WO2012007688A1 - Anticorps monoclonaux diriges contre la toxine tetanique - Google Patents

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WO2012007688A1
WO2012007688A1 PCT/FR2011/051666 FR2011051666W WO2012007688A1 WO 2012007688 A1 WO2012007688 A1 WO 2012007688A1 FR 2011051666 W FR2011051666 W FR 2011051666W WO 2012007688 A1 WO2012007688 A1 WO 2012007688A1
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antibody
tetanus toxin
monoclonal antibody
amino acid
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PCT/FR2011/051666
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Sylvie Jorieux
Christophe De Romeuf
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Lfb Biotechnologies
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    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1267—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria
    • C07K16/1282—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria from Clostridium (G)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
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    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
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    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Definitions

  • the subject of the present invention is monoclonal antibodies, in particular human antibodies directed against tetanus toxin.
  • Tetanus is a neurological disease caused by the action of tetanus toxin. This pathology is due to Clostridium tetani, a gram-positive and ubiquitous anaerobic sporulating sporulating bacillus whose spores are often found in soil, dust, animal droppings.
  • This bacillus enters the body during a wound. Deep wounds, punctiform wounds, wounds containing devitalized tissues or a foreign body create a more favorable environment for the development of C. tetani, but any cutaneous rupture, even the most superficial, can allow the infection: cutaneous abrasion, burns or frostbite, surgery, abortion, acute otitis media, intravenous drug addiction. Tetanus may also complicate some chronic diseases: decubitus ulcers, abscesses, gangrene.
  • Tetanospasmine is a thermolabile neurotoxin produced by Clostridium tetani in the form of an inactive or very weakly active precursor consisting of a single 150 kDa polypeptide chain. This chain lacks a signal sequence and is cleaved by bacterial proteases after release to a 100 kDa heavy chain linked by a disulfide bridge to a 50 kDa light chain.
  • tetanospasmine comprises three regions: the terminal COOH end of the heavy chain is responsible for attachment to a 15kDa receptor of the neuron membrane, a N3 ⁇ 4 terminal region of the heavy chain governs penetration and the light chain is responsible for blocking the release of neurotransmitters.
  • the tetanus toxin produced by the bacillus is disseminated in the body via the lymphatic and vascular system to the terminal ends of the motor nerves and migrates along axons to the spinal cord and brainstem.
  • neuromediators in this case glycine and especially GABA (gamma amino-butyric acid), thus interrupting a major pathway in the control of muscular contractions.
  • GABA gamma amino-butyric acid
  • the molecular mechanism of tetanic toxin-mediated neuroexocytosis involves the proteolysis of a synaptic vesicle protein that plays a key role in the fusion of vesicles with the presynaptic membrane.
  • the decrease in inhibition results in an increase in the activity of motor neurons and causes muscle spasms characteristic of tetanus.
  • the loss of inhibition is also found in the sympathetic nervous system, causing an increase in circulating catecholamines responsible for the dysautonomic manifestations of the disease.
  • the clinical signs appear after an incubation period of 2 to 14 days, according to various factors including the site of inoculation and the age of the patient. In adults, the first signs are often dysphagia (pain and difficulty swallowing) and neck pain. In the newborn, everything starts with a refusal to suckle.
  • the trismus locking of the jaw in the closed position
  • the sardonic smile characteristic grimace due to the contracture of the muscles of the face
  • the opisthotonos hyper-extension of the neck
  • the contracture of the muscles of the abdominal wall can simulate an acute abdomen.
  • generalized spasms upper limbs in flexion, lower limbs in extension
  • any stimulus noise, light, touch
  • the disease then inexorably evolves towards the respiratory arrest by laryngeal spasm and / or spasm of the respiratory musculature.
  • Booster injections should be done every 5 to 10 years.
  • Penicillin G long used to treat patients with tetanus, is now replaced by metronidazole IV, because of its antagonistic activity of GABA.
  • Antibiotic therapy decreases the number of toxin-producing bacilli, but has no effect on the toxin already released and circulating or attached to the neuron.
  • Pasteur anti-tetanus serum is a serum derived from horses immunized against tetanus toxin.
  • the serum contains neutralizing F (ab) '2 fragments directed against tetanus toxin and only acts on the circulating toxin.
  • F (ab) neutralizing F
  • tetanus serum Due to major side effects including allergic, anaphylactic and serum accidents, tetanus serum is today replaced by the administration of human immunoglobulin anti-tetanus toxin.
  • Gammatétanos® (LFB Biomedicine, Marketing Authorization in France (AMM) No. 3289219) is a composition of polyclonal immunoglobulins tetanus antitoxin human, which neutralizes tetanospasmine that has not yet gained the nervous system.
  • Symptoms such as spasms can be treated with benzodiazepines. These drugs effectively act at the synaptic level by decreasing the recapture of GABA and therefore have a direct opposite effect to that of tetanospasmine.
  • the treatment aims to control spasm for more than 5-10 seconds to prevent respiratory arrest, the required doses can be considerable (5-15mg / kg / d) and to be divided (every 1 to 4 hours).
  • the management of dysautonomic manifestations which appear late in the course of the disease, is difficult.
  • Sympathetic hyperactivity is relieved by beta-blockers and sometimes by epidural block with local anesthetics. Parasympathetic hyperactivity is rare but may require a pacemaker for bradycardia. Maintenance of hydration and adequate nutrition is essential, using a nasogastric tube or a gastrostomy tube.
  • Preventive treatment of deep vein thromboses, gastric ulcers and decubitus should be instituted.
  • EP 0 562 132 discloses anti-tetanus toxin monoclonal antibodies produced in a hybridoma, binding to the tetanus toxin light chain with an affinity of at least 1x10 9 M -1 for tetanus toxin.
  • Tetanus toxin biology with a capacity of at least 2 IU / 100 ⁇ g immunoglobulins, or even 4 ⁇ l / 10 ⁇ g immunoglobulins.They are used in a pharmaceutical composition for passive immunization against tetanus. are produced by hybridomas between lymphoblastoid cells and mouse myelomas, and do not describe the amino acid sequences of the antibodies used, nor the amino acid sequence of the epitope against which these antibodies are directed.
  • the object of the invention is to provide tetanus toxin neutralizing antibodies as an advantageous alternative to existing compositions comprising antibodies directed against tetanus toxin.
  • Another subject of the invention concerns the use of these antibodies as drugs or decontamination agents during contamination with tetanus toxin.
  • the Applicant is now proposing the use of novel monoclonal antibodies, especially human antibodies directed against tetanus toxin, as an alternative solution to the already known antibodies directed against tetanus toxin for preventing and / or treating tetanus.
  • These antibodies are characterized in that they bind a protein fragment whose amino acid sequence has a sequence identity of at least 85% relative to the amino acid sequence of the tetanus toxin fragment C.
  • the advantage presented by the binding of antibodies to this protein fragment is that the binding of the antibody according to the invention to fragment C, the fragment responsible for binding to the receptor present at the membrane of neurons, inhibits the phase of attachment of the toxin to the neuron preventing any deleterious action of the toxin vis-à-vis the target cell.
  • the subject of the invention is a monoclonal antibody directed against tetanus toxin, characterized in that it binds to a protein fragment whose amino acid sequence is SEQ ID NO: 63 or to a protein fragment having a DNA sequence identity. at least 85%, and preferably at least 90%, with the amino acid sequence SEQ ID NO: 63.
  • the invention also relates to a monoclonal antibody directed against tetanus toxin, characterized in that said antibody binds to a protein fragment of said tetanus toxin, said protein fragment consisting of the amino acid sequence SEQ ID No. 63 or
  • any amino acid sequence consisting of an amino acid sequence having an identity of at least 85%, and preferably 90%, with the sequence SEQ ID No. 63.
  • amino acid sequence SEQ ID NO: 63 corresponds to the sequence of fragment C of the tetanus toxin from strain E88 (No. 20886).
  • any amino acid sequence consisting of an amino acid sequence having an identity of at least 85% corresponds to variants of the tetanus toxin fragment C having essentially the same number of amino acids.
  • said "any amino acid sequence consisting of an amino acid sequence having an identity of at least 85%” can not represent, in the invention, the entire tetanus toxin.
  • antibodies and “immunoglobulin” have the same meaning. They are used interchangeably in the present invention to designate a multimeric protein consisting of 4 chains participating in the acquired immune response.
  • the immunoglobulins consist of an assembly of two dimers each consisting of a heavy chain and a light chain.
  • the multimeric complex is assembled by the binding of a light chain and a heavy chain by a disulfide bridge between two cysteines, the two heavy chains being itself also interconnected by one or more (from 1 to 11) bridges. disulfide depending on the isotype considered.
  • the light chain consists of a variable region (V L ) and a constant region (C L ).
  • the heavy chain consists of a variable region (V H ) and a constant region itself consisting of three or four constant domains Cm, Cm and C H3 Ci M depending on the isotype considered.
  • the variable regions of light chains and heavy chains determine the recognition capacity of the antigen and the specificity of antibody-antigen binding.
  • the constant regions of the light and heavy chains confer on the antibodies their biological properties such as the association of the antibody chains with each other, the secretion of the antibodies, the complement binding and the Fc receptor binding (FcR).
  • the assembly of the chains constituting an immunoglobulin monomer can be schematized by a letter Y, in which: the base of the Y corresponds to the constant region "Fc", constituted by the domains Cm C H3 and C H4 if appropriate two heavy chains, which is recognized by the complement and specific receptors of this Fc fragment, and each of the ends of the two arms of Y corresponds to the assembly of the respective variable regions of a light chain and a heavy chain.
  • variable region of each of the light and heavy chains consists of three domains determining Complementarity Determining Region (CDR), surrounded by four framework domains (framework, or FR).
  • CDRs correspond to amino acid sequences which, when assembled, predominantly condition the binding affinity and specificity of the antibody for its antigen.
  • the binding site of an antigen (epitope) therefore depends on 6 CDRs, 3 of which come from the light chain and 3 from the heavy chain.
  • human antibody defines an antibody consisting solely of sequences of human origin.
  • a “chimeric antibody” may contain, on the one hand, VH and VL domains of an antibody derived from a non-human animal and, on the other hand, CH and CL domains of another antibody, for example a human antibody.
  • a “humanized antibody” is an antibody in which the CDRs originate from an antibody of a specificity different from that of the other domains of the antibody. For example, mouse CDRs can be introduced between the FR regions of a human antibody.
  • mAb defines an antibody molecule, or a homogenous population of antibodies, directed against a defined antigenic determinant and usually produced by a single B cell clone, or hybridoma. Such antibodies may also be produced according to a method described in the article by Pasquali et al. (Blood, 2001, 97, 3820-28). Polyclonal antibodies are a heterogeneous antibody population that can recognize different antigenic determinants of a single antigen.
  • antibody fragment defines an intact antibody portion, preferably an antigen-binding site or a variable region of the antibody. Examples of fragments include Fv, Fab, F (ab ') 2, Fab', dsFv, scFv, sc (Fv) 2, and multispecific antibodies composed of different fragments.
  • Fab refers to an antibody fragment of about
  • Fab can be obtained in particular by the treatment of IgG with a protease, papain.
  • F (ab ') 2 refers to a fragment of about 100,000 dalton and antigen binding activity, the disulfide bonding of two Fabs described above.
  • a “scFv” (single chain Fv) is a VH :: VL polypeptide synthesized using the genes encoding the VL and VH domains and a sequence encoding a peptide for binding these domains.
  • a scFv according to the invention includes CDRs maintained in a suitable conformation, for example using genetic recombination techniques.
  • the antibodies described in the invention are produced in recombinant form whose coding sequences (cDNA) are isolated from human lymphocytes producing immunoglobulins directed against tetanus toxin.
  • cDNA coding sequences
  • B cells contained in the purified PBMCs of human blood, are themselves purified (cell sorting) by a cell sorter coupled to a flow-through cymometer using an anti-CD19 and the FITC-labeled toxin fragment C (Sigma T3819, Massachusetts strain D7) for identification and isolation.
  • Single-cell RT-PCR allows the conversion of the total RNAs into cDNA, from which the variable fragments encoding the antibodies of interest are specifically amplified using carefully chosen primers.
  • variable fragments of immunoglobulins are then cloned in expression vectors adapted to the chosen expression system and containing the constant parts of a selected isotype of human immunoglobulin. Cloning of the variable parts can be done in a single vector containing the 2 constant parts of immunoglobulin.
  • the expression vector (s) are then transfected into an expression line to be transiently or stably expressed after treating the cells with an antibiotic G418.
  • the antibodies are purified by affinity chromatography according to techniques well known to those skilled in the art. These antibodies are mature, that is to say they have an ad hoc three-dimensional structure allowing them to recognize the antigen, and have all the post-translational modifications essential for their antigenic recognition.
  • the protein fragment of SEQ ID No. 63 corresponds to an amino acid sequence of the tetanus toxin located in the C-terminal portion of the toxin and resulting from the cleavage thereof by papain.
  • the invention relates to a chimeric monoclonal antibody, humanized or human, directed against tetanus toxin.
  • the monoclonal antibody used is human.
  • the invention relates to a human monoclonal antibody directed against tetanus toxin, characterized in that it has an affinity constant (KA) for tetanus toxin at least equal to 1 ⁇ 10 8 M -1 .
  • the human monoclonal antibody directed against the tetanus toxin has an affinity constant for it at least equal to 1 ⁇ 10 9 M -1 .
  • the human monoclonal antibody directed against the tetanus toxin has an affinity constant for it at least equal to 1 ⁇ 10 10 M -1 .
  • the affinity of an antibody for an antigen can be measured by various methods well known to those skilled in the art, and in particular by using ELISA techniques or by surface plasmon resonance, by directly measuring the antigen-antibody binding or by means of competitive inhibition methods.
  • the monoclonal antibody as defined above binds substantially irreversibly to said peptide fragments mentioned above.
  • irreversible binding is meant in the invention a strong bond between the antibody and its substrate (the tetanus toxin), said interaction can not be broken, or displaced, by means of equivalent concentrations of a competitor for example another antibody directed against the same substrate.
  • a competitor for example another antibody directed against the same substrate.
  • an antibody according to the invention having a KD greater than 10 -8 M, under the conditions of measurement of KD by surface plasmon resonance will be considered as irreversibly binding to its substrate.
  • monoclonal according to the invention as defined above binds stably to said peptide fragments mentioned above. This means that the antigen / antibody interaction according to the invention is not broken by the simple use of buffers, used in particular in SPR interaction tests.
  • An antibody with high affinity for tetanus toxin has the advantage of requiring a comparatively lower dose of antibody than an antibody with low affinity.
  • the subject of the invention is a monoclonal antibody directed against tetanus toxin, in which the light chain and the heavy chain are such that:
  • the constant region of the light chain of the antibody consists essentially of the constant region of the light chain of an IgG1 human immunoglobulin, and / or
  • the constant region of the heavy chain consists essentially of the constant region of the heavy chain of an IgG1 human immunoglobulin. More particularly, said light chain of an IgG1-type human immunoglobulin and / or said heavy chain of an IgG1-type human immunoglobulin are constituted by the constant part of a light chain and the constant part of a heavy chain. a human immunoglobulin obtained by immunization with the Rhesus D antigen, and in particular the human T125-A2 clone.
  • the constant region of the light chain essentially consists of the constant region of the light chain of a human immunoglobulin
  • the constant region of the light chain may consist of the sequence of the constant region of a light chain of human immunoglobulin, but may also consist of a sequence corresponding to the fusion of several sequences of several constant regions of several human immunoglobulins.
  • the constant region of the light chain may consist of a sequence corresponding to a mosaic of sequences of light chain constant regions, provided that said mosaic sequence reconstitutes a sequence of a constant region of a light region. light chain.
  • the constant region of the heavy chain consists essentially of the constant region of the heavy chain of a human immunoglobulin
  • the constant region of the heavy chain can be constituted by the sequence of the constant region of a heavy chain.
  • human immunoglobulin but may also consist of a sequence corresponding to the fusion of several sequences of several constant regions of several human immunoglobulins.
  • the constant region of the heavy chain may consist of a sequence corresponding to a mosaic of heavy chain constant region sequences, provided that said mosaic sequence reconstitutes a sequence of a constant region of a heavy chain.
  • variable region of the light chain comprises the variable region of the light chain of a human immunoglobulin', means that the sequence of the variable region of the light chain corresponds to the sequence of the variable region of the light chain of a human immunoglobulin.
  • This variable region of the light chain can be fused, in its N-terminal region, to the C-terminal region of a sequence allowing the excretion of the antibody. This sequence allowing the excretion of the antibody is called signal peptide or leader sequence.
  • variable region of the heavy chain comprises the variable region of the heavy chain of a human immunoglobulin
  • sequence of the variable region of the heavy chain corresponds to the sequence of the variable region of a heavy chain of a human immunoglobulin.
  • This variable region of the heavy chain can also be fused in its N-terminal region to the C-terminal region of a sequence allowing the excretion of the antibody.
  • said anti-tetanus toxoid monoclonal antibody is produced in the form of a precursor which has, in the N-terminal region of the light chain and the heavy chain, a sequence leader or signal peptide. This precursor then undergoes various stages of maturation, and in particular the leader sequences are cleaved to allow the secretion of the antibody in the extracellular medium. The secreted antibody is therefore a mature antibody.
  • the definition of the human monoclonal antibody of the invention covers both: the precursor of the human antibody as defined above, and
  • the monoclonal antibody described above and hereinafter has a light chain, and in particular a constant region of said kappa ( ⁇ ) light chain.
  • the invention relates to a monoclonal antibody directed against the tetanus toxin described above, wherein: the light chain of said monoclonal antibody comprises at least the complementarity determining regions (CDR Lm ) of the variable region of a light chain of a human immunoglobulin, and the heavy chain of said monoclonal antibody comprises at least the complementarity determining regions (CDRn m ) of the variable region of a heavy chain of a human immunoglobulin.
  • CDR Lm complementarity determining regions
  • CDRn m complementarity determining regions
  • the subject of the invention is a monoclonal antibody characterized in that the variable region of the light chain comprises SEQ ID NO: 57 and SEQ ID NO: 58.
  • sequences SEQ ID NO: 57 and SEQ ID NO: 58 respectively correspond to the CDR2 and CDR3 sequences identified in the monoclonal antibody sequence having a particularly high affinity for tetanus toxin.
