CN114621348B

CN114621348B - 一种多肽及其抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体

Info

Publication number: CN114621348B
Application number: CN202210081264.9A
Authority: CN
Inventors: 姚添淇; 姜孝明; 林浩峰
Original assignee: Shanghai Letu Life Technology Co ltd; Shenzhen Le Earth Life Science And Technology Investment Co ltd; Shenzhen Letu Biomedical Co ltd
Current assignee: Shanghai Letu Life Technology Co ltd; Shenzhen Le Earth Life Science And Technology Investment Co ltd; Shenzhen Letu Biomedical Co ltd
Priority date: 2022-01-24
Filing date: 2022-01-24
Publication date: 2023-09-22
Anticipated expiration: 2042-01-24
Also published as: CN114621348A

Abstract

一种多肽及其抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体，所述多肽包含如SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46所示氨基酸序列中的至少一种。该抗体可抑制GPC3阳性细胞增殖，具有可用于制备癌症治疗药物的潜力。

Description

一种多肽及其抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体

技术领域

本发明涉及生物制药领域，具体涉及一种多肽及其抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体。

背景技术

2021年全球抗体药物市场的规模首次突破2000亿美元，抗体是机体通过免疫系统产生的天然药物，对于许多热门靶点，可以通过杂交瘤技术、噬菌体展示技术或单B细胞技术筛选出全新的抗体药物，抗体的Fab提供了结合不同靶标不同表位的特异性，Fc骨架保证了抗体药物的长效性(PK)及理化稳定性。磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)也叫MXR7、OCI-5，是硫酸乙酰肝素糖蛋白(heparan sulfate proteoglycan,HSPG)家族中的一员，GPC3作为肝细胞癌细胞的肿瘤标记物，其在肝癌组织中的特异性高表达已被广泛报道，还有数据表明，GPC3阳性患者的5年生存率比GPC3阴性患者低。此外，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)高表达于肝细胞癌、肺鳞癌、小细胞肺癌和食管鳞状细胞癌等癌症组织，是一个肿瘤免疫治疗中特异性较好的肿瘤相关抗原靶标。但是，目前全球范围内尚无靶向GPC3的药物上市。

肝癌是常见的恶性肿瘤疾病，根据美国癌症协会《临床医师癌症杂志》(CA:ACancer Journal for Clinici ans)发表的《2020年全球癌症统计报告：全球185个国家36种癌症发病率和死亡率的估计》，肝癌的全球发病率位于全部癌症发病率第6，2020年全球有83万人死于肝癌(在所有癌症中占比8.3％)，位居全部癌症死亡率第3。在我国，肝癌的发病率位居癌症发病率第5，死亡率高达13％，位居第2，仅次于肺癌，对患者生命健康产生了极大的威胁。尽管癌症的早期诊断技术逐年提高，但肝癌患者的5年生存率仅有10％左右。常见的对于早期发现的肝癌患者的治疗方法有切除、肿瘤消融治疗等，但对于通过血液循环转移或淋巴循环转移的肝癌细胞则无能为力，因此肝癌患者的复发率居高不下。1975年，Kohler和Milstein将小鼠骨髓瘤细胞和小鼠脾脏细胞融合形成可以生产单克隆抗体的杂交瘤细胞，创立了单克隆抗体杂交瘤技术，然而鼠源性单克隆抗体应用于人类有较强的免疫原性，注射入人体后会诱发产生人抗鼠抗体(Human anti-mouse antibody，HAMA)反应，引起较强的免疫排斥反应；20世纪80年代开始研发人源化抗体，从最初的嵌合抗体到后来的CDR移植的人源化抗体，或多或少地含有部分鼠源蛋白，因而在临床中或多或少地存在一些免疫排斥反应。

目前常用的治疗肝癌的多靶点抗血管生成抑制剂索拉菲尼和瑞戈非尼的疗效也不尽如人意，而使用抗体治疗的CDR移植的人源化抗体又有可能激发免疫排斥，因此急需开发出有效的靶向肝癌的药物来减轻肝癌患者的痛苦。

发明内容

根据第一方面，在一实施例中，提供一种多肽，所述多肽包含如SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46所示氨基酸序列中的至少一种。

在一实施例中，所述多肽包含如SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46所示氨基酸序列中的任意一种。

根据第二方面，在一实施例中，提供一种抗体轻链的可变区(VL)，所述抗体轻链的可变区包含如SEQ ID NO：4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44所示氨基酸序列中的至少一种。

在一实施例中，所述抗体轻链包含如SEQ ID NO：4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44所示氨基酸序列中的任意一种。

根据第三方面，在一实施例中，提供一种抗体重链的可变区(VH)，所述抗体重链的可变区包含如SEQ ID NO：6、10、14、18、22、26、30、34、38、42、46所示氨基酸序列中的至少一种。

根据第四方面，在一实施例中，提供一种抗体，所述抗体包含第一方面所述多肽，或第二方面所述抗体轻链的可变区，或第三方面所述抗体重链的可变区。

根据第五方面，在一实施例中，提供分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含可编码第一方面所述多肽，或第二方面所述抗体轻链的可变区，或第三方面所述抗体重链的可变区，或第四方面所述抗体的核苷酸。

根据第六方面，在一实施例中，提供一种构建体，所述构建体含有第五方面所述多核苷酸。

根据第七方面，在一些实施例中，提供一种表达系统，所述表达系统含有如第六方面所述构建体或基因组中整合有外源的如第五方面所述多核苷酸。

根据第八方面，在一些实施例中，提供一种组合物，其包含第一方面所述多肽，或第二方面所述抗体轻链的可变区，或第三方面所述抗体重链的可变区，或第四方面所述抗体，或第五方面所述多核苷酸，以及药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂、佐剂中的至少一种。

根据第九方面，在一些实施例中，提供一种试剂盒，其包括第八方面所述组合物。

根据第十方面，在一些实施例中，提供第一方面所述多肽，或第二方面所述抗体轻链的可变区，或第三方面所述抗体重链的可变区，或第四方面所述抗体，或第五方面所述多核苷酸，或第六方面所述构建体，或第七方面所述表达系统，或第八方面所述组合物在制备治疗癌症的药物中的用途。

依据上述实施例的一种多肽及其抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体，该抗体与Hepg2、Huh-7等GPC3阳性天然肝癌细胞系具有较高亲和力，具有可用于制备癌症治疗药物的潜力。

