CN116375873A - 抗人Siglec-9单克隆抗体及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了抗人Siglec‑9单克隆抗体及其用途，其对Siglec‑9表现出特异性结合并可阻断Siglec‑9与含有α(2，3)‑糖链或α(2，6)‑糖链结合，该抗体单独使用可促进人源NK或巨噬细胞杀伤肿瘤细胞，并在小鼠体内具有抑制肿瘤生长活性。
Description
技术领域
本发明属于肿瘤治疗及分子免疫学领域，涉及Siglec-9单克隆抗体、其抗原结合片段、其药物组合物以及医药用途。
背景技术
唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素(sialic acid-binding immunoglobulin-likelectin,Siglec)是一类表达于大多数免疫细胞的受体家族。Siglec配体包括蛋白质和脂质，其上含有唾液酸聚糖(唾液酸化)(Macauley,M.S等，NatRevImmunol,2014.14(10):p.653-66)。由于它们与免疫球蛋白超家族的同源性，Siglecs被认为是I型凝集素。从结构上看，它们包括一个氨基末端的IgV样结构域(该结构域与唾液酸化糖链结合)，然后是几个类似免疫球蛋白的结构域，一个跨膜结构域，最后是一个羧基末端的细胞质尾巴，带有激活或抑制性信号基序。Siglecs可分为两个家族：保守的Siglecs蛋白，包括Sialoadhesin(Siglec-1)、CD22(Siglec-2)、髓鞘相关糖蛋白(MAG；Siglec-4)和Siglec-15；其余为CD33相关(CD33r)的Siglecs蛋白，在不同物种间有很大差异。总的来说，人类有14个已知的功能性Siglecs(其中10个是CD33rSiglecs蛋白)，小鼠有9个(其中5个是CD33r Siglecs蛋白)。目前在临床试验中，针对Siglecs-糖生物学的治疗方法很少。然而，最近有关Siglecs在癌症、传染病和神经科学中的数据报道，使这一领域成为糖生物学中较活跃的领域之一。
Siglec-9又称CD329，在小鼠上为Siglec-E，含有463个氨基酸(Foussias,G等，Genomics,2000.67(2):p.171-8)。Siglec-9表达于多种免疫细胞，如巨噬细胞，单核细胞，树突状细胞，中性粒细胞以及自然杀伤(naturalkiller，NK)细胞等(Rubenson,E.S等，Oecologia,2017.184(2):p.453-467)。与其他CD33r Siglecs蛋白相似，为I型跨膜蛋白。其胞外段含有一个N-末端免疫球蛋白样IgV结构域和两个C2结构域，其中IgV为与唾液酸聚糖结合部位；其胞内尾部包含一个免疫受体酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhiitory motif,ITIM)序列(Crocker,P.R等，Trends Immunol,2001.22(6):p.337-42)。Siglec-9通过ITIM基序上的酪氨酸磷酸化募集酪氨酸磷酸化酶SHP-1与SHP-2(Src homology 2domain containing protein tyrosinephosphatase1/2)，并活化SHP-1与SHP-2，进而抑制细胞内下游的激活信号(Crocker,P.R等，Nat Rev Immunol,2007.7(4):p.255-66)。Siglec-9是一种抑制性受体，抑制免疫细胞的功能。
对于大部分肿瘤患者来说，肿瘤转移仍是难以治愈的，因为癌症固有的基因组多变性有助于肿瘤细胞逃逸细胞毒性杀伤或者靶向治疗(Sharma,P.,S.等，Cell,2017.168(4):p.707-723)。肿瘤微环境中，肿瘤细胞通过上调抑制性分子，如PD1/L1、Siglec-9配体等，抑制机体免疫细胞实现免疫逃逸。唾液酸是一个带负电的糖分子家族，在其糖蛋白或糖脂上连接聚糖链，肿瘤细胞表面高表达唾液酸。肿瘤细胞上的唾液酸聚糖(sialoglycans)可参与肿瘤细胞-细胞间相互作用和肿瘤细胞-细胞外基质相互作用，它可以形成一种保护域，使肿瘤细胞免受免疫识别。Siglec-7、Siglec-9和Siglec-17在NK细胞中表达，通过与唾液酸聚糖结合在抑制性信号转导中发挥重要作用。研究表明，Siglec-9可以与黏蛋白(mucins，MUC)相互作用，导致肿瘤免疫逃逸。MUC是主要表达于上皮组织的重度糖基化蛋白，如MUC1和MUC16。Siglec-9通过识别含有α(2，3)-糖链的MUC16，促进肿瘤细胞粘附过程(Belisle,J.A.等，Mol Cancer,2010.9:p.118)。肿瘤细胞上唾液酸聚糖通过与NK细胞上的Siglec-7和Siglec-9相互作用来逃避NK细胞的攻击，因此，这两个凝集素成为抗肿瘤药物开发的靶点。
WO2017/153433专利公开提供了Siglec中和抗体。此公开的抗体mAbA可结合人Siglec-9并可阻断唾液酸聚糖与Siglec-9之间的相互作用。该抗体可用于多种治疗方法，在某些情况下，抗Siglec-9抗体可在体外调节健康人或者病人来源的NK细胞杀伤肿瘤细胞。
WO2017/075432专利公开提供了抗SIGLEC-9抗体及其使用方法。公开的抗体可结合人Siglec-9但不可阻断唾液酸聚糖与Siglec-9之间的相互作用。在某些情况下，抗Siglec-9抗体可降低细胞表面Siglec-9表达水平。
尽管现有技术中描述的Siglec-9抗体展示了一定的体外抑制肿瘤活性，但尚未开发出靶向Siglec-9的抗体用于临床治疗。因此，仍需要有这样的Siglec-9抗体，能与Siglec-9特异性结合并阻断或干扰Siglec-9与其唾液酸聚糖配体之间的相互作用，用于抗癌治疗。
发明内容
本发明的具体方面包括：
本发明提供一种抗Siglec-9抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区序列VH，所述重链可变区序列VH包含VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，其中所述VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3为如下的氨基酸序列：
(1)分别为SEQ ID NO:1、2和3；或
(2)分别为SEQ ID NO:7、8和9；或
(3)分别为SEQ ID NO:13、14和15；
上述序列基于Kabat系统。
进一步的，所述的抗体或其抗原结合片段，其进一步包含轻链可变区VL，所述轻链可变区VL包含VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，其中所述VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3为如下的氨基酸序列：
(4)分别为SEQ ID NO:4、5和6；或
(5)分别为SEQ ID NO:10、11和12；或
(6)分别为SEQ ID NO:16、17和18；
上述序列基于Kabat系统。
进一步的，所述的抗体或其抗原结合片段，其重链可变区序列VH和轻链可变区VL包含如下CDR组合：
