JPH05262662A - Ｈｉｖ重感染防止剤、抗イディオタイプ抗体作製用抗原及び抗イディオタイプ抗体の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 ヒトＣＤ４分子の特定アミノ酸鎖、ヒトＣＤ
４分子の特定アミノ酸鎖と反応するモノクローナル抗体
又はヒトＣＤ４分子の特定アミノ酸鎖よりなるペプチド
と反応する抗体よりなる抗イディオタイプ抗体作製用抗
原より調製する抗イディオタイプ抗体を含み、ヒト細胞
にＨＩＶが感染した後、再度ＨＩＶが感染することを防
止するためのＨＩＶ重感染防止剤、該抗イディオタイプ
抗体作製用抗原並びに該抗イディオタイプ抗体の製造方
法。 【効果】 本発明のＨＩＶ重感染防止剤は、ＨＩＶ持続
感染細胞が再びＨＩＶに感染し、強毒性ウイルス産生細
胞に変化する重感染を有効に防止することができる。ま
た本発明の抗イディオタイプ抗体作製用抗原は、抗イデ
ィオタイプ抗体の抗原として極めて有用であり、更に該
抗イディオタイプ抗体作製用抗原を使用する、本発明の
方法では、容易に抗イディオタイプ抗体を得ることがで
きる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ＨＩＶ(Human Immunod
eficiency Virus)重感染防止剤、抗イディオタイプ抗体
作製用抗原及び抗イディオタイプ抗体の製造法に関し、
更に詳細には、ヒト細胞にＨＩＶが感染した後、再度Ｈ
ＩＶが感染することを防止するための防止剤、該防止剤
に利用する抗イディオタイプ抗体作製用抗原及び抗イデ
ィオタイプ抗体の製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ヒトＣＤ４タンパク質は、後天性免疫不
全症候群（エイズ）の原因ウイルスであるＨＩＶの外被
糖タンパク質（ｇｐ１２０）と特異的に結合し、Ｔリン
パ細胞をＨＩＶ感染に導く受容体として知られている(D
algleish et al.Nature 312,763-767,1984；Klatzmann
et al.Nature 312,767-768,1984；McDougal et al.Sci-
ence 231,382-385,1986；Sodroski et al.Nature 322,4
70-474,1986；Lasky etal.Cell 50,975-985,1987)。

【０００３】一方、ヒトＣＤ４タンパク質は、Ｔリンパ
細胞等の細胞膜上に存在する膜タンパクであり、可溶性
ＣＤ４分子（ＣＤ４分子中の膜外部分のみを発現させた
可溶性分子）が、ＣＤ４と、ｇｐ１２０との結合を拮抗
的に阻害することにより、抗ＨＩＶ活性を示すことが明
らかにされているほか、ヒトＣＤ４ペプチド（６８−１
３０）は、抗ＨＩＶ活性を示し、ｇｐ１２０との特異的
結合領域であろうことが報告されている（Hayashi et a
l.Arch.Virol.,105,129-135,1989)。

【０００４】これらのことから、エイズの予防・治療に
おけるＣＤ４分子を介した感染機構の重要性が認識され
ており、これ迄にもＣＤ４陽性細胞へＨＩＶが最初に感
染することを防止する防止剤が種々提案されている。例
えば、可溶性ＣＤ４、抗ＣＤ４抗体、ＣＤ４ペプチド等
が知られており、更に具体的には例えば、ＣＤ４分子の
部分ペプチド、即ち、ヒトＣＤ４分子のＮ末端から数え
て６６番目から９２番目のアミノ酸鎖よりなるペプチ
ド、ヒトＣＤ４分子のＮ末端から数えて６８番目から１
３０番目のアミノ酸鎖よりなるペプチド等が提案されて
いる（尚、Maddonら(Cell,42,93-104,1985)により報告
されたＣＤ４分子のアミノ酸配列は、Litt-manら(Cell,
55,541,1988)により修正され、アミノ酸番号は、旧報よ
り２残基分減少修正されたので、これに従った）。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】ＨＩＶがヒトに感染す
ると、特にＣＤ４陽性細胞を好んで感染し、感染した細
胞には、細胞障害や、機能異常等が惹起する。ＣＤ４陽
性細胞の多くは、免疫系を司るヘルパーＴ細胞や、マク
ロファージ、抗原提示細胞等であり、ＨＩＶ感染に伴う
これら細胞の機能障害により免疫不全が引き起こされ、
日和見感染症等のいわゆるエイズ症状を発症する。一
方、ＨＩＶに感染した後エイズ発症に至るまでには、通
常、短い急性感染期、平均９．８年の長期間に及ぶ無症
候性キャリア期（以下ＡＣ期と称す）及びエイズ関連症
候群（ＡＲＣ）を認める期間を経る。従って、既にＨＩ
Ｖに感染しているが、エイズ発症に至っていない患者を
救済するためには、ＡＣ期を維持継続させ、エイズ発症
を防止する薬剤の開発が強く求められている。このため
には、エイズ発症を引き起こす要因の解明と、その防止
が重要である。一般に、急性感染期には、細胞障害性が
高く増殖の早いＨＩＶが存在するが、免疫系の活動と共
に、この強毒性ＨＩＶは排除されＡＣ期に移行する。加
えて、ＡＣ期には主に、細胞障害性が低く増殖の遅いＨ
ＩＶの持続感染を認めるが、エイズ発症期になると、再
び細胞傷害性が高く増殖の早い強毒性のＨＩＶが出現す
ることが知られている。従って、この強毒性のＨＩＶ出
現のメカニズムが重要である。Ikuta等は、試験管内に
おいて、これと全く同様な感染機序が存在することを証
明した(Production of infectious particles from def
ect-ive human immunodeficiency virus type 1(HIV-
1)-producing cell clones bysuperinfection with inf
ectious HIV-1 M.Yunoki,K.Maotani-Imai,H.Kusuda,M.M
otoyama,S.Miyake,H.Imai,Y.S.Shin,S.Kato,K.Sano,C.M
orita,M.Nakai,K.Hirai,and K,Iku-ta, Archives of Vi
rology 116,143-158,1991)。即ち、具体的に説明する
と、ＣＤ４陽性細胞株であるＭＴ−４細胞に、野生型Ｈ
ＩＶ(例えばHTLV-IIIB,LAV-1等)を感染させると強い細
胞障害を示して多くの細胞が死滅するが、一部の細胞は
生残し、非感染細胞と略同様な増殖性を示すＨＩＶ持続
感染細胞(MT-4/HIV)となる。これら生残細胞の産生する
ＨＩＶの多くは、ＨＩＶ表現型に変異を認め、クローニ
ングにより、感染性、細胞障害活性の低下又は消失した
不完全なＨＩＶを産生するクローンが多数分離される
（全体の８５％）。これらの現象は、ＡＣ期の臨床症状
を反映しており、ＡＣ期のＨＩＶ存在様式のモデルとし
て考えることができる。この様にして多数出現した、不
完全なＨＩＶを産生するＭＴ−４／ＨＩＶ細胞は、再度
のＨＩＶの重感染によって、細胞障害を受けずに、強い
感染性や細胞障害活性を有するＨＩＶ（野生型ＨＩＶ）
を産生する持続感染細胞に変化する。従って、重感染を
防止することができれば、エイズ発症を防止できること
になり、このような作用を示す薬剤は、エイズ発症防止
剤として期待される。特に、従来提案されているＨＩＶ
防止剤は、最初の感染を防止又は治療することを意図し
ているために、その投与時期を感染者との性行為、多数
感染者への治療行為、注射器の共用等を行った際に投与
する必要があり、しかも、最初の感染においては、多数
のＴ細胞に対して短期間に感染が生じるので、その投与
量も多くする必要があり、更には一度に多量投与しなけ
ればならず、それに伴う副作用の可能性が高くなるとい
う欠点がある。従って、エイズ発症を防止するには、従
来知られているＣＤ４細胞へＨＩＶが最初に感染するこ
とを防止する方法だけでは十分ではなく、前記重感染を
防止する必要があり、この様な重感染防止剤の開発が望
まれている。

