JP7440122B2 - Ｃｌｄｎ１８．２抗体及びその用途 - Google Patents

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Description

本願は、２０１９年０７月１２日に出願された、出願番号がＣＮ ２０１９１０６２８０１８．９であり、発明名称が“ＣＬＤＮ１８．２抗体及びその用途”である中国特許に基づき優先権を主張し、その内容を本願に援用する。
本願発明は、免疫治療分野に関する。具体的に、本願発明は、ＣＬＤＮ１８．２に結合する抗体及びその脱フコシル化形態、及びこれらの疾患の治療、特に癌の治療における応用に関する。
胃癌や食道癌を含む上部消化管腫瘍は、世界的によく見られ、予後が比較的悪い悪性腫瘍である。胃癌は中国では特に好発しており、世界中約４２％の胃癌新発症例が中国で報告されている。早期診断が欠けているため、約８０％胃癌患者は、発見時にすでに末期である。胃癌が一般的な化学療法薬物に対する感受性が低いので、末期胃癌の五年生存率極めて低く、現に中国の３番目に大きな致死性悪性腫瘍になっている。それ故、近年では、胃癌特異性を標的とする治療方法に対する研究が展開されている。
クローディン（Ｃｌａｕｄｉｎ）ファミリータンパク質は、上皮細胞に広く分布されている密着結合構造の主要構成部である。他のクローディンファミリータンパク質の構造と類似して、ＣＬＤＮ１８．２は分子量が約２７．８ｋｄ、四つの膜貫通ドメインを持つ膜タンパク質であり、且つＣＬＤＮ１８．２は二つ比較的に短い細胞外ドメインＥＣ１とＥＣ２をも持っている。他のクローディンファミリータンパク質と異なる点は、正常組織において、ＣＬＤＮ１８．２が胃部の高度分化した上皮細胞にのみ極めて特異的に発現している点である（Ｔｕｒｅｃｉ Ｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，２０１１）。胃上皮細胞由来の腫瘍において、高い割合の腫瘍細胞の表面にＣＬＤＮ１８．２が発現している。胃癌細胞のリンパ節と他の組織転移腫瘍においても高レベルのＣＬＤＮ１８．２発現が検出されている（Ｗｏｌｌ Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，２０１３）。ＣＬＤＮ１８．２は、胃癌に加えて、高い割合の胆管癌、食道癌と膵臓癌等の腫瘍細胞に発現している。特異性表面マーカーとして、ＣＬＤＮ１８．２が癌治療の潜在的標的分子となる。ＣＬＤＮ１８．２に対する高効率抗体薬物の開発は、多様な癌の治療を可能とし、巨大な応用可能性と市場価値を有する。
治療性モノクローナル抗体が腫瘍細胞を傷害する主な作用機構の一つは、ＡＤＣＣ効果（抗体依存性細胞が媒介する細胞毒性、ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）である。治療性抗体の抗原認識領域（Ｆａｂ）が腫瘍細胞表面の特異性抗原と結合した後、抗体定常領域（Ｆｃ）がＦＣ受容体を発現している（ＦｃγＲ）エフェクター細胞と結合することによってエフェクター細胞の細胞傷害活性を活性化することにより、グランザイムとパーフォリン等を含む細胞毒性メディエーターを分泌し、最終的に標的細胞（腫瘍細胞）の溶解破壊を引き起こす。抗体の抗原に対する結合能力の強さ、抗原発現の量（Ａｂｕｎｄａｎｃｅ）、並びに抗体ＦＣ領域とエフェクター細胞表面のＦＣ受容体の結合力の強さは、全てＡＤＣＣ効果の強度に影響する可能性があり、それにより癌の治療効果に影響する可能性がある（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ ａｎｄ Ｌｕｎｄ、２００２）。
本願発明は、新しい抗ＣＬＤＮ１８．２の抗体を提供した。前記抗体は、高い親和力でＣＬＤＮ１８．２と特異的に結合し、エフェクター細胞のＣＬＤＮ１８．２発現標的細胞（例えば腫瘍細胞）に対する傷害を媒介する。また、前記抗体の脱フコシル化形態をも作成しており、この脱フコシル化形態は、通常抗体に比べて、ＦｃγＲＩＩａにより効率的に結合し、ＡＤＣＣ効果を誘導する。
それに応じて、一つの局面では、本発明はＣＬＤＮ１８．２に結合する抗体又はその抗原結合断片に関し、前記抗体は以下の重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲＨ）と軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲＬ）を有する：
ａ．配列番号１に示す重鎖可変領域（ＶＨ）におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２とＣＤＲＨ３；及び配列番号６に示す軽鎖可変領域（ＶＬ）におけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２とＣＤＲＬ３；
ｂ．配列番号１１に示すＶＨにおけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２とＣＤＲＨ３；及び配列番号１６に示すＶＬにおけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２とＣＤＲＬ３；
ｃ．配列番号２１に示すＶＨにおけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２とＣＤＲＨ３；及び配列番号２６に示すＶＬにおけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２とＣＤＲＬ３；
ｄ．配列番号３１に示すＶＨにおけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２とＣＤＲＨ３；及び配列番号３６に示すＶＬにおけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２とＣＤＲＬ３；
ｅ．配列番号４１に示すＶＨにおけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２とＣＤＲＨ３；及び配列番号４６に示すＶＬにおけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２とＣＤＲＬ３；又は
ｆ．配列番号５５に示すＶＨにおけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２とＣＤＲＨ３；及び配列番号６０に示すＶＬにおけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２とＣＤＲＬ３。
本発明の抗体又はその抗原結合断片のある特定の実施様態において、前記抗体は以下のＣＤＲＨとＣＤＲＬを有する：
ａ．配列番号３－５に示すＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２とＣＤＲＨ３；及び配列番号８－１０に示すＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２とＣＤＲＬ３；
ｂ．配列番号１３－１５に示すＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２とＣＤＲＨ３；及び配列番号１８－２０に示すＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２とＣＤＲＬ３；
ｃ．配列番号２３－２５に示すＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２とＣＤＲＨ３；及び配列番号２８－３０に示すＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２とＣＤＲＬ３；
ｄ．配列番号３３－３５に示すＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２とＣＤＲＨ３；及び配列番号３８－４０に示すＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２とＣＤＲＬ３；
ｅ．配列番号４３－４５に示すＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２とＣＤＲＨ３；及び配列番号４８－５０に示すＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２とＣＤＲＬ３；又は
ｆ．配列番号５７－５９に示すＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２とＣＤＲＨ３；及び配列番号６２－６４に示すＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２とＣＤＲＬ３。
本発明の抗体又はその抗原結合断片のある特定の実施様態において、前記抗体は以下のＶＨとＶＬを有する：
ａ．配列番号１のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号６のアミノ酸配列を含むＶＬ；
ｂ．配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号１６のアミノ酸配列を含むＶＬ；
ｃ．配列番号２１のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号２６のアミノ酸配列を含むＶＬ；
ｄ．配列番号３１のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号３６のアミノ酸配列を含むＶＬ；
ｅ．配列番号４１のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４６のアミノ酸配列を含むＶＬ；
ｆ．配列番号５５のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号６０のアミノ酸配列を含むＶＬ。
本発明の抗体又はその抗原結合断片のある特定の実施様態において、前記抗体が配列番号５１に示す重鎖定常領域配列及び／又は配列番号５３に示す軽鎖定常領域配列を有してもよい。
本発明の抗体又はその抗原結合断片のある特定の実施様態において、前記抗体はＦｃ領域を有する。ある特定の実施様態において、Ｅｕナンバリングシステムでナンバリングする場合、前記抗体はＡｓｎ２９７において糖鎖構造修飾を有してもよい。ある特定の実施様態において、前記糖鎖構造において、フコースの糖鎖構造を有する割合が５０％又はそれ以下である。ある特定の実施様態において、前記糖鎖構造において、フコースの糖鎖構造を有する割合が３０％以下、例えば２０％以下、１０％以下、５％以下、２％以下又は１％以下である。
好ましい実施様態において、前記抗体において、フコースの糖鎖構造を有する割合が０％－１％である。
本発明の抗体又はその抗原結合断片のある特定の実施様態において、前記抗体はＦｕｔ８遺伝子ノックアウトの細胞によって生成される。ある特定の実施様態において、前記細胞はＣＨＯ細胞とＨＥＫ２９３細胞から選択されてもよい。
本発明の抗体又はその抗原結合断片のある特定の実施様態において、Ｆｕｔ８遺伝子ノックアウトを有しない細胞において生成した抗体と比べ、前記抗体がより高いＦｃγＲＩＩＩａ結合活性を有する。ある特定の実施様態において、Ｆｕｔ８遺伝子ノックアウトを有しない細胞において生成した抗体と比べ、前記抗体がより高いＡＤＣＣ活性を有する。
本発明の抗体又はその抗原結合断片のある特定の実施様態において、前記抗体はモノクローナル抗体であってもよい。他の特定の実施様態において、前記抗体は二重特異性抗体また多重特異性抗体であってもよい。
本発明の抗体又はその抗原結合断片のある特定の実施様態において、前記抗体はＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥとＩｇＤのアイソタイプから選択されてもよい。ある特定の実施様態において、前記抗体はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３とＩｇＧ４のサブタイプから選択されてもよい。
本発明の抗体又はその抗原結合断片のいかなる実施様態において、前記抗原結合断片はＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｄ’断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ断片、ｄｓ－ｓｃＦｖ断片、ｄＡｂ断片、一本鎖断片、二価抗体及び線状抗体から選択されてもよい。
ある局面において、本発明は核酸分子に関し、前記核酸分子は本発明の抗体又はその抗原結合断片をコードするヌクレオチド配列を含む。
他の局面において、本発明はベクターに関し、前記ベクターは本発明の核酸分子を含む。
さらに他の局面において、本発明は宿主細胞に関し、前記宿主細胞は本発明の核酸分子又はベクターを含む。
ある局面において、本発明はコンジュゲートに関し、前記コンジュゲートは、治療剤、診断剤又は顕像剤とコンジュゲート化する本発明のいかなる抗体又はその抗原結合断片を含む。
他の局面において、本発明は組成物に関し、前記組成物は、本発明の抗体又はその抗原結合断片、又はコンジュゲート、及び、一種又は多種の薬学的に許容される担体、賦形剤及び／又は希釈剤を含む。ある特定の実施様態において、前記組成物は一種又は多種の他の治療剤をさらに含む。
ある特定の実施様態において、前記治療剤は抗体、化学療法の薬物と小分子薬物から選択されてもよい。ある特定の実施様態において、前記化学療法の薬物はエピルビシン（Ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）、オキサリプラチン（Ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）及び５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）から選択される一種又は多種であってもよい。
ある局面において、本発明は被験者のＣＬＤＮ１８．２発現に関連する疾患を治療する方法に関し、前記方法は前記被験者に対して、本発明の抗体又はその抗原結合断片、コンジュゲート、又は組成物を投与するステップを含む。
ある特定の実施様態において、前記疾患は癌である。例えば、前記癌は胃癌、胆管癌、食道癌と膵臓癌から選択されてもよい。
ある特定の実施様態において、前記方法は前記被験者に対して、一種又は多種の他の療法、例えば癌療法を実施するステップをさらに含む。ある特定の実施様態において、前記他の療法は化学療法、放射療法、免疫療法と手術治療から選択される。
ある特定の実施様態において、前記免疫療法は免疫チェックポイント分子に対する療法、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法及びＣＡＲ－ＮＫ細胞療法から選択される。
ある特定の実施様態において、前記化学療法はエピルビシン、オキサリプラチン及び５－フルオロウラシルを含む併用化学療法から選択される。
ある局面において、本発明は、本発明の抗体又はその抗原結合断片、コンジュゲート、又は組成物の、被験者のＣＬＤＮ１８．２の発現に関連する疾患の治療における用途に関する。
他の局面において、本発明は、本発明の抗体又はその抗原結合断片、コンジュゲート、又は組成物の、被験者のＣＬＤＮ１８．２の発現に関連する疾患を治療するための薬物の製作における用途に関する。
本発明の用途のある特定の実施様態において、前記疾患は癌である。例えば、前記癌は胃癌、胆管癌、食道癌と膵臓癌から選択されてもよい。
ある局面において、本発明はポリペプチドに関し、前記ポリペプチドは配列番号１、６、１１、１６、２１、２６、３１、３６、４１、４６、５５及び６０から選択されるアミノ酸配列を有する。
他の局面において、本発明は核酸分子に関し、前記核酸分子は配列番号２、７、１２、１７、２２、２７、３２、３７、４２、４７、５６及び６１から選択されるヌクレオチド配列を有する。また、本発明は前記核酸分子を含むベクターに関する。
