CN116063504A - Cldn18.2抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

提供了结合CLDN18.2的抗体及其去岩藻糖化的形式。还提供了制备上述抗体的方法，包含抗体的缀合物和组合物，及其在治疗疾病例如癌症中的用途。

Description

CLDN18.2抗体及其用途
本申请是申请号为202080046257.4，优先权日为2019年07月12日，申请日为2020年7月10日，发明名称为“CLDN18.2抗体及其用途”的发明专利申请的分案申请。
本申请要求于2019年07月12日递交的申请号为CN 201910628018.9，发明名称为“CLDN18.2抗体及其用途”的中国专利申请的优先权，在此全文引用上述中国专利申请公开的内容以作为本申请的一部分。
技术领域
本公开涉及免疫治疗领域。具体而言，本公开涉及结合CLDN18.2的抗体及其去岩藻糖化的形式，及其在治疗疾病特别是癌症中的应用。
技术背景
包括胃癌及食道癌在内的上消化道肿瘤是一种全球常见，预后较差的恶性肿瘤。胃癌在中国尤其高发，全球有近42％的胃癌新发病例集中在中国。由于缺乏早期诊断，约80％胃癌患者发现时已是晚期。由于胃癌对常规化疗药物不够敏感，晚期胃癌的五年生存率极低，并已成为中国第三大致死的恶性肿瘤。因此，近年的研究致力于寻找胃癌特异性的靶向治疗。
封闭蛋白(Claudin)家族蛋白是广泛分布于上皮细胞中的紧密连接结构的主要组成部分。和其它封闭蛋白家族蛋白的结构类似，CLDN18.2是分子量约27.8kd，具有四个跨膜区的膜蛋白，且具有两个较短的胞外区EC1和EC2。与其它封闭蛋白家族蛋白不同的是，在正常组织中CLDN18.2非常特异地仅表达于胃部高度分化的上皮细胞中(Tureci O et al.,Gene,2011)。在来源于胃上皮细胞的肿瘤中，有很高比例的肿瘤细胞表面表达CLDN18.2。在胃癌细胞的淋巴结和其它组织转移肿瘤中，也可以检测到高水平的CLDN18.2表达(WollS.et al.,Int.J.Cancer,2013)。除胃癌外，也有很高比例的胆管癌、食道癌和胰腺癌等肿瘤细胞中表达CLDN18.2。作为特异性表面标志物，CLDN18.2成为癌症治疗的潜在靶点。研发针对CLDN18.2的高效抗体药物将为多种癌症的治疗提供可能，具有巨大的应用潜力和市场价值。
治疗性单克隆抗体杀伤肿瘤细胞的主要作用机制之一是ADCC效应(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，antibody dependent cell mediated cytotoxicity)。通过治疗性抗体的抗原识别段(Fab)与肿瘤细胞表面的特异性抗原结合后，利用抗体恒定区(Fc)与表达FC受体(FcγR)的效应细胞结合来激活效应细胞的细胞杀伤活性，从而分泌细胞毒性介质包括颗粒酶和穿孔素等，最终导致靶细胞(肿瘤细胞)的溶解破坏。抗体对抗原的结合力强弱，抗原表达丰度以及抗体FC区和效应细胞表面的FC受体的结合力强弱均可影响ADCC效应的强度，进而影响癌症的治疗效果(Jefferis and Lund,2002)。
发明概述
本公开提供了新的抗CLDN18.2的抗体。上述抗体能够以高亲和力和特异性结合CLDN18.2，并介导效应细胞对表达CLDN18.2的靶细胞(例如肿瘤细胞)的杀伤。此外，还生成了上述抗体的去岩藻糖化形式，其能够比普通抗体更好地结合FcγRIIa并诱导ADCC效应。
相应地，在一方面，本公开涉及一种结合CLDN18.2的抗体或其抗原结合片段，所述抗体具有以下重链CDR(CDRH)和轻链CDR(CDRL)：
a.如SEQ ID NO:1中所示的重链可变区(VH)中的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和如SEQID NO:6中所示的轻链可变区(VL)中的CDRL1、CDRL2和CDRL3；
b.如SEQ ID NO:11中所示的VH中的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和如SEQ ID NO:16中所示的VL中的CDRL1、CDRL2和CDRL3；
c.如SEQ ID NO:21中所示的VH中的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和如SEQ ID NO:26中所示的VL中的CDRL1、CDRL2和CDRL3；
d.如SEQ ID NO:31中所示的VH中的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和如SEQ ID NO:36中所示的VL中的CDRL1、CDRL2和CDRL3；
e.如SEQ ID NO:41中所示的VH中的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和如SEQ ID NO:46中所示的VL中的CDRL1、CDRL2和CDRL3；或
f.如SEQ ID NO:55中所示的VH中的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和如SEQ ID NO:60中所示的VL中的CDRL1、CDRL2和CDRL3。
在本公开的抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，所述抗体具有以下CDRH和CDRL：
a.如SEQ ID NO:3-5中所示的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和如SEQ ID NO:8-10中所示的CDRL1、CDRL2和CDRL3；
b.如SEQ ID NO:13-15中所示的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和如SEQ ID NO:18-20中所示的CDRL1、CDRL2和CDRL3；
c.如SEQ ID NO:23-25中所示的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和如SEQ ID NO:28-30中所示的CDRL1、CDRL2和CDRL3；
d.如SEQ ID NO:33-35中所示的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和如SEQ ID NO:38-40中所示的CDRL1、CDRL2和CDRL3；
e.如SEQ ID NO:43-45中所示的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和如SEQ ID NO:48-50中所示的CDRL1、CDRL2和CDRL3；或
f.如SEQ ID NO:57-59中所示的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和如SEQ ID NO:62-64中所示的CDRL1、CDRL2和CDRL3。
在本公开的抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，所述抗体具有以下VH和VL：
a.包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的VH，和包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的VL；
b.包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的VH，和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VL；
c.包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VH，和包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的VL；
d.包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的VH，和包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的VL；
e.包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的VH，和包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的VL；
f.包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的VH，和包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的VL。
在本公开的抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，所述抗体可以具有如SEQID NO:51所示的重链恒定区序列和/或如SEQ ID NO:53所示的轻链恒定区序列。
在本公开的抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，所述抗体具有Fc区。在一些实施方案中，所述抗体可以在Asn297处具有糖基结构修饰，其中根据EU编号系统编号。在一些实施方案中，所述糖基结构中具有岩藻糖的糖基结构的比例为50％或更少。在一些实施方案中，所述糖基结构中具有岩藻糖的糖基结构的比例为不高于30％，例如不高于20％，不高于10％，不高于5％，不高于2％或不高于1％。
在优选的实施方案中，所述抗体中具有岩藻糖的糖基结构的比例为0％-1％。
在本公开的抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，所述抗体由Fut8基因敲除的细胞产生。在一些实施方案中，所述细胞可以选自CHO细胞和HEK293细胞。
在本公开的抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，相比于在不具有Fut8基因敲除的细胞中产生的抗体，所述抗体具有增加的FcγRIIIa结合活性。在一些实施方案中，相比于在不具有Fut8基因敲除的细胞中产生的抗体，所述抗体具有增加的ADCC活性。
在本公开的抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，所述抗体可以是单克隆抗体。在另一些实施方案中，所述抗体可以是双特异性抗体或多特异性抗体。
在本公开的抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，所述抗体可以选自IgG、IgA、IgM、IgE和IgD同种型。在一些实施方案中，所述抗体可以选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚型。
在本公开的抗体或其抗原结合片段的任何实施方案中，所述抗原结合片段可以选自Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fd片段、Fd’片段、Fv片段、scFv片段、ds-scFv片段、dAb片段、单链片段、二价抗体和线性抗体。
在一个方面，本公开涉及一种核酸分子，所述核酸分子包含编码本公开的抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。
在另一个方面，本公开涉及一种载体，所述载体包含本公开的核酸分子。
在再一个方面，本公开涉及一种宿主细胞，所述宿主细胞包含本公开的核酸分子或载体。
在一个方面，本公开涉及一种缀合物，所述缀合物包含与治疗剂、诊断剂或显像剂缀合的本公开的任何抗体或其抗原结合片段。
在另一个方面，本公开涉及一种组合物，所述组合物包含本公开的抗体或其抗原结合片段或缀合物，以及一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。在一些实施方案中，所述组合物还包含一种或多种另外的治疗剂。
在一些实施方案中，所述治疗剂可以选自抗体、化疗药物和小分子药物。在一些实施方案中，所述化疗药物可以选自表柔比星(Epirubicin)、奥沙利铂(Oxaliplatin)和5-氟尿嘧啶(5-FU)的一种或多种。
在一个方面，本公开涉及一种治疗受试者中与CLDN18.2的表达相关的疾病的方法，所述方法包括对所述受试者施用本公开的抗体或其抗原结合片段、缀合物或组合物的步骤。
在一些实施方案中，所述疾病是癌症。例如，所述癌症可以选自胃癌、胆管癌、食道癌和胰腺癌。
在一些实施方案中，所述方法还包括对所述受试者施用一种或多种另外的疗法例如癌症疗法的步骤。在一些实施方案中，所述另外的疗法选自化学疗法、放射疗法、免疫疗法和手术治疗。
在一些实施方案中，所述免疫疗法选自针对免疫检查点分子的疗法、CAR-T细胞治疗和CAR-NK细胞治疗。
