CN117567618A - 抗cd73抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种特异性结合CD73的抗体、其抗原结合片段或其变体，其包括重链可变区和轻链可变区，其中，所述重链可变区包含：CDRH1，其序列如SEQ ID NO.1所示；CDRH2，其序列如SEQ ID NO.2所示；以及CDRH3，其序列如SEQ ID NO.3所示；以及所述轻链可变区包含：CDRL1，其序列如SEQ ID NO.4所示；CDRL2，其序列如SEQ ID NO.5所示；以及CDRL3，其序列如SEQ ID NO.6所示。本发明的抗CD73抗体具有高结合的亲和力；并且在可溶性蛋白水平和细胞水平都具有抑制CD73酶活的强效活性。此外，抗体的结合可诱导CD73的肿瘤细胞内化，导致细胞表面上的CD73活性进一步降低。与参比抗体相比，本发明抗体表现出更优的体内外抗肿瘤活性，使其成为用于治疗和诊断用途的优秀候选药物分子。

Description

抗CD73抗体及其用途
技术领域
本发明涉及生物医药领域，特别地涉及抗CD73抗体及其用途。
背景技术
肿瘤微环境(Tumor micro-environment,TME)中存在抑制免疫细胞的物质，其会导致肿瘤细胞逃脱免疫细胞的杀伤。由CD73催化的将AMP转化为腺苷的过程被认为是肿瘤微环境中细胞外腺苷水平升高的主要因素(stagg,j.etal.,proc.natl.acad.sci.usa.:107(2010):1547-1552)。CD73的表达由于缺氧诱导因子-1α而直接上调，这解释了在缺氧恶性肿瘤中观察到的细胞外腺苷增加。CD73还被调节性T细胞(TREGS)表达并促进TREG介导的免疫抑制(stagg j,etal.,cancer res.71(2011):2892-2900)。此外，CD73受转化生长因子-β(TGF-β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、肝细胞生长因子(HGF)、白介素-6(IL-6)、促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)、信号转导和转录激活因子3(STAT3)、白介素-2(IL-2)、视黄酸、INT/无翅(WNT)、上皮间质转化和P53突变的诱导。CD73在多种肿瘤类型中被过度表达，并促进肿瘤细胞的侵入、转移和粘附。CD73还与癌症中的免疫耐受性和不良预后相关。此外，cd73抑制剂在治疗由腺苷及其受体介导的其它疾病中具有潜力(y.-p.gong,et al.,expertopin.ther.pat.,28(2018):167-171)。因此CD73是研发抗癌药物中有希望的靶点。
目前全球多家生物制药公司已经开始积极探索CD73抑制剂对癌症的治疗方面的潜在应用(参见例如，m.al-rashida et al.,eur.j.med.chem.,115(2016):484-494以及其中所引用的文献)。仍然需要开发出具有更好的亲和力和/或活性的抗CD73抗体。
发明内容
针对现有技术中存在的技术问题，本发明提出了一种特异性结合CD73的抗体、其抗原结合片段或其变体，其包括重链可变区和轻链可变区，其中，所述重链可变区包含：CDRH1，其序列如SEQ ID NO.1所示；CDRH2，其序列如SEQ ID NO.2所示；以及CDRH3，其序列如SEQ ID NO.3所示；以及所述轻链可变区包含：CDRL1，其序列如SEQ ID NO.4所示；CDRL2，其序列如SEQ ID NO.5所示；以及CDRL3，其序列如SEQ ID NO.6所示。
在一些实施例中，如上所述的抗体、其抗原结合片段或其变体，其中：重链可变区的序列如SEQ ID NO.7所示；以及轻链可变区的序列如SEQ ID NO.8所示。
在一些实施例中，如上所述抗体或其变体，其进一步包括重链恒定区和轻链恒定区，其中：所述抗体重链恒定区选自IgG、IgM、IgA、IgE或者IgD中的一者或者多者；轻链恒定区选自κ或λ链。
在一些实施例中，其中IgG系列抗体选自IgG1、IgG2和IgG4中的一者或多者。
在一些实施例中，其中所述的抗体或其抗原结合部分选自以下组：全抗体、双特异性抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体。
在一些实施例中，其中所述抗原结合片段选自以下组：Fab片段、Fab’片段、F(ab)2片段、Fv片段和ScFv。
在一些实施例中，其中所述CD73选自灵长目动物CD73。
在一些实施例中，所述灵长目动物选自人类、食蟹猴。
本发明进一步提出了一种融合蛋白，其包含如上任一项的抗体、其抗原结合片段或其变体。
本发明进一步提出了一种或多种分离的核酸分子，其编码如上任一项的抗体、其抗原结合片段或其变体，或如上的融合蛋白。
本发明进一步提出了一种或多种载体，其包含如上的一种或多种分离的核酸分子。
本发明进一步提出了一种细胞，其包含如上的一种或多种分离的核酸分子或如上的一种或多种载体。
在一些实施例中，如上所述的细胞进一步为包含如上的一种或多种分离的核酸分子或如上的一种或多种载体的CAR-T或CAR-NK细胞。
本发明进一步提出了一种用于产生如上任一项的抗体、其抗原结合片段或其变体或如上的融合蛋白的方法，其包括在使得如上任一项的抗体、其抗原结合片段或其变体或如上的融合蛋白能够表达的条件下培养如上的细胞。
本发明进一步提出了一种组合物，其包含如上任一项的抗体、其抗原结合片段或其变体、如上的融合蛋白、如上的一种或多种分离的核酸分子、如上的一种或多种载体和/或如上的细胞，以及任选的药学上可接受的赋形剂。
在一些实施例中，如上任一项的抗体、其抗原结合片段或其变体、如上的融合蛋白、如上的一种或多种分离的核酸分子、如上的一种或多种载体和/或如上的细胞在制备预防和/或治疗癌症或肿瘤的药物中的用途。
在一些实施例中，其中，所述药物为细胞治疗的药物。
在一些实施例中，所述癌症或肿瘤为CD73表达阳性的癌症或肿瘤。
在一些实施例中，其中所述癌症或肿瘤选自结直肠癌、食管癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、膀胱癌、血癌、黑色素瘤、神经胶质瘤、甲状腺癌、前列腺癌和乳腺癌。
在一些实施例中，如上任一项的抗体、其抗原结合片段或其变体、或如上的融合蛋白在制备与CD73蛋白的C端结构域特异结合的试剂或药品中的用途。
在一些实施例中，如上任一项的抗体、其抗原结合片段或其变体、或如上的融合蛋白在制备确定样品中CD73的存在和/或量的试剂中的用途。
本发明进一步提出了一种药物组合物，其包含：如上任一项的抗体、其抗原结合片段或其变体、如上的融合蛋白、如上的一种或多种分离的核酸分子或者如上的一种或多种载体和/或如上的细胞。
本发明的抗CD73抗体具有高结合的亲和力；并且在可溶性蛋白水平和细胞水平都具有抑制CD73酶活的强效活性。此外，抗体的结合可诱导CD73的肿瘤细胞内化，导致细胞表面上的CD73活性进一步降低。与参比抗体相比，本发明抗体表现出更优的体内外抗肿瘤活性，使其成为用于治疗和诊断用途的优秀候选药物分子
本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。
通过引用并入本申请中所提及的所有专利、公开专利申请及非专利出版物均以全文引用的方式明确并入本文中，其并入程度如同特定地及个别地指出将每一个专利或出版物以引用的方式并入。
附图说明
在所附权利要求中具体阐述了本申请的新颖特征。通过参考以下阐述了采用了本申请原理的说明性实施方案的详细描述以及附图(本文中也称为“图(figure)”和“图(FIG)”)将获得对本申请的特征和有利方面的更好理解，其中所述附图：
