KR20120098873A - Ｐｃｓｋ9 길항제 - Google Patents

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노파르티스 아게
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Abstract

본 개시내용은 전구단백질 컨버타제 서브틸리신/켁신 유형 9a ("PCSK9")에 대한 항체 길항제, 및 이러한 항체를 사용하는 방법을 제공한다.

Description

ＰＣＳＫ9 길항제 {PCSK9 ANTAGONISTS}
관련 특허 출원에 대한 상호 참조
본 발명은 2009년 12월 11일자로 출원된 US 가특허 출원 제61/285,942호 (이는 모든 목적을 위해 참조로 포함됨)에 대한 우선권의 이익을 청구한다.
발명의 분야
본 발명은 PCSK9에 대한 항체 길항제에 관한 것이다.
저밀도 지단백질 수용체 (LDL-R)는 혈류 중 저밀도 지단백질 (LDL)의 제거를 통해 아테롬성동맥경화증 및 고콜레스테롤혈증을 예방한다. LDL-R은 전구단백질 컨버타제 서브틸리신/켁신 유형 9a ("PCSK9")에 의해 번역후 수준에서 조절된다. 최근, 마우스에서 PCSK9의 녹아웃이 보고되었다. 이들 마우스는 혈장 콜레스테롤 수준에서 대략 50％의 감소를 보여주었고, 혈장 콜레스테롤을 감소시킴에 있어 스타틴에 대한 증진된 민감도를 보여주었다 (문헌 [Rashid S, et al. (2005) Proc Natl Acad Sci 102:5374-5379]). 인간 유전학 데이터는 또한 LDL 항상성에 있어 PCSK9의 역할을 뒷받침한다. 아마도 PCSK9에서의 "기능-상실" 돌연변이인 2개의 돌연변이가 최근 확인되었다. 이들 돌연변이를 갖는 개체는 LDL-C의 혈장 수준에서 대략 40％의 감소를 가지며, 이는 관상동맥 심장 질환에서의 대략 50-90％의 감소를 의미한다. 종합하면, 이들 연구는 PCSK9의 억제제가 LDL-C의 혈장 농도, 및 PCSK9에 의해 매개되는 다른 질환 상태를 저하시키는 데 유익할 것이고, 증가된 효능을 위해 예를 들어 콜레스테롤을 저하시키기에 유용한 제2 작용제와 공동-투여될 수 있다는 것을 나타낸다.
본 발명은 전구단백질 컨버타제 서브틸리신/켁신 유형 9 (PCSK9) (예를 들어, 서열 47)에 결합하여 그의 기능을 길항하는 항체, 및 예를 들어 PCSK9에 의해 매개되는 질환 상태를 치료하기 위해 이러한 항체를 사용하는 방법을 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 전구단백질 컨버타제 서브틸리신/켁신 유형 9 (PCSK9)에 결합하는 항체 및 항원 결합 분자를 제공한다. 일부 실시양태에서, 항체는:
a) 저밀도 지단백질 수용체 (LDLR)에 결합하는 PCSK9를 차단하지 않고,
b) LDLR의 PCSK9-매개 분해를 억제한다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 분자는 인간 PCSK9의 잔기 위치 680-692 내의 적어도 1개의 아미노산에 결합한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 분자는 아미노산 서열 RSRHLAQASQELQ (서열 49) 내의 PCSK9의 에피토프에 결합한다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 분자는 약 500 pM 이하의 평형 해리 상수 (KD)로 인간 PCSK9에 결합한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 분자는 약 400 pM, 300 pM, 250 pM, 200 pM, 190 pM, 180 pM, 170 pM, 160 pM, 150 pM, 140 pM, 또는 그 미만의 평형 해리 상수 (KD)로 인간 PCSK9에 결합한다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 분자는 적어도 약 7일의 생체내 반감기를 갖는다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 분자는 적어도 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10일의 생체내 반감기를 갖는다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 분자는 적어도 약 2주의, 예를 들어 2, 3, 4주의 또는 더 긴 생체내 콜레스테롤 저하 효과를 갖는다. 바람직하게는, 생체내 반감기는 인간 대상체에서 측정된다.
일부 실시양태에서, 항체는
(a) 인간 중쇄 V-절편, 중쇄 상보성 결정 영역 3 (CDR3) 및 중쇄 프레임워크 영역 4 (FR4)를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
(b) 인간 경쇄 V-절편, 경쇄 CDR3 및 경쇄 FR4를 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하고, 여기서
i) 중쇄 CDR3은 아미노산 서열 SYYYY(A/N)MD(A/F/S/V/Y) (서열 14)를 포함하고;
ii) 경쇄 CDR3 가변 영역은 아미노산 서열 LQWSSDPPT (서열 26)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체는
(a) 인간 중쇄 V-절편, 중쇄 상보성 결정 영역 3 (CDR3) 및 중쇄 프레임워크 영역 4 (FR4)를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
(b) 인간 경쇄 V-절편, 경쇄 CDR3 및 경쇄 FR4를 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하고, 여기서
i) 중쇄 CDR3은 아미노산 서열 SYYYYNMDY (서열 12)를 포함하고;
ii) 경쇄 CDR3 가변 영역은 아미노산 서열 LQWSSDPPT (서열 26)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체는
(a) 인간 중쇄 V-절편, 중쇄 상보성 결정 영역 3 (CDR3) 및 중쇄 프레임워크 영역 4 (FR4)를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
(b) 인간 경쇄 V-절편, 경쇄 CDR3 및 경쇄 FR4를 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하고, 여기서
i) 중쇄 CDR3은 아미노산 서열 SYYYYAMDY (서열 13)를 포함하고;
ii) 경쇄 CDR3 가변 영역은 아미노산 서열 LQWSSDPPT (서열 26)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 중쇄 CDR3은 서열 12 및 서열 13으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 CDR3은 서열 26의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 중쇄 V-절편은 서열 28에 대해 적어도 85％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％의 서열 동일성을 갖고, 여기서 경쇄 V-절편은 서열 31에 대해 적어도 85％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％의 서열 동일성을 갖는다.
일부 실시양태에서, 중쇄 V-절편은 서열 27에 대해 적어도 85％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％의 서열 동일성을 갖고, 여기서 경쇄 V-절편은 서열 29 및 서열 30으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 대해 적어도 85％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％의 서열 동일성을 갖는다.
일부 실시양태에서, 중쇄 FR4는 인간 배선(germline) FR4이다. 일부 실시양태에서, 중쇄 FR4는 서열 35이다.
일부 실시양태에서, 경쇄 FR4는 인간 배선 FR4이다. 일부 실시양태에서, 경쇄 FR4는 서열 39이다.
일부 실시양태에서, 중쇄 V-절편 및 경쇄 V-절편은 각각 상보성 결정 영역 1 (CDR1) 및 상보성 결정 영역 2 (CDR2)를 포함하고; 여기서
i) 중쇄 V-절편의 CDR1은 서열 8의 아미노산 서열을 포함하고;
ii) 중쇄 V-절편의 CDR2는 서열 11의 아미노산 서열을 포함하고;
iii) 경쇄 V-절편의 CDR1은 서열 22의 아미노산 서열을 포함하고;
iv) 경쇄 V-절편의 CDR2는 서열 25의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 중쇄 V-절편 및 경쇄 V-절편은 각각 상보성 결정 영역 1 (CDR1) 및 상보성 결정 영역 2 (CDR2)를 포함하고; 여기서
i) 중쇄 V-절편의 CDR1은 서열 7의 아미노산 서열을 포함하고;
ii) 중쇄 V-절편의 CDR2는 서열 10의 아미노산 서열을 포함하고;
iii) 경쇄 V-절편의 CDR1은 서열 21의 아미노산 서열을 포함하고;
iv) 경쇄 V-절편의 CDR2는 서열 24의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서,
i) 중쇄 V-절편의 CDR1은 서열 7을 포함하고;
ii) 중쇄 V-절편의 CDR2는 서열 10을 포함하고;
iii) 중쇄 CDR3은 서열 12 및 서열 13으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고;
iv) 경쇄 V-절편의 CDR1은 서열 21을 포함하고;
v) 경쇄 V-절편의 CDR2는 서열 24를 포함하고;
vi) 경쇄 CDR3은 서열 26을 포함한다.
일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열 40의 가변 영역에 대해 적어도 85％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％의 아미노산 서열 동일성을 갖고, 경쇄 가변 영역은 서열 41의 가변 영역에 대해 적어도 90％의 아미노산 서열 동일성을 갖는다.
일부 실시양태에서, 항체는 서열 40을 포함하는 중쇄 및 서열 41을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열 2 및 서열 4로 이루어진 군으로부터 선택된 가변 영역에 대해 적어도 85％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％의 아미노산 서열 동일성을 갖고, 경쇄 가변 영역은 서열 16 및 서열 18로 이루어진 군으로부터 선택된 가변 영역에 대해 적어도 85％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％의 아미노산 서열 동일성을 갖는다.
일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열 2 및 서열 4로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열 16 및 서열 18로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체는 IgG이다. 일부 실시양태에서, 항체는 IgG1이다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열 3 및 서열 5로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 대해 적어도 85％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％의 서열 동일성을 공유하는 중쇄를 갖는다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열 17 및 서열 19로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 대해 적어도 85％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％의 서열 동일성을 공유하는 경쇄를 갖는다.
일부 실시양태에서, 항체는 FAb' 단편이다. 일부 실시양태에서, 항체는 단일 쇄 항체 (scFv)이다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 IgG1 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간 IgG1 불변 영역은 세포 또는 보체의 C1 성분 상의 이펙터 리간드, 예컨대 Fc 수용체 (FcR), 예를 들어 Fc 감마 R1에 대해 감소된 결합 친화도를 갖도록 돌연변이된다. 예를 들어, 미국 특허 제5,624,821호를 참조한다. 일부 실시양태에서, IgG1 불변 영역의 아미노산 잔기 L234 및 L235는 Ala234 및 Ala235로 치환된다. 중쇄 불변 영역에서의 잔기의 넘버링은 EU 인덱스의 넘버링이다 (문헌 [Kabat, et al., (1983) "Sequences of Proteins of Immunological Interest," U.S. Dept. Health and Human Services] 참조).
일부 실시양태에서, 항체는 운반 단백질, 예를 들어 알부민에 연결된다.
일부 실시양태에서, 항체는 PEG화된다.
관련된 측면에서, 본 발명은, 각각 하기 3개의 상보성 결정 영역 (CDR): CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고; 여기서
i) 중쇄 가변 영역의 CDR1은 서열 8의 아미노산 서열을 포함하고;
ii) 중쇄 가변 영역의 CDR2는 서열 11의 아미노산 서열을 포함하고;
iii) 중쇄 가변 영역의 CDR3은 서열 14의 아미노산 서열을 포함하고;
iv) 경쇄 가변 영역의 CDR1은 서열 22의 아미노산 서열을 포함하고;
v) 경쇄 가변 영역의 CDR2는 서열 25의 아미노산 서열을 포함하고;
vi) 경쇄 가변 영역의 CDR3은 서열 26의 아미노산 서열을 포함하는 것인,
PCSK9에 결합하는 항체를 제공한다.
일부 실시양태에서,
i) 중쇄 가변 영역의 CDR1은 서열 6 및 서열 7로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고;
ii) 중쇄 가변 영역의 CDR2는 서열 9 및 서열 10으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고;
iii) 중쇄 가변 영역의 CDR3은 서열 12 및 서열 13으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고;
iv) 경쇄 가변 영역의 CDR1은 서열 20 및 서열 21로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고;
v) 경쇄 가변 영역의 CDR2는 서열 23 및 서열 24로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고;
vi) 경쇄 가변 영역의 CDR3은 서열 26의 아미노산 서열을 포함한다.
관련된 측면에서, 본 발명은, 각각 하기 3개의 상보성 결정 영역 (CDR): CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고; 여기서
i) 중쇄 가변 영역의 CDR1은 서열 6의 아미노산 서열을 포함하고;
ii) 중쇄 가변 영역의 CDR2는 서열 9의 아미노산 서열을 포함하고;
iii) 중쇄 가변 영역의 CDR3은 서열 13의 아미노산 서열을 포함하고;
iv) 경쇄 가변 영역의 CDR1은 서열 20의 아미노산 서열을 포함하고;
v) 경쇄 가변 영역의 CDR2는 서열 23의 아미노산 서열을 포함하고;
vi) 경쇄 가변 영역의 CDR3은 서열 26의 아미노산 서열을 포함하는 것인,
PCSK9에 결합하는 항체를 제공한다.
관련된 측면에서, 본 발명은, 각각 하기 3개의 상보성 결정 영역 (CDR): CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고; 여기서
i) 중쇄 가변 영역의 CDR1은 서열 7의 아미노산 서열을 포함하고;
ii) 중쇄 가변 영역의 CDR2는 서열 10의 아미노산 서열을 포함하고;
iii) 중쇄 가변 영역의 CDR3은 서열 12의 아미노산 서열을 포함하고;
iv) 경쇄 가변 영역의 CDR1은 서열 21의 아미노산 서열을 포함하고;
v) 경쇄 가변 영역의 CDR2는 서열 24의 아미노산 서열을 포함하고;
vi) 경쇄 가변 영역의 CDR3은 서열 26의 아미노산 서열을 포함하는 것인,
PCSK9에 결합하는 항체를 제공한다.
관련된 측면에서, 본 발명은, 각각 하기 3개의 상보성 결정 영역 (CDR): CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고; 여기서
i) 중쇄 가변 영역의 CDR1은 서열 7의 아미노산 서열을 포함하고;
ii) 중쇄 가변 영역의 CDR2는 서열 10의 아미노산 서열을 포함하고;
iii) 중쇄 가변 영역의 CDR3은 서열 13의 아미노산 서열을 포함하고;
iv) 경쇄 가변 영역의 CDR1은 서열 21의 아미노산 서열을 포함하고;
v) 경쇄 가변 영역의 CDR2는 서열 24의 아미노산 서열을 포함하고;
vi) 경쇄 가변 영역의 CDR3은 서열 26의 아미노산 서열을 포함하는 것인,
PCSK9에 결합하는 항체를 제공한다.
추가 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 항원 결합 분자 및 생리학상 상용성인 부형제를 포함하는 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 조성물은 개체에서 저밀도 지단백질 콜레스테롤 (LDL-C) 수준을 감소시키는 제2 작용제를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 제2 작용제는 스타틴이다. 예를 들어, 스타틴은 아토르바스타틴, 세리바스타틴, 플루바스타틴, 로바스타틴, 메바스타틴, 피타바스타틴, 프라바스타틴, 로수바스타틴 및 심바스타틴으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, 제2 작용제는 피브레이트, 니아신 및 그의 유사체, 콜레스테롤 흡수 억제제, 담즙산 격리제, 갑상선 호르몬 모방체, 마이크로솜 트리글리세리드 전달 단백질 (MTP) 억제제, 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 (DGAT) 억제제, PCSK9를 표적으로 하는 억제 핵산 및 apoB100을 표적으로 하는 억제 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가 측면에서, 본 발명은 LDL-C, 비-HDL-C 및/또는 총 콜레스테롤의 감소를 필요로 하는 개체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 항원 결합 분자를 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체에서 LDL-C, 비-HDL-C 및/또는 총 콜레스테롤을 감소시키는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 개체는 스타틴 요법에 저반응성이거나 저항성이다. 일부 실시양태에서, 개체는 스타틴 요법에 불내성이다. 일부 실시양태에서, 개체는 적어도 약 100 mg/dL의, 예를 들어 적어도 약 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 mg/dL의, 또는 더 높은 기준선 LDL-C 수준을 갖는다. 일부 실시양태에서, 개체는 가족성 고콜레스테롤혈증을 갖는다. 일부 실시양태에서, 개체는 트리글리세리드혈증을 갖는다. 일부 실시양태에서, 개체는 기능-획득 PCSK9 유전자 돌연변이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 개체는 약물-유발 이상지혈증을 갖는다.
일부 실시양태에서, 총 콜레스테롤을 LDL-C와 함께 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 방법은 개체에게 LDL-C를 감소시키는 데 효과적인 제2 작용제의 치료 유효량을 투여하는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 제2 작용제는 스타틴이다. 예를 들어, 스타틴은 아토르바스타틴, 세리바스타틴, 플루바스타틴, 로바스타틴, 메바스타틴, 피타바스타틴, 프라바스타틴, 로수바스타틴 및 심바스타틴으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, 제2 작용제는 피브레이트, 니아신 및 그의 유사체, 콜레스테롤 흡수 억제제, 담즙산 격리제, 갑상선 호르몬 모방체, 마이크로솜 트리글리세리드 전달 단백질 (MTP) 억제제, 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 (DGAT) 억제제, PCSK9를 표적으로 하는 억제 핵산 및 apoB100을 표적으로 하는 억제 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 분자 및 제2 작용제는 혼합물로서 공동-투여된다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 분자 및 제2 작용제는 개별적으로 공동-투여된다.
일부 실시양태에서, 항체는 정맥내로 투여된다. 일부 실시양태에서, 항체는 피하로 투여된다.
정의
"항체"는 이뮤노글로불린 패밀리의 폴리펩티드, 또는 상응하는 항원에 비공유적으로, 가역적으로, 및 특이적인 방식으로 결합할 수 있는 이뮤노글로불린의 단편을 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. 예시적인 항체 구조 단위는 사량체를 구성한다. 각각의 사량체는 폴리펩티드 쇄의 2개의 동일한 쌍으로 구성되어 있고, 각각의 쌍은 디술피드 결합을 통해 연결된 하나의 "경쇄" (약 25 kD) 및 하나의 "중쇄" (약 50-70 kD)를 갖는다. 인정된 이뮤노글로불린 유전자는 κ, λ, α, γ, δ, ε 및 μ 불변 영역 유전자, 뿐만 아니라 무수한 이뮤노글로불린 가변 영역 유전자를 포함한다. 경쇄는 κ 또는 λ로 분류된다. 중쇄는 γ, μ, α, δ 또는 ε로 분류되고, 이들은 차례로 각각 이뮤노글로불린 클래스 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE를 규정한다. 각각의 쇄의 N-말단은 주로 항원 인식을 담당하는 약 100 내지 110개 또는 그 초과의 아미노산의 가변 영역을 규정한다. 용어 가변 경쇄 (VL) 및 가변 중쇄 (VH)는 각각 경쇄 및 중쇄의 이들 영역을 나타낸다. 본원에 사용된 "항체"는, 예를 들어 PCSK9에 대해 특이적인 특정 결합을 보유하는 항체의 모든 변이체 및 그의 단편을 포함한다. 따라서, 전장 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 단일 쇄 항체 (ScFv), Fab, Fab', 및 동일한 결합 특이성을 갖는 이들 단편의 다량체 버전 (예를 들어, F(ab')2)이 상기 개념의 범주 내에 존재한다.
"상보성-결정 도메인" 또는 "상보성-결정 영역 ("CDR")은 상호교환적으로 VL 및 VH의 초가변 영역을 지칭한다. CDR은 항체 쇄의 표적 단백질-결합 부위로, 이러한 표적 단백질에 대한 특이성을 보유한다. 각각의 인간 VL 또는 VH에 3개의 CDR (N-말단으로부터 순차적으로 넘버링된 CDR1-3)이 있고, 이들은 가변 도메인의 약 15-20％를 구성한다. CDR은 표적 단백질의 에피토프에 대해 구조적으로 상보적이며, 따라서 결합 특이성의 직접적인 원인이 된다. VL 또는 VH의 나머지 구간, 소위 프레임워크 영역은 아미노산 서열에서 보다 적은 변이를 나타낸다 (문헌 [Kuby, Immunology, 4th ed., Chapter 4. W.H. Freeman & Co., New York, 2000]).
CDR 및 프레임워크 영역의 위치는 당업계의 널리 공지된 다양한 정의, 예를 들어 카바트(Kabat), 코티아(Chothia), 국제 ImMunoGeneTics 데이터베이스 (IMGT) (월드와이드 웹(worldwide web) 상의 imgt.cines.fr/) 및 AbM을 이용하여 결정된다 (예를 들어, 문헌 [Johnson et al., Nucleic Acids Res., 29:205-206 (2001)]; [Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)]; [Chothia et al., Nature, 342:877-883 (1989)]; [Chothia et al., J. Mol. Biol., 227:799-817 (1992)]; [Al-Lazikani et al., J.Mol.Biol., 273:927-748 (1997)] 참조). 항원 결합 부위의 정의는 하기에도 또한 기재되어 있다: 문헌 [Ruiz et al., Nucleic Acids Res., 28:219-221 (2000)]; 및 [Lefranc, M.P., Nucleic Acids Res., 29:207-209 (2001)]; [MacCallum et al., J. Mol. Biol., 262:732-745 (1996)]; 및 [Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:9268-9272 (1989)]; [Martin et al., Methods Enzymol., 203:121-153 (1991)]; 및 [Rees et al., In Sternberg M.J.E. (ed.), Protein Structure Prediction, Oxford University Press, Oxford, 141-172 (1996)].
용어 "결합 특이성 결정자" 또는 "BSD"는 상호교환적으로 항체의 결합 특이성 결정에 필요한 상보성 결정 영역 내의 최소의 연속적 또는 비-연속적 아미노산 서열을 지칭한다. 최소 결합 특이성 결정자는 하나 이상의 CDR 서열 내에 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 최소 결합 특이성 결정자는 항체의 중쇄 및 경쇄의 CDR3 서열의 일부 또는 전장 내에 위치한다 (즉, 단지 이에 의해서만 결정됨).
본원에 사용된 "항체 경쇄" 또는 "항체 중쇄"는 각각 VL 또는 VH를 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 내생 VL은 유전자 절편 V (가변 부위) 및 J (연결 부위)에 의해 코딩되고, 내생 VH는 V, D (다양성 부위) 및 J에 의해 코딩된다. 각각의 VL 또는 VH는 CDR 뿐만 아니라 프레임워크 영역을 포함한다. 본원에서, 항체 경쇄 및/또는 항체 중쇄는 때로는 집합적으로 "항체 쇄"로 지칭될 수 있다. 당업자가 용이하게 인지할 바와 같이, 이들 용어는 VL 또는 VH의 기본 구조를 붕괴시키지 않는 돌연변이를 함유하는 항체 쇄를 포함한다.
항체는 무손상 이뮤노글로불린으로서, 또는 다양한 펩티다제를 사용한 소화에 의해 생성된 다수의 널리 특징규명된 단편으로서 존재한다. 따라서, 예를 들어 펩신은 힌지 영역 내의 디술피드 연결 아래에서 항체를 소화시켜, 그 자체가 디술피드 결합에 의해 VH-CH1에 연결된 경쇄인 Fab'의 이량체 F(ab)'2를 생성한다. F(ab)'2를 온화한 조건 하에서 환원시켜 힌지 영역 내의 디술피드 연결을 파괴함으로써 F(ab)'2 이량체를 Fab' 단량체로 전환시킬 수 있다. Fab' 단량체는 본질적으로 힌지 영역의 일부를 갖는 Fab이다. 문헌 [Paul, Fundamental Immunology 3d ed. (1993)]. 다양한 항체 단편이 무손상 항체의 소화의 측면에서 규정되지만, 당업자는 이러한 단편이 화학적으로 또는 재조합 DNA 방법을 이용하여 신생 합성될 수 있다는 것을 알 것이다. 따라서, 본원에 사용된 용어 "항체"는 전체 항체의 변형에 의해 생산된 항체 단편, 또는 재조합 DNA 방법을 이용하여 신생 합성된 단편 (예를 들어, 단일 쇄 Fv) 또는 파지 디스플레이 라이브러리를 사용하여 확인된 단편도 또한 포함한다 (예를 들어, 문헌 [McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990)] 참조).
모노클로날 또는 폴리클로날 항체의 제조를 위해, 당업계에 공지된 임의의 기술을 사용할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Kohler & Milstein, Nature 256:495-497 (1975)]; [Kozbor et al., Immunology Today 4:72 (1983)]; [Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp. 77-96. Alan R. Liss, Inc. 1985] 참조). 단일 쇄 항체의 생산 기술 (미국 특허 제4,946,778호)을 변용하여 본 발명의 폴리펩티드에 대한 항체를 생산할 수 있다. 또한, 트랜스제닉 마우스, 또는 다른 유기체, 예컨대 다른 포유동물을 사용하여 인간화 항체를 발현시킬 수 있다. 대안적으로, 파지 디스플레이 기술을 이용하여, 선택된 항원에 특이적으로 결합하는 항체 및 헤테로머 Fab 단편을 확인할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [McCafferty et al.] (상기 문헌); [Marks et al., Biotechnology, 10:779-783, (1992)] 참조).
비-인간 항체를 인간화 또는 영장류화하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 비-인간 공급원으로부터 도입된 1개 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 종종 도입 잔기로 지칭되고, 전형적으로 도입 가변 도메인으로부터 취해진다. 인간화는 본질적으로 윈터(Winter)와 공동 연구자들의 방법에 따라 (예를 들어, 문헌 [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988)]; [Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988)] 및 [Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)] 참조), 인간 항체의 상응하는 서열을 설치류 CDR 또는 CDR 서열로 치환시킴으로써 수행할 수 있다. 따라서, 이러한 인간화 항체는, 무손상 인간 가변 도메인보다 실질적으로 더 작은 영역이 비-인간 종으로부터의 상응하는 서열로 치환된 키메라 항체이다 (미국 특허 제4,816,567호). 실제로는, 인간화 항체는 전형적으로 일부 상보성 결정 영역 ("CDR") 잔기 및 가능하게는 일부 프레임워크 ("FR") 잔기가 설치류 항체 내 유사 부위로부터의 잔기로 치환되어 있는 인간 항체이다.
"키메라 항체"는 (a) 항원 결합 부위 (가변 영역)가 상이한 또는 변경된 클래스, 이펙터 기능 및/또는 종의 불변 영역, 또는 키메라 항체에 새로운 특성을 부여하는 완전히 상이한 분자, 예를 들어 효소, 독소, 호르몬, 성장 인자 및 약물에 연결되도록 불변 영역 또는 그의 일부가 변경, 대체 또는 교환되거나; 또는 (b) 가변 영역 또는 그의 일부가, 상이한 또는 변경된 항원 특이성을 갖는 가변 영역으로 변경, 대체 또는 교환된 항체 분자이다.
본 발명의 항체 또는 항원 결합 분자는 다른 단백질에 화학적으로 접합되거나 또는 다른 단백질과의 융합 단백질로서 발현되는 하나 이상의 이뮤노글로불린 쇄를 추가로 포함한다. 이는 또한 이중특이적 항체를 포함한다. 이중특이적 또는 이관능성 항체는 2개의 상이한 중쇄/경쇄 쌍 및 2개의 상이한 결합 부위를 갖는 인공 하이브리드 항체이다. 본 발명의 다른 항원 결합 단편 또는 항체 부분은 2가 scFv (디아바디), 항체 분자가 2개의 상이한 에피토프를 인식하는 이중특이적 scFv 항체, 단일 결합 도메인 (dAb) 및 미니바디를 포함한다.
본원에 기재된 다양한 항체 또는 항원 결합 단편은 무손상 항체의 효소적 또는 화학적 변형에 의해 생산하거나, 또는 재조합 DNA 방법을 이용하여 신생 합성하거나 (예를 들어, 단일 쇄 Fv), 또는 파지 디스플레이 라이브러리를 사용하여 확인할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [McCafferty et al., Nature 348:552-554, 1990] 참조). 예를 들어, 미니바디는 당업계에 기재된 방법 (예를 들어, 문헌 [Vaughan and Sollazzo, Comb Chem High Throughput Screen. 4:417-30 2001])을 이용하여 생성할 수 있다. 이중특이적 항체는 하이브리도마의 융합 또는 Fab' 단편의 연결을 비롯한 다양한 방법에 의해 생산할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990)]; [Kostelny et al., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992)]을 참조한다. 단일 쇄 항체는 파지 디스플레이 라이브러리 또는 리보솜 디스플레이 라이브러리, 유전자 셔플링된 라이브러리를 사용하여 확인할 수 있다. 이러한 라이브러리는 합성, 반합성 또는 천연 및 면역적격 공급원으로부터 구축할 수 있다.