図１はフローサイトメトリーでＣＨＯ、ＣＴ２６、ＳＮＵ６０１細胞並びに構築のＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２、ＣＴ２６－ＣＬＤＮ１８．２及びＳＮＵ６０１－ＣＬＤＮ１８．２細胞のＣＬＤＮ１８．２発現を検出した結果を示す。 図２はフローサイトメトリーでコントロールＭ１３ファージ並びに一次、二次、三次スクリーニングを経たファージライブラリーとＣＨＯ細胞、ＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２細胞との結合を検出した結果を示す。 図３はフローサイトメトリーでスクリーニングしたファージクローンＡ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５（図３Ａ）及びＡ６（図３Ｂ）とＣＨＯ細胞、ＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２細胞との結合を検出した結果を示す。 図４はフローサイトメトリーで違う濃度の組換え抗体１８．２－Ａ１、１８．２－Ａ２、１８．２－Ａ３、１８．２－Ａ４、１８．２－Ａ５（図４Ａ）、１８．２－Ａ５Ｆ及び１８．２－Ａ６Ｆ（図４Ｂ）とＣＴ２６－ＣＬＤＮ１８．２細胞との結合を検出した結果並びにＥＣ５０値を示す。 図５はフローサイトメトリーでＣＬＤＮ１８．２抗体とＣＬＤＮ１８．１（１８．１－ｆｌａｇ）又はＣＬＤＮ１８．２（１８．２－ｆｌａｇ）を発現する２９３ｔ細胞との結合を検出した結果を示す。 図６は４℃、３７℃のインキュベート条件で、ＣＬＤＮ１８．２抗体と、ＣＬＤＮ１８．２を発現するＳＮＵ６０１細胞の表面との結合、並びに細胞にエンドサイトーシスされることを検出した結果を示す。 図７はフローサイトメトリーで抗体ＣＬＤＮ１８．２抗体並びに脱フコシル化した抗体とＣＴ２６－ＣＬＤＮ１８．２細胞との結合を検出した結果を示す。 図８はＢｉａｃｏｒｅ方法でＣＬＤＮ１８．２－Ａ１及びＣＬＤＮ１８．２－Ａ１ＦとＦｃγＲＩＩＩａとの結合を検出した結果を示す。図８Ａは抗体がＦｃγＲＩＩＩａと結合するカーブフィッティング曲線を示す、且つ図８Ｂは抗体がＦｃγＲＩＩＩａと結合するＫａ、Ｋｄ、ＫＤ及びｔｃ値を示す。 図９はフローサイトメトリーでＣＬＤＮ１８．２抗体並びに脱フコシル化した抗体と細胞表面で発現したＦｃγＲＩＩＩａとの結合を検出した結果を示す。図９Ａは抗体とＦｃγＲＩＩＩａ－Ｊｕｒｋａｔ細胞との結合の結果を示す。図９Ｂは抗体とＮＫ９２ＭＩ細胞との結合の結果を示す。 図１０はルシフェラーゼレポーターシステムにより、ＳＮＵ６０１－ＣＬＤＮ１８．２細胞（図１０Ａ）又はＣＴ２６－ＣＬＤＮ１８．２（図１０Ｂ）の存在下で、ＣＬＤＮ１８．２抗体並びに脱フコシル化した抗体がＦｃγＲＩＩＩａ－Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＦｃγＲＩＩＩａ受容体を活性化させることを検出した結果を示す。 図１１はフローサイトメトリーでＫＡＴＯＩＩＩ細胞上でのＣＬＤＮ１８．２発現レベルを検出した結果を示す。 図１２はルシフェラーゼレポーターシステムにより、ＳＮＵ６０１－ＣＬＤＮ１８．２細胞の存在下で、ＣＬＤＮ１８．２抗体（図１２Ａ）及びＣＬＤＮ１８．２抗体と化学療法の薬物ＥＯＦとの併用（図１２Ｂ）がＦｃγＲＩＩＩａ－Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＦｃγＲＩＩＩａ受容体を活性化させることを検出した結果を示す。 図１３は健常人ドナー１（図１３Ａ）、ドナー２（図１３Ｂ）又はドナー３（図１３Ｃ）由来のＰＢＭＣの存在下で、ＣＬＤＮ１８．２抗体並びに脱フコシル化した抗体の媒介するＡＤＣＣ経路がＳＮＵ６０１－ＣＬＤＮ１８．２標的細胞に対する傷害効果を示す。 図１４は補体の存在下で、ＣＬＤＮ１８．２抗体並びに脱フコシル化した抗体の媒介するＣＤＣ経路がＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２標的細胞に対する傷害効果を示す。 図１５はＳＮＵ６０１－ＣＬＤＮ１８．２細胞のマウス異種移植モデルにおいて、違う用量のＣＬＤＮ１８．２抗体１８．２－Ａ１Ｆが腫瘍成長を抑制する結果を示す。 図１６は異種移植モデルに使用するＣＬＤＮ１８．２高発現ＫＡＴＯＩＩＩ細胞（ＫＡＴＯＩＩＩ－１８．２Ｈｉｇｈ）のフローサイトメトリーでの結果を示す。 図１７はＫＡＴＯＩＩＩ－１８．２Ｈｉｇｈ細胞のマウス異種移植モデルにおいて、ＣＬＤＮ１８．２抗体１８．２－Ａ１Ｆ並びに１８．２－Ａ１Ｆと化学療法の薬物ＥＯＦの併用が腫瘍成長を抑制する結果を示す。
特別の説明がない限り、本発明と結合して使用する科学的、技術的用語及びその略語は本発明が関連する分野の当業者が普通に理解している意義を有する。以下に、本明細書で使用される術語と略語の一部を挙げている。
抗体：ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ａｂ；免疫グロブリン：ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ、Ｉｇ；
重鎖：ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ、ＨＣ；軽鎖：ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ、ＬＣ；
重鎖可変領域：ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ、ＶＨ；
重鎖定常領域：ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ ｄｏｍａｉｎ、ＣＨ；
軽鎖可変領域：ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ、ＶＬ；
軽鎖定常領域：ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ ｄｏｍａｉｎ、ＣＬ；
相補性決定領域：ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ；
Ｆａｂ断片：ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｆｒａｇｍｅｎｔ、Ｆａｂ；
Ｆｃ領域：ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ、Ｆｃ；
モノクローナル抗体：ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ、ｍＡｂ；
抗体依存性細胞毒作用：ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、ＡＤＣＣ；
補体依存性細胞毒性作用：ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、ＣＤＣ。
一方、本発明はＣＬＤＮ１８．２に結合する抗体又はその抗原結合断片に関し、前記抗体は以下の重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲＨ）と軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲＬ）を有する：
ａ．配列番号１に示す重鎖可変領域（ＶＨ）におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２とＣＤＲＨ３；及び配列番号６に示す軽鎖可変領域（ＶＬ）におけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２とＣＤＲＬ３；
ｂ．配列番号１１に示すＶＨにおけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２とＣＤＲＨ３；及び配列番号１６に示すＶＬにおけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２とＣＤＲＬ３；
ｃ．配列番号２１に示すＶＨにおけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２とＣＤＲＨ３；及び配列番号２６に示すＶＬにおけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２とＣＤＲＬ３；
ｄ．配列番号３１に示すＶＨにおけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２とＣＤＲＨ３；及び配列番号３６に示すＶＬにおけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２とＣＤＲＬ３；
ｅ．配列番号４１に示すＶＨにおけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２とＣＤＲＨ３；及び配列番号４６に示すＶＬにおけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２とＣＤＲＬ３；又は
ｆ．配列番号５５に示すＶＨにおけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２とＣＤＲＨ３；及び配列番号６０に示すＶＬにおけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２とＣＤＲＬ３。
本明細書で使用される場合、術語“結合”又は“特異的に結合”とは、二種類の分子間の非ランダム的な結合反応、例えば、抗体とその対象である抗原との間の反応を指す。ある特定の実施様態において、ある抗原に特異的に結合する抗体（又はある抗原に対する特異性を有する抗体）とは、抗体が約１０－５ Ｍ未満、例えば約１０－６ Ｍ未満、１０－７ Ｍ未満、１０－８ Ｍ未満、１０－９ Ｍ未満、又は１０－１０ Ｍ未満又はさらに小さい親和力（ＫＤ）で当該抗原に結合することを指す。本明細書が使用する“ＫＤ”とは、特定の抗体－抗原相互作用の解離平衡定数であり、抗体と抗原との間の結合親和力を表現する。平衡解離定数が小さいほど、抗体－抗原の結合が強くなり、抗体と抗原との間の親和力が高くなる。
本明細書で使用される場合、術語“抗体”とは、少なくとも一つの抗原認識サイトを含み、且つ抗原に特異的に結合することができる免疫グロブリン分子を指す。術語“抗原”は、生体内において免疫応答を誘導することができ、且つ抗体と特異的に結合する物質、例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ハプテン又は前記物質の組合である。抗体と抗原との結合は、両者の間に形成する相互作用を媒介するものであり、水素結合、ファンデルワールス力、イオン結合並びに疎水性結合を含む。抗原表面の抗体と結合するドメインは、“抗原決定基”又は“エピトープ”であり、一般的に、一つの抗原が複数のエピトープを有してもよい。
本明細書で使用される場合、術語の“エピトープ”は、連続のアミノ酸、又はタンパク質の三次フォールディングによって並置された非連続のアミノ酸により形成されてもよい。エピトープは、通常、独特な空間的コンフォメーションにおいて少なくとも３つ、より通常は少なくとも５つ、約９つ、又は約８－１０つアミノ酸を含む。“エピトープ”は通常免疫グロブリンＶＨ／ＶＬ対により結合される構造単位を含む。エピトープは、抗体の最小結合サイトを定義するので、抗体又はその抗原結合断片の特異性標的物を代表する。
本発明で言及される術語“抗体”は最も広い意義で理解され、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、抗体断片、少なくとも二つの異なる抗原結合構造領域を含む多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）を含む。抗体はマウス抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ヒト抗体並びにその他由来の抗体をさらに含む。抗体は他の改変を含んでもよい、例えば、非天然アミノ酸、Ｆｃエフェクター機能変異と糖鎖化サイト変異等。期望する生物活性を示す限り、抗体は、翻訳後修飾した抗体、抗体を含む抗原決定基の融合タンパク質、並びに抗原認識サイトに対するいかなるその他修飾を含む免疫グロブリン分子をさらに含む。言い替えると、抗体は、免疫グロブリン分子や免疫グロブリン分子の免疫活性断片、即ち少なくとも一つの抗原結合構造領域を含有する分子を含む。
本明細書で使用される場合、“可変領域”（重鎖可変領域ＶＨと軽鎖可変領域ＶＬ）は対になった軽鎖及び重鎖構造領域部分を示す、これは直接的に抗体と抗原の結合に参与する。各ＶＨ及びＶＬ領域は以下の順でＮ末端からＣ末端まで並べる三つの超可変領域又は相補性決定領域（ＣＤＲ）と四つフレームワーク領域（ＦＲ）によって構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。
本明細書で使用される場合、術語“ＣＤＲ”とは、抗体可変配列内の相補性決定領域を指す。各可変領域は、重鎖と軽鎖の各可変領域において三つのＣＤＲを有し、これらはＣＤＲ１、ＣＤＲ２とＣＤＲ３を称する。これらのＣＤＲの具体的な境界は、違うシステムによって定義が違くなる。Ｋａｂａｔら（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７）と（１９９１））が発表したシステムは、抗体可変領域に適用する明確な残基ナンバリングシステムを提供しただけではなく、三つのＣＤＲを限定する残基境界をも提供した。これらのＣＤＲはＫａｂａｔ ＣＤＲと呼ばれてもよい。各相補性決定領域は、Ｋａｂａｔによって定義される“相補性決定領域”のアミノ酸残基を含んでもよい。Ｃｈｏｔｈｉａら（Ｃｈｏｔｈｉａ ＆ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，１９６：９０１－９１７（１９８７）とＣｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７－８８３（１９８９））は、アミノ酸配列レベルにおいて多様性を有しているが、Ｋａｂａｔ ＣＤＲ内特定の一部のサブパーツがほぼ同じペプチド骨格コンフォメーションを採用していることを発現した。これらのサブパーツは、それぞれＬ１、Ｌ２とＬ３又はＨ１、Ｈ２とＨ３と呼ばれ、そのなか“Ｌ”と“Ｈ”は、それぞれ軽鎖と重鎖領域を示す。これらのドメインは、Ｋａｂａｔ ＣＤＲと重ねる境界を有し、Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲと呼ばれてもよい。また、他のＣＤＲ境界の定義は、前記システムのどちらかに従う必要がないが、Ｋａｂａｔ ＣＤＲと重ねることになる。本明細書に使用している方法は、好ましい実施様態においてＫａｂａｔ又はＣｈｏｔｈｉａ定義のＣＤＲを使用するが、いかなる前記システムによって定義されるＣＤＲを利用してもよい。
Ｋａｂａｔシステムを使用するＣＤＲ配列を定義する場合、配列番号１に示すＶＨにおけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２とＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号３（ＳＳＷＬＩ）、配列番号４（ＴＩＶＰＳＤＳＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤ）と配列番号５（ＦＲＴＧＮＳＦＤＹ）のアミノ酸配列を有し、且つ配列番号６に示すＶＬにおけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２とＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号８（ＫＳＳＱＳＶＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＴ）、配列番号９（ＷＡＶＡＲＱＳ）と配列番号１０（ＱＮＳＩＡＹＰＦＴ）のアミノ酸配列を有する；
配列番号１１に示すＶＨにおけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２とＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号１３（ＳＦＷＶＧ）、配列番号１４（ＮＶＳＰＳＤＳＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤ）と配列番号１５（ＬＳＳＧＮＳＦＤＹ）のアミノ酸配列を有し、且つ配列番号１６に示すＶＬにおけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２とＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号１８（ＫＳＳＱＳＶＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＴ）、配列番号１９（ＷＳＳＴＫＱＳ）と配列番号２０（ＱＮＡＦＳＦＰＦＴ）のアミノ酸配列を有する；