【０００６】本発明の別の目的は、ヒト細胞にＨＩＶが
感染した後、重感染することを防止し得る防止剤に利用
可能な抗イディオタイプ抗体の原料と成る抗イディオタ
イプ抗体作製用抗原を提供することにある。

【０００７】本発明の他の目的は、ヒト細胞にＨＩＶが
感染した後、重感染することを防止し得る防止剤に利用
可能な抗イディオタイプ抗体の製造法を提供することに
ある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明によれば、ヒト細
胞にＨＩＶが感染した後、再度ＨＩＶが感染すること
（重感染）を防止するための防止剤であって、該防止剤
が、ヒトＣＤ４分子のＮ末端から数えて６６番目から９
２番目、６８番目から１３０番目、８４番目から１０２
番目若しくは８４番目のＣｙｓをＡｃｍ（アセトアミド
メチル基）又はＢｚｌ（ベンジル基）で修飾した６６番
目から９２番目及び６８番目から１３０番目のアミノ酸
鎖よりなるいずれかのペプチドを含むことを特徴とする
ＨＩＶ重感染防止剤が提供される。

【０００９】また本発明によれば、ヒト細胞にＨＩＶが
感染した後、再度ＨＩＶが感染すること（重感染）を防
止するための防止剤であって、該防止剤が、ヒトＣＤ４
分子のＮ末端から数えて６６番目から９２番目又は６８
番目から１３０番目のアミノ酸鎖よりなるペプチドと反
応し得るモノクローナル抗体を含むことを特徴とするＨ
ＩＶ重感染防止剤が提供される。

【００１０】更に本発明によれば、ヒトＣＤ４分子のＮ
末端から数えて６６番目から９２番目又は６８番目から
１３０番目のアミノ酸鎖よりなるペプチドと反応する抗
体よりなり、且つヒト細胞にＨＩＶが感染した後、再度
ＨＩＶが感染すること（重感染）を防止する作用を有す
る抗イディオタイプ抗体作製用抗原が提供される。

【００１１】更にまた本発明によれば、ヒト細胞にＨＩ
Ｖが感染した後、再度ＨＩＶが感染すること（重感染）
を防止するための防止剤であって、該防止剤が、前記各
々の抗イディオタイプ抗体作製用抗原より調製する、抗
イディオタイプ抗体をそれぞれ含むことを特徴とするＨ
ＩＶ重感染防止剤が提供される。

【００１２】更に本発明によれば、ヒト細胞にＨＩＶが
感染した後、再度ＨＩＶが感染すること（重感染）を防
止する作用を有する抗体の製造法であって、該抗体が、
ヒトＣＤ４分子のＮ末端から数えて６６番目から９２番
目又は６８番目から１３０番目のアミノ酸鎖よりなるペ
プチドと反応する抗体を免疫原として生成することを特
徴とする抗イディオタイプ抗体の製造法が提供される。

【００１３】以下本発明を更に詳細に説明する。

【００１４】本発明のＨＩＶ重感染防止剤は、特定のア
ミノ酸鎖よりなるペプチド、特定のアミノ酸鎖よりなる
ペプチドと反応し得るモノクローナル抗体又は特定のア
ミノ酸鎖よりなるペプチドと反応する抗イディオタイプ
抗体作製用抗原より調製する、抗イディオタイプ抗体を
含み、ヒト細胞、具体的には例えば、特にヒトＣＤ４陽
性細胞等にＨＩＶが感染した後、再度ＨＩＶが感染する
こと（重感染）を防止し、ＡＣ期からエイズ発症を防止
する作用を有する。該ヒト細胞にＨＩＶが感染した細胞
とは、ヒト細胞株に、野生型ＨＩＶを感染させると強い
細胞障害を示すが、この際死滅せずに生残し、非感染細
胞と略同様な増殖性を示すＨＩＶ持続感染細胞である。
該ＨＩＶ持続感染細胞は、感染性、細胞障害活性が低下
又は消失した不完全なＨＩＶを産生するが、再度ＨＩＶ
に感染すること（重感染）によって細胞障害を受けず
に、感染性や細胞障害活性を有する野生型ＨＩＶを産生
する持続感染細胞に変化する細胞である。具体的には例
えばＬ−２細胞、Ｌ−３細胞、Ｈ−７細胞等の存在が確
認されている(Yunoki,et al.,Arch.Viral.116,143-158,
1991)。該Ｌ−２細胞を調製するには、たとえば野生型
ＨＩＶの１種であるＬＡＶ−１（F.Barre Sinoussi,et.
al.,Science,220,868-871,1983)をヒトＣＤ４陽性細胞
の１種であるＭＴ−４細胞に感染させた後、限界希釈法
により、２０％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培
地に希釈し、マイクロプレートに１細胞／穴となるよう
に播き、２〜３週間培養することにより容易に得ること
ができる。該Ｌ−２細胞は、ＬＡＶ−１持続感染クロー
ンの１種であり、ＨＩＶのｇａｇタンパク前駆体ｐ５３
が未成熟のまま開裂せず、成熟ｇａｇタンパクであるｐ
２４、ｐ１７、ｐ９、ｐ７等も検出されず、また逆転写
酵素（ＲＴ）活性も陰性であり、形態的にドーナツ様の
ＨＩＶ不完全粒子を産生する細胞であることが知られて
いる(Goto,et al.,Arch.Viral.111,87-101,1990)。

【００１５】本発明のＨＩＶ重感染防止剤に用いる特定
のアミノ酸鎖よりなるペプチドは、ヒトＣＤ４分子のＮ
末端から数えて(1)６６番目から９２番目、(2)６８番目
から１３０番目、(3)８４番目から１０２番目、(4)８４
番目のＣｙｓをＡｃｍ（アセトアミドメチル基）又は
(5)Ｂｚｌ（ベンジル基）で修飾した６６番目から９２
番目、(6)８４番目のＣｙｓをＡｃｍ又は(7)Ｂｚｌで修
飾した６８番目から１３０番目のアミノ酸鎖よりなるペ
プチドであって、他にも(8)８４番目のCysをPhe又は(9)
Serで置換した66番目から92番目のアミノ酸鎖よりなる
ペプチド等を用いることもできる。これらのアミノ酸配
列は、後述の配列表に示す。

【００１６】本発明において、前記（１）〜（９）で示
されるそれぞれのペプチド及び修飾、置換ペプチドを合
成するには、例えば、第１の方法として、Ｆｍｏｃアミ
ノ酸を使用する固相法（Sheppard,R.C.et al,J.Chem.Co
mm.,165-166,1985)によって得ることができる。即ち、
まず前記（１）〜（９）で表わされるペプチドのＣ末端
に相当するＦｍｏｃアミノ酸ペンタフルオロフェニル(P
fp)エステルを、例えばジメチルホルムアミド中で、４
−ジメチルアミノピリジン等の存在下、ｐ−アルコキシ
ベンジルアルコール樹脂等の高分子担体に結合させ、次
いで結合すべき別のＦｍｏｃアミノ酸Pfpエステルと縮
合反応により、高分子担体に結合させる。この際、スレ
オニンとセリンについては、１−オキソ−２−ヒドロキ
シジヒドロベンゾトリアジン（DHBT）エステルを用いて
導入するのが好ましい。各アミノ酸のカップリング反応
終了後、ペプチドの結合した高分子担体を、ピペリジン
・ジメチルホルムアミド混液等で処理してＮ末端Ｆｍｏ
ｃ基を除去し、次いでｎ−クレゾール存在下、室温に
て、トリフルオロアセテート（ＴＦＡ）チオアニソール
等を作用させて、全ての保護基を除去すると同時に、目
的とする部分ペプチドを高分子担体より回収し、精製す
ることにより得ることができる。この際、アルギニン残
基を含むペプチドは、トリメチルシリルブロミド(TMSB
r)/TFAで処理を行う。

【００１７】また第２の方法としては、ｔ−Ｂｏｃアミ
ノ酸を使用する固相法(Merrifield,J.Am.Chem.Soc.,85,
2149,1963)によって得ることができる。該第２の方法に
おいて、前記（４）〜（７）に表わされる修飾ペプチド
のように、アミノ酸の側鎖を修飾する場合には、脱保護
条件下、安定な修飾アミノ酸をペプチド中に導入するこ
とにより得ることができる。