附图说明

图1为Codrituzumab表达纯化后SDS-PAGE鉴定图。

图2为Codrituzumab与HepG2细胞的结合情况图。

图3为Codrituzumab与HuH-7细胞的结合情况图。

图4为表达的Codrituzumab与GPC3高表达细胞株GPC3-CHO-S的结合情况图。

图5.1、图5.2为第2、3轮次富集的噬菌体池与GPC3-CHO-S细胞结合情况图。

图6为单克隆噬菌体与GPC3-CHO-S细胞结合情况图。

图7为单克隆全长质粒表达纯化后SDS-PAGE鉴定图。

图8为单克隆全长抗体与GPC3-CHO-S细胞株结合活性图。

图9为单克隆全长抗体与HepG2细胞株结合活性图。

图10为单克隆全长抗体与HuH-7细胞株结合活性图。

图11为一种实施例的抗体结构示意图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。其中不同实施方式中类似元件采用了相关联的类似的元件标号。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本申请能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他元件、材料、方法所替代。在某些情况下，本申请相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本申请的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。

另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。

本文中为部件所编序号本身，例如“第一”、“第二”等，仅用于区分所描述的对象，不具有任何顺序或技术含义。而本申请所说“连接”、“联接，”如无特别说明，均包括直接和间接连接(联接)。

术语解释

如本文所用，“肽”是指一个氨基酸的氨基与另一个氨基酸的羧基缩合而成的化合物，肽可以由两个、三个或者更多氨基酸“脱水缩合”而成。

如本文所用，“多肽”是指由多个(两个或两个以上)氨基酸“脱水缩合”而成的化合物。

如本文所用，“蛋白”亦称蛋白质，是由氨基酸以“脱水缩合”的方式组成的多肽链经过盘曲折叠形成的具有一定空间结构的物质。

如本文所用，多肽的“N端”是指多肽链上具有突出的氨基(-NH₂)的一端，多肽的“C端”是指多肽链上具有突出的羧基(-COOH)的一端。

在一实施例中，所述抗体重链包含如SEQ ID NO：6、10、14、18、22、26、30、34、38、42、46所示氨基酸序列中的任意一种。

在一实施例中，所述抗体的轻链包含第二方面所述抗体轻链的可变区。

在一实施例中，所述抗体的重链包含第三方面所述抗体重链的可变区。

在一实施例中，所述抗体包含IgG抗体。

在一实施例中，所述IgG抗体包含IgG1、IgG2、IgG4中的至少一种。

在一实施例中，所述抗体包含人源抗体。

在一实施例中，轻链、重链可变区还可应用于car-t(嵌合抗原受体T细胞免疫疗，Chimeric Antigen Rece ptor T-Cell Immunotherapy)、双抗、ADC(抗体偶联药物)等等。

在一实施例中，第二方面所述抗体轻链的可变区的C端键联至所述抗体的轻链的恒定区的N端。

在一实施例中，第三方面所述抗体重链的可变区的C端键联至所述抗体的重链的CH1区的N端。

在一实施例中，所述抗体包含特异性靶向磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的抗体。

在一实施例中，所述抗体包含全人源单克隆抗体。

根据第六方面，在一实施例中，提供一种构建体，所述构建体含有第五方面所述多核苷酸。所述构建体通常可以通过将所述分离的多核苷酸插入合适的载体中构建获得，本领域技术人员可选择合适的载体，所述载体可以是噬菌体、质粒、病毒载体或人工染色体，诸如细菌或酵母人工染色体。换言之，本发明的实施方案的载体包含能够在宿主细胞或其分离的级分中表达的感兴趣的多核苷酸。载体通常还适合作为克隆载体，即在微生物系统中可复制；克隆载体可以被设计用于在一种宿主中复制，而构建体被设计用于在不同的宿主中表达。包含本发明的实施方案的多肽和蛋白的载体还可以包含用于在宿主细胞中繁殖或选择的选择标记。载体可以通过常规转化或转染技术引入到原核或真核细胞中。

根据第七方面，在一些实施例中，提供一种表达系统，所述表达系统含有如第六方面所述构建体或基因组中整合有外源的如第五方面所述多核苷酸。所述表达系统可以是宿主细胞，所述宿主细胞可以表达如第一方面所述多肽，或第二方面所述抗体轻链的可变区，或第三方面所述抗体重链的可变区，或第四方面所述抗体。在本发明另一具体实施例中，所述宿主细胞可以是真核细胞和/或原核细胞，更具体可以是小鼠细胞、人细胞等。

本说明书中使用的术语“药学上可接受的载体”或“生理学上可接受的载体”包括液体或固体填充剂，还可以包括但不限于溶剂和包封材料中的至少一种；并且是指药学或生理学上可接受的材料、组合物、物质或介质。

在一些实施例中，所述试剂盒还包括容纳第八方面所述组合物的容器。

在一些实施例中，所述试剂盒还包括使用说明书。

在一些实施例中，所述癌症包括但不限于肝癌、肺鳞癌(肺鳞状上皮细胞癌)、鳞状食道癌(食管鳞状细胞癌)、小细胞肺癌中的至少一种。

根据第十一方面，在一些实施例中，提供一种抗体筛选方法，包括：

富集步骤，包括表达Codrituzumab验证高表达GPC3细胞株，利用高表达GPC3细胞株对人源天然库进行富集；

单克隆挑选步骤，包括对富集较好的噬菌体挑单克隆，进行phage ELISA及phage流式检测结合活性；

结合活性检测步骤，包括对筛选得到的克隆测序、构建到人IgG1骨架上进行真核表达后，检测细胞结合活性。

在一实施例中，本发明通过利用过表达GPC3的细胞株对全人源Fab噬菌体库进行筛选抗体，由于细胞上表达的高丰度GPC3具有天然的构象，相比利用合成的多肽、原核或真核表达的抗原进行筛选，利用细胞进行筛选能更快获得理想的针对靶标的高亲和力抗体。

在一实施例中，本发明提供一种靶向磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的全人源单克隆抗体。该抗体具有抗体可变结构域氨基酸序列，包括抗体轻链和重链中互补决定区(CDR)和构架区(FR)的氨基酸序列的部分。此外，本发明提供的抗体为全人源单克隆抗体。

在一实施例中，本发明所提供的的筛选抗体方法包括：首先，建立高效合理的富集方法，使用阴性细胞负筛再用阳性细胞正向筛选，减少噬菌体的非特异性结合。之后，筛选得到的阳性噬菌体克隆无法完全反映真核表达的抗体结合情况，须测序可变区后构建至人IgG1(1类人免疫球蛋白G)抗体骨架上，表达纯化后再进行检测。

