクローナ
ル抗体をG3系列で命名し、それぞれG3−42、−211、−2
99、−508、−519、−536、および−537と命名した。こ
れらは、すべてIgG1のサブクラスである。
次いで、上記と同じ免疫化を別の２匹のマウスに実施し
た。これらを解剖した後、上記と同一の融合法を実施し
た。ハイブリッドの選別も上記のとおりに行ったが、60
枚の96穴プレートを使用した。１穴あたり約10個のクロ
ーンが存在し、ハイブリドーマのコロニー約60,000個を
産生していた。ペプチドgp120を用いたELISAによって連
続的にスクリーニングを行ったところ、635個の穴が陽
性を示した（ELISA上での光学密度＞0.25で示す）。こ
れらのハイブリドーマを選別し、上記のとおりに増殖さ
せたところ、そのスクリーニングで強い陽性を示す４つ
のハイブリドーマを、限界希釈でクローン化した。そし
て、上清は、コーチング剤としてgp120を用いたELISAに
よってスクリーニングした。この４つのモノクローナル
抗体はすべてIg G1サブクラスであって、G45シリーズで
命名し、それぞれG45−60、G45−16、G45−70、およびG
45−89と命名した。
2.さまざまなHIV−１の単離物を用いた反応性に関する
モノクローナル抗体の性質決定 G3系列のモノクローナル抗体を、その他のHIV−１単離
物との反応性に関して試験した。HTLV−III B、HTLV−I
II RF、HTLV−III MN、HTLV−III AL、HTLV−III WMJ、
HTLV−III Z34およびHTLV−III Z84で断続的に感染させ
たH9細胞を、10％熟不活化ウシ胎児血清、100U/mlペニ
シリンおよび100μg/mlストレプトマイシを添加したRPM
I−1640培地中で維持した。高レベルの逆転写酵素活性
を含むHTLV−III B、HTLV−III RFおよびHTLV−III AL
で感染させたH9細胞からの無細胞培養上清の一部を凍結
させ、下記のとおりに中和試験で使用した。
3.免疫蛍光染色 HIV−１感染H9細胞の免疫蛍光染色法は、Fungら（上
掲）によって記載された。５×106細胞/mlのH9細胞の一
部55μｌを、1.5mlの微小遠心管に添加した。プロテイ
ンＡで精製したモノクローナル抗体（５μg/ml）55μｌ
を添加し、室温で30分間インキュベーションした。次い
で、これらの遠心管を300×ｇで５分間遠心し、上清を
除いて、細胞を２％ウシ胎児血清および0.1％アジ化ナ
トリウムを含むRPMI−1640倍地で洗浄した。これらの遠
心管に水を加え、細胞をほぐした。リン酸緩衝液（PB
S）により1:200で希釈した、フルオロセインイソチオシ
アネート（FITC）複合抗マウスIg Gやぎ抗体（タゴ社、
カリフォルニア州ブーリンゲーム）10μｌを添加し、室
温で30分間インキュベーションした。細胞を洗浄した
後、PBSに浮遊させ、この液をスライドガラス上にの
せ、カバーガラスで覆って、蛍光顕微鏡で調べた。対照
は、非感染のH9細胞および特異性のない抗体であった。
G45シリーズのモノクローナル抗体では、同じ染色法を
使ってある腫のHIV−１単離物への結合を試験した。し
かし、細胞は、0.5％パラホルムアルデヒドで固定して
から、フローサイトメトリー法（Kim et al.,1990.J.Im
munol.144:1257）によって解析した。
4.酵素結合免疫吸着検定法（ELISA） モノクローナル抗体のスクリーニングおよびエピトープ
マッピングは、ELISAによって行なわれた。HIV−１血清
型陽性患者の血清の反応性も、ELISAによって試験し
た。血清は、65人のHIV−１血清型陽性患者から任意に
採取した。これら被検者の30人はAIDS患者であり、19人
はAIDS関連複合体をもっており、16人は無症候であっ
た。10人の血清型陰性ドナーからの血清も対照として試
験した。
ELISAでは、イムロン（Immulon）２マイクロタイタープ
レート（ダイナテック社、バージニア州チャンチリ）
を、PBSに溶けた、合成ペプチド100μｌ（５μg/ml、し
