JP2008528060A - ボツリヌス神経毒素を中和する治療的モノクローナル抗体 - Google Patents
ボツリヌス神経毒素を中和する治療的モノクローナル抗体 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2008528060A JP2008528060A JP2008500705A JP2008500705A JP2008528060A JP 2008528060 A JP2008528060 A JP 2008528060A JP 2008500705 A JP2008500705 A JP 2008500705A JP 2008500705 A JP2008500705 A JP 2008500705A JP 2008528060 A JP2008528060 A JP 2008528060A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cdr3
- cdr1
- domain
- cdr2
- bont
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
- C07K16/1267—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria
- C07K16/1282—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria from Clostridium (G)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P39/00—General protective or antinoxious agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P39/00—General protective or antinoxious agents
- A61P39/02—Antidotes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
- A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
Abstract
Description
本願は、米国特許出願第60/648,256号(2005年1月27日出願)(これは、全ての目的のためにその全体が本明細書中に参考として援用される)に基づく優先権およびその利益を主張する。
本発明は、National Institutes of Healthによって授与された助成金番号:AI53389およびAI56493、ならびにDepartment of Defense Grants DAMD17−03−C−0076およびDAMD17−98−C−8030による政府支援によってなされた。政府は、本発明において特定の権利を有する。
本発明は、ボツリヌス神経毒素(例えば、BoNT/A)を中和する抗体、およびボツリヌス中毒の処置におけるそれらの使用に関する。
ボツリヌス中毒は、クロストリジウム属のメンバーによって分泌されるボツリヌス神経毒素によって引き起こされ、そしてボツリヌス中毒は、弛緩性麻痺によって特徴付けられ、直ちに致命的でない場合、ボツリヌス中毒は、集中治療室および機械換気における長期の入院を必要とする。天然に存在するボツリヌス中毒は、胃腸管がクロストリジウム属の細菌によってコロニー形成される乳児または成人(乳児ボツリヌス中毒または腸管ボツリヌス中毒)、汚染された食品の摂取後(食物ボツリヌス中毒)、あるいは嫌気性の創傷感染(創傷ボツリヌス中毒)に見出される(非特許文献1:「www.bt.cdc.gov/agent/Botulism/index.asp」にてダウンロード可能)。ボツリヌス神経毒素(BoNT)はまた、それらの極度の効力および死亡率、生産および輸送の容易性、ならびに長期の集中治療の必要性(非特許文献2)に起因して、Centers for Disease Control(CDC)によって、生物テロリズムに関して最も高い危険性を有する6種の脅威因子(threat agent)(「Category A agent」)のうちの1種として分類される。イラクおよびかつてのソビエト連邦の両方は、兵器として使用するためにBoNTを生産し(非特許文献3;非特許文献4)、そして日本のカルトであるオウム真理教は、生物テロリズムにBoNTを使用することを試みた(Arnonら(2001)前出)。これらの脅威の結果として、特定の薬学的因子は、中毒の予防および処置に必要とされる。
Center for Disease Control、(1998)、Botulism in the United States,1899−1998,Handbook for epidemiologists,clinicians,and laboratory workers、Atlanta、Georgia U.S.Department of Health and Human Services,Public Health Service Arnonら、JAMA、2001年、第285巻、p.1059−1070 United Nations Security Council、(1995)、Tenth report of the executive committee of the special commission established by the secretary−general pursuant to paragraph 9(b)(I)of security council resolution 687(1991)、and paragraph 3 of resolution 699(1991)on the activities of the Special Commision Bozheyevaら、(1999)、Former soviet biological weapons facilities in Kazakhstan:past、present、and future.Center for Nonproliferation Studies、Monterey Institute of International Studies Siegel、J.Clin.Microbiol.、1988年、第26巻、p.2351−2356 Smith、Toxicon、1998年、第36巻、p.1539−1548 Franzら、Botulinum and Tetanus Neurotoxins:Neurotransmission and Biomedical Aspects、B.R.DasGupta(編)、Plenum Press、New York、1993年、p.473−476、 BlackおよびGunn、Am.J.Med.、1980年、第69巻、p.567−570 Hibbsら、Clin.Infect.Dis.、1996年、第23巻、p.337−340 Arnon、Clinical trial of human botulism immune globulin.、、B.R.DasGupta(編)、Botulinum and Tetanus Neurotoxins:Neurotransmission and Biomedical Aspects、Plenum Press、New York、1993年、p.477−482. Nowakowskiら、Proc.Natl.Acad.Sci.U S A、2002年、第99巻、p.11346−50 Hatheway、Curr.Top.Microbio.Immunol、1995年、第195巻、p.55−75 Ogumaら、Lancet、1990年、第336巻、p.1449−1450 Demarchiら、Bull.Acad.Nat.Med.、1958年、第142巻、p.580−582 Sonnabendら、J.Infect.Dis.、1981年、第143巻、p.22−27 MiddlebrookおよびFranz、Botulinum Toxins、第33章、Medical Aspects of Chemical and Biological Warfare.TMM publications、Washington、D.C.、1997年、F.R.Sidell、E.T.Takafuji、D.R.Franz(編) Kozakiら、Infect.Immun.、1998年、第66巻、p.4811−4816 Kozakiら、Microbiol.Immunol.、1995年、第39巻、p.767−774
本発明は、ボツリヌス神経毒素に結合し、かつボツリヌス神経毒素を中和する抗体に関する。本発明者らは、ボツリヌス神経毒素(BoNT)血清型の特に有効な中和は、特定の神経毒素血清型の2種以上のサブタイプを、高親和性で結合する中和抗体の使用によって達成され得ることを見出した。これは、上記サブタイプの各々に対する2種以上の異なる抗体を使用することによって達成され得るが、特定の実施形態において、各々の抗体が少なくとも2種のBoNTサブタイプと交差反応性である場合、よりさらに効率的な中和が、1種以上の抗体の使用によって達成される。特定の実施形態において、本発明は、2種以上のBoNTサブタイプ(例えば、BoNT/A1、BoNT/A2、BoNT/A3など)を高親和性で結合する中和抗体を含む組成物を提供する。
「BoNTポリペプチド」とは、ボツリヌス神経毒素ポリペプチド(例えば、BoNT/Aポリペプチド、BoNT/Bポリペプチド、BoNT/Cポリペプチドなど)をいう。BoNTポリペプチドとは、完全長ポリペプチドまたはそのフラグメントをいい得る。したがって、例えば、用語「BoNT/Aポリペプチド」とは、完全長BoNT/A(A型の血清型のClostridium botulinumによって産生される神経毒素)またはそのフラグメント(例えば、Hcフラグメント)のいずれかをいう。HCフラグメントは、BoNT/Aの約50DaのC末端フラグメント(残基873〜1296)である(LacyおよびStevens(1999)J.Mol.Biol.、291:1091−1104)である。
本発明は、ボツリヌス神経毒素A型(特定の実施形態において、他のボツリヌス神経毒素血清型(例えば、B、C、D、E、Fなど))に特異的に結合し、そしてそれを中和する新規の抗体を提供する。ボツリヌス神経毒素は、嫌気性細菌Clostridium botulinumによって産生される。ボツリヌス神経毒素中毒(ボツリヌス中毒)は、多くの状況(context)において生じ、その状況としては、食中毒(食物媒介性ボツリヌス中毒)、感染した創傷(創傷ボツリヌス中毒)、ならびに芽胞の摂取および乳児の腸管における毒素の産生に由来する「乳児ボツリヌス中毒」が挙げられるが、これらに限定されない。ボツリヌス中毒は、代表的に脳神経の関与によって始まり、そして四肢を含んで末端に進行する麻痺性疾患である。急性の場合において、ボツリヌス中毒は、致命的であり得る。
特定の理論に拘束されることはないが、ボツリヌス中毒(ウマおよびヒト)を処置するために使用される現在の抗毒素は、約5000マウスLD50/mg(ヒト)の効力および55,000マウスLD50mg(ウマ)の効力を有すると考えられる。
特定の好ましい実施形態において、1種(しかし、より好ましくは少なくとも2種)のBoNTサブタイプに結合するBoNT中和抗体が、選択される。多くのサブタイプが、各BoNT血清型に関して公知である。したがって、例えば、BoNT/Aサブタイプとしては、BoNT/A1、BoNT/A2、BoNT/A3などが挙げられるが、これらに限定されない(例えば、図11を参照のこと)。例えば、BoNT/A1サブタイプとしては、62A、NCTC 2916、ATCC 3502、およびHall hyper(Hall Allergan)が挙げられるが、これらに限定されないこと、ならびにBoNT/A1サブタイプは、同一(アミノ酸で99.9〜100%の同一性)であること、ならびにBoNT/A1サブタイプは、サブタイプA1として分類されていることもまた、示される(図12A)。BoNT/A2配列(Kyoto−FおよびFRI−A2H)(Willemsら、(1993)Res.Microbiol.144:547−556)は、アミノ酸レベルで100%同一である。(本発明者らがA3と称している)別のBoNT/Aサブタイプは、スコットランドにおける感染で多くの者を殺したLoch Mareeと称される株によって産生される。本発明者らは、A1毒素およびA2毒素の両方と交差反応する本明細書中に記載される3種の抗体(表1を参照のこと)がまたA3毒素と交差反応するというデータを有する(これらは、CR1、ING1、およびRAZ1である)。別のBoNT/A毒素(本発明者らがを同定した)を、本発明者らは、A4と称する。それは、B毒素およびA毒素の両方を産生するクロストリジウム属の二価の株によって産生される。
完全な軽鎖についての配列は、軽鎖フレームワーク1+軽鎖CDR1+軽鎖フレームワーク2+軽鎖CDR2+軽鎖フレームワーク3+軽鎖CDR3+軽鎖フレームワーク4である。
(A.BoNT中和抗体の組換え発現)
本明細書中に提供される情報を用いて、本発明のボツリヌス神経毒素中和抗体は、当業者に周知の標準的な技術を使用して調製される。
本発明のBoNT中和抗体は、個体、対立遺伝子、株、または種の改変体、およびそのフラグメント(それらの天然に存在する(完全長)形態および組換え形態の両方において)を含む。特定の実施形態において、好ましくは抗体は、本明細書中に記載される抗体(例えば、S25、C25、C39、1C6、3D12、B4、1F3、HuC25、AR1、AR2、WR1(V)、WR1(T)、3−1、3−8、3−10、CR1、RAZ1、1D11、2G11、5G4、ING1、および/またはING2)によって結合される1種以上のエピトープを結合するために選択される。特定の好ましい抗体は、2種以上のBoNTサブタイプ(例えば、BoNT/A1、BoNT/A2、BoNT/A3など)と交差反応性である。上記抗体は、それらのネイティブな構造またはネイティブではない構造において生じ得る。抗イデオタイプ抗体もまた、産生され得る。特定のエピトープに特異的に結合する抗体を作製する多くの方法は、当業者に公知である。以下の考察は、利用可能な技術の一般的な外観として存在する;しかし、当業者は、以下の方法における多くのバリエーションが公知であることを認識する。
ポリクローナル抗体を産生する方法は、当業者に公知である。簡単にいうと、免疫原(例えば、BoNT/A1もしくはBoNT/A2、BoNT/A1 HcもしくはBoNT/A2 Hc、またはBoNT/A1下位配列もしくはBoNT/A2下位配列(本明細書中に開示されるクローンS25、C25、C39、1C6、3D12、B4、1F3、HuC25、AR1、AR2、WR1(V)、WR1(T)、3−1、3−8、3−10、および/もしくはCR1、RAZ1、1D11、2G11、5G4、ING1、ならびに/またはING2によって発現される抗体によって特異的に結合されるエピトープを含む下位配列が挙げられるが、これに限定されない))、好ましくは精製されたポリペプチド、適切なキャリア(例えば、GST、キーホールリンペットヘモシアニンなど)とカップリングされたポリペプチド、または組換えワクシニアウイルス(米国特許第4,722,848号を参照のこと)などの免疫化ベクターに組み込まれるポリペプチドは、アジュバントと混合され、そして動物は、その混合物によって免疫化される。上記免疫原調製物に対する哺乳動物の免疫応答は、試験採血(test bleed)を行い、そして目的のポリペプチドに対する反応性の力価を決定することによってモニタリングされる。免疫原に対して適切に抗体の高い力価が得られる場合、血液が動物から回収され、そして抗血清が調製される。さらに上記BoNT/Aポリペプチドに対して反応性である抗体を濃縮するために、上記抗血清の分別が、行われる(例えば、Coligan(1991)Current Protocols in Immunology Wiley/Greene、NY;ならびにHarlowおよびLane(1989)Antibodies:A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press、NYを参照のこと)。
いくつかの場合において、種々の哺乳動物宿主(例えば、マウス、げっ歯類、霊長類、ヒトなど)からモノクローナル抗体を調製することが、望ましい。このようなモノクローナル抗体を調製するための技術の説明は、例えば、Stitesら(編)Basic and Clinical Immunology(第4版)Lange Medical Publications、Los Altos、CA、およびその中に引用される参考文献;HarlowおよびLane、前出;Goding、(1986)Monoclonal Antibodies:Principles and Practice(第2版)Academic Press、New York、NY;ならびにKohlerおよびMilstein、(1975)Nature 256:495−497に見出される。
(A.ファ−ジディスプレイは抗体の親和性を増大させるために使用され得る)
より高い親和性の抗体を作製するために、結合scFv(例えば、表2、および/または表6、および/または表9および/または13)の配列に基づく変異scFv遺伝子レパートリーが、作製され得、そしてファージの表面上に発現され得る。細菌に感染するウイルス(バクテリオファージまたはファージ)の表面上での抗体フラグメントの提示は、広範な親和性および動態特性を有するヒトまたは他の哺乳動物の抗体(例えば、scFv)を産生することを可能にする。ファージの表面上に抗体フラグメントを提示する(ファージディスプレイ)ために、抗体フラグメント遺伝子は、ファージ表面タンパク質(例えば、pIII)をコードする遺伝子中に挿入され、そして抗体フラグメント−pIII融合タンパク質は、そのファージ表面上に発現される(McCaffertyら、(1990)Nature、348:552−554;Hoogenboomら、(1991)Nucleic Acids Res.、19:4133−4137)。
変異scFv遺伝子レパートリーを作製するための1つのアプローチは、結合性scFv由来のVH遺伝子またはVL遺伝子のいずれかをVH遺伝子のレパートリーまたはVL遺伝子のレパートリーで置換すること(鎖シャッフリング)を包含する(Clacksonら、(1991)Nature、352:624−628)。このような遺伝子レパートリーは、結合性scFvと同じであるが、点変異を有する生殖系列遺伝子に由来する多くの変異する遺伝子を含む(Marksら、(1992)Bio/Technology、10:779−783)。軽鎖シャッフリングまたは重鎖シャッフリングおよびファージディスプレイを使用して、例えば、BoNT/A1/BoNT/A2−中和抗体フラグメントの結合アビディティは、劇的に増大され得る(例えば、Marksら、(1992)Bio/Technology、10:779−785(ハプテンフェニルオキサゾロン(phox)を結合したヒトscFv抗体フラグメントの親和性が、300nMから15nM(20倍)に増大した)を参照のこと)。
抗原に接触するアミノ酸側鎖の大部分は、相補性決定領域(CDR)(VHにおいて3個(CDRl、CDR2、およびCDR3)およびVLにおいて3個(CDRl、CDR2、およびCDR3))に位置する(Chothiaら、(1987)J.Mol.Biol.、196:901−917;Chothiaら、(1986)Science、233:755−8;Nhanら、(1991)J.Mol.Biol.、217:133−151)。これらの残基は、抗原に対する抗体の親和性を担う大部分の結合エネルギー論に寄与する。他の分子において、リガンドに接触するアミノ酸を変異させることは、1つのタンパク質分子の、その結合パートナーに対する親和性を増大させる有効な手段であることが、示されている(Lowmanら、(1993)J.Mol.Biol.、234:564−578;Wells(1990)Biochemistry、29:8509−8516)。したがって、CDRの変異(ランダム化)、およびBoNT/A、BoNT/A HCまたは本明細書中で同定されるそれらのエピトープに対するスクリーニングは、改良された結合親和性を有するBoNT/A−中和抗体を産生するために使用され得る。
BoNT−中和(scFv’)2抗体を作製するために、2種のBoNT−中和scFvが、リンカー(例えば、炭素リンカー、ペプチドなど)または例えば、2つのシステインの間のジスルフィド結合のいずれかを介して連結される。したがって、例えば、ジスルフィド結合したBoNT/A−中和scFvを作製するために、システイン残基が、BoNT/A−中和scFvのカルボキシ末端におけるmycタグとヘキサヒスチジンタグとの間の位置指定突然変異誘発によって導入され得る。正しい配列の導入は、DNA配列決定によって検証される。好ましい実施形態において、上記構築物は、pelBリーダーが発現したscFvをペリプラズムに指向させ、かつBoNT/A−中和変異scFvを導入するためのクローニング部位(NcolおよびNotl)が存在するようなpUC119中にある。発現したscFvは、そのC末端にmycタグを有し、その後ろに2個のグリシン、システイン、次いでIMACによる精製を容易にする6個のヒスチジンを有する。2つのシステイン残基の間のジスルフィド結合の形成後、2つのscFvは、互いから26アミノ酸(2つの11アミノ酸のmycタグおよび4個のグリシン)によって隔てられる。この構築物から発現され、IMACによって精製されたscFvは、モノマーのscFvを優勢に含み得る。(scFv’)2ダイマーを産生するために、そのシステインは、1MM β−メルカプトエタノールと一緒にインキュベートすることによって還元され、そしてそのscFvの半分は、DTNBの添加によってブロックされる。ブロックされたscFvおよびブロックされていないscFvは、一緒にインキュベートされて(scFv’)2を形成し、そして得られた物質は、必要に応じて、ゲル濾過によって分析され得る。BoNT−中和scFv’モノマーおよびBoNT−中和(scFv’)2ダイマーの親和性は、必要に応じて、本明細書中に記載されるようにBIAcoreによって決定され得る。
BoNT−中和抗体(例えば、BoNT/A1−A2−中和scFv)またはより高い親和性を有する改変体は、サイズおよび価についての改変体を作製するのに適したテンプレートである。例えば、BoNT/A1−A2−中和(scFv’)2は、上に記載されるような親scFv(例えば、CR1、RAZ1、ING1、ING2など)から作製され得る。scFv遺伝子は、適切な制限酵素を使用して切除され得、そして本明細書中に記載されるような別のベクター中にクローニングされ得る。
