JP2022545834A

JP2022545834A - 抗ｃｄ２０抗体、抗ｃｄ３７抗体、およびこれらの混合物

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Publication number: JP2022545834A
Application number: JP2022513538A
Authority: JP
Inventors: リュウ，チ; ファンスロウ，ウィリアム; ヤン，ウェイ
Original assignee: クイルピュージェットサウンドバイオセラピューティクスコーポレーション
Priority date: 2019-08-30
Filing date: 2020-08-27
Publication date: 2022-10-31
Also published as: EP4021579A1; WO2021041678A1; CN114650867A; US20240059785A1; AU2020336440A1

Abstract

本明細書で記載されるのは、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ３７抗体、およびこれらの混合物、ならびにこれらの抗体および混合物をコードする核酸、これらの核酸を含むベクター、およびこれらの核酸および／またはベクターを含む宿主細胞である。さらに、本明細書で記載されるのは、これらの抗体、抗体混合物、核酸、およびベクターを製造するおよび使用するための方法である。使用は、癌を含む種々の状態を治療するための治療的使用を含む。【選択図】図２７

Description

発明の分野
本明細書で記載の本発明は、組み換え体抗体、それらをコードするポリヌクレオチド、およびこのような分子の製造および使用方法の分野に関する。

抗ＣＤ２０および抗ＣＤ３７抗体は、当該技術分野において報告され、興味深い特性を有することが明らかになっている。例えば、Ｈｅｉｄｅｒｅｔａｌ．，ＡｎｏｖｅｌＦｃ－ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙｔｏＣＤ３７ｗｉｔｈｅｎｈａｎｃｅｄＡＤＣＣａｎｄｈｉｇｈｐｒｏａｐｏｐｔｏｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｙｆｏｒｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆＢ－ｃｅｌｌｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ，２０１１，Ｂｌｏｏｄ１１８（１５）：４１５９－４１６８；Ｍａｎｃｈｅｓｅｔａｌ．，Ｉｎｖｉｔｒｏｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆａｃｔｉｏｎｏｆｒｉｔｕｘｉｍａｂｏｎｐｒｉｍａｒｙｎｏｎ－Ｈｏｄｇｋｉｎｌｙｍｐｈｏｍａｓ，２００３，Ｂｌｏｏｄ１０１：９４９－９５４を参照されたい。いくつかの抗ＣＤ２０抗体は臨床で使用されている。Ｐａｙａｎｄｅｈｅｔａｌ．（２０１９），ＢｉｏｍｅｄＰｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．１０９：２４１５－２４２６；２０１９。しかし、様々な癌を治療するために抗ＣＤ２０抗体を用いた現在の臨床的経験は、多くの患者が、治療に対する初期の応答にも関わらず、抗ＣＤ２０抗体治療に抵抗性になることを示している。ＳｍａｌｌＧ．Ｗ．ｅｔａｌ．，Ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｉｎｎａｔｅａｎｄａｃｑｕｉｒｅｄｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏａｎｔｉ－ＣＤ２０ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｉｎｍａｌｉｇｎａｎｔａｎｄｎｏｎｍａｌｉｇｎａｎｔＢｃｅｌｌｓ，２０１３，Ｐｅｅｒｊ．１：ｅ３１；ＤＯＩ１０．７７１７／ｐｅｅｒｊ．３１。米国で臨床使用のために認可された抗ＣＤ３７抗体は、現時点では存在しない。従って、改善された抗ＣＤ２０および／または抗ＣＤ３７抗体および／または抗ＣＤ２０抗体および／または抗ＣＤ３７抗体を含む、改善された治療薬が当該技術分野において求められている。

本明細書で提供されるのは、抗ＣＤ２０および抗ＣＤ３７抗体および少なくとも１種の抗ヒトＣＤ２０（抗ｈＣＤ２０）抗体および１種の抗ｈＣＤ３７抗体を含む抗体の混合物などの組み合わせである。一態様では、このような混合物は、単一細胞株により産生でき、その細胞株により産生された種々の抗体種の精製は、その細胞株により産生される抗体種の数を制限し得る片方または両方の抗体中の改変に起因して、不必要であり得る。両方の抗体は、霊長類、ヒト、またはヒト化ＩｇＧ抗体であってよい。このような混合物は、単一宿主細胞株により産生され得る。一態様では、本明細書で記載の抗ｈＣＤ２０および／または抗ＣＤ３７抗体は、それぞれ、ヒトＣＤ２０（ｈＣＤ２０）および／またはヒトＣＤ３７（ｈＣＤ３７）に結合できる。これらの抗体は、ヒト、霊長類、および／またはヒト化抗体であってよい。いくつかの実施形態では、これらの抗体はまた、カニクイザルＣＤ２０（カニクイザルＣＤ２０（ｃｙｎｏＣＤ２０））および／またはカニクイザルＣＤ３７にも結合できる。当該技術分野で知られているように、ヒト化抗体は、非ヒト生物、例えばマウスまたはキメラ抗体由来のフレームワーク領域を有する抗体に比較して、ヒトで低減された免疫原性を有し得る。しかし、ヒト化抗体はまた、非ヒト生物由来の元の抗体に比べて、低減された生物活性を有する場合がある。ヒト化抗ｈＣＤ２０または抗ｈＣＤ３７抗体、またはこれらの混合物は、例えば、抗原結合、架橋抗体の存在下および／または非存在下での直接殺細胞作用、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）、Ｂ細胞の枯渇、および／またはインビトロおよび／またはインビボで腫瘍細胞殺作用などの、強い生物活性を有し得る。さらに、本明細書で記載の抗ｈＣＤ２０および抗ｈＣＤ３７抗体の混合物を含む製剤による患者の治療は、抗ｈＣＤ２０または抗ｈＣＤ３７抗体単独の製剤に比較して、高められた生物活性を有し得る。癌を治療するためにこれらの抗体混合物またはこれらの混合物をコードするポリヌクレオチドを用いる場合、抗ｈＣＤ２０または抗ｈＣＤ３７抗体を単独で使用する場合に観察される値よりも、癌の低減または除去における有効率は高くなり、および／または癌の再発率は低くなり得る。

より具体的には、本明細書で記載されるのは、抗ｈＣＤ２０抗体、抗ｈＣＤ３７抗体、およびこれらの混合物、ならびに、このような抗体および混合物をコードするポリヌクレオチドまたはこのようなポリヌクレオチドを含むベクター、ならびにこれらの抗体、抗体混合物、ポリヌクレオチド、およびベクターの製造および使用方法である。以下の番号を振った項目は、これらの組成物および方法をより詳細に説明する。
１．重鎖（ＨＣ）可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）を含む重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）を含む軽鎖（ＬＣ）を含む抗ヒトＣＤ２０（抗ｈＣＤ２０）抗体であって、
Ｖ_Ｈが、配列番号１２に対して、１２、１１、１０、９、８、７、６、または５個以下の改変を含むアミノ酸配列を含み、
Ｖ_Ｌが、配列番号８に対して、７、６、または５個以下の改変を含むアミノ酸配列を含み、および
１０μｇ／ｍｌの濃度の抗ｈＣＤ２０抗体を用いる、架橋抗体なしで実施される直接殺細胞作用アッセイにおいて、少なくとも４０％のＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞を直接死滅させ得る、
抗ｈＣＤ２０抗体。
２．Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌがそれぞれ、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、および
Ｖ_ＨＣＤＲ１、Ｖ_ＨＣＤＲ２、Ｖ_ＨＣＤＲ３、Ｖ_ＬＣＤＲ１、Ｖ_ＬＣＤＲ２、およびＶ_ＬＣＤＲ３が、（ａ）それぞれ、配列番号１、２、３、４、５、および６のアミノ酸配列を含み、および／または（ｂ）それぞれ、配列番号１、２、３、４、５、および６をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含む、
項目１に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
３．Ｖ_Ｈが、配列番号１２に対して、４個または３個以下の改変を含むアミノ酸配列を含み、および
Ｖ_Ｌが、配列番号８に対して、４個または３個以下の改変を含むアミノ酸配列を含む、
項目１または２に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
４．Ｖ_Ｈが、配列番号１２に対して、２個または１個以下の改変を含むアミノ酸配列を含み、および
Ｖ_Ｌが、配列番号８に対して、２個または１個以下の改変を含むアミノ酸配列を含む、
項目３に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
５．（ａ）Ｖ_Ｈが、（１）配列番号１２のアミノ酸配列および／または（２）配列番号１２をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、および
（ｂ）Ｖ_Ｌが、（１）配列番号８のアミノ酸配列および／または（２）配列番号８をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含む、
項目４に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
６．抗ｈＣＤ２０抗体が、ＨＣおよびＬＣを含むヒトまたはヒト化ＩｇＧ抗体である、項目１～５のいずれか１項に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
７．ＨＣが、（ａ）配列番号２４のアミノ酸配列および／または（ｂ）配列番号２４をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含む、項目６に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
８．ＨＣが、配列番号１８に対して、７個または６個以下の改変を含むアミノ酸配列を含む、項目７に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
９．ＨＣが、配列番号１８に対して、５個または４個以下の改変を含むアミノ酸配列を含む、項目８に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
１０．ＨＣが、配列番号１８に対して、３個以下の改変を含むアミノ酸配列を含む、項目９に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
１１．ＨＣが、配列番号１８に対して、２個以下の改変を含むアミノ酸配列を含む、項目１０に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
１２．ＨＣが、配列番号１８に対して、１個以下の改変を含むアミノ酸配列を含む、項目１１に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
１３．ＨＣが、（ａ）配列番号１８のアミノ酸配列および／または（ｂ）配列番号１８をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含む、項目１２に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
１４．ＨＣが、（ａ）配列番号３６のアミノ酸配列および／または（ｂ）配列番号３６をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含む、項目７に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
１５．ＨＣが、（ａ）配列番号４５のアミノ酸配列および／または（ｂ）配列番号４５をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含む、項目７に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
１６．ＨＣが、配列番号２３に対して、１２、１１、１０または９個以下の改変を含むアミノ酸配列を含み、および
ＬＣが、配列番号１０に対して、７個または６個以下の改変を含むアミノ酸配列を含む、
項目１～７のいずれか１項に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
１７．ＨＣが、配列番号２３に対して、８個または７個以下の改変を含むアミノ酸配列を含み、および
ＬＣが、配列番号１０に対して、５個または４個以下の改変を含むアミノ酸配列を含む、
項目１６に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
１８．ＨＣが、配列番号２３に対して、６、５、または４個以下の改変を含むアミノ酸配列を含み、および
ＬＣが、配列番号１０に対して、３個または２個以下の改変を含むアミノ酸配列を含む、
項目１７に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
１９．（ａ）ＨＣが、（１）配列番号２３に対し、３、２、１個以下、またはゼロ個の改変を含むアミノ酸配列および／または（２）配列番号２３をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、および
（ｂ）ＬＣが、（１）配列番号１０に対して、１個以下またはゼロ個の改変を含むアミノ酸配列および／または（２）配列番号１０をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含む、
項目１８に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
２０．抗ｈＣＤ２０抗体のＨＣが、２３９Ｄおよび２９８Ａを含み、および
ＨＣが、配列番号３５に対して、７個または６個以下の改変を含むアミノ酸配列を含む、
項目６または７に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
２１．ＨＣが、配列番号３５に対して、５個または４個以下の改変を含むアミノ酸配列を含み、および
ＬＣが、配列番号１０に対して、５個または４個以下の改変を含むアミノ酸配列を含む、
項目２０に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
２２．ＨＣが、配列番号３５に対して、３個以下の改変を含むアミノ酸配列を含み、および
ＬＣが、配列番号１０に対して、３個以下の改変を含むアミノ酸配列を含む、
項目２１に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
２３．ＨＣが、配列番号３５に対して、２個以下の改変を含むアミノ酸配列を含み、および
ＬＣが、配列番号１０に対して、２個以下の改変を含むアミノ酸配列を含む、
項目２２に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
２４．ＨＣが、配列番号３５に対して、１個以下の改変を含むアミノ酸配列を含み、および
ＬＣが、配列番号１０に対して、１個以下の改変を含むアミノ酸配列を含む、
項目２３に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
２５．（ａ）ＨＣが、（１）配列番号３５のアミノ酸配列および／または（２）配列番号３５をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、および
（ｂ）ＬＣが、（１）配列番号１０のアミノ酸配列および／または（２）配列番号１０をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含む、
項目２４に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
２６．（ａ）ＨＣが、（１）配列番号４４のアミノ酸配列および／または（２）配列番号４４をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、および
（ｂ）ＬＣが、（１）配列番号１０のアミノ酸配列および／または（２）配列番号１０をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含む、
項目２０に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
２７．１０μｇ／ｍｌの濃度の抗ｈＣＤ２０抗体を用いる直接殺細胞作用アッセイにおいて、少なくとも５０％のＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞を直接死滅させ得る、項目１～２６のいずれか１項に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
２８．Ｖ_Ｈを含むＨＣおよびＶ_Ｌを含むＬＣを含む抗ヒトＣＤ３７（抗ｈＣＤ３７）抗体であって、
Ｖ_Ｈが、配列番号５７に対して、８、７、６、または５個以下の改変を含むアミノ酸配列を含み、
Ｖ_Ｌが、配列番号５３に対して、８、７、６、５個または４個以下の改変を含むアミノ酸配列を含み、および
１０μｇ／ｍｌの濃度の抗ｈＣＤ３７抗体を用いる、架橋抗体なしで実施される直接殺細胞作用アッセイにおいて、少なくとも５０％のラモス細胞を直接死滅させ得る、
抗ｈＣＤ３７抗体。
２９．Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌがそれぞれ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、および
Ｖ_ＨＣＤＲ１、Ｖ_ＨＣＤＲ２、Ｖ_ＨＣＤＲ３、Ｖ_ＬＣＤＲ１、Ｖ_ＬＣＤＲ２、およびＶ_ＬＣＤＲ３が、（ａ）それぞれ、配列番号４６、４７、４８、４９、５０および５１のアミノ酸配列を含み、および／または（ｂ）それぞれ、配列番号４６、４７、４８、４９、５０および５１をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含む、
項目２８に記載の抗ｈＣＤ３７抗体。
３０．Ｖ_Ｈが、配列番号５７に対して、４個以下の改変を含むアミノ酸配列を含み、および
Ｖ_Ｌが、配列番号５３に対して、３個以下の改変を含むアミノ酸配列を含む、
項目２８または２９に記載の抗ｈＣＤ３７抗体。
３１．Ｖ_Ｈが、配列番号５７に対して、３個以下の改変を含むアミノ酸配列を含み、および
Ｖ_Ｌが、配列番号５３に対して、２個以下の改変を含むアミノ酸配列を含む、
項目３０に記載の抗ｈＣＤ３７抗体。
３２．Ｖ_Ｈが、配列番号５７に対して、２個以下の改変を含むアミノ酸配列を含み、および
Ｖ_Ｌが、配列番号５３に対して、１個以下の改変を含むアミノ酸配列を含む、
項目３１に記載の抗ｈＣＤ３７抗体。
３３．（ａ）Ｖ_Ｈが、（１）配列番号５７に対し、１個以下、またはゼロ個の改変を含むアミノ酸配列および／または（２）配列番号５７をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、および
（ｂ）Ｖ_Ｌが、（１）配列番号５３のアミノ酸配列および／または（２）配列番号５３をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含む、
項目３２に記載の抗ｈＣＤ３７抗体。
３４．ＨＣが、配列番号５９に対して、１０、９または８個以下の改変を含むアミノ酸配列を含み、および
ＬＣが、配列番号５５に対して、８個または７個以下の改変を含むアミノ酸配列を含む、
項目２８～３３のいずれか１項に記載の抗ｈＣＤ３７抗体。
３５．ＨＣが、配列番号５９に対して、７個または６個以下の改変を含むアミノ酸配列を含み、および
ＬＣが、配列番号５５に対して、５個以下の改変を含むアミノ酸配列を含む、
項目３４に記載の抗ｈＣＤ３７抗体。
３６．ＨＣが、配列番号５９に対して、５個または４個以下の改変を含むアミノ酸配列を含み、および
ＬＣが、配列番号５５に対して、４個または３個以下の改変を含むアミノ酸配列を含む、
項目３５に記載の抗ｈＣＤ３７抗体。
３７．ＨＣが、配列番号５９に対して、３個または２個以下の改変を含むアミノ酸配列を含み、および
ＬＣが、配列番号５５に対して、２個以下の改変を含むアミノ酸配列を含む、
項目３６に記載の抗ｈＣＤ３７抗体。
３８．ＨＣが、配列番号５９に対して、１個以下の改変を含むアミノ酸配列を含み、および
ＬＣが、配列番号５５に対して、１個以下の改変を含むアミノ酸配列を含む、
項目３７に記載の抗ｈＣＤ３７抗体。
３９．（ａ）ＨＣが、（１）配列番号５９のアミノ酸配列および／または（２）配列番号５９をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、および
（ｂ）ＬＣが、（１）配列番号５５のアミノ酸配列および／または（２）配列番号５５をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含む、
項目３８に記載の抗ｈＣＤ３７抗体。
４０．ＨＣが３４Ｖを含み、ＬＣが３１Ｎを含む、項目２８または３４に記載の抗ｈＣＤ３７抗体。
４１．ＨＣが１４７Ｄ、１７０Ｃ、１７３Ｃ、２２０Ｇ、および３９９Ｒを含み、ＬＣが１３１Ｋ、１６０Ｃ、１６２Ｃ、および２１４Ｓを含む、項目２８、３４または４０に記載の抗ｈＣＤ３７抗体。
４２．（ａ）ＨＣが、（１）配列番号６５に対し、４、３、２、１個以下、またはゼロ個の改変を含むアミノ酸配列および／または（２）配列番号６５をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、および
（ｂ）ＬＣが、（１）配列番号６１に対して、４、３、２、１個以下またはゼロ個の改変を含むアミノ酸配列および／または（２）配列番号６１をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含む、
項目４０または４１に記載の抗ｈＣＤ３７抗体。
４３．（ａ）ＨＣが、（１）配列番号６７または７１に対し、４、３、２、１個以下、またはゼロ個の改変を含むアミノ酸配列および／または（２）配列番号６７または７１をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、および
（ｂ）ＬＣが、（１）配列番号６３または６９に対して、４、３、２、１個以下の改変を含むアミノ酸配列および／または（２）配列番号６３または６９をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含む、項目４２に記載の抗ｈＣＤ３７抗体。
４４．ＨＣが３４Ｌおよび６４Ｑを含み、ＬＣが５３Ｓおよび９３Ｅを含む、
項目２８または３４に記載の抗ｈＣＤ３７抗体。
４５．（ａ）Ｖ_Ｈが、（１）配列番号７７に対し、４、３、２、１個以下、またはゼロ個の改変を含むアミノ酸配列および／または（２）配列番号７７をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、および
（ｂ）Ｖ_Ｌが、（１）配列番号７３に対して、４、３、２、１個以下またはゼロ個の改変を含むアミノ酸配列および／または（２）配列番号７３をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含む、
項目４４に記載の抗ｈＣＤ３７抗体。
４６．（ａ）ＨＣが、（１）配列番号７９または８３に対し、４、３、２、１個以下、またはゼロ個の改変を含むアミノ酸配列および／または（２）配列番号７９または８３をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、および
（ｂ）ＬＣが、（１）配列番号７５または８１に対して、４、３、２、１個以下またはゼロ個の改変を含むアミノ酸配列および／または（２）配列番号７５または８１をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含む、
項目４５に記載の抗ｈＣＤ３７抗体。
４７．項目１～２７のいずれか１項に記載の抗ｈＣＤ２０抗体および項目２８～４６のいずれか１項に記載の抗ｈＣＤ３７抗体を含む、抗体の混合物。
４８．抗ｈＣＤ２０抗体および抗ｈＣＤ３７抗体以外の主要抗体種を含まない、項目４７に記載の混合物。
４９．項目１～２７のいずれか１項に記載の抗ｈＣＤ２０抗体および項目２８～４６のいずれか１項に記載の抗ｈＣＤ３７抗体、または項目４７または４８に記載の抗体の混合物を製造するための方法であって、
抗ｈＣＤ２０抗体、抗ｈＣＤ３７抗体、または抗体の混合物をコードする１種または複数のＤＮＡを宿主細胞中に導入するステップ、
宿主細胞を培養するステップ、および
抗体または抗体の混合物を細胞集団からまたは細胞培養上清から回収するステップ、
を含む、方法。
５０．宿主細胞が、ＣＨＯ細胞またはマウス骨髄腫細胞である、項目４９に記載の方法。
５１．項目１～２７のいずれか１項に記載の抗ｈＣＤ２０抗体および項目２８～４６のいずれか１項に記載の抗ｈＣＤ３７抗体、または項目４７または４８に記載の抗体の混合物をコードする１種または複数のポリヌクレオチド。
５２．項目５１に記載のポリヌクレオチドを含む１種または複数のベクター。
５３．ウイルスベクターである、項目５２に記載のベクター。
５４．腫瘍溶解性ウイルスベクターである、項目５３に記載のベクター。
５５．レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクシニアウイルス、改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、麻疹ウイルス、コクサッキーウイルス、ニューカッスル病ウイルス、レオウイルス、および／またはポックスウイルスベクターである、項目５４に記載のベクター。
５６．項目５１に記載のポリヌクレオチドまたは項目５２に記載のベクターを含む宿主細胞。
５７．哺乳動物細胞である、項目５６に記載の宿主細胞。
５８．ＣＨＯ細胞またはマウス骨髄腫細胞である、項目５７に記載の宿主細胞。
５９．項目１～２７のいずれか１項に記載の抗ｈＣＤ２０抗体、項目２８～４６のいずれか１項に記載の抗ｈＣＤ３７抗体、項目４７または４８に記載の抗体の混合物、項目５１に記載のポリヌクレオチド、または項目５２～５５のいずれか１項に記載のベクターを含む、医薬組成物。
６０．ＩｇＧ抗体のＨＣが、配列番号２４のアミノ酸配列および／または配列番号２４をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含む、ヒトまたはヒト化ＩｇＧ抗体。
６１．ＩｇＧ抗体のＨＣが、配列番号３６のアミノ酸配列に対して、６、５、４、または３個以下の改変を含むアミノ酸配列を含む、項目６０に記載のＩｇＧ抗体。
６２．ＩｇＧ抗体のＨＣが、配列番号３６のアミノ酸配列に対して、３個以下の改変を含むアミノ酸配列を含む、項目６１に記載のＩｇＧ抗体。
６３．ＩｇＧ抗体のＨＣが、配列番号３６のアミノ酸配列に対して、２個以下の改変を含むアミノ酸配列を含む、項目６２に記載のＩｇＧ抗体。
６４．ＩｇＧ抗体のＨＣが、配列番号３６のアミノ酸配列に対して、１個以下の改変を含むアミノ酸配列を含む、項目６３に記載のＩｇＧ抗体。
６５．ＩｇＧ抗体のＨＣが、配列番号３６のアミノ酸配列および／または配列番号３６をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含む、項目６４に記載のＩｇＧ抗体。
６６．ＩｇＧ抗体のＨＣが、配列番号４５のアミノ酸配列および／または配列番号４５をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含む、項目６０または６１に記載のＩｇＧ抗体。
６７．項目１～２７のいずれか１項に記載の抗ｈＣＤ２０抗体、項目２８～４６のいずれか１項に記載の抗ｈＣＤ３７抗体、項目４７または４８に記載の抗体の混合物、項目５１に記載のポリヌクレオチド、または項目５２～５５のいずれか１項に記載のベクターを患者に投与するステップを含む、癌またはＢ細胞媒介疾患を有する患者を治療するための方法。
６８．患者が、癌を有する、項目６７に記載の方法。
６９．癌が、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（Ｂ－ＮＨＬ）または慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）である、項目６８に記載の方法。
７０．癌が、Ｂ－ＮＨＬであり、Ｂ－ＮＨＬが、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、粘膜関連リンパ組織のリンパ腫（ＭＡＬＴリンパ腫）、バーキットリンパ腫、またはマントル細胞リンパ腫からなる群より選択される、項目６９に記載の方法。
７１．患者が、Ｂ細胞媒介疾患を有する、項目６７に記載の方法。
７２．Ｂ細胞媒介疾患が、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、および多発性硬化症からなる群より選択される、項目７１に記載の方法。
７３．Ｖ_Ｈを含むＨＣ、およびＶ_Ｌを含むＬＣを含む抗ｈＣＤ２０抗体であって、
Ｖ_Ｈが、配列番号１２に対して、１２、１１、１０、９、８、７、６、または５個以下の改変を含むアミノ酸配列を含み、
Ｖ_Ｌが、配列番号８に対して、７、６、または５個以下の改変を含むアミノ酸配列を含み、および
５、４、３、２、または１．５ｎＭ以下の最大応答の５０％（ＥＣ_５０）を与える濃度で、架橋抗体なしに実施される直接殺細胞作用アッセイにおいてＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞を直接死滅させることができ、および／またはアッセイで１０μｇ／ｍｌの濃度の抗ｈＣＤ２０抗体を用いる、架橋抗体なしで実施される直接殺細胞作用アッセイにおいて、少なくとも２０％、３０％、または４０％のＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞を直接死滅させることができる、
抗ｈＣＤ２０抗体。
７４．１．０ｎＭ以下のＥＣ_５０で、架橋抗体なしに実施される直接殺細胞作用アッセイにおいてＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞を直接死滅させることができ、および／またはアッセイで１０μｇ／ｍｌの濃度の抗ｈＣＤ２０抗体を用いる、架橋抗体なしで実施される直接殺細胞作用アッセイにおいて、少なくとも３０％のＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞を直接死滅させることができる、項目７３に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
７５．０．６ｎＭ以下のＥＣ_５０で、架橋抗体なしに実施される直接殺細胞作用アッセイにおいてＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞を直接死滅させることができ、および／またはアッセイで１０μｇ／ｍｌの濃度の抗ｈＣＤ２０抗体を用いる、架橋抗体なしで実施される直接殺細胞作用アッセイにおいて、少なくとも４０％のＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞を直接死滅させることができる、項目７４に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
７６．０．４５ｎＭ以下のＥＣ_５０で、架橋抗体なしに実施される直接殺細胞作用アッセイにおいてＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞を直接死滅させることができ、および／またはアッセイで１０μｇ／ｍｌの濃度の抗ｈＣＤ２０抗体を用いる、架橋抗体なしで実施される直接殺細胞作用アッセイにおいて、少なくとも４０％のＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞を直接死滅させることができる、項目７５に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
７７．Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌがそれぞれ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、および
Ｖ_ＨＣＤＲ１、Ｖ_ＨＣＤＲ２、Ｖ_ＨＣＤＲ３、Ｖ_ＬＣＤＲ１、Ｖ_ＬＣＤＲ２、およびＶ_ＬＣＤＲ３が、（ａ）それぞれ、配列番号１、２、３、４、５、および６のアミノ酸配列を含み、および／または（ｂ）それぞれ、配列番号１、２、３、４、５、および６をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含む、
項目７３～７６のいずれか１項に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
７８．Ｖ_Ｈが、配列番号１２に対して、４個または３個以下の改変を含むアミノ酸配列を含み、および
Ｖ_Ｌが、配列番号８に対して、４個または３個以下の改変を含むアミノ酸配列を含む、
項目７３～７７のいずれか１項に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
７９．Ｖ_Ｈが、配列番号１２に対して、２個または１個以下の改変を含むアミノ酸配列を含み、および
Ｖ_Ｌが、配列番号８に対して、２個または１個以下の改変を含むアミノ酸配列を含む、
項目７８に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
８０．（ａ）Ｖ_Ｈが、（１）配列番号１２のアミノ酸配列および／または（２）配列番号１２をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、および
（ｂ）Ｖ_Ｌが、（１）配列番号８のアミノ酸配列および／または（２）配列番号８をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含む、
項目７９に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
８１．抗ｈＣＤ２０抗体が、ヒトまたはヒト化ＩｇＧ抗体である、項目７３～８０のいずれか１項に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
８２．ＨＣが、（ａ）配列番号２４のアミノ酸配列および／または（ｂ）配列番号２４をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含む、項目８１に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
８３．ＨＣが、配列番号１８に対して、７個または６個以下の改変を含むアミノ酸配列を含む、項目８２に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
８４．ＨＣが、配列番号１８に対して、５個または４個以下の改変を含むアミノ酸配列を含む、項目８３に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
８５．ＨＣが、配列番号１８に対して、３個以下の改変を含むアミノ酸配列を含む、項目８４に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
８６．ＨＣが、配列番号１８に対して、２個以下の改変を含むアミノ酸配列を含む、項目８５に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
８７．ＨＣが、配列番号１８に対して、１個以下の改変を含むアミノ酸配列を含む、項目８６に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
８８．ＨＣが、（ａ）配列番号１８のアミノ酸配列および／または（ｂ）配列番号１８をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含む、項目７３～７６のいずれか１項に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
８９．ＨＣが、（ａ）配列番号３６のアミノ酸配列および／または（ｂ）配列番号３６をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含む、項目８２に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
９０．ＨＣが、（ａ）配列番号４５のアミノ酸配列および／または（ｂ）配列番号４５をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含む、項目８２に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
９１．ＨＣが、配列番号２３に対して、１２、１１、１０または９個以下の改変を含むアミノ酸配列を含み、および
ＬＣが、配列番号１０に対して、７個または６個以下の改変を含むアミノ酸配列を含む、項目７３～８２のいずれか１項に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
９２．ＨＣが、配列番号２３に対して、８個または７個以下の改変を含むアミノ酸配列を含み、および
ＬＣが、配列番号１０に対して、５個または４個以下の改変を含むアミノ酸配列を含む、項目９１に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
９３．ＨＣが、配列番号２３に対して、６、５、または４個以下の改変を含むアミノ酸配列を含み、および
ＬＣが、配列番号１０に対して、３個または２個以下の改変を含むアミノ酸配列を含む、
項目９２に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
９４．（ａ）ＨＣが、（１）配列番号２３に対し、３、２、１個以下、またはゼロ個の改変を含むアミノ酸配列および／または（２）配列番号２３をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、および
（ｂ）ＬＣが、（１）配列番号１０に対して、１個以下またはゼロ個の改変を含むアミノ酸配列および／または（２）配列番号１０をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含む、
項目９３に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
９５．抗ｈＣＤ２０抗体のＨＣが、２３９Ｄおよび２９８Ａを含み、および
ＨＣが、配列番号３５に対して、７個または６個以下の改変を含むアミノ酸配列を含む、
項目８１または８２に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
９６．ＨＣが、配列番号３５に対して、５個または４個以下の改変を含むアミノ酸配列を含み、および
ＬＣが、配列番号１０に対して、５個または４個以下の改変を含むアミノ酸配列を含む、
項目９５に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
９７．ＨＣが、配列番号３５に対して、３個以下の改変を含むアミノ酸配列を含み、および
ＬＣが、配列番号１０に対して、３個以下の改変を含むアミノ酸配列を含む、
項目９６に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
９８．ＨＣが、配列番号３５に対して、２個以下の改変を含むアミノ酸配列を含み、および
ＬＣが、配列番号１０に対して、２個以下の改変を含むアミノ酸配列を含む、
項目９７に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
９９．ＨＣが、配列番号３５に対して、１個以下の改変を含むアミノ酸配列を含み、および
ＬＣが、配列番号１０に対して、１個以下の改変を含むアミノ酸配列を含む、
項目９８に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
１００．（ａ）ＨＣが、（１）配列番号３５のアミノ酸配列および／または（２）配列番号３５をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、および
（ｂ）ＬＣが、（１）配列番号１０のアミノ酸配列および／または（２）配列番号１０をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含む、
項目９９に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
１０１．（ａ）ＨＣが、（１）配列番号４４のアミノ酸配列および／または（２）配列番号４４をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、および
（ｂ）ＬＣが、（１）配列番号１０のアミノ酸配列および／または（２）配列番号１０をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含む、
項目９５に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
１０２．０．４０ｎＭ以下のＥＣ_５０で、架橋抗体なしに実施される直接殺細胞作用アッセイにおいてＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞を直接死滅させることができる、項目７３～１０１のいずれか１項に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
１０３．Ｖ_Ｈを含むＨＣおよびＶ_Ｌを含むＬＣを含む抗ｈＣＤ３７抗体であって、
Ｖ_Ｈが、配列番号５７に対して、８、７、６、または５個以下の改変を含むアミノ酸配列を含み、
Ｖ_Ｌが、配列番号５３に対して、８、７、６、５個または４個以下の改変を含むアミノ酸配列を含み、および
５、４、または３ｎＭ以下のＥＣ_５０で、架橋抗体なしに実施される直接殺細胞作用アッセイにおいてラモス細胞を直接死滅させることができ、および／または１０μｇ／ｍｌの濃度の抗ｈＣＤ３７抗体を用いる、架橋抗体なしで実施される直接殺細胞作用アッセイにおいて、少なくとも４０％、または５０％のラモス細胞を直接死滅させることができる、
抗ｈＣＤ３７抗体。
１０４．２ｎＭ以下のＥＣ_５０で、架橋抗体なしに実施される直接殺細胞作用アッセイにおいてラモス細胞を直接死滅させることができ、および／または１０μｇ／ｍｌの濃度の抗ｈＣＤ３７抗体を用いる、架橋抗体なしで実施される直接殺細胞作用アッセイにおいて、少なくとも５０％のラモス細胞を直接死滅させることができる、項目１０３に記載の抗ｈＣＤ３７抗体。
１０５．１ｎＭ以下のＥＣ_５０で、架橋抗体なしに実施される直接殺細胞作用アッセイにおいてラモス細胞を直接死滅させることができ、および／または１０μｇ／ｍｌの濃度の抗ｈＣＤ３７抗体を用いる、架橋抗体なしで実施される直接殺細胞作用アッセイにおいて、少なくとも６０％のラモス細胞を直接死滅させることができる、項目１０４に記載の抗ｈＣＤ３７抗体。
１０６．Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌがそれぞれ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、および
Ｖ_ＨＣＤＲ１、Ｖ_ＨＣＤＲ２、Ｖ_ＨＣＤＲ３、Ｖ_ＬＣＤＲ１、Ｖ_ＬＣＤＲ２、およびＶ_ＬＣＤＲ３が、（ａ）それぞれ、配列番号４６、４７、４８、４９、５０および５１のアミノ酸配列を含み、および／または（ｂ）それぞれ、配列番号４６、４７、４８、４９、５０および５１をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含む、
項目１０３～１０５のいずれか１項に記載の抗ｈＣＤ３７抗体。
１０７．Ｖ_Ｈが、配列番号５７に対して、４個以下の改変を含むアミノ酸配列を含み、および
Ｖ_Ｌが、配列番号５３に対して、３個以下の改変を含むアミノ酸配列を含む、
項目１０３～１０６のいずれか１項に記載の抗ｈＣＤ３７抗体。
１０８．Ｖ_Ｈが、配列番号５７に対して、３個以下の改変を含むアミノ酸配列を含み、および
Ｖ_Ｌが、配列番号５３に対して、２個以下の改変を含むアミノ酸配列を含む、
項目１０７に記載の抗ｈＣＤ３７抗体。
１０９．Ｖ_Ｈが、配列番号５７に対して、２個以下の改変を含むアミノ酸配列を含み、および
Ｖ_Ｌが、配列番号５３に対して、１個以下の改変を含むアミノ酸配列を含む、
項目１０８に記載の抗ｈＣＤ３７抗体。
１１０．（ａ）Ｖ_Ｈが、（１）配列番号５７に対し、１個以下、またはゼロ個の改変を含むアミノ酸配列および／または（２）配列番号５７をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、および
（ｂ）Ｖ_Ｌが、（１）配列番号５３のアミノ酸配列および／または（２）配列番号５３をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含む、
項目１０９に記載の抗ｈＣＤ３７抗体。
１１１．ＨＣが、配列番号５９に対して、１０、９または８個以下の改変を含むアミノ酸配列を含み、および
ＬＣが、配列番号５５に対して、８個または７個以下の改変を含むアミノ酸配列を含む、
項目１０３～１１０のいずれか１項に記載の抗ｈＣＤ３７抗体。
１１２．ＨＣが、配列番号５９に対して、７個または６個以下の改変を含むアミノ酸配列を含み、および
ＬＣが、配列番号５５に対して、５個以下の改変を含むアミノ酸配列を含む、
項目１１１に記載の抗ｈＣＤ３７抗体。
１１３．ＨＣが、配列番号５９に対して、５個または４個以下の改変を含むアミノ酸配列を含み、および
ＬＣが、配列番号５５に対して、４個または３個以下の改変を含むアミノ酸配列を含む、
項目１１２に記載の抗ｈＣＤ３７抗体。
１１４．ＨＣが、配列番号５９に対して、３個または２個以下の改変を含むアミノ酸配列を含み、および
ＬＣが、配列番号５５に対して、２個以下の改変を含むアミノ酸配列を含む、
項目１１３に記載の抗ｈＣＤ３７抗体。
１１５．ＨＣが、配列番号５９に対して、１個以下の改変を含むアミノ酸配列を含み、および
ＬＣが、配列番号５５に対して、１個以下の改変を含むアミノ酸配列を含む、
項目１１４に記載の抗ｈＣＤ３７抗体。
１１６．（ａ）ＨＣが、（１）配列番号59のアミノ酸配列および／または（２）配列番号59をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、および
（ｂ）ＬＣが、（１）配列番号５５のアミノ酸配列および／または（２）配列番号５５をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含む、
項目１１５に記載の抗ｈＣＤ３７抗体。
１１７．ＨＣが３４Ｖを含み、ＬＣが３１Ｎを含む、項目１０３または１１１に記載の抗ｈＣＤ３７抗体。
１１８．ＨＣが、１４７Ｄ、１７０Ｃ、１７３Ｃ、２２０Ｇ、および４０９Ｒを含み、ＬＣが、１３１Ｋ、１６０Ｃ、１６２Ｃ、および２１４Ｓを含む、項目１０３、１１１または１１７に記載の抗ｈＣＤ３７抗体。
１１９．（ａ）ＨＣが、（１）配列番号６５に対し、４、３、２、１個以下、またはゼロ個の改変を含むアミノ酸配列および／または（２）配列番号６５をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、および
（ｂ）ＬＣが、（１）配列番号６１に対して、４、３、２、１個以下またはゼロ個の改変を含むアミノ酸配列および／または（２）配列番号６１をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含む、
項目１１７または１１８に記載の抗ｈＣＤ３７抗体。
１２０．（ａ）ＨＣが、（１）配列番号６７または７１に対し、４、３、２、１個以下、またはゼロ個の改変を含むアミノ酸配列および／または（２）配列番号６７または７１をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、および
（ｂ）ＬＣが、（１）配列番号６３または６９に対して、４、３、２、１個以下の改変を含むアミノ酸配列および／または（２）配列番号６３または６９をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含む、
項目１１９に記載の抗ｈＣＤ３７抗体。
１２１．ＨＣが、３４Ｌおよび６４Ｑを含み、ＬＣが、５３Ｓおよび９３Ｅを含む、項目１０３または１１１に記載の抗ｈＣＤ３７抗体。
１２２．（ａ）Ｖ_Ｈが、（１）配列番号７７に対し、４、３、２、１個以下、またはゼロ個の改変を含むアミノ酸配列および／または（２）配列番号７７をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、および
（ｂ）Ｖ_Ｌが、（１）配列番号７３に対して、４、３、２、１個以下またはゼロ個の改変を含むアミノ酸配列および／または（２）配列番号７３をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含む、
項目１２１に記載の抗ｈＣＤ３７抗体。
１２３．（ａ）ＨＣが、（１）配列番号７９または８３に対し、４、３、２、１個以下、またはゼロ個の改変を含むアミノ酸配列および／または（２）配列番号７９または８３をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、および
（ｂ）ＬＣが、（１）配列番号７５または８１に対して、４、３、２、１個以下またはゼロ個の改変を含むアミノ酸配列および／または（２）配列番号７５または８１をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含む、
項目１２２に記載の抗ｈＣＤ３７抗体。
１２４．項目７３～１０２のいずれか１項に記載の抗ｈＣＤ２０抗体および項目１０３～１２３のいずれか１項に記載の抗ｈＣＤ３７抗体を含む抗体の混合物。
１２５．抗ｈＣＤ２０抗体および抗ｈＣＤ３７抗体以外の主要抗体種を含まない、項目１２４に記載の混合物。
１２６．抗ｈＣＤ２０抗体が、項目１００または１０１の抗ＣＤ２０抗体であり、
抗ｈＣＤ３７抗体が、項目１２０または１２３の抗ＣＤ３７抗体である、
項目１２４または１２５に記載の混合物。
１２７．項目７３～１０２のいずれか１項に記載の抗ｈＣＤ２０抗体、項目１０３～１２３のいずれか１項に記載の抗ｈＣＤ３７抗体、または項目１２４～１２６のいずれか１項に記載の抗体の混合物を製造するための方法であって、
抗ｈＣＤ２０抗体、抗ｈＣＤ３７抗体、または抗体の混合物をコードする１種または複数のＤＮＡを含む宿主細胞を培養するステップ、および
抗ｈＣＤ２０抗体、抗ｈＣＤ３７抗体、または抗体の混合物を細胞集団からまたは細胞培養上清から回収するステップ、
を含む、方法。
１２８．宿主細胞が、ＣＨＯ細胞またはマウス骨髄腫細胞である、項目１２７に記載の方法。
１２９．項目７３～１０２のいずれか１項に記載の抗ｈＣＤ２０抗体、項目１０３～１２３のいずれか１項に記載の抗ｈＣＤ３７抗体、または項目１２４～１２６のいずれか１項に記載の抗体の混合物をコードする１種または複数のポリヌクレオチド。
１３０．項目１２９に記載のポリヌクレオチドを含む１種または複数のベクター。
１３１．ウイルスベクターである、項目１３０に記載のベクター。
１３２．腫瘍溶解性ウイルスベクターである、項目１３１に記載のベクター。
１３３．レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクシニアウイルス、改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、麻疹ウイルス、コクサッキーウイルス、ニューカッスル病ウイルス、レオウイルス、および／またはポックスウイルスベクターである、項目１３２に記載のベクター。
１３４．項目１２９に記載のポリヌクレオチドまたは項目１３０に記載のベクターを含む宿主細胞。
１３５．哺乳動物細胞である、項目１３４に記載の宿主細胞。
１３６．ＣＨＯ細胞またはマウス骨髄腫細胞である、項目１３５に記載の宿主細胞。
１３７．項目７３～１０２のいずれか１項に記載の抗ｈＣＤ２０抗体、項目１０３～１２３のいずれか１項に記載の抗ｈＣＤ３７抗体、項目１２４～１２６のいずれか１項に記載の抗体の混合物、項目１２９に記載のポリヌクレオチド、または項目１３０～１３３のいずれか１項に記載のベクターを含む医薬組成物。
１３８．ＩｇＧ抗体のＨＣが、配列番号２４のアミノ酸配列および／または配列番号２４をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含む、ヒトまたはヒト化ＩｇＧ抗体。
１３９．ＩｇＧ抗体のＨＣが、配列番号３６のアミノ酸配列に対して、６、５、４、または３個以下の改変を含むアミノ酸配列を含む、項目１３８に記載のＩｇＧ抗体。
１４０．ＩｇＧ抗体のＨＣが、配列番号３６のアミノ酸配列に対して、３個以下の改変を含むアミノ酸配列を含む、項目１３９に記載のＩｇＧ抗体。
１４１．ＩｇＧ抗体のＨＣが、配列番号３６のアミノ酸配列に対して、２個以下の改変を含むアミノ酸配列を含む、項目１４０に記載のＩｇＧ抗体。
１４２．ＩｇＧ抗体のＨＣが、配列番号３６のアミノ酸配列に対して、１個以下の改変を含むアミノ酸配列を含む、項目１４１に記載のＩｇＧ抗体。
１４３．ＩｇＧ抗体のＨＣが、配列番号３６のアミノ酸配列および／または配列番号３６をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含む、項目１４２に記載のＩｇＧ抗体。
１４４．ＩｇＧ抗体のＨＣが、配列番号４５のアミノ酸配列および／または配列番号４５をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含む、項目１３８または１３９に記載のＩｇＧ抗体。
１４５．項目７３～１０２のいずれか１項に記載の抗ｈＣＤ２０抗体、項目１０３～１２３のいずれか１項に記載の抗ｈＣＤ３７抗体、項目１２４～１２６のいずれか１項に記載の抗体の混合物、項目１２９に記載のポリヌクレオチド、または項目１３０～１３３のいずれか１項に記載のベクターを患者に投与するステップを含む、癌またはＢ細胞媒介疾患を有する患者を治療するための方法。
１４６．患者が、癌を有する、項目１４５に記載の方法。
１４７．患者が、抗ｈＣＤ２０抗体、抗ｈＣＤ３７抗体、抗体の混合物、ポリヌクレオチド、またはベクターの投与の前に、その後に、またはそれと同時に放射線または化学療法剤により治療される、項目１４６に記載の方法。
１４８．癌が、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（Ｂ－ＮＨＬ）または慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）である、項目１４６または１４７に記載の方法。
１４９．癌が、Ｂ－ＮＨＬであり、Ｂ－ＮＨＬが、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、粘膜関連リンパ組織のリンパ腫（ＭＡＬＴリンパ腫）、バーキットリンパ腫、またはマントル細胞リンパ腫からなる群より選択される、項目１４８に記載の方法。
１５０．患者が、Ｂ細胞媒介疾患を有する、項目１４５に記載の方法。
１５１．Ｂ細胞媒介疾患が、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、および多発性硬化症からなる群より選択される、項目１５０に記載の方法。

