FR2962439A1

FR2962439A1 - Anticorps monoclonaux diriges contre la toxine tetanique

Info

Publication number: FR2962439A1
Application number: FR1055671A
Authority: FR
Inventors: Sylvie Jorieux; Romeuf Christophe De
Original assignee: LFB Biotechnologies SAS
Current assignee: LFB Biotechnologies SAS
Priority date: 2010-07-12
Filing date: 2010-07-12
Publication date: 2012-01-13
Also published as: WO2012007688A1; AR082160A1

Abstract

La présente invention concerne un anticorps monoclonal dirigé contre la toxine tétanique, caractérisé en ce qu'il se lie à un fragment protéique de la toxine tétanique.

Description

Anticorps monoclonaux dirigés contre la toxine tétanique

La présente invention a pour objet des anticorps monoclonaux, notamment humains dirigés contre la toxine tétanique. Le tétanos est une maladie neurologique due à l'action de la toxine tétanique. Cette pathologie est due à Clostridium tetani, un bacille sporulant anaérobie strict à Gram positif et ubiquitaire dont les spores sont souvent retrouvées dans le sol, les poussières, les déjections animales.

Ce bacille pénètre dans l'organisme à l'occasion d'une plaie. Les plaies profondes, punctiformes, les plaies contenant des tissus dévitalisés ou un corps étranger créent un environnement plus favorable au développement de C. tetani, mais n'importe quelle effraction cutanée, même la plus superficielle, peut permettre l'infection : abrasion cutanée, brûlures ou engelures, chirurgie, avortement, otite moyenne aiguë, toxicomanie intraveineuse. Le tétanos peut également compliquer certaines maladies chroniques : ulcères de décubitus, abcès, gangrène. Quand les conditions d'anaérobiose sont réunies, il y a germination des spores et production de tétanospasmine. La tétanospasmine est une neurotoxine thermolabile produite par Clostridium tetani, sous la forme d'un précurseur inactif ou très faiblement actif constitué d'une unique chaîne polypeptidique de 150 kDa. Cette chaîne est dépourvue de séquence signal et est clivée par des protéases bactériennes, après sa libération, en une chaîne lourde de 100 kDa liée par un pont disulfure à une chaîne légère de 50 kDa. Fonctionnellement, la neurotoxine la tétanospasmine comprend trois régions : l'extrémité COOH terminale de la chaîne lourde est responsable de l'attachement à un récepteur de 15kDa de la membrane des neurones, une région NH2 terminale de la chaîne lourde gouverne la pénétration et la chaîne légère est responsable du blocage de la libération des neurotransmetteurs. La tétanospasmine produite par le bacille est disséminée dans l'organisme via le système lymphatique et vasculaire jusqu'aux extrémités terminales des nerfs moteurs et migre le long des axones vers la moelle épinière et le tronc cérébral. Là, elle accède aux interneurones inhibiteurs dont elle bloque la libération de neuromédiateurs, en l'occurrence la glycine et surtout le GABA (acide gamma amino-butyrique), interrompant ainsi une voie majeure du contrôle des contractions musculaires. Le mécanisme moléculaire du blocage de la neuroexocytose par la toxine tétanique fait intervenir la protéolyse d'une protéine des vésicules synaptiques ayant un rôle clé dans la fusion des vésicules avec la membrane présynaptique. La diminution de l'inhibition résulte en une augmentation de l'activité des neurones moteurs et provoque les spasmes musculaires caractéristiques du tétanos. La perte de l'inhibition se retrouve également au niveau du système nerveux sympathique, provoquant une augmentation des catécholamines circulantes responsable des manifestations dysautonomiques de la maladie.

Les signes cliniques apparaissent après une période d'incubation de 2 à 14 jours, selon différents facteurs incluant notamment le site d'inoculation et l'âge du patient. Chez l'adulte, les premiers signes sont souvent une dysphagie (douleurs et difficultés à la déglutition) et une douleur de la nuque. Chez le nouveau-né, tout débute par un refus de téter. Au fur et à mesure que l'infection progresse, apparaissent le trismus (blocage de la mâchoire en position fermée), le rictus sardonique (grimace caractéristique due à la contracture des muscles de la face) et l'opisthotonos (hyper extension de la nuque et du dos par contracture des muscles paravertébraux). La contracture des muscles de la paroi abdominale peut simuler un abdomen aigu. Viennent ensuite les spasmes généralisés (membres supérieurs en flexion, membres inférieurs en extension), déclenchés par n'importe quel stimulus (bruit, lumière, toucher) ou survenant spontanément dans les formes graves. La maladie évolue alors inexorablement vers l'arrêt respiratoire par spasme laryngé et/ou spasme de la musculature respiratoire. Il existe à l'heure actuelle, des mesures pour prévenir l'infection par le tétanos, telles que : - L'immunisation active des sujets par la vaccination avec l'anatoxine tétanique (souvent couplée avec la vaccination diphtérique et anticoquelucheuse chez les enfants). La vaccination comporte 3 injections sous-cutanées à 1 mois d'intervalle avec rappel 1 an plus tard. Des injections de rappel doivent être faites tous les 5 à 10 ans. - Le nettoyage minutieux des plaies souillées de terre. Le débridement chirurgical permet seul d'enlever les tissus nécrosés. Par ailleurs, il existe également des traitements curatifs de cette pathologie via notamment l'antibiothérapie, la sérothérapie et l'immunothérapie. La pénicilline G, longtemps utilisée pour traiter les patients atteints du tétanos, est maintenant remplacée par le métronidazole IV, du fait de son activité antagoniste du GABA. L'antibiothérapie permet de diminuer le nombre de bacilles produisant la toxine, mais n'a aucun effet sur la toxine déjà libérée et circulante ou fixée sur le neurone. Le sérum antitétanique de Pasteur est un sérum issu de chevaux immunisés contre la toxine tétanique. Le sérum contient des fragments F(ab)'2 neutralisants dirigés contre la toxine tétanique et il n'agit que sur la toxine circulante. Du fait d'effets secondaires majeurs et notamment des accidents allergiques, anaphylactiques et sériques, le sérum antitétanique est aujourd'hui remplacé par l'administration d'immunoglobuline anti-toxine tétanique. Gammatétanos® (LFB Biomédicaments) est une composition d'immunoglobulines polyclonales antitoxine tétanique humaine, qui permet de neutraliser la tétanospasmine qui n'a pas encore gagnée le système nerveux. Les symptômes tels que les spasmes peuvent être traités par les benzodiazépines. Ces médicaments agissent effectivement au niveau synaptique en diminuant la recapture du GABA et ont donc un effet directement opposé à celui de la tétanospasmine. Le traitement vise à contrôler les spasmes durant plus de 5-10 secondes pour prévenir l'arrêt respiratoire, les doses requises pouvant être considérables (5-15mg/kg/j) et devant être fractionnées (toutes les 1 à 4 heures). La prise en charge des manifestations dysautonomiques, qui apparaissent tardivement dans le décours de la maladie, est difficile. L'hyperactivité sympathique est soulagée par bêta-bloquants et parfois par bloc épidural avec des anesthésiques locaux. L'hyperactivité parasympathique est rare mais peut nécessiter la pose d'un stimulateur cardiaque en cas de bradycardie. Le maintien d'une hydratation et d'une alimentation suffisante est capital, on utilise une sonde naso-gastrique ou un tube de gastrostomie. Un traitement préventif des thromboses veineuses profondes, des ulcères gastriques et de décubitus doit être institué. Le traitement curatif du tétanos reste toutefois très difficile. Il existe un besoin important de nouveaux traitements du tétanos et de ses complications. Plus particulièrement, il existe un besoin aigu d'une thérapeutique adaptée pour la prévention et/ou le traitement curatif de cette pathologie. Le brevet EP 0 562 132 divulgue des anticorps monoclonaux anti-tétanotoxine, produits dans un hybridome, se liant à la chaine légère de la toxine tétanique avec une affinité d'au moins 1 x109 M"' pour la toxine tétanique. Ces anticorps neutralisent l'activité biologique de la tétanotoxine avec une capacité d'au moins 2 UI/100 pg d'lg, voire de 4UI/100pg d'lg. Ils sont utilisés dans une composition pharmaceutique pour l'immunisation passive contre le tétanos. Les anticorps sont produits par des hybridomes entre des cellules lymphoblastoïdes et des myélomes de souris. EP 0 562 132 ne décrit pas les séquences en acides aminés des anticorps utilisés, ni la séquence en acides aminés de l'épitope contre lequel ces anticorps sont dirigés. Aussi, l'invention a pour objet de fournir des anticorps neutralisant la toxine tétanique, comme alternative avantageuse aux compositions existantes comprenant des anticorps dirigés contre la toxine tétanique.

Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation de ces anticorps en tant que médicaments ou agents de décontamination lors d'une contamination par la toxine tétanique. La Demanderesse propose maintenant d'utiliser de nouveaux anticorps monoclonaux notamment humains dirigés contre la toxine tétanique, comme solution alternative aux anticorps déjà connus dirigés contre la toxine tétanique pour prévenir et/ou traiter le tétanos. Ces anticorps sont caractérisés en ce qu'ils lient un fragment protéique dont la séquence en acides aminés présente une identité de séquence d'au moins 85% par rapport à la séquence en acides aminés du fragment C de la toxine tétanique.

L'avantage présenté par la liaison des anticorps à ce fragment protéique réside en ce que la liaison de l'anticorps selon l'invention sur le fragment C, fragment responsable de liaison au récepteur présent à la membrane des neurones, inhibe la phase d'accrochage de la toxine au neurone empêchant toute action délétère de la toxine vis-à-vis de la cellule cible.

L'invention a pour objet un anticorps monoclonal dirigé contre la toxine tétanique, caractérisé en ce qu'il se lie à un fragment protéique dont la séquence en acides aminés est SEQ ID NO:63 ou à un fragment protéique présentant une identité de séquence d'au moins 85%, et de préférence au moins 90%, avec la séquence en acides aminés SEQ ID NO:63. La séquence en acides aminés SEQ ID NO :63 correspond à la séquence du fragment C de la toxine tétanique issue de la souche E88 (n°20886).

