CN105229029B

CN105229029B - 结合到cd20和cd95的重组双特异性抗体

Info

Publication number: CN105229029B
Application number: CN201380069135.7A
Authority: CN
Inventors: A·赫尔曼; L·格罗塞-霍韦斯特
Original assignee: Baliopharm AG
Current assignee: Baliopharm AG
Priority date: 2012-11-19
Filing date: 2013-11-19
Publication date: 2020-07-14
Anticipated expiration: 2033-11-19
Also published as: US10590202B2; EP2920210A1; WO2014076292A1; JP6475631B2; KR102168562B1; CN105229029A; CA2891764A1; US20150274833A1; JP2016500061A; ES2649991T3; EP2920210B1; KR20160010391A

Abstract

本发明公开了一种双特异性抗体结构，其包含a)包含用于第一抗原的第一结合位点的Fab片段；b)包含用于第二抗原的第二结合位点的scFv片段；c)CH2域，其中Fab片段和scFv片段通过CH2域连接，其中所述第一抗原是CD95，所述第二抗原是CD20；或所述第一抗原是CD20，所述第二抗原是CD95。

Description

结合到CD20和CD95的重组双特异性抗体

技术领域

本发明涉及一种新的结合到CD20和CD95的双特异性抗体结构。

背景技术

CD95/Fas/Apo-1是能够诱导人类细胞凋亡的细胞表面受体。类似于这种受体的生理性配体，如果激动性抗CD-95抗体CD95L与CD95以多聚体形式结合，例如作为五聚体IgM或自聚集IgG3，可诱导凋亡。或者，抗CD95抗体可由附近的细胞上的Fc受体交联，或由二级抗体交联，以获得激动活性。

许多肿瘤细胞都表达CD95，因此，在初步表征原型CD95抗体后，使用激动性抗CD95抗体用于肿瘤治疗已得到大力推行。但是，很快变得明显的是，至少对患者施用最简单形式的激动性抗CD95抗体或重组CD95L，这种方法是失败的，因为许多正常的细胞类型都表达功能性CD95，并可被激动性抗体杀死。

CD20是许多淋巴瘤和自身免疫疾病(例如，多发性硬化症(MS)、类风湿关节炎(RA)和系统性红斑狼疮(SLE))中涉及的B细胞的标记。

针对B细胞相关CD20表面抗原的抗体可以以正常和恶性B细胞为目标。它们分别成功用于治疗B细胞源性白血病和淋巴瘤以及抗体介导自身免疫疾病。利妥昔单抗(Rituximab)(商品名为Rituxan和MabThera)是抗CD20蛋白的嵌合单克隆抗体。利妥昔单抗破坏B细胞，因此用以治疗特征为B细胞数目过多、B细胞过度活跃或B细胞功能失调的疾病。这包括许多淋巴瘤、白血病、移植排斥和一些自身免疫紊乱。

然而，利妥昔单抗非特异性地杀死CD20阳性细胞，并证明在MS中临床有效，但受到副作用损害(例如进行性多灶性脑白质病，PML)。

以前证明了双特异性F(ab’)₂片段(bs-F(ab’)₂)对CD95和淋巴瘤细胞上的不同目标抗原，例如CD20和CD40具有特异性，其诱导对CD95和相应目标抗原呈阳性的细胞的凋亡。表达CD95但不表达目标抗原的淋巴瘤细胞未被杀死(Jung et al.Cancer Research 61,1846-1848(2001))。

Herrmann等人(Cancer Research 68(4):1221-7(2008))评估了抗体结构和目标抗原的性质对肿瘤细胞中选择性CD95介导细胞凋亡的影响。

US2003/0232049A1描述了多特异性试剂用于选择性刺激细胞表面受体。双特异性抗体被描述用以杀死癌症细胞，所述双特异性抗议由抗原结合抗体片段构成，带有细胞表面受体，如死亡受体，例如CD95的第一结合位点和相同细胞目标抗原，例如CD20或CD40的第二结合位点。

发明内容

本发明的目的是为了提供双特异性抗体结构，其针对CD20和CD95具有改良的生物活性。

可通过本发明要求保护的主题来实现这个目标。

根据本发明，提供了一种双特异性结构，其包括或由以下部分组成：

a)包含用于第一抗原的第一结合位点的Fab片段；

b)包含用于第二抗原的第二结合位点的scFv片段；

c)可选地，连接序列；以及

d)CH2域，其中Fab片段和scFv片段通过CH2域连接，其中

所述第一抗原是CD95，所述第二抗原是CD20；或

所述第一抗原是CD20，所述第二抗原是CD95。

特别是，该抗体结构包含如图1描绘的结构。将它命名为，如NA-C20或Novotarg。

根据一具体的实施方式，所述结构的构造包含或由以下构成：

a)由VL/VH域对和CL/CH1域对构成的Fab片段，其中Fab片段包含第一结合位点；

b)由相互连接的VH/VL域构成的scFv；

c)可选地，连接序列；以及

c)CH2域，其将a)的Fab片段的CH1域连接至b)的scFv的VH域。

其中

所述第一抗原是CD95，所述第二抗原是CD20；或

所述第一抗原是CD20，所述第二抗原是CD95。

该结构是基于具有或不具有连接序列的特定抗体域。

本发明的抗体结构，优选地是由重组宿主细胞产生的重组抗体结构，其包含表达所述抗体结构的异源序列。

优选地，本发明的抗体片段是单克隆抗体结构，其可包含天然的氨基酸序列或包含氨基酸序列、三级结构和可选的糖基化的一种或多种突变，例如，为改善与目标结合的特异性、亲和力和/或亲合力，或为改善所述结构的稳定性，或为提高重组分子的可生产性。

特别地，抗体域是哺乳动物来源的，例如啮齿目动物，如鼠科动物，或人来源的，或非人的哺乳动物来源的嵌合体或人源化抗体域，如人源化鼠科动物或骆驼科动物的抗体域。

根据本发明一具体的方面，与CD20结合的结合位点包含抗体可变域的六个互补决定区(CDR1至CDR6)，其中

A)

i)CDR1包含氨基酸序列RASSSVSYM(SEQ ID 12)；

ii)CDR2包含氨基酸序列APSNLAS(SEQ ID 13)；

iii)CDR3包含氨基酸序列QQWSFNPPT(SEQ ID 14)；

iii)CDR4包含氨基酸序列SYNMH(SEQ ID 16)；

v)CDR5包含氨基酸序列AIYPGNGDTSYNQKFKG(SEQ ID 17)；以及

vi)CDR6包含氨基酸序列VVYYSNSYWYFDV(SEQ ID 18)；

或者

B)其功能活性变异体，其中至少一个

i)CDR1包含与氨基酸序列RASSSVSYM(SEQ ID 12)至少70％，或至少80％或至少90％的序列一致性的氨基酸序列；

ii)CDR2包含与氨基酸序列APSNLAS(SEQ ID 13)至少70％，或至少80％或至少90％的序列一致性的氨基酸序列；

iii)CDR3包含与氨基酸序列QQWSFNPPT(SEQ ID 14)至少70％，或至少80％或至少90％的序列一致性的氨基酸序列；

iv)CDR4包含与氨基酸序列SYNMH(SEQ ID 16)至少70％，或至少80％或至少90％的序列一致性的氨基酸序列；

v)CDR5包含与氨基酸序列AIYPGNGDTSYNQKFKG(SEQ ID 17)至少70％，或至少80％或至少90％的序列一致性的氨基酸序列；和/或

vi)CDR6包含与氨基酸序列VVYYSNSYWYFDV(SEQ ID 18)至少70％，或至少80％或至少90％的序列一致性的氨基酸序列。

本发明特别地考虑使用包含CD20结合位点的任何抗体形式，所述CD20结合位点获自上面的序列A i)至vi)，例如轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3序列和/或重链可变区的CDR4、CDR5和CDR6序列，包括多个单可变域的构造，所述多个单可变域包含CDR1、CDR2和CDR3序列的组合，或CDR4、CDR5和CDR6序列的组合，或这些单可变域对，例如VH、VHH或VH/VL域对。

特定的实施方式涉及包含至少一个，优选至少两个或至少三个A的CDR序列，以及至少一个B的CDR序列的抗体结构。

另一特定的实施方式涉及包含至少一个，优选至少两个或至少三个B的CDR序列，以及至少一个A的CDR序列的抗体结构。

特定的实施方式涉及使用轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含A i)的CDR1序列、A ii)的CDR2序列以及A iii)的CDR3序列，所述重链可变区包含A iv)或B iv)的CDR4序列、A v)或B v)的CDR5序列，以及A vi)或B vi)的CDR6序列，其中CDR4、CDR5和CDR6序列中的至少一个包含B的功能活性变异体。

特定的实施方式涉及使用重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含A iv)的CDR4序列、A v)序列的CDR5以及A vi)的CDR6序列，所述轻链可变区包含A i)或B i)的CDR1序列、A ii)或B ii)的CDR2序列以及A iii)或B iii)的CDR3序列，其中CDR1、CDR2和CDR3序列中的至少一个包含B的功能活性变异体。

B的变异体可选地包含列出的特定CDR序列，其包含，例如通过氨基酸残基的插入、删除、取代或化学衍化而导致的一个、两个或三个点突变。

如果与CD20(特别是人CD20，特别是具有高亲和力，例如Kd<10^-8M的CD20)结合，CD20结合物的变体被视为功能活性变异体。

根据一个特定的实施方式，双特异性抗体结构包含VL域和/或VH域，所述VL域包含SEQ ID 11的氨基酸序列或其功能活性变异体，或由SEQ ID 11的氨基酸序列或其功能活性变异体构成，所述VH域包含SEQ ID 15的氨基酸序列或其功能活性变异体，或由SEQ ID 15的氨基酸序列或其功能活性变异体构成。

特别地，该变异体是包含VL域和/或VH域的人源化变异体，所述VL域包含SEQ ID19的氨基酸序列或其功能活性变异体，或由SEQ ID 19的氨基酸序列或其功能活性变异体构成，所述VH域包含SEQ ID 20的氨基酸序列或其功能活性变异体，或由SEQ ID 20的氨基酸序列或其功能活性变异体构成。