在一实施例中，对于IgG，重链分类为γ。每条重链由N-端重链可变区(可缩写为HCVR)和重链恒定区组成。对于IgG，重链恒定区由三个结构域(CH1、CH2和CH3)和CH1与CH2结构域之间的铰链(HINGE)结构域组成。

在一实施例中，抗体构建的详细步骤如下：

第一阶段：准备材料，表达Codrituzumab验证高表达GPC3细胞株，利用高表达GPC3细胞株对人源天然库进行富集。

第二阶段：对富集较好的噬菌体挑单克隆，进行phage ELISA及phage流式检测结合活性。

第三阶段：对筛选得到的克隆测序、构建到人IgG1骨架上进行真核表达后检测细胞结合活性。

以下实施例中，TOP10感受态细胞购自生工生物工程(上海)股份有限公司，CHO-S细胞购自ThermoFisher，HepG2和HuH-7细胞系购自中国细胞库。

实施例1：GPC3阳性抗体Codrituzumab(GC33)表达

如图11所示为本实施例的抗体结构，具体说明如下：

抗体的轻链可变区(VL)与重链可变区(VH)包含互补决定区(CDR)与构架区(FR)。

抗体的轻链恒定区(CL)与重链恒定区的CH1通过二硫键聚合，重链恒定区还包含CH2、CH3，CH1的C端依次键联至CH2、CH3。

为检测GPC3高表达细胞株的结合能力，表达GPC3阳性抗体(抗GPC3抗体)Codrituzumab，对细胞株进行检测。

本实施例使用的SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示氨基酸序列为完整的GC33重/轻链序列，前述两段序列是在WHO list中公布的完整序列，为IgG1亚型结构，本实施例直接将全序列进行引用，未对其进行人工改造。

SEQ ID NO：1所示的GC33重链氨基酸序列如下：

其中，各功能区如下：VH为下划单直线标示的序列，CH1为下划双直线标示的序列，HINGE为下划粗直线标示的序列，CH2为点式下划线标示的序列，CH3为下划波浪线标示的序列。

SEQ ID NO：2所示的GC33轻链氨基酸序列如下：

其中，各功能区如下：VL为下划单直线标示的序列，CL为下划双直线标示的序列。

将Codrituzumab(GC33)的重链(SEQ ID NO：1)和轻链(SEQ ID NO：2)转化成对应密码子之后，构建在pKS001质粒(购买自中山康晟生物技术有限公司)上，构建的质粒进行转化至TOP10感受态细胞中，涂板后挑单克隆至LB液体培养基中进行扩培，用无内毒素试剂盒进行质粒提取后备用。另将CHO-S细胞培养至对数期(5×10⁶活细胞/mL，活率≥99％)，在转染前一天(Day-1)，将细胞浓度调整至3×10⁶～4×10⁶活细胞/mL，培养过夜，然后用新鲜37℃预热的ExpiCHO^TM Expression Medium将细胞稀释至终浓度为6×10⁶活细胞/mL，总体积共250mL；随后用OptiPRO^TM SFM complexation medium稀释ExpiFectamine^TM CHOReagent后5分钟内加入40μL质粒(1μg/mL)，在4℃环境混匀后5分钟内加入细胞，37℃，8％CO₂，125rpm环境培养。在转染后第1天加入ExpiCHO^TM Feed，将温度调整至32℃，等至第5天再添加一次ExpiCHO^TM Feed，第12天4000×g离心收获蛋白，使用0.22μm滤膜过滤后使用protein A纯化柱进行纯化收集洗脱液，进行SDS-PAGE蛋白电泳对洗脱液进行鉴定，鉴定结果由图1所示，抗体大小约145kDa，重链大小约49kDa，轻链大小约24kDa，非还原胶及还原胶鉴定结果显示抗体大小正确；使用紫外分光光度计进行蛋白定量。

实施例2：检测Codrituzumab的细胞结合活性

使用天然GPC3阳性细胞株HepG2和HuH-7细胞系对表达的Codrituzumab进行结合检测，设置R15-F7(IgG2a)抗体为阴性对照；首先将扩大培养后的HepG2和HuH-7细胞株加入96孔板中，每孔1×10⁵个细胞，400×g离心3分钟，弃去上清后用流式细胞缓冲液清洗细胞。将抗体以20μg/mL的起始浓度2倍梯度稀释8个浓度梯度，加入96孔板中轻柔将细胞团吹打混匀，置于4℃环境下孵育1小时。孵育后用400×g离心3分钟，用流式细胞缓冲液清洗，此步骤重复3次。然后加入山羊F(ab')2抗人IgG-Fc(PE)预吸附二抗(abcam ab98596 1:300稀释)到96孔板中轻柔将细胞团吹打混匀，置于4℃环境下孵育1小时，孵育后用400×g离心3分钟，用流式细胞缓冲液清洗，此步骤重复3次，最后用流式细胞缓冲液进行重悬后等待上机，鉴定结果如图2、3所示，表达的Codrituzumab与GPC3阳性细胞株HepG2、HuH-7均有结合活性。

实施例3：检测GPC3高表达细胞株GPC3-CHO-S

使用GPC3阳性抗体Codrituzumab进行细胞结合活性检测，分别设置阴性对照与空白对照。首先将扩大培养后的GPC3-CHO-S细胞株加入96孔板中，每孔1×10⁵个细胞，400×g离心3分钟，弃去上清后用流式细胞缓冲液清洗细胞。将GC33以20μg/mL的起始浓度2倍梯度稀释12个浓度梯度，加入96孔板中轻柔将细胞团吹打混匀，置于4℃环境下孵育1小时。孵育后用400g离心3分钟，用流式细胞缓冲液清洗，此步骤重复3次。然后加入山羊F(ab')2抗人IgG-Fc(PE)预吸附二抗(abcam ab98596 1:300稀释)到96孔板中轻柔将细胞团吹打混匀，置于4℃环境下孵育1小时，孵育后用400×g离心3分钟，用流式细胞缓冲液清洗，此步骤重复3次，最后用流式细胞缓冲液进行重悬后等待上机，鉴定结果如图4所示，表达的Codrituzumab与GPC3高表达细胞株GPC3-CHO-S有结合活性。

