发明内容
本发明提供了一种全人源抗人CD20单克隆抗体(以下简称:抗人CD20单抗分子)及其编码核酸序列。特别是,本发明的这种分子对人CD20分子具有高亲和力和低解离速率。
本发明中,所述抗体分子的重链和轻链是全人源的,尽管嵌合的或人源化的也可以使用,但是用于人体时,全人源的可以避免很多副作用,例如HAMA和HACA反应引起的副作用。
本发明的某些实施例提供了包括抗人CD20单抗分子的组合物,所述分子包含:(a)一个由可变区和Fc片段等部分构成的完整的或不完整的轻链,其可变区由氨基酸序列SEQ IDNO:1或由SEQ ID NO:3或编码同样氨基酸序列的等效序列编码的SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列组成;和b)一个由可变区和Fc片段等部分构成的完整的或不完整的重链,其可变区包含SEQ.ID NO:2或由SEQ.ID NO:5或其等效序列编码的SEQ.ID NO:6所示的氨基酸序列。
本发明的抗人CD20单抗分子包括重链与轻链;所述轻链包含有序列如SEQ ID NO:1所示的轻链可变区或其一部分,所述重链包含有序列如SEQ ID NO:2所示的重链可变区或其一部分;或所述轻链包含有序列如SEQ ID NO:4所示的轻链可变区或其一部分,所述重链包含有序列如SEQ ID NO:6所示的重链可变区或其一部分。
本发明的优选抗人CD20单抗包含全人源Fc区和框架区以及通过分子进化获取的全人源的轻链和/或重链可变区。
本发明中,轻链和重链的框架区都是全人源的,其框架区来自人IgA、IgD、IgE、IgG或IgM亚型;优选的是来自人IgG1,最优先选择的是来自IgG1 kappa。
本发明中,重链和轻链的Fc区都是全人源的,其Fc区来自人IgA、IgD、IgE、IgG或IgM亚型,优选的是人IgG1。本发明所述抗体分子的Fc可以是天然的,也可以是修改过的。所述Fc区可以是采用任何有效的基因工程方法或其他方法改造过的,其效应功能得到提高或降低的变异体。
本发明的全人源框架和Fc区是直接或间接从人体得到的。所述的直接方法包括但不限于基因组DNA克隆、cDNA、cDNA文库。所述的间接方法包括但不限于根据包括但不限于GenBank或其他出版物提供的生物信息为基础部分合成或完全从头合成完整的DNA。DNA合成技术包括但不限于以PCR为基础的DNA合成方法。
在某些实施例中,所述抗人CD20抗体分子包括全长分子或其一个片段(例如Fv、Fab、F(ab’)2等)。在特定实施例中,所述抗人CD20抗体分子包含一个单域(即CDR),单链Fv、Fab或F(ab)2等。
在某些实施例中,轻链可变区包括全人源框架。在另一些实施例中,轻链可变区包含一种人源的种系框架。在特定的实施例中,所述轻链可变区包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。在特定的实施例中,重链可变区包含人的种系框架区。在另外一些实施例中,所述重链可变区包含如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
在某些情况下,所述抗人CD20抗体分子可以是为延长其在循环系统中的半衰期用化学方法进行了PEG修饰的。PEG修饰是通过活化scFv、Fab或Fab’2分子上截短的铰链区的一个氨基酸残基实现的,方法是Chapman AP等的论文中描述的(PEG)-lysyl maleimide方案(Chapman AP,et al,1999,Nature Biotechnology 17,780-783。其他替代方法的细节可以在许多出版物中找到,例如Knight DM,et al,2004,Platelets 15(7):409-18和美国专利US5824784。
在某些实施例中,所述抗人CD20单抗分子包含由轻链和重链组成的Fab分子。所述轻链是由SEQ ID NO:7所示的DNA片段或编码同样氨基酸序列的等效DNA序列编码的SEQ IDNO:8所示的氨基酸序列。其重链包括由SEQ ID NO:9或编码同样氨基酸序列的等效DNA序列编码的如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。
在某些实施例中,所述抗人CD20抗体分子包含一种Fab,并进一步包含完整的Fc区,从而形成全长的mAb分子,或者进一步包含Fc的一部分,从而形成不完整的mAb分子。
此外,Fc区应当具有补体依赖的细胞毒作用(CDC)和抗体依赖的细胞毒作用(ADCC)。这些功能可以通过氨基酸替换进行修饰,以减少或消除或增强其效应功能。
本发明的抗人CD20抗体分子是在真核或原核受体细胞中表达的。在某些实施例中,编码轻链和/或重链的核酸序列包含在一种质粒或其他表达载体中。
本发明还提供了在治疗疾病时施用这种抗体的方法。这些方法包括:(1)一种包含本发明所述抗人CD20抗体分子的药物组合;(2)对客体施用这种药物组合。所述客体是指具有本品适应症症状的病人。在某些实施例中,所述适应症可从以下疾病中选择:(1)B细胞相关的疾病:复发性霍金奇病、B细胞急性淋巴白细胞瘤(B-CLL)、抗性霍金奇病和高度、中度和低度非霍金奇淋巴细胞瘤(NHLs)、弥散性大细胞淋巴细胞瘤(DLCL)、Burkitt淋巴细胞瘤(BL);(2)自身免疫疾病:类风关、牛皮癣、系统性红斑狼疮、强制性脊柱炎、多发性硬化等。(3)其他与CD20有关的疾病。