在一些实施方案中，所述化学疗法选自包括表柔比星、奥沙利铂和5-氟尿嘧啶的联合化疗方案。
在一个方面，本公开涉及本公开的抗体或其抗原结合片段、缀合物或组合物在治疗受试者中与CLDN18.2的表达相关的疾病中的用途。
在另一个方面，本公开涉及本公开的抗体或其抗原结合片段、缀合物或组合物在制备用于治疗受试者中与CLDN18.2的表达相关的疾病的药物中的用途。
在本公开的用途的一些实施方案中，所述疾病是癌症。例如，所述癌症可以选自胃癌、胆管癌、食道癌和胰腺癌。
在一个方面，本公开涉及一种多肽，所述多肽具有选自SEQ ID NO:1、6、11、16、21、26、31、36、41、46、55和60的氨基酸序列。
在另一个方面，本公开涉及一种核酸分子，所述核酸分子具有选自SEQ ID NO:2、7、12、17、22、27、32、37、42、47、56和61的核苷酸序列。本公开还涉及包含上述核酸分子的载体。
本发明涉及以下各项：
1.一种结合CLDN18.2的抗体或其抗原结合片段，所述抗体具有以下重链CDR(CDRH)和轻链CDR(CDRL)：
a.如SEQ ID NO:1中所示的重链可变区(VH)中的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和如SEQID NO:6中所示的轻链可变区(VL)中的CDRL1、CDRL2和CDRL3；
b.如SEQ ID NO:11中所示的VH中的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和如SEQ ID NO:16中所示的VL中的CDRL1、CDRL2和CDRL3；
c.如SEQ ID NO:21中所示的VH中的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和如SEQ ID NO:26中所示的VL中的CDRL1、CDRL2和CDRL3；
d.如SEQ ID NO:31中所示的VH中的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和如SEQ ID NO:36中所示的VL中的CDRL1、CDRL2和CDRL3；
e.如SEQ ID NO:41中所示的VH中的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和如SEQ ID NO:46中所示的VL中的CDRL1、CDRL2和CDRL3；或
f.如SEQ ID NO:55中所示的VH中的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和如SEQ ID NO:60中所示的VL中的CDRL1、CDRL2和CDRL3。
2.如项1所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体具有以下CDRH和CDRL：
a.如SEQ ID NO:3-5中所示的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和如SEQ ID NO:8-10中所示的CDRL1、CDRL2和CDRL3；
b.如SEQ ID NO:13-15中所示的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和如SEQ ID NO:18-20中所示的CDRL1、CDRL2和CDRL3；
c.如SEQ ID NO:23-25中所示的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和如SEQ ID NO:28-30中所示的CDRL1、CDRL2和CDRL3；
d.如SEQ ID NO:33-35中所示的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和如SEQ ID NO:38-40中所示的CDRL1、CDRL2和CDRL3；
e.如SEQ ID NO:43-45中所示的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和如SEQ ID NO:48-50中所示的CDRL1、CDRL2和CDRL3；
f.如SEQ ID NO:57-59中所示的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和如SEQ ID NO:62-64中所示的CDRL1、CDRL2和CDRL3。
3.如项1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体具有以下VH和VL：
a.包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的VH，和包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的VL；
b.包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的VH，和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VL；
c.包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VH，和包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的VL；
d.包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的VH，和包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的VL；
e.包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的VH，和包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的VL；
f.包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的VH，和包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的VL。
4.如项1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体具有Fc区。
5.如项4所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体在Asn297处具有糖基结构修饰，其中根据EU编号系统编号。
6.如项5所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述糖基结构中具有岩藻糖的糖基结构的比例为50％或更少。
7.如项6所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述糖基结构中具有岩藻糖的糖基结构的比例为30％或更少，例如20％或更少，10％或更少，5％或更少，2％或更少或1％或更少。
8.如项6所述的抗体或其抗原能结合片段，其中所述抗体中具有岩藻糖的糖基结构的比例为0％-1％。
9.如项6-8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体由Fut8基因敲除的细胞产生。
10.如项9所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述细胞选自CHO细胞和HEK293细胞。
11.如项9或10所述的抗体或其抗原结合片段，其中相比于在不具有Fut8基因敲除的细胞中产生的抗体，所述抗体具有增加的FcγRIIIa结合活性。
12.如项9-11中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中相比于在不具有Fut8基因敲除的细胞中产生的抗体，所述抗体具有增加的ADCC活性。
13.如项1-12中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是单克隆抗体。
14.如项1-12中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是双特异性抗体或多特异性抗体。
15.如项1-14中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体选自IgG、IgA、IgM、IgE和IgD同种型。
16.如项1-14中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚型。
17.如项1-16中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段选自Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fd片段、Fd’片段、Fv片段、scFv片段、ds-scFv片段、dAb片段、单链片段、二价抗体和线性抗体。
18.一种核酸分子，所述核酸分子包含编码如项1-17中任一项的抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。
19.一种载体，所述载体包含如项18所述的核酸分子。
20.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如项18所述的核酸分子或如项19所述的载体。
21.一种缀合物，所述缀合物包含与治疗剂、诊断剂或显像剂缀合的如项1-17中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
22.一种组合物，所述组合物包含如项1-17中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或如项21所述的缀合物，和一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。
23.如项22所述的组合物，其中所述组合物还包含一种或多种另外的治疗剂。
24.项23所述的组合物，其中所述治疗剂选自抗体、化疗药物和小分子药物。
25.项24所述的组合物，其中所述化疗药物选自表柔比星(Epirubicin)、奥沙利铂(Oxaliplatin)和5-氟尿嘧啶(5-FU)的一种或多种。
26.一种治疗受试者中与CLDN18.2的表达相关的疾病的方法，所述方法包括对所述受试者施用如项1-17中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，如项21所述的缀合物，或如项22-25中任一项所述的组合物的步骤。
27.如项26所述的方法，其中所述疾病是癌症。
28.如项27所述的方法，其中所述癌症选自胃癌、胆管癌、食道癌和胰腺癌。
29.如项26-28中任一项所述的方法，其中所述方法还包括对所述受试者施用一种或多种另外的疗法的步骤。
30.如项29所述的方法，其中所述另外的疗法选自化学疗法、放射疗法、免疫疗法和手术治疗。
31.如项30所述的方法，其中所述免疫疗法选自针对免疫检查点分子的疗法、CAR-T细胞治疗和CAR-NK细胞治疗。
32.如项30所述的方法，其中所述化学疗法选自包括表柔比星、奥沙利铂和5-氟尿嘧啶的联合化疗方案。
33.如项1-17中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，如项21所述的缀合物，或如项22-25中任一项所述的组合物在治疗受试者中与CLDN18.2的表达相关的疾病中的用途。
34.如项1-17中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，如项21所述的缀合物，或如项22-25中任一项所述的组合物在制备用于治疗受试者中与CLDN18.2的表达相关的疾病的药物中的用途。
35.如项33或34所述的用途，其中所述疾病是癌症。
36.如项35所述的用途，其中所述癌症选自胃癌、胆管癌、食道癌和胰腺癌。
37.一种多肽，所述多肽具有选自SEQ ID NO:1、6、11、16、21、26、31、36、41、46、55和60的氨基酸序列。
38.一种核酸分子，所述核酸分子具有选自SEQ ID NO:2、7、12、17、22、27、32、37、42、47、56和61的核苷酸序列。
39.一种载体，所述载体包含如项38所述的核酸分子。
附图说明
图1显示了通过流式细胞法检测CHO、CT26、SNU601细胞以及构建的CHO-CLDN18.2、CT26-CLDN18.2和SNU601-CLDN18.2细胞的CLDN18.2表达的结果。
图2显示了通过流式细胞法检测对照M13噬菌体以及经过第一轮、第二轮和第三轮筛选的噬菌体文库与CHO细胞和CHO-CLDN18.2细胞结合的结果。