【００１８】更に前記方法の他に、通常行なわれる、他
の化学合成法、製造するペプチドに対応するＤＮＡを
得、これを適当なベクターに挿入し、動物細胞又は微生
物等で発現させ、目的とする部分ペプチドを得る方法又
は得られたペプチドに適当な化学修飾を加えて調製する
方法等により得ることができる。

【００１９】本発明のＨＩＶ重感染防止剤に用いる特定
のアミノ酸鎖よりなるペプチドと反応し得るモノクロー
ナル抗体は、前記（１）及び（２）に示されるペプチド
を合成し、これを免疫原として動物等に免疫し、その動
物のリンパ球と骨髄腫細胞とを融合させる方法等により
得られるハイブリドーマ株に産生させることができる。
該ハイブリドーマ株であり、ペプチド（６８−１３０）
と反応するクローン株は、ハイブリドーマＣＰ−９（Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１０８６４、ＢＰ−３０１１）として、ま
たペプチド（６６−９２）と反応するクローン株は、ハ
イブリドーマＣＰ−１（ＦＥＲＭ Ｐ−１０８６２、Ｂ
Ｐ−３００９）として寄託されている。

【００２０】更に詳細には、本発明に用いるモノクロー
ナル抗体を製造するには、例えばまず抗原となる前記
（１）及び（２）に示されるペプチドを合成し、得られ
たペプチド又は該ペプチドを適当なキャリアータンパク
質、例えば牛血清アルブミン、ヘモシアニン等に結合さ
せたペプチドを、哺乳動物、例えばマウス又はラット等
に免疫する。この際マウスは５〜１０週令が好ましく、
マウス１匹あたり１回につき０．０１〜１ｍｇ、特に５
０〜２００μｇをアジュバント、具体的には例えばフロ
イントの完全アジュバント、フロイントの不完全アジュ
バント、ミョウバンアジュバントと良く混合して投与す
る。該投与は皮下注射、静脈注射、腹腔内注射等により
行うことができる。その後、１〜３週ごとに数回、具体
的には３〜４回追加免疫して、十分免疫する。この様に
免疫された動物から、最終免疫の２〜４日後に、リンパ
球を採取する。リンパ球調製には脾臓、リンパ節、末梢
血等を用いることができ、該リンパ球を骨髄腫細胞と融
合させる。

【００２１】前記骨髄腫細胞としては、特定酵素の欠損
した細胞、例えばマウスミエローマP3-X63-Ag8-U1(P3-U
1)、P3-X63-Ag8-653(X63-653)、P3-NS1-1Ag4-1(NS-1)、
ラットミエローマ 210-RCY3-Ag123等が好ましい。細胞
融合は、ケラーとミルシュタインの方法（Nature 256,4
95-497,1975)により行うことができる。

【００２２】前記細胞融合の終了後、選択培地、例えば
ＨＡＴ（ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン）
培地等によりハイブリドーマを選択することによって、
ヒトＣＤ４ペプチドに対する抗体を産生するハイブリド
ーマを、酵素免疫測定法により選出し、その後限界希釈
法によるクローニングを１〜３回程度繰り返す方法等に
よりモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞
を得ることができる。この様にして得られるハイブリド
ーマ細胞を、同系の動物の腹腔内に接種し、増殖させた
後腹水を採取することにより、また培養器で培養するこ
とにより、目的のモノクローナル抗体を得ることができ
る。

【００２３】またモノクローナル抗体は、特にヒト型抗
体が必要とされる場合には、インビトロ感作法により得
ることもできる。具体的には、まず正常動物末梢血よ
り、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（ファルマシア社製）等
による比重遠心法、塩化アンモニウムによる赤血球除去
法、フローサイトメトリー法などにより、リンパ球細胞
画分を調製する。次に、得られた細胞画分を培養すると
共に、培養液中に前記（１）及び（２）に示されるペプ
チドを例えば０．００１〜１ｍｇ／ｍｌの濃度で添加
し、画分中のマクロファージに、抗原提示させる。提示
された抗原により共存するヘルパーＴ細胞が活性化し、
抗原の情報をＢ細胞にうけわたし、抗原に感作したＢ細
胞、即ち前記（１）及び（２）に示されるペプチド抗体
を産生するＢ細胞が生成する。次いで該Ｂ細胞をＥＢ
（エプスタイン−バー）ウィルスにて、またはミエロー
マとの細胞融合等により株化し、持続的にポリクローナ
ル抗体を得ることができる。更に、該株化されたＢ細胞
を限界希釈法により、２〜３回クローニングする方法等
によって分離し、モノクローナル抗体を得ることができ
る。

【００２４】本発明のＨＩＶ重感染防止剤に用いる前記
モノクローナル抗体の、ＭＯＬＴ−４、ＭＴ−４等のヒ
トＣＤ４陽性細胞等のヒト細胞の膜に存在するヒトＣＤ
４タンパク質との直接的な反応性は、ウエスタンブロッ
ト法を用いて調べることにより確認できる。例えばＣＤ
４陽性細胞を、２×１０⁷個程度集め、フェニルメチル
スルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）等のプロテアーゼ阻
害剤を含む低張リン酸バッファー中でのホモジナイズ等
により細胞を破壊し、１０００ｒｐｍ、５分間程度の遠
心で未破壊細胞画分を沈殿させた上清を、６５００ｒｐ
ｍ、２０分間程度で遠心し、沈殿として細胞膜を含む粗
核画分を得、次にこの粗核画分をLaemmliらの方法（Nat
ure,227,680,1970)に従うSDS-10%ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動により分離し、更にTowbinらの方法（Proc.N
atl.Acad.Sci.USA,76,4350-4354,1979)に従ってウエス
タンブロッティングを行う。一次抗体として、前述のモ
ノクローナル抗体を用い、ペルオキシダーゼを結合した
２次抗体を用いて発色させると、ＣＤ４分子の分子量５
５０００〜６００００に対応する部分に特異的に発色す
るバンドが見られ、またこのバンドは、市販の抗ＣＤ４
モノクローナル抗体ＯＫＴ４（オルソダイアグノスティ
ックシステムズ社製）を用いても検出できる。従って本
発明のモノクローナル抗体は、細胞由来のヒトＣＤ４分
子等と結合性を示し、且つヒト細胞、特にヒトＣＤ４陽
性細胞等にＨＩＶが感染した後、再度ＨＩＶが感染する
のに必要な、特異的結合領域を認識しているので、ＨＩ
Ｖの重感染を有効に防止することができる。

【００２５】本発明に用いる特定のアミノ酸鎖よりなる
ペプチドと反応する抗イディオタイプ抗体作製用抗原よ
り作製する、抗イディオタイプ抗体は、前記（１）及び
（２）に示されるアミノ酸鎖よりなるペプチドと反応す
る抗体を免疫原として生成することができる。該抗イデ
ィオタイプ抗体を製造するには、例えばまず第１段階と
して、前記（１）及び（２）に示されるアミノ酸鎖より
なるペプチドを合成した後、第２段階として、前記ペプ
チドと反応する抗イディオタイプ抗体作製用抗原、即ち
前記モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を作製
し、該モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を
単独で抗イディオタイプ抗体作製用抗原とするか、好ま
しくはモノクローナル抗体をヘモシアニン等のキャリア
タンパク質と結合させて抗イディオタイプ抗体作製用抗
原とする。該抗イディオタイプ抗体作製用抗原は、必要
に応じて精製することもできる。具体的には、硫安分
画、イオン交換、ゲル濾過、アフィニティクロマトグラ
フィー等の通常のタンパク質に適用される方法を用いて
精製することができる。

【００２６】第３段階として、第２段階で得られる抗イ
ディオタイプ抗体作製用抗原を免疫原として免疫するこ
とにより、目的の抗イディオタイプ抗体を得ることがで
きる。該免疫法は、基本的には、前述したモノクローナ
ル抗体の際の免疫法と同様に、抗イディオタイプ抗体作
製用抗原を、抗体作製動物と同系のものに免疫すれば良
く、この際例えばマウスを用いる場合には、マウス１匹
あたり、０．１〜１ｍｇの抗原を、１〜２週間おきに４
〜５回免疫するのが好ましい。