本发明提供了抗人CD20单抗分子及其编码核酸序列。特别是,本发明提供了具有高亲和力和低解离速率的抗人CD20单抗分子。优选地,本发明所述的所述抗人CD20单抗分子由具有全人源框架的轻链和/或重链可变区组成。为方便描述,本发明就此内容分成以下几方面:I.抗人CD20单抗分子;II.制备抗人CD20单抗分子;III.用于治疗的配方和使用方法。以及IV.抗人CD20抗体分子的应用。
I.抗人CD20单克隆抗体分子
本发明的单抗可以用多种技术获得,包括但不限于Kohler and Milstein,Nature 256:495(1975)发表的标准的杂交瘤技术。尽管原则上这一技术是受偏爱的,但其他获得单抗的技术也可以应用,例如转基因小鼠或杂交瘤技术。小鼠中的杂交瘤技术已经十分成熟。免疫和融合伙伴已经十分清楚。但是,用小鼠或其他非人动物杂交瘤产生的抗体会引起HAMA反应,从而导致用于人体疾病治疗时会引起副作用。以这些抗体为基础获得的嵌合的或人源化的单抗用于人体时仍然能够引起HACA反应,从而导致类似的免疫反应,尽管比起原型分子轻微。全人源杂交瘤技术仍然处于开发状态,尚不足以获得用于人类疾病治疗的单抗。
对于人类疾病治疗来说,需要全人源抗体以减少或消除引起副作用的HAMA或HACA反应。尽管转基因小鼠已经有很成功的记录,其他技术也是可以选择的。
抗体库技术,特别是由CAT及其他机构建立的全人源抗体库技术就是其中值得考虑的一种选择。CAT建立的技术在一些治疗性抗体的开发上获得了某种程度的成功,引起了国际上的关注,但是它依然有非常明显的问题:获得高亲和力scFv分子的几率很低。这就需要对该技术进行改进,以满足治疗性抗体的需要。
本发明对现有抗体库技术的最重要的改进有:(1)用3000位来自于不同民族和地区的健康成年人血样构建了超大规模全人源天然Fab抗体库,称之为HuLib。显然,与已发表的抗体库相比,该抗体库具有更丰富的遗传变异。对于熟知本领域的人员来说,不难理解这将大大提高遗传复杂性和通过淘筛或其他方法获得高亲和力Fab分子的可能性。此处可以使用的其他抗体库可以是合成的或部分合成的,也可以是scFv,起始材料也可以是其他非人动物,例如小鼠。(2)为了提高亲和力和改变获得的Fab分子亲和力以外的其他性状以满足治疗的需要,采用了分子进化技术。通过分子进化改进的分子可以借助哺乳动物细胞、酵母菌细胞或细菌细胞进行生产。
本发明中的原型Fab分子是用人CD20作为抗原上述抗体库进行淘筛获得的,它将被用于后续通过分子进化的原型分子,以获得亲和力等技术指标达到治疗性药物要求的候选单抗。
本发明的分子进化技术是通过PCR引入突变的,它包括:(1)关键氨基酸(KA)扫描。KA扫描被用来在人工进化之前检定最有意义、最有可能获得有用突变体的位点,以减少无效突变。KA扫描是检定可以通过任何可能的突变方案并通过亲和力测定获得有效突变体的氨基酸位点的过程。若一个具有一个特定氨基酸位点突变的突变子的亲和力发生了变化,该位点就是有用的突变位点,反之亦然。基于这样的扫描方法就可以确定有效的和无效的突变位点,并可借助Cunningham和Wells(Science,1998,244:1081-1085)的方法在设计突变方案之前对各位点进行分类。借此可以大大简化突变设计的数据处理,并减少甚至避免无效突变,这又使突变后亚库的构建和淘筛大大简化。(2)突变引物设计。突变引物设计是这一技术中获得足够数量的有用突变的关键步骤,本发明中采用了以GCR引物设计方案,详细情况见PCT/CN2009/074839。本发明中所述的目标区域(即拟突变的区域)是一个抗体分子的CDR区,优先选择的是轻链和重链的CDR3。本发明中,所述的随机突变优先选择的是在每一个有用突变位点以19种或20种天然氨基酸进行饱和随机突变。(3)此外,根据Kabat计数法确定的目标CDR的侧翼序列也有一些氨基酸对于产生对亲和力有意义的突变子是重要的,至少在某些情况下,某种程度上是这样。因为此,KA扫描应当覆盖CDR及其侧翼氨基酸以获得更广泛的亲和力改善的变异。
在本发明,有用的氨基酸位点可以用本领域熟知的方法突变为随机氨基酸或特定的氨基酸。突变为拟定的氨基酸序列可以通过改变编码该氨基酸的核酸序列来实现。这种编码在特定CDR区具有一个或多个突变的突变子的核酸分子可以用本领域熟知的方法获得。所述的突变方法包括但不限于对已经提前制备的编码CDR区的核酸进行定点突变、寡核苷酸介导的突变、位点特异性突变或随机PCR突变、表达框突变等。制备这种取代突变子的一种优选方法是定点突变。这一技术在本领域是广为熟知(see,e.g.,Carter et al,1985,NAR,13:4431-4443,and Kunkel et al,1987,PNAS,82:488-492)。以PCR为基础的突变方法,其突变核苷酸被置入到了引物中,从而使相应的PCR产物带有突变,这也是可达到此目的的一种优选的方法,详细情况可参考see Vallette et al,(1989)NAR,723-733。本发明中最佳的突变方法是用根据GCR方法(详见PCT/CN2009/074839)或其他可用的方法设计引物,通过PCR在特定的位点进行随机突变。必要时可以同时对一个以上的位点进行突变,从而获得具有多个突变的突变子。