根据本发明一具体的方面，与CD95结合的结合位点包含抗体可变域的六个互补决定区(CDR1至CDR6)，其中

A)

i)CDR1包含氨基酸序列RASESVEYYGTSLMQ(SEQ ID 2)；

ii)CDR2包含氨基酸序列VASNVES(SEQ ID 3)；

iii)CDR3包含氨基酸序列QQSTKVPWT(SEQ ID 4)；

iv)CDR4包含氨基酸序列TNAMN(SEQ ID 6)；

v)CDR5包含氨基酸序列RIRSKSNNYATYYAESVKD(SEQ ID 7)；以及

vi)CDR6包含氨基酸序列DGYY(SEQ ID 8)；

或者

B)其功能活性变异体，其中至少一个

i)CDR1包含与氨基酸序列RASESVEYYGTSLMQ(SEQ ID 2)至少70％，或至少80％或至少90％的序列一致性的氨基酸序列；

ii)CDR2包含与氨基酸序列VASNVES(SEQ ID 3)至少70％，或至少80％或至少90％的序列一致性的氨基酸序列；

iii)CDR3包含与氨基酸序列QQSTKVPWT(SEQ ID 4)至少70％，或至少80％或至少90％的序列一致性的氨基酸序列；

iv)CDR4包含与氨基酸序列TNAMN(SEQ ID 6)至少70％，或至少80％或至少90％的序列一致性的氨基酸序列；

v)CDR5包含与氨基酸序列RIRSKSNNYATYYAESVKD(SEQ ID 7)至少70％，或至少80％或至少90％的序列一致性的氨基酸序列；和/或

vi)CDR6包含与氨基酸序列DGYY(SEQ ID 8)至少70％，或至少80％或至少90％的序列一致性的氨基酸序列。

本发明特别地考虑使用包含CD95结合位点的任何抗体形式，所述CD95结合位点获自上面的序列A i)至vi)，例如轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3序列和/或重链可变区的CDR4、CDR5和CDR6序列，包括含有多个单可变域的构造，所述多个单可变域包含CDR1、CDR2和CDR3序列的组合，或CDR4、CDR5和CDR6序列的组合，或这些单可变域对，例如VH、VHH或VH/VL域对。

特定的实施方式涉及包含至少一个优选至少两个或至少三个A的CDR序列，以及至少一个B的CDR序列的抗体形式。

另一特定的实施方式涉及包含至少一个优选至少两个或至少三个B的CDR序列，以及至少一个A的CDR序列的抗体形式。

如果与CD95(特别是人CD95，特别是具有高亲和力例如Kd<10-8M)结合，CD95结合物的变异体被视为功能活性变异体。

根据一个特定的实施方式，双特异性抗体结构包含VL域和/或VH域，所述VL域包含SEQ ID 1的氨基酸序列或其功能活性变异体，或由SEQ ID 1的氨基酸序列或其功能活性变异体构成，所述VH域包含SEQ ID 5的氨基酸序列或其功能活性变异体，或由SEQ ID 5的氨基酸序列或其功能活性变异体构成。

特别地，该变异体是包含VL域和/或VH域的人源化变异体，所述VL域包含SEQ ID 9的氨基酸序列或其功能活性变异体，或由SEQ ID 9的氨基酸序列或其功能活性变异体构成，所述VH域包含SEQ ID 10的氨基酸序列或其功能活性变异体，或由SEQ ID 10的氨基酸序列或其功能活性变异体构成。

根据另一个特定的实施方式，双特异性抗体结构包含SEQ ID 21的轻链序列和SEQID 23的重链序列或它们的功能活性变异体，或由SEQ ID 21的轻链序列和SEQ ID 23的重链序列或它们的功能活性变异体构成。

特别地，该变异体是包含VL域和/或VH域的人源化变异体，所述VL域包含SEQ ID26的氨基酸序列或其功能活性变异体，或由SEQ ID 26的氨基酸序列或其功能活性变异体构成，所述VH域包含SEQ ID 28的氨基酸序列或其功能活性变异体，或由SEQ ID 28的氨基酸序列或其功能活性变异体构成。

本发明双特异性抗体形式特别地包含鼠科、嵌合体、人源化和/或人序列。

优选地，根据本发明的双特异性抗体结构以Kd＜10^-8M结合到CD20，和/或以Kd＜10^-8M结合到CD95。

一个示范性构造是图1中示意描绘的具有CD20×CD95特异性的重组双特异性Fab-单链(bsFabXsc)。将它命名为，如NA-C20或Novotarg。

特别地，该结构可获自IgG类的抗体，特别是任何IgG1、IgG2或IgG4亚类，特别地包括获自人IgG抗体的序列或抗体域。

特别地，该结构可获自人IgG抗体。

根据另一具体的方面，该抗体结构是提供用于医疗用途的，优选地，用于治疗或预防B-细胞紊乱。

根据一特定的方面，本发明的抗体结构是提供用于医疗用途的，用于治疗与不希望有的或上调的B-细胞水平相关的疾病状况，例如，过多的或恶性的B-细胞，或由于异常的、过度的或不希望有的免疫反应引起的免疫紊乱。这种疾病状况的例子是自身免疫性疾病或癌症，包括白血病或淋巴瘤。

根据本发明，还提供了治疗或预防B-细胞紊乱的方法，包括给需要的对象施用一治疗有效量的双特异性抗体结构。

根据本发明的另一方面，提供了一种用于治疗B细胞的方法，包括使所述细胞与包含本发明双特异性抗体形式的组合物相接触。这种治疗方法可以是体内或离体的。

具体地，表达死亡受体CD95和细胞表面抗原CD20的所述细胞由双特异性抗体结构靶标，从而诱导细胞凋亡和/或细胞抑制。

具体地，给需要的患者施用治疗有效量的本发明的双特异性抗体结构，优选地，以胃肠外使用的剂型提供，例如，静脉内或皮下剂型，特别是以药物制品提供，所述药物制品包含所述抗体结构和可选的药学上可接受的载体或赋形剂。

根据本发明，进一步提供一药物组合物，其中包含本发明的抗体结构和药学上可接受的载体或赋形剂。

具体地，所述药物组合物提供用于治疗或预防B-细胞紊乱。

根据本发明，还提供了治疗或预防B-细胞紊乱的方法，包括给需要的对象施用一治疗有效量的药物组合物。

根据另一方面，进一步提供一诊断试剂或试剂盒，其中包含本发明的抗体结构用于靶标样品中的B-细胞，以及可选地，进一步包含诊断试剂或工具，如标签，以确定引起B-细胞紊乱的B-细胞数量和/或质量。合适的分析是免疫吸附剂分析试验，如ELISA。例如，本发明抗体可结合到另外的分子上，从而允许在结合分析(如ELISA)和结合研究中对所述结合物进行简单的测定。

然而，根据本发明一具体的实施方式，本发明抗体结构是结合到一标签或报告分子上，例如选自由有机分子、酶标签、放射性标记、彩色标签，荧光标记、显色标签、发光标签、半抗原、地高辛、生物素、金属络合物、金属、胶体金以及它们的混合物组成的组。例如，在分析系统或诊断方法中，可使用结合有标签或报告分子的抗体。

根据进一步的方面，提供了一诊断方法，即采用本发明的抗体结构来确定样品中的B-细胞的方法。

所述样品可以是体液样品，包括血液、血清或尿液。

根据另一方面，进一步提供了编码本发明所述抗体结构的核苷酸序列。

根据另一方面，进一步提供了包含本发明核苷酸序列的载体。

根据另一方面，进一步提供了包含本发明核苷酸序列或本发明载体的宿主细胞。

根据另一方面，进一步提供了产生本发明抗体结构的方法，包括在宿主细胞产生抗体结构的条件下培养或保持本发明的宿主细胞。

附图说明

图1：重组双特异性Fab单链(在本文中，也称为bsFab×sc或作为嵌合体版本的NA-C20，以及作为人源化版本的Novotarg)，其中包含采用单体CH₂域作为连接物将Fab连接到scFv；

本发明的示例性抗体结构的概要描述：双特异性CD20×CD95抗体结构是提供用于在正常的、活化的或恶性的同时表达CD20和CD95的B细胞表面选择性刺激死亡受体CD95；

图2E提供了这种抗体结构的序列，包括CD20(2H7、鼠科、嵌合的和人源化的)和CD95(鼠科、嵌合体的和人源化的)抗体的序列；利用标准技术将编码抗体的遗传构造稳定地转染到Sp2/0细胞内；使用购自英国Chalfont St Giles的GE-Healthcare的kappa-select树脂，利用亲和层析从转染细胞的上清液中纯化蛋白质；

图2：实施例中涉及到的示例性抗体结构的序列：

图2A：抗体结构的小鼠VL和VH序列(分别是SEQ ID 1和5)，它们具有针对CD95的结合位点，下划线的是CDR序列(VL的CDR1、CDR2、CDR3：SEQ ID 2-4；VH的CDR1、CDR2、CDR3：SEQID 6-8)；

图2B：抗体结构的VL和VH序列(分别是SEQ ID 9和10)，它们具有针对CD95的结合位点(人源化的)，下划线的是CDR序列；

图2C：抗体结构的VL和VH序列(分别是SEQ ID 11和15)，它们具有针对CD20的结合位点(鼠科的，来源于Liu et al.The Journal of Immunology 139,3521-3526(1987),NCBI Accession M17953and M17954中描述的抗体2H7)，下划线的是CDR序列(VL的CDR1、CDR2、CDR3：SEQ ID 12-14；VH的CDR1、CDR2、CDR3：SEQ ID 16-18)；

图2D：抗体结构的VL和VH序列(分别是SEQ ID 19和20)，它们具有针对CD20的结合位点(人源化的，衍生自抗体2H7)，下划线的是CDR序列；

图2E：示例性的双特异性抗体结构CD95×CD20、嵌合体和人源化版本：

SEQ ID 21：嵌合体版本轻链的氨基酸序列；

SEQ ID 22：嵌合体版本轻链的核苷酸序列；

SEQ ID 23：嵌合体版本重链的氨基酸序列；

SEQ ID 24：连接序列；

SEQ ID 25：嵌合体版本重链的核苷酸序列；

SEQ ID 26：人源化版本轻链的氨基酸序列；

SEQ ID 27：人源化版本轻链的核苷酸序列；

SEQ ID 28：人源化版本重链的氨基酸序列；

SEQ ID 29：人源化版本重链的核苷酸序列。

图3：NA-C20对CD20和CD95的结合特异性

CD95^-/CD20⁺Daudi细胞(●)和CD95⁺/CD20^-LN-18细胞(○)在用标明浓度的纯化NA-C20(嵌合体CD95×CD20抗体衍生物)孵育后，对它们进行流式细胞术分析；这与5B12(表达NA-C20)克隆得到的未稀释上清液中的抗体结合相比较；抗体检测：羊α人Fcγ-PE，Jackson Immuno Research 109-116-098；