好ましい実施形態において、BoNT−中和抗体の選択(ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、免疫法、ハイブリドーマ技術などによって産生されたかにかかわらず)は、得られた抗体を、適切な抗原に対する特異的結合についてスクリーニングすることを包含する。簡単な場合において、適切な抗原としては、BoNT/A1、BoNT/A2、BoNT/A3 HC、BoNT重鎖のC末端ドメイン(結合ドメイン)、BoNT/A3ホロ毒素、または組換えBoNTドメイン(例えば、HC(結合ドメイン)、HN(輸送ドメイン)、またはLC(軽鎖))が挙げられるが、これらに限定されない。特に好ましい実施形態において、上記中和抗体は、1種以上の本明細書中に記載される抗体によって認識されるエピトープの特異的結合に関して選択される。
上で説明される通り、増大したアビディティについての選択は、目的とする1種以上の標的(例えば、BoNT/Aサブタイプまたはそのドメイン(例えば、Hcまたは他のエピトープ)に対するBoNT−中和抗体(または改変されたBoNT−中和抗体)の親和性を測定することを包含する。このような測定を行なう方法は、本明細書中に提供される実施例において詳細に記載される。簡潔には、例えば、BoNT/A−中和抗体のKdおよびBoNT/Aに対する結合の動態は、BIAcore(表面プラズモン共鳴に基づくバイオセンサー)において決定される。この技術に関して、抗原は、質量における変化を検出し得る誘導体化されたセンサーチップにカップリングされる。抗体が上記センサーチップ上に通される場合、抗体は、定量可能である質量の増加を生じる抗原に結合する。抗体濃度の関数としての会合速度の測定が、会合速度定数(kon)を計算する為に使用され得る。会合相の後、緩衝液が、上記チップ上に通され、そして抗体の解離の速度(koff)が決定される。Konは、代表的に、1.0×102〜5.0×106の範囲で測定され、そしてkoffは、1.0×10−1〜1.0×10−6の範囲で測定される。次いで平衡定数Kdが、koff/konとして算出され、したがって平衡定数Kdは、代表的に、10−5〜10−12の範囲で測定される。この様式で測定された親和性は、蛍光消光滴定によって溶液において測定された親和性と良好に相関する。
上に示されるように、本発明のBoNT−中和抗体は、治療目的(例えば、ボツリヌス中毒の処置)のために、生物体(例えば、ヒト患者)に投与され得る。それらが惹起された種以外の生物体に投与された抗体は、免疫原性であり得る。したがって、例えば、ヒトに繰り返し投与されたマウス抗体は、しばしばその抗体に対する免疫学的応答(例えば、ヒト抗マウス抗体(HAMA)応答)を誘導する。これは、代表的に、それらの抗体が繰り返し利用されないので、本発明の非ヒト抗体に関して問題ではないが、その抗体の免疫原特性は、その抗体の一部または全部を、特徴的に、ヒト配列へと変え、それによってそれぞれキメラ抗体またはヒト抗体を産生することによって減少される。
キメラ抗体は、ヒト部分と非ヒト部分とを含む免疫グロブリン分子である。より具体的に、キメラ抗体の抗原結合領域(または可変領域)は、非ヒト供給源(例えば、マウス)に由来し、そして(生物学的エフェクター機能を免疫グロブリンに与える)そのキメラ抗体の定常領域は、ヒト供給源に由来する。上記キメラ抗体は、非ヒト抗体分子の抗原結合特異性とヒト抗体分子によって与えられるエフェクター機能とを有するべきである。抗体をもたらす多数の方法は、当業者に周知である(例えば、米港特許第5,502,167号、同第5,500,362号、同第5,491,088号、同第5,482,856号、同第5,472,693号、同第5,354,847号、同第5,292,867号、同第5,231,026号、同第5,204,244号、同第5,202,238号、同第5,169,939号、同第5,081,235号、同第5,075,431号、および同第4,975,369号を参照のこと)。
別の実施形態において、本発明は、ヒト化抗BoNT−中和抗体または完全ヒト抗BoNT−中和抗体(例えば、HuC25、RAZ1、CR1、ING1、ING2など)を提供する。ヒト抗体は、全体的に、特徴としてヒトポリペプチド配列からなる。本発明のヒトBoNT−中和抗体は、広範な種々の方法を使用して産生され得る(概説については、例えば、Larrickら、米国特許第5,001,065号を参照のこと)。
好ましい実施形態において、本発明の抗体は、本明細書中に記載される抗体(例えば、S25、C25、C39、1C6、1F3、CR1、3D12、RAZ1、ING1、ING2など)によって認識される1種以上のエピトープに特異的に結合する。換言すれば、特に好ましい抗体は、これらの抗体のうちの1種以上と交差反応性である。交差反応性についてアッセイする手段は、当業者に周知である(例えば、Dowbenkoら、(1988)J.Virol.62:4703−4711を参照のこと)。
本発明の好ましい抗体は、ボツリヌス神経毒素A型の毒性を中和(減少または排除)するために、個別かまたは組み合わせで作用する。中和は、インビボまたはインビトロで評価され得る。インビボ中和測定は、単純に、BoNT神経毒素の投与に起因する死亡率(例えば、LD50または他の標準的な測定基準)における、中和活性について試験される1種以上の抗体の存在に起因する変化を測定することを包含する。上記神経毒素は、試験生物体(例えば、マウス)に直接投与され得るか、またはその生物体は、ボツリヌス中毒感染を有し得る(例えば、Clostridium botulinumに感染する)。上記抗体は、BoNT神経毒素の感染もしくは試験動物の感染の前、その間、またはその後に投与され得る。進行の速度、または死亡率の減少は、上記抗体が中和活性を有すること示す。
上で説明されるように、本発明の抗BoNT抗体は、BoNT毒素(例えば、BoNT/A1毒素)のインビボ検出またはインビトロ検出に使用され得、したがって、本発明の抗BoNT抗体は、ボツリヌス中毒の診断(例えば、確認診断)において有用である。生物体から得られた生物学的サンプル中のBoNTの検出および/または定量は、その生物体のClostridium botulinum感染を示す。
BoNTポリペプチド(例えば、BoNT/A1、BoNT/A2など)は、本発明の抗BoNA抗体のうちの1種以上をそのBoNTポリペプチドに特異的に結合する捕捉因子として利用するイムノアッセイにおいて検出され得る。
BoNT神経毒素(例えば、BoNT血清型および/またはBoNTサブタイプ)を検出するためのイムノアッセイは、特定の実施形態において、競合的かまたは非競合的かのいずれかである。非競合的イムノアッセイは、捕捉された分析物(この場合において、BoNTポリペプチド)の量が直接測定されるアッセイである。1つの好ましい「サンドイッチ」アッセイにおいて、例えば、上記捕捉因子(例えば、抗BoNT抗体)は、その捕捉因子が固定化される固体基材に、直接的かまたは間接的に結合される。これらの固定化された抗BoNT抗体は、試験サンプル(例えば、血液サンプル)中に存在するBoNTポリペプチドを捕捉する。そのようにして固定化されたBoNTポリペプチドは、次いで、標識因子(例えば、標識を有するBoNT/A−中和抗体)によって結合される。あるいは、二次抗体は、標識を欠き得るが、その二次抗体は、次に、第2の抗体が得られる種の抗体に特異的な標識された第3の抗体によって結合され得る。遊離の標識された抗体は、洗い流され、そして残りの、結合され、標識された抗体が、検出される(例えば、その標識が放射性である場合、γ線検出器を使用する)。
競合的アッセイにおいて、サンプル中に存在する分析物(例えば、BoNT/A)の量は、そのサンプル中に存在する分析物によって捕捉因子(例えば、BoNT/A−中和抗体)から置換された(または追い出された(competed away))、添加された(外因性)分析物の量を測定することによって間接的に測定される。例えば、1つの競合的アッセイにおいて、既知の量のBoNT/Aが、定量されていない量のBoNT/Aを含む試験サンプルに添加され、そしてそのサンプルは、捕捉因子(例えば、BoNT/Aを特異的に結合するBoNT/A−中和抗体)と接触される。BoNT/A−中和抗体に結合する添加されたBoNT/Aの量は、試験サンプル中に存在するBoNT/Aの濃度に反比例する。
当業者は、イムノアッセイ中および分析物の精製の間に非特異的結合を減少させることがしばしば望ましいということを、認識する。上記アッセイが、例えば、BoNT/Aポリペプチド、BoNT/A−中和抗体、または固体基材上に固定化された他の捕捉因子を含む場合、その基材の非特異的結合の量を最小限にすることが、望ましい。このような非特異的結合を減少させる手段は、当業者に周知である。代表的に、これは、上記基材をタンパク質様組成物によってコーティングすることを包含する。特に、タンパク質組成物(例えば、ウシ血清アルブミン(BSA)、脱脂粉乳、およびゼラチン)が、広く使用される。
上述の通り、上記アッセイに依存して、BoNTポリペプチド、抗BoNT抗体などを含む種々の成分は、必要に応じて、固体表面に結合される。種々の固体表面に生体分子を固定化するための多くの方法は、当該分野で公知である。例えば、上記固体表面は、膜(例えば、ニトロセルロース)、マイクロタイターディッシュ(例えば、PVC、ポリプロピレン、またはポリスチレン)、試験管(ガラスまたはプラスチック)、ディップスティック(dipstick)(例えば、ガラス、PVC、ポリプロピレン、ポリスチレン、ラテックスなど)、微量遠心管、またはガラス、シリカ、プラスチック、金属ビーズもしくはポリマービーズであり得る。所望の成分は、非特異的結合によって、共有結合されても、非共有結合的に連結されてもよい。
BoNTポリペプチドまたは抗BoNT抗体(例えば、BoNT/A中和抗体)はまた、当業者に周知である任意の多くの他の手段によって検出および定量され得る。これらとしては、分析に関する生化学的方法(例えば、分光測光法、ラジオグラフィー、電気泳動、キャピラリー電気泳動、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、薄層クロマトグラフィー(TLC)、超拡散(hyperdiffusion)クロマトグラフィーなど)、および種々の免疫学的方法(例えば、流体沈降反応またはゲル沈降反応、免疫拡散法(一次元または二次元)、免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ(RIA)、酵素結合イムノソルベント(ELISA)、免疫蛍光アッセイなど)が挙げられる。
抗BoNT抗体は、当業者に公知である任意の多くの方法によって標識され得る。したがって、例えば、上記標識因子は、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、タンパク質もしくは複合体(例えば、本明細書中に記載されるもの)、またはポリマー(例えば、親和性マトリックス、炭水化物または脂質)であり得る。検出は、任意の公知の方法によって進行し、その方法としては、免疫ブロット法、ウェスタン分析、ゲル易動度シフトアッセイ、放射性マーカーまたは生物発光マーカーの追跡、核磁気共鳴、電子常磁性共鳴、ストップトフロー分光法、カラムクロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動、またはサイズおよび/また電荷の変化に基づいて分子を追跡する他の方法が挙げられる。上記アッセイにおいて使用される特定の標識または検出可能な群は、本発明の重要な局面ではない。上記検出可能な群は、検出可能な物理特性または化学特性を有するあらゆる材料であり得る。このような検出可能な標識は、イムノアッセイの分野において十分に開発されており、そして一般に、このような方法において有用な任意の標識は、本発明に適用され得る。したがって、標識は、分光器的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、電気的手段、光学的手段または化学的手段によって検出可能なあらゆる組成物である。本発明において有用な標識としては、磁性ビーズ(例えば、DynabeadsTM)、蛍光色素(例えば、フルオレセインイソチオシアネート、テキサスレッド(Texas red)、ローダミンなど)、放射性標識(例えば、3H、125I、35S、14C、または32P)、酵素(例えば、LacZ、CAT、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよびマーカー遺伝子産物としてかまたはELISAにおいてのいずれかで検出可能な酵素として一般に使用される他の酵素)、および比色定量標識(例えば、金コロイドまたは有色ガラスビーズまたはプラスチック(例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど)ビーズが挙げられる。
本発明のBoNT−中和抗体は、例えば、内因性の疾患プロセスによってか、または化学的/生物学的な兵器によってもたらされたボツリヌス中毒の進行を緩和するのに有用である。代表的に、1種の抗体または好ましくは2種以上の異なる抗体を含む組成物は、その必要がある哺乳動物(例えば、ヒト)に投与される。
別の実施形態において、本発明は、ボツリヌス中毒の処置またはClostridium botulinum感染の検出/確認のためのキットを提供する。キットは、代表的に、本発明の1種以上の抗BoNT抗体(例えば、薬学的用途のためのBoNT−中和抗体)を含む。診断用途に関して、抗体は、必要に応じて、標識され得る。さらに、上記キットは、代表的に、ボツリヌス中毒の症状の処置においてBoNT−中和抗体を使用する手段を開示する指示資料を備える。上記キットはまた、そのキットが設計される特定の用途を容易にするために、さらなる成分を含み得る。したがって、例えば、キットがBoNTサブタイプの診断の検出のために1種以上の抗BoNT抗体を含む場合、その抗体は標識され得、そしてそのキットはその標識を検出する手段(例えば、酵素標識に対する酵素基質、蛍光標識を検出するためのフィルターセット、適切な二次標識(例えば、ヒツジ抗ヒト抗体)など)をさらに含み得る。上記キットは、特定の方法の実施のために慣用的に使用される緩衝液および他の試薬をさらに含み得る。このようなキットおよび適切な内容物は、当業者に周知である。
(材料および方法)
(A.オリゴヌクレオチドの設計)
科特異的なマウスVHおよびマウスVKのプライマーを、再配列した完全長V遺伝子を増幅するために、ヒトV遺伝子プライマーについて先に記載(Marksら、(1991)J.Mol.Biol.222:581−597;Marksら、Eur.J.Immunol.21:985−991)されるように設計した。簡潔には、マウスVH DNA配列およびVK DNA配列を、Kabat(Kabatら、(1991)Sequences of proteins of immunological interest、U.S.Department of Health and Human Services、U.S.Government Printing Office、Bethesda、MD)およびGenBankデータベースから収集し、アライメントし、そして科によって分類し、そして科特異的プライマーを、フレームワーク1を含む第1の23ヌクレオチドにアニーリングするように設計した。同様に、JH遺伝子セグメントに特異的なプライマーおよびJK遺伝子セグメントに特異的なプライマーを、4種のJH遺伝子セグメントおよび5種のJK遺伝子セグメント(Kabatら、前出)の各々を含む最後の24ヌクレオチドにアニーリングするように設計した。
ベクターpSYN3を構築するために、1.5kbのスタッファー(stuffer)フラグメントを、プライマーLMB3(Marksら、(1991)Eur.J.Immunol.21:985−991)、およびE−タグバック(tagback)(5’−ACC ACC GAA TTC TTA TTA ATG GTG ATG ATG GTG GAT GAC CAG CCG GTT CCA GCG G−3’、(配列番号5))を用いたPCRを使用して、pCANTAB5E(Pharmacia Biotech、Milwaukee、WI.)から増幅した。上記DNAフラグメントを、SfiIおよびNotfを用いて設計し、ゲル濾過し、そしてSfiIおよびNotIによって消化したpCANTAB5Eにライゲーションした。ライゲーションしたDNAを、Escherichia coli TGl(Gibson、(1991)Studies on the Epstein−Barr virus genome.University of Cambridge、Cambridge、U.K.)を形質転換するために使用し、そして正しい挿入物を含むクローンを、DNA配列決定することによって同定した。得られたベクターは、ファージに提示されたscFvを、E.coliのペリプラズムにC末端Eエピトープタグ(その後にヘキサヒスチジンタグを伴う)を有するネイティブなscFvとして分泌させるためのSfiI−NotIフラグメントまたはMcol−NotIフラグメントとしてサブクローニングすることを可能にする。
ライブラリー1の構築のために、BALB/cマウス(16g〜22g)を、純粋なBoNT/A Hc(Ophidian Pharmaceuticals、Madison、WI.)を用いて、0週間目、2週間目、および4週間目に免疫化した。各動物に、ミョウバンに吸着された材料の1μg(Pierce Chemical Co.、Rockford、IL.)を、0.5mlの容量で皮下に与えた。マウスを、第2の免疫化の2週間後に、純粋なBoNT/Aの100,000の50%致死量によってチャレンジし、そしてその1週間後に屠殺した。
第1のcDNA鎖を、免疫グロブリンmRNAをそれぞれ10pmolのオリゴヌクレオチドMIgGl、MIgG3、およびMCK(表3)と特異的にプライミングさせたことを除いて、Marksら、(1991)J.Mol.Biol.222:581−597において先に記載される通りに約10μgの全RNAから合成した。ライブラリー1の構築のために、再配列したVH遺伝子およびVK遺伝子を、市販のVH逆方向プライマーおよびVK逆方向プライマーならびにJH順方向プライマーおよびJK順方向プライマー(Recombinant Phage Antibody System;Pharmacia Biotech)を使用することによって第1のcDNA鎖から増幅した。ライブラリー2のために、科特異的なVH逆方向プライマーとVK逆方向プライマーとの等モル混合物を、ライブラリーの多様性を増大させる試みにおいて、JH遺伝子セグメントに特異的なプライマーまたはJK遺伝子セグメントに特異的なプライマーの等モル混合物と組み合わせて使用した(上記の「オリゴヌクレオチドの設計」を参照のこと)。再配列したVH遺伝子および再配列したVK遺伝子を、5μlの第1のcDNA鎖反応混合物、適切な逆方向プライマーの20pmolの等モル混合物、適切な順方向プライマーの20pmolの等モル混合物、(各)250μmのデオキシヌクレオチド三リン酸、1.5mmのMgCI2、1mlあたり10μgのウシ血清アルブミン、および1μl(5U)の製造業者によって供給される緩衝液中のThermus aquaticus(Taq)DNAポリメラーゼ(Promega)を含む50μlの反応混合物中で、別々に増幅した。その反応混合物に、パラフィン油(Sigma)を積層(overlay)し、そしてそれを、(95℃にて1分間、60℃にて1分間、および72℃にて1分間で)30回のサイクルに供した。反応生成物を、ゲルで精製し、DEAE膜を使用することによってそのゲルから単離し、高塩濃度の緩衝液を用いてその膜から溶出させ、エタノール沈殿し、そして20μLの水に再懸濁した(Sambrookら、(1989)Molecular cloning;a laboratory manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、N.Y.)。
上記ライブラリーからプラスミド粒子をレスキュー(rescue)するために、10mlの2×TY−AMP−GLUに、上記ライブラリーストック由来の適切な容量の細菌(約50〜100μl)を接種して0.3〜0.5のA600を与え、そして細菌を、37℃にて振盪しながら30分間増殖させた。約1012PFUのVCS−Ml3(Stratagene)粒子を、添加し、そしてその混合物を、4℃にて一晩インキュベートした。チューブを、2% MPBSを用いて37℃にて1時間ブロックし、そして選択、洗浄、および溶出を、5.0×1012TU/mlの濃度にてファージを使用することにより、参考文献35に記載される通りに正確に行った。溶出したファージの3分の1を使用して対数増殖期のE.coli TGIの10mlに感染させ、そのE.coli TGIを、上に記載したようにTYE−AMP−GLU上にプレーティングした。
BoNT/A、BoNT/A Hc、およびBoNT/A HNに対する結合についての初回分析(Chenら、(1997)Infect.Immun.65:1626−1630)を、発現したscFvを含む細菌の上清を使用したELISAによって行なった。scFvの発現(De Bellisら、(1990)Nucleic Acids Res.18:1311)を、marksら、(1991)J.Mol.Biol.、222:581−597によって記載される通りに、96ウェルマイクロタイタープレートにおいて行なった。ELISAのために、マイクロタイタープレート(Falcon 3912)を、PBS(10μg/ml)中のBoNT/A、BoNT/A Hc、またはBoNT/A HNのいずれかによって4℃にて一晩コーティングし、次いで2% MPBSを用いて室温にて1時間ブロックした。発現したscFvを含む細胞の上清を、ウェルに添加し、そして室温にて1.5時間インキュベートした。プレートを、6回(TPBSで3回およびPBSで3回)洗浄し、そしてscFvの結合を、Marksら、(1991)J.Mol.Biol.、222:581−597およびSchierら、(1996)Gene 169:147−155によって記載される通りに、抗mycタグ抗体(9E10;Santa Cruz Biotechnology)または抗E抗体(Pharmacia Biotech)およびペルオキシダーゼ結合体化抗マウスFc抗体(Sigma)のいずれかを使用することによってそれらのC末端ペプチドタグ(pCANTAB5E中のライブラリー1については、Eエピトープタグ、およびpHEN−1中のライブラリー2については、mycエピトープタグ[Munro、ら、(1986)Cell 46:291−300])によって検出した。固有に結合するscFvの数を、BstN1のフィンガープリントおよびDNA配列決定によって決定した。
精製を容易にするために、scFv遺伝子を、上記scFvのC末端の端におけるヘキサヒスチジンタグの付加を生じる発現ベクターpUC119mycHis(Schier ら、(1995)J.Mol.Biol.、263:551−567)またはpSYN3中にサブクローニングした。適切なファージミドのうちの1つを有するE.coli TG1の200ミリリットル培養物を、増殖させ、scFvの発現を、IPTG(De Bellis、ら、(1990)、Nucleic Acids Res.18:1311)を用いて誘導し、そしてその培養物を、25℃にて一晩増殖させた。scFvを、ペリプラズムから回収し(Breitling、ら、(1991)Gene 104:147−153)、IMACローディング緩衝液(50mMのリン酸ナトリウム[pH7.5]、500mMのNaCl、20mMのイミダゾール)に対して4℃にて一晩透析し、次いで0.2μm孔径のフィルターを通して濾過した。scFvを、Schierら、(1995)、前出によって記載される通りに、IMAC(Hochuliら、(1988)Bio/Technology 6:1321−1325)によって精製した。