"키메라 항체"는 (a) 항원 결합 부위 (가변 영역)가 상이한 또는 변경된 클래스, 이펙터 기능 및/또는 종의 불변 영역, 또는 키메라 항체에 새로운 특성을 부여하는 완전히 상이한 분자, 예를 들어 효소, 독소, 호르몬, 성장 인자, 약물 등에 연결되도록 불변 영역 또는 그의 일부가 변경, 대체 또는 교환되거나; 또는 (b) 가변 영역 또는 그의 일부가, 상이한 또는 변경된 항원 특이성을 갖는 가변 영역으로 변경, 대체 또는 교환된 항체 분자이다. 예를 들어, 하기 실시예에 나타낸 바와 같이, 마우스 항-PCSK9 항체를, 그의 불변 영역을 인간 이뮤노글로불린으로부터의 불변 영역으로 대체함으로써 변형시킬 수 있다. 인간 불변 영역으로의 대체로 인해, 키메라 항체는 본래의 마우스 항체와 비교하여 인간에서의 감소된 항원성을 가지면서, 인간 PCSK9를 인식하는 그의 특이성을 유지할 수 있다.
용어 "항체 결합 분자" 또는 "비-항체 리간드"는 애드넥틴, 아비머, 단일 쇄 폴리펩티드 결합 분자, 및 항체-유사 결합 펩티드모방체를 비롯한, 비-이뮤노글로불린 단백질 스캐폴드를 사용하는 항체 모방체를 지칭한다.
용어 "가변 영역" 또는 "V-영역"은 상호교환적으로 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4를 포함하는 중쇄 또는 경쇄를 지칭한다. 도 1을 참조한다. 내생 가변 영역은 이뮤노글로불린 중쇄 V-D-J 유전자 또는 경쇄 V-J 유전자에 의해 코딩된다. V-영역은 자연 발생되거나, 재조합되거나 또는 합성될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "가변 절편" 또는 "V-절편"은 상호교환적으로 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3을 포함하는 가변 영역의 하위서열을 지칭한다. 도 1을 참조한다. 내생 V-절편은 이뮤노글로불린 V-유전자에 의해 코딩된다. V-절편은 자연 발생되거나, 재조합되거나 또는 합성될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "J-절편"은 CDR3의 C-말단 부분 및 FR4를 포함하는, 코딩된 가변 영역의 하위서열을 지칭한다. 내생 J-절편은 이뮤노글로불린 J-유전자에 의해 코딩된다. 도 1을 참조한다. J-절편은 자연 발생되거나, 재조합되거나 또는 합성될 수 있다.
"인간화" 항체는 인간에서 면역원성이 더 적으면서 비-인간 항체의 반응성을 유지하는 항체이다. 이는, 예를 들어 비-인간 CDR 영역을 유지하고 항체의 나머지 부분을 그의 인간 대응부로 대체함으로써 달성할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)]; [Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92 (1988)]; [Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)]; [Padlan, Molec. Immun., 28:489-498 (1991)]; [Padlan, Molec. Immun., 31(3):169-217 (1994)]을 참조한다.
용어 "상응하는 인간 배선 서열"은, 인간 배선 이뮤노글로불린 가변 영역 서열에 의해 코딩되는 모든 다른 공지된 가변 영역 아미노산 서열과 비교하여 참조 가변 영역 아미노산 서열 또는 하위서열과 결정된 가장 높은 아미노산 서열 동일성을 공유하는 인간 가변 영역 아미노산 서열 또는 하위서열을 코딩하는 핵산 서열을 지칭한다. 상응하는 인간 배선 서열은 또한 모든 다른 평가된 가변 영역 아미노산 서열과 비교하여 참조 가변 영역 아미노산 서열 또는 하위서열과 가장 높은 아미노산 서열 동일성을 갖는 인간 가변 영역 아미노산 서열 또는 하위서열을 지칭할 수 있다. 상응하는 인간 배선 서열은 프레임워크 영역 단독, 상보성 결정 영역 단독, 프레임워크 및 상보성 결정 영역, 가변 절편 (상기 정의된 바와 같음), 또는 가변 영역을 포함하는 서열 또는 하위서열의 다른 조합일 수 있다. 서열 동일성은 본원에 기재된 방법을 이용하여, 예를 들어 BLAST, ALIGN, 또는 당업계에 공지된 또 다른 정렬 알고리즘을 이용하여 2개의 서열을 정렬시켜 결정할 수 있다. 상응하는 인간 배선 핵산 또는 아미노산 서열은 참조 가변 영역 핵산 또는 아미노산 서열과 적어도 약 90％, 92％, 94％, 96％, 98％, 99％의 서열 동일성을 가질 수 있다. 상응하는 인간 배선 서열은, 예를 들어 공개적으로 이용가능한 국제 ImMunoGeneTics 데이터베이스 (IMGT) (월드와이드 웹 상의 imgt.cines.fr/) 및 V-base (월드와이드 웹 상의 vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk)를 통해 결정할 수 있다.
항원 (예를 들어, 단백질)과 항체 또는 항체-유래 결합제 사이의 상호작용을 설명하는 문맥에 사용된 경우에, 어구 "특이적으로 (또는 선택적으로) 결합하다"는 단백질 및 다른 생물제제, 예를 들어 생물학적 샘플, 예컨대 혈액, 혈청, 혈장 또는 조직 샘플의 이종 집단 내 항원의 존재를 결정하는 결합 반응을 지칭한다. 따라서, 제시된 면역검정 조건 하에서, 특정 결합 특이성을 갖는 항체 또는 결합제는 특정 항원에 대해 배경의 적어도 2배로 결합하고, 샘플에 존재하는 다른 항원에 실질적으로 유의한 양으로 결합하지 않는다. 이러한 조건 하에서 항체 또는 결합제에 대한 특이적 결합은, 특정 단백질에 대한 그의 특이성에 대해 항체 또는 결합제를 선택하는 것을 필요로 할 수 있다. 바람직하거나 적절한 경우에, 예를 들어 다른 종 (예를 들어, 마우스)으로부터의 PCSK9 분자 또는 다른 PCSK 하위유형과 교차-반응하는 항체를 배제함으로써 상기 선택을 달성할 수 있다. 다양한 면역검정 포맷을 이용하여 특정 단백질과 특이적으로 면역반응성인 항체를 선택할 수 있다. 예를 들어, 단백질과 특이적으로 면역반응성인 항체를 선택하기 위해 고체-상 ELISA 면역검정이 일상적으로 이용된다 (예를 들어, 특이적 면역반응성을 측정하는 데 이용할 수 있는 면역검정 포맷 및 조건의 설명에 대해서는 문헌 [Harlow & Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual (1998)] 참조). 전형적으로, 특이적이거나 선택적인 결합 반응은 배경 신호의 적어도 2배, 보다 전형적으로는 배경 신호의 적어도 10 내지 100배의 신호를 생성할 것이다.
용어 "평형 해리 상수 (KD, M)"는 해리 속도 상수 (kd, 시간-1)를 회합 속도 상수 (ka, 시간-1, M-1)로 나눈 것을 지칭한다. 평형 해리 상수는 당업계의 임의의 공지된 방법을 이용하여 측정할 수 있다. 본 발명의 항체는 일반적으로 약 10-7 또는 10-8 M 미만, 예를 들어 약 10-9 M 또는 10-10 M 미만, 일부 실시양태에서 약 10-11 M, 10-12 M 또는 10-13 M 미만의 평형 해리 상수를 가질 것이다.
본원에 사용된 용어 "항원 결합 영역"은 분자와 PCSK9 사이의 특이적 결합을 담당하는 본 발명의 PCSK9-결합 분자의 도메인을 지칭한다. 항원 결합 영역은 적어도 하나의 항체 중쇄 가변 영역 및 적어도 하나의 항체 경쇄 가변 영역을 포함한다. 본 발명의 각각의 PCSK9-결합 분자에 존재하는 적어도 하나의 이러한 항원 결합 영역이 있으며, 각각의 항원 결합 영역은 서로 동일하거나 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 PCSK9-결합 분자의 항원 결합 영역 중 적어도 하나는 PCSK9의 길항제로서 작용한다.
본원에 사용된 용어 "길항제"는 표적 분자에 특이적으로 결합하여 그의 활성을 억제할 수 있는 작용제를 지칭한다. 예를 들어, PCSK9의 길항제는 PCSK9에 특이적으로 결합하고, LDLR의 PCSK9-매개 분해를 완전히 또는 부분적으로 억제한다. LDLR의 PCSK9-매개 분해를 억제하는 것은 PCSK9가 LDLR에 결합하는 것을 방해할 수 있거나 방해하지 않을 수 있다. 일부 경우에서, PCSK9 길항제는, PCSK9에 결합하고 LDLR에 대한 PCSK9의 결합을 억제하는 그의 능력에 의해 확인될 수 있다. 억제는 본 발명의 길항제에 노출될 때 LDLR의 PCSK9-매개 분해가 대조군 존재 하의 또는 길항제 부재 하의 PCSK9-매개 분해와 비교하여 적어도 약 10％ 더 적은 경우에, 예를 들어 적어도 약 25％, 50％, 75％ 더 적거나 또는 완전히 억제되는 경우에 발생한다. 대조군은 어떠한 항체 또는 항원 결합 분자에도 노출되지 않을 수 있거나, 또는 또 다른 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 분자, 또는 길항제로서 기능하지 않는 것으로 알려진 항-PCSK9 항체 또는 항원 결합 분자에 노출될 수 있다. "항체 길항제"는 길항제가 억제 항체인 상황을 지칭한다.
용어 "PCSK9" 또는 "전구단백질 컨버타제 서브틸리신/켁신 유형 9a"는 상호교환적으로 분비성 서브틸라제 패밀리의 프로테이나제 K 서브패밀리에 속하는 자연 발생 인간 전구단백질 컨버타제를 지칭한다. PCSK9는 소포체에서 자가촉매적 분자내 프로세싱을 겪는 가용성 지모겐으로서 합성되며, 전구단백질 컨버타제로서 기능하는 것으로 여겨진다. PCSK9는 콜레스테롤 항상성에 있어 역할을 하고, 피질 뉴런의 분화에 있어 역할을 가질 수 있다. 상기 PCSK9 유전자에서의 돌연변이는 상염색체 우성 가족성 고콜레스테롤혈증의 형태와 관련되어 왔다. 예를 들어, 문헌 [Burnett and Hooper, Clin Biochem Rev (2008) 29(1):11-26]을 참조한다. PCSK9의 핵산 및 아미노산 서열은 공지되어 있고, 각각 진뱅크 등록 번호 NM_174936.2 및 NP_777596.2로 공개되어 있다. 본원에 사용된 PCSK9 폴리펩티드는 LDLR에 기능적으로 결합하고, LDLR의 분해를 촉진한다. 구조적으로, PCSK9 아미노산 서열은 진뱅크 등록 번호 NP_777596.2의 아미노산 서열과 적어도 약 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 또는 100％의 서열 동일성을 갖는다. 구조적으로, PCSK9 핵산 서열은 진뱅크 등록 번호 NM_174936.2의 핵산 서열과 적어도 약 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 또는 100％의 서열 동일성을 갖는다.
어구 "PCSK9 기능-획득 돌연변이"는, 예를 들어 증진된 LDLR 분해 및 LDLR 수준의 감소로 인해 가족성 고콜레스테롤혈증 표현형, 가속된 아테롬성동맥경화증 및 조기 관상동맥 심장 질환과 관련되고/거나 그의 원인이 되는, PCSK9 유전자에서 발생하는 천연 돌연변이를 지칭한다. PCSK9 기능-획득 돌연변이의 대립유전자 빈도는 드물다. 문헌 [Burnett and Hooper, Clin Biochem Rev. (2008) 29(1):11-26]을 참조한다. 예시적인 PCSK9 기능-획득 돌연변이는 D129N, D374H, N425S 및 R496W를 포함한다. 문헌 [Fasano, et al., Atherosclerosis (2009) 203(1):166-71]을 참조한다. PCSK9 기능-획득 돌연변이는, 예를 들어 문헌 [Burnett and Hooper] (상기 문헌); [Fasano, et al.] (상기 문헌); [Abifadel, et al., J Med Genet (2008) 45(12):780-6]; [Abifadel, et al., Hum Mutat (2009) 30(4):520-9]; 및 [Li, et al., Recent Pat DNA Gene Seq (2009) Nov. 1 (PMID 19601924)]에 검토되어 있다.
본 발명의 폴리펩티드의 "활성"은 폴리펩티드의 원래 세포 또는 조직에서의 그의 구조적, 조절 또는 생화학적 기능을 지칭한다. 폴리펩티드의 활성의 예는 직접 활성 및 간접 활성 둘 다를 포함한다. PCSK9의 예시적인 직접 활성은 LDLR에 대한 결합 및 LDLR의 PCSK9-매개 분해를 비롯하여, 폴리펩티드와의 직접적인 상호작용의 결과이다. PCSK9와 관련된 예시적인 간접 활성은 폴리펩티드의 직접 활성에 대한 세포, 조직, 기관 또는 대상체에서의 표현형 또는 반응의 변화, 예를 들어 상승된 간 LDLR의 감소, 감소된 혈장 HDL-C, 감소된 혈장 콜레스테롤, 스타틴에 대한 민감도 증진으로서 관찰된다.
핵산 또는 단백질에 적용되는 경우에 용어 "단리된"은, 핵산 또는 단백질이 천연 상태에서 회합되어 있는 다른 세포 성분을 본질적으로 갖지 않는다는 것을 나타낸다. 균질 상태인 것이 바람직하다. 이는 건조 상태로 또는 수용액으로 존재할 수 있다. 순도 및 균질성은 전형적으로 분석 화학 기술, 예컨대 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 고성능 액체 크로마토그래피를 이용하여 결정된다. 시료 중에 우세하게 존재하는 종의 단백질이 실질적으로 정제된다. 특히, 단리된 유전자는, 상기 유전자의 측면에 위치하며 관심 유전자 이외의 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임으로부터 분리된다. 용어 "정제된"은 핵산 또는 단백질이 전기영동 겔에서 본질적으로 하나의 밴드를 생성함을 나타낸다. 특히, 이는 핵산 또는 단백질이 적어도 85％ 순수하다는 것, 더욱 바람직하게는 적어도 95％ 순수하다는 것, 가장 바람직하게는 적어도 99％ 순수하다는 것을 의미한다.
용어 "핵산" 또는 "폴리뉴클레오티드"는 단일- 또는 이중-가닥 형태의 데옥시리보핵산 (DNA) 또는 리보핵산 (RNA) 및 그의 중합체를 지칭한다. 특별히 제한되지 않는 한, 상기 용어는, 참조 핵산으로서 유사한 결합 특성을 가지며 자연 발생 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 천연 뉴클레오티드의 공지된 유사체를 함유하는 핵산을 포함한다. 달리 나타내지 않는 한, 특정한 핵산 서열은 또한 명확하게 명시된 서열 뿐만 아니라, 그의 보존적으로 변형된 변이체 (예를 들어, 축중성 코돈 치환), 대립유전자, 오르토로그, SNP 및 상보적 서열을 함축적으로 포함한다. 구체적으로, 축중성 코돈 치환은 하나 이상의 선택된 (또는 모든) 코돈의 제3 위치가 혼합-염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 달성할 수 있다 (문헌 [Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991)]; [Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985)]; 및 [Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)]).
용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 본원에서 상호교환적으로 사용되어 아미노산 잔기의 중합체를 지칭한다. 상기 용어는 자연 발생 아미노산 중합체 및 비-자연 발생 아미노산 중합체 뿐만 아니라, 1개 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연 발생 아미노산의 인공적인 화학적 모방체인 아미노산 중합체에 적용된다.
용어 "아미노산"은 자연 발생 및 합성 아미노산, 뿐만 아니라 자연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 지칭한다. 자연 발생 아미노산은 유전자 코드에 의해 코딩되는 것들, 뿐만 아니라 이후에 변형된 아미노산, 예를 들어 히드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트 및 O-포스포세린이다. 아미노산 유사체는 자연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조, 즉, 수소, 카르복실 기, 아미노 기 및 R 기에 결합된 α-탄소를 갖는 화합물, 예를 들어 호모세린, 노르류신, 메티오닌 술폭시드, 메티오닌 메틸 술포늄을 지칭한다. 이러한 유사체는 변형된 R 기를 갖거나 (예를 들어, 노르류신) 변형된 펩티드 주쇄를 갖지만, 자연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 유지한다. 아미노산 모방체는 아미노산의 일반적인 화학 구조와 상이한 구조를 갖지만 자연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 화학적 화합물을 지칭한다.
"보존적으로 변형된 변이체"는 아미노산 및 핵산 서열 둘 다에 적용된다. 특정 핵산 서열과 관련하여, 보존적으로 변형된 변이체는 동일하거나 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 지칭하거나, 또는 핵산이 아미노산 서열을 코딩하지 않는 경우에는 본질적으로 동일한 서열을 지칭한다. 유전자 코드의 축중성 때문에, 수많은 기능적으로 동일한 핵산이 임의의 주어진 단백질을 코딩한다. 예를 들어, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU는 모두 아미노산 알라닌을 코딩한다. 따라서, 코돈에 의해 알라닌이 지정되는 모든 위치에서, 상기 코돈은 코딩되는 폴리펩티드를 변경하지 않으면서, 기재된 임의의 상응하는 코돈으로 변경될 수 있다. 이러한 핵산 변이는 보존적으로 변형된 변이의 한 종인 "침묵 변이"이다. 폴리펩티드를 코딩하는 본원의 모든 핵산 서열은 또한 핵산의 모든 가능한 침묵 변이도 설명한다. 당업자는 핵산 내의 각각의 코돈 (통상적으로 메티오닌에 대한 유일한 코돈인 AUG, 및 통상적으로 트립토판에 대한 유일한 코돈인 TGG 제외)이 기능적으로 동일한 분자를 생성하도록 변형될 수 있음을 인지할 것이다. 따라서, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 각각의 침묵 변이는 각각의 기재된 서열에 내포된다.
아미노산 서열에 관하여, 당업자는 코딩된 서열에서 단일 아미노산 또는 작은 비율의 아미노산을 변경, 부가 또는 결실시키는 핵산, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 서열에의 개별 치환, 결실 또는 부가가, 상기 변경이 화학적으로 유사한 아미노산으로의 아미노산의 치환을 일으키는 경우에 "보존적으로 변형된 변이체"임을 인지할 것이다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표가 당업계에 널리 공지되어 있다. 이러한 보존적으로 변형된 변이체는 본 발명의 다형성 변이체, 종간 상동체 및 대립유전자에 부가적인 것이고 이들을 제외하지 않는다.
하기 8개의 군은 각각 서로에 대해 보존적 치환인 아미노산을 함유한다: 1) 알라닌 (A), 글리신 (G); 2) 아스파르트산 (D), 글루탐산 (E); 3) 아스파라긴 (N), 글루타민 (Q); 4) 아르기닌 (R), 리신 (K); 5) 이소류신 (I), 류신 (L), 메티오닌 (M), 발린 (V); 6) 페닐알라닌 (F), 티로신 (Y), 트립토판 (W); 7) 세린 (S), 트레오닌 (T); 및 8) 시스테인 (C), 메티오닌 (M) (예를 들어, 문헌 [Creighton, Proteins (1984)] 참조).
"서열 동일성의 백분율"은 2개의 최적으로 정렬된 서열들을 비교 윈도우 상에서 비교함으로써 결정되며, 여기서 비교 윈도우 내의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 2개의 서열의 최적 정렬을 위해, 부가 또는 결실을 포함하지 않는 참조 서열 (예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드)과 비교하여 부가 또는 결실 (즉, 갭)을 포함할 수 있다. 상기 백분율은 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 두 서열 모두에서 나타나는 위치의 수를 측정하여 매칭되는 위치의 수를 산출하고, 상기 매칭되는 위치의 수를 비교 윈도우 내의 총 위치의 수로 나누고, 결과치에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 계산한다.
2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열과 관련하여 용어 "동일한" 또는 "동일성" 백분율은 동일한 서열인 2개 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다. 2개의 서열은, 하기 서열 비교 알고리즘 중 하나를 이용하거나 또는 수동 정렬 및 육안 검사로 측정시 비교 윈도우 또는 지정된 영역에 대해서 최대로 상응하도록 비교 및 정렬될 때, 2개의 서열이 특정 백분율의 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드 (즉, 특정 영역에 걸쳐 또는 특정되지 않는 경우에는 참조 서열의 전체 서열에 걸쳐 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％의 서열 동일성)을 갖는 경우에 "실질적으로 동일하다". 본 발명은 각각 본원에 예시된 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 서열 1-5, 15-19 및 40-41 중 임의의 하나에 예시된 가변 영역; 서열 27-31 중 임의의 하나에 예시된 가변 절편; 서열 6-14, 20-26 중 임의의 하나에 예시된 CDR; 서열 32-39 중 임의의 하나에 예시된 FR; 서열 42-45 중 임의의 하나에 예시된 핵산 서열)와 실질적으로 동일한 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 임의로, 동일성은 길이가 적어도 약 15, 25 또는 50개 뉴클레오티드인 영역, 또는 보다 바람직하게는 길이가 100 내지 500개 또는 1000개 이상의 뉴클레오티드인 영역, 또는 참조 서열의 전장에 걸쳐 존재한다. 아미노산 서열과 관련하여, 동일성 또는 실질적인 동일성은 길이가 적어도 5, 10, 15 또는 20개 아미노산인 영역, 임의로 길이가 적어도 약 25, 30, 35, 40, 50, 75 또는 100개 아미노산인 영역, 임의로 길이가 적어도 약 150, 200 또는 250개 아미노산인 영역, 또는 참조 서열의 전장에 걸쳐 존재할 수 있다. 보다 짧은 아미노산 서열, 예를 들어 20개 이하의 아미노산의 아미노산 서열과 관련하여, 실질적인 동일성은 본원에 정의된 보존적 치환에 따라 1 또는 2개의 아미노산 잔기가 보존적으로 치환되는 경우에 존재한다.
서열 비교를 위해, 전형적으로 하나의 서열이 시험 서열과 비교되는 참조 서열로서 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 이용하는 경우에, 시험 및 참조 서열을 컴퓨터에 입력하고, 필요한 경우에는 하위서열 좌표를 지정하고, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터를 지정한다. 디폴트 프로그램 파라미터를 사용할 수 있거나, 또는 대안적인 파라미터를 지정할 수 있다. 이어서, 서열 비교 알고리즘은 프로그램 파라미터를 기초로 하여 참조 서열에 대한 시험 서열의 서열 동일성 백분율을 계산한다.
본원에 사용된 "비교 윈도우"는 2개의 서열을 최적으로 정렬시킨 후에 서열을 인접 위치의 동일한 수의 참조 서열과 비교할 수 있는, 20 내지 600개, 통상적으로는 약 50 내지 약 200개, 더욱 통상적으로는 약 100 내지 약 150개로 이루어진 군으로부터 선택된 인접 위치의 수 중 임의의 하나의 절편에 대한 것을 포함한다. 비교를 위한 서열 정렬 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은, 예를 들어 문헌 [Smith and Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c]의 국소 상동성 알고리즘에 의해서, 문헌 [Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443]의 상동성 정렬 알고리즘에 의해서, 문헌 [Pearson and Lipman (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444]의 유사성 방법에 대한 탐색에 의해서, 이들 알고리즘의 컴퓨터 실행 (위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575에 소재하는 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group)의 위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지(Wisconsin Genetics Software Package) 내의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA)에 의해서, 또는 수동 정렬 및 육안 검사 (예를 들어, 문헌 [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995 supplement)] 참조)에 의해서 수행할 수 있다.
서열 동일성 및 서열 유사성 백분율을 결정하기에 적합한 알고리즘의 2가지 예는 각각 문헌 [Altschul et al. (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402] 및 [Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410]에 기재되어 있는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 미국립 생물공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information)를 통해 공개적으로 입수가능하다. 상기 알고리즘은 먼저 데이터베이스 서열 내 동일 길이의 워드(word)와 정렬되는 경우에 어떤 양수 값의 역치 스코어 T에 매칭되거나 이를 충족시키는, 의문(query) 서열 내의 길이 W의 짧은 워드들을 확인함으로써 높은 스코어의 서열 쌍 (HSP)을 확인하는 것을 포함한다. T는 이웃 워드 스코어 역치를 지칭한다 (상기 문헌 [Altschul et al.]). 이들 초기 이웃 워드 히트(hit)는 이것을 함유하는 더 긴 HSP를 찾는 검색을 개시하기 위한 시드(seed)로 작용한다. 워드 히트는 누적 정렬 스코어가 증가될 수 있는 한, 각각의 서열을 따라 양쪽 방향으로 연장된다. 누적 스코어는 뉴클레오티드 서열에 대해 파라미터 M (매칭 잔기의 쌍에 대한 보상 스코어, 항상 > 0) 및 N (미스매칭 잔기에 대한 페널티 스코어, 항상 < 0)을 사용하여 계산한다. 아미노산 서열의 경우에는 스코어링 매트릭스를 이용하여 누적 스코어를 계산한다. 누적 정렬 스코어가 그의 최대 달성 값으로부터 X의 양만큼 하락하거나; 하나 이상의 음의 값으로 스코어링된 잔기 정렬의 축적으로 인해 누적 스코어가 0 이하로 떨어지거나; 또는 어느 한쪽의 서열의 끝에 도달한 경우에, 각 방향으로의 워드 히트의 연장이 중단된다. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T 및 X는 정렬의 감도 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램 (뉴클레오티드 서열의 경우)은 디폴트로서 워드길이 (W) 11, 기대값 (E) 10, M=5, N=-4 및 양쪽 가닥의 비교를 사용한다. 아미노산 서열의 경우에, BLASTP 프로그램은 워드길이 3, 및 예상치 (E) 10, 및 BLOSUM62 스코어링 매트릭스 (문헌 [Henikoff and Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915] 참조) 정렬 (B) 50, 예상치 (E) 10, M=5, N=-4, 및 양쪽 가닥의 비교를 디폴트로서 사용한다.
BLAST 알고리즘은 또한 두 서열 사이의 유사성에 대한 통계적 분석을 수행한다 (예를 들어, 문헌 [Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787] 참조). BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성의 한 척도는 2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 매칭이 우연히 발생할 확률을 나타내는 최소 합계 확률 (P(N))이다. 예를 들어, 핵산은 참조 핵산에 대한 시험 핵산의 비교에서의 최소 합계 확률이 약 0.2 미만, 보다 바람직하게는 약 0.01 미만, 가장 바람직하게는 약 0.001 미만인 경우에 참조 서열과 유사한 것으로 간주된다.
2개의 핵산 서열 또는 폴리펩티드가 실질적으로 동일하다는 표시는, 하기 기재된 바와 같이 제1 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩티드가 제2 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩티드에 대해 생성된 항체와 면역학적으로 교차 반응성이라는 것이다. 따라서, 폴리펩티드는 전형적으로, 예를 들어 2개의 펩티드가 보존적 치환에 의해서만 상이한 경우에 제2 폴리펩티드와 실질적으로 동일하다. 2개의 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 또 다른 표시는, 2개의 분자 또는 이들의 상보체가 하기 기재된 바와 같이 엄격한 조건 하에 서로 혼성화된다는 것이다. 2개의 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 또 다른 표시는 동일한 프라이머를 사용하여 서열을 증폭시킬 수 있다는 것이다.
항원 결합 영역이 본 발명의 PCSK9-결합 분자 내에서 연결되는 방식을 설명하는 문맥에서 사용되는 경우에, 용어 "연결하다"는 영역들을 물리적으로 연결하기 위한 모든 가능한 수단을 포함한다. 다수의 항원 결합 영역들은 빈번하게 공유 결합 (예를 들어, 펩티드 결합 또는 디술피드 결합), 또는 직접 결합 (즉, 2개의 항원 결합 영역 사이에 링커 없이 결합) 또는 간접 결합 (즉, 2개 이상의 항원 결합 영역 사이에 적어도 1개의 링커 분자의 도움으로 결합)일 수 있는 비-공유 결합과 같은 화학 결합에 의해 연결된다.