图4：Novotarg对CD20和CD95的结合特异性

CD95^-/CD20⁺Daudi细胞(●)和CD95⁺/CD20^-LN-18细胞(○)在用标明浓度的纯化Novotarg(人源化CD95×CD20抗体衍生物)孵育后，对它们进行流式细胞术分析；这与25-CHO-S/BV004/K44(表达Novotarg)克隆得到的标明稀释倍数的上清液中的抗体结合相比较；抗体检测：羊α人Fcγ-PE，Jackson Immuno Research 109-116-098；

图5：嵌合体CD95×CD20抗体衍生物在体内的半衰期

给C57BL6(雄性，6周大)注射50μg的NA-C20，并在0.5h、1.0h、2.0h和4.0h抽取血液样本。将血清与SKW 6.4细胞一起孵育，然后流式细胞仪中分析结合的抗体(检测抗体：PE-羊抗人Fcγ，Jackson Immuno Research)；

图6：NA-C20和Novotarg激活CD95⁺/CD20⁺细胞中CD95的能力

CD95⁺/CD20⁺SWK 6.4细胞在用标明浓度的NA-C20(●)或Novotarg(○)孵育后，进行胸苷掺入实验；未处理的细胞充当阴性对照(只有细胞的柱)，与抗Apo-1的小鼠mAb(由羊抗鼠Ab交联)一起孵育的细胞充当阳性对照(GaM+Apo的柱)；

图7：在SCID小鼠模型中测试NA-C20

在0天，给八只SCID老鼠注射致死剂量的CD20⁺/CD95⁺B类淋巴母细胞系SKW 6.4。随后，接种肿瘤细胞后，在1天、2天和3天重复给老鼠注射20μg的NA-C20(○)、NA-CMeI(▼)或100μl PBS(●)，或接种肿瘤细胞后，在1天一次性分别注射60μg的抗CD20嵌合抗体(■,▽)以及抗EGFR(表皮生长因子受体，□)的抗体。

具体实施方式

本文使用的术语“抗体结构”指的是由抗体域组成或包含抗体域的多肽或蛋白，其中，抗体域理解为免疫球蛋白重链和/或轻链的恒定域和/或可变域，具有或不具有连接序列。本发明的抗体结构是特定的结构，具体地，包括由VL/VH域对和抗体恒定域(如CL/CH1域)组成的Fab片段的结合位点，并进一步包括scFv的结合位点，其通过CH2域连接到scFv。

木瓜蛋白酶溶解抗体产生三个片段：两个Fab片段以及一个Fc片段。本文的术语“Fab”应理解为，包括Fab、F(ab)或F(ab’)，其包括或不包括铰链区。Fab片段是仍能结合到抗原但不具有Fc部分的单价抗体结构。

抗体域可以是初始的结构，或通过突变或衍生化修饰，例如，修饰抗原结合特征或任何其他特征，如稳定性或功能性特征，如，结合到Fc受体FcRn和/或Fcγ受体。如果包含β-桶状结构，其由环(loop)序列连接的至少两条抗体域结构的β-链组成，多肽序列则认为是抗体域。

术语“抗体结构”应具体指的是展示双特异性结合特性的多肽或蛋白，即，针对靶标抗原CD20和CD95。

示例性的抗体结构具有如图1所描述的特定结构。它可由一Fab片段、一CH2域和一单链Fv(scFv)片段组成，特别地，scFv在VH/VL方向上。该抗体分子可具有一主链，其中，CH2域通过其N-端连接到重链CH1和Fab片段的VH域，通过其C-端连接到scFv片段。

它还可包含一主链，其中，CH2域连接到Fab片段的轻链，即，其中，主链包括VL域和CL域、铰链区、CH2域以及单链Fv片段。

涉及抗体结构的进一步例子是，其主链包括VL域和CH1域、铰链区、CH2域以及scFv片段。较低分子量的第二链包括VH域和CL域。因此，在这种抗体结构中，Fab片段不是“传统的(自然产生的)”Fab片段，其中，轻链和重链的可变域是融合到各自的恒定域(分别是CL或CH1)，但是，“杂合”的Fab片段中，可变域是融合到“相对的链(opposite chain)”的恒定域，即VH域融合到CL域，VL域融合到CH1域。

根据进一步的例子，该抗体结构包括一分子，其主链中的CH2于是连接到CL域和VH域的。较低分子量的第二链包括VL域和CH1域。

然而，根据进一步的例子，该抗体包括一分子，其包含在铰链区和CH2域的修饰，例如，为了获得单体CH2域，例如，CH2域和/或铰链区中的氨基酸已被修饰，例如，替换了形成链间二硫键的半胱氨酸残基(人IgG抗体中的C226和/或C229，此处氨基酸的编号与Kabat编号[EU-index]一致)，从而阻止二聚体的形成。示例性的点突变是C226S和C229S。在一个实施例中，根据Kabat编号[EU-index]，第一主链的铰链域与第二主链的铰链域间的二硫键由一个铰链域序列位置226的半胱氨酸残基和序列位置229的半胱氨酸残基中的至少一个来定义。

一示例性的抗体结构包含SEQ ID 26(轻链)和SEQ ID 28(重链)的氨基酸序列。

进一步的例子涉及修饰以获得可能的ADCC和/或CDC活性下降，例如，通过将IgG1亚型转换成IgG2亚型，例如，通过E233P和/或L234V和/或L235A和/或G236的删除。

进一步的例子涉及修饰以降低系统的活性，例如，通过减少结合到Fc-受体，如D265G和/或A327Q和/或A330A。

进一步的例子涉及修饰以降低免疫原性，例如，通过K.O.糖基化位点，如N297Q，提供对凝集素受体的受损结合。

特别地，术语“抗体”包括分离形式的抗体结构，在本文中理解为，大体上不包含针对不同目标抗原的其他抗体结构，或不包含具有不同结构排列的抗体域的抗体结构。然而，根据本发明的分离的抗体结构可包含在组合的剂型中，该剂型包含分离抗体结构的组合，如包含至少一种其他抗体结构，如具有不同特异性的单克隆抗体或抗体片段。

本发明使用的抗体结构可以是重组的双特异性抗体结构，该术语包含所有通过重组手段制备、表达、创造或分离的抗体结构，如源自动物的抗体，如哺乳动物(包括人)，其包含不同来源的基因或序列，如嵌合抗体、人源化抗体或杂种瘤来源的抗体。另一些例子中，指的是从转化以表达抗体结构的宿主细胞中分离的抗体结构，或从重组的抗体或抗体域组合文库中分离的抗体结构，或通过任何其他手段制备、表达、创造或分离的抗体结构，这些手段涉及将抗体基因序列剪接成其他DNA序列。

应当理解的是，术语“抗体结构”包括其衍生物。衍生物是一个或多个本发明的抗体域或抗体结构和/或融合蛋白的任意组合，其中，任意本发明的抗体结构域可融合在一个或多个其他蛋白(如，其他抗体或抗体结构)的任何位置上，如包含CDR环的结合结构、受体多肽，但也可以是配体、支架蛋白、酶、毒素等。本发明的模块化抗体的衍生物也可通过如共价交联、静电交互作用、二硫键等多种化学技术来联合或结合到其他物质获得。结合到免疫球蛋白的其他物质可以是脂质、碳水化合物、核酸、有机和无机分子或它们的任意组合(例如，聚乙二醇、前体药物或药物)。本发明一个具体的实施例中，本发明的抗体结构是一衍生物，其包含一额外的标签，以允许与生物学可接受的化合物进行特异性反应。对于可用于本发明的标签没有具体的限制，只要在抗体结构结合到其靶标时不会产生或者产生可容许的负面影响即可。合适的标签的例子包括His标签、Myc标签、FLAG标签、Strep标签、钙调蛋白标签、GTS标签，MBP标签和S标签。

该术语衍生物也包括抗体结构的片段、变异体、类似物或同系物，或具有特定糖基化模式的抗体结构，如由糖基化工程生产的，它们是功能等同的并充当功能等同物，如结合到特定的靶标并具有功能特性，如针对靶标B-细胞的活性，如细胞凋亡活性。优选的衍生物在抗原结合方面仍然是功能活跃的，优选地，具有细胞凋亡活性。

关于抗体序列的术语“糖基化工程的”是指由于糖基化工程而具有修改的免疫原性、ADCC和/或CDC的糖基化变异体。所有抗体在重链恒定区的保守位置含有碳水化合物结构，每个同型都拥有不同排列的N连接的碳水化合物结构，这种结构不一地影响蛋白质组装、分泌或功能活性。IgG1型抗体是糖蛋白，其在每一个CH2域里有一保守的N联糖基化位点，Asn297。连接在Asn297的两个复合物双触角寡糖被埋在两个CH2域之间，形成与多肽骨架的广泛接触，并且他们的存在对于抗体调节效应子功能是必要的，如抗体依赖的细胞毒性(ADCC)(Lifely M.R.等人，1995年的Glycobiology第5卷第813-822页)(Lifely,M.R.,etal.,Glycobiology 5:813-822(1995))。将在N297的N多糖移除，通常会产生具有减少ADCC的无糖基化的Fc，如通过N297突变，例如转变为A或T299。

抗体糖基化的主要区别产生于细胞株之间，在不同培养条件下，给定细胞株即使很微小的差异也能被看到。通常在细菌细胞中表达糖基化的抗体。

特别地，根据本发明的抗体结构缺乏活性Fc部分，因而组成不包含FCGR结合位点的抗体域，具体地，该抗体结构包括缺乏CH2域和CH3域的链的任意的抗体结构，或包含的抗体域是缺乏Fc效应子功能的，例如，通过修饰来降低Fc效应子功能，特别是废除或降低ADCC和/或CDC活性。这种修饰可以通过突变来产生，例如，在FCGR结合位点的突变，或通过衍生物或试剂来影响抗体结构的ADCC和/或CDC活性，从而实现下调Fc效应子的功能或缺失Fc效应子的功能，这通常被理解为，是指通过测量ADCC和/或CDC活性，得到Fc效应子的功能小于未修饰(野生型)结构的10％，优选地，小于5％。

本文使用的术语“B-细胞紊乱”是指多种紊乱，包括但不限于B-细胞恶性肿瘤、自身免疫紊乱、B-细胞淋巴瘤、B-细胞白血病和其他紊乱。自身免疫紊乱的具体例子选自：系统性红斑狼疮、Sjogren综合症、硬皮病、类风湿关节炎、幼年特发性关节炎、移植体对抗宿主疾病、皮肌炎、I型糖尿病、桥本氏甲状腺炎、格雷夫斯氏病、阿迪森氏病、乳糜泻、克罗恩病、恶性贫血、寻常型天疱疮、白癜风、自身免疫性溶血性贫血、特发性血小板减少性紫癜、巨细胞性动脉炎、重症肌无力、多发性硬化症(MS)，优选复发缓解型MS(RRMS)、血管球性肾炎、古德帕斯丘综合症、大疱性类天疱疮、溃疡性结肠炎、格林-巴利综合症、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、抗磷脂综合症、发作性嗜睡病、结节病以及韦格纳氏肉芽肿。