  • the subject of the invention is a monoclonal antibody characterized in that the variable region of the light chain comprises SEQ ID NO: 59.
  • the invention relates to a monoclonal antibody defined above, characterized in that the variable region of the light chain comprises an amino acid sequence identical to SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence having a similar identity. sequence of at least 85%, preferably at least 90%, preferably at least 95% and preferably at least 97% with SEQ ID NO: 1.
  • a particularly advantageous embodiment of the invention relates to a monoclonal antibody as defined above, in which: The variable region of the light chain comprises an amino acid sequence identical to a sequence chosen from the group consisting of the following sequences: SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 23, and
  • variable region of the heavy chain comprises an amino acid sequence identical to a sequence chosen from the group consisting of the following sequences:
  • variable region of the light chain comprises a sequence identical to SEQ ID NO: 13 and the variable region of the heavy chain comprises an amino acid sequence identical to SEQ ID NO: 14.
  • variable region of the light chain comprises a sequence identical to SEQ ID NO: 23 and the variable region of the heavy chain comprises an amino acid sequence identical to SEQ ID NO: 24.
  • Another advantageous embodiment of the invention relates to a monoclonal antibody as defined above, in which:
  • the constant region of the light chain comprises an amino acid sequence identical to SEQ ID NO: 3 or having a sequence identity of at least 85% with SEQ ID NO: 3, and
  • the constant region of the heavy chain comprises an amino acid sequence identical to SEQ ID NO: 4 or having a sequence identity of at least 85% with SEQ ID NO: 4.
  • Another advantageous embodiment of the invention relates to a monoclonal antibody defined above, in which:
  • Each of the light chains comprises an amino acid sequence identical to a sequence chosen from the group consisting of: SEQ ID NO: 15 or SEQ ID NO:
  • Each of the heavy chains comprises an amino acid sequence identical to a sequence chosen from the group consisting of: SEQ ID NO: 16 or SEQ ID NO: 26.
  • Another advantageous embodiment of the invention relates to a monoclonal antibody defined above, in which:
  • Each of the light chains comprises an amino acid sequence identical to a sequence chosen from the group consisting of: SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 25,
  • Each of the heavy chains comprises an amino acid sequence identical to a sequence chosen from the group consisting of: SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 26.
  • Another embodiment of the invention relates to a monoclonal antibody directed against tetanus toxin, wherein:
  • variable region of the light chain comprises an amino acid sequence identical to SEQ ID NO: 13, and
  • variable region of the heavy chain comprises an amino acid sequence identical to SEQ ID NO: 14.
  • the invention relates to a monoclonal antibody as defined above, in which:
  • variable region of the light chain comprises an amino acid sequence identical to SEQ ID NO: 13, and
  • variable region of the heavy chain comprises an amino acid sequence identical to SEQ ID NO: 14, and
  • the constant region of the light chain comprises an amino acid sequence identical to SEQ ID NO: 3, and
  • the constant region of the heavy chain comprises an amino acid sequence identical to SEQ ID NO: 4.
  • an advantageous embodiment of the invention relates to a monoclonal antibody as defined above, in which:
  • the light chain comprises an amino acid sequence identical to SEQ ID NO: 15, and
  • the heavy chain comprises an amino acid sequence identical to SEQ ID NO:
  • This monoclonal antibody is the antibody designated as "Antibody 4" in the "Examples” portion of this patent application.
  • Another embodiment of the invention relates to a monoclonal antibody directed against tetanus toxin, wherein:
  • variable region of the light chain comprises an amino acid sequence identical to SEQ ID NO: 23, and
  • variable region of the heavy chain comprises an amino acid sequence identical to SEQ ID NO: 24. More particularly, an advantageous embodiment of the invention relates to a monoclonal antibody as defined above, in which:
  • variable region of the light chain comprises an amino acid sequence identical to SEQ ID NO: 23, and
  • variable region of the heavy chain comprises an amino acid sequence identical to SEQ ID NO: 24, and
  • the constant region of the light chain comprises an amino acid sequence identical to SEQ ID NO: 3, and
  • the constant region of the heavy chain comprises an amino acid sequence identical to SEQ ID NO: 4.
  • an advantageous embodiment of the invention relates to a monoclonal antibody as defined above, in which:
  • the light chain comprises an amino acid sequence identical to SEQ ID NO:
  • the heavy chain comprises an amino acid sequence identical to SEQ ID NO:
  • This monoclonal antibody is the antibody designated as "Antibody 5" in the "Examples” portion of this patent application.
  • the invention also relates to a monoclonal antibody directed against tetanus toxin as defined above, wherein:
  • the light chain of said monoclonal antibody comprises the leader region of the variable region of a light chain of a human immunoglobulin (LVn selected from the following sequences, SEQ ID NO: 73,74,75 and 76),
  • the heavy chain of said monoclonal antibody comprises the leader region of the variable region of a heavy chain of a human immunoglobulin (LVHI selected from the following sequences, SEQ ID NO: 77, 78, 79 and 80.
  • LVHI human immunoglobulin
  • Another advantageous embodiment of the invention relates to a monoclonal antibody directed against tetanus toxin as defined above, in which:
  • variable region of the light chain comprises, in its N-terminal region, a signal sequence, in particular the leader region of the variable region of the light chain of a second immunoglobulin, in particular a human, and
  • variable region of the heavy chain comprises, in its N-terminal region, a signal sequence, in particular the leader region of the variable region of the heavy chain of a third immunoglobulin, in particular human, the second and third immunoglobulins being identical or different.
  • the leader region, or signal peptide which is in the N-terminal region of the variable region of the light chain and the heavy chain corresponds to a secretory protein sequence.
  • said leader sequence means that the protein being synthesized must remain in the light of the rough endoplasmic reticulum (RER). This sequence is then removed from the mature light chain and the mature heavy chain, so that the mature monoclonal antibody capable of interacting with the tetanus toxin no longer has this sequence.
  • the invention relates to a precursor of the monoclonal antibody directed against tetanus toxin, as previously described, wherein:
  • the light chain comprises an amino acid sequence identical to SEQ ID NO: 17
  • the heavy chain comprises an amino acid sequence identical to SEQ ID NO: 18.
  • the invention relates to a precursor of the monoclonal antibody directed against tetanus toxin, as previously described, wherein:
  • the light chain comprises an amino acid sequence identical to SEQ ID NO: 27, and
  • the heavy chain comprises an amino acid sequence identical to SEQ ID NO: 28.
  • the invention also relates to a fragment of the monoclonal antibody as defined above, said fragment being a Fab or F (ab) '2 or scFv fragment.
  • the invention also relates to a monoclonal antibody or antibody fragment, as defined above, characterized in that they are capable of neutralizing the biological activity of tetanus toxin in vitro and / or in vivo.
  • the inventors have shown that the human monoclonal antibody according to the invention is capable of effectively inhibiting tetanus toxin, at a low dose of antibodies.
  • An advantageous embodiment of the invention relates to a monoclonal antibody as defined above, capable of neutralizing tetanus toxin, and especially having a tetanus toxin neutralization rate of at least 40%, 50%, 60%, 70%. % and preferably at least 80%.
  • the monoclonal antibodies of the invention are capable of neutralizing tetanus toxin” means that the monoclonal antibodies according to the invention are capable of preventing the action of tetanus toxin, that is to say of inhibiting the toxic effect of tetanus toxin on blocking the release of neurotransmitters GABA and glycine.
  • Antibody neutralization activity can be measured using various routine tests commonly used by those skilled in the art. Among them, the neutralization test based on measuring the capacity of the antibodies of the invention to inhibit the binding of the toxin to PC 12 or SK-N-SH J774A cells contacted with tetanus toxin.
  • the subject of the invention is also a nucleic acid comprising a sequence encoding the light chain of the monoclonal antibody defined above, in particular comprising the sequence SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 21 or SEQ ID NO: 29 or SEQ ID NO : 31.
  • nucleic acid sequences are such that:
  • sequence SEQ ID NO: 19 codes for the protein SEQ ID NO: 17,
  • sequence SEQ ID NO: 20 encodes the protein SEQ ID NO: 18,
  • sequence SEQ ID NO: 21 codes for the protein SEQ ID NO: 15,
  • sequence SEQ ID NO: 22 codes for the protein SEQ ID NO: 16
  • sequence SEQ ID NO: 29 encodes the protein SEQ ID NO: 27
  • sequence SEQ ID NO: 30 encodes the protein SEQ ID NO: 28
  • sequence SEQ ID NO: 31 encodes the protein SEQ ID NO: 25, and
  • sequence SEQ ID NO: 32 encodes the protein SEQ ID NO: 26.
  • the subject of the invention is also a nucleic acid comprising a sequence encoding the light chain of the monoclonal antibody defined above, in particular a sequence identical to SEQ ID NO: 19 or 21 or 29 or 31.
  • the subject of the invention is also a nucleic acid comprising a sequence encoding the heavy chain of the monoclonal antibody defined above, in particular a sequence identical to SEQ ID NO: 20 or 22 or 30 or 32.
  • nucleic acid as defined above, comprising:
  • nucleic acid as defined above, comprising: A nucleic acid encoding the light chain of the monoclonal antibody defined above and comprising a sequence identical to SEQ ID NO: 29 or SEQ ID NO: 31, and / or
  • the invention relates to a nucleic acid comprising a sequence encoding the light chain of the monoclonal antibody defined above and comprising a sequence encoding the heavy chain of the monoclonal antibody defined above.
  • the above-mentioned sequence comprises, in the same molecule, or more particularly on the same strand, a sequence encoding the light chain of the monoclonal antibody defined above followed by a sequence encoding the heavy chain of the monoclonal antibody defined above.
  • the aforementioned sequence comprises, in the same molecule, a sequence encoding the heavy chain of the monoclonal antibody defined above followed by a sequence encoding the light chain of the monoclonal antibody defined above.
  • the invention also relates to an expression vector comprising at least one nucleic acid defined above, said nucleic acid being under control elements allowing its expression.
  • expression vector it is defined in the invention a DNA molecule that has elements allowing its replication (duplication) in at least one living organism. These elements allowing replication include origins of replication of yeast or bacteria, or elements for controlling the replication of a virus.
  • the vectors according to the invention are in particular plasmids, phages, artificial chromosomes of yeast (YAC), artificial chromosomes of bacteria (BAC), modified genomes of replicative viruses or integrative viruses, etc.
  • vectors are called "expression” because they have nucleotide sequences that allow the expression, that is to say the transcription in RNA, of the nucleotide sequences that they control.
  • said nucleic acid sequence contained in said vector is placed "under control of the elements allowing its expression". That means that said vector expression has at least one transcription initiation sequence such as a promoter of a virus such as the SV40 simian virus early promoter, or Cytomegalovirus (CMV) or the promoter sequences of the Rous sarcoma virus ( RSV), and in particular a sequence or promoter comprising a TATAA box.
  • said vector also has at least one transcription termination sequence, and in particular a polyadenylation sequence derived from a mammalian gene, in particular a human gene.
  • sequences indispensable for the expression of the nucleotide sequence contained in said vector may be added other sequences for regulating or modulating the expression of said sequence.
  • a non-exhaustive list includes: introns of mammalian genes, and in particular human genes, enhancer-type transcriptional regulation sequences ("enhancers") or else transcribed but untranslated sequences of mammalian and, in particular, human genes.
  • Another advantageous embodiment of the invention relates to a set comprising two expression vectors,
  • the first expression vector comprising a nucleic acid comprising a sequence chosen from nucleic acids SEQ ID NO: 19 and 29
  • the second expression vector comprising a nucleic acid comprising a sequence chosen from nucleic acids SEQ ID NO: 20 and 30;
  • FIGS. 1 to 8 Another advantageous embodiment of the invention relates to an expression vector mentioned above, comprising
  • a first nucleic acid chosen from the nucleic acids of the following sequences: SEQ ID NO: 19, 29, said first nucleic acid being under control of the elements allowing its expression, and
  • a second nucleic acid chosen from the nucleic acids of the following sequences: SEQ ID NO: 20, 30, said second nucleic acid being under control of the elements allowing its expression.
  • An advantageous embodiment relates to a vector as defined above comprising
  • a second nucleic acid SEQ ID NO: 30, under control of the elements allowing its expression Another advantageous embodiment of the invention relates to an expression vector mentioned above, comprising
  • a first nucleic acid chosen from the nucleic acids of the following sequences: SEQ ID NO: 21, 31, said first nucleic acid being under control of the elements allowing its expression, and
  • a second nucleic acid chosen from the nucleic acids of the following sequences: SEQ ID NO: 22, 32, said second nucleic acid being under control of the elements allowing its expression.
  • Another advantageous embodiment of the invention relates to an expression vector mentioned above, comprising
  • Another advantageous embodiment of the invention relates to an expression vector mentioned above, comprising
  • This expression vector therefore comprises two nucleic acid sequences as mentioned, and more particularly a nucleic acid sequence encoding the light chain of the monoclonal antibody defined above, and a nucleic acid sequence encoding the chain. heavy monoclonal antibody defined above.
  • said expression vector contains a first element allowing the expression of the nucleic acid sequence encoding the light chain of the monoclonal antibody defined above and a second element allowing the expression of the nucleic acid sequence. coding the heavy chain of the monoclonal antibody defined above, said first and said second element allowing the expression of said nucleic acid sequences being identical or different, and preferably identical.
  • control elements include RSV long-sequence repeat (LTR) sequences, or CMV promoters.
  • Another embodiment of the invention relates to an expression vector defined above, comprising at least one antibiotic resistance gene.
  • said expression vector may contain 1 or 2, or 3 or 4 or 5 or 6 antibiotic resistance genes.
  • antibiotic resistance gene is defined in the invention a gene whose expression product exerts a cytostatic effect (growth inhibition) or cytolytic (cell death) cells.
  • the antibiotics concerned by the invention in particular have an effect on prokaryotic cells, but may also have an effect on eukaryotic cells, whether they be yeasts, plants, insects, amphibians or mammals.
  • the aforementioned expression vector has an antibiotic resistance gene specific for prokaryotic cells and at least one gene, preferably 2 genes, for resistance to an antibiotic specific for eukaryotic cells.
  • antibiotics include prokaryotic cells: F Ampicillin, Tetracycline and its derivatives, Hygromycin, Kanamycin, etc. antibiotics specific for eukaryotic cells: G418, Geneticin (G418 salts), Puromycin, Methotrexate, Blasticidine ...
  • the subject of the invention is also a cell, or several cells, or a cell line comprising at least one expression vector as defined above.
  • the cells "comprising at least one vector” correspond to cells in which at least one aforementioned expression vector has been introduced.
  • Examples include calcium phosphate transfection techniques, using lipid particles or "lipofectants", or techniques for generating holes in the cell membrane by means of an electric shock (electroporation). This list is not exhaustive.
  • the cells or cell lines used in the invention are cells derived from prokaryotes or eukaryotes such as bacteria, yeasts or other fungi, insect cells, amphibian cells, mammalian cells and especially rodents, human cells ...
  • the cell is distinguished from the cell line by the fact that the cell line is a cell population in established culture, that is to say that it has acquired characteristics allowing their proliferation in vitro, and in particular a characteristic of immortalization.
  • a particular embodiment of the invention relates to a cell or a previously mentioned cell line, having a fucosylation activity substantially reduced compared to a normal cell, said cell or cell line being in particular a mammalian cell, and in particular the line YB2 / 0, available from ATCC under number CRL 1662.
  • the invention relates to a cell line chosen from the HEK line or the CHO line, expressing the monoclonal antibody as defined above.
  • the invention relates to a cell or a cell line comprising an expression vector defined above, allowing the expression
  • the invention relates to a cell or a cell line obtained by cloning a cell mentioned above.
  • Cell cloning techniques are widely known to those skilled in the art, and are based on the principle of isolating the cells of a cell population so that each individual cell gives rise to daughter cells (or clone) isolated cells cells girls of the division of the other cells of the population.
  • the general principle of cell cloning is the limiting dilution of cells.
  • Another aspect of the invention relates to a pharmaceutical composition, and especially a vaccine composition, containing at least one antibody directed against the tetanus toxin according to the invention, an antibody fragment according to the invention, a nucleic acid according to the invention, a vector according to the invention or a host cell according to the invention, for the treatment or prevention of a pathology associated with contamination with tetanus toxin.
  • composition a combination of two aforementioned antibodies, said composition said composition being antibody 4+ antibody 5.
  • An advantageous embodiment relates to a previously defined composition comprising:
  • the inventors have shown that the antibody 4 and the antibody 5 do not compete because the two antibodies recognize distinct epitopes on the fragment C of the tetanus toxin.
  • the invention also relates to a previously defined composition comprising:
  • composition may of course comprise a pharmaceutically acceptable vehicle, easily determinable by those skilled in the art.
  • the invention relates to a pharmaceutical composition, and especially a vaccine composition, comprising at least one monoclonal antibody defined above, in association with a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • the dosage of the active substance is particularly dependent on the mode of administration, and is readily determined by those skilled in the art.
  • a pharmaceutically acceptable carrier refers to a non-toxic material that is compatible with a biological system such as a cell, a cell culture, a tissue or an organism.
  • a therapeutically effective amount may range from 0.01 mg / kg to 50 mg / kg, preferably from 0.1 mg / kg to 20 mg / kg, and more preferably from 0.1 mg / kg to 2 mg / kg, in one or more daily administrations. for one or more days.
  • the pharmaceutical composition of the invention may be administered especially intravenously, in particular by injection or by gradual infusion, subcutaneously, by the local route by means of infiltrations, per os. Preparations for parenteral administration may include sterile aqueous or non-aqueous solutions, suspensions or emulsions.
  • non-aqueous solvents examples include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils, such as olive oil, or injectable organic esters such as ethyloleate.
  • Aqueous vehicles include water, alcohol / water solutions, emulsions or suspensions.
  • the invention also relates to the use of at least one antibody directed against the tetanus toxin according to the invention, an antibody fragment according to the invention, a nucleic acid according to the invention, a vector according to the invention or a host cell according to the invention, for the preparation of a medicament for the treatment or prevention of a pathology associated with contamination with tetanus toxin.
  • treatment we mean the means of treating a declared pathology, whose symptoms are visible.