组合I：
| 片段名称 | SEQ ID NO: | 序列 |
| 3-31G5VHCDR1 | 1 | DYSIY |
| 3-31G5VHCDR2 | 2 | WINTETGEPTYADDFKG |
| 3-31G5VHCDR3 | 3 | EGEYAFDY |
| 3-31G5VLCDR1 | 4 | KSSQSLLYSSNQKNYLA |
| 3-31G5VLCDR2 | 5 | WASTRES |
| 3-31G5VLCDR3 | 6 | QQYYSYPPT |
组合II：
| 片段名称 | SEQ ID NO: | 序列 |
| 11G8VHCDR1 | 7 | SYTMS |
| 11G8VHCDR2 | 8 | YISNGGGSTYYPDTVKG |
| 11G8VHCDR3 | 9 | HYYGYDEGYYAVDY |
| 11G8VLCDR1 | 10 | RASQDISNYLN |
| 11G8VLCDR2 | 11 | YTSRLHS |
| 11G8VLCDR3 | 12 | QQGNMFPWT |
组合III：
上述序列基于Kabat系统。
在本发明的优选方面，所述的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区VH，所述重链可变区VH包含与SEQ ID NO:19、21或23具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
在本发明的优选方面，所述的抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变区VL，所述轻链可变区VL包含与SEQ ID NO:20、22或24具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
在本发明的优选方面，所述的抗体或其抗原结合片段，其进一步包含轻链可变区VL，所述轻链可变区VL包含与SEQ ID NO:20、22或24具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
进一步的，所述的抗体或其抗原结合片段，其包含如下重链可变区VH和轻链可变区VL的组合：
抗体3-31G5：
或抗体11G8：
或抗体14A1：
进一步的，所述的抗体或其抗原结合片段，其满足以下二项中至少一项：
(1)所述抗体或其抗原结合片段选自全长抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、纳米抗体(单域抗体)、双特异性抗体或最小识别单位(MRU)；
(2)所述抗体为小鼠、嵌合或人源化抗体或全人源抗体。
进一步的，所述的抗体或其抗原结合片段为人源化抗体，其重链可变区VH包含与SEQ IDNO:25、26或27具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；轻链可变区VL包含与SEQ ID NO:28、29或30具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；优选地，所述人源化抗体的重链可变区与轻链可变区为如下组合：11G8-VH1/VL1(SEQ ID NO:25和28)、11G8-VH2/VL2(SEQ ID NO:26和29)或11G8-VH3/VL3(SEQ ID NO:27和30)。
进一步的，所述的抗体或其抗原结合片段为人源化抗体，其重链可变区VH包含与SEQ IDNO:31、32、33、34或35具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；轻链可变区VL包含与SEQ ID NO:36、37、38或39具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；优选地，所述人源化抗体的重链可变区与轻链可变区为如下组合：14A1-VH1/VL1(SEQ ID NO:31和36)、14A1-VH2/VL2(SEQ ID NO:32和37)、14A1-VH3/VL3(SEQ ID NO:33和38)或14A1-VH4/VL4(SEQ ID NO:34和39)。
进一步的，所述的抗体或其抗原结合片段为人源化抗体，其重链可变区VH包含与SEQ IDNO:40、41、42、43、44或45具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；轻链可变区VL包含与SEQ ID NO:46、47、48、49或50具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
进一步的，所述的抗体或其抗原结合片段，其包含重链和轻链，其中所述重链包含重链恒定区(CH)，所述轻链包含轻链恒定区(CL)，所述重链恒定区和轻链恒定区的至少之一的至少一部分来自于鼠源抗体、人源抗体或灵长目源抗体的至少之一。
进一步的，所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段的重链恒定区和轻链恒定区均来自于人源IgG抗体。
进一步的，所述的抗体或其抗原结合片段，所述重链恒定区包含如SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列；所述轻链恒定区包含如SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列。
本发明还提供一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码上述任一的抗体或其抗原结合片段。
本发明还提供一种载体，其特征在于，所述的载体含有上述的核酸分子。
本发明还提供一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有上述的载体或染色体中整合有上述的核酸分子或表达上述任一的抗体或其抗原结合片段。
本发明还提供一种药物组合物，其包含上述任一所述的抗体或其抗原结合部分，以及药学上可接受的佐剂。
本发明还提供上述任一的抗体或其抗原结合片段、上述的核酸分子、上述的载体、上述细胞的用途，其特征在于，用于制备预防和/或治疗癌症或肿瘤的药物或制剂。
本发明还提供一种治疗癌症的方法，其包括以有效治疗癌症的量向需要其的对象施用上述任一发明所述的抗体分子或其结合片段或者上述的药物组合物。
本发明还提供了增强和/或调节对其有需要的受试者中NK细胞或巨噬细胞活性的方法，该方法包括向受试者给予有效量的上述任一的抗体分子或其结合片段或者上述的药物组合物。在一个实施例中，受试者是患有癌症的患者。例如，患者可能患有造血细胞癌，例如急性髓细胞白血病、慢性髓细胞样白血病、多发性骨髓瘤或非霍奇金淋巴瘤。可替代地，患者可能患有实体瘤，例如结直肠癌、肾癌、卵巢癌、肺癌、乳腺癌或恶性黑色素瘤。在另一个实施例中，受试者是患有感染性疾病的患者。
本发明的技术效果：
本发明提供了一种新的抗人Siglec-9抗体，其对Siglec-9表现出特异性结合并可阻断Siglec-9与含有α(2，3)-糖链或α(2，6)-糖链结合，该抗体单独使用可促进人源NK或巨噬细胞杀伤肿瘤细胞，并在小鼠体内具有抑制肿瘤生长活性。此外，部分抗体同时具有结合并可阻断Siglec-7与含有α(2，3)-糖链或α(2，6)-糖链结合的功能。