根据本发明的抗体结构允许调节B细胞库以下调B细胞的自身反应性。该调节比通过单特异性抗体获得的更有特异性，这是因为仅有活化的表达CD95的B细胞，而没有不表达的未活化B细胞受到影响。可以证明，根据本发明的抗体结构诱导了活化的B细胞的细胞凋亡，并进一步抑制诱导IgG产生的激活，并抑制活化B细胞的IgG合成。因此，产生IgG抗体的自身反应性B细胞针对自身免疫靶标，如自身抗原可被有效地降低。

通过本发明的双特异性抗体结构，不仅恶性B细胞，而且表达CD95死亡受体的活化的正常(良性)B细胞都能被靶向且被耗尽。相反，不会靶向未活化的B细胞，这些正常B细胞不会看到效果。这表明，活化的B细胞在于本发明的抗体结构孵育后，是对CD95敏感的，易于经历凋亡性细胞死亡。

耗尽活化的B细胞抑制了抗体的产生。这是让人意外的，因为末端已分化的抗体产生细胞，即浆细胞不会表达CD20。显然，抑制活化的前体B细胞足以抑制抗体的产生。

通过本发明双特异性抗体结构抑制抗体产生是优先于采用已构建好的单特异性CD20抗体，如利妥昔单抗

其耗尽所有表达CD20的B细胞，而不会从正常的或未活化的B细胞分化自身反应性的或活化的B细胞。

对于本发明的抗体或抗体结构，使用的术语“结合位点”指的是能与抗原反应结合的分子结构。通常，该结合位点是位于抗体的互补决定区(CDR)内，本文也称之为“CDR结合位点”，其为具有多种结构的特定区域，赋予结合到多种抗原的结合功能。多种结构可从自然抗体库中衍生得到，例如，鼠科动物或人抗体库，或可以是一重组或合成产生的，例如，通过突变形成，以及具体地通过随机化技术。这些包括诱变突变的CDR区和抗体可变域的环区，特别地，抗体的CDR环，如VL和/或VH抗体域的任意CDR1、CDR2和CDR3环。根据本发明使用的抗体结构通常包含一个或多个CDR结合位点，每一个针对一种抗原。

本文所使用的“特异”或“双特异性”是指在异源群体分子中对目标同源配体起决定作用的结合反应。因此，在指定条件，例如，免疫分析条件下，抗体结构特异性结合到特定目标，而不会大量结合到样本中其他分子上面。

特异性结合位点通常与其他抗原没有交叉反应。尽管如此，特异性结合位点可特异性地结合到抗原的一个或多个表位、异构体或变异体，或与其他相关的靶标抗原，如同系物或类似物交叉反应。

特异性结合是指根据选择的目标识别度，高、中或低结合亲和力或亲合力进行的选择性结合。如果结合常数或者结合动力学至少10倍不同，优选是100倍不同，更优选是1000倍不同，则通常可实现选择性结合。

本发明的双特异性抗体结构具体地包含带有特异性结合特性的两个位点，其中，该抗体结构能识别两种不同的靶标抗原。因此，示例性的双特异性抗体结构可包含两个结合位点，其中，每个结合位点能特异性地结合不同的抗原，例如，死亡受体和B细胞的细胞表面抗原。

对于抗体或抗体结构的结合位点，本文使用的术语“单价”指的是仅包含一个针对靶标抗原的结合位点的分子。因此，术语“化合价”理解为针对相同靶标抗原的结合位点的数目，特异性地结合抗原的相同或不同的表位。

本发明的抗体结构理解为包含特异性结合死亡受体靶标的单价结合位点，以及特异性结合到B细胞上，尤其是自身反应性B细胞上表达的细胞表面抗原的单价结合位点。

本文术语“抗原”与术语“靶标”或“靶标抗原”可交换使用，指的是通过抗体结合位点识别的整个靶标分子或该分子的片段。具体地，抗原的底层结构，如多肽或糖结构，通常称为“表位”，例如，B细胞表位或T细胞表位，这些都是免疫相关的，是由结合位点识别的。本文使用的术语“表位”特别指的是可完整地形成本发明抗体结构结合位点的特异性结合配体或特异性结合配体的部分。一表位可由糖、肽结构、脂肪酸、有机、生化或无机物质组成，或它们的衍生物和任意组合组成。如果表位包含在肽结构如肽、多肽或蛋白中，其通常包括至少3个氨基酸，优选地，5-40个氨基酸，以及更优选地，在大约10-20个氨基酸之间。表位可以是线性的，或构象表位。线性表位有多肽或糖链一级序列的单个节段组成。线性表位可以是连续的，或者是重叠的。构象表位由氨基酸或糖类组成，通过折叠多肽组合在一起形成三级结构，而这些氨基酸是不需要在线性序列中彼此相邻的。

对于B细胞，本文使用的术语“细胞表面抗原”指的是在B细胞，优选地，成熟的、活化的或自身反应性B细胞的表面上表达的抗原，其能被结合到其上的拮抗剂攻击。CD20被认为是示例性的B细胞表面标识物，由本发明的抗体结构靶向。

特异性结合到CD20的结合位点可来自商业可购买的针对抗原的单克隆抗体，如利妥昔单抗或针对CD20的欧可利殊单抗(ocrelizumab)。具体地，可以使用来自任意抗CD20抗体结构的结合位点，如图2中例示。

术语“CD20”包括人CD20的任意变体、异构体和物种同系物，其通过细胞自然表达，或在转染了CD20基因的细胞上表达。

本文的术语“死亡受体”与本文使用的术语“CD95”可以互换，指的是衍生自细胞表面受体的抗原，其通过一个或多个细胞凋亡途径导致程序性细胞死亡。结果表明，与活化的B细胞不同，CD95不会在正常的未活化的B细胞上表达。

CD95也被称为Fas或Apo-1，是肿瘤坏死因子受体超家族的成员。特异性结合到CD95的结合位点可以是来自针对CD95的抗体，如德国Herford的Acris Antibodies分售的克隆APO-1或LT95和DX 2。具体地，可以使用来自任意抗CD95抗体结构的结合位点，如图2中例示。

术语“CD95”包括人CD95的任意变异体、异构体和物种同系物，其通过细胞自然表达，或在转染了CD95基因的细胞上表达。

术语“变异体”指的是，例如通过定点突变方法获得的突变体，特别是，例如通过亲和力成熟技术删除、替换、将插入引入到抗体特定区域或化学衍生化氨基酸序列，优选地，在恒定域中设计抗体效应子的功能或半衰期，或者在可变域中改善抗原结合特性。可使用任何已知的突变方法，例如包括通过随机技术在所需位置获得的点突变。在一些情况下，位置是随机挑选的，例如，可选择任意氨基酸或选择优选的氨基酸来随机化抗体序列。术语“变异体”应当特别包含功能活化的变异体。

术语分子的“功能活化的变异体”，如本文使用的抗体，指的是通过插入、删除或替换一个或多个氨基酸，或通过化学衍生化氨基酸序列中一个或多个氨基酸残基，或核苷酸序列的一个或两个远端中的核苷酸，其中，这些修饰不会影响(特别是不会损害)这一序列的活性。在结合位点对选择的靶抗原具有特异性的情况下，功能活跃的分子变异体仍然具有预定的结合特性，尽管这一点可能会改变，如改变对特定抗原表位的良好特异性、亲和性、亲合力、Kon或Koff率等。

可通过改变母本抗体结构的序列来获得功能活性变异体，如图2的任意序列，如图2E i)或ii)的NA-C20或Novotarg序列，并且其特征在于，具有与各自序列展示的生物活性相似，包括结合CD20和/或CD95或靶标活化的或自身反应性的B细胞的能力。

优选地，该抗体结构的功能活化变异体通过特异性结合试验或靶向活化的或自身反应性的B细胞功能测试，确定具有大体上相同的生物活性。本文使用的术语“大体上相同的生物活性”指的是大体上相同的生物活性显示为母本抗体结构，如图2E的重组双特异性抗体结构NA-C20或Novotarg测定的活性的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或甚至至少100％或至少110％、或至少120％、或至少130％、或至少140％、或至少150％、或至少160％、或至少170％、或至少180％、或至少190％，如达到200％。

在一个优选实施例中，功能活化变异体

a)是分子的生物活性片段，所述片段包括该分子的至少50％分子序列，优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％，甚至更优选至少95％及最优选至少97％、98％或99％；

b)是来自至少进行一个氨基酸替代、添加和/或删除的分子，其中所述功能活跃变异体与所述分子或者一部分具有序列一致性，例如具有至少50％序列一致性的抗体，优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％，甚至更优选至少95％，以及最优选至少97％、98％或者99％；和/或

c)由所述分子或它的功能活性变异体组成，另外至少一个氨基酸或者核苷酸与多肽或者核苷酸序列是异源的，优选是其中的功能活性变异体来自任何自然产生，或重组抗-CD19、抗-CD20、抗CD-40和/或抗CD-95抗体。

在本发明一个优选实施例中，本发明抗体的功能活化变异体本质上与上述变异体相同，但与变异体的多肽或核苷酸序列分别不同，因为其来源于不同种的同源序列。这些都指的是自然产生的变异体。

本发明尤其提供嵌合的、人源化的或人类的序列以及包含这些嵌合的、人源化的或人类的序列的母本抗体结构的功能活化变异体。

对于本发明的抗体结构，使用术语“嵌合的”，指的是那些重链和轻链的每个氨基酸序列的一部分与来源于特定种或属于特定纲的抗体中相应的序列是同源，而链中的剩余部分与另一种或纲的相应序列是同源的抗体。通常，轻链和重链的可变域模仿来源于一种哺乳动物的抗体可变域，而恒定域则与来源于另一种哺乳动物的抗体序列同源。例如，可变域可以来源于目前已知的来源，其使用容易地从非人宿主生物中获得的B-细胞或杂交瘤，并与来源于如人细胞制剂的恒定域组合。

