PT90657B - Processo para a preparacao de peptidos que bloqueiam a ligacao de hiv-1 a proteina cd4 receptora - Google Patents

Description

Descrição referente â patente de in venção de ORTHO PHARMACEUTICAL CORPORATION, norte-americana, industri al e comercial, estabelecida em U.

S. Route 202, Raritan, New Jersey, Estados Unidos da América e de Cali fornia Institute of Technology, ins tituto norte-americano, com domicílio em 1201 E. Califórnia Street, Pasadena, Califórnia 91125, Estados Unidos da América, (inventores: Patricia E. Rao, Bradford A. Jameson e Stephen B.H. Kent, residentes nos E.U.A.), para PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE PÊPTIDOS QUE BLOQUEIAM A LIGAÇÃO DO HIV—1 A PROTEÍNA CD4 RECEPTORA .

DESCRIÇÃO

Fundamento da Invenção

Esta invenção refere-se a novos peptldos que têm a capacidade de bloquear a ligação do virus da imuno deficiência humana (HIV) ao receptor CD4 de uma célula T4. A pre sente invenção refere-se também a métodos para a utilização destes pêptidos para o tratamento de pacientes infectados com HIV, como ainda a anticorpos específicos para os pêptidos, a vacinas contendo esses anticorpos e a kits diagnósticos contendo os pêptidos.

O HIV é o agente etiológico daquilo que ê comummente designado por síndroma da imunodeficiência ad1 quirida (SIDA). O HIV é um retrovírus RNA que tem sido designado por vários nomes durante os últimos anos, tais como virus T-linfotropico III humano (HTLV-III); virus linfodenopático associado (LAV); ou retrovírus SIDA associado (ARV). Actualmente o HIV designa-se como HIV-1 para o diferenciar de um virus relacionado designado por HIV-2 (ou LAV-2). No âmbito desta descoberta a designação HIV-1 presentemente aceite usar-se-ã para designar o agente virai que provoca a SIDA.

A infecção cora HIV-1 conduz a uma imunossupressão grave no paciente infectado causada pela deplecção dos linfócitos T auxiliar/indutores que exprimem o receptor do virus. Este receptor designa-se habitualmente por proteína receja tora CD4 (ou T4). Uma vez que a função primária do sistema imuno lógico é proteger o corpo contra os micróbios invasores, essa imunossupressão conduz a um defeito no mecanismo de defesa do hospedeiro que o torna altamente susceptível às infecções e neoplasmas oportunistas. As infecções provocadas pelo HIV-1 têm sido fatais na maioria dos casos relatados. Por isso, tem-se investido um largo esforço pela comunidade médica na procura de um agente que se possa utilizar para parar ou impedir o alastramento da infecção do HIV-1. Para uma revisão actualizada do HIV-1, vejam-se os seguintes artigos: Anthony S. Fauci, The Human Iramu nodeficiency Virus: Infectivity and Mechanisms of Pathogenesis, Science 239:617-622 (February 5, 1988); e Robert C. Gallo, The AIDS Virus, Scientific American, pp. 47-56 (January 1987).

Como mencionado acima, a causa primária da imunossupressão resultante da infecção com HIV-1 ê a deplecção do subconjunto auxiliar/indutor dos linfócitos T, que ex primem o marcador fenotípico CD4 (a célula T4). 0 linfócito T4 é uma célula crítica envolvida directamente ou indirectamente na indução de uma larga gama de funções imunológicas do sistema imuno lógico. Por isso, um defeito funcional das células T4 conduz a uma diminuição de muitas respostas imunológicas diferentes num paciente infectado com HIV-1. A molécula de CD4 ê uma das várias proteínas de superfície dos linfócitos T não polimórficas que têm estado implicadas na medição das interacções eficientes célu la T - célula alvo. Os linfócitos T maduros dividem-se em duas aattt

classes: os que exprimem a glicoprotelna de superfície T4 e os que exprimem a glicoprotelna T8. As moléculas T4 são predominantemente expressas em linfocitos T auxiliares, enquanto que as T8 são expressas em células T citotõxicas e supressoras. Os linfõci tos T T4⁺ interactuam com células alvo que exprimem a maioria dos produtos genéticos da classe II dos dos complexos de histocompatibilidade (MHC), enquanto que as células T T8⁺ interactuam com alvos que exprimem as moléculas MHC da classe I. As interacções dos linfocitos T auxiliares estão largamente restringidas às células alvo portadoras de antigenes que exprimem proteínas MHC da classe II, enquanto que as células T citotõxicas e supresj soras estão restritas a alvos portadores de moléculas MHC da classe I. Assim, a molécula de CD4 pode actuar como um receptor geral para reconhecer moléculas à superfície das células alvo e ainda como um receptor do HIV-1.

A CD4 é uma grande glicoprotelna de su perflcie com uma sequência parcial homóloga à das imunoglobulinas, tendo esta molécula sido isolada e caracterizada. A molécula de CO4 tem um peso molecular de cerca de 55 kilodalton e a mo lêcula processada tem um total de 435 unidades de aminoácido. A molécula de CD4 é constituída por um péptido de sinal, uma região extracelular de 374 aminoácidos contendo 4 zonas idênticas à imunoglobulina, uma região transmembrana e uma região transmem brana carregada com 40 unidades de aminoácido. Veja, por exemplo, P.J. Maddon, The Isolation and Nucleotide Sequence of a cDNA En coding the T-cell Surface Protein T4: A New Member of the Immuno globulin Gene Family, Cell £2:93-104 (Agosto, 1985).

A capacidade do HIV-1 para infectar se lectivamente, se replicar e destruir as células T4 explica em parte a perda da função auxiliar/indutora T4 caracterlstica do SIDA. Vãrios investigadores sugeriram que a molécula de CD4 ê o receptor celular do HIV-1 depois de terem verificado que os anti corpos específicos para CD4 podiam bloquear a infecção por HIV-1 e a formação de sincitia; Dalgleish, A. et al., The CD4 (T4) An tigen Is An Essential Component for the Receptor for the AIDS Re trovirus, Nature 312:763-766 (1985); Klatzmann, D. et al., Selective Tropism of Lymphadenopathy Virus (LAV) for Helper-Indu3

cer T-Lymphocytes, Science 225:59-63 (1984); e McDougal, J. et al., Cellular Tropism of the Human Retrovirus HTLV-III/LAV. I. Role of T Cell Activation and Expression of the T4 Antigen, J. Immunol. 135:3151-3162 (1985). Estas observações foram confirmadas pela detecção do CD4 se ligar a gpl20, a maior glicoproteína envolvente do HIV-1 (McDougal, J. et al., Binding of ETLV-III/ /LAV to T4⁺ T cells By a Cctaplex of the 110K Virai Protein and the T4 Molecule, Science 231:382-385 (1986)) e pela descoberta de que as células humanas não permissivas se tomam susceptíveis a infecção por HTV-1 após expressão estável de um DNA complementar ao CD4 (Maddon, P. et al., The T4 Gene Encodes the AIDS ViÍrus Receptor ans Its Expressed In the Immune System and the Brair

Cell 47:333-348 (1986)).

Um importante mecanismo de morte da cê lula na infecção por HIV-1 envolvendo a proteína envolvente CD4 ê a fusão celular. O elevado nível de expressão do gene da glico proteína envolvente do HIV-1 nas células.T4 infectadas, como demonstrado pelo aparecimento de partículas virais na membrana plasmãtica, leva ã fusão celular com as células T4 vizinhas não infectadas e conduz â formação de células gigantes multinucleadas conhecidas por sincitia, que abrangem tanto as células infec tadas como as não infectadas. Conforme o virus em causa, a citõlise e a morte das células fundidas ocorre normalmente dentro de 48 horas.

Vários investigadores têm referido que a infecção por HIV-1 pode ser bloquada por uma forma solúvel da molécula de CD4. Vejam-se, por exemplo, os artigos recentes seguintes: Smith, D.H., et al., Blocking of the HIV-1 Infectivi ty by a Soluble, Secreted Form of the CD4 Antigen, Science 238: 1704-1007 (dezembro, 18, 1987); Deen, K.C. et al., A Soluble Form of CD4 (T4) Protein Inhibits AIDS Virus Infection, Nature 331:82-84 (Janeiro, 7, 1988); Fisher, R.A. et al., HIV Infection is Blocked in vitro by Recombinant Soluble CD4, Nature 331: 76-78 (Janeiro 7, 1988)? Hussey, R.E., A Soluble CD4 Protein Se lectively Innibits HIV Replication and Syncytium Formation, Nature 331:78-81 (Janeiro 7, 1988); e Traunecker, A. et al., Solu ble CD4 Molecules Neutralize Human Immunodeficiency Virus Type

I, Nature 331:84-86 (January Ί, 1988). Cada um destes artigos descreve o uso de versões parciais da molécula total de CD4, pro duzidas por técnicas de DNA recombinantes, para inibir a infecção por HIV-1. A molécula truncada descrita tinha o peso molecular de cerca de 50 kilodalton e incluia o segmento extracelular do CD4 (isto é, a porção de 374 aminoácidos sem as regiões da transmembrana e citoplãsmica).

As chamadas formas solúveis do CD4 descritas nos artigos acima referidos são grandes moléculas de proteína gue se podem preparar por técnicas de DNA recombinante de modo a obterem-se quantidades suficientes para uso terapêutico. Isto é uma desvantagem porque tais métodos são dispendiosos e morosos. Uma outra desvantagem é que essas moléculas grandes podem ter problemas de solubilidade e imunogenicidade quando usa das em terapia humana. A presente invenção supera estas desvanta gens fornecendo péptidos relativamente pequenos que se ligam ao HIV-1 que se podem facilmente sintetizar quimicamente sem recorrer a técnicas de DNA recombinante. Os péptidos de acordo com a presente invenção podem bloquear a ligação do HIV-1 ao receptor CD4 em células T4. Os presentes péptidos constituem essencialmen te falsos alvos para onde diverge o HIV-1 impedindo assim a infecção das células T4.