  • prevention means the means of preventing said pathology from being declared.
  • the pathologies associated with tetanus toxin correspond to the symptoms related to tetanus toxin contamination, and in particular an increase in muscle tone and generalized spasms, trismus, dysphagia, stiffness, muscular pains that can go as far as hyperlordosis, rigidity of the tetanus toxin.
  • the invention also relates to a method for the in vitro determination of tetanus toxin in a biological sample from an individual likely to be contaminated with tetanus toxin, said method comprising:
  • ⁇ Determining the presence or absence of tetanus toxin in said sample by detecting the formation of a possible immune complex between the tetanus toxin and said monoclonal antibody.
  • the monoclonal antibodies of the invention can therefore be used to detect the presence of tetanus toxin in a biological sample.
  • said antibodies can be used for the implementation of detection techniques known to those skilled in the art such as ELISAs, RIEs, RIAs, immunoprecipitation or immunoblotting (Western blot, immunohistology).
  • the invention also relates to a method for in vitro decontamination of a sample that may be contaminated with tetanus toxin, in particular a biological sample, comprising:
  • One way of carrying out said decontamination process consists, for example, in the use of the monoclonal antibodies of the invention on which magnetic beads are grafted onto the constant region of said antibody.
  • the tetanus toxin is removed from the sample by capturing the antibodies according to the invention by means of a magnet.
  • Another means of carrying out said decontamination process consists, for example, in the use of immobilized monoclonal antibodies on a column comprising Staphylococcus aureus protein A or G.
  • the decontaminated sample is then passed through the column in order to retain, on the antibodies according to the immobilized invention, the tetanus toxin likely to be contained in said sample.
  • the light chain comprises an amino acid sequence identical to SEQ ID NO:
  • the heavy chain comprises an amino acid sequence identical to SEQ ID NO:
  • this monoclonal antibody is the antibody designated as "Antibody 3, and b- a monoclonal antibody as defined above, in which:
  • the light chain comprises an amino acid sequence identical to SEQ ID NO:
  • the heavy chain comprises an amino acid sequence identical to SEQ ID NO:
  • Figure 1 is a schematic representation of the vector for the expression of the light chain of antibody # 3.
  • Figure 2 is a schematic representation of the vector allowing the expression of the heavy chain of antibody n ° 3.
  • Figure 3 is a schematic representation of the vector for the expression of the light chain of antibody # 4.
  • FIG. 4 is a schematic representation of the vector allowing the expression of the heavy chain of the antibody # 4.
  • Figure 5 is a schematic representation of the vector for the expression of the light chain of antibody # 5.
  • Figure 6 is a schematic representation of the vector for the expression of the heavy chain of antibody # 5.
  • Figure 7 is a schematic representation of the vector for the expression of the light chain of antibody # 6.
  • Figure 8 is a schematic representation of the vector for the expression of the heavy chain of antibody # 6.
  • Figure 9 shows a graph showing the interaction of antibodies 3 (white squares), antibody 4 (black triangles), antibody 5 (black diamonds), antibody 6 (round white) and irrelevant immunoglobulins (broken line).
  • the Y axis represents the absorbance measured at 492 nm and the X axis represents the concentration of toxoid expressed in ng / ml.
  • FIG. 10 represents the sensorgram of the antibody 4.
  • FIG. 11 represents the sensorgram of the antibody 5.
  • Figure 12 shows the competition test between antibody 4 (white columns) or antibody 5 (black columns) with Gammatétanos®
  • Tracks 1) respectively represent: for the white columns: the antibody 4, and for the black columns: the antibody 5.
  • the Y axis represents the absorbance at 450 nm.
  • Figure 13 shows curves showing the percentage inhibition of binding of antibody 4 (diamonds) or antibody 5 (squares) with tetanus toxin, as a function of Gammatetanos® concentration.
  • the Y axis represents the percent inhibition
  • the X axis represents the concentration of Gammatétanos® in mU / mL.
  • Figure 14 shows the competition test between antibody 4 (white columns) or antibody 5 (black columns) with antibody 4 (lanes 3 to 6) and antibody 5 (lanes 7 to 10).
  • Tracks 1) respectively represent: for the white columns: the antibody 4, and for the black columns: the antibody 5.
  • the Y axis represents the absorbance at 492 nm.
  • Figures 15A-J correspond to diagrams showing the abduction of the fingers of the hind legs of mice.
  • Figures 5A-E show diagrams showing normal abduction of the paw fingers (controls, left paws)
  • Figure 15F shows a diagram showing maximum paw leg paralysis (abduction score 4, right leg).
  • Figure 15G shows a diagram showing high palsy of the paw fingers (abduction score 3, right paw).
  • Figure 15H shows a diagram showing moderate paralysis of the paw fingers (abduction score 2, right paw).
  • Figure 151 represents a diagram showing a weak palsy of the paw fingers (abduction score 1, right paw).
  • Figure 15J is a diagram showing the absence of paralysis of the paw fingers (Score 0 right leg abduction).
  • Voluntary blood donors are vaccinated against tetanus and given a final injection within 10 to 25 days of donation. In these immunized patients, 30 ml of whole blood are taken. By centrifugation, the mononuclear cells are then isolated from the blood (PBMC) and these cells are frozen in an RPMI 1640 containing 20% fetal calf serum and 10% dimethylsulfoxide.
  • PBMC blood cells
  • the antibodies described in the invention are produced in recombinant form whose coding sequences (cDNA) are isolated from human lymphocytes producing immunoglobulins directed against tetanus toxin.
  • cDNA coding sequences
  • B cells contained in the purified PBMCs of human blood, are themselves purified (cell sorting) by a cell sorter coupled to a flow cytometer using an anti-CD19 and the fragment C of the FITC-labeled toxin (Sigma ref T3819, Massachusetts strain D7) for identification and isolation.
  • the cells of interest are thus isolated and placed in a 96-well plate containing 6 .mu.l of water and 3 .mu.l of RT-PCR buffer containing 5-fold reverse transcriptase. The plate is then placed at -80 ° C.
  • the cells are heated for 1 minute at 65 ° C and then placed in ice. 6mL of reaction mixture consisting of 1M dithiotreitol, 0.1mM deoxyribonucleoside triphosphate, 40U ribonuclease inhibitor, pd (N) 6 and superscript RT 25U were added to the cells. The samples are incubated at 37 ° C for 1h30. The enzymatic reaction is stopped by heating at 95 ° C for 3 minutes. 3. PCR amplification
  • the first PCR is performed using a mixture of the 12 primers V (SEQ ID NO: 43, 44, 45, 46, 47, 48, 55, 56, 59, 60, 61 and 65) and external 3 * primers (3 * ) And H k (SEQ ID NO: 49, 50, 51, 52, 53, 54, 66, 67, 68, 69, 70, 71 and 72) in the same tube with the matrix product RT- PCR in 90 ⁇ l final reaction containing 50 mM KO; 10 mM Tris-HCl, pH 8.4; 2.5 mM MgCl2; 6 nM of each dATP, dCTP, dGTP, and dTTP; 7.5 ⁇ M of each primer and 5 U of High Fidelity Taq polymerase (Roche Molecular Biochemicals).
  • the primers used are the following:
  • SEQ ID NO: 43 5'-ACTAGTCGACCTCAGTGAAGGT ⁇ CT> TCCTGC AAGGC-3 '
  • SEQ ID NO: 45 5'-ACTAGTCGACGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAG-3 *
  • SEQ ID NO: 46 5'-ACTAGTCGACCCTGTCCCTCACCTGC ⁇ AG> CTGTC-3 *
  • the PCR reaction is carried out according to the following protocol: denaturation: 1 min at 94 ° C.
  • the second PCR is done separately for each family of VH and Vk in a reaction volume of 20 ⁇ .
  • a volume of ⁇ of the first PCR is reamplified with a 5 'specific primer and all 3' primers.
  • All PCRs contain 200mM of each dNTP and 1U of High Fidelity Taq polyperase in buffer (50mM KC1; 10mMTris-HCl, pH8.4; 1.5mM MgC12 to amplify VH or 2.5mM MgC12 to amplify Vk 0.125mM). 5 'primer and 0.125 mM primer mix 3').
  • the PCR reaction is carried out according to the following protocol:
  • the amplicon 1 corresponding to the sequence coding for the variable part of the immunoglobulin light chain is introduced into the "generic" vector CK463-11 containing the sequence of the light CK light chain of the IgG1 of the T125-A2 clone directed against the Rhesus D antigen.
  • a PCR on the variable fragment using specific primers makes it possible to introduce a Spel site and a kozak sequence respectively at 5 'while at 3' the first codon of the first amino acid of the constant part. is introduced with a restriction site DralII.
  • the amplicon 2 encoding the variable part of the heavy chain is introduced into the CH463-12 "generic" vector containing the sequence of the heavy CH chain of IgG1 of the T125-A2 clone directed against the Rhesus D antigen.
  • PCR on the variable fragment using specific primers makes it possible to introduce a NheI site and a kozak sequence respectively at 5 'whereas at 3' the codons of the first 3 amino acids of the constant part are introduced with an Apal restriction site. .
  • the cells are transfected using lipofectamine 2000 (Invitrogen) as the transfection agent and the vectors described above.
  • the CHO-K1 cells were inoculated the day before the transfection. 3 6-well plates are transfected for each antibody.
  • Production monitoring is performed on pools of aliquots of each 6-well plate. 72 hours after transfection, the different fractions are combined into one, in order to perform the assay of a single pool for each antibody by the ELISA technique using the RD-Biotech ELISA Kit (ref: RDB3257).
  • Example 3 Interaction and affinity tests of human monoclonal antibodies directed against tetanus toxin
  • Samples The antibodies, diluted in dilution buffer (PBS + BSA 0.1% + Tween-0.1% o) at 1 ⁇ g / ml then 1 ⁇ 2 1 ⁇ 2 of 7 points, are deposited in a volume of 100 ⁇ per well and incubated. 2 h at room temperature with gentle stirring.
  • Conjugate After washing, the antibodies bound to the toxoid are detected by a polyclonal goat anti-human IgG antibody labeled with peroxidase (Jackson, 109-035-098) diluted 1/2000 in dilution buffer and incubated 90 min at room temperature with stirring.
  • ⁇ Ligand injection of fragment C, diluted to 20 ⁇ g / ml in mM sodium acetate buffer, pH 4.5 ,. during 300 s at 10 ⁇ / min.
  • the tetanus antibodies are diluted in HBS-EP buffer (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% surfactant 20, pH 7.4) of 1.65 to 6.6 nM.
  • HBS-EP buffer 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% surfactant 20, pH 7.4
  • the antibody solutions are injected at 30 ⁇ l / min for 120 sec (association phase) and then the HBS-EP buffer alone is passed for 180 sec (dissociation phase).
  • the sensorgrams are analyzed by BIAeval software using the kinetic model 1: 2, that is to say a single recognition site on the fragment C (ligand) and 2 binding sites on the antibody (analyte).
  • This model is the one that 'does' best with the experimental results.
  • the measured and calculated kinetic constants are grouped in the following table:
  • the antibodies according to the invention Ac4 and Ac5 recognize the tetanus toxoid and more particularly the fragment C of the toxin.
  • the binding of antibodies to the fragment C of the tetanus toxin is either strong, 34 nM for Ac4 is very strong, 0.16 nM for Ac5 but above all very stable.
  • Example 4 Competition tests of antibodies 4 and 5 for tetanus toxin.
  • the Ac4 and Ac5 antibodies, labeled with biotin, are diluted in dilution buffer (PBS + 0.1% BSA + 0.1% Tween-20) at 0.5 ⁇ g / ml.
  • the Gammatétanos® therapeutic antibody preparation is diluted in dilution buffer to 4 IU / ml and then 1/3 in 1/3 over 7 dilutions.
  • Dilutions of labeled antibodies are mixed, volume-to-volume, with dilutions of Gammatétanos® or with the dilution buffer and then the mixtures are deposited in the wells of the microtiter plate coated with tetanus toxoid and incubated for 2 hours at room temperature. room.
  • biotinylated monoclonal antibodies bound to the toxoid in the wells of the microtiter plate are detected by a solution of streptavidin-peroxidase diluted to 0.5 ⁇ g / ml. After washing, the wells are revealed by a solution of TMB (Pierce, 34028). b- Competition of the antibodies according to the invention between them
  • Ac4 and Ac5 antibodies labeled with biotin are diluted in dilution buffer (PBS + 0.1% BSA + Tween-20 0.1%) to 0.5 ⁇ g / ml.
  • the "cold" monoclonal antibodies are diluted in dilution buffer at 50 ⁇ g / ml and then 1/5 in 1/5 over 3 dilutions.
  • Dilutions of labeled antibodies are mixed, volume-to-volume, with "cold” antibody dilutions or with the dilution buffer and then the mixtures are deposited in the wells of the tetanus toxoid-coated microtiter plate and incubated 2 h at room temperature.
  • biotinylated monoclonal antibodies bound to the toxoid in the wells of the microtiter plate are detected by a solution of streptavidin-peroxidase diluted to 0.5 ⁇ g / ml. After washing, the wells are revealed by a solution of TMB (Pierce, 34028).
  • doses of 4x to 100x of antibody 4 are capable of dissociating the interaction between the antibody 4 and the tetanus toxin (FIG. 14, white columns No. 3 to 5), while the same doses of antibodies 5 do not displace the interaction ( Figure 14, white columns # 7 to 9).
  • doses of 4x to 100x antibody 5 are able to dissociate the interaction between antibody 5 and tetanus toxin ( Figure 12, black columns # 7 to 9), while the same doses of antibodies 4 do not displace the interaction ( Figure 14, black columns # 3 to 5). This result indirectly confirms the specificity of antibodies 4 and 5 for tetanus toxin.
  • Example 5 Test of In Vitro Neutralization of Tetanus Toxin by Human Monoclonal Antibodies - Protein Translation Inhibition Test
  • the translation of a marker protein for example the translation of luciferase, is measured in an acellular in vitro translation system [ML Pharmacol Toxicol Hatch 2001, 88 (5): 255-260].
  • the monoclonal antibodies are deposited in 96-well plates in phosphate buffered saline (PBS) and tetanus toxin is added to a final concentration of 4 mM.
  • PBS phosphate buffered saline
  • Rabbit reticulocyte lysate supplemented with RNAsin®, amino acids and messenger RNA from luciferase is then added to each well. The reaction is carried out for 1h30.
  • Example 6 Test for the In Vivo Neutralization of Tetanus Toxin by the Human Monoclonal Antibody
  • Fisher rats (Charles River Laboratories L'Arbresle, France) received a dose of 16 mg / kg tetanus toxin mass and 50 ⁇ g of tetanus toxin. anti-tetanus toxin antibody, after adaptation of the protocol described by Ezzell et al. (Ezzell et al., 1984. Infect Immun 45: 761-767)
  • the tests were carried out by measuring the viability of the animals according to the doses of tetanus toxin and tetanus toxoid injected antibodies.
  • Example 7 Action of anti-tetanus toxin antibodies according to the invention on the blocking effect of tetanus toxin on neuromuscular transmission in vivo by the finger abduction test in mice.
  • mice Swisswe Webster weighing between 20 and 25 g, are anesthetized by inhalation of Isoflurane (AErrane®, Baxter S.A., Lessines, Belgium) before being injected with a single dose of tetanus toxin into the left hind paw.
  • Isoflurane AErrane®, Baxter S.A., Lessines, Belgium
  • a solution of toxin in 0.1 M PBS, pH 6.5, and containing 0.2% gelatin is prepared from the tetanus toxin stock solution.
  • a volume of 40 ⁇ , of this solution will be injected through the skin into the muscle Extensor digitorum longus (EDL) of the left hind paw of the mice, using a sterile syringe equipped with a needle 25G x 5 / 8.
  • EDL Extensor digitorum longus
  • a group of control mice received an injection of 0.1 M PBS solution, pH
  • mice After intramuscular injection of the tetanus toxin and a waiting period of about 12 to 18 hours, the paralysis of the mice is tested. These are suspended by the tail and present under normal conditions an abduction of the fingers of the paw. Following an injection of tetanus toxin, the paralysis is manifested by a reduction of this ability of abduction of the fingers of the hind paw.
  • a score of 0 to 4 is used for the assessment of finger abduction ( Figures 15A-J). The score 0 reflects the absence of paralysis, while the score of 4 reflects the maximum reduction of the abduction of the fingers. The reading is done in double blind and other parameters will be quantified like the time necessary to obtain a maximum paralysis (score of 4), the maximum recovery time (score of 0) and for the tetanus toxin, the time of appearance central effects.
  • mice are sacrificed by overdose of isoflurane inhalation.
  • the anti-tetanus toxoid antibodies according to the invention administered intramuscularly or intraperitoneally, show an inhibition of the blocking effect of tetanus toxin by decreasing the score relating to the abduction of the fingers of the hind paw.
  • Example 8 Action of anti-tetanus toxin antibodies according to the invention on the blocking effect of tetanus toxin on neuromuscular preparations isolated from mice. The efficacy of tetanus toxin is tested in vitro on neuromuscular preparations isolated from mice by measuring muscle contraction caused by nerve stimulation.
  • mice are anesthetized by inhalation of Isoflurane (AErrane®, Baxter S.A., Lessines, Belgium) before being sacrificed by decapitation.
  • Isoflurane AErrane®, Baxter S.A., Lessines, Belgium
  • the left or right hemi-diaphragm, or the extensor muscle Extensor digitorum longus (EDL) of Mouse with their respective motor nerves are rapidly isolated and removed, and mounted in experimental tanks (2-4 ml volume), the bottom of which is covered of a silicone (Rhodorsil) and filled with a standard physiological solution (Krebs-Ringer) containing (in mM): 145 NaCl, 5 KCl, 2 CaCl 2, 1 MgCl 2, 11 glucose and 5 N-2-hydroxyethylpiperazine-N ' -2-ethanesulfonic acid (HEPES) (pH 7.4), continuously perfused with oxygen.
  • one of the tendons of the preparation is connected by a resistant wire, via a micromanipulator, to an isometric force transducer (Grass Instruments Warwick West, RI, USA, model FT03), and the other tendon is fixed, by micro-needles, on the silicone of the bottom of the tank of experimentation.