本发明采用Kabat方法编码各个CDR区(EA,et al,1991,Sequences of proteins ofimmunological interest,5th ed.U.S.Department of Health and Human Services,National Institutes of Health,Bethesda,Md.)。
在某些实施例中,抗人CD20单抗分子由一条轻链和带有全人源恒定区的一条重链组成。对于本领域技术人员,不难理解当本发明的抗人CD20单抗分子用于人体治疗疾病时将很少或没有免疫反应。
本发明的某些实施例中,抗人CD20单抗分子带有Fc区,其优选来源是直接从人种系获得或通过其他途径例如全长DNA合成,人基因组库等。
本发明提供一种亲和力高、解离速率低的抗人CD20单抗,该单抗在低剂量下是有效的。本领域技术人员不难理解,本发明的抗人CD20单抗分子特别适合用于人体疾病的治疗,它不像带有鼠源成分的嵌合型抗人CD20单抗分子(例如Rituxan)那样容易引发HACA反应。
本发明所述的CDR可以与任何类型的框架区整合为有功能的scFv、Fab和/或进一步与Fc区整合从而形成有功能的全长抗体分子。优选的CDR区与全人源框架区或其亚区和种系的或经过修饰的Fc区进行整合。可以用于与本发明的CDR区整合的全人源框架包括但不限于KOL、NEWM、REI、EU、TUR、TEI、LAY和POM(见(1)Kabat et al,1991,Sequencesof Proteins of Immunological Interest,US Department of Health and Human Services,and(2)NIH,USA;and Wu et al,1970,J Exp Med 132:211-250)。
II.产生结合CD20分子的方法
本发明的抗体或抗体片段可以通过轻链和重链基因在受体细胞中的重组表达来实现。所述受体细胞可以是哺乳动物细胞,也可以是酵母或细菌细胞。
本发明中轻链和重链的表达可以通过瞬时或稳定表达来实现。两种表达策略都包括用一种或多种带有编码抗体轻链和重链的DNA片段的表达载体转染(哺乳动物和酵母系统)或转化(细菌系统)受体细胞,从而使轻链和重链在受体细胞中表达,优选的表达方式是分泌到培养基中,可以用本领域技术人员熟知的层析等方法从中回收抗体。标准的重组DNA方法可以有效地用于轻链和重链基因的获得、克隆至表达载体以及引入到受体细胞。
本发明中在分子进化之前或之后通过淘筛获得的抗体分子是Fab形式的。这种形式可以通过本领域的技术人员熟知的基因工程技术方便地进一步转换成scFv、全长抗体或其他形式。
本发明中,一旦通过上述方法获得了编码所需VL和VH区的DNA片段,就可以用标准基因工程方法进一步转换成全长的抗体轻链和重链基因、Fab片段基因或scFv基因。
为获得全长轻链基因,可以把编码VL区的DNA整合到人轻链恒定区。优先选择的是人kappa或lambda恒定区,最优先选择的是人kappa恒定区。为了获得全长重链基因,可以把编码VH区的DNA整合到重链的恒定区。重链恒定区可以从以下几种中选择,IgG,、IgA、IgE、IgM或IgD。优先选择的是IgG1~IgG4,最优先选择IgG1(gamma)的恒定区。
为了获得单链Fv基因,可以用PCR方法从上述Fab分子进一步获得VH-和VL-DNA编码区,然后用(Gly4)3编码区作Linker把两个片段连接成一个完整分子,使得所述VH和VL序列可以用McCafferty et al,1990,Nature 348:552-554描述的方法以单链Fv蛋白的方式在E.coli中表达。
为了表达本发明所述的抗体或抗体的片段,可以把其相应的轻链和重链编码序列插入到表达载体的转录和翻译控制序列之间。本发明所述的表达载体包含调控序列如启动子、增强子等。所述的表达载体及其控制序列应当与受体细胞兼容。编码轻链和重链的基因可以分别插入到两个独立的载体,也可以插入到同一个载体。所述表达载体可以预置了恒定区,也可以不预置恒定区。如果一个抗体基因只含有可变区,应当使用预置了恒定区的表达载体。
除了转录和翻译调控序列,本发明的表达载体还含有:(1)在每一个表达框有一个信号肽序列,它可以促进抗体从受体细胞分泌到培养基中;(2)至少一个复制起点;(3)一个或多个选择标记基因,借此可方便地对引入了表达载体的受体细胞进行筛选。典型的选择标记基因可为受体细胞提供抗性,例如细菌对抗生素的抗性,哺乳动物细胞或其他受体细胞对G418、潮霉素和MTX等的抗性。所有这些信息对本领域的人员都已经广为熟知。
优选的用于本发明的受体细胞包括具有或不具有DHFR的CHO细胞系、HEK293细胞系。抗体的表达是通过培养携带有上述表达载体的受体细胞,然后对产物进行纯化进行的。
本发明的受体细胞也可易用来生产截短的抗体片段,如Fab或scFv。为此目的,尽管哺乳动物或其他受体细胞也可以使用,但以E.coli为代表的细菌是优先选择的受体细胞。