용어 "대상체", "환자" 및 "개체"는 상호교환적으로 포유동물, 예를 들어 인간 또는 비-인간 영장류 포유동물을 지칭한다. 포유동물은 또한 실험실 포유동물, 예를 들어 마우스, 래트, 토끼, 햄스터일 수 있다. 일부 실시양태에서, 포유동물은 농경 포유동물 (예를 들어, 말, 양, 소, 돼지, 낙타류) 또는 가축 포유동물 (예를 들어, 개, 고양이)일 수 있다.
용어 "치료상 허용되는 양" 또는 "치료 유효 용량"은 상호교환적으로, 바람직한 결과 (즉, 혈장 비-HDL-C, 고콜레스테롤혈증, 아테롬성동맥경화증, 관상동맥 심장 질환의 감소)를 일으키기에 충분한 양을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 치료상 허용되는 양은 바람직하지 않은 부작용을 유도 또는 유발하지 않는다. 치료상 허용되는 양은 먼저 저용량을 투여한 다음, 목적 효과가 달성될 때까지 그 용량을 증진적으로 증가시킴으로써 결정될 수 있다. 본 발명의 PCSK9 길항 항체의 "예방 유효 투여량" 및 "치료 유효 투여량"은 각각, PCSK9의 존재와 관련된 질환 증상 (예를 들어, 고콜레스테롤혈증)의 발병을 예방하거나, 또는 그의 중증도의 감소를 일으킬 수 있다. 상기 용어들은 또한 각각, 질환 증상으로부터 자유로운 기간의 빈도 및 지속시간을 촉진 또는 증가시킬 수 있다. "예방 유효 투여량" 및 "치료 유효 투여량"은 또한 각각, PCSK9의 활성으로부터 초래되는 장애 및 질환으로 인한 손상 또는 장애를 예방 또는 완화할 수 있다.
용어 "공동-투여하다"는 개체의 혈액 중 2종의 활성제의 동시 존재를 지칭한다. 공동-투여된 활성제는 동시에 또는 순차적으로 전달될 수 있다.
본원에 사용된 어구 "본질적으로 이루어진"은 방법 또는 조성물에 포함된 활성 제약 작용제, 뿐만 아니라 상기 방법 또는 조성물의 의도된 목적에 대해 불활성인 임의의 부형제의 속 또는 종을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 어구 "본질적으로 이루어진"은 본 발명의 길항제 항 PCSK9 항체가 아닌 하나 이상의 추가의 활성제의 포함을 명백히 제외한다. 일부 실시양태에서, 어구 "본질적으로 이루어진"은 본 발명의 길항제 항 PCSK9 항체 이외의 하나 이상의 추가의 활성제 및 제2의 공동-투여된 작용제의 포함을 명백히 제외한다.
용어 "스타틴"은 3-히드록시-3-메틸글루타릴 조효소 A (HMG-CoA) 리덕타제의 경쟁적 억제제인 약리 작용제의 한 클래스를 지칭한다.
도면의 간단한 설명
도 1은 모 마우스 모노클로날 항체 NVP-LFU720의 중쇄 (서열 1) 및 경쇄 (서열 15) 아미노산 서열을 예시한다. CDR1, CDR2 및 CDR3의 서열은 밑줄 및 볼드체 표시되어 있다.
도 2는 모 마우스 모노클로날 항체 NVP-LGT209의 중쇄 (서열 2) 및 경쇄 (서열 16) 아미노산 서열을 예시한다. CDR1, CDR2 및 CDR3의 서열은 밑줄 및 볼드체 표시되어 있다.
도 3은 모 마우스 모노클로날 항체 NVP-LGT210의 중쇄 (서열 2) 및 경쇄 (서열 18) 아미노산 서열을 예시한다. CDR1, CDR2 및 CDR3의 서열은 밑줄 및 볼드체 표시되어 있다.
도 4는 모 마우스 모노클로날 항체 NVP-LGT211의 중쇄 (서열 4) 및 경쇄 (서열 16) 아미노산 서열을 예시한다. CDR1, CDR2 및 CDR3의 서열은 밑줄 및 볼드체 표시되어 있다.
도 5a-c는 여러 다양한 인간 및 마우스 항원에 대한 NVP-LGT209 (a), NVP-LGT210 (b) 및 NVP-LGT-211 (c)의 결합의 ELISA 검정 시험을 NVP-LFU720-NX-4와 비교하여 예시한다.
도 6a-c는 인간 및 시노 Pcsk9에 대한 ELISA에서의 NVP-LGT209 (a), NVP-LGT210 (b) 및 NVP-LGT-211 (c)의 결합을 예시한다. 2차 항체는 염소 항-마우스이고, 1:5000으로 희석하였다. 2차 단독은 2차 항체 단독 대조군이다.
도 7은 모 마우스 모노클로날 항체 NVP-LFU720이 PCSK9의 C-말단, 잔기 680-692 (RSRHLAQASQELQ; 서열 49)에 결합한다는 것을 예시한다. 휴머니어드™(Humaneered™) 항체 LGT209, LGT210 및 LGT211은 동일한 에피토프에 대해 경쟁한다. C-말단 돌연변이체 A685X = 서열 56.
도 8은 모 마우스 항체 NVP-LFU720 (5P20)이, 시분해 형광 공명 에너지 전달 (TR-FRET) 생화학 검정으로 측정시 PCSK9 및 LDL-R 상호작용을 저조하게 방해한다는 것을 예시한다. 대조적으로, 13C10은 50 nM의 IC50으로 PCSK9-LDL-R FRET 상호작용을 방해한다. 형광단 (hPCSK9-AF)으로 표지된 인간 PCSK9를 검정 완충제 (20 mM HEPES (pH 7.2), 150 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 0.1％ v/v 트윈(Tween) 20, 및 0.1％ w/v BSA) 중 NVP-LFU720-AX-1 또는 13C10과 함께 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 최종 농도가 8 nM hPcsk9-AF 및 1 nM hLDL-R-Eu이도록 유로퓸-표지된 LDL-R (hLDL-R-Eu)을 첨가하고, 실온에서 90분 동안 추가로 인큐베이션하였다. TR-FRET 신호 (330 nm 여기 및 665 nm 방출)를 플레이트 판독기 (엔비전(EnVision) 2100, 퍼킨 엘머(Perkin Elmer))로 측정하고, 5P20 또는 13C10의 존재 하의 억제 ％를 계산하였다. IC50 값은 프리즘(Prism) (그래프패드(GraphPad))에서 억제 ％ 값을 플롯팅하여 계산하였다. 각각의 데이터 점은 평균 ± SD를 나타낸다 (점 당 n = 4 반복). 데이터는 2회 이상의 독립 실험을 대표한다.
도 9는 휴머니어드™ 항체 LGT209, LGT210 및 LGT211이 증가된 LDL-R 수준 및 HepG2 세포에 의한 LDL-흡수를 유발하는 데 있어 마우스 항체 LFU720과 동등하다는 것을 예시한다. LDL-R 측정을 위해, 세포를 PCSK9-결합 항체와 함께 인큐베이션하고, 항-LDL-R 항체로 표지하였다. LDL 흡수를 위해, 세포를 PCSK9-결합 항체, PCSK9 및 DiI-LDL과 함께 인큐베이션하였다. LDL-R 항체 및 DiI-LDL 형광을 유동 세포측정법에 의해 측정하였다. 반복 측정에 대한 평균 + SEM을 각각의 검정에 대해 나타내었다. 결과는 3회의 독립 실험을 대표한다.
LDL-흡수 검정을 위해, PCSK9-결합 항체를 10％ 소 태아 지단백질-결핍 혈청 (인트라셀(Intracel)) 및 200 nM 인간 PCSK9를 함유하는 DMEM 중에서 30분 동안 실온에서 인큐베이션하고 (문헌 [Hampton et al. PNAS (2007)104:14604-14609]), 항체/PCSK9/배지 용액을 96-웰 플레이트에서 세포에 첨가하고, 밤새 인큐베이션하였다. 다음날, 1,1'-디옥타데실-3,3,3',3'-테트라메틸-인도카르보시아닌 퍼클로레이트-표지된 LDL (DiI-LDL, 바이오메디칼 테크놀로지스(Biomedical Technologies))을 추가로 2시간 동안 첨가하였다. 이어서, 배지를 흡인하고, 세포를 PBS로 3회 세척하고, 세포를 0.25％ 트립신-EDTA를 사용하여 해리시켰다. 이어서, 세포를 FACS 완충제 (5％ 소 태아 혈청, 2 mM EDTA 및 0.2％ 나트륨 아지드를 함유하는 PBS) 중으로 옮기고, 1000 x g에서 10분 동안 원심분리하고, 흡인하고, 1％ 파라포름알데히드에 고정시켰다. LDL 흡수를 유동 세포측정법 (벡톤 디킨슨(Becton Dickinson) LSR II)을 이용하여 세포 DiI 형광 (488 nm에서 여기, 및 575 nm에서 방출)에 의해 측정하였다. 표면 LDL-R 검정을 위해, 세포를 항체를 함유하는 혈청-무함유 배지와 함께 인큐베이션하고, PBS로 세척하고, 베르신(Versine) (바이오휘태커(Biowhittaker), 17-771E) 및 FACS 완충제 중에서 수확하였다. 세포를 새로운 플레이트로 옮기고, 1200 rpm에서 5분 동안 원심분리하고, 정상 토끼 IgG (MP 바이오메디칼스(MP Biomedicals))를 사용하여 블로킹하였다. 세포를 FACS 완충제 중 토끼-항-hLDL-R-알렉사(Alexa) 647 IgG (5 μg/ml) 표지된 항체로 표지하고, 원심분리하고, 세척하고, 1％ 파라포름알데히드에 고정시켰다. 표면 LDL-R을 유동 세포측정법 (488 nm의 여기, 및 633 nm의 방출)에 의해 측정하였다. EC50을 프리즘 (그래프패드)을 이용하여 계산하였다.
도 10은 본 발명의 항체의 콜레스테롤 저하 효과를 측정하기 위한, 인간 PCSK9 주입 마우스 모델에 대한 연구 디자인의 개략도를 제공한다. LGT209, LGT210 및 LGT211은 뮤린 PCSK9에는 검출가능한 결합을 전혀 하지 않으면서 hPCSK9에 높은 친화도로 결합하는 휴머니어드™ 항-PCSK9 항체이다. LGT209, LGT210 또는 LGT211이 비-HDL 콜레스테롤의 hPCSK9-매개 상승을 억제하는 동시에 간 LDLR의 PCSK9-매개 분해를 방지할 수 있는지의 여부를 시험하기 위해, 항체를 마우스에 각각 주사하고, 3시간 후에 hPCSK9를 함유하는 삼투 미니-펌프를 이식하였다 (연속 주입을 위해). 혈장 및 간 조직 수확을 hPCSK9 주사 24시간 후에 수행하였다.
도 11은 항체 LGT209, LGT210 및 LGT211로의 처리가 주입 마우스 모델에서 인간 PCSK9 ("hPCSK9")의 축적을 일으켰다는 것을 보여준다. 간략하게, 포획용으로 mAb 7D16을 사용하는 ELISA에 의해 총 hPCSK9를 측정하였다. mAb 7D16은 LGT209, LGT210 및 LGT211과 상이한 PCSK9 상의 에피토프에 결합하고, 총 (유리 및 결합된) PCSK9를 측정하는 데 사용될 수 있다. 총 hPCSK9에서 관찰된 증가는 아마도 hPCSkK9/Ab 복합체의 증가로 인한 것이다. 포획용으로 hPCSK9를 사용하는 ELISA에 의해 유리 항체를 측정하였다. 상기 검정은 "유리" 항체를 측정하였으며, 가능하게는 1:1 Ab:PCSK9 복합체를 측정하였다. C57BL/6 마우스를 비히클 단독, PCSK9 단독, PCSK9 + 20 mg/kg LGT210, PCSK9 + 20 mg/kg NVP-LGT211 또는 마우스 비-특이적 IgG 혼합물 (음성 대조군)로 처리하였다. 개별 데이터 점을 플롯팅하고, 수평 바에 의해 평균 값의 경계를 표시하였고; p < 0.05를 유의한 것으로 간주하였다.
혈장 IgG 수준을 메조 스케일 디스커버리(Meso Scale Discovery; MSD) 검정에 의해 정량화하였다. 포획용으로 hPCSK9를 사용하여 유리 항체를 측정하였다. 상기 검정은 "유리" 항체를 측정하였으며, 가능하게는 1:1 Ab:PCSK9 복합체를 측정하였다. IgG MSD 검정을 위해, MSD 표준 96 플레이트 (L11XA-3)를 사용하였다. 간략하게, 플레이트를 25 내지 28 μl의 포획 항원 (PCSK9-His, PBS 중 1 μg/ml (25-28 ng/웰))으로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 코팅 용액을 제거하고, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 진탕시키면서 5％ MSD 차단제 A (R93AA-2) 150 μl/웰로 블로킹하였다. 플레이트를 PBS + 0.05％ 트윈-20 300 μl로 3회 세척한 후, 25 μl의 IgG 캘리브레이터 희석물 (MSD 차단제 A를 사용한 10,000에서 0.0003 ng/ml까지의 10개의 연속 희석물), 미지의 혈장 샘플 희석물 (MSD 차단제 A를 사용하여 10,000X) 또는 특성 대조군 샘플을 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 진탕시키면서 인큐베이션하였다. 세척한 후, 1 μg/ml 검출 항체 (1％ BSA / PBS / 0.05％ 트윈 20으로 희석된, MSD 염소 항-마우스 술포-태그(SULFO-TAG) 표지된 검출 항체 R32AC-5) 25 μl/웰을 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 진탕시키면서 인큐베이션하였다. 세척하고 1X 판독 완충제 T 150 μl/웰을 첨가한 후, 플레이트를 즉시 MSD 섹터(SECTOR) 이미저 6000 상에서 판독하였다. 표준 곡선 및 미지의 샘플의 플롯을 MSD 데이터 분석 소프트웨어를 이용하여 계산하였다.
혈장 IgG 및 hPCSK9 수준을 둘 다 메조 스케일 디스커버리 (MSD) 검정에 의해 정량화하였다. MSD hPCSK9 검정은 하기 예외를 제외하면 IgG 검정과 유사하다. 플레이트를 1 μg/ml의 포획 항체 (7D16.C3: 2.95 mg/ml) 25-28 μl로 코팅하였다. mAb 7D16은 LGT209, LGT210 및 LGT211과 상이한 PCSK9 상의 에피토프에 결합하고, 총 (유리 및 결합된) PCSK9를 측정하는 데 사용될 수 있다. 플레이트를 블로킹한 후, 25 μl의 hPCSK9 캘리브레이터 희석물 (10,000에서 0.0003 ng/ml까지의 10개 지점), 혈장 샘플 희석물 (MSD 차단제 A를 사용하여 10,000X)을 실온에서 1시간 동안 진탕시키면서 인큐베이션하고, 이어서 1차 검출 항체 (토끼 항-PCSK9 폴리클로날 항체, Ab4, 실험실내 토끼 ID #RB11835)와 함께 인큐베이션하였다. 2차 검출 항체 (MSD 염소 항-토끼 술포-태그 표지된 검출 항체 R32AB-5)와의 인큐베이션 단계를 추가한 후, MSD 섹터 이미저 6000을 사용하여 판독하였다. 총 hPCSK9에서 관찰된 증가는 아마도 hPCSkK9/Ab 복합체의 증가로 인한 것이다. 통계적 분석을 그래프패드 프리즘 4.02 (캘리포니아주 샌디에고, 그래프패드 소프트웨어(GraphPad software))를 이용하여 수행하였다. 일원 ANOVA를 이용하여 군 편차를 분석하였고, 전반적 편차가 발견되는 경우에는 뉴만-쿨스(Newman-Keuls) 사후검정을 이용하여 처리군 사이의 특이적 편차를 결정하였다.
도 12는 항체 LGT209, LGT210 및 LGT211이 주입 마우스 모델에서 hPCSK9-매개 분해로부터의 간 LDL-R의 보호를 유발한다는 것을 예시한다. C57BL/6 마우스를 비히클 단독, PCSK9 단독, PCSK9 + 20 mg/kg LGT210, PCSK9 + 20 mg/kg NVP-LGT211 또는 마우스 비-특이적 IgG 혼합물 (음성 대조군)로 처리하였다. 개별 동물로부터의 간 샘플을 나타내었다.
원형질 막 샘플의 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을, MOPS 러닝 완충제 (인비트로젠(Invitrogen) NP0001)와 함께 20-레인 4-12％ 비스-트리스 인비트로젠 미디(Midi) 겔 (인비트로젠 WG1402BX10)을 사용하여 수행하였다. 제조된 샘플을 10분 동안 70℃에서 가열하고, 얼음 상에 위치시킨 다음, 매트릭스(Matrix) 다중-채널 피펫터를 사용하여 각각의 샘플 10 μl를 겔 상에 로딩하였다. 크기 결정 및 겔 방향표시를 위해 시블루 플러스2(SeeBlue Plus2) 마커 (인비트로젠 LC5925)를 샘플 옆에 로딩하였다. 겔을 염료 전방이 겔의 하단에 도달할 때까지 200V의 일정한 전압에서 러닝시켰다. 전기영동 후, 겔을 iBlot 유닛 (인비트로젠 IB1001EU)을 사용하여 니트로셀룰로스 막 (인비트로젠 IB3010-01)으로 이동시켰다. 이동은 7분 동안 20V에서 수행하였다. 이동 후, 막을 적어도 30분 동안 피어스(Pierce) 슈퍼블록(Superblock) T20 (피어스 37536)을 사용하여 블로킹하였다. 막을 "실-어-밀(seal-a-meal)" 백에 넣은 다음, 슈퍼블록 중 토끼 항-LDLR 항체의 1:500 희석물을 첨가한 후, 요동시키면서 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 막을 TBS/0.05％ 트윈 중에서 요동시키면서 5분 동안 5회 헹군 다음, 슈퍼블록 중 염소 항-토끼 HRP 2차 항체의 1:30,000 희석물을 1시간 동안 막에 첨가하였다. 막을 다시 TBS/0.05％ 트윈 중에서 요동시키면서 5분 동안 5회 헹구었다. 피어스 슈퍼시그널 웨스트 피코(SuperSignal West Pico) 화학발광 기질 (피어스 37079)을 제조업체의 지시에 따라 사용하여 HRP-접합체를 검출하였다. 간략하게, 동일부의 퍼옥시드 용액과 루미놀/인핸서(Luminol/Enhancer) 용액을 혼합하고, 5분 동안 막에 첨가하였다 (0.2 ml/cm2). 과잉 용액을 블롯팅에 의해 제거하고, 막을 노출용 코닥(Kodak) 바이오맥스(BioMax) MR X선 필름 (코닥 870 1302)에 노출시켰다.
도 13A-C는 항체 LGT209, LGT210 및 LGT211이 hPCSK9 주입 마우스 모델에서 혈장 비-HDL-콜레스테롤의 감소를 유발한다는 것을 예시한다. LGT209 항체의 예비-주사는 비-HDL 콜레스테롤의 hPCSK9-매개 상승으로부터의 46％의 보호를 일으켰다. LGT210 또는 LGT211의 예비-주사는 비-HDL 콜레스테롤의 hPCSK9-매개 상승으로부터의 동등하거나 더 큰 보호를 일으켰다. 13C10은, 높은 친화도로 hPCSK9에 결합하고 본 검정의 경우에 양성 대조군으로서 사용된, 허가된 뮤린 항-PCSK9 항체이다. C57BL/6 마우스를 비히클 단독, PCSK9 단독, PCSK9 + 20 mg/kg LGT209, PCSK9 + 20 mg/kg LGT210, PCSK9 + 20 mg/kg NVP-LGT211, PCSK9 + 20 mg/kg 13C10 또는 마우스 비-특이적 IgG 혼합물 (음성 대조군)로 처리하였다. 개별 값을 수평 바에 의해 경계가 표시된 평균 값으로 나타내었다. 혈장 총 콜레스테롤 수준을 정량화하기 위해, 올림푸스(Olympus) 임상 분석기 (올림푸스 아메리카 인크.(Olympus America Inc.): 올림푸스 AU400)를 사용하였다. 혈장 샘플을 ddH2O 중에 1:3으로 희석하고, 희석된 혈장 샘플 40 μl를 제조업체의 지시에 따라 총 콜레스테롤 수준에 대해 정량화하였다. 혈장 HDL 및 비-HDL을 정량화하기 위해, 지단백질 콜레스테롤 분획을 헬레나 래보러토리즈(Helena Laboratories)로부터의 스파이프(Spife) 3000을 사용하여 수득하였다. 샘플 제조, 겔 제조, 샘플 적용, 겔 전기영동, 염색, 세척 및 건조를 비롯한 모든 절차는 조작자의 매뉴얼에 제공된 지시를 따랐다. 이어서, 겔을 퀵 스캔 2000(Quick Scan 2000)에서 슬릿(Slit) 5를 사용하여 스캐닝하고, 지단백질 콜레스테롤 분획의 상대적 백분율을 헬레나 농도계를 사용하여 계산하였다. 최종적으로, HDL 및 비-HDL의 절대값을, 각각의 분획의 백분율과 총 콜레스테롤 수준을 곱하여 계산하였다.
도 14는 "전형적인" IgG1 (PK) 프로파일과 비교하여 항체 LGT209, LGT210 및 LGT211 (인간 IgG1-침묵)에 대한 래트 약동학 (PK) 프로파일을 예시한다. 항체 LGT209, LGT210 및 LGT211의 반감기는 (예를 들어, 인간 대상체에서 측정시) 전형적인 IgG1 반감기 (약 6일)와 비교하여 현저하게 길다 (7-13일). 항체가 설치류 PCSK9와 교차-반응성이 아님을 나타내는 표적 매개 배치 (TMD)의 어떠한 증거도 없었다. 각각의 시험 항체에 대해, 3마리의 수컷 루이스(Lewis) 래트에 10 mg/kg을 주사하였다. 시간 = 0, 1, 6, 24시간, 2, 4, 8 및 16일에, 250 μl의 혈액을 샘플링하고, 투명한 혈청을 희석하고, 포획 ELISA (염소 항-인간 IgG)로 평가하여, 회수된 총 인간 항체를 측정하였다. 표준 곡선을 또한 각각의 시험 항체에 대해 생성하였다. 회수된 IgG의 양을 래트에서 전형적인 인간 IgG의 예상되는 회수에 대해 그래프화하였다.
상세한 설명
1. 서론
본 발명의 항체 및 항원 결합 분자는 전구단백질 컨버타제 서브틸리신/켁신 유형 9a ("PCSK9")에 특이적으로 결합한다. 본 발명의 항-PCSK9 항체 및 항원 결합 분자는 PCSK9의 C-말단에 결합하고, LDL-R에 대한 PCSK9의 결합을 방해하지 않으면서 저밀도 지단백질 수용체 (LDL-R)의 PCSK9-매개 분해를 방해하는 예기치 못한 특성을 갖는다. 특히, 상기 항-PCSK9 항체 및 항원 결합 분자는 PCSK9의 C-말단 끝에 위치한 PCSK9의 잔기 680-692 내의 에피토프, 예를 들어 아미노산 서열 RSRHLAQASQELQ (서열 49) 내의 에피토프에 결합한다. 본 발명의 항체 및 항원 결합 분자가 단지 순환 PCSK9에만 결합하기보다는 세포 상에 결합된 PCSK9에도 결합하기 때문에, 이들은 환자에서 비교적 더 긴 (예를 들어, 적어도 약 7일 또는 더 긴) 생체내 반감기를 갖고, 일부 실시양태에서는 투여 후 적어도 2주 동안 지질-저하 효과를 제공한다. 본 발명의 항-PCSK9 항체 및 항원 결합 분자는, 이들이 LDL-R의 PCSK9-매개 분해를 방지하고/거나, 감소시키고/거나 억제하고, 그로 인해 저밀도 지단백질 콜레스테롤 (LDL-C) 흡수의 증가를 촉진시킨다는 점에서 PCSK9의 길항제이다. 상기 항-PCSK9 항체 및 항원 결합 분자는, 예를 들어 이상지혈증, 고콜레스테롤혈증, 트리글리세리드혈증 및 다른 PCSK9-매개 질환 상태로부터 고통받는 대상체를 치료하는 데 유용하다.
2. 일반적으로 개선된 항- PCSK9 항체
전장 모노클로날 항체가 예를 들어 하이브리도마 또는 재조합 생산에 의해 수득될 수 있는 반면에, 항-PCSK9 항체 단편은 재조합 발현, 화학적 합성, 및 항체 사량체의 효소적 소화를 비롯하여 (이에 제한되지 않음) 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 생성될 수 있다. 재조합 발현은 당업계에 공지된 임의의 적절한 숙주 세포, 예를 들어 포유동물 숙주 세포, 박테리아 숙주 세포, 효모 숙주 세포, 곤충 숙주 세포 등으로부터 일어날 수 있다. 존재하는 경우에, 항-PCSK9 항체의 불변 영역은, 적절한 한, 임의의 유형 또는 하위유형일 수 있고, 본 발명의 방법에 의해 치료할 대상체의 종 (예를 들어, 인간, 비-인간 영장류, 또는 다른 포유동물, 예를 들어 농경 포유동물 (예를 들어, 말, 양, 소, 돼지, 낙타류), 가축 포유동물 (예를 들어, 개, 고양이) 또는 설치류 (예를 들어, 래트, 마우스, 햄스터, 토끼))으로부터의 것이도록 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 인간화되거나 또는 휴머니어드™이다. 일부 실시양태에서, 불변 영역 이소형은 IgG, 예를 들어 IgG1이다. 일부 실시양태에서, 인간 IgG1 불변 영역은 세포 또는 보체의 C1 성분 상의 이펙터 리간드, 예컨대 Fc 수용체 (FcR), 예를 들어 Fc 감마 R1에 대해 감소된 결합 친화도를 갖도록 돌연변이된다. 예를 들어, 미국 특허 제5,624,821호를 참조한다. 이러한 돌연변이를 함유하는 항체는 항체-의존성 세포 세포독성 (ADCC) 또는 보체-의존성 세포독성 (CDC)이 감소되거나 없도록 조정한다. 일부 실시양태에서, IgG1 불변 영역의 아미노산 잔기 L234 및 L235는 Ala234 및 Ala235로 치환된다. 중쇄 불변 영역의 잔기의 넘버링은 EU 인덱스의 넘버링이다 (문헌 [Kabat, et al., (1983) "Sequences of Proteins of Immunological Interest," U.S. Dept. Health and Human Services] 참조). 또한, 예를 들어 문헌 [Woodle, et al., Transplantation (1999) 68(5):608-616]; [Xu, et al., Cell Immunol (2000) 200(1):16-26]; 및 [Hezareh, et al., J Virol 75(24):12161-8]을 참조한다.
본 발명의 항-PCSK9 항체 또는 항원 결합 분자는 또한 낙타류 스캐폴드를 갖는 단일 도메인 항원 결합 단위를 포함한다. 낙타류 패밀리의 동물은 낙타, 라마 및 알파카를 포함한다. 낙타류는 경쇄가 없는 기능적 항체를 생성한다. 중쇄 가변 (VH) 도메인은 자발적으로 폴딩되고, 항원 결합 단위로서 독립적으로 기능한다. 그의 결합 표면은, 전형적인 항원 결합 분자 (Fab) 또는 단일 쇄 가변 단편 (scFv)의 6개의 CDR에 비해 단지 3개의 CDR만을 포함한다. 낙타류 항체는 통상적인 항체의 결합 친화도와 유사한 결합 친화도를 달성할 수 있다. 본원에 예시된 항-PCSK9 항체의 결합 특이성을 갖는 낙타류 스캐폴드-기반 항-PCSK9 분자는 당업계에 널리 공지된 방법, 예를 들어 문헌 [Dumoulin et al., Nature Struct. Biol. 11:500-515, 2002]; [Ghahroudi et al., FEBS Letters 414:521-526, 1997]; 및 [Bond et al., J Mol Biol. 332:643-55, 2003]의 방법을 이용하여 생성될 수 있다.