图3显示了通过流式细胞法检测筛选的噬菌体克隆A1、A2、A3、A4、A5(图3A)和A6(图3B)与CHO细胞和CHO-CLDN18.2细胞结合的结果。
图4显示了通过流式细胞法检测不同浓度的重组抗体18.2-A1、18.2-A2、18.2-A3、18.2-A4、18.2-A5(图4A)、18.2-A5F和18.2-A6F(图4B)与CT26-CLDN18.2细胞结合的结果以及EC50值。
图5显示了通过流式细胞法检测CLDN18.2抗体与表达CLDN18.1(18.1-flag)或CLDN18.2(18.2-flag)的293t细胞结合的结果。
图6显示了在4℃和37℃孵育条件下检测CLDN18.2抗体与表达CLDN18.2的SNU601细胞表面结合和被细胞内吞的结果。
图7显示了通过流式细胞法检测抗体CLDN18.2抗体以及去岩藻糖化的抗体与CT26-CLDN18.2细胞结合的结果。
图8显示了通过Biacore方法检测的CLDN18.2-A1和CLDN18.2-A1F与FcγRIIIa结合的结果。图8A显示了抗体结合FcγRIIIa的拟合曲线，且图8B显示了抗体结合FcγRIIIa的Ka、Kd、KD和tc值。
图9显示了通过流式细胞法检测CLDN18.2抗体以及去岩藻糖化的抗体与细胞表面表达的FcγRIIIa的结合结果。图9A显示了抗体与FcγRIIIa-Jurkat细胞结合的结果。图9B显示了抗体与NK92MI细胞结合的结果。
图10显示了通过荧光素酶报告系统检测在SNU601-CLDN18.2细胞(图10A)或CT26-CLDN18.2(图10B)的存在下，CLDN18.2抗体以及去岩藻糖化的抗体活化FcγRIIIa-Jurkat细胞中的FcγRIIIa受体的结果。
图11显示了通过流式细胞检测KATOIII细胞上的CLDN18.2表达水平的结果。
图12显示了显示了通过荧光素酶报告系统检测在SNU601-CLDN18.2细胞的存在下，CLDN18.2抗体(图12A)和CLDN18.2抗体抗体与化疗药物EOF的联合(图12B)活化FcγRIIIa-Jurkat细胞中的FcγRIIIa受体的结果。
图13显示了在来自健康人供体1(图13A)、供体2(图13B)或供体3(图13C)和的PBMC的存在下，CLDN18.2抗体以及去岩藻糖化的抗体介导的ADCC途径对SNU601-CLDN18.2靶细胞的杀伤效果。
图14显示了在补体的存在下，CLDN18.2抗体以及去岩藻糖化的抗体介导的CDC途径对CHO-CLDN18.2靶细胞的杀伤效果。
图15显示了在SNU601-CLDN18.2细胞的小鼠异种移植模型中，不同剂量的CLDN18.2抗体18.2-A1F抑制肿瘤生长的结果。
图16显示了用于异种移植模型的CLDN18.2高表达的KATOIII细胞(KATOIII-18.2High)的流式细胞结果。
图17显示了在KATOIII-18.2High细胞的小鼠异种移植模型中，CLDN18.2抗体18.2-A1F以及18.2-A1F和化疗药物EOF的联合抑制肿瘤生长的结果。
发明详述
除非本文另有定义，与本发明结合使用的科学和技术术语及其缩略语应具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。以下列举了本文中使用的部分术语和缩略语。
抗体：antibody，Ab；免疫球蛋白：immunoglobulin，Ig；
重链：heavy chain，HC；轻链：light chain，LC；
重链可变区：heavy chain variable domain，VH；
重链恒定区：heavy chain constant domain，CH；
轻链可变区：light chain variable domain，VL；
轻链恒定区：light chain constant domain，CL；
互补决定区：complementarity determining region，CDR；
Fab片段：antigen binding fragment，Fab；
Fc区：fragment crystallizable region，Fc；
单克隆抗体：monoclonal antibody，mAb；
抗体依赖性细胞毒作用：antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC；
补体依赖性细胞毒性作用：complement dependent cytotoxicity，CDC。
在一方面，本公开涉及一种结合CLDN18.2的抗体或其抗原结合片段，所述抗体具有以下重链CDR(CDRH)和轻链CDR(CDRL)：
a.如SEQ ID NO:1中所示的重链可变区(VH)中的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和如SEQID NO:6中所示的轻链可变区(VL)中的CDRL1、CDRL2和CDRL3；
b.如SEQ ID NO:11中所示的VH中的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和如SEQ ID NO:16中所示的VL中的CDRL1、CDRL2和CDRL3；
c.如SEQ ID NO:21中所示的VH中的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和如SEQ ID NO:26中所示的VL中的CDRL1、CDRL2和CDRL3；
d.如SEQ ID NO:31中所示的VH中的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和如SEQ ID NO:36中所示的VL中的CDRL1、CDRL2和CDRL3；
e.如SEQ ID NO:41中所示的VH中的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和如SEQ ID NO:46中所示的VL中的CDRL1、CDRL2和CDRL3；或
f.如SEQ ID NO:55中所示的VH中的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和如SEQ ID NO:60中所示的VL中的CDRL1、CDRL2和CDRL3。
如本文所用，术语“结合”或“特异性结合”是指两种分子间的非随机的结合反应，如抗体及其所针对的抗原之间的反应。在某些实施方案中，特异性结合某抗原的抗体(或对某抗原具有特异性的抗体)是指抗体以小于大约10-5M，例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、或10-10M或更小的亲和力(KD)结合该抗原。本文所用“KD”是指，特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，用于描述抗体与抗原间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。
如本文所用，术语“抗体”指包含至少一个抗原识别位点并能特异性结合抗原的免疫球蛋白分子。术语“抗原”是在机体内能诱发免疫应答且与抗体特异性结合的物质，如蛋白质、多肽、肽、碳水化合物、多聚核苷酸、脂质、半抗原或上述物质的组合。抗体与抗原的结合依靠二者间形成的相互作用来介导，包括氢键、范德华力、离子键以及疏水键。抗原表面与抗体结合的区域为“抗原决定簇”或“表位”，一般来说，每个抗原可以具有多个表位。
如本文所用，术语“表位”可以由连续氨基酸或通过蛋白质的三级折叠并置的非连续氨基酸形成。表位通常在独特的空间构象中包括至少3个，更通常至少5个、约9个、或约8-10个氨基酸。“表位”包括通常由免疫球蛋白VH/VL对结合的结构单元。表位定义抗体的最小结合位点，因此代表抗体或其抗原结合片段特异性的靶物。
本公开所提及的术语“抗体”以其最广泛的含义理解，并包含单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、抗体片段、包含至少两个不同的抗原结合结构域的多特异性抗体(例如，双特异性抗体)。抗体还包括鼠源抗体、人源化抗体、嵌合抗体、人抗体以及其它来源的抗体。抗体可以含有另外的改变，如非天然氨基酸，Fc效应功能突变和糖基化位点突变。抗体还包括翻译后修饰的抗体、包含抗体的抗原决定簇的融合蛋白，以及包含对抗原识别位点的任何其它修饰的免疫球蛋白分子，只要这些抗体展现出所期望的生物活性。换句话说，抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即至少含有一个抗原结合结构域的分子。
如本文所用，“可变区”(重链可变区VH和轻链可变区VL)表示成对的轻链和重链结构域部分，其直接参与抗体和抗原的结合。每个VH和VL区由以下顺序从N末端到C末端排列的三个高变区或互补决定区(CDR)和四个框架区(FR)组成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
如本文所用，术语“CDR”是指抗体可变序列内的互补决定区。对于每个可变区，在重链和轻链的每个可变区中有三个CDR，其称为CDR1、CDR2和CDR3。这些CDR的确切边界根据不同的系统而不同定义。Kabat等人(Kabat et al,Sequences of Proteins ofImmunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987)和(1991))描述的系统不仅提供了适用于抗体可变区的明确的残基编号系统，而且还提供了限定三个CDR的残基边界。这些CDR可以称为Kabat CDR。每个互补决定区可以包含由Kabat定义的“互补决定区”的氨基酸残基。Chothia等人(Chothia&Lesk,J.Mol.Biol,196:901-917(1987)和Chothia et al.,Nature 342:877-883(1989))发现，Kabat CDR内的某些子部分采用几乎相同的肽骨架构象，尽管在氨基酸序列水平上具有多样性。这些子部分分别称为L1、L2和L3或H1、H2和H3，其中“L”和“H”分别表示轻链和重链区。这些区域可以称为Chothia CDR，其具有与Kabat CDR重叠的边界。还有其它CDR边界定义可以不严格遵循上述系统之一，但是仍将与Kabat CDR重叠。本文使用的方法可以利用根据任何这些系统定义的CDR，尽管优选实施方案使用Kabat或Chothia定义的CDR。
当使用Kabat系统来定义CDR序列时，如SEQ ID NO:1中所示的VH中的CDRH1、CDRH2和CDRH3分别具有SEQ ID NO:3(SSWLI)、SEQ ID NO:4(TIVPSDSYTNYNQKFKD)和SEQ ID NO:5(FRTGNSFDY)的氨基酸序列，且如SEQ ID NO:6中所示的VL中的CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有SEQ ID NO:8(KSSQSVLNSGNQKNYLT)、SEQ ID NO:9(WAVARQS)和SEQ ID NO:10(QNSIAYPFT)的氨基酸序列；
如SEQ ID NO:11中所示的VH中的CDRH1、CDRH2和CDRH3分别具有SEQ ID NO:13(SFWVG)、SEQ ID NO:14(NVSPSDSYTNYNQKFKD)和SEQ ID NO:15(LSSGNSFDY)的氨基酸序列，且如SEQ ID NO:16中所示的VL中的CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有SEQ ID NO:18(KSSQSVLNSGNQKNYLT)、SEQ ID NO:19(WSSTKQS)和SEQ ID NO:20(QNAFSFPFT)的氨基酸序列；
如SEQ ID NO:21中所示的VH中的CDRH1、CDRH2和CDRH3分别具有SEQ ID NO:23(SYWLN)、SEQ ID NO:24(SMYPSDSYTNYNQKFKD)和SEQ ID NO:25(FSRGNSFDY)的氨基酸序列，且如SEQ ID NO:26中所示的VL中的CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有SEQ ID NO:28(KSSQSLLESGNQKNYLT)、SEQ ID NO:29(WSWAKNS)和SEQ ID NO:30(QNAYAFPFT)的氨基酸序列；
如SEQ ID NO:31中所示的VH中的CDRH1、CDRH2和CDRH3分别具有SEQ ID NO:33(SFWIS)、SEQ ID NO:34(NILPSDSYTNYNQKFKD)和SEQ ID NO:35(YWRGNSFDY)的氨基酸序列，且如SEQ ID NO:36中所示的VL中的CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有SEQ ID NO:38(KSSQSIINSGNQKNYLT)、SEQ ID NO:39(WGGTRHS)和SEQ ID NO:40(QNGYYSPFT)的氨基酸序列；