图1显示根据本发明的一个实施例的抗CD73抗体P3D6的种属交叉反应性；其中CHO-huCD73显示P3D6与人CD73抗原的结合、CHO-cynoCD73显示P3D6与食蟹猴CD73抗原的结合、CHO-mCD73显示P3D6与鼠CD73抗原的结合；
图2显示根据本发明的一个实施例的P3D6与参比抗体TJD5的CHOK1-huCD73细胞结合曲线；其中，参比抗体TJD5作为阳性对照；阴性对照为确定不与CD73结合的同型对照抗体；
图3A显示根据本发明的一个实施例的P3D6与参比抗体MEDI-9447和TJD5的蛋白水平酶活抑制；其中，横坐标表示加入的P3D6、参比抗体MEDI-9447和TJD5或者阴性对照的量；纵坐标表示酶活抑制率；
图3B显示根据本发明的一个实施例的P3D6与参比抗体TJD5的蛋白水平酶活抑制；其中，横坐标表示加入的P3D6、参比抗体TJD5或者阴性对照的量；纵坐标表示酶活抑制率；
图4显示根据本发明的一个实施例的P3D6与参比抗体TJD5、MEDI-9447的细胞水平酶活抑制；其中，横坐标表示加入的P3D6、参比抗体MEDI-9447、TJD5的量；纵坐标表示酶活抑制率；
图5显示根据本发明的一个实施例的P3D6与参比抗体TJD5、阴性对照的内吞活性检测；
图6显示根据本发明的一个实施例的P3D6与参比抗体TJD5、MEDI-9447的混合淋巴反应(MLR)检测；
图7显示根据本发明的一个实施例的P3D6与人CD73的结合解离常数；以及
图8显示根据本发明的一个实施例的P3D6与参比抗体TJD5在小鼠异种移植瘤模型A375的抑瘤效果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在以下的详细描述中，可以参看作为本申请一部分用来说明本申请的特定实施例的各个说明书附图。在附图中，相似的附图标记在不同图式中描述大体上类似的组件。本申请的各个特定实施例在以下进行了足够详细的描述，使得具备本领域相关知识和技术的普通技术人员能够实施本申请的技术方案。应当理解，在不脱离本申请的情况下，本领域技术人员可实施许多变化、改变和替换，可以采用本文描述的本申请的实施方案的各种替代方案。
本发明提供了CD73抗体，无论是可溶形式还是细胞膜表面形式，其对人CD73蛋白和食蟹猴CD73蛋白具有高结合的亲和力；并且在可溶性蛋白水平和细胞水平都具有抑制CD73酶活的强效活性。此外，这些抗体的结合可诱导CD73的肿瘤细胞内化，导致细胞表面上的CD73活性进一步降低。与本发明抗体性质类似(结合C端结构域)已知的天境生物的TJD5相比，本发明抗体表现出更优的体内外抗肿瘤活性，使其成为用于治疗和诊断用途的优秀候选药物分子。
如本文中所用，术语“抗体”通常指由两对相同的多肽链组成的免疫球蛋白分子，每对多肽链具有一条“轻”(L)链和一条“重”(H)链。抗体的轻链可被分为к和λ轻链。重链可被分类为μ、δ、γ、α或ε，并且抗体的同型被分别定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区由约12个或更多个氨基酸的“J”区连接，并且重链还包括约3个或更多个氨基酸的“D”区。每条重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由三个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。每个轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq))的结合。VH和VL区还可细分为称为互补决定区(CDR)的具有高度可变性的区域，所述互补决定区散布在称为框架区(FR)的更保守的区域之间。每个VH和VL从N端到C端按以下顺序排列由3个CDR和4个FR组成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。每个重/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗体结合位点。氨基酸至区域或结构域的分布遵循免疫学相关蛋白的Kabat序列(KabatSequences ofProteins of Immunological Interest)(National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.(1987and 1991))或Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917、Chothia et al.,(1989)Nature 342:878-883的定义。本发明中所述的氨基酸位置基于abysis工具(http://www.bioinf.org.uk/abysis/index.html)的在线比较，并且不代表氨基酸序列中的实际位置。术语“抗体”不受任何抗体产生方法的限制。例如，其包括重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，IgG(例如，IgG 1、IgG2、IgG3或IgG4亚型)、IgAl、IgA2、IgD、IgE或IgM抗体。
如本文中所用，术语“抗原结合片段”通常指全长抗体的一个或多个片段，其保持与所述抗体所结合的相同抗原(例如CD73)结合的能力，并与完整抗体竞争抗原特异性结合。抗原结合片段可通过重组DNA技术或通过酶促或化学切割完整抗体来产生。在一些情况下，抗原结合位点包括Fab、Fab’、F(ab’)2、F(ab)2、Fd、Fv、dAb和互补决定区(CDR)片段、单链抗体(例如，scFv)、嵌合抗体、双抗体和多肽，其至少包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的一部分。
如本文中所用，术语“变体”通常指与母体分子(例如，多肽)至少有一个氨基酸不同的蛋白质。变体可以指分子本身，包含该分子的组合物。当这种分子是多肽或蛋白质时，其也可以指分子的氨基酸序列。在一些情况下，变体与其母体分子(例如，蛋白质)相异在于一个或多个氨基酸，诸如1-50、1-40、1-30、1-20、1-15、1-14、1-13、1-12、1-11、1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3或1-2个氨基酸的添加、缺失或替换。在一些情况下，变体可以与其母体分子的氨基酸序列具有至少约80％(例如，至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高)的序列同源性。
如本文中所用，术语“CD73”通常指蛋白质CD73或编码其的核酸分子。CD73为胞外-5’-核苷酸酶，是胞外核苷酸酶家族的一个成员。腺苷5'-单磷酸(amp)是cd73的主要底物，其水解产物为腺苷。腺苷普遍存在于体内，是对许多生理和病理生理过程至关重要的嘌呤能细胞信号传导的重要调节因子。
如本文中所用，术语“结合特异性”通常指一种物质特异性结合另一种物质，并且不容易随机结合任何其它物质的能力。如特异性结合(例如，与之免疫反应)给定靶标(同时不结合或基本上不结合非靶标)的能力。例如，一种蛋白质可由于其特定的结构而与另一种蛋白质特异性结合。靶向部分可以表现出对相应肿瘤抗原的结合特异性。本申请的抗体(或其抗原结合片段或变体)可以是单特异性的，并且包含一个或多个特异性结合靶标的结合位点，或者可以是多特异性的(例如双特异性或三特异性)，并且包含两个或更多个特异性结合相同或不同靶的结合位点。
如本文中所用，术语“基本上不”通常是指很少或几乎不结合特定物质。例如，非常少或几乎没有(例如，少于10％、少于9％、少于8％、少于7％、少于6％、少于5％、少于4％、少于3％、少于2％、少于1％、少于0.5％、少于0.1％或少于0.01％)。