采用Siglec-9重组蛋白免疫小鼠，通过分离免疫小鼠脾脏细胞并运用单B细胞筛选技术以及杂交瘤技术获得符合筛选标准的小鼠单B细胞或阳性克隆，其可分泌识别Siglec-9的单克隆抗体，部分抗体可同时识别Siglec-7；采用基因工程手段从单B细胞中或杂交瘤中获得Siglec-9鼠单克隆抗体重链可变区VH及轻链可变区VL序列；将可变区序列拼接到人源免疫球蛋白IgG1框架中并重组表达获得人鼠嵌合抗体用于抗体鉴定；利用3D建模的方法，将Siglec-9鼠单克隆抗体重链可变区VH及轻链可变区VL序列与数据库人源抗体序列比对，将鼠源序列突变成人源序列并拼接到人源免疫球蛋白IgG1框架中获得人源化Siglec-9抗体；上述人源免疫球蛋白IgG1框架中Fc片段含L234A,L235A氨基酸突变以降低抗体与Fcγ受体的结合，进而去除IgG1亚型抗体介导的ADCC及ADCP效应。
本发明相关术语的解释
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属技术领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。
本发明所述的“抗体(antibody)”包括全长抗体、全长抗体的抗原结合片段以及包含抗体CDR、VH区和/或VL区的分子。抗体的实例包括(但不限于)单克隆抗体、以重组方式产生的抗体、单特异性抗体、多特异性抗体(包括双特异性抗体)、鼠抗人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、包含两个重链和两个轻链分子的四聚体抗体、抗体轻链单体、抗体重链单体、抗体轻链二聚体、抗体重链二聚体、抗体轻链-抗体重链对、抗体-药物缀合物、单域抗体、单价抗体、单链抗体或单链Fv(scFv)、骆驼化抗体以及以上任一个的抗原结合片段。
本发明优选的抗体形式包括Fab、Fab′、Fv、scFv、(Fab′)2片段。
Fab是指含有一条轻链的可变区和恒定区和一条重链的可变区和恒定区经二硫键结合起来的抗体分子的一部分。术语Fab′通常是指在重链CH1结构域的羧基端添加少量残基(包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸)而不同于Fab的片段，其一般由(Fab′)2还原得到。
Fv指的是含有抗体重链可变区、轻链可变区并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。
scFv指的是由轻链可变区与重链可变区直接相连或通过一个肽链连接而成的工程抗体。
(Fab′)2指的是Fab′的二聚体。
本发明的抗体形式还包括单域抗体(纳米抗体)、双特异性抗体或最小识别单位。
术语“单域抗体”也被称为“纳米抗体”，是指仅包含一个重链可变区的抗体,，因此也称为VHH抗体。
术语“双特异性抗体”是含有两种特异性抗原结合位点的人工抗体，其可以为本领域已知的任何形式。
最小识别单位或分子识别单位(molecular recognition unit,MRU)：抗体与抗原的结合主要涉及CDR，而CDR中以CDR3尤其重链CDR3最为关键。基于这一事实有人用来自CDR的短肽模拟了亲本抗体的特异结合活性，证实CDR确有可能成为特异结合抗原的最小分子，被称为最小识别单位或分子识别单位。
本发明还包括抗体氨基酸序列的保守序列变体的抗体，保守氨基酸序列变体包括不显著改变本发明抗体对靶点结合活性的氨基酸序列的修饰，如源于本领域熟知的相似氨基酸替代的变体，氨基酸的缺失、增加导致的变体。
本发明所述的抗体，还包括CDR区之外抗体重链可变区氨基酸序列和抗体轻链可变区氨基酸序列具有80％以上，或90％以上，或95％以上，或99％以上同一性的序列。
在本发明中，术语“同一性”或“同源性”通常是指将候选序列中核苷酸碱基或氨基酸残基与相应序列进行比较，经序列比对和必要情况下引入间隔以实现整段序列的最大相同百分数并且不把任何保守取代视为序列同一性的一部分后，二者碱基或残基相同的比例。无论N端或C端延伸或插入均不应理解为降低同一性或同源性。对于比对的方法和计算程序均可获得，并为本领域所熟知，例如，可以通过序列分析软件测定序列同一性。
本发明中的术语“VH区”和“VL区”分别是指包含FR(框架区)1、2、3和4以及CDR(互补决定区)1、2和3的单一抗体重链和轻链可变区。
本发明所述的“CDR”或“互补决定区”意指在重链和轻链多肽的可变区内发现的非连续抗原结合位点，对抗体可变区进行CDR和FR区域的标注，需要选择一种编号系统，编号方案(antibody numbering scheme)有：IMGT,Chothia,Kabat,Martin(扩展版Chothia)等，如无特殊说明，本发明使用Kabat编号系统。
本发明中的术语“VL”和“VL区”指抗体的轻链可变区。
本发明中的术语“VH”和“VH区”指抗体的重链可变区。
本发明中的术语“恒定区”是本领域中常见的。恒定区是不直接参与抗体与抗原的结合但可以展现各种效应功能，如与Fc受体(例如Fcγ受体)的相互作用的抗体部分，例如轻链和/或重链的羧基端部分。其中在IgG1亚类的Fc区引入LALA突变(L234A，L235A)，可以降低抗体与Fcγ受体和其补体(complement)的结合，但不影响体内的药物动力学。免疫球蛋白分子的恒定区通常具有相对于免疫球蛋白可变结构域来说更为保守的氨基酸序列。
本发明中的术语“嵌合抗体”是指“人-鼠嵌合抗体”，是将鼠源单抗的轻链、重链可变区插入含有人抗体恒定区的表达载体中，转化哺乳动物细胞进行表达所产生的单克隆抗体。
本发明中，术语“单克隆抗体”通常是指从一群基本上同质的抗体中获得的抗体，即集群中的抗体是相同的，除了可能存在的少量的自然突变。单克隆抗体通常针对单个抗原位点具有高度特异性。本发明中，术语“分离的核酸分子”通常是指从其天然环境中分离的或人工合成的任何长度的分离形式的核苷酸、脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。
本发明中，术语“载体”通常是指能够转运与它连接的另一个核酸分子，并在合适的宿主中自我复制的核酸分子。载体包括任何遗传元件，例如质粒、转座子、人工染色体、病毒等，其在与适当的控制元件组合时能够进行自我复制并且将基因序列转移到宿主或宿主之间。
本发明中，术语“KD”、“KD”或“KD”可互换使用，通常是指抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。本发明中使用的“KD”是解离速率常数(kdis，也称为“解离率(off-rate)(koff)”或“kd”)与结合速率常数(kon，也称为“结合率(kon)”或“ka”)的比值。
附图说明
图1：嵌合抗体阻断Sia1或Sia2与Siglec-9结合；
图2：嵌合抗体阻断Sia1或Sia2与Siglec-7结合；
图3：Siglec-9抗体调节NK细胞杀伤肿瘤细胞；
图4：Siglec-9抗体对巨噬细胞吞噬肿瘤细胞功能的影响；
图5：Siglec-9抗体在小鼠模型中抑制肿瘤生长。
具体实施方式
1.抗人Siglec-9鼠单克隆抗体的产生