Resumo da invenção

A presente invenção refere-se a péptidos isolados e essencialmente puros, contendo a seguinte sequência de aminoácidos (escrita na ordem de leitura padrão, do termi nal azotado ao terminal carboxílico):

Cys-Thr-Ala-Ser-Gln-Lys-Lys-Ser-Ile-Gln-Phe-His-TrpLys-Asn-Ser-Asn-Gln-Ile-Lys-Ile-Leu-Gly-Asn-Gln-GlyS er-Phe-Leu-Thr-Lyε-Gly-Pro-Ser

Esta sequência de aminoácidos corresponde a uma sequência de aminoácidos da proteína receptora CD4 que se liga à proteína envolvente gpl20 do HIV-1. Esta sequência será designada daqui em diante como péptido 18-51, que correspon de ã sequência de aminoácidos na molécula de CD4 tal como deduzi da por Maddon et al. (Cell 42:93-104, (1985)).

Além disso, a presente invenção refere -se a péptidos isolados e essencialmente puros contendo a seguin te sequência de aminoácidos:

Cys-Arg-Ser-Pro-Arg-Gly-Lys-Asn-Ile-Gln-GlyGly-Lys-Thr-Leu-Ser-Val-Ser-Gln-Leu-Glu-LeuGln-Asp-Ser-Gly-Thr-Trρ-Thr-Cys

Esta sequência designar-se-ã daqui em diante por péptido 132-161 que corresponde também à sequência de Maddon. Neste contexto, a palavra péptidos ou a expressão péjo tidos da presente invenção referir-se-ão a qualquer péptido que compreenda a totalidade ou uma parte da sequência de aminoácidos dos péptidos 18-51 ou 132-161.

Dm traço no principio ou no fim de um aminoácido nas sequências anteriores indica uma ligação peptidica ao aminoácido vizinho na sequência. As substâncias análogas com capacidade de ligação ao HIV, fragmentos, derivados químicos e sais farmaceuticamente aceitáveis destas sequências encontram-se abrangidas no âmbito da presente invenção. Os péptidos contendo qualquer destas sequências são capazes de se ligar à proteína envolvente gpl20 do virus HTV-1 neutralizando desse modo o vinis. Assim, os péptidos da presente invenção podem usar-se num método de tratamento de pacientes suspeitos de terem sido in fectados pelo virus HTV-1, administrando a esses pacientes um dos presentes péptidos numa quantidade efectiva para neutralizar o HTV-1. Admite-se ainda a possibilidade de usar os presentes péptidos como agente imunossupressor geral num hospedeiro, bloqueando a ligação ao receptor CD4, uma vez que o receptor CD4 po de participar noutras reacções imunológicas no hospedeito não re lacionadas com o HTV-1.

Dm dos péptidos da presente invenção é o péptido com a seguinte sequência de aminoácidos:

NHj-Trp-Lys-Asn-Ser-Asn-Gln-Ile-Lys-Ile-Leu-Gly-AsnGln-Gly—Ser-Phe-Leu-COOH

Esta sequência peptídica corresponde aos aminoácidos 30-46 na proteina CD4 e referir-se-â daqui em diante por péptido 30-46.

Um outro péptido da presente invenção ê o péptido com a seguinte sequência de aminoácidos:

NE^-Cys-Thr-Ala-Ser-Gln-Lys-Lys-Ser-Ile-Gln-Phe-HisTrp-Lys-Asn-Ser-Asn-Gln-Ile-Lys-Ile-Leu-Gly-COOH

Esta sequência peptidica corresponde aos aminoácidos 18-40 na proteína CD4 e referir-se-á daqui em diante por péptido 18-40.

Estão também incluidos no âmbito da presente invenção anticorpos específicos para os pêptidos, compo sições farmacêuticas contendo os pêptidos, vacinas contendo os anticorpos específicos para os pêptidos, anticorpos anti-idiotípicos contendo imagens internas dos pêptidos, e kits diagnôstJL cos contendo os pêptidos ou anticorpos anti-idiotípicos.

Breve descrição das figuras

A Figura 1 mostra o quadro dos pêptidos sintéticos derivados de CD4 descritos no Exemplo 1. A linha grossa no meio deste diagrama é uma representação esquemática dos primeiros 218 aminoácidos da região extracelular da proteína CD4, mostrando-se as posições das primeiras duas pontes di-sulfu •reto da proteína, tal como determinado por Classon et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83:4499 (1986). As linhas curtas no topo desta figura indicam a família de pêptidos derivados de CD4 que foram sintetizados para este estudo. Todos os pêptidos se sintetizaram num sintetizador peptídico automático 430A da firma Applied Biosystems, de acordo com os processos de Kent e Clark-Lewis (Synthetic Peptldes in Biology and Medicine, K. Alitalo et al., eds., Elsevier, New York, 1985, pag. 29-58), usando uma resina de parametilbenzidrilamina (U.S. Biochemicals). Na parte inferior desta figura mostra-se um resumo dos resultados obtidos com os anticorpos monoclonais específicos para CD4. A ordem do mapa linear dos anticorpos monoclonais OKT4C (C), OKT4A TA), OKT4D (D), OKT4E (Ε), OKT4 (B), MT 151 e OKT4F (F) mostra-se abaixo da proteína CD4. As linhas cheias que ligam os vários anticorpos monoclonais indicam os anticorpos que revelaram compor- 7 -

tamentos de interferência de ligação recíprocos nos testes de competição cruzada.

A Figura 2 mostra os resultados dos testes radio-imunolõgicos em fase sólida dos péptidos sintéticos com os anticorpos monoclonais específicos para CD4 0KT4A, OKT4C e 0KT4F. Os dados aqui apresentados são a média dos resultados de testes em triplicado (desvio médio indicado por barras; cpm de fundo subtraído). Absorveram-se 20 micrograma de péptido no fundo de placas de microtitulação de 96 orifícios. Após lavagem (solução salina tritamponizada com soro bovino a 0,1%), bloquearam-se as placas com gelatina de pele de porco a 0,1% (Sigma) an tes da adição do anticorpo monoclonal (20 micrograma/ml), de acordo com o processo de Emini et al. (Nature 304 : 699 (1983)), exceptuando o facto de se ter medido a ligação dos anticorpos mo 125~ noclonais com anticorpo de cabra anti-rato marcado com I (INC Biochemicals).

A Figura 3 mostra os resultados das competições do anticorpo monoclonal especifico para o CD4 com o péptido 132-161. Para este ensaio usaram-se os seguintes anticor pos monoclonais específicos para o CD4 : OKT4A (A), OKT4 (Φ), OKT4F (), OK4B (O) e MT151 (0). O eixo dos yy mostra a percenta gem de anticorpo ligado a várias concentrações do péptido 132-161. Efectuou-se o teste usando 8x10³ células/orifleio de modo dependente da concentração.

A Figura 4 mostra os resultados de tes tes de competição entre anticorpos monoclonais marcados com FITC,,

Descrição detalhada da invenção

A presente invenção baseia-se na identificação das posições de ligação ao HIV-1 na proteína CD4 e na determinação das sequências de aminoácidos das regiões da proteí na CD4 às quais se liga o HIV-1. Admite-se que existem duas posi ções de ligação na molécula de CD4, uma posição de ligação de ca da lado de uma invaginação. O conhecimento destas sequências de aminoácidos permitiu a síntese dos péptidos da presente invenção, que têm a capacidade de se ligarem ao HTV-1, bloqueando assim a ligação do HTV-1 à proteína CD4. Como é evidente, estes péptidos podem usar-se na prevenção da infecção pelo HIV-1 ou na terapia de indivíduos jã infectados pelo HIV-1. Estes péptidos podem têm bém bloquear a ligação de outros virus relacionados com ο ΗΓ7 (tais como o HIV-2) desde que esses virus tenham proteínas envol ventes semelhantes à gpl20. Os presentes péptidos são relativamente curtos podendo por isso sintetizar-se facilmente por via química. Tais péptidos sintéticos podem apresentar vantagens em relação ao uso da proteína CD4 completa ou de leirgas porções da proteína CD4, como tem sido descrito na literatura. Por exemplo, as largas porções da proteína CD4 não se podem preparar convenientemente por via sintética, tendo de obter-se por meio de técni cas de DNA recombinantes, que são dispendiosas e demoradas. Além disso, as proteínas CD4 grandes podem apresentêtr problemas de so lubilidade e de imunogenicidade quando aplicadas a um paciente. Os péptidos sintéticos curtos são muito mais solúveis e menos imunogénicos do que as proteínas maiores.

No presente contexto, péptido refere -se a uma série linear de não mais do que cerca de 50 unidades de aminoácido ligadas umas ãs outras por ligações peptldicas entre os grupos alfa-êunino e os grupos carboxilo de aminoácidos ad jacentes. Taunbém neste contexto, proteína refere-se a uma série linear de mais do que 50 unidades de aminoácido ligadas entre si como num péptido. O termo péptido sintético significa uma cadeia de unidades de aminoácido, obtido quimicamente, ligadas entre si por ligações peptldicas, isenta de proteínas naturalmente ocorrentes ou de fragmentos destas.

Os símbolos de 3 letras usados para re presentar as unidades de euninoacido nos péptidos da presente invenção são os símbolos usualmente empregues nesta especialidade. Os aminoácidos encontram-se de preferência na forma lsomérlca L. Contudo, aminoácidos na forma isamérica D podem substituir os aminoácidos-L, desde que se mantenha inalterada no pépti do a desejada propriedeule funcional de ligação ao HIV-1. NH^ é um grupo amino livre e COOH ê um grupo carboxilo livre. Os slmbo los de 3 letras aqui usados referem-se aos seguintes aminoácidos Cys ê cistelna; Ser é serina; Ile ê isoleucina; Gin ê glutamina; Phe ê fenilaleuiina; His ê histidina; Trp ê triptofano; Lys é li-

sina; Asn é asparagina; Leu ê leucina; Gly ê glicina; Thr é treo nina; Asp é ácido aspártico; Arg é arginina; Vai é valina e Ala ê alanina.