如本文中所用，术语“KD”通常指平衡解离常数，其为一种特定类型的测量较大物体可逆地分离(离解)成较小组分的倾向(如当复合物分离成其组分分子时)的平衡常数。离解常数是缔合常数的倒数。平衡解离常数KD＝Kd/Ka，KD单位是M(mol/L)。其中，kd为解离常数，其数值小于1，Kd的单位是S-1；Kd表示单位时间内解离了的二者(下文中以AB表示)占解离前初始AB的比例，由此可见Kd能表示解离反应的快慢，Kd越大代表解离越快，Kd越小代表解离越慢；KD为平衡解离常数，可以表示出处于平衡状态的二者的解离程度，KD越大说明解离越多，二者之间的亲和力越弱；KD越小说明解离越少，代表二者之间的亲和力越强。
在抗体(Ab)与抗原(Ag)结合的特定情况下，通常术语亲和常数是指缔合常数。这种化学平衡也是结合速率(kforward)和解离速率(kback)常数的比率。两种抗体可具有相同的亲和力，但一种抗体可具有高的结合以及解离速率常数，而另一种抗体可以具有低的结合以及解离速率常数。
如本文中所用，术语“解离常数”即pKa，是水溶液中具有一定解离度的溶质的极性参数。解离常数给予分子的酸性或碱性以定量的量度，Ka增大，对于质子给予体来说，其酸性增加；Ka减小，对于质子接受体来说，其碱性增加。定义pKa是一种特定类型的平衡常数。解离常数pKa是Ka的负对数。Ka越大，pKa越小。
如本文中所用，术语“单克隆抗体”通常是指一群基本同源的抗体的集合体，即包含该群的各个抗体除了可能的以微量存在的天然发生的突变之外是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，直接针对单个抗原性位点。此外，与包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物相反，每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇修饰语"单克隆"不是被解释为需要通过任何特殊方法产生抗体。例如，所述单克隆抗体可以通过杂交瘤技术制备或者通过使用重组DNA方法在细菌、真核动物或植物细胞中产生单克隆抗体也可以得自噬菌体抗体文库，使用例如Clackson etal.,Nature,352:624-628(1991)和Marks etal.,Mol.Biol.，222:581-597(1991)所述的技术进行。
如本文中所用，术语“嵌合抗体”通常是指这样的抗体，其中每个重链或轻链氨基酸序列的一部分与来自特定物种的抗体中相应氨基酸序列同源，或者属于特定的类别，而该链的其余区段则与另一物种中的相应序列同源。例如，轻链和重链的可变区均来自一个动物物种(如小鼠、大鼠等)的抗体的可变区，而恒定部分则与来自另一物种(如人)的抗体序列同源。例如，为获得嵌合抗体，可利用非人源的B细胞或杂交瘤细胞产生可变区，而与其组合的恒定区则来自人。所述可变区具有易于制备的优点，并且其特异性不受与其组合的恒定区的来源的影响。同时，由于嵌合抗体的恒定区可来源于人类，因此嵌合在注射时抗体引发免疫应答的可能性会低于使用恒定区为非人来源的抗体。
在本申请中，术语“人源化抗体”通常是指一种嵌合抗体，其含有较少的来自非人免疫球蛋白的序列，从而降低异种抗体引入到人类中时的免疫原性，同时保持抗体的完全抗原结合亲和力和特异性。例如，可以使用CDR移植(Jones et al.,Nature 321:522(1986))及其变体；包括“重塑”(reshaping)，(Verhoeyen,et al.,1988Science 239:1534-1536；Riechmann,et al.,1988 Nature 332:323-337；Tempest,et al.,Bio/Technol19919:266-271)，“高度加成”(hyperchimerization)，(Queen,et al.,1989 Proc NatlAcadSci USA 86:10029-10033；Co,et al.,1991Proc Natl Acad Sci USA 88:2869-2873；Co,et al.,1992 J Immunol 148:1149-1154)和“贴面”(veneering)，(Mark,et al.,“Derivation of therapeutically active humanized and veneered anti-CD18antibodies.”In:Metcalf B W,Dalton B J,eds.Cellular adhesion:moleculardefinition to therapeutic potential.New York:Plenum Press,1994:291-312)、表面重建(美国专利US5639641)等技术手段，对非人源的结合域进行人源化。如果其他区域，例如铰链区和恒定区结构域也源自非人来源，则这些区域也可以被人源化。
如本文中所用，术语“完全人抗体”通常指具有完全人氨基酸序列衍生的抗体区域治疗剂的抗体，其中已通过使用遗传修饰的小鼠或通过结合筛选的抗体工程方法在体内选择了抗原特异性。与小鼠或嵌合抗体相比，完全人抗体和人源化抗体在人中诱导免疫反应的风险较低。
如本文中所用，术语“双特异性抗体”通常指能够同时与两种不同类型的抗原结合的人工蛋白质。制造方法的主要类型有四重杂交瘤(quadromas)、化学缀合和基因重组。IgG样形式，除两个Fab位点结合不同的抗原外，保留了两个Fab臂和一个Fc区的常规单克隆抗体(mAb)结构。每个重链和轻链对来自独特的mAb。由两条重链制成的Fc区形成第三个结合位点。非IgG样形式包括化学连接的Fab，仅由Fab区组成，以及各种类型的二价和三价单链可变片段(scFvs)。还有模拟两种抗体可变结构域的融合蛋白。双特异性抗体具有较高的细胞毒性潜能，并与在较低有效剂量下表达相对弱的抗原结合。另外，靶向一种以上的分子可用于规避平行途径的调节并避免对治疗的抗性。
如本文中所用，术语“Fab片段”通常指免疫球蛋白分子的一部分(诸如抗原结合片段)。Fab片段可以包含一条轻链和重链的一部分，具有单个抗原结合位点。Fab片段可以通过木瓜蛋白酶消化免疫球蛋白分子而获得。例如，Fab片段可由每个重链和轻链的一个恒定结构域和一个可变结构域组成。可变结构域可在免疫球蛋白分子的氨基末端含有包含一组互补决定区的互补位(抗原结合位点)。木瓜蛋白酶可用于将免疫球蛋白分子裂解成两个Fab片段和一个Fc片段。胃蛋白酶在铰链区下方裂解，从而形成一个F(ab’)2片段和一个pFc’片段。二价F(ab)2或F(ab’)2片段具有两个通过二硫键连接的抗原结合区。F(ab)2或F(ab’)2片段的还原产生2个单价Fab或Fab’片段，其具有可用于与其它分子缀合的游离巯基。
本文所用的术语“Fv片段”通常指由IgG和IgM类抗体的酶促裂解制成的最小片段。Fv片段具有由VH和VL区制成的抗原结合位点，但它们缺少CH1和CL区。通过非共价相互作用，VH和VL链在Fv片段中结合在一起。
如本文中所用，术语“ScFv”通常指单链抗体片段。ScFv可指重组单链多肽分子，其中抗体的轻链和重链可变区通过肽接头连接。单链抗体(ScFv)通常不包括抗体的Fc区的涉及效应子功能的部分，因此是裸抗体，尽管已知有将此类区域添加到已知ScFv分子中(如果需要的话)的方法。参见Helfrich等人，Arapid and versatile method forharnessingScFv antibody fragments with various biological functions.J ImmunolMethods237:131-145(2000)和de Haard等人，Creating and engineering humanantibodies forimmunotherapy.Advanced Drug Delivery Reviews 31:5-31(1998)。
