EA032084B1 - Антагонисты pcsk9 - Google Patents

Антагонисты pcsk9 Download PDF

Info

Publication number
EA032084B1
EA032084B1 EA201200861A EA201200861A EA032084B1 EA 032084 B1 EA032084 B1 EA 032084B1 EA 201200861 A EA201200861 A EA 201200861A EA 201200861 A EA201200861 A EA 201200861A EA 032084 B1 EA032084 B1 EA 032084B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
antibody
amino acid
variable region
acid sequence
heavy chain
Prior art date
Application number
EA201200861A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201200861A1 (ru
Inventor
Сара Рю
Стивен Б. Коэн
Цзунь Ли
Дейвид Юве
Original Assignee
Новартис Аг
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=43466865&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA032084(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Новартис Аг filed Critical Новартис Аг
Publication of EA201200861A1 publication Critical patent/EA201200861A1/ru
Publication of EA032084B1 publication Critical patent/EA032084B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Изобретение относится к антителу, которое связывается с пропротеин-конвертазой субтилизин/кексин типа 9 (PCSK9), композиции для снижения холестерина липопротеинов низкой плотности (ЛПНП-Х), содержащей указанное антитело, и способу снижения уровня ЛПНП-Х у индивидуума.

Description

Изобретение относится к антителу, которое связывается с иропротеин-конвертазой субтилизин/ кексин типа 9 (РС8К9), композиции для снижения холестерина липопротеинов низкой плотности (ЛПНП-Х), содержащей указанное антитело, и способу снижения уровня ЛПНП-Х у индивидуума.
Перекрестная ссылка на родственные заявки
Настоящая заявка притязает на приоритет предварительной заявки на патент США 61/285942, зарегистрированной 11 декабря 2009 г., которая включена в настоящее описание в качестве ссылки для всех целей.
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к антителам, являющимся антагонистами РС8К9.
Предпосылки создания изобретения
Рецептор липопротеина низкой плотности (ЛПНПР) предупреждает развитие атеросклероза и гиперхолестеринемии посредством клиренса липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) из кровотока. ЛПНПР регулируется на посттрансляционном уровне пропротеин-конвертазой субтилизин/кексин типа 9а (РС8К9). В последние годы опубликованы данные касательно выключения РС8К9 у мышей. Установлено, что у таких мышей уровни холестерина в плазме снижены примерно на 50% и они обладают повышенной чувствительностью к статинам, снижающим уровень холестерина в плазме (КакЫб 8. и др., Ргос №1П Асаб 8с1 102, 2005, сс. 5374-5379). Генетические данные, полученные для человека, также подтверждают роль РС8К9 в гомеостазе ЛПНП. В последние годы были идентифицированы две мутации, которые возможно являются мутациями, приводящими к потере функции (1окк-о£-1ипс1юп) гена РС8К9. У индивидуумов с такими мутациями уровни холестерина липопротеинов низкой плотности (ЛПНП-Х) в плазме снижены примерно на 40%, что обусловливает снижение примерно на 50-90% риска заболевания ишемической болезни сердца. В целом результаты указанных исследований свидетельствуют о том, что ингибитор РС8К9 может оказывать благоприятное действие в отношении снижения концентраций ЛПНП-Х в плазме, а также в отношении других болезненных состояний, опосредуемых РС8К9, и для повышения эффективности его можно вводить совместно, например, со вторым средством, применяемым для снижения уровня холестерина.
Краткое описание сущности изобретения
В настоящем изобретении предложены антитела, которые обладают способностью связываться с пропротеин-конвертазой субтилизин/кексин типа 9 (РС8К9) (например, имеющей последовательность, которая представлена в 8Е0 ГО N0: 47) и оказывают антагонистическое действие на ее функцию, и способы применения таких антител, например, для лечения болезненных состояний, опосредуемых РС8К9.
Один из объектов изобретения относится к антителу, которое связывается с пропротеинконвертазой субтилизин/кексин типа 9 (РС8К9), где антитело содержит:
I) гипервариабельный участок 1 (СЭР1) тяжелой цепи содержит 8Е0 ГО N0: 7;
II) гипервариабельный участок 2 (СОРТ) тяжелой цепи содержит 8Е0 ГО N0: 10;
III) гипервариабельный участок 3 (СЭК3) тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей 8Е0 ГО N0: 12 и 8Е0 ГО N0: 13;
IV) СЭР1 легкой цепи содержит 8Е0 ГО N0: 21;
V) СЭК2 легкой цепи содержит 8Е0 ГО N0: 24 и
VI) ί.ΌΡ3 легкой цепи содержит 8Е0 ГО N0: 26.
В одном из вариантов осуществления изобретения в антителе по изобретению аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи идентична по меньшей мере на 90% или по меньшей мере на 95% аминокислотной последовательности вариабельной области, представленной в 8Е0 ГО N0: 40, и аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи идентична по меньшей мере на 90% аминокислотной последовательности вариабельной области, представленной в 8Е0 ГО N0: 41, в более предпочтительном варианте антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит 8Е0 ГО N0: 40, и вариабельную область легкой цепи, которая содержит 8Е0 ГО N0: 41.
В другом варианте осуществления изобретения в антителе по изобретению аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи идентична по меньшей мере на 90% или по меньшей мере на 95% аминокислотной последовательности вариабельной области, выбранной из группы, включающей 8Е0 ГО N0: 2 и 8Е0 ГО N0: 4, и аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи идентична по меньшей мере на 90% аминокислотной последовательности вариабельной области, выбранной из группы, включающей 8Е0 ГО N0: 16 и 8Е0 ГО N0: 18, в более предпочтительном варианте вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей 8Е0 ГО N0: 2 и 8Е0 ГО N0: 4, и вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей 8Е0 ГО N0: 16 и 8Е0 ГО N0: 18.
В одном из вариантов осуществления антитело по изобретению представляет собой ^С.
В еще одном из вариантов осуществления изобретения антитело по изобретению представляет собой одноцепочечное антитело (ксЕу).
В следующем варианте осуществления изобретения антитело содержит человеческие константные области.
Следующий объект изобретения относится к ЕаЬ'-фрагменту антитела по изобретению.
Один из объектов изобретения относится к антителу, которое специфически связывается с РС8К9, где антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где
- 1 032084 вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи, каждая, содержат три следующих гипервариабельных участка (СБК): СБК1, С1Ж2 и С1Ж3, где:
I) СБК1 вариабельной области тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей 8Ер ГО N0: 6 и 8Ер ГО N0: 7;
II) С1Ж2 вариабельной области тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей 8Ер ГО N0: 9 и 8Ер ГО N0: 10;
III) С1Ж3 вариабельной области тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей 8Ер ГО N0: 12 и 8Ер ГО N0: 13;
IV) СОК1 вариабельной области легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей 8Ер ГО N0: 20 и 8Ер ГО N0: 21;
V) С1Ж2 вариабельной области легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей 8Ер ГО N0: 23 и 8Ер ГО N0: 24;
VI) С1Ж3 вариабельной области легкой цепи содержит аминокислотную последовательность 8Ер ГО N0: 26.
Один из объектов изобретения относится к антителам и антигенсвязывающим молекулам, которые обладают способностью связываться с пропротеин-конвертазой субтилизин/кексин типа 9 (РС8К9). В одном из вариантов осуществления изобретения антитело:
а) не блокирует связывание РС8К9 с рецептором липопротеинов низкой плотности (ЛПНПР) и
б) ингибирует опосредуемое РС8К9 расщепление ЛПНПР.
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или антигенсвязывающая молекула связывается по меньшей мере с одним остатком аминокислоты, который находится в одном из положений 680-692 человеческой РС8К9. Например, в некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или антигенсвязывающая молекула связывается с эпитопом РС8К9, присутствующим в аминокислотной последовательности К8КНЬАрА8рЕЕр (£Е<3 Ιϋ N0: 49).
В некоторых вариантах осуществления изобретения связывание антитела или антигенсвязывающей молекулы с человеческой РС8К9 характеризуется константой равновесия реакции диссоциации (КО), составляющей примерно 500 пМ или менее. Например, в некоторых вариантах осуществления изобретения связывание антитела или антигенсвязывающей молекулы с человеческой РС8К9 характеризуется константой равновесия реакции диссоциации (КО), составляющей примерно 400, 300, 250, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140 пМ или менее.
В некоторых вариантах осуществления изобретения время полужизни антитела или антигенсвязывающей молекулы ΐπ νΐνο составляет по меньшей мере примерно 7 дней. В некоторых вариантах осуществления изобретения время полужизни антитела или антигенсвязывающей молекулы ΐπ νΐνο составляет по меньшей мере примерно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 дней. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или антигенсвязывающая молекула обладает ΐπ νΐνο понижающим уровень холестерина действием, которое продолжается по меньшей мере в течение примерно 2 недель, например в течение 2, 3, 4 недель или более. Предпочтительно время полужизни ΐπ νΐνο определяют в организме человека.
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело содержит:
(а) вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит ν-сегмент человеческой тяжелой цепи, гипервариабельный участок 3 тяжелой цепи (СОК3) и каркасный участок 4 тяжелой цепи (ЕК4), и (б) вариабельную область легкой цепи, которая содержит ν-сегмент человеческой легкой цепи, С1Ж3 легкой цепи и ЕК4 легкой цепи, где:
I) С1Ж3 тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность
8ΥΥΥΥ(Α/Ν)ΜΟ(Α/Ε/8/ν/Υ) (8Е(^ ГО N0: 14); и
II) С1Ж3 вариабельной области легкой цепи содержит аминокислотную последовательность Ер\¥88ОРРТ (8Е(} ГО N0: 26).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело содержит:
(а) вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит ν-сегмент человеческой тяжелой цепи, гипервариабельный участок 3 тяжелой цепи (СОК3) и каркасный участок 4 тяжелой цепи (ЕК4), и (б) вариабельную область легкой цепи, которая содержит ν-сегмент человеческой легкой цепи, С1Ж3 легкой цепи и ЕК4 легкой цепи, где:
I) ΟΌΚ3 тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность 8υυυυνμου (8Е(} го N0: 12); и
II) С1Ж3 вариабельной области легкой цепи содержит аминокислотную последовательность ЦС>\У88ОРРТ (8ЕС> ГО N0: 26).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело содержит:
(а) вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит ν-сегмент человеческой тяжелой цепи, гипервариабельный участок 3 тяжелой цепи (СОК3) и каркасный участок 4 тяжелой цепи (ЕК4), и (б) вариабельную область легкой цепи, которая содержит ν-сегмент человеческой легкой цепи, С1Ж3 легкой цепи и ЕК4 легкой цепи, где:
I) ΟΌΚ3 тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность §υυυυαμου (8Ер го N0: 13); и
II) С1Ж3 вариабельной области легкой цепи содержит аминокислотную последовательность Е()\У88ОРРТ (8Е<2> ГО N0: 26).
- 2 032084
В некоторых вариантах осуществления изобретения ΟΌΚ3 тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей 8ЕО ΙΌ N0: 12 и 8Е0 ΙΌ N0: 13; и СЭВ3 легкой цепи содержит аминокислотную последовательность 8Е0 Ю N0: 26.
В некоторых вариантах осуществления изобретения последовательность У-сегмента тяжелой цепи идентична по меньшей мере на 85, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% последовательности, представленной в 8Е0 Ю N0: 28, и последовательность У-сегмента легкой цепи идентична по меньшей мере на 85, 88, 89, 90 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% последовательности, представленной в 8Е0 ΙΌ N0: 31.
В некоторых вариантах осуществления изобретения последовательность У-сегмента тяжелой цепи идентична по меньшей мере на 85, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% последовательности, представленной в 8Е0 Ю N0: 27, и последовательность У-сегмента легкой цепи идентична по меньшей мере на 85, 88, 89, 90 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% последовательности, выбранной из группы, включающей 8Е0 ΙΌ N0: 29 и 8Е0 ΙΌ N0: 30.
В некоторых вариантах осуществления изобретения ЕВ4 тяжелой цепи представляет собой ЕК4 человеческой зародышевой линии. В некоторых вариантах осуществления изобретения ЕВ4 тяжелой цепи имеет последовательность, представленную в 8Е0 ΙΌ N0: 35.
В некоторых вариантах осуществления изобретения ЕВ4 легкой цепи представляет собой ЕВ4 человеческой зародышевой линии. В некоторых вариантах осуществления изобретения ЕК4 легкой цепи имеет последовательность, представленную в 8Е0 Ю N0: 39.
В некоторых вариантах осуществления изобретения У-сегмент тяжелой цепи и У-сегмент легкой цепи каждый содержит гипервариабельный участок 1 (0ΌΚ1) и гипервариабельный участок 2 (СЭВ2); где:
I) СЭВ1 У-сегмента тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность 8Е0 Ю N0: 8;
II) ί.ΌΒ2 У-сегмента тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 11;
III) СЭВ1 У-сегмента легкой цепи содержит аминокислотную последовательность 8Е0 Ю N0: 22; и
ГУ) СЭВ2 У-сегмента легкой цепи содержит аминокислотную последовательность 8Е0 Ю N0: 25.
В некоторых вариантах осуществления изобретения У-сегмент тяжелой цепи и У-сегмент легкой цепи каждый содержит гипервариабельный участок 1 (СЭВ1) и гипервариабельный участок 2 (ί.ΌΒ2); где:
I) СЭВ1 У-сегмента тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность 8Е0 Ю N0: 7;
II) ί.ΌΒ2 У-сегмента тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 10;
III) СЭВ1 У-сегмента легкой цепи содержит аминокислотную последовательность 8Е0 Ю N0: 21; и
ЕУ) СЭВ2 У-сегмента легкой цепи содержит аминокислотную последовательность 8Е0 Ю N0: 24.
В некоторых вариантах осуществления изобретения:
I) СЭВ1 У-сегмента тяжелой цепи содержит 8Е0 ΙΌ N0: 7;
II) ί.ΌΒ2 У-сегмента тяжелой цепи содержит 8Е0 ΙΌ N0: 10;
III) ί.ΌΒ3 тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей 8Е0 ΙΌ N0: 12 и 8Е0 ΙΌ N0: 13;
ТУ) СЭВ1 У-сегмента легкой цепи содержит 8Е0 ΙΌ N0: 21;
У) СЭВ2 У-сегмента легкой цепи содержит 8Е0 ΙΌ N0: 24; и
У!) СЭВ3 легкой цепи содержит 8Е0 ΙΌ N0: 26.
В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи идентична по меньшей мере на 85, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% аминокислотной последовательности вариабельной области, представленной в 8Е0 ΙΌ N0: 40, аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи идентична по меньшей мере на 90% аминокислотной последовательности вариабельной области, представленной в 8Е0 Ю N0: 41.
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело содержит тяжелую цепь, которая содержит 8Е0 ΙΌ N0: 40, и легкую цепь, которая содержит 8Е0 ΙΌ N0: 41.
В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи идентична по меньшей мере на 85, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% аминокислотной последовательности вариабельной области, выбранной из группы, включающей 8Е0 Ю N0: 2 и 8Е0 Ю N0: 4, и аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи идентична по меньшей мере на 85, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% аминокислотной последовательности вариабельной области, выбранной из группы, включающей 8Е0 Ю N0: 16 и 8Е0 Ю N0: 18.
В некоторых вариантах осуществления изобретения вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей 8Е0 Ю N0: 2 и 8Е0 Ю N0: 4, и вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей 8Е0 ΙΌ N0: 16 и 8Е0 ΙΌ N0: 18.
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело представляет собой Ι§0. В некоторых
- 3 032084 вариантах осуществления изобретения антитело представляет собой 1дС1. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело имеет тяжелую цепь, аминокислотная последовательность которой идентична по меньшей мере на 85, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% аминокислотной последовательности, выбранной из группы, включающей 8ЕО ΙΌ N0: 3 и 8Е0 ΙΌ N0: 5. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело имеет легкую цепь, аминокислотная последовательность которой идентична по меньшей мере на 85, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% аминокислотной последовательности, выбранной из группы, включающей 8Е0 ΙΌ N0: 17 и 8Е0 ΙΌ N0: 19.