本发明中抗体或抗体片段的回收和纯化主要包括:(1)对样品进行调适,即为纯化做准备。首先要去除细胞、细胞碎片、脂质和凝聚物。为此,可先离心,然后0.45μm过滤的方法。(2)层析,包括但不限于亲和、离子交换、分子筛的等层系方法。,在有些情况下,超滤或透析也可选用。本发明优先选择的纯化方法是:Protein A/G亲和后在目标抗体可结合到柱子上、阴离子可穿过的低pH下进行阳离子交换层析。也可以在抗体分子可穿过,但阴离子可结合到柱子上的高pH下用阴离子层析。在离子交换层系中,许多具有不同等电点的杂蛋白可以被去除。(3)如有必要,可用分子筛对已经获得的原液进行进一步纯化。为获得高纯度的单抗,本发明中在过滤后经过GE HealthCare生产的MabselectSuRe,CaptoS和Capto Q进行纯化。为建立更有效的方法,也可以使用包括MabselectSuRe和CaptoAdhere两种组分的两步法。
III.制剂及其应用
本发明的抗人CD20单抗,包括全长的和截短的,都是治疗或诊断与CD20相关的人体疾病的有用材料。如上所述,抗人CD20单抗可用于治疗B细胞淋巴瘤或CD20相关的其他肿瘤或疾病,自身免疫疾病例(如RA、SLE等)。
本领域的技术人员都知道,与各种放射性或非放射性标记物偶联的抗人CD20对于诊断和治疗是有用的。可用于此目的放射性标记物包括但不限于131I,125I,99Tc和90Y,可用于此目地的非放射标记物包括但不限于酶(例如HRP,AP等)、荧光染料、毒素等。
在优选的案例中,接受治疗的客体是非免疫抑制的(如SLE和RA病人)。尽管机理仍然不清楚,但本领域的技术人员很清楚,本发明的抗人CD20抗体分子引起HACA反应的可能性比以前知道的抗人CD20抗体要低很多,特别是对非免疫抑制的病人来说更是如此。因此,非免疫抑制的病人可以不用过分顾忌引起副作用的HACA反应。此外,本发明的抗体分子的亲和能力显著提高,因此其有效剂量可明显降低。这进一步避免了可能的HACA反应。
本发明的抗人CD20单抗分子可以与包括但不限于化疗或放疗等其他抗肿瘤治疗方法联用,在某些情况下,也可以与一些细胞因子,如G-CSF联用。
本发明的抗人CD20抗体分子可以制备成适于给病人使用的剂型,其含有一种人CD20结合分子,例如抗体或抗体片段,和一种或多种作为医药可接受的载体,例如溶剂、分散介质、包裹剂、抗生素、抗真菌物质、等渗物质、减缓吸收物质以及其他的生理学上能接受的物质。可接受的载体物质包括以下一种或多种:水、盐、磷酸盐缓冲液、葡聚糖、甘油、乙醇等,可单用或组合使用。优选的等渗剂是糖、聚乙醇如mannitol,sorbito,也可以是氯化钠。最优先选择的等渗剂是海藻糖。所述载体可进一步含有微量auxiliary物质,如润湿剂、乳化剂、防腐剂或缓冲液,这些物质有助于提高所述分子的货架期或有效性。
本发明的组分可以形成多种多样的形式,例如注射或输液、分散液或悬浮液等。本发明的优选方式是注射液或输液。
IV.抗人CD20单抗的其他应用
本发明的抗人CD20单抗可用于样品中CD20定性或定量免疫检测。免疫检测是一种检测在含有复杂混合物的溶液中是某种物质是否存在或浓度的方法。除了结合的特异性外,所有免疫检测的主要共同特点是可产生可检测的信号。当今,多数多数免疫检测方法都依赖于与可测标记相关的分析试剂。本发明可用的标记可以从以下物质中选择:放射性同位素、酶、荧光物质、磷光物质和合学发光染料、磁性颗粒、染料、金和银等的胶体、金属螯合剂、辅酶等。本发明中优选方案是酶(例如HRP和AP),以及荧光染料。其中最选的是HRP和AP等酶。
本领域中的许多检测方法都是广为熟知并在临床或科学研究中广泛应用,例如疾病检测、生物化学研究等。
具体实施方式
以下实施例是为了说明或进一步阐释本发明的某些优选的实施方案以及某些论点,并非要限制本发明的范围。
实施例1.大规模全人源抗体库构建
这一实施例描述如何构建Fab形式的超大规模全人源天然抗体库。本发明的Fab抗体库是用来自不同地区、不同民族的3000多名健康成人的血样,参照以下文献构建的,详细构建过程在文献目录之后描述。
1.Dantas,BC,et al,2005,Construction of a human Fab phage display library fromantibody repertoires of osteosarcoma patients.Gene.Mo.Res,4(2):126-140.
2.Hiroshi,T,et al,1999,Preparation of Recombinant Human Monoclonal AntibodyFab Fragments Specific for Entamoeba histolytica,Clinical and Diagnostic LaborImmunol,May 1999,383-387.
3.Wu,BP,et al,2001,Construction and selection of the natural immune Fabantibody phage display library from patients with colorectal cancer,World JGastroenterol,7(6):811-815.
4.Lee,CV,et al,2004,High-affinity Human Antibodies from Phage-displayedSynthetic Fab Libraries with a Single Framework Scaffold,J Mol Biol,340,1073-1093.
5.Michael H,et al,2005,Antibody phage display,Mod Asp Immunobiol,15:47-49.