如本文中所用，术语“IgG”通常指一种亚型的抗体。每个IgG具有两个抗原结合位点。代表了约75％的人血清抗体，IgG是在循环中发现的最常见的抗体类型。被识别的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)。
如本文中所用，术语“修饰”通常指对多肽的肽骨架(例如氨基酸序列)的任何操作或任何翻译后修饰(例如糖基化)。例如，修饰与相应野生型多肽的序列相比较。修饰可以是一个或多个氨基酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)的替换、添加和/或缺失。
如本文中所用，术语“融合蛋白”通常可以指包含与异源多肽(即，与前一多肽或其结构域无关的多肽)的氨基酸序列直接或间接(例如，通过接头)融合的多肽的氨基酸序列，或者由其组成的多肽。
如本文中所用，术语“一种或多种分离的核酸分子”或者“核酸分子”通常是指从其天然环境中分离的或人工合成的任何长度的核苷酸(无论是脱氧核糖核苷酸还是核糖核苷酸或其类似物)的聚合形式。
在本申请中，术语“序列同源性”通常是指同源蛋白质的氨基酸序列具有明显的相似性。
在本申请中，术语“表位”通常是指抗原决定簇，即指分子中被免疫系统识别(例如被抗体识别)的部分。例如，表位是被免疫系统识别的抗原上不连续的三维位点。表位通常由分子的化学活性表面基团(例如氨基酸或糖侧链)组成，并通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。表位根据结构，可分为构象表位和非构象表位(线性表位)。构象表位与非构象表位的区别在于在变性溶剂存在下前者丧失结合，而后者则不会。只位于抗原物质表面、易与抗原识别受体或抗体结合的表位可称为功能性表位；位于分子内部、无免疫原性的表位可称为隐藏性表位。表位可以由连续的残基构成，或者由被抗原聚合物的折叠造成领近的不连续残基形成。在蛋白质中连续氨基酸所形成的表位通常在暴露到变性溶剂时仍被保持，然而不连续氨基酸所形成的表位通常会在所述暴露后丧失。
如本文中所用，术语“载体”或者“一种或多种载体”通常指可将编码蛋白质的多核苷酸插入其中并表达的核酸媒介物。载体中携带的遗传物质元件可以通过用载体转化、转导或转染宿主细胞而在宿主细胞中表达。载体的实施方案包括:质粒；噬菌粒；粘粒；人工染色体，诸如酵母人工染色体(YACs)、细菌人工染色体(BACs)或P1衍生的人工染色体(PACs)；噬菌体诸如λ噬菌体或M13噬菌体和动物病毒。用作载体的动物病毒包括逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(诸如单纯疱疹病毒)、黄疸病毒、杆状病毒、乳头状瘤病毒、乳多空病毒(诸如SV40病毒)。载体可包含多种控制表达的元件，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件和报告基因。另外，载体还可包含复制起点。载体还可能包括有助于其进入细胞的组分，诸如病毒颗粒、脂质体或蛋白壳，但不仅仅是这些物质。
如本文中所用，术语“细胞”或者“宿主细胞”通常指向其中引入载体的细胞，包括许多细胞类型，诸如原核细胞诸如大肠杆菌(Escherichia coli)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、真菌细胞诸如酵母细胞或曲霉属(Aspergillus)细胞、昆虫细胞诸如S2果蝇细胞或Sf9，或动物细胞诸如成纤维细胞、CHO细胞、COS细胞、NSO细胞、HeLa细胞、BHK细胞、HEK293细胞或人细胞。在本申请中，术语“重组宿主细胞”通常指在其中引入了重组表达载体的细胞。所述重组宿主细胞不仅包括某种特定的细胞，还包括这些细胞的后代。
如本文中所用，术语“使得能够表达的条件”通常指使得能够表达本申请的抗体、其抗原结合片段或其变体的条件。在一些实施方案中，使得能够表达的条件包括但不限于孵育时间、温度和培养基，并且可以取决于细胞类型，以及可由本领域普通技术人员容易地确定。在一些实施方案中，在产生本申请的抗体、其抗原结合片段或其变体的过程中，将细胞在培养中生长，并且在可用于生长培养物的任何装置(包括发酵罐)中生长。可将细胞生长成单层或附着至表面。或者，可将细胞悬浮生长。可将细胞在无血清培养基中生长。
如本文中所用，术语“癌症”通常指一组涉及异常细胞生长的疾病，其具有侵入或扩散到身体其它部位的潜力。癌症从根本上说是一种组织生长调节的疾病。为了使正常细胞转化为癌细胞，必须改变调节细胞生长和分化的基因。受影响的基因分为两大类。癌基因是促进细胞生长和繁殖的基因。肿瘤抑制基因是抑制细胞分裂和存活的基因。恶性转化可通过新型癌基因的形成、正常癌基因的不适当过表达或肿瘤抑制基因的表达不足或失活而发生。通常，要将正常细胞转化为癌细胞，需要多个基因的改变。癌症按细胞类型分类，包括癌、肉瘤、淋巴瘤和白血病、生殖细胞肿瘤和母细胞瘤。
如本文中所用，术语“肿瘤”是指机体在各种致瘤因子作用下，局部组织细胞增生所形成的新生物(neogrowth)，因为这种新生物多呈占位性块状突起，也称赘生物(neoplasm)。肝癌和胰腺癌均被称为“癌中之王”，都是恶性程度极高的肿瘤。研究发现，肿瘤细胞会出现不同于正常细胞的代谢变化，同时肿瘤细胞自身可通过糖酵解和氧化磷酸化(OXPHOS)之间的转换来适应代谢环境的改变。2019年，Cancer Cell最新刊登了一篇文章，研究人员发现在禁食状态下使用二甲双胍可以显著抑制肿瘤生长，并提出PP2A-GSK3β-MCL-1通路可能是肿瘤治疗的新靶点。
如本文中所用，术语“T细胞”通常指在细胞介导的免疫中起核心作用的一种类型的淋巴细胞(白细胞的一种亚型)。通过细胞表面存在的T细胞受体，可以将T细胞与其它淋巴细胞(诸如B细胞和天然杀伤细胞)区分开来。它们被称为T细胞，因为它们在胸腺中从胸腺细胞成熟。大多数人T细胞在细胞受体上重新排列它们的α和β链，并被称为alpha beta T细胞(αβT细胞)，是适应性免疫系统的一部分。特化γδT细胞(人体内的一小部分T细胞，在反刍动物中更常见)具有不变的T细胞受体，其多样性有限，能够有效地向其它T细胞呈递抗原，并被认为是先天免疫系统的一部分。
如本文中所用，术语“CHOK1”或“CHO”为仓鼠卵巢细胞，其中CHOK1为仓鼠卵巢细胞的一个亚株，二者均为为常用的实验用细胞。在本申请中，CHOK1和CHO可以互换。
如本文中所用，术语“A375细胞”是指人黑色素瘤细胞。该细胞的物种来源可以时人源、鼠源或其他物种来源。
如本文中所用，术语“MEDI9447”、“BMS986179”以及“TJD5”均为现已知的抗CD73抗体，用以作为本申请抗CD73抗体P3D6的参比抗体。
如本文中所用，术语“二抗”是指识别P3D6和参比抗体的带荧光的抗体，如抗人IgG-PE。
如本文中所用，术语“药学上可接受的赋形剂”通常指与药物施用相容的任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、等渗剂和吸收延迟剂等。
如本文中所用，术语“EC50”是指半最大效应浓度(concentration for 50％ofmaximal effect,EC50)是指能引起50％最大效应的浓度。EC50是药物安全性指标。其含义是：引起50％个体有效的药物浓度。LD50/ED50、TD50/ED50、TC50/EC50等统称为治疗指数，是一类药物的安全指标，通常其值越大越安全。需注意这些指标只反映治疗作用与急性毒性的关系，并不能反映慢性毒性、过敏性。
