PT671947E

PT671947E - Composicoes para produzir respostas de linfocitos t citotoxicas contra virus

Info

Publication number: PT671947E
Application number: PT93900770T
Authority: PT
Inventors: Jagannadha K Sastry; Ralph B Arlinghaus; Chris D Platsoucas; Pramod N Nehete
Original assignee: Univ Texas
Priority date: 1991-12-02
Filing date: 1992-12-02
Publication date: 2000-07-31
Also published as: EP0671947A1; CA2124691A1; ATE190226T1; WO1993010816A1; EP0968721A2; AU3233993A; DE69230769T2; GR3033488T3; EP0671947B1; JPH07502729A; ES2145768T3; EP0968721A3; DE69230769D1; AU666160B2; DK0671947T3

Description

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DESCRIÇÃO

"COMPOSIÇÕES PARA. PRODUZIR RESPOSTAS DE LINFÓCITOS T CITOTÓXICAS CONTRA VÍRUS" 1. Área da Invenção Á presente invenção refere-se de um modo geral à prevenção e tratamento de SIDA e a métodos e composições para a iniciação de respostas de linfócitos T citotóxicas especificas (CTL) in vivo. São descritos métodos para a identificação de substâncias candidatas, tipicamente polipéptidos, para utilização na preparação de vacinas de CTL. São reveladas formulações peptidicas que aumentam a distribuição sistémica, actividade e longevidade de células T citotóxicas anti-virais e/ou que protegem células humanas da infecção por HIV. 2. Descrição de Técnicas Relacionadas A SIDA foi primeiro reconhecida nos Estados Unidos em 1981; o número de casos tem vindo a aumentar a um ritmo dramático desde então. Desde 1978, foram relatadas mais do que 2,4 milhões de infecções com SIDA, apenas nos Estados Unidos (Rees, 1987). Quando surgem sintomas imunossupressivos significativos num indivíduo afectado, o desenvolvimento esperado da infecção é a morte. Não há presentemente tratamento que possa atrasar indefinidamente ou prevenir as consequências fatais da doença. Embora a doença se tenha manifestado primeiramente em homens homossexuais ou bissexuais e consumidores de drogas intravenosas, espalhou-se agora aos outros por meios tais como contacto sexual íntimo ou recepção de produtos derivados de sangue de um portador do vírus. 1 p L·, Ο agente causador, associado com a SIDA tem sido identificado como um grupo de retrovírus intimamente relacionados, conhecidos de um modo comum como de Vírus Linfotrópico de Células T Humanas do tipo III (HTLV-III), Vírus de Linfadenopatia (LAV), Vírus Relacionados com a SIDA (ARV), ou mais recentemente denominado Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV). Estes vírus serão aqui colectivamente referidos como HIV, por conveniência.

Como outros retrovírus, o HIV possui ARN como o seu material genético. Quando o vírus entra na célula hospedeira, uma enzima virai conhecida como transcriptase reversa copia o ARN virai formando um ADN de cadeia dupla. 0 ADN virai migra para o núcleo da célula onde serve como um molde para cópias adicionais de ARN virai, que pode então ser montado em novas partículas virais. 0 ARN virai pode também servir como ARN mensageiro (ARNm) para certas proteínas virais, incluindo as proteínas do núcleo virai pl8, p24, pl3 e transcriptase reversa. 0 ARN pode também ser "unido" em ARNm virais específicos necessários para produzir várias outras proteínas virais, incluindo duas proteínas estruturais glicosiladas conhecidas como gp41 e gpl20 que foram inseridas na membrana externa do vírus (Wain-Hobson et al., 1985). É conhecido que gpl20 purificada induz anticorpos na cabra, cavalo e macaco rhesus, que neutraliza HIV nos testes de laboratório (Robey et al., 1986).

As vacinas têm sido utilizadas durante muitos anos para prevenir infecções causadas por agentes tais como vírus. A abordagem geral tem sido injectar indivíduos saudáveis com, por exemplo, uma preparação de vírus mortos ou modificados de modo a iniciar o sistema imune dos indivíduos para montar um assalto ao vírus infectante. Avanços recentes na tecnologia do ADN recombinante têm originado métodos mais seguros de vacinação que envolvem a utilização de componentes virais expostos produzidos 2 \

por sistemas microbianos. Após purificação suficiente, o componente virai, por exemplo uma subunidade proteica, é administrado como uma vacina num veiculo adequado e/ou um adjuvante. Este último estimula o sistema do hospedeiro de um modo que melhora a resposta imune à subunidade virai.

Outro método potencial de produzir uma vacina é por utilização de fragmentos peptídicos de uma subunidade proteica virai sintetizados quimicamente. Este método possui várias vantagens sobre os outros métodos de produzir vacinas, incluindo pureza do produto, reprodutibilidade e especificidade da resposta imunitária.

Antigénios de superfície de um vírus infeccioso podem induzir respostas de células B e de células T. Torna-se claro a partir do trabalho de Milich e colaboradores (Milich et al., 1986; Milich & McLachlan, 1986) que algumas regiões de uma cadeia peptídica de uma proteína podem possuir epitopos quer de células T quer de células B. Estes epitopos são frequentemente distintos uns dos outros e podem compreender sequências peptídicas diferentes. Outros exemplos incluem o trabalho de Maizel et al., (1980) sobre lisozima de clara de ovo de galinha, e de Senyk et al., (1971) sobre glucagon. Assim, pequenas extensões de uma sequência proteica podem induzir uma resposta de células T mas não uma resposta de células B. Uma revisão mais completa destas e de outras observações pertinentes para este ponto é incluída no trabalho de Livingstone & Fathman (1987).

Foi demonstrado que uma região peptídica curta da proteína de superfície do vírus infeccioso da Hepatite B induz apenas uma resposta de células T em murganhos (Milich et al., 1986). Especifícamente, um péptido sintético, cuja sequência é derivada dos aminoácidos numerados de 120-132 localizados no domínio pre-S(2) do gene do antigénio de superfície do vírus da Hepatite B, 3 Γ

induziu uma resposta ao péptido iniciadora de células T muito forte, mas estimulou apenas uma resposta de anticorpos muito fraca. Por outras palavras, os murganhos apresentaram uma resposta de anticorpos muito pobre a este péptido, mas as células T de murganhos imunizados foram iniciadas eficientemente (i.e. activadas) para reconhecer aquele péptido, conforme medido em ensaios de proliferação de células T (Milich et al., 1986). 0 nivel baixo do anticorpo produzido por murganhos imunizados com este péptido não se ligou ao antigénio de superfície virai nativa.

Em contraste com os resultados acima descritos, uma segunda sequência peptidica (aminoácidos 132-145) induziu uma resposta muito fraca de células T em murganhos (Milich et al., 1986). Este segundo péptido, contudo, ligou-se eficientemente ao anticorpo criado contra ele em condições nas quais foi fornecido um epitopo de células T.

Os murganhos foram também imunizados com um péptido mais comprido construído a partir de ambas as sequências de péptido activo T e B acima mencionadas. Neste caso, foram produzidos títulos elevados de anticorpo contra o péptido do sítio B, mas não contra o péptido do sítio T. A combinação de ambos os sítios T e B num péptido deveriam estimular ambas as respostas de células T e B, como medido produzindo um anticorpo específico para o epitopo da cadeia peptidica de célula B. Podem ser construídos antigénios de péptidos sintéticos para produzir dois tipos de respostas imunitárias: apenas de células T e de células T combinada com uma resposta de células B.

As respostas imunitárias celulares proporcionam um mecanismo importante para reduzir o crescimento de células infectadas com vírus (Doherty et al., 1985). Um relatório de Earl et al., (1986) demonstrou a iniciação de linfócitos T e protecção contra 4 t

1““ ί-C a leucemia de murganho induzida pelo virus de Friend (um retrovírus), por uma vacina de proteína de superfície virai. Foi recentemente obtida, por Walker et al. (1986) evidência directa sobre o papel de um subconjunto de linfócitos T (OKT8/LEU2 positivo) na supressão do crescimento de HIV in vitro. Este estudo demonstra ainda que, após esgotamento dos linfócitos T CD8+ no sangue de indivíduos infectados com HIV, foram isoladas grandes quantidades de HIV de células mononucleares de sangue periférico de quatro de sete homens homossexuais seropositivos assintomáticos, que eram inicialmente negativos para o vírus ou possuíam níveis muito baixos do vírus. Assim, os linfócitos T citotóxicos CD8+ (CTLs) podem desempenhar um papel em indivíduos infectados com o vírus para prevenir ã replicação de HIV e progressão da doença. 0 conceito de identificar epitopos de células T em proteínas para inclusão em candidatos potenciais de vacina ganhou grande importância como resultado da demonstração de Townsend et al. (1986) de que epitopos de CTL de nucleoproteína da gripe podem ser definidos por péptidos sintéticos curtos. Contudo, até agora existem apenas três casos documentados (Deres et al., 1989; Aichele et al., 1990; Kast et al., 1991) que descrevem a utilização de péptidos sintéticos na iniciação in vivo de CTLs, estes referem-se a vírus da gripe, Sendai e coriomeningite linfocitária. Em cada um dos casos acima, os protocolos de imunização são incómodos, requerem ou modificações de péptidos ou a realização de muitas imunizações para demonstrar CTLs, e não -se mostram adequados à pesquisa rápida de um número grande de substâncias candidatas. Por exemplo, o método de Aichele e colaboradores (1990) envolve três imunizações a intervalos de uma semana por via subcutânea e demora quatro semanas até serem obtidos CTLs potenciais para ensaio.

Foram propostos epitopos de CTL candidatos em ambas as proteínas de HIV, estrutural e de regulação (Takahashi et al., 5

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L-Ι 1988; Nixon et al., 1988), mas nenhum destes demonstrou ser capaz de induzir CTLs específicos para o vírus in vivo (Berzofsky, 1991). Por exemplo, embora o péptido RIQRGPGRAFVTIGK tenha sido identificado como um epitopo de CTL (Takahashi et al., 1988), nestes estudos a indução in vivo de CTLs específicos para RIQRGPGRAFVTIGK foi alcançada infectando murganhos Balb/c com vírus vaccinia recombinantes expressando proteínas env de HIV (Takahashi et al., 1988) e tentativas de imunização com péptido livre não foram bem sucedidas (Berzofsky, 1991). Hart et al. (1991) foram também incapazes de gerar respostas de CTL na imunização com um único péptido possuindo a sequência do epitopo de CTL, CTRPNNNTRKSIRIQRGPGRAFVTI.

Os mecanismos subjacentes à indução de respostas in vivo a CTL induzidas pelo péptido não são ainda totalmente conhecidos. Por exemplo, Gao et al. (1991) relataram que a adição de um determinante de "T helper" a um determinante de CTL, para criar um péptido híbrido, não aumentou a produção de CTL contra o vírus da gripe. Estes resultados sugerem que a indução de actividade celular "T helper" não é especificamente necessária para a produção eficaz de CTL embora os mesmos estudos demonstrem que o esgotamento de células CD+ inibem a produção de CTL em resposta a péptidos.

Assim, permanece uma necessidade tanto para o desenvolvimento de técnicas para a identificação rápida de epitopos de CTL que possuem a capacidade de induzir uma resposta de CTL in vivo, como para a optimização de indução de CTL. Métodos de ensaio anteriores para a identificação de epitopos indutores de CTL que funcionarão in vivo sofreram um número de desvantagens. As mais notáveis das quais são: a necessidade de múltiplas injecções do material a ser testado, a espera de até 3 semanas ou mais para determinar se a substância teve um efeito positivo na resposta de CTL, e a necessidade geral de incluir um 6

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L-Cj ^ modificador com a substância a ser testada de modo a induzir uma resposta. Claramente, é de importância vital um método rápido para delinear péptidos com uma capacidade de induzir CTL in vivo, na construção de estratégias preventivas e terapêuticas em relação a uma vasta variedade de doenças.

Presentemente a técnica também não possui um método eficaz de produzir uma resposta sistémica, de longa duração e com nivel elevado de CTL após imunização com o péptido. 0 desenvolvimento de um método para aumentar a produção e distribuição sistémica de células CTL anti-virais, em animais ou humanos, seria de grande vantagem no desenvolvimento de vacinas contra agentes virais infecciosos. Um tal método não seria apenas uma arma importante para utilização contra vírus, incluindo a SIDA e a gripe, mas também seria aplicável na vacinação contra outros agentes tais como parasitas.

Embora a região da ansa V3 de gpl20 seja reconhecida como sendo essencial para a entrada de HIV-1 nas células (Travis et al., 1991; Freed & Riser, 1987; Freed et al., 1991), este conhecimento ainda terá de levar ao desenvolvimento de uma estratégia clínica eficaz para prevenir a infecção por HIV. Têm sido relatados péptidos sintéticos derivados de V3 como inibindo a formação de sincícios entre as células infectadas com HIV-1,. mas apenas a concentrações entre 100-300 μΜ (Koito et al., 1989). Em contraste, De Rossi et al. (1991) relataram que péptidos sintéticos derivados de V3 na realidade aumentam a infecção de células por HIV-1 através de um mecanismo dependente de CD4. Assim, adicionalmente à notória falta de uma vacina adequada contra o HIV, também não existe presentemente um meio eficaz para travar a infecção virai e para prevenir a progressão da doença em indivíduos infectados com HIV. 7

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Berzofsky (1991) sugere uma vacina de HIV artificial compreendendo epitopos antigénicos que induzem a neutralização de anticorpos, células "T helper" e células T citotóxicas CD8+. .

Gao et al. (1991) descrevem que a imunização com um péptido híbrido que incorpora um epitopo de CTL e um epitopo de células "T helper" não resulta num aumento de resposta de CTL quando comparado com uma resposta de CTL pelo péptido de CTL isolado.

Berzofsky et al., AIDS Research and Human Retroviruses, Annual Meeting of the National Câncer Institute Laboratory of Tumor Cell Biology, Maryland, EUA, 11-17 de Agosto, 1990, Vol. 7, New York, p. 144 descrevem a presença de um epitopo de uma CTL e de célula "T helper" no mesmo péptido, i.e., não em péptidos separados, e não menciona a inclusão de um péptido inibidor de infecção por HIV separado. EP-A-0 433 242 debruça-se sobre a indução de anticorpos neutralizadores e especificamente a estimulação de células "Th2 helper" indutoras de anticorpos, mas não sobre a utilização de péptidos separados possuindo funções diferentes. WO 91/04045 revela um multímero peptídico para utilização na indução de um activador de células T citotóxicas contra a proteína de HIV nativa.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a uma ou mais das mencionadas ou outras desvantagens nas técnicas anteriores proporcionando várias composições e métodos novos para induzir respostas imunitárias ou anti-infecciosas. A invenção proporciona composições específicas e métodos para imunização contra doenças virais, e em particular para imunização contra o HIV. As 8 t composições de imunização melhoradas, ou vacinas, da invenção compreendem combinações de péptidos sintéticos, que aumentam a distribuição sistémica, nivel de actividade e longevidade de células T citotóxicas especificas para o virus (CTLs). A presente invenção proporciona composições terapêuticas e métodos para utilização na inibição de infecção por HIV. As formulações terapêuticas da invenção compreendem péptidos sintéticos, que funcionam para proteger células humanas de infecção por HIV. A presente invenção envolve largamente composições anti-virais, e particularmente anti-HIV, que possuem tanto aplicações preventivas como terapêuticas.

Também são descritos métodos de imunização e de ensaio para a pesquisa rápida e sensível de uma grande número de compostos candidatos, tais como péptidos, para identificar aqueles que possuem a capacidade de iniciar especificamente uma resposta de CTL, e por isso mais apropriados para utilização em composições terapêuticas tais como vacinas indutoras de CTL. Este aspecto refere-se geralmente a métodos e composições para a identificação de componentes de vacina que possuem a capacidade de iniciar especificamente CTLs a tornando-os reactivos contra células contendo agentes infecciosos tais como vírus, incluindo HIV e vírus da gripe.

Em relação ao aumento de respostas de CTL, a presente invenção refere-se a composições e métodos para aumentar a resposta de CTL de um animal a um dado imunogénio, e particularmente a um péptido indutor de CTL. Um péptido indutor de CTL é um péptido contendo um epitopo indutor de CTL, que é capaz de estimular a formação, ou aumentar a actividade, de células T citotóxicas específicas, após a sua administração num animal. O termo "aumentar a resposta de CTL" é aqui utilizado para integrar melhoramentos em todos os aspectos da resposta de 9 CTL, tais como, por exemplo, melhorar a distribuição sistémica, nivel de actividade e longevidade da resposta de péptidos indutores de CTL. A composição da presente invenção para aumentar a resposta de CTL a um imunogénio, tal como um péptido, envolve a adição de uma composição incluindo uma classe de péptidos separada e distinta para a mistura de imunização que possui actividade de indução de células "T helper". Para obter o aumento da resposta de CTL deste modo deve administrar-se ao animal, adicionalmente ao próprio imunogénio, uma quantidade imunologicamente eficaz de um péptido contendo um epitopo de célula "T helper". É também descrito um método de identificação de uma substância candidata capaz de aumentar a resposta de CTL. Para identificar tal substância indutora do aumento, tal como um péptido, deve administrar-se a um animal tanto a substância candidata como um imunogénio capaz de induzir uma resposta de CTL. Os CTLs podem então ser recuperadas do animal e a sua actividade, incluindo distribuição sistémica e longevidade, será determinada. Uma substância candidata capaz de aumentar uma resposta de CTL seria identificada como uma substância que aumentou a resposta de CTL, utilizando qualquer dos parâmetros acima, em relação à observada na presença do imunogénio isolado.

Os métodos de imunização aqui descritos são geralmente aplicáveis para aumentar as respostas de CTL contra imunogénios de qualquer fonte, incluindo aqueles de uma vasta variedade de agentes infecciosos tais como virus ou parasitas. Contudo, em realizações preferidas, a presente revelação é exemplificada pelo aumento de resposta de CTL contra componentes da família virai de HIV. As respostas de CTL podem ser criadas contra epitopos localizados nos produtos de qualquer gene virai, tal 10 L-Cj )^· como, por exemplo, os genes gag, pol, nef e env, com os produtos dos genes env sendo os alvos preferidos.