Parmi les fragments protéique présentant une homologie de séquence d'au moins 85%, préférentiellement au moins 90%, avec la séquence d'acides aminés SEQ ID NO:63, on peut citer le fragment C de la souche Massachussetts de C. tetani, possédant la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 64 Les termes « anticorps » et « immunoglobuline » ont la même signification. Ils sont utilisés indifféremment dans la présente invention pour désigner une protéine multimérique constituée de 4 chaînes participant à la réponse immunitaire acquise. Les immunoglobulines sont constituées d'un assemblage de deux dimères constitués chacun d'une chaîne lourde et d'une chaîne légère. Le complexe multimérique est assemblé par la liaison d'une chaîne légère et d'une chaîne lourde par un pont disulfure entre deux cystéines, les deux chaînes lourdes étant elle-même également reliées entre elles par un ou plusieurs (de 1 à 11) ponts disulfure dépendant de l'isotype considéré. II existe deux types de chaînes légères : lambda (2k) et kappa M. II existe cinq types de chaînes lourdes définissant les classes (ou isotypes),et qui déterminent l'activité fonctionnelle d'un anticorps : IgM, IgD, IgG, IgA et IgE. Chaque chaîne comprend différents domaines. La chaîne légère est constituée d'une région variable (VL) et d'une région constante (CL). La chaîne lourde est constituée d'une région variable (VH) et d'une région constante elle-même constituée de trois ou quatres domaines constants CH1, CH2 et CH3 CH4.en fonction de l'isotype considéré. Les régions variables des chaînes légères et des chaînes lourdes déterminent la capacité de reconnaissance de l'antigène et la spécificité de liaison anticorps-antigène. Les régions constantes des chaînes légères et lourdes confèrent aux anticorps leurs propriétés biologiques telles que l'association des chaînes d'anticorps entre elles, la sécrétion des anticorps, la liaison au complément et la liaison aux récepteurs Fc (FcR). L'assemblage des chaînes constituant un monomère d'immunoglobuline peut être schématisé par une lettre Y, dans laquelle : la base du Y correspond à la région constante « Fc », constituée par les domaines CH2 CH3 et des CH4 le cas échéant deux chaînes lourdes, qui est reconnue par le complément et les récepteurs spécifiques de ce fragment Fc, et chacune des extrémités des deux bras du Y correspond à l'assemblage des régions variables respectives d'une chaîne légère et d'une chaîne lourde.

La région variable de chacune des chaînes légères et des chaînes lourdes est constituée de trois domaines déterminant la reconnaissance de l'antigène (Complementarity determining region, ou CDR) entourées de quatre domaines charpentes (framework, ou FR). Les CDRs correspondent à des séquences d'acides aminés qui, lorsqu'elles sont assemblées, conditionnent majoritairement l'affinité de liaison et la spécificité de l'anticorps pour son antigène. Le site de liaison d'un antigène (épitope) dépend donc 6 CDRs, dont 3 proviennent de la chaîne légère et 3 de la chaîne lourde. Le terme « anticorps humain » définit un anticorps constitué uniquement de séquences d'origine humaine. Un « anticorps chimère » peut contenir, d'une part, des domaines VH et VL d'un anticorps dérivé d'un animal non humain et, d'autre part, des domaines CH et CL d'un autre anticorps, par exemple un anticorps humain. Un « anticorps humanisé » est un anticorps dans lequel les CDRs proviennent d'un anticorps de spécificité différente de celle des autres domaines de l'anticorps. Par exemple, des CDRs de souris peuvent être introduits entre les régions FR d'un anticorps humain. Le terme « anticorps monoclonal », ou AcM, définit une molécule d'anticorps, ou une population homogène d'anticorps, dirigée contre un déterminant antigénique défini et habituellement produite par un seul clone de cellules B, ou hybridome. De tels anticorps peuvent être également produits selon une méthode décrite dans Pasquali et al. (Blood, 2001, 97, 3820-28). Les anticorps polyclonaux constituent une population d'anticorps hétérogènes pouvant reconnaître différents déterminants antigéniques d'un antigène unique. Le terme « fragment d'anticorps » définit une portion d'anticorps intact, de préférence un site de liaison à l'antigène ou une région variable de l'anticorps. Des exemples de fragments incluent Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, scFv, sc(Fv)2, et des anticorps multispécifiques composés de différents fragments. Le terme « Fab » désigne un fragment d'anticorps de masse moléculaire d'environ 50.000 dalton et possédant une activité de liaison à l'antigène. Il comprend environ la moitié du côté N-terminal de la chaîne lourde et la chaîne légère entière liés par un pont disulfure. Le Fab peut être obtenu notamment par le traitement des IgG par une protéase, la papaïne. Le terme « F(ab')2 » désigne un fragment d'environ 100.000 dalton et une activité de liaison à l'antigène, l'association par un pont disulfure de deux Fab décrits ci-dessus. Il peut être obtenu par le traitement des IgG par une protéase, la pepsine. Un « scFv » (single chain Fv) est un polypeptide VH::VL synthétisé en utilisant les gènes codant pour les domaines VL et VH et une séquence codant pour un peptide destiné à lier ces domaines. Un scFv selon l'invention inclut les CDRs maintenus dans une conformation appropriée, par exemple en utilisant des techniques de recombinaison génétique.

Les anticorps décrits dans l'invention sont produits sous forme recombinante dont les séquences codantes (ADNc) sont isolées de lymphocytes B humains produisant des immunoglobulines dirigées contre la toxine tétanique. Ces cellules B, contenues dans les PBMC purifiés de sang humain, sont elles mêmes purifiés (cell sorting) par un trieur de cellules couplé à un cytométre en flux en utilisant un anti-CD19 et le fragment C de la toxine marqué au FITC (Sigma ref T3819, souche Massachusetts D7) pour les identifier et les isoler. Une RT-PCR sur cellule unique permet la conversion des ARN totaux en ADNc duquel sont amplifiés spécifiquement à l'aide d'amorces judicieusement choisies les fragments variables codant les anticorps d'intérêt. Ces fragments variables d'immunoglobulines sont ensuite clonés dans des vecteurs d'expression adapté au système d'expression choisi et contenant les parties constants d'une immunoglobuline humaine d'isotype choisi. Le clonage des parties variables peut se faire dans un vecteur unique contenant les 2 parties constantes d'Ig. Le ou les vecteurs d'expression sont ensuite transfectés par dans une lignée d'expression, pour être exprimé de façon transitoire ou stable après avoir traité les cellules avec un antibiotique la G418. Les anticorps sont purifiés par chomatographie d'affinité selon des techniques bien connues de l'homme du métier.

Ces anticorps sont matures, c'est-à-dire qu'ils possèdent une structure tridimensionnelle ad hoc leur permettant de reconnaitre l'antigène, et possèdent toutes les modifications post-traductionnelles essentielles à leur reconnaissance antigénique.

Le fragment protéique de SEQ ID N°63 correspond à une séquence en acides aminés de la toxine tétanique située dans la partie C-terminale de la toxine et issu du clivage de celle-ci par la papaïne.

Plus particulièrement, l'invention concerne un anticorps monoclonal chimère, humanisé ou humain, dirigé contre la toxine tétanique. De préférence, l'anticorps monoclonal utilisé est humain. Encore plus particulièrement, l'invention concerne un anticorps monoclonal humain dirigé contre la toxine tétanique, caractérisé en ce qu'il présente une constante d'affinité (KA) pour la toxine tétanique au moins égale à 1x10$ M"1. De préférence, l'anticorps monoclonal humain dirigé contre la toxine tétanique présente une constante d'affinité pour celle-ci au moins égale à 1x109 M"1. Plus préférentiellement, l'anticorps monoclonal humain dirigé contre la toxine tétanique présente une constante d'affinité pour celle-ci au moins égale à 1x1010 L'affinité d'un anticorps pour un antigène peut être mesurée par différentes méthodes bien connues de l'homme du métier, et notamment en utilisant les techniques ELISA ou par résonnance plasmonique de surface, en mesurant directement la fixation antigène-anticorps ou par des méthodes d'inhibition compétitive.

Un anticorps disposant d'une affinité élevée pour la toxine tétanique présente l'avantage de nécessiter une dose comparativement plus faible d'anticorps par rapport à un anticorps présentant une affinité faible. Selon un mode particulier de réalisation, l'invention a pour objet un anticorps monoclonal dirigé contre la toxine tétanique, dans lequel la chaîne légère et la chaîne lourde sont telles que : - la région constante de la chaîne légère de l'anticorps est essentiellement constituée par la région constante de la chaîne légère d'une immunoglobuline humaine IgG1, et/ou - la région constante de la chaîne lourde est essentiellement constituée par la région constante de la chaîne lourde d'une immunoglobuline humaine IgG1. Plus particulièrement encore, ladite chaine légère d'une immunoglobuline humaine de type IgG1 et/ou ladite chaîne lourde d'une immunoglobuline humaine de type IgG1 sont constituées par la partie constante d'une chaine légère et la partie constante d'une chaine lourde d'une immunoglobuline humaine obtenue par immunisation avec l'antigène Rhésus D, et en particulier du clone T125-A2 humain. « La région constante de la chaîne légère est essentiellement constituée de la région constante de la chaîne légère d'une immunoglobuline humaine » signifie que la région constante de la chaîne légère peut être constituée de la séquence de la région constante d'une chaîne légère d'une immunoglobuline humaine, mais peut également être constituée d'une séquence correspondant à la fusion de plusieurs séquences de plusieurs régions constantes de plusieurs immunoglobulines humaines. En d'autres termes, la région constante de la chaîne légère peut être constituée d'une séquence correspondant à une mosaïque de séquences de régions constantes de chaînes légères, sous réserve que ladite séquence mosaïque reconstitue une séquence d'une région constante d'une chaîne légère. « La région constante de la chaîne lourde est essentiellement constituée de la région constante de la chaîne lourde d'une immunoglobuline humaine » signifie que la région constante de la chaîne lourde peut être constituée de la séquence de la région constante d'une chaîne lourde d'une immunoglobuline humaine, mais peut également être constituée d'une séquence correspondant à la fusion de plusieurs séquences de plusieurs régions constantes de plusieurs immunoglobulines humaines. En d'autres termes, la région constante de la chaîne lourde peut être constituée d'une séquence correspondant à une mosaïque de séquences de régions constantes de chaînes lourdes, sous réserve que ladite séquence mosaïque reconstitue une séquence d'une région constante d'une chaîne lourde. « La région variable de la chaîne légère comprend la région variable de la chaîne légère d'une immunoglobuline humaine », signifie que la séquence de la région variable de la chaîne légère correspond à la séquence de la région variable de la chaîne légère d'une immunoglobuline humaine. Cette région variable de la chaîne légère peut être fusionnée, dans sa région N-terminale, à la région C- terminale d'une séquence permettant l'excrétion de l'anticorps. Cette séquence permettant l'excrétion de l'anticorps est appelée peptide signal ou séquence leader. « La région variable de la chaîne lourde comprend la région variable de la chaîne lourde d'une immunoglobuline humaine» signifie que la séquence de la région variable de la chaîne lourde correspond à la séquence de la région variable d'une chaîne lourde d'une immunoglobuline humaine. Cette région variable de la chaîne lourde peut également être fusionnée dans sa région N-terminale, à la région C-terminale d'une séquence permettant l'excrétion de l'anticorps.