본 발명의 개선된 항-PCSK9 항체는 참조 항체의 특이성 및 친화도를 유지하면서, 인간 배선 V-영역 서열에 대한 실질적인 아미노산 서열 동일성을 갖는 V-영역 서열을 갖는 조작된 인간 항체이다. 미국 특허 공보 제2005/0255552호 및 미국 특허 공보 제2006/0134098호 (둘 다 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다. 개선 방법은, 참조 항체의 가변 영역으로부터 항원 결합 특이성을 결정하기 위해 필요한 최소 서열 정보를 확인하고, 상기 정보를 인간 부분적 V-영역 유전자 서열의 라이브러리에 전달하여 인간 항체 V-영역의 에피토프-집중 라이브러리를 생성한다. 미생물-기반 분비 시스템을 이용하여 항체 Fab 단편으로서 라이브러리의 구성원을 발현시킬 수 있고, 라이브러리를 예를 들어 콜로니-리프트 결합 검정을 이용하여 항원 결합 Fab에 대해 스크리닝한다. 예를 들어, 미국 특허 공보 제2007/0020685호를 참조한다. 양성 클론은 최고 친화도를 갖는 클론을 확인하기 위해서 추가로 특징규명할 수 있다. 생성된 조작된 인간 Fab는 모 항체, 즉, 참조 항-PCSK9 항체의 결합 특이성을 유지하고, 전형적으로 모 항체와 비교하여 항원에 대해 동등하거나 더 높은 친화도를 갖고, 인간 배선 항체 V-영역과 비교하여 고도의 서열 동일성을 갖는 V-영역을 갖는다.
에피토프-집중 라이브러리를 생성하기 위해 필요한 최소 결합 특이성 결정자 (BSD)는 일반적으로 중쇄 CDR3 ("CDRH3") 내의 서열 및 경쇄 CDR3 ("CDRL3") 내의 서열에 의해 제시된다. BSD는 CDR3의 일부 또는 전체 길이를 포함할 수 있다. BSD는 연속적인 또는 비-연속적인 아미노산 잔기로 이루어질 수 있다. 일부 경우에, 에피토프-집중 라이브러리는 BSD를 함유하는 참조 항체로부터의 특유한 CDR3-FR4 영역에 연결된 인간 V-절편 서열 및 인간 배선 J-절편 서열로부터 구축한다 (미국 특허 공보 제2005/0255552호 참조). 대안적으로, 인간 V-절편 라이브러리는 참조 항체 V-절편의 일부만이 처음에 인간 서열의 라이브러리로 교체되는 순차적인 카세트 교체에 의해 생성할 수 있다. 이어서, 나머지 참조 항체 아미노산 서열의 측면에서 결합을 지지하는 확인된 인간 "카세트"를 제2 라이브러리 스크리닝에서 재조합시켜 완전 인간 V-절편을 생성한다 (미국 특허 공보 제2006/0134098호 참조).
각 경우에, 라이브러리로부터 얻은 항원-결합제가 참조 항체의 에피토프-특이성을 유지하도록, 참조 항체로부터의 특이성 결정자를 함유하는 페어링된 중쇄 및 경쇄 CDR3 절편, CDR3-FR4 절편, 또는 J-절편이 결합 특이성을 제약하기 위해 사용된다. 라이브러리 구축 동안 각 쇄의 CDR3 영역 내에 추가의 성숙 변화를 도입하여 최적의 결합 동역학을 갖는 항체를 확인할 수 있다. 생성된 조작된 인간 항체는 인간 배선 라이브러리로부터 유도된 V-절편 서열을 갖고, CDR3 영역 내부로부터의 짧은 BSD 서열을 유지하고, 인간 배선 프레임워크 4 (FR4) 영역을 갖는다.
따라서, 일부 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 본래의 또는 참조 모노클로날 항체로부터 유도된 중쇄 및 경쇄의 CDR3 내부의 최소 결합 서열 결정자 (BSD)를 함유한다. 중쇄 및 경쇄 가변 영역 (CDR 및 FR)의 나머지 서열, 예를 들어 V-절편 및 J-절편은 상응하는 인간 배선 및 친화도 성숙 아미노산 서열로부터 온 것이다. V-절편은 인간 V-절편 라이브러리로부터 선택될 수 있다. 추가의 서열 정밀화는 친화도 성숙에 의해 달성할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 항-PCSK9 항체의 중쇄 및 경쇄는, 예를 들어 인간 V-절편 라이브러리로부터 선택되는 상응하는 인간 배선 서열로부터의 인간 V-절편 (FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3), 및 본래의 모노클로날 항체로부터의 CDR3-FR4 서열 절편을 함유한다. CDR3-FR4 서열 절편은 서열 절편의 상응하는 인간 배선 서열로의 교체 및/또는 친화도 성숙에 의해 추가로 정밀화될 수 있다. 예를 들어, BSD 주위의 FR4 및/또는 CDR3 서열은 상응하는 인간 배선 서열로 교체될 수 있는 반면, 본래의 모노클로날 항체의 CDR3으로부터의 BSD는 유지된다.
일부 실시양태에서, 중쇄 V-절편에 대한 상응하는 인간 배선 서열은 Vh1-02이다. 일부 실시양태에서, 중쇄 J-절편에 대한 상응하는 인간 배선 서열은 JH4이다. 일부 실시양태에서, 중쇄 J-절편은 인간 배선 JH4 부분 서열 WGQGTLVTVSS (서열 50)를 포함한다. 인간 배선 JH4로부터의 전장 J-절편은 YFDYWGQGTLVTVSS (서열 51)이다. 가변 영역 유전자는 이뮤노글로불린 가변 영역 유전자에 대한 표준 명명법에 따라 지칭된다. 현재의 이뮤노글로불린 유전자 정보는 월드와이드 웹을 통해서, 예를 들어 ImMunoGeneTics (IMGT), V-base 및 PubMed 데이터베이스 상에서 이용가능하다. 또한, 문헌 [Lefranc, Exp Clin Immunogenet. 2001;18(2):100-16]; [Lefranc, Exp Clin Immunogenet. 2001;18(3):161-74]; [Exp Clin Immunogenet. 2001;18(4):242-54]; 및 [Giudicelli, et al., Nucleic Acids Res. 2005 Jan 1;33(Database issue):D256-61]을 참조한다.
일부 실시양태에서, 경쇄 V-절편에 대한 상응하는 인간 배선 서열은 VK3 L6이다. 일부 실시양태에서, 경쇄 J-절편에 대한 상응하는 인간 배선 서열은 Jk2이다. 일부 실시양태에서, 경쇄 J-절편은 인간 배선 Jk2 부분 서열 FGQGTKLEIK (서열 52)를 포함한다. 인간 배선 Jk2로부터의 전장 J-절편은 YTFGQGTKLEIK (서열 53)이다.
일부 실시양태에서, 중쇄 V-절편은 아미노산 서열 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFS(D/T)MYMSWVRQAPGQGLEWMGRIDPAN(A/E/G)HTNY(A/D)(P/Q)KFQ(A/G)RVTMTRDTSISTAYMELSRLTSDDTAVYYCAR (서열 28)에 대해 적어도 85％, 89％, 90％, 93％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 또는 100％의 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 중쇄 V-절편은 아미노산 서열 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFSTMYMSWVRQAPGQGLEWMGRIDPANEHTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLTSDDTAVYYCAR (서열 27)에 대해 적어도 85％, 89％, 90％, 93％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 또는 100％의 서열 동일성을 갖는다.
일부 실시양태에서, 경쇄 V-절편은 아미노산 서열 (E/Q)IV(L/M)TQSPATLSVSPGERATLSC(R/S)AS(Q/S)SVSYMHWYQQKPGQAPRLLIY(G/L)(T/V)F(N/R)(L/R)A(S/T)GIPDRFSGSGSGTDFTLTIGRLEPEDFAVYYC (서열 31)에 대해 적어도 85％, 89％, 90％, 93％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 또는 100％의 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 중쇄 V-절편은 아미노산 서열 QIVLTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSYMHWYQQKPGQAPRLLIYGVFRRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTIGRLEPEDFAVYYC (서열 29)에 대해 적어도 85％, 89％, 90％, 93％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 또는 100％의 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 중쇄 V-절편은 아미노산 서열 EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSYMHWYQQKPGQAPRLLIYGVFRRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTIGRLEPEDFAVYYC (서열 30)에 대해 적어도 85％, 89％, 90％, 93％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 또는 100％의 서열 동일성을 갖는다.
일부 실시양태에서:
i) 중쇄 CDR3은 아미노산 서열 SYYYY(A/N)MD(A/F/S/V/Y) (서열 14)를 포함하고;
ii) 경쇄 CDR3 가변 영역은 아미노산 서열 LQWSSDPPT (서열 26)를 포함한다.
일부 실시양태에서:
i) 중쇄 CDR3은 서열 12 및 서열 13으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고;
ii) 경쇄 CDR3은 서열 26의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 아미노산 서열 (D/T)MYMS (서열 8)를 포함하는 CDR1; 아미노산 서열 RIDPAN(A/E/G)HTNY(A/D)(P/Q)KFQ(A/G) (서열 11)를 포함하는 CDR2; 및 SYYYY(A/N)MD(A/F/S/V/Y) (서열 14)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 아미노산 서열 (R/S)AS(Q/S)SVSYMH (서열 22)를 포함하는 CDR1; 아미노산 서열 (G/L)(T/V)F(N/R)(L/R)A(S/T) (서열 25)를 포함하는 CDR2; 및 LQWSSDPPT (서열 26)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열 32의 아미노산 서열을 포함하는 FR1; 서열 33의 아미노산 서열을 포함하는 FR2; 서열 34의 아미노산 서열을 포함하는 FR3; 및 서열 35의 아미노산 서열을 포함하는 FR4를 포함한다. 확인된 아미노산 서열은 1개 이상의 치환된 아미노산 (예를 들어, 친화도 성숙으로부터), 또는 1 또는 2개의 보존적으로 치환된 아미노산을 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 경쇄 가변 영역은 서열 36의 아미노산 서열을 포함하는 FR1; 서열 37의 아미노산 서열을 포함하는 FR2; 서열 38의 아미노산 서열을 포함하는 FR3; 및 서열 39의 아미노산 서열을 포함하는 FR4를 포함한다. 확인된 아미노산 서열은 1개 이상의 치환된 아미노산 (예를 들어, 친화도 성숙으로부터), 또는 1 또는 2개의 보존적으로 치환된 아미노산을 가질 수 있다.
그의 전장에 걸쳐, 본 발명의 항-PCSK9 항체의 가변 영역은 일반적으로, 상응하는 인간 배선 가변 영역 아미노산 서열에 대해 적어도 약 85％, 예를 들어 적어도 약 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 또는 100％의 전체 가변 영역 (예를 들어, FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4) 아미노산 서열 동일성을 가질 것이다. 예를 들어, 항-PCSK9 항체의 중쇄는 인간 배선 가변 영역 Vh1-02에 대해 적어도 약 85％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 또는 100％의 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있다. 항-PCSK9 항체의 경쇄는 인간 배선 가변 영역 VK3 L6에 대해 적어도 약 85％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 또는 100％의 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 프레임워크 영역 내의 아미노산만이 첨가, 결실 또는 치환된다. 일부 실시양태에서, 서열 동일성 비교는 CD3을 제외한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항-PCSK9 항체는 서열 40의 중쇄 가변 영역에 대해 적어도 85％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 또는 100％의 아미노산 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 서열 41 (즉, 컨센서스 서열)의 경쇄 가변 영역에 대해 적어도 85％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 또는 100％의 아미노산 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항-PCSK9 항체는 서열 1의 중쇄 가변 영역에 대해 적어도 85％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 또는 100％의 아미노산 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 서열 15 (즉, 마우스 LFU720)의 경쇄 가변 영역에 대해 적어도 85％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 또는 100％의 아미노산 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항-PCSK9 항체는 서열 2의 중쇄 가변 영역에 대해 적어도 85％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 또는 100％의 아미노산 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 서열 16 (즉, LGT-209)의 경쇄 가변 영역에 대해 적어도 85％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 또는 100％의 아미노산 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항-PCSK9 항체는 서열 2의 중쇄 가변 영역에 대해 적어도 85％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 또는 100％의 아미노산 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 서열 18 (즉, LGT-210)의 경쇄 가변 영역에 대해 적어도 85％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 또는 100％의 아미노산 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항-PCSK9 항체는 서열 4의 중쇄 가변 영역에 대해 적어도 85％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 또는 100％의 아미노산 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 서열 16 (즉, LGT-211)의 경쇄 가변 영역에 대해 적어도 85％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 또는 100％의 아미노산 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항-PCSK9 항체는 서열 3의 중쇄 가변 영역에 대해 적어도 85％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 또는 100％의 아미노산 서열 동일성을 갖는 중쇄 폴리펩티드를 포함하고, 서열 17 (즉, LGT-209)의 경쇄 가변 영역에 대해 적어도 85％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 또는 100％의 아미노산 서열 동일성을 갖는 경쇄 폴리펩티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항-PCSK9 항체는 서열 3의 중쇄 가변 영역에 대해 적어도 85％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 또는 100％의 아미노산 서열 동일성을 갖는 중쇄 폴리펩티드를 포함하고, 서열 19 (즉, LGT-210)의 경쇄 가변 영역에 대해 적어도 85％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 또는 100％의 아미노산 서열 동일성을 갖는 경쇄 폴리펩티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항-PCSK9 항체는 서열 5의 중쇄 가변 영역에 대해 적어도 85％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 또는 100％의 아미노산 서열 동일성을 갖는 중쇄 폴리펩티드를 포함하고, 서열 17 (즉, LGT-211)의 경쇄 가변 영역에 대해 적어도 85％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 또는 100％의 아미노산 서열 동일성을 갖는 경쇄 폴리펩티드를 포함한다.
길이가 20개 미만의 아미노산인 확인된 아미노산 서열에 대해, 1 또는 2개의 보존적 아미노산 잔기 치환은 목적하는 특이적 결합 및/또는 길항제 활성을 여전히 유지하는 한 허용될 수 있다.
본 발명의 항-PCSK9 항체는 일반적으로 약 10-8 M 또는 10-9 M 미만, 예를 들어 약 10-10 M 또는 10-11 M 미만, 일부 실시양태에서 약 10-12 M 또는 10-13 M 미만의 평형 해리 상수 (KD)로 PCSK9에 결합할 것이다.
항-PCSK9 항체는 임의로 본 발명의 방법에 따라 다량체화되어 사용될 수 있다. 항-PCSK9 항체는 전장 사량체 항체 (즉, 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 가짐), 단일 쇄 항체 (예를 들어, scFv), 또는 하나 이상의 항원 결합 부위를 형성하고 PCSK9-결합 특이성을 부여하는 항체 단편을 포함하는, 예를 들어 중쇄 및 경쇄 가변 영역 (예를 들어, Fab' 또는 다른 유사한 단편)을 포함하는 분자일 수 있다.
본 발명은 본원에 기재된 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 또는 절편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 제공한다. 일부 실시양태에서, 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열 42, 서열 43 및 서열 54로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드와 적어도 85％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 또는 100％의 핵산 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열 44, 서열 45 및 서열 55로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드와 적어도 85％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 또는 100％의 핵산 서열 동일성을 갖는다.
일부 실시양태에서, 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열 42의 폴리뉴클레오티드와 적어도 85％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 또는 100％의 핵산 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열 45 (즉, LGT-209)의 폴리뉴클레오티드와 적어도 85％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 또는 100％의 핵산 서열 동일성을 갖는다.
일부 실시양태에서, 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열 42로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드와 적어도 85％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 또는 100％의 핵산 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열 44 (즉, LGT-210)로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드와 적어도 85％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 또는 100％의 핵산 서열 동일성을 갖는다.
일부 실시양태에서, 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열 43으로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드와 적어도 85％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 또는 100％의 핵산 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열 45 (즉, LGT-211)로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드와 적어도 85％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 또는 100％의 핵산 서열 동일성을 갖는다.
일부 실시양태에서, 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열 54의 폴리뉴클레오티드와 적어도 85％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 또는 100％의 핵산 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열 55 (즉, 마우스 LFU720)의 폴리뉴클레오티드와 적어도 85％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 또는 100％의 핵산 서열 동일성을 갖는다.
3. 항- PCSK9 항체를 확인하기 위한 검정
길항제 항체는 항-PCSK9 항체를 생성한 다음, 각각의 항체를 PCSK9 매개 사건, 예를 들어 LDLR에 결합하는 것, LDLR의 분해를 촉진시키는 것을 감소시키거나 억제하는 능력에 대해 시험함으로써 확인할 수 있다. 검정은 시험관내 또는 생체내에서 수행할 수 있다. 바람직한 항체는 PCSK9에 결합하고, PCSK9가 LDLR에 결합하는 것을 방지하지 않고, LDLR의 PCSK9-매개 분해를 감소시키거나 억제한다.
PCSK9에 대한 항체 또는 항원 결합 분자의 결합은 당업계에 공지된 임의의 방법 (비제한적으로 ELISA, 비아코어(Biacore) 및 웨스턴 블롯(Western Blot) 포함)을 이용하여 측정할 수 있다.
LDLR의 PCSK9-매개 분해는 또한 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용하여 측정할 수 있다. 한 실시양태에서, LDLR 분해를 억제하는 항-PCSK9 항체 또는 항원 결합 분자의 능력은 주입 마우스 모델을 이용하여 측정한다. 항-PCSK9 항체 또는 항원 결합 분자를 마우스에 정맥내로 주입 (예를 들어, 3 μg/시간)하고, 간 막 시료 중의 LDLR 수준을 대조군 항체 (예를 들어, 관계없는 항원에 결합함)의 정맥내 주입을 제공받은 마우스로부터의 간 막 시료 중 LDLR 수준과 비교하여 측정한다. 길항제 항-PCSK9 항체를 제공받은 마우스는 대조군 항체를 제공받은 마우스와 비교하여 검출가능하게 더 높은, 예를 들어 적어도 10％, 20％, 50％, 80％, 100％ 더 높은 수준의 LDLR을 가질 것이다.
항-PCSK9 길항제 항체를 또한 LCL-C, 비-HDL-C 및/또는 총 콜레스테롤의 혈장 수준을 감소시킴에 있어서의 그의 치료 효능에 대해 시험할 수 있다. 항-PCSK9 항체 또는 항원 결합 분자를 포유동물 (예를 들어, 마우스, 래트, 비-인간 영장류, 인간)에 정맥내로 주입 (예를 들어, 3 μg/시간)하고, LCL-C, 비-HDL-C 및/또는 총 콜레스테롤의 혈장 수준을 처리 전의 동일한 포유동물로부터 또는 대조군 항체 (예를 들어, 관계없는 항원에 결합함)의 정맥내 주입을 제공받은 포유동물로부터의 LCL-C, 비-HDL-C 및/또는 총 콜레스테롤의 혈장 수준과 비교하여 측정한다. 길항제 항-PCSK9 항체를 제공받은 포유동물은 처리 전의 포유동물 또는 대조군 항체를 제공받은 포유동물과 비교하여 검출가능하게 더 낮은, 예를 들어 적어도 10％, 20％, 50％, 80％, 100％ 더 낮은 LCL-C, 비-HDL-C 및/또는 총 콜레스테롤의 혈장 수준을 가질 것이다.
4. 항- PCSK9 항체를 포함하는 조성물
본 발명은 제약상 허용되는 담체와 함께 제제화된 항-PCSK9 항체 또는 항원 결합 분자를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 주어진 장애를 치료 또는 예방하기에 적합한 다른 치료제를 추가로 함유할 수 있다. 제약상 담체는 조성물을 향상시키거나 안정화시키거나, 또는 조성물의 제조를 용이하게 한다. 제약상 허용되는 담체는 생리학상 상용성인 용매, 분산 매질, 코팅제, 항박테리아제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다.
본 발명의 제약 조성물은 당업계에 공지된 다양한 방법으로 투여할 수 있다. 투여 경로 및/또는 방식은 목적하는 결과에 따라 달라진다. 투여가 정맥내, 근육내, 복강내 또는 피하이거나, 표적 부위에 근접하게 투여되는 것이 바람직하다. 제약상 허용되는 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 비내, 흡입, 척수 또는 표피 투여 (예를 들어, 주사 또는 주입에 의함)에 적합해야 한다. 투여 경로에 따라, 활성 화합물 (즉, 항체, 이중특이적 및 다중특이적 분자)은 산의 작용 및 화합물을 불활성화시킬 수 있는 다른 천연 조건으로부터 화합물을 보호하는 물질로 코팅될 수 있다.
항체는 단독으로 또는 다른 적합한 성분과 조합하여 에어로졸 제제 (즉, 이는 "분무화"될 수 있음)로 제조되어 흡입을 통해 투여될 수 있다. 에어로졸 제제는 허용가능한 가압 추진제, 예컨대 디클로로디플루오로메탄, 프로판, 질소 등 중에 위치할 수 있다.
일부 실시양태에서, 조성물은 멸균 상태 및 유체이다. 적당한 유동성은 예를 들어 레시틴과 같은 코팅제의 사용에 의해, 분산액의 경우에는 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 많은 경우에, 등장화제, 예를 들어 당, 폴리알콜, 예컨대 만니톨 또는 소르비톨, 및 염화나트륨을 조성물 내에 포함시키는 것이 바람직하다. 주사가능한 조성물의 장기간 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 또는 젤라틴을 조성물 중에 포함시킴으로써 유도될 수 있다.
본 발명의 제약 조성물은 당업계에 널리 공지되고 통상적으로 실시되는 방법에 따라 제조할 수 있다. 제약상 허용되는 담체는 투여될 특정 조성물에 의해서 뿐만 아니라 조성물을 투여하는 데 이용되는 특정 방법에 의해서 부분적으로 결정된다. 따라서, 본 발명의 제약 조성물의 다양한 적합한 제제가 존재한다. 항체를 제제화하고 적절한 투여량 및 스케쥴을 결정하는 데 적용가능한 방법은, 예를 들어 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed., University of the Sciences in Philadelphia, Eds., Lippincott Williams & Wilkins (2005)]; 및 [Martindale: The Complete Drug Reference, Sweetman, 2005, London: Pharmaceutical Press.] 및 [Martindale, Martindale: The Extra Pharmacopoeia, 31st Edition., 1996, Amer Pharmaceutical Assn], 및 [Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978]에서 찾아볼 수 있고, 이들 각각은 본원에 참조로 포함된다. 제약 조성물은 바람직하게는 GMP 조건 하에서 제조된다. 전형적으로, 항-PCSK9 항체의 치료 유효 용량 또는 효능 용량이 본 발명의 제약 조성물에 사용된다. 항-PCSK9 항체는 당업자에게 공지된 통상의 방법에 의해 제약상 허용되는 투여 형태로 제제화된다. 투여 요법은 목적하는 반응 (예를 들어, 치료 반응)을 제공하도록 조정된다. 치료 또는 예방 유효 용량을 결정하는 데 있어서, 저용량을 투여한 후, 목적하는 반응이 최소의 바람직하지 않은 부작용과 함께 또는 부작용 없이 달성될 때까지 점차 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 단일 볼루스가 투여될 수 있거나, 여러 분할 용량이 시간 경과에 따라 투여될 수 있거나, 또는 용량이 치료 상황의 긴급성에 따라 정해지는 바에 비례하여 감소 또는 증가될 수 있다. 비경구 조성물을 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 투여량 단위 형태로 제제화하는 것이 특히 유리하다. 본원에 사용된 투여량 단위 형태는 치료할 대상체에 대한 단일 투여량으로서 적합한 물리적으로 분리된 단위를 지칭하고; 각 단위는 요구되는 제약 담체와 함께 원하는 치료 효과를 제공하도록 계산된 소정량의 활성 화합물을 함유한다.
본 발명의 제약 조성물 중 활성 성분의 실제 투여량 수준은, 환자에게 독성이 아니면서 특정 환자, 조성물 및 투여 방식에 대해 원하는 치료 반응을 달성하는데 효과적인 활성 성분의 양이 달성되도록 달라질 수 있다. 선택된 투여량 수준은 다양한 약동학 인자, 예를 들어 사용된 본 발명의 특정 조성물, 또는 그의 에스테르, 염 또는 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용된 특정 화합물의 배출 속도, 치료 기간, 사용된 특정 조성물과 조합되어 사용된 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료받는 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 일반적인 건강 및 이전의 의학적 병력 및 기타 인자에 따라 달라진다.
일부 실시양태에서, 약리학적 조성물은 항-PCSK9 항체 또는 항원 결합 분자 및 제2 약리 작용제의 혼합물을 포함한다. 예를 들어, 조성물은 본 발명의 항-PCSK9 항체 또는 항원 결합 분자, 및 LDL-C, 비-HDL-C 및 총 콜레스테롤을 비롯한 콜레스테롤을 감소시키고/거나 HDL-C를 상승시키기에 유익한 것으로 알려진 작용제를 포함할 수 있다.
본 발명의 항-PCSK9 길항제 항체 또는 항원 결합 분자와의 혼합물에 포함되기 위한 예시적인 제2 작용제는 비제한적으로 HMG-CoA 리덕타제 억제제 (즉, 스타틴), 피브레이트 (예를 들어, 클로피브레이트, 겜피브로질, 페노피브레이트, 시프로피브레이트, 베자피브레이트), 니아신 및 그의 유사체, 콜레스테롤 흡수 억제제, 담즙산 격리제 (예를 들어, 콜레스티라민, 콜레스티폴, 콜레세벨람), 회장 담즙산 수송 (IBAT) 억제제, 갑상선 호르몬 모방체 (예를 들어, 화합물 KB2115), 마이크로솜 트리글리세리드 전달 단백질 (MTP) 억제제, 이중 퍼옥시솜 증식자-활성화 수용체 (PPAR) 알파 및 감마 효능제, 아실 CoA:디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 (DGAT) 억제제, 아실 CoA:콜레스테롤 아실트랜스퍼라제 (ACAT) 억제제, 니만 피크 C1-유사 1 (NPC1-L1) 억제제 (예를 들어, 에제티미브), ATP 결합 카세트 (ABC) 단백질 G5 또는 G8의 효능제, 콜레스테롤 에스테르 전달 단백질 (CETP) 억제제, PCSK9를 표적으로 하는 억제 핵산 및 apoB100을 표적으로 하는 억제 핵산을 포함한다. 지질-저하제는 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 11th Ed., Brunton, Lazo and Parker, Eds., McGraw-Hill (2006)]; [2009 Physicians' Desk Reference (PDR)] (예를 들어, [63rd (2008) Eds., Thomson PDR])에 기재되어 있다.
본 발명의 조성물에 유용한 추가적인 지질 저하제는, 예를 들어 문헌 [Chang, et al., Curr Opin Drug Disco Devel (2002) 5(4):562-70]; [Sudhop, et al., Drugs (2002) 62(16):2333-47]; [Bays and Stein, Expert Opin Pharmacother (2003) 4(11):1901-38]; [Kastelein, Int J Clin Pract Suppl (2003) Mar(134):45-50]; [Tomoda and Omura, Pharmacol Ther (2007) 115(3):375-89]; [Tenenbaum, et al., Adv Cardiol (2008) 45:127-53]; [Tomkin, Diabetes Care (2008) 31(2):S241-S248]; [Lee, et al., J Microbiol Biotechnol (2008) 18(11):1785-8]; [Oh, et al., Arch Pharm Res (2009) 32(1): 43-7]; [Birch, et al., J Med Chem (2009) 52(6):1558-68]; 및 [Baxter and Webb, Nature Reviews Drug Discovery (2009) 8:308-320]에 기재 및/또는 검토되어 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항-PCSK9 항체 또는 항원 결합 분자는 스타틴과의 혼합물로서 제공된다. 예시적인 스타틴은 비제한적으로 아토르바스타틴, 세리바스타틴, 플루바스타틴, 로바스타틴, 메바스타틴, 피타바스타틴, 프라바스타틴, 로수바스타틴 및 심바스타틴을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항-PCSK9 항체 또는 항원 결합 분자는 고콜레스테롤혈증 또는 트리글리세리드혈증을 유도하는 약리 작용제와의 혼합물로서 제공된다. 예를 들어, 제2 약리 작용제는 프로테아제 억제제, 예를 들어 사퀴나비르, 리토나비르, 인디나비르, 넬피나비르, 암프레나비르, 로피나비르, 아타자나비르, 포삼프레나비르, 티프라나비르, 다루나비르, 아바카비르-라미부딘-지도부딘 (트리지비르)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 약리 작용제는 타크롤리무스이다.