Qualquer uma de uma vasta variedade de sequências peptídicas pode ser empregue como um epitopo indutor de CTL de acordo com a presente invenção. Estas incluem os péptidos listados na TABELA 1, que é, obviamente, uma lista exemplar e não exaustiva. Em realizações preferidas está contemplado que péptidos de um produto do gene env (envelope), e mais preferencialmente aqueles derivados da ansa V3 de gpl20 de HIV, serão empregues como péptidos indutores de CTL. Uma listagem exemplificativa de péptidos de ansa V3 de uma variedade de isolados de HIV-1 é fornecida na TABELA 2. Um exemplo especifico de um péptido derivado de ansa V3 que se revelou bem sucedido na criação de respostas de CTL é o péptido R15K, possuindo a sequência RIQRGPGRAFVTIGK (seq id no; 1). 11 TABELA 1

EPITOPOS CANDIDATOS ANTI-HIV INCLUINDO CTL

Gene Péptido Sequência Fonte de CTLs MHC/HL A Referência gag K25E 18-42 KIRLRPGGKKKYKLKHIVWASRELE Humano Bw62 Johnson et al., 1991 Q25E 69-93 QTGSEELRSLYNTVATLYCVHQRIE Humano A2 " V22F 143-164 VHQAIS PRTLNAWVKWEEKAF Humano Bw57 " N22A 153-174 NAWVKWEEKAFS PE VIPMFSA Humano Bw2 7 " S22H 173-194 SALSEGATPQDLNTMLNTVGGH Humano BI 4 G22R 193-214 GHQAAMQMLKETINEEAAEWDR Humano Bw52 N22V 253-274 NP PIPVGEIYKRWIILGLNKIV Humano B8 W K22D 263-284 KRWIILGLNKIVRMYS PTSILD Humano Bw62 Y19T 262-280 YKRWIILGLNKIVRMYS PT Murganho H-2d Michel et al., 1992 K16C 265-279 KRWIILGLNKIVRMYC Humano B27 Nixon et al., 1988 R10K 305-314 RAEQAAQEVK Humano B14 Johnson et al., 1991 Pol I25E 172-196 IETVPVKLKPGMDGPKVKQWPLTEE Humano B8 Walker et al., 1989 C15P 205-219 CTEMELEGLISLIGP* Murganho/ Humano H-2k Hosmalin et al, 1990 A25Q 325-349 AIFQSSMTKILEPFRKQNPDIVIYQ Humano All Walker et al., 1989 N25R 342-366 NPDIVIYQYMDDLYVGSDLEIGQHR Humano All " D25T 359-383 DLEIGQHRTKIEELRQHLLRWGLTT Humano Bw60 " P25Y 461-485 PLTEEAELELAENREILKEPVHGVY Humano Bw6 0 « E25G 495-519 EIQKQGQGQWTYQIYQEPFKNLKTG Humano All env L22A 25-46 LWVTVY Y GVPVWKEATT T L FCA Humano A2 Dadaglio et al., 1991 T20K 193-212 TTDYTLTSCNTSVITQACPK Humano A2 " S17I 295-312 SVEINCTRPNNNTRKSI Humano A2 " R15K 315-329 RIQRGPGRAFVTIGK Murganho/ Humano H- 2d/A2 Berzofsky et al., 1991 P7S 374-380 PEIVTHS Humano A2 Dadaglio et al., 1991 K12S 381-392 KNCGGEFFYCNS Humano A2 w L20Y 421-440 LPCRIKQFINMWQEVGKAMY Humano A2 " E9L 584-592 ERYLKDQQL Humano B14 Johnson et al., 1992 Y8L 586-593 YLKDQQLL Humano B8 " nef Q25L 73-97 QVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGL Humano A3.1 Koenig et al., 1990 I W16T 113-128 WIYHTQGYFPDWQNYT Humano B17B37 Culmann et al., 1989 D16A 176-191 DPEREVLEWRFDSRLA Murganho H-2d Michel et al., 1992 E17L 183-199 EWRFDSRLAFHHVARE1 Murganho H-2d " ‘Cys-Thr-Glu-Met-Glu-Lys-Glu-Gly-Lys-Ile-Ser-Lys-Ile-Gly-Pro 12 Γ TABELA 2 PÉPTIDOS SINTÉTICOS DA ANSA V3 DE VÁRIOS ISOLADOS DE HIV-1

PÉPTIDO NO. ESTIRPE SEQUÊNCIA D23(24aa) MN YNKRKRIHIGPGRAFYTTKNNIGC D24(15aa) MN RIHIGPGRAFYTTKN D25(15aa) WMJ-3 SLSIGPGRAPRTREI D26(24aa) RF NNTRKSITKGPGRVIYATGQIIGD D27(15aa) NY-5 GIAIGPGRTLYAREK D28(15aa) RF SITKGPGRVIYATGQ D29(15aa) CDC4 RVTLGPGRVWYTTGE D30(15aa) SC SIHIGPGRAFYATGD D31(15aa) Z3 SIRIGPGKVFTAKGG D32(15aa) SF2 SIYIGPGRAFHTTGR D33(15aa) MAL GIHFGPGQALYTTGI D34 (15aa) Z321 SISIGPGRAFFATTD D35(15aa) Z6 STPIGLGQALYTTRG D37(15aa) JY1 STPIGLGQALYTTRI D38(15aa) ELI RTPTGLGQSLYTTRS D39(15aa) MN(Y-L) RIHIGPGARFLTTKN D40(15aa) MN(Y-F) RIHIGPGRAFFTTKN D44 (15aa) (R15K) IIIB RIQRGPGRAFVTIGK 13 ' Γ

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Estão disponíveis vários métodos para identificar epitopos indutores de células "T helper", adequados para utilização de acordo com o exposto. Por exemplo, a anf ipaticidade de uma sequência de um péptido é reconhecida como exercendo a sua capacidade de funcionar como um indutor de células "T helper". Em realizações preferidas, está contemplado que se desejaria empregar um epitopo indutor de células "T helper" possuindo um valor de anfipaticidade de desde cerca de 10 positivos até 20 positivos. Outras características quantificáveis incluem, por exemplo, possuir uma curva de hélice alfa de 100 ± 15 graus, ou uma curva em hélice 3io com 120 ± 15 graus. Em realizações que se referem especificamente ao HIV, serão preferidos os péptidos indutores de células "T helper" incluindo sequências derivadas de uma sequência gpl20 de HIV que possui um valor de anfipaticidade dentro do intervalo acima.

Novamente em relação ao HIV, é preferida a utilização de péptidos contendo a sequência CRIKQIINMWQGVGKAMYA (C19A, seq id no: 2), uma vez que este péptido revelou ser particularmente eficaz no aumento de respostas de CTL. Contudo, podem ser empregues péptidos incluindo outros epitopos indutores de células "T helper". Em Patente U.S. 5 128 319 é fornecida uma discussão alargada sobre epitopos indutores de células "T helper".

Realizações relacionadas com esta invenção referem-se a composições para promover respostas de CTL melhoradas. Tais composições incluirão geralmente pelo menos três péptidos, o primeiro dos quais conterá o epitopo indutor de CTL contra o qual a resposta imunitária é especificamente desejada, e o segundo dos quais compreenderá uma sequência peptídica inibidora da infecção por HIV, que inibe a entrada de HIV numa célula alvo, e o terceiro dos quais compreenderá um epitopo indutor de células "T helper". Naturalmente, uma combinação de uma tal 14 t r composição na qual os péptidos são dispersos num veiculo farmacologicamente aceitável seria uma formulação ideal para utilização como uma vacina. A identificação de péptidos sintéticos que protegem células humanas de infecção por HIV-1 é também aqui descrita. Tais péptidos inibidores podem ser empregues para inibir infecção de células por HIV, para utilização, por exemplo, em protocolos de ensaio e como agentes terapêuticos para utilização no tratamento de SIDA.

Como aqui utilizado, o termo "sequência inibidora de infecção por HIV" refere-se a uma sequência peptídica que previne a entrada do virus HIV na sua célula alvo. Deste modo, um péptido inibidor pode ser caracterizado como incluindo uma sequência peptídica que está envolvida no processo de infecção, ou que funciona para contactar a célula alvo. Péptidos inibidores de infecção incluem particularmente péptidos que compreendem uma sequência em que anticorpos contra essa sequência são capazes de inibir infecção celular por HIV. A presente invenção revela que péptidos sintéticos com sequências derivadas de um produto do gene env de HIV-1, gpl20, possui a capacidade de inibir infecção celular por HIV. Em particular, os inventores identificaram sequências inibidoras de infecção por HIV na ansa V3 e nas regiões do terminal N de gpl20. Está também contemplado que as sequências inibidoras de infecção por HIV podem revelar estar localizadas na região de ligação a CD4.

Em realizações preferidas, os inventores contemplaram a utilização de péptidos inibidores de infecção por HIV, com sequências derivadas da ansa V3 de gpl20. Como aqui detalhado, os péptidos que se revelaram úteis a este respeito incluem, por 15 ' I—Ιι . exemplo, os péptidos da TABELA 11, e particularmente os péptidos D23, D24, D25, D26, D30, D35, D38, D39, D40 e D44 (R15K), cujas sequências são apresentadas na TABELA 11A. Estes péptidos possuem sequências derivadas das ansas V3 de uma variedade de estirpes tais como mn, rf, wmj-3, sc, z6, eli, mn (y-1) e mn (y-p) . Péptidos inibidores de infecção derivados de V3 preferidos estão contemplados para incluir os listados na TABELA 11A e aqueles tais como R15K, possuindo a sequência RIQRGPGRAFVTIGK (seq id no:l), e também N24G, possuindo a sequência NNTRKSIRIQRGPGRAFVTIGKIG (SEQ ID N0:3).

Um aspecto importante da presente invenção é a descoberta de que péptidos com sequências que correspondem a sequências de uma variedade de isolados de HIV diferentes possuem a capacidade de inibir a infecção de células por HIV. Além dos apresentados na TABELA 11A, estes péptidos incluem, por exemplo, H13N (HIGPGRAFYTTKN, seq id no:7), um péptido de ansa V3 da estirpe HIV-lmn, e T13Q (TKGPGRVIYATGQ, seq id no:6), um péptido de ansa V3 da estirpe HlV-lrf. Contudo, em relação à TABELA 11, é importante notar que estes resultados foram compilados a partir de ensaios especificamente dirigidos para inibir a infecção por uma estirpe de HIV, nomeadamente HIV-1 IIIB. Por isso, péptidos como D27, D28, D29, D31, D32, D33, D34 e D37, listados na TABELA 11B, que podem não apresentar actividade num ensaio inibitório específico, podem ter ainda utilidade na prevenção de infecção de células alvo por uma variedade de outras estirpes de HIV, por exemplo, contra as estirpes de HIV ny-5, rf, cdc4, z3, sf2, mal, z321 e jyl.

Os inventores também identificaram péptidos do terminal N de gpl20, tal como E13V, possuindo a sequência EQLWVTVYYGVPV (seq id no:4), como péptidos inibidores de infecção. Isto é uma descoberta importante uma vez que esta área de gpl20 é 16 reconhecida como sendo relativamente conservada entre diferentes estirpes de HIV.

Deve também ser notado que péptidos mais pequenos que incluem porções destas sequências, tais como, por exemplo, R8K, possuindo a sequência RAFVTIGK (seq id no:5), têm também sido identificados como possuindo sequências inibidoras de infecção. Deste modo, péptidos mais pequenos e fragmentos de péptidos são considerados úteis de acordo com o exposto estando no âmbito desta invenção.

Os péptidos inibidores de infecção da presente invenção podem incluir variações de sequência naturais, ou construídas, e ainda assim funcionarem na prevenção da entrada de HIV nas células. Deste modo, os equivalentes funcionais biológicos dos péptidos nas TABELAS 1, 2 e 11, e os péptidos tais como R15K, N24G, E13N e T13Q são também considerados como caindo dentro do âmbito da presente invenção.

Tais equivalentes de péptidos funcionais biológicos podem incluir alterações baseadas no índice hidropático dos aminoácidos. Crê-se que o carácter hidropático relativo do aminoácido determina a estrutura secundária da proteína ou péptido resultante, que por sua vez define a sua interacção com outras moléculas, tais como por exemplo, receptores, anticorpos e afins. É geralmente conhecido que certos aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoácidos possuindo um índice ou valor hidropático semelhante e ainda resultar num péptido com actividade biológica semelhante (Kyte & Doolittle, 1982).

Os índices hidropáticos dos aminoácidos são: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptofano (- 17

V L-Ci ^8> ^ 0,9); tirosina (-1,7); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); e arginina (-4,5). Os equivalentes funcionais biológicos são considerados os péptidos que incluem a substituição de aminoácidos cujos índices estão dentro de ±2, e mais preferencialmente dentro de ±1, e ainda mais preferencialmente, dentro de ±0,5. A substituição de aminoácidos semelhantes pode também ser feita na base da hidrofilicidade, particularmente quando a proteína funcional biológica equivalente ou péptido assim criado é pretendido para utilização em realizações imunológicas, como é o caso para a presente invenção. A Patente U.S. 4 554 101 afirma que a maior hidrofilicidade média local de uma proteína, como governada pela hidrofilicidade dos seus aminoácidos adjacentes, correlaciona-se com. a sua imunogenicidade e antigenicidade, i.e. com uma propriedade biológica da proteína.

Como detalhado na Patente U.S. 4 554 101, os seguintes valores de hidrofilicidade foram atribuídos aos resíduos de aminoácidos: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0±1); glutamato (+3,0 ± 1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); prolina (-0,5); treonina (-0,4); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5); triptofano (-3,4). De modo semelhante, equivalentes funcionais biológicos são considerados ser aqueles péptidos que incluem a substituição de aminoácidos cujos valores de hidrofilicidade estão dentro de ±2, e mais preferencialmente dentro de ±1, e ainda mais preferencialmente, dentro de ±0,5. 18

V L-Cj

Como acima sublinhado, as substituições de aminoácidos são, por isso, geralmente baseadas na semelhança relativa dos substituintes da cadeia lateral do aminoácido, por exemplo, a sua hidrofobicidade, hidrofilicidade, carga, tamanho e afins. Substituições exemplificativas que tomam várias das caracteristicas referidas em consideração são bem conhecidas dos especialistas na técnica e incluem: arginina e lisina; glutamato e aspartato; serina e treonina; glutamina e asparagina; e valina, leucina e isoleucina.

Adicionalmente às sequências especificas acima descritas, e aos seus equivalentes funcionais biológicos, podem ser empregues outras sequências como péptidos inibidores de infecção por HIV. Por exemplo, como acima mencionado, está contemplado que qualquer sequência em que anticorpos antipéptido contra essa sequência tenha demonstrado inibir a entrada virai nas células, será um péptido inibidor de infecção de HIV adequado para utilização de acordo com o exposto. As vantagens da presente invenção incluem a demonstração de que tais péptidos podem funcionar eficazmente a baixas concentrações, tais como entre cerca de 1 μρ/πιΐ até cerca de 1 ng/ml.

Em qualquer dos casos, à luz da presente revelação, as sequências candidatas com o potencial para funcionar como péptidos inibidores de infecção por HIV podem agora ser identificadas e testadas. Tais péptidos candidatos provavelmente incluirão sequências localizadas na ansa V3 de gpl20 ou na região do terminal N, ou mesmo na região de ligação a CD4 de gpl20, e preferencialmente serão sequências contra as quais foram criados anticorpos e mostraram inibir ou reduzir infecção celular por HIV. As sequências candidatas podem ser sintetizadas como péptidos e testadas quanto à capacidade de inibir infecção celular por HIV. 19 p U, ^

Como discutido acima, nas composições da presente invenção, péptido(s) contendo epitopo(s) indutores de CTL mais sequência(s) inibidora(s) de infecção por HIV podem ser combinados com péptido(s) incluindo epitopo(s) indutor(es) de células "T helper" para criar formulações para imunização ou vacina. Em relação a misturas de péptidos para imunização, é geralmente preferida a utilização de péptidos com sequências que correspondem às áreas mais conservadas de gpl20 de HIV. Adicionalmente e especificamente em relação ao HIV, o(s) péptido(s) indutores de CTL podem ser combinados com sequência(s) inibidoras de infecção por HIV, como formulações terapêuticas.

Contudo, e de grande importância, as composições compreendendo todas as três classes distintas de péptido aqui

identificadas estão também contempladas pela presente invenção. Tal formulação única seria capaz de prevenir a infecção de células humanas por HIV-1 e de induzir respostas de CTL especificas para HIV-1. Uma vez que todas estas formulações são completamente sintéticas e definidas, estes reagentes serão económicos e seguros.

Naturalmente, qualquer dos péptidos pode possuir mais do que uma actividade imunológica. Este fenómeno é exemplificado pelo péptido R15K que possui propriedades de inibição de infecção e de indução de CTL. Nas realizações mais preferidas, está contemplado que serão empregues os péptidos que não induzem a produção significativa de anticorpos que se ligam ao HIV nativo. Adicionalmente ao facto de serem utilizados directamente como monómeros, os péptidos da presente invenção podem também ser formulados como polímeros ou péptidos de cauda lipídica.

Também são aqui descritos métodos para ensaiar uma composição quanto à sua capacidade de induzir uma resposta de 20 t Γ célula Τ citotóxica (CTL) num animal. Relacionado com este aspecto estão os métodos para ensaiar uma composição quanto à sua capacidade para aumentar uma resposta de CTL induzida por uma componente distinta. Estes métodos de pesquisa incluem geralmente imunizar um animal, tal como um sujeito humano ou um animal experimental tal como um murganho, rato, coelho, cobaia, cabra, macaco rhesus, ou chimpanzé, posteriormente recolher células de nódulos da linfa ou outro tecido linfóide do animal, e depois testar o tecido quanto à presença de CTLs que são iniciados para matar ou lisar as células produtoras de um componente de um agente infeccioso, tal como um envelope virai, proteína do núcleo, uma das proteínas funcionais (p.ex. transcriptase reversa) ou afins.