かしT35Sでは0.5μg/ml）または精製gp120（0.1μg/m
l）で室温にて一晩コートした。次いで、これらを、PBS
に溶けた５％BLOTTOで室温にて１時間インキュベーショ
ンし、PBS−Tween20（0.05％）で洗浄した。次いで、培
養培地100μｌ、または精製マウスモノクローナル抗体1
00μｌ（PBS/Tween20で0.4μg/mlまで希釈）もしくは希
釈ヒト血清100μｌ（BLOTTO緩衝液で1:100に希釈）を添
加した。そして穴を、セイヨウワサビのパーオキシダー
ゼと結合した適切な抗マウスIg Gヤギまたは抗ヒトIg G
ヤギで室温にて１時間インキュベーションした。もう１
回の洗浄工程を行った後、結合した抗体を、基質として
の0.1％テトラメチルベンジヂンおよび0.0003％過酸化
水素との反応によって肉眼で観察できるようにした。反
応溶液の光学密度（OD）を450nmで測定した。
5.gp120ペプチドの生成 ペプチドT35Sを合成し、ペニシュラ・ラボラトリーズ社
（カルフォルニア州ベルモント）によってその性質を調
べた。この発明で使用された他すべてのペプチドは、マ
ニュアルに記載されたFMOC（９−フルオレニルメトキシ
カルボニル）合成プロトコールによって、デュポン社
（デラウエア州ウイルミントン）のRaMPSペプチド合成
系を使って合成した。RaMPS合成ペプチドの純度を高速
液体クロマトグラフィーによって決定し、予想された構
造を高速原子衝撃／質量分析法によって検定した。その
合成ペプチドのアミノ酸残基および配列は、表１に示す
ように、HIV−１のHXB2クローン由来であった［Myers,
G.et al.,Human Retroviruses and AIDS,Los Alamos Na
tl LAb.,Los Alamos,NM（1988）］。
6.放射線免疫沈澱検定法（RIPA） G3系列抗体の反応性を確立したRIPAプロトコールによっ
て試験した。文献［Ho,D.D.et al.,Science239:1021−1
023（1988）］参照。すなわち、H9細胞（HTLV−III B、
HTLV−III RF、HTLV−III ALおよびHTLV−III WMJで感
染）を、［35S］システインおよび［35S］メチオニン
（100μCi/ml）（ICN、カルフォルニア州イルビン）で
代謝的に標識し、RIPA溶解緩衝液（50mM Tris−HCl（pH
8.0）、150mM NaCl、１％Triton X−100、１％Naデオ
キシコレート、0.1％SDS、および1mM フッ化フェニル
メチルスルフォニル）中に浮遊した。溶解物は、マウス
のκ短鎖（κ−PAS）に対するウサギ抗血清に結合した
プロテインＡセファロースで室温にて３時間前処理し
た。RIPAは、精製マウスモノクローナル抗体３μｇ、お
よび10％κ−PAS浮遊液0.3mlを、標識して清澄化した溶
解物200μｌに添加することによって行った。これらの
試料を４℃で18時間インキュベーションし、RIPA溶解緩
衝液で洗浄した。ペレットを、電気泳動の試料緩衝液中
に懸濁し、３分間沸騰させた。タンパクをSDSポリアク
リルアミドゲル電気泳動、続いてオートラジオグラフィ
ーによって解析した。
7.HIV−１の中和試験 ２種類の異なる検定法を用いて、G3系列のモノクローナ
ル抗体でウイルスの中和試験を実施した。その決定法と
は、文献［Nara et al.,AIDS Res.Human Retroviruses,
3:283−302（1987）］に記載されたような、CEM−SS細
胞を用いたシンシチウム形成試験、および文献［Ho et
al.,（上掲）］に記載されたような、H9細胞を用いた別
の中和試験である。G45系列には、シンシチウム形成試
験のみを使用した。
シンシチウム形成試験では、モノクローナル抗体の２倍
の逓減希釈を、10％の熱不活化ウシ胎児血清を補ったRP
MI−1640培地中で行った。各希釈抗体50μｌを等量のウ
イルス（100シンシチウム形成単位、すなわちSFU）と混
合し、室温で１時間インキュベーションした。この混合
物を、DEAE−デキストラン処理CEM−SS細胞５×104を含