抗ＣＤ２０抗体の可変ドメインのアミノ酸配列アラインメント。パネルＡ、トシツモマブ（キメラ抗ｈＣＤ２０抗体；最上行）、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１（「ａＣＤ２０Ａｂ１」と標識される、本明細書で記載のヒト化抗ｈＣＤ２０抗体；２行目）、トシツモマブのＣＤＲおよび以下に記載のヒト生殖系列のフレームワーク領域を有するＣＤＲグラフト化抗ＣＤ２０抗体（「ＣＤＲグラフト」と標識される、３行目）、およびＩＧＨＶ１－４６^＊０１およびＩＧＨＤ１－１^＊０１およびＩＧＨＪ３^＊０１によりコードされるアミノ酸配列を含むアセンブルされたヒト生殖系列（「生殖系列」と標識、最下行）のＶ_Ｈのアミノ酸配列アラインメント。パネルＢ、トシツモマブ（最上行）、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１（２行目）、トシツモマブのＣＤＲおよび以下に記載のヒト生殖系列のフレームワーク領域を有するＣＤＲグラフト化抗ＣＤ２０抗体（３行目）、およびＩＧＫＶ６－２１^＊０２およびＩＧＫＪ２^＊０１によりコードされるアミノ酸配列を含むアセンブルされたヒト生殖系列（最下行）のＶ_Ｌのアミノ酸配列アラインメント。抗体は、パネルＡでのように特定される。両方のパネルのナンバリングは、Ｋａｂａｔらに従う。Ｋａｂａｔｅｔａｌ．，ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ，ＦｉｆｔｈＥｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＨｅａｌｔｈａｎｄＨｕｍａｎＳｅｒｖｉｃｅｓ，ＰｕｂｌｉｃＨｅａｌｔｈＳｅｒｖｉｃｅ，ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ，ＮＩＨＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎＮｏ．９１－３２４２，１９９１。「＃」で標識される位置は、全可変領域中でその位置がアミノ酸で満たされていないために、追加の番号が割り付けられていない位置である。例えば、Ｖ_Ｈ中の次の位置８２は、それらの上に「＃」が付けられている３個のアミノ酸である。これらは、本明細書では、８２ａ、８２ｂ、および８２ｃと呼ばれる。他の追加のアミノ酸は、同様にして番号が付けられる。ＣＤＲは、両方のパネルで、標識され、太字で示される。示されるＣＤＲは、重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ１がアミノ酸３１～３５（Ｋａｂａｔら（前出）、により定義されている）に加えてアミノ酸２６～３０を含むこと以外は、Ｋａｂａｔら（前出）の定義と一致する。両パネルの２行目で、太字、下線で示される残基は、実施例１で説明されるように、ＣＤＲグラフト化配列中に存在するものからトシツモマブのマウス配列中に存在するものに変更された抗ｈＣＤ２０Ａｂ１Ｖ_ＨまたはＶ_Ｌ配列中の位置である。パネルＡ中のａＣＤ２０Ａｂ１Ｖ_Ｈの位置１６のイタリックの太字のセリン残基は、予測される立体障害を減らすために導入された。パネルＡ中のａＣＤ２０Ａｂ１Ｖ_ＨのＣＤＲ２中の太字、下線、イタリックのグルタミン残基（Ｑ）は、この残基の予測される突出を減らすために導入された。両方のパネルで、整列された配列の下の記号の行は、次記を表す：アスタリスク（＊）は、残基が全ての配列で同じであることを意味する；ドット（．）またはコロン（：）は、配列がこの位置で保存的に変化することを示し、コロンは、ドットより類似性が大きいことを示す；記号なし（または空白）は、この位置のアミノ酸が非保存的に異なることを示す。ヒト化工程の詳細は、実施例１に記載される。パネルＡ。抗ｈＣＤ２０Ａｂ１のラージ腫瘍細胞への結合。実施例２で記載のように、細胞および試験抗体または対照抗体が、混合され、細胞に対する結合が、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）分析により検出された。ｘ軸は、幾何平均蛍光強度（ＧｅｏＭＦＩ、これは結合強度の尺度である）を示し、ｙ軸は、細胞数を示し、所与のＧｅｏＭＦＩで結合する細胞の数を示す。実線で輪郭が描かれ、濃い灰色で塗りつぶされた左側のピークは、細胞へのヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照（これは陰性対照である）の結合を示す。実線で輪郭が描かれ、濃い灰色で塗りつぶされた右側のピークは、細胞へのリツキシマブ（ＩｇＧ１抗ｈＣＤ２０抗体：陽性対照）の結合を示す。点線で輪郭が描かれたピークは、オビヌツズマブ（ＩｇＧ１抗ｈＣＤ２０抗体：陽性対照）の結合を示す。薄灰色で塗りつぶされたピークは、細胞への抗ｈＣＤ２０Ａｂ１（本明細書で記載のヒト化ＩｇＧ１抗ｈＣＤ２０抗体）の結合を示す。パネルＢ．抗ＣＤ２０抗体によるラージ細胞の直接殺作用。方法は、実施例２で記載される。ｘ軸は、次記の試験抗体を意味する：１、リツキシマブ；２、オビヌツズマブ；３、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１；および４、ヒトＩｇＧ１抗体（細胞を死滅させると予測されない、陰性対照抗体）。各群の２本のバーの縦線の左側のバーは、９６ウェルマイクロタイタープレートからのデータを示し、各群の２本のバーの横線の右側のバーは、４８ウェルマイクロタイタープレートからのデータを示す。ｙ軸は、検出された芽球細胞の数（芽球細胞＃）を示し、これは、細胞死滅の程度を示す（より小さい数字は、より多くの細胞死滅を示す）。このアッセイは、架橋抗体の非存在下で実施された。抗ｈＣＤ２０Ａｂ１のバリアントの種々のヒト腫瘍細胞株への結合。パネルＡ、Ｂ、ＣおよびＤは、それぞれ、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２腫瘍細胞、ラージ細胞、ラモス細胞、およびラモス細胞からのデータを示す。ｘ軸は、試験した（１０マイクログラム／ミリリットル（μｇ／ｍＬ）で）次の抗体を示す：Ｔ１、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１－Ｔ１；Ｔ２、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１－Ｔ２；Ｔ３、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１－Ｔ３；Ｔ４、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１－Ｔ４；Ｔ５、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１－Ｔ５；Ｔ６、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１－Ｔ６；Ｔ７、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１－Ｔ７；Ｔ８、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１－Ｔ８；ＴＳ（トシツモマブの可変ドメインを含むキメラ抗ＣＤ２０、これは以下でさらに詳細に定義される）；ＯＢ、オビヌツズマブ；Ｇ１、ヒトＩｇＧ１（陰性対照）；－、抗体なし；およびＲＸ、リツキシマブ。パネルＤは、このアッセイの種々のベンチマーク抗体の活性を比較するために提供される。方法は、実施例１および３で記載される。ＧｅｏＭＦＩ（結合強度の指標）は、ｙ軸に示される。パネルＡ～Ｃでは、バーを塗りつぶしたチェッカーボードパターンには特に意味はない。パネルＤでは、各群の２本のバーは、１μｇ／ｍｌの抗体を含む試料（左側の縦線のバー）または１０μｇ／ｍｌの抗体を含む試料（右側の横線のバー）からのデータを示す。架橋抗体の存在または非存在下での抗ｈＣＤ２０Ａｂ１バリアントによる腫瘍細胞株の直接殺細胞作用。方法は、実施例２および３で記載される。全パネルにおいて、各群の２本のバーは、ポリクローナルヤギ抗ヒト抗体で架橋された試料、すなわち、「架橋抗体」（チェッカーボードパターンで塗りつぶした左側のバー）または架橋されていない試料（右側の横線のバー）からのデータを示す。各試料で使用される抗体は、パネルＡ～Ｃに対し、パネルＣのｘ軸上で、次のように特定される：Ｔ１、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１－Ｔ１；Ｔ２、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１－Ｔ２；Ｔ３、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１－Ｔ３；Ｔ４、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１－Ｔ４；Ｔ５、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１－Ｔ５；Ｔ６、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１－Ｔ６；Ｔ７、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１－Ｔ７；Ｔ８、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１－Ｔ８；ＴＳ；ＯＢ、オビヌツズマブ；Ｇ１、ヒトＩｇＧ１（陰性対照）；および－、抗体なし。ｙ軸は、芽球細胞数（芽球細胞＃）を示し、これは、細胞死滅を示し、より小さい数字は、より多くの細胞死滅を示す。パネルＡ、Ｂ、およびＣでは、使用細胞は、それぞれ、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２腫瘍細胞、ラージ細胞、およびラモス細胞であった。改変された定常ドメインを有する抗ｈＣＤ２０Ａｂ１のバリアントの結合および直接殺細胞作用。パネルＡは、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞に対する結合に関するデータを示し、パネルＢは、架橋抗体の非存在下で実施される直接ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞死滅アッセイの結果を示す。方法は、実施例２および４で記載される。両パネルにおいて、試料に使用された抗体は、ｘ軸に沿って次のように示される：ＴＳ；Ｔ７、抗ｈＣＤ２０Ａｂ－Ｔ７；１．１、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．１；１．２、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２；１．３、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．３；１．４、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．４；および－、抗体なし。ｙ軸は、パネルＡでは、ＧｅｏＭＦＩを示し、パネルＢでは、芽球細胞数（芽球細胞＃）を示す。漸増濃度での改変定常ドメインを有する抗ｈＣＤ２０Ａｂ１バリアントの架橋抗体なしでの直接殺細胞作用活性。濃度（ｎＭ）は、ｘ軸に示され、芽球細胞数（芽球細胞＃）は、ｙ軸に示される。試料中の抗体の識別は、Ｇ１が陰性対照としてし使用されるヒトＩｇＧ１抗体を示すこと以外は、図５と同様に示される。パネルＡおよびＢは、それぞれ、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞およびラモス細胞由来のデータを示す。方法および実験は、実施例２および４で記載される。抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２のバリアントのエフェクター機能。パネルＡは、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２を標的細胞として、およびＮＫ細胞をエフェクター細胞として使用する抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）のアッセイ結果を示す。抗体濃度（ｎＭ）を、ｘ軸に、パーセント特異的細胞障害性（％特異的細胞障害性）を、ｙ軸に示す。抗体名は、パネルＡでは凡例中で次のように略記される：ＲＸ、リツキシマブ；１．２、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２；１．２．１、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．１；１．２．２、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２；１．２．３、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．３；１．２．４、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．４；およびＧ１、陰性アイソタイプ対照として使われるヒトＩｇＧ１。アイソタイプ対照は、最高濃度（１０ｎＭ）でのみ試験された。パネルＢは、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞を標的細胞としておよびウサギ血清により供給された補体を使用する補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）アッセイの結果を示す。抗体濃度（ｎＭ）は、ｘ軸に沿って示され、ｙ軸は、死細胞のパーセンテージ（％死細胞）を示し、これは、細胞傷害性の指標である。抗体名は、抗体なしの加熱不活性化したウサギ補体を含む試料がＨＩ（３０ｎＭでのみ試験された）で示され、オビヌツズマブがＯＢとして略記されること以外は、パネルＡで示すように略記される。実験は、実施例５で記載される。抗ＣＤ３７抗体可変ドメイン配列のアライメント。パネルＡ、Ｇ２８．１（「Ｇ２８．１」と標識される、マウス抗ｈＣＤ３７抗体；最上行）、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１（「ａＣＤ３７Ａｂ１」と標識される、本明細書で記載のヒト化抗ｈＣＤ３７抗体；２行目）、Ｇ２８．１のＣＤＲおよび以下に記載のヒト生殖系列のフレームワーク領域を有するＣＤＲグラフト化抗ＣＤ３７抗体（「ＣＤＲグラフト」と標識される、３行目）、およびＩＧＨＶ１－３^＊０１およびＩＧＨＤ１－２６^＊０１およびＩＧＨＪ４^＊０１によりコードされるアミノ酸配列を含むアセンブルされたヒト生殖系列（「生殖系列」と標識される、最下行）のＶ_Ｈのアミノ酸配列アラインメント。パネルＢ、Ｇ２８．１（最上行）、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１（２行目）、Ｇ２８．１のＣＤＲおよび以下に記載のヒト生殖系列のフレームワーク領域を有するＣＤＲグラフト化抗ＣＤ３７抗体（３行目）、およびＩＧＫＶ１－２７^＊０１およびＩＧＫＪ４^＊０１によりコードされるアミノ酸配列を含むアセンブルされたヒト生殖系列（最下行）のＶ_Ｌのアミノ酸配列アラインメント。抗体は、パネルＡでのように特定される。両方のパネルのナンバリングは、Ｋａｂａｔらに従う。Ｋａｂａｔｅｔａｌ．，同上。「＃」は図１と同じ意味を有する。太字は、ＣＤＲの位置を示す。太字、下線は、そこで抗ＣＤ３７Ａｂ１のアミノ酸配列がＣＤＲグラフト化抗ＣＤ３７抗体のものとは異なり、Ｇ２８．１のものと同じである、位置を示す。イタリック、太字は、立体障害を最少化すると予測される置換が抗ＣＤ３７Ａｂ１中に導入された位置を示す。太字、下線、イタリックは、抗体の表面をよりスムーズにするための導入置換が抗ＣＤ３７Ａｂ１中に導入された位置を示す。両パネルにおいて、整列配列の下の略号の行は、図１の簡単な説明で説明されたものと同じ意味を有する。ヒト化工程の詳細は、実施例６に記載される。抗ＣＤ３７抗体の腫瘍細胞株への結合。方法は、実施例２および７で記載される。パネルＣのｘ軸は、次のように、全パネル中で試験される抗体を示す：ＯＢ、オビヌツズマブ、ヒト化抗ｈＣＤ２０抗体；Ｇ２８．１、キメラ抗ｈＣＤ３７抗体；Ｈ３７、Ｇ２８．１由来ヒト化抗ｈＣＤ３７抗体；Ａｂ１、本明細書の実施例６で記載のヒト化抗ｈＣＤ３７Ａｂ１；およびＧ１、アイソタイプ対照として使用されるヒトＩｇＧ１抗体。ｙ軸は、図にあるように、ＧｅｏＭＦＩを示す。パネルＡ、Ｂ、およびＣは、それぞれ、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２腫瘍細胞、ラージ細胞、およびラモス細胞からのデータを示す。抗ｈＣＤ３７Ａｂ１のバリアントによる直接殺細胞作用。方法は、実施例２および７で記載される。両パネルの試験抗体の識別は、パネルＢのｘ軸の下に、図９に記載の説明と同様に示される。図に示すように、ｙ軸は、芽球細胞数（芽球細胞＃）を示し、これは、細胞死滅を示す（より小さい数字は、より多くの細胞死滅を示す）。両パネルにおいて、各群の２本のバーは、ポリクローナルヤギ抗ヒトＦｃ抗体で架橋された試料、すなわち、「架橋抗体」（左側の縦線のバー）または架橋されていない試料（右側の横線のバー）からのデータを示す。パネルＡおよびＢは、それぞれ、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞およびラージ細胞由来のデータを示す。ラモス細胞における抗ｈＣＤ２０および抗ｈＣＤ３７抗体による直接殺細胞作用。方法は、実施例２および７で記載される。両パネルで示される結果は、ラモス細胞由来である。使用した抗体は、抗体添加なしの試料がダッシュ（－）により特定されること以外は、図９の記載で説明されたように識別される。架橋抗体有りおよびなしの試料は、図１０の記載で説明されたように識別される。パネルＡは、抗体の添加の２４時間後の結果を示す。パネルＢは、抗体の添加の７２時間後の結果を示す。ＦＡＣＳ分析によるカニクイザルＣＤ３７（ｃｙｎｏＣＤ３７）への結合についての抗ｈＣＤ３７Ａｂ１ＩｇＧ１変異体のバリアントの試験。方法は、実施例８で記載され、これは、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１のバリアントについても記載する。手短に説明すると、カニクイザル末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、（１）ＡＰＣ標識マウス抗ｈＣＤ２０抗体（これは、カニクイザルＣＤ２０にも結合し得る）、（２）抗ｈＣＤ３７Ａｂ１またはそのバリアント、および（３）フルオレセインイソチオシアネート標識（ＦＩＴＣ標識）マウス抗ヒトＩｇＧＦｃ特異的抗体、と混合した。処理後、これらの細胞をＦＡＣＳで分析した。ＣＤ２０^＋細胞を、ボックス領域で示されるように、ゲートアウトし、このサブセットの細胞への抗ＣＤ３７抗体の結合を、評価した。ｘ軸は、ＦＩＴＣ蛍光強度を示し、ＦＩＴＣのより高い強度は、細胞への抗ＣＤ３７抗体のより強力な結合を示す。ｙ軸は、ＡＰＣ蛍光強度を示し、そのより高い強度は、細胞への抗ＣＤ２０抗体のより強力な結合を示す。示されるように、パネルで分析した抗体は次の通りであった：パネルＡ、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１；パネルＢ、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１；パネルＣ、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ｄ１１；パネルＤ、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ｈ７；パネルＥ、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ｎ１２；およびパネルＦ、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ｎ１９。抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１のヒトおよびカニクイザルＣＤ１９^＋細胞への結合。方法は、実施例８で記載される。手短に説明すると、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１のＡＰＣ標識バージョンまたはＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体を、ヒトまたはカニクイザルＰＢＭＣおよびＦＩＴＣ標識抗ＣＤ１９抗体と、種々の濃度で混合した。処理後、ＦＡＣＳ分析を、ゲート制御ＣＤ１９^＋細胞集団に対し実施して、これらの細胞への抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１またはアイソタイプ対照の結合強度を測定した。ｘ軸は、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１またはアイソタイプ対照ＩｇＧ１抗体の濃度を示す。ｙ軸は、ＣＤ１９^＋細胞、すなわち、Ｂ細胞中のＡＰＣ蛍光による幾何学的ＭＦＩを示す。略号は、次記を意味する：実線で連結された中実円、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１＋カニクイザルＰＢＭＣ；実線で連結された中実四角、アイソタイプ対照ＩｇＧ１抗体＋カニクイザルＰＢＭＣ；実線で連結された中実上向き三角形、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１＋ヒトＰＢＭＣ；および実線で連結された中実下向き三角形、アイソタイプ対照ＩｇＧ１抗体＋ヒトＰＢＭＣ。抗ｈＣＤ３７Ａｂ１のバリアントの直接殺細胞作用活性。使用抗体は、各パネルの凡例中に記載され、これらの抗体は、実施例８で記載される。アッセイは、架橋抗体なしで実施された。図に示すように、ｘ軸は、抗体濃度（ｎＭ）を示し、ｙ軸は、芽球細胞数を示す。パネルＡは、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞を用いたデータを示し、パネルＢは、ラモス細胞を用いたデータを示す。抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２のヒトおよびカニクイザルＢ細胞への結合。方法は、実施例９で記載される。手短に説明すると、ＡＰＣ標識抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２またはアイソタイプ対照抗体を、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ１９抗体と共に、ヒトまたはカニクイザルＰＢＭＣと混合し、ＦＡＣＳにより分析してゲート制御ＣＤ１９^＋細胞（すなわち、Ｂ細胞）集団中のＡＰＣ蛍光（抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２またはアイソタイプ対照の結合に起因する）を検出した。５０μｇ／ｍｌ（パネルＡ）または１０μｇ／ｍｌ（パネルＢ）の抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２またはアイソタイプ対照抗体のいずれかを使用した。両パネル中のｘ軸は、ＡＰＣ蛍光のＧｅｏＭＦＩを示す（ＡＰＣ－Ａと標識）。ｙ軸は、細胞数を示す。両パネル中の点線は、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２と混合されたヒトＣＤ１９^＋細胞からのデータを示す。両パネル中の実線は、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２と混合されたカニクイザルＣＤ１９^＋細胞からのデータを示す。両パネル中の破線で確定され、灰色で塗られたピークは、アイソタイプ対照抗体と混合されたヒトＣＤ１９^＋細胞からのデータを示す。抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２および抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１のキャラクタリゼーション。実験は、実施例１０で記載される。パネルＡは、ラージ細胞への抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２ＩｇＧ、オビヌツズマブ（ガザイバ（登録商標）、ＩｇＧ１抗ｈＣＤ２０抗体）、リツキシマブ（リツキサン（登録商標）、ＩｇＧ１抗ｈＣＤ２０抗体）、およびＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体（ｈｕＩｇＧ１と標識）の結合を示す。ｘ軸は、抗体濃度（ｎＭ）を示し、ｙ軸は、結合能力（ＧｅｏＭＦＩ）を示す。パネルＢは、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１、またはＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体（ｈｕＩｇＧ１と標識）の存在下で、ＮＫ細胞によるラージ細胞の死滅を評価するＡＤＣＣアッセイの結果を示す。抗体濃度（ｎＭ）を、ｘ軸に、パーセント特異的細胞障害性をｙ軸に示す。実験は、実施例１０で記載される。抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２および抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１の間で、非同族ＬＣ／ＨＣ対形成の程度を評価するための、一過的に遺伝子導入したＥＸＰＩ２９３（商標）細胞由来の上清のウェスタンブロット。実験は、実施例１１で記載される。左のブロットおよび右のブロットは、並行してに実験した二重の試料（１は１’の重複物である、等々）を含む。レーン１および１’の遺伝子導入細胞上清は、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２のＬＣおよびＨＣ（ＬＣ１およびＨＣ１）をコードするプラスミドＤＮＡを含む細胞に由来した。レーン４および４’の遺伝子導入細胞上清は、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１のＬＣおよびＨＣ（ＬＣ２およびＨＣ２）をコードするプラスミドＤＮＡを含む細胞に由来した。レーン２および２’の遺伝子導入細胞上清は、ＨＣ１およびＬＣ２をコードするプラスミドＤＮＡを含む細胞に由来した。レーン３および３’の遺伝子導入細胞上清は、ＬＣ１およびＨＣ２をコードするプラスミドＤＮＡを含む細胞に由来した。レーン５および５’の遺伝子導入細胞上清は、抗Ｈｅｒ２抗体トラスツズマブのＬＣおよびＨＣをコードするプラスミドＤＮＡを含む細胞に由来した。ＨＣおよびＬＣまたはトラスツズマブのアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号８９および８７で見つけることができる。抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１．１、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ｎ１２．１、およびこれらの混合物の非還元および還元試料のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。この実験は、実施例１２で記載される。非還元（パネルＡおよびＣ）および還元（パネルＢおよびＤ）試料を、４～１５％Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ（商標）ＴＧＸＳｔａｉｎ－Ｆｒｅｅ（商標）ＰｒｅｃａｓｔＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルで泳動し、実施例１２に記載のように可視化した。タンパク質分子量基準を左端レーンで泳動し、サイズをキロダルトン（ｋＤａ）で示す。パネルＡおよびＢでは、レーンは、次の試料を含む：レーン１および１’、トラスツズマブ、ＩｇＧ１抗Ｈｅｒ２抗体；レーン２および２’、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１；レーン３および３’、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１．１；およびレーン４および４’、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１および抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１．１のＭａｂＰａｉｒ、すなわち、単一宿主細胞中で作製された抗体の対。パネルＣおよびＤでは、レーンは、次の試料を含む：レーン５および５’、トラスツズマブ；レーン６および６’、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１；レーン７および７’、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ｎ１２．１；およびレーン８および８’、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１ＩｇＧおよび抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ｎ１２．１ＩｇＧ１のＭａｂＰａｉｒ。低ｐＨカチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）による非還元抗ｈＣＤ２０および抗ｈＣＤ３７ＭａｂＰａｉｒ混合物の分析。パネルは、実施例１２に記載のように低ｐＨで実行したＣＥＸカラムからの出力を示す。水平軸は、カラム溶出の開始からの時間（分）を示し、垂直軸は、カラム流出物で検出される２１４ナノメートルでの吸光度（「ＡＵ」と示され、これは、タンパク質濃度を反映する）を示す。パネルＡは、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１および抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１．１からなるＭａｂＰａｉｒからの出力、およびパネルＢは、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１および抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ｎ１２．１からなるＭａｂＰａｉｒからの出力を示す。両方のＭａｂＰａｉｒは、これらの抗体をコードするＤＮＡを遺伝子導入されたＥＸＰＩＣＨＯ（商標）宿主細胞中で産生された。パネルＡは、分析されたＭａｂＰａｉｒ混合物中の抗体の４３％が抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１であり、５７％が抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１．１であることを示す。パネルＢは、ＭａｂＰａｉｒ混合物中の抗体の４９％が抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１であり、５１％が抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ｎ１２．１であることを示す。未処理のＭａｂＰａｉｒ抗体混合物の質量分析（ＭＳ）。手順は、実施例１２で記載される。ｘ軸は、デコンボリューション質量を示し、ｙ軸は、所与の質量のタンパク質の存在量を反映するカウント数を示す。パネルＡは、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１および抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１．１から基本的になるＭａｂＰａｉｒ由来のデータを示す。パネルＢは、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１ＩｇＧおよび抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ｎ１２．１ＩｇＧ１から基本的になるＭａｂＰａｉｒ由来のデータを示す。それぞれ個別の抗体の抗体名および検出質量は、各ピークの上部に示され、質量誤差（理論的質量からの差異、百万分率（ｐｐｍ））は、各ピークの脇に示される。パネルＡ中の１４５，０７５．３５Ｄａの位置での小さいピピークは、Ｏ－グリコシル化抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１．１（２．１％の総タンパク質からなる）であり、パネルＢ中の中央部の１４５，０５８．９０Ｄａでの小さいピークは、Ｏ－グリコシル化抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ｎ１２．１（１．８％の総タンパク質からなる）である。抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ｎ１２．１中のＯ－グリコシル化の分析。パネルＡは、逆相ＨＰＬＣカラムからのＵＶ出力を示し、実施例１２で説明されるように、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１および抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ｎ１２．１ＭａｂＰａｉｒ混合物の脱グリコシル化（ＰＮＧａｓｅＦで）および還元から得られた種を示す。ｘ軸は、データ採取時間（分）を示し、ｙ軸は応答を示し、これは、所与の時間でのタンパク質の量を反映する。矢印で示された領域は、ベースラインより高く、いくつかの追加の微量のタンパク質種が存在する可能性を示す。そのため、この領域は、ＭＳによりさらに分析された。パネルＢは、このＭＳ分析を示し、ｘ軸は、デコンボリューション質量を示し、ｙ軸は、タンパク質を反映するカウント数を示す。ｙ軸は、この試料中の比較的小さい量で存在する種を示すために、拡大されている。実施例１２で説明されるように、検出された種のサイズは、これらがＨＣ抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ｎ１２．１のＯ－グリコシル化種であることを示す。パネルＣは、パネルＡで示される抗ｈＣＤ３７抗体の主ＨＣピークのＭＳ分析を示す。抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１および抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１．１からなる脱グリコシル化および還元ＭａｂＰａｉｒ試料のＭＳ分析。これらの実験は、実施例１２で記載される。パネルＡは、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１のＬＣの分析を示す。パネルＢは、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１．１のＬＣの分析を示す。パネルＣは、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１のＨＣの分析を示す。パネルＤは、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１．１のＨＣの分析を示す。ｘ軸は、デコンボリューション質量を示し、ｙ軸は、所与の質量のタンパク質の量を反映するカウント数を示す。各ピークは、その測定されたデコンボリューション質量で標識される。分析される分子の予測質量は、各ピークに隣接して示される。抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１および抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ｎ１２．１からなる脱グリコシル化および還元ＭａｂＰａｉｒ試料のＭＳ分析。これらの実験は、実施例１２で記載される。パネルＡは、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１のＬＣの分析を示す。パネルＢは、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ｎ１２．１のＬＣの分析を示す。パネルＣは、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１のＨＣの分析を示す。パネルＤは、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ｎ１２．１のＨＣの分析を示す。ｘ軸は、デコンボリューション質量を示し、ｙ軸は、所与の質量のタンパク質の量を反映する、カウント数を示す。抗ｈＣＤ２０／抗ｈＣＤ３７ＭａｂＰａｉｒ抗体混合物から生成したＦａｂ’フラグメントのＭＳ分析。この実験は、実施例１２で記載される。パネルＡは、ＩｄｅＳプロテアーゼ消化および２－ＭＥＡ／ＥＤＴＡ処理により生成された、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１／抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１．１ＭａｂＰａｉｒ由来のＦａｂ’フラグメントのＭＳ分析を示す。パネルＢは、ＩｄｅＳプロテアーゼ消化および２－ＭＥＡ／ＥＤＴＡ処理により生成された、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１／抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ｎ１２．１ＭａｂＰａｉｒ由来のＦａｂ’フラグメントのＭＳ分析を示す。両パネルで示されるように、ｘ軸は、デコンボリューション質量を示し、ｙ軸は、所与の質量のタンパク質の量を反映する、カウント数を示す。測定されたピークの質量は、各ピークの上部に示され、同族ＨＣ同族ＨＣ／ＬＣ対を含む２つのＦａｂ’フラグメントの予測質量は、ピークの脇に示される。架橋抗体の存在下での抗ｈＣＤ２０／抗ｈＣＤ３７ＭａｂＰａｉｒ混合物によるＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞（パネルＡ）およびラモス細胞（パネルＢ）の直接殺細胞作用。この実験は、実施例１４で記載される。両パネルにおいて、ｘ軸は、抗体濃度（ｎＭ）を示し、ｙ軸は、芽球細胞の数（芽球細胞＃）を示す。両パネルにおいて、記号は、次記のように試料で使用された抗体を示す：実線で連結された下向き中実三角形、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１；実線で連結された中実円、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１．１；破線で連結された中空円、ＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１および抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１．１を含むＭａｂＰａｉｒ混合物；実線で連結された下向き中実三角形、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ｎ１２．１；点線で連結された下向き中空三角形、ＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１および抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ｎ１２．１を含むＭａｂＰａｉｒ混合物；および中実四角形（パネルＡでは単一試料のみ、およびパネルＢでは、実線で連結される）、ヒトＩｇＧ１／κアイソタイプ対照抗体。抗ＣＤ２０および抗ＣＤ３７抗体およびこれらの混合物およびこれらの混合物のＢ細胞枯渇活性。これらの実験は、実施例１５で記載される。パネルＡ、Ｂ、およびＣで示すデータは、ドナー１１９８、１０５６、および２００４と呼ばれる３人の異なるヒトドナーからのＰＢＭＣを用いた実験に由来した。示されるように、ｘ軸は、抗体濃度（ｎＭ）を示し、ｙ軸は、パーセントＢ細胞枯渇を示す。使用した抗体は、次に示す通りである：点線で連結された半中実、上向き三角形、オビヌツズマブ（ガザイバ（登録商標）、抗ｈＣＤ２０ＩｇＧ１抗体）；交互点およびダッシュで連結された半中実菱形、リツキシマブ（リツキサン（登録商標）、抗ｈＣＤ２０ＩｇＧ１抗体）；実線で連結された上向き中実三角形、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１；実線で連結された上向き中実三角形、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１．１；および実線で連結された中実円、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１および抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１．１から基本的になるＭａｂＰａｉｒ混合物。ラモス異種移植マウスモデルにおける抗ｈＣＤ２０抗体、抗ｈＣＤ３７抗体、および抗ｈＣＤ２０／抗ｈＣＤ３７ＭａｂＰａｉｒ抗体混合物による腫瘍増殖抑制のインビボ試験。この実験は、実施例１６で記載される。示されるように、ｙ軸は、個別の動物の立方ミリメートル（ｍｍ^３）による腫瘍体積を示し、ｘ軸は、腫瘍開始後の日数を示す。マウスを治療するために使用した抗体の識別は、各パネル上の凡例中に示される。「ＨｕＩｇＧ１」は、アイソタイプ陰性対照抗体を示す。

抗ＣＤ２０抗体で現在治療される癌の種類は、癌細胞の表面上でＣＤ２０を発現する。Ｐａｙａｎｄｅｈｅｔａｌ．，Ｔｈｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｏｆａｎｔｉ－ＣＤ２０ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｔｏｔｒｅａｔｖａｒｉｏｕｓＢｃｅｌｌｓｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，２０１９，ＢｉｏｍｅｄＰｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．１０９：２４１５－２４２６。いくつかのこのような癌は、それらの細胞表面上でＣＤ３７も発現する。いくつかの抗ＣＤ２０抗体は、特定の癌に対する治療薬としてある程度の有効性を有し、米国では販売が認可されているが、抗ＣＤ２０抗体で治療された多くの患者は、薬剤耐性を発生し、それは有効性を低下させる。Ｓｍａｌｌらは、癌細胞上のＣＤ２０レベルの下方制御、補体依存性細胞溶解（ＣＤＣ）および宿主免疫細胞により媒介される抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）のレベルの低下、ならびにアポトーシスに対する感受性の低下を含む、複数の機序を示唆している。Ｓｍａｌｌｅｔａｌ．，Ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｉｎｎａｔｅａｎｄａｃｑｕｉｒｅｄｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏａｎｔｉ－ＣＤ２０ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｉｎｍａｌｉｇｎａｎｔａｎｄｎｏｎｍａｌｉｇｎａｎｔＢｃｅｌｌｓ，２０１３，Ｐｅｅｒｊ．１：ｅ３１。抗ＣＤ３７抗体は、初期段階臨床試験で活性を示したが、米国において臨床使用のために認可されたものは現時点で存在しない。従って、改善された抗ＣＤ２０および／または抗ＣＤ３７抗体および／または抗ＣＤ２０抗体および／または抗ＣＤ３７抗体を含む改善された治療薬が、当該技術分野において求められている。

いくつかの態様では、このような改善された抗ＣＤ２０および／または抗ＣＤ３７抗体は、既存の抗ＣＤ２０および／または抗ＣＤ３７抗体に比べて、細胞を死滅させる異なるモードなどの、異なる生物活性を有する可能性があり、販売されている抗ＣＤ２０抗体に抵抗性または難治性の患者を治療するために使用される可能性がある。他の態様では、このような改善された抗ＣＤ２０および／または抗ＣＤ３７抗体は、免疫原性、異種間結合活性、安定性、および／または宿主細胞中の発現に関連する、改善された治療特性および／または実用的特性を有するであろう。他の改善は、抗ＣＤ２０および／または抗ＣＤ３７抗体相互のまたは他の治療分子との組み合わせを含む可能性がある。以下で記載の種々の組成物および方法は、当該技術分野において既知の抗体に比べて、有用な特性を有する抗ＣＤ２０および抗ＣＤ３７抗体ならびにこれらの組み合わせである。

多くの非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）および慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）細胞は、それらの細胞表面上でＣＤ２０とＣＤ３７の両方を発現する。Ｄｅｃｋｅｒｔｅｔａｌ．，Ａｎｏｖｅｌａｎｔｉ－ＣＤ３７ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇｃｏｎｊｕｇａｔｅｗｉｔｈｍｕｌｔｉｐｌｅａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｆｏｒｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆＢ－ｃｅｌｌｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ，２０１３，Ｂｌｏｏｄ１２２（２０）：３５００－３５１０；Ｄａｈｌｅｅｔａｌ．，Ｅｖａｌｕａｔｉｎｇａｎｔｉｇｅｎｔａｒｇｅｔｉｎｇａｎｄａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒａｃｔｉｖｉｔｙｏｆａｎｅｗａｎｔｉ－ＣＤ３７ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅａｇａｉｎｓｔｎｏｎ－Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓｌｙｍｐｈｏｍａ，２０１３，ＡｎｔｉｃａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ３３：８５－９６。このような癌に対し、抗ＣＤ２０および抗ＣＤ３７抗体を含む混合物による治療は、薬剤耐性を生じる患者の数を減らし、それにより抗ＣＤ２０抗体単独で観察されるものより治療効力を高め、現在認可されている治療法より効果的である長期維持療法を提供し得る。さらに、このような抗体混合物は、例えば、米国特許出願公開第２０１９／０２４８８９９号に記載の技術を用いて単一宿主細胞株中で作製でき、それにより抗体混合物を、２つの別々のプロセスではなく、単一の生産プロセスで作製する。このプロセスを用いて作製した抗体対は、本明細書では、ＭａｂＰａｉｒと称する。このプロセスを記載する米国特許出願公開第２０１９／０２４８８９９号の一部（すなわち、実施例１～１２およびそこで言及される図）は、参照により本明細書に組み込まれる。従って、この製造方法は、付随する製造コストの低減は言うまでもなく、抗体混合物の製造効率を劇的に高める。

定義
本明細書で意図される「改変」は、アミノ酸配列中またはヌクレオチド配列中の変化である。改変は、挿入、欠失、または置換であり得る。「改変」は、単一アミノ酸またはヌクレオチドの挿入、欠失、または置換である。例えば、欠失が３個のアミノ酸または３個のヌクレオチドをアミノ酸またはヌクレオチド配列から除去する場合、３個の改変（この場合は、欠失）が起こっている。アミノ酸置換である改変は、元の配列中に存在するアミノ酸から始まり、それに続いて、元の配列中のアミノ酸の位置、それに続いて、元のアミノ酸を置換するアミノ酸を提示することにより表現される。例えば、Ｇ１３３Ｍは、元の配列中の位置１３３に元々存在するグリシンが、メチオニンにより置換されることを意味する。さらに、１３３Ｍは、位置１３３のアミノ酸がメチオニンであることを意味するが、元のアミノ酸の素性を指定せず、これはメチオニンを含む任意のアミノ酸であり得る。最後に、Ｇ１３３は、グリシンが元の配列中の位置１３３のアミノ酸であることを意味する。加えて、Ｇ１３３Ｍ／Ａは、元の配列中の位置１３３に元々存在するグリシンが、メチオニンまたはアラニンにより置換されることを意味する。

本明細書で意図される「ヘテロダイマーに適さない改変」は、第３の重鎖定常ドメイン（Ｃ_Ｈ３）アミノ酸配列、任意選択でヒトまたは霊長類Ｃ_Ｈ３アミノ酸配列内の単一アミノ酸の置換、挿入、または欠失であり、置換、挿入、または欠失は、抗体の混合物の観点から、ヘテロダイマーＨＣ／ＨＣ対の形成に適さない。抗体は、ヘテロダイマーに適さない２個以上の改変を含む場合があり、ヘテロダイマーに適さない複数の改変は、抗体の混合物の１種または複数の抗体中の複数の部位で起こり得る。いくつかの事例では、ヘテロダイマーに適さない改変は、単独ではほとんどまたは全く効果を示さない可能性があるが、ヘテロダイマー形成に適さない１種または複数の他の改変が抗体の混合物中の同じ抗体中または他の抗体中に存在する場合、ヘテロダイマー形成を抑制し得る。改変は、野生型配列中に存在する、荷電していてもしていなくてもよい残基に対する荷電残基の置換を含み得る。あるいは、置換は、別の「突出部」に対し接している「突出部」、または別の「孔」に対し接している「孔」などの適切な重鎖／重鎖（ＨＣ／ＨＣ）対形成を妨害する、ヘテロダイマーＨＣ／ＨＣ対中の立体障害を作成し得る。突出部（またはノブ）および孔は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，６７９，７８５号、欄１２、行１２～欄１３、行２に記載される。一緒にある場合に、ヘテロダイマー形成に適さない可能性があるＩｇＧ重鎖中の対改変の例は、Ｄ３９９Ｋ／Ｒ＋Ｋ４０９Ｄ／Ｅである。