5. 항- PCSK9 항체의 사용 방법
a. 항- PCSK9 항체로의 치료에 적용되는 상태
본 발명의 항-PCSK9 길항제 항체 및 항원 결합 분자는 PCSK9의 활성 또는 과다-활성에 의해 매개되는 임의의 질환 상태를 치료하는 데 유용하다.
예를 들어, 임의 개수의 원인 또는 병인으로 이상지혈증 또는 고콜레스테롤혈증을 갖거나 또는 이들이 발병할 위험이 있는 개체는 본 발명의 항-PCSK9 길항제 항체 및 항원 결합 분자의 투여로부터 이익을 얻을 수 있다. 예를 들어, 기능적 LDL-R이 존재하는 개체가, 가족성 또는 유전적으로 전해진 동형접합성 또는 이형접합성 고콜레스테롤혈증을 가질 수 있다. 가족성 또는 유전적으로 물려받은 고콜레스테롤혈증과 관련되고/거나 그의 원인이 되는 유전자 돌연변이가, 예를 들어 문헌 [Burnett and Hooper, Clin Biochem Rev (2008) 29(1):11-26]에 요약되어 있다. 개체는 또한 다른 질환 상태를 가질 수 있거나, 또는 이상지혈증 또는 고콜레스테롤혈증 발병의 위험에 기여하거나 이를 증가시키는 거동에 관여할 수 있다. 예를 들어, 개체는 비만이거나, 또는 당뇨병 또는 대사 증후군으로부터 고통받을 수 있다. 개체는 흡연자이거나, 좌식 생활방식으로 살거나, 또는 콜레스테롤이 높은 식사를 할 수 있다.
PCSK9를 표적으로 하는 것은 이상지혈증, 고콜레스테롤혈증 및 식후 트리글리세리드혈증의 감소, 역전, 억제 또는 예방에 유용하다. 예를 들어, 문헌 [Le May, et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol (2009) 29(5):684-90]; [Seidah, Expert Opin Ther Targets (2009) 13(1):19-28]; 및 [Poirier, et al., J Biol Chem (2009) PMID 19635789]을 참조한다. 따라서, 본 발명의 항-PCSK9 길항제 항체 및 항원 결합 분자의 투여는, 이상지혈증, 고콜레스테롤혈증 및 식후 트리글리세리드혈증의 감소, 역전, 억제 및 예방을 필요로 하는 개체에서 이상지혈증, 고콜레스테롤혈증 및 식후 트리글리세리드혈증을 감소시키고, 역전시키고, 억제하고, 예방하는 데 유용하다.
본 발명의 항-PCSK9 길항제 항체 및 항원 결합 분자는 저밀도 지단백질 콜레스테롤 (LDL-C)의 감소 또는 저하를 필요로 하는 개체에서 저밀도 지단백질 콜레스테롤 (LDL-C)을 감소시키거나 또는 저하시키는 데 유용하다. 상기 개체는 LDL-C의 상승된 수준을 지속적으로 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 개체는 일관되게 80 mg/dL 초과의, 예를 들어 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 mg/dL 초과의, 또는 더 높은 LDL-C 혈장 수준을 갖는다. 본 발명의 항-PCSK9 길항제 항체 및 항원 결합 분자는 또한, 비-고밀도 지단백질 콜레스테롤 (비-HDL-C) 또는 총 콜레스테롤의 감소 또는 저하를 필요로 하는 개체에서 비-고밀도 지단백질 콜레스테롤 (비-HDL-C) 또는 총 콜레스테롤을 감소시키거나 또는 저하시키는 데 유용하다.
개체는 콜레스테롤을 저하시키기 위해 이미 또 다른 약리 작용제를 사용하고 있을 수 있고, 상기 작용제에 저항성이거나 불내성일 수 있다. 예를 들어, 개체는 이미 스타틴의 치료 요법 하에 있을 수 있고, 이는 상기 개체에서 LDL-C, 비-HDL-C 또는 총 콜레스테롤을 허용가능한 수준으로 저하시킴에 있어 효능이 없는 것으로 판명되었을 수 있다. 개체는 또한 스타틴의 투여에 불내성일 수 있다. 본 발명의 항-PCSK9 길항제 항체 및 항원 결합 분자와 LDL-C 또는 비-HDL-C를 저하시키고/거나 HDL-C를 상승시키는 데 유용한 제2 작용제의 조합 투여는, 예를 들어 더 낮은 용량의 제2 작용제가 투여되는 것을 가능하게 함으로써 제2 작용제의 유효성 및 내약성을 향상시킬 것이다.
일부 실시양태에서, 개체는 예를 들어 LDLR의 분해에서의 비정상적 증가를 일으키는 PCSK9 유전자의 기능-획득 돌연변이를 갖는다.
일부 실시양태에서, 개체는 이상지혈증 또는 고콜레스테롤혈증을 유도하는 약리 작용제를 제공받는다 (즉, 개체가 약물-유발 이상지혈증 또는 고콜레스테롤혈증을 가짐). 예를 들어 개체는, 예를 들어 HIV 감염의 치료를 위해 프로테아제 억제제의 치료 요법을 제공받을 수 있다. 혈장 트리글리세리드의 상승된 수준을 유발하는 것으로 알려져 있는 또 다른 약리 작용제는, 이식 환자에게 투여되는 면역억제 약물인 타크롤리무스이다. 시클로스포린은 LDL을 유의하게 증가시키는 것으로 나타났다. 예를 들어 문헌 [Ballantyne, et al. (1996) 78(5):532-5]을 참조한다. 제2세대 항정신병제 (예를 들어, 아리피프라졸, 클로자핀, 올란자핀, 쿠에티아핀, 리스페리돈 및 지프라시돈)가 또한 이상지혈증과 관련되어 왔다. 예를 들어, 문헌 [Henderson, J Clin Psychiatry (2008) 69(2):e04] 및 [Brooks, et al., Curr Psychiatry Rep (2009) 11(1):33-40]을 참조한다.
b. 항- PCSK9 항체의 투여
전문의 또는 수의사는 제약 조성물 중에 사용되는 본 발명의 항체의 투여를 원하는 치료 효과 달성에 필요한 것보다 더 낮은 수준에서 시작할 수 있고, 원하는 효과가 달성될 때까지 투여량을 점차 증가시킬 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 조성물의 유효 용량은 치료할 특정 질환 또는 상태, 투여 수단, 표적 부위, 환자의 생리적 상태, 환자가 인간인지 동물인지 여부, 투여되는 다른 의약, 및 치료가 예방적인지 치료적인지 여부를 비롯한 여러 다양한 요인에 따라 달라진다. 치료 투여량은 안전성 및 효능이 최적화되도록 적정할 필요가 있다. 항체를 사용하는 투여에 대해, 용량은 약 0.0001 내지 100 mg/kg 숙주 체중, 더욱 통상적으로는 0.01 내지 5 mg/kg 범위이다. 예를 들어, 투여량은 1 mg/kg 체중 또는 10 mg/kg 체중일 수 있거나, 1-10 mg/kg 범위일 수 있다. 필요한 경우 또는 바람직한 경우에, 투여는 매일, 매주, 2주마다, 매월, 또는 더욱 자주 또는 덜 자주 수행할 수 있다. 예시적인 치료 요법은 매주 1회, 2주마다 1회, 또는 매월 1회, 또는 3 내지 6개월마다 1회의 투여를 수반한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항-PCSK9 항체 또는 항원 결합 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 투여된다. 작용제가 핵산인 실시양태에서, 전형적인 투여량은 약 0.1 mg/kg 체중 내지 약 100 mg/kg 체중 이하, 예를 들어 약 1 mg/kg 체중 내지 약 50 mg/kg 체중의 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서는 약 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40 또는 50 mg/kg 체중이다.
항체는 단일 또는 분할 용량으로 투여될 수 있다. 항체는 일반적으로 여러 번 투여된다. 필요한 경우 또는 바람직한 경우에, 단일 투여량 사이의 간격은 매주, 2주마다, 매월 또는 매년일 수 있다. 간격은 또한 환자에서 항-PCSK9 항체의 혈중 수준을 측정하여 나타나는 바에 따라 불규칙할 수도 있다. 일부 방법에서 투여량은, 1-1000 μg/ml, 일부 방법에서는 25-300 μg/ml의 혈장 항체 농도를 달성하도록 조정된다. 대안적으로, 빈도를 덜하게 하여 투여하는 것이 요구되는 경우에는 항체를 지속 방출 제제로서 투여할 수 있다. 투여량 및 빈도는 환자에서의 항체의 반감기에 따라서 달라진다. 일반적으로, 인간화 항체는 키메라 항체 및 비인간 항체보다 더 긴 반감기를 보인다. 투여량 및 투여 빈도는 치료가 예방적인지 치료적인지의 여부에 따라 달라질 수 있다. 예방 용도에서는, 비교적 낮은 투여량이 비교적 빈번하지 않은 간격으로 장기간의 시간에 걸쳐 투여된다. 일부 환자는 그의 나머지 일생 동안 계속 치료를 받는다. 치료 용도에서는, 때때로 질환의 진행이 감소되거나 종결될 때까지, 바람직하게는 환자가 질환 증상의 부분적 또는 완전한 완화를 보일 때까지 상대적으로 짧은 간격의 상대적으로 높은 투여량이 요구된다. 그 후, 환자에게 예방 요법을 투여할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-PCSK9 항체 또는 항원 결합 작용제는 환자의 혈장 LDL-C 수준이 소정 역치 수준을 초과하는 경우에, 예를 들어 적어도 약 80 mg/dL, 예를 들어 적어도 약 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 mg/dL, 또는 더 높은 경우에 투여된다.
c. 제2 작용제와의 공동-투여
PCSK9 항체 길항제는 LDL-C, 비-HDL-C 및 총 콜레스테롤을 비롯한 콜레스테롤을 감소시키고/거나 HDL-C를 상승시키기에 유익한 것으로 알려진 작용제와 조합으로 사용될 수 있다.
활성제는 항-PCSK9 길항제 항체와의 혼합물로 함께 투여될 수 있거나, 또는 각각의 작용제는 개별적으로 투여될 수 있다. 항체 작용제 및 다른 활성제는 동시에 투여될 수 있으나, 그럴 필요가 있는 것은 아니다.
본 발명의 항-PCSK9 길항제 항체 또는 항원 결합 분자와의 공동-투여에 사용하기 위한 예시적인 제2 작용제는 비제한적으로 HMG-CoA 리덕타제 억제제 (즉, 스타틴), 피브레이트 (예를 들어, 클로피브레이트, 겜피브로질, 페노피브레이트, 시프로피브레이트, 베자피브레이트), 니아신 및 그의 유사체, 콜레스테롤 흡수 억제제, 담즙산 격리제 (예를 들어, 콜레스티라민, 콜레스티폴, 콜레세벨람), 회장 담즙산 수송 (IBAT) 억제제, 갑상선 호르몬 모방체 (예를 들어, 화합물 KB2115), 마이크로솜 트리글리세리드 전달 단백질 (MTP) 억제제, 이중 퍼옥시솜 증식자 활성화 수용체 (PPAR) 알파 및 감마 효능제, 아실 CoA:디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 (DGAT) 억제제, 아실 CoA:콜레스테롤 아실트랜스퍼라제 (ACAT) 억제제, 니만 피크 C1-유사 1 (NPC1-L1) 억제제 (예를 들어, 에제티미브), ATP 결합 카세트 (ABC) 단백질 G5 또는 G8의 효능제, 콜레스테롤 에스테르 전달 단백질 (CETP) 억제제, PCSK9를 표적으로 하는 억제 핵산 및 apoB100을 표적으로 하는 억제 핵산을 포함한다.
유용한 추가적인 지질 저하제는, 예를 들어 문헌 [Chang, et al., Curr Opin Drug Disco Devel (2002) 5(4):562-70]; [Sudhop, et al., Drugs (2002) 62(16):2333-47]; [Bays and Stein, Expert Opin Pharmacother (2003) 4(11):1901-38]; [Kastelein, Int J Clin Pract Suppl (2003) Mar(134):45-50]; [Tomoda and Omura, Pharmacol Ther (2007) 115(3):375-89]; [Tenenbaum, et al., Adv Cardiol (2008) 45:127-53]; [Tomkin, Diabetes Care (2008) 31(2):S241-S248]; [Lee, et al., J Microbiol Biotechnol (2008) 18(11):1785-8]; [Oh, et al., Arch Pharm Res (2009) 32(1): 43-7]; [Birch, et al., J Med Chem (2009) 52(6):1558-68]; 및 [Baxter and Webb, Nature Reviews Drug Discovery (2009) 8:308-320]에 기재 및/또는 검토되어 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항-PCSK9 항체 또는 항원 결합 분자는 스타틴과 공동-투여된다. 예시적인 스타틴은 비제한적으로 아토르바스타틴, 세리바스타틴, 플루바스타틴, 로바스타틴, 메바스타틴, 피타바스타틴, 프라바스타틴, 로수바스타틴 및 심바스타틴을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항-PCSK9 항체 또는 항원 결합 분자는 고콜레스테롤혈증 또는 트리글리세리드혈증을 유도하는 약리 작용제와 공동-투여된다. 예를 들어, 제2 약리 작용제는 프로테아제 억제제, 예를 들어 사퀴나비르, 리토나비르, 인디나비르, 넬피나비르, 암프레나비르, 로피나비르, 아타자나비르, 포삼프레나비르, 티프라나비르, 다루나비르, 아바카비르-라미부딘-지도부딘 (트리지비르)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 약리 작용제는 타크롤리무스이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항-PCSK9 항체 또는 항원 결합 분자는 특이적으로 PCSK9 또는 apoB100을 표적으로 하는 억제 핵산 (예를 들어, siRNA, miRNA, 안티센스 서열, 리보자임)과 공동-투여된다.
6. 키트
본 발명의 제약 조성물은 키트로 제공될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 키트는 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 항-PCSK9 길항제 항체 또는 항원 결합 분자를 포함한다. 항-PCSK9 항체 또는 항원 결합 분자는 균일하거나 변화하는 투여량으로 제공될 수 있다.
일부 실시양태에서, 키트는 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 제2 약리 작용제를 포함한다. 제2 약리 작용제는 항-PCSK9 항체 또는 항원 결합 분자와 동일한 제제로 또는 그로부터 분리된 제제로 제공될 수 있다. 제1 및 제2 작용제의 투여량은 독립적으로 균일하거나 변화할 수 있다.
일부 실시양태에서, 키트는 PCSK9 항체 길항제, 및 LDL-C, 비-HDL-C 및 총 콜레스테롤을 비롯한 콜레스테롤을 감소시키고/거나 HDL-C를 상승시키기에 유익한 것으로 알려진 하나 이상의 작용제를 포함한다.
본 발명의 항-PCSK9 길항제 항체 또는 항원 결합 분자를 갖는 키트에 포함되기 위한 예시적인 제2 작용제는 비제한적으로 HMG-CoA 리덕타제 억제제 (즉, 스타틴), 피브레이트 (예를 들어, 클로피브레이트, 겜피브로질, 페노피브레이트, 시프로피브레이트, 베자피브레이트), 니아신 및 그의 유사체, 콜레스테롤 흡수 억제제, 담즙산 격리제 (예를 들어, 콜레스티라민, 콜레스티폴, 콜레세벨람), 회장 담즙산 수송 (IBAT) 억제제, 갑상선 호르몬 모방체 (예를 들어, 화합물 KB2115), 마이크로솜 트리글리세리드 전달 단백질 (MTP) 억제제, 이중 퍼옥시솜 증식자 활성화 수용체 (PPAR) 알파 및 감마 효능제, 아실 CoA:디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 (DGAT) 억제제, 아실 CoA:콜레스테롤 아실트랜스퍼라제 (ACAT) 억제제, 니만 피크 C1-유사 1 (NPC1-L1) 억제제 (예를 들어, 에제티미브), ATP 결합 카세트 (ABC) 단백질 G5 또는 G8의 효능제, 콜레스테롤 에스테르 전달 단백질 (CETP) 억제제, PCSK9를 표적으로 하는 억제 핵산 및 apoB100을 표적으로 하는 억제 핵산을 포함한다.
키트에 유용한 추가적인 지질 저하제는, 예를 들어 문헌 [Chang, et al., Curr Opin Drug Disco Devel (2002) 5(4):562-70]; [Sudhop, et al., Drugs (2002) 62(16):2333-47]; [Bays and Stein, Expert Opin Pharmacother (2003) 4(11):1901-38]; [Kastelein, Int J Clin Pract Suppl (2003) Mar(134):45-50]; [Tomoda and Omura, Pharmacol Ther (2007) 115(3):375-89]; [Tenenbaum, et al., Adv Cardiol (2008) 45:127-53]; [Tomkin, Diabetes Care (2008) 31(2):S241-S248]; [Lee, et al., J Microbiol Biotechnol (2008) 18(11):1785-8]; [Oh, et al., Arch Pharm Res (2009) 32(1): 43-7]; [Birch, et al., J Med Chem (2009) 52(6):1558-68]; 및 [Baxter and Webb, Nature Reviews Drug Discovery (2009) 8:308-320]에 기재 및/또는 검토되어 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항-PCSK9 항체 또는 항원 결합 분자는 스타틴을 포함하는 키트로 제공된다. 예시적인 스타틴은 비제한적으로 아토르바스타틴, 세리바스타틴, 플루바스타틴, 로바스타틴, 메바스타틴, 피타바스타틴, 프라바스타틴, 로수바스타틴 및 심바스타틴을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항-PCSK9 항체 또는 항원 결합 분자는 고콜레스테롤혈증 또는 트리글리세리드혈증을 유도하는 약리 작용제를 포함하는 키트로 제공된다. 예를 들어, 제2 약리 작용제는 프로테아제 억제제, 예를 들어 사퀴나비르, 리토나비르, 인디나비르, 넬피나비르, 암프레나비르, 로피나비르, 아타자나비르, 포삼프레나비르, 티프라나비르, 다루나비르, 아바카비르-라미부딘-지도부딘 (트리지비르)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 약리 작용제는 타크롤리무스이다.
실시예
하기 실시예는 예시하기 위해 제공되며, 청구된 본 발명을 제한하기 위한 것이 아니다.
실시예 1: Pcsk9 길항제 NVPLFU720 의 생성 및 확인
개요
Pcsk9에 대한 기능적 항체 길항제를 생성하는 연구를 수행하였다. 단백질의 His-태그가 부착된 버전에 결합할 수 있는 항체를 분비하는 다중 하이브리도마를 확인하였다. 하이브리도마로부터의 항체를, HepG2 세포 상의 LDL 수용체의 Pcsk9-매개 분해를 억제하여 이들 세포가 LDL 콜레스테롤을 흡수하는 능력을 증가시키는 그의 능력에 의해 측정되는 기능적 길항제 활성에 대해 평가하였다. 강력한 기능적 뮤린 항-인간 Pcsk9 IgG1-카파 모노클로날 항체를 확인하고, NVP-LFU720 (LFU720)으로 지정하였다.
방법
항원 및 다른 단백질
인간 Pcsk9 단백질을 분비하는 안정한 발현 세포주를, HEK293 프리스타일(Freestyle)™ 세포 (인비트로젠; 캘리포니아주 칼스배드)의 형질감염에 의해 생성하였다. 간략하게, 바이오코트(BioCoat) 플라스크 (벡톤 디킨슨) 상에서 부착 모드로 프리스타일™ 배지 (인비트로젠) + 10％ 소 태아 혈청 중에서 배양된 세포를, 리포펙타민 2000(Lipofectamine 2000)™ 형질감염 시약, 및 멜리틴 신호 서열, 성숙 Pcsk9 cDNA (aa 31-692) 및 서열의 C-말단의 his6 (서열 57) 태그를 특징으로 하는 재조합 플라스미드 (이.햄프턴(E.Hampton)에 의해 클로닝됨, GNF, NPL 010051)를 사용하여 형질감염시켰다. 형질감염 48시간 후, 배양 배지에 제오신(Zeocin) 100 μg/mL를 첨가함으로써 양성 형질감염체의 선택을 개시하였다. 4주 후, 4개의 Pcsk9-생산 세포의 안정한 세포 풀이 나타났다. 최대 생산자인 풀 4를 프리스타일™ 배지 중에서 혈청-무함유 현탁액 조건에 적응시키고, 후속적으로 대규모 생산을 위해 웨이브(Wave)™ 생물반응기를 사용하여 10-20 L 생산 부피의 규모로 규모를 증가시켰다.
시간이 지나면서 12 내지 30 mg/L의 속도로 생산되는 재조합 단백질을 수득하는 여러 번의 작업을 수행하였다. 세포 상청액을 수확하고, 횡류 여과에 의해 농축시켰다. 생성된 농축물을 25 mL NiNTA His-바인드 슈퍼플로우(His-Bind Superflow) 칼럼 (50 mM 트리스/300 mM NaCl/1 mM CaCl2/2 mM β-메르캅토에탄올 (pH 7.4)로 평형화됨)에 0.5 mL/분으로 적용시켰다. 50 mM 트리스/300 mM NaCl/20 mM 이미다졸 (pH 7.4)로 기준선 세척한 후, 결합된 물질을 50 mM 트리스/300 mM NaCl/250 mM 이미다졸 (pH 7.4)로 용리하였다. 생성된 용리액을 PBS (pH 7.3)에 대해 투석하고, 멸균 여과하고, 분취하였다. 올리고머화의 결정을 위해 샘플을 분석용 크기-배제 크로마토그래피에 의해 분석하였다. 정제된 단백질로 얻은 HPLC 크로마토그램은 2개의 피크 (주 피크가 85％를 차지함)를 보여주었다. 전장 단백질의 HPLC-ESI MS 분석은 58176.0 Da의 질량을 밝혀내었고, 이는 모든 시스테인 잔기가 산화된 멜리틴-hsPcsk9 aa31-692-His로부터 예상되는 질량에 부합하였다. 샘플 중 일부는 추가로 N-글리코실화되어 있었다. 대략 13 kD 질량의 오염 단백질은 아마도 단백질의 유리 프로-도메인과 유사하였다. 마우스 및 시노몰구스 원숭이로부터의 상응하는 Pcsk9 상동체를, 프리스타일 배지 중의 혈청-무함유 현탁액 중에서 배양된 HEK293 프리스타일 세포를 다시 사용하여 대규모 일시적 발현 접근법으로 생산하였다. 천연 리더 서열 및 C-말단의 his6 (서열 57) 태그를 특징으로 하는 마우스 Pcsk9 cDNA의 재조합 플라스미드, 및 CD33 리더 서열 및 C-말단 his6 (서열 57) 태그를 특징으로 하는 시노 Pcsk9의 재조합 플라스미드를, 폴리에틸렌이민을 플라스미드 DNA의 운반체로서 1:3 (μg/mL:μg/mL DNA:PEI)의 비율로 사용하여 프리스타일 세포로 형질감염시켰다. 생산 작업을 웨이브™ 생물반응기에서 10 리터 규모로 수행하고; 단백질 정제 및 특징규명을, 인간 Pcsk9 단백질에 대해 상기 기재된 프로토콜과 유사하게 수행하였다. 마우스 Pcsk9 단백질에 대한 수율은 0.7 내지 2.7 mg/L 배양물의 범위였고, 시노 Pcsk9는 3.1 mg/L로 수득하였다.
하이브리도마 생성
마우스의 면역화 및 하이브리도마의 생산
Bcl-2 트랜스제닉 마우스 (C57BL/6-Tgn (bcl-2) 22 wehi 세포주)의 면역화 전에, 정제된 Pcsk9를 프로인트 완전 아주반트로 1:1로 희석하였다. 마우스를 다중 부위에서의 반복 면역화 (RIMMS)로 불리는 절차를 이용하여 면역화시켰다. 간략하게, 마우스의 말초 림프절 (PLN)에 근접한 8군데의 특정 부위에 항원 1-3 μg을 주사하였다. 상기 절차를 12-일 주기에 걸쳐 6회 반복하였다. 제12일에, 시험 혈액을 수집하고, 혈청 항체 역가를 ELISA에 의해 분석하였다. 제15일에 높은 역가의 마우스로부터 모은 PLN을 제거하였다. 림프구를 수확하기 위해, PLN을 보통의 DMEM으로 2회 세척한 다음, .22 마이크로미터 스크린 (팔콘(Falcon) #352350)으로 통과시켜 분리시켰다. 생성된 림프구를 융합 전에 2회 추가로 세척하였다. NSO/Bcl-2 골수종 세포를 1 NSO 세포에 대해 2.5 림프구의 비율로 림프구와 혼합하였다. 세포 혼합물을 원심분리하고, PEG 1500 1 mL를 후속적으로 세포 펠릿에 1분 동안 적가하였다. 30초 후, DMEM 1 mL를 천천히 첨가하고, 1분 후, DMEM 19 mL를 5분 동안 첨가하였다. 융합된 세포를 펠릿화시키고, HAT 배지 (DMEM + 20％ FBS, Pen/Strep/Glu, 1x NEAA, 1x HAT, 0.5x HFCS) 중에 2 x 105개 세포/mL의 밀도로 재현탁시키고, 1시간 동안 37℃에 두었다. 이어서, 세포를 384-웰 플레이트에 60 μL/웰로 플레이팅하였다.
Pcsk9 에 대한 기능적 항체를 분비하는 하이브리도마의 스크리닝
융합 10일 후, 하이브리도마 플레이트를 Pcsk9 특이적 항체의 존재에 대해 스크리닝하였다. ELISA 스크리닝을 위해, 맥시소르프(Maxisorp) 384-웰 플레이트 (눈크(Nunc) #464718)를 Pcsk9 50 μL (PBS 중에 15 ng/웰로 희석됨)로 코팅하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 남아있는 단백질을 흡인하고, 웰을 PBS 중 1％ BSA를 사용하여 블로킹하였다. 실온에서 30분 동안 인큐베이션한 후, 웰을 PBS + 0.05％ 트윈 (PBST)으로 4회 세척하였다. 하이브리도마 상청액 15 μL를 ELISA 플레이트로 옮겼다. PLN 제거 시점에 취한 마우스 혈청 15 μL를 PBS 중에 1:1000으로 희석하고, 양성 대조군으로서 첨가하였다. 2차 항체 (염소 항 마우스 IgG - HRP (잭슨 이뮤노 리서치(Jackson Immuno Research) #115-035-071), PBS 중에 1:5000으로 희석됨) 50 μL를 ELISA 플레이트 상의 모든 웰에 첨가하였다. 1시간 동안 실온에서 인큐베이션한 후, 플레이트를 PBST로 8회 세척하였다. TMB (KPL #50-76-05) 25 μL를 첨가하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 605 nm에서의 흡광도로 판독하였다. 양성 웰로부터의 세포를 HT 배지 (DMEM + 20％ FBS, Pen/Strep/Glu, 1x NEAA, 1x HT, 0.5x HFCS) 중에서 24-웰 플레이트로 확장시켰다.