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело представляет собой ЕаЬ'-фрагмент. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело представляет собой одноцепочечное антитело (ксЕу). В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело содержит человеческие константные области. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело содержит константную область человеческого 1дС1. В некоторых вариантах осуществления изобретения константная область человеческого 1дС1 подвергнута мутации с целью снижения аффинности связывания эффекторного лиганда, такого как Ес-рецептор (ЕсК). например Ес-гамма-К1, на клетке или С1-компонент системы комплемента (см., например, И8 5624821). В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотные остатки Ь234 и Ь235 константной области 1дС1 заменены на А1а234 и А1а235. Нумерация остатков в константной области тяжелой цепи соответствует нумерации ЕЙ (см. КаЬа! и др., 8сс.|испсс5 оГ Рго1сш5 оГ 1ттипо1ощса1 1п1сгс51. изд-во И.8. Эер1. НсаИН апб Нитап Зегуюек, 1983).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело связано с белком-носителем, например альбумином.
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело является ПЭГилированным.
Родственным объектом изобретения являются антитела, которые специфически связываются с РС8К9, где антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, при этом вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи, каждая, содержат три следующих гипервариабельных участка (СЭК): СЭКЕ СЭК2 и СЭК3; где:
I) ί.ΌΡ1 вариабельной области тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 8;
II) ί.ΌΡ2 вариабельной области тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 11;
ΙΙΙ) СЭК3 вариабельной области тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 14;
ГУ) СЭК 1 вариабельной области легкой цепи содержит аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 22;
У) СЭР2 вариабельной области легкой цепи содержит аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 25;
У!) СЭК3 вариабельной области легкой цепи содержит аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 26.
В некоторых вариантах осуществления изобретения:
Ι) ί.ΌΡ1 вариабельной области тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей 8Е0 ΙΌ N0: 6 и 8Е0 ΙΌ N0: 7;
ΙΙ) ί.ΌΡ2 вариабельной области тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей 8Е0 ΙΌ N0: 9 и 8Е0 ΙΌ N0: 10;
ΙΙΙ) ί.ΌΡ3 вариабельной области тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей 8Е0 ΙΌ N0: 12 и 8Е0 ΙΌ N0: 13;
РУ) СЭР 1 вариабельной области легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей 8Е0 ΙΌ N0: 20 и 8Е0 ΙΌ N0: 21;
У) СЭК2 вариабельной области легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей 8Е0 ΙΌ N0: 23 и 8Е0 ΙΌ N0: 24;
УТ) СЭК3 вариабельной области легкой цепи содержит аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 26.
Родственным объектом изобретения являются антитела, которые специфически связываются с РС8К9, где антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, при этом вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи, каждая, содержат три следующих гипервариабельных участка (СОК): СЭРЕ СЭК2 и СЭК3; где:
Ι) ί.ΌΡ1 вариабельной области тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 6;
ΙΙ) ί.ΌΡ2 вариабельной области тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 9;
ΙΙΙ) ί.ΌΡ3 вариабельной области тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 13;
ЕУ) СЭК 1 вариабельной области легкой цепи содержит аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 20;
- 4 032084
V) СОК2 вариабельной области легкой цепи содержит аминокислотную последовательность 8Еф ГО N0: 23;
VI) СИКЗ вариабельной области легкой цепи содержит аминокислотную последовательность 8Еф ГО N0: 26.
Родственным объектом изобретения являются антитела, которые специфически связываются с РС8К9, где антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, при этом вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи, каждая, содержат три следующих гипервариабельных участка (СЭК): СИК1, СЭК2 и СИКЗ; где:
I) СИК1 вариабельной области тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность 8Еф ГО N0: 7;
II) СИК2 вариабельной области тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность 8Еф ГО N0: 10;
III) СИКЗ вариабельной области тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность 8Еф ГО N0: 12;
IV) СИК1 вариабельной области легкой цепи содержит аминокислотную последовательность 8Еф ГО N0: 21;
V) СИК2 вариабельной области легкой цепи содержит аминокислотную последовательность 8Еф ГО N0: 24;
VI) СИКЗ вариабельной области легкой цепи содержит аминокислотную последовательность 8Еф ГО N0: 26.
Родственным объектом изобретения являются антитела, которые специфически связываются с РС8К9, где антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, при этом вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи, каждая, содержат три следующих гипервариабельных участка (СЭК): СИК1, СЭК2 и СИКЗ; где:
I) СИК1 вариабельной области тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность 8Еф ГО N0: 7;
II) СИК2 вариабельной области тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность 8Еф ГО N0: 10;
III) СЭКЗ вариабельной области тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность 8Еф ГО N0: 1З;
IV) СЭК 1 вариабельной области легкой цепи содержит аминокислотную последовательность 8Еф ГО N0: 21;
V) СЭК2 вариабельной области легкой цепи содержит аминокислотную последовательность 8Еф ГО N0: 24;
VI) СЭКЗ вариабельной области легкой цепи содержит аминокислотную последовательность 8Еф ГО N0: 26.
Следующим объектом изобретения являются композиция для снижения холестерина липопротеинов низкой плотности (ЛПНП-Х) у индивидуума, нуждающегося в этом, содержащая антитело по изобретению и физиологически совместимый эксципиент.
В некоторых вариантах осуществления изобретения композиция дополнительно содержит второй агент, который снижает уровни холестерина липопротеинов низкой плотности (ЛПНП-Х) у индивидуума.
В некоторых вариантах осуществления изобретения второй агент представляет собой статин. Статин может быть выбран, например, из группы, включающей аторвастатин, церивастатин, флувастатин, ловастатин, мевастатин, питавастатин, правастатин, розувастатин и симвастатин.
В некоторых вариантах осуществления изобретения второй агент выбран из группы, включающей фибраты, ниацин и его аналоги, ингибиторы абсорбции холестерина, секвестранты желчных кислот, миметики тиреоидного гормона, ингибитор микросомального белка-переносчика триглицеридов (МТР), ингибитор диацилглицеролацилтрансферазы (ΌΟΆΤ), нуклеиновую кислоту-ингибитор, мишенью которой является РС8К9, и нуклеиновую кислоту-ингибитор, мишенью которой является ароВ100.
Следующий объект изобретения относится к способам снижения уровня ЛПНП-Х и/или общего холестерина у индивидуума, который нуждается в этом, заключающийся в том, что индивидууму вводят в терапевтически эффективном количестве представленное/представленную в настоящем описании антитело или антигенсвязывающую молекулу.
В некоторых вариантах осуществления изобретения индивидуум обладает пониженной чувствительностью или устойчивостью к терапии на основе статинов. В некоторых вариантах осуществления изобретения индивидуум обладает интолерантностью к терапии на основе статинов. В некоторых вариантах осуществления изобретения исходный уровень ЛПНП-Х у индивидуума составляет по меньшей мере примерно 100 мг/дл, например по меньшей мере примерно 110, 120, 1З0, 140, 150, 160, 170, 180, 190 мг/дл или выше. В некоторых вариантах осуществления изобретения индивидуум страдает семейной гиперхолестеринемией. В некоторых вариантах осуществления изобретения индивидуум страдает триглицеридемией. В некоторых вариантах осуществления изобретения индивидуум несет мутацию, приво
- 5 032084 дящую к усилению функции по доминантно-негативному типу (даш-оГ-Гипебоп) гена РС8К9. В некоторых вариантах осуществления изобретения индивидуум страдает индуцированной лекарственными средствами дислипидемией.
В некоторых вариантах осуществления изобретения при снижении уровня ЛПНП-Х происходит снижение уровня общего холестерина.
В некоторых вариантах осуществления изобретения способы дополнительно заключаются в том, что индивидууму вводят в терапевтически эффективном количестве второй агент, обладающий эффективностью в отношении снижения уровня ЛПНП-Х.
В некоторых вариантах осуществления изобретения второй агент представляет собой статин. Статин можно выбирать, например, из группы, включающей аторвастатин, церивастатин, флувастатин, ловастатин, мевастатин, питавастатин, правастатин, розувастатин и симвастатин.
В некоторых вариантах осуществления изобретения второй агент выбирают из группы, включающей фибраты, ниацин и его аналоги, ингибиторы абсорбции холестерина, секвестранты желчных кислот, миметики тиреоидного гормона, ингибитор микросомального белка-переносчика триглицеридов (МТР), ингибитор диацилглицеролацилтрансферазы (ЭСАТ). нуклеиновую кислоту-ингибитор, мишенью которой является РС8К9, и нуклеиновую кислоту-ингибитор, мишенью которой является ароВ100.
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или антигенсвязывающую молекулу и второй агент применяют совместно в виде смеси.
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или антигенсвязывающую молекулу и второй агент применяют совместно, но вводят раздельно.
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело вводят внутривенно. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело вводят подкожно.
Определения.
Понятие антитело относится к полипептиду из семейства иммуноглобулинов или полипептиду, который содержит фрагменты иммуноглобулина, который обладает способностью нековалентно, обратимо и специфически связывать соответствующий антиген. Примером структурной единицы антитела является тетрамер. Каждый тетрамер состоит из двух идентичных пар полипептидных цепей, каждая пара имеет одну легкую (имеющую молекулярную массу примерно 25 кДа) и одну тяжелую цепь (имеющую молекулярную массу примерно 50-70 кДа), которые связаны дисульфидным мостиком. Известные гены иммуноглобулинов включают гены константных областей к, λ, α, γ, δ, ε и μ, а также множество генов вариабельных областей иммуноглобулинов. Легкие цепи классифицируют либо как к, либо как λ. Тяжелые цепи классифицируют как γ, μ, α, δ или ε, что, в свою очередь, определяет классы иммуноглобулинов 1дС, 1дМ, 1дА, 1дО и 1дЕ соответственно. Ν-конец каждой цепи включает вариабельную область, состоящую примерно из 100-110 или большего количества аминокислот, которая прежде всего ответственна за распознавание антигена. Понятия вариабельная область легкой цепи (Уь) и вариабельная область тяжелой цепи (Ун) относятся к указанным областям легких и тяжелых цепей соответственно. В контексте настоящего описания под понятие антитело подпадают все варианты антитела или его фрагментов, которые обладают определенной специфичностью к связыванию, например, с РС8К9. Таким образом, под указанное понятие подпадают полноразмерные антитела, химерные антитела, гуманизированные антитела, одноцепочечные антитела (кеРу), РаЬ-, РаЬ'-фрагменты и мультимерные версии указанных фрагментов (например, Р(аЬ')2), которые обладают такой же специфичностью к связыванию.
Понятия определяющие комплементарность домены или гипервариабельные участки (СИК) используются взаимозаменяемо и относятся к гипервариабельным участкам Уъ и Ун. СИК представляют собой сайт цепей антитела, связывающий белок-мишень, который определяет специфичность в отношении белка-мишени. Существует три СИК (СИК1-3, нумерация, начинается с Ν-конца) в каждой человеческой Уъ или Ун, в вариабельных областях на их долю приходится примерно 15-20%. СИК структурно комплементарны эпитопу белка-мишени и поэтому непосредственно ответственны за специфичность связывания. Оставшиеся участки в Уъ- или Ун-областях, так называемые каркасные участки, характеризуются меньшей вариацией аминокислотной последовательности (КиЬу, 1ттипо1оду, 4-е изд., глава 4, изд-во \У.н. Ргеетап & Со., Νονν Уогк, 2000).
Положения СИК и каркасных участков определяют с помощью различных хорошо известных в данной области обозначений, например, согласно Кэботу (КаЬаЦ, Скобиа, международной базе данных 1тМипоСепеТ1ек (1МСТ) (сайт во всемирной сети ппдкетек.Гг.) и АЬМ (см., например, .Тойпкоп и др., ΝιιοΚίο Ае1бк Кек., 29, 2001, ее. 205-206; Сйо1Ыа и Ьекк, I. Мо1. Вю1., 196, 1987, ее. 901-917; Сйо1Ыа и др., ШАие, 342, 1989, ее. 877-883; Сйо1Ыа и др., I. Мо1. Вю1., 227, 1992, ее. 799-817; А1-ЕахП<аш и др., I. Мо1. Вю1., 273, 1997, ее. 927-948). Определение антигенсвязывающих центров описано также в следующих публикациях: Ριιίζ и др., №1е1е1е Ае1бк Кек., 28, 2000, ее. 219-221 и ЬеГтапе М.Р., №1е1е1е Ае1бк Кек., 29, 2001, ее. 207-209; МаеСа11ит и др., I. Мо1. Вю1., 262, 1996, ее. 732-745; и Майш и др., Ргое. Аеаб. 8е1. И8А, 86, 1989, ее. 9268-9272; Магйп и др., МеШобк ЕпхутоЕ 203, 1991, ее. 121-153; и Кеек и др., в: Рго1еш 81гие1иге Ргеб1ебоп, под ред. 81егпЬегд М.1Е., изд-во ОхГогб Ишуеткйу Ргекк, ОхГогб, 1996, ее. 141172.
- 6 032084
Понятия детерминанта специфичности связывания и Β8Ό используют взаимозаменяемо для обозначения минимальной состоящей из смежных или несмежных аминокислот последовательности, присутствующей в гипервариабельном участке, которая необходима для придания антителу специфичности к связыванию. Минимальная детерминанта специфичности связывания может присутствовать в последовательностях одного или нескольких СЭР. В некоторых вариантах осуществления изобретения минимальные детерминанты специфичности связывания локализованы (т.е. определяются только ими) в фрагментах или полноразмерных последовательностях СЭР3 тяжелых и легких цепей антитела.
Понятие легкая цепь антитела или тяжелая цепь антитела в контексте настоящего описания относится к полипептиду, содержащему Уь или Ун соответственно. Эндогенная Уъ кодируется генными сегментами V (вариабельный) и I (соединительный), а эндогенная Ун кодируется V, Ό (разнообразие) и 1. Каждая VI, или νΗ включает СЭВ, а также каркасные участки. В контексте настоящего описания легкие цепи антитела и/или тяжелые цепи антитела иногда могут быть обозначены вместе как цепи антитела. Под эти понятия подпадают цепи антитела, содержащие мутации, которые не нарушают основную структуру ν£ или νΗ, хорошо известные специалисту в данной области.
Антитела могут представлять собой интактные иммуноглобулины или многочисленные их фрагменты с хорошо известными характеристиками, которые получают расщеплением различными пептидазами. Так, например, пепсин расщепляет антитело за дисульфидными мостиками в шарнирной области, приводя к образованию Р(аЬ)'2-фрагмента, димера Рай, который сам представляет собой легкую цепь, связанную с №-СН дисульфидной связью. Р(аЬ)'2 может восстанавливаться в мягких условиях, при которых происходит расщепление дисульфидного мостика в шарнирной области, что приводит к превращению димера Р(аЬ)'2 в мономер РаЬ'. Мономер РаЬ' представляет собой в основном РаЬ-фрагмент с частью шарнирной области (см. Раи1, Риибатеи!а1 1ттиио1оду, 3-е изд., 1993). Хотя обозначение различных фрагментов антитела определяется с точки зрения расщепления интактного антитела, специалисту в данной области должно быть очевидно, что такие фрагменты можно синтезировать бе ηονο либо химически, либо с помощью методологии рекомбинантной ДНК. Так понятие антитело в контексте настоящего описания включает также фрагменты антитела, полученные либо путем модификации полных антител, либо синтезированные бе ηονο с использованием методологии рекомбинантной ДНК (например, одноцепочечный Ρν), либо фрагменты, идентифицированные с помощью фаговых дисплейных библиотек (см., например, МсСаГГеПу и др., №Шге 348, 1990, сс. 552-554).
Для получения моноклональных или поликлональных антител можно использовать любой метод, известный в данной области (см., например, Кой1ет и Мййеш, №Щ.1ге 256, 1975, сс. 495-497; КохЬог и др., 1ттиио1оду Тобау 4, 1983, с. 72 (1983); Со1е и др., в: Моиос1оиа1 АийЬоб1е8 аиб Сапсег Тйегару, 1985, сс. 77-96). Методики получения одноцепочечных антител (И8 4946778) можно адаптировать для получения антител к полипептидам, предлагаемым в настоящем изобретении. Кроме того, для экспрессии гуманизированных антител можно использовать трансгенных мышей или другие организмы, такие как другие млекопитающие. В другом варианте для идентификации антител и гетеромерных РаЬ-фрагментов, которые специфически связываются с выбранными антигенами, можно применять основанные на использовании фагового дисплея методики (см., например, МсСаГГеПу и др., №11иге 348, 1990, сс. 552-554; Маткк и др., Вю!есйио1оду 10, 1992, сс. 779-783).