Dans la cellule productrice de l'anticorps monoclonal de l'invention, ledit anticorps monoclonal anti-toxine tétanique est produit sous forme d'un précurseur qui possède, dans la région N-terminale de la chaîne légère et de la chaîne lourde, une séquence leader ou peptide signal. Ce précurseur subit alors diverses étapes de maturation, et en particulier les séquences leader sont clivées pour permettre la sécrétion de l'anticorps dans le milieu extracellulaire. L'anticorps sécrété est donc un anticorps mature. Ainsi la définition de l'anticorps monoclonal humain de l'invention couvre à la fois : le précurseur de l'anticorps humain tel que défini ci-dessus, et l'anticorps humain défini ci-dessus.

Dans un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, l'anticorps monoclonal décrit ci-dessus et ci-après possède une chaîne légère, et notamment une région constante de ladite chaîne légère de type kappa M. Dans autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne un anticorps monoclonal dirigé contre la toxine tétanique précédemment décrit, dans lequel : la chaîne légère dudit anticorps monoclonal comprend au moins les régions de complémentarité déterminante (CDRLm) de la région variable d'une chaîne légère d'une immunoglobuline humaine, et la chaîne lourde dudit anticorps monoclonal comprend au moins les régions de complémentarité déterminante (CDRHm) de la région variable d'une chaîne lourde d'une immunoglobuline humaine.

Selon un mode particulier de réalisation, l'invention a pour objet un anticorps monoclonal caractérisé en ce que la région variable de la chaîne légère comprend les SEQ ID NO: 57 et SEQ ID NO: 58.

Les séquences SEQ ID NO: 57 et SEQ ID NO: 58 correspondent respectivement aux séquences des CDR2 et CDR3 identifiés dans la séquence d'anticorps monoclonaux présentant une affinité particulièrement élevée pour la toxine tétanique.

Selon un mode plus particulier de réalisation, l'invention a pour objet un anticorps monoclonal caractérisé en ce que la région variable de la chaîne légère comprend la SEQ ID NO: 59.

Selon un mode réalisation avantageux, l'invention concerne un anticorps monoclonal défini précédemment, caractérisé en ce que la région variable de la chaîne légère comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO:1 ou une séquence en acides aminés présentant une identité de séquence d'au moins 85%, de préférence au moins 90%, de préférence au moins 95% et de préférence au moins 97% avec SEQ ID NO:1.

Un mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention a pour objet un anticorps monoclonal tel que défini ci-dessus, dans lequel : - la région variable de la chaîne légère comprend une séquence en acides aminés identique à une séquence choisie dans le groupe constitué par les séquences suivantes: SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:23 et SEQ ID NO:33, et - la région variable de la chaîne lourde comprend une séquence en acides aminés identique à une séquence choisie dans le groupe constitué par les séquences suivantes: SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:24 et SEQ ID NO:34.

Un mode de réalisation plus particulièrement avantageux de l'invention a pour objet un anticorps monoclonal tel que défini ci-dessus, dans lequel la région variable de la chaîne légère comprend une séquence identique à SEQ ID NO:1 et la région variable de la chaîne lourde comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO:2. Un autre mode de réalisation plus particulièrement avantageux de l'invention a pour objet un anticorps monoclonal tel que défini ci-dessus, dans lequel la région variable de la chaîne légère comprend une séquence identique à SEQ ID NO:13 et la région variable de la chaîne lourde comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO:14.

Un autre mode de réalisation plus particulièrement avantageux de l'invention a pour objet un anticorps monoclonal tel que défini ci-dessus, dans lequel la région variable de la chaîne légère comprend une séquence identique à SEQ ID NO:23 et la région variable de la chaîne lourde comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO:24. Un autre mode de réalisation plus particulièrement avantageux de l'invention a pour objet un anticorps monoclonal tel que défini ci-dessus, dans lequel la région variable de la chaîne légère comprend une séquence identique à SEQ ID NO:33 et la région variable de la chaîne lourde comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO:34.

Un autre mode de réalisation avantageux de l'invention concerne un anticorps monoclonal tel que défini ci-dessus, dans lequel : - la région constante de la chaîne légère comprend une séquence en acides 15 aminés identique à SEQ ID NO:3 ou présentant une identité de séquence d'au moins 85% avec SEQ ID NO:3, et - la région constante de la chaîne lourde comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO:4 ou présentant une identité de séquence d'au moins 85% avec SEQ ID NO:4. 20 Un autre mode de réalisation avantageux de l'invention concerne un anticorps monoclonal défini ci-dessus, dans lequel : - chacune des chaînes légères comprend une séquence en acides aminés identique à une séquence choisie dans le groupe constitué par : SEQ ID NO:5, 25 SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:25 ou SEQ ID NO:35. - chacune des chaînes lourdes comprend une séquence en acides aminés identique à une séquence choisie.dans le groupe constitué par : SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:26 ou SEQ ID NO:36.

30 Un mode de réalisation de l'invention concerne un anticorps monoclonal dirigé contre la toxine tétanique, dans lequel : - la région variable de la chaîne légère comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO: 1, et - la région variable de la chaîne lourde comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO: 2.

Plus particulièrement, un mode de réalisation avantageux de l'invention concerne un anticorps monoclonal tel que défini ci-dessus, dans lequel : - la région variable de la chaîne légère comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO: 1, et 10 - la région variable de la chaîne lourde comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO: 2, et - la région constante de la chaîne légère comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO:3, et - la région constante de la chaîne lourde comprend une séquence en acides 15 aminés identique à SEQ ID NO:4.

Plus particulièrement encore, un mode de réalisation avantageux de l'invention concerne un anticorps monoclonal tel que défini ci-dessus, dans lequel : - la chaîne légère comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID 20 NO: 5, et - la chaîne lourde comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO: 6. Cet anticorps monoclonal est l'anticorps désigné comme « Anticorps 3 » dans la partie « Exemples » de la présente demande de brevet. 25 Un autre mode de réalisation de l'invention concerne un anticorps monoclonal dirigé contre la toxine tétanique, dans lequel : - la région variable de la chaîne légère comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO: 13, et 30 - la région variable de la chaîne lourde comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO: 14.

Plus particulièrement, l'invention concerne un anticorps monoclonal tel que défini ci-dessus, dans lequel : - la région variable de la chaîne légère comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO: 13, et - la région variable de la chaîne lourde comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO: 14, et - la région constante de la chaîne légère comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO:3, et - la région constante de la chaîne lourde comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO:4.

Plus particulièrement encore, un mode de réalisation avantageux de l'invention concerne un anticorps monoclonal tel que défini ci-dessus, dans lequel : - la chaîne légère comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO: 15, et - la chaîne lourde comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO: 16. Cet anticorps monoclonal est l'anticorps désigné comme « Anticorps 4 » dans la partie « Exemples » de la présente demande de brevet.

Un autre mode de réalisation de l'invention concerne un anticorps monoclonal dirigé contre la toxine tétanique, dans lequel : - la région variable de la chaîne légère comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO: 23, et - la région variable de la chaîne lourde comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO: 24.

Plus particulièrement, un mode de réalisation avantageux de l'invention concerne un anticorps monoclonal tel que défini ci-dessus, dans lequel : - la région variable de la chaîne légère comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO: 23, et - la région variable de la chaîne lourde comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO: 24, et - la région constante de la chaîne légère comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO:3, et - la région constante de la chaîne lourde comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO:4.

Plus particulièrement encore, un mode de réalisation avantageux de l'invention concerne un anticorps monoclonal tel que défini ci-dessus, dans lequel : - la chaîne légère comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO: 25, et - la chaîne lourde comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO: 26. Cet anticorps monoclonal est l'anticorps désigné comme « Anticorps 5 » dans la partie « Exemples » de la présente demande de brevet.

Un autre mode de réalisation de l'invention concerne un anticorps monoclonal dirigé contre la toxine tétanique, dans lequel : - la région variable de la chaîne légère comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO: 33, et - la région variable de la chaîne lourde comprend une séquence en acides 20 aminés identique à SEQ ID NO: 34.

Plus particulièrement, un mode de réalisation avantageux de l'invention concerne un anticorps monoclonal tel que défini ci-dessus, dans lequel : - la région variable de la chaîne légère comprend une séquence en acides 25 aminés identique à SEQ ID NO: 33, et - la région variable de la chaîne lourde comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO: 34, et - la région constante de la chaîne légère comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO:3, et 30 - la région constante de la chaîne lourde comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO:4.

Plus particulièrement encore, un mode de réalisation avantageux de l'invention concerne un anticorps monoclonal tel que défini ci-dessus, dans lequel : - la chaîne légère comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO: 35, et - la chaîne lourde comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO: 36. Cet anticorps monoclonal est l'anticorps désigné comme « Anticorps 6 » dans la partie « Exemples » de la présente demande de brevet.

L'invention concerne également un anticorps monoclonal dirigé contre la toxine tétanique tel que défini ci-dessus, dans lequel : - la chaîne légère dudit anticorps monoclonal comprend la région leader de la région variable d'une chaîne légère d'une immunoglobuline humaine (LVLh) choisi parmi les séquences suivantes, SEQ ID NO:73,74,75 et 76), - la chaîne lourde dudit anticorps monoclonal comprend la région leader de la région variable d'une chaîne lourde d'une immunoglobuline humaine (LVHh) choisi parmi les séquences suivantes, SEQ ID NO:77, 78, 79 et 80.