항체 정제
LFU720을 함유하는 상청액을 단백질 G (업스테이트(Upstate) # 16-266 (매사추세츠주 빌레리카))를 사용하여 정제하였다. 상청액을 로딩하기 전에, 수지를 10 칼럼 부피의 PBS로 평형화시켰다. 샘플의 결합에 이어서, 칼럼을 10 칼럼 부피의 PBS로 세척한 다음, 항체를 5 칼럼 부피의 0.1 M 글리신 (pH 2.0)으로 용리하였다. 칼럼 분획을 즉시 1/10 부피의 트리스 HCl (pH 9.0)로 중화시켰다. 분획의 OD280을 측정하고, 양성 분획을 모으고, PBS (pH 7.2)에 대해 밤새 투석하였다.
결합 동역학 및 비아코어 검정
광학 바이오센서 비아코어 S51을 사용하는 표면 플라즈몬 공명 측정에 의해 동역학적 결합 파라미터의 측정을 수행하였다. 상기 기술은 수용체에 대한 리간드의 결합 (ka) 및 해리 (kd)에 대한 미시적 속도 상수의 무-표지 측정을 가능하게 한다. 이는 따라서 항체-항원 상호작용을 특징규명하기에 특히 적합하다.
LFU720 (2 μg/mL)에 대한 Pcsk9의 결합 연구를, 시리즈(Series) S CM-5 비아코어 센서 칩 (공인됨) (비아코어 #BR-1005-30) 상에 미리 고정된 토끼 항-마우스 Fcγ 항체 (비아코어 #BR-1005-14)로 마우스 항체를 포획함으로써 수행하였다. Fcγ 포획 항체의 공유 결합을 '아민 커플링 키트' (비아코어 #BR-1000-50)로 수행하였다. 포획 항체 (토끼-항-마우스)를, 10 mM 아세트산나트륨 중 50 μg/mL 항-Fcγ 항체 용액 (pH 5) (비아코어 #BR-1003-51)을 사용하여 10 μL/분의 유량으로 EDC활성화된 덱스트란 표면에 부착시켰다. 0.5 μM 내지 7.8 nM (2배 연속 희석)의 농도 범위의 Pcsk9를 PBS + 100 mM NaCl, 0.005％ P20 (비아코어 #BR-1000-54) 중 포획된 LFU720 칩 상에 흐르게 하였다. 생성된 센서그램을 비아코어 S51 평가 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. 모든 농도로부터의 데이터를 1:1 랭뮤어(Langmuir) 모델에 전체적으로 핏팅시켰다.
TR - FRET 검정
TR-FRET 검정을 384-웰 백색 얕은 플레이트 (퍼킨 엘머, 6008280)에서 수행하였다. hPcsk9-AF (10.7 nM)를 검정 완충제 (20 mM HEPES (pH 7.2), 150 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 0.1％ v/v 트윈 20, 및 0.1％ w/v BSA) 15 μL 중에서 30분 동안 실온에서 비표지된 hPcsk9 단백질, EGF-A 펩티드 또는 NVP-LFU720-AX-1 항체의 연속 희석물과 함께 인큐베이션하였다. 이어서, 검정 완충제 중 hLDL-R-Eu (4 nM) 5 μL를 hPcsk9 및 NVP-LFU720-AX-1의 사전-인큐베이션된 복합체에 첨가하고, 90분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 이들 표지된 단백질의 최종 농도는 hPcsk9-AF 8 nM 및 hLDL-R-Eu 1 nM이었다. TR-FRET 신호를 엔비전 2100 다중표지 판독기 (퍼킨 엘머)로 330 nm 여기 및 665 nm 방출에서 측정하였다. 데이터를 하기 식을 이용하여 정규화된 값으로 변환시켰다: [(665 nm 값 x 10,000)/(615 nm 값)]. 백분율 억제를 하기 식으로 계산하였다: 100 - [(처리된 샘플의 정규화된 값/처리되지 않은 샘플의 정규화된 평균값) x 100]. 백분율 억제 용량 반응 곡선을 프리즘 버전 5를 이용하여 식, Y = 최저 + (최고 - 최저)/(1+10^((LogIC50-X)*힐기울기(HillSlope)))로 플롯팅하였다 (그래프패드 프리즘 소프트웨어).
LDL -R 턴오버 검정
HepG2 세포를 트립신처리하고, 1％ v/v 콜라겐으로 사전-코팅된 편평 바닥 96-웰 플레이트 (코닝(Corning), 3595)에 배양 배지 100 μL 중 웰당 6 x 104개 세포로 시딩한 다음, 5％ CO2 중에서 24시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 일반적으로, 세포를 hPcsk9 단백질, EGF-A 펩티드 및/또는 NVP-LFU720-AX-1 항체를 함유하는 혈청-무함유 배지 100 μL로 처리하였다. 처리 후, 배지를 폐기하고, 세포를 PBS 100 μL로 세척하였다. 세포를 수확하기 위해, 베르신 (바이오휘태커, 17-771E) 100 μL를 첨가하고, 5％ CO2 중에서 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하고, 이어서 FACS 완충제 100 μL를 첨가하였다. 세포를 V-바닥 96-웰 플레이트 (코닝, 3894)로 옮기고, 1200 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠릿화시켰다. 세포 상의 비-특이적 결합 부위를 블로킹하기 위해, FACS 완충제 중 100 μg/mL 정상 토끼 IgG (MP 바이오메디칼스, 55944) 및 마우스 IgG (시그마(Sigma), I5381) 50 μL를 각 웰에 첨가하고, 얼음에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 1200 rpm에서 5분 동안 원심분리하고, 완충제를 플레이트를 가볍게 털어 제거하였다. 세포를 표지하기 위해, FACS 완충제 중 토끼 항-hLDL-R-알렉사 647 IgG (5 μg/mL) 10 μL 및 마우스 항-트랜스페린-R-피코에리트린 (PE) IgG (2 μg/mL) (CD71, 벡톤 디킨슨 바이오사이언시스(Becton Dickinson Biosciences), 624048) 표지된 항체 10 μL를 각 웰에 첨가하고, 얼음에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 1200 rpm에서 5분 동안 원심분리하고, 완충제를 플레이트를 가볍게 털어 제거하였다. 결합되지 않은 항체를, 세포를 웰당 200 μL의 FACS 완충제로 2회 세척하여 제거하였다. 세포를 PBS 중 1％ 파라포름알데히드에 고정시키고, 생존 세포를 게이팅 (5000)하고, BD LSR II 유동 세포측정기 및 FACSDIVA 소프트웨어 (벡톤 디킨슨)를 이용하여 분석하였다. PE 형광의 중앙값을 488 nm의 여기 및 575 nm의 방출에서 측정하였다. 알렉사 647 형광의 중앙값을 488 nm의 여기 및 633 nm의 방출에서 측정하였다. 주문 제작 토끼 항-hLDL-R 폴리클로날 IgG 583을 HepG2 세포 상의 표면 hLDL-R의 FACS 검출을 위해 코반스(Covance) (미국 펜실베니아주 덴버)에 의해 주문 생산하였다. 토끼 항-hLDL-R IgG 583은 HepG2 세포 표면 상의 hLDL-R 검출에 대해 정상 토끼 IgG와 비교하여 대략 7배의 윈도우를 나타내었다. HepG2 세포 표면 상의 LDL-R에 대한 항-hLDL-R IgG 583의 특이성을 측정하기 위해, hLDL-R 단백질을 상기 IgG의 결합에 대한 경쟁자로서 사용하여 실험을 수행하였다. HepG2 세포를 향한 항-hLDL-R IgG 583에 대한 평균 배지 형광의 용량-의존성 감소가 hLDL-R 단백질의 농도 증가와 함께 관찰되었다. 이는 FACS에 의해 측정시, 항-hLDL-R IgG 583이 HepG2 세포 표면 상의 LDL-R을 특이적으로 인식한다는 것을 입증한다. 앞으로의 연구는 HepG2 세포 표면 상의 LDL-R의 FACS 정량화를 위해 직접적으로 표지된 항-hLDL-R-583-알렉사 647 IgG를 사용하였다.
LDL -C 흡수
HepG2 세포를 트립신처리하고, 편평 바닥 96-웰 플레이트 (코닝, 3595, 1％ v/v 콜라겐으로 사전-코팅됨)에 배양 배지 100 μL 중 웰당 6 x 104개 세포로 시딩한 다음, 5％ CO2 중에서 24시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 달리 언급되지 않는 한, 세포를 hPcsk9 단백질, EGF-A 펩티드 및/또는 NVP-LFU720-AX-1 항체를 함유하는 혈청-무함유 배지 100 μL로 처리하였다. 처리 후, 각 웰에 혈청-무함유 배지 중 30 μg/mL 3,3'-디옥타데실인도카르보시아닌-표지된 저밀도 지단백질 (DiI-LDL) (인트라셀, RP-077-175) 20 μL를 제공하고, 5％ CO2 중에서 2시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 배지를 플레이트를 가볍게 털어 제거하고, 세포를 포스페이트 완충 염수 (칼슘 또는 마그네슘이 없는 PBS, 인비트로젠, 14190-144) 100 μL로 세척하였다. PBS를 플레이트를 가볍게 털어 제거하고, 0.25％ 트립신-EDTA 100 μL를 각 웰에 첨가하고, 5％ CO2 중에서 5분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. FACS 완충제 (5％ FBS, 2 mM EDTA 및 0.2％ 나트륨 아지드를 함유하는 PBS) 100 μL를 각 웰에 첨가하고, 세포를 1200 rpm에서 5분 동안 원심분리에 의해 펠릿화시켰다. 배지를 플레이트를 가볍게 털어 폐기하고, 세포를 웰당 PBS 중 1％ 파라포름알데히드 (일렉트론 마이크로스코피 사이언시스(Electron Micoscopy Sciences), 15710) 50 μL의 첨가에 의해 고정시켰다. 생존 세포를 게이팅하고, BD LSR II 유동 세포측정기 및 FACSDIVA 소프트웨어 (벡톤 디킨슨)를 이용하여 분석하였다. DiI-LDL 형광의 중앙값을 여기 488 nm 및 방출 575 nm에서 측정하고, 5000개의 세포를 분석하였다. 막대 그래프를 마이크로소프트 엑셀 2002(Microsoft Excel 2002) (마이크로소프트 코포레이션(Microsoft Corporation))를 이용하여 생성하였다. 활성화 백분율을 하기와 같이 계산하였다 (활성화 ％ = [1 - (X ÷ A)] x 100, 여기서 X = 샘플 웰로부터 판독한 배지 형광, 및 A = 단지 hPcsk9 처리한 웰로부터 판독한 배지 형광).
활성화의 백분율을 처리에 대해 플롯팅하여, 방정식 Y = 최저 + (최고-최저)/(1+10^((LogEC50-X) x 힐기울기)) 및 그래프패드 프리즘 5 (그래프패드 소프트웨어)를 이용하여 생성한 용량 반응 곡선으로부터 EC50을 결정하였다.
결과
항-인간 Pcsk9 모노클로날 항체의 생성
B-세포를, Pcsk9 단백질로 면역화시킨 동물의 1차 림프절로부터 수확하였다. 하이브리도마를 표준 PEG-매개 융합을 이용하여 생성하였다. 생성된 융합체를 ELISA에 의해 분석하고, 인간 Pcsk9에 대한 양성 결합제를 확인하고, 상청액을 생성하기 위해 확장시켰다. 확인된 다중 ELISA 양성 클론이 있었고, 이를 후속적으로 기능적 검정에 의해 분류하였다. 선도 후보로서 확인된 클론은 LFU720이었다. 본 발명자들의 선도 후보인 LFU720 이외에도, 아직 Pcsk9 및 LDLr의 상호작용을 차단 (FRET에 의해 측정시)하는 데 실패하였으나 Pcsk9에 결합된 경우에 LDLr 분해를 매개 (LDLc 흡수에 의해 측정시)하는 Pcsk9의 능력을 차단할 수 있는, 클론 21D6, 5A4-C1 및 13F1을 포함하는 다른 다중 클론이 확인되었다. 클론 21D6은 또한 생체내에서 LDLr의 Pcsk9 분해를 차단하는 능력을 보여주었다.
Pcsk9 에 특이적으로 결합하는 것에 대한 LFU720 의 스크리닝
LFU720 특이성을 일련의 다른 단백질에 대한 ELISA에서의 결합을 평가함으로써 검사하였다. 3종의 다른 HIS-태그가 부착된 단백질에 대한 LFU720의 결합을 Pcsk9-HIS에 대한 결합과 비교하였다. 이는 Pcsk9에 대한 결합이 특이적이고, 항체가 HIS 태그에 결합하지 않았다는 것을 입증하였다.
시노몰구스 Pcsk9 에 결합하는 것에 대한 LFU720 의 평가
Pcsk9의 시노몰구스 상동체에 대한 LFU720의 결합을 측정하였다. 본 검정을 위해, 시노몰구스 HIS-태그가 부착된 Pcsk9를 발현하는 세포로부터의 상청액을, 물질을 정제할 필요가 없도록 Ni 포획 플레이트와 함께 사용하였다. 인간 Pcsk9를 희석하고, 또한 그의 HIS-태그를 통해 포획하였다. LFU720은 인간 및 시노몰구스 Pcsk9 둘 다에 결합할 수 있었다. 5P20은 또한 ELISA에서 인간 LDL-R 또는 마우스 Pcsk9에 결합하지 않았다.
LFU720 의 결합 동역학
인간 Pcsk9 단백질을 인식하는 마우스 항체 LFU720을, 광학 바이오센서 기술 (비아코어)을 이용하여 그의 결합 친화도에 대해 분석하였다. LFU720은 재조합 인간 Pcsk9에 높은 친화도 (나노몰 이하의 친화도 (KD =200 pM))로 결합하는 것으로 밝혀졌다.
Pcsk9 / LDL -R 상호작용을 차단하는 것에 대한 LFU720 의 스크리닝
항-hPcsk9 항체 NVP-LFU720이 hPcsk9-AF 및 hLDL-R-Eu 표지된 단백질 사이의 상호작용을 방해할 수 있는지를 결정하기 위해 TR-FRET 검정을 이용하였다. 검정이 hLDL-R-Eu 및 hPcsk9-AF 표지된 단백질의 상호작용에 의해 생성된 TR-FRET 신호의 방해를 검출할 수 있음을 입증하기 위해, 표지되지 않은 hPcsk9 단백질 또는 EGF-A 펩티드를 평가하였다. 증가하는 농도의 표지되지 않은 hPcsk9는 hLDL-R-Eu에의 결합에 대해 hPcsk9-AF와 경쟁하였고, 이는 TR-FRET 신호의 감소를 일으켰다. EGF-A 펩티드는 2.5 μM의 IC50으로 hLDL-R-Eu 및 hPcsk9-AF 사이의 상호작용을 방해하였다. 반대로, NVP-LFU720은 1000 nM을 초과하는 IC50으로 hPcsk9-Eu 및 hLDL-R-AF 사이의 TR-FRET 신호를 저조하게 방해하였고, 낮은 항체 농도에서 U자형 반응을 나타내었다.
LDL -R의 Pcsk9 -매개 분해를 억제하는 것에 대한 LFU720 의 스크리닝
LDL-R에 결합하는 Pcsk9는 LDL-R 분해를 유발하는 것으로 나타났고, 이를 HepG2 세포 및 재조합 인간 Pcsk9를 사용하여 확인하였다. Pcsk9에 결합하여 상기 효과를 차단하는 LFU720의 능력을 측정하였다. NVP-LFU720은 외생 hPcsk9 처리된 HepG2 세포를 억제하였고, 세포-표면 LDL-R의 증가를 유발하였다.
Pcsk9 를 억제하고 LDL 흡수를 복구하는 것에 대한 LFU720 의 스크리닝
LDL-R의 Pcsk9 분해의 억제는, LDL-C를 내재화하는 HepG2 세포의 능력을 복구하여야 한다. NVP-LFU720은 외생 hPcsk9로 처리된 HepG2 세포 상에서의 Pcsk9-매개 LDL-R 분해를 방지하였고, 99 nM의 EC50으로 DiI-LDL-흡수의 증가를 유발하였다.
실시예 2: PCSK9 길항제 항체 NVP - LGT209 , NVP - LGT210 및 NVP - LGT211 의 생성
서론
본 실시예는 인간 배선 항체에 대해 더 큰 서열 상동성을 갖도록 뮤린 모노클로날 PCSK9 길항제 항체 NVP-LFU720을 조작함으로써 인간 항체 NVP-LGT209, NVP-LGT210 및 NVP LGT211을 생성하는 것을 기재한다. NVP-LGT209, NVP-LGT210 및 NVP LGT211은 모 뮤린 항체인 NVP-LFU720의 에피토프 특이성, 친화도, 및 시노몰구스 마카크 PCSK9 교차-반응성을 유지한다. NVP-LGT209, NVP-LGT210 및 NVP LGT211은 인간 배선 서열에 대해 본래의 뮤린 항체보다 훨씬 더 높은 상동성을 가지며, 따라서 인간 면역계에 의해 더 양호하게 허용되어야 한다.
마우스 모노클로날 항체 LFU720을, 그의 단백질 서열을 인간 배선 서열에 더 가깝게 만들고 그의 면역원성을 감소시키기 위해 휴머니어드™하였다. 휴머니어링™ 기술은 사우스 샌프란시스코의 KaloBios를 통해 (월드와이드 웹 상의 kalobios.com에서) 이용가능하다. 항체 휴머니어링™은, 모 또는 참조 항체의 특이성 및 친화도를 여전히 유지하면서 인간 배선 서열에 대해 높은 상동성을 갖는 V-영역 서열을 갖는 조작된 인간 항체를 생성한다 (미국 특허 공개번호 2005/0255552 및 2006/0134098). 과정은, 먼저 참조 Fab의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 내의 최소 항원 결합 특이성 결정자 (BSD) (전형적으로 중쇄 CDR3 및 경쇄 CDR3 내의 서열)를 확인하였다. 이들 중쇄 및 경쇄 BSD는 휴머니어링™ 과정 동안 구축되는 모든 라이브러리에서 유지되므로, 각각의 라이브러리는 에피토프-집중되어 있으며, 완전 휴머니어드™ 최종 항체는 본래의 마우스 항체의 에피토프 특이성을 유지한다.
다음으로, 완전-쇄 라이브러리 (전체 경쇄 또는 중쇄 가변 영역이 인간 서열의 라이브러리로 대체됨) 및/또는 카세트 라이브러리 (마우스 Fab의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역의 일부가 인간 서열의 라이브러리로 대체됨)를 생성하였다. 박테리아 분비 시스템을 이용하여 항체 Fab 단편으로서의 라이브러리의 구성원을 발현시키고, 콜로니-리프트 결합 검정 (CLBA)을 이용하여 라이브러리를 항원에 결합하는 Fab에 대해 스크리닝하였다. 양성 클론을 추가로 특징규명하여 최고의 친화도를 갖는 것들을 확인하였다. 이어서, 나머지 뮤린 서열과 관련하여 결합을 지원하는 확인된 인간 카세트를, 인간 V-영역을 완전히 생성하는 최종 라이브러리 스크리닝에서 합쳤다.
생성된 휴머니어드™ Fab는 인간 라이브러리로부터 유래된 V-절편 서열을 갖고, CDR3 영역 내에서 확인된 짧은 BSD 서열을 유지하고, 인간 배선 프레임워크 4 영역을 가졌다. 이들 Fab를, IgG 발현 벡터 내로 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 클로닝함으로써 완전한 IgG로 전환시켰다. 상기 과정에서 생성된 완전 휴머니어드™ 항체는 모, 뮤린 항체의 결합 특이성을 유지하였고, 전형적으로 모 항체에 비해 항원에 대한 동등하거나 더 높은 친화도를 가졌고, 단백질 수준에서 인간 배선 항체 유전자와 비교하여 고도의 서열 동일성을 갖는 V-영역을 가졌다.
방법
뮤린 V-영역의 클로닝
뮤린 모노클로날 NVP-LFU720으로부터의 V-영역 DNA를 표준 방법을 이용하여 하이브리도마 세포주로부터 단리된 RNA로부터의 RT-PCR에 의해 증폭시켰다. 하이브리도마 cDNA로부터의 중쇄 가변 영역의 PCR 증폭에 성공적으로 사용된 프라이머는 VH14 (5'-CTTCCTGATGGCAGTGGTT-3'; 서열 58) (문헌 [Chardes T, et al. 1999, FEBS Letters; 452(3):386-94) 및 HC불변 (5'-GCGTCTAGAAYCTCCACACACAGGRRCCAGTGGATAGAC-3'; 서열 59)였다. 하이브리도마 cDNA로부터의 경쇄 (카파) 가변 영역의 PCR 증폭에 성공적으로 사용된 프라이머는 Vκ4/5 (5'-TCAGCTTCYTGCTAATCAGTG-3'; 서열 60) (상기 문헌 [Chardes T, et al., 1999]) 및 LC불변 (5'-GCGTCTAGAACTGGATGGTGGGAAGATGG-3'; 서열 61)였다. 증폭된 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 서열분석하였다. 이어서, PCR을 이용하여 V-유전자를 증폭시키고, KaloBios 벡터 내로 클로닝하기 위한 제한 효소 부위를 포함시켰다: KB1292-His (CH1 상에서 아미노산 서열 AAGASHHHHHH (서열 62)의 C-말단 가요성 링커 및 6-His (서열 57) 태그를 코딩하는, KB1292의 변형된 버전) 내로 NcoI (5') 및 NheI (3')에서 Vh; KB1296 내로 NcoI (5') 및 BsiWI (3')에서 Vk. 이어서, 이들 개별 중쇄 및 경쇄 벡터를, BssHII 및 ClaI을 사용한 제한적 소화 및 라이게이션에 의해 단일 디시스트론 KaloBios Fab 발현 벡터 내로 합쳤다. Fab 단편을 상기 벡터로부터 이. 콜라이에서 발현시켰다. 상기 Fab를 PCSK9-항원 결합에 대해 시험하였고, 참조 Fab SR032로 지칭하였다.
Fab 정제
Fab 단편을 KaloBios 발현 벡터를 사용하여 이. 콜라이로부터의 분비에 의해 발현시켰다. 세포를 2xYT 배지 중에서 약 0.6의 OD600로 성장시켰다. IPTG를 100 μM로 첨가하고, 33℃에서 4시간 동안 진탕시킴으로써 발현을 유도하였다. 삼투 용해, 및 표준 방법에 따라 Ni-NTA 칼럼 (HisTrap HP 칼럼; 지이 헬쓰케어(GE Healthcare) 카탈로그 #17-5247-01)을 사용하는 친화성 크로마토그래피에 의해, 조립된 Fab를 주변세포질 분획으로부터 수득하였다. Fab를 500 mM 이미다졸을 함유하는 완충제 중에서 용리하고, 칼슘 및 마그네슘이 없는 PBS pH 7.4에 대해 투석하였다.
라이브러리 구축
라이브러리 구축에서의 제1 단계를 위해, 에피토프-집중된 완전 인간 V-영역 라이브러리를 KaloBios 인간 V-절편 라이브러리 서열의 PCR 증폭에 의해 생성하였다. 이들 완전-쇄 라이브러리를 만드는 데 있어, 최적화된 참조 Fab SR038로부터의 BSD 및 인간 배선 J-절편 서열을 함유하는 고유의 CDR3-FR4 영역을 인간 V-절편 라이브러리에 중복 PCR을 이용하여 부착시켰다. 이들 완전 V-영역 라이브러리를 직접적으로 스크리닝하지 않고; 그보다는 이들을 Vh 및 Vk 중간부 라이브러리의 구축을 위한 주형으로서 사용하였다. 완전-쇄 라이브러리 구축에 사용된 KaloBios 인간 V-절편 라이브러리는, CDR 영역에서 본래의 뮤린 Vh 및 Vk의 서열에 가장 근접한 인간 배선 서열에 기초하여 선택하였다. 본래의 뮤린 NVP-LFU720 Vh는 그의 CDR에서 인간 배선 서열 VH1-02에 가장 근접하였고, 따라서 Vh1 하위군 구성원을 함유하는 2개의 KaloBios 라이브러리 (KB1410 및 KB1411)의 혼합물을 완전 Vh 라이브러리를 만드는 데 사용하였다. 마찬가지로, NVP-LFU720 Vk는 그의 CDR에서 Vk3 L6 인간 배선 서열에 가장 근접하였기 때문에, Vk3 하위군 구성원을 함유하는 2개의 KaloBios 인간 V-절편 라이브러리 (KB1423 및 KB1424)의 혼합물을 완전 Vk 라이브러리를 만드는 데 사용하였다. 이어서, 이들 전장 Vh 및 Vk 라이브러리를, 모 뮤린 V-절편의 일부만이 인간 서열의 라이브러리에 의해 대체된 카세트 라이브러리의 구축을 위한 주형으로서 사용하였다. 2가지 유형의 카세트를 가교 PCR에 의해 구축하였다: FR1, CDR1, 및 FR2의 처음 부분에 인간 서열을 함유하는 전단부 카세트를, 주형으로서 상기 기재된 Vh1 라이브러리의 혼합물 (KB1410 및 KB1411) 또는 Vk3 라이브러리의 혼합물 (KB1423 및 KB1424)로부터 증폭시켰다. FR2, CDR2 및 FR3의 마지막 부분에 인간 서열을 함유하는 중간부 카세트를, 주형으로서 상기 기재된 완전 인간 Vh- 또는 Vk-영역 라이브러리를 사용하여 증폭시켰다. Vh 카세트는 FR2에서 아미노산 위치 45-49 (카바트 넘버링)에 중복된 공통 서열을 가졌고; Vk 카세트는 FR2에서 아미노산 잔기 35-39 (카바트 넘버링)에 중복된 공통 서열을 가졌다. 상기 방식으로, 인간 V-중쇄 1 및 V-카파 3 이소형에 대한 전단부 및 중간부 인간 카세트 라이브러리를 PCR에 의해 구축하였다. 각각의 Vh 카세트 라이브러리를 벡터 KB1292-His 내로 NcoI (5') 및 KpnI (3')에서 클로닝하고; 각각의 Vk 카세트 라이브러리를 벡터 KB1296-B (FR4에 첨가된 침묵 HindIII 부위를 갖는 KaloBios 벡터 KB1296의 변형된 버전) 내로 NcoI (5') 및 HindIII (3')에서 클로닝하였다. 이어서, 생성된 Vh 또는 Vk 플라스미드 라이브러리를, BssHII 및 ClaI을 사용한 소화 및 후속적인 라이게이션에 의해 최적화된 참조 Fab SR038로부터의 상보적 쇄와 조합시켜 (예를 들어, Vh 전단부 라이브러리를 최적화된 참조 Vk 벡터와 조합시킴), 완전 Fab를 발현하는 디시스트론 벡터의 라이브러리를 생성하였다.
일반적 ELISA
재조합 인간 또는 시노몰구스 마카크 PCSK9-His6 항원을 모든 ELISA 검정에 사용하였다. 전형적으로, PBS pH 7.4에 희석된 PCSK9-His6 항원을 300 ng/웰로 4℃에서 밤새 인큐베이션함으로써 96-웰 마이크로타이터 플레이트에 결합시켰다. 플레이트를 PBS 중 3％ BSA의 용액으로 37℃에서 1시간 동안 블로킹한 다음, PBST로 1회 헹구었다. 이어서, Fab-함유 유도된 세포 배지 또는 희석된, 정제된 Fab (50 μL)를 각 웰에 첨가하였다. 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 PBST로 3회 헹구었다. PBS (50 μL)에 1:5000으로 희석된 항-인간-카파 쇄 HRP 접합체 (시그마 #A7164)를 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 45분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBST로 3회 세척한 다음, 슈어블루(SureBlue) TMB 기질 (KPL #52-00-03) 100 μL를 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 약 10분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 분광광도계에서 650 nm에서 판독하였다.