【００２７】抗イディオタイプ抗体は、ポリクローナル
抗体として使用することもできるが、エピトープが均一
のモノクローナル抗体として用いるのが好ましい。

【００２８】また他の方法としては、ＨＩＶ感染者の末
梢血Ｂリンパ球を用いて、各々のペプチドに対する抗イ
ディオタイプ抗体を調製することができる。即ち、ＨＩ
Ｖ感染者の免疫系において、ＨＩＶ外被タンパク質の大
部分の領域は、抗原決定基として既に認識されている。
一方、前記それぞれのペプチドに対する抗イディオタイ
プ抗体は、ＨＩＶ外被タンパク質に対する抗体の特殊形
であると考えられる。即ち、ＨＩＶ外被タンパク質上
の、ＣＤ４タンパク質との特異的結合領域と反応する、
抗ＨＩＶ外被タンパク質抗体と同様な挙動を示すと考え
られる。従って、ＨＩＶ感染者の末梢血Ｂリンパ球を調
製し、適当な二次抗原、例えば前記抗イディオタイプ抗
体作製用抗原を用いて刺激し抗原感作させることによ
り、抗イディオタイプ抗体に対応する抗体を産生する細
胞のみが、抗原刺激を受けて増殖し、増殖した細胞をＥ
Ｂウィルス等を用いて株化させ、培養することにより抗
イディオタイプ抗体を得ることができる。

【００２９】本発明のＨＩＶ重感染防止剤に用いる抗イ
ディオタイプ抗体のうち、ヒトＣＤ４分子のＮ末端から
数えて６８番目から１３０番目のアミノ酸鎖よりなるペ
プチドと反応する抗体よりなり、且つヒト細胞にＨＩＶ
が感染した後、再度ＨＩＶが感染することを防止する作
用を有する、抗イディオタイプ抗体作製用抗原より作製
する抗イディオタイプ抗体は、ＩＤ−５５（ＦＥＲＭ
Ｐ−１１１５７，ＢＰ−３１６５）として、またヒトＣ
Ｄ４分子のＮ末端から数えて６６番目から９２番目のア
ミノ酸鎖よりなるペプチドと反応する抗体よりなり、且
つヒト細胞にＨＩＶが感染した後、再度ＨＩＶが感染す
ることを防止する作用を有する、抗イディオタイプ抗体
作製用抗原より作製する抗イディオタイプ抗体は、ＩＤ
−６２（ＦＥＲＭ Ｐ−１１１５８，ＢＰ−３１６６）
として寄託されている。

【００３０】本発明のＨＩＶ重感染防止剤は、前記特定
のアミノ酸鎖よりなるペプチド、特定のアミノ酸鎖より
なるペプチドと反応し得るモノクローナル抗体又は特定
のアミノ酸鎖よりなるペプチドと反応する抗イディオタ
イプ抗体作製用抗原より作製する、抗イディオタイプ抗
体を含んでいれば良く、その投与形態は、例えばそのま
ま用いても良いが、細胞毒素と結合させることにより、
感染細胞殺傷剤のターゲティングプローブとして用いる
ことも可能である。

【００３１】本発明のＨＩＶ重感染防止剤は、ＡＣ期か
らエイズ発症前までの所定期間に投与することができ、
その投与量は、これらの期間のＩＶ量が、ＨＩＶ急性感
染期及びエイズ発症期のＨＩＶ量に比して、１／１０〜
１／１００の低濃度であるため、その投与量も従来提案
されているＨＩＶ防止剤に比して、1/10〜1/100の投与
量、即ち前記ペプチドを有効成分とする場合、好ましく
はペプチド量換算で５０〜１５００ｍｇ／日、また前記
モノクローナル抗体または抗イディオタイプ抗体を有効
成分とする場合には、抗体量換算で、５０〜２０００ｍ
ｇ／日であるのが好ましい。しかも重感染防止の場合、
感染期間が最初の感染に比して長期間を要するので、有
効成分を低濃度とし、連続投与することが可能である。
また投与方法は、静脈注射又は筋肉注射等により行うこ
とができる。

【００３２】

【発明の効果】本発明のＨＩＶ重感染防止剤は、ＨＩＶ
持続感染細胞が再びＨＩＶに感染し、強毒性ウイルス産
生細胞に変化する重感染を有効に防止することができ
る。また本発明の抗イディオタイプ抗体作製用抗原は、
重感染を阻害するばかりでなく、ＨＩＶ重感染防止剤の
有効成分と成る抗イディオタイプ抗体の抗原として極め
て有用であり、更に該抗イディオタイプ抗体作製用抗原
を使用する、本発明の方法では、容易に抗イディオタイ
プ抗体を得ることができる。

【００３３】

【実施例】以下本発明を実施例により更に詳細に説明す
るが、本発明はこれらに限定されるものではない。

【００３４】

【実施例１】 (1)ヒトＣＤ４分子のＮ末端から数えて８４番目のＣｙ
ｓがＢｚｌで修飾された６６番目から９２番目のアミノ
酸鎖よりなるペプチドの調製 ペプチドＣ末端のＧｌｕをその誘導体Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ
(OBut)−Ｏｐｆｐ活性エステル１ｍｍｏｌとし、触媒と
してＤＭＡＰ（４−ジメチルアミノピリジン）０．２ｍ
ｍｏｌを用い、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）中、ポ
リアルコキシベンジルアルコール樹脂０．２ｍｍｏｌ
(0.35meq OH/g,ポリスチレン１％ ジビニルベンゼンコ
ポリマー、国産化学株式会社製)上にエステル結合によ
り導入した。

【００３５】使用したＦｍｏｃ−アミノ酸誘導体（ミリ
ジエン社製）の側鎖の保護基は、Asp(OBut)、Glu(OBu
t)、Thr(But)、Ser(But)、Tyr(But)、Lys(Boc)、His(Bo
c)、Arg(Mtr)、Cys(Bzl)であり、ペプチド鎖伸長時の各
縮合反応は、スレオニン、セリンを除き、すべてpfp(ペ
ンタフルオロフェニル)活性エステル体（２．５ｅｑ）
を用い、触媒としてＨＯＢＴ（１−ハイドロキシベンゾ
トリアゾール）０．２ｍｍｏｌの存在下ＤＭＦ中で行っ
た。

【００３６】各々のＦｍｏｃ基の除去は、２０重量％の
ピペリジン・ジメチルホルムアミド混合液を用いた。更
に各々のカップリング反応は、ニンヒドリンでモニター
しながら行った。全てのカップリング反応終了後、Ｎ末
端に残ったＦｍｏｃ基を２０重量％のピペリジン・ジメ
チルホルムアミド混合液によって除去し、ＮＨ₂−基を
フリー状態とし、その後全ての他の保護基の除去と、樹
脂からペプチドを切り出すために、ＴＦＡ−チオアニソ
ールを用いてｍ−クレゾール存在下、室温３時間処理し
た。次いでグラスフィルターにより濾過し、樹脂を除
き、濾液を室温で濃縮した後、エーテルを加えてペプチ
ド粉末を得た。得られたペプチド粉末を収集した後、蟻
酸アンモニウムバッファーに溶解し、商品名「Sephadex
G-25]（ファルマシア社製）によって処理し、０．５Ｎ
酢酸で溶出させ、脱塩、精製を行い、更に高速液体ク
ロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で精製した。

【００３７】ＨＰＬＣによる分取は、０．１重量％ＴＦ
Ａ中のアセトニトリル１０〜６０％の濃度勾配により、
商品名「Nucleosil 100 5c18」（半井化学社製）（4.0
×150mm)カラムを流速１ｍｌ／分で流し、２１０、２６
０ｎｍにおいてモニターした。ヒトＣＤ４分子のＮ末端
から数えて６６番目から９２番目のアミノ酸鎖よりなる
ペプチドは、保持時間１６．８分間で溶出した。分取し
た画分の一部について、アミノ分析機「８３５Ｓ」（日
立製作所株式会社製）によってアミノ酸分析を行ったと
ころ、目的のＣＤ４（６６−９２，Ｃｙｓ−Ｂｚｌ）ペ
プチドであることがわかった。