Un autre mode de réalisation avantageux de l'invention concerne un anticorps 20 monoclonal dirigé contre la toxine tétanique tel que défini précédemment, dans lequel : - la région variable de la chaîne légère comprend, dans sa région N-terminale, une séquence signal, notamment la région leader de la région variable de la chaîne légère d'une seconde immunoglobuline, en particulier 25 humaine, et - la région variable de la chaîne lourde comprend, dans sa région N- terminale, une séquence signal, notamment la région leader de la région variable de la chaîne lourde d'une troisième immunoglobuline, en particulier humaine, 30 la seconde et la troisième immunoglobuline étant identiques ou différentes. Comme mentionné précédemment la région leader, ou peptide signal, qui se trouve dans la région N-terminale de la région variable de la chaîne légère et de la chaîne lourde correspond à une séquence protéique de sécrétion. Au cours de la synthèse protéique de la chaîne légère et de la chaîne lourde, ladite séquence leader signifie que la protéine en cours de synthèse doit rester dans la lumière du réticulum endoplasmique rugueux (RER). Cette séquence est ensuite éliminée de la chaîne légère mature et de la chaîne lourde mature, de telle sorte que l'anticorps monoclonal mature capable d'interagir avec la toxine tétanique ne possède plus cette séquence.

Dans un mode de réalisation préféré, l'invention concerne un précurseur de l'anticorps monoclonal dirigé contre la toxine tétanique, tel que précédemment décrit, dans lequel : - la chaîne légère comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO: 7 et - la chaîne lourde comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO: 8 Dans les séquences SEQ ID NO:7 et SEQ ID NO:8, comme dans SEQ ID NO:17 et SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:27 et SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:37 et SEQ ID NO:38 citées ci-dessous, les acides aminés soulignés dont le symbole en codification « une lettre » est en minuscule correspondent aux acides aminés de la séquence leader.

Les acides aminés dont le symbole en codification « une lettre » est en majuscule correspondent à la région variable.

Dans un autre mode de réalisation préféré, l'invention concerne un précurseur de l'anticorps monoclonal dirigé contre la toxine tétanique, tel que précédemment décrit, dans lequel : - la chaîne légère comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO: 17, et - la chaîne lourde comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO: 18.

Dans un autre mode de réalisation préféré, l'invention concerne un précurseur de l'anticorps monoclonal dirigé contre la toxine tétanique, tel que précédemment décrit, dans lequel : - la chaîne légère comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO: 27, et - la chaîne lourde comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO: 28.

Dans un autre mode de réalisation préféré, l'invention concerne un précurseur de l'anticorps monoclonal dirigé contre la toxine tétanique, tel que précédemment décrit, dans lequel : - la chaîne légère comprend une séquence en acides aminés identique à 10 SEQ ID NO: 37, et - la chaîne lourde comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO: 38.

L'invention concerne également un fragment de l'anticorps monoclonal tel que défini 15 ci-dessus, ledit fragment étant un fragment Fab ou F(ab)'2 ou scFv.

L'invention concerne également un anticorps monoclonal, ou fragment d'anticorps, tels que définis précédemment caractérisés en ce qu'ils sont capables de neutraliser l'activité biologique de la toxine tétanique in vitro et/ou in vivo. 20 Les Inventeurs ont montré que l'anticorps monoclonal humain selon l'invention est capable d'inhiber efficacement la toxine tétanique, à une faible dose d'anticorps. Un mode de réalisation avantageux de l'invention concerne un anticorps monoclonal tel que défini précédemment, capable de neutraliser la toxine tétanique, et 25 notamment présentant un taux de neutralisation de la toxine tétanique d'au moins 40%, 50%, 60%, 70% et préférentiellement d'au moins 80%.

« Les anticorps monoclonaux de l'invention sont capables de neutraliser la toxine 30 tétanique » signifie que les anticorps monoclonaux selon l'invention sont capables d'empêcher l'action de la toxine tétanique, c'est à dire d'inhiber l'effet toxique de la toxine tétanique sur le blocage de la libération des neurotransmetteurs GABA et glycine. Cette inhibition peut être due à une séquestration de la toxine tétanique, ou bien à un masquage du ou des domaines de la toxine tétanique responsable de son effet toxique. L'activité de neutralisation des anticorps peut être mesurée à l'aide de différents tests de routine couramment utilisés par l'homme de métier. Parmi ceux-ci, le test de neutralisation basé sur la survie cellulaire mesure la capacité qu'ont les anticorps de l'invention à protéger de la mort les cellules J774A.1 mises en contact avec de la toxine tétanique. Un autre test de neutralisation mesure l'inhibition de la traduction d'une protéine marqueur, telle que la luciférase, dans un système de traduction in vitro acellulaire [Hale ML Pharmacol Toxicol 2001, 88(5):255-260].

L'invention a également pour objet un acide nucléique comprenant une séquence codant la chaîne légère de l'anticorps monoclonal défini précédemment, notamment comprenant la séquence SEQ ID NO:9 ou SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:19 ou SEQ ID NO:21 ou SEQ ID NO:29 ou SEQ ID NO:31 ou SEQ ID NO:39 ou SEQ ID NO:41.

Ainsi, dans l'invention les séquences d'acides nucléiques sont telles que la séquence SEQ ID NO:9 code pour la protéine SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:10 code pour la protéine SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:11 code pour la protéine SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:12 code pour la protéine SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:19 code pour la protéine SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:20 code pour la protéine SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:21 code pour la protéine SEQ ID NO:15 et SEQ ID NO:22 code pour la protéine SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:29 code pour la protéine SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:30 code pour la protéine SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:31 code pour la protéine SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:32 code pour la protéine SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:39 code pour la protéine SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:40 code pour la protéine SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:41 code pour la protéine SEQ ID NO:35 et SEQ ID NO:42 code pour la protéine SEQ ID NO:36.

L'invention a également pour objet un acide nucléique comprenant une séquence codant la chaîne légère de l'anticorps monoclonal défini précédemment, notamment une séquence identique à SEQ ID NO:9 ou 11, 19 ou 21, 29 ou 31, 39 ou 41.

L'invention a également pour objet un acide nucléique comprenant une séquence codant la chaîne lourde de l'anticorps monoclonal défini précédemment, notamment une séquence identique à SEQ ID NO:10 ou 12, 20 ou 22, 30 ou 32, 40 ou 42.

Un mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention concerne un acide nucléique tel que défini précédemment, comprenant : - un acide nucléique codant la chaîne légère de l'anticorps monoclonal défini ci-dessus et comprenant une séquence identique à SEQ ID NO:9 ou à SEQ 10 ID NO:11, et/ou - un acide nucléique codant la chaîne lourde de l'anticorps monoclonal défini ci-dessus et comprenant une séquence identique à SEQ ID NO:10 ou à SEQ ID NO:12.

15 Un autre mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention concerne un acide nucléique tel que défini précédemment, comprenant : - un acide nucléique codant la chaîne légère de l'anticorps monoclonal défini ci-dessus et comprenant une séquence identique à SEQ ID NO:19 ou à SEQ ID NO:21, et/ou 20 - un acide nucléique codant la chaîne lourde de l'anticorps monoclonal défini ci-dessus et comprenant une séquence identique à SEQ ID NO:20 ou à SEQ ID NO:22.

Un autre mode de réalisation avantageux de l'invention concerne un acide 25 nucléique tel que défini précédemment, comprenant : - un acide nucléique codant la chaîne légère de l'anticorps monoclonal défini ci-dessus et comprenant une séquence identique à SEQ ID NO:29 ou à SEQ ID NO:31, et/ou - un acide nucléique codant la chaîne lourde de l'anticorps monoclonal défini 30 ci-dessus et comprenant une séquence identique à SEQ ID NO:30 ou à SEQ ID NO:32.

Un autre mode de réalisation avantageux de l'invention concerne un acide nucléique tel que défini précédemment, comprenant : - un acide nucléique codant la chaîne légère de l'anticorps monoclonal défini ci-dessus et comprenant une séquence identique à SEQ ID NO:39 ou à SEQ ID NO:41, et/ou - un acide nucléique codant la chaîne lourde de l'anticorps monoclonal défini ci-dessus et comprenant une séquence identique à SEQ ID NO:40 ou à SEQ ID NO:42.

Dans un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne un acide nucléique comprenant une séquence codant la chaîne légère de l'anticorps monoclonal défini ci-dessus et comprenant une séquence codant la chaîne lourde de l'anticorps monoclonal défini ci-dessus. En d'autres termes, la séquence susmentionnée comprend, dans la même molécule, ou plus particulièrement sur le même brin, une séquence codant la chaîne légère de l'anticorps monoclonal défini ci-dessus suivie d'une séquence codant la chaîne lourde de l'anticorps monoclonal défini ci-dessus. Cela signifie également que la séquence susmentionnée comprend, dans la même molécule, une séquence codant la chaîne lourde de l'anticorps monoclonal défini ci-dessus suivie d'une séquence codant la chaîne légère de l'anticorps monoclonal défini ci-dessus.

L'invention concerne aussi un vecteur d'expression comprenant au moins un acide nucléique défini précédemment, ledit acide nucléique étant sous contrôle des éléments permettant son expression.

Par « vecteur d'expression », il est défini dans l'invention une molécule d'ADN qui possède des éléments permettant sa réplication (duplication) dans au moins un organisme vivant. Ces éléments permettant la réplication sont notamment des origines de réplication de levure ou de bactéries, ou encore des éléments de contrôle de la réplication d'un virus.

Les vecteurs selon l'invention sont notamment des plasmides, des phages, des chromosomes artificiels de levure (YAC), des chromosomes artificiels de bactéries (BAC), les génomes modifiés de virus réplicatifs ou de virus intégratifs ..

Ces vecteurs sont dits « d'expression » car ils disposent de séquences nucléotidiques qui permettent l'expression, c'est-à-dire la transcription en ARN, des séquences nucléotidiques qu'elles contrôlent. Dans l'invention, ladite séquence d'acide nucléique contenue dans ledit vecteur est placée « sous contrôle des éléments permettant son expression ». Cela signifie que ledit vecteur d'expression possède au moins une séquence d'initiation de la transcription tel qu'un promoteur d'un virus comme le promoteur précoce du virus simien SV40, ou du Cytomégalovirus (CMV) ou encore les séquences promotrices du virus du sarcome de Rous (RSV), et notamment une séquence ou promoteur comprenant une boite TATAA. De plus, ledit vecteur possède également au moins une séquence de terminaison de la transcription, et en particulier une séquence de polyadénylation issues d'un gène de mammifère, notamment humain. A ces séquences indispensables pour l'expression de la séquence nucléotidique contenue dans ledit vecteur peuvent s'ajouter d'autres séquences permettant de réguler ou de moduler l'expression de la dite séquence. Une liste non exhaustive comprend : des introns de gènes de mammifères, et notamment humains, des séquences de régulation de transcription de type amplificateur (« enhancers ») ou encore des séquences transcrites mais non traduites de gènes de mammifères, et notamment humains.