6.De Haard HJ,et al,1999,A large non-immunized human Fab fragment phage librarythat permits rapid isolation and kinetic analysis of high affinity antibodie.J Biol Chem,1999,274:18218-18230.
7.Fel louse,FA,2007,High-throughput generation of synthetic antibodies fromhighly functional minimalist phage-displayed libraries.J Mol Biol 373,924-940.
1.血样和cDNA合成
取每个供体的血样1毫升混合,用淋巴细胞分离液分离外周血单核细胞,然后用Invitrogen或Roche公司的试剂盒分离总mRNA,用GIBCO的逆转录试剂盒合成cDNA的第一链。所有步骤按照制造商的说明书进行。
2.扩增重链和轻链的Fab区
为了扩增编码kappa和lambda轻链以及gamma重链的Fd区,采用了表1所示的引物组。除了上述轻链或重链的互补序列外,引物上了带有特定的酶切位点和保护碱基以便于克隆。用100μl体系进行PCR扩增,正义链和反意链引物均采用1mM终浓度,PCR按下述条件进行25个循环:94℃30秒,50℃30秒,72℃1分钟;94℃4分钟预变性,72℃5分钟后延伸。用QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN GmbH,Hilden,Germany)纯化扩增的DNA片段。纯化的片段用SacI/HindIII或XhoI/SpeI酶切后琼脂糖电泳分离,用QIAEXGel Extraction Kit进行胶回收。
表1.用于人免疫球蛋白基因PCR扩增的引物组,下划线部分是增加的酶切位点,兼并密码为:M=A or C,Y=C or T,W=A or T,R=A or G,H=A,C,or T,S=C or G,and K=T or G.
3.Fab轻链和重链PCR产物克隆到表达载体pCOMb3M
把编码轻链的DNA连接到表达载体pCOMb3M(在pCOMb3H的SacI/XbaI位点之间增加了一个HindIII位点,以方便克隆轻链和重链,详细序列见GenBank Accession No.AF268280,其结构示意图见附图1。然后,把编码Fd重链的DNA连接到上述插入了轻链基因的pCOMb3M,从而形成pCOMb3M/Fab。连接好的载体DNA在1.2%琼脂糖凝胶电泳上与未连接的DNA分离后电击转化大肠杆菌TG1细胞。DNA样品应当完全脱盐。
4.转化
新接种的E.coli TG1菌株250RPM振荡培养至A600约0.5~0.7(大约2~2.5小时),然后用冰冷的含10%甘油的1mM HEPES(pH7.0)洗涤细胞两次,然后分成100μl的小份,并进行电击。
电击在BIO-RAD Gene Pulser上进行,条件是:25μF,2.5kV,200ohms(100μl),所有用具和液体均在冰浴预冷。100ng pCOMb3M/Fab DNA水溶液加入到电击杯,立即进行电击。获得的时间常数是4.5~5msec。电击后的细胞立即用1ml新鲜的LB-G或2×YT-G培养基重悬。上述电击共进行10次,所获细胞混合后在含有6ml无抗生素2×YT-G的50毫升离心管中37℃、250RPM培养1小时。然后,加入75μl 20mg/ml的氨苄青霉素和6×1010pfu的M13KO7,以拯救pCOMb3M/Fab噬粒。1000×g离心20min收获上清,得噬粒悬浮液。
上述过程共重复200次电击,每次可获得约0.67~5.66×108克隆,混合所得噬粒悬浮液,即为超大规模全人源抗体库,称之为HuLib。200次电击的总库容为6.2×1010分子。拯救的库分成500μl的小份(含约2.7×1012噬菌体颗粒),立即使用或4℃保存备用。
实施例2用人CD20对全人源抗体库淘筛
以自备2F2(HuMax-CD20,GenMab)Fab为阳性对照,以重组人CD20为抗原对上述HuLib进行淘筛。淘筛过程如下:
把1小份HuLib加入到预先用重组人CD20蛋白包被的25毫升细胞培养方瓶中,37℃温育1小时。用含有1%Tween-20的PBS洗涤20次后,加入1ml对数期的TG1细胞,37℃震荡培养16小时。12000rpm离心10分钟,上清转移到一只新的50ml试管。取500μl上清,按照上述方法再次淘筛,总计进行4轮。最后一轮完毕后,获得的细菌悬液稀释至100000细胞/毫升,在含0.1%氨苄青霉素的1.5%琼脂培养平板上筛选,以获得单斑。用上述平板的单斑接种10块96孔深孔板,每孔加入0.25ml带氨苄青霉素的LB培养基,每孔一个单斑,37℃震荡培养16小时后,5000rpm离心20分钟,按孔收取上清,转移至新的96深孔板,4℃保存备用。
用10μg/ml的重组人CD20包被10块96孔免疫板,从上述单斑上清保存物中每孔取10μl转移至包被的板,混匀后37℃温育1小时后,用含1%Tween-20的PBS洗涤20次后,加入1μl HRP标记的羊抗M13单抗,37℃温育30分钟,如上洗涤10次。然后,加入200μl含有0.025%DAB和1μl 1%H2O2的PBS,读取595nm光密度。OD值最高的孔就是亲和力最高的Fab。
依据上述OD值,鉴定出了396个OD值比阳性对照高的克隆,进一步亲和力分析发现,5H3,3D1,6D2和7F2的OD值较高,其中7F2是最高的。
用Friguent等(Friguet,B.et al.,1985,J.Immunol.Methods,77:305-319)对7F2的测定发现,其解离常数为2783pM。
根据DNA测序结果推断的7F2表达的单克隆抗体的轻链可变区氨基酸序列为:SEQ IDNO.1;重链可变区氨基酸序列为:SEQ ID NO.2。
7F2轻链可变区氨基酸序列:
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCKASNFVGWFIRWYQQKPGQAPRLLIYAASDHATGVPSKFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCNQYLNQPWTFGQGTRLEIK,127(SEQ ID NO.1)
7F2重链可变区氨基酸序列:
EVQLVESGGGLVQPGESLRLSCAGSGFTFNDFAMRWVRQMPGKGLEWVSTIWPWQSGYKLLCDLETPIHHLQRQRHQHRLPAVEQPEGLGHGLVLLCKIEIQFGGYYHFEVWGQGTTVTVSS,122(SEQ ID NO.2)
注:带下划线的是CDR区(氨基酸序列中)或CDR编码区(DNA序列中).