Assim, este método inclui geralmente três passos, envolvendo o primeiro passo a imunização de um animal com a composição a ser testada. Embora se creia que pode ser empregue qualquer modo ou via de imunização aceite e mesmo assim alcançar algumas das vantagens de acordo com o exposto, os inventores encontraram vantagens particulares associadas à imunização intradérmica. A imunização intradérmica crê-se ser preferida porque serve para activar mais eficientemente o braço do sistema imunitário mediado pela célula. Para além disso, embora quando desejável se possam escolher injecções múltiplas da substância de imunização, e mesmo sítios múltiplos de injecção, os inventores observaram que uma vantagem particular da invenção é que uma injecção única do candidato será usualmente suficiente para alcançar activação de CTL detectável num nódulo linfático próximo. Além disso, embora quando desejado se possam empregar modificadores de imunização tais como sequências de péptido de célula "T helper", estruturas lipídicas que indpzem a formação de micelas, métodos de polimerização de péptidos, ou afins em associação com a composição candidata, os inventores observaram que a sensibilidade do ensaio é tal que a utilização de tais 21 modificadores geralmente não são requeridos de modo a obter iniciação de CTL.

Uma vez efectuada a imunização será então necessário recuperar as células T citotóxicas do tecido linfóide do animal imunizado. 0 tecido linfóide preferido será tecido do nódulo linfático, e mais preferencialmente tecido de nódulos linfáticos de drenagem próximos do sitio de injecção. Como aqui utilizado, o termo "nódulo próximo" pretende referir o nódulo ou nódulos que estão localizados próximo do sitio de injecção, p. ex. o nódulo popliteo do murganho após injecção na almofada da pata. Crê-se que a utilização de tecido de nódulo próximo ou de drenagem para identificar activação de CTL é uma razão para a rapidez dos aspectos mais preferidos da presente revelação. Tais nódulos estão fisicamente localizados na proximidade do sitio de imunização, ou na área de drenagem do sitio de imunização, e também estão incluídos os nódulos de drenagem que estão fisicamente a uma maior distância do sítio de imunização. 0 passo final do ensaio no seu sentido mais geral envolve determinar se as referidas células T citotóxicas foram activadas pela composição. Embora não seja geralmente requerido, será tipicamente preferido medir na realidade o nível de activação através de, p. ex., ensaios de libertação de crómio radioactivo, ou outros ensaios com radioisótopos, ou ensaios de célula única; também podem ser empregues ensaios de célula citotóxica única utilizando corantes e/ou seleccionadores celulares.

Quando é desejável a medição da activação de células T citotóxicas, um método preferido envolve colocar em contacto uma quantidade mortalmente eficaz das referidas células T citotóxicas com células alvo semelhantes a MHC, que exibem o epitopo candidato nas suas superfícies celulares; mantendo o referido contacto durante um período de tempo suficiente para as 22 f- u K-t referidas células T citotóxicas lisarem as referidas células alvo; e determinar o grau de lise mediada por células T das referidas células alvo. Contudo, pode ser empregue qualquer método capaz de detectar uma resposta de CTL especifica, incluindo mas não estando limitado a, ensaios de libertação de crómio, ensaios de célula única ou mesmo determinação de conjugados célula-célula.

Uma vantagem da presente técnica é a velocidade com a qual se é capaz de determinar a capacidade da substância candidata activar CTLs. Técnicas anteriores têm geralmente requerido uma espera de algumas semanas (Kast et al., 1991; Aichele et al., 1990). A presente técnica, contudo, requer tipicamente apenas cerca de 7 a 10 dias após imunização. Crê-se que a razão para o tempo reduzido necessário para atingir uma resposta de CTL com o ensaio de presente invenção é o resultado da da via de imunização e a utilização de células do nódulo linfático de drenagem ou próximo. Outra vantagem é a capacidade de testar candidatos a péptidos sem a utilização de um modificador associado, tal como moléculas de transporte, caudas lipidicas, ou epitopos de células "T helper", para aumentar a sua actividade de CTL.

Tipicamente, a composição a ser testada quanto à capacidade de iniciar CTL compreenderá um ou mais péptidos, ou multímeros de péptidos, que se crê que possuam ou que se suspeite que possuam actividades úteis. Através da aplicação das técnicas da presente revelação a tais péptidos, é assim possível determinar se tais péptidos possuem de facto actividade iniciadora de CTL. Se for esse o caso, então o péptido será um candidato para inclusão numa vacina iniciadora de CTL. Será entendido pelos especialistas na técnica que embora os candidatos para actividade de iniciação de CTL compreendam geralmente péptidos (ou proteínas), a utilização do ensaio da presente invenção no 23

V

U, contexto de compostos não peptídicos não está certamente excluída.

Propõe-se que o método terá uma vasta gama de aplicações, particularmente na identificação de componentes para utilização na preparação de vacinas para o tratamento e/ou prevenção de SIDA. Por isso, no caso de realizações dirigidas para a identificação de epitopos para promover uma resposta de CTL específica anti-HIV, a presente revelação tratará geralmente a identificação de péptidos possuindo a capacidade de dirigir uma resposta de CTL a células infectadas por HIV.

No contexto de desenvolvimento de vacinas, o método incluirá primeiro identificar uma composição reactiva com CTL de acordo com o método apresentado, e misturar a composição com um ou mais diluentes ou aditivos farmaceuticamente aceitáveis, tais como água, sais, emulsificantes e/ou adjuvantes. Obviamente, a quantidade de composição adicionada à vacina variará dependendo da sua capacidade para induzir uma resposta de CTL específica, da sua solubilidade e de outras respostas biológicas. A selecção de uma quantidade apropriada da composição iniciadora de CTL identificada estará assim bem dentro da especialidade da técnica à luz da presente revelação.

Noutras realizações, a invenção envolve um método para preparar células T citotóxicas. No seu sentido mais geral, este método inclui imunizar, preferencialmente por via intradérmica, um animal com uma composição possuindo a capacidade de induzir uma resposta de células T citotóxicas para um epitopo pré-seleccionado de uma proteína alvo. 0 epitopo ou epitopos empregues podem induzir substancialmente ou não anticorpos que terão reacção cruzada com a proteína alvo. Contudo, na prática desta aspecto da invenção, é tipicamente desejável recuperar os nódulos linfáticos de células T citotóxicas do animal para 24

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t utilização posterior. São visionadas numerosas potenciais utilizações de CTLs especificamente iniciados. Por exemplo, no caso de terapia humana, está contemplado que CTLs especificamente iniciados podem ser cultivados e administrados a humanos para o tratamento de infecção por HIV. Neste caso, os CTLs são preparados por imunização de espécies in vivo e isolamento de células imunes para expansão in vitro na presença do péptido apropriado, citoquinas e células de apresentação.

Tipicamente, para a indução de uma resposta de CTL dirigida contra HIV, a invenção envolverá a utilização de péptidos que compreendem de 7 até cerca de 30 resíduos de aminoácidos, e possuem uma sequência que corresponde a um domínio de uma proteína de HIV tal como as proteínas do envelope gpl20 e do núcleo, transcriptase reversa, tat, rev ou outros produtos de genes expressos pelo vírus, cujo péptido inclui uma região conservada na sua estrutura.

Para a preparação de vacinas, são geralmente preferidos multímeros de péptidos de modo a incluir epitopos múltiplos de CTL num único complexo. São reveladas suas classes específicas de multímeros de péptidos. Numa classe, o resíduo do terminal amino de um péptido está ligado por ligação peptídica a um péptido espaçador que contém um resíduo lisilo no terminal amino e uma até cerca de cinco resíduos de aminoácidos tais como resíduos glicilo para formar um polipéptido compósito. Estes resíduos adicionados do péptido espaçador não interferem com a capacidade de imunização do multímero, nem com a sua capacidade para formar micelas tipo tensioactivo em composições aquosas. Os grupos amino alfa e epsilon do resíduo do terminal amino são amidificados com um ácido gordo C12-C18 tal como ácido palmítico para formar o produto de reacção que é utilizado. A di-amida assim formada forma multímeros micelulares tipo tensioactivo numa composição aquosa. 25 Γ

Uma segunda classe de multímero é um polímero possuindo um péptido como uma unidade repetida. Neste caso, cada péptido é sintetizado de modo a conter um resíduo de cisteína (Cys) em cada um dos seus terminais amino e carboxilo. O péptido com terminação di-cisteína (di-Cys) resultante é então oxidado para polimerizar os monómeros do péptido di-Cys num polímero ou multímeros de péptido cíclico no qual as unidades de péptido repetidas são ligadas por resíduos de cisteína (cisteína oxidada).

Um péptido multímero de qualquer das classes pode conter uma ou uma pluralidade de diferentes sequências peptídicas. Um péptido ou um multímero é um péptido "activo" no sentido em que, quando utilizado numa composição discutida abaixo, o multímero pode induzir imunidade mediada pela célula tal como a produção de células T citotóxicas. Um multímero pode também incluir um péptido inactivo, por exemplo para auxiliar na dispersão do multímero no meio aquoso. 0 péptido espaçador contendo lisilo discutido anteriormente pode ser visto como um péptido inactivo. 0 multímero peptídico é utilizado numa composição aquosa (inoculo). Esta composição contém água possuindo nela disperso um multímero anteriormente descrito. A composição, quando utilizada para imunizar um animal hospedeiro imunocompetente tal como um murganho, possui a capacidade de induzir imunidade mediada pela célula tal como activação de células T citotóxicas para a proteína de HIV nativa correspondente em sequência à de um péptido activo do multímero, mas não induz substancialmente produção de anticorpos que imunorreagem com essa proteína de HIV nativa correspondente. A composição contém assim uma quantidade eficaz de um péptido multimérico anteriormente discutido para imunização. 26

DESCRIÇÃO BREVE DAS FIGURAS FIGURA 1. A proliferação in vitro de células do nódulo linfático popliteo (PLN) após imunização in vivo de murganhos Balb/c.. Os murganhos Balb/c foram imunizados com uma composição aquosa contendo uma quantidade imunologicamente eficaz de um polímero de multímero peptídico desta invenção preparado a partir de cada um dos péptidos 61, 63, 65 e 67. Foi utilizado como controlo, como apresentado, um derivado da proteína tuberculina purificada (PPD). Foi utilizado para estes estudos uma incorporação de 3H-timidina (3H-TdR). Os resultados são ilustrados como um índice de estimulação, que é calculado como o aumento em número de vezes na contagem de radioactividade na presença do antigénio peptídico em comparação com os valores de fundo quando não é adicionado antigénio. Os detalhes deste estudo são aqui discutidos adiante. FIGURA 2. Proliferação de células T (incorporação de 3H-TdR) de células PLN após imunização de murganhos B6C3 F1 com uma composição aquosa contendo uma quantidade imunologicamente eficaz de um polímero de multímero peptídico desta invenção, preparado a partir de cada um dos péptidos 61, 63, 65 e 67. Um péptido não relacionado, PPD e gpl60, foram utilizados como controlos. Os resultados são apresentados como a incorporação de 3H-TdR [delta (Δ) contagens por minuto (cpm)] obtidas subtraindo os valores de radioactividade no poços controlo sem antigénio adicionado aos dos poços com antigénio. Os detalhes deste estudo e os dos estudos das FIGURAS 3-5 são aqui discutidos adiante. FIGURA 3. Como na FIGURA 2, excepto terem sido utilizados murganhos A.SwxBalb/c F1 como animais hospedeiros. 27

L-Cj FIGURA 4. Como na FIGURA 2, mas utilizando multimeros preparados a partir dos péptidos 103 a 117 (a a o, respectivamente) para imunizar murganhos B6C3 Fl. FIGURA 5. Como na FIGURA 4, excepto terem sido novamente utilizados murganhos A.SwxBalb/c como animais hospedeiros. FIGURA 6. Proliferação de células PLN de murganhos B6C3 Fl por incorporação de 3H-TdR utilizando concentrações variáveis de multimero peptidico e gpl20 como antigénios. Painel A, foi preparado um polímero de multimero peptidico a partir dos péptidos 10; Painel B, um multimero preparado a partir do péptido 106. Foram utilizados como controlos PPD e péptido não relacionado. É aqui apresentada mais adiante uma discussão posterior relacionada com as FIGURAS 6-8. FIGURA 7. Proliferação de células PLN de murganhos B6C3 Fl utilizando várias concentrações de gpl60 e polímeros de multimeros peptídicos preparados a partir de péptidos 61 (Painel A) e 63 (Painel B) como antigénios, com PPD, e um péptido não relacionado como controlos. FIGURA 8. Proliferação de células PLN de murganhos B6C3 Fl utilizando várias concentrações de gpl20 e polímeros de multimeros peptídicos preparados a partir de péptidos 65 (Painel A) e 111 (Painel B) como antigénios, com PPD, e um péptido não relacionado como controlos. FIGURA 9. Actividade de CTL de células de nódulo linfático poplíteo (PLN) de murganhos Balb/c após imunização com o péptido R15K da ansa V3 de env de HIV (aa 315-329) em três formas. A, monómero linear; B, polímeros ligados por dissulfureto formados por resíduos de cisteína adicionados a ambos os terminais N e C; C, micelas com caudas lipídicas formadas por conjugação com uma 28

I p L· ^ dipalmitil-lisina-glicina-glicina no terminal N (Hopp, 1984; Sastry et al., 1991). Foram imunizados murganhos Balb/c (6-8 semanas de idade) na almofada da pata posterior com o péptido (100 μρ numa emulsão 1:1 com CFA) . Após 10 dias, as células obtidas de PLN foram re-estimuladas in vitro durante 5 dias com células de baço de murganho singeneicas irradiadas (3300 rads), que tinham sido pré-tratadas com a forma monomérica do péptido (40 μρ/ηηΐ) durante 2 h a 37°C. as misturas de células foram mantidas em 5-10 ml de meio de Click (Click et al., 1972) suplementado com soro de vitelo fetal a 10% (FCS) e 2-mercaptoetanol a 50 μΜ, depois lavadas três vezes com meio RPMI 1640, FCS a 10%. A actividade de CTL foi determinada por ensaio de libertação de 51Cr (Platsoucas & Good, 1981) contra células alvo singeneicas (P815) com ou sem pré-tratamento com a forma monomérica do péptido durante 2 h a 37°C. FIGURA 10. CTLs de murganhos Balb/c imunizados in vivo com quaisquer péptidos tipo R15K reconheceram células alvo semelhantes a MHC que foram pré-tratadas com monómeros de péptido (P815+péptido) ou infectadas com vírus vaccinia recombinante expressando a proteína do envelope de HIV IIIB, gpl60 (P815+VPE16) . A imunização dos murganhos e o pré-tratamento das células alvo P815 com péptido foram realizados como na FIGURA 9. 5 x 106 células alvo P815 foram infectadas com 5 x 107 unidades de formação de placas do controlo (VSC8) ou do vírus vaccinia recombinante expressando a proteína do envelope de HIV (VPE16) durante 18-20 horas antes da marcação com 100 μΟΐ de 51Cr (ICN Radiochemicals, Irvine, CA). A actividade citotóxica foi determinada por ensaio de libertação de 51Cr (Platsoucas & Good, 1981). FIGURA 11. CTLs iniciados por imunização in vivo com a forma monomérica ou com a forma de micela com cauda lipídica do 29

V péptido R15K da ansa V3 de HIV são positivos para CD8. Células PLN re-estimuladas (como na FIGURA 9) foram tratadas juntamente com o complemento (+C) ou com quer anticorpo monoclonal anti-CD4 (clone GK-1.5) mais C (+ anti CD4-C), quer anticorpo monoclonal anti-CD8 (clone 53-6.72) mais C (+anti CD8+C) como em (Platsoucas & Good, 1981). As células resultantes foram então testadas quanto à sua capacidade para lisar células alvo semelhantes a MHC que foram pré-tratadas com a forma monomérica do péptido (P815+péptido) ou infectadas com virus vaccinia recombinante expressando proteína do envelope de HIV IIIB, gpl60 (P815+VPE16). FIGURA 12. Actividade de células do baço de murganhos imunizados com R15K/R15K + Th. Murganhos Balb/c de 6-8 semanas de idade foram imunizados na almofada na pata posterior com 100 μg do péptido R15K isolado ou 100 pg de um péptido de células "T helper" (Th) emulsif içado em CFA. Às 2, 3 ou 4 semanas após imunização foram recolhidas as células PLN e do baço dos murganhos e re-estimuladas durante 5 dias com células do baço de murganho singeneico irradiado, pré-tratadas com R15K durante 2 horas. Foi realizado um ensaio padrão de libertação de 51Cr durante 4 horas, como descrito por Sastry et ai. (1992). São apresentados resultados representativos de células PLN (A) e do baço (B), e demonstram que um péptido de células "T helper" da proteína env de HIV aumenta a resposta de CTL sistémica ao péptido da ansa V3 de R15K (seq id no:l). FIGURA 13. 0 péptido R15K inibe a infecção de células ' T humanas (MT-4) por HIV-1. As células MT-4 são células T humanas, que são infectadas cronicamente pelo vírus tipo 1 da leucemia de células T humanas e sofrem infecção lítica por HIV-1 (Larder et ai., 1989). Por isso, a inibição de infecção de células MT-4 com HIV-1 prevenirão a morte celular. Nestas experiências, células MT-4 (5x104/100 μΐ) foram pré-incubadas em poços em triplicado de 30 placas de microtitulação com 96 poços, com várias concentrações do péptido R15K durante 15 minutos a 37°C, e confrontadas com HIV-1. Os controlos incluíram células isoladas e células infectadas por HIV-1, mas sem o péptido adicionado. Sete dias após incubação, o número total de células viáveis foi determinado utilizando o ensaio de redução do corante MTT de Larder et al. (1989). A linha marcada sem vírus apresenta o efeito de várias concentrações de péptido na sobrevivência de células MT-4 na ausência de infecção por HIV-1. A linha marcada com "+vírus" apresenta o efeito protector do péptido R15K (seq id no:l) FIGURA 14. 0 péptido R15K inibe a infecção de células MT-4 por HIV-1, como medido através de um ensaio de transcriptase reversa. Nestas experiências, as células MT-4 foram infectadas como na FIGURA 13, mas em vez de medir o efeito citopático, a quantidade de actividade de transcriptase reversa (RT) no meio de cultura foi determinada sete dias após infecção pelo método de Popovic et al. (1984). FIGURA 15. 0 péptido R15K inibe a infecção das linhas de células T humanas CEM e H9, por HIV-1. As células CEM e H9 (lxlO5 células/poço) foram infectadas por HIV-1 em poços em triplicado, em experiências separadas, numa placa de 48 poços na presença ou ausência de várias concentrações de péptido R15K. Sete dias após infecção, a actividade de transcriptase reversa (RT) no sobrenadante da cultura foi medida pelo método de Popovic et al. (1984). FIGURA 16. Péptidos da ansa V3 inibem a infecção de células T humanas primárias por HIV-1. Células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) de dadores saudáveis seronegativos para o HIV-1, foram separadas por centrifugação em Ficoll-hipaque. Foi utilizada coloração E em roseta para a preparação de uma 31