Un autre mode de réalisation avantageux de l'invention concerne un ensemble comprenant deux vecteurs d'expression, le premier vecteur d'expression comprenant un acide nucléique comprenant une séquence choisie parmi les acides nucléiques SEQ ID NO: 9, 19, 29, 39 25 et le second vecteur d'expression comprenant un acide nucléique comprenant une séquence choisie parmi les acides nucléiques SEQ ID NO:10, 20, 30, 40

Les premiers et seconds vecteurs d'expression sont représentés dans les figures 1 à 30 8.

Un autre mode réalisation avantageux de l'invention concerne un vecteur d'expression susmentionné, comprenant - un premier acide nucléique choisi parmi les acides nucléiques de séquences suivantes : SEQ ID NO: 9, 19, 29, 39, ledit premier acide nucléique étant sous contrôle des éléments permettant son expression, et - un second acide nucléique choisi parmi les acides nucléiques de séquences suivantes : SEQ ID NO:10, 20, 30, 40, ledit second acide nucléique étant sous contrôle des éléments permettant son expression Un mode de réalisation avantageux concerne un vecteur tel que défini ci-dessus comprenant - un premier acide nucléique SEQ ID NO: 9, sous contrôle des éléments permettant son expression, et - un second acide nucléique SEQ ID NO:10, sous contrôle des éléments permettant son expression Un mode de réalisation avantageux concerne un vecteur tel que défini ci-dessus comprenant - un premier acide nucléique SEQ ID NO: 19, sous contrôle des éléments permettant son expression, et - un second acide nucléique SEQ ID NO: 20, sous contrôle des éléments permettant son expression Un mode de réalisation avantageux concerne un vecteur tel que défini ci-dessus comprenant - un premier acide nucléique SEQ ID NO: 29, sous contrôle des éléments permettant son expression, et - un second acide nucléique SEQ ID NO: 30, sous contrôle des éléments permettant son expression Un mode de réalisation avantageux concerne un vecteur tel que défini ci-dessus 30 comprenant - un premier acide nucléique SEQ ID NO: 39, sous contrôle des éléments permettant son expression, et - un second acide nucléique SEQ ID NO: 40, sous contrôle des éléments permettant son expression

Un autre mode réalisation avantageux de l'invention concerne un vecteur 5 d'expression susmentionné, comprenant - un premier acide nucléique choisi parmi les acides nucléiques de séquences suivantes : SEQ ID NO: 11, 21, 31, 41, ledit premier acide nucléique étant sous contrôle des éléments permettant son expression, et - un second acide nucléique choisi parmi les acides nucléiques de séquences 10 suivantes : SEQ ID NO:12, 22, 32, 42, ledit second acide nucléique étant sous contrôle des éléments permettant son expression. Un autre mode réalisation avantageux de l'invention concerne un vecteur d'expression susmentionné, comprenant - un premier acide nucléique de séquence suivante : SEQ ID NO: 11, sous 15 contrôle des éléments permettant son expression, et - un second acide nucléique de séquence: SEQ ID NO:12, sous contrôle des éléments permettant son expression. Un autre mode réalisation avantageux de l'invention concerne un vecteur d'expression susmentionné, comprenant 20 - un premier acide nucléique de séquence suivante : SEQ ID NO: 21, sous contrôle des éléments permettant son expression, et - un second acide nucléique de séquence: SEQ ID NO: 22, sous contrôle des éléments permettant son expression. Un autre mode réalisation avantageux de l'invention concerne un vecteur 25 d'expression susmentionné, comprenant - un premier acide nucléique de séquence suivante : SEQ ID NO: 31, sous contrôle des éléments permettant son expression, et - un second acide nucléique de séquence: SEQ ID NO: 32, sous contrôle des éléments permettant son expression. 30 Un autre mode réalisation avantageux de l'invention concerne un vecteur d'expression susmentionné, comprenant - un premier acide nucléique de séquence suivante : SEQ ID NO: 41, sous contrôle des éléments permettant son expression, et - un second acide nucléique de séquence: SEQ ID NO: 42, sous contrôle des éléments permettant son expression.

Ce vecteur d'expression comporte donc deux séquences d'acides nucléiques telles que mentionnées, et plus particulièrement une séquence d'acide nucléique codant la chaîne légère de l'anticorps monoclonal défini ci-dessus, et une séquence d'acide nucléique codant la chaîne lourde de l'anticorps monoclonal défini ci-dessus. Préférentiellement, ledit vecteur d'expression contient un premier élément permettant l'expression de la séquence d'acide nucléique codant la chaîne légère de l'anticorps monoclonal défini ci-dessus et un second élément permettant l'expression de la séquence d'acide nucléique codant la chaîne lourde de l'anticorps monoclonal défini ci-dessus, ledit premier et ledit second élément permettant l'expression desdites séquences d'acides nucléiques étant identiques ou différents, et préférentiellement identiques. Ces éléments de contrôle sont notamment les séquences terminales longues répétées (LTR) du virus RSV, ou des promoteurs CMV.

Un autre mode de réalisation de l'invention concerne un vecteur d'expression défini ci-dessus, comprenant au moins un gène de résistance à un antibiotique. Par « au moins un gène de résistance » on entend dans l'invention que ledit vecteur d'expression peut contenir 1 ou 2, ou 3 ou 4 ou 5 ou 6 gènes de résistance à un antibiotique. Par « gène de résistance à un antibiotique », on définit dans l'invention un gène dont le produit d'expression exerce un effet cytostatique (inhibition de la croissance) ou cytolytique (mort cellulaire) de cellules. Les antibiotiques concernés par l'invention ont notamment un effet sur les cellules procaryotes, mais peuvent également avoir un effet sur les cellules eucaryotes, qu'il s'agisse de levures, de plantes, d'insectes, d'amphibiens ou de mammifères. Plus particulièrement, le vecteur d'expression susmentionné possède un gène de résistance à un antibiotique spécifique des cellules procaryotes et au moins un gène, préférentiellement 2 gènes, de résistance à un antibiotique spécifique des cellules eucaryotes. On peut citer comme antibiotiques spécifiques des cellules procaryotes : l'Ampicilline, la Tétracycline et ses dérives, l'Hygromycine, la Kanamycine... On peut citer comme antibiotiques spécifiques des cellules eucaryotes : le G418, la Généticine (sels de G418), la Puromycine, le Méthotrexate, la Blasticidine...

L'invention a également pour objet une cellule, ou plusieurs cellules, ou une lignée cellulaire comprenant au moins un vecteur d'expression tel que défini précédemment. Les cellules « comprenant au moins un vecteur » correspondent à des cellules dans lesquelles au moins un vecteur d'expression susmentionné a été introduit. L'homme de métier connait parfaitement les techniques de biologie moléculaire permettant d'introduire à l'intérieur d'une cellule une séquence d'ADN ou un vecteur d'expression, et notamment en se référant par exemple à [Sambrook, J et al. in Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, Vol. 1, 2, 3 (1989)]. Il sera communément utilisé par la suite le terme de « transfection » pour designer l'action d'introduire un acide nucléique dans une cellule. On peut citer par exemple, les techniques de transfection au phosphate de calcium, par utilisation de particules lipidiques ou « lipofectants », ou encore par des techniques permettant de générer des trous dans la membrane cellulaire au moyen d'un choc électrique (électroporation). Cette liste n'a pas de caractère exhaustif.

Les cellules ou lignes cellulaires utilisées dans l'invention sont des cellules issues de procaryotes ou d'eucaryotes tels que les bactéries, les levures ou autres champignons, les cellules d'insectes, les cellules d'amphibiens, les cellules de mammifères et notamment de rongeurs, les cellules humaines... On distinguera plutôt la cellule de la lignée cellulaire par le fait que la lignée cellulaire est une population cellulaire en culture établie, c'est-à-dire qu'elle a acquis des caractéristiques permettant leur prolifération in vitro, et notamment une caractéristique d'immortalisation.

Un mode de réalisation particulier de l'invention concerne une cellule ou une lignée cellulaire précédemment citée, présentant une activité de fucosylation substantiellement réduite par rapport à une cellule normale, ladite cellule ou lignée cellulaire étant notamment une cellule de mammifère, et en particulier la lignée YB2/0, disponible à l'ATCC sous le numéro n° CRL 1662.

Dans un autre mode de réalisation, l'invention concerne une lignée cellulaire choisie parmi la lignée HEK ou la lignée CHO, exprimant l'anticorps monoclonal tel que défini ci-dessus.

Dans un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne une cellule ou une lignée cellulaire comprenant un vecteur d'expression défini ci-dessus, permettant l'expression - d'un anticorps monoclonal précédemment défini, - ou d'une chaîne légère d'un anticorps monoclonal telle que définie précédemment, - ou d'une chaîne lourde d'un anticorps monoclonal telle que définie précédemment.

Dans un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne une cellule ou une lignée cellulaire obtenue par le clonage d'une cellule susmentionnée. Les technique de clonage cellulaire sont largement connues de l'homme de métier, et reposent sur le principe d'isolement des cellules d'une population cellulaire afin que chaque cellule individuelle donne naissance à des cellules filles (ou clone) isolées des cellules filles issues de la division des autres cellules de la population. Le principe général du clonage cellulaire est la dilution limite des cellules.

L'invention concerne également une méthode de production d'un anticorps tel que défini précédemment, ou d'un fragment d'anticorps tel que défini précédemment, comprenant une étape de culture d'une cellule hôte susmentionnée et une étape d'isolement de l'anticorps ou du fragment d'anticorps exprimé.

Un autre aspect de l'invention concerne une composition pharmaceutique, et notamment vaccinale, contenant au moins un anticorps dirigé contre la toxine tétanique selon l'invention, un fragment d'anticorps selon l'invention, un acide nucléique selon l'invention, un vecteur selon l'invention ou une cellule hôte selon l'invention, pour le traitement ou la prévention d'une pathologie associée à la contamination par la toxine tétanique.

