CN105037540A - 抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3全人源抗体 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从人源大容量噬菌体抗体库中筛选到的与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3高亲和性结合的全人源抗体，包括抗体的筛选方法、抗体编码序列及相应的氨基酸残基序列，特别是分别位于重链和轻链的3个CDR区序列、抗原的结合特性以及全抗体的构建方法。该抗体为一种全人源抗体，用于人体治疗，具有免疫原性低、毒副作用小的特性，具有用于肝癌和黑色素瘤治疗的潜在价值。

Description

抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3全人源抗体

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及了一株高亲和性结合磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican-3，GPC3)的全人源抗体的筛选、制备方法及其潜在的用于肝癌和黑色素瘤治疗中的应用。

背景技术

肝癌是危害很广泛的一种恶性肿瘤，在世界范围内肝癌位居全部恶性肿瘤发病男性第5位、女性第7位，为恶性肿瘤死亡男性第2位，女性第6位。在发展中国家，其居男性恶性肿瘤发病第3位，女性第6位，居男性恶性肿瘤死亡第2位，居女性第5位。我国的乙型肝炎病人位居世界第一，这也直接导致我国肝癌病人高居全球榜首。调查显示，1973-1975年、1990-1992年及2004-2005年我国肝癌死亡分别位居全部恶性肿瘤死因顺位的第3、2、和2位(张思维等：中国肝癌发病的趋势分析和预测.《中华预防医学杂志》，2012，46(7)：588-592)。未来很长一段时间肝癌仍将是危害国内各大群众主要恶性肿瘤。阿霉素是传统的用于肝癌治疗的药物，但缓解率仅为10-15％且不能延长患者的生存时间。近年来，随着分子生物学、基因组学及蛋白质组学的进展，陆续问世了一系列的分子靶向药物可以用于肝癌的救治。分子靶向治疗是以肿瘤细胞过度表达的某些标志性分子为靶点，选择针对性的阻断剂，可有效地干预该标志性分子调控和密切相关的信号传导通路，从而达到抑制肿瘤生长、进展及转移的效果。相对于手术、放疗、化疗三大传统治疗手段，其具有较好的分子选择性，能高效并选择性地杀伤肿瘤细胞，减少对正常组织的损伤。分子靶向药物的选择性高，广谱有效，不易发生耐药，同时安全性优于细胞毒性化疗药物，是目前肿瘤治疗领域发展的新方向。目前，针对肝癌靶向治疗的主要研究有：以表皮生长因子受体(EGFR)为靶点的肝癌治疗研究，目前主要包括大分子的单克隆抗体(如西妥昔单抗、尼妥珠单抗)和小分子的化合物如吉非替尼、厄罗替尼等药物；以抗血管生成为靶点的肝癌治疗研究，VEGF单克隆抗体Becacizumab；多激酶抑制剂索拉非尼对原发性肝癌的治疗研究；以肝细胞生长因子及其受体为靶点的肝癌治疗研究等。

磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican-3，GPC3)是一种膜性硫酸乙酰肝素糖蛋白。glypican-3蛋白通过硫酸乙酰肝素葡萄糖胺聚糖链连接于核心蛋白，核心蛋白羧基末端通过GPI锚定于细胞膜表面。glypican-3与肝癌、黑素瘤及卵巢透明细胞癌的发生和发展密切相关。GPC3表达具有较高的特异性，在肝癌中高表达，在黑素瘤、卵巢透明细胞癌、卵黄囊瘤、成神经细胞瘤、肝母细胞瘤和Wilm肉瘤细胞等肿瘤中少量表达，而在乳腺癌、间皮瘤、卵巢上皮癌和肺癌中则不表达表达，在正常人组织中几乎不表达，因此其有望成为肝癌免疫治疗的理想靶点之一(阮健等.磷脂酰肌醇蛋白聚糖3在恶性肿瘤中的表达及其临床应用.肿瘤，2011，31(9)：863-866)。目前，共有4个glypican-3抗体进入不同的研究阶段。GC33(IshiguroT，etal.Anti-glypican3antibodyasapotentialantitumoragentforhumanlivercancer.CancerRes.2008；68(23)：9832-9838.NakanoK，etal.Generationofahumanizedanti-glypican3antibodybyCDRgraftingandstabilityoptimization.AnticancerDrugs.2010；21(10)：907-916)为第一个进入临床研究的人源化抗体。GC33为对鼠源性母本抗体进行人源化改造后得到的抗体，GC33识别glypican-3的羧基端(542-563)的多肽表位，主要通过抗体依赖的细胞毒作用(ADCC)以及募集肿瘤肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)发挥抗肿瘤作用。目前完成与索拉非尼(sorafenib)联合用药的I期临床研究(NCT00976170)，II期临床研究患者正在招募中(NCT01507168)。YP7为高亲和力人源化抗体(PhungY，GaoW，ManYG，NagataS，HoM.High-affinitymonoclonalantibodiestocellsurfacetumorantigenglypican-3generatedthroughacombinationofpeptideimmunizationandflowcytometryscreening.MAbs.2012Sep-Oct；4(5)：592-9)，YP7与glypican-3的亲和力的KD为0.3nM，识别glypican-3的羧基端(510-560)的多肽表位。具有较强的肿瘤抑制活性。HN3为人源单域抗体(FengM，etal.Therapeuticallytargetingglypican-3viaaconformation-specificsingle-domainantibodyinhepatocellularcarcinoma.ProcNatlAcadSciUSA.2013；110(12)：E1083-1091.)。该抗体可直接抑制HCC细胞的增殖。该抗体是通过噬菌体抗体库技术筛选得到。HN3高亲和性结合glypican-3的核心蛋白部位。在体内、体外均对glypican-3阳性肝癌细胞有很好的抑制作用。HN3的独特性在于它可直接抑制肿瘤细胞的增殖，参与YAP信号通路，使细胞周期阻滞。MDX-1414为全人源抗体(FengM，HoM.Glypican-3antibodies：anewtherapeutictargetforlivercancer.FEBSLett.2014Jan21；588(2)：377-82.)。MDX-1414由Medarex公司从多株全人源抗体中筛选得到，具有亲和力高，特异性强，有内在化特性，体内外研究显示有较好的抑制肿瘤细胞生长的作用，且无明显的毒副作用。目前还处于临床前研究阶段。

检索国内专利数据库与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican-3)治疗抗体相关专利共12件，为中外制药株式会社(申请号：038210576、2012101528190、2012101548137授权公告号：CN102046200B、授权公告号：CN102850455B、授权公告号：CN101287492B、授权公告号：CN101809162B、授权公告号：CN101186650B、授权公告号：CN101014367B、授权公告号：CN1842540B、授权公告号：CN1314803C)，其中授权公告号：CN102850455B与赞科股份有限公司共有；米德列斯公司(授权公告号：CN101815726B)等3家国外公司所有，尚未见国内由关单位和个人的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的专利申报。在glypican-3抗体研究方面有王玉亮等所做的一个glypican-3鼠源性单克隆的报道(王玉亮，刘涛，穆红.癌胚抗原磷脂酰肌醇蛋白聚糖3单克隆抗体的制备及应用。天津医药，2014，42(3)：235-238.)。本发明所公布的是一株高亲和性结合磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican-3，GPC3)的全人源抗体的筛选、制备方法及其潜在的用于肝癌和黑色素瘤治疗中的应用。

发明内容：

本发明首先人工合成了一段位于磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican-3)C末端40个氨基酸的(524A-563K)多肽。利用该多肽经多轮筛选，从已构建的人源大容量Fab噬菌体抗体库中筛选到的与该多肽结合的Fab抗体。经ELISA和分子相互作用仪Biacore3000检测，在大肠杆菌表达的Fab抗体与该glypican-3多肽有较好的结合活性，Biacore3000检测二者亲和常数为6.54×10^-8M。在此基础上，利用分子生物学的方法构建完整的抗体，并在真核细胞中实现表达，所表达的抗体经纯化后证实与肝癌细胞株膜表面的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3具有很好的结合活性。构建的全抗体为一种全人源抗体，用于人体治疗具有免疫原性低、毒副作用小的特性，具有用于肝癌和黑色素瘤治疗的潜在价值。

本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种可与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3结合的全人源单克隆抗体，由可变区和恒定区构成，可变区包含CDR和框架区，所述抗体的重链CDR区氨基酸序列为：