Os péptidos da presente invenção inclu em qualquer espécie análoga, fragmento ou derivado químico do péptido 18-51 ou do péptido 132-161, capaz de se ligar â posição de ligação gpl20 do HIV-1. 0 termo espécie análoga refere-se a qualquer péptido que tenha uma sequência de aminoácidos substancialmente idêntica à dos péptidos 18-51 ou 132-161, na qual um ou mais aminoácidos tenham sido substituídos por aminoácidos • quimicamente semelhantes. Por exemplo, um aminoácido polar, tal j corno glicina ou serina, pode ser substituído por outro aminoãcido polar; ou um aminoácido acídico, tal como ácido aspártico, po de ser substituído por outro aminoácido acídico, tal como ácido glutâmico; ou um aminoácido básico, tal como lisina, arginina ou histidina, pode ser substituído por outro aminoácido básico, ou um aminoácido não polar, tal como alanina, leucina ou isoleucina pode ser substituído por outro aminoácido não polar.

i ! O termo especie analoga deve também abranger qualquer péptido que tenha um ou mais aminoácidos a menos ou a mais em relação aos péptidos 18-51 ou 132-161, mas que imantenha ainda uma substancial homologia na sequência de amino|ãcidos em relação a estes péptidos. Uma homologia de sequência substancial ê uma homologia superior a 50%. O termo fragmento refere-se a qualquer versão mais curta dos péptidos aqui identificados, que tenha pelo menos cinco unidades de aminoácidos, sen do o fragmento capaz de se ligar â proteína envolvente gpl20 do HIV-1 e de bloquear a ligação do HIV-1 ao receptor CD4.

O termo derivado químico refere-se a qualquer péptido derivado do péptído 18-51 ou do péptido 132-161, no qual um ou mais aminoácidos tenham sido derivatizados química mente por reacção dos grupos laterais funcionais dos aminoácidos presentes no péptido. Deste modo, um derivado químico é um pép tido derivado das sequências ou péptidos aqui identificados, por um ou mais passos químicos. Tais moléculas derivatizadas incluem, por exemplo, moléculas nas quais se tenham derivatizado grupos amino livres para formar cloridratos de amina, grupos p-tolueno10 sulfonilo, grupos carbobenzoxi, grupos ter-butlloxlcarbonllo, de rivados do tipo tiouretano, grupos trifluoroacetilo, grupos cloroacetilo ou grupos formilo. Os grupos carboxilo livres podem de rivatizar-se para formar sais, ésteres metllicos e etílicos ou outros tipos de ésteres ou hidrazidas. Os grupos hidroxilo livres podem derivatizar-se para formar derivados O-acilo ou O-alquilo. 0 azoto do anel de imidazole da histidina pode derivatizar-se pa ra formar N-benzilhistina (N de imidazole). Também se consideram derivados químicos os péptidos que contenham um ou mais derivados naturais dos vinte aminoácidos padrão. Por exemplo: 4-hidroxiprolina pode substituir a prolina; 5-hidroxilisina pode substi. ítuir a lisina; 3-metilhistidina pode substituir a histidina; homoserina pode substituir a serina e a ornitina pode substituir a lisina.

Os péptidos da presente invenção podem preparar-se por meio de qualquer das técnicas conhecidas seguintes. Os péptidos podem preparar-se convenientemente usando a téc nica da síntese em fase sólida inicialmente descrita por Merrifield, em J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2154 (1963). Outras técnicas de síntese peptldiva podem encontrar-se por exemplo em M. Bo jdanszky et al., Peptide Synthesis, John Wiley & Sons, 2d Ed., (1976), bem cotio em outros trabalhos conhecidos do especialista. Pode encontrar-se um resumo de técnicas de síntese peptldica em J. Stuart e J.D. Young, Solld Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Company, Rockford, IL (1984). Pode também fazer-se síntese de péptidos recorrendo a métodos em solução, como descrito a

em The Proteins, Vol. II, 3- Ed., Neurath, H. e al., Eds., pag. 105-237, Acaderaic Press, New York, NY (1976). Os grupos protecto res apropriados para uso nas sínteses referidas encontram-se nos textos acima indicados bem como em J.F.W. McOmie, Protective Groups in Organic Chemistry, Plenum Press, New York NY (1973). Ê claro que os péptidos da presente invenção também se podem prepa rar por meio de técnicas de DNA recombinantes, embora tais métodos não sejam preferenciais.

Em geral, estes métodos de síntese cot preendem a adição sequencial de um ou mais aminoácidos ou aminoãcidos adequadamente protegidos a uma cadeia peptldica em cresci.

Jl

mento. Normalmente, quer o grupo amino quer o grupo carboxilo do primeiro aminoácido encontra-se protegido por um grupo protector adequado removível selectivamente. Utiliza-se um grupo protector diferente removível selectivamente no caso de aminoácidos que contenham um grupo lateral reactivo, tal como a lisina.

Usando a sintese em fase sólida como exemplo, liga-se o aminoácido protegido ou derivatizado a um suporte sólido inerte através do seu grupo carboxilo ou amino não protegido. O grupo protector do grupo amino ou carboxilo remove-se então selectivamente a adiciona-se o aminoácido seguinte na sequência com o grupo complementar (amino ou carboxilo) adequada mente protegido, fazendo-se reagir nas condições adequadas para a formação da ligação amida com o aminoácido já ligado ao suporte sólido. 0 grupo protector do grupo amino ou carboxilo remove-se então do ultimo aminoácido introduzido, adicionando-se depois o aminoácido seguinte (adequadamente protegido) e assim sucessivamente. Depois de se terem ligado todos os aminoácidos pre tendidos na sequência apropriada, removera-se sequencial ou concurrenteraente os grupos protectores dos grupos terminais ou late rais ainda presentes (e o suporte sólido), de modo a obter-se o péptido final.

Os péptidos da presente invenção contêm geralmente pelo menos cinco unidades de aminoácido e até cin quenta unidades de aminoácido, de preferência 3 a 35 unidades de aminoácido. Estes péptidos podem ligar-se a uma sequência adicio nal de aminoácidos por um ou por ambos os extremos azotado ou carboxílico, tendo as sequências adicionais o comprimento de 1 a 100 aminoácidos. Tais sequências adicionais de aminoácidos, ou sequências de lincagem, podem ligar-se por conveniência a um mar cador detectável, a uma matriz sólida ou a um suporte. Os marcadores, matrizes sólidas e suportes que se podem usar com os péptidos da presente invenção encontram-se descritos abaixo. Os ami noácidos tipicamente usados para a lincagem são a tirosina, cistelna, lisina, ácido glutâmico e ácido aspártico ou semelhantes.

Os pequenos péptidos da presente inven ção são geralmente mais antigênicos do que imunogênicos. Isto e, os péptidos podem ligar-se por um anticorpo a eles especifico

- 12 (antigênico) mas não podem induzir a produção de anticorpos num hospedeiro (imunogénico). Podem usar-se técnicas padrão bem conhecidas do especialista para tornar os presentes pêptidos imuno gênicos se necessário (isto é, se não forem imunogénicos no hospedeiro tal como sintetizados). Um destes métodos consiste em li gar o péptido a um suporte antigênico na forma de um conjugado e injectar depois o conjugado numa quantidade efectiva como inoculo imunogénico a um hospedeiro.

Qualquer péptido da presente invenção se pode usar na forma de um sal farmacêuticamente aceitável. Os ácidos adequados para formarem sais com os pêptidos da presente invenção incluem ácidos inorgânicos tais como ãcido clorídrico, ácido bromídrico, ãcido perclórico, ãcido nítrico, ãcido tiociânico, ãcido sulfurico, ãcido fosfórico e semelhantes e ácidos ofc gânicos tais como ãcido fórmico, ãcido acético, ãcido propiónico, ãcido glicólico, ãcido láctico, ãcido pirúvico, ãcido oxãlico, ãcido malônico, ãcido succinico, ãcido maleico, ãcido fumãrico, ãcido antranílico, ãcido cinâmico, ãcido naftalenosulfónico, ãci do sulfanílico ou semelhantes.

As bases adequadas para formarem sais com os pêptidos da presente invenção incluem bases inorgânicas tais como hidróxido de sódio, hidróxido de amónio, hidróxido de potássio e semelhantes e bases orgânicas tais como nono-, di- e trialquil- e aril-aminas (por exemplo trietilamina, diisopropilamina, metilamina, dimetilamina e semelhantes) e etanolaminas eventualmente substituídas (por exemplo, etanolamina, dietanolamina e semelhantes).

Para fins de uso num método de tratamento da infecção pelo HIV-1, os pêptidos da presente invenção podem estar presentes numa composição farmacêutica numa quantida de efectiva para a ligação ao HIV-1, misturados com um veículo farmacêuticamente aceitável. A composição farmacêutica pode preparar-se de acordo com técnicas de formulação farmacêutica convencionais. 0 veículo pode tomar uma larga variedade de formas do tipo de preparação desejado para administração, por exemplo sublingual, rectal, nasal, oral ou parental. As composições para formas de dosagem oral podem conter qualquer dos meios farmacêu- 13

ticos usuais, tais como, por exemplo, água, óleos, álcoois, aromas, conservantes, corantes e anãlogos, no caso de preparações líquidas orais (por exemplo suspensões, elixires e soluções), ou veículos tais como amidas, açucares, diluentes, granulantes, lubrificantes, ligantes, desintegrantes e anãlogos, no caso de pre parações sólidas orais (por exemplo pós, cápsulas e comprimidos). Também se podem usar formas de libertação controlada. Devido â sua facilidade de administração, os comprimidos e as capsulas re presentam a forma unitária de dosagem oral mais vantajosa, empre gando-se obviamente nesse caso veículos farmacêuticos sólidos.