【００３８】(2)ヒトＣＤ４分子のＮ末端から数えて８
４番目のＣｙｓがＡｃｍで修飾された６８番目から１３
０番目のアミノ酸鎖よりなるペプチドの調製 ペプチドＣ末端のＣｙｓを前記（１）の方法に従って樹
脂に導入した後、前記(1)と同様にしてＦｍｏｃ法に従
って、ヒトＣＤ４分子のＮ末端から数えて８４番目のＣ
ｙｓがＡｃｍで修飾された６８番目から１３０番目のア
ミノ酸鎖よりなるペプチドを調製した。

【００３９】(3)ヒトＣＤ４分子のＮ末端から数えて４
５番目から６０番目のアミノ酸鎖よりなる比較用ペプチ
ドの調製 ペプチドＣ末端のＳｅｒを前記（１）の方法に従って樹
脂に導入した後、前記(1)と同様にしてＦｍｏｃ法に従
って、以下に示すヒトＣＤ４分子のＮ末端から数えて４
５番目から６０番目のアミノ酸鎖よりなるペプチドを調
製し、比較用の陰性コントロールペプチドとした。

【００４０】Thr-Lys-Gly-Pro-Ser-Lys-Leu-Asu-Asp-Ar
g-Ala-Asp-Ser-Arg-Arg-Ser

【００４１】

【実施例２】ヒトＣＤ４分子のＮ末端から数えて６８番目から１３０
番目又は６６番目から９２番目のアミノ酸鎖よりなるペ
プチドと反応し得るモノクローナル抗体の調製 (1) 免疫マウス脾細胞の調製 ５週令のＢＡＬＢ／ｃ雌マウス（日本チャールズリバー
社より入手）に、ヒトＣＤ４ペプチド（６８−１３０）
５００μｇをフロイントの完全アジュバントと共に腹腔
内投与して免疫した。更に２週間後に同ペプチド２００
μｇをＰＢＳに溶解して腹腔内投与して、追加免疫し
た。同様に追加免疫を３回繰返し、３回目の３日後に脾
臓を摘出しＲＰＭＩ−１６４０培地中でほぐし、懸濁、
洗浄し、融合用の脾細胞を調製した。

【００４２】(2) マウス骨髄腫(ミエローマ)細胞の調製 マウスミエローマ細胞Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１を１
０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地で培養し、対数増殖期にあ
る細胞を集め、融合用の親株とした。

【００４３】(3) 細胞融合 (1)と(2)で得られた脾細胞（２×１０⁸個）と、マウス
ミエローマ細胞（２×１０⁷個）とを混合し、遠心分離
して上清を捨ててペレットをよくほぐし、５０％「ポリ
エチレングリコール１５００」（ベーリンガーマンハイ
ム社製）１ｍｌを１〜２分間で徐々に加え細胞融合を行
った。更に、約１０分間かけてＤＭＥＭ培地１０ｍｌを
撹拌しながら摘下し融合を完成させた。これに、ＦＣＳ
１ｍｌを加え融合反応を停止した。

【００４４】遠心分離により上清のポリエチレングリコ
ール溶液を除き、ペレットを１０％ＦＣＳを含むＤＭＥ
Ｍ培地で洗い、遠心分離によって上清を除いた。ペレッ
トをＨＡＴ培地（１００μＭヒポキサンチン、０．４μ
Ｍアミノプテリン、１６μＭチミジン、０．０３％Ｌ−
グルタミン、１５％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地）により
懸濁し、５×１０⁴細胞／穴となるように９６穴培養プ
レートに０．２ｍｌ／穴づつ分注した。炭酸ガス培養器
中、３７℃の条件下で培養し、１日おきにＨＡＴ培地を
０．１ｍｌ／穴づつ新鮮なものと交換した。７〜１０日
間培養、育成し、融合細胞(ハイブリドーマ)コロニーを
得た。

【００４５】〔酵素免疫測定法〕ＥＬＩＳＡ用９６穴ア
ミノプレート（住友ベークライト社製）に、ＰＢＳで溶
解したヒトＣＤ４ペプチド（１μｇ／ｍｌ）を５０μｌ
／穴づつ分注し、室温で１〜４時間放置してプレート穴
底面に吸着させた。０．１５Ｍの塩化ナトリウムを含む
リン酸バッファー（ＰＢＳ，ｐＨ７．４）で３回洗浄し
た後、３％カゼインナトリウムを含むＰＢＳを各穴に満
たし室温で１時間静置し、プレート穴全体をカゼインで
コーティングした。各穴の液を捨てた後、ＰＢＳで洗浄
し、ハイブリドーマ培養上清液を５０μｌ／穴加え、室
温で１〜４時間放置した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を
含むＰＢＳで５回洗浄後、ペルオキシダーゼ結合抗マウ
スＩｇＧ抗体（バイオラッド社製）の４０００倍ＰＢＳ
希釈液を５０μｌ／穴分注し、室温で１〜２時間放置し
た。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで５回洗浄、Ｐ
ＢＳで２回洗浄後、１０ｍＭオルトフェニレンジアミン
−０．０２５％ＢＳＡを含む５０ｍＭ酢酸ナトリウムバ
ッファー（ｐＨ５．０）と０．１％過酸化水素水とを
３：１に混合した発色液を５０μｌ／穴加え、室温で１
５〜３０分放置して反応させた。これに、０．１％亜硫
酸ナトリウム（Ｎａ₂ＳＯ₃）を含む１Ｎ硫酸を１５０μ
ｌ／穴加え反応を停止後、４９２ｎｍの吸光度を測定し
た。求めるハイブリドーマのスクリーニングに際して
は、高い測定値を示す上清液の株を選択した。

【００４６】(4) ハイブリドーマのスクリーニングとク
ローニング 各穴の培養上清液を取り、前述の酵素免疫測定法に供し
た。抗原には、化学合成されたヒトＣＤ４ペプチド（６
８−１３０）及び（６６−９２）を用いた。抗体産生を
示した穴のハイブリドーマは、限界希釈法にてクローニ
ングを行い、抗ヒトＣＤ４ペプチド（６８−１３０）抗
体及び抗ヒトＣＤ４ペプチド（６６−９２）抗体を産生
するクローン株（ＣＰ−９，ＣＰ−１）を得た。

【００４７】(5) モノクローナル抗体の精製 上記(4)で得たハイブリドーマ株を無血清培地ＡＳＦ１
０３（味の素社製）で各々５０ｍｌずつ培養し、細胞濃
度１×１０⁶個／ｍｌとなった培養物を遠心分離し、そ
の上清液をプロテインＡ−アガロース（バイオラッド社
製）又はレンチルレクチン−セファロース（ファルマシ
ア社製）にかけ、前者ではｐＨ４．０のクエン酸緩衝
液、後者では１０％メチル−α−Ｄ−マンノピラノシド
含有ＰＢＳで溶出したのち、ＰＢＳに透析して各目的の
精製モノクローナル抗体を得た。

【００４８】

【実施例３】ヒトＣＤ４分子のＮ末端から数えて８８番目から１３０
番目又は６６番目から９２番目のアミノ酸鎖より成るペ
プチドと反応するモノクローナル抗体を免疫源として用
いた抗イディオタイプ抗体の調製 (1) 免疫 実施例２で得られたヒトＣＤ４ペプチド（６８−１３
０）と反応するモノクローナル抗体＃６３（ハイブリド
ーマＣＰ−９株の産生する抗体）及び同（６６−９２）
と反応するモノクローナル抗体＃３５（ハイブリドーマ
ＣＰ−１株の産生する抗体）の精製ＩｇＧ標品をアルミ
ニウムアジュバントと共に５週令のＢＡＬＢ／ｃ雌マウ
スに腹腔内投与してそれぞれ免疫した。一回当たり１０
０μｇのＩｇＧを２週間おきに４回免疫し、更に２週間
後２００μｇを追加免疫して、３日後に脾臓を摘出し
た。