配列番号２１に示すＶＨにおけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２とＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号２３（ＳＹＷＬＮ）、配列番号２４（ＳＭＹＰＳＤＳＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤ）と配列番号２５（ＦＳＲＧＮＳＦＤＹ）のアミノ酸配列を有し、且つ配列番号２６に示すＶＬにおけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２とＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号２８（ＫＳＳＱＳＬＬＥＳＧＮＱＫＮＹＬＴ）、配列番号２９（ＷＳＷＡＫＮＳ）と配列番号３０（ＱＮＡＹＡＦＰＦＴ）のアミノ酸配列を有する；
配列番号３１に示すＶＨにおけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２とＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号３３（ＳＦＷＩＳ）、配列番号３４（ＮＩＬＰＳＤＳＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤ）と配列番号３５（ＹＷＲＧＮＳＦＤＹ）のアミノ酸配列を有し、且つ配列番号３６に示すＶＬにおけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２とＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号３８（ＫＳＳＱＳＩＩＮＳＧＮＱＫＮＹＬＴ）、配列番号３９（ＷＧＧＴＲＨＳ）と配列番号４０（ＱＮＧＹＹＳＰＦＴ）のアミノ酸配列を有する；
配列番号４１に示すＶＨにおけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２とＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号４３（ＳＳＷＶＧ）、配列番号４４（ＮＳＹＰＳＤＳＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤ）と配列番号４５（ＬＧＲＧＮＳＦＤＹ）のアミノ酸配列を有し、且つ配列番号４６に示すＶＬにおけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２とＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号４８（ＫＳＳＱＳＬＩＨＳＧＮＱＫＮＹＬＴ）、配列番号４９（ＷＧＬＳＫＮＳ）と配列番号５０（ＱＮＳＩＹＹＰＦＴ）のアミノ酸配列を有する；
配列番号５５に示すＶＨにおけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２とＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号５７（ＳＹＷＬＧ）、配列番号５８（ＩＩＹＰＳＤＳＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤ）と配列番号５９（ＦＷＲＧＮＳＦＤＹ）のアミノ酸配列を有し、且つ配列番号６０に示すＶＬにおけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２とＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号６２（ＫＳＳＱＳＬＬＥＳＧＮＱＫＮＹＬＴ）、配列番号６３（ＷＡＡＧＫＥＳ）と配列番号６４（ＱＮＧＹＳＨＰＦＴ）のアミノ酸配列を有する。
それに応じて、本発明の抗体又はその抗原結合断片のある特定の実施様態において、前記抗体は以下ＣＤＲＨとＣＤＲＬを有する：
ａ．配列番号３－５に示すＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２とＣＤＲＨ３；及び配列番号８－１０に示すＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２とＣＤＲＬ３；
ｂ．配列番号１３－１５に示すＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２とＣＤＲＨ３；及び配列番号１８－２０に示すＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２とＣＤＲＬ３；
ｃ．配列番号２３－２５に示すＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２とＣＤＲＨ３；及び配列番号２８－３０に示すＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２とＣＤＲＬ３；
ｄ．配列番号３３－３５に示すＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２とＣＤＲＨ３；及び配列番号３８－４０に示すＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２とＣＤＲＬ３；
ｅ．配列番号４３－４５に示すＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２とＣＤＲＨ３；及び配列番号４８－５０に示すＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２とＣＤＲＬ３；又は
ｆ．配列番号５７－５９に示すＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２とＣＤＲＨ３；及び配列番号６２－６４に示すＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２とＣＤＲＬ３。
本発明の抗体又はその抗原結合断片のある特定の実施様態において、前記抗体は以下のＶＨとＶＬを有する：
ａ．配列番号１のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号６のアミノ酸配列を含むＶＬ；
ｂ．配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号１６のアミノ酸配列を含むＶＬ；
ｃ．配列番号２１のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号２６のアミノ酸配列を含むＶＬ；
ｄ．配列番号３１のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号３６のアミノ酸配列を含むＶＬ；
ｅ．配列番号４１のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４６のアミノ酸配列を含むＶＬ；又は
ｆ．配列番号５５のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号６０のアミノ酸配列を含むＶＬ。
本発明の抗体又はその抗原結合断片の他の特定の実施様態において、前記抗体は以下のＶＨとＶＬを有する：
ａ．配列番号１において一つ又は幾つかのアミノ酸修飾をしたアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号６において一つ又は幾つかのアミノ酸修飾をしたアミノ酸配列を含むＶＬ；
ｂ．配列番号１１において一つ又は幾つかのアミノ酸修飾をしたアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号１６において一つ又は幾つかのアミノ酸修飾をしたアミノ酸配列を含むＶＬ；
ｃ．配列番号２１において一つ又は幾つかのアミノ酸修飾をしたアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号２６において一つ又は幾つかのアミノ酸修飾をしたアミノ酸配列を含むＶＬ；
ｄ．配列番号３１において一つ又は幾つかのアミノ酸修飾をしたアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号３６において一つ又は幾つかのアミノ酸修飾をしたアミノ酸配列を含むＶＬ；
ｅ．配列番号４１において一つ又は幾つかのアミノ酸修飾をしたアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４６において一つ又は幾つかのアミノ酸修飾をしたアミノ酸配列を含むＶＬ；又は
ｆ．配列番号５５において一つ又は幾つかのアミノ酸修飾をしたアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号６０において一つ又は幾つかのアミノ酸修飾をしたアミノ酸配列を含むＶＬ。
ある特定の実施様態において、前記アミノ酸修飾は抗体のＣＤＲ配列を改変しない、即ち、前記アミノ酸修飾は可変領域のフレームワーク領域（ＦＲ）において行われる。
ある特定の実施様態において、前記一つ又は幾つかのアミノ酸修飾とは、１－１０つのアミノ酸修飾又は１－５つのアミノ酸修飾、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０つのアミノ酸修飾を指す。
ある特定の実施様態において、前記アミノ酸修飾はアミノ酸残基の置換、欠失、付加及び／又は挿入から選択される。ある特定の実施様態において、前記アミノ酸修飾はアミノ酸置換であり、例えば保存的置換である。
本発明の抗体又はその抗原結合断片のある特定の実施様態において、前記抗体は以下のＶＨとＶＬを有する：
ａ．配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ；
ｂ．配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ；
ｃ．配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号２６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ；
ｄ．配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号３６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ；
ｅ．配列番号４１のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ；又は
ｆ．配列番号５５のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号６０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ。
例えば、当業者が理解する、二つのアミノ酸配列の間又は二つのヌクレオチド配列の間の関連性は、パラメータ“配列同一性”で表現できる。例えば、数学アルゴリズムを使って、二種類の配列間の配列同一性の百分比を測定することができる。例えば、数学アルゴリズムを使って、二種類の配列間の配列同一性の百分比を測定することができる。このような数学アルゴリズムの非限定的実例は、ＭｙｅｒｓとＭｉｌｌｅｒ（１９８８）ＣＡＢＩＯＳ ４：１１－１７のアルゴリズム、Ｓｍｉｔｈ等（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２のローカルホモロジーアルゴリズム、ＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３の相同性比較アルゴリズム、ＰｅａｒｓｏｎとＬｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：２４４４－２４４８の相同性検索用方法、及びＫａｒｌｉｎとＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４のアルゴリズムの改変形式、ＫａｒｌｉｎとＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－５８７７に記載したアルゴリズムを含む。このような数学アルゴリズムに基づいたプログラムにより、配列同一性を測定するための配列比較（即ち比較）を行うことができる。プログラムはコンピューターにより適切に実施されてもよい。このようなプログラムの実例は、ＰＣ／ＧｅｎｅプログラムのＣＬＵＳＴＡＬ、ＡＬＩＧＮプログラム（Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０）、及びＷｉｓｃｏｎｓｉｎ遺伝学ソフトウェアパッケージのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡを含むが、この限りではない。例えば、初期パラメータを使って、プログラムを使用した比較を実施してもよい。
本発明の抗体又はその抗原結合断片のある特定の実施様態において、前記抗体は配列番号５１に示す重鎖定常領域配列及び／又は配列番号５３に示す軽鎖定常領域配列を有してもよい。
本発明の抗体又はその抗原結合断片のある特定の実施様態において、前記抗体はＦｃ領域を有する。ある特定の実施様態において、Ｅｕナンバリングシステムでナンバリングする場合、前記抗体はＡｓｎ２９７において糖鎖構造修飾を有する。本発明における“Ａｓｎ２９７”とは、Ｅｕナンバリングシステムにおいて、抗体Ｆｃ領域の２９７位に位置するアスパラギン。具体的な抗体の些細な配列変化によって、Ａｓｎ２９７は２９７位から上流に、又は下流に幾つかのアミノ酸を離れたところに位置してもよい。
本明細書で使用される場合、術語“抗体のＦｃ領域”又は“人免疫グロブリンＦｃ領域”は、抗体の重鎖定常領域１（ＣＨ１）以外の定常領域ポリペプチド、例えば人免疫グロブリンＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ重鎖定常領域のカルボキシル基端の二つの定常領域構造領域ＣＨ２及びＣＨ３、並びに人免疫グロブリンＩｇＥとＩｇＭ重鎖定常領域のカルボキシル基端の三つの定常領域構造領域ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４を含み、且つこれらの構造領域のアミノ基端の柔性ヒンジ領域をさらに含む。Ｆｃ領域の境界が変化してもよいが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は通常、Ａ２３１からそのカルボキシル基末端までの残基を含むと定義される。
免疫グロブリンＦｃ領域は、抗体が免疫効果を発揮する機能的ドメイン。ＩｇＧ抗体のＦｃは、複数の受容体と相互作用することができ、そのなかで最も重要なのはＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）ファミリーである。治療性モノクローナル抗体が腫瘍細胞を傷害する主な作用機構の一つは、ＡＤＣＣ効果（抗体依存性細胞が媒介する細胞毒性、ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）である。治療性抗体の抗原認識領域が腫瘍細胞表面の特異性抗原と結合した後、抗体のＦｃ領域とＦｃγＲを発現する傷害細胞との結合により、エフェクター細胞の細胞傷害活性を活性化するこれにより、グランザイム、パーフォリン等を含む細胞毒性メディエーターを分泌し、最終的に標的細胞（例えば腫瘍細胞）の溶解破壊を引き起こす。それ以外、Ｆｃは、補体タンパク質Ｃ１ｑとも結合し、ＣＤＣ効果（補体依存性細胞毒性ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、ＣＤＣ）を発生させることができる。