精製したscFvのKdを、BIAcore(Pharmacia Biosensor AB)における表面プラズモン共鳴を使用することによって決定した。BIAcoreフローセルにおいて、約600RUのBoNT/A Hc(10mM酢酸ナトリウム[pH4.5]中に15μg/ml)を、N−ヒドロキシスクシニミド−N−エチル−N’−(ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド化学(Johnsonら、(1991)Anal.Biochem.198:268−277)を使用することによってCM5センサーチップにカップリングした。このカップリングしたBoNT/A Hcの量は、100〜175の最大RUの結合されたscFvをもたらした。scFvの結合後の表面の再生のために、5μlの4M MgCl2を注入し、ベースラインへの回帰をもたらした。上記表面を、これらの再生条件下で20〜30回再使用した。会合を、50〜1,000nMの範囲の濃度で5μl/分の連続的な流れにおいて測定した。konを、ln(dR/dt)/t対濃度のプロットから決定した。ここでRは、応答であり、そしてtは、時間である(Karlssonら、(1991)J.Immunol.Methods 145:229−240)。koffを、30μl/分の流速を使用することによって、分析したscFvの最も高い濃度におけるセンサーグラムの解離部分から決定した(Karlssonら、(1991)J.Immunol.Methods 145:229−240)。Kdを、koff/konとして算出した。
エピトープマッピングを、BIAcoreにおける表面プラズモン共鳴を使用することによって行なった。BlAcoreフローセルにおいて、約1,200RUのBoNT/A Hcを、上に記載したようにCM5センサーチップにカップリングさせる。5μl/分の流速を用いて、100nM〜1μMのscFvの滴定を、ほぼ飽和した表面を生じる抗体濃度を決定するために、約5分間にわたってフローセル表面上に注入した。エピトープマッピングを、完全に近い飽和および少なくとも100RUの結合された抗体を生じる濃度にて、scFvの対を使用して行った。結合されたscFvの量を、対の各メンバーについて決定し、次いでその2種のscFvを、個々のscFvの測定のために使用した濃度と等しい最終濃度を与えるように一緒に混合した。異なるエピトープを認識するscFvは、一緒に注入した場合に、RU結合において相加的な増加を示し(図2パネルA)、一方で、同一のエピトープを認識するscFvは、RUの最小限の増加のみを示した(図2パネルB)。
適切なインビトロ中和研究はを、Deshpandeら、(1995)Toxicon 33:551−557によって記載されるように、マウス片側横隔膜調製物を使用することによって行った。簡潔には、左右の横隔神経の片側横隔膜調製物を、雄CD/1マウス(25〜33g)から切除し、そして生理的溶液(135mM NaCl、5mM KCl、15mM NaHCO3、1mM Na2HPO4、1mM MgCl2、2mM CaCl2、および11mM GLU)に懸濁した。インキュベーションバスを、95% O2−5% CO2を用いて泡立て、そして36℃の一定温度に維持した。横隔神経を、0.2ms持続時間の四角波で0.05Hzにて超最大に刺激した。等尺性単収縮張力を、チャートレコーダーに接続した力変位変換器(Model FT03;Grass)によって測定した。精製したscFvを、精製したBoNT/Aと一緒に室温にて30分間インキュベートし、次いで組織のバスに添加し、2.0×10−8MのscFv最終濃度および2.0×10−11MのBoNT/A最終濃度をもたらした。研究した各scFvについて、50%の単収縮張力減少までの時間を、BoNT/A単独について3回測定し、そしてscFv+BoNT/Aについて3回測定した。S25とC25との組み合わせを、各2.0×10−8Mの最終濃度にて研究した。50%の単収縮減少までの時間の間の差を、有意と見なされる0.05未満のP値を用いて両側t検定によって決定した。
bBoNT/A Hcで2回、かつBoNT/Aで1回免疫化したマウスに由来する。
cイムノチューブ選択を、イムノチューブ上に吸着させた抗原を用いて行った。
dビオチン化選択を、ストレプトアビジン磁性ビーズ上の捕捉を用いて、溶液中で行った。
eBoNT/A Hcで3回免疫化したマウスに由来する。
fNi2+−NTA選択を、Ni2+−NTA上の捕捉を用いて、溶液中で行った。
(A.ファ−ジ抗体ライブラリーの構築および特徴付け)
2つのファージ抗体ライブラリーを、免疫化したマウスのVH遺伝子およびVK遺伝子から構築した(図1)。ライブラリー1について、マウスを、BoNT/A HCを用いて2回免疫化し、そして100,000のBoNT/Aの50%致死量を用いた第2の免疫化の2週間後にチャレンジした。BoNT/Aチャレンジで生存したマウスを、1週間後に屠殺した。その脾臓を、屠殺直後に取り出し、そして全RNAを、調製した。ライブラリー構築のために、IgG重鎖mRNAおよびκ軽鎖mRNAを、特異的にプライムし、第1のcDNA鎖を、合成した。VH遺伝子レパートリーおよびVK遺伝子レパートリーを、PCRによって増幅し、そしてVHプライマー、JHプライマー、VKプライマー、およびJKプライマーを、ファージ抗体システムにおいて提供した。
BoNT/A結合ファージ抗体を単離するために、ファージを、上記ライブラリーからレスキューし、そして精製したBoNT/Aまたは精製したBoNT/A Hcのいずれかに対して選択した。選択を、Hcに加えてホロ毒素に対して行った。なぜなら組換え毒素Hcホロ毒素におけるHcの立体構造を模倣する程度が明確でなかったからである。BoNT/AバインダーおよびBoNT/A Hcバインダーについての選択を、ポリスチレンに吸着させた抗原に対して行った。さらに、Hc結合ファージを、ビオチン化Hcについて、ストレプトアビジン磁性ビーズに対する捕捉(ライブラリー1について)またはヘキサヒスチジンタグ化Hcに対する捕捉、Ni2+−NTAアガロースに対する捕捉(ライブラリー2について)を用いて溶液中で選択した。溶液中の選択を、ポリスチレンに吸着されたタンパク質に対する選択がネイティブなタンパク質を認識しないファージ抗体をもたらし得るという本発明者らの先の観察(Schierら、(1995)Immunotechnology、1:73−81)に基づいて利用した。溶液中の選択を、本発明者らが上記毒素を、交差反応性を破壊せずに首尾よくビオチン化できなかったことに起因して、ホロ毒素に対して行わなかった。
全28種の固有のHc結合scFvを、BIAcoreにおける表面プラズモン共鳴を使用してエピトープマッピングした。エピトープマッピングを、チップ表面のほぼ完全な飽和および少なくとも100RUの結合されたscFvを生じる濃度にてscFvの対を用いて行った。結合されたscFvの量を、対の各メンバーについて決定し、次いでその2種のscFvを、個々のscFvの測定のために使用した濃度と等しい最終濃度を与えるように一緒に混合した。異なるエピトープを認識するscFvは、一緒に注入した場合に、RU結合において相加的な増加を示し(図2パネルA)、一方で、同一のエピトープを認識するscFvは、RUの最小限の増加のみを示した(図2パネルB)。この技術によって、28種のscFvのマッピングは、Hcに対して認識される4種の重複しないエピトープをもたらした(表6)。エピトープ1およびエピトープ2のみを認識するscFvを、ライブラリー1から得たが、全4種のエピトープを認識するscFvを、ライブラリー2から得た。
親和性、結合動態、およびインビトロ毒素中和を、各エピトープに対する1つの代表的なscFv結合について決定した。各エピトープに関して、さらなる研究のために選択したscFvは、エピトープマッピング研究の間に決定したように、高い発現レベルと緩徐なkoffとの最適な組み合わせを有した。研究した4種のscFvについてのKdは、7.3×10−8Mと1.1×10−9Mとの間の範囲であり(表7)、ハイブリドーマから産生されたモノクローナルIgGについて報告されたもの(Footeら、(1991)Nature 352:530−532)に匹敵する値であった。C25は、抗ボツリヌス毒素抗体について報告された最も高い親和性(Kd=1.1×10−9M)を有する。scFvの間で、konは、84倍を上回って異なり、そしてkoffは、33倍を上回って異なった(表7)。インビトロ毒素中和を、マウス片側横隔膜調製物を使用し、そしてBoNT/A単独および2.0×10−8MのscFvの存在下において、50%の単収縮張力減少までの時間を測定することによって決定した。値を、50%の単収縮減少までの時間において報告する。エピトープ1(S25)およびエピトープ2(C25)に対するscFvの結合は、神経麻痺までの時間を著しく延長させた:それぞれ、1.5倍(152%)および2.7倍(270%)(表7および図3)。対照的に、エピトープ3およびエピトープ4に対するscFvの結合は、神経麻痺までの時間に対する有意な効果を有さなかった。S25とC25との混合物は、神経麻痺までの時間に対して有意な相加的効果を有し、50%の単収縮減少までの時間を3.9倍(390%)増大させた。
b20nM scFv+20pM BoNT/Aを使用したマウス片側横隔膜アッセイにおける、BoNT/A単独についての時間と比較した50%の単収縮減少までの時間(分)。C25+S25組み合わせに関して、各20nMのscFvを使用した。各値は、少なくとも3回の観察の平均±SEMである。
cBoNT/Aと比較してp<0.01。
dC25と比較してp<0.05。
BoNTは、単一のジスルフィド結合によって連結した重鎖および軽鎖からなる。その毒素のそのカルボキシ末端半部は、特定の膜レセプターに結合して内部移行をもたらす一方で、そのアミノ末端半部は、エンドソームからサイトゾルへの毒素のトランスロケーションを媒介する。その軽鎖は、シナプス伝達の不全および麻痺を生じる、必須のシナプトソームタンパク質を切断する亜鉛エンドペプチダーゼである。有効な免疫療法は、そのレセプターに対する毒素の結合を阻害しなければならない。なぜならば他の2つの毒素分画は、細胞内で発生するからである。結合を媒介するHc上のエピトープの同定は、受動免疫療法のためのより良好なワクチンの設計および高力価の中和モノクローナル抗体(または中和抗体)の開発の両方のために、必須の第1工程である。
芽胞形成細菌Clostridium botulinumは、ボツリヌス神経毒素(BoNT)(公知である最も有毒な物質(Gill、(1982)Microbiol.Rev.46:86−94))を分泌する。上記タンパク質毒素は、3つの機能的ドメインを含む重鎖および軽鎖からなる(Simpson、(1980)J.Pharmacol.Exp.Ther.212:16−21;MontecuccoおよびSchiavo(1995)Q.Rev.Biophys.28:423−472;Lacyら、(1998)Nat.Struct.Biol.5:898−902)。重鎖の末端部分(HC)は、シナプス前ニューロン上のシアロガングリオシドレセプターおよび推定上のタンパク質レセプターに結合する結合ドメインを含み、その結合は、毒素のエンドサイトーシスを生じる(Dollyら、(1984)Nature(London)307:457−460;Montecucco、(1986)Trends Biochem.Sci.11:315−317)。重鎖のN末端部分(HN)は、毒素にエンドソームを回避させるトランスロケーションドメインを含む。軽鎖は、血清型に依存してSNARE複合体の異なるメンバーを切断する亜鉛エンドペプチダーゼであり、その切断は、神経筋伝達のブロックをもたらす(Schiavoら、(1992)Nature(London)359:832−835;Schiavoら、(1993)J.Biol.Chem.268:23784−23787)。
BoNTの場合において、強力な中和mAbは、依然としてもたらされていない:単一のmAbは、マウスにおける毒素の50%致死量(LD50)の多くても10倍〜100倍にて中和する(Plessら、(2001)Infect.Immun.69:570−574;Hallisら、(1993)Pp.433−436、Botulinum and Tetanus Neurotoxins:Neurotransmission and Biomedical Aspects、編、DasGupta、B.R.、Plenum、New York)。この例において、本発明者らは、BoNT血清型A(BoNT/A)が、2種または3種のmAbを組み合わせることによってインビトロおよびインビボで非常に強力に中和され得、このことがボツリヌス中毒ならびに他の病原体および生物学的脅威因子によって引き起こされる疾患を予防および処置するための薬物への手段を提供すること示す。
(IgGの構築)
C25単鎖可変フラグメント(scFv)、S25単鎖可変フラグメント、および3D12単鎖可変フラグメントのVH遺伝子を、プライマー対(GTC TCC TGA GCT AGC TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT(配列番号183)、およびGTA CCA ACG CGT GTC TTG TCC CAG GTC CAG CTG CAG GAG TCT(C25、配列番号184)、GTA CCA ACG CGT GTC TTG TCC CAG GTG AAG CTG CAG CAG TCA(S25、配列番号185)、またはGTA CCA ACG CGT GTC TTG TCC CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT(3D12、配列番号186)のいずれか)を用いてPCRを使用することによって各ファージミドDNAから増幅した。DNAを、Mlu1およびNheIで消化し、N5KG1Val−Lark(Mitch Reff、IDEC Pharmaceuticals、San Diegoの贈呈)にライゲーションし、正しいVHを含むクローンを、DNA配列決定によって同定した。C25 scFv、S25 scFv、および3D12 scFvのV_遺伝子を、プライマー対(TCA GTC GTT GCA TGT ACT CCA GGT GCA CGA TGT GAC ATC GAG CTC ACT CAG TCT(配列番号187)およびCTG GAA ATC AAA CGT ACG TTT TAT TTC CAG CTT GGT(C25、配列番号188)、TCA GTC GTT GCA TGT ACT CCA GGT GCA CGA TGT GAC ATC GAG CTC ACT CAG TCT(配列番号189)およびCTG GAA ATC AAA CGT ACG TTT GAT TTC CAG CTT GGT(S25、配列番号190)、またはTCA GTC GTT GCA TGT ACT CCA GGT GCA CGA TGT GAC ATC GTG ATG ACC CAG TCT(配列番号191)およびCTG GAA ATC AAA CGT ACG TTT TAT CTC CAG CTT GGT(3D12、配列番号192))を用いて各ファージミドDNAから増幅し、pCR−TOPO(Invitrogen)中にクローニングし、そして正しいV_を含むクローンを、DNA配列決定によって同定した。V_遺伝子を、DraIIIおよびBsiWIを用いてpCR−TOPOから切り出し、そして適切なVH遺伝子を含むDraIII消化およびBsiWI消化を行ったN5KG1Val−Lark DNAにライゲーションした。正しいVH遺伝子と正しいVκ遺伝子とを含むクローンを、DNA配列決定によって同定し、そしてベクターDNAを、エレクトロポレーションによってCHO DG44細胞をトランスフェクトするために使用した。安定な細胞株を、G418中で選択することによって確立し、そして1Lスピナーフラスコ中に拡大培養した。IgGを含む上清を、回収し、限外濾過によって濃縮し、そしてプロテインG(Pharmacia)に対して精製した。
IgG結合動態を、BIAcore(Pharmacia Biosensor)における表面プラズモン共鳴を使用して測定し、そしてKdを算出ために使用した。約200〜400応答単位(response unit)の精製したIgG(10mMアセテート中の10〜20μg/ml、pH3.5〜4.5)を、N−ヒドロキシスクシニミド−N−エチル−N’−(ジメチルアミノプロピル)−カルボジイミド化学を使用することによってCM5センサーチップにカップリングさせた。精製したBoNT/AHCについての会合速度定数を、50〜800nMの範囲の濃度を使用して、15μl/分の連続的な流れにおいて測定した。その会合速度定数(kon)を、(ln(dR/dt))/t対濃度のプロットから決定した。解離速度定数(koff)を、再結合を防止するために30μl/分の流速を使用することによって、分析したscFvの最も高い濃度におけるセンサーグラムの解離部分から決定した。Kdを、koff/konとして算出した。
横隔神経片側横隔膜調製物を、雄CD−1マウス(25〜33g)から切除し、そして135mM NaCl、5mM KCl、1mM Na2PO4、15mM NaHCO3、1mM MgCl2、2mM CaCl2、および11mM グルコースに懸濁した。インキュベーションバスを、95% O2、5% CO2を用いて泡立て、そして36℃に維持した。横隔神経を、0.2ms持続時間の四角波で0.05Hzにて刺激した。等尺性単収縮張力を、力変位変換器(Model FT03、Grass)を用いて測定した。精製したIgG抗体を、BoNT Aと一緒に室温にて30分間インキュベートし、次いで組織のバスに添加し、6.0×10−8M(S25単独および3D12単独)または2.0×10−8M(C25単独)のIgG最終濃度および2.0×10−11MのBoNT/A最終濃度をもたらした。IgGの対に関して、各IgGの最終濃度を、50%減少させ、そして全3種のIgGの混合物の研究に関して、各IgGの濃度を、67%減少させた。
50マイクログラムの適切なIgGを、0.5ml(総容量)のゼラチンリン酸緩衝液中のBoNT/A神経毒素(Hall株)の示された数のマウスLD50に添加し、そしてRTにて30分間インキュベートした。Abの対に関して、25μgの各Abを添加し、そして3種のAbの組み合わせに関して、16.7μgの各Abを添加した。次いでその混合物を、雌CD−1マウス(16〜22g)に対してi.p.に注射した。マウスを、10の群において研究し、そして少なくとも毎日観察した。死亡の最終集計を、注射の5日後に決定した。
平衡結合研究を、抗体と抗原との反応混合物中の占有されていない結合部位を有する抗体を定量するためにKinExAフロー蛍光光度計を使用して行った。1種、2種、または3種の異なる抗体から構成される反応混合物を用いた研究を、それぞれ、342pM、17.2pM、および17.2pMの抗体の総濃度を含むHepes緩衝化生理食塩水(pH7.4)において行った。全ての場合において、可溶性の毒素の濃度を、0.1未満から10倍を超える見かけのKdの値まで変化させた(12の濃度、最小)。1種、2種、または3種の異なる抗体から構成される反応混合物を、平衡が達成されたこと確保するために、25°Cにて、それぞれ0.5時間、3時間、および17時間インキュベートした。
BoNT/Aを中和し得るmAbを産生するために、本発明者らは、先に、組換えBoNT/A結合ドメイン(HC)によって免疫化したマウス由来のscFvファージ抗体ライブラリー、および五価ボツリヌストキソイド(Amersdorferら、(1997)Infect.Immun.65:3743−3752;Amersdorferら、(2002)Vaccine 20:1640−1648)によって免疫化したヒト由来のscFvファージ抗体ライブラリーを産生した。これらのライブラリーから100種より多い固有のmAbをスクリーニングした後、BoNT/AHC上の重複しないエピトープを結合し、かつインビトロで毒素を中和する(マウス片側横隔膜モデルにおいて神経麻痺までの時間を延長する;Amersdorferら、(1997)Infect.Immun.65:3743−3752;Amersdorferら、(2002)Vaccine 20:1640−1648)、scFvの3つの群を、同定した。インビトロ毒素中和は、重複しないエピトープを結合する2種のscFvを組み合わせた場合、顕著に増大した。インビボ毒素中和は、血清からの25kDaのscFvの迅速なクリアランス(Colcherら、(1990)J.Natl.Cancer Inst.82:1191−1197)に起因して決定できなかった。
遊離の毒素/結合した毒素=Kd/[血清抗体]
2mlのマウス血液容量を仮定すると、その血清抗体濃度は、マウスが50μgのAbを受容する場合、160nMである。毒素の投与される量は、LD50の高倍数である(結合した毒素〜投与される毒素)。したがって、上記方程式は、
遊離の毒素/投与される毒素=Kd/160nM
ヘと単純化される。50%のマウスの死亡をもたらす投与される毒素の量を決定するために、遊離の毒素の量を1LD50に置換し、そして投与される毒素について解き、方程式:
投与される毒素(LD50)=1LD50×160nM/Kd
を得る。C25について解Kdを使用して、50%のマウスが生存する推定される毒素用量は、16LD50である(投与される毒素=1LD50×160nM/10nM)。この計算がC25 Abと3D12 Abとの対、およびオリゴクローナルAbに適用される場合、抗体を組み合わせることにおける効力の増大の大きさは、機能的親和性の増大と平行する(表9)。
結論として、本発明者らは、6種のクラスA細菌兵器のうちの1種であるBoNT/Aが3種のみのmAbからなるオリゴクローナルAbによって強力に中和され得ることを示した。オリゴクローナルAbは、超免疫ヒトグロブリンよりも90倍強力であり、そして超免疫モノ血清型ウマA型抗毒素の効力に近づく(Sheridanら、(2001)Toxicon 39:651−657)。したがって、ポリクローナル血清の効力は、3種のみの重複しないエピトープを結合するmAbに逆重畳(deconvolute)し得るか、またはそのmAbに戻り得る。この相乗効果は、上記3種のmAbに対し、任意の単一のmAbの効力と比較して20,000倍よりも大きい効力の増大をもたらす。他のものは、破傷風毒素またはHIV感染の中和におけるモノクローナル抗体の間の相乗作用を、先に示した。破傷風毒素の場合において、3種〜4種のモノクローナル抗体の組み合わせは、インビボ毒素中和の効力を、200倍まで増大させた(Volkら、(1984)Infect.Immun.45:604−609)。HIVの場合において、3種または4種のmAbの組み合わせは、個々のmAbと比較して、ウイルス中和の効力を10倍に増大させた(Zwickら、(2001)J.Virol.75:12198−12208)。したがって、本発明者らの観察は、多くのシステムにおいて一般的であると分かっているようである。しかし、本発明者らは、増大した効力が、毒素中和の場合において、混合抗体の機能的親和性の大きな増大によって生じるようであることを示す。このような機構がウイルス中和について真実のままであるか否かは、不明確である。