【００４９】(2) ハイブリドーマの作製 実施例２と同様に、免疫マウス脾細胞、ミエローマ細胞
を調製し、それぞれの細胞融合を行った。

【００５０】(3) ハイブリドーマのスクリーニング及び
クローニング スクリーニングには、実施例２と同様に酵素免疫測定法
を用いた。免疫に用いたモノクローナル抗体＃６３およ
び＃３５のＩｇＧの標品１０ｍｇと１００μｇのペプシ
ン（シグマ社製）を、それぞれ１ｍｌの０．２Ｍ酢酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ４．５）に溶解した。次いで３７
℃で２０時間反応させて限定分解後ｐＨを８に調整し、
セファデックスＧ−１５０（ファルマシア社製）カラム
を用いてゲル濾過し、分子量約１０万の画分にＩｇＧの
限定分解産物Ｆ（ａｂ’）₂を得た。ＥＬＩＳＡプレー
ト（コースター社製）に、ＰＢＳで２μｇ／ｍｌに溶解
した＃３５及び＃６３のＦ（ａｂ’）₂をそれぞれ３７
℃、８０分間吸着し、固相化抗原として用いた。カゼイ
ンによるコーティング後、それぞれのハイブリドーマ培
養上清液を５０μｌ／穴添加し、３７℃、６０分間反応
させ、洗浄後更に、ＰＢＳで４０００倍に希釈したペル
オキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ鎖特異的）抗体
（カッペル社製）を５０μｌ／穴添加し、３７℃、６０
分間反応させた。実施例２と同様に発色後、高い測定値
を示す上清液を産生するハイブリドーマを選択した。こ
のハイブリドーマを限界希釈法によりクローニングし、
前記スクリーニングを行って、各抗イディオタイプ抗体
を産生するクローン株（＃６３を免疫原として調製した
ＩＤ５５及び＃３５を免疫原として調製したＩＤ−６
２）を得た。これらの産生する抗イディオタイプ抗体
は、実施例２と同様に精製した。

【００５１】

【製造例】Ｌ−２細胞の調製 ＬＡＶ−１ ウイルス(F.Barre Sinoussi,et al.,Scienc
e,220,868-871,1983)は、ＬＡＶ−１に持続感染したＭ
ＯＬＴ−４細胞を、新鮮な１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ
−１６４０培地にて、５×１０⁵細胞／ｍｌとなるよう
懸濁し、ＣＯ₂インキュベーター中、３７℃、３日間培
養し、該培養液中に含まれるＬＡＶ−１ウイルス粒子
を、１００ｇ×５分間の遠心上清液として回収し、ＬＡ
Ｖ−１ウイルス原液として、−８５℃に保存した。該Ｌ
ＡＶ−１ウイルス原液は、ＭＴ−４細胞を用いて感染価
を決定した。即ち、該ウイルス原液をＲＰＭＩ−１６４
０培地にて１×１０〜１×１０⁸倍に希釈し、希釈液１
００μｌを、２０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培
地にて１×１０⁶細胞／ｍｌに懸濁したＭＴ−４細胞液
を１００μｌ／穴分注した９６穴マイクロプレートに、
重層し混合した。培養４日後のＭＴ−４細胞へのＬＡＶ
−１感染を、蛍光抗体法により検出するためスライドガ
ラスに塗沫し、冷アセトン（−２０℃）で５分間固定し
た。該標本は１次抗体としてＨＩＶのｐ１８タンパク質
を特異的に認識するマウスモノクローナル抗体液（Ｖ１
７）(Ikuta,et al.,Virol.170,408-417,1989)を室温で
１５分間反応させ、ＰＢＳで洗浄後、２次抗体としてＰ
ＢＳで４０倍に希釈したフルオレセインイソチオシアネ
ート（ＦＩＴＣ）を結合した抗マウスＩｇＧ抗体（カッ
ペル社製）を室温で１５分間反応させ、ＰＢＳで洗浄し
た。蛍光顕微鏡でＦＩＴＣに特異的な蛍光が検出される
ＬＡＶ−１ウイルス液の希釈倍の最終値から感染価を決
定した。詳しくは該最終希釈倍の１０倍を、１ｍｌあた
りの感染価、即ちＴＣＩＤ₅₀／ｍｌ(Tissue Culture In
fectious Dose 50)とした。

【００５２】１０％ＦＳＣを含むＲＰＭＩ−１６４０培
地で培養した対数増殖期にあるＭＴ−４細胞を遠心によ
り集め、新鮮な２０％ＦＳＣを含むＲＰＭＩ−１６４０
培地にて、１×１０⁶細胞／ｍｌとなるように懸濁し
た。該ＭＴ−４細胞液１ｍｌに、ＴＣＩＤ₅₀／ｍｌ＝１
０⁶となるようＲＰＭＩ−１６４０培地で希釈したＬＡ
Ｖ−１ウイルス液を１ｍｌ加え、３７℃で１時間インキ
ュベート後、遠心により該ＭＴ−４細胞をＲＰＭＩ−１
６４０培地にて２回洗浄した。この際１個のＭＴ−４細
胞に対し、１個のＬＡＶ−１ウイルスが感染する計算と
なり、即ち、該ＬＡＶ−１感染時におけるＭ．Ｏ．Ｉ．
（感染の多重度）は１であった。以後第１法としては、
直ちに２０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地にて
限界希釈法によりクローニングし、９６穴マイクロプレ
ートに、１細胞／０．２ｍｌ／穴となるよう分注して、
ＣＯ₂インキュベーター中で２週間培養した。

【００５３】また第２法としては、洗浄した該細胞を、
１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地で１×１０
⁶細胞／ｍｌとなるように懸濁し、ＣＯ₂インキュベータ
ー中で培養した。培養開始から３〜７日間は、ＬＡＶ−
１の感染に伴う強い細胞障害が観察され、多数の細胞が
死滅したが、以後はＬＡＶ−１に持続感染した細胞が、
非感染細胞と略同様に対数的増殖を開始した。この際、
新鮮な同培地にて１日おきに１×１０⁶細胞／ｍｌとな
るよう培地交換した。その後該細胞を２０％ＦＣＳを含
むＲＰＭＩ−１６４０培地にて限界希釈法によりクロー
ニングし、９６穴マイクロプレートに１細胞／０．２ｍ
ｌ／穴となるよう分注して、ＣＯ₂インキュベーター中
で２週間培養した。

【００５４】マイクロプレート中で増殖した、ＬＡＶ−
１に持続感染したＭＴ−４細胞のクローン細胞を大量培
養し、ＨＩＶのコア（ｇａｇ）及び外被（ｅｎｖ）タン
パクの発現、感染性、逆転写酵素（ＲＴ）活性の表現型
について検索した結果、様々な表現型に対する変異を認
めた。例えばｇａｇタンパクが前駆体タンパクｐ５３の
まま開裂を受けていないもの、ｅｎｖタンパクが、前駆
体タンパクｇｐ１６０のまま開裂を受けていないもの、
ＲＴ活性を示さないもの及びこれらの複合したものが得
られ、結果として感染性を示さないものが全体の８５％
であった。これらの中にはｇａｇタンパクの前駆体タン
パクｐ５３の開裂陰性、ＲＴ活性陰性を示す表現型で特
徴づけられる細胞（以下Ｌ−２細胞と称す）が存在し
た。即ちＬ−２細胞は、前記の蛍光抗体法において、成
熟ｇａｇタンパクｐ１８と反応し、前駆体ｇａｇタンパ
クｐ５３とは反応しない抗ｐ１８マウスモノクローナル
抗体（Ｖ１７）と反応せず、またＲＴ活性を［³²Ｐ］ｄ
ＴＴＰ(NEN Du Pont社製)，ｏｌｉｇｏ ｄＴ，ｐｏｌｙ
ｒＡ(ファルマシア−ＬＫＢ社製)を含む反応液を用い
て、産生される［³²Ｐ］ｐｏｌｙ Ｔ ＤＮＡをＤＥＡＥ
紙（商品名「ＤＥ８１」、ワットマン社製）に固定し
て、該ＤＥＡＥ紙上の放射能を、Ｘ線フィルム（コダッ
ク社製）を用いたオートラジオグラフィーにより検出し
た結果陰性であった。

【００５５】重感染の成立と、その防止効果を調べるた
めの宿主細胞には、前述のＬ−２細胞のような、表現型
の変異が明確で、且つ測定が容易であるものが都合が良
いが、Ｌ−２細胞に限定されるものではない。即ち重感
染の成立は、このような変異が正常に回復したか否かに
より判定することができ、従って該Ｌ−２細胞において
は、Ｖ１７抗体を用いた蛍光抗体法が陽性或いはＲＴ活
性が陽性となれば重感染が成立したことになる。