对于本发明的抗体结构，使用的术语“人源化”指的是具有抗原结合位点的分子，该抗原结合位点大体上来源于非人类种属的免疫球蛋白，其中，该分子剩余的免疫球蛋白结构是基于人类免疫球蛋白的结构和/或序列。该抗原结合位点包含完整的融合在恒定域上的可变域，或仅仅是移植在可变域中合适的构架区的互补决定区(CDR)。抗原结合位点可以是野生型或修饰的，如，一个或多个氨基酸替换，优选地，修饰成更接近于人免疫球蛋白。一些类型的人源化抗体保留着所有的CDR序列(例如，包含来自老鼠抗体中所有6个CDRs的人源化老鼠抗体)。其他类型则具有一个或多个相对于原始抗体改变了的CDRs。

对于本发明的抗体结构，使用的术语“人”，理解为包括具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变域和恒定域的抗体。本发明的人抗体结构可包括并非由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(如，体外随机突变或定点突变，或体内体细胞突变引入突变)，例如，在CDRs上。本发明的人抗体结构包括从人免疫球蛋白库中分离，或从动物中分离并通过转基因用于一种或多种人免疫球蛋白的抗体。

术语“功能活化变异体”还包括自然产生的等位基因变异体，以及突变体或者任何其他非自然产生的变异体。在现有技术中众所周知的是，等位基因变异体是一种(多)肽的替代形式，其特征是具有一个或多个氨基酸的替换、删除、添加，其本质上不会改变多肽的生物功能。

功能活化变异体可通过改变多肽或核苷酸序列获得，例如通过一个或多个点突变，其中在结合本发明使用时，序列改变保持了没被改变的多肽或核苷酸序列的功能。此种序列改变包括但不限于，(保守)替换、添加、删除、突变和插入。

CDR变异体包括修改了至少一个氨基酸的氨基酸序列，其中，所述修改可以是氨基酸序列的化学改变或部分改变，该修改使得变异体保留着未修改序列的生物特性。例如，该变异体是功能变异体，可结合CD19、CD20、CD40或CD95。CDR氨基酸序列的部分改变可通过删除或替换一个到多个氨基酸序列，如1、2、3、4或5个氨基酸，或通过增加或插入一个到多个氨基酸序列，如1、2、3、4或5个氨基酸，或通过化学衍生化一个到多个氨基酸序列，如1、2、3、4或5个氨基酸，或通过它们的组合来实现。氨基酸残基的替换可以是保守替换，例如，将一个疏水性氨基酸替换成替代的疏水性氨基酸。

保守替换是那些在其侧链和化学性质方面相关的氨基酸家族内发生的替换。这些氨基酸家族的实例有具有碱性侧链的氨基酸、具有酸性侧链的氨基酸、具有非极性脂肪族侧链的氨基酸、具有非极性芳香烃铡链的氨基酸、具有不带电极性侧链的氨基酸、具有小侧链的氨基酸及具有大侧链的氨基酸等。

特别地，点突变理解为对多核苷酸的工程设计，获得与非工程设计的氨基酸序列不同的氨基酸序列的表达，其中，非工程设计的氨基酸序列通过替换或交换、删除或插入一个或多个单核苷酸(不连续的)或核苷酸双联体得到不同的氨基酸。

优选的点突变指的是相同极性和/或电荷的氨基酸的替换。在这一点上，氨基酸指的是由64个三联体密码子编码的20种自然氨基酸。这20中氨基酸可以划分成具有中性电荷、正电荷和负电荷：

“中性”氨基酸如下所示，连同它们对应的三字母码和单字母码，以及极性：

丙氨酸：(ALa，A)非极性，中性；

天门冬酰胺：(Asn，N)极性，中性；

半胱氨酸：(Cys，C)非极性，中性；

谷氨酰胺：(Gln，Q)极性，中性；

甘氨酸：(Gly，G)非极性，中性；

异亮氨酸：(Ile，I)非极性，中性；

亮氨酸：(Leu，L)非极性，中性；

蛋氨酸：(Met，M)非极性，中性；

苯丙氨酸：(Phe，F)非极性，中性；

脯氨酸：(Pro，P)非极性，中性；

丝氨酸：(Ser，S)极性，中性；

苏氨酸：(Thr，T)极性，中性；

色氨酸：(Trp，W)非极性，中性；

酪氨酸：(Tyr，Y)极性，中性；

缬氨酸：(Val，V)非极性，中性；以及

组氨酸：(His，H)极性，正电荷(10％)中性(90％)。

“正”电荷的氨基酸是：

精氨酸：(Arg，R)极性，正电荷；以及

赖氨酸：(Lys，K)极性，正电荷。

“负”电荷的氨基酸是：

天冬氨酸：(Asp，D)极性，负电荷；以及

谷氨酸：(Glu，E)极性，负电荷。

关于在此鉴定的多肽序列的"百分比(％)氨基酸序列同源性”定义为候选序列中的氨基酸残基与特定多肽序列中的氨基酸残基相同的百分比，为了实现最大百分比序列同源度，而不考虑任何保守取代作为序列同源性的部分，如果有必要，可在序列比对和引入缺口后计算氨基酸残基百分比。本领域技术人员可确定测定比对的适当参数，包括为了实现与待比对的全长序列的最大对准度的任何算法。

本文使用的术语“对象”指的是温血哺乳动物，特别地，指人类。尤其是应用到需要预防或治疗B细胞紊乱或与B细胞紊乱相关的疾病状况的对象中的本发明的医疗用途类型，或者各自治疗方法。所述对象可以是遭受早期或晚期疾病折磨的病人，或容易遭受这些疾病的对象，例如，遗传素质。

根据一特定的实施例，本发明的抗体结构具有细胞凋亡活性，即不依赖免疫效应细胞，如NK细胞，而对靶标B细胞有细胞毒性活性。具体地，本发明的抗体结构在标准细胞凋亡分析中检测具有细胞凋亡活性，如在标准DNA片段分析中检测。

优选地，采用测定死亡中和/或死亡细胞的标准方法来测量细胞凋亡活性。为了测量细胞凋亡，可以采用细胞毒性分析。这些分析可以是测量细胞质膜透性增加的放射性或非放射性分析，因为死亡中的细胞会变得渗漏的，或者测量线粒体中代谢活性降低的比色分析。死亡细胞中的线粒体不能代谢染料，但活细胞中的线粒体可以。

也可测量细胞凋亡的早期指示物，如由于细胞表面外的磷脂酰丝氨酸的出现而导致的细胞膜不对称性改变(基于膜联蛋白V的分析)。可选地，细胞凋亡后期，如可以测量细胞群或单个细胞中凋亡蛋白酶的激活。此外，可以确定细胞色素C和AIF释放通过线粒体进入细胞质或染色体DNA片段的计量。

脱氧核苷酸末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记是一种用于检测细胞凋亡信号级联所产生的DNA片段的常用方法。这种分析依赖于DNA中缺口的存在，其可被脱氧核苷酸末端转移酶识别，这种酶将催化加入溴化的(bromolated)dUTPs，而溴化的dUTPs由特定的标记抗体进行间接检测。

在单独的离体细胞杀伤分析中测量，如通过流式细胞术测量用双特异性抗体孵育后的B细胞存活数，根据本发明的抗体结构的优选细胞凋亡活性相当于至少20％的细胞溶解，优选地，至少30％，更优选地，至少40％，甚至更优选地，至少50％。

具体地，本发明的抗体结构缺失Fc效应子功能，并在标准ADCC或CDC分析中测量，如采用在细胞表面表达受体靶标的细胞，免疫效应细胞存在时没有明显的细胞毒性活性。

如果与对照相比，由ADCC或CDC分析测定的细胞溶解没有明显增加，那么，本发明的抗体结构则显示为很低的细胞毒性活性。如果通过ADCC和/或CDC活性的绝对增长百分率测量细胞毒性活性，优选低于10％，优选低于5％，更优选地低于3％，那么通常可以确定Fc效应子功能的缺失。

优选地，抗体结构用于以高亲和力结合一个或两个靶标抗原，特别是以高的结合速率和/或低的解离速度，或高的结合亲合力。抗体的结合亲和力通常以抗体的浓度来表征，在这一浓度下，一半的抗原结合位点被占用，被称为解离常数(Kd或K_D)。通常，结合剂(binder)具有Kd＜10^-8M，优选地，Kd＜10^-9M，甚至更优选地，Kd＜10_-10M被认为是高亲和力的结合剂。

但是，在一可选的优选实施例中，单独抗原的结合亲和力是具有中等亲和力，如，当结合到至少两个抗原时，例如，Kd小于10^-6M而大于10^-8M。

本发明的双特异性单克隆抗体结构可通过多种技术产生，包括重组抗体技术，可选地，采用杂种瘤或人类抗体序列库。优选是重组抗体技术，因为其允许通过转染细胞实现可重复的生产，以及简单的纯化。

具体地，本发明的抗体结构以药物组合物来提供。考虑到药物组合物，其中，按配方制造本发明抗体结构和一种或多种治疗活性剂。通过混合具有所需纯度的抗体结构，与可选的药学上可接受的载体、辅料或稳定剂，以冻干剂型、水溶液或水包油乳液的形式配制用于存储的本发明抗体结构的稳定配方。

通常，这种组合物包含已知的并且由可接受的医学实践呼吁的药学上可接受的载体，见，如Remingtons Pharmaceutical Sciences,16th edition(1980)Mack PublishingCo.。这种载体的例子包括无菌的载体，如盐水、林格氏液或葡萄糖溶液，可选地，用合适的缓冲剂缓冲到pH在5-8的范围内。

待施用的体内剂型需要是无菌的。这通过无菌滤膜或其他合适的方法过滤可以很容易实现。

施用包含本发明抗体结构的药物组合物可以通过多种途径实现，包括全身性或肠胃外给药，优选地以灭菌水溶液的形式，如通过静脉、肌肉或皮下途径，也可以通过口服、鼻内、耳内(intraotically)、经皮、黏膜、局部(例如，凝胶、膏剂、洗剂、霜剂等)、腹膜内、肌肉内、肺内、阴道内、肠道外、经直肠或眼内给药。因此，本发明为这些用途提供抗体结构的各自合适剂型。

本发明包括一药物制剂，包含治疗有效量的作为活性物质的本发明抗体结构。特别地，抗体结构的药学上可接受的剂型与需要治疗的对象的治疗相兼容。

本发明的抗体结构的术语“治疗有效量”在本文与“有效量”或“足够量”的任意一个可交换地使用，是指当给药给对象时，能足够获得有益或期望的结果包括临床效果的量或活性，并且，就这点而论，有效量或其同义词取决于其应用的背景。在疾病的背景中，抗体结构的治疗有效量可用于治疗、调节、减弱、逆转或影响疾病或病状，这受益于过多B细胞的下调或降低，如用于自身免疫反应的抑制，例如与自身反应性B细胞紊乱相关的急性或慢性炎症性疾病。有效量是目的在表示化合物足够治疗、预防或抑制这些疾病或紊乱的量。相应于这一有效量的抗体结构的量根据不同的因素而不同，如给定的药物或化合物、药物剂型、给药的方式、疾病或紊乱的类型、治疗的对象或宿主的特性等等，虽然如此，但是通常能由本领域技术人员确定。