如SEQ ID NO:41中所示的VH中的CDRH1、CDRH2和CDRH3分别具有SEQ ID NO:43(SSWVG)、SEQ ID NO:44(NSYPSDSYTNYNQKFKD)和SEQ ID NO:45(LGRGNSFDY)的氨基酸序列，且如SEQ ID NO:46中所示的VL中的CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有SEQ ID NO:48(KSSQSLIHSGNQKNYLT)、SEQ ID NO:49(WGLSKNS)和SEQ ID NO:50(QNSIYYPFT)的氨基酸序列；
如SEQ ID NO:55中所示的VH中的CDRH1、CDRH2和CDRH3分别具有SEQ ID NO:57(SYWLG)、SEQ ID NO:58(IIYPSDSYTNYNQKFKD)和SEQ ID NO:59(FWRGNSFDY)的氨基酸序列，且如SEQ ID NO:60中所示的VL中的CDRL1、CDRL2和CDRL3分别具有SEQ ID NO:62(KSSQSLLESGNQKNYLT)、SEQ ID NO:63(WAAGKES)和SEQ ID NO:64(QNGYSHPFT)的氨基酸序列。
相应地，在本公开的抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，所述抗体具有以下CDRH和CDRL：
a.如SEQ ID NO:3-5中所示的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和如SEQ ID NO:8-10中所示的CDRL1、CDRL2和CDRL3；
b.如SEQ ID NO:13-15中所示的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和如SEQ ID NO:18-20中所示的CDRL1、CDRL2和CDRL3；
c.如SEQ ID NO:23-25中所示的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和如SEQ ID NO:28-30中所示的CDRL1、CDRL2和CDRL3；
d.如SEQ ID NO:33-35中所示的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和如SEQ ID NO:38-40中所示的CDRL1、CDRL2和CDRL3；
e.如SEQ ID NO:43-45中所示的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和如SEQ ID NO:48-50中所示的CDRL1、CDRL2和CDRL3；或
f.如SEQ ID NO:57-59中所示的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和如SEQ ID NO:62-64中所示的CDRL1、CDRL2和CDRL3。
在本公开的抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，所述抗体具有以下VH和VL：
a.包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的VH，和包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的VL；
b.包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的VH，和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VL；
c.包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VH，和包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的VL；
d.包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的VH，和包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的VL；
e.包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的VH，和包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的VL；或
f.包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的VH，和包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的VL。
在本公开的抗体或其抗原结合片段的另一些实施方案中，所述抗体具有以下VH和VL：
a.包含在SEQ ID NO:1中进行了一个或几个氨基酸修饰的氨基酸序列的VH，和包含在SEQ ID NO:6中进行了一个或几个氨基酸修饰的氨基酸序列的VL；
b.包含在SEQ ID NO:11中进行了一个或几个氨基酸修饰的氨基酸序列的VH，和包含在SEQ ID NO:16中进行了一个或几个氨基酸修饰的氨基酸序列的VL；
c.包含在SEQ ID NO:21中进行了一个或几个氨基酸修饰的氨基酸序列的VH，和包含在SEQ ID NO:26中进行了一个或几个氨基酸修饰的氨基酸序列的VL；
d.包含在SEQ ID NO:31中进行了一个或几个氨基酸修饰的氨基酸序列的VH，和包含在SEQ ID NO:36中进行了一个或几个氨基酸修饰的氨基酸序列的VL；
e.包含在SEQ ID NO:41中进行了一个或几个氨基酸修饰的氨基酸序列的VH，和包含在SEQ ID NO:46中进行了一个或几个氨基酸修饰的氨基酸序列的VL；或
f.包含在SEQ ID NO:55中进行了一个或几个氨基酸修饰的氨基酸序列的VH，和包含在SEQ ID NO:60中进行了一个或几个氨基酸修饰的氨基酸序列的VL。
在一些实施方案中，所述氨基酸修饰不改变抗体的CDR序列，即在可变区的框架区(FR)中进行所述氨基酸修饰。
在一些实施方案中，所述一个或几个氨基酸修饰是指1-10个氨基酸修饰或1-5个氨基酸修饰，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸修饰。
在一些实施方案中，所述氨基酸修饰选自氨基酸残基的取代、缺失、添加和/或插入。在一些实施方案中，所述氨基酸修饰是氨基酸取代，例如保守取代。
在本公开的抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，所述抗体具有以下VH和VL：
a.包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少80％序列同一性，例如至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的VH，和包含与SEQ ID NO:6的氨基酸序列的具有至少80％序列同一性，例如至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的VL；
b.包含与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少80％序列同一性，例如至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的VH，和包含与SEQ ID NO:16的氨基酸序列的具有至少80％序列同一性，例如至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的VL；
c.包含与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少80％序列同一性，例如至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的VH，和包含与SEQ ID NO:26的氨基酸序列的具有至少80％序列同一性，例如至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的VL；
d.包含与SEQ ID NO:31的氨基酸序列具有至少80％序列同一性，例如至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的VH，和包含与SEQ ID NO:36的氨基酸序列的具有至少80％序列同一性，例如至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的VL；
e.包含与SEQ ID NO:41的氨基酸序列具有至少80％序列同一性，例如至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的VH，和包含与SEQ ID NO:46的氨基酸序列的具有至少80％序列同一性，例如至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的VL；或
f.包含与SEQ ID NO:55的氨基酸序列具有至少80％序列同一性，例如至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的VH，和包含与SEQ ID NO:60的氨基酸序列的具有至少80％序列同一性，例如至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的VL。
如本领域技术人员所理解的，两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性可以通过参数“序列同一性”描述。出可以通过例如使用数学算法测定两种序列间的序列同一性的百分比。可以通过例如使用数学算法测定两种序列间的序列同一性的百分比。此类数学算法的非限制性实例包括Myers和Miller(1988)CABIOS 4:11-17的算法、Smith等(1981)Adv.Appl.Math.2:482的局部同源性算法、Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443-453的同源性比对算法、Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85:2444-2448的用于搜索同源性的方法、和Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264的算法的修改形式，记载于Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877的算法。通过使用基于此类数学算法的程序，可以实施用于测定序列同一性的序列比较(即比对)。程序可以由计算机适当执行。此类程序的实例包括但不限于PC/Gene程序的CLUSTAL、ALIGN程序(Version 2.0)、和Wisconsin遗传学软件包的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA、和TFASTA。可以例如通过使用初始参数实施使用这些程序的比对。
在本公开的抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，所述抗体可以具有如SEQID NO:51所示的重链恒定区序列和/或如SEQ ID NO:53所示的轻链恒定区序列。
在本公开的抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，所述抗体具有Fc区。在一些实施方案中，所述抗体在Asn297处具有糖基结构修饰，其中根据Eu编号系统编号。根据本公开的“Asn297”意指根据Eu编号系统位于抗体Fc区的297位的天冬酰胺。基于具体抗体的细微序列变化，Asn297也可以位于297位上游或下游几个氨基酸。
如本文所用，术语“抗体的Fc区”或“人免疫球蛋白Fc区”包含抗体除重链恒定区1(CH1)之外的恒定区多肽，例如人免疫球蛋白IgA、IgD、IgG重链恒定区羧基端的两个恒定区结构域CH2及CH3，以及人免疫球蛋白IgE和IgM重链恒定区羧基端的三个恒定区结构域CH2、CH3及CH4，并且还包括这些结构域氨基端的柔性铰链区。虽然Fc区的边界可以变化，但人IgG重链Fc区通常定义为包含从A231开始到其羧基末端的残基。