(免疫性ヒトファージライブラリーおよび非免疫性ヒトファージライブラリー由来の抗ボツリヌスA型抗体の遺伝的比較ならびに免疫学的比較)
ボツリヌス中毒における抗体応答を理解することは、ワクチン設計および受動的予防のために重要である。この活性を調査するために、本発明者らは、ファージディスプレイを使用して、分子レベルでBoNT/A(ボツリヌス神経毒素血清型A)結合ドメイン(HC)に対する免疫応答を研究した。上記scFv抗体を、(a)五価ボツリヌストキソイドによって免疫化したヒトボランティア、ならびに(b)非免疫のヒト末梢血リンパ球およびヒト脾臓細胞から調製したV遺伝子レパートリーから単離した。ボツリヌス結合scFvを発現する血清型特異的ファージの大きなパネルを、両方のライブラリーから選択し得る。BoNT/A HCに対する免疫scFvバインダー(binder)のエピトープマッピングは、驚くべきことに、2つの異なる群(クラスターIおよびクラスターII)に対応した立体構造的なエピトープを認識する限定された数のscFvを示した。クラスターI由来のscFvのみが、マウス片側横隔膜アッセイにおいて中和活性を示した。非免疫性ライブラリーに由来する抗BoNT/A HCクローンは、便宜的に、クラスターIII〜XIにグループ分けされ得、そして重複するエピトープを、クラスターIまたはクラスターIIと共有しないようであった。さらに、それらは、生物学的に顕著な濃度で毒素を中和しないことを示した。したがって、本発明者らは、五価ボツリヌストキソイドに基づくワクチンが結合ドメインHC上に露出した限定された数の免疫優勢なエピトープに対する体液性免疫応答を導くことを、示唆する。
ボツリヌス毒素は、Clostridium属に属する多くの細菌種によって産生される7種の異なる血清型(A〜G)として存在する麻痺性神経毒素である(Hatheway、(1989)Pp.3−24、Simpson LL、編集者、Botulinum neurotoxin and tetanus toxin.San Diego:Academic Press)。それらは、単鎖タンパク質(Mr:150,000)として産生され、そしてジスルフィド結合および非共有結合によって1つに保たれる2つの鎖(重鎖(Mr:100,000)および軽鎖(Mr:50,000))の形成をもたらす限定的なタンパク質分解によって完全に活性化される(Niemann、(1991)Pp.303−348、Alouf JE、Freer JH、編集者、Sourcebook of bacterial protein toxins.New York:Academic Press;Simpson、(1990)J Physiol.84:143−151)。中毒は、クロストリジウム属に汚染された食物の摂取(食物媒介性ボツリヌス中毒)、乳児の腸管感染(乳児ボツリヌス中毒)、および創傷の深部皮下の感染(創傷ボツリヌス中毒)によって生じる。ヒトボツリヌス中毒は、A型、B型、およびE型によって最も頻繁に引き起こされ、そして稀にFによって引き起こされる(Dowell、(1984)Rev Infect Dis.、6(第1補遺):202−207;Botulisum in the United States.Handbook for epidemiologists,clinicians and laboratory workers.Atlanta、Center for Disease Control、1980)。BoNT(ボツリヌス神経毒素血清型)は、コリン作動性神経終末に対して優先的に作用して、アセチルコリンの放出をブロックする(Habermannら、(1986)Curr Top Microbiol Immunol.、129:93−179;Montecuccoら、(1994)Mol Microbiol.、13:1−8)。BoNTの作用は、3つの工程を包含する(Simpson、(1986)Ann Rev Pharmacol Toxicol.、26:427−453):(1)重鎖のC末端HCを介したシナプス前膜上のレセプターに対する結合;(2)重鎖のN末端HNを介した、軽鎖のサイトゾル中へのトランスロケーション;および(3)軽鎖の亜鉛プロテアーゼ活性による、シナプス小胞のドッキングおよび融合タンパク質複合体における1つ以上の重要な成分の切断(Montecuccoら、(1994)Mol Microbiol.、13:1−8;Schiavo、(1992)J Biol Chem.、267:23479−23483;Schiavoら、(1995)Curr Top Microbiol Immun.195:257−275)。受動免疫療法は、ヒトの病原体およびそれらの毒素に対する有益な予防的アプローチならびに治療的アプローチとして確立されている(概説については、Gronskiら、(1990)Mol Immunol.28:1321−1332およびCross(1997)P.97、Cryz SJ、編集者、Immunotherapy and vaccines.Weinheim、Germany:VCH Verlagsgesellschaftを参照のこと)。ボツリヌス中毒の場合において、BoNT重鎖のC末端ドメイン(HC)を認識する抗体調製物は、その細胞レセプターに対するその毒素の結合を妨げる得ると考えられる。組換えHCによるマウスの免疫化は、1,000,000マウスi.p.LD50までのチャレンジ用量に対して、インビボでの良好な保護を提供した(Claytonら、(1995)Infect Immun.、63:2738−2742;Byrneら、(1998)Infect Immun.、66:10)。ウマ血漿由来のポリクローナル抗ボツリヌス抗体調製物(ウマHIG)は、過去において、80%より多い成人ボツリヌス中毒患者に投与されてきた(MiddlebrookおよびBrown、(1995)Curr Top Microbiol Immun.、195:89−122;Tacketら、(1984)Am J Med.、76:794−798;Morris(1981)P.15 In:Lewis GE jr、編集者、Biomedical aspects of botulism.New York:Academic Press)。ポリクローナル抗体調製物によって認識される多数の異なるエピトープは、通常、保護的な抗体の存在を確実にし、その存在は、通常、全抗体の小さい亜集団である。予防に関して、ウマ抗体は、曝露前に投与された場合に最も有効であるが、曝露後24時間まで、疾患を予防し得る(Middlebrook and Brown(1995)Curr Top Microbiol Immun.、195:89−122)。しかし、ウマ抗毒素の投与は、症例のうちの9%において血清病およびアナフィラキシーなどの有害作用を引き起こし得る(BlackおよびGunn、(1980)Am J Med.69:567−570)。最近の努力は、免疫化したボランティアドナーの血清から調製したヒト免疫グロブリン(ヒトBIG)の産生に集中している(Arnon、(1993)Pp.477−482、DasGupta BR、編集者、Botulinum and tetanus neurotoxins,neurotransmission and biomedical aspects.New York:Plenum Press)。中和モノクローナル抗体(特に、ヒト起源のものである場合)は、抗体の無制限の供給源を提供し、そしてヒトまたはウマからの抗体の調製を置換する。
(免疫性V遺伝子抗体ライブラリーおよび非免疫性V遺伝子抗体ライブラリー)
免疫性ファージ抗体ライブラリーの構築のために、ヒトボランティアは、五価ボツリヌストキソイドA型〜五価ボツリヌストキソイドE型(Michigan Department of Public Health)による免疫化を受容した。上記ボランティアを、0週間目、2週間目および12週間目において、0.5mlの五価トキソイドによって免疫化し、そして1年後に0.5mlのトキソイドによって追加免疫した。BoNT/Aに対する中和の力価を、マウス血清中和バイオアッセイを使用して測定した(Hathewayら、(1984)J Infect Dis.、150:407−412)。PBLを、Histopaque 1077における遠心分離によって単離し、そしてRNAを、改変したCathalaらの方法(Cathalaら、(1983)DNA、2:329−335)を使用して調製した。第1のcDNA鎖を、重鎖についてのIgG定常領域プライマー、または軽鎖についてのκ定常領域プライマーおよびλ定常領域プライマーを使用して、1.0×108個のB細胞から調製したRNAから作製した[26]。VH遺伝子、Vκ遺伝子およびVλ遺伝子を、記載(Marksら、(1991)J Mol Biol.、222:581−597)される通りに、第1のcDNA鎖から増幅した。PCR産物を、ゲルで精製し、そのゲルからの抽出後にエタノール沈殿し、そして先に記載される通りに、scFv遺伝子レパートリーを構築するために使用した(Id.)。そのscFv遺伝子レパートリーを、ゲルで精製し、次いで付与した制限酵素部位を含むフランキングオリゴヌクレオチドによって再度増幅するために、テンプレートとして使用した(Id.)。scFv遺伝子レパートリー(VH−Vκ、VH−Vλ)を、ゲルで精製し、SfiIおよびNotIを用いて消化し、フェノール/クロロホルムを用いて抽出し、そしてSfiIおよびNotIを用いて消化したベクターpCANTAB−5E(Pharmacia Biotech、Milwaukee、WI)にライゲーションした(Sambrookら、(1991)New York:Cold Spring Harbor Laboratory)。そのライゲーション混合物を、フェノール/クロロホルムを用いて抽出し、エタノール沈殿し、そして50μlのE.coli TG1細胞中にエレクトロポレーションした(Gibson、(1984)University of Cambridge:studies on the Epstein−Barr virus genome)。細胞を、100_g/mlのアンピシリンと1%(w/v)グルコースとを含むTYEプレート上にプレーティングした。コロニーを、−70℃にて保存するために、そのプレートから、100μg/mlのアンピシリンと、1%(w/v)グルコースと15%(v/v)グリセロールとを含む2mlの2×TY中にこすり落とした。4種の形質転換体由来の産物は、7.7×105個の個別の組換え体からなるライブラリーをもたらした。非免疫性ライブラリーに関して、6.7×109個のメンバーを含む先に報告されたファージ上に提示されたヒト単鎖抗体ライブラリーを、利用した(Sheetsら、(1997)Proc Natl.Acad Sci USA、95:6157−6162)。
両方のライブラリー由来のプラスミド粒子を、先に記載される通り、VCS−M13ヘルパーファージ(Stratagene)を用いたレスキューによって調製した(Marksら、(1991)J Mol Biol.、222:581−597)。ファージ粒子を、精製し、そして2回のPEG沈殿によって濃縮し(Sambrookら、(1991)New York:Cold Spring Harbor Laboratory)、2mlのリン酸緩衝化生理食塩水(PBS:25mM NaH2PO4、125mM NaCl、pH7.4)中に再懸濁し、そして0.45μmフィルター(Nalgene)を通して濾過して、約1013形質導入単位(TU)/mlの力価を達成した。
選択の各ラウンド後、単一のアンピシリン耐性コロニーを使用して、150μlの2×TY−AMP−0.1%グルコースを含むマイクロタイタープレートウェルに接種した。その細菌を、約0.9のA600を与えるように増殖させ、そしてscFv発現を、イソプロピル−β−d−チオガラクト−ピラノシド(IPTG)を1mMの最終濃度まで添加することによって誘導した(De BellisおよびSchwartz、(1990)Nucl Acids Res.18:1311)。細菌を、25℃にて振盪しながら一晩増殖させ、その細胞を、遠心分離によってペレットにし、そして可溶性のscFvを含む上清を、回収した。BoNTおよびBoNT/A HCに対する結合についてのscFvのスクリーニングを、PBS(pH7.4)中の10μg/mlの抗原を用いてコーティングした96ウェルマイクロタイタープレート(Falcon 3912)において行なった。非免疫性ライブラリーに由来するscFvを、記載(GriffithsおよびMalmqvist、(1993)EMBO J.12:725−734)通りに、その後にペルオキシダーゼ結合体化抗マウスFc抗体(Sigma)を伴うC末端mycタグ(MunroおよびPelham、(1986)Cell、46:291−300))を認識するマウスモノクローナル抗体9E10(1μg/ml)(Santa Cruz Biotechnology、CA)を使用して検出した。免疫性ライブラリーに由来するscFvを、ペルオキシダーゼ結合体化モノクローナル抗体抗E(2.5μg/ml)(Pharmacia Biotech)を使用して検出した。その反応を、30分後にNaF(3.2mg/ml)を用いて停止させ、そしてA405nmを、測定した。固有のクローンの数を、PCR−フィンガープリント(Marksら、(1991)J Mol Biol.222:581−597)を行い、次いで各フィンガープリントパターンからの少なくとも2つのクローンのVH遺伝子およびVL遺伝子のDNA配列決定を行なうことによって決定した。抗体の特異性を、10μg/mlのBoNT/A、BoNT/B、BoNT/C、BoNT/E、BoNT/A HCおよび血清型Aの組換えトランスロケーションドメイン(BoNT/A HN)を用いてコーティングしたウェルを使用して、上記の通りに行ったELISAによって決定した。クローンを、それらがバックグラウンドよりも少なくとも5倍高いシグナルを与えた場合、選択した抗原に対して特異的であるものとして同定した。
ELISAによって決定したところのBoNT/AおよびBoNT/A HCを結合するscFv抗体を、そのscFvのC末端にてヘキサヒスチジンタグの融合を生じる発現ベクターpUC119 Sfi−NotmycHis中にサブクローニングした(Schierら、(1995)Immunotech.、1:73−81)。そのscFvを、発現させ、そして先に記載される通りに固定化金属アフィニティークロマトグラフィーによって精製し(Schierら、(1996)J Mol Biol.、255:28−43)、そして精製したモノマーのscFvの濃度を、1.0のA280nmが0.7mg/mlのscFv濃度に相関すると仮定して分光測光法によって決定した。
エピトープマッピング研究および動態研究を、BIAcore(Pharmacia Biosensor)における表面プラズモン共鳴を使用して行なった。BIAcoreフローセルにおいて、約600共鳴単位(RU)のBoNT/A HC(10mM酢酸ナトリウム(pH4.5)中の15μg/ml)を、NHS−EDC化学(Johnsonら、(1991)Anal Biochem.、198:268−277)を使用して、CM5センサーチップにカップリングさせた。カップリングしたBoNT/A HCのこの量は、100〜175RUのscFv RUmaxをもたらした。その表面を、scFvの結合後に4M MgCl2を使用して再生した。エピトープマッピング研究のために、対の各メンバーに結合されたscFvの量(RU)を決定し、次いでその2種のscFvを、個々のscFvの測定のために使用した濃度と等しい最終濃度を与えるように一緒に混合した(Amersdorferら、(1997)Infect.Immun.、65:3743−3752)。scFvのKdを、BIAcoreにおいて決定した会合速度定数(kon)および解離速度定数(koff)から算出した(Kd=koff/kon)。会合を、50〜1000nMのscFvの濃度範囲を使用して、5μl/分の連続的な流れにおいて測定した。そのkonを、ln(dR/dt)/t対濃度のプロットから決定した(Karlssonら、(1991)J Immunol Meth.、145:229−240)。そのkoffを、再結合を防止するために30μl/分の流速を使用することによって、分析したscFvの最も高い濃度におけるセンサーグラムの解離部分から決定した。
インビトロ中和研究を、先に記載される通り、マウス片側横隔膜調製物を使用して行なった(Desphande、(1995)Toxicon、33:551−557)。横隔神経−片側横隔膜調製物を、雄CD/1マウス(25〜33g)から切除し、そして135mM NaCl、5mM KCl、1mM Na2PO4、15mM NaHCO3、1mM MgCl2、2mM CaCl2、および11mM グルコースに懸濁した。インキュベーションバスを、95% O2、5% COを用いて泡立て、そして36℃に維持した。横隔神経を、0.2ms持続時間の四角波で0.05Hzにて刺激した。等尺性単収縮張力を、チャートレコーダーに接続した力変位変換器(Model FT03、Grass)を用いて測定した。精製したscFv抗体を、BoNT/Aと一緒にRTにて30分間インキュベートし、次いで組織のバスに添加し、2.0×10−8MのscFv最終濃度および2.0×10−11MのBoNT/A最終濃度をもたらした。毒素誘導性の麻痺を、最初の筋肉単収縮の50%の減少として規定した。延長の比を、上記抗体による50%の減少をBoNT/Aの50%の減少で除算した値から算出した。3D12とC25との組み合わせを、各2.0×10−8Mの最終濃度において研究した。50%の単収縮減少までの時間の間の差を、有意である0.05未満のP値を用いて両側t検定を使用して決定した。
精製したボツリヌス毒素血清型A、B、CおよびE(150kDa)を、USAMRIIDから得た。ボツリヌス毒素A型の結合ドメイン(BoNT/A HC)を、E.coliで発現させ、そしてC末端の(His6)タグを利用した固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)(Ophidian Pharmaceuticals,Inc.)によって精製した。ボツリヌス毒素A型のトランスロケーションドメイン(BoNT/A HN)は、Dr.R.Stevens(UC−Berkeley、CA)からの贈呈であった。
(免疫性ファージディスプレイライブラリーの合成のためのストラテジー)
五価ボツリヌストキソイドによって免疫化したヒトボランティア由来のPBLを、scFvファージ抗体ライブラリーを産生するために使用した。上記ドナーのポリクローナル血清は、マウス中和バイオアッセイ(Hathewayら、(1984)J Infect Dis.、150:407−412)において、2.56IU(国際単位)の力価でBoNT/Aに対して保護的であった。VH遺伝子およびVL遺伝子を、RNAから増幅し、スプライシングしてscFv遺伝子レパートリーを作製し、そしてそれを、pCANTAB−5E中にクローニングして7.7×105個の形質転換体のファージ抗体ライブラリーを作製した。15個のランダムに選択したクローンのPCRスクリーニングは、全てが、生殖系列遺伝子特異的な軽鎖プライマーによって決定したところ、完全長の挿入物(66%がVκ軽鎖を有し、そして34%がVλ軽鎖を有する)を保有することを示した(データ示さず)。
免疫性ライブラリーおよび大きな非免疫性ヒトファージ抗体ライブラリーの両方(Sheetsら、(1997)Proc Natl.Acad Sci USA、95:6157−6162)を、BoNT血清型A、B、C、EおよびBoNT/A HCに対して選択した。BoNT/AまたはBoNT/A HCに対する3ラウンドの選択後、上記免疫性ライブラリー由来のELISAポジティブクローンの頻度は、それぞれ、79%および100%であった。ELISA陽性の同様の頻度が、他の血清型について観察された。BoNT/AまたはBoNT/A HCに対する3ラウンドの選択後、上記非免疫性ライブラリー由来のELISAポジティブクローンの頻度は、それぞれ、28%および94%であった。ELISA陽性の同様の頻度が、他の血清型について観察された。固有のscFvの数を、DNAフィンガープリントを行ない、次いでDNA配列決定を行なうことによって決定し、そして各scFvの特異性を、ELISAによって決定した。各選択からの100個のクローンのスクリーニングにおいて、48種の固有の抗体(23種のBoNT/A、16種のBoNT/B、6種のBoNT/Cおよび3 BoNT/E)を、上記免疫性ライブラリーから同定し、そして27種の固有の抗体(14種のBoNT/A、5種のBoNT/B、5種のBoNT/Cおよび3種のBoNT/E)を、上記非免疫性ライブラリーから同定した(表10)。
bBoNT/Aに対して選択したライブラリー。
cBoNT/A HCに対して選択したライブラリー。
BoNT/A HC結合scFvを、認識された重複しないエピトープの数を決定するためにエピトープマッピングした。エピトープマッピングを、チップ表面のほぼ完全な飽和および少なくとも100RUの結合されたscFvを生じる濃度にて、scFvの対を研究するBIAcoreTMにおける表面プラズモン共鳴を使用して行なった。結合されたscFvの量を、対の各メンバーについて決定し、次いでその2種のscFvを、個々のscFvの測定のために使用した濃度と等しい最終濃度を与えるように一緒に混合した。同一のエピトープを認識する抗体は、一緒に注入した場合に、結合されたRUの最小限の増大を示し(図9A)、一方で、異なるエピトープを認識するscFvは、RUの相加的な増大を示した(図9B)。表2および表3に示したように、クラスターIと称されるscFv 3A6、scFv 3D12およびscFv 2A1は、VH遺伝子セグメントおよびVL遺伝子セグメント(それぞれ、DP 50およびL12)の高い相同性を共有し、そして重複するエピトープを認識する。それらは、体細胞変異によって導入される重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子における変異によってのみ、配列において異なる。クラスターIIと称されるscFv 3B8およびscFv 3F10は、クラスターIと比較して、異なるエピトープに結合する抗体の第2のセットを形成する。可能な固有のエピトープを示すクローン2B11は、乏しい発現レベルに起因して分析できなかった。上記非免疫性ライブラリーに由来するscFv抗体を分析したとき、本発明者らは、全てが、表3に示したような、クラスターIII〜クラスターXIと称される固有のエピトープに結合したことを見出した。上記非免疫性ライブラリーのメンバー(クラスターIII〜クラスターXI)は、上記免疫性ライブラリーのメンバー(クラスターIおよびクラスターII)と重複しない結合を示した。上記免疫性scFvおよび非免疫性scFvの両方によって認識されるエピトープは、2種の先に報告されたマウスscFv(C25およびS25)(Amersdorferら、(1997)Infect.Immun.、65:3743−3752)によって結合されるエピトープと重複しない。