Se se desejar, os comprimidos podem revestir-se com açucares ou substâncias entéricas, por meio de técnicas padrão.

Para composições a administrar por via parenteral, o veículo compreende usualmente água esterilizada, embora se possam incluir outros ingredientes para ajudar a solubilidade ou por motivos de preservação. Podem também preparar-se suspensões injectâveis podendo empregar-se nesse caso veículos líquidos apropriados, agentes de suspensão e anãlogos. As vias de administração parenteral podem ser injecção intravenosa, injecção intramuscular ou injecção subcutânea.

As composições farmacêuticas da presen te invenção podem usar-se num método de tratamento de um paciente suspeito de ter sido infectado com HIV-1. 0 método consiste na administração ao paciente de uma quantidade da composição far macêutica efectiva para neutralizar o HIV-1. Após a administração, os peptidos contidos na composição ligar-se-ão â gpl20 do HIV-1 e impedem o HIV-1 de se ligar ao receptor CD4. Esta interrupção do processo de ligação impedirá a célula T4 de ser infectada pelo HIV-1 impedindo assim a habitual imunossupressão obser vada nos doentes infectados pelo HIV-1.

A presente invenção refere-se também a anticorpos que sejam específicos para os peptidos desta invenção. Admite-se que tais anticorpos impedirão também a ligação do HIV-1 ao receptor CD4 da célula T4. Esses anticorpos ligar-se-ão ao local receptor na proteína CD4 inibindo assim competitivamente a ligação do HIV-1 a essa mesma posição. Esses anticorpos podem ser policlonais ou monoclonais, contudo prefere-se que se14

jam monoclonais.

Os anticorpos policlonais podem preparar-se de acordo com métodos bem conhecidos da especialidade, tais como os descritos em Benedict, A.A. et al., Production of Antiverum, Methods in Iramunology ]. : 197-306 (1967). Prefere-se o uso de anticorpos monoclonais no presente método porque eles são específicos para um único epitopo e por isso originam resultados mais reprodutíveis. Os métodos de preparação de anticorpos monoclonais são bem conhecidos da especialidade, tal como o conhecido método de Kohler e Milstein. Este método bem como as res pectivas variantes pode obter-se na referência Yelton, D.E. et al., Ann. Rev. of Biochem (1981) 50: 657-80.

A presente invenção refere-se também a um anticorpo anti-idiotípico que contém uma imagem Interna de um péptido da presente invenção e que é por isso capaz de se ligar à proteína envolvente gpl20 do HIV-1. Tal anticorpo anti-idiotípico pode usar-se em qualquer formato terapêutico ou diagnóstico em que se pretenda a formação de um produto de imunoreacção contendo HIV-1.

Como suporte a este assunto faz-se uma breve descrição dos anticorpos anti-idiotípicos. 0 sistema imuno lógico de ura indivíduo ê capaz de produzir milhões de diferentes tipos de anticorpos. Cada anticorpo pode, por sua vez, ser o alvo de outros anticorpos que reconheçam as suas características moleculares únicas. Através dessas reacções anticorpo-anticorpo o sistema imunQlõgico interactua consigo próprio. Estas interacções são conhecidas como reacções idiotipo-anti-idiotipo. Em tais reacções, um anticorpo inicial (Ab-1) isolado de um soro animal e injectado depois num outro animal induz a formação de um segundo anticorpo (Ab-2). O Ab-2 ê específico para o Ab-1 e liga-se a ele e diz-se que reconhece a individualidade do Ab-1. Os determinantes antigénicos característicos do Ab-1 designam-se por idiotipos. O Ab-2 produzido em resposta ao idiotipo designa-se por anticorpo anti-idiotípico. Deste modo, um anticorpo anti -idiotípico pode definir-se como um anticorpo que ê capaz de rea gir com um Ab-1 gerado por um simples antigene. Para uma mais completa informação bãsica sobre anticorpos anti-idiotípicos, ’2ra.

veja-se Kennedy, R.C. et al., Anti-Idiotypes and Immununity, Scientific American, pags. 48-56 (Julho, 1986).

Os idiótopos são determinantes antigénicos (epitopos) expressos por uma molécula de anticorpo. Os idiótopos de imagem interna são determinantes antigénicos expres; sos por uma molécula de anticorpo que sejam imunologicamente semelhantes ou idênticos aos determinantes antigénicos encontrados num antigene estranho ou externo ao sistema imunológico. A teoria operacional que explica a semelhança imunolôgica de um idiotipo de imagem interna e do seu determinante antigénico externo correspondente é que o idiótipo de imagem interna é um homólogo conformacional do determinante antigénico externo. Devido a serem conformacionalmente homólogos, um idiotipo de imagem interna e o seu determinante antigénico externo correspondente são imuno logicamente reactivos cruzados, isto é, um anticorpo induzido por um reagirá imunologicamente com o outro. Por isso, um anticorpo que exprima um idiotipo de imagem interna correspondente a um péptido da presente invenção (um determinante antigénico externo) pode ser substituido por esse péptido no bloqueamento da posição de ligação no virus de HTV-1.

A produção de um anticorpo que expresse uma imagem interna correspondente a um determinante antigénico num agente infeccioso necessita de um templato imunogénico que possa induzir o anticorpo contendo a imagem interna. Os templatos para a produção de anticorpos de imagem interna são moléculas imunogênicas contendo pelo menos uma porção da sua conformação que seja complementar a ou imagem no espelho do determinan te antigénico em causa. Em agentes infecciosos, as moléculas con tendo templatos usadas neste método para induzir anticorpos de imagem interna são proteínas que se ligam ao agente infeccioso em causa. Tais proteínas incluem moléculas de anticorpo cujas po sições de combinação de anticorpo reagem imunologicamente com o agente infeccioso em causa, bem como proteínas receptoras de ser viço celular que se ligam ao agente infeccioso. Em ambos os casos, a parte critica da proteína de ligação ê aquela porção da sua estrutura que interactua com o agente infeccioso pous ê apenas essa porção que pode actuar como templato. Deste modo, os an

ij ticorpos da presente invenção específicos para os péptidos da ι' ί presente invenção podem ser usados como imunogenes para induzir um anticorpo anti-idiotípico, isto é, um anticorpo que reaja imu nologicamente com ura idiótopo. O anticorpo anti-idiotípico conte j rã o idiótopo capaz de bloquear a posição de ligação CD4 do HTV-1.

Prefere-se que o anticorpo anti-idiotí pico seja dirigido contra um anticorpo monoclonal. A preparação ide um anticorpo anti-idiotípico contra um local de combinação de anticorpo monoclonal é bem conhecida na especialidade. Veja-se por exemplo Staudt et al., J. Exp. Med., 157:687-704 (1983); e ίRegan et al., J. Virol. 48:660-666(1983). Em resumo, para produ!' ;zir uma composição de anti-corpo anti-idiotípico de acordo com a invenção, inocula-se um mamífero de laboratório com uma quantida de imunologicamente efectiva de um péptido da presente invenção, |í como se encontra tipicamente presente numa vacina de acordo com

I ~ ; a presente invenção. As moléculas de anticorpo homólogas ao ant£

-péptido assim induzidas recolhem-se então do mamífero e isolam-se, na quantidade desejada, as que são imunoespecificas tanto ίpara o paratopo do péptido como para a posição de ligação na j gpl20, por meio de técnicas bem conhecidas tais como, por exemplo, cromatografia de imunoafinidade.

j As composições de anticorpos anti-idio típicos monoclonais são também objectivo da presente invenção.

ί Uma composição de anticorpo anti-idiotípico monoclonal contém, dentro dos limites de detecção, apenas uma espécie de posição de ! combinação de anticorpos capaz de efectivamente ligar imunologicamente um paratopo homólogo de um péptido e o HIV-1. Deste modo, uma composição de anticorpo anti-idiotípico monoclonal, de acordo com a presente invenção, constitui tipicamente uma única afinidade de ligação para o péptido.

Verificou-se que os anticorpos da presente invenção podem bloquear a posição de ligação no receptor CD4 de modo que o virus HIV-1 não pode Infectar a célula T4. Por isso, estes anticorpos podem usar-se numa vacina para proteger um paciente contra o HIV-1. Além disso, tal vacina levará o paci

- ente a produzir anticorpos anti-idiotípicos em resposta ao anti- 17

corpo inicial conferindo assim ao paciente imunidade activa contra o virus HIV-1, uma vez que o anticorpo anti-idiotlpico se li garã ao HIV-1 e bloqueará a sua posição de ligação. Deste modo, uma vacina de acordo com a presente invenção compreende uma quan tidade imunizante efectiva de um anticorpo da presente invenção e um veiculo farmaceuticamente aceitável. É preferivel que o anticorpo usado na vacina seja um anticorpo monoclonal. Preferem-se os anticorpos monoclonais humanizados pois são menos imuno génicos do que, por exemplo, os monoclonais murinos.

A molécula de anticorpo pode ser linca da operativamente a um veículo imunogênico. Neste contexto, o termo lincado operativamente significa que o anticorpo e a pro telna de suporte (veiculo) estão fisicamente associados por um agente de lincagem que não afecta a capacidade de qualquer dos grupos ligados funcionar da forma descrita. Dado que os veículos imunogénicos são, eles próprios, tipicamente proteínas, as têcni cas de conjugação ou de acoplamento de proteínas através de grupos funcionais activados são particularmente aplicáveis. Para re visão destas técnicas, veja-se Aurameas et al., Scand. J. Immunol., Vol. 8, Supp. 1, pag. 7-23 (1978). Vejam-se também as patentes U.S. N9s 4,493,795 e 4,671,958. Os veículos imunogénicos úteis são bem conhecidos na especialidade e são geralmente proteínas grandes. Exemplos de tais veículos são keyhole limpet he mocyanin (KLH); edestina, tiroglobulina; albuminas, tais como albumina de soro bovino (BSA) ou albumina de soro humano (HSA); glóblulos vermelhos, tais como eritrócitos de carneiro (SRBC); tetanus toxoid; cholera toxoid; e poliaminoãcidos, tais como poli (d-lisina: ácido d-glutâmico) e semelhantes.