抗体Ｆｃ領域の糖鎖化修飾レベルと形式は、Ｆｃ領域とその受容体ＦｃγＲの結合能力に影響を及ぼすことができ、これにより抗体のＡＤＣＣ効果の強さに影響する。本明細書で使用される場合、抗体Ｆｃ領域の糖鎖化修飾は通常、Ａｓｎ２９７における糖鎖化修飾を指す。抗体は、生成過程において、細胞ＥＲとゴルジネットワークでの糖鎖化を受ける。抗体糖鎖化の関連研究において、抗体のフコース化レベルを低下させることはＦｃ領域のＦｃγＲＩＩＩａと結合する能力の向上に寄与し、これにより抗体のＡＤＣＣ効果を向上させることが明らかとなった。したがって、抗体発現細胞の糖鎖化代謝経路を改変することで、発現抗体のフコースレベルを効果的に改変することができ、これにより抗体によって媒介されるＡＤＣＣ効果を調節することができる（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ Ｒ．２００９、ＮＡＴ．ＲＥＶ．Ｄｒｕｇ．ＤＩＳＣ）。
それに応じて、本発明の抗体又はその抗原結合断片のある特定の実施様態において、前記抗体は、低下されたフコース化レベルを有する。例えば、本発明の抗体又はその抗原結合断片のある特定の実施様態において、Ａｓｎ２９７の糖鎖構造において、フコースの糖鎖構造を有する割合は、６０％又はそれ以下、例えば５０％又はそれ以下、例えば４０％又はそれ以下、３０％又はそれ以下、２０％又はそれ以下、１０％又はそれ以下、５％又はそれ以下、２％又はそれ以下、或いは１％又はそれ以下である。ある特定の実施様態において、フコースの糖鎖構造を有する割合は、０％－１０％、例えば０％－５％、０％－２％又は０％－１％である。ある特定の実施様態において、フコースの糖鎖構造を有する割合は、０．１％又はそれ以下である。他の特定の実施様態において、Ａｓｎ２９７の糖鎖構造において、検出できるフコースがない。
当業者が既知した技術でこのような脱フコシル化した抗体を生成してもよい。例えば、抗体は、フコース鎖化能力が欠損又は不足している細胞において発現してもよい。ある特定の実施様態において、例えば、Ｆｕｔ８遺伝子ノックアウトを有する細胞系は、低下されたフコース化レベルを有する抗体の生成に使ってもよい。あるいは、低下されたフコース含量を有する抗体、フコース含量がない抗体、又は抗原結合断片を生成してもよい、例えば：（ｉ）フコース鎖化が阻止又は減少される条件で細胞を培養する；（ｉｉ）翻訳後でフコースを除去する（例えば、フコシダーゼで）；（ｉｉｉ）所望の炭水化物の翻訳後付加、例えば非糖鎖化糖タンパク質を組換え発現した後で；又は（ｉｖ）糖タンパク質の精製これによって、フコース鎖化されてない抗体又はその抗原結合断片を選択する。
本発明の抗体又はその抗原結合断片のある特定の実施様態において、低下されたフコース化レベルを有する抗体を得るために、前記抗体はＦｕｔ８遺伝子ノックアウト細胞によって生成される。ある特定の実施様態において、前記細胞は、中国ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、例えばＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＣＨＯＳ細胞又はその他ＣＨＯ由来の細胞である。ある特定の実施様態において、前記細胞はＦｕｔ８遺伝子ノックアウトＣＨＯ細胞である。
他の特定の実施様態において、前記細胞はヒト胎児腎細胞（ＨＥＫ）２９３細胞、例えばＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ａ、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３Ｆ又はその他ＨＥＫ２９３由来の細胞である。ある特定の実施様態において、前記細胞はＦｕｔ８遺伝子ノックアウトＨＥＫ ２９３細胞である。
本発明の抗体又はその抗原結合断片のある特定の実施様態において、前記抗体はＦｕｔ８遺伝子ノックアウト細胞によって生成され、且つそのなかＦｕｔ８遺伝子ノックアウトを有しない細胞において生成した抗体、例えば配列が同じであるコントロール抗体と比べ、前記抗体がより高いＦｃγＲＩＩＩａ結合活性を有する。ある特定の実施様態において、Ｆｕｔ８遺伝子ノックアウトを有しない細胞において生成した抗体、例えば配列が同じであるコントロール抗体と比べ、Ｆｕｔ８遺伝子ノックアウト細胞によって生成された抗体は、強化したＦｃγＲＩＩＩａ活性を誘導する能力を有する。例えば、ある特定の実施様態において、Ｆｕｔ８遺伝子ノックアウトを有しない細胞において生成した抗体と比べ、Ｆｕｔ８遺伝子ノックアウト細胞によって生成された抗体がＦｃγＲＩＩＩａ活性を誘導するＥＣ５０値は、少なくとも２倍、例えば少なくとも５倍又は少なくとも１０倍、例えば１０－２０倍向上されている。本明細書で使用される場合、術語“ＥＣ５０”とは、５０％最大効果が引き起こされた時が対応する抗体濃度を指す。
本発明の抗体又はその抗原結合断片のある特定の実施様態において、前記抗体はＦｕｔ８遺伝子ノックアウト細胞によって生成され、且つそのなかＦｕｔ８遺伝子ノックアウトを有しない細胞において生成した抗体、例えば配列が同じであるコントロール抗体と比べ、前記抗体がより高いＡＤＣＣ活性を有する。例えば、ある特定の実施様態において、Ｆｕｔ８遺伝子ノックアウトを有しない細胞において生成した抗体と比べ、Ｆｕｔ８遺伝子ノックアウト細胞によって生成された抗体のＡＤＣＣ活性は、少なくとも２倍、例えば少なくとも５倍又は少なくとも１０倍、例えば１０－２０倍向上されている。
本発明の抗体又はその抗原結合断片のある特定の実施様態において、前記抗体はモノクローナル抗体である。
本明細書で使用される場合、術語“モノクローナル抗体”とは、基本的に均質な抗体集団から得られる抗体を指し、即ち少量で存在し得る可能な天然に存在する突然変異を除いて、集団を構成する各抗体は同じである。モノクローナル抗体は、高度な特異性を持ち、単一の抗原を認識する。また、通常違う決定基（エピトープ）を認識する違う抗体を含むポリクローナル抗体製剤とは反対に、モノクローナル製剤において、全種類の抗体が抗原上同一な単一決定簇を認識する。本明細書で使用される場合、術語“モノクローナル抗体”はハイブリドーマ技術によって生成された抗体に限らない、また、修飾語“モノクローナル抗体”はいかなる特定な方法で生産されなければならない抗体に解釈されるべきではない。
本発明の抗体又はその抗原結合断片のある特定の実施様態において、前記抗体は二重特異性抗体又は多重特異性抗体である。
例えば、前記二重特異性抗体又は多重特異性抗体は、ＣＬＤＮ１８．２上のエピトープと結合する第一抗原結合領域、並びに別の抗原エピトープと結合する第二抗原結合領域を有し、そのなか前記第一抗原結合領域が本発明前記の抗体又はその抗原結合断片のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２とＣＤＲＨ３並びにＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２とＣＤＲＬ３；又はＶＨとＶＬ配列を有し、且つ前記第二抗原結合領域が前記第一抗原結合領域とは別の抗原エピトープに結合する。
ある特定の実施様態において、前記第二抗原結合領域はＣＬＤＮ１８．２分子上の別の抗原結合エピトープと結合する。他の特定の実施様態において、前記第二抗原結合領域は別の抗原を結合する。ある特定の実施様態において、前記別の抗原は腫瘍関連抗原と免疫チェックポイント分子から選択される。
本分野において、すでに特定癌に関連する多くの腫瘍関連抗原が鑑定されている。本明細書で使用される場合、術語“腫瘍関連抗原”とは、癌細胞で差次的に発現され、よって癌細胞を標的とするのに利用できる抗原を指す。腫瘍関連抗原は明らかな腫瘍特異性免疫応答を潜在的に刺激することができる抗原である。これらの抗原の一部は正常細胞にコードされるが、正常細胞において発現されるとは限らない。これらの抗原は、通常正常細胞において沈黙（即ち発現しない）である抗原、特定の分化段階でのみ発現する抗原や特定の時間点で発現する抗原、例えば、胚や胎児の抗原などである。他の癌抗原は、変異した細胞遺伝子、例えば、癌遺伝子（例えば活性化したｒａｓ癌遺伝子）、抑制遺伝子（例えば変異型ｐ５３）や内部欠失又は染色体転座によって生成された融合タンパク質にコードされる。他の癌抗原はウイルス遺伝子、例えば、ＲＮＡとＤＮＡ腫瘍ウイルスに搭載されている遺伝子にコードされてもよい。多くの他の腫瘍関連抗原及びこれに対する抗体は既知及び／又は商品化されたものであり、且つ当業者によって製作されてもよい。
免疫チェックポイントタンパク質受容体及びその配体（本明細書では免疫チェックポイント分子を称する）はＴ細胞が媒介する細胞毒性の抑制を媒介し、通常では腫瘍又は腫瘍微小環境中の無反応性Ｔ細胞に発現され、腫瘍が免疫攻撃を回避できるようにする。免疫抑制チェックポイントタンパク質受容体及びその配体の活性を阻害する阻害剤は、免疫抑制性腫瘍環境を克服し、腫瘍に対する細胞毒性Ｔ細胞攻撃を可能にすることができる。免疫チェックポイントタンパク質の実例は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＯＸ４０、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ及びＣＤ１０３を含むが、これらに限らない。このようなタンパク質の活性の調節（阻害を含む）は免疫チェックポイント調節剤で行うことができ、例えばチェックポイントタンパク質を標的とする抗体、適体、小分子及びチェックポイント受容体タンパク質の可溶性形式を含むでもよい。ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＯＸ４０、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ及びＣＤ１０３に対して特異的な抗体は、既知及び／又は商品化されたものであり、且つ当業者によって製作されてもよい。
抗体重鎖定常領域のアミノ酸配列により、免疫グロブリンを５つの系（アイソタイプ）に分類することができる：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧとＩｇＭ。さらに違うサブタイプ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２等に分類することもできる。軽鎖アミノ酸配列により、軽鎖をλ鎖とκ鎖に分類することができる。本発明の抗体は前記種系又は亞系のいずれかであってもよい。
ある特定の実施様態において、本発明の抗体はＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥとＩｇＤのアイソタイプから選択される。ある特定の実施様態において、本発明の抗体はＩｇＧ、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３とＩｇＧ４のサブタイプから選択される。
本明細書で使用される場合、術語“抗原結合断片”は以下のものを含むが、これらに限らない：ＶＬ、ＣＬ、ＶＨとＣＨ１ドメインを有するＦａｂ断片；ＣＨ１ドメインのＣ端において一つ又は複数のシステイン残基を有するＦａｂ断片であるＦａｂ’断片；ＶＨとＣＨ１ドメインを有するＦｄ断片；ＶＨとＣＨ１ドメインとＣＨ１ドメインのＣ端に位置する一つ又は複数のシステイン残基を有するＦｄ’断片；抗体の片方のアームのＶＬとＶＨドメインを有するＦｖ断片とｓｃＦｖ；ＶＨドメイン又はＶＬドメインによって構成されるｄＡｂ断片；分離のＣＤＲ領域；ヒンジ領域でのジスルフィド架橋によって連接された二つのＦａｂ’断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片；一本鎖抗体分子（例えば一本鎖Ｆｖ；ｓｃＦｖ）；その同一ポリペプチド鎖において、軽鎖可変域（ＶＬ）と連接する重鎖可変域（ＶＨ）を含み、二つの抗原結合サイトを有する“二価抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）”；一対のタンデムＦｄセグメント（ＶＨ－ＣＨ１－ＶＨ－ＣＨ１）を含む“線状抗体”、当該セグメントは相補的な軽鎖ポリペプチドと共に一対の抗原結合領域を形成する；並びに抗原結合活性を保有するいかなる前述物質の修飾された形式。
本発明の抗体又はその抗原結合断片のある特定の実施様態において、前記抗原結合断片はＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｄ’断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ断片、ｄｓ－ｓｃＦｖ断片、ｄＡｂ断片、一本鎖断片、二価抗体及び線状抗体から選択される。
他の局面において、本発明は核酸分子に関し、前記核酸分子が本発明の抗体又はその抗原結合断片をコードするヌクレオチド配列を含む。また、本発明はベクターに関し、前記ベクターが本発明の核酸分子を含む。
本明細書が使用する“ベクター”とは、ポリヌクレオチドをこれに挿入することができる核酸送達ツール。ベクターは、挿入されたポリヌクレオチドがコードするタンパク質を発現されることができる場合、当該ベクターを発現ベクターと称する。ベクターは、形質転換、形質導入又はトランスフェクション等の方法で宿主細胞に導入さてることができ、これにより宿主細胞内で搭載した遺伝物質ユニットを発現させる。ベクターは当業者が認識されているものであり、以下のものを含むが、これらに限らない：（１）プラスミド；（２）ファージミド；（３）Ｃｏｓプラスミド；（４）人工染色体、例えば、酵母人工染色体、細菌人工染色体又はＰ１由来の人工染色体；（５）ファージ、例えば、λファージ又はＭ１３ファージ、及び（６）動物ウイルス、例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、バキュロウイルス。一種のベクターは複数の発現制御ユニットを含んでもよく、前記制御ユニットがプロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、スクリーニングユニット及びレポーター遺伝子を含むが、これらに限らない；また、ベクターは複製開始サイトを含んでもよい。
ある局面において、本発明は宿主細胞に関し、前記宿主細胞が本発明の核酸分子又はベクターを含む。ある特定の実施様態において、前記宿主細胞はＣＨＯ細胞、例えばＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＣＨＯＳ細胞又はその他ＣＨＯ由来の細胞である。他の特定の実施様態において、前記宿主細胞はＨＥＫ ２９３細胞、例えばＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ａ、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３Ｆ又はその他ＨＥＫ２９３由来の細胞である。
ある局面において、本発明はコンジュゲートに関し、前記コンジュゲートは治療剤、診断剤又は顕像剤とコンジュゲート化する本発明の抗体又はその抗原結合部を含む。ある特定の実施様態において、前記治療剤は細胞毒素と放射性同位体から選択されてもよい。ある特定の実施様態において、前記診断剤又は顕像剤は蛍光マーカー、発光物質、発色性物質及び酵素から選択されてもよい。
他の局面において、本発明は組成物に関し、前記組成物は本発明の抗体又はその抗原結合断片、又はコンジュゲート、並びに一種又は多種の薬学的に許容される担体、賦形剤及び／又は希釈剤を含む。
短語“薬学的に許容される”とは、合理的な医学判断の範囲内で、人や動物の組織との接触に適用し、過度の毒性、刺激性、アレルギー反応、又は他の問題又は合併症がなく、合理的な収益／リスク比に相応する化合物、材料、組成物及び／又は剤形を指す。例えば、本明細書で使用する、短語“薬学的に許容される担体、賦形剤及び／又は希釈剤”とは、薬学的に許容される材料、組成物又は媒介物、例えば、液体又は固体充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、媒体、カプセル化材料、製造助剤又は溶媒カプセル化材料であり、これらが本発明の抗体又はその抗原結合断片の安定性、溶解度又は活性の維持に関連する。
本発明の組成物は調製によって、固体、液体又はゲルの形式で被験者に投与することができる。例えば、本発明の組成物は調製によって、例えば無菌溶液、懸濁液又は徐放性製剤として、腸胃外投与に使用することができ、例えば皮下、筋肉内、静脉内又は硬膜外で注射することができる。
ある特定の実施様態において、前記組成物は一種又は多種の他の治療剤をさらに含む。ある特定の実施様態において、前記他の治療剤は抗体、化学療法の薬物と小分子薬物から選択される。ある特定の実施様態において、前記治療剤は腫瘍関連抗原、例えば、上記のような腫瘍関連抗原を標的とする。他の特定の実施様態において、前記治療剤は免疫チェックポイント分子、例えば、上記のような免疫チェックポイント分子を標的とする。