Un mode déréalisation avantageux concerne une composition définie précédemment comprenant : - un anticorps choisi parmi l'anticorps 3, 4, 5 ou 6 tels que définis dans l'invention, ou 5 - une combinaison de deux anticorps susmentionnés, ladite composition étant choisie parmi les combinaisons suivantes : anticorps 3 + anticorps 4, anticorps 3+anticorps 5, anticorps 3 + anticorps 6, anticorps 4+ anticorps 5, anticorps 4 + anticorps 6, et anticorps 5 + anticorps 6, ou - une combinaison de trois anticorps susmentionnés, ladite composition étant choisie 10 parmi les combinaisons suivantes : Anticorps 3 + anticorps 4 + anticorps 5, anticorps 3 + anticorps 4 + anticorps 6, anticorps 3 + anticorps 5 + anticorps 6, et anticorps 4 + anticorps 5 + anticorps 6. - une combinaison des quatre anticorps susmentionnés, ladite composition étant Anticorps 3 + anticorps 4 + anticorps 5 + anticorps 6. 15 Avantageusement, l'invention concerne une composition pharmaceutique, et notamment vaccinale, comprenant au moins un anticorps monoclonal défini ci-dessus, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Le dosage de la substance active dépend particulièrement du mode d'administration, et est aisément déterminé par l'homme de métier. 20 « Un véhicule pharmaceutiquement acceptable » réfère à un matériel non toxique qui est compatible avec un système biologique tel qu'une cellule, une culture cellulaire, un tissu ou un organisme. Une quantité thérapeutiquement efficace peut varier entre 0.01 mg/kg et 50 mg/kg, préférablement entre 0.1 mg/kg et 20 mg/kg, et plus préférablement entre 0.1 mg/kg 25 et 2 mg/kg, en une ou plusieurs administrations quotidiennes, pendant un ou plusieurs jours.

La composition pharmaceutique de l'invention peut être administrée notamment par voie intraveineuse, notamment par injection ou par perfusion graduelle, par voie 30 sous-cutanée, par voie locale au moyen d'infiltrations, per os.

Les préparations pour une administration parentérale peuvent inclure des solutions aqueuses ou non-aqueuses stériles, des suspensions ou des émulsions. Des exemples de solvants non-aqueux sont le propylène glycol, le polyéthylène glycol, des huiles végétales, telle que l'huile d'olive, ou des esters organiques injectables tels que l'éthyloléate. Des véhicules aqueux comprennent l'eau, des solutions alcool/eau, des émulsions ou des suspensions.

L'invention concerne également l'utilisation d'au moins un anticorps dirigé contre la toxine tétanique selon l'invention, un fragment d'anticorps selon l'invention, un acide nucléique selon l'invention, un vecteur selon l'invention ou une cellule hôte selon l'invention, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement ou à la prévention d'une pathologie associée à la contamination par la toxine tétanique.

Par traitement, on entend le moyen de soigner une pathologie déclarée, dont les symptômes sont visibles. Par prévention, on entend le moyen d'empêcher ladite pathologie de se déclarer.

Les pathologies associées à la toxine tétanique correspondent aux symptômes liés à la contamination par la toxine tétanique, et notamment une augmentation du tonus musculaire et des spasmes généralisés, trismus, dysphagie, raideur, douleurs musculaires pouvant aller jusqu'à hyperlordose, rigidité de l'abdomen, troubles cardiaques...

L'invention a également pour objet une méthode de dosage in vitro de la toxine tétanique dans un échantillon biologique issu d'un individu susceptible d'être contaminé par la toxine tétanique, ladite méthode comprenant : - la mise en contact dudit échantillon avec au moins un anticorps monoclonal défini précédemment, et - la détermination de la présence ou l'absence de toxine tétanique dans ledit échantillon par la détection de la formation d'un éventuel complexe immun entre la toxine tétanique et ledit anticorps monoclonal. Les anticorps monoclonaux de l'invention peuvent donc être utilisés pour détecter la présence de toxine tétanique dans un échantillon biologique.

Notamment, lesdits anticorps peuvent être utilisés pour la mise en oeuvre de techniques de détection connues de l'homme de métier comme des ELISA, des RIE, de l'immunoprécipitation ou de l'immunomarquage (Western blot).

L'invention concerne aussi un procédé de décontamination in vitro d'un échantillon susceptible d'être contaminé par la toxine tétanique, notamment d'un échantillon biologique, comprenant : - la mise en contact dudit échantillon avec au moins un anticorps monoclonal défini précédemment, et - l'élimination, dudit échantillon, des complexes immuns formés entre la toxine tétanique et ledit anticorps monoclonal. Un moyen de mettre en oeuvre ledit procédé de décontamination consiste, par exemple, en l'utilisation des anticorps monoclonaux de l'invention sur lesquels sont greffés des billes magnétiques sur la région constante dudit anticorps. Une fois lesdits anticorps couplés à des billes magnétiques mises en contact avec l'échantillon à décontaminer, la toxine tétanique est éliminée de l'échantillon en captant les anticorps selon l'invention au moyen d'un aimant. Un autre moyen de mettre en oeuvre ledit procédé de décontamination consiste, par exemple, en l'utilisation des anticorps monoclonaux immobilisé sur une colonne comportant de la protéine A ou G de Staphylococcus aureus. L'échantillon a décontaminé est alors passé au travers de la colonne afin de retenir, sur les anticorps selon l'invention immobilisé, la toxine tétanique susceptible d'être contenue dans ledit échantillon.

Figures La présente invention est illustrée par les figures 1 à 8. La figure 1 est une représentation schématique du vecteur permettant l'expression de la chaine légère de l'anticorps n°3. La figure 2 est une représentation schématique du vecteur permettant l'expression de la chaine lourde de l'anticorps n°3. La présente invention est illustrée par les figures 1 à 8. La figure 3 est une représentation schématique du vecteur permettant l'expression de la chaine légère de l'anticorps n°4. La figure 4 est une représentation schématique du vecteur permettant l'expression de la chaine lourde de l'anticorps n°4. La présente invention est illustrée par les figures 1 à 8. La figure 5 est une représentation schématique du vecteur permettant l'expression de la chaine légère de l'anticorps n°5.

La figure 6 est une représentation schématique du vecteur permettant l'expression de la chaine lourde de l'anticorps n°5. La présente invention est illustrée par les figures 1 à 8. La figure 7 est une représentation schématique du vecteur permettant l'expression de la chaine légère de l'anticorps n°6. La figure 8 est une représentation schématique du vecteur permettant l'expression de la chaine lourde de l'anticorps n°6. Exemples Exemple 1 : Obtention de l'anticorps 3

A. Construction des vecteurs CH463-12 et CK463-11. Les donneurs volontaires de sang sont vaccinés contre le tétanos et ont recu une 15 dernière injection lors des 10 à 25 jours précédant le don. On prélève chez ces patients immunisés 30 mL de sang total. Par centrifugation, on isole ensuite les cellules mononucléaires du sang (PBMC) et on congèle ces cellules dans un RPMI 1640 contenant 20 % de sérum de veau foetal et 10% de diméthylsulfoxide.

20 1. Marquage des cellules en vue de l'analyse par cytométrie de flux et sélection des cellules d'intérêt Les anticorps décrits dans l'invention sont produits sous forme recombinante dont les séquences codantes (ADNc) sont isolées de lymphocytes B humains produisant des immunoglobulines dirigées contre la toxine tétanique. Ces cellules B, 25 contenues dans les PBMC purifiés de sang humain, sont elles mêmes purifiés (cell sorting) par un trieur de cellules couplé à un cytométre en flux en utilisant un anti-CD19 et le fragment C de la toxine marqué au FITC (Sigma ref T3819, souche Massachusetts D7) pour les identifier et les isoler. Les cellules d'intérêt sont ainsi isolées et placées dans une plaque 96 puits 30 contenant 6pL d'eau et 3pL de tampon de RT-PCR contenant de la transcriptase inverse concentrée 5 fois. La plaque est ensuite placée à -80°C.

2. Préparation de l'ADNc10 Pour préparer l'ADNc, on chauffe pendant 1 minute à 65°C les cellules, puis on les place dans la glace. On ajoute aux cellules 6mL de mélange réactionnel composé de dithiotreitol 1mM, désoxyribonucléoside triphosphate 0,1mM, inhibiteur de ribonucléase 40U, pd(N)6 et le superscript RT 25U. Les échantillons sont mis en incubation à 37°C pendant 1h30. La réaction enzymatique est arrêtée par chauffage à 95°C pendant 3 minutes.

3. Amplification par PCR L'amplification par des gènes VK et VH maturés codant les anticorps antitétaniques se fait par PCR "seminested". Cette dernière s'est faite en deux PCR à l'aide d'un Thermocycler DNA thermal cycler 9600 (PerkinElmer) en utilisant les couples d'amorces définis par Küppers et al. EMBO J 12 4955-4967-1993: La première PCR est réalisée en utilisant un mixe des 12 amorces V (SEQ ID NO : 43, 44, 45, 46, 47, 48, 55, 56, 59, 60, 61 et 65) et des amorces 3' externes (3') JH et Jk (SEQ ID NO : 49, 50, 51, 52, 53, 54, 66, 67, 68, 69, 70, 71 et 72) dans un même tube avec pour matrice le produit de RT-PCR dans 90p1 de réaction finale contenant 50 mM KCI;10 mMTris-HCI, pH 8.4; 2.5 mM MgCl2; 6 nM de chaque dATP, dCTP, dGTP,et dTTP; 7.5 pM de chaque amorce et 5 U de Taq polymerase High Fidelity (Roche Molecular Biochemicals).