  • Stimulation of the muscle is performed indirectly, through the motor nerve sucked by a suction electrode formed of a glass tube, stretched and polished at one of its ends so as to suck the nerve without the deteriorate.
  • Two platinum wires are attached to the electrode, one wound outside the tube, the other inside, and connected to the isolation unit of a stimulator (Grass Instruments, Model S- 44).
  • Isometric contractions are triggered by stimulation of the motor nerve by pulses of 0.15 ms duration, supra maximal intensity (3-8 V), and at frequencies between 0.1 and 10 Hz.
  • the basal tension is recorded, then modified, so as to obtain the maximum response, by adjusting the stretching of the sarcomeres of the muscle to its optimum length. This stretch is obtained using a micromanipulator. Under these conditions, we record the isometric contraction because the basal tension is kept constant throughout the experiment.
  • the signals detected by the force transducer (contractile force expressed in units of force, Newtons) are amplified, collected and digitized using a computer equipped with a converter analog-digital (Digidata-1322A, Axon Instruments, Union City, CA, USA.)
  • a converter analog-digital Digidata-1322A, Axon Instruments, Union City, CA, USA.
  • Tetanus toxin is added at doses between 7.5 and 12 nM to block muscle contraction triggered by nerve stimulation in about 120 minutes established, we will calculate the number of LD50 mice involved in this effect.
  • the antibodies according to the invention are then added and show an inhibition of the muscular contraction.

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Abstract

La présente invention concerne un anticorps monoclonal dirigé contre la toxine tétanique, caractérisé en ce qu'il se lie à un fragment protéique de la toxine tétanique.

Description

Anticorps monoclonaux dirigés contre la toxine tétanique
La présente invention a pour objet des anticorps monoclonaux, notamment humains dirigés contre la toxine tétanique.
Le tétanos est une maladie neurologique due à l'action de la toxine tétanique. Cette pathologie est due à Clostridium tetani, un bacille sporulant anaérobie strict à Gram positif et ubiquitaire dont les spores sont souvent retrouvées dans le sol, les poussières, les déjections animales.
Ce bacille pénètre dans l'organisme à l'occasion d'une plaie. Les plaies profondes, punctiformes, les plaies contenant des tissus dévitalisés ou un corps étranger créent un environnement plus favorable au développement de C. tetani, mais n'importe quelle effraction cutanée, même la plus superficielle, peut permettre l'infection : abrasion cutanée, brûlures ou engelures, chirurgie, avortement, otite moyenne aiguë, toxicomanie intraveineuse. Le tétanos peut également compliquer certaines maladies chroniques : ulcères de décubitus, abcès, gangrène.
Quand les conditions d'anaérobiose sont réunies, il y a germination des spores et production de tétanospasmine. La tétanospasmine est une neurotoxine thermolabile produite par Clostridium tetani, sous la forme d'un précurseur inactif ou très faiblement actif constitué d'une unique chaîne polypeptidique de 150 kDa. Cette chaîne est dépourvue de séquence signal et est clivée par des protéases bactériennes, après sa libération, en une chaîne lourde de 100 kDa liée par un pont disulfure à une chaîne légère de 50 kDa. Fonctionnellement, la tétanospasmine comprend trois régions : l'extrémité COOH terminale de la chaîne lourde est responsable de l'attachement à un récepteur de 15kDa de la membrane des neurones, une région N¾ terminale de la chaîne lourde gouverne la pénétration et la chaîne légère est responsable du blocage de la libération des neurotransmetteurs. La tétanospasmine produite par le bacille est disséminée dans l'organisme via le système lymphatique et vasculaire jusqu'aux extrémités terminales des nerfs moteurs et migre le long des axones vers la moelle épinière et le tronc cérébral. Là, elle accède aux interneurones inhibiteurs dont elle bloque la libération de neuromédiateurs, en l'occurrence la glycine et surtout le GABA (acide gamma amino- butyrique), interrompant ainsi une voie majeure du contrôle des contractions musculaires. Le mécanisme moléculaire du blocage de la neuroexocytose par la toxine tétanique fait intervenir la protéolyse d'une protéine des vésicules synaptiques ayant un rôle clé dans la fusion des vésicules avec la membrane présynaptique.
La diminution de l'inhibition résulte en une augmentation de l'activité des neurones moteurs et provoque les spasmes musculaires caractéristiques du tétanos. La perte de l'inhibition se retrouve également au niveau du système nerveux sympathique, provoquant une augmentation des catécholamines circulantes responsable des manifestations dysautonomiques de la maladie. Les signes cliniques apparaissent après une période d'incubation de 2 à 14 jours, selon différents facteurs incluant notamment le site d'inoculation et l'âge du patient. Chez l'adulte, les premiers signes sont souvent une dysphagie (douleurs et difficultés à la déglutition) et une douleur de la nuque. Chez le nouveau-né, tout débute par un refus de téter. Au fur et à mesure que l'infection progresse, apparaissent le trismus (blocage de la mâchoire en position fermée), le rictus sardonique (grimace caractéristique due à la contracture des muscles de la face) et l'opisthotonos (hyper extension de la nuque et du dos par contracture des muscles paravertébraux). La contracture des muscles de la paroi abdominale peut simuler un abdomen aigu. Viennent ensuite les spasmes généralisés (membres supérieurs en flexion, membres inférieurs en extension), déclenchés par n'importe quel stimulus (bruit, lumière, toucher) ou survenant spontanément dans les formes graves. La maladie évolue alors inexorablement vers l'arrêt respiratoire par spasme laryngé et/ou spasme de la musculature respiratoire.
Il existe à l'heure actuelle, des mesures pour prévenir l'infection par le tétanos, telles que :
· L'immunisation active des sujets par la vaccination avec l'anatoxine tétanique (souvent couplée avec la vaccination diphtérique et anticoquelucheuse chez les enfants). La vaccination comporte 3 injections sous-cutanées à 1 mois d'intervalle avec rappel 1 an plus tard. Des injections de rappel doivent être faites tous les 5 à 10 ans.
· Le nettoyage minutieux des plaies souillées de terre. Le débridement chirurgical permet seul d'enlever les tissus nécrosés.
Par ailleurs, il existe également des traitements curatifs de cette pathologie via notamment l'antibiothérapie, la sérothérapie et l'immunothérapie. La pénicilline G, longtemps utilisée pour traiter les patients atteints du tétanos, est maintenant remplacée par le métronidazole IV, du fait de son activité antagoniste du GABA. L'antibio thérapie permet de diminuer le nombre de bacilles produisant la toxine, mais n'a aucun effet sur la toxine déjà libérée et circulante ou fixée sur le neurone.
Le sérum antitétanique de Pasteur est un sérum issu de chevaux immunisés contre la toxine tétanique. Le sérum contient des fragments F(ab)'2 neutralisants dirigés contre la toxine tétanique et il n'agit que sur la toxine circulante. Du fait d'effets secondaires majeurs et notamment des accidents allergiques, anaphylactiques et sériques, le sérum antitétanique est aujourd'hui remplacé par l'administration d'immunoglobulines humaines anti-toxine tétanique. Gammatétanos® (LFB Biomédicaments ; Autorisation de Mise sur Marché en France (AMM) n° 3289219) est une composition d'immunoglobulines polyclonales antitoxine tétanique humaine, qui permet de neutraliser la tétanospasmine qui n'a pas encore gagnée le système nerveux.
Les symptômes tels que les spasmes peuvent être traités par les benzodiazépines. Ces médicaments agissent effectivement au niveau synaptique en diminuant la recapture du GABA et ont donc un effet directement opposé à celui de la tétanospasmine. Le traitement vise à contrôler les spasmes durant plus de 5-10 secondes pour prévenir l'arrêt respiratoire, les doses requises pouvant être considérables (5-15mg/kg/j) et devant être fractionnées (toutes les 1 à 4 heures). La prise en charge des manifestations dysautonomiques, qui apparaissent tardivement dans le décours de la maladie, est difficile. L'hyperactivité sympathique est soulagée par bêta-bloquants et parfois par bloc épidural avec des anesthésiques locaux. L'hyperactivité parasympathique est rare mais peut nécessiter la pose d'un stimulateur cardiaque en cas de bradycardie. Le maintien d'une hydratation et d'une alimentation suffisante est capital, on utilise une sonde naso- gastrique ou un tube de gastrostomie. Un traitement préventif des thromboses veineuses profondes, des ulcères gastriques et de décubitus doit être institué.
Le traitement curatif du tétanos reste toutefois très difficile. Il existe un besoin important de nouveaux traitements du tétanos et de ses complications. Plus particulièrement, il existe un besoin aigu d'une thérapeutique adaptée pour la prévention et/ou le traitement curatif de cette pathologie.
Le brevet EP 0 562 132 divulgue des anticorps monoclonaux anti-tétanotoxine, produits dans un hybridome, se liant à la chaîne légère de la toxine tétanique avec une affinité d'au moins lxlO9 M"1 pour la toxine tétanique. Ces anticorps neutralisent l'activité biologique de la tétanotoxine avec une capacité d'au moins 2 Ul/100 μg d'Immunoglobulmes, voire de 4Ul/10(^g d'Immunoglobulmes. Ils sont utilisés dans une composition pharmaceutique pour l'immunisation passive contre le tétanos. Les anticorps sont produits par des hybridomes entre des cellules lymphoblastoïdes et des myélomes de souris. EP 0 562 132 ne décrit pas les séquences en acides aminés des anticorps utilisés, ni la séquence en acides aminés de l'épitope contre lequel ces anticorps sont dirigés.
Aussi, l'invention a pour objet de fournir des anticorps neutralisant la toxine tétanique, comme alternative avantageuse aux compositions existantes comprenant des anticorps dirigés contre la toxine tétanique.
Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation de ces anticorps en tant que médicaments ou agents de décontamination lors d'une contamination par la toxine tétanique.
La Demanderesse propose maintenant d'utiliser de nouveaux anticorps monoclonaux notamment humains dirigés contre la toxine tétanique, comme solution alternative aux anticorps déjà connus dirigés contre la toxine tétanique pour prévenir et/ou traiter le tétanos. Ces anticorps sont caractérisés en ce qu'ils lient un fragment protéique dont la séquence en acides aminés présente une identité de séquence d'au moins 85% par rapport à la séquence en acides aminés du fragment C de la toxine tétanique.
L'avantage présenté par la liaison des anticorps à ce fragment protéique réside en ce que la liaison de l'anticorps selon l'invention sur le fragment C, fragment responsable de liaison au récepteur présent à la membrane des neurones, inhibe la phase d'accrochage de la toxine au neurone empêchant toute action délétère de la toxine vis-à-vis de la cellule cible.
L'invention a pour objet un anticorps monoclonal dirigé contre la toxine tétanique, caractérisé en ce qu'il se lie à un fragment protéique dont la séquence en acides aminés est SEQ ID NO:63 ou à un fragment protéique présentant une identité de séquence d'au moins 85%, et de préférence au moins 90%>, avec la séquence en acides aminés SEQ ID NO:63.
L'invention concerne également un anticorps monoclonal dirigé contre la toxine tétanique, caractérisé en ce que ledit anticorps se lie à un fragment protéique de ladite toxine tétanique, ledit fragment protéique consistant en - la séquence d'acides aminés SEQ ID N°63 ou
- toute séquence d'acides aminés consistant en une séquence d'acides aminés présentant une identité d'au moins 85%, et de préférence 90%, avec la séquence SEQ ID N°63.
La séquence en acides aminés SEQ ID NO :63 correspond à la séquence du fragment C de la toxine tétanique issue de la souche E88 (n°20886).
Parmi les fragments protéiques présentant une homologie de séquence d'au moins 85%o, préférentiellement au moins 90%, avec la séquence d'acides aminés SEQ ID NO: 63, on peut citer le fragment C de la souche Massachussetts de C. tetani, possédant la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 64.
Avantageusement, « toute séquence d'acides aminés consistant en une séquence d'acides aminés présentant une identité d'au moins 85% » correspond à des variants du fragment C de la toxine tétanique possédant essentiellement le même nombre d'acides aminés. En d'autre termes, ladite « toute séquence d'acides aminés consistant en une séquence d'acides aminés présentant une identité d'au moins 85% » ne peut pas représenter, dans l'invention, la toxine tétanique entière.
Les termes « anticorps » et « immunoglobuline » ont la même signification. Ils sont utilisés indifféremment dans la présente invention pour désigner une protéine multimérique constituée de 4 chaînes participant à la réponse immunitaire acquise.
Les immunoglobulines sont constituées d'un assemblage de deux dimères constitués chacun d'une chaîne lourde et d'une chaîne légère. Le complexe multimérique est assemblé par la liaison d'une chaîne légère et d'une chaîne lourde par un pont disulfure entre deux cystéines, les deux chaînes lourdes étant elle-même également reliées entre elles par un ou plusieurs (de 1 à 11) ponts disulfure dépendant de l'isotype considéré.
Il existe deux types de chaînes légères : lambda (λ) et kappa (κ). Il existe cinq types de chaînes lourdes définissant les classes (ou isotypes), et qui déterminent l'activité fonctionnelle d'un anticorps : IgM, IgD, IgG, IgA et IgE. Chaque chaîne comprend différents domaines. La chaîne légère est constituée d'une région variable (VL) et d'une région constante (CL). La chaîne lourde est constituée d'une région variable (VH) et d'une région constante elle-même constituée de trois ou quatre domaines constants Cm, Cm et CH3 CiM.en fonction de l'isotype considéré. Les régions variables des chaînes légères et des chaînes lourdes déterminent la capacité de reconnaissance de l'antigène et la spécificité de liaison anticorps-antigène. Les régions constantes des chaînes légères et lourdes confèrent aux anticorps leurs propriétés biologiques telles que l'association des chaînes d'anticorps entre elles, la sécrétion des anticorps, la liaison au complément et la liaison aux récepteurs Fc (FcR).
L'assemblage des chaînes constituant un monomère d'immunoglobuline peut être schématisé par une lettre Y, dans laquelle : la base du Y correspond à la région constante « Fc », constituée par les domaines Cm CH3 et des CH4 le cas échéant deux chaînes lourdes, qui est reconnue par le complément et les récepteurs spécifiques de ce fragment Fc, et chacune des extrémités des deux bras du Y correspond à l'assemblage des régions variables respectives d'une chaîne légère et d'une chaîne lourde.
La région variable de chacune des chaînes légères et des chaînes lourdes est constituée de trois domaines déterminant la reconnaissance de l'antigène (Complementarity Determining Région, ou CDR) entourées de quatre domaines charpentes (framework, ou FR). Les CDRs correspondent à des séquences d'acides aminés qui, lorsqu'elles sont assemblées, conditionnent majoritairement l'affinité de liaison et la spécificité de l'anticorps pour son antigène. Le site de liaison d'un antigène (épitope) dépend donc 6 CDRs, dont 3 proviennent de la chaîne légère et 3 de la chaîne lourde.
Le terme « anticorps humain » définit un anticorps constitué uniquement de séquences d'origine humaine. Un « anticorps chimère » peut contenir, d'une part, des domaines VH et VL d'un anticorps dérivé d'un animal non humain et, d'autre part, des domaines CH et CL d'un autre anticorps, par exemple un anticorps humain. Un « anticorps humanisé » est un anticorps dans lequel les CDRs proviennent d'un anticorps de spécificité différente de celle des autres domaines de l'anticorps. Par exemple, des CDRs de souris peuvent être introduits entre les régions FR d'un anticorps humain.
Le terme « anticorps monoclonal », ou AcM, définit une molécule d'anticorps, ou une population homogène d'anticorps, dirigée contre un déterminant antigénique défini et habituellement produite par un seul clone de cellules B, ou hybridome. De tels anticorps peuvent être également produits selon une méthode décrite dans l'article de Pasquali et al. (Blood, 2001, 97, 3820-28). Les anticorps polyclonaux constituent une population d'anticorps hétérogènes pouvant reconnaître différents déterminants antigéniques d'un antigène unique. Le terme « fragment d'anticorps » définit une portion d'anticorps intact, de préférence un site de liaison à l'antigène ou une région variable de l'anticorps. Des exemples de fragments incluent Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, scFv, sc(Fv)2, et des anticorps multispécifïques composés de différents fragments.
Le terme « Fab » désigne un fragment d'anticorps de masse moléculaire d'environ
50.000 dalton et possédant une activité de liaison à l'antigène. Il comprend environ la moitié du côté N-terminal de la chaîne lourde et la chaîne légère entière liés par un pont disulfure. Le Fab peut être obtenu notamment par le traitement des IgG par une protéase, la papaïne.
Le terme « F(ab')2 » désigne un fragment d'environ 100.000 dalton et une activité de liaison à l'antigène, l'association par un pont disulfure de deux Fab décrits ci-dessus.
Il peut être obtenu par le traitement des IgG par une protéase, la pepsine.
Un « scFv » (single chain Fv) est un polypeptide VH::VL synthétisé en utilisant les gènes codant pour les domaines VL et VH et une séquence codant pour un peptide destiné à lier ces domaines. Un scFv selon l'invention inclut les CDRs maintenus dans une conformation appropriée, par exemple en utilisant des techniques de recombinaison génétique.
Les anticorps décrits dans l'invention sont produits sous forme recombinante dont les séquences codantes (ADNc) sont isolées de lymphocytes B humains produisant des immunoglobulines dirigées contre la toxine tétanique. Ces cellules B, contenues dans les PBMC purifiés de sang humain, sont elles mêmes purifiés (cell sorting) par un trieur de cellules couplé à un cymomètre en flux en utilisant un anti-CD19 et le fragment C de la toxine marqué au FITC (Sigma réf. T3819, souche Massachusetts D7) pour les identifier et les isoler. Une RT-PCR sur cellule unique permet la conversion des ARN totaux en ADNc duquel sont amplifiés spécifiquement à l'aide d'amorces judicieusement choisies les fragments variables codant les anticorps d'intérêt. Ces fragments variables d'immunoglobulines sont ensuite clonés dans des vecteurs d'expression adapté au système d'expression choisi et contenant les parties constants d'une immunoglobuline humaine d'isotype choisi. Le clonage des parties variables peut se faire dans un vecteur unique contenant les 2 parties constantes d'Immunoglobuline. Le ou les vecteurs d'expression sont ensuite transfectés par dans une lignée d'expression, pour être exprimé de façon transitoire ou stable après avoir traité les cellules avec un antibiotique la G418. Les anticorps sont purifiés par chromatographie d'affinité selon des techniques bien connues de l'homme du métier. Ces anticorps sont matures, c'est-à-dire qu'ils possèdent une structure tridimensionnelle ad hoc leur permettant de reconnaître l'antigène, et possèdent toutes les modifications post-traductionnelles essentielles à leur reconnaissance antigénique.