Методы гуманизации или приматизации нечеловеческих антител хорошо известны в данной области. Как правило, гуманизированное антитело имеет один или несколько интродуцированных в него аминокислотных остатков из источника, представляющего собой антитело из вида животного, кроме человека. Эти нечеловеческие аминокислотные остатки часто обозначают как импортные остатки, и их, как правило, получают из импортной вариабельной области. Гуманизацию можно осуществлять, в целом, согласно методу, описанному №1и!ет с соавторами (см., например, 1оие§ и др., №11иге. 321, 1986, сс.522525; В1есйтаии и др., №т.1ге. 332, 1988, сс. 323-327; Vе^йοеуеη и др., 8аеисе, 239, 1988, сс. 1534-1536 и Ртейа, Сигг. Ор. 81гис1. Вю1., 2, 1992, сс. 2593-596), путем замены СЭВ или последовательностей СЭВ грызунов на соответствующие последовательности человеческого антитела. Таким образом, указанные гуманизированные антитела представляют собой химерные антитела (ϋδ 4816567), в которых область, существенно меньшая, чем человеческая интактная вариабельная область, заменена на соответствующую последовательность из антитела видов, кроме человека. Практически гуманизированные антитела, как правило, представляют собой человеческие антитела, в которых некоторые остатки гипервариабельного участка (СЭВ) и возможно некоторые остатки каркасного участка (РВ) заменены остатками из аналогичного сайта антител грызунов.
Химерное антитело представляет собой молекулу антитела, в которой (а) константная область или ее часть изменена, заменена или рекомбинирована так, что антигенсвязывающий центр (вариабельная область) связан с константной областью из антитела другого или измененного класса, обладающего другой или измененной эффекторной функцией и/или полученного из других или измененных видов, или с полностью отличной молекулой, которая придает новые свойства химерному антителу, например, с ферментом, токсином, гормоном, фактором роста и лекарственным средством; или (б) вариабельная область или ее часть изменена, заменена или рекомбинирована на вариабельную область, имеющую другую или измененную антигенную специфичность.
- 7 032084
Антитела или антигенсвязывающие молекулы, предлагаемые в изобретении, включают также одну или несколько иммуноглобулиновых цепей, которые химически конъюгированы с другими белками или экспрессируются в виде слитых белков, включающих другие белки. К ним относится также биспецифическое антитело. Биспецифическое или бифункциональное антитело представляет собой созданное искусственным путем гибридное антитело, имеющее две различные пары легких/тяжелых цепей и два различных сайта связывания. К другим антигенсвязывающим фрагментам или элементам антитела, предлагаемым в изобретении, относятся бивалентное антитело в виде 8сБу (диабоди), биспецифические антитела в виде 8сБу, где молекула антитела распознает два различных эпитопа, одноцепочечные связывающие домены (бАЬ§) и минитела.
Различные антитела или антигенсвязывающие фрагменты, представленные в настоящем описании, можно получать путем ферментативной или химической модификации интактных антител или синтезировать бе ηονο с помощью методологии рекомбинантной ДНК (например, одноцепочечный Ру) или их можно идентифицировать с использованием фаговых дисплейных библиотек (см., например, МсСаГГеПу и др., №11иге 348, 1990, сс. 552-554). Например, минитела можно создавать с помощью методов, известных в данной области, описанных, например, у УаидНап и δοϊίαζζο. СотЬ СНет Н|дН ТЬгоидйри! 8стееп. 4, 2001, сс. 417-430. Биспецифические антитела можно получать различными методами, включая методы слияния с использованием гибридом или связывания РаЬ'-фрагментов (см., например, δοιγδίνίΡιί и БасНтапп, С11п. Ехр. ^тимк 79, 1990, сс. 315-321; Кю^е^у и др., 1. Iттиηο1. 148, 1992, сс. 1547-1553). Одноцепочечные антитела можно идентифицировать с использованием фаговых дисплейных библиотек или рибосомных дисплейных библиотек, библиотеки перетасованных генов. Такие библиотеки можно создавать с использованием синтетических, полусинтетических или нативных и иммунокомпетентных источников.
Химерное антитело представляет собой молекулу антитела, в которой (а) константная область или ее часть изменена, заменена или рекомбинирована так, что антигенсвязывающий центр (вариабельная область) связан с константной областью из антитела другого или измененного класса, обладающего другой или измененной эффекторной функцией и/или полученного из других или измененных видов, или с полностью отличной молекулой, которая придает новые свойства химерному антителу, например, с ферментом, токсином, гормоном, фактором роста, лекарственным средством и т.д.; или (б) вариабельная область или ее часть изменена, заменена или рекомбинирована на вариабельную область, имеющую другую или измененную антигенную специфичность. Например, как продемонстрировано в представленных ниже примерах, мышиное антитело к РС8К9 можно модифицировать путем замены его константной области на константную область человеческого иммуноглобулина. Благодаря замене на человеческую константную область химерное антитело может сохранять свою специфичность в отношении распознавания человеческой РС8К9, обладая при этом меньшей иммуногенностью для человека по сравнению с исходным мышиным антителом.
Понятие связывающая молекула типа антитела или лиганд, не являющийся антителом относится к миметикам антитела, имеющим неиммуноглобулиновые белковые каркасы, включая аднектины, авимеры, одноцепочечные полипептидные связывающие молекулы и антителоподобные связывающие пептидомиметики.
Понятие вариабельная область или У-область используют взаимозаменяемо для обозначения тяжелой или легкой цепи, содержащей РК1-СПК1-РК2-СПК2-РК.3-СПК3-РК.4 (см. фиг. 1). Эндогенная вариабельная область кодируется генами У-Э-1 тяжелой цепи иммуноглобулина или генами У-1 легкой цепи. У-область может представлять собой встречающуюся в естественных условиях рекомбинантную или синтетическую область.
В контексте настоящего описания понятие вариабельный сегмент или У-сегмент используют взаимозаменяемо для обозначения подпоследовательности вариабельной области, включающей РК.1ί.ΌΒ1-ΡΒ2-ί.ΌΒ2-ΡΡ3 (см. фиг. 1). Эндогенный У-сегмент кодируется У-геном иммуноглобулина. Усегмент может представлять собой встречающийся в естественных условиях рекомбинантный или синтетический сегмент.
В контексте настоящего описания понятие 1-сегмент относится к подпоследовательности кодируемой вариабельной области, содержащей находящиеся на С-конце СЭК.3 и РР4. Эндогенный 1-сегмент кодируется 1-геном иммуноглобулина (см. фиг. 1). 1-сегмент может представлять собой встречающийся в естественных условиях рекомбинантный или синтетический сегмент.
Гуманизированное антитело представляет собой антитело, которое сохраняет реактивность антитела организма, кроме человека, но которое обладает низкой иммуногенностью для человека. Для достижения этого можно, например, сохранять СЭК-участки антитела из организма, кроме человека, и заменять оставшиеся части антитела человеческими копиями (см., например, Μοιτίδοπ и др., Ргос. Ыа11. Асаб. 8с1. И8А, 81, 1984, сс. 6851-6855; ΜοΓΠδοο и Θί, Абу. Iттиηο1., 44, 1988, сс. 65-92; Уег1юеуеп и др., 8с1епсе, 239, 1988, сс.1534-1536; Раб1ап, ΜοΚ^ 1тгаип, 28, 1991, сс. 489-498; Раб1ап, Μο^. 1ттип, 31(3), 1994, сс. 169-217).
Понятие последовательность, соответствующая последовательности человеческой зародышевой линии относится к нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последователь
- 8 032084 ность человеческой вариабельной области, или к подпоследовательности, для которой характерна наибольшая идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной референспоследовательностью вариабельной области, или к подпоследовательности, сопоставимой со всеми другими оцениваемыми аминокислотными последовательностями, которые кодируются последовательностями вариабельных областей зародышевой линии человеческого иммуноглобулина. Понятие последовательность, соответствующая последовательности человеческой зародышевой линии можно относить также к аминокислотной последовательности человеческой вариабельной области или к подпоследовательности, для которой характерна наибольшая идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной референс-последовательностью вариабельной области, или к подпоследовательности, сопоставимой со всеми другими оцениваемыми аминокислотными последовательностями вариабельных областей. Последовательность, соответствующая последовательности человеческой зародышевой линии, может представлять собой только каркасные участки, только гипервариабельные участки, каркасные и гипервариабельные участки, вариабельный сегмент (как он определен выше) или другие комбинации последовательностей или подпоследовательностей, которые входят в вариабельную область. Идентичность последовательностей можно определять методами, представленными в настоящем описании, например путем выравнивания двух последовательностей с помощью ВЬА8Т, ЛЬЮК или другого алгоритма выравнивания, известного в данной области. Нуклеотидная или аминокислотная последовательность, соответствующая человеческой зародышевой линии, может быть идентичной по меньшей мере примерно на 90, 92, 94, 96, 98, 99% нуклеотидной или аминокислотной референс-последовательности вариабельной области. Соответствующие человеческой зародышевой линии последовательности можно определять, например, с использованием публичных международных баз данных 1тМипоСепеТ1С8 (1МСТ) (сайт во всемирной сети 1тд).сте8.Гт/) и У-Ьаке (сайт во всемирной сети уЬаке.ттс-сре.сат.ас.ик).
Фраза специфически (или избирательно) связывается в контексте настоящего описания применительно к взаимодействию между антигеном, например белком, и антителом или выведенным из антитела связывающим агентом относится к реакции связывания, которая позволяет выявлять присутствие антигена в гетерологичной популяции белков и других биологических субстанций, например в биологическом образце, например в образце крови, сыворотки, плазмы или ткани. Так в определенных условиях иммунологического анализа связывание антител или связывающих агентов, которые обладают конкретной специфичностью связывания, с конкретным антигеном по меньшей мере в 2 раза превышает фоновый сигнал, и они практически не связываются в значительной степени с другими антигенами, присутствующими в образце. Для обеспечения специфического связывания антитела или связывающего агента в таких условиях может потребоваться осуществление отбора антитела или агента на основе его специфичности к конкретному белку. Этот отбор необходимо или желательно осуществлять, отделяя антитела, которые дают перекрестную реакцию, например, с молекулами РС8К9 из других видов (например, мыши) или с другими подтипами РС8К9. Целый ряд форматов иммунологического анализа можно применять для отбора антител, обладающих специфической иммунореактивностью с конкретным белком. Например, для отбора антител, обладающих специфической иммунореактивностью с конкретным белком, обычно применяют твердофазные иммуноферментные анализы (ЕЫ8А) (см., например, описание форматов иммунологических анализов и условия, которые можно применять для определения специфической иммунореактивности, у Наг1о\у и Ьапе, АпйЬоФек А ЬаЬота!огу Мапиа1, 1988). Как правило, при этом сигнал, полученный в результате специфической или избирательной реакции связывания, должен по меньшей мере в 2 раза превышать фоновый сигнал и более предпочтительно превышать фоновый уровень более чем в 10-100 раз.
Понятие константа равновесия реакции диссоциации (Кс, М) относится к значению константы скорости диссоциации (к4, время-1), деленному на константу скорости ассоциации (ка, время-1, М-1). Константы равновесия реакции диссоциации можно измерять с помощью любых известных в данной области методов. Для антител, предлагаемых в настоящем изобретении, как правило, характерны значения константы равновесия реакции диссоциации, составляющие менее примерно 10-7 или 10-8М, например менее примерно 10-9 или 10-10М, в некоторых вариантах осуществления изобретения менее примерно 10-11, 10-12 или 10-13М.
В контексте настоящего описания понятие антигенсвязывающий участок (центр) относится к домену РС8К9-связывающей молекулы, предлагаемой в настоящем изобретении, который ответствен за специфическое связывание между молекулой и РС8К9. Антигенсвязывающий участок включает по меньшей мере одну вариабельную область тяжелой цепи антитела и по меньшей мере одну вариабельную область легкой цепи антитела. В каждой РС8К9-связывающей молекуле, предлагаемой в настоящем изобретении, присутствует по меньшей мере один из антигенсвязывающих участков, и каждый из антигенсвязывающих участков может быть идентичен другим или отличен от них. В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере один из антигенсвязывающих участков РС8К9связывающей молекулы, предлагаемой в настоящем изобретении, действует в качестве антагониста РС8К9.
Понятие антагонист в контексте настоящего описания относится к агенту, который обладает способностью специфически связываться и ингибировать активность молекулы-мишени. Например, антаго
- 9 032084 нист РС8К9 специфически связывается с РС8К9 и полностью или частично ингибирует опосредуемое РС8К9 расщепление ЛПНПР. На ингибирование опосредуемого РС8К9 расщепления ИННПР может оказывать влияние, но может и не оказывать влияния связывание РС8К9 с ИННПР. В некоторых случаях антагонист РС8К9 можно идентифицировать по его способности связываться с РС8К9 и ингибировать связывание РС8К9 с ЛПНПР. Считается, что имеет место ингибирование, если уровень опосредуемого РС8К9 расщепления ЛПНПР при ее контакте с антагонистом, предлагаемым в изобретении, ниже по меньшей мере примерно на 10%, например ниже по меньшей мере примерно на 25, 50, 75% по сравнению с опосредуемым РС8К9 расщеплением в присутствии контроля или в отсутствие антагониста, или если совсем не происходит никакого расщепления (полное ингибирование). Контроль можно не приводить в контакт с антителом или антигенсвязывающей молекулой, приводить в контакт с антителом или антигенсвязывающей молекулой, которая специфически связывается с другим антигеном или с антителом к РС8К9 или антигенсвязывающей молекулой, в отношении которых известно, что они не обладают антагонистической функцией. Понятие антитело-антагонист используют в ситуации, когда антагонист представляет собой обладающее ингибирующей активностью антитело.
Понятия РС8К9 и пропротеин-конвертаза субтилизин/кексин типа 9а используются взаимозаменяемо для обозначения встречающейся в естественных условиях человеческой пропротеинконвертазы, относящейся к подсемейству протеиназ К семейства секреторных субтилаз. РС8К9 синтезируется в виде растворимого зимогена, который подвергается автокаталитическому внутримолекулярному процессингу в эндоплазматическом ретикулуме и, по-видимому, функционирует в качестве пропротеинконвертазы. РС8К9 играет роль в гомеостазе холестерина и может участвовать в дифференцировке кортикальных нейронов. Установлено, что мутации в указанном гене РС8К9 ассоциированы с определенной формой аутосомально-доминантной семейной гиперхолестеринемии (см., например, ВигпсИ и Ноорег, С11п Вюсйет Ксу, 29(1), 2008, сс. 11-26). Нуклеотидная и аминокислотная последовательности РС8К9 известны и они были опубликованы в СеиВаик под регистрационными номерами ΝΜ174936.2 и №777596.2 соответственно. В контексте настоящего описания используют полипептид РС8К9, который обладает функциональной способностью связываться с ЛПНПР и стимулировать расщепление ЛПНПР. С точки зрения структуры аминокислотная последовательность РС8К9 идентична по меньшей мере примерно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% аминокислотной последовательности, депонированной в СеиВаик под регистрационным номером NР777596.2. С точки зрения структуры нуклеотидная последовательность РС8К9 идентична по меньшей мере примерно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% нуклеотидной последовательности, депонированной в СеиВаик под регистрационным номером ΝΜ174936.2.
Понятие мутация, приводящая к усилению по доминантно-негативному типу функции гена РС8К9 относится к встречающимся в естественных условиях мутациям в генах РС8К9, которые ассоциированы и/или являются причиной возникновения фенотипа семейной гиперхолестеринемии, ускоренного атеросклероза и ранней ишемической болезни сердца, например, в результате усиленного расщепления ИННПР и снижения уровней ЛПНПР. Аллельная частота мутаций, приводящих к усилению по доминантно-негативному типу функции гена РС8К9, является редкой (см. Витей и Ноорег, С1ш Вюсйет Неу., 29(1), 2008, сс. 11-26). Примерами мутаций, приводящих к усилению по доминантно-негативному типу функции гена РС8К9, являются Ό129Ν, Ό374Η, N4258 и Р496\У (см. Еакаио и др., А111его5с1его515. 203(1), 2009, сс. 166-171). Обзоры, касающиеся мутаций, приводящих к усилению по доминантнонегативному типу функции гена РС8К9 см. у Витей и Ноорег, выше; Еакаио и др., выше; АЬйабе1 и др., 1 Меб Сеие!, 45(12), 2008, сс. 780-786; АЬИабе1 и др., Нит Ми!а!, 30(4), 2009, сс. 520-529; и Ь1 и др., Несеи! Ра! ΌΝΑ Сеие 8ел., 1 ноября 2009 г. (РМГО 19601924).