如本文中所用，术语“IC50”是指半抑制浓度，或称半抑制率，其在间接竞争ELISA标准曲线中是一个非常重要的数据。
如本文中所用，术语“约”通常是指基于本领域普通技术可以合理推断的给定值的近似值，包括由于该给定值的实验和/或测量条件而产生的等价值和近似值。例如，其可以指比该术语所修饰的值高或低不超过10％的值。例如，术语“约5μg/kg”是指4.5μg/kg至5.5μg/kg的范围。作为另一个实例，“约1小时”意指48分钟到72分钟的范围。
如本文中所用，术语“有效量”通常是指足以提供足够高的浓度以赋予其接受者有益效果的剂量。任何特定受试者的特定治疗有效剂量水平将取决于多种因素，包括所治疗的病症、病症的严重程度、特定组分的活性、施用途径、清除率、治疗持续时间、受试者的年龄、体重、性别、饮食和一般健康状况以及其它相关因素。
本发明提供了CD73抗体，无论是可溶形式还是细胞膜表面形式，其对人CD73蛋白和食蟹猴CD73蛋白具有高结合的亲和力；并且在可溶性蛋白水平和细胞水平都具有抑制CD73酶活的强效活性。与已知CD73抗体MedImmune的MEDI-9447不同，本发明的抗体可以在细胞水平和可溶性蛋白水平达到CD73酶活功能的完全抑制，无所谓的“钩状效应”。可能是因为本发明抗体结合抗原的表位为CD73的C端结构域，不同于结合CD73的N端结构域的MEDI-9447。此外，这些抗体的结合可诱导CD73的肿瘤细胞内化，导致细胞表面上的CD73活性进一步降低。与本发明抗体性质类似(结合C端结构域，无“钩状效应”)已知的天境生物的TJD5相比，本发明抗体表现出更优的体内外抗肿瘤活性，使其成为用于治疗和诊断用途的优秀候选药物分子。
本申请提供了一种抗体、其抗原结合片段或其变体，其以1×10-9M以下(例如KD的值不高于约1×10-9M、不高于约9×10-10M、不高于约8×10-10M、不高于约7×10-10M、不高于约6×10-10M、不高于约5×10-10M、不高于约4×10-10M、不高于约3×10-10M、不高于约2×10-10M、不高于1×10-10M或不高于约2×10-11M或以下)的KD值与CD73蛋白相结合。也就是说，该抗体、其抗原结合片段或其变体特异性结合CD73蛋白。进一步地，CD73蛋白来自灵长目动物。进一步地，CD73蛋白选自以下组：人类D73和猴子CD73。在本申请中，对该特异性结合CD73蛋白的抗体、其抗原结合片段或其变体命名为P3D6。
在一些实施例中，本申请P3D6的重链可变区包含CDRH1，其序列如SEQ ID NO.1所示、CDRH2，其序列如SEQ ID NO.2所示、以及CDRH3，其序列如SEQ ID NO.3所示；以及所述轻链可变区包含CDRL1，其序列如SEQ ID NO.4所示、CDRL2，其序列如SEQ ID NO.5所示、以及CDRL3，其5序列如SEQ ID NO.6所示。
在一些实施例中，本申请P3D6的重链可变区的序列如SEQ ID NO.7所示；
以及轻链可变区的序列如SEQ ID NO.8所示。
进一步，在一些实施例中，本申请P3D6的重链恒定区选自IgG(IgG1、IgG2或者IgG4)、IgM、IgA、IgE或者IgD中的一者或者多者；轻链恒定区选0自κ或λ链。
在一些实施例中，本申请的P3D6的抗体或其抗原结合部分选自以下组：
全抗体、双特异性抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体。
在一些实施例中，本申请的P3D6的抗原结合片段选自以下组：Fab片段、
Fab’片段、F(ab)2片段、Fv片段和ScFv。
5进一步地，本申请的P3D6可以特异识别并结合灵长目动物的CD73蛋白，
而几乎不识别啮齿类动物的CD73。其中，灵长类动物包括但不限于人类、狐猴科、大狐猴科、指猴科、懒猴科、眼镜猴科、悬猴科、狨科、猕猴科、长臂猿科和猩猩科；进一步地，所述灵长目动物为人类和食蟹猴。啮齿类动物包括
但不限于小鼠、大鼠。本申请所述的CD73蛋白可为人CD73蛋白或猴CD730蛋白。例如，所述的CD73蛋白可以不为小鼠CD73蛋白，或者可以不为大鼠CD73蛋白。在某些实施方式中，本申请所述的抗体、其抗原结合片段或变体基本上不结合小鼠CD73蛋白或大鼠CD73蛋白。
在一些实施例中，P3D6对CD73的结合能力与参比抗体TJD5——已知的抗CD73抗体相当。在一些实施例中，P3D6与灵长类动物CD73蛋白的结合5活性具有剂量依赖性。在一些实施例中P3D6可以更好的发挥酶活抑制功能，具备更优的蛋白水平酶活抑制活性。
进一步地，P3D6结合于CD73蛋白的抗原表位C端结构域。
本申请所述的变体可选自下组：1)在所述抗体或所述其抗原结合片段中经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸的蛋白质或多肽；和2)与所述抗体或所述其抗原结合片段具有至少约85％(例如，具有至少约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高的)序列同源性的蛋白质或多肽。在一些实施例中，还可以在本申请P3D6的轻链和/或重链的氨基酸序列中包含一个或多个随机突变(例如，一个或多个、如一个或数个氨基酸取代)。在本申请中，发生突变后的CD73抗体或其抗原结合片段或变体，仍具有特异性结合人CD73蛋白和猴CD73蛋白的能力。
在另一个方面，本申请还提供了分离的一种或多种核酸分子。所述一种或多种核酸分子可编码本申请所述的抗体、其抗原结合片段或变体。例如，所述一种或多种核酸分子中的每一个核酸分子可以编码完整的所述抗体、其抗原结合片段或变体，也可以编码其中的一部分(例如，CDRH1-3、CDRL1-3、VL、VH、轻链或重链中的一种或多种)。
本申请所述的核酸分子中的至少一种所述核酸分子可经密码子优化。例如，所述密码子优化的方法包括但不限于：消除稀有密码子、调整GC含量、增加mRNA的稳定性、调整mRNA的二级结构、合理设计接头和调整起始密码子环境。
本申请所述的核酸分子可以为分离的。例如，其可以是通过以下方法产生或合成的：(i)在体外扩增的，例如通过聚合酶链式反应(PCR)扩增产生的，(ii)通过克隆重组产生的，(iii)纯化的，例如通过酶切和凝胶电泳分级分离，或者(iv)合成的，例如通过化学合成。在某些实施方式中，所述分离的核酸是通过重组DNA技术制备的核酸分子。
在本申请中，可以通过本领域已知的多种方法来制备编码所述的抗体、其抗原结合片段或变体的核酸，这些方法包括但不限于，采用限制性片段操作或采用合成性寡核苷酸的重叠延伸PCR，具体操作可参见Sambrook等人，Molecular Cloning,ALaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.，1989；和Ausube等人Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing andWiley-Interscience,New York N.Y.,1993。
在另一个方面，本申请提供了一种或多种载体，其包含本申请所述的一种或多种核酸分子。每种载体中可包含一种或多种所述核酸分子。此外，所述载体中还可包含其他基因，例如允许在适当的宿主细胞中和在适当的条件下选择该载体的标记基因。此外，所述载体还可包含允许编码区在适当宿主中正确表达的表达控制元件。这样的控制元件为本领域技术人员所熟知的，例如，可包括启动子、核糖体结合位点、增强子和调节基因转录或mRNA翻译的其他控制元件等。在某些实施方式中，所述表达控制序列为可调的元件。所述表达控制序列的具体结构可根据物种或细胞类型的功能而变化，但通常包含分别参与转录和翻译起始的5’非转录序列和5’及3’非翻译序列，例如TATA盒、加帽序列、CAAT序列等。例如，5’非转录表达控制序列可包含启动子区，启动子区可包含用于转录控制功能性连接核酸的启动子序列。所述表达控制序列还可包括增强子序列或上游活化子序列。本申请所述的一种或多种核酸分子可以与所述表达控制元件可操作地连接。