免疫球蛋白Fc区是抗体发挥免疫效应的功能域。IgG抗体的Fc能够与多种受体相互作用，其中最重要的是Fcγ受体(FcγR)家族。治疗性单克隆抗体杀伤肿瘤细胞的一个主要作用机制是ADCC效应(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，antibody dependent cellmediated cytotoxicity)。通过治疗性抗体的抗原识别区与肿瘤细胞表面的特异性抗原结合后，利用抗体Fc区与表达FcγR的杀伤细胞结合并激活效应细胞的细胞杀伤活性，从而分泌含有细胞毒性介质，包括颗粒酶，穿孔素等，最终导致靶细胞(例如肿瘤细胞)的溶解破坏。除此之外，Fc还能与补体蛋白C1q结合，产生CDC效应(补体依赖性细胞毒性complementdependent cytotoxicity，CDC)。
抗体Fc区的糖基化修饰水平和形式可以影响Fc区与其受体FcγR的结合能力，从而影响抗体的ADCC效应的强弱。如本文所用的抗体Fc区的糖基化修饰通常是指在Asn297处的糖基化修饰。在抗体的产生过程中其经历细胞的ER和高尔基体网中的糖基化。在抗体糖基化的相关研究中发现，降低抗体的岩藻糖化水平有助于提高Fc区与FcγRIIIa的结合，进而提高抗体的ADCC效应。因此，改变抗体表达细胞的糖基化代谢途径，可以有效改变表达抗体的岩藻糖水平，从而调节抗体介导的ADCC效应(Jefferis R.2009,NAT.REV.Drug.DISC)。
相应地，在本公开的抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，所述抗体具有降低的岩藻糖化水平。例如，在本公开的抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，在Asn297处的糖基结构中，具有岩藻糖的糖基结构的比例为60％或更少，例如50％或更少，例如40％或更少，30％或更少，20％或更少，10％或更少，5％或更少，2％或更少，或1％或更少。在一些实施方案中，具有岩藻糖的糖基结构的比例为0％-10％，例如0％-5％，0％-2％或0％-1％。在一些实施方案中，具有岩藻糖的糖基结构的比例为0.1％或更少。在另一些实施方案中，在Asn297处的糖基结构中没有可检测的岩藻糖。
可以使用本领域技术人员已知的技术来产生此类去岩藻糖化的抗体。例如，抗体可以在缺陷的或缺乏岩藻糖基化能力的细胞中表达。在一些实施方案中，例如，具有Fut8基因敲除的细胞系可用于产生具有降低的岩藻糖化水平的抗体。或者，可以产生具有降低的岩藻糖含量或无岩藻糖含量的抗体或抗原结合片段，其通过例如：(i)在阻止或减少岩藻糖基化的条件下培养细胞；(ii)翻译后除去岩藻糖(例如，用岩藻糖苷酶)；(iii)期望碳水化合物的翻译后添加，例如重组表达非糖基化糖蛋白后；或(iv)糖蛋白的纯化，以选择不被岩藻糖基化的抗体或其抗原结合片段。
在本公开的抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，所述抗体由Fut8基因敲除的细胞产生，以获得具有降低的岩藻糖化水平的抗体。在一些实施方案中，所述细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，例如CHO-K1细胞、CHOS细胞或其它CHO来源的细胞。在一些实施方案中，所述细胞是Fut8基因敲除的CHO细胞。
在另一些实施方案中，所述细胞是人胚胎肾(HEK)293细胞，例如HEK293、HEK293A、HEK293T、HEK293F或其它HEK293来源的细胞。在一些实施方案中，所述细胞是Fut8基因敲除的HEK 293细胞。
在本公开的抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，所述抗体由Fut8基因敲除的细胞产生，且其中相比于在不具有Fut8基因敲除的细胞中产生的抗体例如序列相同的对照抗体，所述抗体具有增加的FcγRIIIa结合活性。在一些实施方案中，相比于在不具有Fut8基因敲除的细胞中产生的抗体例如序列相同的对照抗体，由Fut8基因敲除的细胞产生的抗体具有增加的诱导FcγRIIIa活性的能力。例如，在一些实施方案中，相比于在不具有Fut8基因敲除的细胞中产生的抗体，由Fut8基因敲除的细胞产生的抗体诱导FcγRIIIa活性的EC50值提高至少2倍，例如至少5倍或至少10倍，例如10-20倍。如本文所用，术语“EC50”是指引起50％最大效应所对应的抗体浓度。
在本公开的抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，所述抗体由Fut8基因敲除的细胞产生，且其中相比于在不具有Fut8基因敲除的细胞中产生的抗体例如序列相同的对照抗体，所述抗体具有增加的ADCC活性。例如，在一些实施方案中，相比于在不具有Fut8基因敲除的细胞中产生的抗体，由Fut8基因敲除的细胞产生的抗体的ADCC活性提高至少2倍，例如至少5倍或至少10倍，例如10-20倍。
在本公开的抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本均质的抗体群体获得的抗体，即构成群体的各抗体是相同的，除了可以少量存在的可能的天然存在的突变外。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆制剂中的每种抗体针对抗原上相同的单一决定簇。如本文使用，术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体，并且修饰语“单克隆抗体”不应被解释为需要通过任何特定方法生产抗体。
在本公开的抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，所述抗体是双特异性抗体或多特异性抗体。
例如，所述双特异性抗体或多特异性抗体具有结合CLDN18.2上的表位的第一抗原结合区，以及结合另一抗原表位的第二抗原结合区，其中所述第一抗原结合区具有如本公开所述的抗体或其抗原结合片段的CDRH1、CDRH2和CDRH3以及CDRL1、CDRL2和CDRL3；或VH和VL序列，且所述第二抗原结合区与所述第一抗原结合区结合不同的抗原表位。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合区结合CLDN18.2分子上的另一抗原结合表位。在另一些实施方案中，所述第二抗原结合区结合另一抗原。在一些实施方案中，所述另一抗原选自肿瘤相关抗原和免疫检查点分子。
本领域已经鉴定出与特定癌症相关的许多肿瘤相关抗原。如本文所用，术语“肿瘤相关抗原”是指由癌细胞差异表达，因此可以利用以靶向癌细胞的抗原。肿瘤相关抗原是可以潜在地刺激明显的肿瘤特异性免疫应答的抗原。这些抗原中的一些由正常细胞编码，但不一定由正常细胞表达。这些抗原可以表征为在正常细胞中通常是沉默(即不表达)的那些抗原、仅在某些分化阶段表达的那些抗原和那些在时间上表达的那些抗原，如胚胎和胎儿抗原。其它癌症抗原由突变细胞基因如癌基因(例如激活的ras癌基因)、抑制基因(例如突变型p53)和由内部缺失或染色体易位产生的融合蛋白编码。其它癌症抗原可以由病毒基因编码，如RNA和DNA肿瘤病毒上携带的基因。许多其它的肿瘤相关抗原及针对其的抗体是已知的和/或商品化的，并且也可以由本领域技术人员产生。
免疫检查点蛋白受体及其配体(本文统称为免疫检验点分子)介导T细胞介导的细胞毒性的抑制，并且通常由肿瘤或在肿瘤微环境中的无反应性T细胞上表达，并允许肿瘤逃避免疫攻击。免疫抑制检查点蛋白受体及其配体的活性的抑制剂可以克服免疫抑制性肿瘤环境，以允许肿瘤的细胞毒性T细胞攻击。免疫检查点蛋白的实例包括但不限于PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、OX40、LAG3、TIM3、TIGIT和CD103。此类蛋白质的活性的调节(包括抑制)可以通过免疫检查点调节剂完成，其可以包括例如靶向检查点蛋白的抗体、适体、小分子和检测点受体蛋白质的可溶性形式。对PD-1、PD-L2、CTLA4、OX40、LAG3、TIM3、TIGIT和CD103特异性的抗体是已知的和/或商品化的，并且也可以由本领域技术人员产生。
根据抗体重链恒定区的氨基酸序列，可以将免疫球蛋白分为5类(同种型)：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其还可以进一步分成不同的亚型，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2等。根据轻链氨基酸序列，可将轻链分类为λ链或κ链。本公开的抗体可以是任何上述种类或亚类。
在一些实施方案中，本公开的抗体选自IgG、IgA、IgM、IgE和IgD同种型。在一些实施方案中，本公开的抗体是IgG，例如选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚型。
如本文所用，术语“抗原结合片段”包括但不限于：Fab片段，其具有VL、CL、VH和CH1域；Fab'片段，其是在CH1域的C端具有一个或多个半胱氨酸残基的Fab片段；Fd片段，其具有VH和CH1域；Fd'片段，其具有VH和CH1域和在CH1域的C端的一个或多个半胱氨酸残基；Fv片段和scFv，其具有抗体的单一臂的VL和VH域；dAb片段，其由VH域或VL域组成；分离的CDR区；F(ab')2片段，其是包含由铰链区处的二硫桥连接的两个Fab'片段的二价片段；单链抗体分子(例如单链Fv；scFv)；具有两个抗原结合位点的"二价抗体(diabody)"，其包含同一多肽链中与轻链可变域(VL)连接的重链可变域(VH)；"线性抗体"，其包含一对串联Fd区段(VH-CH1-VH-CH1)，该区段与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区；和任何前述物质的修饰的形式，其保留了抗原结合活性。
在本公开的抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，所述抗原结合片段选自Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fd片段、Fd’片段、Fv片段、scFv片段、ds-scFv片段、dAb片段、单链片段、二价抗体和线性抗体。
在另一个方面，本公开涉及一种核酸分子，所述核酸分子包含编码本公开的抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。本公开还涉及一种载体，所述载体包含本公开的核酸分子。
本文所用“载体”是指可以将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。而当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，该载体称为表达载体。载体可以通过转化、转导或者转染等方法导入宿主细胞，继而使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内获得表达。载体是本领域技术人员公认的、包括但不限于：(1)质粒；(2)噬菌粒；(3)柯斯质粒；(4)人工染色体，如酵母人工染色体、细菌人工染色体或P1来源的人工染色体；(5)噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及(6)动物病毒，如逆转录酶病毒、腺病毒、腺相关病毒、孢疹病毒、痘病毒、杆状病毒。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不局限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因；此外，载体还可以含有复制起始位点。
在一个方面，本公开涉及一种宿主细胞，所述宿主细胞包含本公开的核酸分子或载体。在一些实施方案中，所述宿主细胞是CHO细胞，例如CHO-K1细胞、CHOS细胞或其它CHO来源的细胞。在另一些实施方案中，所述宿主细胞是HEK 293细胞，例如HEK293、HEK293A、HEK293T、HEK293F或其它HEK293来源的细胞。
在一个方面，本公开涉及一种缀合物，所述缀合物包含与治疗剂、诊断剂或显像剂缀合的本公开的抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，所述治疗剂可以选自细胞毒素和放射性同位素。在一些实施方案中，所述诊断剂或显像剂可以选自荧光标记物、发光物质、显色物质和酶。
在另一个方面，本公开涉及一种组合物，所述组合物包含本公开的抗体或其抗原结合片段，或缀合物，以及一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。
短语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断的范围内适合用于与人和动物的组织接触而没有过度毒性、刺激性、变应性应答或其它问题或并发症，与合理的益处/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。如本文中所用，短语“药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂”是指药学上可接受的材料、组合物或媒介物，如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂、介质、包封材料、制造助剂或溶剂包封材料，其涉及维持本公开的抗体或其抗原结合片段的稳定性、溶解度或活性。