实验动物：所有动物实验均在珠海市丽珠单抗生物技术有限公司实验动物中心的授权下进行，BALB/c小鼠购自广东省医学实验动物中心。
小鼠免疫：对雌性BALB/c小鼠皮下注射(S.C.)人Siglec-9(UniProt:Q9Y336)胞外结构域重组蛋白(AcroBiosystems)进行3次免疫，每次间隔为两周。第三次注射后一周，对免疫小鼠进行采血，收集血清用于间接ELISA法确定免疫应答。
单B细胞筛选：将小鼠脾脏作为单B细胞来源组织，分离免疫小鼠的脾细胞后，采用CD138阳选磁珠试剂盒(STEMCELL)富集小鼠B细胞。将富集小鼠B细胞导入单细胞光导系统(Beacon)芯片中并按照标准程序将其分成单细胞放入系统芯片独立小室中。采用人Siglec-9重组蛋白修饰的实验微球在系统芯片中进行抗原抗体结合试验，实时检测芯片独立小室中单B细胞分泌抗体与实验微球上不同蛋白抗原的结合情况。通过芯片上进行的抗原抗体结合试验确定可分泌目标抗体(下述命名为3-31G5)的单B细胞，目标抗体可结合人Siglec-9重组蛋白。
杂交瘤筛选：将小鼠脾脏作为融合B细胞来源组织，分离免疫小鼠的脾细胞后，采用CD138阳选磁珠试剂盒(STEMCELL)富集小鼠B细胞。按照标准程序将富集的小鼠B细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合。将融合后的细胞铺于96孔板中，采用含HAT添加物的RPMI-1640培养基进行培养。杂交瘤培养后的上清液通过间接ELISA筛选可分泌Siglec-9抗体的阳性克隆。通过有限稀释选择阳性克隆进行进一步克隆。然后选择稳定的单克隆进行扩增和表征。通过间接ELISA的抗原抗体结合试验确定可分泌目标抗体(下述命名为11G8和14A1)的杂交瘤细胞株，目标抗体可结合人Siglec-9重组蛋白。
单B细胞测序获得抗体序列：按照标准程序在芯片上裂解可分泌目标抗体的单B细胞并通过捕获微球捕获其mRNA，将mRNA反转录成cDNA后导出。以cDNA为模板进行PCR扩增后测序，通过序列分析得到鼠单克隆抗体3-31G5轻重链可变区序列。
3-31G5的重链可变区序列具体如下(SEQ ID NO:19)：
QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDYSIYWVKQAPGQGLKWMGWINTETG EPTYADDFKGRFAFSLETSANTAYLQINKLKNEDTATYFCAREGEYAFDYWGQGTTLTV SS。
注：顺序为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。基于Kabat编号系统，加粗并下划线部分分别为VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3。
3-31G5的轻链可变区序列具体如下(SEQ ID NO:20)：
DIVMSQSPSSLAVSVGEKITMSCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWA STRESGVPDRFTGSGSGTDFILTISRVKADDLAVYYCQQYYSYPPTFGSGTKLEIK。
注：顺序为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。基于Kabat编号系统，加粗并下划线部分分别为VLCDR1、VLCDR2、VLCDR3。
杂交瘤测序获得抗体序列：按照标准流程将杂交瘤细胞裂解提取其总RNA，将RNA反转录成cDNA。以cDNA为模板，采用测序引物进行PCR扩增后测序，通过序列分析得到鼠单克隆抗体11G8和14A1轻重链可变区序列。
11G8的重链可变区序列具体如下(SEQ ID NO:21)：
EVQLQESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSSYTMSWVRQTPEKRLEWVAYISNGGGS TYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARHYYGYDEGYYAVDYWG QGTSVTVSS。
注：顺序为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。基于Kabat编号系统，加粗并下划线部分分别为VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3。
11G8的轻链可变区序列具体如下(SEQ ID NO:22)：
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGV PSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNMFPWTFGGGTKLEIK。
注：顺序为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。基于Kabat编号系统，加粗并下划线部分分别为VLCDR1、VLCDR2、VLCDR3。
14A1的重链可变区序列具体如下(SEQ ID NO:23)：
EVQLQESGAELVRSGASVKLSCTASGFNIKDYYMHWVKQRPEPGLEWIGWIDPENG DTEYAPKFQDKATMTADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYFCNGRDDHGFDYWGQGSTLTV SS。
注：顺序为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。基于Kabat编号系统，加粗并下划线部分分别为VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3。
14A1的轻链可变区序列具体如下(SEQ ID NO:24)：
QIVLTQSPAIMSASPGQKVTMTCSASSSVSFMYWYQQKPGSSPRLLIYDTSNLASGVP VRLSGSGSGTSFSLTISRMEAEDAATYYCQQWSSYPLTFGAGTKLELK。
注：顺序为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。基于Kabat编号系统，加粗并下划线部分分别为VLCDR1、VLCDR2、VLCDR3。
2.抗人Siglec-9嵌合抗体BLI检测亲和力
嵌合抗体表达与纯化：将鼠源抗体可变区序列与人IgG抗体恒定区基因拼接，获得嵌合分子抗体序列，对照抗体mABA序列来源于公开专利WO2017/153433。抗体重链采用IgG1恒定区CH1-Fc，Fc中含L234A,L235A氨基酸突变，轻链采用kappa轻链恒定区VL。将嵌合抗体分子轻重链基因插入pcDNA3.4中构建表达载体，并瞬转入CHO细胞中表达。收集表达上清液后采用Protein A亲和纯化获得人鼠嵌合抗体。
生物膜干涉技术(BLI)检测抗体亲和力：通过Octet RED96e(ForteBio)测定抗Siglec-9嵌合抗体结合人Siglec-9和Siglec-7重组蛋白(AcroBiosystems)的亲和力。表1显示11G8，14A1和3-31G5的检测结果。结果显示Siglec-9嵌合抗体11G8，14A1和3-31G5结合人Siglec-9亲和力与对照抗体mABA相当，同时，11G8可较高亲和力结合Siglec-7。