CDR1：GESISSGYY；

CDR2：MWHNGTT；

CDR3：ATRGMFSPLPW；

所述抗体的轻链CDR区氨基酸序列为：

CDR1：HDIRNY；

CDR2：AESTLQN；

CDR3：QQLNSYPLT。

本发明同时提供了所述抗体的重链DNA序列为：

CDR1：GGTGAATCCATCAGTAGTGGCTACTAC；

CDR2：ATGTGGCACAATGGGACCACC；

CDR3：ACTAGAGGGATGTTTAGTCCACTGCCCTGG；

所述抗体的轻链DNA序列为：

CDR1：CACGACATTAGGAATTAT；

CDR2：GCTGAATCCACTTTACAGAAT；

CDR3：CAACAGCTTAATAGTTACCCTCTCACTTTC。

本发明所述抗体的全抗体重链类别可为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的任意一种，优选IgG1，所述IgG1的序列为：

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGESISSGYYWGWIRQPPGRGLEWIGTMWHNGTTYSSPSLTGRVTISVDRSRNRFSLKLTSVTAADTAMYYCATRGMFSPLPWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

本发明所述抗体的全抗体轻链类别可为κ和λ，优选为κ，其序列为：

ELVMTQSPSFLSASVGDRVTITCRASHDIRNYLGWYQQKPGKAPNPLISAESTLQNGVPSRFSGTGSGTEFTLTISSLQPEDFATYHCQQLNSYPLTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC。

本发明所述抗体的表达细胞可为CHO、HEK293、NSO和Per6哺乳动物细胞的任意一种，优选为CHO细胞。

本发明同时提供了所述的单克隆抗体用于制备治疗具有潜在的肝癌和黑色素瘤疾病的药物中的用途。

附图说明：

图1：ELISA方法检测glypican-3多肽与Fab抗体结合；

图2：Biacore3000检测Fab抗体和glypican-3多肽的亲和力；

图3：BY20SDS-PAGE电泳；1，BY20非还原电泳；2，蛋白分子量标准；3，BY20非还原电泳。

图4：免疫荧光检测BY20抗体与肝癌细胞HepG2的结合

具体实施方式：

本发明参考下述实施例进行更详细的描述。然而，本发明不局限于这些实施例。

实施例1、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican-3)C末端多肽的合成

通过分析磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican-3)C末端结构特征的基础上，委托上海淘普生物科技有限公司人工合成40个氨基酸肽“AELAYDLDVDDAPGNSQQATPKDNEISTFHNLGNVHSPLK”(524A-563K)5mg纯度大于95％，用于全人源化抗体的筛选。

实施例2、全人源大容量噬菌体抗体库筛选抗glypican-3抗体

抗体筛选所用的大容量噬菌抗体库库容达4×10⁸的Fab抗体库。首先噬菌体抗体库扩增，多肽按10ug/孔包被做富集，经6轮淘洗，富集后的噬菌体感染细菌，挑单克隆1000左右。小量诱导后上清ELISA检测，挑取阳性克隆，大概获得100个阳性克隆，将用这些阳性克隆的重、轻链重新扩增后建立多肽阳性噬菌体抗体库，用多肽重新富集2轮，富集后的噬菌体感染细菌，涂板，挑单克隆200左右，小量诱导后上清进行ELISA检测。挑取阳性克隆测序，重链轻链分别测序，100个左右阳性克隆，分析序列后挑选出一对出现频率最高的重连(序列1)和轻链(序列2)。将这对重链和轻链扩增后重新配对成Fab抗体，小量诱导后上清进行ELISA验证，结果如图1所示。

编码重链DNA序列(序列1)

CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGGCTCGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGAATCCATCAGTAGTGGCTACTACTGGGGCTGGATCCGGCAGCCCCCAGGGAGGGGGCTGGAGTGGATTGGGACTATGTGGCACAATGGGACCACCTACAGCAGTCCGTCCCTCACGGGTCGAGTCACCATTTCAGTAGACAGGTCCAGGAACCGGTTCTCCCTGAAGCTGACCTCTGTGACCGCCGCAGACACGGCCATGTATTACTGTGCGACTAGAGGGATGT TTAGTCCACTGCCCTGGGGCCCGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGATCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCTGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTAGT

编码链氨基酸序列(序列2)

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGESISSGYYWGWIRQPPGRGLEWIGTMWHNGTTYSSPSLTGRVTISVDRSRNRFSLKLTSVTAADTAMYYCATRGMFSPLPWGPGTLVTVSSASTKGPSIFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFLAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTS

重链V区胚系特征：Homosapiens(人类)，IGHV4-38-2*02，J区胚系：Homosapiens(人类)IGHJ5*02。

重链CDR区，CDR1：GGTGAATCCATCAGTAGTGGCTACTAC；CDR2：ATGTGGCACAATGGGACCACCCDR3：ACTAGAGGGATGTTTAGTCCACTGCCCTGG

所编码对应氨基酸CDR1：GESISSGYY；CDR2：MWHNGTT；CDR3：ATRGMFSPLPW

编码轻链DNA序列(序列3)