本明細書で使用される場合、術語“化学療法の薬物”とは、異常的な細胞成長を特徴とする疾患の治療において、治療有用性を有する全ての化学試剤を指す。本明細書で使用される場合、化学治療剤は化学剤と生物剤を含む。これらの試剤は、その機能を発揮して、癌細胞が継続的な生存のために依存する細胞活性を阻害する。化学療法剤のカテゴリーはアルキル化剤／アルカロイド剤、代謝拮抗剤、ホルモン又はホルモン類似物、並びに各種抗新生薬物を含む。
ある特定の実施様態において、前記他の治療剤は化学療法の薬物であり、且つ前記化学療法の薬物がエピルビシン（Ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）、オキサリプラチン（Ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）と５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）から選択される一種又は多種であってもよい。
ある局面において、本発明は被験者のＣＬＤＮ１８．２の発現に関連する疾患を治療する方法に関し、前記方法は、前記被験者に対して、本発明の抗体又はその抗原結合断片、コンジュゲート又は組成物を投与するステップを含む。
本明細書で使用される場合、術語“治療”とは、治療性処理を指し、その目のが疾患又は病症に関連する状况の進行又は重症度を逆転、軽減、改善、阻害、減速、又は停止させることである。術語“治療”は疾患又は病症の少なくとも一種の副作用又は症状を減少や軽減させることを含む。例えば、一種又は多種の症状又は臨床マーカーを減少させた場合、通常、治療を“有効”とする。あるいは、例えば、疾患の進行を減少又は停止させた場合、治療を“有効”とする、つまり、“治療”は症状の改善のみではなく、治療が欠けている場合での予期される症状の進行や悪化を停止させ、少なくとも減速させることをも含む。有益又は望ましい臨床結果は一種又は多種の症状の軽減、疾患重症度の減少、疾患状態の安定化（即ち悪化しない）、疾患進行の遅延又は減速、疾患状態改善又は緩和、及び緩和（部分的緩和と全体的緩和を含む）を含むが、これらに限られず、検出できるものと検出できないものを全て含む。
本明細書で使用される場合、術語“被験者”、“患者”と“個体”は、本明細書において、交換して使用してもよい、且つ、動物、例えば人類のことを指す。術語被験者は“非人哺乳動物”、例えば、ラット、マウス、兎、羊、猫、犬、牛、豚と非人霊長類動物をさらに含む。好ましい実施様態において、前記被験者は人類被験者である。
前記方法のある特定の実施様態において、前記疾患は癌である。癌の具体例は以下のものを含むが、これらに限らない：基底細胞癌、胆管癌；膀胱癌；骨癌；乳癌；腹膜癌；頸部癌；胆管癌；脈絡癌；結腸及び直腸癌；結合組織癌；消化器系癌；子宮内膜癌；食道癌；眼癌；頭頸癌；胃癌；神経膠芽細胞腫；肝臓癌；腎癌；喉癌；白血病；肝癌；肺癌（例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌と肺扁平上皮癌）；ホジキンリンパ腫と非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫；メラノーマ；骨髓腫；神経芽細胞腫；口腔癌；卵巣癌；膵臓癌；前立腺癌；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫；直腸癌；呼吸器系癌；唾液腺癌；肉腫；皮膚癌；扁平上皮癌；精巣癌；甲状腺癌；子宮又は子宮内膜癌；尿路癌； Ｂ細胞リンパ腫；慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；毛状細胞白血病；慢性骨髄芽球性白血病等。好ましい実施様態において、前記癌は胃癌、胆管癌、食道癌と膵臓癌から選択される。
前記方法のある特定の実施様態において、前記方法は一種又は多種の他の療法を実施するステップことをさらに含む。例えば、ある特定の実施様態において、前記療法は化学療法、放射療法、免疫療法と手術療法から選択される。
ある特定の実施様態において、前記免疫療法は免疫チェックポイント分子に対する療法、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法とＣＡＲ－ＮＫ細胞療法から選択される。例えば、前記免疫チェックポイント分子はＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＯＸ４０、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴとＣＤ１０３から選択されてもよい。
ある特定の実施様態において、前記化学療法はエピルビシン、オキサリプラチンと５－フルオロウラシルを含む併用化学療法から選択される。
ある局面において、本発明は、本発明の抗体又はその抗原結合断片、コンジュゲート又は組成物が被験者のＣＬＤＮ１８．２の発現に関連する疾患の治療における用途に関する。他の局面において、本発明は本発明の抗体又はその抗原結合断片、コンジュゲート又は組成物が被験者のＣＬＤＮ１８．２の発現に関連する疾患を治療するための薬物の製作における用途に関する。
前記用途のある特定の実施様態において、前記疾患は癌であり、例えば、上記のような種類の癌である。好ましい実施様態において、前記癌は胃癌、胆管癌、食道癌と膵臓癌から選択される。
前記用途のある特定の実施様態において、前記被験者は人である。
他の局面において、本発明は核酸分子に関し、前記核酸分子は配列番号２、７、１２、１７、２２、２７、３２、３７、４２、４７、５６及び６１から選択されるヌクレオチド配列を有する。本発明は前記核酸分子を含むベクターにも関する。
本開示は、例えば、以下に関する。
［１］
ＣＬＤＮ１８．２に結合する抗体又はその抗原結合断片であり、前記抗体は以下の重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲＨ）と軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲＬ）を有する、抗体又はその抗原結合断片；
ａ．配列番号１に示す重鎖可変領域（ＶＨ）におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２とＣＤＲＨ３；及び配列番号６に示す軽鎖可変領域（ＶＬ）におけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２とＣＤＲＬ３：
ｂ．配列番号１１に示すＶＨにおけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２とＣＤＲＨ３；及び配列番号１６に示すＶＬにおけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２とＣＤＲＬ３；
ｃ．配列番号２１に示すＶＨにおけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２とＣＤＲＨ３；及び配列番号２６に示すＶＬにおけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２とＣＤＲＬ３；
ｄ．配列番号３１に示すＶＨにおけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２とＣＤＲＨ３；及び配列番号３６に示すＶＬにおけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２とＣＤＲＬ３；
ｅ．配列番号４１に示すＶＨにおけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２とＣＤＲＨ３；及び配列番号４６に示すＶＬにおけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２とＣＤＲＬ３；又は
ｆ．配列番号５５に示すＶＨにおけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２とＣＤＲＨ３；及び配列番号６０に示すＶＬにおけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２とＣＤＲＬ３。
［２］
前記抗体は以下のＣＤＲＨとＣＤＲＬを有する、前記［１］に記載の抗体又はその抗原結合断片：
ａ．配列番号３－５に示すＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２とＣＤＲＨ３；及び配列番号８－１０に示すＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２とＣＤＲＬ３；
ｂ．配列番号１３－１５に示すＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２とＣＤＲＨ３；及び配列番号１８－２０に示すＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２とＣＤＲＬ３；
ｃ．配列番号２３－２５に示すＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２とＣＤＲＨ３；及び配列番号２８－３０に示すＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２とＣＤＲＬ３；
ｄ．配列番号３３－３５に示すＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２とＣＤＲＨ３；及び配列番号３８－４０に示すＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２とＣＤＲＬ３；
ｅ．配列番号４３－４５に示すＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２とＣＤＲＨ３；及び配列番号４８－５０に示すＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２とＣＤＲＬ３；
ｆ．配列番号５７－５９に示すＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２とＣＤＲＨ３；及び配列番号６２－６４に示すＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２とＣＤＲＬ３。
［３］
前記抗体は以下のＶＨとＶＬを有する、前記［１］又は[２]に記載の抗体又はその抗原結合断片：
ａ．配列番号１のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号６のアミノ酸配列を含むＶＬ；
ｂ．配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号１６のアミノ酸配列を含むＶＬ；
ｃ．配列番号２１のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号２６のアミノ酸配列を含むＶＬ；
ｄ．配列番号３１のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号３６のアミノ酸配列を含むＶＬ；
ｅ．配列番号４１のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４６のアミノ酸配列を含むＶＬ；
ｆ．配列番号５５のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号６０のアミノ酸配列を含むＶＬ。
［４］
前記抗体はＦｃ領域を有する、前記［１］－［３］のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
［５］
Ｅｕナンバリングシステムでナンバリングする場合、前記抗体はＡｓｎ２９７において糖鎖構造修飾を有する、前記［４］に記載の抗体又はその抗原結合断片。
［６］
前記糖鎖構造において、フコースの糖鎖構造を有する比例が５０％又はそれ以下である、前記［５］に記載の抗体又はその抗原結合断片。
［７］
前記糖鎖構造において、フコースの糖鎖構造を有する比例が３０％又はそれ以下、例えば２０％又はそれ以下、１０％又はそれ以下、５％又はそれ以下、２％又はそれ以下、又は１％又はそれ以下である、前記［６］に記載の抗体又はその抗原結合断片。
［８］
前記抗体において、フコースの糖鎖構造を有する比例が０％－１％である、前記［６］に記載の抗体又はその抗原能結合断片。
［９］
前記抗体はＦｕｔ８遺伝子ノックアウト細胞によって生成される、前記［６］－［８］のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
［１０］
前記細胞はＣＨＯ細胞とＨＥＫ２９３細胞から選択される、前記［９］に記載の抗体又はその抗原結合断片。
［１１］
Ｆｕｔ８遺伝子ノックアウトを有しない細胞において生成した抗体と比べ、前記抗体がより高いＦｃγＲＩＩＩａ結合活性を有する、前記［９］又は[１０]に記載の抗体又はその抗原結合断片。
［１２］
Ｆｕｔ８遺伝子ノックアウトを有しない細胞において生成した抗体と比べ、前記抗体がより高いＡＤＣＣ活性を有する、前記［９］－［１１］のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
［１３］
前記抗体はモノクローナル抗体である、前記［１］－［１２］のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
［１４］
前記抗体は二重特異性抗体又は多重特異性抗体である、前記［１］－［１２］のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
［１５］
前記抗体はＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥとＩｇＤのアイソタイプから選択される、前記［１］－［１４］のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
［１６］
前記抗体はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３とＩｇＧ４のサブタイプから選択される、前記［１］－［１４］のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
［１７］
前記抗原結合断片はＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’） ２ 断片、Ｆｄ断片、Ｆｄ’断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ断片、ｄｓ－ｓｃＦｖ断片、ｄＡｂ断片、一本鎖断片、二価抗体及び線状抗体から選択される、前記［１］－［１６］のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
［１８］
前記［１］－［１７］のいずれか一項の抗体又はその抗原結合断片をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
［１９］
前記［１８］に記載の核酸分子を含む、ベクター。
［２０］
前記［１８］に記載の核酸分子又は前記［１９］に記載のベクターを含む、宿主細胞。
［２１］
治療剤、診断剤又は顕像剤とコンジュゲート化する前記［１］－［１７］のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を含む、コンジュゲート。
［２２］
前記［１］－［１７］のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片又は前記［２１］に記載のコンジュゲート、及び、一種又は多種の薬学的に許容されるベクター、賦形剤及び／又は希釈剤を含む、組成物。
［２３］
前記組成物は一種又は多種の他の治療剤をさらに含む、前記［２２］に記載の組成物。
［２４］
前記治療剤は抗体、化学療法の薬物と小分子薬物から選択される、前記［２３］に記載の組成物。
［２５］
前記化学療法の薬物はエピルビシン（Ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）、オキサリプラチン（Ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）及び５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）から選択される一種又は多種である、前記［２４］に記載の組成物。