本明細書で意図される「抗体」は、少なくとも１種のＶ_ＨまたはＶ_Ｌを含むタンパク質である。抗体は多くの場合、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌの両方を含有する。Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌは、例えば、Ｋａｂａｔｅｔａｌ．，ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ，ＦｉｆｔｈＥｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＨｅａｌｔｈａｎｄＨｕｍａｎＳｅｒｖｉｃｅｓ，ＰｕｂｌｉｃＨｅａｌｔｈＳｅｒｖｉｃｅ，ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ，ＮＩＨＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎＮｏ．９１－３２４２，１９９１，ｐｐ．ｘｖｉ－ｘｉｘａｎｄｐｐ．１０３－５３３に極めて詳細に記載される。この文献は、参照により本明細書に組み込まれる。「抗体」は、多くの他の可能なフォーマットの中で特に、単鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ、これは、リンカーにより連結されたＶＨおよびＶＬを含む）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ：Ｆｃ抗体（ＣａｒａｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｓａｎｄＣａｐｒａ，Ｃｈ．９ｉｎＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，３ｒｄｅｄ．，Ｐａｕｌ，ｅｄ．，ＲａｖｅｎＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９９３，ｐｐ．２８４－２８６に記載のような、本文献は、参照により本明細書に組み込まれる）、および以下で定義のＩｇＧ抗体などの異なるフォーマットを有する分子を含む。いくつかの実施形態では、「抗体」は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を包含し、これは、重鎖および軽鎖可変ドメイン、これに加えてＴ細胞受容体の部分を含む。

「抗ＣＤ２０」または「抗ＣＤ３７」抗体は、それぞれ、ＣＤ２０またはＣＤ３７、任意選択でヒトまたはカニクイザルＣＤ２０またはＣＤ３７に特異的に「結合する」。ＣＤ２０およびＣＤ３７の両方は、細胞膜を複数回またぐ細胞表面タンパク質であるので、結合を試験するために可溶型のＣＤ２０またはＣＤ３７を産生するのが困難である。従って、例えば、実施例２および７では、それらの標的への抗ＣＤ２０および抗ＣＤ３７の結合を、ＣＤ２０およびＣＤ３７を発現することがわかっている細胞へのそれらの結合により評価した。試験抗体のＣＤＲがＣＤ２０またはＣＤ３７に結合することがわかっている抗体由来であったことを考えれば、検出された結合は、ＣＤ２０またはＣＤ３７への結合に起因する可能性があった。しかし、この種の結合アッセイは特異性を明確に示さないので、本明細書で意図される結合特異性は、実施例１３で提示されるデータでさらに明確にされ、この実施例では、結合特異性は、ｈＣＤ２０を遺伝子導入したＣＨＯ細胞への抗ｈＣＤ２０抗体の特異的結合およびｈＣＤ３７を遺伝子導入したＣＨＯ細胞への抗ｈＣＤ３７抗体の特異的結合により実証された。従って、抗原への「特異的結合」は、実施例１３に記載の結合アッセイにより決定できる。

「化学療法剤」は、分裂細胞を標的にし、細胞分裂に関係するプロセス、例えば、ＤＮＡ複製、ＲＮＡ合成、タンパク質合成、集合、分解、または紡錘体の機能、および／またはこれらのプロセスで一定の役割を果たす、ヌクレオチドまたはアミノ酸などの分子の合成または安定性、を妨害する。従って、化学療法剤は、癌細胞および他の分裂細胞の両方を死滅させ得る。化学療法剤は、当該技術分野で周知である。それらは例えば、次の薬剤を含む：アルキル化剤（例えば、ブスルファン、テモゾロミド、シクロホスファミド、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ストレプトゾトシン、メチルロムスチン、ｃｉｓ－ジアンミンジクロロ白金、チオテパ、およびアジリジニルベンゾキノン）；無機イオン（例えば、シスプラチンおよびカルボプラチン）；ナイトロジェンマスタード（例えば、メルファラン塩酸塩、クロラムブシル、イホスファミド、およびメクロレタミンＨＣｌ）；ニトロソウレア（例えば、カルムスチン（ＢＣＮＵ））；抗悪性腫瘍薬抗生物質（例えば、アドリアマイシン（ドキソルビシン）、ダウノマイシン、ミトラマイシン、ダウノルビシン、イダルビシン、マイトマイシンＣ、およびブレオマイシン）；植物誘導体（例えば、ビンクリスチン、ビンデシン、ビンブラスチン、ビノレルビン、パクリタキセル、ドセタキセル、ＶＰ－１６、およびＶＭ－２６）；代謝拮抗薬（例えば、ロイコボリン含有または非含有メトトレキサート、ロイコボリン含有または非含有５－フルオロウラシル、５－フルオロデオキシウリジン、６－メルカプトプリン、６－チオグアニン、ゲムシタビン、シタラビン、５－アザシチジン、ヒドロキシ尿素、デオキシコホルマイシン、およびフルダラビン）；ポドフィロトキシン（例えば、エトポシド、イリノテカン、およびトポテカン）；ならびにアクチノマイシンＤ、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ｍＡＭＳＡ、プロカルバジン、ヘキサメチルメラミン、ペンタメチルメラミン、Ｌ－アスパラギナーゼ、およびミトキサントロン。例えば、Ｃａｎｃｅｒ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＯｎｃｏｌｏｇｙ，４．ｓｕｐ．ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ，ＤｅＶｉｔａｅｔａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊ．Ｂ．ＬｉｐｐｉｎｃｏｔｔＣｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．（１９９３）、を参照されたい。この文献の関連部分は、参照により本明細書に組み込まれる。

他の化学療法剤は、上で列挙したものと同じ一般的機序で作用するものを含む。例えば、ＤＮＡをアルキル化することにより、例えば、アルキル化剤およびナイトロジェンマスタードが行うように、作用する薬剤は、化学療法剤とみなされる。ヌクレオチド合成を妨害する、例えば、メトトレキサート、シタラビン、６－メルカプトプリン、５－フルオロウラシル、およびゲムシタビンのような薬剤は、化学療法剤と見なされる。紡錘体毒物は、例えば、パクリタキセルおよびビンブラスチンのように、化学療法剤と見なされる。ＤＮＡ複製を妨害する、トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、ポドフィロトキシン）は、化学療法剤と見なされる。種々の機序によりＤＮＡ合成を妨害する抗生物質、例えば、ドキソルビシン、ブレオマイシン、およびマイトマイシン、は化学療法剤と見なされる。アミノ酸をカルバモイル化する薬剤（例えば、ロムスチン、カルムスチン）またはアスパラギンプールを枯渇させる薬剤（例えば、アスパラギナーゼ）も、化学療法剤と見なされる。ＭｅｒｃｋＭａｎｕａｌｏｆＤｉａｇｎｏｓｉｓａｎｄＴｈｅｒａｐｙ，１７．ｓｕｐ．ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ，Ｓｅｃｔｉｏｎ１１，ＨｅｍａｔｏｌｏｇｙａｎｄＯｎｃｏｌｏｇｙ，１４４．ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆＣａｎｃｅｒＴｈｅｒａｐｙ，Ｔａｂｌｅ１４４－２（１９９９）。化学療法剤中に特に含まれるのは、上記化学療法剤により影響を受ける同じ細胞プロセスに直接影響を与えるものである。

抗体の混合物の観点で本明細書で意図される「同族」ＨＣは、特定のＬＣが対形成して特定の抗原のための結合部位を形成することが既知である、ＨＣである。例えば、既知の完全長ＩｇＧ抗体Ｘが抗原Ｘに結合する場合、抗体ＸＨＣは、抗体ＸＬＣの同族ＨＣである、および逆もまた同じである。さらに、混合物が、抗原Ｙに結合する抗体Ｙも含む場合、抗体ＹＨＣは、抗体ＸＬＣに対して「非同族」である、および逆もまた同じであり、および抗体ＹＬＣは、抗体ＸＨＣに対して「非同族」である、および逆もまた同じである。

「相補性決定領域」（ＣＤＲ）は、Ｖ_ＨまたはＶ_Ｌ内の高頻度可変領域である。各Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と呼ばれる３個のＣＤＲを含む。ＣＤＲは、抗体の表面上にループを形成し、抗体の結合特異性の決定に主として関与する。ＣＤＲは、４個のより保存されたフレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４と呼ばれる）の間に次のように挿入される：ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４。ＣＤＲの位置は、例えば、図１、パネルＡ（Ｖ_Ｈに対し）および図１、パネルＢ（Ｖ_Ｌに対し）に示される。Ｋａｂａｔらの位置Ｖ_ＨＣＤＲは、次の通り：ＣＤＲ１は位置３１～３５（可能な挿入番号３５ａおよび３５ｂ）であり；ＣＤＲ２は位置５０～６５（可能な挿入番号５２ａ～５２ｃ）であり；およびＣＤＲ３は位置９５～１０２（可能な挿入番号１００Ａ～１００Ｋ）である。Ｋａｂａｔｅｔａｌ．，前出、ｘｖｉｉ。Ｖ_ＨＣＤＲ２およびＣＤＲ３のためのこれらの位置が、本明細書で使用される。本明細書で、我々は、ＶＨＣＤＲ１を、残基２６～３５（可能な挿入番号３５ａおよび３５ｂ）を含むと定義し、これは、Ｋａｂａｔらの定義とは異なる。その理由は、それが、アミノ酸３１～３５に加えて、アミノ酸２６～３０を含むためである。Ｋａｂａｔらの位置Ｖ_ＬＣＤＲは、次の通り：ＣＤＲ１は位置２４～３４（可能な挿入番号２７ａ～２７ｆ）であり；ＣＤＲ２は位置５０～５６であり；およびＣＤＲ３は位置８９～９７（可能な挿入番号９５ａ～９５ｆ）である。Ｋａｂａｔｅｔａｌ．，ｓｕｐｒａ，ａｔｘｖｉｉ，これは参照により本明細書に組み込まれる。これらのＶ_ＬＣＤＲの定義が、本明細書で使用される。

治療または薬物は、２種の治療／薬物が、例えば同じ日に、同じ小さな時間枠内で、または同じさらに延長された時間枠内で投与される場合、別の治療または薬物と「同時に」投与されると見なされる。このようなより延長された時間枠は、例えば、１種の治療／薬物が週１回投与され、他の治療／薬物が４日毎に投与される状況を含み得る。２種の治療／薬物は同じ日に投与されなくても、またはめったに投与されなくてもよいが、２種の治療／薬物は、週、月、またはそれより長い期間の共通の期間にわたり継続的に投与される。同様に、１種の薬物が年１回投与されもう一方の薬物が毎週投与される場合、それらは、毎週投与される薬物が、年１回投与される薬物の投与の前の年および／または後の年の間に投与される場合、「同時に」投与されると見なされる。従って、本明細書で意図される、２種の治療／薬物の「同時」投与は、共通の時間帯に進行する２種の異なる治療／薬物による進行中の治療を含む。

本明細書で意図される「保存的」アミノ酸置換は、類似の極性、疎水性、または体積などの、類似の特性を有する異なるアミノ酸によるアミノ酸の置換である。保存的置換は、アミノ酸の同じグループ内の別のアミノ酸による置換を含み、アミノ酸のグループは、次記を含む：（１）疎水性アミノ酸、これは、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンを含む；（２）非荷電極性アミノ酸、これは、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンを含む；（３）塩基性アミノ酸、これは、アルギニン、リジン、およびヒスチジンを含む；および（４）酸性アミノ酸、これは、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含む。保存的置換はまた、次記の置換も含む：（１）ＡのＶ、Ｌ、またはＩによる置換、（２）ＲのＫ、Ｑ、またはＮによる置換、（３）ＮのＱ、Ｈ、Ｋ、Ｒによる置換、（４）ＤのＥによる置換、（５）ＣのＳまたはＡによる置換、（６）ＱのＮによる置換、（７）ＥのＤによる置換、（８）、ＧのＰまたはＡによる置換、（９）ＨのＮ、Ｑ、Ｋ、またはＲによる置換、（１０）ＩのＬ、Ｖ、Ｍ、Ａ、またはＦによる置換、（１１）ＬのＩ、Ｖ、Ｍ、Ａ、またはＦによる置換、（１２）ＫのＲ、Ｑ、またはＮによる置換、（１３）ＭのＬ、Ｆ、またはＩによる置換、（１４）ＦのＬ、Ｖ、Ｉ、Ａ、またはＹによる置換、（１５）ＰのＡによる置換、（１６）ＳのＴ、Ａ、またはＧによる置換、（１７）ＴのＳによる置換、（１８）ＷのＹまたはＦによる置換、（１９）ＹのＷ、Ｆ、Ｔ、またはＳによる置換、および（２０）ＶのＩ、Ｍ、Ｌ、Ｆ、またはＡによる置換。
本明細書で意図される「システイン置換」は、システインが別のアミノ酸を置換する、アミノ酸置換である。

本明細書で意図される、１種または複数の指定濃度での抗体による種々の細胞型のいずれかにおける「直接殺細胞作用」は、実施例２で記載のように基本的に評価され、例えば、図２（パネルＢ）で示される。使用される細胞型、使用される抗体濃度、抗体添加後にアッセイがインキュベートされる時間の長さ、使用されるマイクロタイタープレートのタイプ（９６または４８ウェルマイクロタイタープレート）、および架橋抗体の使用または不使用（以下の実施例２で定義のように）を含む詳細なパラメーターは、変更されてよく、このような変化は結果に影響を与え得る。しかし、別に定める場合を除き、「直接殺細胞作用」は、（１）アッセイは、抗体添加後３７℃で２４時間インキュベートされる、および（２）９６ウェルマイクロタイタープレートが、アッセイを実施するために使用される、アッセイを意味する。「架橋抗体」の意味を含む、このアッセイ実施の詳細は、実施例２に記載される。アッセイで死滅された細胞のパーセンテージは、次のように評価される。最初に、細胞培養物中の細胞総数が、試験抗体を添加しない並行の試料中で検出された細胞の数により評価され得る。従って、抗体は、抗体含有試料が、抗体を含まない平行処理試料中に存在する芽球細胞の数の９０％以下を含む場合、細胞培養物中の細胞の少なくとも１０％の細胞を「直接死滅させる」。同様に、抗体は、抗体含有試料が、抗体を含まない並行の試料中に存在する芽球細胞の数の５０％以下を含む場合、培養物中の細胞の少なくとも５０％の細胞を「直接死滅させる」。直接殺細胞作用について抗ＣＤ２０または抗ＣＤ３７抗体を試験するために使用できる細胞型は、例えば、特に、ラージ細胞、ラモス細胞、またはＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞を含む。

異なる濃度の抗体が異なる試料中で使用される場合、最大応答の５０％を与える濃度（「ＥＣ_５０」）は、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍＳｏｆｔｗａｒｅ（例えば、バージョン６．０；ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて所与の実験で生成されたデータを分析することにより決定できる。このソフトウェアでは、非線形回帰カーブフィットを用いてＥＣ_５０を計算する。さらに、ＥＣ_５０は、上記直接殺細胞作用アッセイのために、ならびに種々の量の試薬を使用して用量／反応曲線を生成するアッセイ、例えば、実施例１３に記載の結合アッセイまたは実施例５に記載のＡＤＣＣまたはＣＤＣアッセイなどの多くの他のアッセイのために決定できる。

アミノ酸配列は、アミノ酸配列が、既知の遺伝子コードで与えられる、ヌクレオチド配列により理論的にコードされ得る場合、本明細書で意図されるように、「ヌクレオチド配列によりコードされる」。このようなポリペプチド鎖は、本明細書で意図されるように、ヌクレオチド配列により「コードされる」べきこのような核酸から実際に作製される必要はなく、およびヌクレオチド配列は、アミノ酸配列を「コードする」ための転写のおよび／または翻訳の停止および開始に必要な全ての補助配列を含む必要はない。当該技術分野において知られるように、所与のアミノ酸配列は、遺伝子コードの縮退のために所定の一群の核酸配列により「コードされる」。さらに、上述のように、ヌクレオチド配列により「コードされる」アミノ酸配列は、それが翻訳後修飾によりそのアミノ酸配列が変化するように改変される場合、その核酸配列により「コードされる」（本明細書で意図されるように）と本明細書で依然として見なされる。従って、例えば、アミノ酸配列が、配列中のあるアミノ酸が改変されるまたは欠失されることを除いて、ヌクレオチド配列により「コードされ」得るならば、その改変または欠失が翻訳後修飾による場合、そのヌクレオチド配列により「コードされる」と本明細書では見なされる。例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中で産生された組み換えヒト化ＩｇＧ抗体は、このような抗体をコードするヌクレオチド配列がＣ末端リジンをコードし得る場合であっても、ＨＣのカルボキシ末端（Ｃ末端）リジンを通常欠いている。このリジンは通常、翻訳後除去される。このようなＨＣは、Ｃ末端リジンを有するＨＣをコードするヌクレオチド配列により「コードされる」と本明細書では見なされる。

本明細書で意図される、ＩｇＧ抗体の「Ｆｃフラグメント」、「Ｆｃ領域」、または「Ｆｃ部分」は、ＨＣ由来のヒンジ領域（ヒンジ）、第２の重鎖定常ドメイン（Ｃ_Ｈ２）、およびＣ_Ｈ３から本質的になるが、それは、ＩｇＡまたはＩｇＭなどのいくつかのアイソタイプにおいてＣ_Ｈ３から下流の領域をさらに含み得る。

本明細書で意図される「重鎖（ＨＣ）」は、少なくともＶ_Ｈ、Ｃ_Ｈ１、ヒンジ、Ｃ_Ｈ２、およびＣ_Ｈ３を含む。これらのドメインの全てを含むＨＣはまた、「完全長ＨＣ」または「ＩｇＧＨＣ」とも呼ばれ得る。ＩｇＡまたはＩｇＭなどのいくつかのアイソタイプは、例えば、ＩｇＭＣ_Ｈ４ドメインなどの、追加の配列を含み得る。Ｋａｂａｔｅｔａｌ．，前出、のナンバリングシステムが、Ｖ_Ｈに対し使用され（図１（パネルＡ）および８（パネルＡ）参照）、およびＥＵシステム（Ｅｄｅｌｍａｎｅｔａｌ．（１９６９），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ６３：７８－８５、この文献は、参照により本明細書に組み込まれる）が、Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、およびＣ_Ｈ３に対し使用される。これらのよく知られたナンバリングシステムの使用は、本明細書で開示される配列中の実際のアミノ酸位置と、ＫａｂａｔまたはＥｄｅｌｍａｎナンバリングシステムを用いてその位置に割り付けられた番号の間の差異をもたらす場合がある。しかし、当業者は、Ｋａｂａｔｅｔａｌ．，前出およびＥｄｅｌｍａｎｅｔａｌ．，前出に含まれる情報を用いて、および／またはどのようにして下記のＫａｂａｔまたはＥｄｅｌｍａｎ番号が、開示配列中で見つけ得る抗体配列の保存された特徴を基準にして割り付けられ得るかを示す本明細書で以下に開示の表を基準にして、ＫａｂａｔまたはＥｄｅｌｍａｎ番号を、開示抗体配列中の任意の特定の位置に割り付けることができる。下表１～４は、一般化ＨＣ配列に対するこのナンバリングを示す。

表１：この表は、Ｋａｂａｔｅｔａｌ．，（前出）中のヒトＶ_Ｈアミノ酸配列（サブグループＩ～ＩＩＩ）に基づく「不変の」（Ｋａｂａｔｅｔａｌ．，前出、による）アミノ酸を示す。ナンバリングは、Ｋａｂａｔｅｔａｌ．，前出、による。ＣＤＲ内の位置番号は、太字イタリックで書かれている。後ろに文字を有する位置番号、例えば、１００Ａは、８２Ａ～８２Ｃを除き、ＣＤＲの可変長のためアミノ酸により埋められても、埋められなくてもよい。フレームワーク領域中の、位置８２Ａ～８２Ｃは、ほとんどの場合、サブグループＩ～ＩＩＩのヒトＶ_Ｈ中のアミノ酸により埋められる。特定の位置での単一太字アミノ酸は、Ｋａｂａｔｅｔａｌ．，（前出）により記載のヒトＶ_Ｈの３つ全てのサブグループＩ～ＩＩＩ中の「不変の」アミノ酸を示す。アミノ酸が指定されていない位置は、この基準に適合しない。

表１は、任意のＶ_Ｈ配列のアライメントを可能にし得る保存された間隔を有する多数の保存アミノ酸が存在することを示し、上記に示すように保存アミノ酸を目測で間隔をあけて配置した。あるいは、新規配列は、アライメントソフトウェア、例えば、ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ（登録商標）で入手可能なアライメントソフトウェア（例えば、ＩＭＧＴ／ＤｏｍａｉｎＧａｐＡｌｉｇｎ、これは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇで入手可能である、またはＣＬＵＳＴＡＬＯｍｅｇａ（Ｓｉｅｖｅｒｓｅｔａｌ．，Ｆａｓｔ，ｓｃａｌａｂｌｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｈｉｇｈｑｕａｌｉｔｙｐｒｏｔｅｉｎｍｕｌｔｉｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅａｌｉｇｎｍｅｎｔｓｕｓｉｎｇＣｌａｓｔａｌＯｍｅｇａ，２０１１，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＳｙｓｔｅｍｓＢｉｏｌｏｇｙ７（１）：５３９）を用いて、既知のＶ_Ｈ配列と整列されてよい。

下表２は、Ｃ_Ｈ１のコンセンサスアミノ酸配列を示す。

表２：ナンバリングは、Ｅｄｅｌｍａｎｅｔａｌ．，（前出）による。以下の太字で示す単一アミノ酸は、様々な種からのＣ_Ｈ１のアライメントからのＫａｂａｔｅｔａｌ．，（前出）による「不変の」残基である。本明細書で記載の改変のために選択された位置または米国特許出願公開第２０１９／０２４８８９９号の位置（１３１、１３３、１４７、１６８、１７０、１７３、１７６、１８１、および１８３）は、下線付き太線で示される。これらの位置で、Ｋａｂａｔｅｔａｌ．，（前出）で報告された６３霊長類Ｃ_Ｈ１配列中の最もよくある１個または２個のアミノ酸は、プレーンテキストで示される。アミノ酸が指定されていない位置は、「不変」ではなく、改変用に選択されなかった。

種および／またはアイソタイプ内のＣ_Ｈ１は、配列中で表２から明らかな状態より密接に関係している。下表３は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４アイソタイプのヒトＣ_Ｈ１のアライメントを示す。このアライメントは、これらの密接に関係したＣ_Ｈ１中で配列の極めて強い保存を強調する。

表３：ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４抗体の代表的Ｃ_Ｈ１のアミノ酸配列を、ＩＭＧＴウエブページのそれぞれ、受入番号Ｊ００２２８、Ｊ００２３０、Ｘ０３６０４、およびＫ０１３１６から入手し、ＣＬＵＳＴＡＬＷソフトウェアで整列させた。残基は、Ｅｄｅｌｍａｎｅｔａｌ．，前出のＥＵシステムに従ってナンバリングされる。Ｋａｂａｔｅｔａｌ．，前出、による「不変の」残基は、太字で示される。これらの残基は、高度に保存されているが、完全に不変ではない。下線付き太線でイタリックの残基は、米国特許出願公開第２０１９／０２４８８９９号で報告されるようにそこで置換が行われ試験された位置である。

下表４は、４つのＩｇＧサブクラス、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４のヒトＩｇＧＦｃ領域のアライメントを示す。このアライメントは、これらのサブクラス間の差異、ならびに高い配列保存を示す。

「ヒト」ヌクレオチドまたはアミノ酸配列、タンパク質、または抗体は、天然においてヒトで発生するものであるか、または以下で説明する少数の改変を除きこのような配列またはタンパク質と同一であるものである。多くのヒトヌクレオチドおよびアミノ酸配列が、例えば、Ｋａｂａｔｅｔａｌ．，前出、で報告されており、それは、当該技術分野における用語「ヒト」の使用を示す。本明細書で意図される「ヒト」アミノ酸配列または抗体は、天然起源の配列に対して、１種または複数の挿入、欠失、または置換を含み得るが、但し、「ヒト」アミノ酸配列が、１００個毎のアミノ酸当り、１０個を超える単一アミノ酸の挿入、欠失、および／または置換を含まないことが前提である。同様に、ヒトヌクレオチド配列は、３００個のヌクレオチド毎に３０個を超える一塩基の挿入、欠失、および／または置換を含まない。特殊なＶ_ＨまたはＶ_Ｌ配列の例では、ＣＤＲは、極端に可変であることが予測され、特定のＶ_ＨまたはＶ_Ｌアミノ酸配列（またはそれをコードするヌクレオチド配列）が「ヒト」配列であるかどうかを決定するために、ＣＤＲ（またはそれらをコードするヌクレオチド配列）は配列の一部と見なされない。

本明細書で意図される「ヒト化」抗体は、非ヒト起源であるが、可能な限りヒトであるように遺伝子改変され、それにより願わくはヒト中での免疫原性を低減し、同時に、抗体安定性および結合などの機能特性を保持している抗体である。通常、これは、ほとんどの、または全ての可変ドメインの定常ドメインおよびフレームワーク領域がヒトまたはほぼヒト配列であり、同時に、ＣＤＲは、異なる生物に由来することを意味する。しかし、例えば、マウス抗体からヒトフレームワークへの単なるＣＤＲのグラフト化は、望ましい特性を有する抗体を生成し得ず、さらなる改変が必要とされることがある。近年、ヒト化の結果を簡略化および改善するための種々の手法が開発されている。例えば、Ｃｈｏｉｅｔａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｙｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎｂｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｂａｓｅｄｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌｐｒｏｔｅｉｎｄｅｓｉｇｎ，２０１５，ｍＡｂｓ７（６）：１０４５－１０５７、およびそこで引用されている参考文献を参照されたい。しかし、抗体の１種または複数の特性を改善するために実施された変更の結果は、主にＣＤＲ３ループの大きなフレキシビリティに起因して、完全に予測可能ではない。例えば、ｄｏｓＳａｎｔｏｓｅｔａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｓａｎｄｃｈａｌｌｅｎｇｅｓｉｎｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｄｒｕｇｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０１８，Ｂｒａｚ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．５４（Ｓｐｅｃｉａｌ）：ｅ０１００７、を参照のこと。

本明細書で意図される「ＩｇＧ抗体」は、（１）それぞれがＶ_Ｈ、Ｃ_Ｈ１、ヒンジドメイン、Ｃ_Ｈ２、およびＣ_Ｈ３を含む、２つのＨＣ、および（２）それぞれがＶ_ＬおよびＬＣ定常ドメイン（Ｃ_Ｌ）を含む、２つの軽鎖（ＬＣ）、を含む。ＩｇＧ抗体の重鎖定常ドメインは、ＩｇＧアイソタイプ、例えば、ＩｇＧのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４サブクラスのものである。これらのドメインは、例えば、Ｋａｂａｔｅｔａｌ．，前出、ｐｐ．ｘｖ－ｘｉｘおよび６４７－６９９に記載され、これらのページは、参照により本明細書に組み込まれる。Ｋａｂａｔｅｔａｌ．，前出のナンバリングシステムが、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌに対し使用される（図１および８ならびに表１および５を参照）。ＥＵシステム（Ｅｄｅｌｍａｎｅｔａｌ．（１９６９），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ６３：７８－８５、この文献はその全体が本明細書に組み込まれる）が、Ｃ_Ｌ、Ｃ_Ｈ１、ヒンジ、Ｃ_Ｈ２、およびＣ_Ｈ３に対し使用される。表２～４および６を参照されたい。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ抗体の定常ドメインのいくつかの部分は、１つのサブクラス、例えば、ＩｇＧ４のものであってよく、同じ抗体の別の部分は、別のサブクラス、例えば、ＩｇＧ１のものであってよい。このような抗体は、本明細書で意図されるように依然としてＩｇＧ抗体である。このような混合サブクラスアミノ酸配列を有するＣ_Ｈ１～Ｃ_Ｈ３抗体フラグメントのアミノ酸配列の例としては、配列番号３３、３６、３９、および４２が挙げられる。さらに、本明細書で意図されるＩｇＧ抗体の定常ドメインのアミノ酸配列は、本明細書で意図されるように、ＩｇＧ抗体以外の何かに抗体を変えることなく、限られた程度に天然起源配列とは異なり得る。例えば、ＩｇＧ抗体は、天然起源ＩｇＧアミノ酸配列に対して、２４、２０、１６、１４、１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１個のアミノ酸置換、欠失、または挿入を含むＣ_Ｈ１～Ｃ_Ｈ３フラグメントを含み得る。しかし、ＩｇＧ抗体のＩｇＧサブクラスは、抗体が本明細書で意図されるＩｇＧ抗体であるかどうかを決定するために、Ｃ_Ｈ１～Ｃ_Ｈ３フラグメントのアミノ酸配列の一部が、例えば、ＩｇＧ１抗体配列と比較でき、アミノ酸配列の他の部分が、例えば、ＩｇＧ４抗体配列と比較できるように、Ｃ_Ｈ１～Ｃ_Ｈ３フラグメントの長さにわたり変わっても変わらなくてもよい。

本明細書で意図される「軽鎖（ＬＣ）」は、Ｖ_ＬおよびＣ_Ｌを含み、これらは、カッパ（Ｖ_ＬκおよびＣ_Ｌκ）またはラムダ（Ｖ_ＬλおよびＣ_Ｌλ）であり得る。それらの典型的アミノ酸配列を含むこれらのドメインは、例えば、Ｋａｂａｔｅｔａｌ．，前出、ｐｐ．ｘｉｉｉ－ｉｉｘ、１０３－３０９、および６４７－６６０に記載され、これらのページは、参照により本明細書に組み込まれる。Ｖ_Ｌに対して本明細書で使用されるナンバリングシステムは、Ｋａｂａｔｅｔａｌ．，前出で記載のものであり、Ｃ_Ｌに対して使用されるＥＵナンバリングシステムは、Ｅｄｅｌｍａｎｅｔａｌ．，前出で記載のものである。下表５および６は、これらのシステムの種々の軽鎖配列への適用を示す。当業者は、このような方法を使用してＫａｂａｔまたはＥｄｅｌｍａｎ番号を本明細書で開示される配列中の特定の位置に割り付けることができる。

表５：ナンバリングは、Ｋａｂａｔｅｔａｌ．，（前出）による。太字の番号は、ＣＤＲの位置を示す。後ろに文字を有する位置番号、例えば、２７Ａは、ＣＤＲの可変長のため、アミノ酸により埋められても、埋められなくてもよい。Ｋａｂａｔｅｔａｌ．，（前出）のヒトカッパＶ_Ｌ（グループＩ～ＩＶ）に対する「不変の」残基は、太字として示され、その位置で見つけられるアミノ酸を示す。位置７３では、２個の保存的可変アミノ酸（ロイシンまたはバリン）のいずれかが、この位置で「不変」である。さらに、多くの他のアミノ酸は、特定のアミノ酸配列をＶ_Ｌとして分類するのに役立ち得るカッパまたはラムダＶ_Ｌのいくつかのサブグループ内で不変であるか、または高度に保存されている。アミノ酸が指定されていない位置は、不変ではない。

表６：ナンバリングは、Ｅｄｅｌｍａｎｅｔａｌ．，（前述）に従い、これは、Ｋａｂａｔｅｔａｌ．，（前出）のＣ_Ｌのナンバリングと同じである。数字の下部に太字で示すアミノ酸は、種々の種由来のカッパまたはラムダＣ_ＬのアライメントからのＫａｂａｔｅｔａｌ．，（前出）による「不変の」残基である。選択位置（１３１、１６０、１６２、１７４、１７６、および１７８）で示されるように、１０個のヒトカッパ鎖（上段の行）またはＫａｂａｔｅｔａｌ．，（前出）で報告された２８個のヒトラムダ鎖（下段の行）中の高度に保存されたアミノ酸は、プレーンテキストで示される。２個の異なるアミノ酸のいずれかがこれらの位置の１つで見つけられる場合には、より多い共通アミノ酸が、より少ない共通の、例えば、Ａ／Ｍの前に示される。さらに、多くの他のアミノ酸が、Ｃ_ＬκまたはＣ_Ｌλドメインのいくつかのサブグループ内で不変であるか、または高度に保存されており、これは、Ｃ_Ｌとして特定のアミノ酸配列を分類するのに役立ち得る。アミノ酸が指定されていない位置は、不変ではない。

本明細書で使用される場合、「ＭａｂＰａｉｒ」または「ＭａｂＰａｉｒ混合物」は、その中に抗体コードＤＮＡが導入されている単一宿主細胞株の培養で産生される１対の、すなわち、２個の抗体を意味する。宿主細胞は、抗体の２種の主要種のみを産生する。どのようにしてＭａｂＰａｉｒが産生されるかに関するさらなる説明については、米国特許出願公開第２０１９／０２４８８９９号、実施例１、２、３、４、５、６、および７、ならびにその中に記載の図を参照されたい。

本明細書で意図される、抗体の混合物の観点で抗体の「主要な種」は、混合物内の抗体の総量の少なくとも１０％を占める、特定の抗体である。抗体の混合物中にどのくらい多くの主要な種が存在するかを決定するために、米国特許出願公開第２０１９／０２４８８９９号の実施例５で記載され、図１４（米国特許出願公開第２０１９／０２４８８９９号のこの部分は、参照により本明細書に組み込まれる）で示される低ｐＨカチオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィーを、実施し得る。この方法は、Ｃｈｅｎｅｔａｌ．，Ｔｈｅｕｓｅｏｆｎａｔｉｖｅｃａｔｉｏｎ－ｅｘｃｈａｎｇｅｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｔｏｓｔｕｄｙａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎａｎｄｐｈａｓｅｓｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，２０１０，ＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉｅｎｃｅ，１９：１１９１－１２０４により記載され、この文献は、その全体が本明細書に組み込まれる。手短に説明すると、それは、ＷａｔｅｒｓＡｌｌｉａｎｃｅ２６９５高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システムを使用する、前段に５０ｍｍのガードカラム（ＰｒｏＰａｃ（商標）ＷＣＸ－１０Ｇ）を備えたＴｈｅｒｍｏＰｒｏＰａｃ（商標）ＷＣＸ－１０弱ＣＥＸカラム、４ｘ２５０ｍｍを採用する。クロマトグラフィーは、３０分間にわたる１００％緩衝液Ａ（２０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．２）から１００％緩衝液Ｂ（２５０ｍＭの塩化ナトリウムを加えた２０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．２）までの直線勾配で実行できる。カラムを、高塩（１Ｍの塩化ナトリウム）で洗浄し、緩衝液Ａの開始条件に再平衡化できる。抗体を、２１４ｎｍの吸光度によりカラム流出物中で検出できる。検出ピークの相対量を、ＥＭＰＯＷＥＲ（商標）ソフトウェア（ＷａｔｅｒｓＣｏｒｐ．，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて決定できる。低ｐＨＣＥＸを、異なる完全長抗体種間で識別でき、混合物中の特定の抗体種の相対量を定量するために使用できる。

本明細書で意図される、抗体の混合物内の「微量種」は、混合物中の抗体の総量の１０％未満を含む。これは、「主要種」の定義で記載の低ｐＨＣＥＸクロマトグラフィーにより決定できる。

用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、本明細書では同義に使用され、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」、または「ポリヌクレオチド配列」の場合と同様である。

本明細書で意図される「相手指向改変」は、Ｖ_Ｈ、Ｃ_Ｈ１、Ｖ_Ｌ、またはＣ_Ｌアミノ酸配列内のＨＣ／ＬＣ境界での単一アミノ酸の置換、挿入、または欠失、任意選択で、荷電アミノ酸またはシステインによる天然起源アミノ酸の置換であり、これは、ＨＣおよびＬＣ、任意選択でヒトおよび／または霊長類ＨＣおよびＬＣがより強力に結合することを可能にする。より具体的には、「ＨＣ相手指向改変」は、ときにはＶ_ＨまたはＣ_Ｈ１中の「接触」残基での「ＬＣ相手指向改変」の存在下でのみに、ＨＣおよびＬＣをより強力に結合させる、Ｖ_ＬまたはＣ_Ｌ中の改変である。同様に、「ＬＣ相手指向改変」は、ときにはＶ_ＬまたはＣ_Ｌ中の「接触」残基での「ＨＣ相手指向改変」の存在下でのみに、ＨＣおよびＬＣをより強力に結合させる、Ｖ_ＨまたはＣ_Ｈ１中の改変である。いくつかの実施形態では、ＨＣおよびＬＣ相手指向改変の接触対は、反対電荷を有する荷電アミノ酸の置換であり得る。他の実施形態では、荷電アミノ酸が、同族ＨＣ／ＬＣ対、すなわち電荷対中の接触位置で逆帯電した残基の対を形成するために１個のみの改変が必要とされるように、ＨＣまたはＬＣの接触位置の１つに既に存在する。他の実施形態では、システイン残基が、同族ＨＣ／ＬＣ対中のジスルフィド架橋が形成できるように、接触位置で導入されてよい。さらなる実施形態では、米国特許第８，６７９，７８５号（この関連部分は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載のように、ノブおよびホール（または突出部および空洞）を接触残基の位置に作成するアミノ酸を、相手指向改変により得ることができる。ＨＣは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、またはＩｇＥアイソタイプ、任意選択で、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のものであってよい。ＨＣおよびＬＣ相手指向改変は、ＨＣ／ＬＣ境界の一部を形成する接触アミノ酸位置で起こる。Ｃ_ＬＳおよびＣ_Ｈ１中の界面残基は、米国特許第８，５９２，５６２号、表４および５および付随する本文の欄１０および１１（これらの全ては、参照により本明細書に組み込まれる）で説明されているように、４．５Å以内の残基を含む。ヒトＣ_Ｈ１およびＣ_ＬＳ中のこれらの位置は、下表７に整理されている。

Ｖ_ＨとＶ_Ｌの間の境界上の接触残基の特定の例では、改変に好適な残基の対、Ｖ_Ｈ中の１個とＶ_Ｌ中の１個は、次の基準を使用して選択できる：（１）残基は埋め込まれているまたは部分的に埋め込まれている、すなわち、三次構造の完全長抗体中で隔絶されている、（２）残基は空間的に近接している、すなわち、既知の構造モデルにより、２個のアミノ酸のＣα（Ｃαは、アミノ酸の中心炭素であり、これにアミノ基、カルボキシル基、および側鎖が付着される）が約１２Å以内にある、または１個のアミノ酸の側鎖重原子（水素以外の任意の原子）と他のアミノ酸の任意の重原子の間が最大で５．５Åである、（３）残基は高度に保存されているが、それらは完全に不変である必要はない、および（４）残基はＣＤＲ内に存在しない、またはＣＤＲと相互作用している。このような接触残基の例としては、限定されないが、次記が挙げられる：位置４４（Ｖ_Ｈ）および位置１００（Ｖ_Ｌ）；位置３９（Ｖ_Ｈ）および位置３８（Ｖ_Ｌ）；ならびに位置１０５（Ｖ_Ｈ）および位置４３（Ｖ_Ｌ）。

１次近似のため、ＨＣおよび／またはＬＣ相手指向改変によるＨＣ／ＬＣ結合の強度における変化が、米国特許出願公開第２０１９／０２７６５４２号の実施例１１およびその中で言及された図、ならびに米国特許出願公開第２０１９／０２４８８９９号の実施例３およびその中で言及された図に記載のように、「チェインドロップアウト」実験により測定できる。これらの特許の全ては、参照により本明細書に組み込まれる。

チェインドロップアウト実験からの結果を確認または明確化するために、第１の抗体（Ｍａｂ１）のＨＣおよびＬＣ、および第２の抗体（Ｍａｂ２）をコードするＤＮＡを含む形質移入体で生じる種々のサイズのＦａｂフラグメントを、本明細書の実施例１２および図２４で、Ｔｈｏｍｐｓｏｎｅｔａｌ．，ＣｏｍｐｌｅｘｍｉｘｔｕｒｅｓｏｆａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｇｅｎｅｒａｔｅｄｆｒｏｍａｓｉｎｇｌｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅｌｙａｎｄｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｌｙｅｖａｌｕａｔｅｄｂｙｎａｔｉｖｅＯｒｂｉｔｒａｐｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，２０１４，ｍＡｂｓ６：１：１９７－２０３（この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）で、および米国特許出願公開第２０１９／０２４８８９９号の図１５および実施例５で記載の質量分析により決定できる。ほとんどの場合、同族および非同族対は、このような技術を用いて質量により区別できる。非同族対が、未改変Ｍａｂ１ＨＣおよびＬＣならびに未改変Ｍａｂ２ＨＣおよびＬＣをコードするＤＮＡを遺伝子導入した細胞中で主要な種であり、Ｍａｂ１ＨＣおよびＬＣならびにＭａｂ２ＨＣおよびＬＣをコードするＤＮＡを遺伝子導入した細胞中で主要な種でなく、これらの抗体の少なくとも１種が相手指向改変を含む場合、改変の少なくとも１個は、好ましい相手指向改変であると、本明細書では見なされる。