むポリ−Ｌ−リシン処理マイクロタイター２穴に添加
し、３〜４日インキュベーションした。形成されたシン
シチウムの数を、倒立顕微鏡を使って計数した。中和の
力価は、50％（Vn/Vo＝0.5）を用いて決定した。Vnは、
試験穴中のウイルス誘導SFUの数を示し、Voは、増殖培
地のみが添加された際に対照でのウイルス誘導SFUの総
数を示す。
他の中和試験では、H9の細胞中でのHIV−１の阻害程度
が測定された。この検定法では、ウイルス接種物100μ
ｌ（50TCID50）を異なった濃度の試験抗体100μｌで37
℃にて１時間プレインキュベーションしてから、この接
種物を、15％ウシ胎児血清、10mM HEPES（Ｎ−２−ヒ
ドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホン
酸）、250U/ml ペニシリン、250μg/mlストレプトマイ
シンおよび2mM Ｌグレタミンを補ったRPMI−1645培地
1.5ml中に存在する0.75×106個のH9の細胞中に接種し
た。７日目に、ELISA（アボットラボラトリーズ社、イ
リノイ州N.シカゴ）によるHIV−特異的p24抗原を試験す
るために、無細胞培養の上清を回収した。
数人の患者のHIV−１単離物にG3−519を使ったもう一つ
の中和試験を、文献［Ho,D.D.et al.,N.Engl.J.Med.198
9,321:1621］に記載されたような、別の方法によって実
施した。患者のHIV−１の単離物の50TCID50を使って、H
IV−１の血清型陰性クローンから得られた、１×106個
のPHA刺激末梢血核球（PBMC）を感染させた。さまざま
な濃度のモノクローナル抗体を、感染前に37℃で１時間
ウイルスとともにインキュベーションした。７〜10日目
では、p24検定法（以下記載）のための培養上清を回収
し、HIV−１感染をモニターした。
8.HIV−１結合阻害試験 G3系列に対して、Ho,D.D.ら（上掲）が記載するような
結合阻害試験を用いた。すなわち、HIV−１ヴィリオン
の濃縮調製物（10μｌ）をモノクローナル抗体（1mg/m
l）10μｌで室温にて30分間前処理してから、C8166細胞
とともにインキュベーション（５×105個、37℃で30分
間）した、続いて、細胞を洗浄し、FITC（希釈率1:50）
に複合させたヒト抗HIV25ml中に浮遊させた。４℃で30
分間、細胞を洗浄し、１％パラホルムアルデヒドで固定
して、フローサイトメトリーによって解析した。
B.結果 1.gp120特異的モノクローナル抗体の生産および性質決
定 ここで詳述した方法で単離した７種類のG3系列モノクロ
ーナル抗体およびG45系列モノクローナル抗体は、HTLV
−III RF、−MN、−AL、−Z84および−Z34といった他の
HIV−１株に反応性を示す。これは、ウイルス感染細胞
表面を間接的に免疫蛍光染色することによって確認され
た（表２）。
代謝的に標識したHTLV−III B、HTLV−III RF、HTLV−I
II ALおよびHTLV−III MJが感染したH9細胞溶解物を使
って、G3系列モノクローナル抗体を放射線免疫沈澱試験
によっても調べた。表３に総括されるように、７種類の
G3系列すべてのモノクローナル抗体は、さまざまなHIV
−１単離物のgp120とgp160の両者を特異的に沈澱させ
た。このことは、HIV−１の少なからぬ株に対するこれ
ら抗体の幅広い反応性をさらに示す。
2.HTLV−III B、HTLV−III RF、HTLV−III ALおよびHTL
V−III Z84感染性の中和 シンシチウム形成試験では、複数のシンシチウムが３日
目または４日目に計数された。群特異的な中和免疫反応
がCD4結合領域に対するモノクローナル抗体の特徴か否
かを決めいために、gp120中の予想アミノ酸配列が21.4
％だけ異なるHTLV−III BおよびHTLV−III RF単離物を
使用し、同様にこれらの株とは異なることが知られてい
るHTLV−III Z84（ザイール由来）およびHTLV−III AL
（ハイチ由来）を使用した。図１に示すように、７種類