konおよびkoffを、BIAcoreにおける表面プラズモン共鳴を使用して測定し、そしてそれらを、平衡解離定数を算出するために使用した。上記免疫性ライブラリーから選択したscFvは、3.69×10−8Mおよび7.8×10−9MのKdを有し、ハイブリドーマから産生されたモノクローナルIgGについて報告されたもの(FooteおよびMilstein、(1991)Nature、352:530−532)に匹敵する値であった(表12)。非免疫性scFvは、4.6×10−7M〜2.61×10−8Mの範囲の、より低いKdを有した。毒素誘導性の神経麻痺を中和するscFvの能力を決定するために、インビトロ研究を、横隔神経−片側横隔膜調製物を使用して、各エピトープクラスター由来の1つの代表的なメンバーについて行なった。値を、BoNT/A単独および2.0×10−8MのscFvの存在下における50%の単収縮減少までの時間で報告した。表12ならびに図10Aおよび図10Bに示した通り、異なる抗BoNT/A HC scFvの中和における有意な差が、使用したライブラリーに依存して見出された。上記免疫性ライブラリーから、3D12(クラスターI)が、神経麻痺までの時間を有意に1.5倍延長したのに対して、3F10(クラスターII)は、毒素中和に対する効果を示さなかった。上記非免疫性ライブラリーのうちの代表的なもの(クラスターIII〜クラスターXI)は、1.8×10−7Mの最終濃度におけるクラスターIII〜クラスターXIの全てのメンバーの組み合わせの後でさえも、上記片側横隔膜アッセイにおいて保護的効果を示さなかった。3D12(クラスターI)と先に単離されたマウスscFv(C25)(Amersdorferら、(1997)Infect.Immun.、65:3743−3752)との組み合わせを使用する場合、麻痺までの時間は、3.2倍まで有意に増大し、このことは、毒素中和に対する相乗効果を示した。本発明者らは、マウスscFv S25とマウスscFv 3D12とによる同様の相乗作用を観察した(データ示さず)。
b20nM scFv+20pM BoNT/Aを使用したマウス片側横隔膜アッセイにおける50%の単収縮減少までの時間(分)を、BoNT/A単独についての時間と比較した。各値は、少なくとも3回の観察の平均±S.E.M.である。
cBoNT/Aに対して選択したライブラリー。
dBoNT/Aと比較してP<0.01。
e有意ではない。
fBoNT/A HCに対して選択したライブラリー。
gBoNT/A HCと比較してP<0.01。
本発明者らは、BoNT/A HCの組換え結合ドメインを用いたマウスの免疫化が、免疫応答を、シナプス前毒素レセプターに対するHC結合に関与するエピトープを結合する抗体の産生に導くことを、先に示した(Amersdorferら、(1997)Infect.Immun.、65:3743−3752)。これらの実験は、scFvによる毒素の中和が、レセプター結合部位に関して上記ホロ毒素と競合するscFvの親和性および能力の両方に相関し得ることを示した。ここで、本発明者らは、BoNT/Aに対するヒト体液性免疫応答および非免疫応答をマッピングするために、免疫性ファージディスプレイライブラリーおよび非免疫性ファージディスプレイライブラリーを使用することによって、より系統的なアプローチを実施した。上記2種の抗体ライブラリーのための抗体遺伝子の供給源は、(a)五価トキソイド(A〜E)によって免疫化したヒトボランティアのPBL、ならびに(b)非免疫性の末梢血リンパ球および脾臓細胞であった。このアプローチの1つの制限は、これらの研究のために用いる1人のヒトドナーが、ボツリヌス中毒に対する曝露の際にもたらされる広範な遺伝的多様性を示す程度である。マウスおよびヒトにおける体液性免疫応答がむしろ限定された数の保護的エピトープをもたらしたという事実は、保護を与える抗原性エピトープの顕著な保存を示唆する。選択手順は、4種の固定化されたボツリヌス神経毒素(血清型A、B、C、およびE)に対して両方のコンビナトリアルライブラリーをパニングすることを包含する。3回〜4回のパニング周期の後、この順序(BoNT/A、BoNT/B、BoNT/CおよびBoNT/E)で漸減する頻度で、各血清型に対する抗体を両方のライブラリーから得た。バインダーの同様の頻度はまた、BoNT/Bを除いて、非免疫性ライブラリーについて観察された。これらの結果は、Siegel(Siegel、(1989)J Clin Microbiol.、26:2351−2356)の知見と相関し、Siegelは、ボツリヌス五価トキソイドの25人のヒトレシピエントからの血清標本を研究した。種々の血清型の免疫原性を、マウス血清中和バイオアッセイによって決定した−−血清型Aは、5.7IU/mlと51.6IU/mlとの間の範囲であり、次いで血清型Bは、0.78IU/ml〜18IU/mlであり、そして血清型Eは、0.61IU/ml〜10IU/mlであった。
(より高い親和性に関して進化した中和抗体)
ボツリヌス中毒の検出および処置を改良するために、分子進化および酵母ディスプレイを、BoNT血清型A(BoNT/A)を結合する2種の中和単鎖Fv(scFv)抗体(HuC25および3D12)の親和性を増大させるために使用した。
BoNT/Aに対するHuC25の親和性を、一連の変異酵母ディスプレイライブラリーを使用して連続的に増大させた(図20)。第1に、HuC25遺伝子を、NcoI−NotIフラグメントとして酵母ディスプレイベクターpYD2中にサブクローニングした。上記scFv遺伝子は、酵母表面上に首尾よく提示され、そして提示されたscFvの純粋なBoNT/Aに対するKDを、フローサイトメトリーによって決定し、そのKDは、8.44×10−10Mであった(図21)。これは、BIAcoreにおけるSPRを使用して先に測定したような、組換えBoNT/A HCに対する精製したHuC25 scFvの結合について測定したKD(1.4×10−9M)に匹敵する。次いでHuC25 scFv遺伝子を、誤りを起こしやすい条件を使用したPCRによってランダムに変異させ、そして得られた遺伝子レパートリーをギャップ修復を使用してpYD2中にクローニングして、2.0×105個の形質転換体のライブラリーを作製した(図20)。上記ライブラリーを、増殖させ、インキュベーションし、次いでscFvディスプレイの頻度(27%)および抗原結合の頻度(3.65%)についてフローサイトメトリーによって分析した。
親和性の成熟のために、3D12 scFv遺伝子を、ファージミドベクターpCANTAB5Eから、NcoI−NotIフラグメントとして酵母ディスプレイベクターpYD2中にクローニングした。次いでランダム変異を、誤りを起こしやすい条件下でPCRを使用して3D12 scFv遺伝子に導入し、そして得られた遺伝子レパートリーを、ギャップ修復を使用してpYD2中にクローニングして、2.1×106個の形質転換体のライブラリーを作製した。上記ライブラリーを、増殖させ、インキュベーションし、次いでscFvディスプレイの頻度(27%)および抗原結合の頻度(3.65%)についてフローサイトメトリーによって分析した。次いで上記ライブラリーを、漸減濃度の純粋なBoNT/Aを使用して5ラウンドの選択に供した。次いで最終ラウンドの解離速度選択を、精製したBoNT/Aを用いて標識化し、次いで再結合を防止するためにBoNT/A結合ドメイン(HC)の存在下において15時間の解離を行なうことによって実施した。次いでBoNT/A標識化酵母を、その毒素の触媒ドメインを結合するmAb(7C1)を使用して選別した。上記scFv遺伝子を、選別の最終ラウンド後に得られた6種の個々のコロニーからPCRで増幅し、これは、3種の固有の配列の存在(表13、クローン3−1(RAZ1としても公知である、図19A)、クローン3−8、およびクローン3−10)を示した。固有の各クローンを、増殖させ、scFvディスプレイを、誘導し、そしてBoNT/Aに対する提示されたscFvのKDを、野生型3D12 scFvと一緒に、フローサイトメトリーを使用して測定した、全3種の変異scFvは、野生型3D12 scFvよりも高い親和性を有した。最も高い親和性のscFv(RAZ1、図21におけるKD)に関して、変異は、そのVL内でCDR1、CDR2、およびCDR3中に全体的に位置した(図19A)。
完全な軽鎖についての配列は、軽鎖フレームワーク1+軽鎖CDR1+軽鎖フレームワーク2+軽鎖CDR2+軽鎖フレームワーク3+軽鎖CDR3+軽鎖フレームワーク4である。
多くの免疫学的アッセイ、およびインビボ中和研究のために、IgGを利用する必要がある。したがって、本発明者らは、二重CMVプロモーターによって駆動する哺乳動物発現ベクター中にVH遺伝子およびVk遺伝子を連続的にクローニングすることによって、HuC25、AR1、AR2、AR3、AR4、3D12、およびRAZ1を、ヒトγ1定常領域およびヒトκ定常領域からなる完全長IgGに変換した。安定なCHO DG44細胞株を、7種の抗体の各々について確立し、そしてIgGを、上記7種の抗体のうちの6種について5〜20mg/Lの収量で細胞培養上清から精製した。本発明者らは、顕著な量のAR3 IgGを、全く発現させることができなかった。
酵母上に提示されたより高い親和性のscFvは、酵母が提示したより低い親和性のscFvと比較して、顕著により低い濃度のBoNT/Aを検出できた(図22)。最も高い親和性のscFv(AR4)は、0.1pM(他の増幅されないBoNT検出システムについて報告されたものよりも低い値)程度に低いBoNT/Aを検出できた。したがって、その結果は、検出感度を増加させるための漸増する抗体親和性の有用性を立証する。
野生型抗体およびより高い親和性の抗体を、インビボマウス中和アッセイにおいて研究した。単一の抗体に関して、より高い親和性は、腹腔内にBoNT/Aをチャレンジしたマウスの保護の小さい増大(約2倍)をもたらし(図23)、最も高い親和性のAR抗体は、100マウスLD50の毒素に対する完全な保護を提供したが、200 LD50に対しては完全な保護を提供しなかった。2種の抗体を組み合わせた場合、保護は、顕著に増大し、AR4+3D12の組み合わせは、保護の約2倍(2500 LD50から5000 LD50)までの増加を提供した。RAZ1を、その抗体の対において3D12に対して置換した場合、保護は、AR4とRAZ1との組み合わせについて、10,000マウスLD50を超えて見られた。したがって、そのデータは、抗体の組み合わせにおいてより高い親和性の抗体を使用することがより強力な毒素中和を生じることを示す。これは、3種の抗体の組み合わせについて、よりさらに明確である(表15)。
(ボツリヌス神経毒素血清型内の配列バリエーションは、抗体結合および中和に影響する)
(材料および方法)
(毒素遺伝子配列)
NCBIデータベースおよびMedlineを、ボツリヌス神経毒素遺伝子またはボツリヌス神経毒素タンパク質の公開された配列あるいは記録された配列を同定するために検索した。クロストリジウム属の株FRI−A2Hの神経毒素遺伝子を、この研究のために配列決定した(調製における書き写し)。Clostridial株の神経毒素遺伝子配列は、Michael Peckからの贈呈であった。遺伝子配列を、ベクターNTI(Invitrogen、San Diego、CA)中に入れ、翻訳させ、血清型によって分類し、そして整列した。系統樹を、ClustalWを使用して構築した。
精製した純粋でありかつ複合体形成したボツリヌス神経毒素A1(Hall hyper)およびA2(FRI−A2H)を、Metabiologics Inc(Madison、WI)から購入した。抗体S25およびC25を、免疫化されたマウス(Amersdorferら、(1997)Infect.Immun.65:3743−3752;Nowakowskiら、(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.U S A、99:11346−50)のV遺伝子から構築した単鎖Fvファージディスプレイライブラリーから得た。抗体3D12を、免疫化されたヒトボランティアドナー(Amersdorferら、(2002)Vaccine 20:1640−1648;Amersdorferら、(1997)Infect.Immun.65:3743−3752)のV遺伝子から構築した単鎖Fvファージディスプレイライブラリーから得た。抗体B4を、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の免疫化されたトランスジェニックマウス(Xenoマウス)(I.GerenおよびJ.D.Marksが考案した)のV遺伝子から構築した単鎖Fvファージディスプレイライブラリーから得た。これら4種の抗体の各々のV遺伝子を、先に記載される通りに、ヒトIgG1定常領域およびヒトκ定常領域を含む哺乳動物発現ベクター中にクローニングした(Nowakowskiら、(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.U S A、99:11346−50)。安定なCHO DG44細胞株を確立し、そしてIgGを、先に記載される通りに、プロテインGを使用して精製した(Nowakowskiら、(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.U S A、99:11346−50)。抗体の純度および濃度を、SDS−PAGEおよび280nmにおける吸光度によって決定した。抗体9D8(マウスIgG1/κ)および7C1(マウスIgG1/κ)を、rBoNT/A HCによって免疫化し、そしてBoNT/A毒素によって追加免疫したマウスから産生したハイブリドーマから得た。IgGを、プロテインGを使用してハイブリドーマ上清から精製し、そして純度および濃度を、SDS−PAGEおよびBCAアッセイ(Pierce Chemical Co.)によって決定した。次なる研究のために、IgG抗体を、約1〜3mg/mlにてPBS(pH7.4)中に保存した。
毒素捕捉ELISAのために、96ウェルマイクロタイタープレート(Immunolon 2、Dynatech)を、2μg/mlの抗体を用いて4℃にて一晩コーティングした。5%脱脂乳−PBSにおいて30分間ブロックした後、毒素を、100nMから1pMまで、二連で3.2倍希釈(half−log dilution)に適用し、そして37℃にて90分間インキュベートした。プレートを、洗浄し、そしてウマ抗BoNT抗体(PerImmune)と一緒にインキュベートし、0.2IU/mlまで希釈し(60分間)、次いで洗浄し、そして1:1000希釈の西洋ワサビペルオキシダーゼ(KPL)に結合体化したヤギ抗ウマ抗体と一緒に60分間インキュベートした。プレートを、ABTS(KPL)によって発色させた。バックグラウンドコントロールの減算後の405nmにおける平均吸光度を、毒素濃度に対してプロットした。
精製したBoNT/A1毒素または精製したBoNT/A2毒素についてのIgG会合速度定数およびIgG解離速度定数を、BIAcore 1000(Pharmacia Biosensor)における表面プラズモン共鳴を使用して測定し、そしてそれらを使用して、先に記載される通りにKDを算出した(Nowakowskiら、(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.U S A、99:11346−11350)。簡潔には、約100〜400RUの精製したIgG(10mMアセテート(pH3.5〜4.5)中の10〜20ug/ml)を、NHS−EDC化学を使用してCM5センサーチップにカップリングさせた。精製したBoNT/A1神経毒素または精製したBoNT/A2神経毒素についての会合速度定数を、50〜800nMの範囲の毒素濃度を使用して、15μl/分の連続的な流れにおいて測定した。その会合速度定数(kon)を、(ln(dR/dt))/t対濃度のプロットから決定した。解離速度定数(koff)を、再結合を防止するために30μl/分の流速を使用して、分析した毒素の最も高い濃度におけるセンサーグラムの解離部分から決定した。KDを、koff/konとして算出した。
50μgの適切なIgGを、0.5ml(総容量)のゼラチンリン酸緩衝液中のBoNT/A1神経毒素複合体(Hall株)の示された数のマウスLD50またはBoNT/A2神経毒素複合体(FRI−A2H株)の示された数のマウスLD50に添加し、そしてRTにて30分間インキュベートした。mAbの対に関して、25μgの各mAbを添加し、そして3種のmAbの組み合わせに関して、16.7μgの各mAbを添加した。次いでその混合物を、雌CD−1マウス(受領時に16〜22g)に対して腹腔内に注射した。マウスを、10の群において研究し、そして少なくとも毎日観察した。死亡の最終集計を、注射の5日後に決定した。マウスを使用した研究を、動物保護法および他の連邦法令ならびに動物および動物に関する実験に関する規制に従って行い、そしてこの研究は、Guide for the Care and Use of Laboratory Animals、National Research Council、1996に記述される原則を遵守する。この調査が行われた施設は、Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care Internationalによって完全に認定される。
(ボツリヌス神経毒素血清型内の配列バリエーション)
毒素血清型内の配列変異性の程度を決定するために、60種の公開された神経毒素配列を示す文献を、検索した。このデータは、49種の完全な毒素遺伝子配列および11種の部分的な毒素遺伝子配列を含んだ(表16)。上記49種の完全な配列を、血清型によって分類し、整列し、そして配列同一性の程度を決定した(表17および図11)。分析した49種の配列のうち、7種のBoNT/A、9種のBoNT/B、6種のBoNT/C、5種のBoNT/D、17種のBoNT/E、4種のBoNT/F、および1種のBoNT/Gが存在した。血清型内で、2つの型の毒素遺伝子配列が、観察された;互いに実質的に同一である配列(下記参照)およびアミノ酸レベルで少なくとも2.6%異なる配列。このような配列変異性は、1種より多い毒素遺伝子が配列決定されている全6種の血清型(BoNT A、BoNT B、BoNT C、BoNT D、BoNT E、およびBoNT F)内で観察された。血清型内で、変異性は、高くてBoNT/Fについての32%〜低くてBoNT/Eについての2.6%の範囲であった(表17)。3種のBoNT C/Dモザイク株および2種のBoNT D/Cモザイク株を、配列決定した。これらの株は、代表的に、それらの親血清型に対応した軽鎖およびN末端の重鎖を含み、その神経毒素配列の末端の3分の1は、そのモザイク株の代わりの血清型との強力であるが、絶対的ではない同一性を有する(表16)。
免疫の認識に対するBoNT/A毒素配列変異性の影響を決定するために、本発明者らは、捕捉ELISAによって、BoNT/A1に対して惹起された6種のモノクローナル抗体のBoNT/A1およびBoNT/A2に結合する能力を測定した。純粋な神経毒素および神経毒素複合体の両方に対する結合を、決定した。4種のmAb(3D12、C25、B4、およびS25)は、組換えHCに対するELISAによって決定したところ、BoNT/A HC上の重複しないエピトープを結合した。3D12およびS25は、先に、BoNT/A HCのC末端サブドメインに対してエピトープマッピングされており、一方で、C25は、2つのHCサブドメインによって形成された複合体エピトープを認識する(Mullaneyら、(2001)Inf.Immun.、69:6511−6514)。1種のmAb(9D8)は、組換えHNに対するELISAによって決定したところ、BoNT/Aトランスロケーションドメイン(HN)を結合した(データ示さず)。1種のmAb(7C1)は、組換え軽鎖に対するELISAによって決定したところ、BoNT/A軽鎖を結合した。
(A1神経毒素およびA2神経毒素の中和に対する抗体結合の影響)
本発明者らは、先に、本明細書で記載した3種のmAb(3D12、S25、およびC25)のBoNT/A1毒素に対するインビボ中和能を研究した。BoNT/A1の顕著なインビトロ中和を示すにもかかわらず、これら3種のmAbは、50ugの抗体を受容し、かつ20マウスLD50のBoNT/A1によってチャレンジしたマウスの顕著なインビボ保護を示さなかった(10〜20%のみの生存(Nowakowskiら、(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.U S A、99:11346−11350))。同様に、本明細書で報告した残りの3種のmAbは、マウスを20マウスLD50のBoNT/A1によってチャレンジした場合に、顕著なインビボ保護を示さなかった(10〜20%のみの生存、データ示さず)。本発明者らは、mAbを組み合わせた場合のインビボ保護における顕著な相乗作用を先に報告したので、本発明者らは、mAbの対およびトリプレットのインビボで毒素を中和する能力を研究した。先に観察した通り、抗体の対は、単一のmAbよりも顕著に大きいBoNT/A1中和を示し、さらに大きい効力が、3種のmAbの組み合わせについて観察された(図16および17A)。相乗効果は、1種のみの結合ドメイン抗体を含んだmAb対(C25+9D8)または非結合ドメイン抗体を含んだmAb対(9D8+7C1)(図16)、または1種のみの結合ドメイン抗体を含んだ3種のmAbの組み合わせ(C25+9D8+7C1)(図17A)について観察された。BoNT/A2毒素の中和に関して、BoNT/A2を高親和性で結合したmAbを含むmAbの対またはトリプレットのみが、中和について顕著な相乗作用を示した(図17B)。最も強力なmAbのトリプレット(3D12+9D8+7C1)は、10,000マウスLD50のA1毒素またはA2毒素のチャレンジからマウスを完全に保護できた。この組み合わせ(3D12+9D8+7C1)は、A1毒素の中和について3種の結合ドメインmAbの組み合わせ(C25+3D12+B4)ほど強力ではなく、一方で、1種のみの結合ドメインmAbは、A2毒素を任意の親和性で結合し、そして結果として、C25+3D12+B4のトリプレットは、200マウスLD50未満のA2毒素を中和した。