实施例4：利用GPC3高表达细胞株GPC3-CHO-S进行人源噬菌体库富集

首先用5％FBS-PBS封闭液对CHO-S细胞与GPC3-CHO-S细胞进行封闭，每管细胞加入2mL封闭液，室温置于摇床上封闭1h。将保存的人源天然库噬菌体悬液也用5％FBS-PBS封闭液封闭，封闭后投入封闭后的CHO-S细胞中，室温置于摇床孵育2小时；然后将孵育后的噬菌体吸出，转移至GPC3-CHO-S细胞中，室温置于摇床孵育2小时；随后用PBS对细胞进行清洗6～8次，利用Gly-HCl将结合的噬菌体洗脱下来。最后用收获的噬菌体侵染对数期的SS320宿主菌，充分混匀后37℃静置孵育30分钟，将菌液涂在带有四环素(12μg/mL)、羧苄(50μg/mL)抗性的2YT平板上，37℃培养箱过夜培养，最后制备成噬菌体作为下一轮次的输入噬菌体。以此实验方法进行2～3轮次噬菌体富集。

实施例5：对噬菌体池进行细胞结合能力检测

将第2、3轮次的收获的噬菌体池进行流式细胞检测，首先对噬菌体池8000×g离心10分钟，取上清，用提前包被了anti-human Fab抗体的酶标板进行ELISA检测上清中Fab浓度；对每个噬菌体池进行定量后，首先将扩大培养后的细胞株加入96孔板中，每孔1×10⁵个细胞，400×g离心3分钟，弃去上清后用流式细胞缓冲液清洗细胞。分别设置阳性对照与阴性对照，以10μg/mL的起始浓度5倍梯度稀释4个浓度梯度，加入96孔板中轻柔将细胞团吹打混匀，置于4℃环境下孵育1小时。孵育后用400×g离心3分钟，用流式细胞缓冲液清洗，此步骤重复3次。然后加入山羊F(ab')2抗人IgG-Fc(PE)预吸附二抗(abcam ab98596 1:300稀释)到96孔板中轻柔将细胞团吹打混匀，置于4℃环境下孵育1小时，孵育后用400g离心3分钟，用流式细胞缓冲液清洗，此步骤重复3次，最后用流式细胞缓冲液进行重悬后等待上机，结果如图5.1、图5.2所示，第2、3轮次富集的噬菌体池中，有6个噬菌体池与GPC3-CHO-S细胞有较强结合信号。

实施例6：检测单克隆噬菌体的GPC3-CHO-S细胞结合能力

对第2、3轮次富集的有较高细胞结合信号的噬菌体池进行感染SS320宿主菌，涂板生长后挑平板上的单克隆至2YT培养基中，在37℃、220rpm环境下培养24小时，培养后首先对单克隆噬菌体8000×g离心10分钟，取上清，利用上清中的噬菌体侵染对数期的SS320宿主菌，充分混匀后37℃静置孵育30分钟，然后将菌液按10倍比例稀释成不同浓度，取2μL将菌液滴在2YT平板上，37℃培养箱过夜培养后对单克隆噬菌体进行计数；对每个单克隆噬菌体进行定量后，首先将扩大培养后的细胞株加入96孔板中，每孔1×10⁵个细胞，400×g离心3分钟，弃去上清后用流式细胞缓冲液清洗细胞。分别设置阳性对照与阴性对照，单克隆噬菌体以1E+11pfu/mL的起始浓度10倍梯度稀释4个浓度梯度、对照抗体以1μg/mL的浓度20倍梯度稀释4个浓度梯度加入96孔板中轻柔将细胞团吹打混匀，置于4℃环境下孵育1小时。孵育后用400×g离心3分钟，用流式细胞缓冲液清洗，此步骤重复3次。然后加入Add M13-PE(1:500)二抗到96孔板中，轻柔地将细胞团吹打混匀，置于4℃环境下孵育30分钟，孵育后用400×g离心3分钟，用流式细胞缓冲液清洗，此步骤重复3次，最后用流式细胞缓冲液进行重悬后等待上机。

实施例7：单克隆噬菌体测序与抗体全长构建

通过图6所示的筛选结果，本实施例挑选信号较高的几株单克隆噬菌体的VH/VL进行测序(测序由北京擎科生物科技有限公司完成)。通过筛选及分析基因序列，最终得到11个(前期筛选只得到11个克隆，序列均列出，下游的结合实验显示出11个里面的只有部分抗体有比较好的结合活性)具有独特序列的噬菌体单克隆(克隆号分别为D5/D7/D35/D36/D37/D38/D42/D44/D46/D47/D48)。

其中D5的轻链DNA序列为SEQ ID NO：3，氨基酸序列为SEQ ID NO：4，重链DNA序列为SEQ ID NO：5，氨基酸序列为SEQ ID NO：6；

其中D7的轻链DNA序列为SEQ ID NO：7，氨基酸序列为SEQ ID NO：8，重链DNA序列为SEQ ID NO：9，氨基酸序列为SEQ ID NO：10；

其中D35的轻链DNA序列为SEQ ID NO：11，氨基酸序列为SEQ ID NO：12，重链DNA序列为SEQ ID NO：13，氨基酸序列为SEQ ID NO：14；

其中D36的轻链DNA序列为SEQ ID NO：15，氨基酸序列为SEQ ID NO：16，重链DNA序列为SEQ ID NO：17，氨基酸序列为SEQ ID NO：18；

其中D37的轻链DNA序列为SEQ ID NO：19，氨基酸序列为SEQ ID NO：20，重链DNA序列为SEQ ID NO：21，氨基酸序列为SEQ ID NO：22；

其中D38的轻链DNA序列为SEQ ID NO：23，氨基酸序列为SEQ ID NO：24，重链DNA序列为SEQ ID NO：25，氨基酸序列为SEQ ID NO：26；

其中D42的轻链DNA序列为SEQ ID NO：27，氨基酸序列为SEQ ID NO：28，重链DNA序列为SEQ ID NO：29，氨基酸序列为SEQ ID NO：30；

其中D44的轻链DNA序列为SEQ ID NO：31，氨基酸序列为SEQ ID NO：32，重链DNA序列为SEQ ID NO：33，氨基酸序列为SEQ ID NO：34；

其中D46的轻链DNA序列为SEQ ID NO：35，氨基酸序列为SEQ ID NO：36，重链DNA序列为SEQ ID NO：37，氨基酸序列为SEQ ID NO：38；

其中D47的轻链DNA序列为SEQ ID NO：39，氨基酸序列为SEQ ID NO：40，重链DNA序列为SEQ ID NO：41，氨基酸序列为SEQ ID NO：42；