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população de linfócitos enriquecida em células T por Mannhalter et al. (1986). As células T (lxl06/ml) foram incubadas em poços em triplicado em placas de microtitulação de 96 poços apenas com meio ou péptido controlo não relacionado (correspondendo a uma sequência no produto do protooncogene c-mos) ou vários péptidos de ansa V3 a uma concentração de 1 μς/ττιΐ. Outros péptidos são: H13N, péptido da ansa V3 da estirpe HlV-lmn (seq id no:7); T13Q, péptido da ansa V3 da ansa V3 da estirpe HlV-lrf (seq id no: 6); R8K, um péptido de 8 aminoácidos da ansa V3 da estirpe HIV-1 IIIB (seq id no:5); N24G, um péptido de 24 aminoácidos para a ansa V3 de HIV-1 IIIB (seq id no:3); e R15K, um péptido de 15 aminoácidos para a ansa V3 de HIV-1 IIIB (seq id no:l). Após 9 dias, a actividade de transcriptase reversa no sobrenadante da cultura foi determinada de acordo com o método de Popovic et al. (1984) . FIGURA 17. Estabilidade no soro do péptido R15K: 0 péptido R15K (seq id no:l) foi incubado a 37°C com soro de bovino fetal a uma concentração de 100 μς/ιηΐ durante 24 horas. A diferentes intervalos de tempo, fracções de mistura péptido/soro correspondentes a uma concentração final de 1 μg/ml foram adicionadas a células MT-4 numa placa de microtitulação de 96 poços. Após 15 minutos de incubação com o péptido, as células MT-4 foram infectadas por HIV-1 como descrito na FIGURA 13. Sete dias após infecção, o número total de células viáveis foi determinado pelo método de redução do corante MTT (Larder et al., 1989). Os controlos incluíram células incubadas em meio isolado com ou sem infecção por vírus e células infectadas por vírus e incubadas com péptido R15K que não foi pré-incubado em soro de vitela fetal. FIGURA 18. O péptido E13V (seq id no:4) do domínio terminal amino de gpl20 inibe infecção por HIV-1 de células T humanas 32 Γ primárias. Os detalhes experimentais são os mesmos da FIGURA 1.6 excepto que nesta experiência foram utilizadas diferentes concentrações do péptido E13V em vez de R15K. DESCRIÇÃO DETALHADA DAS REALIZAÇÕES PREFERIDAS A SIDA é uma doença altamente infecciosa e fatal causada por um grupo de retrovirus intimamente relacionados, geralmente conhecidos como HIV. Presentemente não existem vacinas para prevenir a infecção por HIV, nem agentes terapêuticos eficazes para parar a progressão uma vez iniciada a infecção. A presente invenção dirige-se a ambas estas lacunas presentes através da utilização de tecnologia de péptidos no desenvolvimento de formulações para vacinação anti-viral e tratamento.

Inicialmente, os presentes inventores desenvolveram um método rápido para a identificação de péptidos que possuem a capacidade de induzir uma resposta de CTL especifica in vivo. Este método é amplamente aplicável a detecção e vacinação, e é relevante para o desenvolvimento de vacinas preventivas, não apenas para a SIDA, mas também para uma vasta variedade de outras doenças. Estes métodos de indução de CTL foram então refinados, através da adição de péptidos indutores de células "T helper", levando a composições e métodos particularmente eficazes para produzir actividade de CTL sistémica, de longa duração e de nível alto, em resposta a imunização com péptido.

Adicionalmente a formulações de vacina, os inventores também identificaram sequências peptídicas que funcionam para inibir eficazmente a entrada de HIV em células alvo humanas. É visionado que estes péptidos, que param a infecção virai, formarão a base para terapêuticas eficazes anti-HIV que interrompem a dispersão do vírus e a progressão da doença em doentes infectados por HIV. 33 Γ ^ É geralmente preferida a utilização de péptidos, por exemplo, em vez de proteínas, em realizações clínicas, por várias razões. Estas incluem o baixo custo e a facilidade relativa de preparação em grande escala, e a fiabilidade do produto. Também são preferidas as suas propriedade biológicas, tais como a facilidade com a qual os péptidos podem penetrar nos tecidos, e a sua baixa imunogenicidade. Antes da utilização clínica, os péptidos podem ser estabilizados através da adição de grupos dos terminais N ou C, por exemplo, por acilação ou amidação. A formulação dos péptidos da presente invenção em vários polímeros é discutida em detalhe abaixo. É também aqui discutido um método novo e rápido para pesquisar compostos candidatos, tais como péptidos ou multímeros destes, para identificar compostos activos indutores de CTL apropriados para utilização, por exemplo, em vacinas de CTL. Em procedimentos de pesquisa preferidos, os péptidos candidatos ou multímeros peptídicos são ensaiados para indução de CTL in vivo injectando a substância teste num animal experimental, recuperando as células T dos nódulos linfáticos e medindo a actividade (iniciação) de tais CTLs. Uma imunização mais preferida envolverá uma única injecção intradérmica do péptido teste em adjuvante completo de Freund (CFA) num sítio apropriado, tal como a almofada da para posterior de um murganho, recuperando células T do nódulo linfático, preferencialmente dos nódulo linfáticos do poplíteo de drenagem (PLN), e determinar a sua actividade de CTL ensaiando a lise mediada por células T de células alvo semelhantes a MHC decoradas com o péptido candidato ou expressando a proteína que o originou. Este procedimento permite que os resultados sejam obtidos em apenas 8-10 dias após imunização. O emprego de tal procedimento de pesquisa resultará na identificação de péptidos activos de células T, quer sejam 34 Γ 1^—'sj péptidos que induzem substancialmente apenas uma resposta de CTL, ou também induzam uma resposta de anticorpos (i.e., reactiva para células B). Podem ser utilizadas para estas pesquisas uma pluralidade de estirpes de murganhos que variam nos seus genes de histocompatibilidade. Os péptidos que possuem uma resposta alargada nos vários genótipos MHC devem ser seleccionados para estudo posterior em primatas, e finalmente em humanos. Procedimentos de ensaios exemplificativos são aqui encontrados adiante. A síntese de péptidos pode ser realizada utilizando um sintetizador de péptidos automatizado. Por exemplo, os péptidos podem ser sintetizados utilizando o método de Merrifield em fase sólida (Merrifield, 1963), seja num sintetizador de péptidos automático Vaga 250 modificado, ou pelo método de "Saco", como descrito por Houghton et al. (1985). Após as reacções de síntese, os péptidos completos são então recuperados. Nos dois métodos acima isto envolve a remoção dos grupos bloqueadores T-BOC e a hidrólise do péptido da resina utilizando tratamento com ácido fluorídrico (HF) a 0°C durante 1 hora. Os vários subprodutos orgânicos podem então ser removidos, por exemplo por extracção com éter, e os péptidos extraídos da resina suporte com um reagente tal como ácido acético a 25%.

No método de pesquisa rápido para a identificação de compostos candidatos indutores de CTL apropriados, os inventores descobriram que a imunização intradérmica de um murganho pode ser empregue vantajosamente. Crê-se que a imunização intradérmica seja particularmente eficaz na medida em que serve para activar eficazmente o membro mediado pela célula do sistema imunitário. Os inventores descobriram que aspectos ainda mais vantajosos deste protocolo de imunização são (i) que uma injecção única do candidato será normalmente suficiente para atingir activação de CTL detectável, e (ii) que a sensibilidade 35 do ensaio é tal que a utilização dos modificadores de imunização geralmente não são necessários para a obtenção de iniciação de CTL.

De acordo com o exposto, em realizações de pesquisa preferidas, os murganhos são imunizados por injecção intradérmica na almofada da pata posterior com uma composição apropriada, tal como 100 μq do péptido teste numa emulsão 1:1 com adjuvante de Freund completo (CFA). Após um período de tempo suficiente para induzir uma resposta de CTL, tal como 10 dias, os nódulos linfáticos do poplíteo de drenagem (PLN) são removidos cirurgicamente e as células são separadas por homogeneização suave. As células PLN assim obtidas, tipicamente entre 10-50 x 106 células/nódulo linfático/murganho, são mantidas em 5-10 ml de uma solução tal como meio de Click, FCS a 10%, 2-mercaptoetanol a 50 μΜ, e re-estimuladas durante 5 dias, in vitro, com células do baço de murganho singeneicas irradiadas (3300 rads) pré-tratadas com o péptido candidato. Uma célula singeneica expressando a proteína original a partir da qual o péptido é derivado, tal como a proteína gpl60 de HIV, seria apropriada como uma célula alvo. Contudo, os inventores contemplam que podem ser preferidas para utilização células de baço decoradas com o péptido que podem ser criadas facilmente, por exemplo pré-tratando as células com o monómero do péptido a uma concentração de aproximadamente 40 μρ/πιΐ durante 2 horas a 37°C,.

As células eficazes re-estimuladas são então lavadas, por exemplo com meio RPMI 1640, TCS a 10%, ressuspendidas a uma densidade de células apropriada na região de 5 x 106/ml, e ensaiadas para actividade de CTL. Um método adequado de ensaiar a actividade de CTL é determinar a libertação de uma substância marcada radioactivamente, não matabolizável, nas células alvo 36 V Γ u

específicas que tenham sido previamente carregadas com a substância. Medir a libertação de 51Cr de células singeneicas tratadas com o péptido, como descrito por Platsoucas & Good (1981), é considerado pelos inventores como sendo um método particularmente adequado.

Para gerar células alvo expressando o péptido para utilização no ensaio de CTL, células singeneicas apropriadas, tais como células P815, são primeiro carregadas com composto radioactivo tal como crómio. Isto pode ser alcançado incubando as células durante 2 horas a 37°C com 51Cr a 250 pCi. As células são então lavadas três vezes e incubadas durante 2 horas adicionais a 37°C com a forma monomérica do péptido teste a uma concentração de aproximadamente 40 μς/πιΐ. As células foram então lavadas duas vezes com uma solução tal como meio RPMI, FCS a 10%, e então ressuspendidas a uma concentração apropriada, por exemplo na região de 5 x 104 células/ml. As células alvo assim preparadas podem então ser empregues no ensaio de CTL, por exemplo misturando-as com as células eficazes candidatas em placas de microtitulação de 96 poços com fundo em U, de modo a que possam ser alcançadas razões diferentes de células eficazes para células alvo (E:T).

Alternativamente, como discutido acima, podem ser preparadas e utilizadas no ensaio de CTL células alvo expressando a proteína original a partir da qual o péptido teste derivou. Neste método, células singeneicas são infectadas durante 18-20 horas com uma quantidade apropriada, tal como 5 x 107 unidades formadoras de placas, de virus vaccinia recombinante contendo o gene para a proteína original que se deseja que seja expressa. Como um controlo, as células singeneicas podem ser infectadas com vírus vaccinia recombinante, que transporta o gene para uma proteína imunologicamente não relacionada. Neste ponto, pode desejar-se confirmar a presença da proteína requerida nas células alvo, mas não nas células controlo, por exemplo, por 37 Γ u t transferência de western de ambos os tipos de células infectadas, com anticorpos específicos. As células alvo preparadas deste modo podem então ser marcadas com o composto radioactivo, neste caso 51Cr a 100 μΟϊ, e utilizadas no ensaio de CTL de libertação de crómio (Platsoucas & Good, 1981), como descrito acima.

Em certas realizações em que os péptidos candidatos a ser pesquisados são derivados da proteína de HIV gpl60, pode ser utilizado o sistema de vírus vaccinia recombinante para preparar células que expressam especificamente esta proteína. Para utilização neste aspecto, os inventores observaram que os vírus vaccinia controlo (VSC8) e recombinante expressando env de HIV (VPE16) , obtidos através do Dr. Bernard Moss por via do AIDS Research and Reference Reagent Program, (Division of AIDS, NIAID, NIH) são particularmente utilizáveis. Para confirmar a presença da proteína gpl60 nessas células alvo P815 infectadas com VPE16, os inventores observaram ser conveniente empregar soros humanos positivos para anticorpos de HIV nas experiências de transferência de western. Utilizando as células alvo P815 infectadas com VPE16 em ensaios de CTL, os inventores determinaram que era particularmente vantajoso empregar 5 x 104 células alvo/ml e 1 x 106 células eficazes CTL candidatas/ml, misturadas de modo a obter uma razão inicial E:T de 20:1.

Em ensaios de CTL realizados utilizando qualquer uma das células alvo acima, a percentagem de libertação específica de 51Cr pode ser calculada como: 100 x (libertação experimental - libertação espontânea) (libertação máxima - libertação espontânea) A libertação máxima pode ser determinada medindo a radioactividade libertada no sobrenadante a partir de células 38

alvo, nas quais a lise completa foi induzida experimentalmente, tal como utilizando uma solução a 5% do detergente não iónico Triton X-100, para rebentar as membranas das células. A libertação espontânea pode ser determinada medindo a radioactividade libertada para o sobrenadante pelas células alvo incubadas sem células eficazes adicionadas. Está contemplado que as experiências válidas possuirão um valor para lise alvo espontânea que está entre 15-20% da lise máxima observada.

Antes de ensaiar as células PLN para possível actividade de CTL, pode ser desejável eliminar primeiro certas populações de células, tais como CD4+ ou CD8+, da mistura de células. Neste aspecto, células PLN re-estimuladas podem ser tratadas quer com anticorpo monoclonal anti-CD4 (clone GK-1,5) mais complemento (C) (+ anti CD4+C), ou com anticorpo monoclonal anti-CD8 (clone 53-6,72) mais C (+anti CD4+C), como descrito por Platsoucas & Good (1981). Também pode ser desejável tratar certas células PLN apenas com complemento (+C), para funcionar como comparação. As células tratadas com qualquer destes métodos podem então ser testadas quanto à sua capacidade para lisar células alvo semelhantes a MHC que foram pré-tratadas com a forma monomérica do péptido ou infectadas por vírus vaccinia recombinante expressando a proteína original a partir da qual o péptido teste derivou.

Quando se deseja identificar compostos reactivos a CTL que não exibem uma capacidade geradora de anticorpos, os péptidos identificados como sendo activos para células T, podem ser pesquisados para identificar aqueles que não possuem actividade estimuladora de células B. Tais péptidos são propostos como sendo particularmente úteis na preparação de vacinas para o tratamento ou prevenção de doenças virais tais como a SIDA, em que uma resposta de anticorpo pode de facto aumentar a infecciosidade do agente causador. A identificação de tais 39 p Lc, ^ péptidos é conseguida injectando um candidato num animal imunocompetente (p. ex., murganhos) para identificar os péptidos que não conseguem provocar uma resposta de anticorpos significativa para a proteína nativa para cuja sequência os péptidos correspondem em parte. Por exemplo, no caso do HIV, pode ser desejável testar a produção de anticorpos possuindo reactividade contra gpl20, gp41 ou proteínas do núcleo, etc.

Obviamente, como acima mencionado, a presente revelação também se refere à identificação de compostos capazes de produzir uma resposta a células T e uma resposta a células B, na qual este último grupo servirá para induzir imunidade baseada em anticorpos protectores no hospedeiro imunizado.

Composições activas de CTL da presente invenção iniciam células T de um modo que, quando o vírus infectante aparece numa altura posterior, as células T de memória são activadas para resultar numa resposta imunitária mediada pela célula, que destrói as células alvo que possuem a proteína alvo correspondente ou uma porção desta, nas suas superfícies celulares, e assim o vírus.

Os inventores optimizaram ainda o método acima descrito para a preparação de respostas de CTL induzidas pelo péptido contra imunogénios peptídicos. Objectivos particulares foram aumentar a produção de CTL específico por tecido linfóide mais distante do sítio de injecção, tal como no baço, e melhorar a longevidade da resposta. Foi determinado que péptidos fisicamente misturados contendo sequências de epitopo de "T helper" com péptidos indutores de CTL aumentaram as respostas de CTL em murganhos, tanto após injecções múltiplas subcutâneas (sc) como injecções únicas intradérmicas (id) na almofada da pata. Adicionalmente, o nível elevado de resposta de CTL no baço foi mantido durante até oito semanas após uma injecção id. Um exemplo de um péptido de 40

"T helper" adequado é C19A, possuindo a sequência CRIKQIINMWQGVGKAMYA (seq id no:2), que foi demonstrado ser eficaz nas formas de polímero monómero, de cauda lipídica, e dissulfureto. 0 mecanismo de aumentar uma resposta de CTL induzida pelo péptido in vivo por péptidos que induzem células "T helper" é desconhecido. Contudo, é provável que o péptido estimulante, devido à sua capacidade de induzir células T, resulte num aumento dos níveis de citoquinas necessárias que auxiliam na expansão clonal e na disseminação de CTLs específicos. Apesar do mecanismo sublinhado, prevê-se que a utilização de misturas de célula "T helper" e péptidos indutores de CTL em imunização ou formulações de vacinas melhorará substancialmente a capacidade de gerar uma resposta sistémica de CTL com uma semi-vida relativamente longa, comparada com a imunização com o(s) péptido(s) indutor(es) isolado(s).

Em relação ao HIV, é proposto que péptidos particularmente úteis contra os que originam uma resposta de CTL, serão os péptidos que possuem sequências derivadas dos genes virais gag, pol, nef e env (TABELA 1), sendo particularmente preferidos os genes env. Ainda mais preferencialmente podem ser empregues como péptidos indutores de CTL péptidos com sequências derivadas da ansa V3 de gpl20 de HIV, tais como os listados na TABELA 2. É visionado que epitopos indutores de células "T helper" para utilização na presente invenção terão geralmente um valor de anfipaticidade de cerca de mais 10 até cerca de mais 20.

Os péptidos e combinações de péptidos considerados como sendo adequados como vacinas ou componentes destes podem ser testados em modelos experimentais animais, tais como murganhos, ratos, coelhos, cobaias, cabras, macacos Rhesus, chimpanzés, e afins. Tais testes levarão provavelmente à produção de vacinas 41 f v

U t de sucesso que induzem imunidade mediada por células para protecção contra uma variedade de agentes infecciosos.