のG3系列モノクローナル抗体は、単離物HTLV−III Bお
よびHTLV−III RFに対して異なった中和活性を明らかに
示す［これらの株の中和を、図１（Ａ）および図１
（Ｂ）にそれぞれ示す］。Vnは試験穴中のウイルス誘導
SFUの総数を、Voは抗体を用いない対照のウイルス誘導S
FUの総数を示す。HTLV−III BおよびHTLV−III RFに対
する各G3系列モノクローナル抗体のID50（50％阻害用
量、すなわち、HIV−１による標的細胞の感染が50％だ
け阻害されるモノクローナル抗体濃度）を表４に示す。
表４は、HTLV−III MNおよびHTLV−III Z84に対するG3
−519およびG45−60のシンシチウム形成阻害も示す。
図１および表４のデータから、（シンシチウム阻害とH9
細胞感染性試験の両者によって測定されるように）G3−
299がHTLV−III Bの中和で最も強く、一方、G3−519がH
TLV−III RFの中和で最も強いことが示唆される。これ
らモノクローナル抗体の大部分は、投与HIV−１の50％
中和を達成するのに高用量（＞10μg/ml）を必要とす
る。
シンシチウム阻害だけで測定した場合、G45−60は、HTL
V−III RFおよびHTLV−III MNを中和する上でG3−519と
実質的に同等であった。しかし、G45−60は、HTLV−III
Z84を中和する際には実質的により有効であった。
HIV−１中和に関する同様の結果が、H9細胞の感染性試
験によるG3系列のモノクローナル抗体で得られた。これ
らの結果を表４および図２に総括するが、図2Aは、HTLV
−III Bの中和を示し、図2BはHTLV−III RFの中和を示
し、図2CはHTLV−III ALの中和を示す。図２は、対照の
培養物と比較した場合、上清中のp24高原の減少を示
す。記号は図１でのものと同一である。ここでも、HTLV
−III BおよびHTLV−III RFの中和で最も強い抗体は、
それぞれG3−299およびG3−519であった。HTLV−III AL
はG3−508、G3−519、G3−42およびG3−536による中和
に特に感受性を示した。G3−508およびG3−519のID
50は、両者とも0.2μg/ml未満であった（表４）。数種
のモノクローナル抗体は、HIV−１の感染性を50％中和
するのに10μg/mlを超える濃度を要した。
3.G3−519による患者のHIV−１単離物の調製および中和 G3−519を使った中和試験を、ロサンゼルス地域の８人
のAIDS患者の血漿から得られた数種のHIV−１初期単離
物に対して実施した。これらの初期HIV−１単離物を使
用して、PHA刺激血清型陰性の末梢血単核球（PBMC）を
感染させた。７日目ないし10日目に、患者のウイルス単
離物を含む培養上清を細胞培養物の遠心によって回収し
た。この培養上清は、アボット・ラボラトリーズ社製の
p24ELISAを用いて、p24濃縮物に関して測定された。
G3−519は、８人の患者中４人に対して中和活性（ID50
＜５μg/ml）および１人の患者に対して限界中和活性
（ID≧５μg/ml）を示し、３人の患者に対して全く中和
活性を示さなかった。
4.CD4結合領域におけるエピトープの構造 gp120上のCD4結合中和においてエピトープをより正確に
マッピングするために、それぞれ５個のアミノ酸同士が
重なり合う４種類のペプチド（T15W、I15P、A15Sおよび
I15D）、ならびにモノクローナル抗体のエピトープが5C
2E5（Lasky,L.A.ら、上掲）と同定された５種類目のペ
プチドQ11Kを合成した（表１）。この群のペプチドに対
するELISAを、７種類のモノクローナル抗体を用いて実
施した。これらすべてのモノクローナル抗体は、I15Pに
極めて強く結合するが（OD＞1.0）、その隣接ペプチド
には結合しない（OD＜0.1）（表５）。ペプチドQ11K（L
asky,L.A.ら、上掲）は、Ｎ末端のグルタミンを除いて
ペプチドI15Pに全体的にほとんど含まれる11個のアミノ
酸からなるペプチドであって、これらの実験条件下で７