相手指向改変の例としては、部分的にまたは完全に、次の電荷対を作成する改変が挙げられる：４４Ｄ／Ｅ（Ｖ_Ｈ）および１００Ｒ／Ｋ（Ｖ_Ｌ）；４４Ｒ／Ｋ（Ｖ_Ｈ）および１００Ｄ／Ｅ（Ｖ_Ｌ）；１０５Ｒ／Ｋ（Ｖ_Ｈ）および４３Ｄ／Ｅ（Ｖ_Ｌ）；１０５Ｄ／Ｅ（Ｖ_Ｈ）および４３Ｒ／Ｋ（Ｖ_Ｌ）；１４７Ｄ／Ｅ（Ｃ_Ｈ１）および１３１Ｒ／Ｋ（Ｃ_Ｌ）；１４７Ｒ／Ｋ（Ｃ_Ｈ１）および１３１Ｄ／Ｅ（Ｃ_Ｌ）；１６８Ｄ／Ｅ（Ｃ_Ｈ１）および１７４Ｒ／Ｋ（Ｃ_Ｌ）；１６８Ｒ／Ｋ（Ｃ_Ｈ１）および１７４Ｄ／Ｅ（Ｃ_Ｌ）；１８１Ｒ／Ｋ（Ｃ_Ｈ１）および１７８Ｅ／Ｄ（Ｃ_Ｌ）；ならびに１８１Ｅ／Ｄ（Ｃ_Ｈ１）および１７８Ｒ／Ｋ（Ｃ_Ｌ）。加えて、相手指向改変は、システインが別のアミノ酸を置換し、それによりシステインの接触対が抗体のＨＣおよびＬＣ中、例えば次記のいずれかの対中に存在する、置換を含む：１２６Ｃ（Ｃ_Ｈ１）および１２１Ｃ（Ｃ_Ｌ）；１２６Ｃ（Ｃ_Ｈ１）および１２４Ｃ（Ｃ_Ｌ）；１２７Ｃ（Ｃ_Ｈ１）および１２１Ｃ（Ｃ_Ｌ）；１２８Ｃ（Ｃ_Ｈ１）および１１８Ｃ（Ｃ_Ｌ）；１３３Ｃ（Ｃ_Ｈ１）および１１７Ｃ（Ｃ_Ｌ）；１３３Ｃ（Ｃ_Ｈ１）および２０９Ｃ（Ｃ_Ｌ）；１２３Ｃ（Ｃ_Ｈ１）および１１６Ｃ（Ｃ_Ｌ）；１４１Ｃ（Ｃ_Ｈ１）および１１６Ｃ（Ｃ_Ｌ）；１６８Ｃ（Ｃ_Ｈ１）および１７４Ｃ（Ｃ_Ｌ）；１７０Ｃ（Ｃ_Ｈ１）および１６２Ｃ（Ｃ_Ｌ）；１８３Ｃ（Ｃ_Ｈ１）および１７６Ｃ（Ｃ_Ｌ）；１７３Ｃ（Ｃ_Ｈ１）および１６０Ｃ（Ｃ_Ｌ）；１７０Ｃ（Ｃ_Ｈ１）および１７６Ｃ（Ｃ_Ｌ）；ならびに１７３Ｃ（Ｃ_Ｈ１）および１６２Ｃ（Ｃ_Ｌ）。

「霊長類」ヌクレオチドまたはアミノ酸配列またはタンパク質は、霊長類で見つかる核酸またはタンパク質中で天然に発生するものであるか、またはこのような配列またはタンパク質と、以下で説明する少数の改変を除き同一であるものである。霊長類は、限定されないが、原猿類（キツネザルを含む）、新世界ザル、チンパンジー、ヒト、ゴリラ、オランウータン、テナガザル、および旧世界ザルを含む多数の科由来の動物を含む。特定の霊長類種は、限定されないが、特に、ホモサピエンス、アカゲザル（Ｍａｃａｃａｍｕｌａｔａ）（アカゲザル（ｒｈｅｓｕｓｍａｃａｑｕｅ））、カニクイザル（Ｍａｃａｃａｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）（カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓｍｏｎｋｅｙ））、およびチンパンジー（Ｐａｎｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）（チンパンジー（ｃｈｉｍｐａｎｚｅｅ））を含む。多くの霊長類ヒトヌクレオチドおよびアミノ酸配列が、当技術分野において既知であり、例えば、Ｋａｂａｔｅｔａｌ．，前出、で報告されている。一般に、本明細書で意図される「霊長類」アミノ酸配列は、天然起源の霊長類配列に対して、１種または複数の挿入、欠失、または置換を含み得るが、但し「霊長類」アミノ酸配列が、１００個毎のアミノ酸当り、１０個を超える単一アミノ酸の挿入、欠失、および／または置換を含まないことが前提である。同様に、霊長類ヌクレオチド配列は、天然起源の霊長類配列に対して、３００個のヌクレオチド毎に３０個を超える一塩基の挿入、欠失、および／または置換を含まない。特殊なＶ_ＨまたはＶ_Ｌ配列の例では、ＣＤＲは、極端に可変であることが予測され、特定のＶ_ＨまたはＶ_Ｌアミノ酸配列（またはそれをコードするヌクレオチド配列）が「霊長類」配列であるかどうかを決定するために、ＣＤＲ（またはそれらをコードするヌクレオチド配列）は配列の一部と見なされない。

本明細書で意図される、特定の疾患または状態に対する「治療」は、一連の手順を指し、これは、ヒト患者、疾患または状態を反映すると考えられる動物モデル系、または疾患または状態を反映すると考えられるインビトロ細胞ベースアッセイにおける１種または複数の症状の軽減または予測された疾患または状態の進行の低減または中断をもたらす、１種または複数の抗体またはポリヌクレオチドまたは１種または複数の抗体をコードするポリヌクレオチドの投与を含み得る。これは、ヒトまたは動物の症状の客観的測定値により、または細胞ベースアッセイの種々のパラメーター、例えば、１種または複数のサイトカイン（例えば、ＩＦＮγ）の産生、細胞増殖、または細胞死、などの測定により確認できる。例えば、癌「治療」の場合、治療は、腫瘍体積の減少、ヒトまたは動物モデル系における予測腫瘍転移の非存在、生存時間の延長、または癌を罹患しているヒトまたは動物における無増悪生存期間または無病生存期間の増加をもたらし得る。癌治療はまた、細胞ベースアッセイで免疫系の活性化を示す指数の増大、例えば、免疫応答を媒介するＴ細胞または他の細胞の増殖および／または免疫応答を媒介するＴ細胞または他の細胞によるサイトカイン産生の増大をもたらし得る。

本明細書で意図される「ＴＳ」は、キメラ抗ＣＤ２０抗体トシツモマブとアミノ酸配列がほとんど同一である、キメラ抗ＣＤ２０抗体である。ＴＳは、トシツモマブの可変ドメイン＋ヒト定常ドメインを有する。トラスツズマブのＨＣおよびＬＣのアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号１００および１０１で提供される。ＴＳのＨＣのアミノ酸配列は、トシツモマブのものと次のように異なる：（１）それは、配列番号１００の位置１２１と１２２の間に挿入された配列ＡＳＴＫを有する；（２）配列番号１００の位置２１５のアラニンは、ＴＳＨＣ中の対応する位置（ＴＳＨＣ中の位置２１９）でバリンに変更される。理由は、それが、この位置の上流で挿入された４個の追加のアミノ酸を有するためである。ＴＳのＬＣのアミノ酸配列は、それが、追加の３個のアミノ酸、すなわち、配列番号１０１のアミノ酸配列のカルボキシ末端に付加されたＧＥＣを有するという点で、配列番号１０１とは異なる。

抗ＣＤ２０抗体
本明細書で記載されるのは、多数の抗ヒトＣＤ２０（抗ｈＣＤ２０）抗体である。これらの抗体は、ヒトまたはヒト化抗体、任意選択でＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体などのＩｇＧ抗体であり得る。これらの抗体は、Ｖ_Ｈを含むＨＣ、およびＶ_Ｌを含むＬＣを含み得る。いくつかの実施形態では、抗ｈＣＤ２０抗体のＶ_Ｈは、配列番号１２に対して１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１個以下の改変を含むアミノ酸配列を含んでよく、抗ｈＣＤ２０抗体のＶ_Ｌは、配列番号８に対して７、６、５、４、３、２または１個以下の改変を含むアミノ酸配列を含んでよい。このような抗体は、ｈＣＤ２０、任意選択でカニクイザルＣＤ２０（ｃｙｎｏＣＤ２０）に特異的に結合でき、１０μｇ／ｍｌの濃度の試験抗体を用いる、架橋抗体なしで実施される直接殺細胞作用アッセイで、少なくとも２０％、３０％、４０％、または５０％のＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞を直接死滅させることができる。別の態様では、このような抗体は、１０、８、６、４、３、２、１．５、１、０．８、０．６、０．５、または０．４ｎＭ以下のＥＣ_５０で、架橋抗体なしに実施される直接殺細胞作用アッセイで、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞を直接死滅させることができる。

いくつかの実施形態では、Ｖ_Ｈは、（１）配列番号１２のアミノ酸配列および／または（２）配列番号１２をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列および／または（３）配列番号１１によりコードされるアミノ酸配列、を含み得る。いくつかの実施形態では、Ｖ_Ｌは、（１）配列番号８のアミノ酸配列および／または（２）配列番号８をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列および／または（３）配列番号７によりコードされるアミノ酸配列、を含み得る。別の態様では、抗ｈＣＤ２０抗体は、それぞれ、配列番号１、２、３、４、５、および６のアミノ酸配列を含む、Ｖ_ＨＣＤＲ１、Ｖ_ＨＣＤＲ２、Ｖ_ＨＣＤＲ３、Ｖ_ＬＣＤＲ１、Ｖ_ＬＣＤＲ２、およびＶ_ＬＣＤＲ３を含み得る。さらにＶ_ＨＣＤＲ１、Ｖ_ＨＣＤＲ２、Ｖ_ＨＣＤＲ３、Ｖ_ＬＣＤＲ１、Ｖ_ＬＣＤＲ２、およびＶ_ＬＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号１、２、３、４、５、および６をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、Ｖ_Ｈは、配列番号１１によりコードされ、Ｖ_Ｌは、配列番号７によりコードされ得る。このような抗体は、ｈＣＤ２０、任意選択で、ｃｙｎｏＣＤ２０に特異的に結合でき、１０μｇ／ｍｌの濃度の試験抗体を用いる、架橋抗体なしで実施される直接殺細胞作用アッセイで、少なくとも２０％、３０％、４０％、または５０％のＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞を直接死滅させることができる。別の態様では、このような抗体は、１０、８、６、４、３、２、１．５、１、０．８、０．６、０．５、または０．４ｎＭ以下のＥＣ_５０で、架橋抗体なしに実施される直接殺細胞作用アッセイにおいてＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞を直接死滅させることができる。

これらの抗ｈＣＤ２０抗体は、ＩｇＧ抗体、いくつかの実施形態では、ヒトまたはヒト化ＩｇＧ抗体であり得る。このようなＩｇＧ抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４サブクラスのものであり得る。他の実施形態では、このようなＩｇＧ抗体は、２つ以上のＩｇＧサブクラス由来のアミノ酸配列を含み得る。例えば、さもなければＩｇＧ１抗体である抗体は、ＩｇＧ４ヒンジ、またはＩｇＧ１ヒンジまたはその一部を置換されたＩｇＧ４ヒンジの一部のみを有し得、それは依然として本明細書で意図されるＩｇＧ抗体と見なされ得る。他の例では、ＣＨ１ドメインまたはその一部は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４Ｃ_Ｈ１ドメインのアミノ酸配列を有し得、ヒンジまたはその一部は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４ヒンジのアミノ酸配列を有し得、およびＣ_Ｈ２ドメインまたはその一部は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４Ｃ_Ｈ２ドメインのアミノ酸配列を有し得る。いくつかの実施形態では、ＣＨ１ドメインは、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４Ｃ_Ｈ１ドメインのアミノ酸配列を有し、ヒンジは、部分的ＩｇＧ４配列および部分的ＩｇＧ１配列であるアミノ酸配列を有し、Ｃ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３ドメインは、ＩｇＧ１アミノ酸配列を有する。代わりに、または追加して、定常ドメインの配列は、天然起源のＩｇＧ抗体の配列から、特にヒンジドメインで幾分異なり得る。いくつかの実施形態では、抗ｈＣＤ２０抗体のＨＣは、（１）配列番号２４のアミノ酸配列および／または（２）配列番号２４をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列、を含み得る。さらなる実施形態では、抗ｈＣＤ２０のＨＣは、配列番号１８に対して８、７、６、５、４、３、２、または１個以下の改変を含むアミノ酸配列を含み得る。さらに、抗ｈＣＤ２０抗体のＨＣは、（１）配列番号１８のアミノ酸配列および／または（２）配列番号１８をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列、を含み得る。このような抗体は、ｈＣＤ２０、任意選択でｃｙｎｏＣＤ２０に特異的に結合でき、１０μｇ／ｍｌの濃度の抗体を用いる、架橋抗体なしで実施される直接殺細胞作用アッセイにおいて、少なくとも２０％、３０％、４０％、または５０％のＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞を直接死滅させることができる。別の態様では、このような抗体は、５、４、３、２、１、０．８、０．６、０．５、または０．４ｎＭ以下のＥＣ_５０で、架橋抗体なしで、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞を直接死滅させることができる。

さらなる実施形態では、抗ｈＣＤ２０のＨＣは、配列番号２３に対して１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１個以下の改変を含むアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、抗ｈＣＤ２０抗体のＨＣは、（１）配列番号２３のアミノ酸配列および／または（２）配列番号２３をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列および／または（３）配列番号２２のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列、を含み得る。このような抗体は、ｈＣＤ２０、任意選択でｃｙｎｏＣＤ２０に特異的に結合でき、１０μｇ／ｍｌの濃度の試験抗体を用いる、架橋抗体なしで実施される直接殺細胞作用アッセイにおいて、少なくとも２０％、３０％、４０％、または５０％のＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞を直接死滅させることができる。別の態様では、このような抗体は、１０、８、６、４、３、２、１．５、１、０．８、０．６、０．５、または０．４ｎＭ以下のＥＣ_５０で、架橋抗体なしに実施される直接殺細胞作用アッセイにおいてＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞を直接死滅させることができる。

いくつかの実施形態では、抗ｈＣＤ２０抗体のＨＣは、２３９Ｄおよび２９８Ａを含み得る。さらなる態様では、抗ｈＣＤ２０のＨＣは、配列番号３５に対して７、６、５、４、３、２、または１個以下の改変を含むアミノ酸配列を含み得る。別の態様では、抗ｈＣＤ２０抗体のＨＣは、（１）配列番号３５のアミノ酸配列および／または（２）配列番号３５をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列および／または（３）配列番号３４によりコードされるアミノ酸配列、を含み得る。このような抗体は、ｈＣＤ２０、任意選択でｃｙｎｏＣＤ２０に特異的に結合でき、１０μｇ／ｍｌの濃度の試験抗体を用いる、架橋抗体なしで実施される直接殺細胞作用アッセイにおいて、少なくとも２０％、３０％、４０％、または５０％のＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞を直接死滅させることができる。別の態様では、このような抗体は、１０、８、６、４、３、２、１．５、１、０．８、０．６、０．５、または０．４ｎＭ以下のＥＣ_５０で、架橋抗体なしに実施される直接殺細胞作用アッセイにおいてＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞を直接死滅させることができる。

いくつかの実施形態では、改変を、抗ｈＣＤ２０ＩｇＧ抗体中に導入して、抗体のエフェクター機能、例えば、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣを高めることができる。このような改変は、例えば、ＨＣ中の次の改変の１個または複数を含み得る：２３９Ｄ、３３０Ｆ、３３４Ｖ、２９８Ａ、２９０Ｙ、２９６Ｗ、および３３０Ｍ。いくつかの実施形態では、ＨＣは、改変２３９Ｄおよび２９８Ａを含み得る。表１６に記載のものなどの、他の組み合わせも可能である。これらの抗体のＣ_Ｈ１～Ｃ_Ｈ３部分は、配列番号３３、３６、３９、または４２のアミノ酸配列、または配列番号３３、３６、３９、または４２をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、これらの抗体のＣＨ１～ＣＨ３部分は、配列番号３３、３６、３９、または４２に対して、８、７、６、５、４、３、２、または１個以下の改変を含むアミノ酸配列を有し得る。さらなる実施形態では、このような抗体のＨＣは、例えば、配列番号３２、３５、３８、または４１のアミノ酸配列および／または配列番号３２、３５、３８、または４１をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、これらの抗体のＨＣは、配列番号３２、３５、３８、または４１に対して９、８、７、６、５、４、３、２、または１個以下の改変を含むアミノ酸配列を有し得る。他の実施形態では、このような抗体のＨＣは、配列番号３１、３４、３７、または４０の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含み得る。このような抗体は、ｈＣＤ２０、任意選択でｃｙｎｏＣＤ２０に特異的に結合でき、１０μｇ／ｍｌの濃度の試験抗体を用いる、架橋抗体なしで実施される直接殺細胞作用アッセイにおいて、少なくとも２０％、３０％、４０％、または５０％のＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞を直接死滅させることができる。別の態様では、このような抗体は、１０、８、６、４、３、２、１．５、１、０．８、０．６、０．５、または０．４ｎＭ以下のＥＣ_５０で、架橋抗体なしに実施される直接殺細胞作用アッセイにおいてＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞を直接死滅させることができる。

さらに他の実施形態では、ＩｇＧ抗ｈＣＤ２０抗体は、ＩｇＧアミノ酸配列に対する改変であり得る、アミノ酸３９９Ｋ／Ｒおよび４０９Ｅ／Ｄを含んでよい。これらのアミノ酸は、異なるＨＣを有する少なくとも２種の異なるＩｇＧ抗体を含む抗体の混合物の観点から、ヘテロダイマーＨＣ／ＨＣ対の形成を阻害する効果を有し得る。このような抗体は、例えば、配列番号４５のアミノ酸配列または配列番号４５に対して７、６、５、４、３、２、または１個以下の改変を含むアミノ酸配列を含むＣ_Ｈ１～Ｃ_Ｈ３アミノ酸配列を有し得る。さらなる実施形態では、このような抗体は、配列番号４４のアミノ酸配列、配列番号４４をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸、および／または配列番号４４に対して７、６、５、４、３、２、または１個以下の改変を含むアミノ酸配列を含むＨＣアミノ酸配列を有し得る。いくつかの実施形態では、このような抗体は、配列番号４３のヌクレオチド配列によりコードされるＨＣアミノ酸配列を有し得る。このような抗体は、ｈＣＤ２０、任意選択でｃｙｎｏＣＤ２０に特異的に結合でき、１０μｇ／ｍｌの濃度の試験抗体を用いる、架橋抗体なしで実施される直接殺細胞作用アッセイにおいて、少なくとも２０％、３０％、４０％、または５０％のＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞を直接死滅させることができる。別の態様では、このような抗体は、１０、８、６、４、３、２、１．５、１、０．８、０．６、０．５、または０．４ｎＭ以下のＥＣ_５０で、架橋抗体なしに実施される直接殺細胞作用アッセイにおいてＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞を直接死滅させることができる。

いくつかの実施形態では、本明細書で記載の抗ｈＣＤ２０Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌを含む抗ｈＣＤ２０抗体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の一部であってよく、これはまた、Ｔ細胞受容体の一部を含んでよく、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法に使用できる。ＣＡＲ－Ｔ細胞療法は、例えば、Ｙｕｅｔａｌ．，ＮｅｘｔｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｃｈｉｍｅｒｉｃａｎｔｉｇｅｎｒｅｃｅｐｔｏｒＴｃｅｌｌｓ：ｓａｆｅｔｙｓｔｒａｔｅｇｉｅｓｔｏｏｖｅｒｃｏｍｅｔｏｘｉｃｉｔｙ，２０１９，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣａｎｃｅｒ１８：１２５（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１８６／ｓ１２９４３－０１９－１０５７－４）；およびＬｅｍａｌａｎｄＴｏｕｒｎｉｌｈａｃ，Ｓｔａｔｅ－ｏｆ－ｔｈｅ－ａｒｔｆｏｒＣＡＲＴ－ｃｅｌｌｔｈｅｒａｐｙｆｏｒｃｈｒｏｎｉｃｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃｌｅｕｋｅｍｉａｉｎ２０１９，２０１９），Ｊ．ＩｍｍｕｎｏＴｈｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ７：２０２（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１８６／ｓ４０４２５－０１９－０６８６－ｘ）で説明される。これらの参考文献の両方は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

本明細書で前におよび以下で記載の抗ｈＣＤ２０抗体は、有利な性質を有し得る。例えば、これらの抗ｈＣＤ２０抗体は、ｈＣＤ２０が細胞の表面上に提示されている場合、それに結合でき、ｃｙｎｏＣＤ２０が細胞の表面上に提示されている場合、それに結合でき、および／または架橋抗体を有して、または架橋抗体なしで、ＣＤ２０発現細胞を直接死滅させることができる。このような抗体は、ｈＣＤ２０、任意選択でｃｙｎｏＣＤ２０に特異的に結合でき、１０μｇ／ｍｌの濃度の試験抗体を用いる、架橋抗体なしで実施される直接殺細胞作用アッセイにおいて、少なくとも２０％、３０％、４０％、または５０％のＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞を直接死滅させることができる。別の態様では、このような抗体は、１０、８、６、４、３、２、１．５、１、０．８、０．６、０．５、または０．４ｎＭ以下のＥＣ_５０で、架橋抗体なしに実施される直接殺細胞作用アッセイにおいてＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞を直接死滅させることができる。本明細書で記載の抗ｈＣＤ２０抗体は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）をインビトロで媒介でき、実施例５に記載のＷＳＵ－ＤＬＣＬ２が標的細胞として使われるアッセイで２、１、０．５、０．２、０．１、０．０５、０．０３、または０．０２ｎＭ未満のＥＣ_５０を有し得る（データは図７、パネルＡに示される）。本明細書で記載の抗ｈＣＤ２０抗体は、インビトロで補体依存性細胞溶解（ＣＤＣ）を媒介でき、実施例５に記載のＷＳＵ－ＤＬＣＬ２が標的細胞として使われるＣＤＣアッセイで２０、１５、１０、９、８、７、６、または５ｎＭ未満のＥＣ_５０を有し得る（データは、図７、パネルＢに示される）。

抗ＣＤ３７抗体
本明細書で記載されるのは、多数の抗ヒトＣＤ３７（抗ｈＣＤ３７）抗体である。これらの抗体は、ヒトまたはヒト化抗体、任意選択でＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体などのＩｇＧ抗体であり得る。これらの抗体は、Ｖ_Ｈを含むＨＣ、およびＶ_Ｌを含むＬＣを含み得る。いくつかの実施形態では、抗ｈＣＤ３７抗体のＶ_Ｈは、配列番号５７に対して８、７、６、５、４、３、２または１個以下の改変を含むアミノ酸配列を含んでよく、抗ｈＣＤ３７抗体のＶ_Ｌは、配列番号５３に対して８、７、６、５、４、３、２または１個以下の改変を含むアミノ酸配列を含み得る。抗ｈＣＤ３７抗体のＶ_Ｈは、（１）配列番号５７のアミノ酸配列および／または（２）配列番号５７をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列および／または（３）配列番号５６によりコードされるアミノ酸配列、を含み得る。抗ｈＣＤ３７抗体のＶ_Ｌは、（１）配列番号５３のアミノ酸配列および／または（２）配列番号５３をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列および／または（３）配列番号５２によりコードされるアミノ酸配列、を含み得る。抗ｈＣＤ３７抗体は、配列番号４６、４７、４８、４９、５０および５１のアミノ酸配列をそれぞれ含む、または配列番号４６、４７、４８、４９、５０および５１をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列をそれぞれ含む、Ｖ_ＨＣＤＲ１、Ｖ_ＨＣＤＲ２、Ｖ_ＨＣＤＲ３、Ｖ_ＬＣＤＲ１、Ｖ_ＬＣＤＲ２、およびＶ_ＬＣＤＲ３を含み得る。このような抗ｈＣＤ３７抗体は、１０μｇ／ｍｌの濃度の抗ｈＣＤ３７抗体を用いる、架橋抗体なしで実施される直接殺細胞作用アッセイにおいて、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、または６０％のラモス細胞を直接死滅させることができる。別の態様では、このような抗ｈＣＤ３７抗体は、１０、７、５、４、３、２、１、０．８、０．７、０．６、または０．５ｎＭ以下のＥＣ_５０で、架橋抗体なしで、ラモス細胞を直接死滅させることができる。

本明細書で記載の抗ｈＣＤ３７抗体は、（１）配列番号５９のアミノ酸配列に対して１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１個以下の改変を含むアミノ酸配列を含むＨＣ、および（２）配列番号５５に対して８、７、６、５、４、３、２または１個以下の改変を含むアミノ酸配列を含むＬＣ、を含み得る。いくつかの実施形態では、このような抗ｈＣＤ３７抗体のＨＣは、（１）配列番号５９のアミノ酸配列および／または（２）配列番号５９をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列および／または（３）配列番号５８によりコードされるアミノ酸配列、を含み得る。さらに、本明細書で記載の抗ｈＣＤ３７抗体は、（１）配列番号５５のアミノ酸配列および／または（２）配列番号５５をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列および／または（３）配列番号５４によりコードされるアミノ酸配列、を含むＬＣを含み得る。このような抗ｈＣＤ３７抗体は、１０μｇ／ｍｌの濃度の抗ｈＣＤ３７抗体を用いる、架橋抗体なしで実施される直接殺細胞作用アッセイにおいて、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、または６０％のラモス細胞を直接死滅させることができる。別の態様では、このような抗ｈＣＤ３７抗体は、１０、７、５、４、３、２、１、０．８、０．７、０．６、または０．５ｎＭ以下のＥＣ_５０で、架橋抗体なしで、ラモス細胞を直接死滅させることができる。

いくつかの実施形態では、このような抗ｈＣＤ３７抗体のＨＣおよび／またはＬＣは、改変から生じ得る特定の位置で、１個または複数の特定のアミノ酸を含み得る。例えば、一態様では、抗ＣＤ３７は、特定の位置に次記のアミノ酸セットの１つを含み得る：（ａ）３４Ｖ（ＨＣ）および３１Ｎ（ＬＣ）；（ｂ）９９Ｌ（ＨＣ）および５４Ｉ（ＬＣ）；（ｃ）６４Ｑ（ＨＣ）および９４Ｄ（ＬＣＬ）；（ｄ）３４Ｌ（ＨＣ）、６４Ｑ（ＨＣ）、５３Ｓ（ＬＣ）、および９３Ｅ（ＬＣ）；（ｅ）３４Ｌ（ＨＣ）、６４Ｑ（ＨＣ）、９９Ｌ（ＨＣ）、３１Ｎ（ＬＣ）、５３Ｓ（ＬＣ）、および９２Ｇ（ＬＣ）。さらなる態様では、抗ｈＣＤ３７抗体のＨＣは、１種または複数の次記のアミノ酸を含み得る：１４７Ｄ、１７０Ｃ、１７３Ｃ、２２０Ｇ、および３９９Ｒ。ＬＣは、１種または複数の次記のアミノ酸を含み得る：１３１Ｋ、１６０Ｃ、１６２Ｃ、および２１４Ｓ。このような抗ｈＣＤ３７抗体は、１０μｇ／ｍｌの濃度の抗ｈＣＤ３７抗体を用いる、架橋抗体なしで実施される直接殺細胞作用アッセイにおいて、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、または６０％のラモス細胞を直接死滅させることができる。別の態様では、このような抗ｈＣＤ３７抗体は、１０、７、５、４、３、２、１、０．８、０．７、０．６、または０．５ｎＭ以下のＥＣ_５０で、架橋抗体なしで、ラモス細胞を直接死滅させることができる。

いくつかの実施形態では、抗ｈＣＤ３７抗体のＶ_Ｈは、配列番号６５に対して１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１個以下の改変を含むアミノ酸配列を含んでよく、Ｖ_Ｌは、配列番号６１に対して１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１個以下の改変を含むアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、抗ｈＣＤ３７抗体のＶ_Ｈは、（１）配列番号６５のアミノ酸配列および／または（２）配列番号６５をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列および／または（３）配列番号６４によりコードされるアミノ酸配列、を含み得る。別の態様では、抗ｈＣＤ３７抗体のＶ_Ｌは、（１）配列番号６１のアミノ酸配列および／または（２）配列番号６１をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列および／または（３）配列番号６０によりコードされるアミノ酸配列、を含み得る。このような抗ｈＣＤ３７抗体は、１０μｇ／ｍｌの濃度の抗ｈＣＤ３７抗体を用いる、架橋抗体なしで実施される直接殺細胞作用アッセイにより、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、または６０％のラモス細胞を直接死滅させることができる。別の態様では、このような抗ｈＣＤ３７抗体は、１０、７、５、４、３、２、１、０．８、０．７、０．６、または０．５ｎＭ以下のＥＣ_５０で、架橋抗体なしで、ラモス細胞を直接死滅させることができる。

別の態様では、抗ｈＣＤ３７抗体のＨＣは、配列番号６７に対して１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１個以下の改変を含むアミノ酸配列を含んでよく、ＬＣは、配列番号６３に対して１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１個以下の改変を含むアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＨＣは、（１）配列番号６７のアミノ酸配列および／または（２）配列番号６７をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列および／または（３）配列番号６６によりコードされるアミノ酸配列、を含み得る。別の態様では、ＬＣは、（１）配列番号６３のアミノ酸配列および／または（２）配列番号６３をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列および／または（３）配列番号６２によりコードされるアミノ酸配列、を含み得る。このような抗ｈＣＤ３７抗体は、１０μｇ／ｍｌの濃度の抗ｈＣＤ３７抗体を用いる、架橋抗体なしで実施される直接殺細胞作用アッセイにおいて、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、または６０％のラモス細胞を直接死滅させることができる。別の態様では、このような抗ｈＣＤ３７抗体は、１０、７、５、４、３、２、１、０．８、０．７、０．６、または０．５ｎＭ以下のＥＣ_５０で、架橋抗体なしで、ラモス細胞を直接死滅させることができる。

他の実施形態では、抗ｈＣＤ３７抗体のＨＣは、配列番号７１に対して１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１個以下の改変を含むアミノ酸配列を含んでよく、ＬＣは、配列番号６９に対して１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１個以下の改変を含むアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＨＣは、（１）配列番号７１のアミノ酸配列および／または（２）配列番号７１をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列および／または（３）配列番号７０によりコードされるアミノ酸配列、を含み得る。別の態様では、ＬＣは、（１）配列番号６９のアミノ酸配列および／または（２）配列番号６９をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列および／または（３）配列番号６８によりコードされるアミノ酸配列、を含み得る。このような抗ｈＣＤ３７抗体は、１０μｇ／ｍｌの濃度の抗ｈＣＤ３７抗体を用いる、架橋抗体なしで実施される直接殺細胞作用アッセイにおいて、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、または６０％のラモス細胞を直接死滅させることができる。別の態様では、このような抗ｈＣＤ３７抗体は、１０、７、５、４、３、２、１、０．８、０．７、０．６、または０．５ｎＭ以下のＥＣ_５０で、架橋抗体なしで、ラモス細胞を直接死滅させることができる。

さらなる実施形態では、抗ｈＣＤ３７抗体のＨＣは、配列番号７９または８３に対して１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１個以下の改変を含むアミノ酸配列を含んでよく、ＬＣは、配列番号７５または８１に対して１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１個以下の改変を含むアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＨＣは、（１）配列番号７９または８３のアミノ酸配列および／または（２）配列番号７９または８３をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列および／または（３）配列番号７８または８２によりコードされるアミノ酸配列、を含み得る。別の態様では、ＬＣは、（１）配列番号７５または８１のアミノ酸配列および／または（２）配列番号７５または８１をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列および／または（３）配列番号７４または８０によりコードされるアミノ酸配列、を含み得る。このような抗ｈＣＤ３７抗体は、１０μｇ／ｍｌの濃度の抗ｈＣＤ３７抗体を用いる、架橋抗体なしで実施される直接殺細胞作用アッセイにおいて、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、または６０％のラモス細胞を直接死滅させることができる。別の態様では、このような抗ｈＣＤ３７抗体は、１０、７、５、４、３、２、１、０．８、０．７、０．６、または０．５ｎＭ以下のＥＣ_５０で、架橋抗体なしで、ラモス細胞を直接死滅させることができる。

いくつかの実施形態では、本明細書で記載の抗ｈＣＤ３７Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌを含む抗ｈＣＤ３７抗体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の一部であってよく、これはまた、Ｔ細胞受容体の一部を含んでよく、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法に使用できる。ＣＡＲ－Ｔ細胞療法は、例えば、Ｙｕｅｔａｌ．，前出；およびＬｅｍａｌａｎｄＴｏｕｒｎｉｌｈａｃ，前出、で説明される。

本明細書で前におよび以下で記載の抗ｈＣＤ３７抗体は、種々の有利な性質を有し得る。例えば、抗ｈＣＤ３７抗体は、細胞の表面上に提示されるｈＣＤ３７に結合でき、細胞の表面上に提示されるカニクイザルＣＤ３７（ｃｙｎｏＣＤ３７）に結合でき、および／または架橋抗体と共に、または架橋抗体なしで、ＣＤ３７発現細胞を死滅させることができる。このような抗ｈＣＤ３７抗体は、１０μｇ／ｍｌの濃度の抗ｈＣＤ３７抗体を用いる、架橋抗体なしで実施される直接殺細胞作用アッセイにおいて、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、または６０％のラモス細胞を直接死滅させることができる。別の態様では、このような抗ｈＣＤ３７抗体は、１０、７、５、４、３、２、１、０．８、０．７、０．６、または０．５ｎＭ以下のＥＣ_５０で、架橋抗体なしで、ラモス細胞を直接死滅させることができる。いくつかの実施形態では、本明細書で記載の抗ｈＣＤ３７抗体は、標的細胞がＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞ではなくラージ細胞であることを除き実施例５で記載されるようなアッセイを使用する場合、３０、２０、１０、９、８、７、６、５、１、０．１、または０．０１ｎＭ未満のＥＣ_５０で、ラージ細胞に対しＮＫ細胞媒介ＡＤＣＣを開始させるように働き得る。図１６、パネルＢおよび下記の実施例１０の最後の段落。

抗ｈＣＤ２０および抗ｈＣＤ３７抗体の混合物
本明細書で提供されるのは、本明細書で記載の抗ｈＣＤ２０および抗ｈＣＤ３７抗体を含む抗体の混合物である。いくつかの実施形態では、このような抗体の混合物は、２種の抗体をコードする１種または複数のＤＮＡが導入されている単一宿主細胞株中で作製される。単一細胞株から抗体の対を製造するこの方法は、米国特許出願公開第２０１９／０２４８８９９号で詳細に記載されている。この方法を記載する米国特許出願公開第２０１９／０２４８８９９号の一部（すなわち、実施例１～１２、ページ３４～５２、およびそこで言及される図）は、参照により本明細書に組み込まれる。この方法を用いて作製された２種の抗体の混合物を、本明細書では、ＭａｂＰａｉｒと称する。抗ｈＣＤ２０および抗ｈＣＤ３７抗体の混合物はまた、例えば、別々の細胞株中で産生された２種の抗体の混合などの他の方法によっても作製できる。

より詳細には、これらの混合物は、本明細書で上記したいずれかの抗ｈＣＤ２０抗体を含んでよく、これは、本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１９／０２４８８９９号の一部、すなわち、実施例１～１２、ページ３４～５２、およびその中で言及されている図中に記載されるように、改変できる。いくつかの実施形態では、抗ｈＣＤ２０または抗ｈＣＤ３７抗体は、そのＨＣ中にＤ３９９ＲおよびＫ４０９Ｅを含む。これらの改変を有するＨＣのアミノ酸配列の例は、配列番号４４（抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１ＨＣ）中で、または配列番号４３の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列中で見つけることができる。混合物は、本明細書で記載のいずれかの抗ｈＣＤ３７をさらに含み得る。これらの抗ｈＣＤ３７抗体、あるいは、抗ｈＣＤ２０抗体のいずれかは、例えば、それらのＨＣ中に１４７Ｄ、１７０Ｃ、１７３Ｃ、２２０Ｇ、および４０９Ｒ、ならびにＬＣ中に１３１Ｋ、１６０Ｃ、１６２Ｃおよび２１４Ｓを含み得る。これらの変化を有するＨＣアミノ酸配列の例は、配列番号７１（抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１．１ＨＣ）および配列番号８３（抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ｎ１２．１ＨＣ）であり、これらの変化を含むＬＣアミノ酸配列の例は、配列番号６９（抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１．１ＬＣ）および配列番号８１（抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ｎ１２．１ＬＣ）を含む。本明細書で記載のＨＣおよびＬＣに対し、他の改変を有する（ＷＯ２０１７／２０５０１４に記載のような）抗ｈＣＤ２０および抗ｈＣＤ３７抗体を含む他のＭａｂＰａｉｒもまた、本明細書で提供の抗体の混合物中に含まれる。さらに、いくつかの実施形態では、抗ｈＣＤ２０抗体は、そのＨＣ中に１４７Ｄ、１７０Ｃ、１７３Ｃ、２２０Ｇ、および４０９Ｒを含んでよく、およびそのＬＣ中に１３１Ｋ、１６０Ｃ、１６２Ｃおよび２１４Ｓを含んでよく、さらに抗ｈＣＤ３７抗体は、そのＨＣ中に３９９Ｒおよび４０９Ｅを含んでよい。いくつかの実施形態では、抗ｈＣＤ３７抗体は、そのＨＣ中に１４７Ｄ、１７０Ｃ、１７３Ｃ、２２０Ｇ、および４０９Ｒを含んでよく、およびそのＬＣ中に１３１Ｋ、１６０Ｃ、１６２Ｃおよび２１４Ｓを含んでよく、さらに抗ｈＣＤ２０抗体は、そのＨＣ中に３９９Ｒおよび４０９Ｅを含んでよい。いくつかの実施形態では、抗ｈＣＤ２０抗体は、そのＨＣ中に１４７Ｄ、１７０Ｃ、１７３Ｃ、２２０Ｇ、Ｄ３９９Ｒ、およびＫ４０９Ｅを含んでよく、およびそのＬＣ中に１３１Ｋ、１６０Ｃ、１６２Ｃおよび２１４Ｓを含んでよく、さらに抗ｈＣＤ３７抗体は、そのＨＣ中に４０９Ｒを含んでよい。いくつかの実施形態では、抗ｈＣＤ３７抗体は、そのＨＣ中に１４７Ｄ、１７０Ｃ、１７３Ｃ、２２０Ｇ、Ｄ３９９Ｒ、およびＫ４０９Ｅを含んでよく、およびそのＬＣ中に１３１Ｋ、１６０Ｃ、１６２Ｃおよび２１４Ｓを含んでよく、さらに抗ｈＣＤ２０抗体は、そのＨＣ中に４０９Ｒを含んでよい。

代表的相手指向改変が、下表８に列挙される。この内の１種または複数を、抗体混合物中の抗ｈＣＤ２０および／または抗ｈＣＤ３７抗体中に含めることができる。

ヘテロダイマーに適しない改変は、それらが抗体混合物の一部である場合、両方の抗体がＩｇＧ抗体であると仮定して、抗ｈＣＤ２０および／または抗ｈＣＤ３７抗体中に含まれてよい。一実施形態では、片方の抗体は、ＩｇＧ４抗体（天然起源アルギニンを位置４０９に有する）または位置４０９にアルギニンを有する、すなわち、改変Ｋ４０９Ｒを有するように改変されているＩｇＧ１抗体であり得、および他方の抗体は、アミノ酸３９９Ｋ／Ｒおよび４０９Ｄ／Ｅを有する。

いくつかの実施形態では、本明細書で記載の抗ｈＣＤ２０Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌならびに抗ｈＣＤ３７Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌを含む、抗ｈＣＤ２０抗体および抗ｈＣＤ３７抗体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の一部であってよく、これはまた、Ｔ細胞受容体の一部を含んでよく、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法に使用できる。ＣＡＲ－Ｔ細胞療法は、例えば、Ｙｕｅｔａｌ．，前出；およびＬｅｍａｌａｎｄＴｏｕｒｎｉｌｈａｃ，前出、で説明されている。

ポリヌクレオチド、ベクターおよび宿主細胞
提供されるのは、本明細書で記載の抗体および／または抗体の混合物をコードするポリヌクレオチド、例えば、ＤＮＡまたは他の核酸である。本明細書で提供されるガイダンスを用いて、当業者は、抗体をコードする既知または新規の核酸配列を組み合わせ、本明細書で記載のＶ_ＨおよびＶ_Ｌアミノ酸配列を含む、本明細書で記載の抗体および抗体混合物をコードするポリヌクレオチドを生成し得る。Ｖ_Ｈ、Ｖ_Ｌ、ＨＣ、もしくはＬＣ、またはこのような配列の一部をコードするこのようなヌクレオチド配列は、例えば、配列番号７、９、１１、１３、１９、２２、２５、２８、３１、３４、３７、４０、４３、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、１１０、１１１、および１１２で、ならびに本明細書全体を通して開示される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、図１および８で開示されるアミノ酸配列に対する相手指向改変などの改変を含むＨＣおよび／またはＬＣをコードできる。このような改変は、アミノ酸置換であり得る。加えて、このようなポリヌクレオチドは、可変ドメインの外の１個または複数の相手指向改変および／またはヘテロダイマーに適さない１個または複数の改変を含むＨＣおよび／またはＬＣをコードできる。ヒト、哺乳動物、および霊長類の免疫グロブリン定常ドメイン、例えば、Ｃ_Ｌ、Ｃ_Ｈ１、ヒンジ、Ｃ_Ｈ２、およびＣ_Ｈ３をコードする多数の核酸配列は、当技術分野において既知である。例えば、Ｋａｂａｔｅｔａｌ．，前述、を参照されたい。任意選択で、本明細書で記載の可変ドメインをコードするポリヌクレオチド配列は、このような定常ドメインをコードするポリヌクレオチド配列と、種々のフォーマット、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、二重特異的フォーマット、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、Ｆａｂ、ＢｉＴＥ（ｓｃＦｃ－リンカーｓｃＦｖ）、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ、ＩｇＧ－ｓｃＦｖなどのいずれかとして組み合わされてよい。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、ＨＣをコードでき、そのＨＣ中で、ヒンジ、またはヒンジの一部は、１種または複数の定常ドメインとは異なるアイソタイプまたはアイソタイプサブクラスから取り込まれてよい、および／またはヒンジ領域は、天然起源ヒンジドメインに対し改変されたアミノ酸配列を有し得る。いくつかの実施形態では、これらの抗体は、相手指向改変および／またはヘテロダイマーに適さない改変を含み得る。さらなる実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）および抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）などのエフェクター機能を高めるように改変されているＨＣをコードできる。実施例５および表１６を参照。いくつかの実施形態では、これらの抗体は、哺乳動物の抗体、任意選択でヒトの、ヒト化された、または霊長類の抗体であり得る。