其中D48的轻链DNA序列为SEQ ID NO：43，氨基酸序列为SEQ ID NO：44，重链DNA序列为SEQ ID NO：45，氨基酸序列为SEQ ID NO：46。

分别将测序D5/D7/D35/D36/D37/D38/D42/D44/D46/D47/D48克隆得到的VL DNA序列与IgG1轻链CL拼接；VH DNA序列与IgG1重链CH1-Fc段拼接，分别将拼接后的序列构建在双启动子质粒pKS001上(序列合成由江苏金斯瑞生物科技有限公司完成)；将合成后的质粒按照实施例1中所述方法进行转化、扩培、转染、纯化等步骤，获得由CHO-S细胞表达的抗体，进行SDS-PAGE蛋白电泳对洗脱液进行鉴定，结果如图7所示，非还原胶及还原胶鉴定结果显示抗体大小正确；使用紫外分光光度计进行蛋白定量。

实施例8：全长抗体与GPC3-CHO-S、HepG2、HuH-7结合活性检测

将筛选出的噬菌体单克隆测序、构建、表达完整的抗体结构后，对克隆抗体的细胞活性重新进行检测。首先将扩大培养后的GPC3-CHO-S、HepG2和HuH-7细胞株加入96孔板中，每孔1×10⁵个细胞，400×g离心3分钟，弃去上清后用流式细胞缓冲液清洗细胞；分别设置阴性对照与空白对照，将单克隆抗体及对照以20μg/mL的起始浓度3倍梯度稀释8个浓度梯度，加入96孔板中轻柔将细胞团吹打混匀，置于4℃环境下孵育1小时。孵育后用400×g离心3分钟，用流式细胞缓冲液清洗，此步骤重复3次。然后加入山羊F(ab′)2抗人IgG-Fc(PE)预吸附二抗(abcam ab985961∶300稀释)到96孔板中轻柔将细胞团吹打混匀，置于4℃环境下孵育1小时，孵育后用400×g离心3分钟，用流式细胞缓冲液清洗，此步骤重复3次，最后用流式细胞缓冲液进行重悬后等待上机，结果如图8～图10所示，其中克隆D7与克隆D38与三株GPC3阳性细胞株均有较好结合活性。

最终计算对应EC50值，结果如下表所示。

表1单克隆全长抗体与不同GPC3阳性细胞株结合EC50值(μg/mL)

EC50(μg/mL)	D5	D7	D35	D36	D37	D38	D42	D44	D46	D47	D48	Codrituzumab
													GPC3-CHO-S	0.06636	0.0287	0.03159	0.03941	0.03138	0.03941	/	/	0.03541	/	0.09677	0.1838
HepG2	/	0.0256	7.944	/	/	83.94	18.31	/	/	/	11.6	0.1724
													HuH-7	9.622	0.0248	/	/	6.214	45.07	/	/	/	0.02277	/	0.1906

表1中，“/”表示该克隆与对应细胞无结合信号或无良好线性关系，无法计算EC50值。

表1为图8～图10的结果总结，可见，克隆D7与克隆D38与三株GPC3阳性细胞株均有较好结合活性，其中D7的EC50比阳性克隆Codrituzumab更低。

SEQ ID NO：3～46所示序列如下：

SEQ ID NO：3

AACATCCAGTTGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAATCACCATCACTTGCCGGGCCAGTCAGAGTATTAGTAGGTGGTTGGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCCAAAGTCTTGATCTATAAGGCGTCTAATTTAGAAAATGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGACTCTGCAACTTATTACTGCCAACAGCATAGTTATTCCTCTCCGTGGAGGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA；

SEQ ID NO：4

NIQLTQSPSTLSASVGDRITITCRASQSISRWLAWYQQKPGKAPKVLIYKASNLENGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDSATYYCQQHSYSSPWRFGQGTKVEIK；

SEQ ID NO：5

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGGAAGTAATAAATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGACAGTATAGCAGCAGTTCGCCCTTCGACTACTGG GGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCATCA；

SEQ ID NO：6

EVQLLESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQYSSSSPFDYWGQGTLVTVSS；

SEQ ID NO：7

AACATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTACCCCTCGGGTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA；

SEQ ID NO：8

NIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPRVTFGGGTKVEIK；

SEQ ID NO：9

GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGGGGGGGGTAAGGTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCATCA；

SEQ ID NO：10

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGGGKVDYWGQGTLVTVSS；

SEQ ID NO：11

GACATCCAGTTGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCTTCTATAGGCGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCCAGTCAGAGGGTTAGTAGCCGGTTGGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGCAAAGCCCCTAAACTCCTCATCTATAAGACATCGAATTTAGAAGCTGAGGTCCCCTCCAGATTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACCTACTACTG CCAACAGTATCATAGTTACCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA；

SEQ ID NO：12

DIQLTQSPSTLSASIGDRVTITCRASQRVSSRLAWYQQKPGKAPKLLIYKTSNLEAEVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYHSYPLTFGGGTKVEIK；

SEQ ID NO：13

GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCATCTTCAGTGACTCCTACATGACCTGGCTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGGTCTCATACATTAGTGGAAGTGCTAGTGATATAAAGTACGCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGGGACAACGCCAAGAATTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGTCGAGGACACGGCCGTGTATTATTGTGCGAGAGATCCCCGATTAGCGGGCATCTGGGGCCAGGG GACAACGGTCACCGTCTCATCA；

SEQ ID NO：14

EVQLVESGGGVVKPGGSLRLSCAASGFIFSDSYMTWLRQAPGKGLEWVSYISGSASDIKYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRVEDTAVYYCARDPRLAGIWGQGTTVTVSS；

SEQ ID NO：15

GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCTGTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACCTGTCGGGCGAGTCAGGACATTGGCAAATATTTAAATTGGTATCAACAGAAAGCAGGAAAAGCCCCTAACCTCCTGATCTACGATGCATCCAATTTGAAAACAGGGGTCTCATCAAGGTTCAGTGGAAGTGGTTCTGGGACAGAATTTACATTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAGGATATTGCAACATATTTCTGTCAACAGTTTGATGATTTCCCATACACTTTCGGCCCTGGGACCAAGGTGGGAATCAGA；

SEQ ID NO：16

DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDIGKYLNWYQQKAGKAPNLLIYDASNLKTGVSSRFSGSGSGTEFTFTISSLQPEDIATYFCQQFDDFPYTFGPGTKVGIR；