此外，对象采用治疗有效量的本发明抗体结构的治疗或预防方案可包括单次给药，或者包含一系列的应用。例如，可以至少一年给予抗体结构一次、至少半年一次或至少一个月一次。然而，在另一实施例中，对于给定的治疗方案，可以从大约每周一次到大约每日给予对象抗体结构。治疗期的长短取决于多个因素，如疾病的严重性，患者的年龄，抗体形式的浓度和活性。也应当理解的是，用于治疗或预防的有效剂量可在具体的治疗或预防方案过程中增加或降低。剂量的改变可通过本领域已知的标准诊断试验获得并且是变得明显的。在一些例子中，是需要长期给药的。

具体地，为人类患者提供的治疗有效量的抗体结构在0.5-500mg的范围，优选1-400mg，更优选高达300mg，高达200mg，高达100mg或高达10mg，但可能需要更高剂量的治疗，如用于治疗急性疾病的状况。

用于胃肠外给药的剂型例子包括那些适用于皮下注射、肌肉注射或静脉注射的，如无菌溶液或悬浮液。

在一个实施例中，本发明的抗体结构是唯一给药到患者的治疗活性剂，例如，作为疾病缓解的单药疗法。

可选地，根据本发明的抗体结构与一种或多种其他治疗剂一起给药，包括但不下雨标准治疗，如在恶性病情况下的化学治疗，或在MS情况下的干扰素-β或类固醇，或在ITP情况下的高剂量免疫球蛋白。

组合疗法尤其采用标准治疗方案，如，用于治疗RRMS。这可包括干扰素-β或类固醇。

在组合疗法中，抗体结构以混合物给药，或伴随一种或多种治疗方案，如在伴随治疗之前、同时或之后。

本发明抗体结构的生物特性，可在细胞中、组织和整个生物的离体实验中表征。如本领域已知的，为了测试药物对抗疾病或疾病模型的药物效力，或测试药物的药物动力学、药效动力学、毒性或其他特性，通常在动物中进行体内测试，包括但不限于小鼠、大鼠、兔子、狗、猫、猪和猴子。动物可指的是疾病模型。疗法通常在小鼠中测试，包括但不限于裸鼠、SCID小鼠、异种移植小鼠或转基因小鼠(包括敲入和敲除)。这种实验过程可提供有意义的数据，用于确定抗体结构用于治疗的可能性，其具有合适的半衰期、效应物功能、细胞凋亡活性和IgG抑制活性。任何生物，优选哺乳动物，都可用于测试。例如，由于与人类的基因相似性，灵长类动物、猴子可以是合适的治疗模型，因此可用于测试本发明抗体结构的效力、毒性、药物动力学、药效动力学、半衰期或其他性质。最终是要求在人类上测试该物质以批准为药物的，而这些实验是在计划中的。因此，本发明的抗体结构可在动物模型或人类中测试，以确定它们的治疗效力、毒性、免疫原性、药效动力学和/或其他临床性质。

本发明抗体的生产和鉴定方法在本领域是周知的。在一优选实施例中，生产出抗体变异体，并应用采用表达本发明抗体结构的细胞的一种或多种基于细胞的分析或者体内分析来筛选预定属性的抗体。这种分析往往涉及到监控细胞对抗体的应答反应，例如，细胞存活、细胞死亡、细胞形态的改变、转录激活例如自然基因或者报道基因的细胞表达。

这些分析通常基于抗体结构的功能，也就是抗体结构结合靶标抗原的能力，如在相同细胞上的靶标抗原，以及介导一些生化反应的能力，如介导所述细胞的细胞凋亡或抑制所述细胞，例如，在竞争结合分析中，本发明抗体的存在或不存在时，B细胞结合抑制或IgG表达的降低。

监测细胞死亡或生存的方法在本领域是已知的，包括使用染料、免疫化学试剂、细胞化学试剂和放射性试剂。例如，半胱天冬酶染色分析可测量细胞凋亡，并且吸收或释放放射性底物或荧光染料，比如阿尔玛蓝，可实现对细胞生长或活化的监测。

转录激活也可在基于细胞的分析中作为一种分析功能的方法。在这种情况下，可通过分析可上调的自然基因或免疫球蛋白来监测响应，例如，释放某些白细胞介素可被测量，或者通过报告基因结构读出。基于细胞的分析也可涉及细胞形态变化的测量，以作为本发明抗体存在的一种响应。

本发明抗体结构的重组生产，优选采用表达系统，如包含表达构建体或载体，其中包含编码所述抗体结构的核苷酸序列。

术语“表达系统”是指以可控连接的方式(operable linkage)包含所需的编码序列和控制序列的核酸分子，这样这些序列转化或转染的宿主能够产生编码蛋白质。为了有效转化，表达系统可包含在一载体上，然而，相关DNA也可随后被整合到宿主染色体上。或者，体外转录/翻译可采用表达系统。

本文使用的“表达构建体”或“载体”定义为转录克隆重组核苷酸序列所需的DNA序列，即，在合适的宿主生物中，重组基因转录及它们的mRNA的翻译所需的DNA序列。表达载体包含表达组件以及通常在一宿主细胞中包含用于自主复制的复制起始点(origin)或一基因整合位点、一个或多个可选择的标记(例如，氨基酸合成基因或赋予抗生素抵抗的基因，如博来霉素(zeocin)、卡那霉素、G418或潮霉素)、多个限制性酶切位点、适当的启动子序列以及转录终止子，这些组件是可操作连锁在一起的。本文使用的术语“质粒”和“载体”包括自主复制的核苷酸序列以及基因整合核苷酸序列。

特别地，该术语指的是一运载工具，通过它能将DNA或RNA序列(如，外源基因)，如编码本发明抗体结构的核苷酸序列引入宿主细胞中，从而转化宿主，并促进引入的序列的表达(如，转录和翻译)。质粒是本发明优选的载体。

载体通常包含可遗传媒介的DNA，外来DNA可插入其中。将一个DNA片段插入到另一DNA片段中的一种常用方法包括使用称为限制酶的酶，限制酶在称为限制性位点的特定位点(特定的核苷酸群)裂解DNA。“组件”指DNA编码序列或编码可插入载体上明确的限制位点的表达产物的DNA片段。组件的限制位点设计的目的在于确保组件插入到适当的阅读框中。一般来说，外来DNA在载体DNA的一个或多个限制位点处插入，然后由载体携带随可遗传载体DNA进入宿主细胞。具有插入的或增加的DNA的DNA片段或序列，如表达载体，也被称为“DNA构建体”。载体的一种常见类型是“质粒”，其通常是双链DNA的独立分子，能容易地接收额外的(外源)DNA，并能容易地引入到合适的宿主细胞中。本发明的载体通常包含编码DNA和表达控制序列，如启动子DNA，并具有一个或多个适合用于插入外来DNA的限制位点。编码DNA是一种DNA序列，其编码用于特定多肽或蛋白，如本发明的抗体结构的特定氨基酸序列。启动子DNA是启动、调节或者介导或控制编码DNA表达的DNA序列。启动子DNA和编码DNA可以是来自相同的基因或不同基因，可以是来自相同或不同的生物。本发明的重组克隆载体通常包括一个或多个用于克隆或表达的复制系统、一个或多个在宿主中用于筛选的标记物，如抗生素抗性，以及一个或多个表达组件。

用于连接DNA序列的方法，例如分别提供或编码本发明的因子，和/或POI、启动子、终止子以及其他序列，以及用于将它们插入到合适的载体中的方法(该载体包含结合或宿主复制的必需信息)对于本领域技术人员来说是已知的，例如描述于“J.Sambrook etal.,"Molecular Cloning 2nd ed.",Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)”。

本文使用的术语“细胞系”指的是一具体类型的细胞构建的克隆，其获得在一长时间段内增殖的能力。术语“宿主细胞系”是指用于表达内源或重组基因以产生多肽，如本发明的重组抗体结构的细胞系。一“生产宿主细胞系”或“生产细胞系”通常理解为即用型细胞系，其用于在生物反应器中培养以获得生产过程中的产物，例如本发明的重组抗体结构。

具体地，宿主细胞应当理解为转染有表达构建体，如本发明的载体的重组细胞或细胞系。

本文使用的术语“重组”指的是“由基因工程制备”或“基因工程的结果”，如具体采用异源序列并入到重组载体或重组宿主细胞中。

本发明的双特异性单克隆抗体结构可采用任何已知的且成熟的表达系统，以及重组细胞培养技术来产生，例如，通过在细菌宿主(原核生物系统)中表达，或真核生物系统，如真菌、昆虫细胞或哺乳动物细胞。本发明的抗体分子可在转基因生物中产生，如羊、植物或XENOMOUSE转基因鼠，这种基因工程小鼠品系具有大片段的人类免疫球蛋白基因座，并缺失小鼠抗体的产生。抗体也可通过化学合成产生。

根据具体的实施例，宿主细胞是选自以下生产细胞系中的细胞，包括CHO、PerC6、CAP、HEK、HeLa、NS0、SP2/0、杂种瘤和Jurkat。更具体地，宿主细胞获自CHO-K1、CHO-DG44或CHO-S细胞。

中国仓鼠卵巢(CHO)细胞最常被用于抗体生产。除了提供合适的糖基化模式，这些细胞可以持续生产遗传稳定的高产克隆细胞株。他们可以在没有血清的简单生物反应器中培养到较高浓度，并且允许安全和可复制的生物工艺的改进。

具体地，本发明的宿主细胞在无血清培养基中培养或保存，如包含其他成分，如血浆蛋白质、激素和生长因子作为血清的替代物。

在缺乏血清条件下以及在缺乏任何动物来源的蛋白质/肽的培养基中建立、适应和完全培养时，宿主细胞是最首选。

通过参考下述实例能够更充分地理解上述说明。但是，这些的实例仅仅是代表本发明的一个或多个实施方法，而不应理解为限制本发明的范围。

实例

实例1对CD20和CD90具有特异性的双特异性抗体结构的生产

嵌合体版本(命名为NA-C20)