本公开的组合物可以经配制用于以固体、液体或凝胶形式向受试者施用。例如，本公开的组合物可以经配制用于肠胃外施用，例如通过皮下、肌肉内、静脉内或硬膜外注射，作为例如无菌溶液或悬浮液或持续释放配制剂。
在一些实施方案中，所述组合物还包含一种或多种另外的治疗剂。在一些实施方案中，所述另外的治疗剂选自抗体、化疗药物和小分子药物。在一些实施方案中，所述治疗剂靶向肿瘤相关抗原，例如如上文中所述的肿瘤相关抗原。在另一些实施方案中，所述治疗剂靶向免疫检查点分子，例如如上文中所述免疫检查点分子。
如本文所用，术语“化疗药物”是指具有在治疗以异常细胞生长为特征的疾病中的治疗有用性的任何化学试剂。如本文所用的化学治疗剂包括化学剂和生物剂。这些试剂发挥功能以抑制癌细胞实现持续存活所依赖的细胞活性。化疗剂的类别包括烷化/生物碱剂、抗代谢物、激素或激素类似物，以及各种抗新生物药物。
在一些实施方案中，所述另外的治疗剂是化疗药物，且所述化疗药物可以其中所述化疗药物可以选自表柔比星(Epirubicin)、奥沙利铂(Oxaliplatin)和5-氟尿嘧啶(5-FU)的一种或多种。
在一个方面，本公开涉及一种治疗受试者中与CLDN18.2的表达相关的疾病的方法，所述方法包括对所述受试者施用本公开的抗体或其抗原结合片段、缀合物或组合物的步骤。
如本文所用，术语“治疗”是指治疗性处理，其中目的是反转、减轻、改善、抑制、减缓或停止与疾病或病症相关的状况的进展或严重性。术语“治疗”包括减少或减轻疾病或病症的至少一种副作用或症状。如果减少一种或多种症状或临床标志物，则治疗通常是“有效的”。或者，如果疾病的进展减少或停止，则治疗是“有效的”，也就是说，“治疗”不仅包括症状的改善，而且还包括在缺乏治疗的情况下预期的症状的进展或恶化的停止，至少减慢。有益或期望的临床结果包括但不限于减轻一种或多种症状、减少疾病程度，稳定(即不恶化)疾病状态、延迟或减缓疾病进展、改善或缓解疾病状态、和缓解(不管是部分还是全部)，无论是可检测的还是检测不到的。
如本文所用，术语“受试者”、“患者”和“个体”在本文中可互换使用，并且是指动物，例如人类。术语受试者还包括“非人哺乳动物”，例如如大鼠、小鼠、兔、绵羊、猫、狗、牛、猪和非人灵长类动物。在优选的实施方案中，所述受试者是人类受试者。
在上述方法的一些实施方案中，所述疾病是癌症。癌症的具体实例包括但不限于：基底细胞癌、胆管癌；膀胱癌；骨癌；乳腺癌；腹膜癌；宫颈癌；胆管癌；绒毛膜癌；结肠和直肠癌；结缔组织癌；消化系统癌症；子宫内膜癌；食道癌；眼癌；头颈癌；胃癌；胶质母细胞瘤；肝癌；肾癌；喉癌；白血病；肝癌；肺癌(例如，小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状细胞癌)；淋巴瘤，包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤；黑色素瘤；骨髓瘤；神经母细胞瘤；口腔癌；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；直肠癌；呼吸系统癌；唾液腺癌；肉瘤；皮肤癌；鳞状细胞癌；睾丸癌；甲状腺癌；子宫或子宫内膜癌；泌尿系统癌症；B细胞淋巴瘤；慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；急性成淋巴细胞性白血病(ALL)；毛细胞白血病；慢性成髓细胞性白血病等。在优选的实施方案中，所述癌症选自胃癌、胆管癌、食道癌和胰腺癌。
在上述方法的一些实施方案中，所述方法还包括施用一种或多种另外的疗法的步骤。例如，在一些实施方案中，所述疗法选自化学疗法、放射疗法、免疫疗法和手术疗法。
在一些实施方案中，所述免疫疗法选自针对免疫检查点分子的疗法、CAR-T细胞疗法和CAR-NK细胞疗法。例如，所述免疫检查点分子可以选自PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、OX40、LAG3、TIM3、TIGIT和CD103。
在一些实施方案中，所述化学疗法选自包括表柔比星、奥沙利铂和5-氟尿嘧啶的联合化疗方案。
在一个方面，本公开涉及本公开的抗体或其抗原结合片段、缀合物或组合物在治疗受试者中与CLDN18.2的表达相关的疾病中的用途。在另一个方面，本公开涉及本公开的抗体或其抗原结合片段、缀合物或组合物在制备用于治疗受试者中与CLDN18.2的表达相关的疾病的药物中的用途。
在上述用途的一些实施方案中，所述疾病是癌症，例如如上文中所述的癌症类型。在优选的实施方案中，所述癌症选自胃癌、胆管癌、食道癌和胰腺癌。
在上述用途的一些实施方案中，所述受试者是人。
在一个方面，本公开涉及一种多肽，所述多肽具有选自SEQ ID NO:1、6、11、16、21、26、31、36、41、46、55和60的氨基酸序列。
在另一个方面，本公开涉及一种核酸分子，所述核酸分子具有选自SEQ ID NO:2、7、12、17、22、27、32、37、42、47、56和61的核苷酸序列。本公开还涉及包含上述核酸分子的载体。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1.天然噬菌体库的构建
抗体药物开发目前主要通过人源化源自其它物种的抗体或通过转基因动物及体外筛选技术直接筛选全人源抗体来实现,其进一步降低了抗体在人中的免疫原性,减轻了相应的副作用，同时提高了成药性,是抗体药物发展的一个重要趋势。
体外筛选技术中噬菌体展示抗体库技术是获取全人源抗体的主要手段之一。噬菌体展示技术(phage display technology)利用分子生物学手段将外源基因片段插入噬菌体特定蛋白如gIII的基因,通过噬菌体表达外源基因编码的蛋白或多肽,保持重组融合蛋白的相对空间结构和生物学活性并呈现于噬菌体表面。将构建的多样噬菌体库与靶蛋白共同孵育,经生物淘洗去除非靶蛋白结合型噬菌体株。在噬菌体库容足够大的情况下，通过多轮收集、扩增及富集获得高亲和力、高特异性的噬菌体克隆株，采用基因测序鉴定这些噬菌体克隆编码的蛋白序列可用于进一步的研究。
噬菌体抗体库是抗体基因经噬菌体展示后形成的多样噬菌体库。噬菌体抗体库的质量主要由库容量及多样性决定。为获得高亲和力抗体,噬菌体抗体库在保证多样性的前提下还需要尽可能增大库容。噬菌体表面展示的抗体片段数量代表库容大小，而展示的片段的多样性则代表抗体库多样性。理论上来说，噬菌体抗体库的库容越大，筛选获得的抗体亲和力越高。
在本实施例中，为了避免由于个体差异导致抗体库的偏向性,同时尽可能保证库的多样性,共获取、收集和提取了120份来自成年健康个体外周血及脾脏，以及新生儿脐带血的单个核细胞的总RNA。将所述RNA逆转录合成单链cDNA,再使用针对抗体不同亚群的可变区引物分别扩增VH、Vκ和Vλ基因。将扩增产物按照一定比例混合后,分别将重链与轻链基因以PCR法链接成为单链抗体(scFv)，并用双酶切法克隆到噬菌体质粒中。使用携带scFv基因的噬菌体质粒电击穿孔转化SS320大肠杆菌感受态细胞。待SS320增殖到对数期后，加入辅助噬菌体感染。
最终获得库容为1.2×1012、阳性率为88％的天然抗体噬菌体抗体库。通过随机挑选克隆进行测序,发现该抗体库基因家族与天然分布接近,CDR3区的氨基酸个数为3-20分布。测序中，未发现抗体重复序列，且88％的基因序列具有正确的读码框。上述结果表明，该噬菌体抗体库多样性良好，有效库容率很高。
实施例2.CLDN18.2稳定表达细胞株的制备
在本实施例中，制备了稳定表达CLDN18.2的CHO细胞株(CHO-CLDN18.2)以用于基于细胞的噬菌体展示筛选。其具体实验过程如下：将人CLDN18.2的cDNA序列克隆到pCDH慢病毒载体中，然后和慢病毒包装载体共同转染到293t细胞中。培养48或72小时后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清，直接感染CHO细胞、CT26细胞或SNU601细胞。将慢病毒感染后的细胞用嘌呤霉素进行筛选培养，2-3周后使用CLDN18.2特异性抗体(IMAB362,Ganymed)进行流式细胞法来检测细胞的CLDN18.2表达，其结果如图1所示。
上述结果表明，经慢病毒转染和嘌呤霉素筛选，获得了稳定表达CLDN18.2的CHO细胞(命名为CHO-CLDN18.2细胞系)、CT26细胞(CT26-CLDN18.2)和SNU601细胞(SNU601-CLDN18.2)。
实施例3.从抗体噬菌体展示文库中筛选抗CLDN18.2抗体
利用CHO-CLDN18.2稳定表达细胞株，进行了三轮噬菌体展示文库的淘选。实验流程主要参考以下文献：Targeting membrane proteins for antibody discovery usingphage display Jones ML et al.Scientific Reports 2016。
具体流程简述如下：将噬菌体文库和CHO-K1细胞孵育，离心后取上清液。再将所述上清液与CHO-CLDN18.2细胞孵育，以使对CLDN18.2具有特异性的噬菌体与细胞结合。离心后收集细胞沉淀，并清洗和收集细胞。然后使用75mM的柠檬酸钠缓冲液洗脱与细胞结合的噬菌体文库。中和噬菌体文库后，使用M13K07辅助噬菌体扩增100倍筛选后的噬菌体文库，然后以类似第一轮筛选的方法进行第二轮和第三轮筛选。噬菌体的富集情况通过每一轮筛选的起始噬菌体用量和筛选后收集到的噬菌体滴度监测，并用噬菌体文库和CHO或CHO-CLDN18.2稳定表达细胞株进行流式细胞检测。如图2所示的结果表明，从第二轮富集筛选开始，噬菌体展示文库可以特异性结合CHO-CLDN18.2，其结合强度随筛选次数增多而增强。
经过三轮筛选后得到富集的噬菌体文库。使用该文库侵染细菌后，涂于琼脂糖平板培养。挑取单克隆菌落，放入96孔深孔板中用含有氨苄青霉素和卡那霉素的2YT培养基于37℃震荡培养，得到含有单克隆噬菌体的上清。将单克隆噬菌体上清与CHO-CLDN18.2细胞或CT26-CLDN18.2细胞在4℃孵育1小时，随后用含有1mM EDTA和0.5％BSA的PBS(流式细胞缓冲液)清洗。加入PE标记的抗M13抗体(购自义翘神州)，并于4℃孵育30分钟。随后，使用流式细胞法检测噬菌体和细胞的结合，其结果如图3所示。
上述结果表明，筛选得到的单克隆噬菌体A1-A6均可以很好结合CHO-CLDN18.2细胞而不结合CHO对照细胞。
实施例4.重组抗体的制备
将单克隆噬菌体的重链和轻链可变区的cDNA序列分别克隆到已含有抗体恒定区的pcDNA3.4载体(Invitrogen)中，共获得6个单克隆抗体的重链和轻链表达质粒。使用PEI法将质粒转染到EXPI-293细胞(Invitrogen)中，瞬时转染7-10天，离心并收取上清液。将上清液经过protein A纯化，获得纯化的抗体。上述6个单克隆抗体分别命名为18.2-A1(A1)、18.2-A2(A2)、18.2-A3(A3)、18.2-A4(A4)、18.2-A5(A5)和18.2-A6(A6)。这些抗体的重链和轻链可变区的氨基酸序列以及编码序列如以下表1和表2所示，通过Kabat CDR系统确定的抗体的CDR序列如表3所示。重组抗体的重链和轻链恒定区序列如表4中所示。
表1.CLDN18.2抗体的VH和VL序列
Figure BDA0003828703070000291
Figure BDA0003828703070000301
表2.CLDN18.2抗体的VH和VL的编码序列
Figure BDA0003828703070000302
Figure BDA0003828703070000311
Figure BDA0003828703070000321
表3.抗体的Kabat CDR序列
Figure BDA0003828703070000322
表4.重组抗体的重链和轻链恒定区序列
Figure BDA0003828703070000323
Figure BDA0003828703070000331
实施例5.重组单克隆抗体的结合活性检测
检测了重组单克隆抗体对CLDN18.2的结合活性。具体而言，取生长良好的CT26-CLDN18.2稳定表达细胞株。将细胞用PBS清洗后，与倍比稀释的抗体混合，并在4℃孵育1小时。将细胞用流式细胞缓冲液清洗一次，加入PE标记抗人IgG抗体，并在4℃孵育30分钟。离心去除上清，使用流式细胞缓冲液清洗后，用流式细胞仪检测细胞表面的荧光强度。使用平均荧光强度计算每种抗体的相对结合活性。
18.2-A1(A1)、18.2-A2(A2)、18.2-A3(A3)、18.2-A4(A4)18.2-A5(A5)和18.2-A6(A6)抗体均不与对照CT26细胞株结合(结果未显示)，但可以很好地结合表达CLDN18.2的CT26细胞株，如图4所示。随着抗体的稀释，CT26-CLDN18.2的平均荧光强度逐渐减弱。图4中还显示了上述CLDN18.2抗体的相对结合活性(EC50)。