实施例3分子进化
用Cunningham等的方法(Cunningham and Wells,Science,244:1081-1085,1989)对7F2克隆的所有CDR进行分析,鉴定出对甘氨酸取代敏感的残基,这些残基即为优选的突变位点。下表是7F2克隆中的优选氨基酸位点,其中带下划线的是对取代极为敏感的,带点的是对取代比较敏感的,它们都是优选的突变位点。
用寡核苷酸介导的随机突变(Kunkel法)对上述优选位点进行突变,通过淘筛可获得对这些位点进一步改良的抗体分子。简要过程是:为了在上述优选位点引入突变,根据Kunkel法设计了突变引物,并以pCOMb3M为载体构建了Fab次级抗体库。采用实施例2以及本领域数值的方法,以人CD20为抗原对该次级库进行四轮常规淘筛。
以轻链的CDR1为例来进一步说明引物的设计和合成。确定的编码在优选位点带有随机突变的轻链CDR1的引物为:
5’-NNNGCCTCCNNNTTCGTGGGCNNNNNNATCNNN-3’,其中N为A,T,C or G.。
这一序列与其5’-和3’-端侧翼序列整合后形成如下片段:
5’-gaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcNNNGCCTCCNNNTTCGTGGGCNNNNNNATCNNNtggtaccaacagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctat-3’,
这一序列编码轻链CDR1,在其优选位点及侧翼序列引入了随机突变。
用本领域人员熟知的化学法或PCR法合成上述序列。带有优选突变的其他CDR区以此方法进行设计并与其侧翼序列拼接。拼接可以用本领域熟知的重叠PCR进行。通过重叠PCR,可以把这些片段进一步拼接成编码Fab轻链和重链的序列。
把上述序列插入到pCOM3bM,然后引入到E.coli菌株TG1,即可构成所述Fab次级库。按实施例2的方法对人CD20进行四轮淘筛,获得了89个OD值超过阳性对照的克隆。如图3所示,克隆3D5,6F4,7A6和8G3的OD值最高。对最好的克隆8G3亲和力的测定在下面部分描述。
DNA测序结果显示,8G3的轻链可变区编码序列为SEQ ID NO.3,编码SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列;重链可变区的编码序列为SEQ ID NO.5,编码SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。由此推断的Fab轻链氨基酸序列为:SEQ ID NO.8;重链氨基酸序列为:SEQ ID NO.10。8G3轻链可变区DNA序列:
gaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctctcctgccgcgcctcccagttcgtgggcttctacatccactggtaccaacagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctatgccgcctccgagcgcgccaccggcgtgccctccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagcctagagcctgaagattttgcagtttattactgtcagcagtggctgaacaaccccttcaccttcggccaagggacacgactggagataatc(SEQ ID NO.3)
8G3轻链可变区氨基酸序列:
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQFVGFYIHWYQQKPGQAPRLLIYAASERATGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWLNNPFTFGQGTRLEIK 127(SEQ ID NO.4)
8G3重链可变区DNA序列:
gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtacagcccggggagtccctgagactctcctgtgcaggttctggattcacctttaatgattatgccatgcactgggtccgccagatgcccgggaagggcctggagtgggtctcaactatttatccctggaatagtggttaccacctactatgcgaactcgaaactccgattcaccatctccagagacaacgccatcagcaccgcctacctgcagtggagcagcctgagggcctcggacacggccttgtattactgtgcaaaatcgacatacagtatggcggttactggcggttcgacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcctcagc(SEQ ID NO.5)
重链可变区氨基酸序列
EVQLVESGGGLVQPGESLRLSCAGSGFTFNDYAMHWVRQMPGKGLEWVSTIYPWNSGYHLLCELETPIHHLQRQRHQHRLPAVEQPEGLGHGLVLLCKIDIQYGGYWRFDVWGQGTTVTVSS 122(SEQ ID NO.6)
8G3Fab轻链DNA序列
gaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctctcctgccgcgcctcccagttcgtgggcttctacatccactggtaccaacagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctatgccgcctccgagcgcgccaccggcgtgccctccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagcctagagcctgaagattttgcagtttattactgtcagcagtggctgaacaaccccttcaccttcggccaagggacacgactggagataatccgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttagnnnnnn(SEQ ID NO.7)
8G3Fab轻链氨基酸序列:
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQFVGFYIHWYQQKPGQAPRLLIYAASERATGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWLNNPFTFGQGTRLEIIRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC.(SEQ ID NO.8)
8G3Fab重链DNA序列:
gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtacagcccggggagtccctgagactctcctgtgcaggttctggattcacctttaatgattatgccatgcactgggtccgccagatgcccgggaagggcctggagtgggtctcaactatttatccctggaatagtggttaccacctactatgcgaactcgaaactccgattcaccatctccagagacaacgccatcagcaccgcctacctgcagtggagcagcctgagggcctcggacacggccttgtattactgtgcaaaatcgacatacagtatggcggttactggcggttcgacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcctcagcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaggttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgc(SEQ ID NO.9)
8G3Fab重链氨基酸序列:
EVQLVESGGGLVQPGESLRLSCAGSGFTFNDYAMHWVRQMPGKGLEWVSTIYPWNSGYHLLCELETPIHHLQRQRHQHRLPAVEQPEGLGHGLVLLCKIDIQYGGYWRFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTC(SEQ ID NO.10)
注:带下划线的是CDR区(氨基酸序列中)或CDR编码区(DNA序列中).