A vacina pode também conter um imunopo tenciador, que ê uma entidade molecular que estimula a maturação a diferenciação e a função dos linfócitos B e/ou T. Os imunopotenciadores são bem conhecidos na especialidade é incluem polipéptidos estimulantes das células T como os descritos na patente

U.S. N9. 4,426,324 e os nucleótidos de guanina substituídos em C8 descritos por Goodman et al., J. Immunol., 135:3284-3288 (1985) e na patente U.S. N9 4,643,992. As expressões adquado pa ra uso humano e farmaceuticamente aceitável referem-se a enti

dades moleculares e a composiçoes que nao produzam uma reacção alérgica ou semelhante quando administradas a seres humanos.

A preparação de uma vacina que contenha uma molécula de anticorpo como ingrediente activo ê bem conhecida na especialidade. Tipicamente, estas vacinas preparam-se como injecções, quer como soluções liquidas quer como suspensões; podem também preparar-se formas sólidas adequadas para solução ou suspensão num líquido antes da injecção. A preparação pode ser também em emulsão.

ingrediente imunogenico activo pode dissolver-se, dispersar-se ou misturar-se num excipiente que seja farmacêuticamente aceitável e compatível com o ingrediente a£ tivo, tal como é bem conhecido. Os excipientes adequados são, por exemplo, água, saliva, saliva tamponizada com fosfato (PBS), dextrose, glicerina, etanol ou semelhantes e suas combinações. Além disso, se se quiser, a vacina pode conter pequenas quantida des de substâncias auxiliares, tais como agente humectantes ou emulsionantes, tampões de pli ou adjuvantes que aumentem a eficácia da vacina.

As vacinas podem administrar-se conven cionalmente por via parenteral, quer por injecção intravenosa, subcutânea ou intramuscular. Outras formulações adequadas para outros modos de administração incluem supositórios e, em alguns casos, formulações orais. IJo caso dos supositórios os ligantes e veículos tradicionais incluem, por exemplo, polialquilenoglicois ou triglicéridos. As formulações orais incluem os excipientes normalmente utilizados como, por exemplo, manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sõdica, celulose, carbonato de magnésio e semelhantes, farmacêuticamente puros. As composições podem tomar a forna de soluções, suspensões, comprimidos, pílulas, cápsulas, formulações de libertação controlada ou pôs.

anticorpo anti-peptldico pode formular-se numa vacina na forna neutra ou de sal. Os sais farmacêuticamente aceitáveis incluem os indicados acima.

As vacinas podem administrar-se de um modo compatível com a formulação de dosagem, e numa quantidade tal que sejam terapeuticamente efectivas e imunogénicas. A quan19 tidade a administrar depende do paciente a tratar, da capacidade do sistema imunolõgico do paciente para sintetizar os anticorpos e do grau de protecção desejado. As quantidades precisas de ingrediente activo a administrar dependem do julgamento do clínico e são específicas para cada indivíduo.

A vacina pode ainda conter um adjuvante como parte do excipiente. Adjuvantes tais como o adjuvante de Freund completo (CFA) ou o adjuvante de Freund incompleto (IFA) são bem conhecidos na especialidade, para uso em animais de labo ratõrio. Podem também usar-se adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis, tais como alúmen.

A presente invenção refere-se também a composições farmacêuticas que contêm um dos péptidos da presente invenção e um agente antiviral como uma forma de terapia combina da para a infecção pelo HTV-1. 0 péptido e o agente antiviral po dem encontrar-se numa forma molecular separada ou ligados ou con jugados por meio de uma ligação química. No caso em que o pêptido e o agente antiviral estão ligados, a molécula conjugada resultante serve como meio de libertação específica orientada do agente antiviral para o HIV-1. Admite-se também que o péptido e o agente antiviral possam ser administrados separadamente numa terapia combinada. Fischer et al. (Nature 331:76-78 (1988)) suge riram a utilização de uma terapia antiviral para o HIV-1 que envolve a administração a um paciente de proteína CD4 solúvel em combinação com uma droga antiviral que bloqueie a transcriptase reversa.

O agente antiviral pode ser qualquer agente que seja capaz de bloquear um ou mais estádios no ciclo de vida do HIV-1. Uma classe desses agentes antivirais são os inibidores de transcriptase reversa, que são capazes de inibir a função do enzima transcriptase reversa presente em todos os retrovirus. Muitos dos inibidores de transcriptase reversa presentemente utilizados são análogos ou derivados de nucleõsidos, tais como 3’-azido-3'-desoxitimidina (AZT); didesoxicitidina; di desoxiadenosina e outros análogos de nucleõsidos, tais como acylovir, ribavirina e vidarabina. O registo de patente europeu N<? EP 196,185 descreve o uso de AZT para o tratamento do SIDA. Es- 20 -

tes análogos âe nucleósido interrompem a transcrptase reversa que reune o DNA virai destinado a tornar-se no pro-virus do HIV-1. As drogas antivirais usadas para este fim são tipicamente análogas químicos dos nucleósidos que formam as sub-unidades do DNA. Quando se fornece o análogo a uma célula infectada, a trans criptase reversa incorporã-la-ã numa cadeia de DNA em crescimento. Uma vez que ao análogo falta o ponto de ligação correcto para a sub-unidade seguinte a cadeia será terminada. O DNA truncado não poderá Integrar-se a si próprio nos cromossomas ou consti tuir uma base para a replicação virai, sustendo-se assim o alastramento da infecção.

Outros agentes antivirais que podem ser uteis são os que podem bloquear a formação da proteína envol_ vente do HIV-1, tais como a castanospermina; qualquer agente que possa Interferir com o ajustamento de novos componentes virais em células infectadas; ou qualquer agente que possa afectar a agregação de partículas virais completas a partir de células infectadas.

Como mencionado anteriormente, admite-se que os péptidos da presente invenção possam ser usados como agentes imunossupressores, mascarabdo a proteína CD4. A base para esta aplicação dos presentes péptidos ê que se pensa que a proteína CD4 interectua com proteínas MHC da classe IT expressas ; por células alvo contendo antigene. Esta suposta interacção entre proteínas MHC de classe II e as células T4 pode ser essencial para a função apropriada da célula T. Veja-se, por exemplo, Siddinson, W.E. et al., J. Irnmunology 131:152 (1983) e Maddon, P.J. et al., Cell 47:333-348 (1985). Os anticorpos que se ligam â molécula de CD4 ou â molécula da classe II interferem suficien temente cora a interacção celular para inibir as respostas imunoí lógicas in vitro.

Admite-se que, tal como os anticorpos, os péptidos são capazes de bloquear a interacção CD4-proteína MHC de classe II e podem interferir com a resposta imunológica numa extensão tal que esses péptidos podem agir como agentes irau nossupressores. 0 linfôcito T4 é a célula crítica e central envolvida directa ou indirectamente na indução da maior parte das

funções imunolõgicas afectando uma larga gama de funções de limbos múltiplos da resposta imunológica, bem como certas funções celulares não linfôides. Isto é provocado em geral pela recreção de uma série de factores solúveis (por exemplo, linfoquines como a interleuquina-2) que têm efeitos trôficos ou inductivos (ou am bos) nas células em questão. Exemplos de algumas das funções que o linfócito T4 desempenha no sistema lmunológico, são: secreção de factores de crescimento e de diferenciação para células linfõides; secreção de factores estimulantes da colónia hematopoiética; secreção de factores que induzem a função celular não linfõide; indução da função das células B; indução da função das cê lulas supressoras; indução da função das células T killer; indução da função das células T citotóxica e activação de macrofagos.

Deste modo, os peptidos da presente in venção podem ter utilidade como agentes imunossupressores interferindo com ou inibindo a resposta imunológica. Tal efeito pode ser conveniente para o tratamento de estados clínicos em que se pretenda suprimir o sistema lmunológico. Tais estados incluem do enças autoimunes, alergia, rejeição de enxertos, reacção hipersensitiva do tipo retardado e reacção transplante-hospedeiro.

fi ainda um objectivo da invenção o uso de peptidos da presente invenção como agentes de diagnóstico para a detecção da presença do HIV-1, uma vez que estes peptidos são capazes de se ligarem especificamente ao virus. Um tal siste ma diagnóstico, na forma de kit, inclui, numa quantidade suficiente para pelo menos um teste, um péptido ou uma composição de anticorpo anti-idiotípico, de acordo com a presente invenção, co mo reagente embalado. As instruções para o uso de reagente embalado incluem-se normalmente no próprio kit”. O péptido ou o anticorpo anti-idiotípico pode marcar-se com um meio de detecção, tal como um marcador radioactivo, fluorescente ou enzimãtico.

Tal meio de detecção permite a detecção do péptido ou do anticor po anti-idiotípico quando se encontra ligado ao HIV-1. O péptido ou o anticorpo anti-idiotípico pode usar-se como um ligando de captura ligado a uma matriz sólida. Neste caso, usa-se também um anticorpo marcado, especifico para o HIV-1, para detectar o

virus. Em alternativa, o péptido ou o anticorpo anti-idiotípico pode usar-se como ligando detector e o anticorpo anti-HIV-1 usa-se como ligando de captura.

No sentido aqui empregue, o termo embalado refere-se a uma matriz sólida de materiais tais como vidro, plástico, papel, celofane e semelhantes, capaz de suportar, dentro de limites fixos, um péptido ou uma composição de anticor po anti-idiotlpico da presente invenção. Assim, por exemplo, uma embalagem pode ser uma ampola de vidro utilizada para conter quantidades da ordem de miligrama de um determinado péptido ou anticorpo anti-idiotípico, ou pode ser um orifício de placa de microtitulação no qual se colocaram operacionalmente quantidades da ordem do miligrama de um determinado péptido ou anticorpo anti-idiotípico, isto é, se lincaram de modo a ser possível ligã-los ao HIV-1. As instruções de utilização incluem tipicamente uma descrição da concentração do reagente ou pelo menos um parâmetro do método de teste, tal como as quantidades relativas da amostra reagente a utilizar, os tempos de manutenção das misturas de reagente/amostra, a temperatura, as condições de tamponização, etc..