種類のモノクローナル抗体のいずれとも反応性を示さな
いことは興味深い。
5.CD4＋細胞に結合するHIV−１の阻害 図３に示されるように、gp120のアミノ酸423−437に対
するG3系列モノクローナル抗体は、CD4＋C8166細胞に対
するHTLV−III B（開放カラム）またはHTLV−III RF
（充填カラム）の結合を有意に阻害する。これらのモノ
クローナル抗体は、図３で以下のように示される。G3−
519（４）、G3−508（５）、G3−42（６）、G3−211
（７）、G3−299（８）、G3−536（９）、G3−537（1
0）。その他の試薬は、AIDS血清（１）、健常者血清
（２）、およびBAT−123（３）である。上記のように、
HIV−１を中和する能力の実質的な差異にかかわらず、C
D4＋C8166細胞に対するHIV−１の特異的な結合におい
て、これらモノクローナル抗体の阻害活性は同程度であ
った。対照的に、BAT−123は、gp120の中心部の超可変
ループ（アミノ酸残基300〜330、Fnugら、上掲）に特異
的なマウスのモノクローナル抗体であって、標的細胞に
対するHIV−１の結合に影響を及ぼさなかった。
6.CD4結合領域ペプチドT35Sを有する、HIV−１感染者か
らの血清の反応性 AIDS患者（Ｎ＝30）またはARC患者（Ｎ＝16）、無症候
性のHIV−１血清型陽性者、および健常者ドナー（Ｎ＝1
0）からの血清試料は、ELISAによってペプチドT35Sとの
反応性に関して解析した。各血清試料に対して、ペプチ
ドでコートした２穴とPBSで処理した２穴の平均吸光度
の差としてOD値を計算した。カットオフのOD値（0.07
5）は、10個の血清型陰性の血清試料に対して、平均OD
値＋2SDを示す。ELISAの結果（第４）は、AIDSまたはAR
C患者からの血清によって示された免疫反応性が、健常
者の対照試料のものと有意差がないことを表す。試験し
た30人のAIDS患者および19人のARC患者の間では、ペプ
チドT35Sに対する検出可能な抗体は見いだされなかっ
た。無症候性血清型陽性者16人中２人からの血清試料だ
けが、上記のカットオフ値を有意に越えるシグナルを示
す。実施例２ PAP−Ｓおよびモノクローナル抗体の免
疫複合体 免疫複合体は、HIV−１のgp120のCD4結合領域を認識す
るマウスのさまざまなモノクローナル抗体をジスルフィ
ド結合を介してPAP−Ｓに化学的に結合させることによ
って調製可能である。これら免疫複合体は、G3−519−P
AP−Ｓで例示されるように、HIV−１のさまざまな株に
感染したヒトＴ細胞に対する特異的な細胞毒性を示す場
合がある。合成ペプチドを使った、上記のエピトープマ
ッピング試験によれば、モノクローナル抗体G3−519はg
p120の相対的に保存された領域（アミノ酸数423〜433）
を認識することが分かった。
この実施例では、アメリカヤマゴボウの抗ウイルスタン
パクおよびgp120のCD4結合領域上のエピトープに対して
反応するモノクローナル抗体の調製法および有効性を説
明する。
A.材料および方法 1.PAP−Ｓの精製 バルビエリら［Barbieri L.et al.,（1982）Biochem.J.
203:55−59］の方法を用いてフィトラッカ・アメリカナ
（Phytolacca anmericana）（アメリカヤマゴボウ）の
種子から、PAP−Ｓを精製した。すなわち、アメリカヤ
マゴボウの種子（100g）を5mMのリン酸緩衝液（pH6.0）
500ml中でホモジネーションした。10,000×ｇで１時間
遠心した後、不溶性物質および脂質を除去した。上清
を、5mMリン酸緩衝液で平衡化した、CMセファロース・
ファースト・フロー（ファルマシア社、ニュージャージ
ー州ピスカタウエイ）カラムにかけた。洗浄した後、結
合タンパクをNaCl勾配（０〜0.3M）で溶出した。リボソ
ーム不活化活性を含むピークをプールし、分子量カット
オフ値10,000ダルトンの膜を用いてPBSに対して透析し
た。
2.抗体および毒素複合体 カールソンら［Carlson J.et al.,（1978）,Biochem.J.