实施例6.重组抗体的结合特异性检测
人Claudin18蛋白有两个同源异构体，即CLDN18.1和CLDN18.2，这两个同源异构体共用除外显子1以外的其它外显子，并且CLDN18.1和CLDN18.2的外显子1序列高度相似，其中在第一个胞外区中仅有8个不同的氨基酸。CLDN18.1和CLDN18.2外显子1在各自不同的启动子的驱动下，特异性地在不同组织中表达。其中，CLDN18.1在肺上皮细胞中特异性表达，而CLDN18.2在胃上皮细胞中特异地表达。为了鉴定筛选出的CLDN18.2抗体的特异性，检测了抗体与CLDN18.1和CLDN18.2的结合。
具体而言，取生长良好的293t细胞，瞬时表达flag标签标记的CLDN18.1(CLDN18.1-Flag)或CLDN18.2(CLDN18.2-Flag)。转染后48小时，用胰酶消化细胞。经流式细胞缓冲液清洗后，将细胞与10μg/ml的同种型对照抗体或上述5株CLDN18.2抗体混合于200μl流式细胞缓冲液中，并在4℃孵育1小时。随后，将细胞用流式细胞缓冲液清洗一次，加入PE标记抗人IgG抗体，并在4℃孵育30分钟。离心去除上清，使用流式细胞缓冲液清洗两次，并在含有1％多聚甲醛和0.5％triton-X100的固定液中固定细胞并通透细胞膜。随后，使用APC标记的抗flag抗体与细胞孵育30分钟，并用流式细胞仪进行检测。
结果如图5所示，外源表达CLDN18.1-flag或CLDN18.2-flag的293t细胞中均可以检测到flag阳性细胞群，显示转染的CLDN18.1或CLDN18.2蛋白在细胞中良好表达，表达阳性率在20％左右。CLDN18.2抗体18.2-A1、18.2-A2、18.2-A3、18.2-A4、18.2-A5和18.2-A6均能够很好地结合CLDN18.2-flag转染的阳性293t细胞，但6株抗体均不与CLDN18.1阳性细胞结合。上述结果表明，这6株CLDN18.2抗体均能够特异性结合CLDN18.2而不结合CLDN18.1。
实施例7.CLDN18.2抗体结合细胞后被内吞的检测
已经报道了有些抗体与细胞表面的抗原结合后，可以引起抗原和抗体复合物的内吞，从而降低细胞表面抗原表达水平，并加速抗体在体内的代谢(Schrama D et al.2006,Nat Rev Drug Discov)。在本实施例中，在稳定表达CLDN18.2的SNU601细胞中检测了抗体18.2-A1、18.2-A3、18.2-A4和18.2-A6被细胞内吞的能力。具体来说，将浓度为10μg/ml的CLDN18.2抗体18.2-A1、18.2-A3、18.2-A4、18.2-A6或IMAB362抗体(如实施例2中所述)、空白对照(PBS)和同种型对照(ISO)与细胞分别在4℃或37℃孵育4小时。随后，在4℃进行洗涤，并用PE标记的抗人IgG抗体进行染色。经过4％福尔马林固定后，用流式细胞仪检测细胞表面的抗体结合。
如图6中的结果所示，在4℃孵育条件下，IMAB362抗体和18.2-A1、18.2-A3、18.2-A4和18.2-A6抗体均可以很好地结合表达CLDN18.2的SNU601细胞。但在37℃孵育条件下，IMAB362抗体被细胞内吞，细胞表面的抗体染色明显下降；而18.2-A1、18.2-A3、18.2-A4和18.2-A6抗体没有发生明显内吞现象，在37℃条件下仍然可以很好地与细胞结合。
上述结果表明，IMAB362抗体可以引起细胞内吞作用，从而可能下调CLDN18.2抗原在细胞表面的表达水平。在体内，内吞作用还可以引起抗体代谢的改变，加速抗体在体内的清除速度。相反，本公开的CLDN18.2抗体不引起明显的细胞内吞作用，因而不会下调细胞表面的靶抗原CLDN18.2的水平，也不会影响抗体在体内的代谢。
实施例8.去岩藻糖化抗体的制备和纯化
进一步制备了CLDN18.2抗体的去岩藻糖化形式。具体而言，将抗体的重链和轻链编码序列克隆到能够稳定表达的哺乳动物GS表达载体中，重链和轻链编码序列均以CMV启动子驱动。将表达载体转染到经过无血清和悬浮培养驯化的CHO-K1细胞和Fut8基因敲除的驯化CHO-K1细胞株中。利用MSX筛选并挑选稳定表达细胞株。得到稳定表达细胞株后，用摇瓶培养12-14天，中间根据需要补充补料培养基。
随后，收集培养上清，过滤后通过protein A层析柱捕获表达的抗体。将抗体洗脱后经PBS透析，得到纯化的抗体。其中，在Fut8基因敲除的CHO-K1细胞株中表达的18.2-A1、18.2-A2、18.2-A3、18.2-A4、18.2-A5和18.2-A6抗体分别命名为18.2-A1F、18.2-A2F、18.2-A1F、18.2-A4F、18.2-A5F和18.2-A6F。
实施例9.去岩藻糖化抗体的糖基化修饰表征
随后，分析了在Fut8基因敲除的CHO-K1细胞株中表达的去岩藻糖化的抗体以及在CHO-K1细胞中产生的普通抗体的糖基化修饰。通过将100μg抗体在胰蛋白酶和糖基肽酶分解后纯化获得抗体糖基，然后进行荧光串联质谱分析。各种糖基的鉴定取决于其质荷比m/z，通过荧光检测的面积百分比计算糖基百分比。
糖基命名：
Figure BDA0003828703070000361
Figure BDA0003828703070000368
N-乙酰神经氨酸
Figure BDA0003828703070000365
N-乙酰半乳糖胺
Figure BDA0003828703070000367
岩藻糖
Figure BDA0003828703070000366
甘露糖
Figure BDA0003828703070000363
半乳糖
Figure BDA0003828703070000364
N-羟乙酰神经氨酸
糖基编号定义：5个数字分别表达不同糖的个数：六碳糖(半乳糖，甘露糖，或者葡萄糖)，N-乙酰己糖胺(GlcNA或者GalNAc)，岩藻糖(Fucose，简称FUC)，N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)，和N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)。其中第三个数字表示岩藻糖的个数。如以下表4所示：
表4.糖基编号及其对应的糖链
Figure BDA0003828703070000362
Figure BDA0003828703070000371
在CHO-K1细胞中产生的Claudin18.2-A1抗体的糖链分析结果如以下表5中所示。
表5.Claudin18.2抗体的糖链分析结果
糖基编号 岩藻糖 比例％
33000 无 0.2
33100 有 0.3
34000 无 4.8
34100 有 45.0
44000 无 3.3
44100 有 37.7
45000 无 0.3
45100 有 0.2
54100 有 7.0
54110 有 0.3
54101 有 0.2或0
54120 有 0.3
在Fut8基因敲除的CHO-K1细胞中产生的三批去岩藻糖化的Claudin18.2抗体(18.2-A1及18.2-A4)的糖链分析结果如表6中所示。
表6.去岩藻糖化的18.2-A1及18.2-A4抗体的糖链分析结果
Figure BDA0003828703070000372
Figure BDA0003828703070000381
根据以上结果，显示在CHO-K1细胞中产生的普通Claudin18.2抗体的糖基结构中，91.0％包含岩藻。而在Fut8基因敲除的CHO-K1细胞中产生的三批去岩藻糖化的Claudin18.2抗体的糖基中基本不含有可检测的岩藻糖。
实施例10.去岩藻糖化抗体的结合活性检测
通过流式细胞法检测去岩藻糖化抗体18.2-A1F、18.2-A3F和18.2-A4F相比于18.2-A1、18.2-A3和18.2-A4与CLDN18.2的结合活性，其检测方法同实施例5中所述，实验结果如图7所示。
该结果表明，去岩藻糖化的CLDN18.2抗体和普通抗体对CLDN18.2的生物学结合活性没有显著差异。
实施例11.CLDN18.2抗体及其去岩藻糖化形式与FcγRIIIa的结合活性检测
随后，使用Biacore方法检测CLDN18.2抗体及其去岩藻糖化形式与FcγRIIIa的结合活性。具体而言，将FcγRIIIa(Sino Biological Inc,10389-H08C1)用HBS-EP缓冲液稀释至0.1μg/ml作为配体，并分别将18.2-A1F和18.2-A1抗体样品稀释至360μg/ml、120μg/ml、40μg/ml、13.3μg/ml和4.4μg/ml，作为分析物。采用间接捕获的方法固定配体FcγRIIIa，首先用50μg/ml的Anti-His IgG通过氨基偶联共价结合于CM5芯片表面，之后再结合配体和分析物。在Biacore Wizard模式下使用多循环方式，以FcγRIIIa为配体和18.2-A1F和18.2-A1抗体样品为分析物，进行亲和力分析实验。
每个样品的测试包括3个Start up、1个零浓度对照、5个梯度浓度样品和1个重复样品(参考品)。每个循环结束之后用10mM甘氨酸-HCl，pH 1.5再生液使芯片再生。分析物的每个浓度循环设置捕获时间60s，配体溶液流速10μl/min；配体与分析物结合时间180s，分析物溶液流速30μl/min；解离时间180s。将偶联有Anti-His IgG的CM5芯片置于插槽内进行检测分析。将原始数据导入BIACORETM X100分析软件，扣除零浓度对照，并且扣除参比通道以消除容积效应，用亲和力分析方法以稳态模式拟合图形，整理数据。
从图8的结果可以看出，18.2-A1抗体及其去岩藻糖化形式18.2-A1F均能够有效结合FcγRIIIa。并且，18.2-A1F抗体与FcγRIIIa结合的KD值明显低于18.2-A1抗体。该结果表明，去岩藻糖化的18.2-A1F抗体与FcγRIIIa的结合活性显著增强。
实施例12.CLDN18.2抗体及其去岩藻糖化形式与细胞表面的FcγRIIIa的结合活性检测
接下来我们进一步检测了CLDN18.2抗体及其去岩藻糖化的形式与细胞表面表达的FcγRIIIa的结合活性。具体而言，将人FcγRIIIa(V158，高FC结合亚型)基因克隆到带有嘌呤霉素筛选标记的哺乳动物细胞表达载体并转染到Jurkat细胞株中。用嘌呤霉素筛选稳定表达FcγRIIIa的细胞株(FcγRIIIa-Jurkat)。此外，NK92MI是人NK细胞株，其天然表达FcγRIIIa受体(F158，低FC结合亚型)。通过流式细胞法检测CLDN18.2抗体及其去岩藻糖化的形式与FcγRIIIa-jurkat细胞和NK92MI细胞表面表达的FcγRIIIa的结合能力。具体的流式细胞检测方法参照实施例6中所述。
流式细胞检测结果如图9所示。CLDN18.2抗体18.2-A1和18.2-A4及其去岩藻糖化形式18.2-A1F和18.2-A4F均能够结合FcγRIIIa-jurkat细胞，而不结合未转染的Jurkat细胞(结果未显示)。并且，去岩藻糖化的18.2-A1F和18.2-A4F抗体能够更好地结合FcγRIIIa-Jurkat细胞和NK92MI细胞，其EC50明显小于CLDN18.2抗体18.2-A1和18.2-A4抗体。上述结果表明，去岩藻糖化的CLDN18.2抗体具有显著改善的结合Fc受体FcγRIIIa的能力。
实施例13.CLDN18.2抗体及其去岩藻糖化形式活化FcγRIIIa受体
FcγRIIIa受体结合抗体FC区后，可以激活效应细胞内的NF-AT转录因子通路。因此，检测NF-AT介导的报告基因强度可以反映FcγRIIIa受体的激活强度。在本实施例中，在荧光素酶报告基因表达载体中插入含有NF-AT结合位点的启动子，并稳定转染到Jurkat细胞株中。同时，将高FC结合的FcγRIIIa(V158)也稳定转染到Jurkat细胞中，构建了可以感受FcγRIIIa受体激活强度的功能细胞株(FcγRIIIa-Jurkat)。
取稳定表达CLDN18.2的SNU601胃癌细胞(SNU601-CLDN18.2)，稀释至4x105/ml，并与FcγRIIIa-Jurkat细胞以1:6的比例混合。取100μl混合的细胞加入96孔板，然后分别加入倍比稀释的抗体，于37℃静止培养6小时。随后，用One-Glo试剂盒(promega)检测荧光素酶活性。
结果如图10所示。与在CHO-K1细胞中产生的18.2-A1和18.2-A4抗体相比，在Fut8基因敲除的CHO细胞株中表达的去岩藻糖化的抗体18.2-A1F和18.2-A4F诱导的FcγRIIIa受体活性显著增加，其EC50值提高约10-20倍。
实施例14.联合化疗药物EOF增强CLDN18.2抗体诱导的FcγRIIIa受体激活
包括EOF(表柔比星，Epirubicin；奥沙利铂，Oxaliplatin；5-氟尿嘧啶，5-FU)在内的联合化疗方案是胃癌现有的主要治疗手段。对EOF敏感细胞株在EOF处理后，会发生不同程度的细胞分裂周期阻断，增殖抑制和凋亡。