No actual contexto, os termos marcador e meio de detecção e as suas várias formas gramaticais re ferem-se a átomos e moléculas simples que estão directa ou indirectamente envolvidos na produção de um sinal detectãvel que indique a presença de um complexo. A palavra complexo aqui usada refere-se ao produto de reacçoes de ligação específicas tais como a reacção pêptido-HTV-1 ou anti-idiotipo-HIV-1. Qualquer marcador ou meio de detecção se pode ligar ou Incorporar no péptido ou no anticorpo anti-idiotípico da presente invenção, ou usar se paradamente, podendo os referidos átomos ou moléculas usar-se isoladamente ou em conjunção com reagentes adicionais. Tais marcadores são eles próprios bem conhecidos em química diagnóstica clínica e constituem uma parte desta invenção apenas no que respeita ao facto de serem utilizados com péptidos novos e anticorpos anti-idiotípicos novos.

O meio de marcação pode ser um agente marcador fluorescente que se ligue quimicamente a anticorpos ou

a antigenes sem os desnaturar formando um fluorocromo (corante) que seja um traçador iraunofluorescente útil. Os agentes marcadores fluorescentes adequados são fluorocromos, tais como isociana to de fluoresceína (FIC,, isotiocianato de fluoresceína (FITC) e análogos. Encontra-se uma descrição das técnicas de análise imunofluorescentes em DeLuca, Immunofluorescence Analysis, em Antibody as Tool, Marchalonis et al., Eds., John Wiley & Sons Limi | ted, pag. 189-231 (1982).

Nas formas de concretização preferenci ais, o grupo indicador é um enzima, tal como peroxidase de rábano (HRP), oxidase de glucose ou semelhantes. Em tais casos em

I que o grupo indicador principal ê um enzima tal como HRP ou oxidase de glucose, são necessários reagentes adicionais para visua lizar se se formou um complexo de ligação. Tais reagentes adicio nais para a HRP incluem o peróxido de hidrogénio e um corante precursor de oxidação tal como a diaminobenzidina.

Os elementos radioactivos são também agentes de marcação úteis e usar-se-ão aqui como exemplo. Um agente radioraarcador ê um elemento radioactivo que emite raios ga ma. Os elementos que emitem eles próprios raios gama, tais como ¹²⁴I, ¹²⁵I, ¹²⁸I, ¹³²I e ⁸¹Cr representam uma classe de grupos incicadores de elementos radioactivos emissores de raios gama. 125

Prefere-se em particular ο I. Ura outro grupo de marcadores JLJL 18 15 13 ** úteis são os elementos tais como C, F, 0 e N que são emissores de positrões. Os positrões por eles emitidos produzem raios gama após choque com electrões presentes na solução a testar.

A ligação de marcadores, isto ê, a mar cação de proteínas, é bem conhecida da especialidade. Por exemplo, as moléculas de anticorpos anti-idiotípicos produzidas por um hibridoma se podem marcar por incorporação metabólica de aminoácidos contendo radioisôtopos adicionados corao ura componente do meio de cultura. Veja-se, por exemplo, Galfre et al., Meth. Enzyraol, 73: 3-46 (1981) . São particularmente aplicáveis as técnicas de conjugação ou de acoplamento de proteínas através dos grupos funcionais activados.

Os kits diagnósticos da presente in- 24 -

í venção podem usar-se num formato de fase sólida para detectar a presença de uma quantidade de KIV-1 numa amostra de fluido corpo ίral como soro, plasma ou urina. No teste em fase sólida, o pépti ίdo ou o anticorpo anti-idiotlpico pode ligar-se a uma fase sólida e pôr-se depois era contacto com a amostra contendo o HIV-1. 0

I HIV-1 na amostra ligar-se-ã ao péptido ou ao anticorpo anti-idio ' típico. Deste modo, nas formas de concretização preferenciais, uma molécula de péptido ou de anticorpo anti-idiotlpico da presente invenção pode fixar-se a um suporte sólido dando origem a um suporte sólido que contem uma embalagem no sistema diagnôs'tico em causa. 0 reagente fixa-se tipicamente â matriz sólida por adsorpção a partir de um meio aquoso, embora se possam usar outros métodos de fixação bem conhecidos do especialista da arte As matrizes sólidas úteis são também bem conhecidas na especiali idade. Estes materiais são insolúveis em água e incluem o dextran ide ligações cruzadas, disponível como marca registada SEPHADEX da firma Pharmacia Fine Chemicals; agarose; esferas de poliestireno; cloreto de polivinilo; poliestireno; poliacrilamida de li!gação cruzada; filmes de nitrocelulose ou de nylon, tais como pe llculas, bandas ou pãs; ou tubos, placas ou os orifícios de pla|cas de raicrotitulação como as feitas de poliestireno ou cloreto de polivinilo.

péptido ou o anticorpo anti-idiotípi co da presente invenção pode usar-se no sistema diagnóstico em solução, como uma dispersão liquida, ou como um pó substancialmente seco, por exemplo na forma liofilizada. No coso em que o indicador é um enzima, o substrato do enzima pode também fornecer-se numa embalagem separada do sistema. Neste sistema de teste diagnóstico podem também incluir-se, como elementos de embala gem separados, um suporte sólido tal como a placa de microtitula j ção acima descrita e um ou mais tampões.

Os materiais de embalagem aqui mencionados em relação aos sistemas diagnósticos são os normalmente utilizados nos sistemas diagnósticos. Tais materiais incluem frascos de vidro e de plástico (por exemplo polietileno, polipro pileno e policarbonato), ampolas, envelopes de plástico e lamina dos a plástico e semelhantes.

O exemplo seguinte destina-se a ilustrar a presente invenção. A invenção não deve considerar-se limi. tada por este exemplo mas apenas pelas reivindicações apresentadas.

EXEMPLO 1

A estrutura da posição de ligação do HIV-1 na proteína CD4 identificou-se por mapping epitõpico usan do uma família de oito anticorpos monoclonais específicos para a CD4 funcionalmente distintos em conjugação com uma série de gran des péptidos sintéticos derivados da CD4. Todos os sete epltotos localizados se situam em dois loops di-sulfureto análogos â imunoglobulina situados entre os resíduos 1 e 161 da proteína CD4. 0 anticorpo monoclonal 0KT4A, especifico para a CD4, um potente inibidor da ligação do HIV-1, reconheceu uma posição entre os resíduos 25 e 40 na proteína CD4. Por analogia com outros mem bros da superfamília das imunoglobulinas das proteínas, esta região particular previu-se existir na forma de um loop exposto. Um análogo sintético deste loop (resíduos 18 a 51) mostrou uma inibição dependente da concentração da fusão celular induzida pe lo HIV-1. Admite-se que um loop estendendo-se dos resíduos 30-46 ou 18-40 da proteína CD4 possa ser a posição real de ligação do HIV-1.

Nas experiências abaixo descritas usou -se uma série de oito anticorpos monoclonais específicos para a CD4. Os anticorpos MT-151, OKT4F e OKT4A são os inibidores mais potentes da ligação do HIV-1 à proteína CD4, enquanto que os OKT4D e OKT4E mostram um efeito inibitório intermédio, ο OKT4B mostra apenas um efeito fraco e os OKT4 e OKT4C não têm efeito na ligação do virus: McDougal et al., J. Immunol. 137 : 2937 (1986) e Sattentau et al., Science 234 : 1120 (1986). Sattentau et al. (vide acima) sugeriram que se podem distinguir duas regiões de ligação independentes neste grupo de anticorpos monoclonais específicos para a CD4, um definido pelo OKT4A e outro pelo MT151.

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Prepararam-se antisoros antipeptldicos com uma inoculação intradermal inicial de Keyhole limpet hemocy anin (KLH) ligada ao péptido (1 mg) misturada na razão 1:1 ccm adjuvante de Freund completo. Três semanas mais tarde, os coelhos receberam uma inoculação intramuscular de 1 mg do péptido livre misturado na razão 1:1 com adjuvante de Freund incompleto. Em se guida, inocularam-se os animais do mesmo modo com duas semanas de intervalo. Mediram-se as concentrações de antipêptido 10 sema nas apôs a inoculação, exactamente como descrito por Emini et al.

(Nature 304:699 (1983)). A capacidade do antisoro antipeptldico para se ligar à proteína CD4 nativa testou-se como descrito na legenda da figura 3, excepto o facto de se ter usado um segundo anticorpo IgG de cabra anti-coelho (ICN Biochemicals) marcado 125 com I ou um segundo anticorpo IgG de burro anti-coelho (Jackson Immunologicals) marcado com FITC.

Procedeu-se ao ensaio de competição en tre os anticorpos monoclonais específicos para CD4 e uma diluição de 1:100 dos antisoros antipeptldicos de coelho, como descri to. A letra indicada nas colunas RIA ou FITC da Tabela 1 refere-se ã última letra do anticorpo monoclonal para o qual se observou uma forte competição ( >80% de redução da ligação antipéptido-CD4), por exemplo OKT4A - A. Os anticorpos monoclonais precedidos por três pontos são os que competiram significativamente com os antisoros peptldicos (> 40% de redução de ligação), mas em menor extensão que os anticorpos que aparecem antes dos três pontos. Os resultados apresentados para a Inibição de sincitia em relação aos anticorpos monoclonais específicos para CD4 foram retirados de McDougal et al. (J. Immunol. 137 : 2937 (1986)) e Sattentau et al. (Science 234 : 1120 (1986)). Os resultados RIA em fase sólida com os soros antipeptldicos não foram testados em relação à reactividade cruzada, por exemplo, se o anti-18-51 rea ge cruzadamente ou não com o péptido 33-65.