在SP2/0细胞系中成功表达了编码嵌合体轻链(鼠抗CD95VJ/人CL；SEQ ID 21)和嵌合体重链(鼠抗CD95VDJ/人CH1/铰链区/修改的CH2/抗CD20VHVL；SEQ ID 23)的氨基酸序列。这些蛋白由SEQ ID 22和SEQ ID 25的核苷酸序列编码，它们正确地组装以形成所述双特异性抗CD95×CD20的抗体衍生物。这通过在蛋白质印迹采用对人IgG1和人kappa轻链特异的抗体来检测，从而确定。用于进一步表征的蛋白通过亲和力层析(CaptoL，GEHealthcare)将细胞培养液上清液纯化。

人源化版本(命名为Novotarg)

将编码人源化CD95-VJ/人CL(SEQ ID 26)和人源化CD95-VDJ-CH1-H-CH/人源化CD20scFv(SEQ ID 28)的氨基酸序列逆翻译成核苷酸序列，并为灰仓鼠优化密码子。相应的核苷酸序列列举在SEQ ID 27和SEQ ID 29中。为中国仓鼠卵巢(CHO)宿主细胞系的转染设计、合成并克隆合成基因到合适的表达载体中。成功地表达并组装这些序列，以形成所述双特异性抗体衍生物。这通过在蛋白质印迹采用对人IgG1和人kappa轻链特异的抗体来检测，从而确定。用于进一步表征的蛋白通过亲和力层析(CaptoL，GE Healthcare)将细胞培养液上清液纯化。

实施例2：对CD20和CD90具有特异性的双特异性抗体结构的表征

嵌合体CD95×CD20的抗体衍生物对CD95和CD20的结合亲合力

嵌合体CD95×CD20的抗体衍生物对其靶标的成功结合由流式细胞术(BD FACSCalibur)确定。CD20⁺/CD95^-B成淋巴细胞系(Daudi)和CD20^-/CD95⁺胶质瘤细胞系(LN-18)分别与系列稀释的嵌合体抗体衍生物一起孵育(在PBS、1％FCS和0.01％NaN₃中，2×10⁶细胞/样品，4℃，1小时)。采用PE标记的羊抗人Fcγ特异性抗体(Jackson Immuno Research，商品目录号109-116-098，1:200，4℃，30分钟)检测结合的蛋白。平均荧光强度的浓度相关提高证明了嵌合双特异性抗体成功结合到CD20和CD95(图3)。

人源化CD95×CD20的抗体衍生物对CD95和CD20的结合亲合力

人源化CD95×CD20的抗体衍生物对其靶标的成功结合由流式细胞术(BD FACSCalibur)确定。CD20⁺/CD95^-B成淋巴细胞系(Daudi)和CD20^-/CD95⁺胶质瘤细胞系(LN-18)分别与系列稀释的嵌合体抗体衍生物一起孵育(在PBS、1％FCS和0.01％NaN₃中，2×10⁶细胞/样品，4℃，1小时)。采用PE标记的羊抗人Fcγ特异性抗体(Jackson Immuno Research，商品目录号109-116-098，1:200，4℃，30分钟)检测结合的蛋白。平均荧光强度的浓度相关提高证明了人源化双特异性抗体成功结合到CD20和CD95(图4)。

嵌合体CD95×CD20抗体衍生物在体内的半衰期

C57BL6小鼠(雄性，6周大，n＝3)通过静脉(尾静脉注射)接受50μg的嵌合体CD95×CD20抗体衍生物(NA-C20)。在注射后0.5h、1.0h、2.0h和4.0h抽取血液样品。通过流式细胞术检测抗体结合到CD20⁺/CD95⁺B-类淋巴母细胞系SKW 6.4来测量血清抗体浓度。

实施例3：体外证明双特异性抗体结构对CD20和CD90具有特异性的概念

CD95×CD20抗体衍生物的效力

在CD20⁺/CD95⁺B-类淋巴母细胞系SKW 6.4上的嵌合(NA-C20)和人源化变异体展示了在CD20⁺/CD95⁺B-细胞上活化CD95的效力。细胞与系列稀释的CD95×CD20抗体衍生物孵育，并通过胸苷掺入分析确定细胞的增殖。简单地说，在96孔平底微量滴定板中每孔接入3×10⁴个细胞，并加入相应浓度的抗体衍生物。24小时后，加入[³H]甲基-胸苷(购自Hartmananalytics，商品目录号MT6035/3)到细胞，终浓度为0.5μCi/孔。20小时孵育后，收获细胞，采用液体闪烁光谱仪测定(PerkinElmer液体闪烁计数仪MicroBeta2)分析氚的掺入。可以观察到剂量相关的增殖抑制，证明NA-C20和Novotarg选择性刺激表达CD20和CD95的细胞中的死亡受体CD95(图6)。

实施例4：体内证明双特异性抗体结构对CD20和CD90具有特异性的概念

体内淋巴瘤SCID小鼠模型

给4-5周大的SCID小鼠(Bosma et al.,Nature 1983Feb 10；301(5900):527-30)经静脉注射(尾静脉注射)致死剂量(1×10⁷个细胞)的CD20⁺/CD95⁺B-类淋巴母细胞系SKW6.4(n＝8)。在注射后的1天、2天和3天，八只小鼠分别接受20μg的嵌合体CD95×CD20抗体衍生物(NA-C20)，而对照组则分别接受PBS或20μg的NA-CMel(i.p.)。NA-CMel是双特异性抗体衍生物，对CD95具有特异性，其次，对不相关的靶标(黑素瘤相关的蛋白多糖)具有特异性。结果如图7所示。40天后，对照组的所有小鼠都死亡了，而NA-C20处理组的七只小鼠存活下来。120天后，该组中的六只小鼠依然存活。这表明，CD20⁺/CD95⁺SKW 6.4细胞在这些小鼠中被有效地消耗了。反过来，Na-CMel处理的对照组八只小鼠中的七只在第40天死亡。显然，NA-CMel不能有效地清除肿瘤细胞。与NA-C20不同，NA-CMel除了特异性靶向单价结合到SKW6.4细胞上表达的CD95外，没有其他特异性靶标。这防止了受体的交叉结合，是有效活化CD95和诱导细胞凋亡的先决条件。NA-CMel证明了对CD95具有特异性的双特异性抗体衍生物的行为的靶细胞限制模式。因此，我们认为NA-C20仅对CD95⁺/CD20⁺细胞有效，对CD95⁺/CD20^-细胞无效，如肝细胞。这确保了选择性靶向和减少了偏离目标的影响(Jung et al.,Cancer Res.2001 March 1；61(5):1846-8)。

<110> 巴利奥医药股份公司

<120> 重组双特异性抗体

<130> BA003P

<160> 29

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 112

<212> PRT

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<220>

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> CDR序列

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> CDR序列

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> VH序列

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<223> VH序列

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<223> VL序列

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<210> 22

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> LC序列

<400> 22

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atctcctgca gagccagtga aagtgttgaa tattatggca caagtttaat gcaatggtac 120

caacagaagc caggacagcc acccaaactc ctcatctatg ttgcatccaa cgtagaatct 180

ggggtccctg ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcagcct caacatccac 240

cctgtggagg aggatgatat tgcaatgtat ttctgtcagc aaagtacgaa ggttccttgg 300

acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaacggactg tggctgcacc atctgtcttc 360

atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 420

aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg 480

ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 540

agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 600

acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgttag 657

<210> 23

<211> 585

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HC序列

<400> 23

Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Asn

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu

50 55 60

Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Met

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr

85 90 95

Tyr Cys Val Thr Asp Gly Tyr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr

100 105 110

Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro

115 120 125

Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val

130 135 140

Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala

145 150 155 160

Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly

165 170 175

Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly

180 185 190

Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys

195 200 205

Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ser

210 215 220

Pro Pro Ser Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

225 230 235 240

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

245 250 255

Thr Cys Val Val Val Gly Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe

260 265 270

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

275 280 285

Arg Glu Glu Gln Tyr Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

290 295 300

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

305 310 315 320

Ser Asn Lys Gln Leu Pro Ser Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

325 330 335

Lys Gly Gln Pro Ser Gly Gln Ala Tyr Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu

340 345 350

Leu Val Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly

355 360 365

Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Arg

370 375 380

Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr

385 390 395 400

Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp

420 425 430

Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr

435 440 445

Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

450 455 460

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp

465 470 475 480

Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu

485 490 495

Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His

500 505 510

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala

515 520 525

Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly

530 535 540

Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp

545 550 555 560

Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe

565 570 575

Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

580 585

<210> 24

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 连接序列

<400> 24

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 25

<211> 1095

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HC序列

<400> 25

gaggtgcagc ttgttgagac tggtggagga ttggtgcagc ctaaagggtc attgaaactc 60

tcatgtgcag cctctggatt caccttcaat accaatgcca tgaactgggt ccgccaggct 120

ccaggaaagg gtttggaatg ggttgctcgc ataagaagta aaagtaataa ttatgcaaca 180

tactatgccg aatcagtgaa agacaggttc accatctcca gagatgattc acaaagcatg 240

ctctatctgc aaatgaacaa cttgaaagct gaggacacag ccatgtatta ctgtgtgact 300

gatggttact actggggcca aggcaccact ctcacagtct cctcagggca gccctccgga 360

caggcttatc tacagcagtc tggggctgag ctggtgaggc ctggggcctc agtgaagatg 420

tcctgcaagg cttctggcta cacatttacc agttacaata tgcactgggt aaagcagaca 480

cctagacagg gcctggaatg gattggagct atttatccag gaaatggtga tacttcctac 540

aatcagaagt tcaagggcaa ggccacactg actgtagaca aatcctccag cacagcctac 600

atgcagctca gcagcctgac ctctgaagac tctgcggtct atttctgtgc aagagtggtg 660

tactatagta actcttactg gtacttcgac gtctggggca cagggaccac ggtcaccgtc 720

tcctcaggtg gaggcggttc aggcggaggt ggctctggcg gtggcggatc ggacatcgtt 780

ctctcccagt ctccagctat cttgtctgca tctccagggg agaaggtcac catgacttgc 840

agagccagtt caagtgttag ttacatgcac tggtaccagc agaagccagg atcctccccc 900

aaaccctgga tttatgcccc atccaacctg gcttctggag tccctgctcg cttcagtggc 960

agtgggtctg ggacctctta ctctctcaca atcagcagag tggaggctga agatgctgcc 1020

acttattact gccagcagtg gagttttaac ccacccacgt tcggtgctgg gaccaagctg 1080

gagctgaaat gataa 1095

<210> 26

<211> 218

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LC序列

<400> 26

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Tyr Tyr

20 25 30

Gly Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Val Ala Ser Asn Val Glu Ser Gly Val Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Thr