Le fragment protéique de SEQ ID N°63 correspond à une séquence en acides aminés de la toxine tétanique située dans la partie C-terminale de la toxine et issu du clivage de celle-ci par la papaïne.
Plus particulièrement, l'invention concerne un anticorps monoclonal chimère, humanisé ou humain, dirigé contre la toxine tétanique. De préférence, l'anticorps monoclonal utilisé est humain.
Encore plus particulièrement, l'invention concerne un anticorps monoclonal humain dirigé contre la toxine tétanique, caractérisé en ce qu'il présente une constante d'affinité (KA) pour la toxine tétanique au moins égale à lxlO8 M"1. De préférence, l'anticorps monoclonal humain dirigé contre la toxine tétanique présente une constante d'affinité pour celle-ci au moins égale à lxlO9 M"1. Plus préférentiellement, l'anticorps monoclonal humain dirigé contre la toxine tétanique présente une constante d'affinité pour celle-ci au moins égale à lxlO10 M"1.
L'affinité d'un anticorps pour un antigène peut être mesurée par différentes méthodes bien connues de l'homme du métier, et notamment en utilisant les techniques ELISA ou par résonnance plasmonique de surface, en mesurant directement la fixation antigène-anticorps ou par des méthodes d'inhibition compétitive.
De manière plus avantageuse, l'anticorps monoclonal tel que défini précédemment, ledit anticorps se lie de manière essentiellement irréversible auxdits fragments peptidiques susmentionnés.
Par « liaison irréversible » on entend dans l'invention une liaison forte entre l'anticorps et son substrat (la toxine tétanique), ladite interaction ne pouvant être rompue, ou déplacée, au moyen de concentrations équivalentes d'un compétiteur par exemple un autre anticorps dirigé contre le même substrat. De telles données sont montrées dans la partie « Exemples ». Aussi, un anticorps selon l'invention possédant un KD supérieur à 10"8M, dans les conditions de mesure du KD par résonnance plasmonique de surface, sera considéré comme se liant de manière irréversible à son substrat. Par ailleurs, l'anticorps monoclonal selon l'invention tel que défini précédemment se lie de manière stable auxdits fragments peptidiques susmentionnés. Cela signifie que l'interaction antigène/anticorps selon l'invention n'est pas rompue par la simple utilisation de tampons, utilisés notamment dans les tests d'interaction SPR.
Un anticorps disposant d'une affinité élevée pour la toxine tétanique présente l'avantage de nécessiter une dose comparativement plus faible d'anticorps par rapport à un anticorps présentant une affinité faible.
Selon un mode particulier de réalisation, l'invention a pour objet un anticorps monoclonal dirigé contre la toxine tétanique, dans lequel la chaîne légère et la chaîne lourde sont telles que :
• la région constante de la chaîne légère de l'anticorps est essentiellement constituée par la région constante de la chaîne légère d'une immunoglobuline humaine IgGl, et/ou
· la région constante de la chaîne lourde est essentiellement constituée par la région constante de la chaîne lourde d'une immunoglobuline humaine IgGl . Plus particulièrement encore, ladite chaîne légère d'une immunoglobuline humaine de type IgGl et/ou ladite chaîne lourde d'une immunoglobuline humaine de type IgGl sont constituées par la partie constante d'une chaîne légère et la partie constante d'une chaîne lourde d'une immunoglobuline humaine obtenue par immunisation avec l'antigène Rhésus D, et en particulier du clone T125-A2 humain.
« La région constante de la chaîne légère est essentiellement constituée de la région constante de la chaîne légère d'une immunoglobuline humaine » signifie que la région constante de la chaîne légère peut être constituée de la séquence de la région constante d'une chaîne légère d'une immunoglobuline humaine, mais peut également être constituée d'une séquence correspondant à la fusion de plusieurs séquences de plusieurs régions constantes de plusieurs immunoglobulines humaines. En d'autres termes, la région constante de la chaîne légère peut être constituée d'une séquence correspondant à une mosaïque de séquences de régions constantes de chaînes légères, sous réserve que ladite séquence mosaïque reconstitue une séquence d'une région constante d'une chaîne légère. « La région constante de la chaîne lourde est essentiellement constituée de la région constante de la chaîne lourde d'une immunoglobuline humaine » signifie que la région constante de la chaîne lourde peut être constituée de la séquence de la région constante d'une chaîne lourde d'une immunoglobuline humaine, mais peut également être constituée d'une séquence correspondant à la fusion de plusieurs séquences de plusieurs régions constantes de plusieurs immunoglobulines humaines. En d'autres termes, la région constante de la chaîne lourde peut être constituée d'une séquence correspondant à une mosaïque de séquences de régions constantes de chaînes lourdes, sous réserve que ladite séquence mosaïque reconstitue une séquence d'une région constante d'une chaîne lourde.
« La région variable de la chaîne légère comprend la région variable de la chaîne légère d'une immunoglobuline humaine », signifie que la séquence de la région variable de la chaîne légère correspond à la séquence de la région variable de la chaîne légère d'une immunoglobuline humaine. Cette région variable de la chaîne légère peut être fusionnée, dans sa région N-terminale, à la région C-terminale d'une séquence permettant l'excrétion de l'anticorps. Cette séquence permettant l'excrétion de l'anticorps est appelée peptide signal ou séquence leader.
« La région variable de la chaîne lourde comprend la région variable de la chaîne lourde d'une immunoglobuline humaine» signifie que la séquence de la région variable de la chaîne lourde correspond à la séquence de la région variable d'une chaîne lourde d'une immunoglobuline humaine. Cette région variable de la chaîne lourde peut également être fusionnée dans sa région N-terminale, à la région C-terminale d'une séquence permettant l'excrétion de l'anticorps.
Dans la cellule productrice de l'anticorps monoclonal de l'invention, ledit anticorps monoclonal anti-toxine tétanique est produit sous forme d'un précurseur qui possède, dans la région N-terminale de la chaîne légère et de la chaîne lourde, une séquence leader ou peptide signal. Ce précurseur subit alors diverses étapes de maturation, et en particulier les séquences leader sont clivées pour permettre la sécrétion de l'anticorps dans le milieu extracellulaire. L'anticorps sécrété est donc un anticorps mature.
Ainsi la définition de l'anticorps monoclonal humain de l'invention couvre à la fois : le précurseur de l'anticorps humain tel que défini ci-dessus, et
l'anticorps humain défini ci-dessus. Dans un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, l'anticorps monoclonal décrit ci-dessus et ci-après possède une chaîne légère, et notamment une région constante de ladite chaîne légère de type kappa (κ).
Dans autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne un anticorps monoclonal dirigé contre la toxine tétanique précédemment décrit, dans lequel : la chaîne légère dudit anticorps monoclonal comprend au moins les régions déterminant la complémentarité (CDRLm) de la région variable d'une chaîne légère d'une immunoglobuline humaine, et la chaîne lourde dudit anticorps monoclonal comprend au moins les régions déterminant la complémentarité (CDRnm) de la région variable d'une chaîne lourde d'une immunoglobuline humaine.
Selon un mode particulier de réalisation, l'invention a pour objet un anticorps monoclonal caractérisé en ce que la région variable de la chaîne légère comprend les SEQ ID NO: 57 et SEQ ID NO: 58.
Les séquences SEQ ID NO: 57 et SEQ ID NO: 58 correspondent respectivement aux séquences des CDR2 et CDR3 identifiés dans la séquence d'anticorps monoclonaux présentant une affinité particulièrement élevée pour la toxine tétanique.
Selon un mode plus particulier de réalisation, l'invention a pour objet un anticorps monoclonal caractérisé en ce que la région variable de la chaîne légère comprend la SEQ ID NO: 59.
Selon un mode réalisation avantageux, l'invention concerne un anticorps monoclonal défini précédemment, caractérisé en ce que la région variable de la chaîne légère comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO: l ou une séquence en acides aminés présentant une identité de séquence d'au moins 85%, de préférence au moins 90%, de préférence au moins 95% et de préférence au moins 97% avec SEQ ID NO: l . Un mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention a pour objet un anticorps monoclonal tel que défini ci-dessus, dans lequel : • la région variable de la chaîne légère comprend une séquence en acides aminés identique à une séquence choisie dans le groupe constitué par les séquences suivantes: SEQ ID NO: 13 et SEQ ID NO:23, et
• la région variable de la chaîne lourde comprend une séquence en acides aminés identique à une séquence choisie dans le groupe constitué par les séquences suivantes:
SEQ ID NO: 14 et SEQ ID NO:24.
Un autre mode de réalisation plus particulièrement avantageux de l'invention a pour objet un anticorps monoclonal tel que défini ci-dessus, dans lequel la région variable de la chaîne légère comprend une séquence identique à SEQ ID NO: 13 et la région variable de la chaîne lourde comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO:14.
Un autre mode de réalisation plus particulièrement avantageux de l'invention a pour objet un anticorps monoclonal tel que défini ci-dessus, dans lequel la région variable de la chaîne légère comprend une séquence identique à SEQ ID NO:23 et la région variable de la chaîne lourde comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO:24.
Un autre mode de réalisation avantageux de l'invention concerne un anticorps monoclonal tel que défini ci-dessus, dans lequel :
· la région constante de la chaîne légère comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO:3 ou présentant une identité de séquence d'au moins 85% avec SEQ ID NO:3, et
• la région constante de la chaîne lourde comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO:4 ou présentant une identité de séquence d'au moins 85% avec SEQ ID NO:4.
Un autre mode de réalisation avantageux de l'invention concerne un anticorps monoclonal défini ci-dessus, dans lequel :
• chacune des chaînes légères comprend une séquence en acides aminés identique à une séquence choisie dans le groupe constitué par : SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID
NO:25, • chacune des chaînes lourdes comprend une séquence en acides aminés identique à une séquence choisie dans le groupe constitué par : SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO:26. Un autre mode de réalisation avantageux de l'invention concerne un anticorps monoclonal défini ci-dessus, dans lequel :
• chacune des chaînes légères comprend une séquence en acides aminés identique à une séquence choisie dans le groupe constitué par : SEQ ID NO: 15 et SEQ ID NO:25,
· chacune des chaînes lourdes comprend une séquence en acides aminés identique à une séquence choisie dans le groupe constitué par : SEQ ID NO: 16 et SEQ ID NO:26.
Un autre mode de réalisation de l'invention concerne un anticorps monoclonal dirigé contre la toxine tétanique, dans lequel :
• la région variable de la chaîne légère comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO: 13, et
• la région variable de la chaîne lourde comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO: 14.
Plus particulièrement, l'invention concerne un anticorps monoclonal tel que défini ci-dessus, dans lequel :
• la région variable de la chaîne légère comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO: 13, et
· la région variable de la chaîne lourde comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO: 14, et
• la région constante de la chaîne légère comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO:3, et
• la région constante de la chaîne lourde comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO:4.
Plus particulièrement encore, un mode de réalisation avantageux de l'invention concerne un anticorps monoclonal tel que défini ci-dessus, dans lequel : • la chaîne légère comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO: 15, et
• la chaîne lourde comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO:
16.
Cet anticorps monoclonal est l'anticorps désigné comme « Anticorps 4 », dans la partie « Exemples » de la présente demande de brevet.
Un autre mode de réalisation de l'invention concerne un anticorps monoclonal dirigé contre la toxine tétanique, dans lequel :
· la région variable de la chaîne légère comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO: 23, et
• la région variable de la chaîne lourde comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO: 24. Plus particulièrement, un mode de réalisation avantageux de l'invention concerne un anticorps monoclonal tel que défini ci-dessus, dans lequel :
• la région variable de la chaîne légère comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO: 23, et
• la région variable de la chaîne lourde comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO: 24, et
• la région constante de la chaîne légère comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO:3, et
• la région constante de la chaîne lourde comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO:4.
Plus particulièrement encore, un mode de réalisation avantageux de l'invention concerne un anticorps monoclonal tel que défini ci-dessus, dans lequel :
• la chaîne légère comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO:
25, et
· la chaîne lourde comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO:
26.
Cet anticorps monoclonal est l'anticorps désigné comme « Anticorps 5 » dans la partie « Exemples » de la présente demande de brevet. L'invention concerne également un anticorps monoclonal dirigé contre la toxine tétanique tel que défini ci-dessus, dans lequel :
• la chaîne légère dudit anticorps monoclonal comprend la région leader de la région variable d'une chaîne légère d'une immunoglobuline humaine (LVn choisi parmi les séquences suivantes, SEQ ID NO:73,74,75 et 76),
• la chaîne lourde dudit anticorps monoclonal comprend la région leader de la région variable d'une chaîne lourde d'une immunoglobuline humaine (LVHI choisi parmi les séquences suivantes, SEQ ID NO:77, 78, 79 et 80.
Un autre mode de réalisation avantageux de l'invention concerne un anticorps monoclonal dirigé contre la toxine tétanique tel que défini précédemment, dans lequel :
• la région variable de la chaîne légère comprend, dans sa région N-terminale, une séquence signal, notamment la région leader de la région variable de la chaîne légère d'une seconde immunoglobuline, en particulier humaine, et
• la région variable de la chaîne lourde comprend, dans sa région N-terminale, une séquence signal, notamment la région leader de la région variable de la chaîne lourde d'une troisième immunoglobuline, en particulier humaine, la seconde et la troisième immunoglobuline étant identiques ou différentes.
Comme mentionné précédemment la région leader, ou peptide signal, qui se trouve dans la région N-terminale de la région variable de la chaîne légère et de la chaîne lourde correspond à une séquence protéique de sécrétion. Au cours de la synthèse protéique de la chaîne légère et de la chaîne lourde, ladite séquence leader signifie que la protéine en cours de synthèse doit rester dans la lumière du réticulum endoplasmique rugueux (RER). Cette séquence est ensuite éliminée de la chaîne légère mature et de la chaîne lourde mature, de telle sorte que l'anticorps monoclonal mature capable d'interagir avec la toxine tétanique ne possède plus cette séquence.
Dans un autre mode de réalisation préféré, l'invention concerne un précurseur de l'anticorps monoclonal dirigé contre la toxine tétanique, tel que précédemment décrit, dans lequel :
• la chaîne légère comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO: 17, et • la chaîne lourde comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO: 18.
Dans un autre mode de réalisation préféré, l'invention concerne un précurseur de l'anticorps monoclonal dirigé contre la toxine tétanique, tel que précédemment décrit, dans lequel :
• la chaîne légère comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO: 27, et
• la chaîne lourde comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO: 28.
L'invention concerne également un fragment de l'anticorps monoclonal tel que défini ci- dessus, ledit fragment étant un fragment Fab ou F(ab)'2 ou scFv. L'invention concerne également un anticorps monoclonal ou fragment d'anticorps, tels que définis précédemment caractérisés en ce qu'ils sont capables de neutraliser l'activité biologique de la toxine tétanique in vitro et/ou in vivo.
Les Inventeurs ont montré que l'anticorps monoclonal humain selon l'invention est capable d'inhiber efficacement la toxine tétanique, à une faible dose d'anticorps.
Un mode de réalisation avantageux de l'invention concerne un anticorps monoclonal tel que défini précédemment, capable de neutraliser la toxine tétanique, et notamment présentant un taux de neutralisation de la toxine tétanique d'au moins 40%, 50%, 60%, 70% et préférentiellement d'au moins 80%. « Les anticorps monoclonaux de l'invention sont capables de neutraliser la toxine tétanique » signifie que les anticorps monoclonaux selon l'invention sont capables d'empêcher l'action de la toxine tétanique, c'est à dire d'inhiber l'effet toxique de la toxine tétanique sur le blocage de la libération des neurotransmetteurs GABA et glycine. Cette inhibition peut être due à une séquestration de la toxine tétanique, ou bien à un masquage du ou des domaines de la toxine tétanique responsable de son effet toxique. L'activité de neutralisation des anticorps peut être mesurée à l'aide de différents tests de routine couramment utilisés par l'homme de métier. Parmi ceux-ci, le test de neutralisation basé sur la mesure de la capacité qu'ont les anticorps de l'invention à inhiber la fixation de la toxine sur les cellules PC 12 ou SK-N-SH J774A mises en contact avec de la toxine tétanique.
L'invention a également pour objet un acide nucléique comprenant une séquence codant la chaîne légère de l'anticorps monoclonal défini précédemment, notamment comprenant la séquence SEQ ID NO: 19 ou SEQ ID NO:21 ou SEQ ID NO:29 ou SEQ ID NO:31.
Ainsi, les séquences d'acides nucléiques sont telles que :
la séquence SEQ ID NO: 19 code pour la protéine SEQ ID NO: 17,
la séquence SEQ ID NO:20 code pour la protéine SEQ ID NO: 18,
la séquence SEQ ID NO:21 code pour la protéine SEQ ID NO: 15,
la séquence SEQ ID NO:22 code pour la protéine SEQ ID NO: 16,
la séquence SEQ ID NO:29 code pour la protéine SEQ ID NO:27,
la séquence SEQ ID NO:30 code pour la protéine SEQ ID NO:28,
la séquence SEQ ID NO:31 code pour la protéine SEQ ID NO:25, et
la séquence SEQ ID NO:32 code pour la protéine SEQ ID NO:26.
L'invention a également pour objet un acide nucléique comprenant une séquence codant la chaîne légère de l'anticorps monoclonal défini précédemment, notamment une séquence identique à SEQ ID NO: 19 ou 21 ou 29 ou 31.
L'invention a également pour objet un acide nucléique comprenant une séquence codant la chaîne lourde de l'anticorps monoclonal défini précédemment, notamment une séquence identique à SEQ ID NO: 20 ou 22 ou 30 ou 32.