Para identificar os epltopos da família dos anticorpos monoclonais específicos para CD4, sintetizou-se uma série de péptidos derivados CD4 (ver Fig. 1). Verificou-se que os péptidos mais compridos (aproximadamente 30 aminoãcidos de comprimento) dão resultados mais consistentes em ensaios

de ligação directa do que os péptidos mais curtos (6-12 aminoãci dos de comprimento) e que os anticorpos para os péptidos mais longos reagem cruzadamente melhor com a proteína alvo nativa. Usaram-se por isso péptidos de cerca de 30 aminoácidos de compri^ mento. Os anticorpos monoclonais específicos para CD4 testaram-se directamente em relação ã sua capacidade para se ligarem a cada péptido sintético (Fig. 2). Apenas três dos anticorpos mono cionais reconheceram consistentemente qualquer dos péptidos deri vadòs da CD4 na RIA de fase sólida. O OKT4C e o OKT4F deram ambos sinais fortes reprodutíveis no teste enquanto que ο OKT4A, embora consistentemente positivo, deu um sinal muito mais fraco. 0 OKT4C reagiu positivamente com os péptidos 11-40 e 18-51. A re acção com o péptido 11-40 foi consistentemente a mais forte das duas. Ο OKT4A reagiu igualmente bem como os péptidos 11-40 e 18-51. Isto pode ser interpretado consistentemente da maneira que se segue. Tanto o OKT4C como ο OKT4A coicidera com a porção amino terminal do primeiro loop di-sulfureto da proteína CD4 (ver Fig. 1), ligando-se o OKT4C perto do terminal amino do péptido 18-51 e no meio do 11-40, enquanto que ο OKT4A se liga perto do meio de ambos os péptidos. Isto implica que o OKT4C se ligue a uma região ligeiramente aminoterminal ap epítopo OKT4A. O OKT4F, que inibe o HIV-1 de se ligar à CD4, ligou-se apenas ao péptido 132-161. Deste modo, este anticorpo interactua com os resíduos contidos no segundo loop di-sulfureto da proteína CD4 (ver Fig. 1).

Embora nem ο MT151 nem ο OKT4B reconhe cessem qualquer dos péptidos sintéticos derivados de CD4 na RIA de fase sólida, reconheceram especificamente um péptido num teste de ligação competitiva em solução. Titulou-se cada anticorpo monoclonal contra um numero constante de células CD4(+) CEM (8x xlO^ células/orifício). Seleccionou-se uma concentração de anticorpos (8 micrograma/ml) na região de pré-saturação da curva de ligação e usou-se o péptido 132-161 para competir (de um modo de pendente da concentração) para a ligação do anticorpo monoclonal à CD4 nativa presente nos linfócitos T auxiliares (células CEM). Com este ensaio, foi possível identificar as posições de ligação do MT151 e do OKT4B e confirmar as do OKT4F (Fig. 3). A partir

destes dados, concluiu-se que ο 0KT4B, o OKT4F e o ST151 se ligam todos ao segundo loop de di-sulfureto (132-161).

Inocularam-se então os péptidos deriva dos da CD4 (18-51, 33-65, 51-86, 104-132, 132-161 e 180-211) em coelhos brancos da Nova Zelândia fêmeas. Todos os péptidos usados nesta experiência provocaram elevadas concentrações de anticorpo aos péptidos e, excepto para o antisoro ao péptido 104-132, ligados especificamente a células CEM CD4(+). (A ligação dos anticorpos de coelho segiu-se cora um segundo anticorpo marcado com

125 I ou com FITC). Usaram-se quantidades de saturaçao (20 micrograma/ml) dos anticorpos monoclonais específicos para CD4 para inibir corapetitivaraente a ligação de cada um dos anticorpos de coelho às células CD4(+) . Os resultados destes ensaios de competição apresentam-se na Tabela 1. O anticorpo para o péptido 180-211 ligou-se à proteína CD4 nativa mas não foi inibido por qual quer dos anticorpos monoclonais específicos para CD4. A prê-liga ção do OKT4A â proteína CD4 impediu a ligação do anticorpo ao péptido 18-51, em concordância com os resultados do teste de ligação directa ao RIA de fase sólida. O OKT4D Inibiu fortemente a ligação dos anticorpos anti-33-65 no teste de fluorescência (FITC). Contudo, os anti-soros anti-33-65 não mostraram uma liga ção reprodutível â proteína CD4 no ensaio radioimunolôgicom com

Ί p C ~

I. A pré-incubação das células CD4(+) com OKT4E inibiu a liga ção dos anticorpos de coelho anti-51-86. Nos ensaios radioimunolõgicos ο OKT4E inibiu também a ligação dos anticorpos anti-51-86 mas em menor escala. Estes resultados sugerem que ο OKT4E se deve ligar a ou muito perto da região ligada pelos anticorpos an ti-51-86 e que o OKT4D se liga numa região definida pelos resíduos 33-65. Estes resultados e os da localização directa do epítopo acima indicados mostram que a ordem linear dos epítopos aos quais os monoclonais específicos para CD4 se ligam no primeiro loop di-sulfureto (ver Fig. 1) deve ser : OKT4C, OKT4A, OKT4D e OKT4E.

Usaram-se os anticorpos de coelho anti

-132-161 para confirmar a localização de epítopo de OKT4B e

MT151. A pré-ligação do OKT4B ou do MT151 foi capaz de inibir a ligação dos anticorpos anti-132-161. Embora o OKT4F coincida coo

a região 132-161, a pré-incubação deste monoclonal com células CD4(+) teve apenas um ligeiro efeito na ligação dos anticorpos anti-peptídicos.

Exceptuando o caso do 0KT4, que não tem efeito na ligação do HIV-1 às células T, todos os membros do grupo dos anticorpos monoclonais anti-CD4 testados neste estudo se ligam ou ao primeiro ou ao segundo loop di-sulfureto aminoterminal (ver Fig. 1). Este resultado estã de acordo com as observações de Traunecker et al. (Nature 331 : 84 (1988) que mostram que uma proteína CD4 truncada solúvel, constituída apenas por estas duas regiões, ê suficiente para inibir competitivamente o HIV-1 de se ligar â proteína CD4.

Para obter informações acerca das inte racções estereoquímicas do grupo de monoclonais quando ligados à molécula de CD4, marcou-se cada anticorpo monoclonal desse grupo com FITC e testou-se com todos os membros do grupo como a mostra para competições de ligação. Os resultados destas experiências apresentam-se na Figura 4. 0 FITC-OKT4B mostrou uma larga gama de efeitos competitivos de ligação. Isto pode ser explicado pelo facto de esta proteína ser um anticorpo da classe IgM (pentamétrico) e de ser um complexo de proteína muito grande. Todos os outros membros do grupo são anticorpos do tipo IgG monoméricos. De entre os anticorpos testados, apenas o FITC-OKT4 e o FITC-OKT4D não foram afectados pela ligação de outros monoclonais. Nos outros estudos de competição cruzada, observaram-se apenas dois comportamentos de interferência recíproca de ligação. 0 0KT4C e ο OKT4E mostraram uma ligação competitiva mútua enquanto que ο 0KT4A, que se liga perto da região aminoterminal do primei ro loop” di-sulfureto, mostrou ligação competitiva recíproca com os anticorpos monoclonais específicos para CD4 que coincidem com o loop di-sulfureto pequeno, 132-161, isto é, com o OKT4F e ο OKT4B.

Os resultados das competições cruzadas entre os vários anticorpos monoclonais encontram-se resumidos na

Figura 1 e estão de acordo com a ideia de que a estrutura dobrada da proteína CD4 é tal que os dois loops di-sulfureto devem estar próximos um do outro. Além disso, os anticorpos que apre- 31 sentam os mais fortes efeitos sobre a capacidade do HIV-1 se ligar ã proteína CD4, isto ê, ο 0KT4A e o 0KT4F, devem ter epítopoe que estejam próximos um do outro e que se situem no mesmo plano, de modo que os anticorpos ligados interfiram um com o outro, fi de assinalar que os resultados destes ensaios radioimunológicos em fase sólida mostram que ο 0KT4A e o OKT4C têm epítopos vizinhos um do outro numa estrutura linear (Figura 1), embora os dois anticorpos apresentem propriedades radicalmente diferentes (ver Tabela 1) e não compitam entre si num teste de competição cruzada, apesar do facto do tamanho relativo de cada anticorpo monoclonal ser muito grande comparado com os loops di-sulfureto da proteína CD4. Estas implicações geométricas da localização dos epítopos e os dados da ligação competitiva podem explicar-se exa minando as estruturas tridimensionais conhecidas das proteínas relacionadas com a molécula de CD4.

A proteína CD4 tem sido classificada como pertencente ã superfamília proteica das imunoglobulinas com base nas semelhanças sequenciais, tanto ao nível dos ácidos nucleicos como dos aminoácidos; veja-se Littman, D.R., Ann. Rev. Immunol _5 : 566 (1987) . Tem sido frequentemente sugerido que os alinhamentos da sequência de aminoácidos e as previsões da estru tura secundária indicam que a arquitectura dobrada da família das proteínas semelhantes a imunoglobulina se encontra altamente conservada (Clark S.J. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 84: 1149 (1987); e Williams, A.F., Immunol. Today £5 : 298 (1987)).

Por esta razão, examinaram-se as estruturas tridimensionais de uma série de regiões de imunoglobulina análogas aos resíduos 1-86 da molécula de CD4. Os alinhamentos sequenciais aqui usados para comparar a proteína CD4 com as proteínas da imunoglobulina derivaram-se alinhamentos conhecidos publicados (vela-se Littman D.R. et al., ibid; Clark, S.J. et al., ibid e William, A.F., ibid). A estrutura principal da cadeia de carbono alfa de uma destas estruturas, um loop variável de cadeia leve da imunoglo bulina, elucidou-se com base nos resultados de difraeção de raiou X de alta resolução de Epp efe al. (Biochem. 14 : 4933 (1975)). Examinaram-se todas as estruturas tridimensionais de imunoglobulina registadas no banco de dados de Brookhaven e, embora a for- 32 -

na exacta e a composição dos vários loops possam diferir ligei ramente de uma proteína para outra, a arquitectura dobrada total encontra-se conservada e pode exemplificar-se pela estrutura da IgG humana.