ポリヌクレオチドを改変する方法は、当該技術分野において周知である。おそらく、改変ポリヌクレオチドを生成するための最も直接的な方法は、所望配列を有するポリヌクレオチドを合成することである。例えば、ＤＮＡ２．０（ＭｅｎｌｏＰａｒｋ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）、ＢｌｕｅＨｅｒｏｎ（Ｂｏｔｈｅｌｌ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）、Ｇｅｎｅｗｉｚ（ＳｏｕｔｈＰｌａｉｎｆｉｅｌｄ，ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ）、Ｇｅｎ９（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）、およびＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ；Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，Ｉｏｗａ）などの多くの会社がこのサービスを提供している。変異を導入する他の既知の方法、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いる部位特異的変異誘発法も採用できる。例えば、Ｚｏｌｌｅｒ，Ｎｅｗｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｐｒｏｔｅｉｎｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１９９１，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２（４）：５２６－５３１；ＲｅｉｋｏｆｓｋｉａｎｄＴａｏ，Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓｆｏｒｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，１９９２，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．１０（４）：５３５－５４７を参照されたい。

本明細書で記載の抗体およびこれらの混合物をコードするポリヌクレオチド、任意選択でＤＮＡを含むベクターは、選択した宿主細胞中での抗体の発現に適するいずれのベクターであってもよい。ベクターは、ベクターを含む宿主細胞の選択のためのおよび／または宿主細胞中でベクターの維持および／または増幅のための、選択可能マーカーを含み得る。このようなマーカーは、例えば、（１）原核生物宿主細胞のために、抗生物質または他の毒素、例えば、アンピシリン、テトラサイクリン、またはカナマイシンに対する耐性を付与する遺伝子、（２）細胞の栄養素要求性欠陥を補完する遺伝子、または（３）複合培地または限定培地から入手できない不可欠の栄養素を供給するように動作する遺伝子、を含む。特異的な選択可能マーカーは、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、およびテトラサイクリン耐性遺伝子であり得る。ゼオシン耐性またはネオマイシン耐性遺伝子はまた、原核生物および真核生物の宿主細胞の両方で選択のために使用され得る。ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子および／またはプロモーターを持たないチミジンキナーゼ遺伝子は、当該技術分野において知られているように、哺乳動物細胞中で使用できる。例えば、Ｋｉｎｇｓｔｏｎｅｔａｌ．２００２，ＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＵｓｉｎｇＣＨＯＣｅｌｌＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＶｅｃｔｏｒｓ，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈ．１６，Ｕｎｉｔ１６．２３，Ｗｉｌｅｙ２００２を参照されたい。

加えて、ベクターは、ベクターの維持および／または本明細書で記載の抗体または抗体混合物をコードする挿入配列の発現のために必要な、１種または複数の他の配列要素を含み得る。このような要素としては、例えば、複製起点、プロモーター、１種または複数のエンハンサー、転写終結配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、外来性配列（本明細書で記載の抗体または抗体混合物をコードするＤＮＡなど）のためのポリリンカー挿入部位、および２つの挿入配列、例えば、ＨＣおよびＬＣコードＤＮＡ、の間の介在配列が挙げられる。これらの配列要素は、ベクターの複製および／または増幅、ならびにベクターに挿入された異種配列の発現を促進するように所望の宿主細胞中で機能するように選択できる。このような配列要素は、当該技術分野において周知であり、多数の市販のベクターで利用できる。

いくつかの実施形態では、抗体または抗体混合物をコードするポリヌクレオチドは、１種または複数のウイルスベクター、任意選択で腫瘍溶解性ウイルスベクター上に担持される得る。このようなウイルスベクターの例としては、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、修正ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、ニューカッスル病ウイルス、麻疹ウイルス、コクサッキーウイルス、レオウイルス、およびポックスウイルスベクターが挙げられる。このような実施形態では、本明細書で記載の抗体または抗体混合物をコードするポリヌクレオチドを含むこれらのウイルスベクターは、疾患を治療するために患者に投与できる。癌患者では、例えば、抗体または抗体混合物をコードするポリヌクレオチドを含むこのようなウイルスベクターは、患者中の腫瘍または癌細胞の主要部位に、例えば、注射、吸入（例えば、肺癌のために）、局所投与（例えば、皮膚癌のために）、および／または粘膜への投与（これを通して核酸が吸収され得る）により、直接投与されてよい。あるいは、このようなウイルスベクターは、全身に、例えば、経口で、局所に粘膜経由で、または皮下、静脈内、動脈内、筋肉内、または腹膜注射により本明細書に記載のように投与されてよい。同様に、本明細書に記載の抗体の混合物をコードするポリヌクレオチドは、リポソームに包み込まれてよく、疾患を患っている患者に投与できる。

本明細書で記載のポリヌクレオチドおよび／またはベクターは、例えば１種または複数の抗体を産生するために、宿主細胞中に導入できる。１種または複数の抗体をコードする１種または複数のポリヌクレオチドおよび／またはベクターを含む宿主細胞は、組換えタンパク質の発現に適する種々の細胞のいずれでもよい。これらは、例えば、グラム陰性またはグラム陽性原核生物、例えば、大腸菌、枯草菌、またはネズミチフス菌などの細菌を含む。他の実施形態では、宿主細胞は、出芽酵母、分裂酵母などの種を含む真核細胞、または属クリベロマイセス、カンジダ、スポドプテラの真核生物、または異種ポリペプチドを発現できる任意の細胞であり得る。さらなる実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物細胞であり得る。異種ポリペプチドの発現に適する多くの哺乳動物細胞株は、当技術分野において既知であり、例えば、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）を含む種々の購入業者から得ることができる。好適な哺乳動物宿主細胞株としては、例えば、ＣＯＳ－７株（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５１）（Ｇｌｕｚｍａｎｅｔａｌ．，１９８１，Ｃｅｌｌ２３：１７５）、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ１６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはそれらの誘導体、例えば、無血清培地中で増殖するＶｅｇｇｉｅ－ＣＨＯおよび関連細胞株（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎｅｔａｌ．，Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎａｎｄｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＶｅｇｇｉｅ－ＣＨＯ：Ａｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅＣＨＯｈｏｓｔｃｅｌｌｌｉｎｅ，１９９８，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２８：３１－４２）、ＣＨＯ－Ｋ１およびＣＨＯｐｒｏ－３細胞株ならびにこれらの誘導体、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）活性が不足しているＤＵＫＸ－Ｘ１１およびＤＧ４４細胞株、ＨｅＬａ細胞、仔ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞（例えば、ＡＴＣＣＣＲＬ１０）、ＭｃＭａｈａｎｅｔａｌ．，ＡｎｏｖｅｌＩＬ－１ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｃｌｏｎｅｄｆｒｏｍＢｃｅｌｌｓｂｙｍａｍｍａｌｉａｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｉｓｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎｍａｎｙｃｅｌｌｔｙｐｅｓ，１９９１，ＥＭＢＯＪ．１０：２８２１－２８３２に記載のアフリカミドリザル腎臓細胞株ＣＶＩ由来ＣＶＩ／ＥＢＮＡ細胞株（ＡＴＣＣＣＣＬ７０）、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞、例えば、２９３、２９３ＥＢＮＡまたはＭＳＲ２９３、ヒト表皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ２０５細胞、ＨＬ－６０細胞、Ｕ９３７細胞、ＨａＫ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＨｅｐＧ２／３Ｂ細胞、ＫＢ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、Ｓ４９細胞、ならびにＮＳ０およびＳｐ２／０細胞を含むマウス骨髄腫細胞が挙げられる。異種ポリペプチドの発現が可能な他の原核生物、真核生物、または哺乳動物細胞型も、使用し得る。

抗体または抗体の混合物の製造方法
本明細書で記載の抗体および抗体の混合物は、当該技術分野において既知の方法により製造できる。例えば、１種または複数の抗体をコードするＤＮＡを、例えば、遺伝子導入、形質導入、リポフェクション、形質転換、微粒子銃、微量注入、または電気穿孔を含む任意の適切な方法を用いて上記の宿主細胞中に導入できる。いくつかの実施形態では、２種の完全長抗体をコードするＤＮＡを、宿主細胞中に導入できる。このような方法は、当技術分野において既知であり、例えば、Ｋａｅｓｔｎｅｒｅｔａｌ．，Ｃｏｎｃｅｐｔｕａｌａｎｄｔｅｃｈｎｉｃａｌａｓｐｅｃｔｓｏｆｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎａｎｄｇｅｎｅｄｅｌｉｖｅｒｙ，２０１５，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２５：１１７１－１１７６に記載されている。この文献は、参照により本明細書に組み込まれる。

その中に１種または複数の抗体をコードするＤＮＡが導入されている宿主細胞は、培養でき、抗体または複数の抗体は、細胞培養上清または細胞集団から回収できる。抗体または複数の抗体は、例えば、多くの可能な精製ステップの中で特に、様々な種類の遠心沈降、沈殿、透析、および／またはプロテインＡクロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、およびサイズ排除クロマトグラフィーなどの親和性クロマトグラフィーを含むカラムクロマトグラフィーなどのさらなる精製ステップに供され得る。

治療の方法
抗ｈＣＤ２０抗体、抗ｈＣＤ３７抗体、これらの混合物、および／またはこのような本明細書で記載の抗体または抗体混合物をコードするポリヌクレオチド、任意選択で１種または複数のベクター、例えば、発現ベクターまたは腫瘍溶解性ウイルスベクター中に含まれるポリヌクレオチドは、種々の癌、例えば、特に、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、Ｂ細胞ＣＬＬ（Ｂ－ＣＬＬ）、マントル細胞リンパ腫、Ｂ細胞ＮＨＬ（Ｂ－Ｂ－ＮＨＬ）、小リンパ性白血病（ＳＬＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、黒色腫、およびバーキットリンパ腫を治療するために使用できる。いくつかの実施形態では、抗ｈＣＤ２０抗体、抗ｈＣＤ３７抗体、これらの混合物、および／またはこのような本明細書で記載の抗体または抗体混合物をコードするポリヌクレオチド、任意選択で１種または複数のベクターに含まれるポリヌクレオチドは、Ｂ細胞により少なくとも部分的に媒介される種々の疾患、例えば、特に、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデスを治療するために使用できる。例えば、Ｈａｍｐｅ，Ｂｃｅｌｌｓｉｎａｕｔｏｉｍｍｕｎｅｄｉｓｅａｓｅｓ，２０１２，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃａ，ＡｒｔｉｃｌｅＩＤ２１５３０８（ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．６０６４／２０１２／２１５３０８）を参照されたい。いくつかの実施形態では、抗ｈＣＤ２０および／または抗ｈＣＤ３７可変ドメインは、任意選択で、１種または２種の異なるｓｃＦｖを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の一部として前述の疾患の１つの治療に使用され得る。

抗ｈＣＤ２０抗体、抗ｈＣＤ３７抗体、これらの混合物、および／またはこのような抗体または混合物をコードするポリヌクレオチドは、追加の療法と共に投与でき、追加の療法は、抗体、抗体混合物、またはポリヌクレオチドの前に、後に、および／または同時に投与できる。追加の療法は、放射線、化学療法、またはキメラ抗原受容体－Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）療法からなる群より選択できる。ＣＡＲ－Ｔ細胞療法は、例えば、Ｙｕｅｔａｌ．，前出、で説明される。他の追加の療法は、どの状態が治療されるのかに応じて、実施可能である。

追加の療法が化学療法剤の場合、それは、例えば、次記であり得る：ブスルファン、テモゾロミド、シクロホスファミド、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ストレプトゾトシン、メチルロムスチン、ｃｉｓ－ジアンミンジクロロ白金、チオテパ、アジリジニルベンゾキノン、シスプラチン、カルボプラチン、メルファラン塩酸塩、クロラムブシル、イホスファミド、メクロレタミンＨＣｌ、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、アドリアマイシン（ドキソルビシン）、ダウノマイシン、ミトラマイシン、ダウノルビシン、イダルビシン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビンブラスチン、ビノレルビン、パクリタキセル、ドセタキセル、ＶＰ－１６、およびＶＭ－２６、ロイコボリン含有または非含有メトトレキサート、ロイコボリン含有または非含有５－フルオロウラシル、５－フルオロデオキシウリジン、５－フルオロウラシル、６－メルカプトプリン、６－チオグアニン、ゲムシタビン、シタラビン、５－アザシチジン、ヒドロキシ尿素、デオキシコホルマイシン、フルダラビン、エトポシド、イリノテカン、トポテカン、アクチノマイシンＤ、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ｍＡＭＳＡ、プロカルバジン、ヘキサメチルメラミン、ペンタメチルメラミン、Ｌ－アスパラギナーゼ、ミトキサントロン。例えば、その関連部分が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃａｎｃｅｒ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＯｎｃｏｌｏｇｙ，４．ｓｕｐ．ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ，ＤｅＶｉｔａｅｔａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊ．Ｂ．ＬｉｐｐｉｎｃｏｔｔＣｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．（１９９３）を参照のこと。

追加の療法が放射線の場合、放射線治療は、例えば、光子、プロトン、または電子線などを用いた体外照射療法、および／または体内放射線法を含み得る。３Ｄ原体照射法、強度変調放射線治療（ＩＭＲＴ）、画像誘導放射線治療（ＩＧＲＴ）、トモセラピー（登録商標）、定位放射線照射、および体幹部定位放射線治療を含む、多くの種類の体外放射線療法が存在する。体内放射線法は、例えば、ブラキセラピーまたは放射性物質、例えば、放射性ヨウ素の全身投与を含む。

抗体またはこれらの混合物に関して、それらは、適切な間隔をあけて治療有効量で患者に投与できる。例えば、単一抗体または抗体混合物の単回投与は、約０．０１ミリグラム／キログラム体重（ｍｇ／ｋｇ）～約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、または約０．５ｍｇ／ｋｇ～約７ｍｇ／ｋｇであり得る。単回投与は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５、ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、または１０ｍｇ／ｋｇの投与量であり得る。同様に、抗体または抗体混合物の単回投与は、約０．３７ミリグラム／平方メートルの皮膚表面積（ｍｇ／ｍ^２）～約１８５０ｍｇ／ｍ^２、約０．５ｍｇ／ｍ^２～約３７０ｍｇ／ｍ^２、約３．７ｍｇ／ｍ^２～約３７０ｍｇ／ｍ^２、または約１８．５ｍｇ／ｍ^２～約２５９ｍｇ／ｍ^２であり得る。単回投与は、約１０ｍｇ／ｍ^２、２０ｍｇ／ｍ^２、３７ｍｇ／ｍ^２、７４ｍｇ／ｍ^２、１１１ｍｇ／ｍ^２、１４８ｍｇ／ｍ^２、１８５ｍｇ／ｍ^２、２２２ｍｇ／ｍ^２、２５９ｍｇ／ｍ^２、２９６ｍｇ／ｍ^２、３３３、ｍｇ／ｍ^２、３７０ｍｇ／ｍ^２、４０７ｍｇ／ｍ^２、または４４０ｍｇ／ｍ^２であり得る。同様に、抗体または抗体混合物の単回投与は、約０．６２ｍｇ～約３１００ｍｇ、約１ｍｇ～約６２０ｍｇ、約６．２ｍｇ～約６２０ｍｇ、または約１０ｍｇ～約４３４ｍｇの投与量で投与できる。単回投与は、約０．５１、３、６、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ｍｇであり得る。

本明細書で記載の抗体または抗体混合物をコードする１種または複数のポリヌクレオチドの場合、投与量は、例えば、約５ｘ１０^９コピーのポリヌクレオチド／キログラム体重（コピー／ｋｇ）～約１０^１５コピー／ｋｇ、約１０^１０コピー／ｋｇ～約１０^１４コピー／ｋｇ、または約５ｘ１０^１０コピー／ｋｇ～約５ｘ１０^１３コピー／ｋｇであり得る。あるいは、投与量は、約１０^１０、１０^１１、１０^１２、１０^１３、５ｘ１０^１３、１０^１４、２ｘ１０^１４、３ｘ１０^１４、４ｘ１０^１４、５ｘ１０^１４、６ｘ１０^１４、７ｘ１０^１４、８ｘ１０^１４、９ｘ１０^１４、または１０^１５コピーのポリヌクレオチドであり得る。投与頻度は、必要に応じ調節でき、上述の通りであってよく、または、例えば、毎日、１日置き、週２回、週１回、１０日毎に１回、２週毎に１回、３週毎に１回、月１回、または２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２ヶ月毎に１回であり得る。

抗体、抗体混合物、またはそれらをコードするポリヌクレオチドの用量は、一定の期間にわたり、１回または２回または一定の間隔で投与できる。例えば、用量は、毎日、１日置き、週２回、週１回、１０日毎に１回、２週毎に１回、３週毎に１回、月１回、または２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２ヶ月毎に１回投与できる。投与は、例えば、約１～４週、約１～６ヶ月、約６ヶ月～１年、約１～２年、または最大５年間にわたり継続できる。いくつかの事例では、投与は、中断され、および再開されてよい。いくつかの実施形態では、抗ｈＣＤ２０および抗ｈＣＤ３７抗体を含む混合物は、両方の抗体が同時に投与されるように投与されてよい。混合物の１回または複数回の投与後に、１種の抗体を単独で投与できる。いくつかの実施形態では、この抗体の投与は、一定期間にわたり継続できる。いくつかの実施形態では、抗体または抗体混合物の投与は、中断され、および１回または複数回再開されてよい。

本発明を一般的用語で記載してきたが、以下の具体的実施例は、本発明の範囲を限定するためでなく、例示するために提供される。本明細書で記載の発明の趣旨から逸脱することなく、本発明に対し様々な変更や修正をなし得ること、およびこれらの変更や修正は当業者には明らかであることは理解されよう。このような変更や修正は、添付の特許請求の範囲を含む本明細書で記載の本発明の範囲内に入る。

実施例
実施例１：抗ＣＤ２０ＩＩ型ＩｇＧ１抗体のヒト化および産生
以下に記載されるのは、キメラ抗ｈＣＤ２０抗体トシツモマブのヒト化およびさらなる最適化である。第１ステップでは、既存のマウスＶ_ＨおよびＶ_Ｌ配列を、最も類似したヒト生殖系列Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ配列とそれぞれ整列させた。

抗ＣＤ２０クローンＢ１のアミノ酸配列を、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｄｒｕｇｂａｎｋ．ｃａ／ｂｉｏｔｅｃｈ＿ｄｒｕｇｓのＤｒｕｇＢａｎｋウェブサイトから、キーワード「トシツモマブ」を検索することにより取り出した。取り出したアミノ酸配列は、Ｋａｂａｔらによる可変ドメインのナンバリング（Ｋａｂａｔｅｔａｌ．，（前出）を参照）と共に以下に示す。Ｋａｂａｔｅｔａｌ．，で定義されたＣＤＲを、太字で示し、Ｋａｂａｔ（前出）による定義のアミノ酸３１～３５に加えて、Ｖ_ＨＣＤＲ１中にアミノ酸２６～３０を含めたことが例外であった。理由は、最近、これらのアミノ酸も抗原結合に関与しているといういくつかの示唆があるためである。これらは、これらの配列を抗体アミノ酸配列をアノテートするためのＡｎｔｉｇｅｎｒｅｃｅｐｔｏｒＮｕｍｂｅｒｉｎｇＡｎｄＣｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｐｒｏｇｒａｍ（ＡＮＡＲＣＩ）で処理することにより定義されたＣＤＲである。ＤｕｎｂａｒａｎｄＤｅａｎｅ，ＡＮＡＲＣＩ，ａｎｔｉｇｅｎｒｅｃｅｐｔｏｒｎｕｍｂｅｒｉｎｇａｎｄｒｅｃｅｐｔｏｒｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，２０１６，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ３２（２）：２９８－３００を参照されたい。

トシツモマブのＶ_ＨおよびＶ_Ｌアミノ酸配列を、ＤＮＡ配列に逆翻訳し、それを用いてｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／のＩＭＧＴウェブサイトで検索して、高度に相同なヒトＶ_ＨおよびＶ_Ｌ生殖系列配列を見つけた。ヒト生殖系列配列ＩＧＨＶ１－４６^＊０１およびＩＧＨＤ１－１^＊０１およびＩＧＨＪ３^＊０１を、ＩｇＶＨ－Ｄ－Ｊ＿Ｇｅｒｍｌｉｎｅとしてアセンブルし、抗ＣＤ２０トシツモマブＶ_Ｈ配列と整列させた。図１、パネルＡ。同様に、ヒト生殖系列配列ＩＧＫＶ６－２１^＊０２およびＩＧＫＪ２^＊０１を、ＩｇＶＬ－Ｊ＿Ｇｅｒｍｌｉｎｅとしてアセンブルし、トシツモマブＶ_Ｌ配列と整列させた。図１、パネルＢ。

ヒト化プロセスの第２ステップでは、マウス配列であるトシツモマブのＣＤＲを、図１に示される、アセンブルされた相同ヒトＶ_ＨおよびＶ_Ｌ生殖系列配列に個別にグラフト化した。このステップは多くの場合、「ＣＤＲグラフト化」と呼ばれ、これらのＣＤＲグラフト化配列は、図１の両パネルＡおよびＢの３番目の行に示される（「ＣＤＲグラフト」と標識される）。

マウス抗体のＣＤＲループの、ヒト生殖系列フレームワーク中への単純なグラフト化は通常、抗原に対する結合親和性の低減、または場合によっては、完全な喪失に繋がる。さらなる最適化が、ヒト化抗体の結合および他の機能特性を改善しそれによりこれらの特性が元のマウス抗体のものに近づくようにするために必要とされ得る。ＣＤＲグラフト化抗体を最適化する１つの方法は、ＣＤＲグラフト化抗体の三次構造の予測および、フォールディングまたは三次構造の全体の安定性を妨げる可能性のある構造の特徴の特定を含む。この分析に基づき、必要があれば、抗体のアミノ酸配列を、それが正確に折り畳まれ安定な三次構造を形成するように改変してよい。この手法は、ＫｕｒｅｌｌａａｎｄＧａｌｉ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｇｕｉｄｅｄｈｏｍｏｌｏｇｙｍｏｄｅｌｂａｓｅｄｄｅｓｉｇｎａｎｄｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｏｆｍｏｕｓｅａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｆｏｒｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ，２０１４，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ１０（４）：１８０－１８６、に記載される。この文献は、参照により本明細書に組み込まれる。抗体の三次構造のこのような安定化は、改善された発現および結合特性をもたらし得るが、これは、完全に予測可能な結果ではない。

上記ＣＤＲグラフト化抗体の特性を改善するために、ＣＤＲグラフト化Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌのアミノ酸配列を、ＲｏｓｅｔｔａＯｎｌｉｎｅＳｅｒｖｅｒｔｈａｔＩｎｃｌｕｄｅｓＥｖｅｒｙｏｎｅ（ＲＯＳＩＥ）抗体モデリングサーバーに送った。Ｓｉｖａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎｅｔａｌ．，Ｔｏｗａｒｄｈｉｇｈ－ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｈｏｍｏｌｏｇｙｍｏｄｅｌｉｎｇｏｆａｎｔｉｂｏｄｙＦｖｒｅｇｉｏｎｓａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｔｏａｎｔｉｂｏｄｙ－ａｎｔｉｇｅｎｄｏｃｋｉｎｇ，２００９，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ７４（２）：４９７－５１４．ｄｏｉ：１０．１００２／ｐｒｏｔ．２２３０９；Ｍａｒｚｅｅｔａｌ．，ＩｍｐｒｏｖｅｄＰｒｅｄｉｃｔｉｏｎｏｆＡｎｔｉｂｏｄｙＶＬ－ＶＨＯｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ，２０１６，ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇ．Ｄｅｓ．＆Ｓｅｌ．２９（１０）：４０９－４１８；ＷｅｉｔｚｎｅｒａｎｄＧｒａｙ，ＡｃｃｕｒａｔｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｏｆＣＤＲＨ３ｌｏｏｐｓｅｎａｂｌｅｄｂｙａｎｏｖｅｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｂａｓｅｄＣ－ｔｅｒｍｉｎａｌｃｏｎｓｔｒａｉｎｔ，２０１７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１９８（１）：５０５－５１５；Ｗｅｉｔｚｎｅｒｅｔａｌ．，ＭｏｄｅｌｉｎｇａｎｄｄｏｃｋｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｗｉｔｈＲｏｓｅｔｔａ，２０１７，ＮａｔｕｒｅＰｒｏｔｏｃｏｌｓ１２（２）：４０１－４１６；Ｌｙｓｋｏｖｅｔａｌ．，ＳｅｒｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｏｄｅｌｉｎｇＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：ＴｈｅＲｏｓｅｔｔａＯｎｌｉｎｅＳｅｒｖｅｒＴｈａｔＩｎｃｌｕｄｅｓＥｖｅｒｙｏｎｅ（ＲＯＳＩＥ），２０１３ＰＬＯＳＯＮＥ８（５）：ｅ６３９０６．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００６３９０６、を参照されたい。

第１の抗体の三次構造モデルを、エネルギー最小化スコアに基づき上位１０位の得点の抗体モデルの中から選択した。平均二乗偏差（ＲＭＳＤ）スコアを、妥当性およびモデル予測特性を計測するために、組み込み型の組合せ拡張法（ＣＥ）モジュールアライメントツールを備えたＰｙＭＯＬ（シュレーディンガーによる、詳細な立体視的画像を生成できる、分子モデリングプログラムであり、これは、ｈｔｔｐｓ：／／ｐｙｍｏｌ．ｏｒｇ／またはｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ．ｃｏｍ／ｐｙｍｏｌでダウンロードにより入手可能である）を使って計算した。加えて、ＰＤＢｓｕｍ（ＰｒｏｔｅｉｎＤａｔａＢａｓｅからの３次元構造物の画像データベース）構造分析を、ＰＲＯＣＨＥＣＫ（残基の形状寸法および全体構造の形状寸法により残基を分析することにより３次元タンパク質構造の立体化学的品質を分析するソフトウェア）、およびＶｅｒｉｆｙ３Ｄ（タンパク質構造の３次元プロファイル（３Ｄプロファイル）を作成するソフトウェアであり、これは、三次タンパク質構造由来の原子座標がタンパク質のアミノ酸配列と適合性がある構造を規定するかどうかを表す）プログラムを用いて、ホモロジーベース三次構造モデルを検証した。

これらの分析に基づいて、我々は、Ｖ_Ｈ／Ｖ_Ｌ、Ｖ_Ｈ／Ｃ_Ｈ１、およびＶ_Ｌ／Ｃ_Ｌ境界での構造の立体障害を検討した。７個の問題となる可能性がある残基を、ＣＤＲグラフト化Ｖ_Ｈアミノ酸配列中で特定し、４個を、ＣＤＲグラフト化Ｖ_Ｌアミノ酸配列中で特定した。結果として、ＣＤＲグラフト化Ｖ_Ｈアミノ酸配列に次の改変を行った：Ｍ６９Ｌ、Ｒ７１Ｖ、Ｔ７３Ｋ、Ｔ７５Ｓ、Ｖ７８Ａ、Ｙ９１Ｆ、およびＱ１０５Ｔ。ＣＤＲグラフト化Ｖ_Ｌアミノ酸配列に次の改変が作製された：Ｌ４６Ｐ、Ｋ４９Ｙ、Ｆ７１Ｙ、およびＱ１００Ａ。これらの改変は、マウスフレームワーク領域中に存在する残基を、ヒトフレームワーク領域に導入し、図１のパネルＡおよびＢ両方の２つ目の行（「ａＣＤ２０Ａｂ１」と標識）中で太字および下線で示される。改変された抗体アミノ酸配列は、以下に記載の追加のコンピューター分析に供されて、その特性を改善するための追加の方法を見つけることを試みた。

Ｓｗｉｓｓ－ＰｄｂＶｉｅｗｅｒ（ＤｅｅｐＶｉｅｗ）ソフトウェアを、ダウンロードし、エネルギー最小化（シミュレーテッドアニーリング）のためにローカルで実行した。上記段落で述べたＶ_ＨおよびＶ_Ｌアミノ酸配列中の改変を含むＣＤＲグラフト化ＨＣおよびＬＣアミノ酸配列を、エネルギー最小化のＧｒｏｎｉｎｇｅｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＳｉｍｕｌａｔｉｏｎ（ＧＲＯＭＯＳ）力場解析に供した。デフォルト設定を用い、出力モデルを、種々の予測力場エラーを有する残基についてさらに試験し、それを、エネルギー最小化モデル、すなわち、入力アミノ酸配列に対して最も安定であると予測される三次構造モデルで表示した。これらの残基は、ＰｙＭＯＬにより個別に試験された。改変を次に導入して、このシミュレーテッドアニーリング、すなわち、抗体のシミュレートされたフォールディングにより予測される全ての立体障害を修正した。このような追加の改変を含むＶ_ＨおよびＶ_Ｌアミノ酸配列を、力場シミュレーテッドアニーリングに供して、選択した改変が三次構造を安定化したかどうかを決定した。このエネルギー最小化プロセスにより、Ｖ_Ｈ中のＡ１６Ｓの置換が、Ｖ_Ｌに接触している境界で予測された立体障害を防ぐことが明らかになった。この追加の改変を含むＶ_ＨおよびＶ_Ｌアミノ酸配列を次に、ＰｙＭＯＬを用いる追加の試験に供して個別のアミノ酸の表面のアクセスし易さを評価した。この分析は、Ｖ_Ｈ（ＣＤＲ２中の）の位置６４のリジンが付き出ている可能性があることを示唆した。タンパク質表面からの残基の突出は、免疫原性と相関することが知られている。例えば、Ｎｏｖｏｔｎｙ（１９８６），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８３：２２６－２３０を参照されたい。従って、この残基は、グルタミンであるように変更され（Ｋ６４Ｑ）、これは、このアミノ酸の突出を小さくし、免疫原性を減らすことが期待される。最終的なヒト化抗体（その三次構造を安定化し、フォールディングを促進し、および免疫原性残基の可能性を除去するためのＣＤＲグラフト化バージョンの改変を含む）を、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１と命名した。抗ｈＣＤ２０Ａｂ１のＶ_ＨおよびＶ_Ｌの配列（パネルＡおよびＢの２行目）は、抗ｈＣＤ２０抗体トシツモマブのマウスＶ_ＨおよびＶ_Ｌ（パネルＡおよびＢの１行目）、アセンブルされた相同ヒト生殖系列配列のＶ_ＨおよびＶ_Ｌ（パネルＡおよびＢの最下行）、およびＣＤＲグラフト化配列のＶ_ＨおよびＶ_Ｌ（パネルＡおよびＢの３行目）とのアライメントで図１に示される。

抗ｈＣＤ２０Ａｂ１のＶ_ＨおよびＶ_Ｌアミノ酸配列を、ＩＤＴウェブサイト（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ／ＣｏｄｏｎＯｐｔ）のＣｏｄｏｎＯｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎプログラムを、モンゴルキヌゲネズミ（ハムスター）を発現生物として選択し、実施することによりＤＮＡ配列に逆翻訳した。抗ｈＣＤ２０Ａｂ１のＬＣをコードするプラスミドを作成するために、シグナルペプチド（ＳＰ）、続いて抗ｈＣＤ２０Ａｂ１Ｖ_ＬをコードするＤＮＡフラグメントを、ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ），Ｉｎｃ．（Ｉｏｗａ，ＵＳＡ）で、いわゆるｇＢｌｏｃｋ（登録商標）として合成した。これは、通常約３００～１、０００塩基対長の既知の配列の二本鎖ＤＮＡフラグメントであるが、幾分短いまたは長い長さも可能である。抗ｈＣＤ２０Ａｂ１Ｖ_ＬをコードするＤＮＡ配列および抗ｈＣＤ２０Ａｂ１Ｖ_Ｌのアミノ酸配列を、配列番号７および８にそれぞれ示す。このＤＮＡを、ギブソン反応（例えば、ＧｉｂｓｏｎＡｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）マスターミックス取扱説明書、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓＩｎｃ．（ＮＥＢ）、バージョン３．３，ＮＥＢカタログ番号Ｅ２６１１Ｓ／Ｌ，ＮＥＢＩｎｃ．Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）により、一過性発現ベクターｐＳＢ０１中でヒトカッパ定常領域をコードする下流ＤＮＡフラグメントと融合した。反応混合物を、電気穿孔法により、コンピテント大腸菌ＸＬ１Ｂｌｕｅ中に形質転換し、抗生物質カルベニシリン含有ＬＢ寒天プレート上に播種した。得られたコロニーを、採取し、培養した。プラスミド挿入断片配列を、ＧｅｎｅｗｉｚＩｎｃ．でのＤＮＡ塩基配列決定法により確認した。抗ｈＣＤ２０Ａｂ１のＬＣのアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡ配列を、配列番号１０および９にそれぞれ示す。

抗ｈＣＤ２０Ａｂ１のＨＣをコードするプラスミドを作成するために、シグナルペプチド（ＳＰ）、続いて抗ｈＣＤ２０Ａｂ１Ｖ_ＨをコードするＤＮＡフラグメントを、ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ），Ｉｎｃ．により合成した。抗ｈＣＤ２０Ａｂ１Ｖ_ＨのＬＣのアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡ配列を、配列番号１２および１１にそれぞれ示す。このＤＮＡを、ギブソン反応により、一過性発現ベクターｐＳＢ０１中でヒトＩｇＧ１抗体のＣ_Ｈ１、ヒンジ、Ｃ_Ｈ２、およびＣ_Ｈ３領域をコードする下流ＤＮＡフラグメントと融合した。反応混合物を、電気穿孔法により、コンピテント大腸菌ＸＬ１Ｂｌｕｅ中に形質転換し、抗生物質カルベニシリン含有ＬＢ寒天プレート上に播種した。得られたコロニーを、採取、培養し、コロニー中のプラスミド挿入断片配列を、ＤＮＡ塩基配列決定法により確認した。抗ｈＣＤ２０Ａｂ１のＨＣのアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡ配列を、配列番号１４および１３にそれぞれ示す。このＨＣは、ＩｇＧ１ＨＣであった。

抗ｈＣＤ２０Ａｂ１抗体のＬＣおよびＨＣをコードするプラスミドＤＮＡを、それらを含む培養細菌から抽出し、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）Ｍｉｄｉ－プレップキット（ＱｉａｇｅｎＮ．Ｖ．，ｔｈｅＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いて精製した。３０ミリリットル（ｍＬ）体積中の哺乳動物ＥＸＰＩ２９３（商標）細胞に、１２５ｍＬ振盪フラスコ中で、リポフェクタミン（登録商標）２０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて、プラスミドＤＮＡを遺伝子導入した。細胞を、３７℃で５日間、１５０回転／分で連続的に振盪した。上清を、１５００ｒｐｍ、４℃で２０分間、細胞を遠心沈降することにより採取し、上清中の抗体を、標準プロテインＡカラムを用いて精製した。

実施例２：インビトロ細胞ベースアッセイによるヒト化抗ｈＣＤ２０Ａｂ．１抗体のキャラクタリゼーション
次の実験を実施して、他の対照抗ＣＤ２０抗体と比べて、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１が細胞表面上に発現されるヒトＣＤ２０にどのようにうまく結合し得るかを決定した。
ラージ細胞（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＣＬ－８６；バーキットＢ細胞リンパ腫細胞株）は、ヒトＣＤ２０（ｈＣＤ２０）を発現することが知られている。例えば、Ｌｉｅｔａｌ．，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｒｉｔｕｘｉｍａｂｖａｒｉａｎｔｗｉｔｈｐｏｔｅｎｔａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒａｃｔｉｖｉｔｙａｇａｉｎｓｔｒｉｔｕｘｉｍａｂ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔＢ－ｃｅｌｌｌｙｍｐｈｏｍａ，２００９，Ｂｌｏｏｄ１１４（２４）：５００７－５０１５、を参照されたい。ラージ細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、２ｍＭのＬ－グルタミン、１００単位／ｍＬのペニシリン、１００マイクログラム／ミリリットル（μｇ／ｍＬ）ストレプトマイシン（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１５１４０－１２２）の存在下で、ＲＰＭＩ培地１６４０（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号２１８７０）中で増殖させた。各５ｍＬのチューブ中の百万個の細胞を、３ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液（１ｘリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、これは、１．３７ＭＮａＣｌ、２７ｍＭＫＣｌ、１００ｍＭＮａ_２ＨＰＯ_４、および１８ｍＭＫＨ_２ＰＯ_４である）ｐＨ７．４、２％ＦＢＳ、０．０２％ＮａＮ_３）で１回洗浄し、室温（ＲＴ）で３分間、１５００回転／分（ｒｐｍ）で遠心沈降させ、その後１００μｌのＦＡＣＳブロッキング緩衝液（ＦＡＣＳ緩衝液＋１０％正常ヤギ血清（ＮＧＳ）＋２％正常ウサギ血清（ＮＲａｂＳ））中に懸濁した。チューブを、振盪しながら室温で１時間にわたりインキュベートし、３ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄し、１００μｌの５μｇ／ｍＬの試験される種々の抗ＣＤ２０抗体を含むＦＡＣＳブロッキング緩衝液中に懸濁した。細胞を、室温で３０分間抗体と共にインキュベートした。細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、５μｇ／ｍＬの二次抗体（ＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃ特異的、ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号２０９－０９５－０９８）を含むＦＡＣＳブロッキング緩衝液中に再懸濁した。チューブを、室温で３０分間、２００ｒｐｍで震盪した後、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。細胞をその後、２％ウシ胎仔血清含有リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の２％ホルムアルデヒド中で固定し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）卓上型分析装置（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によるＦＡＣＳ分析に供した。

図２、パネルＡに示すように、ＩｇＧ１抗ｈＣＤ２０抗体リツキシマブ含有試料は、３１０の幾何平均蛍光強度（ＧｅｏＭＦＩ）を有し（実線の輪郭で濃い灰色で塗りつぶした右端のピーク）、ＩｇＧ１抗ｈＣＤ２０抗体オビヌツズマブ含有試料は、２２０のＧｅｏＭＦＩを有し（点線で輪郭を描いたピーク）、ヒト化抗ｈＣＤ２０Ａｂ１ＩｇＧ１含有試料は、２４０の幾何学的ＭＦＩを有した（薄い灰色で塗りつぶしたピーク）。図２、パネルＡ中の、実線で輪郭が描かれ濃い灰色で塗りつぶされた左端のピークは、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照を含む試料である。これらの結果は、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１が、２種のベンチマーク抗体、すなわち、リツキシマブおよびオビヌツズマブと同等のレベルで、ラージ細胞上に発現したｈＣＤ２０に結合することを示唆した。これらのデータは抗ｈＣＤ２０Ａｂ１の結合特異性を明確に示してはいないが、それらは、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１がＣＤ２０を介してラージ細胞に結合することを強く示唆する。理由は、この抗体が、単一アミノ酸置換を除いて既知の抗ＣＤ２０抗体（トシツモマブ）と同じＣＤＲを有するためである。図１を参照されたい。

いくつかの抗ＣＤ２０抗体は、細胞死滅のために必要とされる追加の成分を必要とすることなく、例えば、補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）または抗体介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を介して直接に細胞を死滅させることができる。次のアッセイを行って、直接殺細胞作用アッセイにおける抗ｈＣＤ２０Ａｂ１の活性を評価した。アッセイを次のように実施した。

ラージ腫瘍細胞を、平底９６ウェルマイクロタイタープレートの１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地中に、２００μｌ／ウェルの体積中の１ｘ１０^５細胞の細胞密度で播種した。
各抗ＣＤ２０抗体を、アッセイ培地（１０％ＦＳＢ含有ＲＰＭＩ１６４０）中で３０μｇ／ｍＬに希釈した。これらの試験抗体は、この実験では「架橋され」ていないが、「架橋」が上記および下記で直接殺細胞作用実験と関連して言及される場合、それは、ポリクローナルヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＷｅｓｔＧｒｏｖｅ，ＰＡ）、カタログ番号１０９－００５－０９８；本明細書では、「架橋抗体」と呼ばれる）の配合物が希釈抗体と６０μｇ／ｍＬの濃度で混合され、腫瘍細胞への抗体の添加の前に、室温で３０分間インキュベートされたことを意味する。その後、１００μｌ／ウェル（各ウェル中の３００μｌの総体積に対し）で抗体（この場合、これは、「架橋抗体」なしの抗ＣＤ２０抗体）が、１０μｇ／ｍＬの試験抗体の最終濃度に添加される。「架橋抗体」が含まれる場合、ヤギ抗ヒトＩｇＧ、すなわち、架橋抗体の最終濃度は、２０μｇ／ｍＬとなるあろう。マイクロプレートを次に、５％ＣＯ_２にて３７℃で２４時間インキュベートした。インキュベーション後、１０μｌ／ウェルの３７％ホルムアルデヒドを、緩やかに混合しながら加えた。同じアッセイをまた、平底４８ウェルプレート中で、全ての体積を２倍にして実施した。試料を、オートサンプラーを備えたＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）フローサイトメーターで分析した。試料体積を、６０μｌ／ウェルに設定した。フローのデータを、ＦｌｏｗＪｏ（登録商標）ソフトウェアで分析して、芽球細胞（健康な生細胞と見なされる）の数を測定した。この細胞は、サイズにより死細胞から容易に区別でき、かつゲート制御細胞集団中でカウントできる。データを、「芽球細胞＃」としてｙ軸上にプロットする。図２、パネルＢに示すように、９６ウェルプレート中で、リツキシマブおよび抗ｈＣＤ２０Ａｂ１は、アイソタイプ対照抗体に比べて、弱い死滅活性（２０～２５％死滅）を示した。対照的に、オビヌツズマブは、５０％の細胞死滅を超える、強力な死滅活性を示した。４８ウェルプレートからの結果は、９６ウェルプレートでの結果で観察された傾向と一致した。これらのデータは、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１がラージ腫瘍細胞に対して弱い直接殺作用活性を有することを示した。

実施例３：ヒト化抗ｈＣＤ２０Ａｂ１抗体の設計
直接殺細胞作用における強力な活性が所望特性であったので、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１を、この活性を高めるように設計した。実施例２に示すように、抗ｈＣＤ２０抗体オビヌツズマブは、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１およびリツキシマブに比べて、直接殺細胞作用アッセイで強力な活性を示す。オビヌツズマブおよび抗ｈＣＤ２０Ａｂ１は、それらのＶ_Ｈアミノ酸配列中で極めて高い相同性を共有することが明らかになり、一方、それらのＶ_Ｌ配列は、より異なっていた。下表１１および１２を参照されたい。