173:723−737］が記載する通りに、G3−519とヘテロ二
機能性架橋剤のＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリ
ジルジチオ）プロピオネート（ファルマシア社）とをモ
ル比1:3で反応させた。文献［Lambert,R.et al.,（197
8）,Biochemistry,17:406−416］の記載通りに、アメリ
カヤマゴボウの抗ウイルスタンパク（6mg）と２−イミ
ノチオランとをモル比1:3で反応させた。10PDカラム
（バイオ・ラド社、カリフォルニア州リッチモンド）を
用いたゲル濾過によって、過剰の薬剤を除去した。化学
的に修飾された抗体およびPAP−Ｓを一緒にして、室温
で２時間または４℃で一晩インキュベーションした。非
結合のPAP−Ｓを、PBSで平衡化したセファクリルＳ−20
0（HR）カラム上でのゲル濾過によって除去した。抗体
および複合体を含むピークをプールして、10mlまで濃縮
してから、5mMリン酸緩衝液（pH6.0）に対して透析し
た。透析試料をモノＳ（ファルマシア社）カラムにかけ
て、NaCl勾配をかけて免疫複合体をカラムから溶出させ
た。その免疫複合体の組成は、非還元条件下（ファース
トシステム、ファルマシア社）で分子量マーカー（バイ
オラド社）とともに7.5％ドデシル硫酸ナトリウムポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）によって解
析した。
3.免疫複合体の細胞毒性試験 G3−519免疫複合体のHIV感染細胞殺傷能を、感染細胞の
［3H］−チミジン取込みの阻害によって測定した。非感
染か、またはHIV−１株（HTLV−III B、HTLV−III RF、
およびHTLV−III MN）による慢性感染のH9細胞を、15％
熱不活化ウシ胎児血清、100U/mlペニシリンおよび100μ
g/mlストレプトマイシンを補ったRPMI−1640培地中にて
対数増殖期に維持した。100および80μｌの５×104細胞
/mlを96穴マイクロタイマープレートの各穴に分注し
た。５段階に逓減希釈（100μg/ml〜160ng/ml）した精
製免疫複合体20μｌを３つ組みで穴に添加した。対照
は、同一条件下で同等濃度の無関係なPAP−Ｓ免疫複合
体または非複合体抗体とPAP−Ｓとの混合物とした。細
胞培養物を37℃で24時間保存し、さらに４時間１穴あた
り１μCiの［3H］−チミジンでパルスした。スカトロン
（Skatron）細胞収穫器を使って細胞をガラスフィルタ
ー上に収穫し、乾燥濾紙上に保持された［3H］−チミジ
ンをシンチレーション計測によって測定した。細胞によ
るチミジンの取込みの阻害は、対照試料の試験培養物の
放射活性と比較することによって計算した。
上記の免疫複合体による細胞の特異的な殺傷を調べるた
めに、その複合体と拮抗する非複合モノクローナル抗体
を使った試験を行った。チミジンの取込みを55％阻害す
る0.6μg/mlのG3−519−PAP−Ｓがこの試験に選ばれ
た。G3−519−PAP−Ｓを添加する前に、感染したH9細胞
を37℃で30分間非複合モノクローナル抗体とインキュベ
ーションした。
B.結果 1.G3−519免疫複合体の精製および性質決定 G3−519免疫複合体を、110mM NaCl濃度のところの単一
ピークとして、モノＳカラムから溶出させた。しかし、
このピークは、非還元条件下での7.5％SDS−PAGEによっ
て解析されたので、２つのタンパクバンドに分割した、
すなわち、それらは、抗体１分子あたりPAP−S2分子を
含む複合体を表す高分子量のバンドと、１抗体分子あた
りPAP−S1分子の複合体を表す低分子量のバンドであ
る。クマシブルー染色したゲルのデンシトメターによる
解析では、高分子量の複合体が総免疫複合体の約25％を
占めることが示された。G3−519の総合エピトープを含
む合成オリゴSDS−PAGEを使ったELISAによって測定され
た免疫複合体の結合活性によれば、複合の後に抗体の結
合活性の障害は生じないことが分かった。
2.G3−519−PAP−ＳのHIV−１感染細胞に対する細胞毒
性 HIV−１の３種類の異なった株で別個に感染させたH9細
胞はすべて、G3−519−PAP−Ｓ処理に感受性を示した
（図５）。記号は以下のとおりである。非感染H9細胞