表1抗Siglec-9嵌合抗体与人Siglec-9和Siglec-7的亲和力
3.抗人Siglec-9嵌合抗体ELISA检测阻断Siglec-9或Siglec-7与唾液酸化配体结合
Siglec-9和Siglec-7可以和多种唾液酸化聚糖链结合，本方案采用具有唾液酸化二糖的生物素化聚合物Neu5Aca2-6GalNAca-PAA-biotin(GlycoTech，货号01-059，下述命名为Sia1)和Neu5Aca2-3Gal-PAA-biotin(GlycoTech，货号01-067，下述命名为Sia2)分别作为含α(2，6)-糖链和α(2，3)-糖链配体进行受体-配体阻断实验验证。
阻断Siglec-9与唾液酸化配体结合：将人Siglec-9重组蛋白(AcroBiosystems)包被于96孔酶标板，(PierceTM Nickel CoatedPlate，厂家：Thermo))，室温孵育1小时。洗板后将不同浓度抗体(204nM起始，3倍稀释，共7个浓度)和Sia1或Sia2加入板中，室温孵育1小时。洗板后加入辣根过氧化物歧化酶(HRP)标记的链霉亲和素，室温孵育1小时。洗板后加入TMB溶液，37℃孵育10分钟，加入2M H2SO4终止反应，酶标仪检测450nm波长吸光度。HumanIgG1(L234A/L235A)(百英生物，货号B109802)作为同型对照。结果见图1，显示嵌合抗体11G8，14A1和3-31G5能不同程度阻断唾液酸化配体Sia1或Sia2与Siglec-9结合。
阻断Siglec-7与唾液酸化配体结合：采用类似上述阻断Siglec-9与配体结合的方法验证候选抗体阻断含α(2，6)-糖链或α(2，3)-糖链配体与Siglec-7结合的活性，结果见图2，11G8可阻断唾液酸化配体Sia1或Sia2与Siglec-7结合；对标抗体mAbA不能阻断Sia1或Sia2与Siglec-7结合。
4.抗人Siglec-9嵌合抗体调节NK细胞杀伤肿瘤细胞
使用CD56阳性人NK细胞(AllCells)与Siglec-9配体阳性肿瘤细胞A375按照20:1的比例混合培养于96孔细胞培养板，同时加入Siglec-9嵌合抗体或同型对照抗体，浓度为20ug/mL，在5％CO2、37℃下共同孵育72小时。然后去掉培养液，PBS洗涤细胞后，按照CCK-8试剂盒(同仁化学)说明书操作检测孔板中肿瘤细胞存活情况。NK细胞对肿瘤细胞的杀伤作用以肿瘤细胞存活率(Survival rate，％)表示，计算公式：存活率(Survival rate，％)＝抗体实验组细胞活力/不加抗体组细胞活力*100％。图(3)显示不同Siglec-9抗体对NK细胞杀伤瘤细胞功能的影响。与对标抗体mAbA类似，11G8，14A1和3-31G5均可显著抑制肿瘤细胞生长。(与同型对照组对比，***P<0.001,**P<0.01；采用双因素方差分析，Dunnett多重比较检验)。
5.抗人Siglec-9嵌合抗体调节巨噬细胞杀伤肿瘤细胞
取CD14阳性人单核细胞(Milestone)用RPMI-1640培养基(Gibco)在5％CO2、37℃下进行培养，加入刺激因子(50ng/mL M-CSF)进行诱导。培养至7-8天得到巨噬细胞。将MCF-7细胞(ATCC)按CFSE试剂(BioLegend)说明书进行荧光标记。将标记好的肿瘤细胞A375和上述诱导成功巨噬细胞以1:1混合均匀，同时加入抗Siglec-9抗体或同型对照抗体(HumanIgG1(L234A/L235A)，百英生物)，浓度为30ug/mL，10ug/mL和3.3ug/mL，5％CO2、37℃培养3小时。PBS洗涤细胞后，加入抗CD14-APC荧光抗体(BioLegend)后4℃避光孵育30分钟。将细胞洗涤后进行流式细胞术分析，巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用以吞噬率(Phagocytosis,％)表示，计算公式：吞噬率(Phagocytosis,％)＝(APC+CFSE)阳性细胞比例/APC阳性细胞比例*100％。图(4)显示不同Siglec-9抗体对巨噬细胞吞噬肿瘤细胞功能的影响。11G8可显著促进巨噬细胞吞噬肿瘤细胞(与同型对照组对比，***P<0.001；采用双因素方差分析，Dunnett多重比较检验)。
6.鼠源抗体人源化
将上述抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)与人IgG基因序列数据库进行比较，确定最佳匹配的人种系IgG基因序列。11G8，14A1和3-31G5优选的人种系IgG重链分别为IGHV3，IGHV1和IGH7；11G8，14A1和3-31G5优选的人种系IgG轻链分别为IGKV1，IGKV3和IGKV4。将11G8，14A1和3-31G5轻重链可变区中CDR区序列分别移植到匹配的人种系轻重链基因的框架基因上，构建后所得各人源化抗体的VH、VL以及CDR区序列如下述所示，每个轻重链均分别构建了多个人源化序列。人源化抗体重链恒定区(HC)一致，抗体轻链恒定区(LC)一致，如下述所示。本领域技术人员根据上述披露信息可以清楚11G8，14A1和3-31G5人源化抗体的重链和轻链的完整氨基酸序列。
人源化抗体11G8的重链可变区(VH)序列具体如下：
11G8-VH1(SEQ ID NO:25)：
EVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMSWVRQAPEKRLEWVAYISNGGGS TYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHYYGYDEGYYAVDYWG QGTTVTVSS。
11G8-VH2(SEQ ID NO:26)：
EVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMSWVRQAPGKGLEWVAYISNGGG STYYPDTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHYYGYDEGYYAVDYWG QGTTVTVSS。
11G8-VH3(SEQ ID NO:27)：
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMSWVRQAPGKGLEWVAYISNGGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHYYGYDEGYYAVDYWGQGTTVTVSS
注：顺序为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。基于Kabat编号系统，加粗并下划线部分分别为VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3。
人源化抗体11G8的轻链可变区(VL)序列具体如下：
11G8-VL1(SEQ ID NO:28)：
DIQMTQTPSSLSASVGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPGKAVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISSLQPEDFATYYCQQGNMFPWTFGGGTKLEIK。
11G8-VL2(SEQ ID NO:29)：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGNMFPWTFGGGTKLEIK。
11G8-VL3(SEQ ID NO:30)：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGNMFPWTFGGGTKLEIK。
注：顺序为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。基于Kabat编号系统，加粗并下划线部分分别为VLCDR1、VLCDR2、VLCDR3。
人源化抗体14A1的重链可变区(VH)序列具体如下：
14A1-VH1(SEQ ID NO:31)：
EVQLQESGAEVKKPGASVKLSCTASGFNIKDYYMHWVKQAPGQGLEWIGWIDPENGDTEYAPKFQDRATMTADTSSNTAYLELSRLRSDDTAVYYCNGRDDHGFDYWGQGTTVTVSS。
14A1-VH2(SEQ ID NO:32)：
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGFNIKDYYMHWVRQAPGQGLEWIGWIDPENGDTEYAPKFQDRVTMTADTSINTAYLELSRLRSDDTAVYYCNGRDDHGFDYWGQGTTVTVSS。
14A1-VH3(SEQ ID NO:33)：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGFNIKDYYMHWVRQAPGQGLEWIGWIDPENGDTEYAPKFQGRVTMTADTSISTAYLELSRLRSDDTAVYYCNGRDDHGFDYWGQGTTVTVSS。
14A1-VH4(SEQ ID NO:34)：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNIKDYYMHWVRQAPGQGLEWIGWIDPENGDTEYAPKFQGRVTMTADTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCNGRDDHGFDYWGQGTTVTVSS。
14A1-VH5(SEQ ID NO:35)：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNIKDYYMHWVRQAPGQGLEWMGWIDPENGDTEYAQKFQGRVTMTADTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCNGRDDHGFDYWGQGTTVTVSS。
注：顺序为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。基于Kabat编号系统，加粗并下划线部分分别为VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3。
人源化抗体14A1的轻链可变区(VL)序列具体如下：
14A1-VL1(SEQ ID NO:36)：
QIVLTQSPATMSASPGERVTMTCSASSSVSFMYWYQQKPGQAPRLLIYDTSNLASGVPVRLSGSGSGTSFTLTISSMEPEDFAVYYCQQWSSYPLTFGGGTKLELK。
14A1-VL2(SEQ ID NO:37)：
QIVLTQSPATLSLSPGERATMTCSASSSVSFMYWYQQKPGQAPRLLIYDTSNLASGVPVRLSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWSSYPLTFGGGTKLELK。
14A1-VL3(SEQ ID NO:38)：
EIVLTQSPATLSLSPGERATMSCSASSSVSFMYWYQQKPGQAPRLLIYDTSNLASGVPARLSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWSSYPLTFGGGTKLELK。
14A1-VL4(SEQ ID NO:39)：
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVSFMYWYQQKPGQAPRLLIYDTSNLATGIPARLSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWSSYPLTFGGGTKLELK。
注：顺序为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。基于Kabat编号系统，加粗并下划线部分分别为VLCDR1、VLCDR2、VLCDR3。
人源化抗体3-31G5的重链可变区(VH)序列具体如下：
3-31G5-VH1(SEQ ID NO:40)：
QIQLVQSGSELKKPGASVKISCKASGYTFTDYSIYWVKQAPGQGLEWMGWINTETGEPTYADDFKGRFAFSLDTSANTAYLQISSLKAEDTAVYYCAREGEYAFDYWGQGTTVTVSS。
3-31G5-VH2(SEQ ID NO:41)：
QIQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTDYSIYWVRQAPGQGLEWMGWINTETGEPTYADDFKGRFAFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCAREGEYAFDYWGQGTTVTVSS。
3-31G5-VH3(SEQ ID NO:42)：
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTDYSIYWVRQAPGQGLEWMGWINTETGEPTYADDFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCAREGEYAFDYWGQGTTVTVSS。
3-31G5-VH4(SEQ ID NO:43)：
QIQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYSIYWVRQAPGQGLEWMGWINTETGEPTYADDFKGRFTFTLDTSANTAYLEISRLRSDDTAVYYCAREGEYAFDYWGQGTTVTV SS。
3-31G5-VH5(SEQ ID NO:44)：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYSIYWVRQAPGQGLEWMGWINTET GEPTYADDFQGRFTFTLDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAREGEYAFDYWGQGTTVT VSS。