85 90 95

Lys Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 27

<211> 717

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> LC序列

<400> 27

atggagaccg acaccctgct gctgtgggtg ctgctgctgt gggtgcccgg ctccaccggc 60

gacatcgtga tgacccagtc ccccgactcc ctggccgtgt ccctgggcga gagggccacc 120

atctcctgca gggcctccga gtccgtggag tactacggca cctccctgat gcagtggtac 180

cagcagaagc ccggccagcc ccccaagctg ctgatctacg tggcctccaa cgtggagtcc 240

ggcgtgcccg acaggttctc cggctccggc tccggcaccg acttcaccct gaccatctcc 300

tccctgcagg ccgaggacgt ggccgtgtac ttctgccagc agtccaccaa ggtgccctgg 360

accttcggcc agggcaccaa gctggagatc aagcgtacgg tggccgcccc ctccgtgttc 420

atcttccccc cctccgacga gcagctgaag tccggcaccg cctccgtggt gtgcctgctg 480

aacaacttct accccaggga ggccaaggtg cagtggaagg tggacaacgc cctgcagtcc 540

ggcaactccc aggagtccgt gaccgagcag gactccaagg actccaccta ctccctgtcc 600

tccaccctga ccctgtccaa ggccgactac gagaagcaca aggtctacgc ctgcgaggtg 660

acccaccagg gcctgtcctc ccccgtgacc aagtccttca acaggggcga gtgctga 717

<210> 28

<211> 585

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HC序列

<400> 28

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Asn

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu

50 55 60

Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Val Thr Asp Gly Tyr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr

100 105 110

Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro

115 120 125

Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val

130 135 140

Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala

145 150 155 160

Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly

165 170 175

Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly

180 185 190

Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys

195 200 205

Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ser

210 215 220

Pro Pro Ser Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

225 230 235 240

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

245 250 255

Thr Cys Val Val Val Gly Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe

260 265 270

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

275 280 285

Arg Glu Glu Gln Tyr Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

290 295 300

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

305 310 315 320

Ser Asn Lys Gln Leu Pro Ser Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

325 330 335

Lys Gly Gln Pro Ser Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu

340 345 350

Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly

355 360 365

Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

370 375 380

Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr

385 390 395 400

Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr

405 410 415

Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp

420 425 430

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr

435 440 445

Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

450 455 460

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp

465 470 475 480

Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp

485 490 495

Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His

500 505 510

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Ala

515 520 525

Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly

530 535 540

Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp

545 550 555 560

Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe

565 570 575

Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

580 585

<210> 29

<211> 1818

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HC序列

<400> 29

atggagaccg acaccctgct gctgtgggtg ctgctgctgt gggtgcccgg ctccaccggc 60

gaggtgcagc tggtggagtc cggcggcggc ctggtgaagc ccggcggctc cctgaggctg 120

tcctgcgccg cctccggctt caccttcaac accaacgcca tgaactgggt gaggcaggcc 180

cccggcaagg gcctggagtg ggtggccagg atcaggtcca agtccaacaa ctacgccacc 240

tactacgccg agtccgtgaa ggacaggttc accatctcca gggacgactc caagaacacc 300

ctgtacctgc agatgaactc cctgaagacc gaggacaccg ccgtgtacta ctgcgtgacc 360

gacggctact actggggcca gggcaccacc ctgaccgtgt cctccgcctc caccaagggc 420

ccctccgtgt tccccctggc cccctcctcc aagtccacct ccggcggcac cgccgccctg 480

ggctgcctgg tgaaggacta cttccccgag cccgtgaccg tgtcctggaa ctccggcgcc 540

ctgacctccg gcgtgcacac cttccccgcc gtgctgcagt cctccggcct gtactccctg 600

tcctccgtgg tgaccgtgcc ctcctcctcc ctgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg 660

aaccacaagc cctccaacac caaggtggac aagaaggtgg agcccaagtc ctgcgacaag 720

acccacacct cccccccctc ccccgccccc cccgtggccg gcccctccgt gttcctgttc 780

ccccccaagc ccaaggacac cctgatgatc tccaggaccc ccgaggtgac ctgcgtggtg 840

gtgggcgtgt cccacgagga ccccgaggtg aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 900

gtgcacaacg ccaagaccaa gcccagggag gagcagtacc agtccaccta cagggtggtg 960

tccgtgctga ccgtgctgca ccaggactgg ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtg 1020

tccaacaagc agctgccctc ccccatcgag aagacgatat ccaaggccaa gggccagccc 1080

tccggccagg tgcagctggt gcagtccggc gccgaggtga agaagcccgg cgcctccgtg 1140

aaggtgtcct gcaaggcctc cggctacacc ttcacctcct acaacatgca ctgggtcagg 1200

caggcccccg gccagggcct ggagtggatc ggcgccatct accccggcaa cggcgacacc 1260

tcctacaacc agaagttcaa gggcagggtg accatcacca gggacacctc cgcctccacc 1320

gcctacatgg agctgtcctc cctgaggtcc gaggacaccg ccgtgtacta ctgcgccagg 1380

gtggtgtact actccaactc ctactggtac ttcgacgtgt ggggccaggg caccctggtg 1440

accgtgtcct ccggcggcgg cggctccggc ggcggcggat ccggcggcgg cggctccgac 1500

atccagatga cccagtcccc ctcctccctg tccgcctccg tgggcgacag ggtgaccatc 1560

acctgcaggg cctcctcctc cgtgtcctac atgcactggt accagcagaa gcccggcaag 1620

gcccccaagc ccctgatcta cgccccctcc aacctggcct ccggcgtgcc ctccaggttc 1680

tccggctccg gctccggcac cgacttcacc ctgaccatct cctccctgca gcccgaggac 1740

ttcgccacct actactgcca gcagtggtcc ttcaaccccc ccaccttcgg ccagggcacc 1800

aagctggaga tcaagtga 1818

Claims

1.一种双特异性抗体，其由以下各项组成：

a)Fab片段，所述Fab片段包含用于第一抗原的第一结合位点；

b)scFv片段，所述scFv片段包含用于第二抗原的第二结合位点；

c)单体CH2域，其经修饰以替换一个或多个半胱氨酸残基，所述半胱氨酸残基会形成链间二硫键，其中CH2域通过其N末端结合至Fab片段并通过其C末端结合至scFv片段，其中

-所述第一抗原是CD95，所述第二抗原是CD20，或

-所述第一抗原是CD20，所述第二抗原是CD95；

其中，与CD20结合的结合位点包含抗体轻链可变域(VL)和抗体重链可变域(VH)，所述抗体轻链可变域包含三个互补决定区VL-CDR1-3，所述抗体重链可变域包含三个互补决定区VH-CDR1-3，其中：

i)VL-CDR1由氨基酸序列RASSSVSYM(SEQ ID 12)组成；

ii)VL-CDR2由氨基酸序列APSNLAS(SEQ ID 13)组成；

iii)VL-CDR3由氨基酸序列QQWSFNPPT(SEQ ID 14)组成；

iii)VH-CDR1由氨基酸序列SYNMH(SEQ ID 16)组成；

v)VH-CDR2由氨基酸序列AIYPGNGDTSYNQKFKG(SEQ ID 17)组成；以及

vi)VH-CDR3由氨基酸序列VVYYSNSYWYFDV(SEQ ID 18)组成；

以及其中，与CD95结合的结合位点包含抗体轻链可变域(VL)和抗体重链可变域(VH)，所述抗体轻链可变域包含三个互补决定区VL-CDR1-3，所述抗体重链可变域包含三个互补决定区VH-CDR1-3，其中：

i)VL-CDR1由氨基酸序列RASESVEYYGTSLMQ(SEQ ID 2)组成；

ii)VL-CDR2由氨基酸序列VASNVES(SEQ ID 3)组成；

iii)VL-CDR3由氨基酸序列QQSTKVPWT(SEQ ID 4)组成；

iv)VH-CDR1由氨基酸序列TNAMN(SEQ ID 6)组成；

v)VH-CDR2由氨基酸序列RIRSKSNNYATYYAESVKD(SEQ ID 7)组成；以及

vi)VH-CDR3由氨基酸序列DGYY(SEQ ID 8)组成。

2.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中：

a)与CD95结合的结合位点的VL域由SEQ ID 1的氨基酸序列组成，与CD95结合的结合位点的VH域由SEQ ID 5的氨基酸序列组成；或者

b)与CD95结合的结合位点的VL域由SEQ ID 9的氨基酸序列组成，与CD95结合的结合位点的VH域由SEQ ID 10的氨基酸序列组成。

3.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中：

a)与CD20结合的结合位点的VL域由SEQ ID 11的氨基酸序列组成，与CD20结合的结合位点的VH域由SEQ ID 15的氨基酸序列组成；或者

b)与CD20结合的结合位点的VL域由SEQ ID 19的氨基酸序列组成，与CD20结合的结合位点的VH域由SEQ ID 20的氨基酸序列组成。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的双特异性抗体，所述双特异性抗体由轻链和重链组成，其中：

a)轻链序列由SEQ ID 21组成，以及重链序列由SEQ ID 23组成；或者

b)轻链序列由SEQ ID 26组成，以及重链序列由SEQ ID 28组成。

5.根据权利要求1所述的双特异性抗体，所述双特异性抗体包含鼠科动物的、嵌合体的和/或人源化的序列。

6.根据权利要求1所述的双特异性抗体，所述双特异性抗体以Kd＜10^-8M结合到CD20，和/或以Kd＜10^-8M结合到CD95。

7.根据权利要求1所述的双特异性抗体，所述双特异性抗体用于医疗用途。

8.权利要求1-6中任一项所述的双特异性抗体在制备治疗或预防B细胞紊乱的药物中的用途，包括给予需要的对象一治疗有效量的所述双特异性抗体。

9.包括权利要求1-6中任意一项所述的双特异性抗体和药学上接受的载体或赋形剂的药物组合物。

10.根据权利要求9所述的药物组合物，所述药物组合物用于治疗或预防B-细胞紊乱。

11.权利要求8所述的药物组合物在制备治疗或预防B细胞紊乱的药物中的用途，包括给予需要的对象一治疗有效量的所述药物组合物。

12.编码权利要求1-6中任一项所述双特异性抗体的核苷酸序列。

13.包含权利要求12所述的核苷酸序列的载体。

14.包含权利要求12所述的核苷酸序列或权利要求13所述的载体的宿主细胞。

15.产生权利要求1-6中任一项所述的双特异性抗体的方法，包括在权利要求14所述的宿主细胞产生所述双特异性抗体的条件下，培养或保持所述宿主细胞。