（黒塗り三角）、HTLV−III B感染H9細胞（白抜き
丸）、HTLV−III MN（白抜き三角）、およびHTLV−III
RF感染H9細胞（白抜き四角形）。この免疫複合体は、HT
LV−III Bで感染させたH9細胞（IC50＝1.4×10-9M）よ
り、HTLV−III MNで感染させたH9細胞（IC50＝1.7×10
-9M）をより効果的に殺傷した、G3−519−PAP−Ｓは、
5.3×10-8Mまで非感染H9細胞に細胞毒性を示さなかっ
た。
3.免疫複合体の特異的細胞毒性 標的細胞に対するG3−519免疫複合体の特異性を、抗体
阻害試験によって調べた。図６に示すように、この免疫
複合体と標的細胞をインキュベーションする前に、非複
合G3−519（白抜きバー）を添加したところ、この添加
によって、その免疫複合体と結合する細胞が拮抗し、用
量異存様式で免疫複合体の細胞毒性が効果的に阻害され
た。Ｘ軸の数値は、非複合抗体濃度（μg/ml）を示す。
上記のように、0.6μg/mlのG3−519−PAP−Ｓは、HTLV
−III Bで感染させたH9細胞のチミジン取り込み量を55
％阻害した。50倍過剰量のモノクローナル抗体G3−519
の存在下では、その免疫複合体はチミジンの取り込み量
を13％阻害した。hCG（斜線バー）に無関係のモノクロ
ーナル抗体は、200倍過剰量のこの抗体を添加しても免
疫複合体の細胞毒性を阻害しなかった。
これらの結果は、G3−519−PAP−Ｓが、HTLV−IIIの３
種類の異なった株で感染させたH9細胞を特異的に殺傷す
るので、さまざまな株に対して有効であることを示す。
CD4に対する他の抗体複合体も、さまざまなHIV−１株で
感染させた細胞を殺傷する上で有効なはずである。同等
物 当該分野の技術者には、単なるルーチーンの実験法を用
いて、ここに記載したこの発明の特異的な実験態様およ
び実施例に相当する多くの例を、認識するか、確証し得
るであろう。一連の同等物は、以下の請求の範囲に含ま
れる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｍ Ｃ１２Ｎ 5/10 // Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 9161−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｈ 33/577 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 チャン ナンシー ティー. アメリカ合衆国 テキサス州 77005 ヒ ューストン ロビンフッド 3323 (72)発明者 チャン ツェ―ウェン アメリカ合衆国 テキサス州 77008 ヒ ューストン ロビンフッド 3323 (56)参考文献 国際公開87−7616（ＷＯ，Ａ) 欧州特許出願公開279688（ＥＰ，Ａ) Ｃｅｌｌ，50［６］（1987）Ｐ．975− 985

Claims (5)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】HIV−１のgp120のCD4結合領域中のアミノ
    酸配列IINMWQKVGKAMYAPに結合し、HIV−Ｉの異なる複数
    の株によるＴ細胞の感染を抑制するモノクローナル抗
    体。
  2. 【請求項２】マウス起源の抗体である、請求項１記載の
    モノクローナル抗体。
  3. 【請求項３】Ig Gイソタイプの抗体である、請求項２記
    載のモノクローナル抗体。
  4. 【請求項４】細胞障害剤、抗ウイルス剤、または血液−
    脳関門の通過を容易にする薬剤と結合した請求項１ない
    し３のいずれかに記載のモノクローナル抗体を含む免疫
    複合体。
  5. 【請求項５】抗体生産細胞と骨髄種細胞とを融合するこ
    とにより得られ、請求項１記載のモノクローナル抗体を
    産生するハイブリドーマ。
JP2507112A 1989-04-25 1990-04-25 Ｈｉｖのｃｄ４結合領域に特異的な抗体 Expired - Fee Related JPH0768276B2 (ja)

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