49種の公開された完全なボツリヌス神経毒素配列の分析は、毒素遺伝子配列が、血清型内で、実質的に同一であるかまたはアミノ酸レベルで互いと少なくとも3.6%異なるかのいずれかであったことを示した。本発明者らは、この最小限の相違(3.6%)を有するそれらの毒素を、所与の血清型のサブタイプであると称している。このような分析は、1種より多くの毒素遺伝子が配列決定されている6種の血清型について、平均で2.8個のサブタイプを示した(1種の血清型あたり2個〜4個の範囲のサブタイプ)。この分析は、おそらく、最も頻繁な毒素サブタイプを示す一方で、さらなる毒素サブタイプが、同定され続ける(比較的少数の配列決定された毒素遺伝子が与えられる(1種の血清型あたり平均で8種の毒素遺伝子))ようである。
(BoNT/AサブタイプA1、A2、およびA3の交差中和(cross neutralization)のために選択され、そして進化させた中和抗体)
ボツリヌス神経毒素(BoNT/Aが挙げられる)の異なるサブタイプの発見は、診断的抗体および治療的抗体の開発に対する挑戦をもたらす。理想的には、mAbまたはmAbの混合物は、異なるBoNTサブタイプの大部分または全てに結合し、そしてそれらを検出/中和する。これは、いくつかのサブタイプの検出に失敗しなかった検出システムをもたらす。治療的抗体について、交差反応性は、その抗体が上記サブタイプの1種以上を中和し損なわないことを確実にする。
BoNT/A1およびBoNT/A2を結合し得るモノクローナル抗体を産生するために、免疫性ファージscFv抗体ライブラリーまたは免疫性酵母scFv抗体ライブラリーを、最初はBoNT/A1に対し、次いでBoNT/A2に対して連続的に選択した。複数のラウンドの選択後、ファージ抗体または酵母抗体を、両方のBoNTサブタイプに対する結合についてスクリーニングした。2種のscFv抗体を、BoNT/A1およびBoNT/A2の両方を匹敵する親和性で結合した抗体を同定した(ING1、scFv KD BoNT/A1=1.17×10−9M;scFv KD BoNT/A2=1.18×10−9M:およびING2、scFv KD BoNT/A1=4.17×10−10M;scFv KD BoNT/A2=4.5×10−10M。ING1およびING2の配列については、表13を参照のこと。インビボ研究のために、これら2種のscFvを、IgGに変換した。そのIgGは、A1 BoNTおよびA2 BoNTの両方に対して、高親和性の結合を維持した(表21)。
HuC25もそのより高い親和性の誘導体も、BoNT/A2を高親和性で結合する(boNt/A1およびBoNT/A2に対するAR2の親和性については、表22を参照のこと)。BoNT/A2に対する親和性を増大させるために、本発明者らは、より高い親和性の改変体AR2を用いて開始した。IgGとしてのこの抗体は、10,000より多い、BoNT/A1よりも低い親和性をBoNT/A2に対して有し、そしてBoNT/A2に対する2.0×10−7Mの非常に低い親和性を有する(表22)。
実施例5において、抗体HuC25と、B4と、3D12との組み合わせの50ugが40,000マウスLD50のBoNT/A1(しかし、200LD50未満のBoNT/A2)を中和し得ることを示した。B4もHuC25も、BoNT/A2を高親和性で結合した。したがって、本発明者らは、HuC25に由来するがBoNT/A1およびBoNT/A2に対して高親和性を有するCR1抗体(RAZ1、およびING1またはING2のいずれかと組み合わせた)の、BoNT/A1およびBoNT/A2を中和する能力を研究した。50ug(全抗体)の抗体用量を使用して、CR1+RAZ1+ING1またはING2のいずれかの組み合わせは、40,000マウスLD50のBoNT/A1によってチャレンジしたマウスを完全に保護した。同用量の抗体は、BoNT/A2によってチャレンジしたマウスの顕著な保護を示し、組み合わせCR1+RAZ1+ING1が、最も強力であり、それは、40,000マウスLD50のBoNT/A2によってチャレンジしたマウスを完全に保護した(図25)。したがって、本発明者らは、複数のBoNTサブタイプ(この場合において、BoNT/A1およびBoNT/A2)を高親和性で結合し得る抗体を産生し、そして進化させることが可能であること、およびこれが、抗体が組み合わせられる場合に強力な中和をもたらすことを示した。
Claims (83)
- 哺乳動物においてボツリヌス神経毒素を中和する方法であって、該方法は、該哺乳動物に、BoNT血清型に対する少なくとも2種の異なる中和抗−抗体を投与する工程を包含し、該2種の抗体のうちの少なくとも1種は、該BoNT血清型のうちの少なくとも2種の異なるサブタイプを、約10nMより大きい親和性で結合する、方法。
- 前記BoNT血清型は、BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C、BoNT/D、BoNT/E、およびBoNT/Fからなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記BoNT血清型は、BoNT/AまたはBoNT/Bである、請求項1に記載の方法。
- 前記BoNT血清型は、BoNT/Aである、請求項1に記載の方法。
- 前記抗体のうちの少なくとも1種は、BoNT/A1、BoNT/A2、およびBoNT/A3からなる群より選択される少なくとも2種の異なるサブタイプを、それぞれ、約10nMより大きい親和性で結合する、請求項4に記載の方法。
- 前記抗体のうちの少なくとも1種は、BoNT/A1およびBoNT/A2を、それぞれ、約10nMより大きい親和性で結合する、請求項4に記載の方法。
- 前記抗体は、1mgの抗体あたり少なくとも10,000マウスLD50を中和する、請求項1、2、3、または4に記載の方法。
- 両方の抗体は、前記サブタイプのうちの少なくとも1種を同時に結合する、請求項1または4に記載の方法。
- 前記抗体は、1mgの抗体あたり少なくとも10,000マウスLD50を中和する、請求項8に記載の方法。
- 前記抗体は、それぞれ、RAZ1 VL CDR1、RAZ1 VL CDR2、RAZ1 VL CDR3、RAZ1 VH CDR1、RAZ1 VH CDR2、RAZ1 VH CDR3、1D11 VL CDR1、1D11 VL CDR2、1D11 VL CDR3、1D11 VH CDR1、1D11 VH CDR2、1D11 VH CDR3、2G11 VL CDR1、2G11 VL CDR2、2G11 VL CDR3、2G11 VH CDR1、2G11 VH CDR2、2G11 VH CDR3、5G4 VL CDR1、5G4 VL CDR2、5G4 VL CDR3、5G4 VH CDR1、5G4 VH CDR2、5G4 VH CDR3、3D12 VL CDR1、3D12 VL CDR2、3D12 VL CDR3、3D12 VH CDR1、3D12 VH CDR2、3D12 VH CDR3、CR1 VL CDR1、CR1 VL CDR2、CR1 VL CDR3、CR1 VH CDR1、CR1 VH CDR2、CR1 VH CDR3、CR2 VL CDR1、CR2 VL CDR2、CR2 VL CDR3、CR2 VH CDR1、CR2 VH CDR2、CR2 VH CDR3、ING1 VL CDR1、ING1 VL CDR2、ING1 VL CDR3、ING1 VH CDR1、ING1 VH CDR2、ING1 VH CDR3、ING2 VL CDR1、ING2 VL CDR2、ING2 VL CDR3、ING2 VH CDR1、ING2 VH CDR2、およびING2 VH CDR3からなる群より選択される少なくとも1種のCDRを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記抗体は、それぞれ、RAZ1 VL CDR1、RAZ1 VL CDR2、RAZ1 VL CDR3、RAZ1 VH CDR1、RAZ1 VH CDR2、RAZ1 VH CDR3、1D11 VL CDR1、1D11 VL CDR2、1D11 VL CDR3、1D11 VH CDR1、1D11 VH CDR2、1D11 VH CDR3、2G11 VL CDR1、2G11 VL CDR2、2G11 VL CDR3、2G11 VH CDR1、2G11 VH CDR2、2G11 VH CDR3、5G4 VL CDR1、5G4 VL CDR2、5G4 VL CDR3、5G4 VH CDR1、5G4 VH CDR2、5G4 VH CDR3、3D12 VL CDR1、3D12 VL CDR2、3D12 VL CDR3、3D12 VH CDR1、3D12 VH CDR2、3D12 VH CDR3、CR1 VL CDR1、CR1 VL CDR2、CR1 VL CDR3、CR1 VH CDR1、CR1 VH CDR2、CR1 VH CDR3、CR2 VL CDR1、CR2 VL CDR2、CR2 VL CDR3、CR2 VH CDR1、CR2 VH CDR2、CR2 VH CDR3、ING1 VL CDR1、ING1 VL CDR2、ING1 VL CDR3、ING1 VH CDR1、ING1 VH CDR2、ING1 VH CDR3、ING2 VL CDR1、ING2 VL CDR2、ING2 VL CDR3、ING2 VH CDR1、ING2 VH CDR2、およびING2 VH CDR3からなる群より選択される少なくとも3種のCDRを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記抗体は、それぞれ、VH CDR1、VH CDR2、およびVH CDR3を含み、該VH CDR1、VH CDR2、およびVH CDR3は全て、RAZ1 VHドメイン、CR1 VHドメイン、CR2 VHドメイン、ING1 VHドメイン、ING2 VHドメイン、1D11 VHドメイン、2G11 VHドメイン、3D12 VHドメイン、および5G4 VHドメインからなる群より選択されるVHドメインより選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記抗体は、それぞれ、VL CDR1、VL CDR2、およびVL CDR3を含み、該VL CDR1、VL CDR2、およびVL CDR3は全て、RAZ1 VLドメイン、CR1 VLドメイン、CR2 VLドメイン、ING1 VLドメイン、ING2 VLドメイン、1D11 VLドメイン、2G11 VLドメイン、3D12 VLドメイン、および5G4 VLドメインからなる群より選択されるVLドメインより選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記抗体は、それぞれ、
VH CDR1、VH CDR2、およびVH CDR3、ならびに
VL CDR1、VL CDR2、およびVL CDR3を含み、
該VH CDR1、VH CDR2、およびVH CDR3は全て、RAZ1 VHドメイン、CR1 VHドメイン、CR2 VHドメイン、ING1 VHドメイン、ING2 VHドメイン、1D11 VHドメイン、2G11 VHドメイン、3D12 VHドメイン、および5G4 VHドメインからなる群より選択されるVHドメインより選択され、
該VL CDR1、VL CDR2、およびVL CDR3は全て、RAZ1 VLドメイン、CR1 VLドメイン、CR2 VLドメイン、ING1 VLドメイン、ING2 VLドメイン、1D11 VLドメイン、2G11 VLドメイン、3D12 VLドメイン、および5G4 VLドメインからなる群より選択されるVLドメインより選択される、請求項1に記載の方法。 - 前記抗体のうちの少なくとも1種は、RAZ1、CR1、CR2、ING1、ING2、1D11、2G11、3D12、および5G4からなる群より選択される抗体より選択されるVH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、およびVL CDR3を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記抗体のうちの少なくとも1種は、単鎖Fv(scFv)である、請求項15に記載の方法。
- 前記抗体のうちの少なくとも1種は、IgGである、請求項15に記載の方法。
- 前記抗体のうちの少なくとも1種は、Fabである、請求項15に記載の方法。
- 前記抗体のうちの少なくとも1種は、(Fab’)2である、請求項15に記載の方法。
- 前記抗体のうちの少なくとも1種は、(scFv’)2である、請求項15に記載の方法。
- 前記抗体のうちの少なくとも1種は、RAZ1、CR1、CR2、ING1、ING2、1D11、2G11、3D12、および5G4からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記抗体のうちの少なくとも2種は、RAZ1、CR1、CR2、ING1、ING2、1D11、2G11、3D12、および5G4からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
- ボツリヌス神経毒素(BoNT)を中和するための組成物であって、該組成物は、
BoNT血清型に対する少なくとも2種の異なる中和抗体
を含み、該2種の抗体のうちの少なくとも1種は、該BoNT血清型の少なくとも2種の異なるサブタイプを、約10nMより大きい親和性で結合する、組成物。 - 前記BoNT血清型は、BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C、BoNT/D、BoNT/E、およびBoNT/Fからなる群より選択される、請求項23に記載の組成物。
- 前記BoNT血清型は、BoNT/AまたはBoNT/Bである、請求項23に記載の組成物。
- 前記BoNT血清型は、BoNT/Aである、請求項23に記載の組成物。
- 前記抗体のうちの少なくとも1種は、BoNT/A1、BoNT/A2、およびBoNT/A3からなる群より選択される少なくとも2種の異なるサブタイプを、それぞれ、約10nMより大きい親和性で結合する、請求項23に記載の組成物。
- 前記抗体のうちの少なくとも1種は、BoNT/A1およびBoNT/A2を、それぞれ、約10nMより大きい親和性で結合する、請求項23に記載の組成物。、
- 両方の抗体は、前記サブタイプのうちの少なくとも1種を同時に結合する、請求項23または26に記載の組成物。
- 前記抗体は、それぞれ、RAZ1 VL CDR1、RAZ1 VL CDR2、RAZ1 VL CDR3、RAZ1 VH CDR1、RAZ1 VH CDR2、RAZ1 VH CDR3、1D11 VL CDR1、1D11 VL CDR2、1D11 VL CDR3、1D11 VH CDR1、1D11 VH CDR2、1D11 VH CDR3、2G11 VL CDR1、2G11 VL CDR2、2G11 VL CDR3、2G11 VH CDR1、2G11 VH CDR2、2G11 VH CDR3、5G4 VL CDR1、5G4 VL CDR2、5G4 VL CDR3、5G4 VH CDR1、5G4 VH CDR2、5G4 VH CDR3、3D12 VL CDR1、3D12 VL CDR2、3D12 VL CDR3、3D12 VH CDR1、3D12 VH CDR2、3D12 VH CDR3、CR1 VL CDR1、CR1 VL CDR2、CR1 VL CDR3、CR1 VH CDR1、CR1 VH CDR2、CR1 VH CDR3、CR2 VL CDR1、CR2 VL CDR2、CR2 VL CDR3、CR2 VH CDR1、CR2 VH CDR2、CR2 VH CDR3、ING1 VL CDR1、ING1 VL CDR2、ING1 VL CDR3、ING1 VH CDR1、ING1 VH CDR2、ING1 VH CDR3、ING2 VL CDR1、ING2 VL CDR2、ING2 VL CDR3、ING2 VH CDR1、ING2 VH CDR2、およびING2 VH CDR3からなる群より選択される少なくとも1種のCDRを含む、請求項23に記載の組成物。
- 前記抗体は、それぞれ、RAZ1 VL CDR1、RAZ1 VL CDR2、RAZ1 VL CDR3、RAZ1 VH CDR1、RAZ1 VH CDR2、RAZ1 VH CDR3、1D11 VL CDR1、1D11 VL CDR2、1D11 VL CDR3、1D11 VH CDR1、1D11 VH CDR2、1D11 VH CDR3、2G11 VL CDR1、2G11 VL CDR2、2G11 VL CDR3、2G11 VH CDR1、2G11 VH CDR2、2G11 VH CDR3、5G4 VL CDR1、5G4 VL CDR2、5G4 VL CDR3、5G4 VH CDR1、5G4 VH CDR2、5G4 VH CDR3、3D12 VL CDR1、3D12 VL CDR2、3D12 VL CDR3、3D12 VH CDR1、3D12 VH CDR2、3D12 VH CDR3、CR1 VL CDR1、CR1 VL CDR2、CR1 VL CDR3、CR1 VH CDR1、CR1 VH CDR2、CR1 VH CDR3、CR2 VL CDR1、CR2 VL CDR2、CR2 VL CDR3、CR2 VH CDR1、CR2 VH CDR2、CR2 VH CDR3、ING1 VL CDR1、ING1 VL CDR2、ING1 VL CDR3、ING1 VH CDR1、ING1 VH CDR2、ING1 VH CDR3、ING2 VL CDR1、ING2 VL CDR2、ING2 VL CDR3、ING2 VH CDR1、ING2 VH CDR2、およびING2 VH CDR3からなる群より選択される少なくとも3種のCDRを含む、請求項23に記載の組成物。
- 前記抗体は、それぞれ、VH CDR1、VH CDR2、およびVH CDR3を含み、該VH CDR1、VH CDR2、およびVH CDR3は全て、RAZ1 VHドメイン、CR1 VHドメイン、CR2 VHドメイン、ING1 VHドメイン、ING2 VHドメイン、1D11 VHドメイン、2G11 VHドメイン、3D12 VHドメイン、および5G4 VHドメインからなる群より選択されるVHドメインより選択される、請求項23に記載の組成物。
- 前記抗体は、それぞれ、VL CDR1、VL CDR2、およびVL CDR3を含み、該VL CDR1、VL CDR2、およびVL CDR3は全て、RAZ1 VLドメイン、CR1 VLドメイン、CR2 VLドメイン、ING1 VLドメイン、ING2 VLドメイン、1D11 VLドメイン、2G11 VLドメイン、3D12 VLドメイン、および5G4 VLドメインからなる群より選択されるVLドメインより選択される、請求項23に記載の組成物。
- 前記抗体は、それぞれ、
RAZ1 VHドメイン、CR1 VHドメイン、CR2 VHドメイン、ING1 VHドメイン、ING2 VHドメイン、1D11 VHドメイン、2G11 VHドメイン、3D12 VHドメイン、および5G4 VHドメイン;ならびに
VL CDR1、VL CDR2、およびVL CDR3を含み、
該VL CDR1、VL CDR2、およびVL CDR3は全て、RAZ1 VLドメイン、CR1 VLドメイン、CR2 VLドメイン、ING1 VLドメイン、ING2 VLドメイン、1D11 VLドメイン、2G11 VLドメイン、3D12 VLドメイン、および5G4 VLドメインからなる群より選択されるVLドメインより選択される、請求項23に記載の組成物。 - 前記抗体のうちの少なくとも1種は、RAZ1、CR1、CR2、ING1、ING2、1D11、2G11、3D12、および5G4からなる群より選択される抗体より選択されるVH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、およびVL CDR3を含む、請求項23に記載の組成物。
- 前記抗体のうちの少なくとも1種は、単鎖Fv(scFv)である、請求項35に記載の組成物。
- 前記抗体のうちの少なくとも1種は、IgGである、請求項35に記載の組成物。
- 前記抗体のうちの少なくとも1種は、Fabである、請求項35に記載の組成物。
- 前記抗体のうちの少なくとも1種は、(Fab’)2である、請求項35に記載の組成物。
- 前記抗体のうちの少なくとも1種は、(scFv’)2である、請求項35に記載の組成物。
- 前記抗体のうちの少なくとも1種は、RAZ1、CR1、CR2、ING1、ING2、1D11、2G11、3D12、および5G4からなる群より選択される、請求項23に記載の組成物。
- 前記抗体のうちの少なくとも2種は、RAZ1、CR1、CR2、ING1、ING2、1D11、2G11、3D12、および5G4からなる群より選択される、請求項23に記載の組成物。
- 前記抗体は、薬学的に受容可能な賦形剤中にある、請求項23に記載の組成物。
- 前記組成物は、単位投薬処方物である、請求項43に記載の組成物。
- ボツリヌス神経毒素(BontA)を中和する抗体であって、該抗体は、少なくとも2種の異なるBontAサブタイプを、各サブタイプに対して約10nMより大きい親和性で結合する、抗体。
- 前記抗体は、前記Bont A1サブタイプおよび前記Bont A2サブタイプの両方を、それぞれ、約10nMより大きい親和性で結合する、請求項45に記載の抗体。
- 前記抗体は、RAZ1 VL CDR1、RAZ1 VL CDR2、RAZ1 VL CDR3、RAZ1 VH CDR1、RAZ1 VH CDR2、RAZ1 VH CDR3、1D11 VL CDR1、1D11 VL CDR2、1D11 VL CDR3、1D11 VH CDR1、1D11 VH CDR2、1D11 VH CDR3、2G11 VL CDR1、2G11 VL CDR2、2G11 VL CDR3、2G11 VH CDR1、2G11 VH CDR2、2G11 VH CDR3、5G4 VL CDR1、5G4 VL CDR2、5G4 VL CDR3、5G4 VH CDR1、5G4 VH CDR2、5G4 VH CDR3、3D12 VL CDR1、3D12 VL CDR2、3D12 VL CDR3、3D12 VH CDR1、3D12 VH CDR2、3D12 VH CDR3、CR1 VL CDR1、CR1 VL CDR2、CR1 VL CDR3、CR1 VH CDR1、CR1 VH CDR2、CR1 VH CDR3、CR2 VL CDR1、CR2 VL CDR2、CR2 VL CDR3、CR2 VH CDR1、CR2 VH CDR2、CR2 VH CDR3、ING1 VL CDR1、ING1 VL CDR2、ING1 VL CDR3、ING1 VH CDR1、ING1 VH CDR2、ING1 VH CDR3、ING2 VL CDR1、ING2 VL CDR2、ING2 VL CDR3、ING2 VH CDR1、ING2 VH CDR2、およびING2 VH CDR3からなる群より選択される少なくとも1種のCDRを含む、請求項45に記載の抗体。