As estruturas imunogênicas são muitas vezes loops que sobressaem da superfície de uma região proteica. Podem identificar-se quatro loops salientes em todas as es truturas de imunoglobulinas semelhantes â CD4, que se podem designar como: 1) loop 1, correspondente a uma região análoga aos resíduos 18-28 da proteína CD4; 2) loop 2, análogo aos resíduos 30-46 da CD4; 3) loop 3, análogo aos resíduos 51-62 da CD4; e 4) loop 4, análogo aos resíduos 63-71 da CD4. A atribui ção destes quatro loops aos epitopos para OKT4C, OKT4A, OKT4D e OKT4E, respectivamente, está de acordo com os dados de localização epitópica da presente invenção. Além disso, as experiências de competição cruzada com OKT4C e OKT4E mostraram que os respectivos epitopos devem estar próximos no espaço e orientar-se de tal modo que os monoclonais ligados interferem um com o outro. O loop 1 (OKT4C) e o loop 4 (OKT4E) obdecem a estes critê rios. Por outro lado, o loop 2 (análogo aos resíduos 30-46), atribuído ao 0KT4A, é vizinho do loop 1 (análogo aos resíduos 18-28), atribuído ao OKT4C, mas os dois loops estão orientados em direcção opostas, de acordo com a observação de que os monoclonais do OKT4A e do OKT4C não competem em reacções cruzadas. Finalmente, o loop 3 (OKT4D) tem uma posição saliente tal que um anticorpo que a ele se ligue não devera interferir com a ligação de qualquer dos outros anticorpos. A interpretação consistente da localização dos epitopos e os dados de competição cruzada em termos destas estruturas, em conjunto com os alinhamentos sequen ciais e as semelhanças previstas na estrutura secundária, reforça a ideia de que a estrutura tridimensional dos primeiros 86 aminoácidos da proteína CD4 ê análoga à região correspondente da estrutura da imunoglobulina.

A localização dos epítopos e os dados de orientação relativa permitem obter certas conclusões acerca das interacções da CD4 com o HIV-1. O loop 2 que representa o epítopo da CD4 atribuído a OKT4A, está bem saliente das cadeias

gue o circundam de tal modo gue se assemelha a um dedo esticado. 0 anticorpo para este dado (OKT4A) impede ο HIV-1 de se ligar â proteína CD4, enquanto gue um anticorpo gue se ligue ao loop 1 (OKT4C) gue é adjacente mas gue aponta na direcção oposta, não tem efeito sobre a ligação do HIV-1. A observação gue os anti-idiotipos de 0KT4A se ligam à camada envolvente externa do HIV-1 (Kennedy et al., Int. Conf. AIDS III, 160 (1987)) sugere que a inibição de ligação observada com ο OKT4A não se deve simplesmente a efeitos estereogulmicos de vizinhança mas sim ao facto de pelo menos partes do epltopo OKT4A estearem directamente envol vidas na ligação do HIV-1 à proteína CD4. Por analogia com os pi cornavirus (Hogle et al., Science 229 : 1358 (1985)) e de acordo com a recente sugestão de Lasky et al. (Cell 50:975 (1987)) no seu estudo sobre a posição de ligação â CD4 da gpl20, parece pro vãvel que o local de ligação do receptor na superfície do HIV-1 seja um vale de invaginação. Deste modo, os presentes resultados sugerem gue os resíduos 30-46 da CD4 (análogos ao Loop 2) formam uma projecção em forma de dedo a partir da superfície da proteína CD4, que actua como local de ligação para o HIV-1.

Em apoio a esta hipótese, testou-se um péptido sintético derivado da Cd4 (18-51) num ensaio de fusão ce lular induzida pelo HIV-1 (formação de sincitia), usando células WMJ infectadas com HIV-1 misturadas (na razão 1:5) com células SupTl não infectadas. Verificou-se gue este péptido inibia especificamente a formação de sincitia de um modo dependente da concentração, até concentrações tão baixas como zoomicrograma/ml. Nenhum dos péptidos 7-18 ou 33-65, utilizados como controles, fo ram capazes de inibir a fusão celular induzida pelo virus, a con centrações equivalentes. Quando o péptido 18-51 se removeu por lavagem, duas horas após a sua iniciação, a formação de sincitia continuava normalmente, indicando que o péptido não estava a exercer um efeito tóxico sobre as células e gue a inibição obser vada se devia apenas à presença do péptido 18-51.

Acabou de descrever-se a invenção em relação a certas formas de concretização preferenciais. Contudo, uma vez gue podem surgir variações óbvias ao especialista da matéria, a invenção não deve considerar-se limitada a esta descrição, mas sim apenas às reivindicações gue se seguem.

Claims (1)

1. - lâ Processo para a preparação de um pépti do que se ligue ao virus da imunodeficiência humana (HTV), constituído pela seguinte sequência de aminoácidos:

   Cys-Thr-Ala-Ser-Gln-Lys-Lys-Ser-Ile-Gln-Phe-His-TrpLys-Asn-Ser-Asn-Gln-Ile-Lys-Ile-Leu-Gly-Asn-Gln-GlySer-Phe-Leu-Thr-Lys-Gly-Pro-Ser ou de qualquer análogo que se ligue ao HTV, de um seu fragmento, derivado químico ou sal farmacologicamente aceitável, caracterizado por se construir o péptido por síntese peptídica em fase sólida, em solução ou por meio de técnicas recombinantes (engenharia genética).

   Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o péptido ser capaz de se ligar ao envolucro de proteína gpl20 do HIV-1.

   Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a sequência de aminoácidos do péptido ser:

   Ní^-Trp-Lys-Asn-Ser-Asn-Gln-Ile-Lys-Ile-Leu-GlyAsn-Gln-Gly-Ser-Phe-Leu-COOH.

   Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a sequência de aminoácidos do péptido ser:

   NH^-Cys-Thr-Ala-Ser-Gln-Lys-Lys-Ser-Ile-Gln-Phe-HisTrp-Lys-Asn-Ser-Asn-Ser-Asn-Gln-Ile-Lys-Ile-Leu-GlyCOOH.

   - 5- 1,

   Processo de caracterizado por o péptido ser de acordo com a reivindicação origem sintética.

   - 6- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o péptido se ligar a uma sequência adicional de aminoácidos, por um ou por ambos os extremos azotados ou carbonados, possuindo essa sequência o comprimento de 1 a 100 aminoácidos.

   Processo para a preparação de um pépti do que se ligue ao HIV, constituído pela seguinte sequência de aminoácidos:

   Cys-Arg-Ser-Pro-Arg-Gly-Lys-Asn-Ile-Gln-Gly-Gly-Lys-Thr-LeuSer-Val-Ser-Gln-Leu-Glu-Leu-Gln-Asp-Ser-Gly-Thr-Trp-Thr-Cys ou de qualquer análogo que se ligue ao HIV, de um seu fragmento, derivado químico ou sal farmacologicamente aceitável,

   - 36 caracterizado por se construir o péptido por síntese peptídica em fase sólida, em solução ou por meio de técnicas recombinantes (engenharia genética).

   Processo para a preparação de um anticorpo específico para um péptido preparado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o anticorpo ser capaz de bloquear a ligação do HIV-1 a uma célula T4.

   Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por o anticorpo ser monoclonal.

   a

   - 10- Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por se preparar um anticorpo anti-idiotípico, que mantêm a imagem interna de um péptido preparado de acordo com a reivindicação 1, e que seja capaz de se ligar ao envolucro proteico gpl20 do HIV-1.

   - 11- Processo de acordo com a reivindicação

   10, caracterizado por o anticorpo anti-idiotípico ser monoclonal.

   - 12— Processo para a preparaçao de uma composição farmacêutica para o tratamento de infecções provocadas por HIV, caracterizado por se incorporar como ingrediente activo um péptido preparado de acordo com a reivindicação 1, com um vel culo farmacologicamente aceitável.

   Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por o ingrediente activo ser ura péptido preparado de acordo com a reivindicação 3.

   Processo paira a preparação de uma vaci na gue confere ao paciente uma imunidade activa contra o HTV, ca racterizado por se incorporar como ingrediente activo, uma quantidade imunizante efectiva de um anticorpo preparado de acordo com a reivindicação 8, com um veículo farmacologicamente aceitável.

   - isS Processo de acordo com a reivindicação

   14, caracterizado por o anticorpo se ligar a um veículo imunogênico.

   Processo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por se incorporar adicionalmente um imunopoten ciador farmacologicamente aceitável.

   - 17- Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por se incorporar adicionalmente um adjuvante farmaceuticamente aceitável.

   - 182 Processo para a preparação de uma composição farmacêutica, caracterizado por se incorporar como ingre diente activo um péptido preparado de acordo com a reivindicação 1, com um agente antiviral, num veículo farmacologicamente aceitável.

   Processo de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por o péptido e o agente antiviral se encontra rem ligados por uma ligação química.

   - 20⁵ 39

   203

   Processo de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por o agente antiviral ser um inibidor de transcriptase reversa.

   - 213 Processo de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por o inibidor ser um nucleósido.

   - 223 Processo para a preparação de um conjunto para diagnóstico (Kit) para a detecção do HIV, caracterizado por se utilizar um péptido preparado de acordo com a re_i vindicação 1 ou com a reivindicação 3.

   - 233 Processo para a preparaçao de um conjunto para diagnóstico (Kit) para a detecção do HIV, caracterizado por se utilizar um anticorpo anti-idiotípico preparado de acordo com a reivindicação 10.

   As requerentes reivindicam a priorida de do pedido norte-americano apresentado em 27 de Maio de 1988, sob o número de série 199,973.