所述载体可以包括，例如质粒、粘粒、病毒、噬菌体或者在例如遗传工程中通常使用的其他载体。例如，所述载体为表达载体。例如，所述表达载体可以为T-easy。
在另一个方面，本申请提供了宿主细胞，所述宿主细胞可包含本申请所述的一种或多种核酸分子和/或本申请所述的一种或多种载体。在某些实施方式中，每种或每个宿主细胞可包含一个或一种本申请所述的核酸分子或载体。在某些实施方式中，每种或每个宿主细胞可包含多个(例如，2个或以上)或多种(例如，2种或以上)本申请所述的核酸分子或载体。例如，可将本申请所述的载体引入所述宿主细胞中，例如真核细胞，如来自植物的细胞、真菌或酵母细胞等。可通过本领域已知的方法将本申请所述的载体引入所述宿主细胞中，例如电穿孔、lipofectine转染、lipofectamin转染等。例如，所述宿主细胞可以为CHO-K1。
在另一个方面，本申请提供了制备所述的抗体、其抗原结合片段或变体的方法。所述方法可包括，在使得所述的抗体、其抗原结合片段或变体表达的条件下，培养所述本申请所述的宿主细胞。例如，可通过使用适当的培养基、适当的温度和培养时间等，这些方法是本领域普通技术人员所了解的。
在某些情形中，所述方法还可包括分离和/或纯化所述抗体或其抗原结合片段的步骤。例如，可以采用蛋白G-琼脂糖或蛋白A-琼脂糖进行亲和层析，还可通过凝胶电泳和/或高效液相色谱等来纯化和分离本申请所述的抗体或其抗原结合片段。例如，还可以使用Protein A亲和纯化。
在另一个方面，本申请提供了一种药物组合物，其可包含本申请所述的抗体、其抗体结合片段或变体，所述的核酸分子，所述的载体，所述的宿主细胞，以及任选地药学上可接受的佐剂。
所述药学上可接受的佐剂可以包括缓冲剂、抗氧化剂、防腐剂、低分子量多肽、蛋白质、亲水聚合物、氨基酸、糖、螯合剂、反离子、金属复合物和/或非离子表面活性剂等。
在本申请中，所述药物组合物可被配制用于口服给药，静脉内给药，肌肉内给药，在肿瘤部位的原位给药，吸入，直肠给药，阴道给药，经皮给药或通过皮下储存库给药。
所述药物组合物可以用于抑制肿瘤生长。例如，本申请的药物组合物可以抑制或延缓疾病的发展或进展，可以减小肿瘤大小(甚至基本消除肿瘤)，和/或可以减轻和/或稳定疾病状态。
本申请所述的药物组合物可以包含治疗有效量的所述抗体或其抗原结合片段。所述治疗有效量是能够预防和/或治疗(至少部分治疗)患有或具有发展风险的受试者中的病症或病症(例如癌症)和/或其任何并发症而所需的剂量。
另一方面，本申请提供了所述的抗体、其抗原结合片段或变体在制备预防或治疗肿瘤的药物中的用途。
另一方面，本申请提供了用于预防或治疗肿瘤的所述的抗体、其抗原结合片段或变体。
另一方面，本申请提供了预防或治疗肿瘤的方法，其包括向有需要的受试者施用本申请所述的抗体、其抗原结合片段或变体、所述的分子核酸、所述的载体、所述的宿主细胞和/或所述的药物组合物。
本申请的P3D6、或包含P3D6的融合蛋白在制备确定样品中CD73的存在和/或量的试剂中的用途。
包含本申请P3D6、包含P3D6的融合蛋白、编码P3D6的一种或多种分离的核酸分子或者包含编码P3D6的核酸分子的一种或多种载体和/或包含上述抗体、融合蛋白、核酸分子、载体的细胞的药物组合物。
在本申请中，所述肿瘤可包括CD73阳性的肿瘤。例如，所述CD73阳性的肿瘤可以选自以下组：结直肠癌、食管癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、膀胱癌、血癌、黑色素瘤、神经胶质瘤、甲状腺癌、前列腺癌和乳腺癌。
不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的产品、方法或系统的工作方式，而不用于限制本申请发明的范围。
实施例
实施例1:抗-CD73抗体P3D6的产生
采用多种不同的免疫策略(DNA免疫、蛋白免疫、细胞免疫)来免疫不同种属的小鼠，包括Balb/c，SJL品种的小鼠。利用Beacon筛选阳性结合人CD73的小鼠B细胞，并通过序列提取、测序，分离得到了能够特异性识别人CD73的候选分子P3D6。
根据Kabat序列判断法，分析抗体可变区的氨基酸序列如下所示。
在本实施例中，抗CD73抗体P3D6的重链可变区的互补决定区CDRH1序列为：NYWMH、CDRH2序列为：YINPSTSYTDYNRNFKD、CDRH3序列为：SGRWDFFDY。在本实施例中，抗CD73抗体P3D6的轻链可变区的互补决定区CDRL1序列为：KASQNVGSNVA、CDRL2序列为：SASYRNN、CDRL3序列为：HQYNIYPYT。
进一步地，在本申请中，抗CD73抗体P3D6的重链可变区VH序列为：
QVQLQQSGAELAKPGASVKMSCKASGYTFTNYWMHWLKQRPGQGL EWIGYINPSTSYTDYNRNFKDKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSGESAVYFCA RSGRWDFFDYWGQGTTLTVSS；
轻链可变区VL序列为：
DIVMTQSQKFMSTSIGDWVSVTCKASQNVGSNVAWYQQKPGQSPKAL IHSASYRNNGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCHQYNIYPYTFG GGTKLEIK。
根据Kabat序列判断法，分析抗体全长的氨基酸序列，其重链和轻链的恒定区序列如下所示：
抗CD73抗体P3D6的重链恒定区序列为：
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
抗CD73抗体P3D6的轻链恒定区序列为：
AAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
实施例2:P3D6的种属交叉反应性
通过FACS检测P3D6与过表达不同种属CD73的CHOK1结合，评价其种属交叉反应性。
按照细胞培养的SOP操作，培养并处理相应的表达人、猴、鼠CD73抗原的稳转细胞系，包括CHOK1-huCD73，CHOK1-cynoCD73，CHOK1-mCD73。将消化后收获的细胞在室温下300g离心5分钟，丢弃上清后，用FACS缓冲液(PBS+2％FBS)清洗2次。在96孔板中放入(2-5)×105/孔的细胞，离心丢弃上清后，用稀释好的抗体溶液重悬细胞，100uL/孔，混匀后，在4℃中孵育1小时。4℃，300g离心5分钟，丢弃上清抗体溶液，使用FACS缓冲液清洗细胞2次，分别加入相应的二抗溶液，100uL/孔，在4度中孵育1小时。4℃，300g离心5分钟，丢弃上清抗体溶液，使用FACS缓冲液清洗细胞2次，最后使用PBS重悬细胞后，在BD流式细胞仪上检测信号值。
图1显示了根据本申请一个实施例的P3D6的种属交叉反应性。结果如图1所示，P3D6可以识别并结合灵长类动物人和食蟹猴的CD73，不能识别啮齿类动物小鼠的CD73。
实施例3:P3D6的结合活性
通过FACS检测不同浓度下P3D6与细胞表面huCD73结合测得EC50，评价其结合活性。