Outros aspectos relacionam-se com a identificação e formulação de péptidos sintéticos como agentes terapêuticos para utilização contra HIV, de modo a que estes péptidos sintéticos definidos quimicamente protegerão células humanas contra infecção por HIV. A região da ansa V3 de gpl20 é reconhecida como sendo essencial para a infecção de células por HIV (Travis et al., 1991; Freed e Riser, 1987; Freed et al.t 1991). Anticorpos anti-ansa V3 demonstraram inibir a infecção celular por HIV sem interferir com a ligação de gpl20 ao seu receptor celular, CD4 (Linsley et al., 1988; Javaherian et al., 1989). A região de ansa V3 é também conhecida como sendo um alvo para a protease relacionada com a tripsina na superfície da célula hospedeira (Murakami et al., 1991). Foi especulado que após a ligação de gpl20 a CD4, a ansa V3 é clivada por uma protease da superfície celular levando a uma alteração conformacional no complexo proteico gpl20/gp41 (McCune et al., 1988). Tal alteração pode então expor o domínio fusogénico na proteína transmembranar gp41, resultando na fusão da membrana da partícula virai com a membrana celular. Por isso, os inventores pensam que os péptidos da ansa V3 podem prevenir a infecção de células por inibição da clivagem da ansa V3 de gpl20.

Estudos recentes nesta área levaram ao surgimento de resultados incompatíveis. Koito et al. (1989) relataram que um péptido sintético, correspondente ao epitopo principal neutralizador de HIV-1 da ansa V3 de gpl20, inibe a formação de sincícios entre células CCRF-CEM infectadas por HIV-1 e células Molt-4 não infectadas de um modo dependente da dose. Nestes estudos, o péptido de 36 aminoácidos (resíduos 303-338), CTRPNNNTRKSIRIQRGPGRAFVTIGKIGNMRQAHC, representando a ansa V3 42

V total, demonstrou inibir a formação de sincicios em 30-60% a uma concentração de 100 μΜ (aproximadamente 300 μς/πιΐ) . Contudo, um péptido de 24 aminoácidos (resíduos 308-332, NNTRKSIRIQRGPGRAFVTIGKIG) representando a porção média da ansa V3 foi menos eficiente e foi necessária uma concentração de 300 μΜ (aproximadamente 720 pg/ml) para atingir o mesmo nível de inibição de formação de sincicios. Nenhum destes péptidos foi testado quanto à sua capacidade para inibir infecção das células por HIV.

Em contraste, De Rossi et al. (1991) relataram recentemente que péptidos sintéticos de 24 aminoácidos de comprimento das regiões da ansa V3 de diferentes isolados de HIV-1 aumentam de facto a infecção de células por HIV-1 através de um mecanismo dependente de CD4. Nestas experiências péptidos sintéticos em concentrações no intervalo entre 0,62-20 μΜ (aproximadamente 1,5 a 48 μg/ml) foram empregues e foi testada uma linha de células T humana (Molt-3).

Apesar da evidência acima para o contrário, os presentes inventores prosseguiram para testar a capacidade de péptidos sintéticos da ansa V3 inibirem a infecção por HIV. Péptidos sintéticos de comprimento variado (8-24 aminoácidos) seleccionados da ansa V3 de gpl20 foram determinados como sendo surpreendentemente eficazes na inibição da infecção de células T por HIV, utilizando culturas de células T humanas tais como H9, CEM e MT-4, e células T humanas primárias preparadas de fresco. Estes péptidos incluem R15K, possuindo a sequência RIQRGPGRLFVTIGK (seq id no:l), e N24G, possuindo a sequência NNTRKSIRIQRGPGRAFVTIGKIG (seq id no:3). Os péptidos denominados D23, D24, D25, D26, D30, D35, D38, D39 e D40, cujas sequências são apresentadas na TABELA 11A, também se verificou inibirem a infecção celular por HIV. 43

V

Uma descoberta importante desta invenção é a descoberta que péptidos com sequências de uma variedade de diferentes isolados de HIV possuem a capacidade de inibir a infecção de células por HIV-1 IIIB. Estes incluem H13N (HIGPGRAFYTTKN, seq id no:7) de HlV-lmn, e T13Q (TKGPGRVIYATGQ, seq id no: 6) de HlV-lrf, em conjunto com os péptidos apresentados na TABELA 11A. Importante é estar contemplado que péptidos com sequências que correspondem a sequências da ansa V3 de outras estirpes virais serão também úteis na inibição da infecção pelas estirpes de HIV homólogas, ou outras relacionadas. Desse modo, está contemplado que péptidos tais como D27, D28, D29, D31, D32, D33, D34 e D37 (TABELA 11B) possam ainda demonstrar vir a ser úteis como péptidos inibidores de infecção.

Os inventores mostraram previamente que o péptido EQLWVTVYYGVPV (E13V, seq id no:4), da extremidade amino de gpl20 (resíduos 39-51) era capaz de induzir respostas anti-HIV em células "T helper" em murganhos (Sastry & Arlinghaus, 1991). Verificou-se que anticorpos contra este péptido foram capazes de ligação a gpl20 desnaturada, mas não nativa. Analisando a capacidade do péptido E13V (seq id no:4) interferir com a entrada de HIV nas células, e assim inibir a infecção, os inventores verificaram ser este também um péptido inibidor de infecção eficaz.

Os péptidos inibidores de infecção da presente invenção tais como R15K (seq id no:l) e E13V (seq id no:4) estão previstos como sendo candidatos ideais para inclusão em formulações terapêuticas que sejam eficazes na prevenção da infecção de células humanas por HIV-1. Relevante para terapia humana é a descoberta que R15K, por exemplo, retinha a capacidade máxima da actividade inibidora após incubação em soro de vitela fetal durante até 4 horas. Uma vez que tais formulações serão 44 i-v u K—t completamente sintéticas e definidas, estes reagentes serão ambos económicos e seguros. Também, os péptidos da ansa V3 como uma mistura, proporcionarão a vantagem adicional de serem um reagente imuno-terapêutico devido à capacidade de induzir respostas CTL especificas para HIV-1 que podem efectivamente matar todas as células infectadas por vírus enquanto previne a infecção recente de células.

Assim, a presente revelação envolve em última análise a preparação de vacinas e formulações terapêuticas incluindo péptidos sintéticos. Pretende-se que as vacinas incluam péptido(s) contendo epitopos indutores de CTL, e idealmente incluirão também péptido(s) contendo epitopos indutores de células "T helper". As formulações terapêuticas podem também, evidentemente, incluir tais sequências. A presente revelação refere-se a péptidos incorporando uma sequência inibidora da infecção por HIV para utilização como componentes de tal composição terapêutica.

Em relação a péptidos tipo vacinação da presente invenção, está contemplado que multímeros de péptidos podem ser particularmente vantajosos na preparação de vacinas indutoras de CTL de acordo com o exposto. Multímeros preferidos são formados por micelas tipo tensioactivos e polímeros. Adicionalmente ao resíduo lisilo do terminal amino, o péptido espaçador pode conter de um até cerca de cinco resíduos adicionais. Substancialmente, qualquer resíduo de aminoácido pode ser utilizado desde que não interfira com a capacidade imunizante de células T de uma composição aquosa contendo o multímero ou com a capacidade do produto da reacção di-amida formar micelas tipo tensioactivo numa composição aquosa. São preferidos um até cerca de três resíduos glicilo por péptido espaçador. 45

Lc, 0 péptido anteriormente descrito e o péptido espaçador contendo o resíduo lisilo do terminal amino estão unidos por ligação peptídica, e podem assim ser encarados como um polipéptido compósito. A di-amida útil é assim um produto de reacção dos grupos amino alfa e epsilon do resíduo lisilo do terminal amino e duas moles por polipéptido compósito do ácido gordo C12-C18. 0 polipéptido compósito pode assim ser preparado como uma sequência única e amidificado antes ou após a remoção da resina, quando é utilizada síntese em fase sólida, por técnicas convencionais. A frase "micela tipo tensioactivo" é aqui utilizada para enfatizar que, numa composição aquosa, o polipéptido compósito di-amidolisilo parece formar micelas semelhantes às formadas por tensioactivos e distinguir tais multímeros de unidades estruturais microscópicas de protoplasma construída por moléculas poliméricas que são também referidas por vezes como micelas. A palavra "micela" é também aqui utilizada algumas vezes, e quando assim utilizada possui o mesmo significado do que micela tipo tensioactivo.

Outra forma de multímero de um péptido previamente descrito é um polímero possuindo uma pluralidade de unidades repetidas de péptido. Neste caso, pode ser seleccionado e sintetizado um péptido contendo duas cisteínas terminais como parte da sua sequência natural. Um péptido que não apresenta tais cisteínas pode ser modificado adicionando uma ou duas cisteínas extra às suas extremidade terminais N e C, respectivamente. A presença de duas cisteínas por péptido permite a polimerização do péptido de subunidade por oxidação ao ar para formar polímeros oxidados ligados a cisteína(cistina) e/ou péptidos cíclicos. Tais multímeros aumentam o reconhecimento imunitário do péptido sem a necessidade de um veículo. 46

Ui 0 péptido espaçador com lisina terminal pode conter um até cerca de cinco resíduos de aminoácido adicionalmente ao resíduo lisilo, e os um ou dois resíduos de cisteína terminal adicionados não estão incluídos na contagem do comprimento de um péptido da presente invenção. Um péptido contendo resíduos de cisteína terminal é referido como um péptido com terminação de di-cisteína ou, mais simplesmente, um péptido di-Cys. Detalhes para preparar polímeros contendo unidades de repetição de péptidos di-Cys são aqui fornecidas adiante.

As composições aquosas (inóculos) da presente invenção compreendem uma quantidade imunologicamente eficaz de um péptido ou péptidos indutores de CTL, indutores de células "T helper", ou inibidores de infecção por HIV, seja na forma multimérica ou não, dissolvidos ou dispersos num meio aquoso farmaceuticamente aceitável. Tais composições são também referidas como inóculos. A frase "farmaceuticamente aceitável" refere-se a entidades moleculares e composições que não produzem uma reacção alérgica ou igualmente incómoda quando administradas a um humano. A preparação de uma composição aquosa que contém uma molécula imunizante tal como um péptido ou multímero, ou um componente inibidor de infecção, tal como um péptido, como um ingrediente activo, é bem compreendida na técnica. Tipicamente, tais composições são preparadas como injectáveis, quer como soluções líquidas ou suspensões; também podem ser preparadas formas sólidas adequadas para solução em, ou suspensão em, líquido antes da injecção. A preparação também pode ser emulsifiçada.

Um péptido ou multímero de péptido pode ser formulado numa composição numa forma neutra ou em sal. Sais farmaceuticamente aceitáveis incluem sais de adição ácida (formados com os grupos 47 j—' Lc ^ amino do péptido) e que são formados com ácidos inorgânicos tais como, por exemplo, ácidos cloridrico ou fosfórico, ou ácidos orgânicos tais como acético, oxálico, tartárico, mandélico, e afins. Sais formados com os grupos carboxilo livres podem também ser derivados de bases inorgânicas tais como, por exemplo, sódio, potássio, amónio, cálcio, ou hidróxidos ferrosos, e bases orgânicas tais como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaina e afins.

Após formulação, as vacinas serão administradas de um modo compatível com a formulação de dosagem, e numa quantidade que seja imunologicamente eficaz. Como aqui utilizada, "quantidade imunologicamente eficaz" significa que é utilizada uma quantidade de composição que contém uma quantidade de um péptido, péptidos, ou multímeros de péptido suficiente para induzir uma resposta de CTL eficaz no animal hospedeiro (mamífero) tal como por indução de células T citotóxicas alvo específicas. Em realizações preferidas, está contemplado que a composição de vacina imunologicamente eficaz também incluirá uma quantidade de um péptido, péptidos, ou multímero de péptidos eficaz para induzir actividade de células "T helper" e para assim aumentar o efeito de CTL. A presença de tais células T citotóxicas é ensaiada como aqui discutido adiante.

No contexto de uma vacina, a quantidade de péptido(s) e volume de composição a ser administrados depende do animal hospedeiro a ser imunizado, da capacidade do sistema imunitário do animal hospedeiro para activar células T, e do grau de protecção desejado. As quantidades precisas de multímero de péptido activo necessárias para serem administradas depende do julgamento do especialista e são peculiares para cada indivíduo. Contudo, o intervalo de uma dosagem adequada é da ordem de cerca de 10 microgramas (pg) até cerca de 500 miligramas (mg), preferencialmente cerca de 50 μg até cerca de 1 mg, e mais 48 f L· preferencialmente cerca de 100 μς do ingrediente activo multímero de péptido, por indivíduo. É utilizado tipicamente um volume mínimo de uma composição requerida para dispersar a quantidade imunizante do multímero de péptido. Os regimes adequados para administração inicial e as injecções de reforço são também variáveis, mas são tipificadas por uma administração inicial seguida após uma ou duas semanas de intervalo por uma injecção subsequente ou outra administração.

Uma composição pode também incluir um adjuvante como parte do excipiente. Adjuvantes, tais como o adjuvante completo de Freund (CFA), o adjuvante incompleto de Freund (IFA) para utilização em hospedeiros mamíferos de laboratório são bem conhecidos na arte, e são aqui utilizados a titulo ilustrativo. Também podem ser utilizados adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis tais como alúmen. EXEMPLO 1 - Preparação de Péptidos, Polímeros de Péptidos e

Micelas de Péptidos

Foram preparados péptidos sintéticos de 7 até cerca de 30 resíduos de aminoácidos de comprimento, correspondendo aos domínios selectivamente conservados de moléculas do núcleo e de gpl60 (gpl20 e gp41), utilizando a técnica de fase sólida de Merrifield (1963), utilizando um sintetizador de péptidos automatizado Vega 250 modificado, ou pelo método do "saco" descrito em Houghten (1985). Em qualquer dos casos, a remoção dos grupos bloqueadores de aminoácido t-butiloxicarbonilo (t-BOC) e a hidrólise do péptido da resina, foram realizadas por tratamento com ácido fluorídrico (HF) a 0°C durante uma hora. A mistura contendo o péptido foi então extraída com éter dietílico para remover compostos orgânicos não peptídicos e os péptidos sintetizados foram extraídos da resina com ácido acético a 25% (p/v). 49 Γ

t

Foram preparados vários péptidos sintéticos por este procedimento, incluindo dezanove (19) que correspondem a domínios conservados da molécula gpl20 e da molécula gp41, como listado na TABELA 3. Os péptidos sintetizados correspondem a domínios (regiões) conservados de gpl60 em HIV, como apresentado. 50 Γ L-Cj TABELA 3

SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS DE PÉPTIDOS SINTÉTICOS PÉPTIDO LOCALIZAÇÃO NO # SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS ENVELOPE de 103 39EQLWVTVYYGVPV51 GP160-CR-1 104 45VYYGVPVWKEA55 GP160-CR-1 105 48GVPVWKEATTLFC61 GP160-CR-1 106 72ahkvwathacv82 GP160-CR-1 107 81cvptnpvpqew92 GP160-CR-1 108 92vlenvtenfnm102 GP160-CR-1 109 105nnmveqmhedi116 GP160-CR-1 110 109EQMHEDI1SLWDQ121 GP160-CR-1 111 118lwdqslkpcvklt130 GP160-CR-1 112 121slkpcvkltplc133 GP160-CR-1 113 204svitqacskvsfe216 GP160-CR-2 114 215fepipihycafpgf228 GP160-CR-2 115 236kkfngtgpctn246 GP160-CR-2 116 240gtgpctnvstvqc252 GP160-CR-2 117 250vqcthgirpwstq263 GP160-CR-2 61. 586ylrdqqllgiwgc598 GP160-CR-5 63 519 FLGFLGAAGSTMGAASLTLTVQANQ54 3 GP160-CR-5 65 417crikqiinmwqgvgkamya435 GP160-CR-3 67 417 CR IKQ11NMWQGVGKAMYAP PIGGQIRC4 4 4 GP160-CR-3 1. Os resíduos de aminoácidos dos terminais N e C de cada péptido estão numerados em relação às suas posições na sequência de resíduos de aminoácidos de gpl60, de acordo com Modrow et al. Virol. (LL: 570 (1987). 2. CR = Região Conservada 51 p Lcí ^

Foram preparados dois tipos de formas, de elevado peso molecular (multiméricas) dos péptidos listados na TABELA 3. A forma principal de multimero foi um polímero di-cisteína {com terminais di-Cys), no qual foram ligados uma pluralidade de péptidos extremidade-a-extrmidade por pontes dissulfureto. Estes polímeros di-cisteína foram produzidos adicionando resíduos de cisteína aos terminais de cada péptido durante a síntese. Os péptidos com terminais di-cisteína (di-Cys) foram então dissolvidos (10 mg/ml) em bicarbonato de amónia (0,1 M) à temperatura ambiente (~25°C) e agitados durante 16 horas para efectuar a oxidação dos grupos sulfidrilo para produzir formas poliméricas dos péptidos. A solução peptídica foi liofilizada e analisada por HPLC para confirmar a presença de formas poliméricas do péptido. O segundo tipo de forma de peso molecular elevado produzida foi uma micela tipo tensioactivo formada por ligação de um péptido espaçador contendo lisina no terminal amino (Lys-Gly-Gly-) à sequência do péptido para formar um polipéptido compósito, e então acoplar um ácido gordo C12-Ci8, tal como ácido palmítico, a ambos os grupos amino alfa e epsilon, como em Hopp (1984). Os péptidos contendo ácido gordo Ci2-Ci8 produzidos são então extraídos em ácido acético a 95% e utilizados para formar micelas grandes na composição aquosa que exibe imunogenicidade aumentada em relação aos péptidos.

Foram preparados multímeros de polímero di-Cys de todos os péptidos listados na TABELA 3. Foram preparados multímeros aquosos de micela de péptido, dos péptidos designados como 61, 63, 65 e 67, respectivamente. Os péptidos designados como 103 até 117 foram apenas utilizados nas suas formas multiméricas de polímero di-Cys. 52 Γ

As formas multiméricas de elevado peso molecular produzidas correspondem a cópias múltiplas de regiões específicas de gpl20 e gp41 em HIV. Para facilidade de designação, as formas multiméricas serão designadas pelo número do péptido a partir do qual é composta - isto é, o péptido 61 refere-se à forma multimérica (polimérica) di-Cys do péptido 61 e o péptido 66 refere-se à forma de micela aquosa do péptido 65, enquanto que os péptidos 103-117 referem-se a um multimero polimérico.