GAGCTCGTGATGACACAGTCTCCATCCTTCCTGTCTGCGTCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCCAGTCACGACATTAGGAATTATTTAGGCTGGTATCAGCAAAAACCAGGGAAAGCCCCTAACCCCCTGATCTCTGCTGAATCCACTTTACAGAATGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCACTGGATCTGGGACAGAGTTCACTCTCACAATTAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATCACTGTCAACAGCTTAATAGTTACCCTCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCGCAGAGCAGGACAGCAGGGACAGCACCTACAGCCACAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCGGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTTGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT

轻链氨基酸序列(序列4)

ELVMTQSPSFLSASVGDRVTITCRASHDIRNYLGWYQQKPGKAPNPLISAESTLQNGVPSRFSGTGSGTEFTLTISSLQPEDFATYHCQQLNSYPLTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVAEQDSRDSTYSHSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSLPVTKSFNRGEC

轻链V区胚系特征：人类(Homosapiens)IGKV1-9*01，J区胚系：HomosapiensIGKJ4*01。

轻链CDR：CDR1：CACGACATTAGGAATTAT，CDR2：GCTGAATCCACTTTACAGAAT，CDR3：CAACAGCTTAATAGTTACCCTCTCACTTTC

所编码对应氨基酸CDR1：HDIRNY，CDR2：AESTLQN，CDR3：QQLNSYPLT

实施例3、Biacore3000检测Fab抗体和合成肽的亲和力

1、固定：将合成多肽稀释至70μg/ml浓度。采用氨基偶联的方法经由伯胺共价固定在羧甲基葡聚糖包被的CM5芯片(通用电气产品)，固定缓冲液10mM醋酸钠(ph5.0)，固定量：180RU。

2、动力学分析：

PBST(PBS，0.005％吐温20)为Runningbuffer；使用KineticAnalysisWizard模式；Fab稀释为的37.5，75，150，300，600，1200nM浓度梯度；进样时间：1min，解离时间：2min，流速：40ul/min

3、再生条件：

再生液：8mMNaOH，进样时间：30s，流速：40ul/min，buffer：40siniection

4、结果分析：

拟和软件：BIAevaluation4.1software，拟和模型：1：1bindingmodel。ka(1/Ms)＝1.03×10⁵，kd(1/s)＝6.73×10^-3，KD(M)＝6.54×10^-8，抗glypican-3Fab与其亲和常数为6.54×10-8^M，如图2所示。

实施例4、全抗体基因的合成和表达载体的构建

1.依据抗glypican-3的Fab编码特征，序列委托上海捷瑞生物工程有限公司合成完整轻链(L链)编码基因，并对编码基因进行优化，优化为适于CHO细胞表达的编码基因，并在编码基因前加入Kozak序列“GGCCACC”。通过XhoI-EcoRI双酶切连接至p327.7表达载体(专利申请号：201410441296.0)，命名为BY20L。

CTCGAGGCCACCGAGACAGACACTCTGCTGCTGTGGGTCCTGCTGCTGTGGGTGCCTGGAAGCACCGGGGAGCTAGTGATGACACAGTCCCCTTCTTTCCTGTCTGCCAGCGTGGGCGACCGGGTGACAATCACATGCAGAGCTTCTCACGACATCCGGAACTACCTGGGCTGGTATCAGCAGAAGCCAGGCAAGGCTCCTAACCCACTCATCAGCGCTGAGTCTACACTACAAAACGGCGTGCCATCTAGGTTCTCTGGCACAGGCTCTGGCACCGAGTTCACCCTCACAATCTCTAGCCTCCAGCCCGAGGACTTCGCTACATACCACTGCCAGCAGCTGAACTCTTACCCACTGACATTTGGCGGAGGAACAAAGCTGGAGATCAAGAGGACCGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCTCCCAGCGACGAGCAGCTGAAGTCTGGCACCGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGCGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACTCCAAGGACAGCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAGGTGACCCACCAGGGACTGTCTAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCGAATTC

其中和分别为起始和终止密码子，“GCCACC”为Kozak序列，“CTCGA”和“GAATTC”分别为XhoI-EcoRI。编码相应的氨基酸为：

METDTLLLWVLLLWVPGSTGELVMTQSPSFLSASVGDRVTITCRASHDIRNYLGWYQQKPGKAPNPLISAESTLQNGVPSRFSGTGSGTEFTLTISSLQPEDFATYHCQQLNSYPLTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