如上所述流式细胞术方法，培养并处理表达人CD73抗原的稳转细胞系CHOK1-huCD73。将消化后收获的细胞在室温下300g离心5分钟，丢弃上清后，用FACS缓冲液(PBS+2％FBS)清洗2次。在96孔板中放入(2-5)×105/孔的细胞，离心丢弃上清后，用稀释好的不同浓度梯度抗体溶液重悬细胞，100uL/孔，混匀后，在4℃中孵育1小时。4℃，300g离心5分钟，丢弃上清抗体溶液，使用FACS缓冲液清洗细胞2次，分别加入相应的二抗溶液，100uL/孔，在4度中孵育1小时。4℃，300g离心5分钟，丢弃上清抗体溶液，使用FACS缓冲液清洗细胞2次，最后使用PBS重悬细胞后，在BD流式细胞仪上检测信号值。
图2显示了根据本申请一个实施例的P3D6与参比抗体TJD5的CHOK1-huCD73细胞结合曲线，表1为根据本申请一个实施例的P3D6与参比抗体MEDI-9447的CHOK1-huCD73细胞结合参数。结果如图2和表1所示，P3D6与细胞表面的人CD73有较强的结合活性。说明P3D6能够有效的结合到过表达了人CD73的CHOK1-huCD73细胞表面，并且具有一定的剂量依赖性，其结合能力与参比抗体TJD5相当。
表1：P3D6与参比抗体MEDI-9447的CHOK1-huCD73细胞结合参数
P3D6 TJD5 Isotype
Top 39618 31747 4597
EC50(nM) 2.689 3.978 NA
拟合度(R2) 0.9965 0.9997 0.9998
实施例4:P3D6的蛋白水平酶活抑制功能
通过蛋白水平酶活抑制功能的检测，评价P3D6的生物学功能。
在TM缓冲液中稀释5×的抗原蛋白溶液(终浓度300ng/ml)，在96孔板中加入50uL/孔稀释液。在TM缓冲液中稀释一定比例的5×抗体稀释液，在96孔板中加入50uL/孔稀释液，混匀后，37℃中孵育30分钟。在TM缓冲液中稀释10×的AMP(终浓度为200uM)，在96孔板中加入25uL/孔稀释液，37℃中孵育30分钟。取50uL上清到新的96孔板中，加入TM缓冲液稀释的2×ATP溶液(终浓度为65uM)，50uL/孔加入到50uL上清中，再加入100uL/孔的荧光细胞活性检测系统(CellTiter Glo Reagent)。室温中混匀孵育10分钟，读取发光信号。
图3A显示了根据本申请一个实施例的P3D6与参比抗体TJD5、MEDI-9447的蛋白水平酶活抑制；如图3A所示，P3D6与参比抗体TJD5不同于参比抗体MEDI-9447，都没有在高浓度抗体情况下出现蛋白水平酶活抑制活性降低的情况(“钩状效应”)，均能够完全抑制CD73蛋白的酶活功能。
图3B显示了根据本申请一个实施例的P3D6与参比抗体TJD5的蛋白水平酶活抑制比较；表2是根据本申请一个实施例的P3D6与参比抗体TJD5的蛋白水平酶活抑制比较。如图3B所示，P3D6与参比抗体TJD5相比，蛋白水平酶活抑制活性相当。
表2：P3D6与参比抗体TJD5的蛋白水平酶活抑制比较
顶点值 IC50
P3D6 98.983 1.609
TJD5 99.075 1.528
实施例5:P3D6的细胞水平酶活抑制功能
通过细胞水平酶活抑制功能的检测，评价P3D6的生物学功能。
在TM缓冲液中稀释5×细胞悬液(3200个CHOK1-hCD73/孔)，在96孔板中加入50uL/孔稀释液。在TM缓冲液中稀释一定比例的5×抗体稀释液，在96孔板中加入50uL/孔稀释液，混匀后，37℃中孵育30分钟。在TM缓冲液中稀释10×的AMP(终浓度为200uM)，在96孔板中加入25uL/孔稀释液，37℃中孵育30分钟。取50uL上清到新的96孔板中，加入TM缓冲液稀释的2×ATP溶液(终浓度为65uM)，50uL/孔加入到50uL上清中，再加入100uL/孔的荧光细胞活性检测系统(CellTiter Glo Reagent)。室温中混匀孵育10分钟，读取发光信号。
图4显示了根据本申请一个实施例的P3D6与参比抗体TJD5、MEDI-9447的细胞水平酶活抑制，表3为根据本申请一个实施例的P3D6与参比抗体TJD5、MEDI-9447的细胞水平酶活抑制。结果如图4和表3所示，P3D6与参比抗体MEDI-9447相比，随着抗体浓度的增加能够完全抑制细胞过表达的CD73的酶活功能，而参比抗体MEDI-9447随着抗体浓度的增加最高只能抑制大约81％细胞过表达的CD73的酶活功能。P3D6与参比抗体TJD5随着抗体浓度的增加均可以完全抑制细胞过表达的CD73的酶活功能，但P3D6具有更小的IC50，具有更优的酶活抑制功能。
表3:P3D6与参比抗体TJD5、MEDI-9447的细胞水平酶活抑制
顶点值 IC50
P3D6 103.352 0.352
MEDI9447 81.135 0.417
TJD5 99.332 0.669
实施例6:P3D6的内吞活性检测
通过FACS检测P3D6与参比抗体的内吞活性。
在96孔板中加入100uL浓度为2×106/mL的CHOK1-huCD73细胞悬液，300g，4℃离心5分钟，弃去上清。每孔加入100uL的CD73 Tab抗体，使抗体终浓度为20ug/mL，在4℃中孵育30分钟。使用FACS缓冲液清洗细胞2次以去除未结合的多余抗体。使用100ul FACS缓冲液重悬细胞后，分别在4℃和37℃中进行内吞作用1、2和4小时。不同时间点和温度的细胞使用2％的多聚甲醛固定液在冰上固定15分钟，洗去上清后，分别加入相应的二抗溶液，100uL/孔，在4℃中孵育1小时。4℃，300g离心5分钟，丢弃上清抗体溶液，使用FACS缓冲液清洗细胞2次，最后使用PBS重悬细胞后，在BD流式细胞仪上检测信号值。
表4：P3D6与参比抗体TJD5的内吞活性检测
图5显示了根据本申请一个实施例的P3D6与参比抗体TJD5的内吞活性检测参数，表4是根据本申请一个实施例的P3D6与参比抗体TJD5的内吞活性检测结果。如图5和表4所示，P3D6内吞活性显著优于参比抗体TJD5，能够更好的减少细胞表面的CD73，发挥更好的生物学活性。
实施例7:P3D6的混合淋巴反应(MLR)检测
通过MLR检测，评价P3D6的体外免疫激活功能。
调整DC(stimulator)细胞浓度至1×106/ml，加入10ug/ml丝裂霉素C(mitomycinC)抑制DC增殖，37℃孵育45分钟。500g离心5分钟后用10mL PBS清洗2次。按照试剂盒手册(EasySepTMHuman CD4+ T Cell Isolation试剂盒)从PBMC中分离纯化CD4+ T细胞(Responder)。用X-VIVO15培养基调整CD4+T细胞的密度至2×106/ml，调整DC细胞的密度至4×105/ml，1:1等体积混合CD4+T细胞和DC细胞(DC：CD4+T＝1:20)。加入100uL/孔混合细胞悬浮液至96孔板，加入50uL/孔5×anti-PD1(终浓度10nM)，50uL/孔5×AMP(终浓度40uM)和50uL/孔5×梯度稀释的抗体，37℃孵育120小时后，500g,5min离心后，收集上清，按照IFN-γHTRF试剂盒(Cisbio,CAT#62HIFNGPEG)的说明书检测上清中IFN-γ的含量。
图6显示了根据本申请一个实施例的P3D6与参比抗体TJD5、MEDI-9447的MLR检测。结果如图6所示，P3D6可以拮抗AMP介导的免疫抑制状态，表现为促进CD4+T细胞干扰素释放。加入一定浓度的P3D6后，能够显著促进CD4+T细胞释放干扰素，具有一定的剂量依赖性，其促进干扰素释放的能力，与参比抗体TJD5及MEDI-9447相当，证明了P3D6的生物学活性。。
实施例8:P3D6的抗原表位分类
为了进一步明确P3D6结合CD73的表位，与已知结合CD73不同区域表位的参比抗体MEDI9447和TJD5通过竞争FACS法，明确其抗原结合区域。