3-31G5-VH6(SEQ ID NO:45)：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYSIYWVRQAPGQGLEWMGWINTET GEPTYAQKFQGRVTMTLDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAREGEYAFDYWGQGTTV TVSS。
注：顺序为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。基于Kabat编号系统，加粗并下划线部分分别为VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3。
人源化抗体3-31G5的轻链可变区(VL)序列具体如下：
3-31G5-VL1(SEQ ID NO:46)：
DIVMSQSPDSLAVSLGERITMSCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWA STRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCQQYYSYPPTFGGGTKLEIK。
3-31G5-VL2(SEQ ID NO:47)：
DIVMTQSPDSLAVSLGERITMNCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWA STRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSYPPTFGGGTKLEIK。
3-31G5-VL3(SEQ ID NO:48)：
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWA STRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSYPPTFGGGTKLEIK。
3-31G5-VL4(SEQ ID NO:49)：
DIQMTQSPSSLSVSVGDRITMSCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGKVPKLLIYWA STRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVATYYCQQYYSYPPTFGGGTKLEIK。
3-31G5-VL5(SEQ ID NO:50)：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGKVPKLLIYWA STRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQYYSYPPTFGGGTKLEIK。
注：顺序为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。基于Kabat编号系统，加粗并下划线部分分别为VLCDR1、VLCDR2、VLCDR3。
人源化抗体11G8，14A1和3-31G5重链恒定区(HC)序列具体如下(SEQ ID NO:51)：
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。
人源化抗体11G8,14A1和3-31G5轻链恒定区(LC)序列具体如下(SEQ ID NO:52)：
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTE QDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC。
将人源化抗体分子11G8，14A1和3-31G5轻重链基因插入pcDNA3.4中构建表达载体，并瞬转入HEK293细胞中表达。收集表达上清液后采用Protein A亲和纯化获得纯化抗体用于后续鉴定。
7.抗人Siglec-9人源化抗体BLI检测亲和力
通过Octet RED96e(ForteBio)测定抗Siglec-9人源化抗体与人Siglec-9重组蛋白(AcroBiosystems)的亲和力，并将其分别与其对应的母本嵌合抗体11G8，14A1或3-31G5进行比较。表2检测结果显示不同轻重链组合的人源化抗体与Siglec-9蛋白结合的亲和力。部分人源化抗体结合Siglec-9重组蛋白的亲和力分别与其母本嵌合抗体11G8，14A1或3-31G5相当，鼠源抗体人源化不影响Siglec-9抗体活性。
表2抗Siglec-9人源化抗体与人Siglec-9的亲和力
8.抗人Siglec-9抗体在小鼠肿瘤模型中抑制肿瘤生长
采用B6-hSiglec-9小鼠(集萃药康)皮下接种MC38肿瘤模型评价抗人Siglec-9抗体在小鼠模型中对肿瘤生长的抑制作用。将MC38细胞(ATCC)皮下接种于小鼠右侧背部，肿瘤体积张到50～100mm3时，通过腹腔注射给予小鼠Siglec-9抗体11G8、14A1以及对照抗体mAbA，造模组腹腔注射PBS，每三天给药一次，测量并记录肿瘤体积【体积＝长径(mm)*短径(mm)*短径(mm)/2】。肿瘤生长曲线如图(5)所示，和PBS组相比，11G8、14A1以及对照抗体mAbA单药可抑制肿瘤生长。
CDR信息：
抗体3-31G5
抗体11G8
| 片段名称 | SEQ ID NO: | 序列 |
| 11G8VHCDR1 | 7 | SYTMS |
| 11G8VHCDR2 | 8 | YISNGGGSTYYPDTVKG |
| 11G8VHCDR3 | 9 | HYYGYDEGYYAVDY |
| 11G8VLCDR1 | 10 | RASQDISNYLN |
| 11G8VLCDR2 | 11 | YTSRLHS |
| 11G8VLCDR3 | 12 | QQGNMFPWT |
抗体14A1
| 片段名称 | SEQ ID NO: | 序列 |
| 14A1VHCDR1 | 13 | DYYMH |
| 14A1VHCDR2 | 14 | WIDPENGDTEYAPKFQD |
| 14A1VHCDR3 | 15 | RDDHGFDY |
| 14A1VLCDR1 | 16 | SASSSVSFMY |
| 14A1VLCDR2 | 17 | DTSNLAS |
| 14A1VLCDR3 | 18 | QQWSSYPLT |
Claims (21)
1.一种抗Siglec-9抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区序列VH，所述重链可变区序列VH包含VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，其中所述VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3为如下的氨基酸序列：
(1)分别为SEQ ID NO:1、2和3；或
(2)分别为SEQ ID NO:7、8和9；或
(3)分别为SEQ ID NO:13、14和15；
上述序列基于Kabat系统。