【００５６】

【試験例】

(1)Ｌ−２細胞に対するＨＴＬＶ−IIIＢの重感染 Ｌ−２細胞を、２０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ−１６４０
培地で１×１０⁶細胞／ｍｌに懸濁し、９６穴マイクロ
プレートに５０μｌ／ｍｌづつ添加した。これに、Ｍ.
Ｏ.Ｉ.(感染の多重度)＝3.2、0.032に相当するＨＴＬＶ
−IIIＢウイルス(Popovic,et al.,Science,224,497-50
0,1984)液を５０μｌ／穴重層して感染させ、４日おき
に培養上清液及び培養細胞を採取し、各々ＲＴ活性、ｐ
１８抗原の発現の有無を検索し、重感染の指標とした。
ｐ１８抗原の発現の有無を図１に示す。

【００５７】(2)各種ＣＤ４試薬による重感染の阻害 実施例１で調製したＣＤ４ペプチド及び同様な方法で調
製したＣＤ４ペプチド［４５−６０、６６−９２、６６
−９２（Cys-Bzl）６６−９２（Cys-Acm）、８４−１０
２、６８−１３０、６８−１３０（Cys-Acm）、６８−
１３０（Cys-Bzl）］をＲＰＭＩ−１６４０培地にて、
終濃度を１ｍｇ／ｍｌとなるよう溶解し、Ｍ.Ｏ.Ｉ.＝
３．２に相当するＨＴＬＶ−IIIＢ液と混合し、室温で
３０分間反応後、上記（１）と同様にＬ−２細胞に接種
した。また、マウス抗ＣＤ４モノクローナル抗体［ＯＫ
Ｔ４（オルソダイアグノスティックシステムズ社製）］
及び実施例２で調製したＣＤ４（６８−１３０）及び
（６６−９２）に対するマウスモノクローナル抗体［＃
３５（ハイブリドーマＣＰ−１株の産生するもの）、＃
６３（ハイブリドーマＣＰ−９株の産生するもの）］、
抗イディオタイプ抗体ＩＤ５５（＃６３を免疫源として
調製したもの）及び抗イディオタイプ抗体ＩＤ６２（＃
３５を免疫源として調製したもの）を２０％ＰＢＳを含
むＲＰＭＩ−１６４０培地にて、終濃度５μｇ／ｍｌ
（ＯＫＴ４）及び２００μｇ／ｍｌ（＃３５、＃６３、
ＩＤ５５、ＩＤ６２）となるよう希釈した後、上記
（１）と同様にＬ−２細胞と、室温、３０分間処理後、
Ｍ.Ｏ.Ｉ.＝０．０３２に相当するウイルス液を接種
（ＯＫＴ４、＃３５、＃６３）するか、またはＭ.Ｏ.
Ｉ.＝０．０３２に相当するウイルス液を混合し、室温
で３０分間処理後、Ｌ−２細胞に接種（ＩＤ５５、ＩＤ
６２）した。１日後、これらの細胞を新たな培地で洗浄
し、４日おきに上記（１）と同様に重感染成立の有無を
検討した。その結果、Ｍ.Ｏ.Ｉ.＝３．２の場合を図２
に、Ｍ.Ｏ.Ｉ.＝０．０３２の場合を図３に示す。

【００５８】(3)結果 （ａ）Ｌ−２細胞に対するＨＴＬＶ−IIIＢの重感染 Ｌ−２細胞に対し、Ｍ.Ｏ.Ｉ.＝３．２，０．０３２に
相当するＨＴＬＶ−IIIＢで感染し、培養を継続する
と、培養８日目頃からＶ１７抗ｐ１８モノクローナル抗
体に対する反応性が認められるようになった（図１）。
また、オートラジオグラフィーにより検出したＲＴ活性
測定では、Ｖ１７抗ｐ１８モノクローナル抗体に対する
反応性とほぼ同時に培養上清中にもＲＴ活性が検出され
るようになり、重感染が成立した。重感染の際には、Ｈ
ＴＬＶ−IIIＢのＭＴ−４細胞への感染時に観察される
ような細胞傷害性は全く認められずに、感染性を有する
野性型ＨＩＶ粒子を産生するようになった。重感染の速
度は、図１に示されるようにＭ.Ｏ.Ｉ.＝３．２におい
ても、８０％以上陽性を示すまでに約１６日が必要とさ
れた。同じウイルス液を、ＭＴ−４細胞に接種した場
合、４日以内に８０％以上陽性に達するので、重感染の
伝播には長時間を要することがわかった。

【００５９】（ｂ）重感染に対するＣＤ４ペプチドの有
効性 重感染は、ＣＤ４ペプチド（６８−１３０、Cys-Ac
m），（６６−９２、Cys-Bzl）を、終濃度１ｍｇ／ｍｌ
で添加したとき完全に阻害された（図２）。ところが、
このような阻害効果は、同濃度のＣＤ４ペプチド（４５
−６０）では、全く認められなかった。即ち、重感染の
阻害は、ＣＤ４ペプチド（６６−９２）、（６６−９
２）Cys-Bzl、（６６−９２）Cys-Acm、（８４−１０
２）、（６８−１３０）、（６８−１３０）Cys-Acm及
び（６８−１３０）Cys-Bzl領域に極めて特異的な機能
であった。図２は、Ｖ１７抗体を用いた蛍光抗体法によ
る結果を示したが、ＲＴ活性においても全く同様な結果
が得られた。

【００６０】（ｃ）重感染に対するＣＤ４ペプチドに対
するモノクローナル抗体及び抗イディオタイプ抗体の有
効性 一方、抗ＣＤ４モノクローナル抗体のうち、ＨＩＶの感
染阻害効果を示さないＯＫＴ４については、重感染の阻
害も認められなかった（図３）。加えて、ＣＤ４ペプチ
ドに対するモノクローナル抗体＃３５及び＃６３は、終
濃度２００μｇ／ｍｌで重感染を遅延させ抑制した（図
３）。更に抗イディオタイプ抗体ＩＤ５５及びＩＤ６２
は、終濃度２００μｇ／ｍｌで重感染を完全に阻害した
（図３）。

【００６１】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：２７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Asn Phe Pro Leu Ile Ile Lys Asn Leu Lys Ile Glu Asp Ser Asp Thr 66 70 75 80 Tyr Ile Cys Glu Val Glu Asp Gln Lys Glu Glu 85 90 配列番号：２ 配列の長さ：６３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Pro Leu Ile Ile Lys Asn Leu Lys Ile Glu Asp Ser Asp Thr Tyr Ile 68 70 75 80 Cys Glu Val Glu Asp Gln Lys Glu Glu Val Gln Leu Leu Val Phe Gly 85 90 95 Leu Thr Ala Asn Ser Asp Thr His Leu Leu Gln Gly Gln Ser Leu Thr 100 105 110 115 Leu Thr Leu Glu Ser Pro Pro Gly Ser Ser Pro Ser Val Gln Cys 120 125 130 配列番号：３ 配列の長さ：１９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Cys Glu Val Glu Asp Gln Lys Glu Glu Val Gln Leu Leu Val Phe Gly 84 85 90 95 Leu Thr Ala 100 配列番号：４ 配列の長さ：２７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Asn Phe Pro Leu Ile Ile Lys Asn Leu Lys Ile Glu Asp Ser Asp Thr 66 70 75 80 Tyr Ile Cys(Acm) Glu Val Glu Asp Gln Lys Glu Glu 85 90 配列番号：５ 配列の長さ：２７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Asn Phe Pro Leu Ile Ile Lys Asn Leu Lys Ile Glu Asp Ser Asp Thr 66 70 75 80 Tyr Ile Cys(Bzl) Glu Val Glu Asp Gln Lys Glu Glu 85 90 配列番号：６ 配列の長さ：６３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Pro Leu Ile Ile Lys Asn Leu Lys Ile Glu Asp Ser Asp Thr Tyr Ile 68 70 75 80 Cys(Acm) Glu Val Glu Asp Gln Lys Glu Glu Val Gln Leu Leu Val Phe 85 90 95 Gly Leu Thr Ala Asn Ser Asp Thr His Leu Leu Gln Gly Gln Ser Leu 100 105 110 Thr Leu Thr Leu Glu Ser Pro Pro Gly Ser Ser Pro Ser Val Gln Cys 115 120 125 130 配列番号：７ 配列の長さ：６３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Pro Leu Ile Ile Lys Asn Leu Lys Ile Glu Asp Ser Asp Thr Tyr Ile 68 70 75 80 Cys(Acm) Glu Val Glu Asp Gln Lys Glu Glu Val Gln Leu Leu Val Phe 85 90 95 Gly Leu Thr Ala Asn Ser Asp Thr His Leu Leu Gln Gly Gln Ser Leu 100 105 110 Thr Leu Thr Leu Glu Ser Pro Pro Gly Ser Ser Pro Ser Val Gln Cys 115 120 125 130 配列番号：８ 配列の長さ：２７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Asn Phe Pro Leu Ile Ile Lys Asn Leu Lys Ile Glu Asp Ser Asp Thr 66 70 75 80 Tyr Ile Phe Glu Val Glu Asp Gln Lys Glu Glu 85 90 配列番号：９ 配列の長さ：２７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Asn Phe Pro Leu Ile Ile Lys Asn Leu Lys Ile Glu Asp Ser Asp Thr 66 70 75 80 Tyr Ile Ser Glu Val Glu Asp Gln Lys Glu Glu 85 90