Un autre mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention concerne un acide nucléique tel que défini précédemment, comprenant :
· un acide nucléique codant la chaîne légère de l'anticorps monoclonal défini ci- dessus et comprenant une séquence identique à SEQ ID NO: 19 ou à SEQ ID NO:21 , et/ou
• un acide nucléique codant la chaîne lourde de l'anticorps monoclonal défini ci- dessus et comprenant une séquence identique à SEQ ID NO:20 ou à SEQ ID NO:22.
Un autre mode de réalisation avantageux de l'invention concerne un acide nucléique tel que défini précédemment, comprenant : • un acide nucléique codant la chaîne légère de l'anticorps monoclonal défini ci- dessus et comprenant une séquence identique à SEQ ID NO:29 ou à SEQ ID NO:31 , et/ou
• un acide nucléique codant la chaîne lourde de l'anticorps monoclonal défini ci- dessus et comprenant une séquence identique à SEQ ID NO:30 ou à SEQ ID
NO:32.
Dans un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne un acide nucléique comprenant une séquence codant la chaîne légère de l'anticorps monoclonal défini ci-dessus et comprenant une séquence codant la chaîne lourde de l'anticorps monoclonal défini ci-dessus. En d'autres termes, la séquence susmentionnée comprend, dans la même molécule, ou plus particulièrement sur le même brin, une séquence codant la chaîne légère de l'anticorps monoclonal défini ci-dessus suivie d'une séquence codant la chaîne lourde de l'anticorps monoclonal défini ci-dessus. Cela signifie également que la séquence susmentionnée comprend, dans la même molécule, une séquence codant la chaîne lourde de l'anticorps monoclonal défini ci-dessus suivie d'une séquence codant la chaîne légère de l'anticorps monoclonal défini ci-dessus.
L'invention concerne aussi un vecteur d'expression comprenant au moins un acide nucléique défini précédemment, ledit acide nucléique étant sous contrôle des éléments permettant son expression.
Par « vecteur d'expression », il est défini dans l'invention une molécule d'ADN qui possède des éléments permettant sa réplication (duplication) dans au moins un organisme vivant. Ces éléments permettant la réplication sont notamment des origines de réplication de levure ou de bactéries, ou encore des éléments de contrôle de la réplication d'un virus. Les vecteurs selon l'invention sont notamment des plasmides, des phages, des chromosomes artificiels de levure (YAC), des chromosomes artificiels de bactéries (BAC), les génomes modifiés de virus réplicatifs ou de virus intégratifs ...
Ces vecteurs sont dits « d'expression » car ils disposent de séquences nucléotidiques qui permettent l'expression, c'est-à-dire la transcription en ARN, des séquences nucléotidiques qu'elles contrôlent.
Dans l'invention, ladite séquence d'acide nucléique contenue dans ledit vecteur est placée « sous contrôle des éléments permettant son expression ». Cela signifie que ledit vecteur d'expression possède au moins une séquence d'initiation de la transcription tel qu'un promoteur d'un virus comme le promoteur précoce du virus simien SV40, ou du Cytomégalovirus (CMV) ou encore les séquences promotrices du virus du sarcome de Rous (RSV), et notamment une séquence ou promoteur comprenant une boite TATAA. De plus, ledit vecteur possède également au moins une séquence de terminaison de la transcription, et en particulier une séquence de polyadénylation issues d'un gène de mammifère, notamment humain.
A ces séquences indispensables pour l'expression de la séquence nucléotidique contenue dans ledit vecteur peuvent s'ajouter d'autres séquences permettant de réguler ou de moduler l'expression de la dite séquence. Une liste non exhaustive comprend : des introns de gènes de mammifères, et notamment humains, des séquences de régulation de transcription de type amplificateur (« enhancers ») ou encore des séquences transcrites mais non traduites de gènes de mammifères, et notamment humains. Un autre mode de réalisation avantageux de l'invention concerne un ensemble comprenant deux vecteurs d'expression,
le premier vecteur d'expression comprenant un acide nucléique comprenant une séquence choisie parmi les acides nucléiques SEQ ID NO: 19 et 29
et
le second vecteur d'expression comprenant un acide nucléique comprenant une séquence choisie parmi les acides nucléiques SEQ ID NO: 20 et 30
Les premiers et seconds vecteurs d'expression sont représentés dans les figures 1 à 8. Un autre mode réalisation avantageux de l'invention concerne un vecteur d'expression susmentionné, comprenant
• un premier acide nucléique choisi parmi les acides nucléiques de séquences suivantes : SEQ ID NO: 19, 29, ledit premier acide nucléique étant sous contrôle des éléments permettant son expression, et
· un second acide nucléique choisi parmi les acides nucléiques de séquences suivantes : SEQ ID NO: 20, 30, ledit second acide nucléique étant sous contrôle des éléments permettant son expression. Un mode de réalisation avantageux concerne un vecteur tel que défini ci-dessus comprenant
• un premier acide nucléique SEQ ID NO: 19, sous contrôle des éléments permettant son expression, et
• un second acide nucléique SEQ ID NO: 20, sous contrôle des éléments permettant son expression
Un mode de réalisation avantageux concerne un vecteur tel que défini ci-dessus comprenant
• un premier acide nucléique SEQ ID NO: 29, sous contrôle des éléments permettant son expression, et
• un second acide nucléique SEQ ID NO: 30, sous contrôle des éléments permettant son expression Un autre mode réalisation avantageux de l'invention concerne un vecteur d'expression susmentionné, comprenant
• un premier acide nucléique choisi parmi les acides nucléiques de séquences suivantes : SEQ ID NO: 21, 31, ledit premier acide nucléique étant sous contrôle des éléments permettant son expression, et
· un second acide nucléique choisi parmi les acides nucléiques de séquences suivantes : SEQ ID NO: 22, 32, ledit second acide nucléique étant sous contrôle des éléments permettant son expression.
Un autre mode réalisation avantageux de l'invention concerne un vecteur d'expression susmentionné, comprenant
• un premier acide nucléique de séquence suivante : SEQ ID NO: 21, sous contrôle des éléments permettant son expression, et
• un second acide nucléique de séquence: SEQ ID NO: 22, sous contrôle des éléments permettant son expression.
Un autre mode réalisation avantageux de l'invention concerne un vecteur d'expression susmentionné, comprenant
• un premier acide nucléique de séquence suivante : SEQ ID NO: 31, sous contrôle des éléments permettant son expression, et • un second acide nucléique de séquence: SEQ ID NO: 32, sous contrôle des éléments permettant son expression.
Ce vecteur d'expression comporte donc deux séquences d'acides nucléiques telles que mentionnées, et plus particulièrement une séquence d'acide nucléique codant la chaîne légère de l'anticorps monoclonal défini ci-dessus, et une séquence d'acide nucléique codant la chaîne lourde de l'anticorps monoclonal défini ci-dessus.
Préférentiellement, ledit vecteur d'expression contient un premier élément permettant l'expression de la séquence d'acide nucléique codant la chaîne légère de l'anticorps monoclonal défini ci-dessus et un second élément permettant l'expression de la séquence d'acide nucléique codant la chaîne lourde de l'anticorps monoclonal défini ci-dessus, ledit premier et ledit second élément permettant l'expression desdites séquences d'acides nucléiques étant identiques ou différents, et préférentiellement identiques. Ces éléments de contrôle sont notamment les séquences terminales longues répétées (LTR) du virus RSV, ou des promoteurs CMV.
Un autre mode de réalisation de l'invention concerne un vecteur d'expression défini ci- dessus, comprenant au moins un gène de résistance à un antibiotique.
Par « au moins un gène de résistance » on entend dans l'invention que ledit vecteur d'expression peut contenir 1 ou 2, ou 3 ou 4 ou 5 ou 6 gènes de résistance à un antibiotique.
Par « gène de résistance à un antibiotique », on définit dans l'invention un gène dont le produit d'expression exerce un effet cytostatique (inhibition de la croissance) ou cytolytique (mort cellulaire) de cellules. Les antibiotiques concernés par l'invention ont notamment un effet sur les cellules procaryotes, mais peuvent également avoir un effet sur les cellules eucaryotes, qu'il s'agisse de levures, de plantes, d'insectes, d'amphibiens ou de mammifères.
Plus particulièrement, le vecteur d'expression susmentionné possède un gène de résistance à un antibiotique spécifique des cellules procaryotes et au moins un gène, préférentiellement 2 gènes, de résistance à un antibiotique spécifique des cellules eucaryotes.
On peut citer comme antibiotiques spécifiques des cellules procaryotes : F Ampicilline, la Tétracycline et ses dérives, l'Hygromycine, la Kanamycine... On peut citer comme antibiotiques spécifiques des cellules eucaryotes : le G418, la Généticine (sels de G418), la Puromycine, le Méthotrexate, la Blasticidine...
L'invention a également pour objet une cellule, ou plusieurs cellules, ou une lignée cellulaire comprenant au moins un vecteur d'expression tel que défini précédemment.
Les cellules « comprenant au moins un vecteur » correspondent à des cellules dans lesquelles au moins un vecteur d'expression susmentionné a été introduit.
L'homme de métier connaît parfaitement les techniques de biologie moléculaire permettant d'introduire à l'intérieur d'une cellule une séquence d'ADN ou un vecteur d'expression, et notamment en se référant par exemple à [Sambrook, J et al. in Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, Vol. 1, 2, 3 (1989)]. Il sera communément utilisé par la suite le terme de « transfection » pour designer l'action d'introduire un acide nucléique dans une cellule.
On peut citer par exemple, les techniques de transfection au phosphate de calcium, par utilisation de particules lipidiques ou « lipofectants », ou encore par des techniques permettant de générer des trous dans la membrane cellulaire au moyen d'un choc électrique (électroporation). Cette liste n'a pas de caractère exhaustif.
Les cellules ou lignes cellulaires utilisées dans l'invention sont des cellules issues de procaryotes ou d' eucaryotes tels que les bactéries, les levures ou autres champignons, les cellules d'insectes, les cellules d'amphibiens, les cellules de mammifères et notamment de rongeurs, les cellules humaines...
On distinguera plutôt la cellule de la lignée cellulaire par le fait que la lignée cellulaire est une population cellulaire en culture établie, c'est-à-dire qu'elle a acquis des caractéristiques permettant leur prolifération in vitro, et notamment une caractéristique d'immortalisation.
Un mode de réalisation particulier de l'invention concerne une cellule ou une lignée cellulaire précédemment citée, présentant une activité de fucosylation substantiellement réduite par rapport à une cellule normale, ladite cellule ou lignée cellulaire étant notamment une cellule de mammifère, et en particulier la lignée YB2/0, disponible à l'ATCC sous le numéro n° CRL 1662. Dans un autre mode de réalisation, l'invention concerne une lignée cellulaire choisie parmi la lignée HEK ou la lignée CHO, exprimant l'anticorps monoclonal tel que défini ci-dessus. Dans un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne une cellule ou une lignée cellulaire comprenant un vecteur d'expression défini ci-dessus, permettant l'expression
• d'un anticorps monoclonal précédemment défini,
• ou d'une chaîne légère d'un anticorps monoclonal telle que définie précédemment,
• ou d'une chaîne lourde d'un anticorps monoclonal telle que définie précédemment.
Dans un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne une cellule ou une lignée cellulaire obtenue par le clonage d'une cellule susmentionnée. Les technique de clonage cellulaire sont largement connues de l'homme de métier, et reposent sur le principe d'isolement des cellules d'une population cellulaire afin que chaque cellule individuelle donne naissance à des cellules filles (ou clone) isolées des cellules filles issues de la division des autres cellules de la population. Le principe général du clonage cellulaire est la dilution limite des cellules.
Un autre aspect de l'invention concerne une composition pharmaceutique, et notamment vaccinale, contenant au moins un anticorps dirigé contre la toxine tétanique selon l'invention, un fragment d'anticorps selon l'invention, un acide nucléique selon l'invention, un vecteur selon l'invention ou une cellule hôte selon l'invention, pour le traitement ou la prévention d'une pathologie associée à la contamination par la toxine tétanique.
Un mode de réalisation avantageux concerne une composition définie précédemment comprenant :
- un anticorps choisi parmi l'anticorps 4 ou 5 tels que définis dans l'invention, ou
- une combinaison de deux anticorps susmentionnés, ladite composition ladite composition étant, anticorps 4+ anticorps 5. Un mode de réalisation avantageux concerne une composition définie précédemment comprenant :
- un anticorps choisi parmi l'anticorps 4 ou 5 tels que définis dans l'invention, ou
- une combinaison des deux anticorps susmentionnés, comprenant l'anticorps 4 et l'anticorps 5 tels que définis dans l'invention.
Les Inventeurs ont montré que l'anticorps 4 et l'anticorps 5 ne rentrent pas en compétition car les deux anticorps reconnaissent des épitopes distincts sur le fragment C de la toxine tétanique.
L'invention concerne également une composition définie précédemment comprenant :
- un anticorps choisi parmi l'anticorps 4 ou 5 tels que définis dans l'invention, ou
- une combinaison des deux anticorps susmentionnés, comprenant l'anticorps 4 et l'anticorps 5 tels que définis dans l'invention,
en association avec une ou plusieurs autres molécules possédant une activité thérapeutique, notamment un ou plusieurs antibiotiques.
La composition susmentionnée peut bien entendu comprendre un véhicule pharmaceutiquement acceptable, facilement déterminable par l'homme de métier.
Avantageusement, l'invention concerne une composition pharmaceutique, et notamment vaccinale, comprenant au moins un anticorps monoclonal défini ci-dessus, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Le dosage de la substance active dépend particulièrement du mode d'administration, et est aisément déterminé par l'homme de métier.
« Un véhicule pharmaceutiquement acceptable » réfère à un matériel non toxique qui est compatible avec un système biologique tel qu'une cellule, une culture cellulaire, un tissu ou un organisme.
Une quantité thérapeutiquement efficace peut varier entre 0.01 mg/kg et 50 mg/kg, préférablement entre 0.1 mg/kg et 20 mg/kg, et plus préférablement entre 0.1 mg/kg et 2 mg/kg, en une ou plusieurs administrations quotidiennes, pendant un ou plusieurs jours. La composition pharmaceutique de l'invention peut être administrée notamment par voie intraveineuse, notamment par injection ou par perfusion graduelle, par voie sous-cutanée, par voie locale au moyen d'infiltrations, per os. Les préparations pour une administration parentérale peuvent inclure des solutions aqueuses ou non-aqueuses stériles, des suspensions ou des émulsions. Des exemples de solvants non-aqueux sont le propylène glycol, le polyéthylène glycol, des huiles végétales, telle que l'huile d'olive, ou des esters organiques injectables tels que l'éthyloléate. Des véhicules aqueux comprennent l'eau, des solutions alcool/eau, des émulsions ou des suspensions.
L'invention concerne également l'utilisation d'au moins un anticorps dirigé contre la toxine tétanique selon l'invention, un fragment d'anticorps selon l'invention, un acide nucléique selon l'invention, un vecteur selon l'invention ou une cellule hôte selon l'invention, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement ou à la prévention d'une pathologie associée à la contamination par la toxine tétanique.
Par traitement, on entend le moyen de soigner une pathologie déclarée, dont les symptômes sont visibles. Par prévention, on entend le moyen d'empêcher ladite pathologie de se déclarer.
Les pathologies associées à la toxine tétanique correspondent aux symptômes liés à la contamination par la toxine tétanique, et notamment une augmentation du tonus musculaire et des spasmes généralisés, trismus, dysphagie, raideur, douleurs musculaires pouvant aller jusqu'à hyperlordose, rigidité de l'abdomen, troubles cardiaques... L'invention a également pour objet une méthode de dosage in vitro de la toxine tétanique dans un échantillon biologique issu d'un individu susceptible d'être contaminé par la toxine tétanique, ladite méthode comprenant :
• la mise en contact dudit échantillon avec au moins un anticorps monoclonal défini précédemment, et
· la détermination de la présence ou l'absence de toxine tétanique dans ledit échantillon par la détection de la formation d'un éventuel complexe immun entre la toxine tétanique et ledit anticorps monoclonal. Les anticorps monoclonaux de l'invention peuvent donc être utilisés pour détecter la présence de toxine tétanique dans un échantillon biologique.
Notamment, lesdits anticorps peuvent être utilisés pour la mise en œuvre de techniques de détection connues de l'homme de métier comme des ELISA, des RIE, des RIA,_de l'immunoprécipitation ou de l'immuno marquage (Western blot, immunohistologie).
L'invention concerne aussi un procédé de décontamination in vitro d'un échantillon susceptible d'être contaminé par la toxine tétanique, notamment d'un échantillon biologique, comprenant :
· la mise en contact dudit échantillon avec au moins un anticorps monoclonal défini précédemment, et
• l'élimination, dudit échantillon, des complexes immuns formés entre la toxine tétanique et ledit anticorps monoclonal.
Un moyen de mettre en œuvre ledit procédé de décontamination consiste, par exemple, en l'utilisation des anticorps monoclonaux de l'invention sur lesquels sont greffés des billes magnétiques sur la région constante dudit anticorps.
Une fois lesdits anticorps couplés à des billes magnétiques mises en contact avec l'échantillon à décontaminer, la toxine tétanique est éliminée de l'échantillon en captant les anticorps selon l'invention au moyen d'un aimant.
Un autre moyen de mettre en œuvre ledit procédé de décontamination consiste, par exemple, en l'utilisation des anticorps monoclonaux immobilisé sur une colonne comportant de la protéine A ou G de Staphylococcus aureus. L'échantillon a décontaminé est alors passé au travers de la colonne afin de retenir, sur les anticorps selon l'invention immobilisé, la toxine tétanique susceptible d'être contenue dans ledit échantillon.
L'invention sera mieux illustrée par les figures suivantes et les exemples ci-après.
A titre d'exemples comparatifs, la description divulgue
a - un anticorps monoclonal tel que défini ci-dessus, dans lequel :
• la chaîne légère comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO:
5, et
• la chaîne lourde comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO:
6,
cet anticorps monoclonal est l'anticorps désigné comme « Anticorps 3, et b- un anticorps monoclonal tel que défini ci-dessus, dans lequel :
• la chaîne légère comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO:
35, et
• la chaîne lourde comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO:
36,
cet anticorps monoclonal est l'anticorps désigné comme « Anticorps 6 ». LEGENDE DES FIGURES
La présente invention est illustrée par les figures 1 à 8.