Os péptidos 65 e 66 correspondem à região de gpl20 que se liga ao receptor T4 da superfície da célula. Os péptidos 61 e 62 correspondem a uma região próxima da porção do terminal amino de gp41 que representa um epitopo imunodominante principal observado em soros de doentes com SIDA. EXEMPLO 2 - Resposta de Anticorpo Anti-Péptido

As composições aquosas dos multímeros; i.e., os polímeros e micelas dos péptidos di-Cys produzidos no EXEMPLO 1, foram ensaiadas quanto à sua capacidade para provocar uma resposta de anticorpo anti-péptido em murganhos BALB/c, uma estirpe de murganhos imunocompetente.

Os grupos de murganhos BALB/c (fêmeas de 6-8 semanas de idade, 3 a 5 murganhos/grupo, Charles River Laboratories) foram imunizados por injecção subcutânea (s.c.) ou intraperitoneal (i.p.) de um multimero de péptido (100 μg/injecção) em adjuvante de Freund completo (CFA) (razão 1:1). Foram aplicadas injecções de reforço (50 μg de multimero de péptido) em adjuvante incompleto de Freund (IFA) (1:1) às 6 e 10 semanas após a imunização inicial. Cada murganho foi sangrado no seu plexo retro-orbital com intervalos de duas semanas e o soro foi reunido por murganhos individuais em cada grupo. 53 fr Γ

Foi realizado um ensaio de ELISA em cada soro, para detectar a presença de anticorpos anti-péptido utilizando IgG anti-murganho de cabra conjugado com peroxidase (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN) como segundo anticorpo. Resultados preliminares para os péptidos 61-68 são apresentados na TABELA 4, enquanto que resultados mais refinados para os péptidos 61, 63, 65, 67 e 103-107 são apresentados na TABELA 5.

Foi observado que as formas de elevado peso molecular dos péptidos 65, 66, 67, 68, 105 a 110, 112, 114, 115 e 117 produziram títulos de anticorpo elevados, enquanto que os péptidos 61, 62, 63, 64, 103, 104, 111, 113 e 116 produziram quantidades muito baixas a insignificantes de anticorpos anti-péptido. Resultados semelhantes for obtidos para respostas de anticorpo em murganhos B6C3 F1 (Charles River Laboratories), outra estirpe imunocompetente.

Alguns dos soros foram ainda ensaiados para resposta de anticorpo (reactividade) com gpl60 nativa e os resultados, apresentados na TABELA 6, demonstram que estes péptidos não representam epitopos de células B, uma vez que não existia imunoreacção com gpl60 nativa. 54

V

i— TABELA 4

RESPOSTA DE ANTICORPO DE VÁRIOS PÉPTIDOS EM MURGANHOS BALB/C

Titulo da ELISA na colheita de sangue 1 Péptido Pré-imune 1 1 2 3 4 5 6 7 8 61 1:40 1:400 1:100 1:100 a: 100 1:100 1:400 1:200 1:400 62 1:20 1:100 1:100 1:100 1:100 1:200 1:200 1:100 1:100 63 1:40 1:80 1:20 1:40 1:320 1:80 1:80 1:320 1:5120 64 1:20 1:40 1:40 1:00 1:40 1:40 1:40 1:40 1:40 65 1:40 1:80 1:800 1:1x10' 1:5x10' 1:2x10* 1: 2xl05 1: 2xl05 1: 2xl05 66 1:40 1:160 1: 6xl03 1: lxlO5 1: lxlO5 1:lxlO5 1:2x10* 1:5x10* 1: 5xl05 67 1:40 1:160 1: 3xl03 1:2x10* 1:2x10* 1: lxlO5 1: 8xl05 1: lxlO5 1: 2xl05 68 1:80 1:1600 1:1x10' 1:1x10* 1: lxlO5 1: lxlO5 1: 4xl05 1: 4xl05 1:4xl05 55 1/

V TABELA. 5

RESPOSTA DE ANTICORPO DE VÁRIOS PÉPTIDOS EM MURGANHOS BALB/C PEPTIDO TÍTULO DA ELISA #62 . AA . 586-598 1:400 #63 . AA . 519-543 1:5120 #65 . AA · 417-435 1:2xl05 #67 . AA 417-444 1:82xl05 #103 AA 39-51 1:640 #104 AA 45-55 1:2000 #105 AA 48-61 1:5000 #106 AA 72-82 1: 4xl05 #107 AA 81-92 1: lxlO5 #108 AA 92-102 1: lxlO5 #109 AA 105-116 1: 8xl05 #110 AA 109-121 1:6xl05 #111 AA 118-130 1:80 #112 AA 121-133 1:lxlO5 #113 AA 204-216 1:640 #114 AA 215-228 1: lxlO6 #115 AA 236-246 1:4xl05 #116 AA 240-252 1:640 #117 AA 250-263 1:8xl06 56 Γ

Lei ^ TABELA 6

RESPOSTAS DE CÉLULAS T E B EM MURGANHOS A IMUNOGÉNIOS DE PÉPTIDOS SINTÉTICOS DERIVADOS DE GP160 DE ENVELOPE DE HIV

Imuno- génio peptidi- co Proliferação In Vitro de Células PLN de* Reactividade de Anticorpo Antipéptido a** B6C3F1 Um SwxBalb/c Fl Péptido análogo GP160 Péptido análogo GP160 Péptido análogo GP160 61 ++ + ++ ++ - — 63 ++ ++ ++ + + ± — 65 ++ + ++++ ++ ++ — 67 ++ - ++++ ++ +++ — 103 + + +++ + - — 104 ++++ ++ +++ + ± — 105 + + "}" + +++ + + — 106 +++ + ++++ + ++ 107 ++ ++ + + + 108 + + + — + — 109 ++ ± ± + +++ — 110 ++ ++ + ++++ — 111 + ++ ± — — — 112 + + + + + — 113 ++ + ++ + — — 114 ++ - ++ + ++++ - 115 ++ + ♦ND ND ++ — 116 ++ - ND ND — - 117 +++ ND ND ++++ - * Os valores de cpm são corrigidos e categorizados c le acordo com a resposta a antigénio não relacionado in vitro. ** Anticorpos produzidos em murganhos Balb/c, reactividade medida por ELISA e categorizada de acordo com o ponto final. ♦ Não determinado. 57

EXEMPLO 3 - Respostas de Células T

As formas poliméricas de péptidos di-Cys multiméricos, com elevado peso molecular, dos péptidos descritos no EXEMPLO 1 foram ensaiadas, quanto à sua indução de uma resposta proliferativa de células T, como em Millich et al. (1985).

Os murganhos (3 ou 5 murganhos/grupo) foram injectados na almofada da pata posterior direita com uma mistura de 1:1 do polímero peptídico (100 μg/injecção) e CFA. Os péptidos 61, 63, 65 e 67 foram injectados em murganhos B6C3 F1 (11-2^, Charles River Laboratories) e murganhos A.SWXBALB/C F1 (H-2sxd, Jackson Labs, Bar Harbor, ME). As células do nódulo linfático do poplíteo de drenagem (PLN) foram recolhidas após dez (10) dias, e cultivadas (2xl05 células/poço) em placas de microtitulação em 0,2 ml de meio de Click (Click et al., 1972) contendo várias concentrações de péptido sintético, gpl60, um material proteico não relacionado ou apenas meio, durante 96 horas a 37°C numa atmosfera humidificada de C02 a 5%. Durante as 16-18 horas finais de cultivo foi adicionada 3H-timidina (3H-TdR) (1 μCi/poço, 6-7

Ci/mmole, ICN Radiochemicals). As células foram recolhidas para tiras de filtro e foi monitorizada a incorporação de 3H-TdR. Os resultados são apresentados nas FIGURAS 1, 2, 3, 4 e 5. A FIGURA 1 ilustra os resultados para os péptidos 61, 63, 65, 67 em murganhos BALB/C, e esses resultados são expressos como um índice de estimulação (SI) representando o aumento em número de vezes nas contagens de radioactividade na presença de antigénio comparado com os valores de fundo quando não é adicionado antigénio. Os valores de SI com os diferentes péptidos são comparados com os obtidos com um derivado da proteína tuberculina purificada (PPD) como um antigénio controlo positivo. 58 \

L*—«J t

As FIGURAS 2-5 ilustram a'incorporação de 3H-TdR especifica para o péptido para respostas de células T (delta cpm) em murganhos com haplotipos de histocompatibilidade principal diferentes (MHC), murganhos B6C3 F1 (C57Bl/6xC3H/HcJ) (Figuras 2 e 4) e murganhos (A.SWxBALB/c) F1 (FIGURAS 3 e 5), para todos os péptidos sintéticos. Os valores de incorporação de 3H-TdR representam a diferença entre os valores de radioactividade obtidos em poços contendo antigénio e em poços controlo sem adição de antigénio. A proliferação não especifica de células PLN foi determinada incluindo um péptido não relacionado nos ensaios, apresentada como uma barra horizontal para cada péptido.

Todos os péptidos ensaiados exibiram boas respostas proliferativas de células T em murganhos B6C3 Fl, enquanto que todos os péptidos ensaiados, excepto os péptidos 105, 107, 109 e 111, exibiram boas respostas proliferativas de células T em murganhos A.SWxBALB/c.

Foi demonstrado pelos resultados acima e pelos descritos no EXEMPLO 2 que os péptidos 61, 63, 103, 104 e 113 não estimulam produção de anticorpo anti-péptido, mas são muito bons imunogénios, na sua forma polimérica dissulfureto (di-Cys), para induzir uma resposta forte de células T dirigida contra o péptido correspondente e a proteína gpl60 nativa do envelope de HIV. A proliferação de células T medidas por incorporação de 3H-TdR foi também ensaiada de forma semelhante como uma função da concentração de antigénio de células T, utilizando várias quantidades de gpl20 ou gpl60 nativa como um controlo, e PPD como outro controlo. Foram utilizadas PLN de murganhos B6C3 Fl nestes estudos. Os resultados para os péptidos 104 e 105 versus gpl20 são apresentados nas FIGURAS 6A e 6B, respectivamente; os 59 r

resultados para os péptidos 61 e 63 versus gpl60 são apresentados nas FIGURAS 7A e 7B, respectivamente; e os resultados para os péptidos 65 e 111 versus gpl20 são apresentados nas FIGURAS 8A e 8B, respectivamente.

EXEMPLO 4 - Indução de Linfócitos T Citotóxicos Específicos para HIV

Grupos de 3 a 5 murganhos fêmea singeneicos (6 a 8 semanas de idade) são imunizados por injecção intradérmica num sítio apropriado com uma composição aquosa contendo uma quantidade imunizante (estimulante de CTL) de péptido, quer como monómero quer como os multímeros anteriormente discutidos, em CFA (1:1). Dez (10) dias após imunização, as células PLN de drenagem e linfócitos de baço são obtidas e re-estimuladas in vitro cultivando durante seis (6) dias com células normais de baço singeneicas irradiadas, que foram pré-tratadas com o mesmo péptido sintético como imunogénio. A presença de linfócitos T citotóxicos (CTL) é determinada por um ensaio de libertação de 51Cr de 4 horas, como se segue. As células PLN são mantidas durante cinco dias a 37°C em meio de Click contendo soro de vitelo fetal a 10% (FCS) juntamente com células normais de baço singeneicas irradiadas, que foram pré-tratadas com o péptido teste apropriado. Estas células são designadas como as células efectoras, e expressam antigénio H-2d MHC de classe I. Células alvo (conjuntos de células de baço de murganho singeneicas estimuladas por fitohemaglutinina (PHA) ou células de murganho P815 expressando uma proteína de HIV correspondente) são lavadas três vezes com meio RPMI 1640 sem soro e depois misturadas, colocadas em contacto e mantidas (incubadas) a 37°C durante cerca de 1,5 até cerca de 2 horas juntamente com 250 60

V

u t de cromato de sódio (actividade específica 200-400 Ci/g de 51Cr, New England Nuclear, Boston, MA) . As células alvo são subsequentemente lavadas com meio RPMI 1640 contendo FCS a 10%, e ressuspendidas em RPMI 1640 com FCS a 10% e diferentes concentrações de péptido. Estas células são então lavadas 3 vezes com RPMI contendo FCS a 10% e ressuspendidas a 5 x 104 células/ml. Uma fracção de 100 μΐ de cada suspensão de células é adicionada a um poço de uma placa de microtitulação de 96 poços com fundo em U.

Uma fracção de 100 μΐ da suspensão de células efectoras apropriadas (5 x 106 células/ml) é adicionada a cada poço e realizada uma diluição de duas vezes para obter diferentes razões célula efectora para célula alvo (E:T). Os poços de controlo receberam 0,1 ml apenas de meio RPMI com FCS a 10% na ausência de células efectoras, para obter um valor para libertação espontânea de 51Cr, e receber 0,1 ml de detergente

Triton X-100 a 5% para obter um valor para libertação máxima de 51Cr.

As placas foram incubadas a 37°C durante cerca de 4 horas, após o que cada 100 μΐ de sobrenadante de cada poço é monitorizado num contador gama para determinar a libertação de 51Cr. A percentagem de citotoxicidade é calculada como

Libertação Estimulada por células Efectoras_- (Libertação Espontânea) x 100

Libertação Máxima - Libertação Espontânea EXEMPLO 5 - Ensaio rápido de CTLs específicos para HIV Induzidas por um péptido Imunodominante. 61 V. t

L-Cj

Um péptido com a sequência RIQRGPGRAFVTIGK, aqui referido como R15K (seq id no:l), da ansa V3 imunodominante de gp!60 de HIV foi previamente identificado como um epitopo de CTL imunodominante em murganhos H-2d (Takahashi et ai., 1988). Nos estudos originais, CTLs induzidos in vivo infectando murganhos Balb/c com vírus vaccinia recombinante expressando proteínas env de HIV, mostraram lisar células alvo singeneicas pré-incubadas com R15K. Infelizmente, até à data, imunizar murganhos com péptido R15K livre não surtiu êxito na indução de CTLs (Berzofsky, 1991).

De acordo com o exposto, os presentes inventores pensaram examinar a indução de CTLs CD8+ específicos para R15K de HIV em murganhos Balb/c, de 6-8 semanas de idade, empregando diferentes sítios de inoculação, diferentes formas do péptido e recuperando as células eficazes a partir de tecidos com diferentes origens. Foi observado que os nódulos linfáticos do poplíteo de drenagem (PLN) de murganhos imunizados na almofada da pata posterior com 100 μg do péptido R15K, (seq id no:l) numa emulsão 1:1 com CFA, eram a melhor fonte de CTL eficazes contra células alvo singeneicas irradiadas (3300 rads) pré-incubadas com R15K monomérico (40 μg/ml durante 2 horas a 37°C). Isto possui particular importância e significado fisiológico porque os nódulos linfáticos humanos têm sido descritos como o sítio primário de replicação de HIV (Kaneshima et al., 1991; Fauci, 1991). Um aspecto importante deste protocolo de imunização é que as CTLs podem ser recuperadas por homogeneização suave a partir de PLN cirurgicamente removidos após apenas 10 dias.

Para determinar a forma óptima do péptido para indução consistente de CTLs específicos para o péptido in vivo, o péptido R15K (seq id no:l) foi preparado em três diferentes configurações: a) monómero linear, b) polímero com ligações dissulfureto formado por oxidação de resíduos de cisteína 62 V Γ u

adicionados às extremidades N e C e c) micelas formadas por conjugação do péptido a um dipalmitil-lisina-glicina-glicina na extremidade N (Hopp, 1984; Sastry e Arlinghaus, 1991). Verificou-se que uma única imunização de murganho Balb/c na almofada da pata posterior com qualquer das formas de R15K acima em CFA, resultou consistentemente na geração de CTLs que lisaram especificamente células alvo semelhantes em MHC (P815, H-2d) pré-incubadas com o péptido. Tais respostas foram observadas em 8 de 12 murganhos imunizados com a forma monomérica, em 13 de 13 murganhos imunizados com a forma micelar e 6 de 8 murganhos imunizados com a forma polímero de dissulfureto do péptido. A lise de células alvo semelhantes em MHC sem o pré-tratamento do péptido (P815) não foi observada. Resultados representativos são apresentados na FIGURA 9.

Os CTLs induzidos por todas as três formas do péptido também lisaram especificamente células P815 infectadas com um vírus vaccinia recombinante que expressa a gpl60 de HIV (VPE16), mas não células infectadas com um vírus vaccinia controlo (P815+VSC8) (FIGURA 10). Transferência de western com soro humano positivo para anticorpos contra HIV confirmou a presença da proteína gpl60 em células alvo P815 infectadas com VPE16, mas não em células infectadas com VSC8. Os CTLs induzidos por péptidos em murganhos Balb/c foram restringidos a H-2. Lisaram apenas células alvo H-2d pré-tratadas com péptido (P815) mas não células alvo 3A9 não tratadas com péptido, que expressam o haplotipo H-2K (TABELA 7). São apresentados na TABELA 7 resultados representativos com CTLs gerados em murganhos imunizados com a forma de micela do péptido R15K (seq id no:l). Foram obtidos resultados semelhantes com CTLs induzidos por injecção das formas monomérica e polimérica do péptido R15K. 63

r

Foram realizadas experiências para determinar se os CTLs específicos para o vírus eram CD8+ ou CD4+. 0 tratamento dos efectores de CTL de murganhos imunizados com péptido monomérico com anticorpos monoclonais (Mabs) anti-CD8 e complemento de coelho anulou a citotoxicidade contra alvos tratados com péptido ou expressando env (FIGURA 11A) . Em contraste, o pré-tratamento de células efectoras com Mabs anti-CD4 mais complemento, ou só com complemento, não tiveram efeito significativo. Resultados semelhantes foram também obtidos com CTLs gerados em murganhos imunizados com o péptido em micela (FIGURA 11B) e formas polimércas. A indução de CTLs CD8+ por R15K (seq id no:l) é consistente com a utilização de células alvo P815 que expressam produtos de genes de MHC classe I, mas não classe II (Maryanski et al., 1985). A restrição a MHC classe I é geralmente observada com CTLs efectores CD8+.