KATOIII细胞是一种人胃上皮癌细胞株，其表达很低水平的CLDN18.2，在流式细胞检测中仅有约5.2％细胞显示明显阳性(图11)。由于低水平的CLDN18.2表达，在与KATOIII细胞和FcγRIIIa-Jurkat细胞共孵育的抗体诱导的FcγRIIIa受体活化实验中(实验方法如实施例13中所述)，18.2-A1F和18.2-A6F抗体不引起FcγRIIIa受体活化(图12A)。
进一步，使用亚致死剂量的EOF(表柔比星：300nM；奥沙利铂：130nM；5-氟尿嘧啶：561.3nM)处理KATOIII细胞48小时后，经显微镜观察和流式细胞检测，发现细胞体积增大，变圆，分裂期细胞减少。表明细胞停留在分裂期。但细胞仍然存活，未出现明显凋亡现象(结果未显示)。将EOF处理过的KATOIII细胞与FcγRIIIa-Jurkat细胞和不同浓度的CLDN18.2抗体共孵育。结果表明，相比于同种型对照(ISO),18.2-A1F和18.2-A6F抗体可以诱导显著的FcγRIIIa受体激活(图12B)。
以上结果表明，目前常用的化疗药物EOF对胃癌细胞有生长抑制作用。EOF处理后，可以增强CLDN18.2抗体诱导的FcγRIIIa受体激活。不希望受到理论束缚，该效果可能是由于化疗药物的处理通过上调细胞上的抗原表达和其它机制促进CLDN18.2抗体的ADCC效应。
实施例15.抗体对表达CLDN18.2的肿瘤细胞的杀伤
用Ficoll-Paque Plus(GE Healthcare)分离健康人(供体1和供体2)外周血白细胞(PBMC)，在37℃培养过夜。取稳定表达CLDN18.2的SNU601胃癌细胞(SNU601-CLDN18.2)并稀释至1x105/ml，并PBMC稀释至5x106/ml，将两者等体积混合，效应细胞和靶细胞的比率为50:1。取100μl混合的细胞加入96孔板，然后分别加入倍比稀释的抗体，于37℃静止培养24小时。随后，使用乳酸脱氢酶(LDH)法(promega)检测细胞活率，其通过酶标仪测定OD490下的吸光度。杀伤率计算方法如下：
最小释放组：靶细胞单独培养
最大释放组：靶细胞+裂解液
实验组：靶细胞+效应细胞+CLDN18.2抗体
对照组：靶细胞+效应细胞+阴性对照抗体
杀伤率(％)＝(实验组-最小释放组)/(最大释放组-最小释放组)％×100％
结果如图13所示。阴性对照抗体不显示明显的细胞杀伤(结果未显示)，CLDN18.2抗体18.2-A1及去岩藻糖化的抗体18.2-A1F和18.2-A4F均能够有效地引起表达CLDN18.2的靶细胞死亡，其最大杀伤率可以达到80-90％。此外，比较去岩藻糖化的抗体和普通抗体，可以得到去岩藻糖化的抗体对靶细胞的最大杀伤率和IC50值均明显高于普通抗体。
实施例16.CLDN18.2抗体的CDC活性
取稳定表达CLDN18.2的HELA细胞，用含1％灭活补体的血清的培养基重悬计数，并将细胞浓度调整至2x105/ml，细胞活力大于90％。在96孔板中每孔加入50μl细胞，然后分别加入倍比稀释的抗体和50μl稀释后的人血清。将细胞于37℃孵育2小时。随后，用CCK8法测量细胞裂解率。细胞裂解率的计算方法如下：
最小释放组：靶细胞
最大释放组：靶细胞+裂解液
实验组：靶细胞+CLDN18.2抗体+补体
阴性对照组：靶细胞+阴性对照抗体+补体
杀伤率(％)＝(实验组-最小释放组)/(最大释放组-最小释放组)×100％
结果如图14所示。CLDN18.2抗体18.2-A1和18.2-A4及其去岩藻糖化形式18.2-A1F和18.2-A4F均具有明显的CDC活性，对靶细胞的最大杀伤率均大于95％。此外，去岩藻糖化形式的抗体和普通抗体相比，其CDC活性没有显著差异。
实施例17.CLDN18.2抗体的体内肿瘤杀伤活性
通过对NPG免疫缺陷小鼠皮下接种SNU601-CLDN18.2细胞和Ficoll分离的人PBMC细胞(SNU601-CLDN18.2细胞：PBMC为1:0.8)，建立SNU601细胞的小鼠异种移植模型。随后，通过腹腔注射向接种了SNU601肿瘤细胞的NPG免疫缺陷小鼠注射10mg/kg或5mg/kg剂量的18.2-A1F抗体18.2-A1F，或空白对照(PBS)或IgG同种型对照(ISO)，每组n＝15只小鼠。在肿瘤接种后每3天给药一次，并测量小鼠体内肿瘤的体积。
如图15中的结果显示，与PBS组和IgG同种型对照抗体组相比，5mg/kg和10mg/kg剂量的18.2-A1F抗体处理组均显示出良好的肿瘤抑制效果，且5mg/kg和10mg/kg组之间没有明显的效果差别。
实施例18.CLDN18.2抗体和化疗药物联合的体内肿瘤杀伤活性
如实施例14中的结果所示，在体外EOF联合化疗可以提高CLDN18.2抗体诱导的FcγRIIIa受体激活。KATOIII在体外IMDM培养基中培养时表达很低水平的CLDN18.2，仅有约5.2％细胞在流式细胞检测中显示明显阳性(图11)。经流式细胞分选后，选择CLDN18.2高表达的KATOIII细胞(KATOIII-18.2High)接种NPG免疫缺陷小鼠，进行异种移植模型实验(图16)。
在NPG免疫缺陷小鼠皮下接种KATOIII-18.2High细胞和Ficoll分离的人PBMC细胞(KATOIII-18.2High细胞：PBMC为1:0.8)，建立KATOIII-18.2High细胞的异种移植模型。随后，通过腹腔注射向接种了KATOIII-18.2High肿瘤细胞的NPG免疫缺陷小鼠注射同种型对照抗体(ISO)、EOF(表柔比星:1mg/kg；奥沙利铂:3mg/kg；5-氟尿嘧啶:30mg/kg)、10mg/kg剂量的18.2-A1F抗体，或EOF和18.2-A1F，每组n＝6只小鼠。在肿瘤接种后每3天给药一次，并测量小鼠体内肿瘤的体积。
如图17中的结果显示，与EOF组和对照抗体组相比，18.2-A1F可以有效抑制肿瘤生长，18.2-A1F与EOF联用进一步显著降低肿瘤生长，表明其与化疗联用在癌症的临床治疗中的潜力。

Claims (37)

1.一种结合CLDN18.2的抗体或其抗原结合片段，所述抗体具有如SEQ ID NO:11所示的VH中的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和如SEQ ID NO:16所示的VL中的CDRL1、CDRL2和CDRL3。
2.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体具有如SEQ ID NO:13-15所示的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和如SEQ ID NO:18-20所示的CDRL1、CDRL2和CDRL3。
3.如权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体具有包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的VH，和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VL。
4.如权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体的重链包含：如SEQ ID NO:11所示的重链可变区和如SEQ ID NO:51所示的重链恒定区，且所述抗体的轻链包含：如SEQ ID NO:16所示的轻链可变区和如SEQ ID NO:53所示的轻链恒定区。
5.如权利要求1-4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体具有Fc区。
6.如权利要求5所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体在Asn297处具有糖基结构修饰，其中根据EU编号系统编号。
7.如权利要求6所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述糖基结构中具有岩藻糖的糖基结构的比例为50％或更少。
8.如权利要求7所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述糖基结构中具有岩藻糖的糖基结构的比例为30％或更少，例如20％或更少，10％或更少，5％或更少，2％或更少，或1％或更少。
9.如权利要求7所述的抗体或其抗原能结合片段，其中所述抗体中具有岩藻糖的糖基结构的比例为0％-1％。
10.如权利要求7-9中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体由Fut8基因敲除的细胞产生。
11.如权利要求10所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述细胞选自CHO细胞和HEK293细胞。
12.如权利要求10或11所述的抗体或其抗原结合片段，其中相比于在不具有Fut8基因敲除的细胞中产生的抗体，所述抗体具有增加的FcγRIIIa结合活性。
13.如权利要求10-12中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中相比于在不具有Fut8基因敲除的细胞中产生的抗体，所述抗体具有增加的ADCC活性。
14.如权利要求1-13中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是单克隆抗体。
15.如权利要求1-13中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是双特异性抗体或多特异性抗体。
16.如权利要求1-15中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体选自IgG、IgA、IgM、IgE和IgD同种型。
17.如权利要求1-15中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚型。
18.如权利要求1-17中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段选自Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fd片段、Fd’片段、Fv片段、scFv片段、ds-scFv片段、dAb片段、单链片段、二价抗体和线性抗体。
19.一种核酸分子，所述核酸分子包含编码如权利要求1-18中任一项的抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。
20.一种载体，所述载体包含如权利要求19所述的核酸分子。
21.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如权利要求19所述的核酸分子或如权利要求20所述的载体。
22.一种缀合物，所述缀合物包含与治疗剂、诊断剂或显像剂缀合的如权利要求1-18中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
23.一种组合物，所述组合物包含如权利要求1-18中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或如权利要求22所述的缀合物，和一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。
24.如权利要求23所述的组合物，其中所述组合物还包含一种或多种另外的治疗剂。
25.权利要求24所述的组合物，其中所述治疗剂选自抗体、化疗药物和小分子药物。
26.权利要求25所述的组合物，其中所述化疗药物选自表柔比星(Epirubicin)、奥沙利铂(Oxaliplatin)和5-氟尿嘧啶(5-FU)的一种或多种。
27.如权利要求1-18中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，如权利要求22所述的缀合物，或如权利要求23-26中任一项所述的组合物在制备用于治疗受试者中与CLDN18.2的表达相关的疾病的药物中的用途。
28.如权利要求27所述的用途，其中所述疾病是癌症。
29.如权利要求28所述的用途，其中所述癌症选自胃癌、胆管癌、食道癌和胰腺癌。
30.如权利要求27-29中任一项所述的用途，其中所述药物与一种或多种另外的疗法联合施用。
31.如权利要求30所述的用途，其中所述另外的疗法选自化学疗法、放射疗法、免疫疗法和手术治疗。
32.如权利要求31所述的用途，其中所述免疫疗法选自针对免疫检查点分子的疗法、CAR-T细胞治疗和CAR-NK细胞治疗。
33.如权利要求31所述的用途，其中所述化学疗法选自包括表柔比星、奥沙利铂和5-氟尿嘧啶的联合化疗方案。
34.如权利要求28-33中任一项所述的用途，其中所述癌症为胃癌。
35.一种多肽，所述多肽具有选自SEQ ID NO:11和16的氨基酸序列。
36.一种核酸分子，所述核酸分子具有选自SEQ ID NO:12和17的核苷酸序列。
37.一种载体，所述载体包含如权利要求36所述的核酸分子。
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