La figure 1 est une représentation schématique du vecteur permettant l'expression de la chaîne légère de l'anticorps n°3.
La figure 2 est une représentation schématique du vecteur permettant l'expression de la chaîne lourde de l'anticorps n°3.
La présente invention est illustrée par les figures 1 à 8.
La figure 3 est une représentation schématique du vecteur permettant l'expression de la chaîne légère de l'anticorps n°4.
La figure 4 est une représentation schématique du vecteur permettant l'expression de la chaîne lourde de l'anticorps n°4.
La présente invention est illustrée par les figures 1 à 8.
La figure 5 est une représentation schématique du vecteur permettant l'expression de la chaîne légère de l'anticorps n°5.
La figure 6 est une représentation schématique du vecteur permettant l'expression de la chaîne lourde de l'anticorps n°5.
La présente invention est illustrée par les figures 1 à 8.
La figure 7 est une représentation schématique du vecteur permettant l'expression de la chaîne légère de l'anticorps n°6.
La figure 8 est une représentation schématique du vecteur permettant l'expression de la chaîne lourde de l'anticorps n°6. La figure 9 montre un graphique représentant l'interaction des anticorps 3 (carrés blancs), anticorps 4 (triangles noirs), anticorps 5 (losanges noirs), anticorps 6 (rond blancs) et immunoglobulines non relevantes (ligne brisée). L'axe de Y représente l'absorbance mesurée à 492nm et l'axe des X représente la concentration en anatoxine exprimée en ng/mL.
La figure 10 représente le sensorgramme de l'anticorps 4.
La figure 11 représente le sensorgramme de l'anticorps 5.
La figure 12 représente le test de compétition entre l'anticorps 4 (colonnes blanches) ou l'anticorps 5 (colonnes noires) avec Gammatétanos®
Les pistes 1) représentent respectivement : pour les colonnes blanches : l'anticorps 4, et pour les colonnes noires : l'anticorps 5.
Pour chaque colonne (noires ou blanches) :
- la piste 2) représente le tampon, sans anticorps
- la piste 3) représente la compétition avec Gammatétanos® à une concentration de 2000 mU/mL,
- la piste 4) représente la compétition avec Gammatétanos®à une concentration de 666 mU/mL,
- la piste 5) représente la compétition avec Gammatétanos®à une concentration de 222 mU/mL,
- la piste 6) représente la compétition avec Gammatétanos® à une concentration de 74 mU/mL,
- la piste 7) représente la compétition avec Gammatétanos®à une concentration de 24,7 mU/mL,
- la piste 8) représente la compétition avec Gammatétanos®à une concentration de 8,2 mU/mL,
- la piste 9) représente la compétition avec Gammatétanos®à une concentration de 2,7 mU/mL,
- la piste 10) représente la compétition avec Gammatétanos®à une concentration de 0,9 mU/mL,
L'axe des Y représente l'absorbance à 450 nm. La figure 13 montre des courbes représentant le pourcentage d'inhibition de liaison de l'anticorps 4 (losanges) ou l'anticorps 5 (carrés) avec la toxine tétanique, en fonction de la concentration en Gammatétanos®.
L'axe des Y représente le pourcentage d'inhibition, l'axe des X représente la concentration en Gammatétanos®en mU/mL.
La figure 14 représente le test de compétition entre l'anticorps 4 (colonnes blanches) ou l'anticorps 5 (colonnes noires) avec l'anticorps 4 (pistes 3 à 6) et l'anticorps 5 (pistes 7 à 10).
Les pistes 1) représentent respectivement : pour les colonnes blanches : l'anticorps 4, et pour les colonnes noires : l'anticorps 5.
Pour chaque colonne (noires ou blanches)
- la piste 2) représente le tampon, sans anticorps
- la piste 3) représente la compétition avec l'anticorps 4 (100 fois plus concentré que l'anticorps testé),
- la piste 4) représente la compétition avec l'anticorps 4 (20 fois plus concentré que l'anticorps testé),
- la piste 5) représente la compétition avec l'anticorps 4 (4 fois plus concentré que l'anticorps testé),
- la piste 6) représente la compétition avec l'anticorps 4 (0,8 fois plus concentré que l'anticorps testé),
- la piste 7) représente la compétition avec l'anticorps 5 (100 fois plus concentré que l'anticorps testé),
- la piste 8) représente la compétition avec l'anticorps 5 (20 fois plus concentré que l'anticorps testé),
- la piste 9) représente la compétition avec l'anticorps 5 (4 fois plus concentré que l'anticorps testé),
- la piste 10) représente la compétition avec l'anticorps 5 (0,8 fois plus concentré que l'anticorps testé),
L'axe des Y représente l'absorbance à 492 nm.
Les figures 15A-J correspondent à des schémas représentant l'abduction des doigts des pattes postérieures de souris. Les figures 5A-E représentent des schémas montrant l'abduction normale des doigts de la patte (contrôles ; pattes gauches)
La figure 15F représente un schéma montrant une paralysie maximale des doigts de la patte (Score 4 d'abduction ; patte droite).
La figure 15G représente un schéma montrant une paralysie élevée des doigts de la patte (Score 3 d'abduction ; patte droite).
La figure 15H représente un schéma montrant une de paralysie modérée des doigts de la patte (Score 2 d'abduction ; patte droite).
La figure 151 représente un schéma montrant une de paralysie faible des doigts de la patte (Score 1 d'abduction ; patte droite).
La figure 15J représente un schéma montrant l'absence de paralysie des doigts de la patte (Score 0 d'abduction patte droite).
EXEMPLES
Exemple 1 : Obtention de l'anticorps 3
A. Construction des vecteurs CH463-12 et CK463-11.
Les donneurs volontaires de sang sont vaccinés contre le tétanos et ont reçu une dernière injection lors des 10 à 25 jours précédant le don. On prélève chez ces patients immunisés 30 mL de sang total. Par centrifugation, on isole ensuite les cellules mononucléaires du sang (PBMC) et on congèle ces cellules dans un RPMI 1640 contenant 20 % de sérum de veau fœtal et 10% de diméthylsulfoxide.
1. Marquage des cellules en vue de l'analyse par cytométrie de flux et sélection des cellules d'intérêt
Les anticorps décrits dans l'invention sont produits sous forme recombinante dont les séquences codantes (ADNc) sont isolées de lymphocytes B humains produisant des immunoglobulines dirigées contre la toxine tétanique. Ces cellules B, contenues dans les PBMC purifiés de sang humain, sont elles mêmes purifiés (cell sorting) par un trieur de cellules couplé à un cytométre en flux en utilisant un anti-CD19 et le fragment C de la toxine marqué au FITC (Sigma ref T3819, souche Massachusetts D7) pour les identifier et les isoler.
Les cellules d'intérêt sont ainsi isolées et placées dans une plaque 96 puits contenant 6μί d'eau et 3μί de tampon de RT-PCR contenant de la transcriptase inverse concentrée 5 fois. La plaque est ensuite placée à -80°C.
2. Préparation de l'ADNc
Pour préparer l'ADNc, on chauffe pendant 1 minute à 65°C les cellules, puis on les place dans la glace. On ajoute aux cellules 6mL de mélange réactionnel composé de dithiotreitol ImM, désoxyribonucléoside triphosphate 0,lmM, inhibiteur de ribonucléase 40U, pd(N)6 et le superscript RT 25U. Les échantillons sont mis en incubation à 37°C pendant lh30. La réaction enzymatique est arrêtée par chauffage à 95°C pendant 3 minutes. 3. Amplification par PCR
L'amplification par des gènes VK et VH maturés codant les anticorps antitétaniques se fait par PCR "seminested". Cette dernière s'est faite en deux PCR à l'aide d'un Thermocycler DNA thermal cycler 9600 (PerkinElmer) en utilisant les couples d'amorces définis par Kuppers et al. EMBO J 12 4955-4967-1993:
La première PCR est réalisée en utilisant un mixe des 12 amorces V (SEQ ID NO : 43, 44, 45, 46, 47, 48, 55, 56, 59, 60, 61 et 65) et des amorces 3* externes (3*) JH et Jk (SEQ ID NO : 49, 50, 51 , 52, 53, 54, 66, 67, 68, 69, 70, 71 et 72) dans un même tube avec pour matrice le produit de RT-PCR dans 90μ1 de réaction finale contenant 50 mM KO; 10 mMTris-HCl, pH 8.4; 2.5 mM MgC12; 6 nM de chaque dATP, dCTP, dGTP,et dTTP; 7.5 pM de chaque amorce et 5 U de Taq polymerase High Fidelity (Roche Molecular Biochemicals).
Les amorces utilisées sont les suivantes :
SEQ ID N° 43 : 5 '-ACTAGTCGACCTCAGTGAAGGT <CT> TCCTGC AAGGC-3 '
VH1
SEQ ID N° 44 : 5 '-ACTAGTCGACGTCCTGCGCTGGTGAAA < GC > CCACAC-3*
VH2
SEQ ID N° 45 : 5'-ACTAGTCGACGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAG-3*
VH3
SEQ ID N° 46 : 5'-ACTAGTCGACCCTGTCCCTCACCTGC <AG > CTGTC-3*
VH4
Figure imgf000033_0001
La réaction de PCR est réalisée selon le protocole suivant : dénaturation : 1 min à 94°C
- dénaturation : 45 s à 94°C ] hybridation : 1 min à 59°C répétitions 35 fois
élongation : 1,5 min à 72 °C J
élongation : 10 min à 72 °C
La seconde PCR se fait de façon séparée pour chaque famille de VH et Vk dans un volume réactionnel de 20 μΐ. Un volume de Ιμΐ de la première PCR est réamplifié avec une amorce spécifique en 5' et l'ensemble des amorces 3'. Toutes les PCR contiennent 200 mM de chaque dNTP et 1U de Taq polyperase High Fidelity dans un tampon (50 mM KC1; 10 mMTris-HCl, pH8.4; 1.5 mM MgC12 pour amplifier VH or 2.5 mM MgC12 pour amplifier Vk 0.125mM de l'amorce 5' etO.125 mM du mélange d'amorces 3').
La réaction de PCR est réalisée selon le protocole suivant :
dénaturation : 1 min à 94°C
- dénaturation : 20 s à 94°C ]
hybridation : 30 s à 65°C répétitions 35 fois
élongation : 1 min à 72 °C J
- élongation : 10 min à 72 °C
4. Clonage des produits de PCR dans les vecteurs d'expression
L'amplicon 1 correspondant à la séquence codant la partie variable de la chaîne légère de l'immunoglobuline est introduit dans le vecteur « générique » CK463-11 contenant la séquence de la chaîne constante CK légère de l'IgGl du clone T125-A2 dirigé contre l'antigène Rhésus D. Une PCR sur le fragment variable utilisant des amorces spécifiques permet d'introduire respectivement en 5' une site Spel et une séquence de kozak tandis qu'en 3' le premier codon du premier acide aminé de la partie constante est introduit avec un site de restriction DralII.
L'amplicon 2 codant la partie variable de la chaîne lourde est introduit dans le vecteur « générique » CH463-12 contenant la séquence de la chaîne constante CH lourde de l'IgGl du clone T125-A2 dirigé contre l'antigène Rhésus D. Une PCR sur le fragment variable utilisant des amorces spécifiques permet d'introduire respectivement en 5' une site Nhel et une séquence de kozak tandis qu'en 3' les codons des 3 premiers acides aminés de la partie constante sont introduits avec un site de restriction Apal.
Exemple 2 : Expression transitoire des anticorps anti-tétanique dans CHO-K1 1. Co -transfection
Les cellules sont transfectées en utilisant comme agent de transfection de la lipofectamine 2000 (Invitrogen) et les vecteurs décrit ci-dessus. Les cellules CHO-K1 ont été ensemencées la veille de la transfection. 3 plaques 6 puits sont transfectées pour chaque anticorps.
2. Suivi de production: J+48; J+72
Le suivi de production est réalisé sur des pools d'aliquotes de chaque plaque 6 puits. 72 heures après transfection, les différentes fractions sont réunies en une seule, afin de réaliser le dosage d'un pool unique pour chaque anticorps par la technique ELISA à l'aide du Kit ELISA RD-Biotech (réf : RDB3257).
Figure imgf000035_0001
Exemple 3 : Tests d'interaction et d'affinité des anticorps monoclonaux humains dirigés contre la toxine tétanique
I- Méthodes
A) ELISA - Interaction
- Immobilisation sur plaque de microtitration 96 puits de l'anatoxine tétanique diluée à 5 μg/ml en tampon phosphate de sodium 50 mM, pH 7,2.
Incubation de 100 μΐ/puits 1 nuit à 4°C - Lavage par 5x 300 μΐ de PBS (Sigma, P-44) + Tween-20 0,1%. Cette étape de lavage est réalisée entre chaque étape.
- Saturation par incubation de 200 μΐ de PBS + BSA 1% par puits pendant 2 h à température ambiante.
Echantillons : Les anticorps, dilués en tampon de dilution (PBS + BSA 0.1 % + Tween- 20 0.1%o) à 1 μg/ml puis de ½ en ½ sur 7 points, sont déposés sous un volume de 100 μΐ par puits et incubés 2 h à température ambiante sous agitation douce. - Conjugué : Après lavage, les anticorps fixés à l'anatoxine sont détectés par un anticorps polyclonal de chèvre anti-IgG humaine marqué à la peroxydase (Jackson, 109-035-098) dilué au 1/2000 en tampon de dilution et incubé 90 min à température ambiante sous agitation.
- Révélation : par une solution d'orthophényl diamide (Sigma, P8287) à 0,5 mg/ml en tampon phosphate-citrate (sigma, P4922) pendant 10 min puis arrêt de la réaction par ajout de 100 μΙ ά'ΗΟ IN.
- Lecture à 492 nm
B) SPR - affinité
La mesure de l'affinité de l'anticorps anti toxine tétanique pour la toxine tétanique, a été mesurée par résonance plasmonique de surface au moyen d'un appareil BIAcore XI 00 (Biacore, Uppsala, Suède).
Immobilisation du fragment C de l'anatoxine tétanique (Sigma, T3694) sur puce Biacore CM5 en utilisant le kit de couplage aminé (Biacore)
• Activation : par le mélange NHS/EDCN-hydroxysuccinimide / Ethyl- diméthylaminopropyl carbodiimide) à 30 μΐ/min pendant 180 sec.
· Ligand : injection du fragment C, dilué à 20 μg/ml en tampon acétate de sodium mM, pH 4,5,. pendant 300 s à 10 μΐ/min.
• Inactivation : par la solution d'Ethanolamine-NaOH 1M, pH 8,5 à 30 μΐ/min pendant 180 sec. La cellule témoin (Fcl) est activée puis inactivée. Sur la cellule réactive (Fc2), la quantité de fragment C fixé donne un signal de 1442 RU.
- Les anticorps antitétaniques sont dilués en tampon HBS-EP (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0,005% surfactant 20, pH 7.4) de 1,65 à 6,6 nM. Les solutions d'anticorps sont injectées à 30 μΐ/min pendant 120 sec (phase d'association) puis le tampon HBS-EP seul est passé pendant 180 sec (phase de dissociation).
- Régénération par NaOH 50 mM à 30 μΐ/min pendant 30 sec.
II- Résultats
A) ELISA
Comme le montre la figure 9, seuls les anticorps Ac4 et Ac5 se fixent à l'anatoxine tétanique immobilisée sur plaque de microtitration. L'anticorps Ac3 ne reconnaît pas l'anatoxine tétanique et l'anticorps Ac6 présente une faible reconnaissance, inférieure à celle des IVIG.
B) SPR Les résultats de fixation sur le fragment C de l'anatoxine tétanique par la méthode
SPR (Biacore XI 00) confirme l'absence de reconnaissance des anticorps Ac3 et Ac6.
Les anticorps Ac4 et Ac5 se fixent de façon irréversible au ligand ; sur le sensorgramme, il n'y a pas de phase de dissociation. De plus, il est très difficile, voire impossible, de régénérer la surface après fixation d'un anticorps. Suite à ces observations, la méthode en 1 cycle a été choisie pour analyser les anticorps Ac4 et Ac5 (Figures 10 et 11).
Les sensorgrammes sont analysés par le logiciel BIAeval en utilisant le modèle cinétique 1 :2 , c'est-à-dire un seul site de reconnaissance sur le fragment C (ligand) et 2 sites de fixation sur l'anticorps (analyte). Ce modèle est celui qui 'fît' le mieux avec les résultats expérimentaux. Les constantes de cinétique mesurées et calculées sont regroupées dans le tableau suivant :
Figure imgf000038_0001
Ainsi, la comparaison des valeurs de KDi montre que l'anticorps Ac5 a une affinité pour le fragment C de la toxine tétanique supérieure à celle de l'anticorps Ac4. Ce résultat est en accord avec celui de Γ ELIS A qui montrait une meilleure fixation de l'Ac5 sur l'anatoxine tétanique entière.
D'autre part, les 2 valeurs de KD de l'anticorps Ac4 sont relativement proches alors que celles de l'anticorps Ac5 sont très différentes.
III- Conclusion
Sur les 4 anticorps analysés, seuls les anticorps selon l'invention Ac4 et Ac5, reconnaissent l'anatoxine tétanique et plus particulièrement le fragment C de la toxine.
La fixation des anticorps sur le fragment C de la toxine tétanique est soit forte, 34 nM pour Ac4 soit très forte, 0,16 nM pour Ac5 mais surtout très stable.
Exemple 4 : Tests de compétition des anticorps 4 et 5 pour la toxine tétanique.
Ces expériences ont pour but de mesurer l'inhibition de la fixation d'un anticorps monoclonal selon l'invention, marqué par la biotine, sur l'anatoxine tétanique. Cette inhibition est induite par la présence dans le mélange d'anticorps « froid » (anticorps monoclonal selon l'invention et gammatétanos®) en quantités croissantes (jusqu'à 100 fois la quantité d'anticorps marqué).
1) Méthodes
- Immobilisation sur plaque de microtitration 96 puits de l 'anatoxine tétanique diluée à 1 μg/ml en tampon phosphate de sodium 50 mM, pH 7,2.
Incubation de 100 μΐ/puits 1 nuit à 4°C
- Lavage par 5x 300 μΐ de PBS (Sigma, P-4417) + Tween-20 0,1%. Cette étape de lavage est réalisée entre chaque étape.