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明における試験例において、ｐ１８抗原の
発現の有無による重感染の発生を示すチャートである。

【図２】本発明における試験例において、各防止剤の有
効成分が重感染を阻害したか否かをＶ１７抗体を用いた
蛍光抗体法により測定した結果を示すチャートである。

【図３】本発明における試験例において、各防止剤の有
効成分が重感染を阻害したか否かをＶ１７抗体を用いた
蛍光抗体法により測定した結果を示すチャートである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｓ 8413−4Ｃ Ｃ０７Ｋ 7/08 8318−4Ｈ // Ｃ０７Ｋ 7/10 ＺＮＡ 8318−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 15/06 Ｃ１２Ｐ 21/08 8214−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ０７Ｋ 99:00

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒト細胞にＨＩＶが感染した後、再度Ｈ
   ＩＶが感染することを防止するための防止剤であって、
   該防止剤が、ヒトＣＤ４分子のＮ末端から数えて６６番
   目から９２番目のアミノ酸鎖よりなるペプチドを含むこ
   とを特徴とするＨＩＶ重感染防止剤。
2. 【請求項２】 ヒト細胞にＨＩＶが感染した後、再度Ｈ
   ＩＶが感染することを防止するための防止剤であって、
   該防止剤が、ヒトＣＤ４分子のＮ末端から数えて６８番
   目から１３０番目のアミノ酸鎖よりなるペプチドを含む
   ことを特徴とするＨＩＶ重感染防止剤。
3. 【請求項３】 ヒト細胞にＨＩＶが感染した後、再度Ｈ
   ＩＶが感染することを防止するための防止剤であって、
   該防止剤が、ヒトＣＤ４分子のＮ末端から数えて８４番
   目から１０２番目のアミノ酸鎖よりなるペプチドを含む
   ことを特徴とするＨＩＶ重感染防止剤。
4. 【請求項４】 ヒト細胞にＨＩＶが感染した後、再度Ｈ
   ＩＶが感染することを防止するための防止剤であって、
   該防止剤が、ヒトＣＤ４分子のＮ末端から数えて８４番
   目のＣｙｓをＡｃｍ（アセトアミドメチル基）で修飾し
   た６６番目から９２番目のアミノ酸鎖よりなるペプチド
   を含むことを特徴とするＨＩＶ重感染防止剤。
5. 【請求項５】 ヒト細胞にＨＩＶが感染した後、再度Ｈ
   ＩＶが感染することを防止するための防止剤であって、
   該防止剤が、ヒトＣＤ４分子のＮ末端から数えて８４番
   目のＣｙｓをＢｚｌ（ベンジル基）で修飾した６６番目
   から９２番目のアミノ酸鎖よりなるペプチドを含むこと
   を特徴とするＨＩＶ重感染防止剤。
6. 【請求項６】 ヒト細胞にＨＩＶが感染した後、再度Ｈ
   ＩＶが感染することを防止するための防止剤であって、
   該防止剤が、ヒトＣＤ４分子のＮ末端から数えて８４番
   目のＣｙｓをＡｃｍ（アセトアミドメチル基）で修飾し
   た６８番目から１３０番目のアミノ酸鎖よりなるペプチ
   ドを含むことを特徴とするＨＩＶ重感染防止剤。
7. 【請求項７】 ヒト細胞にＨＩＶが感染した後、再度Ｈ
   ＩＶが感染することを防止するための防止剤であって、
   該防止剤が、ヒトＣＤ４分子のＮ末端から数えて８４番
   目のＣｙｓをＢｚｌ（ベンジル基）で修飾した６８番目
   から１３０番目のアミノ酸鎖よりなるペプチドを含むこ
   とを特徴とするＨＩＶ重感染防止剤。
8. 【請求項８】 ヒト細胞にＨＩＶが感染した後、再度Ｈ
   ＩＶが感染することを防止するための防止剤であって、
   該防止剤が、ヒトＣＤ４分子のＮ末端から数えて６６番
   目から９２番目のアミノ酸鎖よりなるペプチドと反応し
   得るモノクローナル抗体を含むことを特徴とするＨＩＶ
   重感染防止剤。
9. 【請求項９】 ヒト細胞にＨＩＶが感染した後、再度Ｈ
   ＩＶが感染することを防止するための防止剤であって、
   該防止剤が、ヒトＣＤ４分子のＮ末端から数えて６８番
   目から１３０番目のアミノ酸鎖よりなるペプチドと反応
   し得るモノクローナル抗体を含むことを特徴とするＨＩ
   Ｖ重感染防止剤。
10. 【請求項１０】 ヒトＣＤ４分子のＮ末端から数えて６
    ６番目から９２番目のアミノ酸鎖よりなるペプチドと反
    応する抗体よりなり、且つヒト細胞にＨＩＶが感染した
    後、再度ＨＩＶが感染することを防止する作用を有する
    抗イディオタイプ抗体作製用抗原。
11. 【請求項１１】 ヒト細胞にＨＩＶが感染した後、再度
    ＨＩＶが感染することを防止するための防止剤であっ
    て、該防止剤が、請求項１０記載の抗イディオタイプ抗
    体作製用抗原より作製する、抗イディオタイプ抗体を含
    むことを特徴とするＨＩＶ重感染防止剤。
12. 【請求項１２】 ヒト細胞にＨＩＶが感染した後、再度
    ＨＩＶが感染することを防止する作用を有する抗体の製
    造法であって、該抗体が、ヒトＣＤ４分子のＮ末端から
    数えて６６番目から９２番目のアミノ酸鎖よりなるペプ
    チドと反応する抗体を免疫原として生成することを特徴
    とする抗イディオタイプ抗体の製造法。
13. 【請求項１３】 ヒトＣＤ４分子のＮ末端から数えて６
    ８番目から１３０番目のアミノ酸鎖よりなるペプチドと
    反応する抗体よりなり、且つヒト細胞にＨＩＶが感染し
    た後、再度ＨＩＶが感染することを防止する作用を有す
    る抗イディオタイプ抗体作製用抗原。
14. 【請求項１４】 ヒト細胞にＨＩＶが感染した後、再度
    ＨＩＶが感染することを防止するための防止剤であっ
    て、該防止剤が、請求項１３記載の抗イディオタイプ抗
    体作製用抗原より作製する、抗イディオタイプ抗体を含
    むことを特徴とするＨＩＶ重感染防止剤。
15. 【請求項１５】 ヒト細胞にＨＩＶが感染した後、再度
    ＨＩＶが感染することを防止する作用を有する抗体の製
    造法であって、該抗体が、ヒトＣＤ４分子のＮ末端から
    数えて６８番目から１３０番目のアミノ酸鎖よりなるペ
    プチドと反応する抗体を免疫原として生成することを特
    徴とする抗イディオタイプ抗体の製造法。