Uma vez que o epitopo de CTL estudado na presente investigação está no meio de uma região activa da gpl20 de HIV de célula B imunodominante, a actividade de célula B do péptido R15K foi investigada. Quer como monómero ou como micela de cauda lipídica ou após conjugação com KLH, este péptido não induziu um título mensurável de anticorpo anti-péptido em murganhos. Contudo, os murganhos imunizados com péptido conjugado com KLH produziu anticorpos contra KLH, mostrando que os murganhos são imunocompetentes. Também foram testados os soros de murganhos imunizados na almofada da pata, onde se observou que não foram produzidos anticorpos anti-péptido. 64 r L· TABELA 7

Especificidade para o Péptido e Células Alvo de CTLs induzidas em Murganhos Balb/c pelo Péptido R15K (seq id no:l) da ansa V3 de env de HIV Células % de Lise Específica a Várias Razões de E:Ta Alvo 100:1 50:1 25:1 P815b 7,2 0 0 P815 + A84c 76,7 67,2 65, 9 P815 + Bl06d 4,2 0,6 0 P815 + Bl05e 6,7 0 0 3A9f 7,0 0,6 0 3A9 + A84g 10,0 8,0 0 a = Razão efector para célula alvo b = Células alvo semelhantes em MHC (H-2d) c = Células H-2d pré-tratadas com o péptido R15K da ansa V3 de

env de HIV d = Células H-2d pré-tratadas com um péptido do virus da gripe e = Células H-2d pré-tratadas com um péptido do virus Sendai f = Células alvo não semelhantes em MHC (H-2k) g = Células alvo H-2k pré-tratadas com o péptido env de HIV da ansa V3

Apesar dos resultados apresentados imediatamente acima, a localização de R15K numa região variável (ansa V3) de gpl60 de HIV pode ser vista como uma razão para não seleccionar este péptido como um potencial candidato a vacina. Contudo, uma comparação entre as sequências de aminoácidos de gpl60 de 245 diferentes isolados de HIV mostraram que podem ser apenas definidas cinco sequências de consenso diferentes numa base serológica entre todos os isolados virais (LaRosa et al., 1990). Por isso, os inventores propõem que um "cocktail" de péptidos indutores de CTL de regiões da ansa V3 incluindo todos os grupos principais de HIV (que podem ser cinco ou menos) possa ser suficiente para gerar CTLs específicos para células que 65

expressam gpl20 da maior parte, senão de todas, as estirpes de HIV. Tal mistura servirá então como um protótipo de vacina para avaliação da prevenção da infecção de humanos por HIV. EXEMPLO 6 - Aumento de Respostas de CTL Especificas para o Vírus por Péptidos Indutores de Células "T helper". 0 presente exemplo refere-se a um método para melhorar a distribuição sistémica, nivel de actividade, e longevidade de CTLs específicos para vírus induzidos em resposta aos péptidos contendo epitopos CTL. Este método envolve a adição de uma classe de péptidos separada e distinta à mistura de imunização que possui actividade indutora de células T como um meio de melhorar a capacidade indutora de CTL de um determinado péptido imunogénico. 0 método dos inventores para induzir respostas de CTL contra péptidos imunogénicos, como descrito no Exemplo 5, resulta numa rápida indução de CTL no nódulo linfático próximo (perto do local da injecção). Contudo, notou-se que o tecido linfóide distante (i.e. o baço) acumulou um baixo nível de CTLs específicos para o antigénio. Os inventores pensaram em seguida que a indução adicional de actividade de células "T helper" pode ser vantajosa no melhoramento da disseminação de CTLs específicos. Como o método descrito acima permite a pesquisa de péptidos indutores de CTL sem a necessidade de incluir sequências de epitopo de "T helper", os inventores testaram se péptidos "helper" de células T para HIV fisicamente misturados com o péptido indutor de CTL específico para HIV (RIQRGPGRAFVTIGK, R15K, seq id no:l) aumentaria a resposta de CTL observada em murganhos após injecções múltiplas subcutâneas (sc) . 0 péptido "T helper" seleccionado para estes estudos foi CRIKQIINMWQGVGKAMYA, C19A, seq id no. 2, que foi previamente demonstrado conter actividade indutora de células "T helper". 66

V

Murganhos Balb/c foram injectados sc três vezes a intervalos bi-semanais com o péptido R15K (seq id no:l) misturado com o péptido "T helper" preparado por uma de três formas: polímero monómero, de cauda lipídica e dissulfureto. Uma semana após a última injecção foram obtidas células do baço re-estimuladas e testadas para a actividade de CTL. Esta experiência foi bem sucedida e foi observada actividade de CTL significativa em todos os murganhos (TABELA 8). Esta experiência foi subsequentemente repetida injectando assim os murganhos com uma mistura de R15K e da forma monomérica do péptido "T helper". Nesta experiência foram ensaiadas células do baço para a resposta de CTL específica para HIV após uma, duas e três injecções sc e foram observadas respostas de CTL positivas a um nível mais baixo, mas significativo (TABELA 9). 67

V

TABELA 8

Actividade de CTL de Células do Baço de Murganhos Balb/c

Imunizados Subcutaneamente (sc) com uma Mistura de R15K (seq id no:l) e o Péptido de Células "T Helper" C19A (seq id no:2)

Imunogénio %de lise especifica a várias razões de E:Ta Células alvo 200:1 100:1 50:1 25:1 p815e 22,9 12,5 7,9 5,1 R15K+122b p815+R15Kf 53, 6 47,4 34,0 25,2 p815+122g 10,6 5,4 3,8' 1,3 R15K+65C p815 8,4 13,4 7,5 4,4 p815+R15K 48,4 27,9 25,3 12,9 P815+122 6,8 9,9 0 0 R15K+66d p815 27,4 16,0 16,0 10,5 P815+R15K 58,8 37,4 33,8 20,7 p815 16,3 7,0 4,1 2,2 a = Razões de efector para célula alvo b = Péptido de célula "T helper" na sua forma monomérica

misturado com R15K

c = Péptido de célula "T helper" na sua forma polimérica misturado com R15K

d = Péptido de célula "T helper" na sua forma de cauda lipidica misturado com R15K e = Células alvo semelhantes em MHC (P815, H-2d)

f = Células alvo P815 pré-incubadas com R15K g = Células alvo P815 pré-incubadas com a forma monomérica de péptido de célula "T helper".

Os murganhos foram imunizados subcutaneamente com a mistura de péptidos emulsificada em adjuvante completo de Freund (1:1) a intervalos bi-semanais durante seis semanas (total de 3 injecções). Os baços foram recolhidos uma semana após a última injecção e re-estimulados durante 5 dias, como descrito por 68

Γ u t

Sastry et al.f 1992. 0 péptido 122 é um péptido estimulante de células "T helper" que possui a sequência CRIKQIINMWQGVGKAMYA, também aqui referido como C19A (seq id no: 2); o R15K é um péptido indutor de CTL que possui a sequência RIQRGPGRAFVTIGK (seq id no:l). Ambas as sequências têm origem na sequência de gpl20 de HIV-1 (Sastry et ai., 1991; 1992). 69

TABELA 9

Actividade de CTL das Células do Baço de Murganhos Balb/c Imunizados Subcutaneamente (sc) com uma Mistura de R15K (seq id no:l) e o Péptido de Células "T Helper" C19A (seq id no: 2) # de Injecções % de lise especifica a várias razões de E: Ta Células alvo 100:1 50:1 25:1 12,5:1 1 P815c 2,9 4', 7 3,3 3,3 P815+R15Kd 11,0 7,7 3, 6 0,1 P815+122e 9,4 3, 8 2,2 1,6 2 P815 5,5 3,8 1,6 1,8 P815+R15K 13,1 11,0 5,0 0,8 P815+122 3, 0 4,3 2,8 1,8 3 P815 6,6 3, 6 4,3 4,3 P815+R15K 13,7 4,3 5,6 0,5 P815+122 10,5 5,2 4,9 6,8 a = Razões de efector para célula alvo b = Os murganhos foram imunizados uma, duas ou três vezes com uma mistura de R15K e a forma monomérica de péptido de células "T helper"

c = Células alvo semelhantes em MHC (P815, H-2d) d = Células alvo P815 pré-incubadas com R15K e = Células alvo P815 pré-incubadas com a forma monomérica de péptido de células "T helper"

Os murganhos foram imunizados subcutaneamente com a mistura de péptidos emulsif içada em CFA (1:1) a intervalos de duas semanas. Uma semana após cada injecção, foram recolhidas células do baço e re-estimuladas como descrito por Sastry et al., 1992.

Até à data, o péptido R15K, por si só, não foi apresentado por nenhum outro grupo como sendo capaz de induzir uma resposta de CTL. Mas os presentes inventores, como aqui revelado, 70 jj“ L-C< ^ demonstraram indução de CTL no nódulo linfático do popliteo no espaço de 7 dias, através de uma única imunização id de murganhos Balb/c apenas com R15K (FIGURA 12A) . Foi por is'so pensado que uma mistura consistindo em R15K e o péptido "T helper", quando injectada uma vez por via id pode ser suficiente para atingir disseminação sistémica e longevidade de resposta de CTL especifica para HIV.

Foram imunizados um número de murganhos com uma única injecção id nas almofadas da pata quer com o péptido de CTL (R15K) isolado, quer em mistura com o péptido "T helper" C19A (seq id no:2). Os resultados (FIGURA 12) mostraram que murganhos imunizados com a mistura tinham respostas de CTL substancialmente mais altas no baço do que murganhos que tivessem recebido apenas o péptido R15K isolado (FIGURA 12B) . Adicionalmente, a resposta de CTL de nível alto no baço foi mantida durante até oito semanas após uma única injecção id, enquanto que o péptido de células "T helper" (C19A, seq id no:l) injectado juntamente não possuía actividade de indução de CTL.

Lasarte et al. (1992) relataram recentemente que injecções múltiplas intraperitoneais de misturas de um epitopo de CTL contendo R15K e um epitopo de células "T helper", KQUIINMWQEVGKAMYA, em murganhos induziram uma resposta de CTL específica para HIV de nível baixo, após três semanas. Contudo, nestas experiências, o péptido de CTL, por si só, não foi capaz de induzir CTLs específicos para HIV, mesmo após injecções múltiplas. Por isso, o papel do péptido de "T helper" nestes estudos não é claro. Por outro lado, os estudos acima descritos demonstram que o péptido de CTL possui a capacidade de induzir CTL e o papel do péptido de "T helper" é disseminar e aumentar essa resposta de CTL inerente, do péptido de CTL. Estes estudos indicam por isso que de modo a obter uma imunidade mediada pelas células, eficaz, sistémica e de longa duração, a preparação de 71 Γ |γ~7Γ^........(Ν

vacina candidata deverá incluir idealmente ambos os péptidos de "T helper" e de CTL. Outro aspecto importante desta invenção é que uma tal mistura fornecida intradermicamente uma vez é suficiente para induzir uma resposta de CTL especifica para o antigénio, de longa duração e sistémica. EXEMPLO 7 - Indução Rápida de CTLs Específicos para o Vírus da Gripe e para o Vírus Sendai

Cria-se que o protocolo desenvolvido para a indução de CTLs específicos para o HIV, como acima descrito no EXEMPLO 5, seria aplicável de um modo geral para a identificação, selecção e ensaio de qualquer péptido com especificidade de epitopo desconhecida, quanto à sua capacidade para iniciar CTLs in vivo. De acordo com o exposto, foi examinada a indução pelo péptido de CTLs específicos para o vírus da gripe. Deres et al.r (1989) demonstraram previamente que um péptido sintético R“, TYQRTRALVTG (aa 147-158), correspondendo a uma porção da nucleoproteína do vírus da gripe, poderia iniciar CTLs específicos para o vírus em murganhos in vivo, apenas quando ligado covalentemente através do terminal N a tripalmitoil-S-glicerilcisteinil-seril-serina (P3CSS). Contudo, utilizando o protocolo descrito acima, CTLs específicos para CD8+, que lisaram células alvo pré-tratadas com este péptido, podiam ser induzidos in vivo por imunização com péptido sintético livre (TABELA 10).

Empregando este protocolo de imunização, foi também gerada com sucesso uma resposta de CTL in vivo, contra o péptido sintético livre não modificado, HGEFAPGNYPALWSYA, que representa o epitopo de CTL imunodominante da nucleoproteína do vírus Sendai (B105: NP 321-336).

Assim, este método revelou na verdade ser útil noutros sistemas que não aqueles relacionados com o vírus HIV. Além 72

V

disso, crê-se que este método de pesquisa rápido terá utilidade médica para o desenvolvimento de vacinas candidatas e terapêuticas para vários agentes infecciosos. 73

V

TABELA 10

Iniciação In Vivo de CTLs Específicos para o Péptido em Murganhos Balb/c com um Péptido Sintético Livre (Β106) da Nucleoproteina do Vírus da Gripe

Tratamento para Células Efectoras Células Alvo % de Lise Específica a Várias Razões de E:Ta 160:1 80:1 40:1 20:1 Sem Tratamento Ρ8'15β 5,7 0 0 2,5 Sem Tratamento P815+B106C 83, 9 76, 6 57,1 47,3 Sem Tratamento P815+B105d 11,0 26,0 19,3 16,0 + Complemento P815+B106 83,3 73, 6 58,2 39,7 + anti-CD4 + C P815+B106 67,2 59,3 40,7 25,8 + anti-CD8 + C P815+B106 2,5 0 0 0,4 + anti-CD4 P815+B106 64,8 67,9 44,7 24,8 + anti-CD8 P815+B106 53,6 43,3 23,7 5,8 Sem Tratamento 3A9e 0' 0 NR NR Sem Tratamento 3A9+B106r 0 0 0 0 NR = Não Realizado a = E:T = Razão de Efector para célula alvo b = Células alvo semelhantes em MHC (H-2d) c = Células alvo H-2d pré-tratadas com péptido do vírus da gripe d = Células alvo H-2d pré-tratadas com péptido do vírus Sendai e = Células alvo não semelhantes em MHC (H-2k) f = Células alvo H-2k pré-tratadas com péptido do vírus da gripe 74 r EXEMPLO 8 - Inibição de Infecção por HIV-1 e Formação de

Sincicios por Células Humanas, por Péptidos Sintéticos de gpl20. 0 presente exemplo descreve a identificação e utilização de péptidos sintéticos, derivados de gpl20, para proteger células humanas contra infecção por HIV-1, e para inibir formação de sincicios. As células MT-4 são células T humanas que são infectadas cronicamente pelo virus tipo 1 da leucemia das células T humanas, e sofrem infecção litica por HIV-1 (Larder et al., 1989). Por isso, a inibição de infecção por HIV-1 de células MT-4 prevenirá a morte celular.

Foi investigada a capacidade de péptidos sintéticos derivados de gpl20 inibirem a infecção de células por HIV. Foi obtida evidência para demonstrar que péptidos sintéticos de comprimento variado (8-24 aminoácidos) seleccionados da ansa V3 de gpl20, inibiram infecção por HIV das células T humanas cultivadas (FIGURAS 13, 14 & 15), bem como das células T humanas primárias preparadas de fresco (FIGURA 16).

Foi observado que tanto o péptido N24G de 24 aminoácidos (aa 308-311, NNTRKSIRIQRGPGRAFVTIGKIG, seq id no:3) como o péptido R15K de 15 aminoácidos (aa 315-329, RIQRGPGRAFVTIGK, seq id no:l), com sequências derivadas da ansa V3 de HIV-1 IIIB, inibiram a infecção por HIV-1 de células T primárias humanas em 92% a uma concentração de 1 μρ/ιηΐ (aproximadamente 0,4-0,6 μΜ) (FIGURA 16). Uma forma mais curta de 8 aminoácidos do péptido da ansa V3, R8K (aa 322-329, RAFVTIGK, seq id no:5) também apresentou 66% de inibição de infecção de células T primárias humanas por HIV-1 a uma concentração de 1 μρ/ιτιΐ (aproximadamente 1,25 μΜ) (FIGURA 16). Péptidos sintéticos de regiões da ansa V3 de isolados heterólogos, HlV-lmn (T13Q, TKGPGRVIYATGQ, seq id 75 t no: 6) e HlV-lrf (H13N, HIGPGRAFYTTKN, seq id no:7), também apresentaram inibição significativa (>60%), cada um a uma concentração de 1 μς/ιηΐ (aproximadamente 0,78 μΜ), de células pela estirpe IIIB (FIGURA 16).

Uma variedade de outros péptidos com sequências derivadas das ansas V3 de outras estirpes de HIV-1 também demonstraram exibir actividade significativa em relação à inibição de infecção de células humanas por HIV-1 IIIB. Como detalhado na TABELA 11A, estes péptidos incluem D23, D24, D25, D30, D35, D38, D39, D40 e D44, que reflectem uma variedade de estirpes tais como mn, rf, wmj-3, sc, z6, eli, mn (y-1) e mn (y-p). Contudo, é importante notar que este ensaio foi especificamente confinado para a inibição da infecção da estirpe heteróloga HIV-1 IIIB. Por isso, péptidos, tais como os da TABELA 11B, que não apresentaram actividade neste ensaio específico, podem ainda assim ter utilidade como sequências inibidoras de infecção para combater a variedade de estirpes de HIV conhecidas como. estando presentes na população humana infectada. 76 V » r

TABELA 11A

EFEITO DE PÉPTIDOS DA ANSA V3 NA INFECÇÃO DE CÉLULAS HUMANAS POR

HIV-1 IIIB PÉPTIDO NO. ESTIRPE SEQUÊNCIA ACTIVIDADE %INIBIÇÃO DE RT (CPM) DE RT D23(24aa) MN YNKRKRIHIGPGRAFYTTK NNIGC 94 98,8 D24(15aa) MN RIHIGPGRAFYTTKN 5000 22,1 D25(15aa) WMJ-3 SLSIGPFRAPRTREI 4342 42,4 D26(24aa) RF NNTRKSITKGPGRVIYATG QIIGD 2093 72,2 D30(15aa) SC SIHIGPGRAFYATGD 3443 54,3 D35(15aa) Z62 STPIGLGQALYTTRG 5242 30,3 D38(15aa) ELI RTPTGLGQSLYTTRS 5823 33, 7 D39(15aa) MN(Y-L) RIHIGPGARFLTTKN 1978 73,8 D40(15aa) MN(Y-F) RIHIGPGRAFFTTKN 2805 62,8 D44(15aa) R15K IIIB RIQRGPGRAFVTIGK 2021 73,2 Células não infectadas 558 — 77 Γ TABELA 11Β

EFEITO DE PÉPTIDOS DA ANSA V3 NA INFECÇÃO DE CÉLULAS HUMANAS POR

HIV-1 IIIB PÉPTIDO NO. ESTIRPE SEQUÊNCIA ACTIVIDADE DE RT (CPM) %INIBIÇÃO DE RT D27(15aa) NY-5 GIAIGPGRTLYAREK 7657 0 D28(15aa) RF SITKGPGRVIYATGQ 7634 0 D29(15aa) CDC4 RVTLGPGRVWYTTGE 13009 0 D31(15aa) Z3 SIRIGPGKVFTAKGG 11877 0 D32(15aa) SF2 SIYIGPGRAFHTTGR 8002 0 D33(15aa) MAL GIHFGPGQALYTTGI 8959 0 D34(15aa) Z321 SISIGPGRAFFATTD 11142 0 D37(15aa) JY1 STPIGLGQALYTTRI 7027 0 Sem Péptido 7528 0 Células não 558 - infectadas

Foi também determinada a capacidade do péptido E13V, EQLWVTVYY GVPV (seq id no:4), da porção do terminal amino de gpl20, para inibir infecção de células T primárias humanas por HIV-1. Observou-se que este péptido, a uma concentração tão baixa como 1 ng/ml (aproximadamente 0,77 nM) , inibiu a infecção por HIV-1 em 90% (FIGURA 18).