Ｖ_ＨＣＤＲはＶ_ＬＣＤＲより抗原結合に重要であることが多いので、我々は、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１のＶ_ＨＣＤＲ中のオビヌツズマブのものとは異なるいくつかのアミノ酸残基（表１１の太字で示される）を、オビヌツズマブ中のこれらの位置に存在するアミノ酸で、または他のアミノ酸で置換することにより、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１の死滅活性を改善することを試みた。

下表１３に示す２３個の異なる改変および改変の組み合わせを、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＩＩＳｉｔｅ－ＤｉｒｅｃｔｅｄＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ａｇｉｌｅｎｔ、カタログ番号２００５２４）を用いる抗ｈＣＤ２０Ａｂ１Ｖ_ＨをコードするＤＮＡの部位特異的変異誘発により抗ｈＣＤ２０Ａｂ１Ｖ_Ｈのアミノ酸配列中で作製した。抗ｈＣＤ２０Ａｂ１ＬＣおよび表１３で記載のように改変された抗ｈＣＤ２０Ａｂ１ＨＣの１つをコードするプラスミドＤＮＡを、２４ウェルマイクロタイタープレート中で、ＥＸＰＩ２９３（商標）細胞中に一過的に同時遺伝子導入した。上清を、遺伝子導入の５日後に採取し、実施例２で記載の結合および死滅アッセイに直接使用した。

実施例２で記載のＦＡＣＳ分析を実施して、これらの２３種のバリアントのラージ細胞への結合を評価した。バリアント＃３、＃７、＃８は、かなりの結合を示したが、他のバリアントは、ラージ細胞上のＣＤ２０に結合しなかった。データは示されない。直接殺細胞作用アッセイ（実施例２で記載のように実施）は、バリアント＃３、＃７、＃８は、架橋抗体、すなわち、ヤギ抗ヒトＦｃポリクローナル抗体が存在する場合ラージ細胞を死滅させることができることを示した。データは示されない。

このアッセイで使用した粗製細胞上清は不確定の抗体濃度および多くの混入物を含んだので、より大きな規模（３０ｍＬ）の一過的遺伝子導入を、バリアント＃３、＃７、＃８をコードするＤＮＡで実施した。得られた形質移入体からの細胞上清を、５日後に採取し、各上清中の抗体を、標準プロテインＡアフィニティカラムで精製した。精製されたバリアント抗体＃３、＃７、＃８は、それぞれ、抗ｈＣＤ２０－Ａｂ１－Ｔ６、抗ｈＣＤ２０－Ａｂ１－Ｔ７、抗ｈＣＤ２０－Ａｂ１－Ｔ８と命名された。加えて、改変Ｎ３３Ｑを有する抗ｈＣＤ２０Ａｂ１Ｖ_Ｈの別のバリアントを、同時に同じ方法で作製した。この精製された抗体は、抗ｈＣＤ２０－ＡＢ１－Ｔ５と命名された。この選択は、Ｖ_ＨのＮ３３が多くの抗体で抗原結合に関与するという事実に基づいた。従って、我々は、Ｎ３３が抗ｈＣＤ２０Ａｂ１の機能にとって重要である可能性があると推測した。我々は、この位置での類似であるが、わずかにより大きなアミノ酸への切り替えが、抗原結合および／または細胞死滅などの抗原結合に関連する特性を改善する可能性があると仮定した。加えて、Ａ５０Ｒ、Ｎ５４Ｅ、およびＳ５８Ｄから選択される２個または３個の改変を含むバリアント抗ｈＣＤ２０Ａｂ１抗体も同じ方法で作製した。全てのこれらのバリアントおよびそれら中の改変の名称は、下表１４に列挙される。

表１４に列挙される抗ｈＣＤ２０Ａｂ１バリアントのタンパク質濃度を、２８０ｎＭ（ＯＤ_２８０）での光学密度から計算した。これらのバリアントを、ラージ細胞のみに対してではなく、３種の異なる細胞型（ラージ、ラモス、およびＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞）に対する結合を試験したことを除いて、実施例２に記載のように実施した結合アッセイにおいて、陽性および陰性の対照抗体と共に試験した。ラージ細胞は、極めて高いレベルのＣＤ２０を発現する。ラモス細胞は、より低いレベルであるが、依然として比較的高いレベルのＣＤ２０を発現する。ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞は、極めて低いレベルのＣＤ２０を発現する。結果を図３に示す。

陽性対照抗体抗ｈＣＤ２０トシツモマブおよびオビヌツズマブは、これらの腫瘍細胞に結合し、一方でアイソタイプ対照抗体ｈｕＩｇＧ１は、全く結合を示さなかった。図３、パネルＡ～Ｄ。８種の試験した抗ｈＣＤ２０Ａｂ１バリアントの中で、抗ｈＣＤ２０－Ａｂ１－Ｔ７のみが、オビヌツズマブと同等のＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞およびラージ細胞に対する結合を示した。しかし、この結合のレベルは、別の陽性対照、トシツモマブで観察されたものより低かった。図３、それぞれパネルＡおよびＢ。トシツモマブはまた、抗ｈＣＤ２０－Ａｂ１－Ｔ７よりも高いレベルのラモス細胞に対する結合を示し、オビヌツズマブは、ラモス細胞では試験されなかった。図３、パネルＣ。対照抗体は、ラモス細胞中で２種の異なる濃度、すなわち、１０μｇ／ｍＬ（他の実験と同様に）および１μｇ／ｍＬ、で試験された。２種の異なる濃度で観察された差異は小さい。図３、パネルＤ。オビヌツズマブを含む試料についてより高い濃度で観察されたわずかにより低いレベルの結合は、この抗体は細胞死滅に極めて効果的であるという理由で、より高い濃度でのこの抗体による細胞死滅が原因である可能性がある。図４を参照されたい。

直接殺細胞作用アッセイを、結合抗体を架橋するためにヤギ抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体、すなわち、架橋抗体を加えて、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２、ラージ、およびラモス細胞中で実施例２に記載のように実施した。結果を図４に示す。陽性対照抗ｈＣＤ２０抗体オビヌツズマブは、架橋抗体と共に、またはなしで、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２、ラージ、およびラモス細胞中で、極めて強力な死滅を誘発し、一方でアイソタイプ対照ｈｕＩｇＧ１は、もしあるとしても、試験抗体の非存在下で観察されるものを超える直接殺細胞作用をほとんど示さなかった。キメラＩｇＧ１抗ｈＣＤ２０抗体ＴＳ（これは、トシツモマブの可変ドメインを含む）は、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞を含む試料中で強力な死滅を示したが、ラージまたはラモス細胞を含む試料中ではそうではなかった。図４、パネルＡを図４、パネルＢおよびＣと比較されたい。試験した８種の抗ｈＣＤ２０Ａｂ１バリアントの中で、抗ｈＣＤ２０－Ａｂ１－Ｔ７のみが、架橋抗体の存在下で、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞を含む試料中のトシツモマブで観察された死滅レベルに対し類似のレベルを示した。図４、パネルＡ。架橋抗体の非存在下では、８種の試験した抗ｈＣＤ２０Ａｂ１バリアント中のいずれも、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２、ラモス、またはラージ細胞中で、説得力のある直接殺細胞作用を示さなかった。

まとめると、結果は、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１のＶ_Ｈ中の１個または複数のアミノ酸の、抗ｈＣＤ２０抗体オビヌツズマブ中の同じ位置に存在するアミノ酸との（または他のアミノ酸との）置換は、親キメラＩｇＧ１抗ｈＣＤ２０抗体ＴＳと比較した場合、結合および／または細胞死滅を十分に改善しなかったことを示した。従って、ヒト化抗ｈＣＤ２０Ａｂ１ＩｇＧ１抗体の直接殺作用活性を高めるために、異なる手法を探究した。

実施例４：抗原結合および直接殺細胞作用を高めるための定常ドメインの改変
Ｉ型およびＩＩ型抗ＣＤ２０抗体は、ＣＤ２０内の同じ３アミノ酸モチーフに結合する。しかし、ＩＩ型抗体は、そのモチーフのＣ末端側に主に結合し、Ｉ型抗体はそのモチーフのアミノ末端側により多く結合する。ＭａｒｋＳ．Ｃｒａｇｇ，ＣＤ２０ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｄｏｉｎｇｔｈｅｔｉｍｅｗａｒｐ，２０１１，Ｂｌｏｏｄ，１１８（２）：２１９－２２０。ＣＤ２０分子は、細胞表面上で四量体を形成する。例えば、Ｎｉｅｄｅｒｆｅｌｌｎｅｒｅｔａｌ．，ＥｐｉｔｏｐｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎａｎｄｃｒｙｓｔａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＧＡ１０１ｐｒｏｖｉｄｅｉｎｓｉｇｈｔｓｉｎｔｏｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｂａｓｉｓｆｏｒｔｙｐｅＩ／ＩＩｄｉｓｔｉｎｃｔｉｏｎｏｆＣＤ２０ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，２０１１，Ｂｌｏｏｄ１１８（２）：３５８－３６７を参照されたい。このわずかな差異は、異なる機能特性と相関する。Ｉ型抗ｈＣＤ２０抗体リツキシマブは、異なる四量体中の２つのＣＤ２０分子に結合し、ＩＩ型抗ｈＣＤ２０抗体オビヌツズマブは、同じ四量体中の２つのＣＤ２０分子に結合すると仮定した。この仮定は、リツキシマブなどのＩ型抗ｈＣＤ２０抗体は、細胞表面上で大量のＣＤ２０四量体の形成をもたらし、一方、ＩＩ型抗ｈＣＤ２０抗体はそうではないという観察と一致する。Ｉ型およびＩＩ型抗ｈＣＤ２０抗体の三次構造は、ＣＤ２０が、抗体に対し異なる方向でＩ型およびＩＩ型抗ｈＣＤ２０抗体に結合することを明らかにする。さらに、ＩＩ型抗ｈＣＤ２０抗体は、Ｉ型抗ｈＣＤ２０抗体より広い「肘角度」を有し、これは、ＩＩ型抗体のアームがＩ型抗体のものより広く広がることを基本的に意味する。例えば、Ｃｒａｇｇ、前出；Ｎｉｅｄｅｒｆｅｌｌｎｅｒｅｔａｌ．，前出、を参照されたい。従って、我々は、ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体のオビヌツズマブが、Ｉ型抗ＣＤ２０抗体のリツキシマブより強力な細胞死滅を示したことから、アームの柔軟性に影響を与える可能性があるヒンジおよび隣接する領域での変化が、直接殺細胞作用にも影響を与える可能性があると仮定した。図４を参照されたい。

ヒトＩｇＧ１抗体のＦａｂアームは、ヒトＩｇＧ４抗体のものより、より柔軟である（またはより広い「肘角度」を有する）。例えば、Ｖｉｄａｒｓｓｏｎｅｔａｌ．，ＩｇＧｓｕｂｃｌａｓｓｅｓａｎｄａｌｌｏｔｙｐｅｓ：ｆｒｏｍｓｔｒｕｃｔｕｒｅｔｏｅｆｆｅｃｔｏｒｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，２０１４，ＦｒｏｎｔＩｍｍｕｎｏｌＶｏｌ．５，Ａｒｔｉｃｌｅ５２０を参照されたい。Ｋａｉらは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４抗体中のＣＨ１と上部ヒンジ部の交換が、インビボおよびインビトロでトロンボポエチン受容体に特異的な２種のアゴニスト抗体の活性を高め得ることを報告した。Ｋａｉｅｔａｌ．，Ｓｗｉｔｃｈｉｎｇｃｏｎｓｔａｎｔｄｏｍａｉｎｓｅｎｈａｎｃｅｓａｇｏｎｉｓｔａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｔｏａｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎｒｅｃｅｐｔｏｒ，２００８，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２６（２）：２０９－２１１。我々は従って、これらの領域で変化を作ることにより、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１（ヒト化ＩｇＧ１抗体）の活性を変えることを試みた。具体的には、（１）全体Ｃ_Ｈ１ドメインを、ＩｇＧ４Ｃ_Ｈ１と類似になるように置換した、および（２）ヒンジを、ヒトＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体のヒンジに少なくとも部分的に類似するように、変更した。

４種の新規抗ｈＣＤ２０Ａｂ１バリアントＨＣ（下表１５を参照）のアミノ酸配列を、ＤＮＡ配列に逆翻訳した。ＤＮＡフラグメントを、ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより合成し、本明細書の実施例１に記載のギブソン反応により、一過的哺乳動物発現ベクターｐＳＢ０１中にサブクローニングした。バリアントＨＣをコードするプラスミドＤＮＡを、大腸菌中に導入し、選択コロニー由来のプラスミドＤＮＡを、ＧｅｎｅｗｉｚＩｎｃ．により配列決定した。塩基配列決定後、プラスミドＤＮＡを、個別に作成し、ＥＸＰＩＣＨＯ（商標）細胞中への同時遺伝子導入のために、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１ＬＣをコードするベクターと組み合わせて、新規組み換えヒトＩｇＧ抗体バリアントを産生した。

上記４種の抗ｈＣＤ２０Ａｂ１バリアントを含むこれらの回収した細胞上清を、プロテインＡアフィニティカラムを通して精製した。精製抗体の濃度を、ＯＤ_２６０を読み取ることにより計算した。精製した抗体を、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞に対する結合（ラージ細胞について実施例２で記載のように実施した）およびＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞を用いる架橋抗体なしでの直接殺細胞作用（実施例２および「直接殺細胞作用」の定義で上記のように）について１０μｇ／ｍＬでアッセイした。これらの実験からの結果を、図５に示す。

バリアント抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．１、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２、および抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．３は、対照キメラ抗体ＴＳより低いレベルのＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞に対する結合を示し、一方で抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．４は、より高いレベルを示した。図５、パネルＡ。これらの結果は、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．４ＩｇＧ中に存在するＩｇＧ３から上部および下部ヒンジ領域は、長く、柔軟性であるという事実を反映し得る。これは、両方のＦａｂアームが同時にＣＤ２０と結合するのを可能にし、細胞表面上で発現されるＣＤ２０へのより強力な結合をもたらし得る。しかし、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２（この中のＣ_Ｈ１および一部のヒンジはＩｇＧ４サブクラスのものである）は、最強の死滅を誘導し、一方で抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．１、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．３および抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．４ＩｇＧは、トシツモマブで観察されたものを超えて、死滅活性を改善しなかった。図５、パネルＢ。

これらの差異に関するさらなる定量的情報を得るために、これらの抗ｈＣＤ２０Ａｂ１バリアントの死滅活性を、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２およびラモス細胞中で異なる濃度で評価した。図６、それぞれパネルＡおよびＢ。細胞を、種々の濃度で異なる抗体とインキュベートした。アイソタイプ対照ｈｕＩｇＧ１は、試験した最高濃度、すなわち、３０μｇ／ｍＬで、いずれの細胞型の死滅も示さなかったが、一方でオビヌツズマブは、強力な、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞の用量依存性細胞死滅（ＥＣ_５０＝０．１０４８ｎＭ）を示した。トシツモマブは、遙かに弱いＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞の細胞死滅（ＥＣ_５０＝２．８４１ｎＭ）を示した。抗ｈＣＤ２０Ａｂ１ＩｇＧバリアントは、用量依存的な死滅を示し、Ａｂ１．２は、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞中で最も強力なバリアントであった（ＥＣ_５０＝０．３７６７ｎＭ）。Ａｂ１．１、Ａｂ１．３、およびＡｂ１．４は、それぞれ、２．９５５ｎＭ、０．５１３７ｎＭ、１．２８９ｎＭのＥＣ_５０を有した。ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞より遙かに高いレベルのＣＤ２０を発現するラモス細胞は、全ての試験した抗ｈＣＤ２０抗体に対し感受性が低かったが、いくつかの類似の傾向が観察された。図６、パネルＢ。

実施例５：抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２の抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性
抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞および単球／マクロファージ、ＮＫＴ細胞、またはγδ Ｔ細胞などの他のＣＤ１６^＋サブセットを含む、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６Ａ）を発現している免疫細胞により実行される細胞溶解のための適切なサブクラスのＩｇＧ抗体（ヒトのＩｇＧ１およびＩｇＧ３）でコートした細胞を標的にする、一連の機序である。ＡＤＣＣは、免疫監視の１つの機序であり、ＡＤＣＣの強化は従って、治療抗体薬効を改善するための１つの戦略である。

ＡＤＣＣ強化のための２つのタイプの技術、すなわち、ＦｃγＲＩＩＩＡに対する抗体の親和性を高めるための、抗体グリコシル化の改変および抗体のアミノ酸配列の改変がある。例えば、Ｐｅｒｅｉｒａｅｔａｌ．，Ｔｈｅ “ｌｅｓｓ－ｉｓ－ｍｏｒｅ” ｉｎｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄａｎｔｉ－ｃａｎｃｅｒａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｗｉｔｈｅｎｈａｎｃｅｄａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｃｅｌｌｕｌａｒｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ，２０１８，ＭＡｂｓ１０（５）：６９３－７１１；Ｋｅｌｌｎｅｒｅｔａｌ．，ＭｏｄｕｌａｔｉｎｇｃｙｔｏｔｏｘｉｃｅｆｆｅｃｔｏｒｆｕｎｃｔｉｏｎｓｂｙＦｃｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｔｏｉｍｐｒｏｖｅｃａｎｃｅｒｔｈｅｒａｐｙ，２０１７，Ｔｒａｎｆｕｓ．Ｍｅｄ．Ｈｅｍｏｔｈｅｒ．４４：３２７－３３６を参照されたい。第１の戦略に関しては、ヒトＩｇＧ重鎖のＮ２９７でＮ結合型グリカンに付着されたフコースは、ＦｃγＲＩＩＩＡとの抗体のＦｃ領域の相互作用を立体的に障害する。糖鎖工学によるこのフコースの除去は、ＦｃγＲＩＩＩＡに対する抗体の親和性を高め、これは、野生型ＩｇＧ１抗体対照に比べて、脱フコシル化ＩｇＧ１抗体における実質的により高いＡＤＣＣ活性をもたらす。１つの戦略では、β－１，４－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴ－ＩＩＩ）およびゴルジαマンノシダーゼＩＩ（αＭａｎＩＩ）が過剰発現され、ＩｇＧ抗体上により高い比率の二分したおよび非フコシル化グリカンを生じる。例えば、Ｆｅｒｒａｒａｅｔａｌ．，Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｎｔｉｂｏｄｙｅｆｆｅｃｔｏｒｆｕｎｃｔｉｏｎｓｂｙｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆＧｏｌｇｉｅｎｚｙｍｅｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｄｏｍａｉｎａｎｄｃｏ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓｂｅｔａ１，４－Ｎ－ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅＩＩＩａｎｄＧｏｌｇｉａｌｐｈａ－ｍａｎｎｏｓｉｄａｓｅＩＩ，２００６，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９３（５）：８５１－８６１を参照されたい。別の戦略では、ＦＵＴ８遺伝子が、抗体が発現される細胞株中で効果的に不活化されるまたは除去される。ＦＵＴ８は、コア部フコシル化のために、Ｎ－グリカン上の最内側のＧｌｃＮＡｃにα１，６結合を介してフコースを移送する、唯一のα１，６－フコシルトランスフェラーゼである。ＦＵＴ８ヌル細胞株は、完全に脱フコシル化された組み換えＩｇＧ１を発現し、これは、フコシル化ＩｇＧ１に比べて、実質的に高められたＡＤＣＣ活性を有し得る。例えば、Ｙｕａｎｅｔａｌ．，ＢｉｏｐｒｏｃｅｓｓｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆａｓｔａｂｌｅＦＵＴ８－／－－ＣＨＯｃｅｌｌｌｉｎｅｔｏｐｒｏｄｕｃｅｄｅｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄａｎｔｉ－ＨＥＲ２ａｎｔｉｂｏｄｙ，２０１９，ＢｉｏｐｒｏｃｅｓｓＢｉｏｓｙｓｔ．Ｅｎｇ．４２（８）：１２６３－１２７１（Ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ００４４９－０１９－０２１２４－７）を参照されたい。別の戦略では、抗体は、２－フルオロフコースなどのＦＵＴ８の化学的阻害剤を含む培地を用いてＣＨＯ細胞中で産生され、それらのコア部グリカン中に少ないフコースを有するまたはフコースのないＩｇＧ抗体の産生をもたらす。Ｏｋｅｌｅｙｅｔａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｏｒａｌｌｙａｃｔｉｖｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓｏｆｐｒｏｔｅｉｎａｎｄｃｅｌｌｕｌａｒｆｕｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ，２０１３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１１０（１４）：５４０４－５４０９，ＤＯＩ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１２２２２６３１１０）を参照されたい。

上述のように、第２の戦略は、抗体に対する結合のためにＦｃγＲＩＩＩＡの親和性を高め、強化されたＡＤＣＣ活性に繋がる、ＩｇＧ１抗体中のアミノ酸改変を含む。この戦略の探求において、我々は、実施例３で記載の部位特異的変異誘発により、４種の抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２のバリアントを作製した。Ａｂ１．２に対する改変を下表１６に示す。

ＡＤＣＣアッセイを実施して、これらの抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２バリアントの細胞傷害性活性を評価した。ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞を、培養、洗浄し、約２ｘ１０細胞を、５０ｍＬのチューブ中の１％ＦＢＳを含むＭｅｄｉｕｍ１９９（例えば、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号１１１５００５９を参照）に再懸濁した。カルセイン－ＡＭ（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｃ１３５９）を、２５ｎＭの最終濃度に加えた。細胞を、５％ＣＯ_２にて３７℃で３０分間インキュベートし、１ｘＰＢＳで２回洗浄して遊離カルセイン－ＡＭを除去し、１％ＦＢＳを含む培地１９９中に１ｘ１０^５細胞／ｍＬで再懸濁した。抗ＣＤ２０抗体またはアイソタイプ対照ＩｇＧ１抗体を、培地１９９＋１％ＦＢＳ中の１：２系列希釈により１μｇ／ｍＬ～０．０１５６μｇ／ｍＬで調製し、１００μｌ／ウェルで９６ウェルのＵ底プレート（ＢｅｒｋｍａｎＤｉｃｋｓｏｎ、カタログ番号３５３０７７）に加えた。ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞を、ウェルに加えた（５０μｌ／ウェル中の５ｘ１０^３個のＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞）。プレートを、３７℃で２０分間インキュベートした。ヒトＰＢＭＣを、５０：１のエフェクター／標的細胞比率、すなわち、５０μｌ中の２．５ｘ１０^５ＰＢＭＣ／ウェルで、ウェルに加えた。対照ウェルでは、自然発生的蛍光放出を測定するために、ＰＢＭＣではなく、５０μｌの１％ＦＢＳ含有培地１９９を加えた。各ウェルの最終体積は、２００μｌであった。プレートを、５％ＣＯ_２にて３７℃で４時間インキュベートした。ウェルからの上清（１５０μｌ／ウェル）を、回収し、蛍光をＥｎｖｉｓｉｏｎ２０１３ＭｕｌｔｉｌａｂｅｌＲｅａｄｅｒで、４８５－５３５ｎｍで測定することにより、カルセイン放出についてアッセイした。１００％溶解に相当する値を、４つのウェルのカルセイン標識標的細胞を２０μｌ／ウェルのイゲパル（登録商標）ＣＡ－６３０洗浄剤（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号５６７４１）で溶解することにより測定した。パーセント特異的溶解を、次のように定義した：（試料蛍光）－（自然発生的溶解蛍光）／（１００％溶解－自然発生的溶解蛍光）^＊１００。パーセント特異的溶解値を変換し、シグモイド型用量反応カーブフィットを、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ５．０ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて実施した。

図７、パネルＡで示すように、アイソタイプ対照ｈｕＩｇＧ１抗体は、最大濃度（１０ｎＭ）で約３０％の溶解を示した。抗ｈＣＤ２０抗体リツキシマブは、０．２６１ｎＭのＥＣ_５０で、用量依存性応答を示し、１０ｎＭの最高濃度で約５０％の最大特異的溶解であった。抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２は、０．１４１６ｎＭのＥＣ_５０で、用量依存性応答を示した。Ａｂ１．２．１、Ａｂ１．２．２、Ａｂ１．２．３、およびＡｂ１．２．４は全て、Ａｂ１．２より高い効力を示し、それぞれ、０．０１５２６ｎＭ、０．０１１３４ｎＭ、０．０２５１２ｎＭ、および０．０２４１８ｎＭのＥＣ_５０を有した。これらのヒト化抗ＣＤ２０抗体は、８０％を超える最大特異的溶解を示した。抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２は、最も効力の高い抗体であった。

補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）は、ＩｇＧ１抗ＣＤ２０抗体に対する別の重要な作用機序である。例えば、リツキシマブは、強力ＣＤＣ活性を有することが報告されている。Ｍａｎｃｈｅｓｅｔａｌ．，Ｉｎｖｉｔｒｏｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆａｃｔｉｏｎｏｆｒｉｔｕｘｉｍａｂｏｎｐｒｉｍａｒｙｎｏｎ－Ｈｏｄｇｋｉｎｌｙｍｐｈｏｍａｓ，２００３，Ｂｌｏｏｄ１０１：９４９－９５４。４種の抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２バリアントを、それらのＣＤＣ活性を評価するために、ウサギ血清（高いレベルの補体を含む）の存在下で、インビトロＣＤＣアッセイにより試験した。１％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地中のＷＳＵ－ＤＬＣＬ２腫瘍細胞を、Ｕ底９６ウェルマイクロタイタープレート中に、５０μｌ中の５ｘ１０^４個の細胞／ウェルで、播種した。その後、ウサギ血清（５０μｌ／ウェル）および種々の濃度の抗ＣＤ２０または対照抗体（５０μｌ／ウェル）を加えた。ウサギ補体の最終濃度は、３％であった。ウェル当たりの総体積は、５０μｌであった。マイクロプレートを、５％ＣＯ_２にて３７℃で２４時間インキュベートした。インキュベーション後に、ＰＢＳ（５０μｌ／ウェル）中のヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を、４μｇ／ｍＬの最終濃度に加えて、死細胞を検出した。ＦＡＣＳを、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）フローサイトメーター（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて実施した。データを、ＦｌｏｗＪｏ（登録商標）ソフトウェアで解析した。細胞傷害性活性を、パーセンテージとして表し、これは、ＰＩ陽性細胞を細胞総数で除算した数値である（パーセント死細胞）。

予想通り、ＩｇＧ１抗ｈＣＤ２０抗体リツキシマブは、強力な活性を示し（ＥＣ_５０＝０．３０ｎＭ）、一方でＩｇＧ１抗ｈＣＤ２０抗体オビヌツズマブは、遙かに弱いＣＤＣ活性を有した（ＥＣ_５０＝８．９０ｎＭ）。図７、パネルＢ。最大濃度（３０ｎＭ）の加熱不活化ウサギ血清単独は、約１０％のみの死細胞を示し、アイソタイプ対照ｈｕＩｇＧ１は、実質的にこのレベルを超える細胞死滅を誘発しなかった。抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２は、オビヌツズマブよりもわずかに強力なＣＤＣ活性（ＥＣ_５０＝４．８５ｎＭ）を示し、一方でＡｂ１．２．２は、オビヌツズマブと同等のＣＤＣ活性（ＥＣ_５０＝７．３３ｎＭ）を示した。しかし、他のバリアントは、このアッセイで、大幅に低減されたＣＤＣ活性を有した（Ａｂ１．２．３；ＥＣ_５０＝５４．３２ｎＭ）か、または実質的にＣＤＣ活性を有しなかった（Ａｂ１．２．１およびＡｂ１．２．４）。図７、パネルＢ。

実施例６：マウス抗ヒトＣＤ３７抗体クローンＧ２８．１のヒト化および産生
Ｇ２８．１と呼ばれるマウス抗ヒトＣＤ３７ハイブリドーマクローンは、１９９１年に報告された。Ｂｒａｓｌａｗｓｋｙｅｔａｌ．，Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（ｈｙｄｒａｚｏｎｅ）－ａｎｔｉｂｏｄｙｃｏｎｊｕｇａｔｅｓｒｅｑｕｉｒｅｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎａｎｄｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒａｃｉｄｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓｆｏｒａｎｔｉｔｕｍｏｒａｃｔｉｖｉｔｙ，１９９１，ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｏｌＩｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３３（６）：３６７－３７４。我々は、このハイブリドーマにより産生された抗体を以降でＧ２８．１と呼ぶ。遺伝子改変キメラバージョンのＧ２８．１は、Ｇ２８．１抗体由来のマウス可変領域および遺伝子改変ヒト定常領域を含み、架橋抗体の存在下で慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）の強力な直接殺作用を誘導するが、架橋抗体がない場合は、これを誘導しないことが示された。Ｚｈａｏｅｔａｌ．，ＴａｒｇｅｔｉｎｇＣＤ３７－ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙｍｐｈｏｉｄｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓｗｉｔｈａｎｏｖｅｌｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄｓｍａｌｌｍｏｄｕｌａｒｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，２００７，Ｂｌｏｏｄ．１１０（７）：２５６９－２５７７。Ｈｅｉｄｅｒら（Ｈｅｉｄｅｒｅｔａｌ．，ＡｎｏｖｅｌＦｃ－ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙｔｏＣＤ３７ｗｉｔｈｅｎｈａｎｃｅｄＡＤＣＣａｎｄｈｉｇｈｐｒｏａｐｏｐｔｏｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｙｆｏｒｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆＢ－ｃｅｌｌｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ，２０１１，Ｂｌｏｏｄ１１８（１５）：４１５９－４１６８）は、Ｇ２８．１可変領域を含むキメラ抗体がホモサピエンス以外の試験したいずれの種由来のＣＤ３７にも結合しないことを見出したので、これらの研究者は、サロゲート抗体、すなわち、カニクイザルカニクイザルＣＤ３７に結合する異なる抗体を毒性試験のために作製した。これは、ヒト治療薬の開発における重要なステップである。Ｈｅｉｄｅｒｅｔａｌ．，前出。下で、我々は、Ｇ２８．１のヒト化バージョンの構築を記載する。これは、架橋抗体の非存在下での腫瘍細胞の強力な直接殺作用およびカニクイザルＣＤ３７抗原に対する異種間結合を達成するように最適化された。

Ｇ２８．１のＶ_ＨおよびＶ_Ｌアミノ酸配列（それぞれ、配列番号９６および９７）を、ＤＮＡ配列に逆翻訳し、これを使って、ＩＭＧＴデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／で利用可能）を検索して、高度に相同なヒトＶ_ＨおよびＶ_Ｌ生殖系列配列を見つけた。ＩｇＶＨ－Ｄ－Ｊ生殖系列としてアセンブルされる場合、ヒト生殖系列配列ＩＧＨＶ１－３^＊０１、ＩＧＨＤ１－２６^＊０１Ｆ、およびＩＧＨＪ４^＊０１は、Ｇ２８．１のＶ_Ｈにほぼ類似のヒトＶ_Ｈをコードすることが見出された。同様に、アセンブルされたヒト生殖系列配列ＩＧＫＶ１－２７^＊０１およびＩＧＫＪ４^＊０１を含むＩｇＶＬ－Ｊヒト生殖系列は、Ｇ２８．１のものにほぼ類似のヒトＶ_Ｌアミノ酸配列をコードすることが見出された。Ｇ２８．１Ｖ_ＨおよびＶ_ＬのＣＤＲ配列を、これらのヒトＶ_ＨおよびＶ_Ｌ生殖系列配列のフレームワーク中にそれぞれグラフト化した。

ヒト化抗ｈＣＤ２０抗体について実施例１で説明されたように、ＣＤＲグラフト化Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌのアミノ酸配列を、ＲｏｓｅｔｔａＯｎｌｉｎｅＳｅｒｖｅｒｔｈａｔＩｎｃｌｕｄｅｓＥｖｅｒｙｏｎｅ（ＲＯＳＩＥ）抗体モデリングサーバー、続けて、ＰｙＭＯＬ組み込み型ＣＥモジュールアライメントツールおよびＰＲＯＣＨＥＣＫおよびＶｅｒｉｆｙ３Ｄプログラムを有するＰＤＢｓｕｍ構造解析に供した。これらの解析に基づいて、改変を、Ｖ_Ｈ／Ｖ_Ｌ、Ｖ_Ｈ／Ｃ_Ｈ１、および／またはＶ_Ｌ／Ｃ_Ｌ境界を安定化するためにＣＤＲグラフト化抗ＣＤ３７抗体のＶ_ＨおよびＶ_Ｌ中に導入し、抗体がＣＤＲに抗原結合部位を形成するように折り畳まれることを可能にした。Ｖ_Ｈでは、これらの改変は、Ａ４０Ｎ、Ｐ４１Ｎ、Ｒ７１Ｖ、Ｓ８２ａＫであり（図８、パネルＡで下線付き太字の残基として示される）、それらのそれぞれは、ヒトフレームワーク領域中に存在するアミノ酸を元のマウス抗体中の同じ位置のアミノ酸で置換した。加えて、５個の改変を、Ｖ_Ｌ中で行った。これらは、Ｄ７０Ｑ、Ｖ８３Ｓ、Ｔ８５Ｓ、Ｋ１０３Ｅ、Ｖ１０４Ｌであった（図８、パネルＢで下線付き太字残基として示される）。上述したＶ_Ｈ改変と同様に、それらのそれぞれは、ヒトフレームワーク領域中に存在するアミノ酸を元のマウス抗体中の同じ位置のアミノ酸で置換した。

Ｓｗｉｓｓ－ＰｄｂＶｉｅｗｅｒ（ＤｅｅｐＶｉｅｗ）ソフトウェアに続いて、ＰｙＭＯＬを、上記の改変されたＣＤＲグラフト化Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ配列に対し実施して、抗体のこれらのＶ_ＨおよびＶ_Ｌアミノ酸配列を含む予測された三次構造中の立体障害を修正した。このエネルギー最小化プロセスにより、Ｖ_Ｌ中の改変Ｖ４３Ａが、Ｖ_Ｈ／Ｖ_Ｌ境界での立体障害を防ぐと予測された。この改変は、図８のパネルＢで太字のイタリック体で示される。この追加で改変されたＶ_Ｌ配列＋以前に使用された改変されたＶ_Ｈ配列を、ＰｙＭＯＬを使用して評価して、個別のアミノ酸が、三次構造の表面から突出しているかどうかを決定した。この解析は、Ｖ_Ｈの位置２８（ＣＤＲ１中）のセリンのトレオニンでの置換（Ｓ２８Ｔ）が、抗体表面中の小さい溝を埋める可能性があることを示唆した。この改変は、図８、パネルＡの下線付き太字のイタリック体で示される。このような「リサーフェイシング」は、抗体をより低い免疫原性にする可能性がある。前述の全ての改変を含むヒト化抗体を、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１と命名した。この抗体のＶ_ＨおよびＶ_Ｌと、Ｇ２８．１、Ｇ２８．１のＣＤＲグラフト化バージョン、およびヒト生殖系列配列によりコードされる抗体のＶ_ＨおよびＶ_Ｌとのアライメントを、図８に示す。

抗ＣＤ２０抗体についての実施例１で記載のように、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１のＶ_ＨおよびＶ_Ｌアミノ酸配列を、ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ），Ｉｎｃ．（Ｉｏｗａ，ＵＳＡ）によるｇＢｌｏｃｋ（登録商標）合成のために、ＤＮＡ配列に逆翻訳した。抗ｈＣＤ３７Ａｂ１のＶ_Ｌのアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡ配列は、配列番号５３および５２でそれぞれ提供される。抗ｈＣＤ３７Ａｂ１のＶ_Ｈのアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡ配列は、配列番号５７および５６でそれぞれ提供される。Ｖ_ＬｇＢｌｏｃｋ（登録商標）を、ギブソン反応により、一過的発現ベクター中でヒトカッパ定常ドメインをコードする下流ＤＮＡフラグメントと融合した。同様に、Ｖ_ＨｇＢｌｏｃｋ（登録商標）を合成し、ギブソン反応により、同じベクター中でヒトＩｇＧ１抗体のＣ_Ｈ１、ヒンジ、Ｃ_Ｈ２、およびＣ_Ｈ３領域をコードする下流ＤＮＡフラグメントと融合した。これらの反応混合物を、電気穿孔法により、コンピテント大腸菌ＸＬ１Ｂｌｕｅ細胞中に別々に導入し、抗生物質カルベニシリン含有ＬＢ寒天プレート上に播種した。得られたコロニーを、採取し、培養した。プラスミド挿入断片配列を、ＤＮＡ塩基配列決定法により確認した。抗ｈＣＤ３７Ａｂ１のＬＣのアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡ配列を、配列番号５５および５４でそれぞれ示す。抗ｈＣＤ３７Ａｂ１のＨＣのアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡ配列を、配列番号５９および５８でそれぞれ示す。

ヒト化抗ｈＣＤ３７Ａｂ１ＩｇＧ１抗体のＬＣおよびＨＣをコードするプラスミドＤＮＡを、それらを含む培養細菌から抽出し、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）Ｍｉｄｉ－プレップキット（ＱｉａｇｅｎＮ．Ｖ．，ｔｈｅＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いて精製した。哺乳動物ＥＸＰＩ２９３（商標）細胞（３０ｍＬの体積）に、１２５ｍＬ振盪フラスコ中で、リポフェクタミン（登録商標）２０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて、プラスミドＤＮＡを遺伝子導入した。細胞を、３７℃で５日間、１５０ｒｐｍで連続的に振盪した。上清を、１５００ｒｐｍ、４℃で２０分間、細胞を遠心沈降により採取し、上清中の抗体を、標準プロテインＡカラムを用いて精製した。精製された抗体を、試験し、その結合および死滅活性を下記に記載のように評価した。

実施例７：抗ｈＣＤ３７抗体Ａｂ１のインビトロ細胞ベースアッセイによる評価
ＦＡＣＳ分析を実施して、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１が、ＣＤ２０およびＣＤ３７の両方を発現している細胞にどのようにうまく結合するかを試験した。実験プロセスは、実施例２で記載される。全ての試料で使用される抗体の濃度は、１０μｇ／ｍＬであった。ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２、ラージ、およびラモス細胞を使用し、これらの結果を図９、パネルＡ、Ｂ、およびＣに示す。アイソタイプ対照ｈｕＩｇＧ１抗体に比較して、抗ｈＣＤ２０抗体オビヌツズマブは、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２、ラージ、およびラモス細胞に強力に結合する。Ｇ２８．１のキメラバージョンに比較して、対照ヒト化抗ｈＣＤ３７抗体（Ｈ３７と命名、これはＧ２８．１から誘導された）は、わずかに低減した結合を示した。抗ｈＣＤ３７Ａｂ１は、これらの抗ｈＣＤ３７抗体の両方に比べて、３種全ての細胞株で、低下された結合を示した。

実施例２および「直接殺細胞作用」の定義で上記したように実施される、直接殺細胞作用アッセイを行って、架橋抗体の存在下または非存在下での抗ｈＣＤ３７Ａｂ１の直接殺細胞作用活性を評価した。全ての試料中の試験抗体濃度は、１０μｇ／ｍＬであった。アッセイを、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２およびラージ細胞を使用して実施し、これらの結果を、図１０、パネルＡおよびＢでそれぞれ示す。アイソタイプ対照ｈｕＩｇＧ１抗体に比べて、オビヌツズマブ（ＩｇＧ１抗ｈＣＤ２０抗体）は、架橋抗体の存在または非存在に関係なく、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２およびラージ細胞両方の強力な細胞死滅を示した。Ｇ２８．１のキメラバージョン（図１０でＧ２８．１と標識）は、架橋抗体の非存在下と比べて、架橋抗体の存在下で、わずかに高い細胞死滅を示した。架橋抗体の非存在下では、Ｈ３７抗体は、アイソタイプ対照抗体（ｈｕＩｇＧ１）よりも多くのＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞を死滅させなかった。しかし、架橋抗体の存在下では、Ｈ３７は、キメラＧ２８．１抗体と同等レベルでＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞を死滅させた。図１０，パネルＡ。Ｈ３７抗体は、架橋抗体の非存在下で低レベルのラージ細胞の細胞死滅を示し、架橋抗体の存在下では、わずかに多い死滅を示した。しかしながら、これらのレベルは、キメラＧ２８．１抗体のレベルより遙かに低かった。図１０、パネルＢ。抗ｈＣＤ３７Ａｂ１は、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２およびラージ細胞の両方において、架橋抗体の非存在下または存在下でキメラＧ２８．１抗体により示されるものと同等の細胞死滅を示した。従って、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１は、このアッセイでキメラＧ２８．１と同等の死滅活性を有した。

類似の実験を、細胞死滅、すなわち、芽球細胞数を抗体添加後２４時間および７２時間の両方で、架橋のある場合とない場合について評価したことを除いて、ラモス細胞で実施した。結果を図１１に示す。２４時間で、キメラＧ２８．１抗体および抗ｈＣＤ３７Ａｂ１は、架橋抗体のある場合とない場合で、強力な細胞死滅を示したが、架橋抗体は、効果を強化した。オビヌツズマブは、架橋抗体なしで、ある程度の細胞死滅を示し、Ｈ３７抗体は、架橋抗体なしでは、ほとんどまたは全く細胞死滅を示さなかった。架橋抗体は、これらの抗体の両方による直接殺細胞作用を大きく高めたが、それらは依然として、キメラＧ２８．１および抗ｈＣＤ３７Ａｂ１よりも効果が小さかった。図１１、パネルＡ。

７２時間で、いくつかの試料は、２４時間で観察されたものと類似の結果を与えたが、他の試料はそうではなかった。Ｈ３７抗体含有試料は、２４時間で観察されたものと類似の結果を与えた。しかし、オビヌツズマブ、キメラＧ２８．１および抗ｈＣＤ３７Ａｂ１は全て、極めて強力な細胞死滅を示し、もしあるにしても、架橋抗体の存在に対するわずかな依存性しかなかった。実際に、架橋抗体の存在下で試験したオビヌツズマブ含有試料は、架橋抗体の非存在下で試験した試料より少ない細胞死滅という、オビヌツズマブの極めて急速な死滅動力学に起因すると思われる結果を示した。

実施例８：カニクイザルＣＤ３７への結合を獲得するための抗ｈＣＤ３７Ａｂ１の遺伝子改変
ヒト治療抗体の開発では、異種間抗原結合は極めて好都合である。理由は、それが、非ヒト霊長類抗原に結合する完全に異なるサロゲート抗体ではなく、提案された治療抗体それ自体を用いて非ヒト霊長類で起こる毒性試験を可能にするためである。カニクイザルは、毒性試験に通常用いられる種である。Ｇ２８．１はカニクイザルＣＤ３７に結合できないことが知られている（Ｈｅｉｄｅｒｅｔａｌ．，前出、を参照）ので、我々は、カニクイザルＣＤ３７に結合し得る抗ｈＣＤ３７Ａｂ１のバリアントを見つけるために次の実験を実施した。