Понятие активность полипептида, предлагаемого в изобретении, относится к структурным, регуляторным или биохимическим функциям полипептида, присутствующего в нативной для него клетке или ткани. Примерами активности полипептида являются как непосредственные (прямые) виды активности, так и косвенные (опосредованные) виды активности. Примерами прямых видов активности РС8К9 являются результаты непосредственного взаимодействия с полипептидом, включая связывание с ЛПНПР и опосредуемое РС8К9 расщепление ЛПНПР. Примерами опосредованных видов активности касательно РС8К9 являются изменения фенотипа или ответ клетки, ткани, органа или индивидуума, обусловленные активностью полипептида, например снижение повышенного уровня ЛПНПР в печени, снижение уровня ЛИВП-Х в плазме, снижение уровня холестерина в плазме, повышение чувствительности к статинам.
Понятие выделенный применительно к нуклеиновой кислоте или белку означает, что нуклеиновая кислота или белок практически свободна/свободен от других клеточных компонентов, с которыми она/он ассоциированы в ее/его естественном состоянии. Предпочтительно она/он находятся в гомогенном состоянии. Она/он могут находиться в безводной форме или в водном растворе. Степень чистоты и гомогенности, как правило, определяют с помощью методов аналитической химии, таких как электрофорез в полиакриламидном геле или жидкостная хроматография высокого разрешения. Белок, присутствующий в препарате в наибольшем количестве по сравнению с другими видами, является практически очищенным. В частности, выделенный ген выделяют из открытых рамок считывания, которые фланкируют ген и кодируют белок, отличный от того, который кодирует представляющий интерес ген. Понятие очищен
- 10 032084 ный обозначает, что нуклеиновая кислота или белок дает практически одну полосу на электрофоретическом геле. В частности, это означает, что нуклеиновая кислота или белок имеет степень чистоты, составляющую по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 95% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 99%.
Понятие нуклеиновая кислота или полинуклеотид относится к дезоксирибонуклеиновым кислотам (ДНК) или рибонуклеиновым кислотам (РНК) и их полимерам либо в одноцепочечной, либо в двухцепочечной форме. Если специально не указано иное, то под понятие подпадают нуклеиновые кислоты, содержащие известные нуклеотидные аналоги, встречающиеся в естественных условиях, которые обладают такой же способностью к связыванию, что и нуклеиновая кислота, с которой проводится сравнение, и метаболизируются аналогично встречающимся в естественных условиях нуклеотидам. Если не указано иное, то подразумевается, что конкретная нуклеотидная последовательность включает также ее консервативно модифицированные варианты (например, замены кодонов в рамках вырожденности генетического кода), аллели, ортологи, 8ИР и комплементарные последовательности, а также специально указанную последовательность. Так замены кодонов, связанные с вырожденностью генетического кода, можно осуществлять, создавая последовательности, в которых третье положение одного или нескольких (или всех) кодонов заменено смешанным основанием и/или дезоксиинозиновыми остатками (Ва1хсг и др., N1.1с1ею Ас1б Кек. 19, 1991, с. 5081; 0111кика и др., 1. Бю1. СЕет. 260, 1985, сс. 2605-2608 и Сакко1 и др., 1992; Κοκκοΐίηί и др., Мо1. Се11. РгоЬек 8, 1994, сс. 91-98).
Понятия полипептид, пептид и белок в контексте настоящего описания используются взаимозаменяемо для обозначения полимера, состоящего из аминокислотных остатков. Понятие применимо к аминокислотным полимерам, в которых один или несколько аминокислотных остатков представляют собой искусственный полученный химическим путем миметик соответствующей встречающейся в естественных условиях аминокислоты, а также к встречающимся в естественных условиях аминокислотным полимерам и не встречающимся в естественных условиях аминокислотным полимерам.
Понятие аминокислота относится к встречающимся в естественных условиях и синтетическим аминокислотам, а также к аминокислотным аналогам и аминокислотным миметикам, которые функционируют аналогично встречающимся в естественных условиях аминокислотам. Встречающиеся в естественных условиях аминокислоты представляют собой аминокислоты, кодируемые генетическим кодом, а также аминокислоты, которые впоследствии модифицируются, например гидроксипролин, гаммакарбоксиглутамат и 0-фосфосерин. Понятие аминокислотные аналоги относится к соединениям, которые имеют такую же основную химическую структуру, что и встречающаяся в естественных условиях аминокислота, т.е. имеют атом углерода в α-положении, который связан с атомом водорода, карбоксильной группой, аминогруппой и К-группой, например гомосерин, норлейцин, метионинсульфоксид и метионинметилсульфоний. Такие аналоги несут модифицированные К-группы (например, норлейцин) или модифицированные пептидные каркасы, но сохраняют такую же основную химическую структуру, что и встречающаяся в естественных условиях аминокислота. Понятие аминокислотные миметики относится к химическим соединениям, которые имеют структуру, отличную от общей химической структуры аминокислоты, но которые функционируют аналогично встречающейся в естественных условиях аминокислоте.
Понятие консервативно модифицированные варианты относится как к аминокислотным, так и к нуклеотидным последовательностям. Касательно конкретных нуклеотидных последовательностей понятие консервативно модифицированные варианты относится к таким нуклеиновым кислотам, которые кодируют идентичные или практически идентичные аминокислотные последовательности, или в случае, когда нуклеиновая кислота не кодирует аминокислотную последовательность, к практически идентичным последовательностям. Из-за вырожденности генетического кода любой конкретный белок кодируется большим количеством функционально идентичных нуклеиновых кислот. Например, кодоны ССА, ССС, ССС и ССи все кодируют аминокислоту аланин. Таким образом, в каждом положении, в котором аланин кодируется кодоном, кодон можно заменять на любые соответствующие известные кодоны без изменения кодируемого полипептида. Такие варианты нуклеиновой кислоты являются молчащими вариациями, которые представляют собой один из видов консервативно модифицированных вариантов. В контексте настоящего описания подразумевается, что каждая нуклеотидная последовательность, которая кодирует полипептид, включает также все возможные молчащие вариации нуклеиновой кислоты. Специалисту в данной области должно быть очевидно, что каждый кодон нуклеиновой кислоты (за исключением АИС, который, как правило, является единственным кодоном метионина, и ТСС, который, как правило, является единственным кодоном триптофана) можно модифицировать с получением функционально идентичной молекулы. Таким образом, для каждой описанной последовательности подразумевается каждая молчащая вариация нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид.
Касательно аминокислотных последовательностей специалисту в данной области должно быть очевидно, что индивидуальные замены, делеции или добавления в последовательности нуклеиновой кислоты, пептида, полипептида или белка, которые изменяют, добавляют или изымают одну аминокислоту или небольшой процент аминокислот в кодируемой последовательности, приводят к получению консервативно модифицированного варианта, в котором изменение приводит к замене аминокислоты на хими
- 11 032084 чески сходную аминокислоту. Перечень консервативных замен, обеспечивающих получение функционально аналогичных аминокислот, хорошо известен в данной области. Такие консервативно модифицированные варианты (и дополнительные варианты) не исключают полиморфные варианты, межвидовые гомологи и аллели, предлагаемые в изобретении.
Каждая из приведенных ниже 8 групп содержит аминокислоты, которые являются консервативными заменами друг друга:
1) аланин (А), глицин (С);
2) аспарагиновая кислота (Ό), глютаминовая кислота (Е);
3) аспарагин Щ), глютамин (О);
4) аргинин (К), лизин (К);
5) изолейцин (I), лейцин (Ь), метионин (М), валин (V);
6) фенилаланин (Е), тирозин (Υ), триптофан (^);
7) серии (8), треонин (Τ); и
8) цистеин (С), метионин (М) (см., например, СгсфЫоп. Рго1еш8 (1984)).
Понятие процент идентичности последовательностей означает величину, определяемую путем сравнения двух оптимальным образом выровненных последовательностей в окне сравнения, где фрагмент полинуклеотидной последовательности в окне сравнения может иметь вставки или делеции (т.е. бреши) по отношению к последовательности, с которой производится сравнение (референспоследовательности) (например, последовательности полипептида, предлагаемого в изобретении), которая не имеет вставок или делеций, для оптимального сравнительного анализа первичной структуры двух последовательностей. Процент рассчитывают путем определения количества положений, в которых в обеих последовательностях встречается идентичный нуклеотид или аминокислотный остаток, в результате чего получают количество совпадающих положений, деления количества совпавших положений на общее количество положений в окне сравнения и умножения результата на 100 для получения процента идентичности последовательностей.
Понятия идентичный или процент идентичности в отношении двух или большего количества нуклеотидных или полипептидных последовательностей относится к двум или большему количеству последовательностей или подпоследовательностей, которые являются одинаковыми. Две последовательности являются практически идентичными, если две последовательности имеют определенный процент одинаковых аминокислотных остатков или нуклеотидов (т.е. идентичность на уровне 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% в определенной области или, если она не указана конкретно, в полной последовательности) при сопоставлении и выравнивании с целью выявления максимального соответствия в окне сравнения или в предназначенной для этого области, что устанавливают с использованием одного из перечисленных ниже алгоритмов сравнения или путем сравнения вручную и визуального анализа. Изобретение относится к полипептидам или полинуклеотидам, которые являются практически идентичными полипептидам или полинуклеотидам соответственно, приведенным в настоящем описании в качестве примеров (например, к вариабельным областям, примерами которых являются любые из последовательностей, представленных в 8Еф ГО N0: 1-5, 15-19 и 40-41; вариабельным сегментам, примерами которых являются любые из последовательностей, представленных в 8Еф ГО N0: 27-З1; к СОК, примерами которых являются любые из последовательностей, представленных в 8Еф ГО N0: 6-14, 20-26; ЕК, примерами которых являются любые из последовательностей, представленных в 8Еф ГО N0: З2-З9; и нуклеотидным последовательностям, примерами которых являются любые из последовательностей, представленных в 8Еф ГО N0: 42-45). Необязательно идентичность имеет место в области длиной примерно 15, 25 или 50 нуклеотидов или более предпочтительно в области длиной от 100 до 500 или 1000 или более нуклеотидов или по всей длине референс-последовательности. В аминокислотных последовательностях идентичность или практическая идентичность может иметь место в области, состоящей по меньшей мере из 5, 10, 15 или 20 аминокислот, необязательно по меньшей мере примерно 25, З0, З5, 40, 50, 75 или 100 аминокислот, необязательно по меньшей мере примерно 150, 200 или 250 аминокислот или по всей длине референс-последовательности. В более коротких аминокислотных последовательностях, например аминокислотных последовательностях, состоящих из 20 или меньшего количества аминокислот, практическая идентичность может иметь место, когда один или два аминокислотных остатка консервативно заменены с использованием описанных выше консервативных замен.
При сравнении последовательностей, как правило, одна последовательность представляет собой референс-последовательность, с которой сравнивают тестируемые последовательности. При использовании алгоритма сравнения данные о тестируемой последовательности и референс-последовательности вводят в компьютер, при необходимости задают координаты подпоследовательности и параметры алгоритмической программы сравнения последовательностей. Можно использовать параметры программы, задаваемые по умолчанию, или альтернативные параметры. После этого алгоритм сравнения последовательностей рассчитывает на основе параметров программы процент идентичности для тестируемых последовательностей и референс-последовательности.
В контексте настоящего описания понятие окно сравнения относится к сегменту, содержащему любое количество следующих непрерывно друг за другом (смежных) положений, выбранных из группы,
- 12 032084 содержащей от 20 до 600, предпочтительно от примерно 50 до примерно 200, более предпочтительно от примерно 100 до примерно 150 положений, в которых можно сравнивать последовательность с референс-последовательностью, имеющей такое же количество следующих друг за другом непрерывных положений, после оптимального выравнивания двух последовательностей. Методы сравнительного анализа первичной структуры последовательностей, пригодные для сравнения, хорошо известны в данной области. Оптимальный сравнительный анализ последовательностей можно осуществлять, например, с использованием алгоритма локальной гомологии, который описан у 8тб11 и \Уа1сгтап. Абт. Αρρί. Ма111. 2, 1970, с. 482, алгоритма сравнительного анализа гомологии, который описан у №еб1етап и АипхсН., 1. Μοί. Βίοί. 48, 1970, с. 443, метода поиска сходства, который описан у Реагюп и Ыртап, Ргос. N1'1. Асаб. 8с1. И8А 85, 1988, с. 2444, с использованием компьютерных реализаций этих алгоритмов (САР, ВЕ8ТНТ, ЕА8ТА и ТЕА8ТА, входящих в пакет программ фирмы νί^οηκίη Сепебск, Сепебск СотрШег Стир, 575 8с1епсе Опте, Мэдисон, Висконсин, США) или путем сравнения вручную и визуального анализа (см., например, АикиЬе1 и др., Сиггеп! РюЮ^Е ίη Μοίесиίа^ Βίοίοβν (1995, приложение).
Двумя примерами алгоритмов, которые можно применять для определения процента идентичности последовательностей и сходства последовательностей, могут служить алгоритмы ВЬА8Т и ВЬА8Т 2.0, описанные у АЙксби1 и др., Шс. Ас1б Кек. 25, 1977, сс. 3389-3402 и у Абксби1 и др., 1. Μοί. Βίοί. 215, 1990, сс. 403-410 соответственно. Программное обеспечение для осуществления анализов с помощью ВЬА8Т может быть предоставлено Национальным центром биотехнологической информации (ΗαΙίοηαί СегИег Γογ ВютсНгю^ду [ηΓοπηιΗίοη). В этом алгоритме сначала производится идентификация пар последовательностей с высокими баллами (Н8Р) путем идентификации коротких слов длины V в рассматриваемой последовательности, которые или совпадают, или удовлетворяют определенной положительной пороговой оценке (баллу) Т при сравнении со словом такой же длины в последовательности из базы данных. Т называется пороговой оценкой (баллом) близкого слова (А11кс1ш1 и др., 1990). Эти исходные совпадения близких слов используются в качестве затравки для инициации поиска, предназначенного для нахождения включающих эти слова более длинных Н8Р. Затем выборки слова удлиняются в обоих направлениях вдоль каждой последовательности до тех пор, пока происходит увеличение кумулятивного (накопительного) балла при сравнительном анализе. Кумулятивные баллы для нуклеотидных последовательностей вычисляют с использованием параметров Μ (призовой балл за пару совпадающих остатков; всегда >0) и N (штрафной балл за несовпадающие остатки; всегда <0). Для аминокислотных последовательностей для вычисления кумулятивного балла используют матрицу баллов. Удлинение совпадающих слов в каждом направлении прекращается в том случае, если кумулятивный балл при сравнительном анализе снижается на величину X от своего максимального достигнутого значения, если кумулятивный балл снижается до нуля или ниже из-за накопления одного или нескольких отрицательных баллов при сравнительном анализе остатков или если достигается конец какой-либо последовательности. Параметры V, Т и X алгоритма ВЬА8Т определяют чувствительность и скорость сравнительного анализа. В программе ВЬА8ТЫ (для нуклеотидных последовательностей) в качестве задаваемых по умолчанию параметров используются длина слова (V), равная 11, ожидание (Е), равное 10, М=5, N=-4, при этом производится сравнение обеих цепей. Для аминокислотных последовательностей в программе ВЬА8ТР используются в качестве задаваемых по умолчанию параметров длина слова (V), равная 3, ожидание (Е), равное 10, и матрица баллов ВЬ08ИМ62 (см. ^ηίΡοΓΓ и ^πίΚοΙ'Γ, Ргос. №111. Асаб. 8ст И8А 89, 1989, с. 10915) для сравнительного анализа (В) 50, ожидание (Е), равное 10, М=5, N=-4, при этом производится сравнение обеих цепей.