Les amorces utilisées sont les suivantes : SEQ ID N° 43 : 5'-ACTAGTCGACCTCAGTGAAGGT <CT> TCCTGCAAGGC-3' VH1 SEQ ID N° 44 : 5'-ACTAGTCGACGTCCTGCGCTGGTGAAA < GC > CCACAC-3' VH2 SEQ ID N° 45 : 5'-ACTAGTCGACGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAG-3' VH3 SEQ ID N° 46 : 5'-ACTAGTCGACCCTGTCCCTCACCTGC <AG > CTGTC-3' VH4 SEQ ID N° 47 : 5'-ACTAGTCGACAAAAAGCCCGGGGAGTCTCTGA < AG > GA- VH5 3' SEQ ID N° 48 : 5'-ACTAGTCGACCTGTGCCATCTCCGGGGACAGTG-3' VH6 SEQ ID N° 49 : 5'-ACCTGAGGAGACGGTGACCAGGGT-3' 3'JH1,2,4,5 SEQ ID N° 50 : 5'-TACCTGAAGAGACGGTGACCATTGT-3' 3'JH3 SEQ ID N° 51 : 5'-ACCTGAGGAGACGGTGACCGTGGT-3' 3'JH6 SEQ ID N° 52 : 5'-ACTAGTCGACGGTGACCAGGGT < GCT > CC < CT > GGCC- 5'JH1,3,4,5 3' SEQ ID N° 53 : 5'-ACTAGTCGACAGTGACCAGGGTGCCACGGCC-3' 5'JH2 SEQ ID N° 54 : 5'-ACTAGTCGACGGTGACCGTGGTCCCTTGCC-3' 3'JH6 SEQ ID N° 55 : 5'-TGATGTCGACATCC < AG > G < TA > TGACCCAGTCTCC < VkI AT > TC-3' SEQ ID N° 56 : 5'-TGATGTCGACAG < TA > CTCCACTCTCCCTG < CT > Vk2 CCGTCA-3' SEQ ID N° 59 : 5'-TGATGTCGACTCCAG < GC > CACCCTGTCT < GT > Vk3 TGTCTC-3' SEQ ID N° 60 : 5'-TGATGTCGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGC-3' Vk4 SEQ ID N° 61 : 5'-TGATGTCGACAGTCTCCAGCATTCATGTCAGCGA-3' Vk5 SEQ ID N° 65 : 5'-TGATGTCGACTT < CT > CTCTCTGTGACTCCA <GA> < GA > Vk6 GGAG-3' SEQ ID N° 66 : 5'-ACTCACGTTTGAT < TC > TCCA < GC > CTTGGTCC-3' 3'Jkl,2,4 SEQ ID N° 67 : 5'-GTACTTACGTTTGATATCCACTTTGGTCC-3' 3'Jk3 SEQ ID N° 68 : 5'-GCTTACGTTTAATCTCCAGTCGTGTCC-3' 3'Jk5 SEQ ID N° 69 : 5'-TGATGTCGACTTGAT < CT > TCCA < GC > CTTGGTCCC < 5'Jkl,2 CT > TGGC-3' SEQ ID N° 70 : 5'-TGATGTCGACTGATATCCACTTTGGTCCCAGGGC-3' 5'Jk3 SEQ ID N° 71 : 5'-TGATGTCGACTGATCTCCACCTTGGTCCCTCCGC-3' 3'Jk4 SEQ ID N° 72 : 5'-TGATGTCGACTAATCTCCAGTCGTGTCCCTTGGC-3' 3'Jk5 La réaction de PCR est réalisée selon le protocole suivant : dénaturation : 1 min à 94°C dénaturation : 45 s à 94°C 1 - hybridation : 1 min à 59°C ' répétitions 35 fois élongation : 1,5 min à 72 °C J - élongation : 10 min à 72 °C La seconde PCR se fait de façon séparée pour chaque famille de VH et Vk dans un volume réactionnel de 20p1. Un volume de 1 pl de la première PCR est réamplifié avec une amorce spécifique en 5' et l'ensemble des amorces 3'. Toutes les PCR contiennent 200 mM de chaque dNTP et 1U de Taq polyperase High Fidelity dans un tampon (50 mM KCI; 10 mMTris-HCI, pH8.4; 1.5 mM MgCl2 pour amplifier VH or 2.5 mM MgCl2 pour amplifier Vk 0.125mM de l'amorce 5' et0.125 mM du mélange d'amorces 3'). La réaction de PCR est réalisée selon le protocole suivant : - dénaturation : 1 min à 94°C - dénaturation : 20 s à 94°C Î hybridation : 30 s à 65°C répétitions 35 fois élongation : 1 min à 72 °C J - élongation : 10 min à 72 °C 4. Clonage des produits de PCR dans les vecteurs d'expression L'amplicon 1 correspondant à la séquence codant la partie variable de la chaine légère de l'immunoglobuline est introduit dans le vecteur « générique » CK463-11 contenant la séquence de la chaîne constante CK légère de l'IgG1 du clone T125-A2 dirigé contre l'antigène Rhésus D. Une PCR sur le fragment variable utilisant des amorces spécifiques permet d'introduire respectivement en 5' une site Spel et une séquence de kozak tandis qu'en 3' le premier codon du premier acide aminé de la partie constante est introduit avec un site de restriction Dralll. L'amplicon 2 codant la partie variable de la chaine lourde est introduit dans le vecteur « générique » CH463-12 contenant la séquence de la chaîne constante CH lourde de l'IgG1 du clone T125-A2 dirigé contre l'antigène Rhésus D. Une PCR sur le fragment variable utilisant des amorces spécifiques permet d'introduire respectivement en 5' une site Nhel et une séquence de kozak tandis qu'en 3' les codons des 3 premiers acides aminés de la partie constante sont introduits avec un site de restriction Apal.

Exemple 2 : Expression transitoire des anticorps anti-tétanique dans CHO-K1 1. Co-transfection Les cellules sont transfectées en utilisant comme agent de transfection de la lipofectamine 2000 (Invitrogen) et les vecteurs décrit ci-dessus. Les cellules CHO-K1 ont été ensemencées la veille de la transfection. 3 plaques 6 puits sont transfectées pour chaque anticorps. 2. Suivi de production: J+48; J+72 Le suivi de production est réalisé sur des pools d'aliquotes de chaque plaque 6 puits. 72 heures après transfection, les différentes fractions sont réunies en une seule, afin de réaliser le dosage d'un pool unique pour chaque anticorps par la technique ELISA à l'aide du Kit ELISA RD-Biotech (réf : RDB3257). Pool plaques Dosage 48 Dosage 72 heures Dosages des Pools Volume N° heures Anticorps 3 1 2,5 pg/pl 4,6 pg/pl 2 2,8 pg/pl 3,6 pg/pl 4,6 pg/pl 45 ml 3 2,7 pg/pl 3,6 pg/pl Anticorps 4 1 0,6 pg/pl 1,1 pg/pl 2 0,6 pg/pl 1,3 pg/pl 1,1 pg/pl 45 ml 3 0,6 pg/pl 1,2 pg/pl Anticorps 5 1 2,7 pg/pl 4,6 pg/pl 2 1,6 pg/pl 4,2 pg/pl 4,8 pg/pl 45 ml 3 2 pg/pl 4,4 pg/pl Anticorps 6 1 2,4 pg/pl 3,9 pg/pl 2 2,3 pg/pl 4,20 pg/pl 4,3 pg/pl 45 ml 3 1,9 pg/pl 4,00 pg/pl Exemple 3 : Test d'affinité des anticorps monoclonaux humains dirigés contre la toxine tétanique La mesure de l'affinité de l'anticorps anti toxine tétanique pour la toxine tétanique, a 10 été mesurée par résonance plasmonique de surface au moyen d'un appareil BlAcore 3000 (Biacore, Uppsala, Suède). La toxine tétanique (Calbiochem ref. 582235) et la BSA (contrôle) ont été immobilisées sur une puce CM5 (Biacore), par injection sur la surface activée au EDC/NHS. 35pL de molécule (30 pg/ml pour la Toxine Tétanique et 100pg/ml pour la BSA dans un tampon acétate, pH 4.9), ce qui conduit à un signal 15 respectivement de 3000 RU et 9000 RU, suivi par 20 pL d'éthanolamine pH 8.5, pour saturer les sites activés restant sur la matrice. Pour chaque mesure, un minimum de quatre dilutions (6 nM à 0.1 nM), d'anticorps anti-toxine tétanique a été injecté pendant 90s à la vitesse de 20 pl/min puis analysé pour la dissociation pendant 90s. Les parametres de cinétique ont été 20 calculés en utilisant BlAeval 3.1 en utilisant le modèle de liaison simple de Langmuir.5 Les profils de liaison ont été obtenus après soustraction du signal dans le canal control. L'ajustement de chaque modèle est jugé par la valeur du Chi2. Les résultats obtenus sont les suivants : KD (M) KA (M-1) Anticorps 3 5,35 10-10 1,8 109 Anticorps 4 3,54 1009 2,82 108 Anticorps 5 2,25 10-11 4,44 1010 Anticorps 6 1,17 1008 8,5 10' On constate donc que ces anticorps ont une affinité particulière pour la toxine tétanique.

Exemple 4: Test de la neutralisation in vitro de la toxine tétanique par les anticorps monoclonaux humains - test de survie.

Dans ce test, on mesure la capacité qu'ont les anticorps de l'invention à protéger de la mort des cellules J774A.1 mises en contact avec de la Toxine tétanique. Brièvement, les cellules J774A.1 (ATCC-LGC, Molsheim, France) sont ensemencées à une densité de 14,000 cellules/puits (200 pl/puits), dans une plaque de culture et cultivées à 37°C en présence de 5% de CO2 pendant 24 heures dans du DMEM complémenté avec 10% de sérum de veau foetal. Les anticorps de l'invention sont incubés avec 480 ng/ml de toxine tétanique ou avec du sérum contrôle (anticorps non relevant) pendant 1 heure. Le mélange est ensuite ajouté aux cellules. 24 heures après, la viabilité cellulaire est mesurée par des techniques connues de l'homme de métier (exclusion au bleu Trypan, Cytox (Promega), mesure de l'apoptose, notamment). Chaque test est corrigé par rapport aux contrôles « 100% de viabilité » cellulaire (pas de toxine tétanique et pas d'anticorps) et « 0% viabilité » (toxine tétanique sans anticorps).

Exemple 5 : Test de la neutralisation in vitro de la toxine tétanique par les anticorps monoclonaux humains - test d'inhibition de la traduction protéique. On mesure la traduction d'une protéine marqueur, par exemple la traduction de la luciférase, dans un système de traduction in vitro acellulaire [Hale ML Pharmacol Toxicol 2001, 88(5):255-260].