- 前記抗体は、RAZ1 VL CDR1、RAZ1 VL CDR2、RAZ1 VL CDR3、RAZ1 VH CDR1、RAZ1 VH CDR2、RAZ1 VH CDR3、1D11 VL CDR1、1D11 VL CDR2、1D11 VL CDR3、1D11 VH CDR1、1D11 VH CDR2、1D11 VH CDR3、2G11 VL CDR1、2G11 VL CDR2、2G11 VL CDR3、2G11 VH CDR1、2G11 VH CDR2、2G11 VH CDR3、5G4 VL CDR1、5G4 VL CDR2、5G4 VL CDR3、5G4 VH CDR1、5G4 VH CDR2、5G4 VH CDR3、3D12 VL CDR1、3D12 VL CDR2、3D12 VL CDR3、3D12 VH CDR1、3D12 VH CDR2、3D12 VH CDR3、CR1 VL CDR1、CR1 VL CDR2、CR1 VL CDR3、CR1 VH CDR1、CR1 VH CDR2、CR1 VH CDR3、CR2 VL CDR1、CR2 VL CDR2、CR2 VL CDR3、CR2 VH CDR1、CR2 VH CDR2、CR2 VH CDR3、ING1 VL CDR1、ING1 VL CDR2、ING1 VL CDR3、ING1 VH CDR1、ING1 VH CDR2、ING1 VH CDR3、ING2 VL CDR1、ING2 VL CDR2、ING2 VL CDR3、ING2 VH CDR1、ING2 VH CDR2、およびING2 VH CDR3からなる群より選択される少なくとも3種のCDRを含む、請求項45に記載の抗体。
- 前記抗体は、VH CDR1、VH CDR2、およびVH CDR3を含み、該VH CDR1、VH CDR2、およびVH CDR3は全て、RAZ1 VHドメイン、CR1 VHドメイン、CR2 VHドメイン、ING1 VHドメイン、ING2 VHドメイン、1D11 VHドメイン、2G11 VHドメイン、3D12 VHドメイン、および5G4 VHドメインからなる群より選択されるVHドメインより選択される、請求項45に記載の抗体。
- 前記抗体は、VL CDR1、VL CDR2、およびVL CDR3を含み、該VL CDR1、VL CDR2、およびVL CDR3は全て、RAZ1 VLドメイン、CR1 VLドメイン、ING1 VLドメイン、ING2 VLドメイン、1D11 VLドメイン、2G11 VLドメイン、3D12 VLドメイン、および5G4 VLドメインからなる群より選択されるVLドメインより選択される、請求項45に記載の抗体。
- 前記抗体は、
RAZ1 VHドメイン、CR1 VHドメイン、CR2 VHドメイン、ING1 VHドメイン、ING2 VHドメイン、1D11 VHドメイン、2G11 VHドメイン、3D12 VHドメイン、および5G4 VHドメイン;ならびに
VL CDR1、VL CDR2、およびVL CDR3を含み、
該VL CDR1、VL CDR2、およびVL CDR3は全て、RAZ1 VLドメイン、CR1 VLドメイン、CR2 VLドメイン、ING1 VLドメイン、ING2 VLドメイン、1D11 VLドメイン、2G11 VLドメイン、3D12 VLドメイン、および5G4 VLドメインからなる群より選択されるVLドメインより選択される、請求項45に記載の抗体。 - 前記抗体は、RAZ1、CR1、CR2、ING1、ING2、1D11、2G11、3D12、および5G4からなる群より選択される抗体より選択されるVH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、およびVL CDR3を含む、請求項45に記載の抗体。
- 前記抗体は、RAZ1 VHおよびRAZ1 VLを含む、請求項45に記載の抗体。
- 前記抗体は、CR1 VHおよびCR1 VLを含む、請求項45に記載の抗体。
- 前記抗体は、CR2 VHおよびCR2 VLを含む、請求項45に記載の抗体。
- 前記抗体は、ING1 VHおよびING1 VLを含む、請求項45に記載の抗体。
- 前記抗体は、ING2 VHおよびING2 VLを含む、請求項45に記載の抗体。
- 前記抗体は、1D11 VHおよび1D11 VLを含む、請求項45に記載の抗体。
- 前記抗体は、2G11 VHおよび1G11 VLを含む、請求項45に記載の抗体。
- 前記抗体は、5G4 VHおよび5G4 VLを含む、請求項45に記載の抗体。
- 前記抗体は、3D12 VHおよび3D12 VLを含む、請求項45に記載の抗体。
- 前記抗体は、単鎖Fv(scFv)である、請求項45に記載の抗体。
- 前記抗体は、IgGである、請求項45に記載の抗体。
- 前記抗体は、Fabである、請求項52に記載の抗体。
- 前記抗体は、(Fab’)2である、請求項45に記載の抗体。
- 前記抗体は、(scFv’)2である、請求項45に記載の抗体。
- 前記抗体は、RAZ1、CR1、CR2、ING1、ING2、3D12、1D11、2G11、および5G4からなる群より選択される、請求項45に記載の抗体。
- ボツリヌス神経毒素(BontA)を結合する抗体であって、該抗体は、AR2 VL CDR1、AR2 VL CDR2、AR2 VL CDR3、AR2 VH CDR1、AR2 VH CDR2、AR2 VH CDR3、AR3 VL CDR1、AR3 VL CDR2、AR3 VL CDR3、AR3 VH CDR1、AR3 VH CDR2、AR3 VH CDR3、AR4 VL CDR1、AR4 VL CDR2、AR4 VL CDR3、AR4 VH CDR1、AR4 VH CDR2、およびAR4 VH CDR3からなる群より選択される少なくとも1種のCDRを含む、抗体。
- 前記抗体は、AR2 VL CDR1、AR2 VL CDR2、AR2 VL CDR3、AR2 VH CDR1、AR2 VH CDR2、AR2 VH CDR3、AR3 VL CDR1、AR3 VL CDR2、AR3 VL CDR3、AR3 VH CDR1、AR3 VH CDR2、AR3 VH CDR3、AR4 VL CDR1、AR4 VL CDR2、AR4 VL CDR3、AR4 VH CDR1、AR4 VH CDR2、およびAR4 VH CDR3からなる群より選択される少なくとも3種のCDRを含む、請求項68に記載の抗体。
- 前記抗体は、VH CDR1、VH CDR2、およびVH CDR3を含み、該VH CDR1、VH CDR2、およびVH CDR3は全て、AR2 VHドメイン、AR3 VHドメイン、およびAR4 VHドメインからなる群より選択されるVHドメインより選択される、請求項68に記載の抗体。
- 前記抗体は、VL CDR1、VL CDR2、およびVL CDR3を含み、該VL CDR1、VL CDR2、およびVL CDR3は全て、AR2 VLドメイン、AR3 VLドメイン、およびAR4 VLドメインからなる群より選択されるVLドメインより選択される、請求項68に記載の抗体。
- 前記抗体は、
VH CDR1、VH CDR2、およびVH CDR3、ならびに
VL CDR1、VL CDR2、およびVL CDR3を含み、
該VH CDR1、VH CDR2、およびVH CDR3は全て、AR2 VHドメイン、AR3 VHドメイン、およびAR4 VHドメインからなる群より選択されるVHドメインより選択され、
該VL CDR1、VL CDR2、およびVL CDR3は全て、AR2 VLドメイン、AR3 VLドメイン、およびAR4 VLからなる群より選択されるVLドメインより選択される、請求項68に記載の抗体。 - 前記抗体は、AR2、AR3およびAR4からなる群より選択される抗体より選択されるVH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、およびVL CDR3を含む、請求項68に記載の抗体。
- 前記抗体は、単鎖Fv(scFv)である、請求項68に記載の抗体。
- 前記抗体は、IgGである、請求項68に記載の抗体。
- 前記抗体は、Fabである、請求項68に記載の抗体。
- 前記抗体は、(Fab’)2である、請求項68に記載の抗体。
- 前記抗体は、(scFv’)2である、請求項68に記載の抗体。
- 前記抗体は、AR2、AR3およびAR4からなる群より選択される、請求項68に記載の抗体。
- 請求項45〜79のいずれかに記載の抗体をコードする核酸。
- 請求項45〜79のいずれかに記載の抗体をコードする核酸を含む細胞。
- ボツリヌス神経毒素を中和するためのキットであって、該キットは、
請求項23〜44のいずれかに記載の組成物;および
ボツリヌス神経毒素を中和するための該組成物の使用を教示する指示資料;
を備える、キット。 - 前記組成物は、使い捨て可能な注射器中に保存される、請求項82に記載のキット。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US64825605P | 2005-01-27 | 2005-01-27 | |
PCT/US2006/003070 WO2007094754A2 (en) | 2005-01-27 | 2006-01-26 | Therapeutic monoclonal antibodies that neutralize botulinum neurotoxins |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2011227423A Division JP2012010714A (ja) | 2005-01-27 | 2011-10-14 | ボツリヌス神経毒素を中和する治療的モノクローナル抗体 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2008528060A true JP2008528060A (ja) | 2008-07-31 |
JP2008528060A5 JP2008528060A5 (ja) | 2009-03-12 |
Family
ID=38371918
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2008500705A Pending JP2008528060A (ja) | 2005-01-27 | 2006-01-26 | ボツリヌス神経毒素を中和する治療的モノクローナル抗体 |
JP2011227423A Pending JP2012010714A (ja) | 2005-01-27 | 2011-10-14 | ボツリヌス神経毒素を中和する治療的モノクローナル抗体 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2011227423A Pending JP2012010714A (ja) | 2005-01-27 | 2011-10-14 | ボツリヌス神経毒素を中和する治療的モノクローナル抗体 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US7700738B2 (ja) |
EP (2) | EP2153848A3 (ja) |
JP (2) | JP2008528060A (ja) |
CN (1) | CN101146554B (ja) |
AU (1) | AU2006332045A1 (ja) |
CA (1) | CA2594297A1 (ja) |
WO (1) | WO2007094754A2 (ja) |
Families Citing this family (26)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7563874B2 (en) * | 1998-08-31 | 2009-07-21 | The Regents Of The University Of California | Therapeutic monoclonal antibodies that neutralize botulinum neurotoxins |
WO2007094754A2 (en) | 2005-01-27 | 2007-08-23 | The Regents Of The University Of Califordnia | Therapeutic monoclonal antibodies that neutralize botulinum neurotoxins |
MX2008014804A (es) * | 2006-06-02 | 2009-01-27 | Regeneron Pharma | Anticuerpos de afinidad elevada a receptor de il-6 humano. |
EP2134749B1 (en) | 2007-03-22 | 2013-11-06 | The Regents of the University of California | Therapeutic monoclonal antibodies that neutralize botulinum neurotoxins |
WO2008157374A1 (en) * | 2007-06-13 | 2008-12-24 | The United States Of America, As Represented By The Secretrary Of Agriculture | High-affinity monoclonal antibodies for botulinum toxin type a |
JP5432727B2 (ja) * | 2008-01-29 | 2014-03-05 | 株式会社抗体研究所 | A型ボツリヌス毒素中和組成物及びヒト抗a型ボツリヌス毒素抗体 |
CA2732003A1 (en) * | 2008-07-31 | 2010-02-04 | James D. Marks | Antibodies that neutralize botulinum neurotoxins |
CN102980999A (zh) * | 2008-11-27 | 2013-03-20 | 上海交通大学 | 检测莱克多巴胺的化学发光免疫检测试剂盒 |
EP2473191B1 (en) * | 2009-09-04 | 2017-08-23 | XOMA Technology Ltd. | Antibody coformulations |
US8821879B2 (en) | 2009-09-04 | 2014-09-02 | Xoma Technology Ltd. | Anti-botulism antibody coformulations |
US20120269822A1 (en) | 2009-10-20 | 2012-10-25 | Marks James D | Anti-Botulinum Neurotoxin a Single Domain Antibody Antibodies |
TW202348631A (zh) | 2010-02-24 | 2023-12-16 | 美商免疫遺傳股份有限公司 | 葉酸受體1抗體類和免疫共軛物類及彼等之用途 |
NZ629829A (en) | 2010-04-30 | 2015-11-27 | Alexion Pharma Inc | Anti-c5a antibodies and methods for using the antibodies |
FR2962439A1 (fr) * | 2010-07-12 | 2012-01-13 | Lfb Biotechnologies | Anticorps monoclonaux diriges contre la toxine tetanique |
US8956859B1 (en) | 2010-08-13 | 2015-02-17 | Aviex Technologies Llc | Compositions and methods for determining successful immunization by one or more vaccines |
WO2012047427A2 (en) * | 2010-08-31 | 2012-04-12 | The Regents Of The University Of California | Antibodies for botulinum neurotoxins |
US9474454B2 (en) * | 2010-10-20 | 2016-10-25 | Advanced Mri Technologies Llc | MRI using faster multiplexed echo planar imaging (EPI) pulse sequences |
HUE036172T2 (hu) | 2011-04-01 | 2018-06-28 | Immunogen Inc | Eljárások a hatékonyság növelésére a FOLR1 rákkezelésénél |
NZ726258A (en) | 2012-08-31 | 2019-07-26 | Immunogen Inc | Antibodies and uses thereof to detect folate receptor 1 |
EP2931749B1 (fr) | 2012-12-17 | 2019-04-24 | Laboratoire Francais du Fractionnement et des Biotechnologies Societe Anonyme | Utilisation d'anticorps monoclonaux pour le traitement de l'inflammation et d'infections bacteriennes |
KR102585409B1 (ko) | 2013-08-30 | 2023-10-05 | 이뮤노젠 아이엔씨 | 엽산 수용체 1의 검출을 위한 항체 및 분석 |
EP3349796A4 (en) | 2015-09-17 | 2019-05-29 | ImmunoGen, Inc. | THERAPEUTIC COMBINATIONS COMPRISING ANTI-FOLR1 IMMUNOCONJUGATES |
EA201990229A1 (ru) * | 2016-07-08 | 2019-06-28 | Пол Стенмарк | Новый ботулинический нейротоксин и его производные |
CN110317268B (zh) * | 2019-07-01 | 2021-06-29 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 一种中和a型肉毒毒素的鼠源单抗及其应用 |
CN114621348B (zh) * | 2022-01-24 | 2023-09-22 | 深圳市乐土生物医药有限公司 | 一种多肽及其抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体 |
CN116925213B (zh) * | 2023-09-12 | 2024-03-15 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 一种中和a型肉毒毒素的纳米抗体 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20040175385A1 (en) * | 1998-08-31 | 2004-09-09 | The Regents Of The University Of Carlifornia | Therapeutic monoclonal antibodies that neutralize botulinum neurotoxins |
Family Cites Families (67)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4254082A (en) | 1978-06-12 | 1981-03-03 | Miles Laboratories, Inc. | Specific binding-adsorbent assay test means |
US4391904A (en) | 1979-12-26 | 1983-07-05 | Syva Company | Test strip kits in immunoassays and compositions therein |
US4376110A (en) | 1980-08-04 | 1983-03-08 | Hybritech, Incorporated | Immunometric assays using monoclonal antibodies |
US4366241A (en) | 1980-08-07 | 1982-12-28 | Syva Company | Concentrating zone method in heterogeneous immunoassays |
US4517288A (en) | 1981-01-23 | 1985-05-14 | American Hospital Supply Corp. | Solid phase system for ligand assay |
US4722848A (en) | 1982-12-08 | 1988-02-02 | Health Research, Incorporated | Method for immunizing animals with synthetically modified vaccinia virus |
CH652145A5 (de) | 1982-01-22 | 1985-10-31 | Sandoz Ag | Verfahren zur in vitro-herstellung von hybridomen welche humane monoklonale antikoerper erzeugen. |
JPS58215453A (ja) | 1982-06-09 | 1983-12-14 | Toray Silicone Co Ltd | 室温硬化後塗装可能なオルガノポリシロキサン組成物 |
US4716111A (en) | 1982-08-11 | 1987-12-29 | Trustees Of Boston University | Process for producing human antibodies |
US4689299A (en) | 1982-09-30 | 1987-08-25 | University Of Rochester | Human monoclonal antibodies against bacterial toxins |
US4511503A (en) | 1982-12-22 | 1985-04-16 | Genentech, Inc. | Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins |
US4816567A (en) | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
US4634666A (en) | 1984-01-06 | 1987-01-06 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Human-murine hybridoma fusion partner |