정제된 인간 및 마우스 IgG 상에서의 특이성 ELISA를 위해, 384-웰 플레이트를 정제된 인간 또는 마우스 항원의 패널로 웰당 88 ng으로 코팅하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 플레이트를 상기 기재된 바와 같이 블로킹 및 세척한 다음, PBS 중에 2 μg/mL로 희석된 정제된 마우스 또는 인간 항-PCSK9 항체 22 μL를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 37℃ 에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음, PBST로 세척하였다. HRP에 접합된 항-마우스 Fc 항체 (잭슨 이뮤노리서치 랩스 #115-035-071) 또는 항-인간 카파 항체 (시그마 #A7164)를 PBS (25 μL)에 1:5000으로 희석하고, 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음, 상기 기재된 바와 같이 세척하고, 발색시켰다.
콜로니 리프트 결합 검정 ( CLBA )
Fab 단편의 휴머니어드™ 라이브러리의 스크리닝을, 본질적으로 (미국 특허 공개번호 2005/0255552 및 2006/0134098)에 기재된 바와 같이 6 μg/mL의 PCSK9-His6으로 코팅된 니트로셀룰로스 필터를 사용하여 수행하였다. 항원-코팅된 필터에 결합된 Fab를, PBST에 1:5000으로 희석된 알칼리성 포스파타제-접합된 항-인간 카파 경쇄 항체 (시그마 #A3813)를 사용하여 검출하고, 블롯을 알칼리성 포스파타제에 대한 듀오럭스(DuoLux) 화학발광 기질 (벡터 래보러토리즈(Vector Laboratories) #SK-6605)을 사용하여 발색시켰다.
비오티닐화 재조합 PCSK9 의 생성 및 친화도 측정
C-말단 Avi- (부위-지정 비오티닐화를 위해) 및 His6 (서열 57) 태그를 갖는 PCSK9 (PCSK9-Avi-His6)를, pRS5a/PCSK9 플라스미드에서 PCSK9를 코딩하는 유전자와 His6 (서열 57) 태그 사이에 EcoRI 제한 부위를 삽입함으로써 생성하였다 (C-말단 His6 (서열 57) 태그를 갖는 PCSK9 Uniprot 등록번호 Q8NBP7의 아미노산 31-692를 발현함). Avi 태그 (아미노산 서열: GGGLNDIFEAQKIEWHE; 서열 63)를 코딩하고 EcoRI 오버행에 접한 올리고뉴클레오티드를 T4 폴리뉴클레오티드 키나제 (인비트로젠)로 인산화시키고, 어닐링하고, 후속적으로 새로이 삽입된 EcoRI 부위를 이용하여 pRS5a/PCSK9 내로 라이게이션시켰다. Avi 태그를 함유하는 클론을 서열 분석에 의해 확인하였다. PCSK9-Avi-His6의 발현을 293 프리스타일 발현 시스템 (인비트로젠)에서 수행하고, 분비된 재조합 단백질을 Ni-NTA 수지 (퀴아젠(QIAGEN))를 사용하여 정제하였다. 정제에 이어서, PCSK9-Avi-His6 단백질을 10 mM 트리스 pH 8.0, 50 mM NaCl에 대해 투석하였다. 단백질을 비오틴-단백질 리가제 (아비디티(Avidity))를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 시험관내 비오티닐화하였다. 완료시에, 반응물을 PBS pH 7.2에 대해 투석하고, 비오티닐화를 HRP-접합된 스트렙타비딘을 프로브로 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 확인하였다.
IgG 및 Fab 단편의 결합 동역학을 용액 평형 적정 ("SET") 검정을 이용하여 분석하였다. 간략하게, hPCSK9의 연속 희석물을 60 pM IgG 또는 Fab에 첨가하고, 밤새 인큐베이션하였다. 96-웰 스탠다드 바인드(Standard Bind) 마이크로타이터 플레이트 (메조 스케일 디스커버리)를 1 μg/ml hPCSK9로 코팅하고, 밤새 인큐베이션하고, PBS/0.05％ (w/v) 트윈 20으로 세척하고, PBS/5％ (w/v) BSA로 블로킹하고, 다시 세척하였다. 항체-항원 제조물을 PCSK9-코팅된 스탠다드 바인드 플레이트에 첨가하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 3회의 추가 세척 단계 후, 술포-태그-표지된 염소-항-인간-검출 항체 (R32AJ-5, 메조 스케일 디스커버리)를 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 3회 세척한 후, 판독 완충제 (메조 스케일 디스커버리)를 첨가하고, 전기화학발광 (ECL) 신호를 섹터 이미저 6000 (메조 스케일 디스커버리)에 의해 측정하였다. ECL 데이터를 문헌 [Piehler, et al., (1997) J Immunol Methods 201:189-206]에 기재된 항체에 적용가능한 핏팅 모델을 이용하여 엑셀 애드-인 XL핏(XLfit) 4.3.2 (아이디 비즈니스 솔루션즈(ID Business Solutions))로 가공하였다. 용액 중에서 인간 PCSK9와 항체 LGT209, LGT210 및 LGT211 사이의 고친화도 결합이, 각각에 대해 계산된 150-190 pM의 KD 값으로 관찰되었다.
항체 생산 및 정제
완전 휴머니어드™ NVP-LGT209, NVP-LGT210 및 NVP-LGT211 항체 (침묵 IgG1 카파)를, 제조업체의 프로토콜에 따라 293펙틴 형질감염 시약 (인비트로젠 #51-0031)을 사용하여 하기와 같은 벡터의 293 프리스타일 세포 내로의 동시-형질감염에 의해 생산하였다.
LGT-209 - pJG04 (Vh) +pJG10 (Vk)
LGT-210 - pJG04 (Vh) + pJG01 (Vk)
LGT-211 - pSR74 (Vh) + pJG10 (Vk)
항체를 5-mL HiTrap 단백질 A HP 칼럼 (지이 헬쓰케어 #17-0403-03)을 사용하여 293 프리스타일 세포 상청액으로부터 정제하였다. 항체를 IgG 용리 완충제 (피어스 #21004)를 사용하여 용리하고, 투석에 의해 PBS로 완충제 교환시켰다. 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 AKTAFPLC 액체 크로마토그래피 시스템 (지이 헬쓰케어) 상에서 수행하였다.
에피토프 경쟁 검정
PCSK9에 결합하는 에피토프에 대한 본래의 마우스 항체 NVP-LFU720 및 그의 휴머니어드™ 유도체 NVP-LGT209 사이의 경쟁을, 포르테바이오 옥텟 큐케이(ForteBio Octet QK) 시스템, 및 비오티닐화 PCSK9-Avi-His6으로 코팅된 스트렙타비딘 하이 바인딩 바이오센서(Streptavidin High Binding Biosensor)를 이용하여 검정하였다. 이어서, 3종의 상이한 항체를 개별적인 PCSK9-코팅된 센서에 포화될 때까지 결합시켰다: 마우스 LFU720, 완전 인간 LGT209 또는 대조군 마우스 항체 7D16 (LFU720의 에피토프와 별개의 에피토프를 갖는 것으로 알려져 있음). 다음으로, 모든 센서를 LFU720 마우스 항체를 함유하는 웰에 침지시켜, 제1 항체가 LFU720 결합을 차단할 수 있는지의 여부를 결정하였다.
결과
뮤린 및 참조 V-영역 아미노산 서열
NVP-LFU720을 발현하는 하이브리도마 세포로부터의 RT-PCR 생성물을 서열분석하고, 상기 서열을 써모일렉트론 LTQ-오르비트랩(ThermoElectron LTQ-Orbitrap) 질량 분광측정계를 이용하여 단백질 수준에서 충분히 (95％ 이상) 확인하였다. 이어서, 참조 Fab SR032를 생성하기 위해 LFU720의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 KaloBios 벡터 내로 클로닝하였다. NVP-LFU720 Vk의 제1 아미노산은 참조 Fab SR032의 생성을 위한 KaloBios 벡터 내로의 클로닝을 가능하게 하기 위해 글루타민 (Q)에서 글루탐산 (E)으로 변경되어야 했고; 따라서, SR032 Vk는 제1 Vk 위치에 글루탐산을 가졌다. Fab SR032는 인간 불변 영역과 융합된 NVP-LFU720으로부터의 무손상 뮤린 V-영역을 가졌고, 이를 이. 콜라이로부터 정제하였다. PCSK9-His6 항원 결합의 희석 ELISA 시험에서, 클로닝된 SR032 참조 Fab는 Fab 농도에 의존적인 결합 곡선을 생성하였다. 참조 Fab (SR032) 이외에도, 최적화된 참조 Fab인 SR038을 구축하였다. SR032의 여러 프레임워크 아미노산 잔기는 SR038에서 인간 배선으로 변경되었다.
참조 및 최적화된 참조 Fab 친화도 분석
FR1 및 FR3에서 최적화된 참조 Fab SR038 내로 혼입된 인간 배선 잔기는 인간 V-절편 레퍼토리를 증폭시키는 데 사용된 PCR 프라이머에 의해 특정된 것들이었고, 따라서 휴머니어드™ V-영역 라이브러리의 모든 구성원에 존재한다. 최적화된 참조 Fab를 구축하여 인간 배선에 대한 어떠한 변화가 Fab 결합의 특성을 변경하는지 아닌지의 여부를 평가하였다. 정제된 Fab를 사용하는 희석 ELISA에 의해, 재조합 PCSK9 항원에 대한 SR032 및 SR038의 친화도는 동일한 것으로 측정되었고, 이는 SR038에서의 아미노산 변경이 허용된다는 것을 나타내었다.
라이브러리 구축, 및 완전 휴머니어드 ™ Fab 의 선택
Vh1 또는 Vk3으로 하위군-제한된 중쇄 및 경쇄 전단부 및 중간부 카세트 라이브러리를 생성하고, CLBA에 의해 스크리닝하였다. Vh의 경우에, PCSK9 항원에 대한 결합을 지원하는 전단부 카세트가 콜로니-리프트 결합 검정에 의해 확인되었으나, Vh 중간부 카세트는 확인되지 않았다. Vk의 경우에, 전단부 및 중간부 카세트가 둘 다 콜로니 리프트에 의해 확인되었고, 추가로 일부 완전 Vk 클론이 확인되었다 (완전-쇄 Vk 클론에 의한 Vk 전단부 라이브러리의 오염에 기인함). 각각의 라이브러리로부터의 다수의 결합제를 Fab-함유 세포 상청액에 대한 ELISA 검정에서 재확인하고, 각각의 라이브러리로부터의 여러 Fab를 주변세포질 분획으로부터 정제하고, 포르테(Forte) 분석을 이용하여 친화도에 의해 순위-나열하였다.
PCSK9 결합을 지원한 어떠한 V-중쇄 중간부 카세트도 확인되지 않았기 때문에, 중쇄 CDR2 또는 FR3 내의 모든 위치에서 모 뮤린 잔기 또는 가장 근접한 인간 배선 잔기를 코딩하는 2개의 돌연변이유발 라이브러리를 구축하였다. 따라서, 조작된 인간 중간부 카세트 라이브러리를 구축하고, 스크리닝하고, 항원 결합 클론을 확인하였다. 이어서, 개별 클론과 관련하여 결합을 지원한 Vh 중간부에서의 인간 배선으로의 변경을 조합시켜 하나의 최종 중간부 카세트를 생성하였고, 최적화된 참조 Fab와 관련하여 상기 카세트를 함유하는 Fab의 친화도는 최적화된 참조 Fab만큼 잘 결합하는 것으로 포르테 분석에 의해 확인되었다.
생성된 라이브러리로부터, PCSK9 항원에 대한 결합을 지원한 전단부 및 중간부 인간 카세트를 CLBA에 의해 중쇄 및 경쇄 둘 다에 대해 성공적으로 확인하였다. 이들 결합제를 ELISA에 의해 모두 확인한 다음, Fab를 정제하고, 포르테바이오 옥텟 시스템을 이용하여 순위-나열하였다. 중쇄 및 경쇄에 대한 고-순위 카세트를 가교 PCR에 의해 하나의 최종 라이브러리 내로 합치고, PCSK9에 대한 결합을 지원한 완전 휴머니어드™ Fab를 CLBA에 의해 상기 라이브러리로부터 선택하였다. 이와 병행하여, 모든 최고-순위 카세트 또는 쇄 (최고의 Vh 전단부, 조작된 Vh 중간부, 및 최고의 완전 경쇄)를 함께 조합시켜 단일 Fab SR066을 생성하였고, 이는 고-친화도 결합을 지원할 것으로 예상되었다.
모 마우스 mAb NVP-LFU720 및 휴머니어드™ Ab NVP-LGT209, NVP-LGT210 및 NVP-LGT211에 대해 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 서열을 각각 도 1-4에 나타내었다.
포르테바이오 옥텟 분석을 이용하는, PCSK9 항원에 대한 완전 휴머니어드 ™된 Fab 의 친화도 시험
휴머니어드™ SR066 Fab 및 최종 조합 라이브러리로부터 모은 3종의 Fab (#1-2, #3-2 및 #4-2)를 발현시키고, 정제하였다. 이어서, 이들 4종의 인간 Fab의 결합 동역학을 포르테바이오 옥텟 시스템을 이용하여 최적화된 참조 Fab SR038의 동역학과 비교하였다 (표 1에 요약된 수치상 데이터).
Figure pct00001
이들 Fab에 대한 단백질 농도 측정은 어려웠고; 이에 따라 이탈 속도 (kd) 데이터가 결합 속도 (ka) 및 KD 데이터 (단지 이탈 속도만 농도-독립적임)보다 훨씬 더 믿을 만하다. 시험된 4종의 휴머니어드™ Fab 모두는 최적화된 참조 Fab의 이탈 속도보다 3- 내지 4-배 "더 불량한" (즉, 빠른) 이탈 속도를 갖는 것으로 나타났다. 본래의 중쇄 전단부 카세트 라이브러리로부터 선택된 모든 Fab 결합제가 최적화된 참조 Fab보다 "더 불량한" 이탈 속도를 갖는 것으로 나타난 것처럼, 상기 친화도의 감소는 아마도 이들 클론의 중쇄 전단부에 기인한다 (데이터는 제시되지 않음). 중쇄 전단부가 CDR1을 함유하기 때문에, Vh 전단부 카세트의 상기 CDR에 생성된 변화는 최종 휴머니어드™ Fab의 친화도 감소에 대한 잠재적 원인이었다. 완전히 휴머니어드™ Fab 중, SR066은 최고 이탈 속도 (표 1)를 가졌고, 중쇄 CDR1에서 SR066과 참조 (마우스) 서열 사이에는 3개의 차이가 있었다. CDRH1에 생성된 변화가 본 발명자들의 모든 휴머니어드™ Fab에서 보이는 친화도 감소의 원인이 되었다는 견해를 시험하기 위해, 본 발명자들은 SR066의 CDRH1에서 동시에 2개의 잔기를 다시 본래의 뮤린 잔기와 일치하도록 변화시키고, 발현시키고, 포르테 동역학 분석을 위해 이들 변경된 Fab를 정제하였다.
CDRH1 (SR079)에 2개의 동시 변화를 갖는 한 Fab (표 2)는 SR066의 결합 동역학을 유의하게 개선시켰다 (수치상 데이터가 표 3에 요약되어 있음). 사실상, SR079 Fab는 최적화된 참조 (마우스) Fab SR038의 이탈 속도와 동등한 이탈 속도를 갖는 것으로 나타났다.
Figure pct00002
Figure pct00003
휴머니어드™ Fab SR066인 #1-2, #3-2 및 #4-2는 CDRH2에 "Asn-Gly" ("NG") 아미노산 서열을 함유하였고, 이는 본래의 마우스 항체로부터 유래하였다. 상기 서열은 잠재적으로 생산에 바람직하지 않은 특성인 탈아미드화를 겪는 것으로 알려져 있다. 따라서, 휴머니어드™ SR066 Fab의 친화도를 향상시키기 위한 노력을 함과 동시에, SR066과 관련하여 "N" 또는 "G"가 본래의 아미노산을 제외한 모든 가능한 아미노산으로 치환된 (예를 들어, "N 제거 라이브러리"에서, "N"은 "N"을 제외한 모든 아미노산으로 치환됨) 2개의 돌연변이유발 라이브러리를 구축하였다. 이어서, 상기 라이브러리로부터의 Fab-함유 세포 상청액을 ELISA에 의해 스크리닝하여, 더이상 "NG" 서열을 갖지 않으나 여전히 SR066 수준의 결합 (이는 최적화된 참조 Fab SR038의 그것 미만임)을 유지한 클론을 확인하였다. "N 제거 라이브러리"는 SR066과 동일한 정도로 결합된 어떠한 Fab도 생성하지 않았으나, "G 제거 라이브러리"는 "G" 위치에 다수의 다양한 치환을 가진 충분한 결합 수준을 갖는 Fab를 생성하였다. 이들 중, "NG"에서 "NE", "NA" 및 "NM"으로의 변화를 가진 Fab가 정제 및 포르테 동역학 분석을 위해 선택되었고, 모 Fab SR066의 그것과 유사한 동역학을 갖는 것으로 밝혀졌다.
친화도를 향상시키기 위한 7472 인간 IgG 조작
Vk 조작
완전 인간 IgG를 생성하기 위해, CDRH2까지의 SR079 (향상된 친화도를 갖는 SR066의 변형된 버전)의 Vh 서열을 브릿지 PCR에 의해 증폭시키고, FR4 중 대부분에 걸친 CDRH2로부터의 "G 제거 라이브러리" 클론 (CDRH2에 "NE"를 함유함)의 서열에 연결시켰다. 상기 Vh 서열을 pRS5a-hIgG1 LALA + KpnI (Vh의 아미노산 서열에 영향을 미치지 않고 FR4에 KpnI 부위를 첨가하도록 변형된 침묵 IgG1 클로닝 벡터) 내로 NruI (5') 및 KpnI (3')에서 클로닝하여 pSR074를 생성하였다. SR066으로부터의 Vk (FR1부터 FR4 도중까지)를 증폭시키고, pRS5a-h카파 내로 AgeI 및 BsiWI에서 클로닝하여 pSR072를 생성하였다. 이들 벡터를 서열분석에 의해 확인하고, 293 프리스타일 세포 내로 동시-형질감염시켰다. 상기 IgG ("7472"로 지칭됨)를 항체-함유 세포 배지로부터 정제하였다. 놀랍게도, 항체 7472는 비아코어 분석에 의하면 모 마우스 항체 LFU720보다 유의하게 더 느린 결합 속도를 가졌다 (제시되지 않음). 각각의 인간 쇄를 상보적 모 마우스 쇄로 교체함으로써, 상기 결합 속도 결함은 인간 경쇄와의 문제에 기인한 것으로 확정되었다. 친화도를 되살리기 위해 pSR072 인간 경쇄에 변경을 생성하였다 (표 4): 경쇄의 처음 4개의 잔기를 다시 마우스 서열로 전환시키고, CDR1의 후반부의 잔기를 다시 마우스로 전환시켰다. 상기 경쇄를 상기 기재된 바와 같이 pRS5a-h카파 내로 클로닝하여 pJG10 및 pJG01을 생성하고, 완전 IgG를 pSR074 (Hc 벡터)와 pJG10 (Lc 벡터) 또는 pJG01 (Lc 벡터)의 동시-형질감염에 의해 생성하였다. 종합하면, 이들 변화는 비아코어에 의해 측정시, 휴머니어드™ 항체의 친화도를 부분적으로 되살려내었다.
Figure pct00004
표 4는 인간 항체 7472의 경쇄, 모 마우스 항체 LFU720의 경쇄, 및 pJG10에 의해 코딩된 경쇄의 일부분의 정렬을 보여준다. 상기 일부분은 pJG01에 의해 코딩된 경쇄와 동일하다. 경쇄 벡터를 최종 휴머니어드™ 항체 NVP-LGT209, NVP-LGT210 및 NVP-LGT-211의 발현에 사용하였다.
CDRH3 의 친화도 성숙
경쇄 변경과 병행하여, pSR074 중쇄의 친화도 성숙 CDR3을 위한 Fab 라이브러리를 구축하였다. 상기 라이브러리에서, CDR3 잔기를 본래의 잔기를 제외한 모든 다른 아미노산으로 단일 치환하였다. 상기 라이브러리를 CLBA에 의해 스크리닝하고, 결합제를 ELISA에 의해 확인하고, 생성된 Fab를 정제하고, 생체-층 간섭측정법에 의해 시험하여, 이들이 모 인간 Fab와 관련하여 개선된 결합 동역학을 가졌는지의 여부를 결정하였다.
한 CDRH3 치환이 친화도를 유의하게 개선시킨 것으로 확인되었다: A → N 변화 (표 5). 상기 변화를 pSR074 중쇄 IgG 발현 플라스미드와 관련하여 후속적으로 생성하였고; 상기 신규 구축물은 pJG04로 불렸다. 최종 휴머니어드™ 항체 NVP-LGT209 (LGT209)를 pJG04 (Hc) 및 pJG10의 동시-형질감염 및 후속 정제에 의해 생성하였다. 최종 휴머니어드™ 항체 NVP-LGT210 (LGT210)을 pJG04 (Hc) 및 pJG01의 동시-형질감염 및 후속 정제에 의해 생성하였다. 상기 변화는 항체 NVP-LGT211 (LGT211)에는 도입하지 않았다.
Figure pct00005
표 5는 인간 항체 7472의 중쇄 CDR3, 모 마우스 항체 LFU720의 중쇄 CDR3, 및 pJG04 (최종 휴머니어드™ 항체 NVP-LGT209 및 NVP-LGT210의 발현에 사용된 중쇄 벡터)에 의해 코딩된 중쇄의 정렬을 보여준다. A → N 치환은 밑줄 표시하였다.
용액 평형 적정 ( SET ) 시스템을 이용한 NVP - LGT209 , NVP - LGT210 및 NVP - LGT211 의 결합 동역학 분석
SET 검정을 이용하여, 인간 PCSK9에 대한 NVP-LGT209, NVP-LGT210 및 NVP-LGT211 항체의 결합 친화도는 표 6에 나타낸 바와 같이 150-190 pM 사이에 있는 것으로 측정되었다. 이는 용액 중에서 항체와 PCSK9 사이의 고친화도 상호작용을 시사한다.
Figure pct00006
ELISA 에 의한 NVP - LGT209 의 항원 특이성 분석
모 마우스 항체 LFU720의 항원 특이성이 최종 휴머니어드™ IgG인 LGT209, LGT210 및 LGT211에서 유지되었는지의 여부를 시험하기 위해, (인간 PCSK9 뿐만 아니라) 인간 및 마우스 항원의 패널에 대한 항체의 결합을 ELISA 검정에서 시험하였다. 상기 검정의 결과 (도 5a-c)는 LGT209, LGT210 및 LGT211이 뮤린 항체 LFU720과 유사한, PCSK9에 대한 높은 특이성을 유지한다는 것을 보여준다.
ELISA 에서의 인간 및 시노몰구스 마카크 Pcsk9 단백질에 대한 항체 결합
LGT209, LGT210 및 LGT211을 인간 및 시노몰구스 마카크 (시노) Pcsk9에 대한 특이적 결합에 대해 평가하였다. 상기 ELISA 검정은, 모 마우스 항체 LFU720과 마찬가지로, 휴머니어드™ 항체 LGT209, LGT210 및 LGT211이 유사한 방식으로 인간 및 시노 Pcsk9 둘 다에 결합할 수 있다는 것을 보여준다 (도 6a-c).
생체-층 간섭측정법-기반 에피토프 경쟁 검정
모 뮤린 항체 NVP-LFU720의 에피토프 특이성이 최종 휴머니어드™ 항체 LGT209, LGT210 및 LGT211에서 유지되었는지의 여부를 시험하기 위해, 포르테바이오 옥텟 시스템을 이용한 경쟁 검정을 개발하였다. 휴머니어드™ 항체 LGT209, LGT210 및 LGT211은 모 마우스 항체 NVP-LFU720의 결합을 차단하였으며, 이는 휴머니어드™ 항체가 본래의 뮤린 항체의 에피토프 특이성을 유지한다는 것을 나타낸다. 항체의 로딩 순서를 바꾼 경우에 (즉, NVP-LFU720을 먼저 결합시키고, 이어서 휴머니어드™ 항체를 결합시킴) 유사한 결과를 얻었다.
휴머니어드 ™ 항체 LGT209 , LGT210 및 LGT211 의 아미노산 서열, 및 인간 배선 서열에 대한 동일성 백분율
최종 휴머니어드™ IgG LGT209, LGT210 및 LGT211의 가변 영역 아미노산 서열을 각각 도 2-4에 나타내었고; CDR은 밑줄 및 볼드체 표시하였다. 뉴클레오티드 서열은 서열 목록에 포함되어 있다.
항체 LGT209, LGT210 및 LGT211에 있어서 인간 배선 서열에 대한 동일성 백분율을 단일 인간 배선 서열에 대해 Vh 및 Vk 아미노산 서열을 정렬시킴으로써 결정하였다 (각각 Vh1 1-02 및 Vk3 A27; 표 7). CDRH3 및 CDRL3의 잔기는 각각의 쇄에 대한 계산으로부터 제외시켰다.
Figure pct00007
휴머니어드 항체의 기능적 특징규명에 관한 추가 정보는 도 8-14의 도면 범례에 논의되어 있다.
실시예 3: PCSK9 길항제 항체 NVP - LGT209 , NVP - LGT210 및 NVP - LGT211 의 돌연변이 분석
PCSK9 길항제 항체 NVP-LGT209, NVP-LGT210 및 NVP LGT211의 변이체를 PCSK9에 결합하는 이들의 능력에 대해 평가하였다. 결과는 하기와 같이 요약된다:
중쇄 CDR1, TMYMS (서열 66)와 관련하여, 단지 본래의 마우스 잔기 (볼드체)를 함유하는 클론만이 마우스 Ab의 결합 동역학을 유지하였다 (생체층 간섭측정법 분석에 의해 측정시). 따라서, 중쇄 CDR1 내의 이들 잔기는 결합에서 역할을 한다.
중쇄 CDR2, RIDPAN E HTNYAQKFQG (서열 74)와 관련하여, 볼드체 표시한 잔기는 본래의 (마우스) 잔기 또는 각각의 위치에서 가장 근접한 인간 배선 서열에서의 상응하는 잔기를 코딩하는 라이브러리로부터 모은 항체 결합제에서 변경되지 않았다 (ELISA에 의해 스크리닝함). 따라서, 볼드체 표시한 잔기는 결합에서 역할을 한다. ELISA에 의해 측정하고 생체층 간섭측정법에 의해 확인한 바와 같이, 밑줄 표시한 Glu 잔기에 의해 나타낸 위치에서 보존적 치환이 허용된다 (예를 들어, 상기 위치는 A, E 또는 D일 수 있음).
중쇄 CDR3, SYYYY(A/N)MD Y (서열 75)와 관련하여, 볼드체 표시한 잔기는 각각의 위치에서 모든 아미노산 가능성 (본래의 aa 제외)을 코딩하는 친화도 성숙 라이브러리로부터 모은 클론에서 변경되지 않았다. 따라서, 볼드체 표시한 잔기는 결합에서 역할을 한다. 비아코어에 의해 측정한 바와 같이, 밑줄 표시한 Ala 또는 Asn 잔기에 의해 나타낸 위치에서 보존적 치환이 허용된다 (예를 들어, 상기 위치는 A, N 또는 Q일 수 있음). 비아코어에 의해 측정한 바와 같이, 밑줄 표시한 Tyr 잔기에 의해 나타낸 위치에서 보존적 치환이 허용된다 (예를 들어, 상기 위치는 A, F, S, V 또는 Y일 수 있음).
경쇄 FR1, (E/Q)IV(M/L)TQSPATLSVSPGERATLSC (서열 76)와 관련하여, 비아코어에 의해 측정한 바와 같이, 밑줄 표시한 위치 1 및 4에서 보존적 치환이 허용된다. 예를 들어, 위치 1의 아미노산은 A, D, E, N 또는 Q일 수 있다. 위치 4의 아미노산은 V, I, L 또는 M일 수 있다. 비아코어에 의해 측정한 바와 같이, QIVL (서열 69)로서의 위치 1-4 (마우스 모 LFU720, LGT209 및 LGT211 Vk에서와 같음)는 EIVM (서열 67)으로서의 위치 1-4 (LGT210 Vk에서와 같음)에 비해 개선된 결합을 갖는다.