ヒトとカニクイザルＣＤ３７アミノ酸配列の間の差異は、下表１７で明らかなように、わずかである。

我々は、ＣＤＲ中の保存的置換が、安定性などの抗体生物物理学的特性に大きな影響を与えることなく、結合特異性および／または親和性を微調整し得ると仮定した。従って、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１のＣＤＲの置換を、実施例３に記載のように実施される部位特異的変異誘発により導入した。抗ｈＣＤ３７Ａｂ１のＶ_Ｈ中の１２個の保存的置換（Ｍ３４Ｖ、Ｍ３４Ｉ、Ｍ３４Ｌ、Ｔ５８Ｓ、Ｔ５８Ｇ、Ｎ６０Ａ、Ｋ６４Ｑ、Ｖ９６Ｉ、Ｍ９９Ｉ、Ｍ９９Ｖ、Ｍ９９Ｌ、Ｄ１０１Ｅ）を作製し、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１のＶ_Ｌ中の８個の保存的置換（Ｓ３１Ｎ、Ｆ５０Ｙ、Ｔ５３Ｓ、Ｌ５４Ｉ、Ｓ９２Ｇ、Ｓ９２Ｔ、Ｄ９３Ｅ、Ｎ９４Ｄ）も、作製した。単一置換を含むＶ_ＨまたはＶ_ＬをコードするプラスミドＤＮＡの配列を全て、ＤＮＡ配列決定法により確認した。その後、各組み合わせが異なるＶ_Ｈ／Ｖ_Ｌ対をコードする、これらのＤＮＡの９６種の組み合わせを作製し、４つの２４ウェルプレート中のＥＸＰＩ２９３（商標）細胞の一過性遺伝子導入に使用した。遺伝子導入の５日後に、プレートを、１２００ｒｐｍ、４℃で１５分間、遠心沈降して細胞をペレット化した。これらの細胞上清（ＰＢＳ中の）の１：２または１：６希釈物を、実施例２に記載のように死滅試験を実施するために、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞を含むウェルに二つ組にして加えた。結果は、１０種の抗ｈＣＤ３７Ａｂ１バリアントが、元のマウス抗ヒトＣＤ３７Ｇ２８．１抗体と同等の直接殺細胞作用活性を有し、残りのバリアントは、より低い直接殺細胞作用活性を有することを示した（データは示さず）。これらの１０種のバリアント抗体は、次の名称および改変を有した：抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１（Ｖ_Ｈ－Ｍ３４Ｖ＋Ｖ_Ｌ－Ｓ３１Ｎ）；抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ｃ１（Ｖ_Ｈ－Ｍ３４Ｖ＋Ｖ_Ｌ－Ｔ５３Ｓ）；抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ｄ１（Ｖ_Ｈ－Ｍ３４Ｖ＋Ｖ_Ｌ－Ｌ５４Ｉ）；抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ｆ３（Ｖ_Ｈ－Ｍ３４Ｌ＋Ｖ_Ｌ－Ｓ９２Ｔ）；抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ｇ３（Ｖ_Ｈ－Ｍ３４Ｌ＋Ｖ_Ｌ－Ｄ９３Ｅ）；抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ｆ７（Ｖ_Ｈ－Ｋ６４Ｑ＋Ｖ_Ｌ－Ｓ９２Ｔ）；抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ｇ７（Ｖ_Ｈ－Ｋ６４Ｑ＋Ｖ_Ｌ－Ｄ９３Ｅ）；抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ｈ７（Ｖ_Ｈ－Ｋ６４Ｑ＋Ｖ_Ｌ－Ｎ９４Ｄ）；抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ｃ１１（Ｖ_Ｈ－Ｍ９９Ｌ＋Ｖ_Ｌ－Ｔ５２Ｓ）；および抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ｄ１１（Ｖ_Ｈ－Ｍ９９Ｌ＋Ｖ_Ｌ－Ｌ５４Ｉ）。

この一次選別から得られた結果は、いくつかの置換は細胞死滅に対し、ほとんどまたは全く効果を有しないことを示唆した。しかし、このような置換は、それらがＣＤＲ中にあったために、カニクイザルＣＤ３７に対する結合に影響を与え得たかもしれない。細胞死滅を有し、かつカニクイザルＣＤ３７に対する結合能力も有する他の組み合わせを見つけるために、これらの置換の組み合わせを作製した。合計２２種の新規バリアントを、実施例３で説明したように、部位特異的変異誘発により作製した。これらのバリアント中の改変を、下表１８に示す。

上記２２種の抗ｈＣＤ３７Ａｂ１バリアントを、それらをコードするＨＣおよびＬＣプラスミドＤＮＡの２４ウェルプレート中でのＥＸＰＩ２９３（商標）細胞への同時遺伝子導入により作製した。キメラＧ２８．１抗体およびアイソタイプ対照ｈｕＩｇＧ１を、同じプレート中でＥＸＰＩ２９３（商標）細胞に、これらの抗体をコードするＤＮＡを遺伝子導入することにより作製した。細胞上清を、遺伝子導入の５日後に回収し、１ｘＰＢＳ、ｐＨ７．４中で１：２または１：６で希釈し、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２およびラモス細胞中で死滅活性について試験した。３種のバリアントＮ１２、Ｎ１８、およびＮ１９は、一貫して強力な両細胞型の直接殺作用を示した。データは示されない。しかし、上清中の抗体の正確な量は既知ではないので、これらのデータは、他のデータと直接比較可能ではなかった。

死滅活性およびカニクイザルＣＤ３７抗原への異種間結合を正確に比較するために、１３種の抗ｈＣＤ３７Ａｂ１バリアント、すなわち、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ｄ１、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ｆ３、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ｇ３、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ｆ７、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ｇ７、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ｈ７、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ｃ１１、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ｄ１１、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ｎ１２、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ｎ１８、および抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ｎ１９を、ＥＸＰＩ２９３（商標）細胞の同時遺伝子導入により３０ｍＬ規模で作製した。抗体を、プロテインＡアフィニティカラムを通して精製し、各精製抗体の濃度を、定量した。抗体を、下記の、結合カニクイザルＣＤ３７および細胞死滅アッセイのＦＡＣＳアッセイのために使用した。

ＡｌｌＣｅｌｌｓ（Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）から購入したカニクイザルＰＢＭＣ（ロット番号：ＮＨＰ－ＰＢ１７０６２１霊長類ＩＤ番号：Ｇ５１１を、１００，０００細胞／ウェルで９６ウェル丸底マイクロタイタープレートに分注した。その後ＰＢＭＣを、遠心沈降し、１ｘＰＢＳで１回洗浄し、ＦＡＣＳブロッキング緩衝液でブロックした（上記実施例２参照）。その後、ＰＢＭＣを再度、遠心沈降し、５０μｌの１ｘＰＢＳ／ウェルで再懸濁した。上記した抗ｈＣＤ３７Ａｂ１バリアントを加えた（１ｘＰＢＳ中の１００μｇ／ｍＬの濃度で、５０μｌ／ウェル）。プレートを、４℃で１時間震盪し、続いて１５００ｒｐｍで１５分間、遠心分離した。液体を、ウェルからフリックして取り出した。マウス抗ヒトＣＤ２０ＡＰＣ標識抗体（クローン２Ｈ７、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから、カタログ番号ＢＤＢ５６０９００）およびマウス抗ヒトＩｇＧＦｃ特異的ＦＩＴＣ標識抗体（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈから、カタログ番号２０９－０９５－０９８）を、両方とも１０μｇ／ｍＬで、１００μｌの１ｘＰＢＳ中で各ウェルに加えた。プレートを、室温で震盪を加えながら、３０分インキュベートし、２００μｌ／ウェルの１ｘＰＢＳで１回洗浄した。ＰＢＭＣを、１ｘＰＢＳ中の２００μｌ／ウェルの２％パラホルムアルデヒドを加えることにより、ＦＡＣＳ分析のために最終的に固定した。ＣＤ２０^＋細胞を、ＰＢＭＣ内のこの細胞サブセット中のＣＤ３７抗原結合のみを調べるために、ゲートアウトした。

図１２は、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１およびカニクイザルＣＤ３７への結合で最も大きな改善を示す５種のバリアント由来のデータを示す。試験した他のバリアントは、ほとんどまたは全く改善を示さなかった。図１２、パネルＡおよびＢに示すように、それぞれ、カニクイザルＰＢＭＣ中の６７％のＣＤ２０^＋細胞が抗ｈＣＤ３７Ａｂ１で強く染色され、および９１．７％のＣＤ２０^＋細胞が抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１で強く染色された。これらのデータは、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１が、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１に比べてカニクイザルＣＤ３７への改善された結合を有することを示す。抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ｄ１１、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ｈ７、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ｎ１２、および抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ｎ１９を含む、他のバリアントは、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１に比べてカニクイザルＣＤ３７への結合における、いくつかの事例では依然としてかなりであるが、より少ない改善を示した。

上記で特定された最良の５種のバリアント、すなわち、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ｄ１１、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ｈ７、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ｎ１２、および抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ｎ１９、ならびに、アイソタイプ対照ＩｇＧ１を、製造業者のプロトコルに従いＺｅｎｏｎ（商標）ＡｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎＨｕｍａｎＩｇＧＬａｂｅｌｉｎｇＫｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ｚ２５４５１）を用いてフルオロフォアアロフィコシアニン（ＡＰＣ）で個別に標識した。カニクイザルおよび健康なヒトドナー由来の単離ＰＢＭＣを、室温にて１５００ｒｐｍで３分間遠心分離し、ＦＡＣＳブロッキング緩衝液（ＦＡＣＳ緩衝液＋１０％ＮＧＳ＋２％ＮＲａｂＳ）中に再懸濁した。これらの洗浄ＰＢＭＣを、９６ウェル丸底マイクロタイタープレートのウェルに入れた（１ｘ１０^６細胞／ウェル）。プレートを、室温で３０分間、１５０ｒｐｍで震盪させ、続いてＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した。その後、細胞を、ペレット化し、１０μｇ／ｍＬのＦＩＴＣ標識抗ＣＤ１９抗体およびＡＰＣ標識抗ＣＤ３７ＩｇＧ１バリアント抗体を含むＦＡＣＳブロッキング緩衝液（１００μｌ／ウェル）またはアイソタイプｈｕＩｇＧ１対照抗体で染色した。抗体濃度は、８０μｇ／ｍＬ（カニクイザルＰＢＭＣの場合）または１０μｇ／ｍＬ（ヒトＰＢＭＣの場合）で開始し、１：２希釈系列でさらに希釈した。プレートを、４℃で３０分間、１５０ｒｐｍで震盪させ、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。ＰＢＭＣを、ペレット化し、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ（２００μｌ／ウェル）中で再懸濁し、本明細書の実施例２に記載のようにＦＡＣＳに供した。ＣＤ１９^＋Ｂ細胞を、ゲートアウトした後、それらのＣＤ３７結合について分析した。

バリアント抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１抗体は、上位５種の抗ｈＣＤ３７Ａｂ１バリアントの中で、最も高い異種間カニクイザルＣＤ３７結合を示した。データを、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１およびアイソタイプ対照に対してのみ図１３で示す。抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１は、ヒトＢ細胞上のヒトＣＤ３７に、４．０５ｎＭのＥＣ_５０で結合し、およびカニクイザルＢ細胞に、２５４．１ｎＭのＥＣ_５０で結合し、これは、ヒトＢ細胞のその結合に比べて、６２．７倍効力が低い。アイソタイプｈｕＩｇＧ１対照抗体は、ヒトＢ細胞またはカニクイザルＢ細胞のいずれかへのいかなる結合も示さなかった。これらの結果は、遺伝子改変抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１は、カニクイザルＣＤ３７へ結合しない元のマウスＧ２８．１抗体に比べて、弱いが、しかし改善されたカニクイザルＣＤ３７への結合を獲得したことを示した。

抗ｈＣＤ３７バリアントである、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ｄ１１、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ｈ７、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ｎ１２、および抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ｎ１９を、アイソタイプ対照ｈｕＩｇＧ１と共に、架橋抗体の非存在下で、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞（図１４、パネルＡ）およびラモス細胞（図１４、パネルＢ）の直接殺細胞作用に関し試験した。実験手順を、実施例２で記載する。各バリアントのＥＣ_５０値を、下表１９に記載する。

バリアントの中で、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１は、カニクイザルＣＤ３７への最も高い異種間結合およびＷＳＵ－ＤＬＣＬ２およびラモス細胞の最も高い死滅効力を示した。従って、これを、さらなる試験の最上位候補として選択した。バリアント抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ｎ１２は、異種間結合および死滅効力の観点から第二位であり、従って、これを予備候補分子として選択した。抗ＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１Ｖ_Ｌのアミノ酸配列およびそれをコードするヌクレオチド配列を、配列番号６１および６０にそれぞれ示す。抗ＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１Ｖ_Ｈのアミノ酸配列およびそれをコードするヌクレオチド配列を、配列番号６５および６４にそれぞれ示す。抗ＣＤ３７Ａｂ１．Ｎ１２Ｖ_Ｌのアミノ酸配列およびそれをコードするヌクレオチド配列を、配列番号７３および７２にそれぞれ示す。抗ＣＤ３７Ａｂ１．Ｎ１２Ｖ_Ｈのアミノ酸配列およびそれをコードするヌクレオチド配列を、配列番号７７および７６にそれぞれ示す。

実施例９：カニクイザルＣＤ２０への結合についての抗ｈＣＤ２０Ａｂ１の試験
Ｉ型抗ｈＣＤ２０抗体リツキシマブおよびＩＩ型抗ｈＣＤ２０抗体ＧＡ１０１（オビヌツズマブ）は、ＣＤ２０上の重なり合うエピトープを結合し、ＧＡ１０１エピトープは、リツキシマブエピトープに対しＣ末端側にわずかにシフトしている。Ｎｉｅｄｅｒｆｅｌｌｎｅｒｅｔａｌ．，前出。両エピトープは、ヒトＣＤ２０の残基１７０～１７２を含むが、ＧＡ１０１エピトープは、これらのアミノ酸から、リツキシマブエピトープよりもさらに下流に延びる。トシツモマブは、ＧＡ１０１により結合されるエピトープに類似のエピトープに結合する。Ｋｌｅｉｎｅｔａｌ．，ＥｐｉｔｏｐｅｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓｏｆｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｔａｒｇｅｔｉｎｇＣＤ２０ａｎｄｔｈｅｉｒｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｔｏｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，２０１３，ｍＡｂｓ５：２２－３３。下記（表２０）のアライメントに示されるように、ＣＤ２０のループ２中の^１７０Ａｌａ～^１８８Ｓｅｒの配列は、ヒトおよびカニクイザルＣＤ２０中で同一である。従って、抗ｈＣＤ２０抗体トシツモマブ、ならびにその誘導体は、カニクイザルＣＤ２０に結合するはずである。

ヒトおよびカニクイザル由来のＰＢＭＣを、実施例８に記載のようにＦＡＣＳで分析して、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２が５０μｇ／ｍＬおよび１０μｇ／ｍＬでＣＤ１９^＋Ｂ細胞に結合し得るかどうかを試験した。５０μｇ／ｍＬでは、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２は、１８．７％のヒトＣＤ１９^＋Ｂ細胞（ＭＦＩ＝８１７；図１５、パネルＡの点線）において、および５．５３％のカニクイザルＣＤ１９^＋Ｂ細胞（ＭＦＩ＝１２８５；図１５、パネルＡの実線）において、強力な結合を示した。１０μｇ／ｍＬでは、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２は、１８．９％のヒトＣＤ１９^＋Ｂ細胞（ＭＦＩ＝７６８；図１５、パネルＢの点線）において、および３．６２％のカニクイザルＣＤ１９^＋Ｂ細胞（ＭＦＩ＝１１４２；図１５、パネルＢ）において、強力な結合を示した。これらの結果は、Ｂ細胞がヒト血液中よりもカニクイザル血液中で遙かに少ない存在量であるという事実と相関し得る。これらの結果は、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２は、ヒトＣＤ２０に結合するほど強力ではないが、カニクイザルＣＤ２０に結合できることを示す。

実施例１０：抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２および抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１ＩｇＧ抗体に対する細胞結合およびＡＤＣＣアッセイ
ＣＤ２０およびＣＤ３７は、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（Ｂ－ＮＨＬ）および慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）における最も悪性のＢ細胞上で共発現されるので（例えば、ＤｅｃｋｅｒｔＪ．ｅｔａｌ．，Ａｎｏｖｅｌａｎｔｉ－ＣＤ３７ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇｃｏｎｊｕｇａｔｅｗｉｔｈｍｕｌｔｉｐｌｅａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｆｏｒｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆＢ－ｃｅｌｌｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ，２０１３，Ｂｌｏｏｄ１２２：３５００－３５１０）、Ｂ－ＮＨＬまたはＣＬＬ、または少なくとも部分的にＢ細胞により媒介される他の疾患の患者の治療のために、ＣＤ２０およびＣＤ３７の両方を標的化することが望ましい場合がある。このような併用療法は、治療効力を高める、および／または薬剤耐性の発生を減らす可能性がある。２種の異なる抗体を単一宿主細胞株中で作製する技術（米国特許出願公開第２０１９／０２４８８９９号を参照）は、２種の異なる抗体を含む治療のコストを低減し得る。疾患細胞に対する効果のための抗ＣＤ２０および抗ＣＤ３７抗体の組み合わせ試験の前に、個別の抗体を、ラージ細胞に対する結合、および種々の他のアッセイにおける活性について試験した。

具体的には、オビヌツズマブ（ガザイバ（登録商標））、リツキシマブ（リツキサン（登録商標））、およびアイソタイプ対照ｈｕＩｇＧ１に加えて、上記の遺伝子改変抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２を、実施例２に記載の方法を用いてラージ細胞への結合について試験した。最高投与量でのアイソタイプ対照ｈｕＩｇＧ１は、結合を示さなかったが、一方でリツキシマブは、ＥＣ_５０＝１８．２１ｎＭで強力な結合を示した（最高投与量でＧｅｏＭＦＩ≒２５０）。オビヌツズマブもまた、ＥＣ_５０＝９．８４６ｎＭで強力な結合を示した（最高投与量でＧｅｏＭＦＩ≒１５０）。遺伝子改変抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２は、ＥＣ_５０＝２６．２７ｎＭで強力な結合を示し（最高投与量でＧｅｏＭＦＩ≒２００）、この抗体が細胞表面上のＣＤ２０分子に良好に結合することを示した。図１６、パネルＡ。

さらなる実験では、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２および抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１を、本明細書の実施例５で記載のように、ラージ細胞中で実施されるＡＤＣＣアッセイでそれらのの活性について試験した。図１６、パネルＢに示すように、アイソタイプ対照ｈｕＩｇＧ１は、ＡＤＣＣを媒介せず、一方で抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２は、強力な活性を有し（ＥＣ_５０＝０．００８１９５ｎＭ）、これは、おそらく、ＡＤＣＣ強化のためのＳ２３９ＤおよびＳ２９８Ａの置換がこの抗体に組み込まれたためであろう。抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１は、中等度の活性（ＥＣ_５０＝６．０４５ｎＭ）を有した。

実施例１１：抗ｈＣＤ２０および抗ｈＣＤ３７ＭａｂＰａｉｒカクテルの生成
次の実験は、どの非同族ＨＣ／ＬＣ対が、その中に抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２および抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１抗体由来の非同族ＨＣ／ＬＣ対をコードするＤＮＡが導入されている遺伝子導入細胞中で、容易に形成したかを決定するために実施された。抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２および抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１のＬＣおよびＨＣをコードするプラスミドＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）Ｍｉｄｉ－プレップキット（ＱｉａｇｅｎＮ．Ｖ．，ｔｈｅＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いて個別に精製した。得られたＤＮＡを、水中で希釈し、ＥＰＰＥＮＤＯＲＦＴＵＢＥＳ（登録商標））中で混合した。一連の４個のチューブの混合ＤＮＡを、ＥＸＰＩ２９３（商標）細胞中に一過的に遺伝子導入して、非同族ＨＣ／ＬＣが発生するかどうかを評価した。チューブ１は、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２抗体ＨＣ（ＨＣ１）およびその同族ＬＣ（ＬＣ１）をコードするＤＮＡを含んだ。チューブ２は、ＨＣ１および抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１ＬＣ（ＬＣ２）からなる非同族ＨＣ／ＬＣ対をコードするＤＮＡを含んだ。チューブ３は、ＬＣ１および抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１ＨＣ（ＨＣ２）からなる非同族ＨＣ／ＬＣ対をコードするＤＮＡを含んだ。チューブ４は、ＨＣ２およびＬＣ２をコードするＤＮＡを含んだ。抗Ｈｅｒ２トラスツズマブＨＣおよびＬＣをコードするＤＮＡを含む追加のチューブ５を、遺伝子導入効率を評価するために並行して遺伝子導入した。
より詳細には、ＥＸＰＩ２９３（商標）細胞に、２４ウェルディープウェルブロックでリポフェクタミン（登録商標）２０００を用いて、試験抗体をコードするプラスミドＤＮＡを二通りに遺伝子導入した。細胞を、３７℃で５日間、１５０ｒｐｍで連続的に振盪した。上清を、１５００ｒｐｍで２０分間、細胞を遠心沈降することにより採取した。全ての試料（これらの全ては還元されなかった）について、５マイクロリットル（μｌ）の上清および５μｌの２ｘレムリ試料緩衝液（６５．８ｍＭトリス塩酸、ｐＨ６．８、２．１％ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、２６．３％（ｗ／ｖ）グリセロール、０．０１％ブロモフェノールブルー）を、７０℃で１０分間加熱した。処理試料を、４～１５％Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ（商標）ＴＧＸＳｔａｉｎ－Ｆｒｅｅ（商標）ＰｒｅｃａｓｔＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（Ｂｉｏ－ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ、カタログ番号５６７－８０８５）にロードした。電気泳動を、２００Ｖで４５分間実施した。タンパク質を、Ｔｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ（登録商標）Ｔｕｒｂｏ（商標）ＴｒａｎｓｆｅｒＳｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いてニトロセルロース膜に転写し、０．０５％ツイーン（登録商標）２０（ＰＢＳＴ）を含む１ｘＰＢＳ中の３％脱脂乳中でブロックした。ニトロセルロース膜を洗浄し、抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識（ＨＲＰ標識）ポリクローナルヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）（Ｓｉｇｍａ－ＡｌｄｒｉｃｈＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ、カタログ番号Ａ０１７０）で検出した。画像を、Ｂｉｏ－ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．のＣｈｅｍｉＤｏｃ（商標）ＸＲＳ＋撮像装置で可視化した。

結果を、図１７に示す。１、２、３、４、および５の標識の試料は、１’、２’、３’、４’および５’の標識の重複試料である。抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２（レーン１および１’）および抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１（レーン４および４’）抗体は、十分に発現されるが、これらの発現は、抗Ｈｅｒ２抗体トラスツズマブの発現よりわずかに低い（レーン５および５’）。抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２の同族ＨＣ１／ＬＣ１対から得られた抗体（レーン１および１’）は、ＨＣ１（抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２から）およびＬＣ２（抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１から）の非同族対から得られた抗体とほぼ同じレベルで発現された。図１７、レーン１および１’を、レーン２および２’と比較されたい。これは、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２のＨＣ１は、それ自体のＬＣ１または抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１からの非同族ＬＣ２と同様に良好に発現できることを示唆する。興味深いことに、ＬＣ１（抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２からの）と抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１からのＨＣ２の非同族の対は、同族ＨＣ２／ＬＣ２対よりも遙かに低いレベルで発現される。図１７、レーン３および３’を、レーン４および４’と比較されたい。これらのデータは、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１のＨＣ２は発現のために、非同族ＬＣ１と比べて、それ自体のＬＣ２を好むことを示唆する。従って、同じ宿主細胞中で発現される場合同族ＨＣ／ＬＣ対のみを発現するようにこれらの特定の抗体を改変することにおいて対処するべき主要な課題は、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２由来のＨＣ１と抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１由来のＬＣ２の誤対合である。

次の実験では、抗体を、同族ＨＣ／ＬＣ対を強化し、非同族ＨＣ／ＬＣ対を弱め、およびＨＣ／ＨＣヘテロダイマーを弱めるように改変した。米国特許出願公開第２０１９／０２４８８９９号（参照により本明細書に組み込まれる）の実施例２および３に記載のように、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２および抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１（＋予備としての抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ｎ１２）ＭａｂＰａｉｒ抗体の改変バージョンを、以下のように作成する。置換Ｄ３９９ＲおよびＫ４０９Ｅを、ＩＤＴにより合成された２種のｇＢｌｏｃｋｓ（登録商標）を使用して、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２のＨＣをコードするＤＮＡ中に適切な変異を導入することにより、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２のＣ_Ｈ３領域に導入し、続いてギブソン反応により２種のｇＢｌｏｃｋｓを、完全長ＨＣをコードするＤＮＡ中にアセンブルした。この改変バージョンの抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２ＨＣを、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１ＨＣと呼んだ。配列番号４４および４３は、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１ＨＣおよびそれをコードする核酸配列のアミノ酸配列を、それぞれ示す。置換Ｋ１４７Ｄ、Ｆ１７０Ｃ、Ｖ１７３Ｃ、Ｃ２２０Ｇ、およびＫ４０９Ｒを、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２ＨＣを改変するための上記方法により、これらのＨＣをコードするＤＮＡ中に適切な変異を導入することにより、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１および抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ｎ１２のＨＣ中に導入した。これらのＨＣを、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１．１ＨＣおよび抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ｎ１２．１ＨＣと呼んだ。配列番号７１および７０は、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１．１ＨＣのアミノ酸配列およびそれをコードする核酸配列を、それぞれ示す。配列番号８３および８２は、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ｎ１２．１ＨＣのアミノ酸配列およびそれをコードする核酸配列を、それぞれ示す。置換Ｓ１３１Ｋ、Ｑ１６０Ｃ、Ｓ１６２Ｃ、Ｃ２１４Ｓを、上記方法により、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１および抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ｎ１２のＬＣ中に導入した。これらのバリアントを、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１．１ＬＣおよび抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ｎ１２．１ＬＣと命名した。配列番号６９および６８は、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１．１ＬＣのアミノ酸配列およびそれをコードする核酸配列を、それぞれ示す。配列番号８１および８０は、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ｎ１２．１ＬＣおよび核酸配列それをコードする核酸配列を、それぞれ示す。

１個の抗体または２個の異なる抗体から構成されるＨＣおよびＬＣをコードするプラスミドＤＮＡを、一連のＥＰＰＥＮＤＯＲＦＴＵＢＥ（登録商標）試験チューブ中に入れた。チューブは、次の抗体をコードするＤＮＡを含んだ：（１）トラスツズマブ（遺伝子導入効率を監視するために対照として使用される抗ＨＥＲ２抗体）；（２）抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１；（３）抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１．１；（４）抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ｎ１２．１；（５）抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１および抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１．１；ならびに（６）抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１および抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ｎ１２．１。混合プラスミドＤＮＡを用いて、３０ｍＬのＥＸＰＩＣＨＯ（商標）細胞に遺伝子導入した。遺伝子導入ＥＸＰＩＣＨＯ（商標）細胞を含むフラスコを、１０％ＣＯ_２にて３７℃で１２日間震盪した。抗体を、培養上清から回収し、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーにより精製した。

実施例１２：抗ｈＣＤ２０および抗ｈＣＤ３７抗体を含むＭａｂＰａｉｒのキャラクタリゼーション
直前に記載の抗体配合物のサイズを大まかに測定するために、精製された抗体配合物を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルによる電気泳動に供した。各試料は、１００ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）の非存在下（非還元試料の場合）またはＤＴＴの存在下（還元試料の場合）で、１０μｌの２ｘレムリ試料緩衝液（６５．８ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ６．８、２．１％のラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、２６．３％（ｗ／ｖ）グリセロール、０．０１％ブロモフェノールブルー）を含む総体積２０μｌ中のそれぞれ２μｇの抗体を含んだ。還元した試料を、７０℃で１０分間加熱した。次に、試料を、４～１５％Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ（商標）ＴＧＸＳｔａｉｎ－Ｆｒｅｅ（商標）ＰｒｅｃａｓｔＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（Ｂｉｏ－ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ、カタログ番号５６７－８０８５）にロードした。電気泳動を、２００Ｖで４５分間実施した。画像を、光活性化後にＢｉｏ－ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．のＣｈｅｍｉＤｏｃ（商標）ＸＲＳ＋撮像装置で可視化した。

図１８Ａに示すように、モノクローナル抗体トラスツズマブ（レーン１）、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１（レーン２）、および抗ｈＣＤ３７ＩｇＧ１Ａｂ１．Ａ１．１（レーン３）は、非還元状態下で１５０ＫＤａ付近に移動した。抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１由来のＨＣ１およびＬＣ１および抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１．１由来のＨＣ２およびＬＣ２をコードするプラスミドＤＮＡを用いて細胞に遺伝子導入した場合、約１５０ＫＤａ（レーン４）の２つのバンドが、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上に観察された。下側バンドは、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１と同じ位置に移動し、上側バンドは、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１．１と同じ位置に移動し、２つのみの異なる抗体、すなわち、抗ｈＣＤ２０および抗ｈＣＤ３７抗体（ＭａｂＰａｉｒ）が、４種の異なるプラスミドＤＮＡの共遺伝子導入により哺乳動物細胞から産生されたことを示唆する。還元条件下では（図１８、パネルＢ）、約５０ＫＤａのサイズのＨＣバンドおよび２５ＫＤａのサイズのＬＣバンドが、トラスツズマブ（レーン１’）、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１（レーン２’）、および抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１．１（レーン３’）について観察され、一方で２つのＨＣバンドおよび２つのＬＣバンドが、抗ｈＣＤ２０および抗ｈＣＤ３７ＭａｂＰａｉｒ（レーン４’）について観察された。図１８、パネルＢのレーン４’中の下側ＨＣバンドおよび上側ＬＣバンドは、レーン２’中の抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１単独のものと同様に移動し、上側ＨＣバンドおよび下側ＬＣバンド（レーン４’）は、レーン３’中の抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１．１単独のものと同様に移動した。これらの結果は、異なるＨＣおよびＬＣを含む少なくとも２種の異なるＩｇＧ抗体が、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１．１および抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１をコードするＤＮＡを含む宿主細胞中で産生されることを示す。さらに、これらのデータは、２種のＨＣおよび２種のＬＣバンドのみが観察されたので、２種の異なる抗体のみが、これらの宿主細胞中で産生されることを示唆する。類似の観察が、抗ｈＣＤ２０ＩｇＧ１Ａｂ１．２．２．１および抗ｈＣＤ３７ＩｇＧ１Ａｂ１．Ｎ１２．１をコードするＤＮＡを含む宿主細胞から回収された抗体についてもなされた。図１８、パネルＣおよびＤを参照されたい。

これらの抗体のサイズをより正確に測定するために、図１８で分析された抗体を、低ｐＨカチオン交換（ＣＥＸ）分析に供した。この技術は、米国特許出願公開第２０１９／０２４８８９９号、ページ９２、行９～３０および図１７に記載される。この特許文献は、参照により本明細書に組み込まれる。この方法は、Ｃｈｅｎｅｔａｌ．，Ｔｈｅｕｓｅｏｆｎａｔｉｖｅｃａｔｉｏｎ－ｅｘｃｈａｎｇｅｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｔｏｓｔｕｄｙａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎａｎｄｓｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，２０１０，ＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉｅｎｃｅ，１９：１１９１－１２０４にも記載される。この文献は、その全体が本明細書に組み込まれる。手短に説明すると、ＷａｔｅｒｓＡｌｌｉａｎｃｅ２６９５高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システムを用いる、前段に５０ｍｍのガードカラム（ＰｒｏＰａｃ（商標）ＷＣＸ－１０Ｇ）を備えたＴｈｅｒｍｏＰｒｏＰａｃ（商標）ＷＣＸ－１０弱ＣＥＸカラム、４ｘ２５０ｍｍを、使用する。クロマトグラフィーを、３０分間にわたる１００％緩衝液Ａ（２０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．２）から１００％緩衝液Ｂ（２５０ｍＭの塩化ナトリウムを加えた２０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．２）までの直線勾配で実行した。カラムを、高塩（１Ｍの塩化ナトリウム）で洗浄し、緩衝液Ａの開始条件に再平衡化した。抗体を、２１４ｎｍの吸光度によりカラム流出物中で検出した。検出ピークの相対量を、ＥＭＰＯＷＥＲ（商標）ソフトウェア（ＷａｔｅｒｓＣｏｒｐ．，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて決定した。低ｐＨＣＥＸは、異なる完全長抗体種を識別でき、混合物中の特定の抗体種の相対量を定量するために使用できる。図１９、パネルＡおよびＢに示すように、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１および抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１．１または抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ｎ１２．１のいずれかをコードするＤＮＡを含む宿主細胞により産生された抗体の低ｐＨＣＥＸ分析は、２種の十分に分解された主要バンドを示す。２種のピークのそれぞれの中の抗体の特定は、個別の抗体を並行してロードしてカラムを実行することにより決定された。データは示されない。曲線下面積（ＡＵＣ）を計算することにより、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１および抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１．１をコードするＤＮＡを含む宿主細胞は、４３％の抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１および５７％の抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１．１を産生し、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１および抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ｎ１２．１をコードするＤＮＡを含む宿主細胞は、４９％の抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１および５１％の抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ｎ１２．１を産生したことが明らかになった。図１９、パネルＡおよびＢ。従って、これらの実験は、２種の異なる主要抗体種が、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１および抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１．１または抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ｎ１２．１をコードするＤＮＡを含む宿主細胞により産生されたことを示す。

質量分析を実施して、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１および抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１．１または抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ｎ１２．１をコードするＤＮＡを含む宿主細胞により産生された抗体が、同族ＨＣ／ＬＣ対およびホモダイマーＨＣ／ＨＣ対形成を有したかどうかを決定した。使用した質量分析法は、Ｔｈｏｍｐｓｏｎｅｔａｌ．，ＣｏｍｐｌｅｘｍｉｘｔｕｒｅｓｏｆａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｇｅｎｅｒａｔｅｄｆｒｏｍａｓｉｎｇｌｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅｌｙａｎｄｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｌｙｅｖａｌｕａｔｅｄｂｙｎａｔｉｖｅＯｒｂｉｔｒａｐｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，２０１４，ｍＡｂｓ６（１）：１９７－２０３（この文献は、その全体が本明細書に組み込まれる）により、および米国特許出願公開第２０１９／０２４８８９９号、ページ９２、行３１～ページ９４、行１０および図１８に記載される。この米国特許出願公開第２０１９／０２４８８９９号の部分は、参照により本明細書に組み込まれる。質量分析による分析の前に、抗体配合物を、ペプチドＮ－グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅＦ）で脱グリコシル化した。抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１および抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１．１または抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ｎ１２．１をコードするＤＮＡを含む細胞中で形成される可能性のある全ての脱グリコシル化抗体種の理論的サイズを、下表２１に示す。

図２０、パネルＡは、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１および抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１．１をコードするＤＮＡを含む宿主細胞により産生された脱グリコシル化抗体由来のデータを示す。図に示すように、検出された主ピークの実質量は、１４５４７４．６８ダルトン（Ｄａ）および１４４４２１．８１Ｄａであり、これは、それぞれ、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１の理論的質量（１４５４７３．３６）から、わずかに９百万分率（ｐｐｍ）であり、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１．１の理論的質量（１４４４２０．１８）からわずかに１１ｐｐｍである。図２０、パネルＢは、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１および抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ｎ１２．１をコードするＤＮＡを含む宿主細胞により産生された脱グリコシル化抗体由来のデータを示す。検出された実質量は、１４５４７６．１８Ｄａ、および１４４４００．２６Ｄａであり、これは、それぞれ、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１の部分は理論的サイズ（１４５４７３．３６）から、わずかに１９（ｐｐｍ）であり、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ｎ１２．１の理論的サイズ（１４４３９４．１８）からわずかに４２ｐｐｍである。全ての理論的サイズからのサイズの変化は１００ｐｐｍ未満であるので、これらの実験的に決定した質量は、観察された主ピークが同族ＨＣ／ＬＣ対およびホモダイマーＨＣ／ＨＣ対形成を有する抗体からのみ得られたことを示す。従って、これらの配合物中の抗体の唯一の主要種は、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１および抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１．１または抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ｎ１２．１であった。

図２０の両パネルの２種の大きなピーク間に、１つの極めて小さいピークが、図２０、パネルＡの１４５，０７５．３５Ｄａ、および図２０、パネルＢの１４５，０５８．９０Ｄａで観察された。これらのピークは、ＬＣ２／ＨＣ１／ＨＣ２／ＬＣ２を含む誤対合抗体の予測質量（パネルＡの１１４５０６４．００Ｄａおよび図２０、パネルＢの１４５０２３．９２Ｄａ）に極めて近接していた。従って、上記の抗ＣＤ２０および抗ＣＤ３７抗体混合物を、高速液体クロマトグラフ－質量分析（ＨＰＬＣ－ＭＳ）によりさらに分析してこの成分を特定した。

この分析を行うために、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１および抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１．１または抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ｎ１２．１をコードするＤＮＡを含む宿主細胞から精製された２０μｇの抗体配合物を、２０μｌの５０ｍＭトリスｐＨ７．５中で、１μｌのＰＮＧａｓｅＦエンドペプチダーゼ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓ）と３７℃で１６時間インキュベートした。ＰＮＧａｓｅＦによる脱グリコシル化後に、試料の半分を、３０分間５０ｍＭのＤＴＴとの、４Ｍの塩酸グアニジンを含む、５０ｍＭトリスｐＨ８．０緩衝液中の５５℃でのインキュベーションにより還元した。還元された試料のＨＰＬＣ－ＭＳ分析を、ＥＳＩ源を備えＡｇｉｌｅｎｔ１２００ＨＰＬＣに連結されたＡｇｉｌｅｎｔ６２２４精密質量ＴＯＦ質量分析計を用いて実施した。ＡｇｉｌｅｎｔＰｕｒｓｕｉｔＤｉｐｈｅｎｙｌカラム（２．０ｘ１５０ｍｍ、３μｍ）を、カラム温度８０℃および流速０．４μl／分で用いた。移動相Ａは、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）含有水からなり、移動相Ｂは、０．９％ＴＦＡを加えたイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）：アセトニトリル（ＡＣＮ）：水（７０：３０：１０）からなる。移動相Ｂを１０％で最初に保持した後、５分間かけて３２％Ｂに増加させ、その後、３５分かけて４２％に高めた。溶媒をその後、９０％Ｂに変更し、４分間保持してカラムを洗浄した。最終的に、溶媒を、１０％Ｂに戻し、カラムの再平衡化のために４分間保持した。ＭＳ装置パラメーターは次の通りであった：乾燥ガス温度、乾燥ガス流および噴霧器を、それぞれ、３００℃、１２Ｌ／分および４０ｐｓｉｇに設定した。毛細管、フラグメンター、スキマー１およびＯｃｔＲＦＶｐｐをそれぞれ、４５００Ｖ、２５０Ｖ、６０Ｖおよび７５０Ｖに設定した。装置を、４ＧＨｚ高解像度で、１００～３０００のｍ／ｚの範囲で較正した。ＨＰＬＣ－ＭＳからのデータを、ＡｇｉｌｅｎｔＭａｓｓＨｕｎｔｅｒＱｕａｌｉｔａｔｉｖｅおよびＢｉｏＣｏｎｆｉｒｍソフトウェアを用いて解析した。

図２１、パネルＡは、４つの十分に分離された鎖を示すカラムのＵＶクロマトグラムを示す。抗ＣＤ３７ＨＣおよびＬＣピーク間の矢印により示される領域は、それがベースラインより高いために、ＭＳにより解析された。ＭＳ解析は、この領域が、４８９４９．６３Ｄａ、４９１１２．２２Ｄａ、４９４０３．９２Ｄａおよび４９６９４．６１Ｄａの質量を有する複数の種を含み、これらは、それぞれ、主要種の抗ＣＤ３７ＨＣ種より２０２．７６Ｄａ、３６５．３５Ｄａ、６５７．０５Ｄａおよび９４７．７４Ｄａ大きい。図２１、パネルＢおよびＣを参照。これらの４つのピークの質量増加は、それぞれ、セリンまたはトレオニン残基の、ｎ－アセチル－Ｄ－ヘキソサミン（ＨｅｘＮＡｃ）、ｎ－アセチル－Ｄ－ヘキソサミンに添加されたヘキソース（ＨｅｘＨｅｘＮＡｃ）、ｎ－アセチル－Ｄ－ヘキソサミンに添加されたヘキソースに添加されたｎ－アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＡｃＨｅｘＨｅｘＮＡｃ）またはＮｅｕＡｃ２ＨｅｘＨｅｘＮＡｃによる改変から予測される質量増加に正確に一致する。ＮｅｕＡｃＨｅｘＨｅｘＮＡｃにより改変された抗ＣＤ３７重鎖は、改変種中で最も豊富であった。これらの改変は、共通のムチン型Ｏ－グリコシル化コア－１グリカンプロファイルである。例えば、ＴｒａｎａｎｄＴｅｎＨａｇｅｎ，Ｍｕｃｉｎ－ｔｙｐｅＯ－ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎｄｕｒｉｎｇｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０１３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８８（１０）：６９２１－６９２９を参照されたい。従って、これらのデータは、図２０、パネルＡ中の１４５，０７５．３５Ｄａおよび図２０、パネルＢ中の１４５，０５８．９０Ｄａ近辺の小さいピークが、抗ＣＤ３７ＨＣのＯ－グリコシル化種であることを示唆する。従って、ＭＳは、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１および抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１．１をコードするＤＮＡを遺伝子導入した宿主細胞由来の抗体配合物中の抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１および抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１．１以外のかなり量のいずれの抗体種も検出しなかった。