2.同样依据Fab编码序列合成重链(H链)编码基因，通过XbaI-SaII双酶切连接至已克隆BY20L的p327.7表达载体。

TCTAGAGCCACCGAGACAGACACTCTGCTGCTGTGGGTCCTGCTGCTGTGGGTGCCTGGAAGCACCGGGCAGGTGCAGCTCCAGGAAAGCGGCCCTGGCCTCGTGAAGCCATCCGAGACCCTGTCTCTGACATGCACAGTGAGCGGCGAGTCTATCAGCTCCGGCTACTACTGGGGCTGGATCAGACAGCCACCTGGCAGAGGCTTGGAGTGGATCGGCACAATGTGGCACAACGGCACAACATACTCTTCCCCTAGCCTGACAGGCCGGGTGACCATCTCTGTGGACAGATCCCGAAACCGGTTCAGCCTCAAGCTCACCAGCGTGACCGCCGCCGACACCGCTATGTACTACTGCGCTACAAGAGGCATGTTCTCCCCACTGCCTTGGGGCCCAGGCACTCTGGTCACCGTGAGCTCCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTCTTCCCACTGGCTCCTTCCTCTAAAAGCACTAGCGGAGGGACCGCAGCCCTGGGCTGTCTGGTGAAAGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTCTCCTGGAACTCTGGAGCCCTGACCTCCGGGGTGCACACCTTTCCCGCCGTGCTGCAGTCTTCTGGACTGTACTCCCTGTCCTCCGTCGTGACTGTGCCCAGCTCCTCCCTGGGAACTCAGACATACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCTTCCAACACAAAGGTGGACAAGAAAGTCGAGCCCAAGAGCTGTGATAAGACCCATACATGTCCCCCATGCCCCGCTCCAGAACTGCTGGGCGGACCTTCCGTGTTTCTGTTCCCACCCAAACCAAAGGACACACTGATGATCAGCAGAACCCCTGAGGTGACTTGCGTGGTCGTGGACGTGAGCCATGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTATGTGGATGGCGTGGAAGTGCATAATGCCAAGACAAAACCTAGGGAAGAGCAGTACAACAGCACCTACAGGGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGCAAGGTGTCCAATAAGGCTCTGCCTGCACCTATCGAGAAGACCATCAGCAAAGCCAAGGGCCAACCCAGAGAGCCTCAAGTCTACACCCTGCCCCCAAGCAGGGATGAGCTGACCAAAAATCAAGTGAGCCTGACATGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCTAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACTCCCCCCGTCCTGGATAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACTCCAAACTGACAGTCGATAAAAGCAGGTGGCAGCAAGGCAATGTCTTTAGCTGTAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCATAACCACTACACTCAAAAGTCCCTGTCCCTGAGCCCCGGAAAAGTCGAC

其中和分别为起始和终止密码子，“GCCACC”为Kozak序列，“CTCGA”和“GAATTC”分别为XhoI-EcoRI。编码相应的氨基酸为：

METDTLLLWVLLLWVPGSTGQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGESISSGYYWGWIRQPPGRGLEWIGTMWHNGTTYSSPSLTGRVTISVDRSRNRFSLKLTSVTAADTAMYYCATRGMFSPLPWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

实施例5、全抗体稳定细胞的筛选

CHO细胞在10％FBS，含4mM谷氨酰胺的CDOptiCHO(Invitrogen产品)中适应并贴壁生长；胰酶消化后调节细胞浓度，接种至75cm²培养瓶，细胞数大约为5×10⁶/瓶；24小时后，按Lipofectin2000(Invitrogen产品)操作说明转染；转染24小时后，胰酶消化并收集转染细胞；调节细胞浓度，接种至96孔培养板，0.8×10⁴/孔，筛选培养基成分10％D-FBS，CDOptiCHO，含25μML-蛋氨酸砜亚胺(L-Methioninesulfoximine，MSX，Sigma产品)；5-7天后补加新鲜培养基50μl/孔；15天左右有克隆长出，取50μl样品双抗体夹心法ELISA方法半定量检测培养液中蛋白含量，初步筛选出蛋白表达量相对较高克隆；蛋白表达量相对较高克隆转入24孔板中悬浮培养，培养基换为不含D-FBS的CDOptiCHO培养基；数天后，同样采用ELISA方法检测24孔板中的相对蛋白表达量；进一步经6孔板、75cm²培养瓶和250ml摇瓶悬浮培养；结合ELISA半定量结果和细胞生长状态，筛选表达量较高细胞。