Foram realizados outros estudos para determinar o efeito de péptidos sintéticos da ansa V3 de diferentes estirpes de HIV-1 na formação de sincicio. Para estes estudos, células HeLa CD4 foram infectadas com virus vaccinia recombinantes expressando a proteína gpl60 do envelope de HIV-1 IIIB, estirpes mn e rf, a uma m.o.i. de 100, na presença e ausência de péptidos da ansa V3 das respectivas estirpes de HIV-1 (i.e., R15K, H13N e T13Q). Às 18 horas após infecção as células foram observadas ao microscópio utilizando uma ampliação de 100, para sincicios. 78

V

Nestes estudos não foram observados sincícios nas células incubadas com os péptidos sintéticos antes da infecção pelos respectivos vírus vaccinia recombinantes. Estes resultados demonstram claramente a capacidade dos péptidos da ansa V3 inibirem a disseminação de HIV-1 célula a célula.

Os estudos foram realizados para examinar a estabilidade do péptido R15K a partir do isolado HIV-1 IIIB no soro. Nestes estudos o péptido R15K (seq id no:l) foi incubado em soro de vitelo fetal a 37°C e a diferentes intervalos de tempo durante a incubação as fracções, a uma concentração final de 1 μς/ιη1 (aproximadamente 0,6 μΜ), foram testadas quanto à inibição da infecção de uma linha celular humana de células T (células MT-4) por HIV-1. Os resultados são apresentados na FIGURA 17. 0 péptido R15K reteve a sua força total de actividade de inibição durante até 4 horas e foi mantida 50% da actividade inibitória do péptido controlo não tratado mesmo após 24 horas de incubação a 37°C em soro de vitelo fetal. É visionado que serão realizados exames de estabilidade em qualquer péptido sintético, ou misturas deste, identificado para utilização clínica potencial. Tais testes incluirão, por exemplo, pré-incubação em soro humano e em plasma; tratamento com várias proteases; e também análises de estabilidade a temperatura e a pH. Se for necessário, a estabilidade dos péptidos sintéticos pode ser aumentada por qualquer um de uma variedade de métodos tais como, por exemplo, empregar d-aminoácidos em vez de 1-aminoácidos para síntese de péptidos; utilizando grupos bloqueadores tais como t-boc e afins; ou encapsular os péptidos dentro de lipossomas. A bio-disponibilidade de misturas seleccionadas de péptidos podem também ser determinadas injectando péptidos marcados radioactivamente em murganhos e em macacos rhesus e subsequentemente analisando a sua distribuição pelos tecidos. 79 7. 7.

r

Adicionalmente à demonstração prévia dos inventores de que o péptido R15K pode induzir respostas de CTL (ver EXEMPLO 5 acima), eles também demonstram que este péptido e os seus análogos de outros isolados de HIV-1 protegem eficientemente células T humanas de infecção por HIV-1. Esta actividade foi demonstrada utilizando células cultivadas tais como células H9, CEM e MT-4, e células T humanas preparadas de fresco. Estes resultados indicam que os péptidos da ansa V3 podem actuar de dois modos separados: 1) induzir linfócitos T citotóxicos específicos para o HIV-1, que matam especificamente células expressando gpl20 de HIV-1; e 2) prevenir a infecção de células normais por virus infeccioso. Assim, estes péptidos da ansa V3 têm utilidade não apenas como vacinas mas também como reagentes terapêuticos para prevenir a infecção por HIV-1 em humanos para reduzir a disseminação da infecção do vírus em indivíduos infectados por HIV. EXEMPLO 9 - Indução de Respostas de células T específicas para HIV em Macacos na Imunização com um "Cocktail" de Péptidos Sintéticos 0 presente exemplo descreve a indução bem sucedida de respostas de células T específicas para o HIV, em macacos rhesus, com uma mistura de oito péptidos sintéticos, sete dos quais foram derivados de regiões conservadas da proteína do envelope de HIV-1. Este resultados demonstrando a indução de respostas de células T específicas para HIV-1 num modelo não primata constitui um passo importante em direcção à identificação e formulação de uma vacina à base de péptidos sintéticos, que podem induzir uma imunidade alargada baseada na mediação celular, para proteger humanos contra a infecção por HIV. 80

V

Nos estudos presente, três macacos rhesus (#7, #23 e #283C) foram imunizados subcutaneamente com 1 ml (0,1 ml/sitio) de uma mistura de oito péptidos sintéticos (300 de cada péptido em água estéril) emulsifiçada em adjuvante de Freund completo a uma razão de 1:1. Estes oito péptidos, denominados 61, 63, 104, 105, 111, 113, 116 e R15K (TABELA 12), foram previamente identificados como péptidos sintéticos activos de células T específicos para gpl60. A 3 e 7 semanas após a imunização primária, foram administradas a cada macaco duas injecções de reforço da mistura de péptidos (150 μg de cada péptido em água estéril) emulsificada em adjuvante incompleto de Freund. O macaco #7 foi sacrificado ao fim de 34 semanas, por razões de saúde não relacionadas com o estudo, enquanto que os dois macacos restantes (#283C e #23) receberam uma injecção de reforço adicional às 25 semanas. TABELA 12

SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS DE PÉPTIDOS IMUNIZANTES

péptido 61 aa 586-598 YLRDQQLLGIWGC péptido 63 aa 519-543 FLGFLGAAGSTMGAASLTLTVQARC péptido 104 aa 45-55 VYYGVPVWKEA péptido 105 aa 48-61 GVPVWKEATTLFC péptido 111 aa 118-130 LWDQSLKPCVKLT péptido 113 aa 204-216 SVITQACSKVSFE péptido 116 aa 240-252 GTGPCTNVSTVQC péptido R15K aa 315-329 RIQRGPGRAFVTIGK A numeração dos aminoácidos dos terminais amino e carboxilo de cada péptido estão de acordo com a sequência relatada por Modrow et al., 1987. 81

V u L—Cj

Foram recolhidos 15 ml de sangue total heparinizado, por punção venosa, a intervalos de duas semanas após a primeira imunização de cada animal. As células mononucleadas do sangue periférico (PBMC) foram separadas por centrifugação padrão com ficoll-hypaque e empregues em ensaios de proliferação. As PBMCs foram monitorizadas de duas em duas semanas durante um período de 32 semanas para respostas proliferativas contra péptidos individuais e gpl60 recombinante.

Observou-se que as PBMCs dos três macacos rhesus apresentaram boas respostas proliferativas com os péptidos 104 (aa 45-55), 111 (aa 118-130) e 63 (aa 519-543); enquanto que foram observadas respostas fracas com os péptidos 113 (aa 204-216) e 116 (aa 240-252) (TABELA 13). Preparações de PBMC derivadas de dois dos três macacos rhesus também apresentaram boas respostas proliferativas com o péptido 61 (aa 586-598) (TABELA 13) . Não foi detectada uma resposta significativa em nenhum dos macacos com os péptidos 105 (aa 48-61) e R15K (aa 315-329). As PBMCs de todos os três macacos apresentaram respostas proliferativas altamente significativas com gpl60 recombinante, o precursor da proteína do envelope de HIV-1, durante todo o período da experiência. 82

TABELA 13

Respostas de Proliferação de Células T

Macaco Rhesus Péptido #7 #23 #283C 104 (aa 45-55) 4 + 2 + 4 + 111 (aa 118-130) 3+ 2+ 3+ 63 (aa 519-543) 2+ 4 + 3+ 113 (aa 204-216) 1+ 2+ 2+ 116 (aa 240-252) 1+ 3+ 2+ 61 (aa 586-598) - 3+ 2+ R15K (aa 315-329) - - - GP160(aa 1-863) 6+ 4 + 4 + (-), resposta não detectável; (1+), resposta fraca; (2+), resposta boa; (3+), resposta melhor; (4+, 6+) , a melhor resposta.

Estes resultados demonstram que misturas de péptidos sintéticos do produto do gene env de HIV podem iniciar respostas de células T especificas para gpl60 em macacos rhesus. Devido à sua capacidade para induzir respostas de célula T especificas tanto em murganhos como em macacos rhesus, estes péptidos de env de HIV são propostos como sendo úteis como componentes de vacinas para prevenir a infecção por HIV em humanos. 83

REFERÊNCIAS

As seguintes referências são aqui incorporadas por referência para o assunto objectivo como especificado na especificação e na medida em que a sua revelação ensina, permite ou proporciona uma base para vários aspectos da presente invenção.

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Weinhold, K.J. et al. J. Immunol. 142:3091-3097 (1989) 88 Í-—Ό t Γ

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL:

(i) REQUERENTE: BOARD OF REGENTS, THE UNIVERSITY OF TEXAS SYSTEM (ii) INVENTORES: SASTRY, Jagannadha K. ARLINGHAUS, Ralph B. PLATSOUÇAS, Chris D. NEHETE, Pramod N.

(iii) TÍTULO DA INVENÇÃO: MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA PROVOCAR RESPOSTAS IMUNITÁRIAS OU ANTI-INFECCIOSAS (iv) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 7 (v) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA: (A) ENDEREÇADO: Arnold, White & Durkee (B) RUA: P.O. Box 4433 (C) CIDADE: Houston (D) ESTADO: Texas

(E) PAÍS: ESTADOS UNIDOS DA AMÉRICA (F) CÓDIGO POSTAL: 77210

(vi) FORMATO DE LEITURA EM COMPUTADOR (A) TIPO DE MEIO: Disquete (B) COMPUTADOR: IBM PC compatível

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAMA INFORMÁTICO: WordPerfect 5.1 (vii) DADOS DA PRESENTE REQUISIÇÃO: (A) NÚMERO DE REQUISIÇÃO: Desconhecido (B) DATA DE ENTRADA: Desconhecida (C) CLASSIFICAÇÃO: Desconhecida (viii) DADOS DE REQUISIÇÃO ANTERIOR: (A) NÚMERO DE REQUISIÇÃO: 07/800 932 (B) DATA DE ENTRADA: 2 de Dezembro de 1991 (C) CLASSIFICAÇÃO: 424 (ix) DADOS DE REQUISIÇÃO ANTERIOR: (A) NÚMERO DE REQUISIÇÃO: 07/945865 89 * (B) DATA DE ENTRADA: 16 de Setembro de 1992 (C) CLASSIFICAÇÃO: Desconhecida (x) INFORMAÇÃO DO ADVOGADO/AGENTE: (A) NOME: Parker, David, L. (B) NÚMERO DE REGISTO: 32 165

(C) NÚMERO DE REFERÊNCIA/FICHEIRO: UTFC305PCT (xi) INFORMAÇÃO DE TELECOMUNICAÇÕES: (A) TELEFONE: 512-320-7200 (B) TELEFAX: 512-474-7577 (C) TELEX: Não Existente i 90 VΓ u

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:l: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 15 amínoácidos (B) TIPO: aminoácidos (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:l:

Arg Ile Gin Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Vai Thr Ile Gly Lys 15 10 15 (3) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:2: (i) CARACTERÍ STICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 19 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:2:

Cys Arg Ile Lys Gin Ile Ile Asn Met Trp Gin Gly Vai Gly Lys Ala 1 5 10 15

Met Tyr Ala (4) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:3: 91

V

u

Asn Asn Thr Arg Lys Ser Ile Arg lie Gin Arg Gly Pro Gly Arg Ala 15 10 15

Phe Vai Thr Ile Gly Lys Ile Gly 20 (5) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:4:

Glu Gin Leu Trp Vai Thr Vai Tyr Tyr Gly Vai Pro Vai 15 10 (6) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 8 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:5:

Arg Ala Phe Vai Thr Ile Gly Lys 1 5 (7) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (C) TIPO DE CADEIA: simples 92 (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:6:

Thr Lys Gly Pro Gly Arg Vai Ile Tyr Ala Thr Gly Gin 1 5 10' (8) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:7:

His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys Asn 15 10

Lisboa, 28 de Abril de 2000

O AGENTE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL V ^ 93

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Composição compreendendo um primeiro e um segundo péptidos, compreendendo o primeiro péptido um epitopo indutor de CTL e compreendendo o segundo péptido uma sequência peptídica inibidora de infecção por HIV que inibe a entrada de HIV numa célula alvo.
2. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que o primeiro péptido compreende uma sequência que é simultaneamente um epitopo indutor de CTL e uma sequência peptidica inibidora de infecção por HIV, que inibe a entrada de HIV numa célula alvo.
3. Composição de acordo com a reivindicação 1 ou 2, compreendendo ainda um terceiro péptido, em que o terceiro péptido compreende um epitopo indutor de célula "T helper" que aumenta a resposta de CTL.
4. Composição de acordo com a reivindicação 3, em que o epitopo indutor de célula "T helper" que aumenta a resposta de CTL é caracterizado por possuir um valor de anfipaticidade de desde cerca de mais 10 até cerca de mais 20.
5. Composição de acordo com a reivindicação. 3 ou 4, em que a sequência do primeiro, segundo ou terceiro péptido compreende uma sequência derivada de um produto de um gene de HIV.
6. Composição de acordo com a reivindicação 5, em que a sequência do péptido compreende um epitopo indutor de CTL que compreende uma sequência de acordo com as apresentadas na TABELA 1. 1
7. Composição de acordo com a reivindicação 5, em que a sequência do primeiro, segundo ou terceiro péptido compreende uma sequência derivada de um produto do gene do envelope de HIV.
8. Composição de acordo com a reivindicação 7, em que a sequência do primeiro, segundo ou terceiro péptido compreende uma sequência derivada de gpl20 de HIV.
9. Composição de acordo com a reivindicação 8, em que a sequência do péptido compreendendo um epitopo indutor de CTL compreende uma sequência derivada da ansa V3 de gpl20 de HIV.
10. Composição de acordo com a reivindicação 9, em que a sequência do péptido indutor de CTL derivado da ansa V3 compreende uma sequência de acordo com as apresentadas na TABELA 2.
11. Composição de acordo com a reivindicação 10, em que a sequência do péptido indutor de CTL derivado da ansa V3 inclui a sequência RIQRGPGRAFVTIGK (R15K, seq id no:l).
12. Composição de acordo com a reivindicação 8, em que a sequência do péptido compreendendo o epitopo indutor de célula "T helper" que aumenta a resposta de CTL compreende uma sequência derivada de uma sequência de gpl20 de HIV, caracterizada por possuir um valor de anfipaticidade de desde cerca de mais 10 até cerca de mais 20.
13. Composição de acordo com a reivindicação 12, em que a sequência do péptido indutor de célula "T helper" que aumenta a resposta de CTL, inclui a sequência CRIKQIINMWQGVGKAMYA (C19A, seq id no:2). 2 V

l-C
14. Composição de acordo com a reivindicação 7, em que o péptido compreendendo a sequência do péptido inibidor de infecção por HIV, compreende uma sequência em que anticorpos contra essa sequência são capazes de inibir infecção celular por HIV.
15. Composição de acordo com a reivindicação 8, em que a sequência do péptido inibidor de infecção por HIV, compreende uma sequência derivada da ansa V3, a porção do terminal N, ou da região de ligação a CD4 da gpl20 de HIV.
16. Composição de acordo com a reivindicação 15, em que a sequência do péptido inibidor de infecção por HIV compreende uma sequência de acordo com as apresentadas na TABELA 11A.
17. Composição de acordo com a reivindicação 15, em que a sequência do péptido inibidor de infecção por HIV inclui a sequência RIQRGPGRAFVTIGK (R15K, seq id no:l), NNTRKSIRIQRGPGRAFVTIGKIG (N24G, seq id no:3), EQLWVTVYYGVPV (E13V, seq id no:4), RAFVTIGK (R8K, seq id no:5), TKGPGRVIYATGQ (T13Q, seq id no:6), ou HIGPGRAFYTTKN (H13N, seq id no:7).
18. Composição de acordo com a reivindicação 17, em que a sequência do péptido inibidor de infecção por HIV inclui a sequência EQLWVTVYYGVPV (E13V, seq id no:4).
19. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que os péptidos são péptidos monómeros, polímeros ou de cauda lipídica. 3 V
20. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que os péptidos são dispersos num veículo farmacologicamente aceitável.
21. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que a sequência do primeiro péptido é derivada de uma proteína do vírus da gripe ou de uma proteína do vírus Sendai.
22. Composição de acordo com a reivindicação 21, em que a sequência do péptido inclui a sequência TYQRTRALVTG ou H GE FAPGNYPALWS ΥΑ.
23. Utilização de uma composição de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 22, na preparação de um medicamento para produzir uma resposta imunitária num mamífero.
24. Utilização de uma composição de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 22, na preparação de um medicamento para inibir a infecção de uma célula alvo por HIV.
25. Método para preparar células T citotóxicas especificamente iniciadas para uma composição seleccionada, compreendendo o método: (a) imunizar um animal com a composição de qualquer das reivindicações 1 a 22 capaz de iniciar células T citotóxicas; e 4 nódulos animal (b) recolher as células T a partir de linfáticos de drenagem do referido imunizado. Lisboa, 28 de Abril de 2000 O AGENTE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL

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