实施例4.全长8G3蛋白制备
用pGP6C做表达载体、DG44为受体细胞获得了稳转细胞系,对8G3全长蛋白进行了表达,详细操作描述如下。
表达载体pGP6C的构建如图2所示。
把8G3的轻链可变区编码序列(SEQ ID NO.4)和重链可变区编码序列(SEQ ID NO.6)克隆到已预置了恒定区和信号肽序列编码区的双表达框表达载体pGP6C。
上述重组表达载体称之为pGP6C/8G3,用来瞬转DG44细胞,以检查是否可以产生正确的全长8G3抗体分子及其表达水平是否正常。如结构正确、表达正常,则用Kpn2线性化pGP6C/8G3载体。
用上述线性化的载体DNA转染DHFR-的预先适应了无血清悬浮培养的DG44受体细胞。转染用LIPFamine2000(Invitrogen产品)或其他转染试剂进行,同时进行三个转染。转染完毕,所述细胞在20,50,100and 200nM G418压力下进行选择,每浓度1次培养2周。然后转移至96孔板培养,长至70%覆盖度时换成选择培养基(含5%透析胎牛血清和适当水平的G418)进行筛选,并监控其生长情况,直至未转染的细胞全部死去,只留下转染的细胞。所述带有转染细胞的板生长大约4周,至形成明显的细胞团。镜检观察产生的细胞团,至适当大小(大于孔底面积的>60%),并确认每孔只有一个细胞团。根据对细胞上清的IgG kappa ELISA检测结果,从960个转染子中筛选出82个表达水平相对较高的孔,并对其进行了静态培养鉴定。对选出的细胞系在EX302无血清培养基(JRH产品)中进行悬浮培养,用ELISA法进一步检定其表达水平并对细胞生长速率进行观察。根据收获上清的抗体浓度和可接受的生长特性,选出了两个最好的细胞系在EX302无血清培养基中进行批式摇瓶培养。用Protein A/ELISA法测定,两个细胞系都可产生8G3全长抗体分子,产率在12.5~27pg/cell/day。
以Invitrogen的mRNA纯化试剂盒分离纯化mRNA后常规方法进行反转录,把获得的cDNA克隆至pUC57,菌落PCR鉴定阳性克隆后,进行DNA测序,证实两个克隆都有全长的轻链和重链编码区。根据DNA测序结果推断的氨基酸序列与预期相同。
借助GE Healthcare的重组抗体纯化的MabSelect/Capto S/Capto Q方案对重组抗体进行纯化。
实施例5.进化后的亲和力测定
亲和力测定与比较
本发明中的待测样品是在E.coli DH5α中表达的3D5、6F4、7A6和8G3及其原型抗体7F2的Fab抗体分子,用Protein L亲和层析纯化得到的。自备的C2B8Fab、2F2Fab是根据美国专利005736137和美国专利申请20040167319提供的序列确定其Fab轻链和重链的编码序列后利用PCR为基础的全基因合成方法合成全长后插入到pCOMb3M,在E.coliDH5α中表达后,用Protein L亲和层析纯化得到的。
以人CD20为抗原,对变异体3D5、6F4、7A6和8G3及其原型抗体7F2进行了亲和力分析,阳性对照为自备的C2B8Fab。
抗体和人CD20在溶液中共温育至平衡,用固化的人CD20进行ELISA测定自由抗体的浓度,并根据Friguent et al.(Friguet,B t al,1985,J Immunol Methods,77:305-319)的方法计算亲和力(Kd)。
根据亲和力测定结果,8G3是最好的克隆,可作为进一步测定生物活性以评价其临床应用价值的对象。
附图3是3D5、6F4、7A6和8G3、原型抗体7F2以及阳性对照C2B8Fab的亲和力数据。数据表明,与其原型分子7F2以及阳性对照相比,进化后的8G3的亲和力有大幅度提高。后续研究中还将对这一改进的生物学功能进行检测。阴性对照与该抗原没有结合能力,这里未给出试验数据。
计算得出的7F2,8G3和阳性对照的Kd值分别为2783,465and 1827pM。
在另一实验中对全长F8G3、自备2F2(HuMax-CD20)和C2B8的亲和力进行了相同的比较,附图4给出了全长8G3(此处称为F8G3)、商品化的C2B8及2F2的亲和力。该图说明,与其阳性对照C2B8相比,F8G3的亲和力得到很大提高。根据Friguent公式得出的F8G3、2F2和C2B8的亲和力是37,121and 3512pM。与两个阳性对照相比,F8G3的亲和力显著提高。
解离速率测定
为了测得这些抗体的解离速率,1ml Ramos细胞在azide/2DOG存在的情况下与2μg/ml125I标记的抗体37℃温育2小时,以达到最大结合量。然后,3000rpm离心15分钟,去上清,沉淀快速重悬于1ml培养基,并立即转移到含有9ml 37℃培养基的15ml conical管中,充分混合。此后2小时进行多点取样,每次0.4ml,在phthalate oils进行分离以测定保持在细胞表面的放射性标记抗体的水平。如图5所示,F8G3的解离速率明显低于C2B8和2F2。