Алгоритм ВЬА8Т позволяет осуществлять также статистический анализ сходства двух последовательностей (см., например, Кагбп и АбксЬи1, Ргос. №16. Асаб. 8ст И8А 90, 1993, сс. 5873-5787). Одним из критериев степени сходства, который позволяет получать алгоритм ВЬА8Т, является наименьшая суммарная вероятность (Р^)), которая характеризует вероятность, с которой может произойти случайным образом совпадение между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями. Например, считается, что тестируемая нуклеотидная последовательность является сходной с референспоследовательностью, если наименьшая суммарная вероятность при сравнении тестируемой нуклеотидной последовательности с нуклеотидной референс-последовательностью меньше приблизительно 0,2, более предпочтительно меньше приблизительно 0,01 и наиболее предпочтительно меньше приблизительно 0,001.
Свидетельством того, что две нуклеотидные последовательности или два полипептида являются практически идентичными, служит то, что полипептид, кодируемый первой нуклеиновой кислотой, обладает перекрестной иммунологической реактивностью с антителами к полипептиду, который кодируется второй нуклеиновой кислотой, как это описано ниже. Так полипептид, как правило, является практически идентичным второму полипептиду, например, в том случае, когда два пептида различаются только консервативными заменами. Другим свидетельством того, что две нуклеотидные последовательности являются практически идентичными, служит то, что две молекулы или их комплементы гибридизуются друг с другом в строгих условиях, как это описано ниже. Еще одним свидетельством того, что две нуклеотидные последовательности являются практически идентичными, служит то, что для амплификации последовательностей можно использовать одни и те же праймеры.
- 13 032084
Понятие связь в контексте настоящего описания характеризует то, каким образом антигенсвязывающие участки соединены с РС8К9-связывающей молекулой, предлагаемой в настоящем изобретении, под понятие подпадают все возможные пути физического соединения областей. Большинство антигенсвязывающих участков часто соединяются химическими связями, такими как ковалентная связь (например, пептидная связь или дисульфидный мостик) или нековалентная связь, которая может представлять собой либо непосредственную связь (т.е. без линкера между двумя антигенсвязывающими участками), либо косвенную связь (т.е. с помощью по меньшей мере одной линкерной молекулы между двумя или большим количеством антигенсвязывающих участков).
Понятия субъект, пациент и индивидуум, которые используются взаимозаменяемо, относятся к млекопитающему, например к человеку или примату, кроме человека. Млекопитающее может представлять собой также лабораторное млекопитающее, например мышь, крысу, кролика, хомяка. В некоторых вариантах осуществления изобретения млекопитающее может представлять собой сельскохозяйственное млекопитающее (например, лошадь, овцу, корову, свинью, верблюда) или домашнее млекопитающее (например, собаку, кошку).
Понятие терапевтически приемлемое количество или терапевтически эффективная доза, которые используются взаимозаменяемо, относится к количеству, достаточному для достижения требуемого результата (т. е. снижению уровня не-ЛПВП-Х в плазме, облегчению гиперхолестеринемии, атеросклероза, ишемической болезни сердца). В некоторых вариантах осуществления изобретения терапевтически приемлемое количество не индуцирует или не вызывает нежелательных побочных действий. Терапевтически приемлемое количество можно определять путем первоначального введения низкой дозы и последующего постепенного повышения указанной дозы вплоть до достижения требуемого действия. Применение антитела, являющегося антагонистом РС8К9, в профилактически эффективной дозе и терапевтически эффективной дозе может предупреждать возникновение или приводить к уменьшению серьезности симптомов заболевания, ассоциированного с присутствием РС8К9 (например, гиперхолестеринемии), соответственно. Применение рассматриваемого антитела в дозах, подпадающих под указанные определения, может также стимулировать наступление или увеличивать соответственно частоту и продолжительность периодов времени, свободных от симптомов заболевания. Профилактически эффективная доза и терапевтически эффективная доза могут также предупреждать или ослаблять соответственно ухудшение состояния или недееспособность, вызываемую нарушениями и заболеваниями, которые обусловлены активностью РС8К9.
Понятие совместное введение относится к введению, обеспечивающему одновременное присутствие двух действующих веществ в крови индивидуума. Действующие вещества, подлежащие совместному введению, можно вводить одновременно или последовательно.
В контексте настоящего описания фраза состоящий практически из относится к типам или видам фармацевтических действующих веществ, применяемых в способе или включенных в композицию, а также к любым эксципиентам, которые не обладают активностью с точки зрения цели, для которой предназначены способы или композиции. В некоторых вариантах осуществления изобретения фраза состоящий практически из специально указывает на то, что исключено присутствие одного или нескольких дополнительных действующих веществ, отличных от антитела, являющегося антагонистом РС8К9, предлагаемым в изобретении. В некоторых вариантах осуществления изобретения фраза состоящий практически из специально указывает на то, что исключено присутствие одного или нескольких дополнительных действующих веществ, отличных от антитела, являющегося антагонистом РС8К9, предлагаемым в изобретении, и второго предназначенного для совместного введения вещества.
Понятие статин относится к классу фармакологических веществ, являющихся конкурентными ингибиторами 3-гидрокси-3-метилглутарил-кофермент А-(НМС-СоА) редуктазы.
Краткое описание чертежей
На чертежах показано:
на фиг. 1 - аминокислотные последовательности тяжелой (8Е0 ГО N0: 1) и легкой (8Е0 ГО N0: 15) цепи родительского мышиного моноклонального антитела ХУР-ЬБи720. Последовательности СЭК1. СЭК2 и СЭК3 подчеркнуты и выделены жирным шрифтом;
на фиг. 2 - аминокислотные последовательности тяжелой (8Е0 ГО N0: 2) и легкой (8Е0 ГО N0: 16) цепи родительского мышиного моноклонального антитела ХУР-ЬСТ209. Последовательности СОК1, СЭК2 и СЭК3 подчеркнуты и выделены жирным шрифтом;
на фиг. 3 - аминокислотные последовательности тяжелой (8Е0 ГО N0: 2) и легкой (8Е0 ГО N0: 18) цепи родительского мышиного моноклонального антитела ХУР-ЬСТ210. Последовательности СОК1, СЭК2 и СЭК3 подчеркнуты и выделены жирным шрифтом;
на фиг. 4 - аминокислотные последовательности тяжелой (8Е0 ГО N0: 4) и легкой (8Е0 ГО N0: 16) цепи родительского мышиного моноклонального антитела ХУР-ЬСТ211. Последовательности СОК1, СЭК2 и СЭК3 подчеркнуты и выделены жирным шрифтом;
на фиг. 5А-5В - результаты анализа методом ЕЫ8А связывания ХУР-ЬСТ209 (А), ХУР-ЬСТ210 (Б) и ХУР-ЬСТ-211 (В) с несколькими различными человеческими и мышиными антигенами в сравнении с результатами, полученными для ХУР-ЬРи720-ЫХ-4;
- 14 032084 на фиг. 6А-6В - результаты оценки методом ЕЫЗА связывания кУР-БСТ209 (А), кУР-БСТ210 (Б) и ХУР-Ь6Т-211 (В) с Рсзк9 человека и обезьяны циномолгус (супо Рсзк9). В качестве вторичного антитела применяли козье антимышиное антитело в разведении 1:5000. Только 2-е обозначает контроль, в котором применяли только вторичное антитело;
на фиг. 7 - иллюстрация того, что родительское мышиное моноклональное антитело НУР-БЕи720 связывается с С-концом РСЗК9 (остатки 680-692, ЯЗЯНЯ-АОАЗОЕБО; ЗЕО ΙΌ N0: 49). Нитапеегеб™антитела БСТ209. БСТ210 и БСТ211 конкурируют за связывание с тем же эпитопом. Мутант с Сконцевой мутацией (С-концевой мутант) А685Х имеет последовательность, представленную в ЗЕО ΙΌ N0: 56;
на фиг. 8 - результаты биохимического анализа методом резонансного переноса энергии флуоресценции с временным разрешением (ТЯ-ЕЯЕТ), свидетельствующие о том, что родительское мышиное антитело кУР-ЯЕЯ720 (5Р20) слабо нарушало взаимодействие РСЗК9 и ЛПНПР. В отличие от этого антитело 13С10 приводило к нарушению взаимодействия РСЗК9-ЛПНПР, что характеризовалось по данным ЕЯЕТ-анализа величиной Ιϋ50, составляющей 50 нМ. Человеческую РСЗК9, меченную флуорофором (кРСЗК9-АЕ), инкубировали с кУР-ЯЕЯ720-АХ-1 или 13С10 в буфере для анализа (20 мМ НЕРЕЗ, рН 7,2, 150 мМ №С1, 1 мМ СаС12, 0,1 об.% Твин 20, и 0,1% (мас./об.)) БСА в течение 30 мин при комнатной температуре. После этого добавляли меченный европием ЛННПР (к ЛННПР-Еи) и осуществляли дополнительную инкубацию при комнатной температуре в течение 90 мин, в результате чего конечная концентрация 11Рсзк9-АЕ составляла 8 нМ, а конечная концентрация к ЛННПР-Еи составляла 1 нМ. ТЯЕЯЕТ-сигнал (длина волны возбуждения 330 нм, длина волны испускания 665 нм) измеряли с помощью планшет-ридера (типа ЕпУ151оп 2100, фирма Регкт Е1тег) и рассчитывали % ингибирования в присутствии 5Р20 или 13С10. Значения Ιί.'50 рассчитывали на основе графика процента ингибирования с помощью программы Рпзт (пакет программ СгаркРаб). Каждая экспериментальная точка представляла собой среднее значение ±С.К.О. (п=4 повторности на одну точку). Представлены данные, полученные по меньшей мере в двух независимых экспериментах;
на фиг. 9 - результаты, свидетельствующие о том, что Нитапеегеб™-антитела ЯСТ209, БСТ210 и БСТ211 эквивалентны мышиному антителу ЬЕи720 в отношении индукции повышения уровней ЛПНПР и поглощения ЛННП клетками линии НерС2. Для измерения уровня ЛННПР клетки инкубировали с РСЗК9-связывающими антителами и метили с помощью антител к ЛПНПР. Для оценки поглощения ЛПНП клетки инкубировали с РСЗК9-связывающими антителами, РСЗК9 и ΌίΙ-ЛПНП. Флуоресценцию антител к ЛПНПР и ΌίΙ-ЛПНП измеряли с помощью проточной цитометрии. Для каждого анализа данные представлены в виде средних значений+С.К.О. по результатам повторных экспериментов. Представлены данные, полученные по трем независимым экспериментам.
Для проведения анализа поглощения ЛННП РСЗК9-связывающие антитела инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре в среде ΌΜΞΜ, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки с дефицитом липопротеина (фирма ШРисе^ и 200 нМ человеческой РСЗК9 (Натр1оп и др., РNАЗ, 104, (2007, сс. 14604-14609), и содержащие антитело/РСЗК9/среду растворы добавляли к клеткам, находящимся в 96-луночных планшетах, и инкубировали в течение ночи. На следующий день добавляли меченный 1,1'-диокстадецил-3,3,3',3'-тетраметилиндокарбоцианинперхлоратом ЛННП (ΌίΙ-ЛПНП, фирма Βίοтеб1са1 Тес1то1още5) и выдерживали еще в течение дополнительных 2 ч. Затем среду удаляли путем аспирации, клетки трижды отмывали ЗФР и подвергали диссоциации путем обработки смесью 0,25% трипсина-ЭДТК. Затем клетки переносили в буфер для ЕАСЗ (ЗФР, дополненный 5% фетальной бычьей сыворотки, 2 мМ ЭДТК и 0,2% азида натрия), центрифугировали при 1000хд в течение 10 мин, подвергали аспирации и фиксировали в 1%-ном параформальдегиде. Поглощение ЛПНП оценивали путем измерения испускаемой клетками ΌίΙ-флуоресценции (длина волны возбуждения 488 нм, длина волны испускания 575 нм) с помощью проточной цитометрии (устройство типа Вес1оп Окктзоп БЗЯ II). Для анализа расположенных на клеточной поверхности ЛПНПР (поверхностные ЛПНПР) клетки инкубировали с бессывороточной средой, содержащей антитела, отмывали с помощью ЗФР и собирали в буфер Уегзте (фирма Вю^Ыйакег, 17-771Е) и буфер для ЕАСЗ-анализа. Клетки переносили в новые планшеты, центрифугировали при 1200 об/мин в течение 5 мин и блокировали с помощью нормального кроличьего ΙβΟ (фирма МР В1отеб1са1з). Клетки метили с использованием меченных А1еха 647 кроличьих антител в виде Ι§Ο к к ЛННПР (5 мкг/мл) в буфере для ЕАСЗ-анализа, центрифугировали, отмывали и фиксировали в 1%-ном параформальдегида. Количество поверхностных ЛПНПР измеряли с помощью проточной цитометрии (длина волны возбуждения 488 нм, длина волны испускания 633 нм). Значения Ιί.'50 рассчитывали с помощью программы Рпзт (пакет программ СгаркРаб);
на фиг. 10 - план исследования по оценке снижающего воздействия антител, предлагаемых в настоящем изобретении, на уровень холестерина, проведенного на мышиной модели с использованием инфузии человеческой РСЗК9. Я6Т209, БСТ210 и БСТ211 представляли собой Нитапеегеб™-антитела к РСЗК9, которые связывались с высокой аффинностью с кРСЗК9, и при этом их связывание с мышиной РСЗК9 находилось на уровне ниже предела обнаружения. Для выяснения вопроса о том, могут ли Я6Т209, БСТ210 или БСТ211 ингибировать опосредуемое кРСЗК9 повышение уровня не-ЛНВП-Х и в
- 15 032084 то же время предупреждать опосредуемое РС8К9 расщепление ИИНПР в печени, каждой мыши вводили путем инъекции антитела за 3 ч до имплантации осмотического мини-насоса, содержащего 11РС8К9 (для осуществления непрерывной инфузии). Через 24 ч после инъекции 11РС8К9 осуществляли отбор образцов плазмы и ткани печени;
на фиг. 11 - результаты, полученные на мышиной модели с использованием инфузии, которые свидетельствуют о том, что антитела БСТ209, БСТ210 и БСТ211 приводили к накоплению человеческой РС8К9 (11РС8К9). В целом, опыт проводили следующим образом: уровень общей 11РС8К9 измеряли с помощью ЕЫ8А с использованием МАт 7Ό16 для осуществления захвата. МАт 7Ό16 связывалось с эпитопом на РС8К9, отличным от эпитопа, с которым связывались БСТ209, БСТ210 и БСТ211, и его можно было применять для измерения уровня общей (свободной и связанной) РС8К9. Обнаруженное повышение уровня общей 11РС8К9. по-видимому, обусловлено увеличением количества комплексов 11РС8кК9/АТ. Уровень свободного антитела измеряли с помощью ЕЫЗА с использованием 11РС8К9 для осуществления захвата. Этот анализ позволял измерять уровень свободного антитела и возможно уровень комплексов Ат:РС8К9 (1:1). Мышей линии С57ВЬ/6 обрабатывали только наполнителем, только РС8К9, РС8К9+20 мг/кг ЬОТ210, РС8К9+20 мг/кг ХУР-БСТ211 или смесью мышиных неспецифических Ι§0 (отрицательный контроль). Индивидуальные экспериментальные точки наносили на график и среднее значение отмечали горизонтальной черточкой; результаты считали статистически достоверными при р<0,05.
Уровни ЦС в плазме определяли количественно с помощью метода анализа фирмы Мезо 8са1е Ό18соуету (ΜδΌ). Уровень свободного антитела измеряли с использованием 11РС8К9 для осуществления захвата. Этот анализ позволял измерять уровень свободного антитела и возможно уровень комплексов Ат:РС8К9 (1:1). Для проведения ΜδΌ-анализа Ι§0 применяли стандартные 96-луночные планшеты фирмы ΜδΌ (типа Б11ХА-3). В целом, опыт проводили следующим образом: планшеты сенсибилизировали в течение ночи при 4°С с использованием 25-28 мкл захватывающего антигена, а именно РС8К9-Н15, 1 мкг/мл в ЗФР (25-28 нг/лунку). Удаляли раствор, применявшийся для сенсибилизации, и планшеты блокировали с использованием 150 мкл/лунку 5% блокирующего буфера В1оскег А фирмы ΜδΌ (К93АА-2), осуществляя встряхивание в течение 1 ч при комнатной температуре. После 3-кратной отмывки планшета с использованием 300 мкл ЗФР+0,05% Твин-20 добавляли 25 мкл разведений используемого для калибровки ЦС (10 серийных разведений от 10000 до 0,0003 нг/мл с использованием В1оскег А фирмы ΜδΌ), разведений неизвестного образца плазмы (10000х, В1оскег А фирмы ΜδΌ) или образцов для качественного контроля и инкубировали при встряхивании в течение 1 ч при комнатной температуре. После отмывки добавляли по 25 мкг/лунку взятого в концентрации 1 мкг/мл идентифицирующего антитела (идентифицирующее козье антимышиное меченное с помощью 8иЬЕ0-ТА0 антитело фирмы ΜδΌ, а именно К32АС-5, разведенное с помощью 1% БСА/ЗФР/0,05% Твин 20) и инкубировали при встряхивании в течение 1 ч при комнатной температуре. После отмывки и добавления по 150 мкл/лунку 1х буфера Т для считывания планшет сразу считывали с помощью устройства 8ЕСТ0К Ийаде!· 6000 фирмы ΜδΌ. С помощью программы для анализа данных фирмы ΜδΌ строили стандартную кривую и графики для неизвестных образцов.