경쇄 CDR1, RASQSVSYMH (서열 71)와 관련하여, Lc CDR1의 상기 부분에 2개의 여분의 아미노산을 갖는 인간 클론이 친화도가 절충된 것과 같이, 볼드체 표시한 잔기의 스페이싱은 결합에 대해 중요성을 가졌다. 따라서, 볼드체 표시한 잔기는 결합에서 역할을 한다.
ELISA에 의해 측정한 바와 같이, 경쇄 CDR3, LQWSSDPPT (서열 26)와 관련하여, 이들 위치에서의 인간 배선으로의 변화는 허용되지 않는다. 따라서, 볼드체 표시한 잔기는 결합에서 역할을 한다.
본원에 기재된 실시예 및 실시양태는 단지 예시적 목적을 위한 것이고, 이를 고려한 다양한 변형 또는 변화가 당업자에게 제안될 것이고 본원의 취지 및 범위와 첨부된 특허청구범위의 범주 내에 포함되어야 한다는 것을 이해한다. 본원에 인용된 모든 공보, 특허, 특허 출원 및 서열 등록 엔트리는 모든 목적을 위해 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> Rue, Sarah Cohen, Steve B. Yowe, David IRM LLC Novartis AG <120> PCSK9 Antagonists <130> 021288-006410PC <140> WO Not yet assigned <141> Not yet assigned <150> US 61/285,942 <151> 2009-12-11 <160> 76 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 118 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> mouse anti-PCSK9 monoclonal antibody LFU720 heavy chain variable region (FR1-FR4) <400> 1 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Met 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly His Thr Asn Tyr Asp Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Ala Lys Ala Thr Ile Thr Thr Asp Thr Ser Ser Lys Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic anti-PCSK9 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Ile Gly Arg Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys 85 <210> 32 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic anti-PCSK9 monoclonal antibody clones LGT-209, LGT-210 and LGT-211 heavy chain framework region 1 (FR1) <400> 32 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser 20 25 30 <210> 33 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic anti-PCSK9 monoclonal antibody clones LGT-209, LGT-210 and LGT-211 heavy chain framework region 2 (FR2) <400> 33 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly 1 5 10 <210> 34 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic anti-PCSK9 monoclonal antibody clones LGT-209, LGT-210 and LGT-211 heavy chain framework region 3 (FR3) <400> 34 Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu 1 5 10 15 Leu Ser Arg Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 35 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chain framework region 3 (FR3) <400> 38 Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Gly Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 39 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic anti-PCSK9 monoclonal antibody clones LGT-209, LGT-210 and LGT-211 light chain framework region 4 (FR4) <400> 39 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 40 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic anti-PCSK9 monoclonal antibody consensus heavy chain variable region (FR1-FR4) <220> <221> VARIANT <222> (31)...(31) <223> Xaa = Asp or Thr <220> <221> VARIANT <222> (56)...(56) <223> Xaa = Ala, Glu or Gly <220> <221> VARIANT <222> (61)...(61) <223> Xaa = Ala or Asp <220> <221> VARIANT <222> (62)...(62) <223> Xaa = Pro or Gln <220> <221> VARIANT <222> (66)...(66) <223> Xaa = Ala or Gly <220> <221> VARIANT <222> (104)...(104) <223> Xaa = Ala or Asn <220> <221> VARIANT <222> (107)...(107) <223> 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actatgtata tgtcttgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggaagg atcgatcctg ccaatgagca cactaactat 180 gcccagaagt tccaggggag ggtgactatg acaagggaca catccatcag cacagcctac 240 atggagctca gcaggctgac gtctgacgac actgccgtct attactgtgc tagaagttac 300 tattactata acatggacta ctggggtcaa ggtaccctgg tgaccgtcag ctca 354 <210> 43 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic anti-PCSK9 monoclonal antibody pSR74 (clone LGT-211) heavy chain <400> 43 caggttcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcagc actatgtata tgtcttgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggaagg atcgatcctg ccaatgagca cactaactat 180 gcccagaagt tccaggggag ggtgactatg acaagggaca catccatcag cacagcctac 240 atggagctca gcaggctgac gtctgacgac actgccgtct attactgtgc tagaagttac 300 tattactatg ctatggacta ctggggtcaa ggtaccctgg tgaccgtcag ctca 354 <210> 44 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic anti-PCSK9 monoclonal antibody pJG01 (clone LGT-210) light chain <400> 44 gaaatagtga tgacgcagtc tccagccacc ctgtctgtgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc tatatgcatt ggtaccagca gaagccaggc 120 caggctccca ggctcctcat atatggtgtt ttcagaaggg ccactggcat cccagacagg 180 ttcagtggca gtgggtctgg gacagacttc actctcacca tcggcagact ggagcctgaa 240 gattttgcag tgtactactg cctacagtgg agtagtgacc cacccacgtt tggccaaggt 300 acgaagcttg aaattaaa 318 <210> 45 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic anti-PCSK9 monoclonal antibody pJG10 (clones LGT-209 and LGT-211) light chain <400> 45 cagattgttc tcacccagtc tccagccacc ctgtctgtgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc tatatgcatt ggtaccagca gaagccaggc 120 caggctccca ggctcctcat atatggtgtt ttcagaaggg ccactggcat cccagacagg 180 ttcagtggca gtgggtctgg gacagacttc actctcacca tcggcagact ggagcctgaa 240 gattttgcag tgtactactg cctacagtgg agtagtgacc cacccacgtt tggccaaggt 300 acgaagcttg aaattaaa 318 <210> 46 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic anti-PCSK9 monoclonal antibody epitope <400> 46 Arg Ser Arg His Leu Ala Gln Ala Ser Gln Glu Leu Gln 1 5 10 <210> 47 <211> 692 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> human proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9), proprotein convertase 9 (PC9), neural apoptosis-regulated convertase 1 (NARC1, NARC-1), FH3, HCHOLA3, LDLCQ1 preproprotein <220> <221> SIGNAL <222> (1)...(30) <223> signal peptide <220> <221> PROPEP <222> (31)...(692) <223> proprotein <220> <221> CHAIN <222> (153)...(692) <223> mature protein <400> 47 Met Gly Thr Val Ser Ser Arg Arg Ser Trp Trp Pro Leu Pro Leu Leu -30 -25 -20 -15 Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Pro Ala Gly Ala Arg Ala Gln Glu -10 -5 1 Asp Glu Asp Gly Asp Tyr Glu Glu Leu Val Leu Ala Leu Arg Ser Glu 5 10 15 Glu Asp Gly Leu Ala Glu Ala Pro Glu His Gly Thr Thr Ala Thr Phe 20 25 30 His Arg Cys Ala Lys Asp Pro Trp Arg Leu Pro Gly Thr Tyr Val Val 35 40 45 50 Val Leu Lys Glu Glu Thr His Leu Ser Gln Ser Glu Arg Thr Ala Arg 55 60 65 Arg Leu Gln Ala Gln Ala Ala Arg Arg Gly Tyr Leu Thr Lys Ile Leu 70 75 80 His Val Phe His Gly Leu Leu Pro Gly Phe Leu Val Lys Met Ser Gly 85 90 95 Asp Leu Leu Glu Leu Ala Leu Lys Leu Pro His Val Asp Tyr Ile Glu 100 105 110 Glu Asp Ser Ser Val Phe Ala Gln Ser Ile Pro Trp Asn Leu Glu Arg 115 120 125 130 Ile Thr Pro Pro Arg Tyr Arg Ala Asp Glu Tyr Gln Pro Pro Asp Gly 135 140 145 Gly Ser Leu Val Glu Val Tyr Leu Leu Asp Thr Ser Ile Gln Ser Asp 150 155 160 His Arg Glu Ile Glu Gly Arg Val Met Val Thr Asp Phe Glu Asn Val 165 170 175 Pro Glu Glu Asp Gly Thr Arg Phe His Arg Gln Ala Ser Lys Cys Asp 180 185 190 Ser His Gly Thr His Leu Ala Gly Val Val Ser Gly Arg Asp Ala Gly 195 200 205 210 Val Ala Lys Gly Ala Ser Met Arg Ser Leu Arg Val Leu Asn Cys Gln 215 220 225 Gly Lys Gly Thr Val Ser Gly Thr Leu Ile Gly Leu Glu Phe Ile Arg 230 235 240 Lys Ser Gln Leu Val Gln Pro Val Gly Pro Leu Val Val Leu Leu Pro 245 250 255 Leu Ala Gly Gly Tyr Ser Arg Val Leu Asn Ala Ala Cys Gln Arg Leu 260 265 270 Ala Arg Ala 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(PCSK9), proprotein convertase 9 (PC9), neural apoptosis-regulated convertase 1 (NARC1, NARC-1), FH3, HCHOLA3, LDLCQ1 preproprotein <220> <221> sig_peptide <222> (292)...(381) <223> signal peptide <220> <221> misc_structure <222> (382)...(2367) <223> proprotein <220> <221> mat_peptide <222> (538)...(2367) <223> mature protein <400> 48 cagcgacgtc gaggcgctca tggttgcagg cgggcgccgc cgttcagttc agggtctgag 60 cctggaggag tgagccaggc agtgagactg gctcgggcgg gccgggacgc gtcgttgcag 120 cagcggctcc cagctcccag ccaggattcc gcgcgcccct tcacgcgccc tgctcctgaa 180 cttcagctcc tgcacagtcc tccccaccgc aaggctcaag gcgccgccgg cgtggaccgc 240 gcacggcctc taggtctcct cgccaggaca gcaacctctc ccctggccct catgggcacc 300 gtcagctcca ggcggtcctg gtggccgctg ccactgctgc tgctgctgct gctgctcctg 360 ggtcccgcgg gcgcccgtgc gcaggaggac gaggacggcg actacgagga gctggtgcta 420 gccttgcgtt ccgaggagga cggcctggcc gaagcacccg agcacggaac cacagccacc 480 ttccaccgct gcgccaagga tccgtggagg ttgcctggca cctacgtggt ggtgctgaag 540 gaggagaccc acctctcgca gtcagagcgc 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ggagccggga cgtcagcact 2280 acaggcagca ccagcgaagg ggccgtgaca gccgttgcca tctgctgccg gagccggcac 2340 ctggcgcagg cctcccagga gctccagtga cagccccatc ccaggatggg tgtctgggga 2400 gggtcaaggg ctggggctga gctttaaaat ggttccgact tgtccctctc tcagccctcc 2460 atggcctggc acgaggggat ggggatgctt ccgcctttcc ggggctgctg gcctggccct 2520 tgagtggggc agcctccttg cctggaactc actcactctg ggtgcctcct ccccaggtgg 2580 aggtgccagg aagctccctc cctcactgtg gggcatttca ccattcaaac aggtcgagct 2640 gtgctcgggt gctgccagct gctcccaatg tgccgatgtc cgtgggcaga atgactttta 2700 ttgagctctt gttccgtgcc aggcattcaa tcctcaggtc tccaccaagg aggcaggatt 2760 cttcccatgg ataggggagg gggcggtagg ggctgcaggg acaaacatcg ttggggggtg 2820 agtgtgaaag gtgctgatgg ccctcatctc cagctaactg tggagaagcc cctgggggct 2880 ccctgattaa tggaggctta gctttctgga tggcatctag ccagaggctg gagacaggtg 2940 cgcccctggt ggtcacaggc tgtgccttgg tttcctgagc cacctttact ctgctctatg 3000 ccaggctgtg ctagcaacac ccaaaggtgg cctgcgggga gccatcacct aggactgact 3060 cggcagtgtg cagtggtgca tgcactgtct cagccaaccc gctccactac ccggcagggt 3120 acacattcgc acccctactt cacagaggaa gaaacctgga accagagggg gcgtgcctgc 3180 caagctcaca cagcaggaac tgagccagaa acgcagattg ggctggctct gaagccaagc 3240 ctcttcttac ttcacccggc tgggctcctc atttttacgg gtaacagtga ggctgggaag 3300 gggaacacag accaggaagc tcggtgagtg atggcagaac gatgcctgca ggcatggaac 3360 tttttccgtt atcacccagg cctgattcac tggcctggcg gagatgcttc taaggcatgg 3420 tcgggggaga gggccaacaa ctgtccctcc ttgagcacca gccccaccca agcaagcaga 3480 catttatctt ttgggtctgt cctctctgtt gcctttttac agccaacttt tctagacctg 3540 ttttgctttt gtaacttgaa gatatttatt ctgggttttg tagcattttt attaatatgg 3600 tgacttttta aaataaaaac aaacaaacgt tgtcct 3636 <210> 49 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic anti-PCSK9 C-terminus epitope, residues 680-692 <400> 49 Arg Ser Arg His Leu Ala Gln Ala Ser Gln Glu Leu Gln 1 5 10 <210> 50 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic human germline JH4 partial sequence in anti-PCSK9 heavy chain J-segment <400> 50 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 51 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic full-length J-segment from human germline JH4 <400> 51 Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 15 <210> 52 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic human germline Jk2 partial sequence in anti-PCSK9 light chain J-segment <400> 52 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 53 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic full-length J-segment from human germline Jk2 <400> 53 Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 54 <211> 354 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <223> mouse anti-PCSK9 monoclonal antibody LFU270 heavy chain variable region <400> 54 gaggttcagc tgcagcagtc tggggcagag cttatgaagc caggggcctc agtcaagttg 60 tcctgcacag cttctggctt caacatcaaa gacatgtata tgagctgggt gaggcagagg 120 cctgaacagg gcctggagtg gattggaagg atcgatcctg cgaatggtca tactaactat 180 gacccgaagt tccaggccaa ggccactata acaacagaca catcctccaa aacagcctac 240 ctgcatctca gcagcctgac atctgaggac actgccgtct attactgtgc tagaagttac 300 tattactatg ctatggacta ctggggtcaa ggaacctcag tcaccgtctc ttca 354 <210> 55 <211> 318 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <223> mouse anti-PCSK9 monoclonal antibody LFU270 light chain variable region <400> 55 caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60 atgacctgca gtgccagctc aagtgtaagt tacatgcact ggtaccagca gaagccagga 120 tcctccccca gactctggat ttatttaaca ttcaacttgg cttctggagt ccctgctcgc 180 ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctctcaa tcagcagcat ggaggctgaa 240 gatgctgcca cttattactg tctacagtgg agtagtgacc cacccacgtt cggctcgggg 300 acaaagttgg aaataaaa 318 <210> 56 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic PCSK9 C-terminal mutant A685X <400> 56 Arg Ser Arg His Leu 1 5 <210> 57 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic C-terminal his6 tag, 6-His tag, HIS-tag <400> 57 His His His His His His 1 5 <210> 58 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic RT-PCR amplification primer V-H14 for heavy chain variable region <400> 58 cttcctgatg gcagtggtt 19 <210> 59 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic RT-PCR amplification primer HCconstant for heavy chain variable region <400> 59 gcgtctagaa yctccacaca caggrrccag tggatagac 39 <210> 60 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic RT-PCR amplification primer Vkappa4/5 for light chain variable region <400> 60 tcagcttcyt gctaatcagt g 21 <210> 61 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic RT-PCR amplification primer LCconstant for light chain variable region <400> 61 gcgtctagaa ctggatggtg ggaagatgg 29 <210> 62 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic C-terminal flexible linker and 6-His tag <400> 62 Ala Ala Gly Ala Ser His His His His His His 1 5 10 <210> 63 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic Avi tag for site-directed biotinylation <400> 63 Gly Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His 1 5 10 15 Glu <210> 64 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic CDRH1 of SR066 (humaneered) <400> 64 Thr Tyr Tyr Met Asn 1 5 <210> 65 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic CDRH1 of SR038 (mouse) <400> 65 Asp Met Tyr Met Ser 1 5 <210> 66 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic CDRH1 of SR079 (humaneered) <400> 66 Thr Met Tyr Met Ser 1 5 <210> 67 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic 7472 light chain (LC) N-terminus <400> 67 Glu Ile Val Met 1 <210> 68 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic 7472 light chain (LC) CDR1 <400> 68 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser His Val Ala 1 5 10 <210> 69 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic LFU720 and pJG10 light chain (LC) N-terminus <400> 69 Gln Ile Val Leu 1 <210> 70 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic LFU720 light chain (LC) complementarity determining region 1 (CDR1) <400> 70 Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His 1 5 10 <210> 71 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic pJG10 light chain (LC) complementarity determining region 1 (CDR1) <400> 71 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met His 1 5 10 <210> 72 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic 7472 and LFU720 heavy chain CDR3 (CDRH3) <400> 72 Cys Ala Arg Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 73 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic pJG04 heavy chain CDR3 (CDRH3) <400> 73 Cys Ala Arg Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Asn Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 74 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic anti-PCSK9 heavy chain CDR2 <400> 74 Arg Ile Asp Pro Ala Asn Glu His Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 75 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic anti-PCSK9 heavy chain CDR3 <221> VARIANT <222> (6)...(6) <223> Xaa = Ala or Asn <400> 75 Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Xaa Met Asp Tyr 1 5 <210> 76 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic anti-PCSK9 light chain FR1 <220> <221> VARIANT <222> (4)...(4) <223> Xaa = Met or Leu <400> 76 Glx Ile Val Xaa Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys 20 2

Claims (50)

  1. a) 저밀도 지단백질 수용체 (LDLR)에 결합하는 전구단백질 컨버타제 서브틸리신/켁신 유형 9 (PCSK9)를 차단하지 않고,
    b) LDLR의 PCSK9-매개 분해를 억제하는,
    PCSK9에 결합하는 항체.
  2. 제1항에 있어서, 인간 PCSK9의 잔기 위치 680-692 내의 적어도 1개의 아미노산에 결합하는 항체.
  3. 제1항에 있어서, 약 500 pM 이하의 평형 해리 상수 (KD)로 인간 PCSK9에 결합하는 항체.
  4. 제1항에 있어서, 적어도 7일의 생체내 반감기를 갖는 항체.
  5. 제1항에 있어서,
    (a) 인간 중쇄 V-절편, 중쇄 상보성 결정 영역 3 (CDR3) 및 중쇄 프레임워크 영역 4 (FR4)를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
    (b) 인간 경쇄 V-절편, 경쇄 CDR3 및 경쇄 FR4를 포함하는 경쇄 가변 영역
    을 포함하고, 여기서
    i) 중쇄 CDR3은 아미노산 서열 SYYYY(A/N)MD(A/F/S/V/Y) (서열 14)를 포함하고;
    ii) 경쇄 CDR3 가변 영역은 아미노산 서열 LQWSSDPPT (서열 26)를 포함하는 것인
    항체.
  6. 제5항에 있어서, 중쇄 V-절편이 서열 28에 대해 적어도 85％의 서열 동일성을 갖고, 경쇄 V-절편이 서열 31에 대해 적어도 85％의 서열 동일성을 갖는 것인 항체.
  7. 제5항에 있어서, 중쇄 V-절편이 서열 27에 대해 적어도 85％의 서열 동일성을 갖고, 경쇄 V-절편이 서열 29 및 서열 30으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 대해 적어도 85％의 서열 동일성을 갖는 것인 항체.
  8. 제5항에 있어서,
    i) 중쇄 CDR3이 서열 12 및 서열 13으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고;
    ii) 경쇄 CDR3이 서열 26의 아미노산 서열을 포함하는 것인
    항체.
  9. 제5항에 있어서, 중쇄 FR4가 인간 배선(germline) FR4인 항체.
  10. 제9항에 있어서, 중쇄 FR4가 서열 35인 항체.
  11. 제5항에 있어서, 경쇄 FR4가 인간 배선 FR4인 항체.
  12. 제11항에 있어서, 경쇄 FR4가 서열 39인 항체.
  13. 제5항에 있어서, 중쇄 V-절편 및 경쇄 V-절편이 각각 상보성 결정 영역 1 (CDR1) 및 상보성 결정 영역 2 (CDR2)를 포함하고; 여기서
    i) 중쇄 V-절편의 CDR1은 서열 8의 아미노산 서열을 포함하고;
    ii) 중쇄 V-절편의 CDR2는 서열 11의 아미노산 서열을 포함하고;
    iii) 경쇄 V-절편의 CDR1은 서열 22의 아미노산 서열을 포함하고;
    iv) 경쇄 V-절편의 CDR2는 서열 25의 아미노산 서열을 포함하는 것인
    항체.
  14. 제13항에 있어서,
    i) 중쇄 V-절편의 CDR1이 서열 7을 포함하고;
    ii) 중쇄 V-절편의 CDR2가 서열 10을 포함하고;
    iii) 중쇄 CDR3이 서열 12 및 서열 13으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고;
    iv) 경쇄 V-절편의 CDR1이 서열 21을 포함하고;
    v) 경쇄 V-절편의 CDR2가 서열 24를 포함하고;
    vi) 경쇄 CDR3이 서열 26을 포함하는 것인
    항체.
  15. 제5항에 있어서, 중쇄 가변 영역이 서열 40의 가변 영역에 대해 적어도 90％의 아미노산 서열 동일성을 갖고, 경쇄 가변 영역이 서열 41의 가변 영역에 대해 적어도 90％의 아미노산 서열 동일성을 갖는 것인 항체.
  16. 제5항에 있어서, 중쇄 가변 영역이 서열 40의 가변 영역에 대해 적어도 95％의 아미노산 서열 동일성을 갖고, 경쇄 가변 영역이 서열 41의 가변 영역에 대해 적어도 95％의 아미노산 서열 동일성을 갖는 것인 항체.
  17. 제5항에 있어서, 서열 40을 포함하는 중쇄 및 서열 41을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체.
  18. 제5항에 있어서, 중쇄 가변 영역이 서열 2 및 서열 4로 이루어진 군으로부터 선택된 가변 영역에 대해 적어도 90％의 아미노산 서열 동일성을 갖고, 경쇄 가변 영역이 서열 16 및 서열 18로 이루어진 군으로부터 선택된 가변 영역에 대해 적어도 90％의 아미노산 서열 동일성을 갖는 것인 항체.
  19. 제5항에 있어서, 중쇄 가변 영역이 서열 2 및 서열 4로 이루어진 군으로부터 선택된 가변 영역에 대해 적어도 95％의 아미노산 서열 동일성을 갖고, 경쇄 가변 영역이 서열 16 및 서열 18로 이루어진 군으로부터 선택된 가변 영역에 대해 적어도 95％의 아미노산 서열 동일성을 갖는 것인 항체.
  20. 제5항에 있어서, 중쇄 가변 영역이 서열 2 및 서열 4로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역이 서열 16 및 서열 18로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체.
  21. 제1항에 있어서, FAb' 단편인 항체.
  22. 제1항에 있어서, IgG인 항체.
  23. 제1항에 있어서, 단일 쇄 항체 (scFv)인 항체.
  24. 제1항에 있어서, 인간 불변 영역을 포함하는 항체.
  25. 제1항에 있어서, 운반 단백질에 연결된 항체.
  26. 제1항에 있어서, PEG화된 항체.
  27. 각각 하기 3개의 상보성 결정 영역 (CDR): CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고; 여기서
    i) 중쇄 가변 영역의 CDR1은 서열 8의 아미노산 서열을 포함하고;
    ii) 중쇄 가변 영역의 CDR2는 서열 11의 아미노산 서열을 포함하고;
    iii) 중쇄 가변 영역의 CDR3은 서열 14의 아미노산 서열을 포함하고;
    iv) 경쇄 가변 영역의 CDR1은 서열 22의 아미노산 서열을 포함하고;
    v) 경쇄 가변 영역의 CDR2는 서열 25의 아미노산 서열을 포함하고;
    vi) 경쇄 가변 영역의 CDR3은 서열 26의 아미노산 서열을 포함하는 것인,
    PCSK9에 특이적으로 결합하는 항체.
  28. 제27항에 있어서,
    i) 중쇄 가변 영역의 CDR1이 서열 6 및 서열 7로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고;
    ii) 중쇄 가변 영역의 CDR2가 서열 9 및 서열 10으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고;
    iii) 중쇄 가변 영역의 CDR3이 서열 12 및 서열 13으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고;
    iv) 경쇄 가변 영역의 CDR1이 서열 20 및 서열 21로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고;
    v) 경쇄 가변 영역의 CDR2가 서열 23 및 서열 24로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고;
    vi) 경쇄 가변 영역의 CDR3이 서열 26의 아미노산 서열을 포함하는 것인
    항체.
  29. 제1항의 항체 및 생리학상 상용성인 부형제를 포함하는 조성물.
  30. 제29항에 있어서, 개체에서 저밀도 지단백질 콜레스테롤 (LDL-C) 수준을 감소시키는 제2 작용제를 추가로 포함하는 조성물.
  31. 제30항에 있어서, 제2 작용제가 스타틴인 조성물.
  32. 제31항에 있어서, 스타틴이 아토르바스타틴, 세리바스타틴, 플루바스타틴, 로바스타틴, 메바스타틴, 피타바스타틴, 프라바스타틴, 로수바스타틴 및 심바스타틴으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  33. 제30항에 있어서, 제2 작용제가 피브레이트, 니아신 및 그의 유사체, 콜레스테롤 흡수 억제제, 담즙산 격리제, 갑상선 호르몬 모방체, 마이크로솜 트리글리세리드 전달 단백질 (MTP) 억제제, 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 (DGAT) 억제제, PCSK9를 표적으로 하는 억제 핵산 및 apoB100을 표적으로 하는 억제 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  34. LDL-C의 감소를 필요로 하는 개체에게 치료 유효량의 제1항의 항체를 투여함으로써 상기 개체에서 LDL-C를 감소시키는 것을 포함하는, 상기 개체에서 LDL-C를 감소시키는 방법.
  35. 제34항에 있어서, 개체가 스타틴 요법에 저반응성이거나 저항성인 방법.
  36. 제34항에 있어서, 개체가 스타틴 요법에 불내성인 방법.
  37. 제34항에 있어서, 개체가 적어도 약 100 mg/dL의 기준선 LDL-C 수준을 갖는 것인 방법.
  38. 제34항에 있어서, 개체가 가족성 고콜레스테롤혈증을 갖는 것인 방법.
  39. 제34항에 있어서, 총 콜레스테롤을 LDL-C와 함께 감소시키는 방법.
  40. 제34항에 있어서, 개체가 트리글리세리드혈증을 갖는 것인 방법.
  41. 제34항에 있어서, 개체가 기능-획득 PCSK9 유전자 돌연변이를 갖는 것인 방법.
  42. 제34항에 있어서, 개체가 약물-유발 이상지혈증을 갖는 것인 방법.
  43. 제34항에 있어서, 개체에게 LDL-C를 감소시키는 데 효과적인 제2 작용제의 치료 유효량을 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  44. 제43항에 있어서, 제2 작용제가 스타틴인 방법.
  45. 제44항에 있어서, 스타틴이 아토르바스타틴, 세리바스타틴, 플루바스타틴, 로바스타틴, 메바스타틴, 피타바스타틴, 프라바스타틴, 로수바스타틴 및 심바스타틴으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  46. 제43항에 있어서, 제2 작용제가 피브레이트, 니아신 및 그의 유사체, 콜레스테롤 흡수 억제제, 담즙산 격리제, 갑상선 호르몬 모방체, 마이크로솜 트리글리세리드 전달 단백질 (MTP) 억제제, 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 (DGAT) 억제제, PCSK9를 표적으로 하는 억제 핵산 및 apoB100을 표적으로 하는 억제 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  47. 제43항에 있어서, 항체 및 제2 작용제를 혼합물로서 공동-투여하는 방법.
  48. 제43항에 있어서, 항체 및 제2 작용제를 개별적으로 공동-투여하는 방법.
  49. 제34항에 있어서, 항체를 정맥내로 투여하는 방법.
  50. 제34항에 있어서, 항체를 피하로 투여하는 방법.
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