2.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其进一步包含轻链可变区VL，所述轻链可变区VL包含VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，其中所述VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3为如下的氨基酸序列：
(4)分别为SEQ ID NO:4、5和6；或
(5)分别为SEQ ID NO:10、11和12；或
(6)分别为SEQ ID NO:16、17和18；
上述序列基于Kabat系统。
3.如权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其重链可变区序列VH和轻链可变区VL包含如下CDR组合：
组合I：
或组合II：
或组合III：
上述序列基于Kabat系统。
4.如权利要求1-3任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区VH，所述重链可变区VH包含与SEQ ID NO:19、21或23具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
5.如权利要求1-3任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变区VL，所述轻链可变区VL包含与SEQ ID NO:20、22或24具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
6.如权利要求4所述的抗体或其抗原结合片段，其进一步包含轻链可变区VL，所述轻链可变区VL包含与SEQ ID NO:20、22或24具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
7.如权利要求6所述的抗体或其抗原结合片段，其包含如下重链可变区VH和轻链可变区VL的组合：
抗体3-31G5：
或抗体11G8：
或抗体14A1：
8.权利要求1-3任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其满足以下二项中至少一项：
(1)所述抗体或其抗原结合片段选自全长抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、纳米抗体(单域抗体)、双特异性抗体或最小识别单位(MRU)；
(2)所述抗体为小鼠、嵌合或人源化抗体或全人源抗体。
9.权利要求8所述的抗体或其抗原结合片段，所述的抗体为人源化抗体，其重链可变区VH包含与SEQ ID NO:25、26或27具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；轻链可变区VL包含与SEQ ID NO:28、29或30具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；优选地，所述人源化抗体的重链可变区与轻链可变区为如下组合：11G8-VH1/VL1(SEQ ID NO:25和28)、11G8-VH2/VL2(SEQ ID NO:26和29)或11G8-VH3/VL3(SEQ ID NO:27和30)。
10.权利要求8所述的抗体或其抗原结合片段，所述的抗体为人源化抗体，其重链可变区VH包含与SEQ ID NO:31、32、33、34或35具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；轻链可变区VL包含与SEQ ID NO:36、37、38或39具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；优选地，所述人源化抗体的重链可变区与轻链可变区为如下组合：14A1-VH1/VL1(SEQ ID NO:31和36)、14A1-VH2/VL2(SEQID NO:32和37)、14A1-VH3/VL3(SEQ ID NO:33和38)或14A1-VH4/VL4(SEQ ID NO:34和39)。
11.权利要求8所述的抗体或其抗原结合片段，所述的抗体为人源化抗体，其重链可变区VH包含与SEQ ID NO:40、41、42、43、44或45具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；轻链可变区VL包含与SEQ ID NO:46、47、48、49或50具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；优选地，所述人源化抗体的重链可变区与轻链可变区为如下组合：3-31G5-VH1/VL1(SEQ ID NO:40和46)、3-31G5-VH2/VL2(SEQ ID NO:41和47)或3-31G5-VH3/VL3(SEQ ID NO:42和48)。
12.权利要求1-11任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包含重链和轻链，其中所述重链包含重链恒定区(CH)，所述轻链包含轻链恒定区(CL)，所述重链恒定区和轻链恒定区的至少之一的至少一部分来自于鼠源抗体、人源抗体或灵长目源抗体的至少之一。
13.权利要求1-11任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段的重链恒定区和轻链恒定区均来自于人源IgG抗体。
14.权利要求13所述的抗体或其抗原结合片段，所述重链恒定区包含如SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列；所述轻链恒定区包含如SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列。
15.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1-14任一的抗体或其抗原结合片段。
16.一种载体，其特征在于，所述的载体含有权利要求15所述的核酸分子。
17.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有权利要求16所述的载体或染色体中整合有权利要求15所述的核酸分子或表达权利要求1-14任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
18.一种药物组合物，其包含权利要求1-14任一项所述的抗体或其抗原结合部分，以及药学上可接受的佐剂。
19.权利要求1-14任一项所述的抗体或其抗原结合部分、权利要求15所述的核酸分子、权利要求16所述的载体、权利要求17所述细胞的用途，其特征在于，用于制备预防和/或治疗癌症或肿瘤的药物或制剂。
20.一种治疗癌症的方法，其包括以有效治疗癌症的量向需要其的对象施用权利要求1-14任一项所述的抗体分子或其结合片段或者权利要求18所述的药物组合物。
21.一种增强和/或调节对其有需要的受试者中NK细胞或巨噬细胞活性的方法，该方法包括向受试者给予有效量的权利要求1-14任一项所述的抗体分子或其结合片段或者权利要求18所述的药物组合物。
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