- Saturation par incubation de 200 μΐ de PBS + BSA 1% par puits pendant 2 h à température ambiante. a) Compétition avec Gammatétanos®
Préparation des solutions d'anticorps:
Les anticorps Ac4 et Ac5, marqués à la biotine, sont dilués en tampon de dilution (PBS + BSA 0.1% + Tween-20 0.1 %) à 0,5 μg/ml.
La préparation d'anticorps thérapeutique Gammatétanos® est diluée en tampon de dilution à 4 IU/ml puis de 1/3 en 1/3 sur 7 dilutions.
Les dilutions d'anticorps marqués sont mélangées, volume à volume, avec les dilutions de Gammatétanos® ou avec le tampon de dilution puis les mélanges sont déposés dans les puits de la plaque de microtitration coatée par l'anatoxine tétanique et incubés 2 h à température ambiante.
Détection : Les anticorps monoclonaux biotinylés fixés à l'anatoxine dans les puits de la plaque de microtitration sont détectés par une solution de Streptavidine-peroxydase diluée à 0,5 μg/ml. Après lavage, les puits sont révélés par une solution de TMB (Pierce, 34028). b- Compétition des anticorps selon l'invention entre eux
Préparation des solutions d'anticorps:
Les anticorps Ac4 et Ac5 marqués à la biotine , sont dilués en tampon de dilution (PBS + BSA 0.1% + Tween-20 0.1%) à 0,5 μg/ml.
Les anticorps monocloanux « froids » sont dilués en tampon de dilution à 50 μg/ml puis de 1/5 en 1/5 sur 3 dilutions.
Les dilutions d'anticorps marqués sont mélangées, volume à volume, avec les dilutions d'anticorps « froids » ou avec le tampon de dilution puis les mélanges sont déposés dans les puits de la plaque de microtitration coatée par l'anatoxine tétanique et incubés 2 h à température ambiante.
Détection : Les anticorps monoclonaux biotinylés fixés à l'anatoxine dans les puits de la plaque de microtitration sont détectés par une solution de Streptavidine-peroxydase diluée à 0,5 μg/ml. Après lavage, les puits sont révélés par une solution de TMB (Pierce, 34028).
2) Résultat
a) Compétition avec les immunglobulines Gammatétanos®. Les résultats sont présentés sur la figure 12.
On constate que des doses de 222mU/mL à 2000 mU/mL de Gammatétanos® sont capables de dissocier l'interaction entre l'anticorps 4 et la toxine tétanique (figure 12, colonnes blanches n°3 à 5) et entre l'anticorps 5 et la toxine tétanique (figure 12, colonnes noires n°3 à 5).
Ce résultat confirme indirectement la spécificité des anticorps 4 et 5 pour la toxine tétanique. Ce résultat montre aussi que les épitopes reconnus par les anticorps 4 et 5 le sont également par des anticorps présents dans la préparation thérapeutique. La figure 13 montre le pourcentage d'inhibition de la liaison entre l'anticorps 4 ou
5 et la toxine, en fonction de la concentration de Gammatétanos® ajouté. b) Compétition entre l'anticorps 4 et 5.
Les résultats sont présentés sur la figure 14.
On constate que des doses de 4x à lOOx d'anticorps 4 sont capables de dissocier l'interaction entre l'anticorps 4 et la toxine tétanique (figure 14, colonnes blanches n°3 à 5) , tandis que les mêmes doses d'anticorps 5 ne déplacent pas l'interaction (figure 14, colonnes blanches n°7 à 9). Réciproquement, constate que des doses de 4x à lOOx d'anticorps 5 sont capable de dissocier l'interaction entre l'anticorps 5 et la toxine tétanique (figure 12, colonnes noires n°7 à 9) , tandis que les mêmes doses d'anticorps 4 ne déplacent pas l'interaction (figure 14, colonnes noires n°3 à 5). Ce résultat confirme indirectement la spécificité des anticorps 4 et 5 pour la toxine tétanique.
Ces résultats montrent qu'il n'y a pas de compétition entre les anticorps 4 et 5 pour la toxine tétanique.
Exemple 5 : Test de la neutralisation in vitro de la toxine tétanique par les anticorps monoclonaux humains - test d'inhibition de la traduction protéique. On mesure la traduction d'une protéine marqueur, par exemple la traduction de la luciférase, dans un système de traduction in vitro acellulaire [Haie ML Pharmacol Toxicol 2001, 88(5):255-260].
Les anticorps monoclonaux sont déposés dans des plaques 96 puits dans du tampon phosphate salin (PBS) et de la toxine tétanique est ajoutée à une concentration finale de 4 mM. Du lysat de réticulocyte de lapin complémenté de RNAsin ®, des acides aminés et de l'ARN messager de la luciférase est alors ajouté dans chaque puits. La réaction est réalisée pendant lh30.
5 de la réaction sont alors prélevés et ajouté à 45 de tampon réactionnel permettant de détecter l'activité luciférase (Luciférase assay reagent, Promega, Inc.). La lumière émise (luminescence) est mesurée en compte par seconde (CPS) à l'aide d'un lecteur multiplaque Victor (PerkinElmer Wallac, Boston MA). Les données sont exprimées en pourcentage par rapport au contrôle (% contrôle= (CPS traité/ CPS contrôle) x 100)).
Dans les deux tests (Exemple 4 et Exemple 5), la comparaison entre la dose protectrice 50% du scFv (1 μg/ml) et celle de l'IgG (0,5 μg/ml) montre un net bénéfice de l'expression sous forme d'IgG. Exemple 6 : Test de la neutralisation in vivo de la toxine tétanique par l'anticorps monoclonal humain.
Afin de tester l'effet neutralisant de l'anticorps anti-toxine tétanique in vivo, des rats Fisher (Charles River Laboratories L'Arbresle, France) ont reçu une dose de 16 mg/kg en masse de toxine tétanique et 50 μg d'anticorps anti-toxine tétanique, après adaptation du protocole décrit par Ezzell et al. (Ezzell, et al. 1984. Infect. Immun. 45:761-767)
Les tests ont été réalisés en mesurant la viabilité des animaux en fonction des doses de toxine tétanique et d'anticorps anti-toxine tétanique injectés.
En contrôle, la viabilité des rats traités à la toxine tétanique seule (test positif) et des rats traités avec de l'anticorps anti-toxine tétanique seul (test négatif) a également été évaluée. Exemple 7 ; Action des anticorps anti-toxine tétanique selon l'invention sur l'effet bloquant de la toxine tétanique sur la transmission neuromusculaire in vivo par le test de l'abduction des doigts chez la souris.
Des Souris, Swiss- Webster pesant entre 20 et 25 g, sont anesthésiées par inhalation d'Isoflurane (AErrane®, Baxter S.A., Lessines, Belgique) avant d'être injectées avec une dose unique de toxine tétanique dans la patte postérieure gauche. Une solution de toxine en PBS 0,1 M, pH 6.5, et contenant 0.2% de gélatine est préparée à partir de la solution stock de toxine tétanique. Un volume de 40 μΐ, de cette solution sera injecté à travers la peau dans le muscle Extensor digitorum longus (EDL) de la patte postérieure gauche des souris, à l'aide d'une seringue stérile munie d'une aiguille 25G x 5/8. Un groupe de souris servant de témoin reçoit une injection de solution de PBS 0.1 M, pH 6.5 contenant 0.2% de gélatine.
Après l'injection intra musculaire de la toxine tétanique et une période d'attente d'environ 12 à 18 heures, la paralysie des souris est testée. Celles-ci sont suspendues par la queue et présentent dans des conditions normales une abduction des doigts de la patte. Suite à une injection de toxine tétanique, la paralysie se manifeste par une réduction de cette capacité d'abduction des doigts de la patte postérieure. Un score de 0 à 4 est utilisé pour l'évaluation de l'abduction des doigts (Figures 15 A-J). Le score 0 reflète l'absence de paralysie, alors que le score de 4 traduit la réduction maximale de l'abduction des doigts. La lecture se fait en double aveugle et d'autres paramètres seront quantifiés comme le temps nécessaire pour obtenir une paralysie maximale (score de 4), le temps de récupération maximale (score de 0) et pour la toxine tétanique, le temps d'apparition d'effets centraux.
Une fois qu'il y a eu apparition d'effets centraux, les souris sont sacrifiées par surdose d'inhalation d'isoflurane.
Les anticorps anti-toxine tétanique selon l'invention, administrés par voie intramusculaire ou par voie intrapéritonéale, montrent une inhibition de l'effet bloquant de la toxine tétanique par diminution du score relatif à l'abduction des doigts de la patte postérieure. Exemple 8 : Action des anticorps anti-toxine tétanique selon l'invention sur l'effet bloquant de la toxine tétanique sur des préparations neuromusculaires isolées de souris. L'efficacité de la toxine tétanique est testée in vitro sur des préparations neuro musculaires isolées de Souris en mesurant la contraction musculaire provoquée par la stimulation nerveuse.
Les Souris sont anesthésiées par inhalation d'Isoflurane (AErrane®, Baxter S.A., Lessines, Belgique) avant d'être sacrifiées par décapitation. L'hémi diaphragme gauche ou droit, ou le muscle Extensor digitorum longus (EDL) de Souris avec leurs nerfs moteurs respectifs sont rapidement isolés et prélevés, et montés dans des cuves d'expérimentation (2-4 ml volume) dont le fond est recouvert d'une silicone (Rhodorsil) et remplies d'une solution physiologique standard (Krebs-Ringer) contenant (en mM) : 145 NaCl, 5 KC1, 2 CaC12, 1 MgC12, 11 glucose et 5 N-2- hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid (HEPES) (pH 7,4), continuellement perfusée avec de l'oxygène.
Pour les enregistrements mécaniques de la force contractile au niveau de préparations neuro musculaires isolées (hémi diaphragme ou muscle EDL) de Souris, l'un des tendons de la préparation est relié par un fil résistant, via un micromanipulateur, à un transducteur de force isométrique (Grass Instruments West Warwick, RI, USA, modèle FT03), et l'autre tendon est fixé, par des micro-aiguilles, sur le silicone du fond de la cuve d'expérimentation. La stimulation du muscle est réalisée de façon indirecte, par l'intermédiaire du nerf moteur aspiré par une électrode de succion formée d'un tube de verre, étiré et poli à l'une de ses extrémités de manière à pouvoir aspirer le nerf sans le détériorer. Deux fils de platine sont fixés sur l'électrode, l'un enroulé à l'extérieur du tube, l'autre à l'intérieur, et connectés à l'unité d'isolement d'un stimulateur (Grass Instruments, modèle S-44).
Les contractions isométriques sont déclenchées par la stimulation du nerf moteur par des impulsions de 0,15 ms de durée, d'intensité supra maximale (3-8 V), et à des fréquences comprises entre 0,1 et 10 Hz. La tension basale est enregistrée, puis modifiée, de façon à obtenir la réponse maximale, par ajustement de l'étirement des sarcomères du muscle à sa longueur optimale. Cet étirement est obtenu à l'aide d'un micromanipulateur. Dans ces conditions, nous enregistrons la contraction isométrique car la tension basale est maintenue constante tout au long de l'expérience.
Les signaux détectés par le transducteur de force (force contractile exprimée en unités de force, Newtons) sont amplifiés, collectés et digitalisés à l'aide d'un ordinateur équipé d'un convertisseur analogue - numérique (Digidata-1322A, Axon Instruments, Union City, CA, USA.) afin d'être analysés à l'aide du programme WinWCP (V3.8, fourni par le Dr. John Dempster, University of Strathclyde, Strathclyde, Scotland) autorisant l'accès aux tracés. La toxine tétanique est ajoutée à des doses comprises entre 7,5 et 12 nM pour bloquer la contraction musculaire déclenchée par la stimulation nerveuse dans environ 120 minutes établie, nous calculerons le nombre de DL50 Souris impliqués dans cet effet.
Les anticorps selon l'invention sont ensuite ajoutés et montrent une inhibition de la contraction musculaire.

Claims

Revendications
1. Anticorps monoclonal dirigé contre la toxine tétanique, caractérisé en ce que ledit anticorps se lie à un fragment protéique de ladite toxine tétanique, ledit fragment protéique consistant en
- la séquence d'acides aminés SEQ ID N°63 ou
- toute séquence d'acides aminés consistant en une séquence d'acides aminés présentant une identité d'au moins 85%, et de préférence 90%, avec la séquence SEQ ID N°63.
2. Anticorps monoclonal selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un anticorps chimérique, humanisé ou humain.
3. Anticorps monoclonal selon l'une des revendications 1 à 2, caractérisé en ce qu'il présente une constante d'affinité pour la toxine tétanique au moins égale à lxl 08 M"1, préférentiellement au moins égale à lxlO9 M"1, plus particulièrement au moins égale à lxlO^ M"1.
4. Anticorps monoclonal selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, ledit anticorps se liant de manière irréversible auxdits fragments peptidiques.
5. Anticorps monoclonal selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que : la région constante de la chaîne légère de l'anticorps est essentiellement constituée par la région constante de la chaîne légère d'une immunoglobuline humaine IgGl, et/ou
la région constante de la chaîne lourde de l'anticorps est essentiellement constituée par la région constante de la chaîne lourde d'une immunoglobuline humaine IgGl .
6. Anticorps monoclonal selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que : la région variable de la chaîne légère comprend une séquence en acides aminés identique à une séquence choisie dans le groupe constitué par : SEQ ID NO: 13 et SEQ ID NO:23 , et la région variable de la chaîne lourde comprend une séquence en acides aminés identique à une séquence choisie dans le groupe constitué par : SEQ ID NO: 14 et SEQ ID NO:24 .
7. Anticorps monoclonal selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que :
• la région variable de la chaîne légère comprend une séquence en acides aminés identique à la séquence SEQ ID NO: 13, et
• la région variable de la chaîne lourde comprend une séquence en acides aminés identique à la séquence SEQ ID NO: 14.
8. Anticorps monoclonal selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que :
• la région variable de la chaîne légère comprend une séquence en acides aminés identique à la séquence SEQ ID NO:23, et
• la région variable de la chaîne lourde comprend une séquence en acides aminés identique à la séquence SEQ ID NO:24.
9. Anticorps monoclonal selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que : la chaîne légère de l'anticorps comprend une séquence en acides aminés choisie dans le groupe constitué par : SEQ ID NO: 17 et SEQ ID NO:27 et
la chaîne lourde comprend une séquence en acides aminés choisie dans le groupe constitué par : SEQ ID NO: 18 et SEQ ID NO:28 et .
10. Anticorps monoclonal selon la revendication 10, caractérisé en ce que :
la chaîne légère comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO: 17, et
la chaîne lourde comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO: 18.
11. Anticorps monoclonal selon la revendication 10, caractérisé en ce que :
la chaîne légère comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO:27, et
la chaîne lourde comprend une séquence en acides aminés identique à SEQ ID NO:28.
12. Fragment d'un anticorps monoclonal humain selon l'une des revendications 1 à
12, ledit fragment étant choisi dans le groupe constitué par : Fab, F(ab)'2 et scFv.
13. Anticorps monoclonal humain selon l'une des revendications 1 à 12, ou fragment d'anticorps selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il est capable de neutraliser l'activité biologique de la toxine tétanique, in vitro et/ou in vivo.
14. Acide nucléique comprenant une séquence codant pour un anticorps selon l'une des revendications 1 à 12 ou pour un fragment d'anticorps selon la revendication 13.
15. Acide nucléique comprenant une séquence codant pour un anticorps selon l'une des revendications 1 à 12 caractérisé en ce qu'il comprend une ou plusieurs séquences présentant une identité de séquence d'au moins 85%, de préférence 90% et plus préférentiellement 100% avec une séquence choisie parmi : SEQ ID NO°19, SEQ ID NO°29, SEQ ID NO°20 et SEQ ID NO°30.
16. Vecteur comprenant un acide nucléique selon l'une des revendications 15 ou 16.
17. Cellule hôte comprenant un acide nucléique selon l'une des revendications 15 ou 16 ou un vecteur selon la revendication 17.
18. Méthode de production d'un anticorps selon l'une des revendications 1 à 12 ou
13, ou d'un fragment d'anticorps selon la revendication 13, comprenant
- une étape de culture d'une cellule hôte telle que définie dans la revendication 18 et
- une étape d'isolement de l'anticorps ou du fragment d'anticorps exprimé.
19. Composition pharmaceutique comprenant, à titre de substance active, au moins
- un anticorps dirigé contre la toxine tétanique selon l'une des revendications 1 à 12 ou 14,
- un fragment d'anticorps selon la revendication 13 ou 14, ou
- ou un acide nucléique selon la revendication 15 ou 16, ou - un vecteur selon la revendication 17 ou
- une cellule hôte selon la revendication 18,
en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
20. Composition pharmaceutique selon la revendication 20, pour son utilisation dans le cadre du le traitement ou la prévention d'une pathologie associée à la contamination par la toxine tétanique.
21. Produit comprenant
a. un anticorps dirigé contre la toxine tétanique selon l'une des revendications 1 à 12 ou 14,
b. un fragment d'anticorps selon la revendication 13 ou 14, ou
c. ou un acide nucléique selon la revendication 15 ou 16, ou
d. un vecteur selon la revendication 17 ou
e. une cellule hôte selon la revendication 18,
pour le traitement ou la prévention d'une pathologie associée à la contamination par la toxine tétanique.
22. Procédé de dosage in vitro de la toxine tétanique dans un échantillon biologique issu d'un individu susceptible d'être contaminé par la toxine tétanique, comprenant les étapes suivantes :
a) mise en contact de l'échantillon avec au moins un anticorps monoclonal selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 ou 14, et
b) détermination de la présence ou de l'absence de la toxine tétanique dans l'échantillon par la détection de la formation d'un éventuel complexe immun entre la toxine tétanique et l'anticorps monoclonal.
23. Procédé de décontamination in vitro d'un échantillon susceptible d'être contaminé par la toxine tétanique, comprenant les étapes suivantes :
a) mise en contact de l'échantillon avec au moins un anticorps monoclonal selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 ou 14, et
b) élimination dans l'échantillon des complexes immuns formés entre la toxine tétanique et l'anticorps monoclonal.
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