［２６］
被験者に対して、前記［１］－［１７］のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片、前記［２１］に記載のコンジュゲート、又は前記［２２］－［２５］のいずれか一項に記載の組成物を投与するステップを含む、被験者のＣＬＤＮ１８．２の発現に関連する疾患を治療する方法。
［２７］
前記疾患は癌である、前記［２６］に記載の方法。
［２８］
前記癌は胃癌、胆管癌、食道癌及び膵臓癌から選択される、前記［２７］に記載の方法。［２９］
前記被験者に対して、一種又は多種の他の療法を実施するステップをさらに含む、前記［２６］－［２８］のいずれか一項に記載の方法。
［３０］
前記他の療法は化学療法、放射療法、免疫療法及び手術治療から選択される、前記［２９］に記載の方法。
［３１］
前記免疫療法は免疫チェックポイント分子に対する療法、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法及びＣＡＲ－ＮＫ細胞療法から選択される、前記［３０］に記載の方法。
［３２］
前記化学療法はエピルビシン、オキサリプラチン及び５－フルオロウラシルを含む併用化学療法から選択される、前記［３０］に記載の方法。
［３３］
前記［１］－［１７］のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片、前記［２１］に記載のコンジュゲート、又は前記［２２］－［２５］のいずれか一項に記載の組成物の、被験者のＣＬＤＮ１８．２の発現に関連する疾患の治療における用途。
［３４］
前記［１］－［１７］のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片、前記［２１］に記載のコンジュゲート、又は前記［２２］－［２５］のいずれか一項に記載の組成物の、被験者のＣＬＤＮ１８．２の発現に関連する疾患を治療するための薬物の製作における用途。
［３５］
前記疾患は癌である、前記［３３］又は[３４]に記載の用途。
［３６］
前記癌は胃癌、胆管癌、食道癌と膵臓癌から選択される、前記［３５］に記載の用途。
［３７］
配列番号１、６、１１、１６、２１、２６、３１、３６、４１、４６、５５及び６０から選択されるアミノ酸配列を有する、ポリペプチド。
［３８］
配列番号２、７、１２、１７、２２、２７、３２、３７、４２、４７、５６及び６１から選択されるヌクレオチド配列を有する、核酸分子。
［３９］
前記［３８］に記載の核酸分子を含む、ベクター。


他の局面において、本発明は核酸分子に関し、前記核酸分子は配列番号２、７、１２、１７、２２、２７、３２、３７、４２、４７、５６及び６１から選択されるヌクレオチド配列を有する。本発明は前記核酸分子を含むベクターにも関する。
以下は、具体的な実施例を参考しながら、本発明をより詳しく説明する。本発明の利点及び特徴は、説明により一段明確になる。しかしこれらの実施形態は単なる例示であり、本発明の範囲に対する一切の限定効果を持たない。当業者が理解すべきのは、本発明の趣旨や範囲から逸脱しない限り、本発明の技術方案の細部や形式に改変や置換を加わってもよいが、これらの改変や置換はすべて本発明の保護範囲にある。
天然ファージライブラリーの構築
抗体薬物の開発は現在、主にその他物種由来の抗体をヒト化させること、又は遺伝子改変動物及び体外スクリーニング技術で完全ヒト抗体をスクリーニングすることにより実現し、これは抗体が人体における免疫原性をより低下させ、対応する副作用を軽減し、同時に成薬性を向上させているので、抗体薬物の発展重要方向の一つである。
体外スクリーニング技術において、ファージディスプレイ抗体ライブラリー技術は完全ヒト抗体を得る主要手段の一つ。ファージディスプレイ技術（ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）は、分子生物学手段を利用し、将外因性遺伝子断片をファージ特定タンパク質、例えば、ｇＩＩＩの遺伝子に挿入し、ファージを外因性遺伝子がコードするタンパク質又はポリペプチドを発現させることで、組換え融合タンパク質を相対的な空間構造と生物学活性が維持されるままでファージの表面に展示させる。構築した多様なファージライブラリーを標的タンパク質と共にインキュベートし、バイオパニングで非標的タンパク質結合型ファージ株を除去する。ファージライブラリー容量が十分に大きい場合、複数回の収集、増幅及び濃縮で高親和力、高特異性を持つファージクローン株を獲得し、遺伝子シーケンシングでこれらのファージクローンがコードするタンパク質配列を鑑定することで、次の研究に使用することが可能である。
ファージ抗体ライブラリーは、抗体遺伝子がファージディスプレイされた後に形成した多様なファージライブラリー。ファージ抗体ライブラリーの品質は、主にライブラリー容量及び多様性によって決定される。高親和力な抗体を獲得するために、ファージ抗体ライブラリーは、多様性が確保される前提で、ライブラリー容量をできるだけ増大させる必要がある。ファージ表面にディスプレイされる抗体断片の数はライブラリー容量の大きさを代表し、ディスプレイの断片の多様性は抗体ライブラリーの多様性を代表する。理論的に言えば、ファージ抗体ライブラリーのライブラリー容量が大きいほど、スクリーニングで得た抗体の親和力が高くなる。
本実施例において、個体差異による抗体ライブラリーの偏りを避け、同時にライブラリーの多様性をできるだけ保証するために、合計で１２０個の成年健常個体の末梢血と脾臓、並びに新生児臍帯血由来の単核細胞の総ＲＮＡを獲得、収集並びに抽出した。前記ＲＮＡを逆転写させ、一本鎖ｃＤＮＡを合成し、そして抗体の異なるサブグループに対する可変領域プライマーでＶＨ、ＶκとＶλ遺伝子をそれぞれ増幅させる。増幅した産物を一定の割合で混合した後、それぞれ重鎖と軽鎖遺伝子をＰＣＲ法で連結して一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）とし、二重酵素消化法でファージプラスミド中にクローンする。エレクトロポレーションにより、ｓｃＦｖ遺伝子を搭載するファージプラスミドでＳＳ３２０大腸菌コンピテントセルを形質転換する。ＳＳ３２０が対数期まで増殖した後、ヘルパーファージを入れて感染する。
最終的に、ライブラリー容量が１．２×１０１２であり、陽性率が８８％である天然抗体ファージ抗体ライブラリーを獲得した。ランダムにクローンを選定し、シーケンシングすることで、当該抗体ライブラリー遺伝子ファミリーが自然の分布に近いことがわかり、ＣＤＲ３領域のアミノ酸数が３－２０分布であった。シーケンシングにおいて、抗体の反復配列が発現されず、且つ８８％の遺伝子配列は正確のリーディングフレームを有する。前記結果は、当該ファージ抗体ライブラリーの多様性が良好で、有効ライブラリー容量率が高いことを示した。
ＣＬＤＮ１８．２安定発現細胞株の製作
本実施例において、細胞によるファージディスプレイスクリーニングに使用するために、ＣＬＤＮ１８．２を安定発現するＣＨＯ細胞株（ＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２）を製作した。その具体的な実験過程は次のとおりである：ヒトＣＬＤＮ１８．２のｃＤＮＡ配列をｐＣＤＨレンチウイルスベクター中にクローンし、その後レンチウイルスパッケージングベクターと共に２９３ｔ細胞にトランスフェクションする。４８又は７２時間培養後、レンチウイルス粒子を多く含む細胞上清を収集し、そのままＣＨＯ細胞、ＣＴ２６細胞又はＳＮＵ６０１細胞を感染する。レンチウイルス感染後の細胞をピューロマイシンでスクリーニング培養をし、２－３周後にＣＬＤＮ１８．２特異性抗体（ＩＭＡＢ３６２、Ｇａｎｙｍｅｄ）によるフローサイトメトリーで細胞のＣＬＤＮ１８．２発現を検出し、その結果を図１に示す。
前記結果から分かるように、レンチウイルストランスフェクション及びピューロマイシンスクリーニングによって、ＣＬＤＮ１８．２安定発現ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２細胞系と命名された）、ＣＴ２６細胞（ＣＴ２６－ＣＬＤＮ１８．２）及びＳＮＵ６０１細胞（ＳＮＵ６０１－ＣＬＤＮ１８．２）を獲得した。
抗体ファージディスプレイライブラリーから抗ＣＬＤＮ１８．２抗体をスクリーニングする
ＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２安定発現細胞株を利用し、ファージディスプレイライブラリーの選択を三回行った。実験手順は主に以下の文献を参考した：Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｕｓｉｎｇ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ Ｊｏｎｅｓ ＭＬ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２０１６。
具体的な手順は以下の通りである：ファージライブラリーをＣＨＯ－Ｋ１細胞とインキュベートし、遠心して上清液を回収する。前記上清液をＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２細胞とインキュベートし、ＣＬＤＮ１８．２に対する特異性を有するファージを細胞と結合させる。遠心して細胞ペレットを収集し、細胞を洗浄、収集する。その後７５ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液で細胞と結合したファージライブラリーを溶出させた。ファージライブラリーを中和した後、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージでスクリーニング後のファージライブラリーを１００倍増幅させ、その後に一次スクリーニングを類似する方法で二次と三次スクリーニングを行う。ファージの濃縮状況は、毎回スクリーニングの初期ファージ用量とスクリーニング後に収集したファージ価でモニターし、ファージライブラリーとＣＨＯ又はＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２安定発現細胞株でフローサイトメトリーを行うことにより検出する。図２に示す結果のように、二次濃縮スクリーニングから、ファージディスプレイライブラリーは、ＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２と特異的に結合することができ、その結合強さがスクリーニング回数の増えに連れて強化される。
三回のスクリーニング後に濃縮のファージライブラリーを得た。当該ライブラリーで細菌を感染した後、アガロースプレートに広げて培養した。モノクローナル菌落を選び、９６ウェルのディープウェルプレートに入れて、アンピシリンとカナマイシンを含有する２ＹＴ培地を使って、３７℃で振とう培養し、モノクローナルファージを含有する上清を得た。モノクローナルファージ上清をＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２細胞又はＣＴ２６－ＣＬＤＮ１８．２細胞と４℃で１時間インキュベートし、その後１ｍＭ ＥＤＴＡと０．５％ ＢＳＡを含有するＰＢＳ（フローサイトメトリーバッファー）で洗浄した。ＰＥ標識抗Ｍ１３抗体（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入）を入れ、４℃で３０分インキュベートした。その後、フローサイトメトリーでファージと細胞の結合を検出し、その結果を図３に示す。
前記結果から分かるように、スクリーニングで得たモノクローナルファージＡ１－Ａ６はいずれもＣＨＯ－ＣＬＤＮ１８．２細胞とよく結合し、同時にＣＨＯコントロール細胞とは結合しない。
組換え抗体の製作
モノクローナルファージの重鎖と軽鎖可変領域のｃＤＮＡ配列をすでに抗体定常領域を含有するｐｃＤＮＡ３．４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にそれぞれクローンし、合計６種類のモノクローナル抗体の重鎖と軽鎖発現プラスミドを獲得した。ＰＥＩ法でプラスミドをＥＸＰＩ－２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にトランスフェクションし、７－１０日一過性トランスフェクションし、遠心して上清液を回収した。上清液をｐｒｏｔｅｉｎ Ａで精製し、精製した抗体を得た。前記６種類のモノクローナル抗体をそれぞれ１８．２－Ａ１（Ａ１）、１８．２－Ａ２（Ａ２）、１８．２－Ａ３（Ａ３）、１８．２－Ａ４（Ａ４）、１８．２－Ａ５（Ａ５）と１８．２－Ａ６（Ａ６）に命名した。これらの抗体の重鎖と軽鎖可変領域のアミノ酸配列並びにコードする配列は以下の表１と表２に示す。Ｋａｂａｔ ＣＤＲシステムで確定した抗体のＣＤＲ配列は表３に示す。組換え抗体の重鎖と軽鎖定常領域配列は表４に示す。
Figure 0007440122000001
Figure 0007440122000002
Figure 0007440122000003
Figure 0007440122000004
Figure 0007440122000005
Figure 0007440122000006
Figure 0007440122000007
Figure 0007440122000008
Figure 0007440122000009
組換えモノクローナル抗体の結合活性の検出
組換えモノクローナル抗体のＣＬＤＮ１８．２に対する結合活性を検出した。具体的には、成長が良好なＣＴ２６－ＣＬＤＮ１８．２安定発現細胞株を取る。細胞をＰＢＳで洗浄した後、倍数で希釈した抗体と混合し、４℃で１時間インキュベートした。細胞をフローサイトメトリーバッファーで一回洗浄し、ＰＥ標識抗ヒトＩｇＧ抗体を入れ、４℃で３０分インキュベートした。遠心して上清を取り除き、フローサイトメトリーバッファーで洗浄した後、フローサイトメーターで細胞表面の蛍光強度を検出した。平均蛍光強度で各種抗体の相対結合活性を計算した。
１８．２－Ａ１（Ａ１）、１８．２－Ａ２（Ａ２）、１８．２－Ａ３（Ａ３）、１８．２－Ａ４（Ａ４） １８．２－Ａ５（Ａ５）と１８．２－Ａ６（Ａ６）抗体はいずれもコントロールであるＣＴ２６細胞株と結合しない（結果は示していない）が、図４に示すように、ＣＬＤＮ１８．２発現ＣＴ２６細胞株とよく結合する。抗体の希釈に連れて、ＣＴ２６－ＣＬＤＮ１８．２の平均蛍光強度徐々に弱くなる。また、図４は前記ＣＬＤＮ１８．２抗体の相対結合活性（ＥＣ５０）をも示した。
組換え抗体の結合特異性の検出
ヒトＣｌａｕｄｉｎ１８タンパク質には二つアイソフォーム、即ちＣＬＤＮ１８．１とＣＬＤＮ１８．２があり、この二つアイソフォームはエクソン１以外の他のエクソンを共有し、且つＣＬＤＮ１８．１とＣＬＤＮ１８．２のエクソン１配列は極めて似ていて、そのなか、第一の細胞外ドメインにおいて、異なるアミノ酸が僅か８つしか存在しない。ＣＬＤＮ１８．１とＣＬＤＮ１８．２エクソン１は、それぞれ異なるプロモーターの制御下で、特異的に異なる組織に発現する。そのなか、ＣＬＤＮ１８．１は肺上皮細胞に特異的に発現し、ＣＬＤＮ１８．２ は胃上皮細胞に特異的に発現する。スクリーニングされたＣＬＤＮ１８．２抗体の特異性を鑑定するために、抗体とＣＬＤＮ１８．１及びＣＬＤＮ１８．２の結合を検出した。
具体的に、成長が良好な２９３ｔ細胞を取り、ｆｌａｇタグで標識したＣＬＤＮ１８．１（ＣＬＤＮ１８．１－Ｆｌａｇ）又はＣＬＤＮ１８．２（ＣＬＤＮ１８．２－Ｆｌａｇ）を一時発現させる。トランスフェクション後４８時間に、トリプシンで細胞を消化する。フローサイトメトリーバッファーで洗浄した後、２００μｌフローサイトメトリーバッファーにおいて、細胞を１０μｇ／ｍｌのアイソタイプコントロール抗体又は前記５株のＣＬＤＮ１８．２抗体と混合し、４℃で１時間インキュベートする。その後、細胞をフローサイトメトリーバッファーで一回洗浄し、ＰＥ標識抗ヒトＩｇＧ抗体を入れ、４℃で３０分インキュベートする。遠心して上清を取り除き、フローサイトメトリーバッファーで二回洗浄し、１％ポリホルムアルデヒドと０．５％ ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００を含有する固定液において細胞を固定し、細胞膜に透過処理する。その後、ＡＰＣ標識抗ｆｌａｇ抗体を使って、細胞と３０分インキュベートし、フローサイトメーターで検出を行う。