Уровни Ι§Ο и 11РС8К9 в плазме определяли количественно с помощью метода анализа фирмы Μе8о 8са1е ИЦсоуету (ΜδΌ). ΜδΌ-анализ 11РС8К9 проводили аналогично анализу ΙβΟ. но со следующими исключениями. Планшеты сенсибилизировали с использованием 25-28 мкл захватывающего антитела (7Ό16.Ο3: 2,95 мг/мл) в концентрации 1 мкг/мл. МАт 7Ό16 связывается с эпитопом на РС8К9, отличным от эпитопа, с которым связываются ИСТ209. ИСТ210 и БСТ211, и его можно использовать для измерения уровня общей (свободной и связанной) РС8К9. После блокирования планшетов осуществляли инкубацию 25 мкл разведений используемого для калибровки 11РС8К9 (10 серийных разведений от 10000 до 0,0003 нг/мл) и разведений образца плазмы (10000х, В1оскег А фирмы ΜδΌ) при встряхивании в течение 1 ч при комнатной температуре с последующей инкубацией с первичным идентифицирующим антителом (кроличье поликлональное антитело к РСδК9, а именно АЬ4, лабораторный номер КаЬЬй ΙΌ № КВ11835). Дополнительно осуществляли стадию инкубации с вторичным идентифицирующим антителом (идентифицирующее козье антимышиное меченное с помощью δυ^·ΕΟ-ТАС антитело фирмы ΜδΌ, К32АС-5) перед считыванием с помощью устройства δЕСТ0К Ийаде!· 6000 фирмы ΜδΌ. Выявленное повышение уровня общей 11РС.ЪК9. по-видимому, обусловлено увеличением количества комплексов 11РС.ЪкК9/АТ. Статистический анализ проводили с использованием программы СтарйРаП Ргып 4.02 (пакет программ СтарйРаП, Сан-Диего, шт. Калифорния). Для анализа различий между группами использовали односторонний дисперсионный анализ и в случае выявления общих различий применяли апостериорный критерий Ньюмена-Кеулса для оценки специфических различий между группами обработки;
на фиг. 12 - данные, полученные на мышиной модели с использованием инфузии, которые демонстрируют, что антитела ИСТ209. ИСТ210 и ИСТ211 обеспечивают защиту ЛПНПР в печени от опосредуемого 11РС.ЪК9 расщепления. Мышей линии С57ВБ/6 обрабатывали только одним наполнителем, только РСδК9, РСδК9+20 мг/кг ИСТ210. РСδК9+20 мг/кг ХУР-ИСТ211 или смесью мышиных неспецифических ЦС (отрицательный контроль). Представлены результаты, полученные на образцах, взятых из пече
- 16 032084 ни индивидуальных животных.
Электрофорез в полиакриламидном геле образцов плазматических мембран осуществляли на 20зоновом 4-12% бис-трис-геле типа 1пуйтодеп Μίάί (фирма 1пуйгодеп, \УО1402ВХ10) с использованием в качестве подвижного буфера МОР8 (фирма 1пуйгодеп, №0001). Приготовленные образцы выдерживали при 70°С в течение 10 мин, помещали на лед и затем с помощью многоканальной пипетки фирмы МаРтх вносили на гель по 10 мкл каждого образца. Наряду с образцами вносили маркеры 8ееВ1не Р1и§2 (фирма 1пу1!годеп, ЬС5925) для определения размера и ориентации геля. Гели разгоняли при постоянном напряжении 200 В до тех пор, пока фронт красителя не достигал нижней границы геля. После электрофореза гели переносили на нитроцеллюлозные мембраны (фирма 1пу1!годеп, 1В3010-01) с помощью устройства 1В1о! (фирма 1пуйгодеп, 1В1001ЕИ). Перенос осуществляли при 20В в течение 7 мин. После переноса мембраны блокировали с помощью Р1егсе 8ирегЬ1оск Т20 (фирма Р1егсе, 37536) в течение по меньшей мере 30 мин. Мембраны помещали в пакеты типа §еа1-а-теа1 и затем добавляли разведенное с помощью 8ирегЬ1оск в соотношении 1:500 кроличье антитело к ЛПНПР, после чего инкубировали в течение ночи при 4°С при качании. Мембраны пятикратно промывали в ТВ8/0,05% Твин в течение 5 мин при качании, а затем к мембранам добавляли разведенное с помощью 8ирегЬ1оск в соотношении 1:30000 вторичное козье антикроличье антитело, конъюгированное с НКР, и выдерживали в течение 1 ч. Мембраны снова пятикратно промывали ТВ8/0,05% Твин в течение 5 мин при встряхивании. Содержащий НКР конъюгат обнаруживали с использованием хемилюминесцентного субстрата 8ирег8щпа1 ^Уе<1 Р1со фирмы Р1егсе (фирма Р1егсе, 37079) согласно инструкциям производителя. В целом, процедура заключалась в следующем: смешивали взятые в равных частях раствор пероксидазы и раствор, содержащий луминол/усилитель люминесценции, добавляли к мембранам (0,2 мл/см2) и выдерживали в течение 5 мин. Избыток раствора удаляли путем промокания, и мембраны экспонировали на рентгеновскую пленку Кобак ВюМах МК (фирма Кобак, 870 1302);
на фиг. 13А-13В - данные, полученные на мышиной модели с использованием инфузии, которые демонстрируют, что антитела ЬОТ209, ЬОТ210 и ЬОТ211 приводили к снижению уровней не-ЛПВПхолестерина в плазме. Предварительная инъекция антитела ЬОТ209 обеспечивала 46%-ную защиту от опосредуемого 11РС8К9 повышения уровня не-ЛПВП-холестерина. Предварительная инъекция ЬОТ210 или ЬОТ211 обеспечивала эквивалентную или более высокую защиту от опосредуемого 11РС8К9 повышения уровня не-ЛПВП-холестерина. 13С10 представляет собой валидированное мышиное антитело к РС8К9, которое связывается с высокой аффинностью с 11РС8К9. и его применяли в рассматриваемом анализе в качестве положительного контроля. Мышей линии С57ВЬ/6 обрабатывали только одним наполнителем, только РС8К9, РС8К9+20 мг/кг ЬОТ209, РС8К9+20 мг/кг ЬОТ210, РС8К9+20 мг/кг ΝΛΡЬОТ211, РС8К9+20 мг/кг 13С10 или смесью мышиных неспецифических 1дС (отрицательный контроль). Представлены индивидуальные данные, среднее значение отмечено горизонтальной черточкой. Для количественного определения уровня общего холестерина в плазме использовали клинический анализатор фирмы О1утри5 (фирма О1утри5 Атенса 1пс., О1утрн5 АИ400). Образцы плазмы разводили в соотношении 1:3 в ббН2О, и в разведенных образцах плазмы объемом по 40 мкл количественно определяли уровень общего холестерина согласно инструкциям производителя. Для количественного определения уровней ЛПВП и не-ЛПВП в плазме получали липопротеиновые фракции холестерина с помощью устройства 8р1Ге 3000 фирмы Не1епа ЬаЬога!опе8. Все процедуры, включая приготовление образцов, приготовление геля, внесение образцов, проведение гель-электрофореза, окрашивание, отмывку и сушку, осуществляли согласно инструкциям, представленным в руководстве для оператора. Затем гель сканировали с помощью сканера Ошск 8сап 2000 с использованием 81ίΐ 5, и рассчитывали относительное процентное содержание липопротеиновых фракций холестерина с помощью денситометра фирмы Не1епа. И, наконец, рассчитывали абсолютные величины уровней ЛПВП и не-ЛПВП путем умножения процентного содержания каждой фракции на уровни общего холестерина;
на фиг. 14 - сравнение фармакокинетических профилей (ФК) антител ЬОТ209, ЬОТ210 и ЬОТ211 (молчащий человеческий 1дО1) и профиля типичного 1дО1 (ФК). Время полужизни антител ЬОТ209, ЬОТ210 и ЬОТ211 заметно больше (7-13 дней), чем время полужизни типичного 1дО1 (примерно 6 дней) (например, при его определении в организме человека). Не было выявлено доказательств наличия опосредуемого мишенью смещения (ТМЭ), это свидетельствует о том, что антитела не обладают перекрестной реактивностью с РС8К9 грызунов). Каждое тестируемое антитело вводили путем инъекции 3 самцам крыс линии ЬеМк в дозе, составлявшей 10 мг/кг. В моменты времени 0, 1, 6, 24 ч, 2, 4, 8 и 16 дней брали образцы крови объемом по 250 мкл, осветленную плазму разводили и анализировали методом иммунного захвата (ЕЫ8А, козий античеловеческий 1дО) с целью измерения общего количества выделенных человеческих антител. Для каждого тестируемого антитела строили также стандартную кривую. Строили график зависимости количества выделенного 1дС от ожидаемого количества выделенного типичного человеческого 1дС в организме крыс.
Подробное описание изобретения
1. Введение.
Антитела и антигенсвязывающие молекулы, предлагаемые в настоящем изобретении, специфически связываются с пропротеин-конвертазой субтилизин/кексин типа 9а (РС8К9). Предлагаемые в на
- 17 032084 стоящем изобретении антитела к РС8К9 и антигенсвязывающие молекулы связываются с С-концом РС8К9 и обладают неожиданной способностью оказывать интерферирующее воздействие на опосредуемое РС8К9 расщепление рецептора липопротеинов низкой плотности (ЛПНПР), не оказывая при этом интерферирующего воздействия на связывание РС8К9 с ЛПНПР. В частности, антитела к РС8К9 и антигенсвязывающие молекулы связываются с эпитопом, находящимся между остатками 680-692 РС8К9, например с эпитопом, находящимся внутри аминокислотной последовательности Е8ЕНЕАОА8ОЕЕО (8Е0 ΙΌ N0: 49), которая расположена на С-конце РС8К9. Поскольку антитела и антигенсвязывающие молекулы, предлагаемые в изобретении, связываются с РС8К9, связанной с клеткой, а не только с присутствующей в кровотоке РС8К9, то они обладают сравнительно более продолжительным временем полужизни т у1уо в организме пациента, например, составляющим по меньшей мере примерно 7 дней или более, и в некоторых вариантах осуществления изобретения они обеспечивают снижающее уровень липидов действия в течение по меньшей мере 2 недель после введения. Антитела к РС8К9 и антигенсвязывающие молекулы, предлагаемые в изобретении, являются антагонистами РС8К9 в том смысле, что они препятствуют, снижают и/или ингибируют опосредуемое РС8К9 расщепление ЛПНПР, тем самым способствуя повышению поглощения холестерина липопротеинов низкой плотности (ЛЛНП-Х). Антитела к РС8К9 и антигенсвязывающие молекулы можно применять для лечения индивидуумов, страдающих, например, дислипидемией, гиперхолестеринемией, триглицеридемией и другими опосредуемыми РС8К9 болезненными состояниями.
2. Общая характеристика улучшенных антител к РС8К9.
Фрагменты антител к РС8К9 можно получать с помощью любых методов, известных в данной области, включая (но, не ограничиваясь только ими) методы рекомбинантной экспрессии, химического синтеза и ферментативного расщепления тетрамеров антител, в то время как полноразмерные моноклональные антитела можно получать, например, с использованием гибридом или методами рекомбинации. Рекомбинантную экспрессию можно осуществлять с использованием любых пригодных клеток-хозяев, известных в данной области, например клеток-хозяев млекопитающих, бактериальных клеток-хозяев, дрожжевых клеток-хозяев, клеток-хозяев насекомых и т.д. Если константные области присутствуют в антителах к РС8К9, то при необходимости они могут быть любого типа или подтипа, и их можно выбирать с помощью способов, предлагаемых в настоящем изобретении, из видов животных, подлежащих лечению (например, человек, примат кроме человека или другое млекопитающее, например сельскохозяйственное млекопитающее (например, лошадь, овца, корова, свинья, верблюд), домашнее млекопитающее (например, собака, кошка) или грызун (например, крыса, мышь, хомячок, кролик). В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела к РС8К9 гуманизируют или создают с помощью Нитаиеегеб™-технологии (Нитаиеегеб™-антитела). В некоторых вариантах осуществления изобретения константная область относится к изотипу 1дС, например 1дС1. В некоторых вариантах осуществления изобретения константную область человеческого 1дС1 подвергают мутации для снижения аффинности связывания с эффекторным лигандом, таким как Ес-рецептор (ЕсН), например Ес-гамма Н1 на поверхности клетки, или С1-компонент системы комплемента (см., например, И8 5624821). Антитела, содержащие такие мутации, опосредуют пониженную антителообусловленную клеточнозависимую цитотоксичность (АЭСС) или комплементзависимую цитотоксичность (СЭС) или вообще не опосредуют указанные виды активности. В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотные остатки Ь234 и Ь235 константной области 1дС1 заменяют на А1а234 и А1а235. Нумерация остатков в константной области тяжелой цепи соответствует нумерации ЕЙ (см. КаЬа! и др., 8ециеисе5 о£ Рго!ет§ о£ 1ттиио1од1са1 ЫегеН, изд-во и.8. Эер1. НеаПН аиб Нитаи 8егуюе5, 1983; см. также, например, \Уооб1е и др., Тгаи§р1аи!а!юи, 68(5), 1999, сс. 608-616; Хи и др., Се11 1ттиио1, 200(1), 2000, сс. 16-26 и НехагеН и др., 1 Упо1, 75(24), сс. 12161-12168).
Антитела к РС8К9 или антигенсвязывающие молекулы, предлагаемые в изобретении, включают также однодоменные антигенсвязывающие единицы, имеющие каркас верблюжьего антитела. К животным из семейства верблюдовых относятся верблюды, ламы и альпаки. В организме представителей верблюдовых образуются антитела, в которых отсутствуют легкие цепи. Укладка вариабельной области тяжелой цепи (УН) происходит автономно и она функционирует в качестве независимой антигенсвязывающей единицы. Ее связывающаяся поверхность включает только три СОН в отличие от шести СОН в классических антигенсвязывающих молекулах (ЕаЬ-фрагменты) или одноцепочечных фрагментах вариабельных областей (ксЕу). Верблюжьи антитела могут обладать аффинностью к связыванию, сопоставимой с аффинностью обычных антител. Молекулы антител к РС8К9, имеющие верблюжьи каркасы, которые обладают специфичностью связывания, присущей антителам к РС8К9, приведенным в качестве примера в настоящем описании, можно получать методами, хорошо известными в данной области, например, описанными у Питои1т и др., №11иге 81гис1. Вю1., 11, 2002, сс. 500-515; СНаНгоиб! и др., ЕЕВ8 Ьейегк, 414, 1997, сс. 521-526 и Воиб и др., 1 Мо1 Вю1., 332, 2003, сс. 643-655.