实施例6.诱导凋亡
靶细胞系为CD20阳性的B淋巴细胞系DHL-4,阴性对照为HumiraFab,阳性对照为C2B8Fab。
加入抗人CD20抗体后,B淋巴细胞出现凋亡。加入抗体5天后,对细胞进行计数并进行MTT试验,表2为实验结果。
表2.抗人CD20抗体诱导凋亡作用(活细胞%)
上表说明,给细胞施用抗人CD20抗体、自备C2B8Fab、2F2Fab和本发明的8G3可以诱导细胞凋亡并使活细胞比例降低,但施用阴性对照Humira Fab没有这种效应。8G3诱发的这种比率的降低远比C2B8Fab和2F2Fab要高。这说明,8G3具有更高的杀死Cd20阳性细胞的能力。
实施例7.活体内抗肿瘤作用试验
以每小鼠5×106细胞皮下注射接种DHL4细胞。第十天肿瘤体积达到0.3×0.3×0.3cm或以上时,皮下注射Humira、C2B8和F8G3,每支动物注射5mg。在注射后第0、10、15、20、25和30天时测定肿瘤大小。附图6是这一实验的结果。
数据说明,与阴性对照相比,施用抗人CD20抗体可以显著抑制肿瘤的生长。与阳性对照相比,F8G3可以在整个试验期间使肿瘤明显生长缓慢。
实施例8.人源抗人CD20抗体的CDC作用
用两种不同的B细胞系Daudi和Raji来测定2F2和F8G3的CDC功能,Humira为阴性对照。向培养的细胞在加入新鲜制备的人血清前10分钟按10μg/ml分别加入上述抗体。在诱导CDC之后,在若干时间点(至1小时)取样,用PI(Propidium Iodide)/Hoechst33342染色悬浮细胞,冰浴或4℃温育20分钟后,用PBS洗涤细胞3次,然后在荧光显微镜下观察,以鉴别正常(弱红色+弱蓝色)、凋亡(弱红+强蓝)和坏死(强红+强蓝)的细胞,每个样品的计数细胞总数应大于500个。
实验结果如图7A(Daudi cells)和图7B(Raji cells)所示。抗体的加入在5分钟即诱导细胞裂解。在两个细胞系,F8G3产生的细胞裂解比例都超过90%,2F2诱导的裂解超过80%,但阴性对照抗体未见裂解细胞。
实施例9。ADCC试验
用淋巴细胞分离液从40ml新鲜制备的外周血制备的效应细胞(mNC cells)接种到圆底96孔板,每孔100μl。Raji细胞作为靶细胞。1×106cells/mL的Raji细胞与100μCi的铬酸钠37℃温育60分钟,PBS洗涤三次后继续温育30分钟使51Cr自发释放。然后,按照指定的效应细胞:靶细胞比例加入到效应细胞。在CO2培养箱中37℃温育18小时。试验为为三重复设计,按公式计算其细胞毒性%。
细胞毒性%=100×(受试51Cr释放-自发51Cr release)/(最大51Cr释放-自发51Cr释放),
这里,最大和自发释放计数是根据三重复设计的与2%靶细胞Triton X-100(Sigma)温育后以及空白培养基中分别测定的数据计算的。
测定了F8G3诱导Raji细胞ADCC的能力,2F2为阳性对照,Humira为阴性对照。所有抗人CD20抗体都表现出明显的剂量效应(附图8),并诱导Raji细胞发生特异性裂解。2F7诱导的靶细胞裂解为35%,而F8G3高达47%,阴性对照不诱导特异性裂解。
实施例10。CD20结合分子在治疗人类疾病中的应用
本实施例描述本发明的CD20结合分子治疗和预防某些人类疾病方面的应用,包括但不限于B细胞相关的癌症和自身免疫疾病。
例如,一个有上述某种病的人可以静脉注射含有8G3或其一个片段的单克隆抗体,例如8G3,F8G3,剂量为每公斤体重0.4to 20.0mg/kg,每周一次,共4到8个剂量。
本发明的抗体或其Fab可以用90Y或其他放射性物质标记以用于治疗和/或活体成像诊断。可以对治疗的效果进行监控以决定是否需要提高或降低剂量,以及是否需要重复治疗。
本发明的抗体或抗体片段可以用放射性物质、荧光物质、显色物质或其他可测定物质进行标记,以用于与CD20相关的疾病的检测。
上述提到的本发明的抗体在治疗、预防及诊断人类疾病上的应用,其相应的使用方法可以有多种多样的变化或修改,这对于本领域的技术人员来说是显而易见的。尽管本发明中描述了一些特定的或优选的实施例,但应当理解,本发明请求的权力并不限于这些特定的案例。事实上,熟知化学、医学、分子生物学或相关领域的人员,对所述各案例进行有效的修改或变化从而获得类似的、相同的甚或更好的结果,是完全可能的,这些也都应当在本发明权利要求的范围之内。