Les anticorps monoclonaux sont déposés dans des plaques 96 puits dans du tampon phosphate salin (PBS) et de la toxine tétanique est ajoutée à une concentration finale de 4 mM. Du lysat de réticulocyte de lapin complémenté de RNAsin ®, des acides aminés et de l'ARN messager de la luciférase est alors ajouté dans chaque puits. La réaction est réalisée pendant 1h30. 5 pL de la réaction sont alors prélevés et ajouté à 45 pL de tampon réactionnel permettant de détecter l'activité luciférase (Luciferase assay reagent, Promega, Inc.). La lumière émise (luminescence) est mesurée en compte par seconde (CPS) à l'aide d'un lecteur multiplaque Victor (PerkinElmer Wallac, Boston MA). Les données sont exprimées en pourcentage par rapport au contrôle (% contrôle= (CPS traité/ CPS contrôle) x100)).

Dans les deux tests (Exemple 4 et Exemple 5), la comparaison entre la dose protectrice 50% du scFv (1 pg/ml) et celle de l'IgG (0,5 pg/ml) montre un net bénéfice de l'expression sous forme d'IgG.

Exemple 6: Test de la neutralisation in vivo de la toxine tétanique par l'anticorps monoclonal humain. Afin de tester l'effet neutralisant de l'anticorps anti-toxine tétanique in vivo, des rats Fisher (Charles River Laboratories L'Arbresle, France) ont reçu une dose de 16 mg/kg en masse de toxine tétanique et 50 pg d'anticorps anti-toxine tétanique, après adaptation du protocole décrit par Ezzell et al. (Ezzell, et al. 1984. Infect. Immun. 45:761-767) Les tests ont été réalisés en mesurant la viabilité des animaux en fonction des doses de toxine tétanique et d'anticorps anti-toxine tétanique injectés. En contrôle, la viabilité des rats traités à la toxine tétanique seule (test positif) et des rats traités avec de l'anticorps anti-toxine tétanique seul (test négatif) a également été évaluée.

Claims

REVENDICATIONS1. Anticorps monoclonal dirigé contre la toxine tétanique, caractérisé en ce qu'il se lie à un fragment protéique dont la séquence en acides aminés est SEQ ID N°63 ou à un fragment protéique présentant une identité de séquence d'au moins 85%, et de préférence 90%, avec la séquence en acides aminés SEQ ID N°63.
2. Anticorps monoclonal selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un anticorps chimérique, humanisé ou humain.
3. Anticorps monoclonal selon l'une des revendications 1 à 2, caractérisé en ce qu'il présente une constante d'affinité pour la toxine tétanique au moins égale à 1x108 M"1.
4. Anticorps monoclonal selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il présente une constante d'affinité pour la toxine tétanique au moins égale à 1 x 109 M"1.
5. Anticorps monoclonal selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il présente une constante d'affinité pour la toxine tétanique au moins égale à 1x1010 M"1
6. Anticorps monoclonal selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que: - la région constante de la chaîne légère de l'anticorps est essentiellement constituée par la région constante de la chaîne légère d'une immunoglobuline humaine IgG1, et/ou - la région constante de la chaîne lourde de l'anticorps est essentiellement constituée par la région constante de la chaîne lourde d'une immunoglobuline humaine IgG1.
7. Anticorps monoclonal selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la région variable de la chaîne légère comprend les SEQ ID NO:57 et SEQ ID NO:58.
8. Anticorps monoclonal selon l'une des revendications 1 à 7 caractérisé en ce que la région variable de la chaîne légère comprend la SEQ ID NO: 59.
9. Anticorps monoclonal selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que la région variable de la chaîne légère comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO:1 ou une séquence en acides aminés présentant une identité de séquence d'au moins 85%, de préférence au moins 90%, de préférence au moins 95% et de préférence au moins 97% avec SEQ ID NO:1.
10. Anticorps monoclonal selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que : - la région variable de la chaîne légère comprend une séquence en acides aminés identique à une séquence choisie dans le groupe constitué par : SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:23 et SEQ ID NO:33, et - la région variable de la chaîne lourde comprend une séquence en acides aminés identique à une séquence choisie dans le groupe constitué par : SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:24 et SEQ ID NO:34.
11. Anticorps monoclonal selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que : - la région variable de la chaîne légère comprend une séquence en acides aminés identique à la séquence SEQ ID NO:1, et - la région variable de la chaîne lourde comprend une séquence en acides aminés identique à la séquence SEQ ID NO:2.
12. Anticorps monoclonal selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que :- la région variable de la chaîne légère comprend une séquence en acides aminés identique à la séquence SEQ ID NO:13, et - la région variable de la chaîne lourde comprend une séquence en acides aminés identique à la séquence SEQ ID NO:14.
13. Anticorps monoclonal selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que: - la région variable de la chaîne légère comprend une séquence en acides aminés identique à la séquence SEQ ID NO:23, et - la région variable de la chaîne lourde comprend une séquence en acides aminés identique à la séquence SEQ ID NO:24.
14. Anticorps monoclonal selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que - la région variable de la chaîne légère comprend une séquence en acides aminés identique à la séquence SEQ ID NO:33, et - la région variable de la chaîne lourde comprend une séquence en acides aminés identique à la séquence SEQ ID NO:34.
15. Anticorps monoclonal selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que : - la région constante de la chaine légère comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO:3 ou présentant une identité de séquence d'au moins 85%, et de préférence au moins 90 % avec SEQ ID NO:3, et - la région constante de la chaine lourde comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO:4 ou présentant une identité de séquence d'au moins 85%, et de préférence au moins 90 % avec SEQ ID NO: 4.
16. Anticorps monoclonal selon l'une des revendications 1 à 15, caractérisé en ce que: - la chaîne légère de l'anticorps comprend une séquence en acides aminés choisie dans le groupe constitué par : SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:27 et SEQ ID NO:37- la chaîne lourde comprend une séquence en acides aminés choisie dans le groupe constitué par : SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:28 et SEQ ID NO:38.
17. Anticorps monoclonal selon la revendication 16, caractérisé en ce que : - la chaîne légère comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO:7, et - la chaîne lourde comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO:8.
18. Anticorps monoclonal selon la revendication 16, caractérisé en ce que : - la chaîne légère comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO:17, et - la chaîne lourde comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO:18.
19. Anticorps monoclonal selon la revendication 16, caractérisé en ce que : - la chaîne légère comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO:27, et - la chaîne lourde comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO:28.
20. Anticorps monoclonal selon la revendication 16, caractérisé en ce que : - la chaîne légère comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO:37, et - la chaîne lourde comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO:38.
21. Fragment d'un anticorps monoclonal humain selon l'une des revendications 1 à 21, ledit fragment étant choisi dans le groupe constitué par : Fab, F(ab)'2 et scFv.
22. Anticorps monoclonal humain selon l'une des revendications 1 à 20, ou fragment d'anticorps selon la revendication 21, caractérisé en ce qu'il est capable de neutraliser l'activité biologique de la toxine tétanique, in vitro et/ou in vivo.
23. Acide nucléique comprenant une séquence codant pour un anticorps selon l'une des revendications 1 à 20 ou pour un fragment d'anticorps selon la revendication 21.
24. Acide nucléique comprenant une séquence codant pour un anticorps selon l'une des revendications 1 à 20 caractérisé en ce qu'il comprend une ou plusieurs séquences présentant une identité de séquence d'au moins 85%, de préférence 90% et plus préférentiellement 100% avec une séquence choisie parmi : SEQ ID NO°9, SEQ ID NO°19, SEQ ID NO°29, SEQ ID NO°39, SEQ ID NO°10, SEQ ID NO°20, SEQ ID NO°30 et SEQ ID NO°40.
25. Vecteur d'expression comprenant un acide nucléique selon l'une des revendications 23 ou 24.
26. Cellule hôte comprenant un acide nucléique selon l'une des revendications 23 ou 24 ou un vecteur selon la revendication 25.
27. Méthode de production d'un anticorps selon l'une des revendications 1 à 20, ou d'un fragment d'anticorps selon la revendication 21, comprenant une étape de culture d'une cellule hôte selon la revendication 26 et une étape d'isolement de l'anticorps ou du fragment d'anticorps exprimé.
28. Composition pharmaceutique comprenant, à titre de substance active, au moins un anticorps dirigé contre la toxine tétanique selon l'une des revendications 1 à 20, ou un fragment d'anticorps selon la revendication 21, ou un acide nucléique selon la revendication 23 ou 24, ou un vecteur selon la revendication 25 ou une cellule hôte selon la revendication 26, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
29. Composition pharmaceutique contenant au moins un anticorps dirigé contre la toxine tétanique selon l'une des revendications 1 à 20, ou un fragment d'anticorps selon la revendication 21, ou un acide nucléique selon la revendication 23 ou 24, ou un vecteur selon la revendication 25 ou une cellule hôte selon la revendication 26, pour le traitement ou la prévention d'une pathologie associée à la contamination par la toxine tétanique.
30. Utilisation d'au moins un anticorps dirigé contre la toxine tétanique selon l'une des revendications 1 à 20, ou d'un fragment d'anticorps selon la revendication 21, ou d'un acide nucléique selon la revendication 23 ou 24, ou d'un vecteur selon la revendication 25 ou d'une cellule hôte selon la revendication 26, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement ou à la prévention des symptômes liés à la contamination par la toxine tétanique, incluant une augmentation du tonus musculaire et des spasmes généralisés, le trismus, la dysphagie, la raideur, les douleurs musculaires pouvant aller jusqu'à hyperlordose, la rigidité de l'abdomen, les troubles cardiaques.
31. Procédé de dosage in vitro de la toxine tétanique dans un échantillon biologique issu d'un individu susceptible d'être contaminé par la toxine tétanique, comprenant les étapes suivantes : a) mise en contact de l'échantillon avec au moins un anticorps monoclonal selon l'une quelconque des revendications 1 à 20, et b) détermination de la présence ou de l'absence de la toxine tétanique dans l'échantillon par la détection de la formation d'un éventuel complexe immun entre la toxine tétanique et l'anticorps monoclonal. 33. Procédé de décontamination in vitro d'un échantillon susceptible d'être contaminé par la toxine tétanique, comprenant les étapes suivantes : a) mise en contact de l'échantillon avec au moins un anticorps monoclonal selon l'une quelconque des revendications 1 à 20, et b) élimination dans l'échantillon des complexes immuns formés entre la toxine tétanique et l'anticorps monoclonal.