Улучшенные антитела к РС8К9, предлагаемые в изобретении, представляют собой сконструированные человеческие антитела с последовательностями У-областей, которые практически идентичны аминокислотным последовательностям У-областей человеческой зародышевой линии, но сохраняют специфичность и аффинность референс-антитела (см. публикацию патента США № 2005/0255552 и пуб
- 18 032084 ликацию патента США № 2006/0134098, которые обе включены в настоящее описание в качестве ссылки). Процесс улучшения заключается в получении информации о минимальных последовательностях, необходимых для определения специфичности связывания с антигеном, присутствующих в вариабельной области референс-антитела и перенос этой информации в библиотеку человеческих последовательностей генов частичных ν-областей с целью создания сфокусированной на эпитопах библиотеки ν-областей человеческих антител. Микробную систему секреции можно применять для экспрессии представителей библиотеки в виде РаЬ'-фрагментов антител, и библиотеку подвергать скринингу в отношении антигенсвязывающих РаЬ'-фрагментов, например, с помощью анализа связывания с использованием переноса колоний клеток (см., например, публикацию патента США № 2007/0020685). Позитивные клоны можно дополнительно характеризовать для идентификации клонов, обладающих самой высокой аффинностью. Полученные сконструированные человеческие РаЬ-фрагменты сохраняют специфичность связывания родительского референс-антитела к РС8К9, как правило, обладают эквивалентной или более высокой аффинностью к антигену по сравнению с родительским антителом и имеют ν-области, последовательности которых обладают высокой степенью идентичности с последовательностями ν-областей антитела человеческой зародышевой линии. Минимальная детерминанта специфичности связывания (ΒδΌ), необходимая для создания сфокусированной на эпитопы библиотеки, как правило, представляет собой последовательность в СИВ3 тяжелой цепи (СИВН3) и последовательность в СИВ3 легкой цепи (СЭВЬ3). ΒδΌ может содержать часть или полностью весь СЭВ3. ΒδΌ может состоять из смежных или несмежных аминокислотных остатков. В некоторых случаях сфокусированную на эпитопы библиотеку конструируют из последовательностей человеческих ν-сегментов, связанных с уникальной областью СОВ3-РВ4 из референс-антитела, которая содержит ΒδΌ и последовательности 1-сегмента человеческой зародышевой линии (публикацию патента США № 2005/0255552). В альтернативном варианте библиотеки человеческих ν-сегментов можно создавать путем последовательной замены кассет, в которых сначала только часть ν-сегмента референс-антитела заменяют на библиотеку человеческих последовательностей. Идентифицированные человеческие кассеты, поддерживающие связывание в контексте оставшихся аминокислотных последовательностей референс-антитела, затем рекомбинируют при втором скрининге библиотеки с получением полностью человеческих ν-сегментов (см. публикацию патента США № 2006/0134098).
В каждом случае спаренные СИВ3-сегменты тяжелой и легкой цепей, СОВ3-РВ4-сегменты или 1сегменты, которые содержат детерминанты специфичности из референс-антитела, применяют для придания специфичности связывания, в результате чего антигенсвязывающие агенты, полученные из библиотеки, сохраняют эпитопспецифичность референс-антитела. Дополнительные предназначенные для созревания изменения можно интродуцировать в СИВ3-участки каждой цепи в процессе конструирования библиотеки с целью идентификации антител с оптимальной кинетикой связывания. Полученные сконструированные человеческие антитела имеют последовательности ν-сегментов, выведенные из библиотек человеческой зародышевой линии, сохраняют короткие ΒδΌ-последовательности из СЭВ3участков и имеют каркасные участки 4 (РВ4) человеческой зародышевой линии.
Таким образом, согласно некоторым вариантам осуществления изобретения антитела к РС8К9 содержат последовательность минимальной детерминанты специфичности связывания (ΒδΌ) в СИВ3 тяжелых и легких цепей антитела, которые выведены из исходного антитела или моноклонального референс-антитела. Оставшиеся последовательности вариабельных областей тяжелых и легких цепей (СИВ и РВ), например, ν-сегмент и 1-сегмент, получают из аминокислотной последовательности соответствующей человеческой зародышевой линии и аминокислотной последовательности с созревшей аффинностью. ν-сегменты можно выбирать из библиотеки человеческих ν-сегментов. Другое усовершенствование последовательностей можно осуществлять, используя процедуру созревания аффинности.
В другом варианте осуществления изобретения тяжелые и легкие цепи антител к РСδК9 содержат человеческий ν-сегмент из последовательности соответствующей человеческой зародышевой линии (РВ1-СПВ1-РВ2-СИВ2-РВ3), например, выбранный из библиотеки человеческих ν-сегментов, и последовательность СОВ3-РВ4-сегмента из исходного моноклонального антитела. Последовательность СЭВ3РВ4-сегмента можно дополнительно усовершенствовать путем замены последовательностей сегментов на соответствующие последовательности человеческой зародышевой линии и/или путем созревания аффинности. Например, последовательность РВ4 и/или СИВ3, окружающую ΒδΌ, можно заменять на соответствующую последовательность человеческой зародышевой линии, и при этом сохранять ΒδΌ из СИВ3 исходного моноклонального антитела.
В некоторых вариантах осуществления изобретения соответствующая последовательность человеческой зародышевой линии для ν-сегмента тяжелой цепи представляет собой УЫ-02. В некоторых вариантах осуществления изобретения соответствующая последовательность человеческой зародышевой линии для 1-сегмента тяжелой цепи представляет собой ДН4. В некоторых вариантах осуществления изобретения 1-сегмент тяжелой цепи содержит частичную последовательность νΟΟΟΤΕντνδδ (δΕΟ ΙΌ N0: 50) человеческой зародышевой линии ДН4. Полноразмерный 1-сегмент человеческой зародышевой линии ДН4 имеет последовательность ΥΡ^Υ\VС^СТ^VТVδδ (δΕΟ ΙΌ N0: 51). Гены вариабельной области обозначают согласно стандартной номенклатуре, принятой для генов вариабельных областей им
- 19 032084 муноглобулинов. Современная информация о генах иммуноглобулинов доступна во всемирной сети, например в базах данных ЕпМипоСепе'Нсз (ШСТ), V-Ьаδе и РиЬМе^ (см. также, например, РеГгапс, Ехр СИп ЕптиподепеЕ 18(2), 2001, сс. 100-116; РеГгапс, Ехр С1т ЕптиподепеР 18(З), 2001, сс. 161-174; Ехр С1т ЕптиподепеР 18(4), 2001, сс. 242-254; и СшШсеШ и др., М1с1ечс АсИ§ Ке§, ЗЗ, 1 января 2005 г. (номер в базе данных): Ό256-61.
В некоторых вариантах осуществления изобретения соответствующая последовательность человеческой зародышевой линии для V-сегмента легкой цепи представляет собой VКII Ь6. В некоторых вариантах осуществления изобретения соответствующая последовательность человеческой зародышевой линии для 1-сегмента легкой цепи представляет собой 1к2. В некоторых вариантах осуществления изобретения 1-сегмент легкой цепи содержит частичную последовательность ЕСРСТКЬЕРК (8ЕР ГО N0: 52) человеческой зародышевой линии 1к2. Полноразмерный 1-сегмент человеческой зародышевой линии 1к2 имеет последовательность утеороткьепс (8Е0 ГО ΝΟ: 53).
В некоторых вариантах осуществления изобретения последовательность V-сегмента тяжелой цепи идентична по меньшей мере на 85, 89, 90, 9З, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% аминокислотной последовательности ρνρτνρ8ΟΑΕνΚΚΡΟΑ8νκν80ΚΑ8ΟΥΤΡ8(ϋ/Τ)ΜΥΜ8\ννκρΑΡθρθΤΕ\νΜΟΚΙ ΟΡΑΝ(Α/Ε/Ο)ΗΤΝΥ(Α/Ο)(Ρ/ρ)ΚΕ(χΑ/Ο)ΚνΤΜΤΚΟΤ8Ι8ΤΑΥΜΕΕ8ΚΕΤ8ΟΟΤΑνΥ УСАК (8Е(3 ГО ΝΟ: 28).
В некоторых вариантах осуществления изобретения последовательность V-сегмента тяжелой цепи идентична по меньшей мере на 85, 89, 90, 9З, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% аминокислотной последовательности
РУРЕУРЗОАЕУККРОАЗУКУЗСКАЗОУТЕЗТМУМЗУУУКРАРОРОЕЕУУМОКЮР ΑΝΕΗΤΝΥΑρΚΕρΟΚνΤΜΤΚϋΤδΙδΤΑΥΜΕΕδΚΕΤδϋϋΤΑνΥΥΟΑΚ (δΕΟ ГО ΝΟ: 27).
В некоторых вариантах осуществления изобретения последовательность V-сегмента легкой цепи идентична по меньшей мере на 85, 89, 90, 9З, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% аминокислотной последовательности (Ε/ρ)ΐν(Ε/Μ)Τρ8ΡΑΤΕ8ν8ΡσΕΚΑΤΕ80(Κ/8)Α8(ρ/8)8νδΥΜΗ\νΥρρΚΡθρΑΡΚΕ ΕΙΥ(Ο/Ε)(Τ/ν)Ε(Ν/Κ)(Ε/Κ)Α(8/Τ)ΟΙΡΟΚΕ8Ο8Ο8ΟΤΟΕΤΕΤΙΟΚΕΕΡΕΟΕΑνΥΥ0 (8Е<2 ГО ΝΟ: 31).
В некоторых вариантах осуществления изобретения последовательность V-сегмента тяжелой цепи идентична по меньшей мере на 85, 89, 90, 9З, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% аминокислотной последовательности ρίνΤΤρδΡΑΤΕδνδΡΟΕΚΑΤΕδΟΚΑδρδνδΥΜΗλνΥρρΚΡΟρΑΡΚΤΕΙΥΟνΕΚΚΑΤΟ ΙΡϋΚΕδΟδΟδΟΤΟΕΤΕΤΙΟΚΕΕΡΕϋΕΑνΥΥΟ (8Е(^ ГО ΝΟ: 29).
В некоторых вариантах осуществления изобретения последовательность V-сегмента тяжелой цепи идентична по меньшей мере на 85, 89, 90, 9З, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% аминокислотной последовательности
Е1УМТР8РАТЕ8У8РОЕКАТЕ8СКА8Р8У8УМН\УУРРКРОРАРКЬЫУОУГККАТ ΟΙΡΟΚΕδΟδΟδΟΤϋΕΤΕΤΙΟΚΕΕΡΕϋΕΑνΥΥΟ (8Е(^ Ιϋ ΝΟ: 30).
В некоторых вариантах осуществления изобретения:
I) С1ЖЗ тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность
8ΥΥΥΥ(Α/Ν)Μϋ(Α/Ε/8/ν/Υ) (8Е(^ ΙϋΝΟ: 14); и
II) С1ЖЗ вариабельной области легкой цепи содержит аминокислотную последовательность Ε(Ανδ8ϋΡΡΤ (8Е(2 ГО ΝΟ: 26).
В некоторых вариантах осуществления изобретения:
I) С1ЖЗ тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей 8ЕР ГО N0: 12 и 8ЕР ГО N0: 1З; и
II) С1ЖЗ легкой цепи содержит аминокислотную последовательность 8ЕР ГО N0: 26.
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела, предлагаемые в изобретении, содержат вариабельную область тяжелой цепи, которая включает СЭК1, имеющий аминокислотную последовательность (Ο/Τ)ΜΥΜ8 (8Е<) ГО ΝΟ: 8); 0ΌΚ2, имеющий аминокислотную последовательность κΐϋΡΑΝ(Α/Ε/Θ)ΗΤΝΥ(Α/ο)(Ρ/ζ))ΚΕζ)(Α/Θ) (8Ер го ΝΟ: и); и 0ΌΚ3, имеющий аминокислотную последовательность 8ΥΥΥΥ(Α/Ν)Μϋ(Α/Ε/8/ν/Υ) (8Е0 ГО ΝΟ: 14).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела, предлагаемые в изобретении, содержат вариабельную область легкой цепи, которая включает СЭК1, имеющий аминокислотную последовательность (κ/δ)Α8(ρ/8)δν8ΥΜΗ (8Е<2 ΐϋΝΟ:22); 0ΌΚ2, имеющий аминокислотную последовательность (θ/Ε)(τ/ν)Ε(Ν/κ)(Ε/κ)Α(8/τ) (8Εζ) го ΝΟ: 25); и СОКЗ, имеющий аминокислотную последовательность ΕΟΧνδδϋΡΡΤ (8Е0 ГО ΝΟ: 26).
В некоторых вариантах осуществления изобретения вариабельная область тяжелой цепи содержит ЕК1, имеющий аминокислотную последовательность 8ЕР ГО N0: З2; ЕК2, имеющий аминокислотную последовательность 8ЕР ГО N0: ЗЗ; ЕКЗ, имеющий аминокислотную последовательность 8ЕР ГО N0:
- 20 032084
34; и РР4, имеющий аминокислотную последовательность 8ЕР Ш N0: 35. Идентифицированные аминокислотные последовательности могут иметь одну или несколько аминокислотных замен (например, в результате созревания аффинности) или одну или две консервативные аминокислотные замены.
В некоторых вариантах осуществления изобретения вариабельная область тяжелой цепи содержит РР1, имеющий аминокислотную последовательность 8ЕР Ш N0: 36; РР2, имеющий аминокислотную последовательность 8 Ер Ш N0: 37; РР3, имеющий аминокислотную последовательность 8ЕР Ш N0: 38; и РР4, имеющий аминокислотную последовательность 8ЕР Ш N0: 39. Идентифицированные аминокислотные последовательности могут иметь одну или несколько аминокислотных замен (например, в результате созревания аффинности) или одну или две консервативные аминокислотные замены.
При рассмотрении всей их длины вариабельные области антител к РС8К9, предлагаемых в настоящем изобретении, как правило, должны включать полную вариабельную область (например, РК1-СИК1РК2-СПК2-РК3-СПК3-РК4), аминокислотная последовательность которой идентична по меньшей мере примерно на 85%, например по меньшей мере примерно на 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% аминокислотной последовательности вариабельной области соответствующей человеческой зародышевой линии. Например, аминокислотная последовательность тяжелой цепи антител к РС8К9 может быть идентична по меньшей мере примерно на 85, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% аминокислотной последовательности УН1-02 вариабельной области человеческой зародышевой линии. Аминокислотная последовательность легкой цепи антител к РС8К9 может быть идентична по меньшей мере примерно на 85, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% аминокислотной последовательности УК3 Ь6 вариабельной области человеческой зародышевой линии. В некоторых вариантах осуществления изобретения добавление, удаление путем делеции или замену аминокислот осуществляют только в каркасных участках. В некоторых вариантах осуществления изобретения при сравнении с целью определения идентичности исключают СИ3.
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела к РС8К9, предлагаемые в изобретении, содержат вариабельную область тяжелой цепи, аминокислотная последовательность которой по меньшей мере на 85, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи, которая представлена в 8ЕР Ш N0: 40, и содержат вариабельную область легкой цепи, аминокислотная последовательность которой по меньшей мере на 85, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи, которая представлена в 8ЕР Ш N0: 41 (т.е. консенсусные последовательности).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела к РС8К9, предлагаемые в изобретении, содержат вариабельную область тяжелой цепи, аминокислотная последовательность которой по меньшей мере на 85, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи, которая представлена в 8ЕР Ш N0: 1, и содержат вариабельную область легкой цепи, аминокислотная последовательность которой по меньшей мере на 85, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи, которая представлена в 8ЕР Ш N0: 15 (т.е. последовательностям мышиного антитела ЬРИ720).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела к РС8К9, предлагаемые в изобретении, содержат вариабельную область тяжелой цепи, аминокислотная последовательность которой по меньшей мере на 85, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи, которая представлена в 8ЕР Ш N0: 2, и содержат вариабельную область легкой цепи, аминокислотная последовательность которой по меньшей мере на 85, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи, которая представлена в 8ЕР Ш N0: 16 (т.е. последовательностям антитела ЬСТ-209).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела к РС8К9, предлагаемые в изобретении, содержат вариабельную область тяжелой цепи, аминокислотная последовательность которой по меньшей мере на 85, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи, которая представлена в 8ЕР Ш N0: 2, и содержат вариабельную область легкой цепи, аминокислотная последовательность которой по меньшей мере на 85, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи, которая представлена в 8ЕР Ш N0: 18 (т.е. последовательностям антитела ЬОТ-210).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела к РС8К9, предлагаемые в изобретении, содержат вариабельную область тяжелой цепи, аминокислотная последовательность которой по меньшей мере на 85, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи, которая представлена в 8ЕР Ш N0: 4, и содержат вариабельную область легкой цепи, аминокислотная последовательность которой по меньшей мере на 85, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи, которая представлена в 8ЕР Ш N0: 16 (т.е. последовательностям анти
- 21 032084 тела ЬСТ-211).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела к РС8К9, предлагаемые в изобретении, содержат полипептид тяжелой цепи, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 85, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи, которая представлена в 8ЕО ΙΌ N0: 3, и содержат полипептид легкой цепи, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 85, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи, которая представлена в 8Е0 ΙΌ N0: 17 (т.е. последовательностям антитела ЬСТ-209).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела к РС8К9, предлагаемые в изобретении, содержат полипептид тяжелой цепи, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 85, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи, которая представлена в 8Е0 ΙΌ N0: 3, и содержат полипептид легкой цепи, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 85, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи, которая представлена в 8Е0 ΙΌ N0: 19 (т.е. последовательностям антитела ЬСТ-210).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела к РС8К9, предлагаемые в изобретении, содержат полипептид тяжелой цепи, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 85, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи, которая представлена в 8Е0 ΙΌ N0: 5, и содержат полипептид легкой цепи, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 85, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи, которая представлена в 8Е0 ΙΌ N0: 17 (т.е. последовательностям антитела ЬСТ-211).