按照细胞培养的SOP操作，培养并处理相应的表达抗原的稳转细胞系。将消化后收获的细胞在室温下300g离心5分钟，丢弃上清后，用FACS缓冲液(PBS+2％FBS)清洗2次。在96孔板中放入(2-5)×E+05/孔的细胞，离心丢弃上清后，用40ug/ml非标记的抗体溶液重悬细胞，100uL/孔，混匀后，在4℃中孵育30分钟。无需洗涤，加入荧光标记的抗体溶液重悬细胞，100uL/孔，混匀后，在4℃中孵育45分钟。4℃，300g离心5分钟，丢弃上清抗体溶液，使用FACS缓冲液清洗细胞3次，最后使用PBS重悬细胞后，在BD流式细胞仪上检测信号值。
表6：P3D6的抗原表位分类
表6为根据本申请一个实施例的P3D6的抗原表位分类。结果如表6所示，P3D6与TJD5的结合表位重叠，与MEDI9447的结合表位不同。证明P3D6结合CD73抗原的表位为C端结构域。
实施例9:P3D6的亲和力检测
通过Biacore对P3D6的亲和力进行检测。
CM5芯片通过氨基偶联一定量的抗人IgG抗体，通过捕获法捕获一定量的抗体，不同浓度人CD73-his以分析物流过芯片，检测其亲和力。
图7显示了根据本申请一个实施例的P3D6与人CD73的结合解离常数。表7为根据本申请一个实施例的P3D6与人CD73的结合解离常数。结果如图7和表7所示，表明抗体P3D6对CD73靶标蛋白有较高亲和力，达1.24x10-9M。
表7：P3D6与人CD73的结合解离常数参数
实施例10:P3D6的体内药效
评价P3D6与同类型参比抗体MEDI-9447受试物在A375细胞异种移植肿瘤模型中的体内药效。
将含4×106个A375细胞的0.2mL细胞悬液(细胞悬基础培养基DMEM＝200μL)皮下接种于每只BALB/c nude小鼠的右后背。在接种后第21天，肿瘤平均体积达到99.16mm3时开始分组给药。每组8只小鼠，给药剂量10mg/kg，每周给药三次，如果体重下降超过15％，应立即停止给药，直到体重恢复至初始体重的98％以上后恢复正常给药；若体重减低超过20％，则安乐死动物。
图8显示了根据本申请一个实施例的A375细胞异种移植肿瘤体积的相对变化。表8为根据本申请一个实施例的A375细胞异种移植肿瘤体积的相对变化。如图8和表8所示，表明抗体P3D6和TJD5均有有效抑制A375的增殖，相比于TJD5，P3D6的抑瘤效果更加显著。
表8：A375细胞异种移植肿瘤体积的相对变化
综上，本发明提供了CD73抗体，无论是可溶形式还是细胞膜表面形式，其对人CD73蛋白和食蟹猴CD73蛋白具有高结合的亲和力；并且在可溶性蛋白水平和细胞水平都具有抑制CD73酶活的强效活性。与已知CD73抗体MedImmune的MEDI-9447不同，本发明的抗体可以在细胞水平和可溶性蛋白水平达到CD73酶活功能的完全抑制，无所谓的“钩状效应”。可能是因为本发明抗体结合抗原的表位为CD73的C端结构域，不同于结合CD73的N端结构域的MEDI-9447。此外，这些抗体的结合可诱导CD73的肿瘤细胞内化，导致细胞表面上的CD73活性进一步降低。与本发明抗体性质类似(结合C端结构域，无“钩状效应”)已知的天境生物的TJD5相比，本发明抗体表现出更优的体内外抗肿瘤活性，使其成为用于治疗和诊断用途的优秀候选药物分子。
上述实施例仅供说明本发明之用，而并非是对本发明的限制，有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明范围的情况下，还可以做出各种变化和变型，因此，所有等同的技术方案也应属于本发明公开的范畴。

Claims (22)

1.一种特异性结合CD73的抗体、其抗原结合片段或其变体，其包括重链可变区和轻链可变区，其中，
所述重链可变区包含：
CDRH1，其序列如SEQ ID NO.1所示；
CDRH2，其序列如SEQ ID NO.2所示；以及
CDRH3，其序列如SEQ ID NO.3所示；以及
所述轻链可变区包含：
CDRL1，其序列如SEQ ID NO.4所示；
CDRL2，其序列如SEQ ID NO.5所示；以及
CDRL3，其序列如SEQ ID NO.6所示。
2.根据权利要求1所述的抗体、其抗原结合片段或其变体，其中：重链可变区的序列如SEQ ID NO.7所示；以及轻链可变区的序列如SEQ ID NO.8所示。
3.根据权利要求1所述抗体、其抗原结合片段或其变体，其进一步包括重链恒定区和轻链恒定区，其中：所述抗体重链恒定区选自IgG、IgM、IgA、IgE或者IgD中的一者或者多者；轻链恒定区选自κ或λ链。
4.根据权利要求3所述抗体、其抗原结合片段或其变体，其中IgG系列抗体选自IgG1、IgG2和IgG4中的一者或多者。
5.根据权利要求1所述的抗体、其抗原结合片段或其变体，其中所述的抗体或其抗原结合部分选自以下组：全抗体、双特异性抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体。
6.根据权利要求1所述的抗体、其抗原结合片段或其变体，其中所述抗原结合片段选自以下组：Fab片段、Fab’片段、F(ab)2片段、Fv片段和ScFv。
7.根据权利要求1所述的抗体、其抗原结合片段或其变体，其中所述CD73选自灵长目动物CD73。
8.根据权利要求7所述的抗体、其抗原结合片段或其变体，所述灵长目动物选自人类、食蟹猴。
9.一种融合蛋白，其包含根据权利要求1-8中任一项的抗体、其抗原结合片段或其变体。
10.一种或多种分离的核酸分子，其编码根据权利要求1-8中任一项的抗体、其抗原结合片段或其变体，或根据权利要求9的融合蛋白。
11.一种或多种载体，其包含根据权利要求10的一种或多种分离的核酸分子。
12.一种细胞，其包含根据权利要求10的一种或多种分离的核酸分子或根据权利要求11的一种或多种载体。
13.根据权利要求12所述的细胞，其进一步为包含根据权利要求10的一种或多种分离的核酸分子或根据权利要求11的一种或多种载体的CAR-T或CAR-NK细胞。
14.一种用于产生根据权利要求1-8中任一项的抗体、其抗原结合片段或其变体或根据权利要求9的融合蛋白的方法，其包括在使得根据权利要求1-8中任一项的抗体、其抗原结合片段或其变体或根据权利要求9的融合蛋白能够表达的条件下培养根据权利要求12或13的细胞。
15.一种组合物，其包含根据权利要求1-8中任一项的抗体、其抗原结合片段或其变体、根据权利要求9的融合蛋白、根据权利要求10的一种或多种分离的核酸分子、根据权利要求11的一种或多种载体和/或根据权利要求12或13的细胞，以及任选的药学上可接受的赋形剂。
16.根据权利要求1-8中任一项的抗体、其抗原结合片段或其变体、根据权利要求9的融合蛋白、根据权利要求10的一种或多种分离的核酸分子、根据权利要求11的一种或多种载体和/或根据权利要求12或13的细胞在制备预防和/或治疗癌症或肿瘤的药物中的用途。
17.根据权利要求16所述的用途，其中，所述药物为细胞治疗的药物。
18.根据权利要求16所述的用途，其中，所述癌症或肿瘤为CD73表达阳性的癌症或肿瘤。
19.根据权利要求18所述的应用，其中所述癌症或肿瘤选自结直肠癌、食管癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、膀胱癌、血癌、黑色素瘤、神经胶质瘤、甲状腺癌、前列腺癌和乳腺癌。
20.根据权利要求1-8中任一项的抗体、其抗原结合片段或其变体、或根据权利要求9的融合蛋白在制备与CD73蛋白的C端结构域特异结合的试剂或药品中的用途。
21.根据权利要求1-8中任一项的抗体、其抗原结合片段或其变体、或根据权利要求9的融合蛋白在制备确定样品中CD73的存在和/或量的试剂中的用途。
22.一种药物组合物，其包含：根据权利要求1-8中任一项的抗体、其抗原结合片段或其变体、根据权利要求9的融合蛋白、根据权利要求10的一种或多种分离的核酸分子或者根据权利要求11的一种或多种载体和/或根据权利要求12或13的细胞。
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