实施例6、全抗体BY20的表达和纯化

将高表达抗体细胞置无血清的CDOptiCHO中培养，一定时间后收集培养上清。用pH7.4的PBS溶液平衡HiTrapMabSelectSuRe1ml柱(GEHealthcareLifeSciences产品，Cat.No：11-0034-93)10个床体积，流速为0.5ml/min；培养上清液用0.45μm滤膜过滤上样，流速为0.5ml/min。用pH7.4的PBS溶液再洗5-10个床体积，流速为0.5ml/min；用100mM柠檬酸缓冲液(pH3.6)洗脱，流速为0.5ml/min，收集洗脱峰。纯化产物非还原电泳和还原SDS-PAGE电泳检测分子量。

纯化BY20全抗体非还原和还原SDS-PAGE电泳见图，非还原电泳抗体表观分子量大于175kDa；还原SDS-PAGE电泳重链约50kDa，轻链约25kDa。全抗体理论分子量约144.3kDa，重链理论预期分子量大约48.8kDa，轻链大小约23.4kDa，实测值均与理论预期基本一致，结果如图3所示。

实施例7、免疫荧光检测BY20抗体与肝癌细胞HepG2的结合

取在10％FBS，DMEM培养中的HepG2肝癌细胞1mL左右(1×10⁶/mL)，1000rpm离心3min，弃上清；1％多聚醛700μL，室温温浴10mins。用冷PBS1mL洗涤3次。加入1mLPBS重悬细胞，按50μg/mL加入BY20抗体，室温，摇床150rpm孵育60mins。用冷PBS1mL洗涤3次；加入FITC标记的羊抗人二抗(用1％BSA按1∶200稀释，Abcam产品)，避光，室温摇床200rpm孵育30mins；用冷PBS1mL洗涤3次；1％多聚甲醛固定剩余细胞；荧光显微镜下观察结果，如图4所示。

Claims (9)

1.一种可与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3结合的全人源单克隆抗体，由可变区和恒定区构成，可变区包含CDR和框架区，其特征在于，所述抗体的重链CDR区氨基酸序列为：

CDR1：GESISSGYY；

CDR2：MWHNGTT；

CDR3：ATRGMFSPLPW；

所述抗体的轻链CDR区氨基酸序列为：

CDR1：HDIRNY；

CDR2：AESTLQN；

CDR3：QQLNSYPLT。

2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述抗体的重链DNA序列为：

CDR1：GGTGAATCCATCAGTAGTGGCTACTAC；

CDR2：ATGTGGCACAATGGGACCACC；

CDR3：ACTAGAGGGATGTTTAGTCCACTGCCCTGG；

所述抗体的轻链DNA序列为：

CDR1：CACGACATTAGGAATTAT；

CDR2：GCTGAATCCACTTTACAGAAT；

CDR3：CAACAGCTTAATAGTTACCCTCTCACTTTC。

3.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，该抗体的全抗体重链类别可为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的任意一种。

4.根据权利要求3所述的单克隆抗体，其特征在于，该抗体的全抗体重链类别为IgG1，所述IgG1的序列为：

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGESISSGYYWGWIRQPPGRGLEWIGTMWHNGTTYSSPSLTGRVTISVDRSRNRFSLKLTSVTAADTAMYYCATRGMFSPLPWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。

5.根据权利要求3所述的单克隆抗体，其特征在于，该抗体的全抗体轻链类别可为К和λ。

6.根据权利要求5所述的单克隆抗体，其特征在于，该抗体的全抗体轻链类别为К，其序列为：

ELVMTQSPSFLSASVGDRVTITCRASHDIRNYLGWYQQKPGKAPNPLISAESTLQNGVPSRFSGTGSGTEFTLTISSLQPEDFATYHCQQLNSYPLTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC。

7.根据权利要求1-6任一所述的单克隆抗体，其特征在于，所述抗体的表达细胞可为CHO、HEK293、NSO和Per6哺乳动物细胞的任意一种。

8.根据权利要求7所述的单克隆抗体，其特征在于，所述抗体的表达细胞为CHO细胞。

9.根据权利要求1-6任一所述的单克隆抗体用于制备治疗具有潜在的肝癌和黑色素瘤疾病的药物中的用途。