結果は図５に示すように、ＣＬＤＮ１８．１－ｆｌａｇ又はＣＬＤＮ１８．２－ｆｌａｇを外因性発現する２９３ｔ細胞のすべてにおいて、ｆｌａｇ陽性細胞群が検出され、これはトランスフェクションされたＣＬＤＮ１８．１又はＣＬＤＮ１８．２タンパク質は細胞において正常に発現されたことを示し、発現陽性率は２０％程度である。ＣＬＤＮ１８．２抗体１８．２－Ａ１、１８．２－Ａ２、１８．２－Ａ３、１８．２－Ａ４、１８．２－Ａ５と１８．２－Ａ６はいずれもＣＬＤＮ１８．２－ｆｌａｇトランスフェクションの陽性２９３ｔ細胞とよく結合することができるが、６株の抗体はいずれもＣＬＤＮ１８．１陽性細胞と結合しない。前記結果から分かるように、この６株のＣＬＤＮ１８．２抗体はいずれもＣＬＤＮ１８．２と特異的に結合し、ＣＬＤＮ１８．１とは結合しない。
ＣＬＤＮ１８．２抗体が細胞に結合した後にエンドサイトーシスされることの検出
すでに報告されたように、一部の抗体は細胞表面の抗原に結合した後、抗原と抗体の復合物のエンドサイトーシスを引き起こすことができ、これにより細胞表面抗原の発現レベルを低下させ、抗体が体内における代謝を加速させる（Ｓｃｈｒａｍａ Ｄ ｅｔ ａｌ．２００６、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ）。本実施例では、ＣＬＤＮ１８．２安定発現ＳＮＵ６０１細胞において、抗体１８．２－Ａ１、１８．２－Ａ３、１８．２－Ａ４及び１８．２－Ａ６の細胞にエンドサイトーシスされる能力を検出した。具体的に、濃度が１０μｇ／ｍｌであるＣＬＤＮ１８．２抗体１８．２－Ａ１、１８．２－Ａ３、１８．２－Ａ４、１８．２－Ａ６又はＩＭＡＢ３６２抗体（例えば、実施例２に記載）、空白コントロール（ＰＢＳ）及びアイソタイプコントロール（ＩＳＯ）をそれぞれ細胞と４℃で又は３７℃で４時間インキュベートした。その後、４℃で洗浄を行い、ＰＥ標識抗ヒトＩｇＧ抗体で染色をした。４％ホルマリンによる固定後、フローサイトメーターで細胞表面の抗体結合を検出した。
図６に示した結果のように、４℃でインキュベートする条件下で、ＩＭＡＢ３６２抗体、１８．２－Ａ１、１８．２－Ａ３、１８．２－Ａ４及び１８．２－Ａ６抗体はいずれもＣＬＤＮ１８．２発現ＳＮＵ６０１細胞とよく結合することができる。しかし３７℃でインキュベートする条件下で、ＩＭＡＢ３６２抗体は細胞にエンドサイトーシスされ、細胞表面の抗体染色が明らかに低下した；１８．２－Ａ１、１８．２－Ａ３、１８．２－Ａ４と１８．２－Ａ６抗体には著しいエンドサイトーシス現象がなく、３７℃条件下であっても細胞とよく結合することができる。
前記結果から分かるように、ＩＭＡＢ３６２抗体は細胞のエンドサイトーシス作用を引き起し、これによりＣＬＤＮ１８．２抗原の細胞表面における発現レベルをダウンレギュレートする可能性がある。体内において、エンドサイトーシス作用は抗体代謝の改変をも引き起し、抗体が体内におけるクリアランス速度を加速させることもできる。反面、本発明のＣＬＤＮ１８．２抗体は明らかな細胞エンドサイトーシス作用を引き起こさず、よって細胞表面の標的抗原ＣＬＤＮ１８．２のレベルをダウンレギュレートせず、抗体が体内における代謝にも影響しない。
脱フコシル化抗体の製作と精製
さらにＣＬＤＮ１８．２抗体の脱フコシル化形態を製作した。具体的に、抗体の重鎖と軽鎖をコードする配列を安定発現できる哺乳動物ＧＳ発現ベクター中にクローンした。重鎖と軽鎖をコードする配列はすべてＣＭＶプロモーターに制御される。発現ベクターを無血清及び懸濁培養で家畜化されたＣＨＯ－Ｋ１細胞とＦｕｔ８遺伝子がノックアウトされた家畜化ＣＨＯ－Ｋ１細胞株にトランスフェクションした。ＭＳＸスクリーニングで安定発現細胞株を選択した。安定発現細胞株を得た後、振とうフラスコで１２－１４日培養し、期間内に必要に応じてサプリメント培地を補充した。
その後、培養上清を回収し、ろ過した後、ｐｒｏｔｅｉｎ Ａクロマトグラフィーカラムで発現した抗体を捕獲した。抗体を溶出させた後、ＰＢＳで透析し、精製した抗体を得た。そのなか、Ｆｕｔ８遺伝子ノックアウトＣＨＯ－Ｋ１細胞株において発現した１８．２－Ａ１、１８．２－Ａ２、１８．２－Ａ３、１８．２－Ａ４、１８．２－Ａ５と１８．２－Ａ６抗体は、それぞれ１８．２－Ａ１Ｆ、１８．２－Ａ２Ｆ、１８．２－Ａ１Ｆ、１８．２－Ａ４Ｆ、１８．２－Ａ５Ｆと１８．２－Ａ６Ｆに命名された。
脱フコシル化抗体の糖鎖化修飾の特性評価
その後、Ｆｕｔ８遺伝子ノックアウトＣＨＯ－Ｋ１細胞株に発現した脱フコシル化抗体とＣＨＯ－Ｋ１細胞に生成した通常抗体の糖鎖化修飾を分析した。１００μｇの抗体をトリプシンとグリコシルペプチダーゼで分解した後に精製して抗体の糖鎖を獲得し、その後蛍光タンデム質量分析を行った。各種糖鎖の鑑定はその質量電荷比ｍ／ｚによるものであり、蛍光により検出した面積百分比で糖鎖百分比を計算した。
Figure 0007440122000010
糖鎖命名：

Figure 0007440122000011
Ｎ－アセチルノイラミン酸
Figure 0007440122000012
Ｎ－アセチルガラクトサミン
Figure 0007440122000013
フコース
Figure 0007440122000014
マンノース
Figure 0007440122000015
ガラクトース
Figure 0007440122000016
Ｎ－グリコリルノイラミン酸
糖鎖番号の定義：５つの数字は、それぞれ異なる糖の数を表現する：ヘキソース（ガラクトース、マンノース、あるいはグルコース）、Ｎ－アセチルヘキソサミン（ＧｌｃＮＡあるいはＧａｌＮＡｃ）、フコース（Ｆｕｃｏｓｅ、ＦＵＣと略称する）、Ｎ－アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）、及びＮ－グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）。そのなかで３番目の数字はフコースの数を示す。例えば、以下表４に示す：
Figure 0007440122000017
ＣＨＯ－Ｋ１細胞において生成したＣｌａｕｄｉｎ１８．２－Ａ１抗体の糖鎖分析結果は以下の表５に示す。
Figure 0007440122000018
Ｆｕｔ８遺伝子ノックアウトＣＨＯ－Ｋ１細胞において生成した三つのバッチの脱フコシル化Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体（１８．２－Ａ１及び１８．２－Ａ４）の糖鎖分析結果は表６に示す。
Figure 0007440122000019
以上の結果は、ＣＨＯ－Ｋ１細胞に生成した通常Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体の糖鎖構造における９１．０％がフコースを含むことを示した。一方、Ｆｕｔ８遺伝子ノックアウトＣＨＯ－Ｋ１細胞に生成した三つのバッチの脱フコシル化Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体の糖鎖において、基本的に検出可能なフコースを含有しない。
脱フコシル化抗体の結合活性の検出
フローサイトメトリーにより、１８．２－Ａ１、１８．２－Ａ３及び１８．２－Ａ４とＣＬＤＮ１８．２との結合活性と比べての、脱フコシル化抗体１８．２－Ａ１Ｆ、１８．２－Ａ３Ｆ及び１８．２－Ａ４ＦとＣＬＤＮ１８．２との結合活性を検出し、その検出方法は実施例５に記載したものと同じであり、実験結果は図７に示す。
当該結果から分かるように、脱フコシル化したＣＬＤＮ１８．２抗体は通常抗体と比べて、ＣＬＤＮ１８．２に対する生物学的結合活性に著しい差がなかった。
ＣＬＤＮ１８．２抗体及びその脱フコシル化形態とＦｃγＲＩＩＩａとの結合活性の検出
その後、Ｂｉａｃｏｒｅ方法でＣＬＤＮ１８．２抗体及びその脱フコシル化形態とＦｃγＲＩＩＩａとの結合活性を検出した。具体的に、ＦｃγＲＩＩＩａ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ、１０３８９－Ｈ０８Ｃ１）をＨＢＳ－ＥＰバッファーで０．１μｇ／ｍｌに希釈し、配体とする。そして１８．２－Ａ１Ｆと１８．２－Ａ１の抗体サンプルをそれぞれ３６０μｇ／ｍｌ、１２０μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、１３．３μｇ／ｍｌ及び４．４μｇ／ｍｌに希釈して、分析物とする。間接的な捕獲の方法で配体ＦｃγＲＩＩＩａを固定し、まず５０μｇ／ｍｌのＡｎｔｉ－Ｈｉｓ ＩｇＧを使い、アミノカップリングでＣＭ５チップの表面に共有結合し、その後に配体及び分析物に結合する。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｗｉｚａｒｄモードで複数循環方式を使い、ＦｃγＲＩＩＩａを配体とし、１８．２－Ａ１Ｆと１８．２－Ａ１の抗体サンプルを分析物とし、親和力分析実験を行った。
各サンプルのテストは３つのＳｔａｒｔ ｕｐ、１つの濃度０のコントロール、５つの勾配濃度サンプル及び１つの繰り返しサンプル（参考品）を含む。各循環が終了後、１０ｍＭグリシン－ＨＣｌ、ｐＨ １．５再生液でチップを再生させる。分析物の各濃度循環の捕獲時間を６０ｓとし、配体溶液の流速が１０μｌ／ｍｉｎ；配体と分析物との結合時間が１８０ｓ、分析物溶液の流速が３０μｌ／ｍｉｎ；解離時間が１８０ｓである。Ａｎｔｉ－Ｈｉｓ ＩｇＧがカップリングしているＣＭ５チップをスロット内にセットし、検出分析を行った。生データをＢＩＡＣＯＲＥＴＭ Ｘ１００分析ソフトウェアに導入し、濃度０コントロールを差し引き、ボリューム効果を消除するために参照チャネルをも差し引き、親和力分析方法を使い、定常状態モードでグラフにフィッティングして、データを整理した。
図８の結果から分かるように、１８．２－Ａ１抗体及びその脱フコシル化形態１８．２－Ａ１Ｆは、いずれもＦｃγＲＩＩＩａと効果的に結合することができる。且つ、１８．２－Ａ１Ｆ抗体とＦｃγＲＩＩＩａとの結合のＫＤ値は明らかに１８．２－Ａ１抗体より低い。この結果から分かるように、脱フコシル化した１８．２－Ａ１Ｆ抗体とＦｃγＲＩＩＩａとの結合活性が著しく強化された。
ＣＬＤＮ１８．２抗体及びその脱フコシル化形態と細胞表面のＦｃγＲＩＩＩａとの結合活性の検出
次に、我々はさらにＣＬＤＮ１８．２抗体及びその脱フコシル化形態と細胞表面で発現したＦｃγＲＩＩＩａとの結合活性を検出した。具体的に、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ１５８、高ＦＣ結合サブタイプ）遺伝子をピューロマイシンスクリーニング標識を持つ哺乳動物細胞発現ベクターにクローンし、Ｊｕｒｋａｔ細胞株中にトランスフェクションした。ピューロマイシンでＦｃγＲＩＩＩａを安定発現する細胞株（ＦｃγＲＩＩＩａ－Ｊｕｒｋａｔ）をスクリーニングした。また、ＮＫ９２ＭＩはヒトＮＫ細胞株であり、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体（Ｆ１５８、低ＦＣ結合サブタイプ）を天然的に発現する。フローサイトメトリーでＣＬＤＮ１８．２抗体及びその脱フコシル化形態とＦｃγＲＩＩＩａ－ｊｕｒｋａｔ細胞及びＮＫ９２ＭＩ細胞表面で発現したＦｃγＲＩＩＩａとの結合能力を検出した。具体的なフローサイトメトリー検出方法は実施例６に記載したものを参照する。
フローサイトメトリーの検出結果は図９に示す。ＣＬＤＮ１８．２抗体１８．２－Ａ１及び１８．２－Ａ４及びそれらの脱フコシル化形態１８．２－Ａ１Ｆ及び１８．２－Ａ４Ｆは、いずれもＦｃγＲＩＩＩａ－ｊｕｒｋａｔ細胞と結合することができ、同時にトランスフェクションされていないＪｕｒｋａｔ細胞には結合しない（結果は示していない）。且つ、脱フコシル化した１８．２－Ａ１Ｆと１８．２－Ａ４Ｆ抗体は、ＦｃγＲＩＩＩａ－Ｊｕｒｋａｔ細胞並びにＮＫ９２ＭＩ細胞とより良く結合することができ、そのＥＣ５０がＣＬＤＮ１８．２抗体１８．２－Ａ１及び１８．２－Ａ４抗体と比べて明らかに低い。前記結果から分かるように、脱フコシル化したＣＬＤＮ１８．２抗体は、著しく向上されたＦｃ受容体ＦｃγＲＩＩＩａとの結合能力を有する。
ＣＬＤＮ１８．２抗体及びその脱フコシル化形態がＦｃγＲＩＩＩａ受容体を活性化させる
ＦｃγＲＩＩＩａ受容体は抗体ＦＣ領域と結合した後、エフェクター細胞内のＮＦ－ＡＴ転写因子通路を活性化させる。したがって、ＮＦ－ＡＴが媒介するレポーター遺伝子強度の検出はＦｃγＲＩＩＩａ受容体の活性化強度を反映することができる。本実施例において、ＮＦ－ＡＴ結合サイトを含有するプロモーターをルシフェラーゼレポーター遺伝子発現ベクターに挿入し、これをＪｕｒｋａｔ細胞株に安定的にトランスフェクションした。同時に、高ＦＣ結合のＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ１５８）もＪｕｒｋａｔ細胞に安定的にトランスフェクションし、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体の活性化強度を感知できる機能性細胞株（ＦｃγＲＩＩＩａ－Ｊｕｒｋａｔ）を構築した。
ＣＬＤＮ１８．２安定発現ＳＮＵ６０１胃癌細胞（ＳＮＵ６０１－ＣＬＤＮ１８．２）を取り、４ｘ１０５／ｍｌまで希釈し、ＦｃγＲＩＩＩａ－Ｊｕｒｋａｔ細胞と１：６の割合で混合させた。１００μｌの混合細胞を取り９６ウェルプレートに入れ、そして倍比希釈した抗体をそれぞれ入れて、３７℃で６時間静置培養した。その後、Ｏｎｅ－Ｇｌｏ試剤盒（ｐｒｏｍｅｇａ）でルシフェラーゼ活性を検出した。
結果は図１０に示す。ＣＨＯ－Ｋ１細胞に生成した１８．２－Ａ１及び１８．２－Ａ４抗体と比べ、Ｆｕｔ８遺伝子ノックアウトＣＨＯ細胞株に発現した脱フコシル化抗体１８．２－Ａ１Ｆ及び１８．２－Ａ４Ｆに誘導されたＦｃγＲＩＩＩａ受容体活性は著しく強化し、そのＥＣ５０値が約１０－２０倍に向上した。
化学療法薬ＥＯＦとの併用でＣＬＤＮ１８．２抗体に誘導されたＦｃγＲＩＩＩａ受容体活性化を強化させる
現在、ＥＯＦ（エピルビシン、Ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ；オキサリプラチン、Ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ；５－フルオロウラシル、５－ＦＵ）を含む併用化学療法は、胃癌の主な治療手段である。ＥＯＦ感受性細胞株はＥＯＦ処理後で、異なる程度の細胞分裂周期の遮断、増殖阻害及びアポトーシスが起こされる。
ＫＡＴＯＩＩＩ細胞はヒト胃上皮癌細胞株の一種であり、レベルの低いＣＬＤＮ１８．２を発現し、フローサイトメトリーでは僅か約５．２％の細胞が明らかな陽性を示した（図１１）。そのＣＬＤＮ１８．２発現レベルの低さによって、ＫＡＴＯＩＩＩ細胞及びＦｃγＲＩＩＩａ－Ｊｕｒｋａｔ細胞と共にインキュベートした、抗体に誘導されたＦｃγＲＩＩＩａ受容体活性化実験において（実験方法は実施例１３に記載した通り）、１８．２－Ａ１Ｆと１８．２－Ａ６Ｆ抗体はＦｃγＲＩＩＩａ受容体の活性化を引き起こさなかった（図１２Ａ）。
さらに、亞致死量のＥＯＦで（エピルビシン：３００ｎＭ；オキサリプラチン：１３０ｎＭ；５－フルオロウラシル：５６１．３ｎＭ）ＫＡＴＯＩＩＩ細胞を処理した４８時間後に、顕微鏡観察とフローサイトメトリー検出により、細胞体積の増大、形状が丸くなること、分裂期細胞の減少が観察された。これは細胞は分裂期にとどまったことを示す。しかし、細胞は依然として生存しており、明らかなアポトーシス現象が観察されなかった（結果は示していない）。ＥＯＦに処理されたＫＡＴＯＩＩＩ細胞をＦｃγＲＩＩＩａ－Ｊｕｒｋａｔ細胞、異なる濃度のＣＬＤＮ１８．２抗体と共にインキュベートした。結果から分かるように、アイソタイプコントロール（ＩＳＯ）と比べ、１８．２－Ａ１Ｆと１８．２－Ａ６Ｆ抗体はＦｃγＲＩＩＩａ受容体の活性化（図１２Ｂ）を著しく誘導することができる。
以上結果から分かるように、現在一般的に使用されている化学療法薬であるＥＯＦは胃癌細胞に対して成長抑制作用を持つ。ＥＯＦ処理はＣＬＤＮ１８．２抗体に誘導されたＦｃγＲＩＩＩａ受容体活性化を強化させることができる。理論に縛られなく、当該効果は化学療法薬の処理が細胞上の抗原発現をアップレギュレーションしたこと及び他のメカニズムによってＣＬＤＮ１８．２抗体のＡＤＣＣ効果を促進するためである可能性がある。
抗体がＣＬＤＮ１８．２発現腫瘍細胞に対する傷害
Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で健常人（ドナー１とドナー２）の末梢血白血球（ＰＢＭＣ）を分離して、３７℃で一晩中培養した。ＣＬＤＮ１８．２安定発現ＳＮＵ６０１胃癌細胞（ＳＮＵ６０１－ＣＬＤＮ１８．２）を取り１ｘ１０５／ｍｌに希釈し、ＰＢＭＣを５ｘ１０６／ｍｌに希釈して、両者を同じ体積で混合し、エフェクター細胞と標的細胞の比率が５０：１である。１００μｌ混合細胞を取り、９６ウェルプレートに入れ、そして倍比希釈した抗体をそれぞれ入れて、３７℃で２４時間静置培養した。その後、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）法（ｐｒｏｍｅｇａ）で細胞生存率を検出した。そのなか、マイクロプレートリーダーによりＯＤ４９０での吸光度を測定する。傷害率の計算方法は以下の通りである：
最小放出組：標的細胞を単独で培養する
最大放出組：標的細胞＋Ｌｙｓｉｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ
実験組：標的細胞＋エフェクター細胞＋ＣＬＤＮ１８．２抗体
コントロール組：標的細胞＋エフェクター細胞＋陰性コントロール抗体
傷害率（％）＝（実験組－最小放出組）／（最大放出組－最小放出組）％×１００％
結果は図１３に示す。陰性コントロール抗体が明らかな細胞傷害を示さなかったが（結果は示していない）、ＣＬＤＮ１８．２抗体１８．２－Ａ１及び脱フコシル化した抗体１８．２－Ａ１Ｆと１８．２－Ａ４ＦはいずれもＣＬＤＮ１８．２を発現する標的細胞の死亡を効果的に引き起すことができ、その最大傷害率は８０－９０％まで達した。また、脱フコシル化した抗体と通常抗体とを比較すると、脱フコシル化した抗体の標的細胞最大傷害率とＩＣ５０値はいずれも通常抗体より明らかに高いことが分かった。
ＣＬＤＮ１８．２抗体のＣＤＣ活性
ＣＬＤＮ１８．２安定発現ＨＥＬＡ細胞を取り、１％不活化補体を含有する血清を含む培地で再懸濁カウントし、細胞濃度を２ｘ１０５／ｍｌに調整した。細胞生存率が９０％を超えた。９６ウェルプレートにウェルあたり５０μｌの細胞を入れ、そして倍比希釈した抗体と５０μｌ希釈後のヒト血清をそれぞれ入れた。細胞を３７℃で２時間インキュベートした。その後、ＣＣＫ８法で細胞溶解率を測定した。細胞溶解率の計算方法は以下の通りである：
最小放出組：標的細胞
最大放出組：標的細胞＋Ｌｙｓｉｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ
実験組：標的細胞＋ＣＬＤＮ１８．２抗体＋補体
陰性コントロール組：標的細胞＋陰性コントロール抗体＋補体
傷害率（％）＝（実験組－最小放出組）／（最大放出組－最小放出組）×１００％
結果は図１４に示す。ＣＬＤＮ１８．２抗体１８．２－Ａ１と１８．２－Ａ４及びその脱フコシル化形態１８．２－Ａ１Ｆと１８．２－Ａ４Ｆはいずれも明らかなＣＤＣ活性を有し、標的細胞に対する最大傷害率は全部９５％を超えた。また、脱フコシル化形態の抗体が通常抗体と比べて、ＣＤＣ活性に著しい差がなかった。
ＣＬＤＮ１８．２抗体の体内腫瘍に対する傷害活性
ＮＰＧ免疫不全マウスに対して、ＳＮＵ６０１－ＣＬＤＮ１８．２細胞とＦｉｃｏｌｌで分離したヒトＰＢＭＣ細胞（ＳＮＵ６０１－ＣＬＤＮ１８．２細胞：ＰＢＭＣが１：０．８）を皮下接種することで、ＳＮＵ６０１細胞のマウス異種移植モデルを建築した。その後、ＳＮＵ６０１腫瘍細胞を接種したＮＰＧ免疫不全マウスに腹腔内注射で１０ｍｇ／ｋｇ又は５ｍｇ／ｋｇ用量の１８．２－Ａ１Ｆ抗体１８．２－Ａ１Ｆ、又は空白コントロール（ＰＢＳ）又はＩｇＧアイソタイプコントロール（ＩＳＯ）を注射した。各組ｎ＝マウス１５匹。腫瘍接種後に３日ごとに投薬して、マウス体内腫瘍の体積を測定した。
図１５に記載した結果から分かるように、ＰＢＳ組、ＩｇＧアイソタイプコントロール抗体組と比べ、５ｍｇ／ｋｇと１０ｍｇ／ｋｇ用量の１８．２－Ａ１Ｆ抗体処理組は、いずれも良好な腫瘍抑制効果を示し、且つ５ｍｇ／ｋｇと１０ｍｇ／ｋｇ組の間に明らかな効果の差が観察されなかった。
ＣＬＤＮ１８．２抗体と化学療法薬物との併用の体内腫瘍に対する傷害活性
実施例１４に記載した結果のように、体外でのＥＯＦ併用化学療法は、ＣＬＤＮ１８．２抗体に誘導されたＦｃγＲＩＩＩａ受容体活性化を向上させることができる。ＫＡＴＯＩＩＩは体外ＩＭＤＭ培地において培養する時、レベルの低いＣＬＤＮ１８．２を発現し、僅か約５．２％の細胞はフローサイトメトリー検出で明らかな陽性を示した（図１１）。フローサイトメトリーでソーティング後、ＣＬＤＮ１８．２高発現のＫＡＴＯＩＩＩ細胞（ＫＡＴＯＩＩＩ－１８．２Ｈｉｇｈ）を選択して、ＮＰＧ免疫不全マウスに接種し、異種移植モデル実験を行った（図１６）。
ＮＰＧ免疫不全マウスにＫＡＴＯＩＩＩ－１８．２Ｈｉｇｈ細胞とＦｉｃｏｌｌで分離したヒトＰＢＭＣ細胞（ＫＡＴＯＩＩＩ－１８．２Ｈｉｇｈ細胞：ＰＢＭＣが１：０．８）を皮下接種し、ＫＡＴＯＩＩＩ－１８．２Ｈｉｇｈ細胞の異種移植モデルを建築した。その後、ＫＡＴＯＩＩＩ－１８．２Ｈｉｇｈ腫瘍細胞を接種したＮＰＧ免疫不全マウスに腹腔内注射でアイソタイプコントロール抗体（ＩＳＯ）、ＥＯＦ（エピルビシン：１ｍｇ／ｋｇ；オキサリプラチン：３ｍｇ／ｋｇ；５－フルオロウラシル：３０ｍｇ／ｋｇ）、１０ｍｇ／ｋｇ用量の１８．２－Ａ１Ｆ抗体、又はＥＯＦ及び１８．２－Ａ１Ｆを注射した。各組ｎ＝マウス６匹。腫瘍接種後に３日ごとに投薬して、マウス体内腫瘍の体積を測定した。
図１７に記載した結果から分かるように、ＥＯＦ組及びコントロール抗体組と比べ、１８．２－Ａ１Ｆは腫瘍成長を効果的に抑制し、１８．２－Ａ１ＦとＥＯＦとの併用は腫瘍成長をさらに著しく低下させ、それと化学療法との併用が癌の臨床治療におけるポテンシャルを示した。

Claims (31)

  1. ＣＬＤＮ１８．２に結合する抗体又はその抗原結合断片であり、前記抗体は以下の重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲＨ）と軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲＬ）を有する、抗体又はその抗原結合断片：
    ａ．配列番号１に示す重鎖可変領域（ＶＨ）におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２とＣＤＲＨ３；及び配列番号６に示す軽鎖可変領域（ＶＬ）におけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２とＣＤＲＬ３；
    ｂ．配列番号２１に示すＶＨにおけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２とＣＤＲＨ３；及び配列番号２６に示すＶＬにおけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２とＣＤＲＬ３；
    ｃ．配列番号３１に示すＶＨにおけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２とＣＤＲＨ３；及び配列番号３６に示すＶＬにおけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２とＣＤＲＬ３；
    ｄ．配列番号４１に示すＶＨにおけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２とＣＤＲＨ３；及び配列番号４６に示すＶＬにおけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２とＣＤＲＬ３；又は
    ｅ．配列番号５５に示すＶＨにおけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２とＣＤＲＨ３；及び配列番号６０に示すＶＬにおけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２とＣＤＲＬ３。
  2. 前記抗体は以下のＣＤＲＨとＣＤＲＬを有する、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片：
    ａ．配列番号３－５に示すＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２とＣＤＲＨ３；及び配列番号８－１０に示すＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２とＣＤＲＬ３；
    ｂ．配列番号２３－２５に示すＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２とＣＤＲＨ３；及び配列番号２８－３０に示すＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２とＣＤＲＬ３；
    ｃ．配列番号３３－３５に示すＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２とＣＤＲＨ３；及び配列番号３８－４０に示すＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２とＣＤＲＬ３；
    ｄ．配列番号４３－４５に示すＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２とＣＤＲＨ３；及び配列番号４８－５０に示すＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２とＣＤＲＬ３；又は
    ｅ．配列番号５７－５９に示すＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２とＣＤＲＨ３；及び配列番号６２－６４に示すＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２とＣＤＲＬ３。
  3. 前記抗体は以下のＶＨとＶＬを有する、請求項１又は２に記載の抗体又はその抗原結合断片：
    ａ．配列番号１のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号６のアミノ酸配列を含むＶＬ；
    ｂ．配列番号２１のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号２６のアミノ酸配列を含むＶＬ；
    ｃ．配列番号３１のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号３６のアミノ酸配列を含むＶＬ；
    ｄ．配列番号４１のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４６のアミノ酸配列を含むＶＬ；又は
    ｅ．配列番号５５のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号６０のアミノ酸配列を含むＶＬ。
  4. 前記抗体はＦｃ領域を有する、請求項１－３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  5. Ｅｕナンバリングシステムでナンバリングする場合、前記抗体はＡｓｎ２９７において糖鎖構造修飾を有する、請求項４に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  6. 前記抗体はモノクローナル抗体である、請求項１－５のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  7. 前記抗体は二重特異性抗体又は多重特異性抗体である、請求項１－５のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  8. 前記抗体はＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥとＩｇＤのアイソタイプから選択される、請求項１－７のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  9. 前記抗体はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３とＩｇＧ４のサブタイプから選択される、請求項１－７のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  10. 前記抗原結合断片はＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｄ’断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ断片、ｄｓ－ｓｃＦｖ断片、ｄＡｂ断片、一本鎖断片、二価抗体及び線状抗体から選択される、請求項１－９のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  11. 請求項１－１０のいずれか一項の抗体又はその抗原結合断片をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
  12. 請求項１１に記載の核酸分子を含む、ベクター。
  13. 請求項１１に記載の核酸分子又は請求項１２に記載のベクターを含む、宿主細胞。
  14. 治療剤、診断剤又は顕像剤とコンジュゲート化する請求項１－１０のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を含む、コンジュゲート。
  15. 請求項１－１０のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片又は請求項１４に記載のコンジュゲート、及び、一種又は多種の薬学的に許容される担体、賦形剤及び／又は希釈剤を含む、組成物。
  16. Ｅｕナンバリングシステムでナンバリングする場合、前記抗体のＡｓｎ２９７における糖鎖構造において、フコースの糖鎖構造を有する割合が５０％又はそれ以下である、請求項１５に記載の組成物。
  17. 前記抗体の前記糖鎖構造において、フコースの糖鎖構造を有する割合が３０％又はそれ以下、例えば２０％又はそれ以下、１０％又はそれ以下、５％又はそれ以下、２％又はそれ以下、又は１％又はそれ以下である、請求項１６に記載の組成物。
  18. 前記抗体において、フコースの糖鎖構造を有する割合が０％－１％である、請求項１６に記載の組成物。
  19. 前記抗体はＦｕｔ８遺伝子ノックアウト細胞によって生成される、請求項１６－１８のいずれか一項に記載の組成物。
  20. 前記細胞はＣＨＯ細胞とＨＥＫ２９３細胞から選択される、請求項１９に記載の組成物。
  21. Ｆｕｔ８遺伝子ノックアウトを有しない細胞において生成した抗体と比べ、前記抗体がより高いＦｃγＲＩＩＩａ結合活性を有する、請求項１９又は２０に記載の組成物。
  22. Ｆｕｔ８遺伝子ノックアウトを有しない細胞において生成した抗体と比べ、前記抗体がより高いＡＤＣＣ活性を有する、請求項１９－２１のいずれか一項に記載の組成物。
  23. 前記組成物は一種又は多種の他の治療剤をさらに含む、請求項１５～２２のいずれかに記載の組成物。
  24. 前記治療剤は抗体、化学療法の薬物と小分子薬物から選択される、請求項２３に記載の組成物。
  25. 前記化学療法の薬物はエピルビシン（Ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）、オキサリプラチン（Ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）及び５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）から選択される一種又は多種である、請求項２４に記載の組成物。
  26. 患者のＣＬＤＮ１８．２の発現に関連する疾患を治療するための、請求項１５－２５のいずれか一項に記載の組成物。
  27. 前記疾患は癌である、請求項２６に記載の組成物。
  28. 前記癌は胃癌、胆管癌、食道癌と膵臓癌から選択される、請求項２７に記載の組成物。
  29. 一種又は多種の他の療法と併用して患者に投与することに利用される、請求項２６－２８のいずれか一項に記載の組成物。
  30. 前記他の療法は、化学療法、放射療法、免疫療法及び手術治療から選択される、請求項２９に記載の組成物。
  31. 前記免疫療法は、免疫チェックポイント分子に対する療法、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法及びＣＡＲ－ＮＫ細胞療法から選択される、請求項３０に記載の組成物。
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