SEQ ID NO：17

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATAGCATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCCATTAGTAGTAGTAGTAGTTACATATACTACGCAGACTCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGAGACTACGGACGGGGGTATGGACGTCTGGGG CCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCATCA；

SEQ ID NO：18

EVQLLESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARETTDGGMDVWGQGTLVTVSS；

SEQ ID NO：19

GACATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTGGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCAGGCGAGTCAGGGCATTAGCAATTATGTGAATTGGTATCAGCAGAAACCTGGAAAAGCCCCTGAACTCCTGATCTCCGATGCATACAATTTGGAAGCTGGGGTCCCATCAACCTTCAGTGGAAGTGGATCTGGGACACAATTTACTTTCACCATCAGCAGCCTGCAACCTGAGCATATTGGAACATATTACTGTC AACAATTTGAGACTATCCCGTGGACTTTCGGCCAAGGGACCAAGATAGAAGTCAAG；

SEQ ID NO：20

DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQGISNYVNWYQQKPGKAPELLISDAYNLEAGVPSTFSGSGSGTQFTFTISSLQPEHIGTYYCQQFETIPWTFGQGTKIEVK；

SEQ ID NO：21

CAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCGGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTTACCTTTAGCAGTTATGCCATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAACTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTTTATTACTGTGCGAGGGGAAGTTGGGGTGCTTTTGATATCTGGGGCCAGGGAACCCCGGTCACCGTCTCATCA；

SEQ ID NO：22

QVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGLEWVSTISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGSWGAFDIWGQGTPVTVSS；

SEQ ID NO：23

AACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCCAGGCAAGTCAGGATATTAGCAACTATGTCAATTGGTATCAACAGAGACCAGGCAAAGCCCCTAAGCTCCTCATGTACGATGCATCAAATTTGGAAGTCGGGGTCCCAGTGAGGTTCCGTGGAAGTGGCTCTGGGACAGAGTTCACCTTCACCATCCTCAGCCTGCAGCCTGAAGATCTTGGAACATATTACTG TCAACAATATGATTCTCTCCCGTTCACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGATCTCAAA；

SEQ ID NO：24

NIQMTQSPSSLSASVGDRVTISCQASQDISNYVNWYQQRPGKAPKLLMYDASNLEVGVPVRFRGSGSGTEFTFTILSLQPEDLGTYYCQQYDSLPFTFGQGTKLDLK；

SEQ ID NO：25

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGTAGTTTGGGGAGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGAACCACGGTCACCGTCTCATCA；

SEQ ID NO：26

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVVWGAFDIWGQGTTVTVSS；

SEQ ID NO：27

GACATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCTTCCGTGTCTGCATCTGTGGGGGACAGAGTCGTCATCACCTGTCGGGCGAGTCAGAGTCTTGGCAACTGGTTAGCCTGGTATCAGCAAAAACCAGGGAAAGCCCCTAATCTCCTAATCTATGGTGCATCCACTTTGCAGACTGGGGTCCCTTCAAGGTTCAGCGGCTTTCACTCCGGGGGAGAATACACTCTCAGCATCTCCAACCTGCAGCCTGAAGATGCTGCAACTTACTATTGT CAACAGGCTAGTAGCATCCCGCTCACTTTCGGCGGGGGGACCAAGGTGGAGATCAAG；

SEQ ID NO：28

DIQLTQSPSSVSASVGDRVVITCRASQSLGNWLAWYQQKPGKAPNLLIYGASTLQTGVPSRFSGFHSGGEYTLSISNLQPEDAATYYCQQASSIPLTFGGGTKVEIK；

SEQ ID NO：29

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCCTTTATAAAGAGGGGTGTTCTTGCTTTTGATATCTGGG GCCAGGGGACCCCGGTCACCGTCTCATCA；

SEQ ID NO：30

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAFIKRGVLAFDIWGQGTPVTVSS；

SEQ ID NO：31

GACATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCGTCCCTGGCCGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAACTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTG TCAACAGAGTTACAGTACCCCTCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA；

SEQ ID NO：32

DIQLTQSPSSLAASVGDRVTITCRASQSISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPRTFGQGTKVEIK；

SEQ ID NO：33

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGAGGAGGGTGGATTCAGCCTGGGGAGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGCTTCGACATCAATAACAAATATATGAGTTGGGTCCGCCAAAGTCCAGAAAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCCATTAGTAGTAGTAGTAGTTACATATACTACGCAGACTCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGCCCCAATAGTGGGAGCTAGGCAGCGTGCTTTT GATATCTGGGGCCAGGGAACCATGGTCACCGTCTCATCA；

SEQ ID NO：34

EVQLLESGGGWIQPGESLRLSCAASGFDINNKYMSWVRQSPEKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARAPIVGARQRAFDIWGQGTMVTVSS；

SEQ ID NO：35

GACATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTG TCAACAGAGTTACAGTACCCCTCGTACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA；

SEQ ID NO：36

DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPRTFGQGTKVEIK；

SEQ ID NO：37

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCATCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGGAAGTAATAAATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGATGTCACCTTGGGGGTTCGGGGAGTCCCTCATTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAGGGGACACCGGTCACCGTCTCATCA；

SEQ ID NO：38

EVQLLESGGGVVHPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDVTLGVRGVPHYYYGMDVWGQGTPVTVSS；

SEQ ID NO：39

AACATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCGTCCGTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACGATCACTTGTCGGGCGAGTCAGGGTATTTGGAGGTGGTTAGCCTGGTATCAACACAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTCTGCTGCATCCAATTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGTAGCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTATTGT CAACAGGCTAACAGTTTCCCTTCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGACATCAGA；

SEQ ID NO：40

NIQLTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGIWRWLAWYQHKPGKAPKLLISAASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQANSFPSLTFGGGTKVDIR；

SEQ ID NO：41

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATAGCATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCCATTAGTAGTAGTAGTAGTTACATATACTACGCAGACTCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGGAGCTGCTCGCTTTGACTACTGGGGCCAAGGAACCATGGTCACCGTCTCATCA；

SEQ ID NO：42

EVQLLESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGAARFDYWGQGTMVTVSS；

SEQ ID NO：43

GACATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCGTCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCAGGGTATTAGCAGCTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACTATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTACTATTGTCAACAGGGTAACAGTTTCCCTCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA；