この抗体混合物を還元し、その後さらなるＨＰＬＣ－ＭＳ分析に供して、個別の重鎖および軽鎖を明確に特定した。検出された第１のピークは、２３３７８．２２Ｄａの質量を有し、これは、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１ＬＣの理論的に決定された質量（２３３７７．９７Ｄａ）と１１ｐｐｍの誤差で一致する。図２２、パネルＡ。検出された第２のピークは、２３４９５．３２Ｄａの質量を有し、これは、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１．１ＬＣの理論的に決定された質量（２３４９５．１５Ｄａ）と７ｐｐｍの誤差で一致する。図２２、パネルＢ。検出された第３のピークは、４８７３２．９４Ｄａの質量を有し、これは、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１．１ＨＣの理論的に決定された質量（４８７３２．９９Ｄａ）と１ｐｐｍの誤差で一致する。図２２、パネルＤ。検出された第４のピークは、４９３７４．４４Ｄａの質量を有し、これは、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１ＨＣの理論的に決定された質量（４９３７４．７１Ｄａ）と５ｐｐｍの誤差で一致する。図２２、パネルＣ。これらの結果は、この抗体混合物中の抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１および抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１．１由来のＬＣおよびＨＣの存在を明確に示す。

同様に、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１および抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ｎ１２．１をコードするＤＮＡを含む宿主細胞から回収された抗体混合物を、脱グリコシル化し、還元し、ＨＰＬＣ－ＭＳ分析に供して、この混合物中のＨＣおよびＬＣを明確に特定した。この混合物中で検出されたピークの１つは、２３３７８．２４Ｄａの質量を有し、これは、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１ＬＣの理論的に決定された質量（２３３７７．９７Ｄａ）と１１ｐｐｍの誤差で一致する。図２３、パネルＡ。検出された別のピークは、４９３７４．４７Ｄａの質量を有し、これは、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１ＨＣの理論的に決定された質量（４９３７４．７１Ｄａ）と５ｐｐｍの誤差で一致する。図２３、パネルＣ。検出された第３のピークは、２３４６８．３４Ｄａの質量を有し、これは、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ｎ１２．１ＬＣの理論的に決定された質量（２３４６８．１２Ｄａ）と９ｐｐｍの誤差で一致する。図２３、パネルＢ。検出された第４のピークは、４８７４６．７０Ｄａの質量を有し、これは、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ｎ１２．１ＨＣの理論的に決定された質量（４８７４６．９７Ｄａ）と５ｐｐｍの誤差で一致する。図２３、パネルＤ。これらの結果は、このＭａｂＰａｉｒ混合物中の抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１および抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ｎ１２．１抗体のＬＣおよびＨＣの存在を明確に示した。

抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１および抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１をコードするＤＮＡを含む細胞由来の抗体混合物を、ＩｇＧ分解酵素の化膿性連鎖球菌（ＩｄｅＳプロテアーゼ；Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｖ７５１１、これは、ヒンジ領域以降の単一部位でＩｇＧ抗体を切断し、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントおよびＣ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３ドメインを含むフラグメントを生じる）、続いて、２－メルカプトエチルアミン（２－ＭＥＡ）およびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）の存在下で部分還元した。２－ＭＥＡおよびＥＤＴＡによる処理は、ＨＣ／ＬＣジスルフィド架橋に実質的に影響を与えることなく、ヒンジ領域ジスルフィド架橋を還元する。従って、この処理は、Ｆａｂ’フラグメントおよびＣ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３ドメインを含むフラグメントを産生し、おそらく、少量のＦｄフラグメント（Ｖ_ＨおよびＣ_Ｈ１を含む）が付随することが予測され得る。

下表２２は、同族および非同族対を含む、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１および抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１．１を含む抗体混合物からの４種の可能なＦｄ／ＬＣ対形成から生じたＦａｂ’フラグメントの計算質量を示す。

抗体のＩｄｅＳプロテアーゼ消化および２－ＭＥＡ＋ＥＤＴＡ処理対のＭＳによる分析は、４８，４１３．２５および４８，９１３．９０Ｄａにピークを生じ、これは、それぞれ、計算されたＦｄ２／ＬＣ２質量およびＦｄ１／ＬＣ１Ｆａｂ質量と２２ｐｐｍおよび２４ｐｐｍの誤差で一致した。図２４、パネルＡ。他のピークは、非同族のＦｄ／ＬＣ対を有するＦａｂ’フラグメントの計算質量を含む、Ｆａｂ’フラグメントの計算質量の周辺のサイズ範囲中では観察されなかった。従って、これらのデータは、両方の観察されたＨＣ／ＬＣ対が同族対であったことを示した。

下表２３は、同族および非同族対を含む、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１および抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ｎ１２．１を含む抗体混合物からの４種の可能なＦｄ／ＬＣ対形成から生じたＦａｂフラグメントの計算質量を示す。

ＭＳによる、抗体のＩｄｅＳプロテアーゼ消化および２－ＭＥＡ＋ＥＤＴＡ処理された対の分析は、４８，４００．１１および４８，９１３．８４Ｄａにピークを生じ、これは、それぞれ、計算されたＦｄ２／ＬＣ２Ｆａｂ質量およびＦｄ１／ＬＣ１Ｆａｂ質量と１９ｐｐｍおよび２３ｐｐｍの誤差で一致した。図２４、パネルＢ。他の主要なピークは、非同族のＦｄ／ＬＣ対を有するＦａｂ’フラグメントの計算質量を含む、Ｆａｂフラグメントの計算質量の周辺のサイズ範囲中では観察されなかった。従って、これらのデータは、両方の観察されたＨＣ／ＬＣ対が同族対であったことを示した。

まとめると、ＭＳ分析の結果は、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１および抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１．１またはＡｂ１．Ｎ１２．１を含む単一宿主細胞株由来の抗体混合物のＨＣおよびＬＣは、ほとんど同族ＨＣ／ＬＣ対形成のみを有し、ヘテロダイマー対形成またはＨＣはほとんどまたは全くなかった。

実施例１３：抗ｈＣＤ２０および抗ｈＣＤ３７抗体の結合特異性
以下に記載の実験は、本明細書で記載の抗ｈＣＤ２０および抗ｈＣＤ３７抗体がｈＣＤ２０およびｈＣＤ３７にそれぞれ特異的に結合することを確認するために設計された。

ＣＨＯ細胞に、ｈＣＤ２０、およびｈＣＤ３７を別々に、遺伝子導入した。１種はｈＣＤ２０を安定に発現しており（ＣＤ２０／ＣＨＯ）およびもう一方はｈＣＤ３７を安定に発現している（ＣＤ３７／ＣＨＯ）２種の細胞株を、これらの形質移入体から誘導した。抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１．１、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１および抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１．１を含むＭａｂＰａｉｒ（表２４では「ＭａｂＰａｉｒ」と呼ばれる）、アイソタイプ対照抗体（表２４ではｈｕＩｇＧ１を呼ばれる）を、約０．０００２ｎＭ～約３０ｎＭの範囲の種々の抗体濃度でこれらの細胞株のそれぞれへの結合について、試験した。実施例２で基本的に記載のＦＡＣＳベース検出システムを用いて、これらの細胞株への抗体の結合を検出した。方法は、次のように実施例２で用いたものと異なった。使用した細胞株は、ラージ細胞細胞ではなく、上で説明されたＣＤ２０／ＣＨＯおよびＣＤ３７／ＣＨＯであった。細胞を、洗浄のために、１５００ｒｐｍで３分間ではなく、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。洗浄後に、細胞および一次抗体を一緒に、１００μＬではなく、５０μＬの体積でインキュベートした。一次抗体を、全ての抗体に対し５μｇ／ｍＬの濃度ではなく、種々の濃度で添加して、用量／反応曲線を生成した。それぞれの抗体の各濃度について記録されたＧｅｏＭＦＩ値のＥＣ_５０を、下表２４に報告する。

表２４のデータは、ＭａｂＰａｉｒおよび抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１の両方がＣＤ２０／ＣＨＯに結合し、一方で抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１．１およびｈｕＩｇＧ１はそうではないことを示す。さらに、これらのデータは、ＭａｂＰａｉｒおよび抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１．１が、ＣＤ３７／ＣＨＯに結合し、一方で抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１およびｈｕＩｇＧ１はそうではないことを示す。従って、これらのデータは、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１のｈＣＤ２０に対する結合特異性を示す。理由は、この抗体が、ｈＣＤ２０を発現しているＣＨＯ細胞に結合するが、ｈＣＤ３７を遺伝子導入したＣＨＯ細胞には結合しないためである。同様に、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１．１は、ｈＣＤ３７に対し特異性を示す。理由は、それがＣＤ３７／ＣＨＯ細胞に結合するが、ＣＤ２０／ＣＨＯ細胞には結合しないためである。従って、このアッセイは、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１が、本明細書で意図されるように、ｈＣＤ２０に特定的に結合すること、および抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１．１が、本明細書で意図されるように、ｈＣＤ３７に特異的に結合することを示す。

機能的観点でのこの結合特異性のさらなる確認として、ＡＤＣＣ活性を、３種の細胞株、すなわち、ＣＤ２０／ＣＨＯ、ＣＤ３７／ＣＨＯ、およびラージ腫瘍細胞株でインビトロで評価した。ＡＤＣＣレポーターアッセイを、この場合のエフェクター細胞がＦｃγＲＩＩＩ遺伝子導入ジャーカットＮＦＡＴルシフェラーゼレポーター細胞株であったことを除いて、基本的に実施例５で記載のようにして実施した。例えば、Ｈｓｉｅｈｅｔａｌ．，ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＦｃγＲＩＩＩＡｅｆｆｅｃｔｏｒｃｅｌｌｓｕｓｅｄｉｎｉｎｖｉｔｒｏＡＤＣＣｂｉｏａｓｓａｙ：ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｐｒｉｍａｒｙＮＫｃｅｌｌｓｗｉｔｈｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄＮＫ－９２ａｎｄＪｕｒｋａｔＴｃｅｌｌｓ，２０１７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ４４１：５６－６６を参照されたい。ラージ細胞は、ｈＣＤ２０およびｈＣＤ３７の両方を発現することが既知である。ＣＨＯ細胞は、ｈＣＤ２０またはｈＣＤ３７をコードする遺伝子導入ＤＮＡの非存在下では、これらのたんぱく質を発現しない。各細胞株で、次の抗体を、ＡＤＣＣ活性について試験した：ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体（ジニトロフェニル（抗ＤＮＰ）抗体）；リツキシマブ（ＩｇＧ１抗ｈＣＤ２０抗体）；抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１および抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１．１。４：１および８：１のエフェクター：標的比を、各細胞株で試験した。結果を、図７、パネルＡのようなパーセント特異的溶解としてではなく、平均相対発光強度（ＲＬＵ（ｎ＝２））として二通りの試料について報告した。これらの結果を、下の表２５に示す。

ＡＤＣＣは試験抗体の標的細胞上に発現される抗原への結合に依存するので、これらのデータは、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１がＣＤ２０／ＣＨＯおよびラージ細胞に結合するが、ＣＤ３７／ＣＨＯに対してはそうではないことを強く示唆する。これらのデータは、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１．１がＣＤ３７／ＣＨＯおよびラージ細胞に結合するが、ＣＤ２０／ＣＨＯに対してはそうではないことを、さらに強く示唆する。従って、これらのデータは、表２４に示す結合データと完全に一致する。

実施例１４：直接殺細胞作用アッセイにおける抗ｈＣＤ２０／抗ｈＣＤ３７抗体混合物の活性
種々の濃度の抗ｈＣＤ２０および抗ｈＣＤ３７抗体を、単独でまたは混合物として、実施例２および「直接殺細胞作用」の定義で上記したように、架橋抗体の非存在下で実施される直接殺細胞作用アッセイに供した。ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２およびラモス細胞を試験し、これらの結果を、図２５、パネルＡおよびＢにそれぞれ示す。試料は、ＩｇＧ１／κアイソタイプ対照抗体（ｈｕＩｇＧ１）抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１．１、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１＋抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１．１、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ｎ１２．１、および抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１＋抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ｎ１２．１を含んだ。試料を、５μｇ／ｍＬ（３４ｎＭ）から開始する１：２希釈系列で調製した。このアッセイでのそれらの活性を、表２６にまとめる。

ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞で試験した場合、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１は、高い効力を示したが、各抗ＣＤ３７抗体は、単独では、ほとんど効果的でなかった。しかし、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１と、どちらかの抗ＣＤ３７抗体の混合物は、個別の成分に比べてある程度、効力を高めた。ラモス細胞で試験した場合、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１ＩｇＧ処理は、ほとんど効力を示さず、これは、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞における結果とは明確に異なった。両方の抗ＣＤ３７抗体は、ラモス細胞中では効力が高く、この結果もまた、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞においてい得られた結果とは異なった。両方の抗体混合物は、ラモス細胞の場合では、混合物のどちらか単独の成分よりも高い効力を有した。従って、これらの結果は、両方の抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３７抗体混合物は、両方がＢ細胞リンパ腫由来の細胞株である試験細胞型における、どちらかの単独の成分よりも、増大した直接殺細胞作用を有したことを示した。従って、これらのデータは、これらの抗体混合物が、Ｂ細胞媒介癌などの疾患において、どちらかの抗体単独に比べて、増大した効力を有し得ることを示唆する。

実施例１５：抗ｈＣＤ２０／抗ｈＣＤ３７抗体混合物による全血中のＢ細胞枯渇
以下に記載の実験は、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１および抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１．１を含む抗体混合物による全血中のＢ細胞枯渇を試験する。健康なヒトドナー由来の全血の２３０μｌの分取量を、ディープウェル９６ウェルマイクロタイタープレートのウェル中に二通りで加えた。対照抗体または２０μｌの体積中で５０μｇ／ｍＬ（３３３．３ｎＭ）から開始する１：１０希釈系列で調製した種々の濃度の抗体混合物を含む溶液を、ウェルに加え、数回の上下のピペッティングにより混合した。プレートを、３７℃で４時間インキュベートした。二次抗体、すなわち、ＡＰＣ標識マウス抗ヒトＣＤ１９抗体（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、クローンＨＩＢ１９、カタログ番号５５５４１５）およびＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＤ４５抗体（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、クローンＨＩ３０、カタログ番号５６１８６５）を、それぞれ、１：２５および１：１２５の希釈で添加した。プレートを、アルミニウム箔で包んで光から保護し、室温でさらに４５分間インキュベートした。溶解溶液（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ（ＢＤ）、カタログ番号３４９２０２）を、ディープウェル９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに添加した（１ｍＬ／ウェル）。プレートを、室温で１０分間インキュベートした後、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を、細胞ペレットを掻き乱すことなく吸引した。プレートを、１ｍＬのＰＢＳを各ウェルに添加することにより洗浄し、混合し、プレートを、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。さらに１ラウンドの溶解、遠心分離、および洗浄を上述のように反復して、溶解した赤血球（ＲＢＣ）を可能な限り除去した。プレートを、５００μｌのＦＡＣＳ緩衝液を各ウェルにもう１回添加することにより洗浄し、混合し、プレートを、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を吸引し、細胞を、２００μｌ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁し、ヨウ化プロピジウム溶液（Ｐｒｏｍｏｋｉｎｅ、カタログ番号ＰＫ－ＣＡ７０７－４００１７）を、最終濃度の５μｇ／ｍＬに加えた。フローサイトメトリー分析を、Ｂｅｃｔｏｎ－Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ蛍光励起セルソーター（ＬＳＲＩＩ）で実施した。Ｂ細胞の減少を、抗ＣＤ１９二次抗体（これは、Ｂ細胞に特異的である）を介して追跡し、一方で試料中の白血球の全数を、抗ＣＤ４５二次抗体（これは、白血球を特定する）を介して追跡し得る。アッセイを、３人の健康なドナー由来のＰＢＭＣを用いて、別々に実施した。結果を図２６に示す。試験した抗体のＥＣ_５０を、表２７にまとめる。

ドナー１１９８の場合、オビヌツズマブ（ベンチマーク抗ＣＤ２０抗体）は、急速に（４時間のインキュベーション期間で）Ｂ細胞を高い効力で枯渇させ、一方でリツキシマブ（別のベンチマーク抗ＣＤ２０抗体）は、効果が小さかった。図２６、パネルＡ。これらのデータは、オビヌツズマブおよびリツキシマブが細胞を死滅させ得る異なる作用機序を反映しているのかもしれない。抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１単独は、リツキシマブに類似の効力を有し、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１．１は、より小さい効力を有した。しかし、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１および抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１．１を含む混合物は、全てのドナーで、いずれかの抗体単独に比べて、増大した効力を有した。図２６、パネルＡ～Ｃ。ドナー１０５６由来の血液含有試料では、Ｂ細胞はいずれかの単一抗体での処理により、効果的に死滅させられなかった。抗体混合物は、最高の効力を有した。図２６、パネルＢ。ドナー２００４由来の血液含有試料では、Ｂ細胞は、リツキシマブでの処理により枯渇されなかった。オビヌツズマブおよび抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１は両方とも、比較的非効果的なＢ細胞枯渇を示し、一方で抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１．１は、ほぼ完全に効果がなかった。しかし、抗体混合物は、いずれかの個別の成分よりも、顕著により高い活性を有した。図２６、パネルＣ。従って、全てのこれらの結果は、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１および抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１．１を含む抗体混合物が、いずれかの抗体単独より効果的に全血中のＢ細胞を枯渇させ得ることを示唆した。従って、これらのデータは、抗ｈＣＤ２０および抗ｈＣＤ３７抗体の組み合わせが、いずれかの抗体単独より、Ｂ細胞媒介疾患の治療において、より効果的である可能性があることを示唆する。

実施例１６：マウスにおける腫瘍増殖に対する抗ＣＤ２０および抗ＣＤ３７抗体の効果
リツキシマブ（リツキサン（登録商標））で治療されたＢ－ＮＨＬ患者は、再発する場合があり、この再発は、薬剤耐性の発生に起因して発生することが多い。従って、薬剤耐性を回避するための新規治療薬の開発に対する未充足のニーズが存在する。
以下に記載の実験では、確立されたラモス細胞異種移植片を有するＣＢ－１７／ＳＣＩＤマウスを、種々の抗体およびこれらの組み合わせで治療して、確立された腫瘍に対する抗体の効果をインビボで試験した。ラモス細胞は、ヒトＢ細胞リンパ腫から誘導される。図２５、パネルＢに示されるように、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１は、インビトロでラモス細胞の直接殺細胞作用に関し、比較的非効果であった。同様に、ラモス細胞は、抗ｈＣＤ２０抗体であるリツキシマブ（リツキサン（登録商標））により誘導されたアポトーシスに対し、比較的耐性であることが示されている。例えば、Ｋｏｎｉｔｚｅｒｅｔａｌ．（２０１５），ＰＬＯＳＯＮＥ１０（１２）：ｅ０１４５６３３（ｄｏｉ：１０：１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１４５６３３）を参照されたい。従って、ラモス細胞腫瘍が抗ｈＣＤ２０抗体に感受性でない可能性があるという予測に対するいくつかの根拠が存在した。

我々の実験では、抗ｈＣＤ２０抗体オビヌツズマブ（ガザイバ（登録商標））、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１．１、および抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１／抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１．１ＭａｂＰａｉｒを含む抗体を、確立されたラモス細胞異種移植片を有するＣＢ－１７／ＳＣＩＤマウスで試験した。ラモス腫瘍細胞の埋め込み後に、腫瘍を、それらが平均１００立方ミリメートル（ｍｍ^３）のサイズに達するまで、７日間増殖させた。担腫瘍マウスを、各群の１０匹のマウスが類似の中央値腫瘍体積を有するように、治療群に配置した。それぞれの試験抗体による治療を、腹腔内注射により７日目に開始し、図２７に記載の投与レベルで、週２回、３週間継続した。腫瘍体積および体重を、各個別のマウスについて週２回測定し、腫瘍体積の結果を、ｍｍ^３で表した。図２７、パネルＡの結果は、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１および抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１．１の組み合わせによる治療が、確立されたラモス細胞腫瘍の増殖を効果的に抑制したことを示す。実際に、腫瘍退縮が、この治療を受けたほとんど全ての担腫瘍マウスで観察され、１０匹のマウスのうちの９匹が、試験終了時点で無腫瘍であった。対照的に、アイソタイプ対照抗体（ｈＩｇＧ１）で治療された全ての１０匹のマウスは、試験期間中に腫瘍増殖を経験する。図２７、パネルＢの結果は、抗抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１．１による治療はまた、ラモス細胞腫瘍の増殖を抑制したが、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１および抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１．１を含むＭａｂＰａｉｒほど効果的ではなかったことを示す。この治療群では、１０匹のマウス中の６匹が、試験終了時点で無腫瘍であった。

これらの知見は、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１および抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１．１を含むＭａｂＰａｉｒが、抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１．１単独で観察されたものより優れたインビボ抗腫瘍活性を有することを示し、この抗ｈＣＤ２０抗体は、あったとしても、限られたインビトロのラモス細胞の直接殺細胞作用しか示さないにもかかわらず、抗ラモス細胞腫瘍活性を有し得ることを示唆する。この実験でのさらなるデータは、抗ｈＣＤ２０抗体オビヌツズマブ（ガザイバ（登録商標））単独が、抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１および抗ｈＣＤ３７Ａｂ１．Ａ１．１を含むＭａｂＰａｉｒのものと同等のインビボ抗腫瘍活性を有することを示した。データは示されない。この結果は、図２５、パネルＢのデータにより示されるラモス細胞中の抗ｈＣＤ２０Ａｂ１．２．２．１の非常に限定的なインビトロ細胞死滅活性およびラモス細胞のリツキシマブ（別の抗ｈＣＤ２０抗体）に対する限定的なインビトロ感受性を考慮すると、少々意外かもしれない。しかし、インビボアッセイは、インビトロアッセイとは大きく異なるので、これらの結果は、まったく矛盾するものではない。

Claims

重鎖（ＨＣ）可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）を含む重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）を含む軽鎖（ＬＣ）を含む抗ヒトＣＤ２０（抗ｈＣＤ２０）抗体であって、
前記Ｖ_Ｈが、配列番号１２に対して１２、１１、１０、９、８、７、６、または５個以下の改変を含むアミノ酸配列を含み、
前記Ｖ_Ｌが、配列番号８に対して７、６、または５個以下の改変を含むアミノ酸配列を含み、および
１．５ｎＭ以下の最大応答の５０％（ＥＣ_５０）を与える濃度を用いて架橋抗体なしに実施される直接殺細胞作用アッセイでＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞を直接死滅させることができ、および／または１０μｇ／ｍｌの濃度の前記抗ｈＣＤ２０抗体を用いて架橋抗体なしで実施される直接殺細胞作用アッセイで少なくとも４０％のＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞を直接死滅させることができる、
抗ｈＣＤ２０抗体。
１．０ｎＭ以下のＥＣ_５０で架橋抗体なしに実施される直接殺細胞作用アッセイでＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞を直接死滅させることができおよび／またはアッセイにおいて１０μｇ／ｍｌの濃度の前記抗ｈＣＤ２０抗体を用いる架橋抗体なしで実施される直接殺細胞作用アッセイで少なくとも４０％のＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞を直接死滅させることができる、請求項１に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
０．６ｎＭ以下のＥＣ_５０で架橋抗体なしに実施される直接殺細胞作用アッセイでＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞を直接死滅させることができおよび／またはアッセイにおいて１０μｇ／ｍｌの濃度の前記抗ｈＣＤ２０抗体を用いる架橋抗体なしで実施される直接殺細胞作用アッセイで少なくとも４０％のＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞を直接死滅させることができる、請求項２に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
０．４５ｎＭ以下のＥＣ_５０で架橋抗体なしに実施される直接殺細胞作用アッセイでＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞を直接死滅させることができおよび／またはアッセイにおいて１０μｇ／ｍｌの濃度の前記抗ｈＣＤ２０抗体を用いる架橋抗体なしで実施される直接殺細胞作用アッセイで少なくとも４０％のＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞を直接死滅させることができる、請求項３に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
前記Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌがそれぞれ、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、および
前記Ｖ_ＨＣＤＲ１、Ｖ_ＨＣＤＲ２、Ｖ_ＨＣＤＲ３、Ｖ_ＬＣＤＲ１、Ｖ_ＬＣＤＲ２、およびＶ_ＬＣＤＲ３が、（ａ）それぞれ、配列番号１、２、３、４、５、および６のアミノ酸配列を含みおよび／または（ｂ）それぞれ、配列番号１、２、３、４、５、および６をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含む、
請求項１～４のいずれか１項に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
前記Ｖ_Ｈが、配列番号１２に対して４個または３個以下の改変を含むアミノ酸配列を含み、および
前記Ｖ_Ｌが、配列番号８に対して４個または３個以下の改変を含むアミノ酸配列を含む、
請求項１～５のいずれか１項に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
前記Ｖ_Ｈが、配列番号１２に対して２個または１個以下の改変を含むアミノ酸配列を含み、および
前記Ｖ_Ｌが、配列番号８に対して２個または１個以下の改変を含むアミノ酸配列を含む、
請求項６に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
（ａ）前記Ｖ_Ｈが、（１）配列番号１２のアミノ酸配列および／または（２）配列番号１２をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、および
（ｂ）前記Ｖ_Ｌが、（１）配列番号８のアミノ酸配列および／または（２）配列番号８をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含む、
請求項７に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
ヒトのまたはヒト化されたＩｇＧ抗体である、請求項１～８のいずれか１項に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
前記ＨＣが、（ａ）配列番号２４のアミノ酸配列および／または（ｂ）配列番号２４をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
前記ＨＣが、配列番号１８に対して７個または６個以下の改変を含むアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
前記ＨＣが、配列番号１８に対して５個または４個以下の改変を含むアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
前記ＨＣが、配列番号１８に対して３個以下の改変を含むアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
前記ＨＣが、配列番号１８に対して２個以下の改変を含むアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
前記ＨＣが、配列番号１８に対して１個以下の改変を含むアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
前記ＨＣが、（ａ）配列番号１８のアミノ酸配列および／または（ｂ）配列番号１８をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
前記ＨＣが、（ａ）配列番号３６のアミノ酸配列および／または（ｂ）配列番号３６をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
前記ＨＣが、（ａ）配列番号４５のアミノ酸配列および／または（ｂ）配列番号４５をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
前記ＨＣが、配列番号２３に対して１２、１１、１０または９個以下の改変を含むアミノ酸配列を含み、および
前記ＬＣが、配列番号１０に対して７個または６個以下の改変を含むアミノ酸配列を含む、
請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
前記ＨＣが、配列番号２３に対して８個または７個以下の改変を含むアミノ酸配列を含み、および
前記ＬＣが、配列番号１０に対して５個または４個以下の改変を含むアミノ酸配列を含む、
請求項１９に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
前記ＨＣが、配列番号２３に対して６、５または４個以下の改変を含むアミノ酸配列を含み、および
前記ＬＣが、配列番号１０に対して３個または２個以下の改変を含むアミノ酸配列を含む、
請求項２０に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
（ａ）前記ＨＣが、（１）配列番号２３に対して３、２、１個以下、またはゼロ個の改変を含むアミノ酸配列および／または（２）配列番号２３をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、および
（ｂ）前記ＬＣが、（１）配列番号１０に対して１個以下またはゼロ個の改変を含むアミノ酸配列および／または（２）配列番号１０をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含む、
請求項２１に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
抗ｈＣＤ２０抗体の前記ＨＣが、２３９Ｄおよび２９８Ａを含み、および
前記ＨＣが、配列番号３５に対して７個または６個以下の改変を含むアミノ酸配列を含む、
請求項９または１０に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
前記ＨＣが、配列番号３５に対して５個または４個以下の改変を含むアミノ酸配列を含み、および
前記ＬＣが、配列番号１０に対して５個または４個以下の改変を含むアミノ酸配列を含む、
請求項２３に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
前記ＨＣが、配列番号３５に対して３個以下の改変を含むアミノ酸配列を含み、および
前記ＬＣが、配列番号１０に対して３個以下の改変を含むアミノ酸配列を含む、
請求項２４に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
前記ＨＣが、配列番号３５に対して２個以下の改変を含むアミノ酸配列を含み、および
前記ＬＣが、配列番号１０に対して２個以下の改変を含むアミノ酸配列を含む、
請求項２５に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
前記ＨＣが、配列番号３５に対して１個以下の改変を含むアミノ酸配列を含み、および
前記ＬＣが、配列番号１０に対して１個以下の改変を含むアミノ酸配列を含む、
請求項２６に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
（ａ）前記ＨＣが、（１）配列番号３５のアミノ酸配列および／または（２）配列番号３５をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、および
（ｂ）前記ＬＣが、（１）配列番号１０のアミノ酸配列および／または（２）配列番号１０をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含む、
請求項２７に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
（ａ）前記ＨＣが、（１）配列番号４４のアミノ酸配列および／または（２）配列番号４４をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、および
（ｂ）前記ＬＣが、（１）配列番号１０のアミノ酸配列および／または（２）配列番号１０をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含む、
請求項２３に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
０．４０ｎＭ以下のＥＣ_５０で架橋抗体なしに実施される直接殺細胞作用アッセイでＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞を直接死滅させることができる、請求項１～２９のいずれか１項に記載の抗ｈＣＤ２０抗体。
Ｖ_Ｈを含むＨＣおよびＶ_Ｌを含むＬＣを含む抗ヒトＣＤ３７（抗ｈＣＤ３７）抗体であって、
前記Ｖ_Ｈが、配列番号５７に対して８、７、６、または５個以下の改変を含むアミノ酸配列を含み、
前記Ｖ_Ｌが、配列番号５３に対して８、７、６、５個または４個以下の改変を含むアミノ酸配列を含み、および
５、４、または３ｎＭ以下のＥＣ_５０で架橋抗体なしに実施される直接殺細胞作用アッセイでラモス細胞を直接死滅させることができおよび／または１０μｇ／ｍｌの濃度の前記抗ｈＣＤ３７抗体を用いて架橋抗体なしで実施される直接殺細胞作用アッセイで少なくとも４０％、または５０％のラモス細胞を直接死滅させることができる、
抗ｈＣＤ３７抗体。
２ｎＭ以下のＥＣ_５０で架橋抗体なしに実施される直接殺細胞作用アッセイでラモス細胞を直接死滅させることができおよび／または１０μｇ／ｍｌの濃度の前記抗ｈＣＤ３７抗体を用いて架橋抗体なしで実施される直接殺細胞作用アッセイで少なくとも５０％のラモス細胞を直接死滅させることができる、請求項３１に記載の抗ｈＣＤ３７抗体。
１ｎＭ以下のＥＣ_５０で架橋抗体なしに実施される直接殺細胞作用アッセイでラモス細胞を直接死滅させることができおよび／または１０μｇ／ｍｌの濃度の前記抗ｈＣＤ３７抗体を用いて架橋抗体なしで実施される直接殺細胞作用アッセイで少なくとも６０％のラモス細胞を直接死滅させることができる、請求項３２に記載の抗ｈＣＤ３７抗体。
前記Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌがそれぞれ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、および
前記Ｖ_ＨＣＤＲ１、Ｖ_ＨＣＤＲ２、Ｖ_ＨＣＤＲ３、Ｖ_ＬＣＤＲ１、Ｖ_ＬＣＤＲ２、およびＶ_ＬＣＤＲ３が、（ａ）それぞれ、配列番号４６、４７、４８、４９、５０および５１のアミノ酸配列を含みおよび／または（ｂ）それぞれ、配列番号４６、４７、４８、４９、５０および５１をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含む、
請求項３１～３３のいずれか１項に記載の抗ｈＣＤ３７抗体。
前記Ｖ_Ｈが、配列番号５７に対して４個以下の改変を含むアミノ酸配列を含み、および
前記Ｖ_Ｌが、配列番号５３に対して３個以下の改変を含むアミノ酸配列を含む、
請求項３１～３４のいずれか１項に記載の抗ｈＣＤ３７抗体。
前記Ｖ_Ｈが、配列番号５７に対して３個以下の改変を含むアミノ酸配列を含み、および
前記Ｖ_Ｌが、配列番号５３に対して２個以下の改変を含むアミノ酸配列を含む、
請求項３５に記載の抗ｈＣＤ３７抗体。
前記Ｖ_Ｈが、配列番号５７に対して２個以下の改変を含むアミノ酸配列を含み、および
前記Ｖ_Ｌが、配列番号５３に対して１個以下の改変を含むアミノ酸配列を含む、
請求項３６に記載の抗ｈＣＤ３７抗体。
（ａ）前記Ｖ_Ｈが、（１）配列番号５７に対し１個以下またはゼロ個の改変を含むアミノ酸配列および／または（２）配列番号５７をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、および
（ｂ）前記Ｖ_Ｌが、（１）配列番号５３のアミノ酸配列および／または（２）配列番号５３をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含む、
請求項３７に記載の抗ｈＣＤ３７抗体。
前記ＨＣが、配列番号５９に対して１０、９または８個以下の改変を含むアミノ酸配列を含み、および
前記ＬＣが、配列番号５５に対して８個または７個以下の改変を含むアミノ酸配列を含む、
請求項３１～３８のいずれか１項に記載の抗ｈＣＤ３７抗体。
前記ＨＣが、配列番号５９に対して７個または６個以下の改変を含むアミノ酸配列を含み、および
前記ＬＣが、配列番号５５に対して５個以下の改変を含むアミノ酸配列を含む、
請求項３９に記載の抗ｈＣＤ３７抗体。
前記ＨＣが、配列番号５９に対して５個または４個以下の改変を含むアミノ酸配列を含み、および
前記ＬＣが、配列番号５５に対して４個または３個以下の改変を含むアミノ酸配列を含む、
請求項４０に記載の抗ｈＣＤ３７抗体。
前記ＨＣが、配列番号５９に対して３個または２個以下の改変を含むアミノ酸配列を含み、および
前記ＬＣが、配列番号５５に対して２個以下の改変を含むアミノ酸配列を含む、
請求項４１に記載の抗ｈＣＤ３７抗体。
前記ＨＣが、配列番号５９に対して１個以下の改変を含むアミノ酸配列を含み、および
前記ＬＣが、配列番号５５に対して１個以下の改変を含むアミノ酸配列を含む、
請求項４２に記載の抗ｈＣＤ３７抗体。
（ａ）前記ＨＣが、（１）配列番号５９のアミノ酸配列および／または（２）配列番号５９をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、および
（ｂ）前記ＬＣが、（１）配列番号５５のアミノ酸配列および／または（２）配列番号５５をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含む、
請求項４３に記載の抗ｈＣＤ３７抗体。
前記ＨＣが、３４Ｖを含み、かつ前記ＬＣが、３１Ｎを含む、請求項３１または３９に記載の抗ｈＣＤ３７抗体。
前記ＨＣが、１４７Ｄ、１７０Ｃ、１７３Ｃ、２２０Ｇ、および４０９Ｒを含み、かつ前記ＬＣが、１３１Ｋ、１６０Ｃ、１６２Ｃ、および２１４Ｓを含む、請求項３１、３９または４５に記載の抗ｈＣＤ３７抗体。
（ａ）前記ＨＣが、（１）配列番号６５に対し４、３、２、１個以下、またはゼロ個の改変を含むアミノ酸配列および／または（２）配列番号６５をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、および
（ｂ）前記ＬＣが、（１）配列番号６１に対して４、３、２、１個以下またはゼロ個の改変を含むアミノ酸配列および／または（２）配列番号６１をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含む、
請求項４５または４６に記載の抗ｈＣＤ３７抗体。
（ａ）前記ＨＣが、（１）配列番号６７または７１に対し４、３、２、１個以下またはゼロ個の改変を含むアミノ酸配列および／または（２）配列番号６７または７１をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、および
（ｂ）前記ＬＣが、（１）配列番号６３または６９に対して４、３、２、１個以下またはゼロ個の改変を含むアミノ酸配列および／または（２）配列番号６３または６９をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含む、
請求項４７に記載の抗ｈＣＤ３７抗体。
前記ＨＣが、３４Ｌおよび６４Ｑを含み、かつ前記ＬＣが、５３Ｓおよび９３Ｅを含む、請求項３１または３９に記載の抗ｈＣＤ３７抗体。
（ａ）前記Ｖ_Ｈが、（１）配列番号７７に対し４、３、２、１個以下またはゼロ個の改変を含むアミノ酸配列および／または（２）配列番号７７をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、および
（ｂ）Ｖ_Ｌが、（１）配列番号７３に対して４、３、２、１個以下またはゼロ個の改変を含むアミノ酸配列および／または（２）配列番号７３をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含む、
請求項４９に記載の抗ｈＣＤ３７抗体。
（ａ）前記ＨＣが、（１）配列番号７９または８３に対し４、３、２、１個以下またはゼロ個の改変を含むアミノ酸配列および／または（２）配列番号７９または８３をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、および
（ｂ）前記ＬＣが、（１）配列番号７５または８１に対して４、３、２、１個以下またはゼロ個の改変を含むアミノ酸配列および／または（２）配列番号７５または８１をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含む、
請求項５０に記載の抗ｈＣＤ３７抗体。
請求項１～３０のいずれか１項に記載の抗ｈＣＤ２０抗体および請求項３１～５１のいずれか１項に記載の抗ｈＣＤ３７抗体を含む抗体の混合物。
前記抗ｈＣＤ２０抗体および前記抗ｈＣＤ３７抗体以外の抗体の主要な種を含まない、請求項５２に記載の混合物。
前記抗ｈＣＤ２０抗体が、請求項２８または２９に記載の抗ＣＤ２０抗体であり、および
前記抗ｈＣＤ３７抗体が、請求項４８または５１に記載の抗ＣＤ３７抗体である、
請求項５２または５３に記載の混合物。
請求項１～３０のいずれか１項に記載の抗ｈＣＤ２０抗体、請求項３１～５１のいずれか１項に記載の抗ｈＣＤ３７抗体、または請求項５２～５４のいずれか１項に記載の抗体の混合物を製造するための方法であって、次の：
前記抗ｈＣＤ２０抗体、前記抗ｈＣＤ３７抗体、または抗体の前記混合物をコードする１種または複数のＤＮＡを含む宿主細胞を培養するステップ、および
前記細胞集団からまたは前記細胞培養上清から前記抗ｈＣＤ２０抗体、前記抗ｈＣＤ３７抗体、または抗体の前記混合物を回収するステップ、
を含む、方法。
前記宿主細胞が、ＣＨＯ細胞またはマウス骨髄腫細胞である、請求項５５に記載の方法。
請求項１～３０のいずれか１項に記載の抗ｈＣＤ２０抗体、請求項３１～５１のいずれか１項に記載の抗ｈＣＤ３７抗体、または請求項５２～５４のいずれか１項に記載の抗体の混合物をコードする１種または複数のポリヌクレオチド。
請求項５７に記載のポリヌクレオチドを含む１種または複数のベクター。
ウイルスベクターである、請求項５８に記載のベクター。
腫瘍溶解性ウイルスベクターである、請求項５９に記載のベクター。
レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクシニアウイルス、改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、麻疹ウイルス、コクサッキーウイルス、ニューカッスル病ウイルス、レオウイルス、および／またはポックスウイルスベクターである、請求項６０に記載のベクター。
請求項５７に記載のポリヌクレオチドまたは請求項５８に記載のベクターを含む宿主細胞。
哺乳動物細胞である、請求項６２に記載の宿主細胞。
ＣＨＯ細胞またはマウス骨髄腫細胞である、請求項６３に記載の宿主細胞。
請求項１～３０のいずれか１項に記載の抗ｈＣＤ２０抗体、請求項３１～５１のいずれか１項に記載の抗ｈＣＤ３７抗体、または請求項５２～５４のいずれか１項に記載の抗体の混合物、請求項５７に記載のポリヌクレオチド、または請求項５８～６１のいずれか１項に記載のベクターを含む医薬組成物。
前記ＩｇＧ抗体のＨＣが、配列番号２４のアミノ酸配列および／または配列番号２４をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含む、ヒトのまたはヒト化されたＩｇＧ抗体。
前記ＩｇＧ抗体のＨＣが、配列番号３６のアミノ酸配列に対して６、５、４、または３個以下の改変を含むアミノ酸配列を含む、請求項６６に記載のＩｇＧ抗体。
前記ＩｇＧ抗体のＨＣが、配列番号３６のアミノ酸配列に対して３個以下の改変を含むアミノ酸配列を含む、請求項６７に記載のＩｇＧ抗体。
前記ＩｇＧ抗体のＨＣが、配列番号３６のアミノ酸配列に対して２個以下の改変を含むアミノ酸配列を含む、請求項６８に記載のＩｇＧ抗体。
前記ＩｇＧ抗体のＨＣが、配列番号３６のアミノ酸配列に対して１個以下の改変を含むアミノ酸配列を含む、請求項６９に記載のＩｇＧ抗体。
前記ＩｇＧ抗体のＨＣが、配列番号３６のアミノ酸配列および／または配列番号３６をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含む、請求項７０に記載のＩｇＧ抗体。
前記ＩｇＧ抗体のＨＣが、配列番号４５のアミノ酸配列および／または配列番号４５をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含む、請求項６６または６７に記載のＩｇＧ抗体。
請求項１～３０のいずれか1項に記載の抗ｈＣＤ２０抗体、請求項３１～５１のいずれか１項に記載の抗ｈＣＤ３７抗体、または請求項５２～５４のいずれか１項に記載の抗体の混合物、請求項５７に記載のポリヌクレオチド、または請求項５８～６１のいずれか１項に記載のベクターを患者に投与するステップを含む癌またはＢ細胞媒介疾患を有する患者を治療するための方法。
前記患者が、癌を有する、請求項７３に記載の方法。
前記患者が、前記抗ｈＣＤ２０抗体、前記抗ｈＣＤ３７抗体、前記抗体の混合物、前記ポリヌクレオチド、または前記ベクターの投与の前に、その後に、またはそれと同時に放射線または化学療法剤により治療される、請求項７４に記載の方法。
前記癌が、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（Ｂ－ＮＨＬ）または慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）である、請求項７４または７５に記載の方法。
前記癌が、Ｂ－ＮＨＬであり、かつ前記Ｂ－ＮＨＬが、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、粘膜関連リンパ組織のリンパ腫（ＭＡＬＴリンパ腫）、バーキットリンパ腫、またはマントル細胞リンパ腫からなる群より選択される、請求項７６に記載の方法。
前記患者が、Ｂ細胞媒介疾患を有する、請求項７３に記載の方法。
前記Ｂ細胞媒介疾患が、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、および多発性硬化症からなる群より選択される、請求項７８に記載の方法。