US4683202A (en) | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
US5169939A (en) | 1985-05-21 | 1992-12-08 | Massachusetts Institute Of Technology & Pres. & Fellows Of Harvard College | Chimeric antibodies |
CA1291031C (en) | 1985-12-23 | 1991-10-22 | Nikolaas C.J. De Jaeger | Method for the detection of specific binding agents and their correspondingbindable substances |
US5306730A (en) | 1986-02-03 | 1994-04-26 | Kabushiki Kaisha Yakult Honsha | Botulinum toxin neutralizer |
US4946778A (en) | 1987-09-21 | 1990-08-07 | Genex Corporation | Single polypeptide chain binding molecules |
IL84285A (en) | 1986-10-27 | 1993-03-15 | Int Genetic Engineering | Chimeric antibody with specificity to human tumor antigen |
IL85035A0 (en) | 1987-01-08 | 1988-06-30 | Int Genetic Eng | Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same |
US5091513A (en) | 1987-05-21 | 1992-02-25 | Creative Biomolecules, Inc. | Biosynthetic antibody binding sites |
US5132405A (en) | 1987-05-21 | 1992-07-21 | Creative Biomolecules, Inc. | Biosynthetic antibody binding sites |
US5001065A (en) | 1987-05-27 | 1991-03-19 | Cetus Corporation | Human cell line and triomas, antibodies, and transformants derived therefrom |
JPS6412935A (en) | 1987-07-02 | 1989-01-17 | Mitsubishi Electric Corp | Constant-speed travel device for vehicle |
US5204244A (en) | 1987-10-27 | 1993-04-20 | Oncogen | Production of chimeric antibodies by homologous recombination |
US5202238A (en) | 1987-10-27 | 1993-04-13 | Oncogen | Production of chimeric antibodies by homologous recombination |
US5231026A (en) | 1987-12-31 | 1993-07-27 | Tanox Biosystems, Inc. | DNA encoding murine-human chimeric antibodies specific for antigenic epitopes of IgE present on the extracellular segment of the membrane domain of membrane-bound IgE |
US4975369A (en) | 1988-04-21 | 1990-12-04 | Eli Lilly And Company | Recombinant and chimeric KS1/4 antibodies directed against a human adenocarcinoma antigen |
US5292867A (en) | 1988-11-16 | 1994-03-08 | Tanox Biosystems, Inc. | Chimeric monoclonal antibodies which bind to the extracellular segment of the membrane-bound domain of a human membrane-bound immunoglobulin |
IL94872A (en) | 1989-06-30 | 1995-03-30 | Oncogen | Monoclonal or chimeric antibodies that react with human carcinoma, recombinant proteins that contain their anti-binding site, pharmaceutical preparations and kits that contain the |
US5075431A (en) | 1989-07-26 | 1991-12-24 | City Of Hope | Chimeric anti-CEA antibody |
US5081235A (en) | 1989-07-26 | 1992-01-14 | City Of Hope | Chimeric anti-cea antibody |
US5599539A (en) | 1989-10-31 | 1997-02-04 | Ophidian Pharmaceuticals, Inc. | Therapy for clostridial botulinum toxin |
US5719267A (en) | 1989-10-31 | 1998-02-17 | Ophidian Pharmaceuticals Inc. | Clostridial toxin disease therapy |
US5919665A (en) | 1989-10-31 | 1999-07-06 | Ophidian Pharmaceuticals, Inc. | Vaccine for clostridium botulinum neurotoxin |
GB9125979D0 (en) | 1991-12-06 | 1992-02-05 | Wellcome Found | Antibody |
JP3720353B2 (ja) | 1992-12-04 | 2005-11-24 | メディカル リサーチ カウンシル | 多価および多重特異性の結合タンパク質、それらの製造および使用 |
US5472693A (en) | 1993-02-16 | 1995-12-05 | The Dow Chemical Company | Family of anti-carcinoembryonic antigen chimeric antibodies |
JP3382295B2 (ja) * | 1993-04-22 | 2003-03-04 | キヤノン株式会社 | 像振れ補正装置 |
US5506132A (en) | 1993-07-28 | 1996-04-09 | Sandoz Pharmaceuticals Corporation | Human antibodies against varicella-zoster virus |
US5426039A (en) | 1993-09-08 | 1995-06-20 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Direct molecular cloning of primer extended DNA containing an alkane diol |
US7214787B1 (en) | 1993-09-21 | 2007-05-08 | United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | Recombinant vaccine against botulinum neurotoxin |
US6974578B1 (en) | 1993-12-28 | 2005-12-13 | Allergan, Inc. | Method for treating secretions and glands using botulinum toxin |
EP1181937A3 (en) | 1994-08-09 | 2004-02-04 | Cytrx Corporation | Novel vaccine adjuvant and vaccine |
AU4670696A (en) | 1995-02-13 | 1996-09-04 | Microbiological Research Authority | Diagnosis of toxicoinfectious clostridiosis |
US5691447A (en) | 1995-03-24 | 1997-11-25 | Tanox Biosystems, Inc. | GC1q receptor, HIV-1 gp120 region binding thereto, and related peptides and targeting antibodies |
US5731161A (en) | 1995-04-24 | 1998-03-24 | Allergan, Inc. | Botulinum toxin antibody detection assay |
US5807741A (en) | 1995-07-20 | 1998-09-15 | Brown; Douglas Richard | Neutralizing monoclonal antibody against botulinum neurotoxin serotype F |
US5932449A (en) | 1996-02-01 | 1999-08-03 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | Detection of botulinum toxin |
GB9617671D0 (en) | 1996-08-23 | 1996-10-02 | Microbiological Res Authority | Recombinant toxin fragments |
US7192596B2 (en) | 1996-08-23 | 2007-03-20 | The Health Protection Agency Ipsen Limited | Recombinant toxin fragments |
US7244826B1 (en) | 1998-04-24 | 2007-07-17 | The Regents Of The University Of California | Internalizing ERB2 antibodies |
US6794128B2 (en) | 1998-04-24 | 2004-09-21 | The Regents Of The University Of California | Methods of selecting internalizing antibodies |
DE19828466A1 (de) | 1998-06-26 | 1999-12-30 | Roche Diagnostics Gmbh | Entstörung von Immunoassays durch Substanzen, die aus den Framework-Regionen von Antikörpern abgeleitet sind |
CA2336587A1 (en) | 1998-07-10 | 2000-01-20 | U.S. Medical Research Institute Of Infectious Diseases | Botulinum neurotoxin vaccine |
US20020155114A1 (en) | 1998-08-31 | 2002-10-24 | James D. Marks | Therapeutic monoclonal antibodies that neutralize botulinum neurotoxins |
US6667158B1 (en) | 1998-12-17 | 2003-12-23 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | Antibodies against type a botulinum neurotoxin |
JP2003502023A (ja) | 1999-05-14 | 2003-01-21 | ユーエス アーミー メディカル リサーチ アンド マテリアル コマンド | ボツリヌス菌毒素b及び破傷風菌神経毒素の特異的阻害剤及び治療薬としてのブフォリンi |
US6573244B1 (en) | 1999-05-17 | 2003-06-03 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | Previns as specific inhibitors and therapeutic agents for Botulinum toxin B and Tetanus neurotoxins |
US20040220100A1 (en) | 2000-07-21 | 2004-11-04 | Essentia Biosystems, Inc. | Multi-component biological transport systems |
CA2451909C (en) | 2000-09-25 | 2010-12-21 | James J. Schmidt | High throughput assays for the proteolytic activities of clostridial neurotoxins |
AU2003304411A1 (en) | 2002-08-01 | 2005-03-07 | The Regents Of The University Of California | Therapeutic monoclonal antibodies that neutralize botulinum neurotoxins |
WO2005030119A2 (en) | 2003-04-11 | 2005-04-07 | Allergan, Inc. | Botulinum toxin a peptides and methods of predicting and reducing immunoresistance to botulinum toxin therapy |
US7157562B1 (en) | 2003-04-14 | 2007-01-02 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | Bioprocess for the production of recombinant anti-botulinum toxin antibody |
GB0312642D0 (en) | 2003-06-03 | 2003-07-09 | Secr Defence | Pharmaceutical composition |
WO2007094754A2 (en) | 2005-01-27 | 2007-08-23 | The Regents Of The University Of Califordnia | Therapeutic monoclonal antibodies that neutralize botulinum neurotoxins |
TWI552751B (zh) | 2011-06-20 | 2016-10-11 | H 朗德貝克公司 | 投予4-((1r,3s)-6-氯-3-苯基-二氫茚-1-基)-1,2,2-三甲基-哌及其鹽用於治療精神分裂症的方法 |
-
2006
- 2006-01-26 WO PCT/US2006/003070 patent/WO2007094754A2/en active Application Filing
- 2006-01-26 EP EP09011256A patent/EP2153848A3/en not_active Withdrawn
- 2006-01-26 AU AU2006332045A patent/AU2006332045A1/en not_active Abandoned
- 2006-01-26 CA CA002594297A patent/CA2594297A1/en not_active Abandoned
- 2006-01-26 JP JP2008500705A patent/JP2008528060A/ja active Pending
- 2006-01-26 US US11/342,271 patent/US7700738B2/en active Active
- 2006-01-26 CN CN2006800097157A patent/CN101146554B/zh active Active
- 2006-01-26 EP EP06849678A patent/EP1850866A4/en not_active Withdrawn
-
2009
- 2009-12-23 US US12/646,705 patent/US7999079B2/en active Active
-
2011
- 2011-07-01 US US13/175,628 patent/US20120177663A1/en not_active Abandoned
- 2011-10-14 JP JP2011227423A patent/JP2012010714A/ja active Pending
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20040175385A1 (en) * | 1998-08-31 | 2004-09-09 | The Regents Of The University Of Carlifornia | Therapeutic monoclonal antibodies that neutralize botulinum neurotoxins |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN101146554A (zh) | 2008-03-19 |
CN101146554B (zh) | 2012-10-10 |
EP1850866A4 (en) | 2009-07-08 |
CA2594297A1 (en) | 2006-07-27 |
JP2012010714A (ja) | 2012-01-19 |
WO2007094754A3 (en) | 2007-10-04 |
AU2006332045A2 (en) | 2009-07-09 |
WO2007094754A2 (en) | 2007-08-23 |
US20110171235A1 (en) | 2011-07-14 |
EP1850866A2 (en) | 2007-11-07 |
AU2006332045A1 (en) | 2007-08-16 |
EP2153848A3 (en) | 2010-07-21 |
US20120177663A1 (en) | 2012-07-12 |
EP2153848A2 (en) | 2010-02-17 |
US7700738B2 (en) | 2010-04-20 |
US7999079B2 (en) | 2011-08-16 |
AU2006332045A8 (en) | 2008-07-31 |
US20080124328A1 (en) | 2008-05-29 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2008528060A (ja) | ボツリヌス神経毒素を中和する治療的モノクローナル抗体 | |
US8263747B2 (en) | Therapeutic monoclonal antibodies that neutralize botulinum neurotoxins | |
US10611851B2 (en) | Therapeutic monoclonal antibodies that neutralize botulinum neurotoxins | |
US10308708B2 (en) | Antibodies that neutralize botulinum neurotoxins | |
US20020155114A1 (en) | Therapeutic monoclonal antibodies that neutralize botulinum neurotoxins | |
EP1572121B1 (en) | Therapeutic monoclonal antibodies that neutralize botulinum neurotoxins | |
AlKhalifah | Recombinant antibodies against Clostridium difficile toxin A |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090114 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20090114 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090121 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110715 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20111014 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20120605 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20121005 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20121019 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20121113 |
|
A912 | Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912 Effective date: 20121207 |