SEQ ID NO：44

DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGNSFPLTFGGGTKVEIK；

SEQ ID NO：45

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTACAGCCGGGGGAATCCCTGAGACTCTCTTGTGAAGCCTCTGGACTCACCTTTAGCAGCTATCCCATGGCCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGTTGGAGTGGGTCTCAGTTATTTATAGCGACGGTAGTAAGAAATTCTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGACACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGGGATTAGCAGCTCGGGCTTTGACTACTGGGGC CAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCATCA；

SEQ ID NO：46

EVQLLESGGGLVQPGESLRLSCEASGLTFSSYPMAWVRQAPGKGLEWVSVIYSDGSKKFYADSVKGRFTISRHNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGISSSGFDYWGQGTLVTVSS。

以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳市乐土生物医药有限公司

<120> 一种多肽及其抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体

<130> 21I32749

<160> 46

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 445

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro

115 120 125

Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val

130 135 140

Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala

145 150 155 160

Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly

165 170 175

Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly

180 185 190

Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys

195 200 205

Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys

210 215 220

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

225 230 235 240

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

245 250 255

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys

260 265 270

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

275 280 285

Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

290 295 300

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

305 310 315 320

Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

325 330 335

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

340 345 350

Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

355 360 365

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

370 375 380

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

385 390 395 400

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

405 410 415

Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

420 425 430

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 2

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser

20 25 30

Asn Arg Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn

85 90 95

Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 3

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aacatccagt tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagaatcacc 60

atcacttgcc gggccagtca gagtattagt aggtggttgg cctggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ccaaagtctt gatctataag gcgtctaatt tagaaaatgg ggtcccatca 180

aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240

gatgactctg caacttatta ctgccaacag catagttatt cctctccgtg gaggttcggc 300

caagggacca aggtggaaat caaa 324

<210> 4

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Asn Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Ile Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Arg Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile

35 40 45

Tyr Lys Ala Ser Asn Leu Glu Asn Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Asp Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Ser Tyr Ser Ser Pro

85 90 95

Trp Arg Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 5

<211> 357

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctatgcta tgcactgggt ccgccaggct 120

ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatcatatg atggaagtaa taaatactac 180

gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctgtgt attactgtgc gagacagtat 300

agcagcagtt cgcccttcga ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcatca 357

<210> 6

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Tyr Ser Ser Ser Ser Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 7

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

aacatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180

aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240

gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta cccctcgggt cactttcggc 300

ggagggacca aggtggagat caaa 324

<210> 8

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Asn Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Arg

85 90 95

Val Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 9

<211> 348

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagggggg 300

ggtaaggttg actactgggg ccagggaacc ctggtcaccg tctcatca 348

<210> 10

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 10

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Gly Gly Gly Lys Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 11

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gacatccagt tgacccagtc tccttccacc ctgtctgctt ctataggcga cagagtcacc 60

atcacttgtc gggccagtca gagggttagt agccggttgg cctggtatca gcagaaacca 120

ggcaaagccc ctaaactcct catctataag acatcgaatt tagaagctga ggtcccctcc 180

agattcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240

gatgattttg caacctacta ctgccaacag tatcatagtt acccgctcac tttcggcgga 300

gggaccaagg tggagatcaa a 321

<210> 12

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 12

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Ile Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Arg Val Ser Ser Arg

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Lys Thr Ser Asn Leu Glu Ala Glu Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Ser Tyr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 13

<211> 348

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtcaagc ctggagggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt catcttcagt gactcctaca tgacctggct ccgccaggct 120

ccagggaagg gactggagtg ggtctcatac attagtggaa gtgctagtga tataaagtac 180

gcagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagggaca acgccaagaa ttcactgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agtcgaggac acggccgtgt attattgtgc gagagatccc 300

cgattagcgg gcatctgggg ccaggggaca acggtcaccg tctcatca 348

<210> 14

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 14

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Asp Ser

20 25 30

Tyr Met Thr Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Tyr Ile Ser Gly Ser Ala Ser Asp Ile Lys Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Pro Arg Leu Ala Gly Ile Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 15

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gacatccaga tgacccagtc tccatcttct gtgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacctgtc gggcgagtca ggacattggc aaatatttaa attggtatca acagaaagca 120

ggaaaagccc ctaacctcct gatctacgat gcatccaatt tgaaaacagg ggtctcatca 180

aggttcagtg gaagtggttc tgggacagaa tttacattca ccatcagcag cctgcagcct 240

gaggatattg caacatattt ctgtcaacag tttgatgatt tcccatacac tttcggccct 300

gggaccaagg tgggaatcag a 321

<210> 16

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 16

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ala Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Lys Thr Gly Val Ser Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Phe Asp Asp Phe Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Gly Ile Arg

100 105

<210> 17

<211> 354

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ctggtcaagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctatagca tgaactgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcatcc attagtagta gtagtagtta catatactac 180

gcagactcag tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagagact 300

acggacgggg gtatggacgt ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc atca 354

<210> 18

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 18

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Thr Thr Asp Gly Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 19

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

gacatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtgggaga cagagtcacc 60

atcacttgtc aggcgagtca gggcattagc aattatgtga attggtatca gcagaaacct 120

ggaaaagccc ctgaactcct gatctccgat gcatacaatt tggaagctgg ggtcccatca 180

accttcagtg gaagtggatc tgggacacaa tttactttca ccatcagcag cctgcaacct 240

gagcatattg gaacatatta ctgtcaacaa tttgagacta tcccgtggac tttcggccaa 300

gggaccaaga tagaagtcaa g 321

<210> 20

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 20

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Val Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Glu Leu Leu Ile

35 40 45

Ser Asp Ala Tyr Asn Leu Glu Ala Gly Val Pro Ser Thr Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu His Ile Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Glu Thr Ile Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Ile Glu Val Lys

100 105

<210> 21

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

caggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc cgggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt tacctttagc agttatgcca tgaactgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaact attagtggta gtggtggtag cacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgttt attactgtgc gaggggaagt 300

tggggtgctt ttgatatctg gggccaggga accccggtca ccgtctcatc a 351

<210> 22

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 22

Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Thr Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Ser Trp Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Pro

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 23

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

aacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtgggaga cagagtcacc 60

atcagttgcc aggcaagtca ggatattagc aactatgtca attggtatca acagagacca 120

ggcaaagccc ctaagctcct catgtacgat gcatcaaatt tggaagtcgg ggtcccagtg 180

aggttccgtg gaagtggctc tgggacagag ttcaccttca ccatcctcag cctgcagcct 240

gaagatcttg gaacatatta ctgtcaacaa tatgattctc tcccgttcac ttttggccag 300

gggaccaagc tggatctcaa a 321

<210> 24

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 24

Asn Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Val Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Met

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Val Gly Val Pro Val Arg Phe Arg Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Phe Thr Ile Leu Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Leu Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Ser Leu Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Asp Leu Lys

100 105

<210> 25

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagtagtt 300

tggggagctt ttgatatctg gggccaagga accacggtca ccgtctcatc a 351

<210> 26

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 26

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Val Val Trp Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 27

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

gacatccagt tgacccagtc tccatcttcc gtgtctgcat ctgtggggga cagagtcgtc 60

atcacctgtc gggcgagtca gagtcttggc aactggttag cctggtatca gcaaaaacca 120

gggaaagccc ctaatctcct aatctatggt gcatccactt tgcagactgg ggtcccttca 180

aggttcagcg gctttcactc cgggggagaa tacactctca gcatctccaa cctgcagcct 240

gaagatgctg caacttacta ttgtcaacag gctagtagca tcccgctcac tttcggcggg 300

gggaccaagg tggagatcaa g 321

<210> 28

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 28

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Val Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Leu Gly Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Thr Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Phe His Ser Gly Gly Glu Tyr Thr Leu Ser Ile Ser Asn Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Ser Ser Ile Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 29

<211> 357

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc ctttataaag 300

aggggtgttc ttgcttttga tatctggggc caggggaccc cggtcaccgt ctcatca 357

<210> 30

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 30

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Phe Ile Lys Arg Gly Val Leu Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Pro Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 31

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

gacatccagt tgacccagtc tccatcgtcc ctggccgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc aactatttaa attggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180

aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240

gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta cccctcggac gttcggccaa 300

gggaccaagg tggagatcaa a 321

<210> 32

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 32

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 33

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

gaggtgcagc tgttggagtc tggaggaggg tggattcagc ctggggagtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggctt cgacatcaat aacaaatata tgagttgggt ccgccaaagt 120

ccagaaaagg ggctggagtg ggtctcatcc attagtagta gtagtagtta catatactac 180

gcagactcag tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagcccca 300

atagtgggag ctaggcagcg tgcttttgat atctggggcc agggaaccat ggtcaccgtc 360

tcatca 366

<210> 34

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 34

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Trp Ile Gln Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Ile Asn Asn Lys

20 25 30

Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ala Pro Ile Val Gly Ala Arg Gln Arg Ala Phe Asp Ile Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 35

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

gacatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180

aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240

gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta cccctcgtac gttcggccaa 300

gggaccaagg tggaaatcaa a 321

<210> 36

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 36

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 37

<211> 381

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc gtggtccatc ctgggaggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctatgcta tgcactgggt ccgccaggct 120

ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatcatatg atggaagtaa taaatactac 180

gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagatgtc 300

accttggggg ttcggggagt ccctcattac tactacggta tggacgtctg gggccagggg 360

acaccggtca ccgtctcatc a 381

<210> 38

<211> 127

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 38

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Val Val His Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Val Thr Leu Gly Val Arg Gly Val Pro His Tyr Tyr Tyr

100 105 110

Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 39

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

aacatccagt tgacccagtc tccatcgtcc gtgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacg 60

atcacttgtc gggcgagtca gggtatttgg aggtggttag cctggtatca acacaaacca 120

gggaaagccc ctaagctcct gatctctgct gcatccaatt tgcaaagtgg ggtcccatca 180

aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagtag cctgcagcct 240

gaagatgttg caacttatta ttgtcaacag gctaacagtt tcccttcgct cactttcggc 300

ggagggacca aggtggacat caga 324

<210> 40

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 40

Asn Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Trp Arg Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Ser Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Ser

85 90 95

Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Asp Ile Arg

100 105

<210> 41

<211> 348

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 41

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ctggtcaagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctatagca tgaactgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcatcc attagtagta gtagtagtta catatactac 180

gcagactcag tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagaggagct 300

gctcgctttg actactgggg ccaaggaacc atggtcaccg tctcatca 348

<210> 42

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 42

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Ala Ala Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 43

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 43

gacatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcgt ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agctggttag cctggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180

aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ctatcagcag cctgcagcct 240

gaagattttg caacttacta ttgtcaacag ggtaacagtt tccctctcac tttcggcgga 300

gggaccaagg tggagatcaa a 321

<210> 44

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 44

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Ser Phe Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 45

<211> 354

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 45

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ctggtacagc cgggggaatc cctgagactc 60

tcttgtgaag cctctggact cacctttagc agctatccca tggcctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggttggagtg ggtctcagtt atttatagcg acggtagtaa gaaattctat 180

gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagacaca attccaagaa cacgctgtat 240

cttcaaatga acagcctgag agctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagggatt 300

agcagctcgg gctttgacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc atca 354

<210> 46

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 46

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Pro Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Val Ile Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Lys Phe Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg His Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Ile Ser Ser Ser Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

Claims

1.一种抗体，其特征在于，所述抗体为特异性靶向磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的抗体，所述抗体包含轻链、重链，所述抗体的轻链包含如SEQ ID NO：8所示氨基酸序列，所述抗体的重链包含如SEQ ID NO：10所示氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体包含IgG抗体。

3.如权利要求2所述的抗体，其特征在于，所述IgG抗体包含IgG1、IgG2、IgG4中的至少一种。

4.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体包含人源抗体。

5.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体的轻链的可变区的C端键联至所述抗体的轻链的恒定区的N端。

6.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体的重链的可变区的C端键联至所述抗体的重链的CH1区的N端。

7.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体包含全人源单克隆抗体。

8.分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸包含可编码如权利要求1~7任意一项所述抗体的核苷酸。

9.一种构建体，其特征在于，所述构建体含有如权利要求8所述多核苷酸。

10.一种表达系统，其特征在于，所述表达系统含有如权利要求9所述构建体或基因组中整合有外源的如权利要求8所述多核苷酸。

11.一种组合物，其特征在于，所述组合物包含如权利要求1~7任意一项所述抗体，或如权利要求8所述多核苷酸，以及药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂、佐剂中的至少一种。

12.一种试剂盒，其包括如权利要求11所述组合物。

13.如权利要求1~7任意一项所述抗体，或如权利要求8所述多核苷酸，或如权利要求9所述构建体，或如权利要求10所述表达系统，或如权利要求11所述组合物在制备治疗癌症的药物中的用途；

所述癌症为肝细胞癌、肺鳞癌、小细胞肺癌、食管鳞状细胞癌中的至少一种。