Для идентифицированных аминокислотных последовательностей, состоящих менее чем из 20 аминокислот, допустимо наличие одной или двух консервативных замен аминокислотных остатков, при этом все еще сохраняется требуемая специфичность связывания и/или антагонистическая активность.
Связывание антител к РС8К9, предлагаемых в настоящем изобретении, с РС8К9, как правило, характеризуется значением константы равновесия реакции диссоциации (Кс), составляющим менее чем примерно 10-8 или 10-9М, например менее чем примерно 10-10 или 10-11М, в некоторых вариантах осуществления изобретения менее чем примерно 10-12 или 10-13М.
Антитела к РС8К9 необязательно можно подвергать мультимеризации и применять согласно способам, предлагаемым в настоящем изобретении. Антитела к РС8К9 могут представлять собой полноразмерное тетрамерное антитело (т.е. антитело, включающее две легкие цепи и две тяжелые цепи), одноцепочечное антитело (например, кеРу) или молекулу, содержащую фрагменты антитела, которые образуют один или несколько антигенсвязывающих центров и определяют специфичность связывания с РС8К9, например содержат вариабельные области тяжелой и легкой цепей (например, РаЬ'-фрагмент или другие аналогичные фрагменты).
В изобретении предложены также полинуклеотиды, кодирующие представленные в настоящем описании антитела, например полинуклеотиды, кодирующие вариабельные области тяжелой или легкой цепи или описанные выше сегменты, которые содержат гипервариабельные участки. В некоторых вариантах осуществления изобретения нуклеотидная последовательность полинуклеотида, кодирующего тяжелую цепь, по меньшей мере на 85, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична последовательности полинуклеотида, выбранной из группы, включающей 8Е0 ΙΌ N0: 42, 8Е0 ΙΌ N0: 43 и 8Е0 ΙΌ N0: 54. В некоторых вариантах осуществления изобретения нуклеотидная последовательность полинуклеотида, кодирующего легкую цепь, по меньшей мере на 85, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична последовательности полинуклеотида, выбранной из группы, включающей 8Е0 ΙΌ N0: 44, 8ЕО ΙΌ N0: 45 и 8ЕО ΙΌ N0: 55.
В некоторых вариантах осуществления изобретения нуклеотидная последовательность полинуклеотида, кодирующего тяжелую цепь, по меньшей мере на 85, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична последовательности полинуклеотида, представленной в 8Е0 ΙΌ N0: 42. В некоторых вариантах осуществления изобретения нуклеотидная последовательность полинуклеотида, кодирующего легкую цепь, по меньшей мере на 85, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична последовательности полинуклеотида, представленной в 8Е0 ΙΌ N0: 45 (т.е. последовательностям, кодирующим антитело ЬСТ-209).
В некоторых вариантах осуществления изобретения нуклеотидная последовательность полинуклеотида, кодирующего тяжелую цепь, по меньшей мере на 85, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична последовательности полинуклеотида, представленной в 8Е0 ΙΌ N0: 42. В некоторых вариантах осуществления изобретения нуклеотидная последовательность полинуклеотида, кодирующего легкую цепь, по меньшей мере на 85, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична последовательности полинуклеотида, представленной в 8Е0 ΙΌ N0: 44 (т.е. последовательностям, кодирующим антитело ЬСТ-210).
В некоторых вариантах осуществления изобретения нуклеотидная последовательность полинуклеотида, кодирующего тяжелую цепь, по меньшей мере на 85, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или
- 22 032084
100% идентична последовательности полинуклеотида, представленной в 8ЕО ГО N0: 43. В некоторых вариантах осуществления изобретения нуклеотидная последовательность полинуклеотида, кодирующего легкую цепь, по меньшей мере на 85, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична последовательности полинуклеотида, представленной в 8Е0 ГО N0: 45 (т.е. последовательностям, кодирующим антитело ЬСТ-211).
В некоторых вариантах осуществления изобретения нуклеотидная последовательность полинуклеотида, кодирующего тяжелую цепь, по меньшей мере на 85, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична последовательности полинуклеотида, представленной в 8Е0 ГО N0: 54. В некоторых вариантах осуществления изобретения нуклеотидная последовательность полинуклеотида, кодирующего легкую цепь, по меньшей мере на 85, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична последовательности полинуклеотида, представленной в 8Е0 ГО N0: 55 (т.е. последовательностям, кодирующим мышиное антитело ЬРи720).
3. Анализы, которые можно применять для идентификации антител к РС8К9.
Антагонистические антитела можно идентифицировать путем создания антител к РС8К9 и последующего тестирования каждого антитела в отношении его способности снижать или ингибировать опосредуемые РС8К9 действия, например связывание с ЛПНПР, стимулирование расщепления ЛПНПР. Анализы можно осуществлять ίη νίΙΐΌ или ίη у1уо. Предпочтительными антителами являются антитела, которые связываются с РС8К9, не препятствуют связыванию РС8К9 с ЛПНПР и снижают или ингибируют опосредуемое РС8К9 расщепление ЛПНПР.
Связывание антител или антигенсвязывающих молекул с РС8К9 можно определять с помощью любого метода, известного в данной области, включая (но, не ограничиваясь только ими) ЕЫ8А, В1асогеанализ и Вестерн-блотинг.
Опосредуемое РС8К9 расщепление ЛПНПР также можно измерять с помощью любого известного в данной области метода. В одном из вариантов осуществления изобретения способность антитела к РС8К9 или антигенсвязывающей молекулы ингибировать расщепление ЛПНПР определяют на мышиной модели с использованием инфузии. Антитела к РС8К9 или антигенсвязывающие молекулы вводят мыши путем внутривенной инфузии (например, со скоростью 3 мкг/ч) и определяют уровни ЛПНПР в препаратах мембран клеток печени в сравнении с уровнями ЛПНПР в препаратах мембран клеток печени, взятых из организма мыши, которой вводили путем внутривенной инфузии контрольное антитело (например, антитело, которое связывается с неродственным антигеном). Следует ожидать, что у мышей, которым вводили антагонистические антитела к РС8К9, должны быть обнаружены значимо более высокие уровни ЛПНПР, например по меньшей мере на 10, 20, 50, 80, 100% выше, чем у мышей, которым вводили контрольное антитело.
Обладающие антагонистической активностью антитела к РС8К9 можно тестировать также с точки зрения их терапевтической эффективности в отношении снижения уровней ЛПНП-Х, не-ЛПВП-Х и/или общего холестерина в плазме. Для этой цели антитела к РС8К9 или антигенсвязывающие молекулы вводят путем внутривенной инфузии (например, со скоростью 3 мкг/ч) млекопитающему (например, мыши, крысе, примату кроме человека, человеку) и определяют уровни ЛПНП-Х, не-ЛПВП-Х и/или общего холестерина в плазме по сравнению с уровнями ЛПНП-Х, не-ЛПВП-Х и/или общего холестерина в плазме в организме того же млекопитающего до обработки или в организме млекопитающего, которому вводили путем внутривенной инфузии контрольное антитело (например, антитело, которое связывается с неродственным антигеном). Следует ожидать, что у млекопитающего, которому вводили обладающие антагонистической активностью антитела к РС8К9, должны быть обнаружены значимо более низкие уровни ЛПНП-Х, не-ЛПВП-Х и/или общего холестерина в плазме, например более низкие по меньшей мере на 10, 20, 50, 80, 100%, по сравнению с млекопитающим до обработки или млекопитающим, которому вводили контрольное антитело.
4. Композиции, содержащие антитела к РС8К9.
Изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим предлагаемые в изобретении моноклональные антитела к РС8К9 или антигенсвязывающие молекулы, приготовленным в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем. Композиции дополнительно могут включать другие терапевтические средства, которые можно применять для лечения или предупреждения данного нарушения. Фармацевтические носители усиливают или стабилизируют композицию или облегчают приготовление композиции.
Фармацевтически приемлемые носители включают растворители, дисперсионные среды, материалы для нанесения покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, агенты, придающие изотоничность, и замедляющие абсорбцию агенты и т.п., которые являются физиологически совместимыми.
Фармацевтическую композицию, предлагаемую в настоящем изобретении, можно вводить различными известными в данной области методами. Путь и/или метод введения варьируется в зависимости от требуемых результатов. Предпочтительным является внутривенное, внутримышечное, внутрибрюшинное или подкожное введение или введение в область, близкую к мишени. Фармацевтически приемлемый носитель должен быть пригодным для внутривенного, внутримышечного, подкожного, парентерального, интраназального введения, введения путем ингаляции, спинального или эпидермального введения (на
- 23 032084 пример, путем инъекции или инфузии). В зависимости от пути введения на действующее вещество, т.е. антитело, биспецифическую или мультиспецифическую молекулу, можно наносить покрытие из материала, защищающего соединение от воздействия кислот и других факторов окружающей среды, которые могут инактивировать соединение.
Антитела, индивидуально или в комбинации с другими пригодными компонентами, можно включать в состав аэрозольных препаратов (т.е. их можно распылять) для введения посредством ингаляции. Аэрозольные препараты можно помещать в пригодные находящиеся под давлением пропелленты, такие как дихлордифторметан, пропан, азот и т.п.
Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения композиция является стерильной и текучей. Требуемую текучесть можно поддерживать, например, с помощью применяемых для нанесения покрытий материалов, таких как лецитин, сохраняя требуемый размер частиц в случае дисперсий, и с помощью поверхностно-активных веществ. Во многих случаях предпочтительно следует включать придающие изотоничность агенты, такие как сахара, многоатомные спирты, такие как маннит или сорбит, или хлорид натрия. Можно получать предназначенные для инъекции композиции с пролонгированной абсорбцией, например, путем включения в композицию агента, который замедляет абсорбцию, такого как моностеарат алюминия или желатин.
Фармацевтические композиции, предлагаемые в изобретении, можно получать согласно методам, хорошо известным и общепринятым в данной области (см., например, КетюдФп: Тке 8аепсе апб Ргасбсе οΓ Рйагтасу, изд-во Маск РнЬккктд Οο., 21-е изд., под ред. ΡίρρίικοΙΙ V^11^атк и νίίΚίηκ, изд-во ИшгегкНу οΓ Ше 8аепсек ίη РкбабефЫа, 2005; и Майшба1е: Тке Сοтρ1еΐе Эгид КеГегепсе, под ред. 8тее1тап, изд-во Ркагтасеибса1 Ргекк., ^οηбοη. 2005, и Майтба1е, МаПтба1е: Тке Ех!га Рка^тасοροе^а. 31-е изд., изд-во Атег РкагтасеиРса1 Аккп, 1996, и 8ик1атеб апб СогПгоПеб Ке1еаке Эгид Ое1Кегу 8ук1етк, под ред. ЕК. ΚοΜ^ο^ изд-во Магсе1 Эеккег, Шс., №\ν ΥογΕ 1978). Фармацевтические композиции предпочтительно изготавливают в условиях, соответствующих требованиям надлежащей производственной практики (СМР). Как правило, применяют антитело к РС8К9 в терапевтически эффективной дозе или в эффективной дозе в составе фармацевтических композиций, предлагаемых в изобретении. Антитела к РС8К9 приготавливают в виде фармацевтически приемлемых лекарственных форм с помощью общепринятых методов, известных специалистам в данной области. Схему приема лекарственного средства регулируют для получения оптимального требуемого ответа (например, терапевтического ответа). При определении терапевтически или профилактически эффективной дозы можно сначала вводить низкую дозу и затем ступенчато повышать ее до достижения требуемого ответа при условии наличия минимальных побочных действиях или при их отсутствии. Например, можно применять однократную болюсную инъекцию, можно вводить несколько разделенных доз в течение определенного промежутка времени или дозу можно пропорционально понижать или повышать в зависимости от конкретной терапевтической ситуации. Наиболее целесообразно приготавливать композиции для парентерального введения в виде стандартных доз лекарственного средства, что облегчает их применение и однородность доз. Под стандартной дозой лекарственного средства в контексте настоящего описания понимают физически дискретные единицы, предназначенные для введения стандартных доз индивидууму, подлежащему лечению; каждая единица содержит предварительно определенное количество действующего вещества, которое согласно расчету должно обладать желаемым терапевтическим действием, в сочетании с требуемым фармацевтическим носителем.
Фактические уровни доз действующих веществ в фармацевтических композициях, предлагаемых в настоящем изобретении, можно варьировать таким образом, чтобы получать количество действующего вещества, эффективное для достижения требуемого терапевтического ответа у конкретного пациента, при использовании конкретной композиции и пути введения, и они не должны быть токсичными для пациента. Выбранный уровень доз зависит от различных фармакокинетических факторов, включая активность применяемых конкретных композиций, предлагаемых в настоящем изобретении, или сложного эфира, соли или амида, пути введения, времени введения, скорости выделения конкретного применяемого соединения, продолжительности лечения, других лекарственных средств, соединений и/или материалов, применяемых в сочетании с конкретными используемыми композициями, возраста, пола, веса, состояния, общего состояния здоровья и предыдущей истории болезни подлежащего лечению пациента и аналогичных факторов.
В некоторых вариантах осуществления изобретения фармакологические композиции содержат смесь, включающую антитело к РС8К9 или антигенсвязывающую молекулу и второе фармакологическое средство. Например, композиции могут содержать предлагаемое/предлагаемую в изобретении антитело к РС8К9 или антигенсвязывающую молекулу и средство, в отношении которого известно, что оно оказывает благоприятное действие, заключающееся в снижении уровней холестерина, включая ЛПНП-Х, неЛПВП-Х и общий холестерин, и/или повышении уровня ЛПВП-Х.
Примерами средств, пригодных для включения в смеси в качестве второго компонента в сочетании с предлагаемым/предлагаемой в настоящем изобретении антагонистическим антителом к РС8К9 или антигенсвязывающей молекулой, являются (но, не ограничиваясь только ими) ингибитор НМС-СгоАредуктазы (т.е. статин), фибраты (например, клофибрат, гемфиброзил, фенофибрат, ципрофибрат, без- 24 032084 афибрат), ниацин и его аналоги, ингибиторы абсорбции холестерина, секвестранты желчных кислот (например, холестирамин, колестипол, колесвелам), ингибитор транспорта желчных кислот в подвздошной кишке (ГВ АТ), миметики тиреоидного гормона (например, соединение КВ2115), ингибитор микросомального белка-переносчика триглицеридов (МТР), двойной агонист активируемого пероксисомальным пролифератором рецептора (РРАК) типа альфа и гамма, ингибитор ацилСоА:диацилглицеролацилтрансферазы (ЭСАТ), ингибитор ацил-СоА:холестеринацилтрансферазы (АСАТ), ингибитор белка, подобного белку Нимана Пика типа 1 (№С1-Ь1) (например, эзетиниб), агонист, белков С5 или С8 АТФ-связывающей кассеты (АВС), ингибитор белка-переносчика эфиров холестерина (СЕТР), нуклеиновую кислоту-ингибитор, мишенью которой является РС8К9, и нуклеиновую кислоту-ингибитор, мишенью которой является ароВ100. Снижающие уровень липидов средства известны в данной области и описаны, например, у Сообтап и СПтап, ТЕе РЕагтасо1одюа1 Вак1к оГ ТЕегареибск, 11-е изд., под ред. Вгийоп, Ьа/о и Рагкег, изд-во МсСга^-НШ, 2006; 2009 РНук1с1апк' Эекк КеГегепсе (РОК), например, 63-е изд., 2008, под ред. ТЕоткоп РОК.
Другие снижающие уровень липидов средства, которые можно применять в композициях, предлагаемых в настоящем изобретении, описаны и/или обобщены, например, в следующих публикациях: СЕапд и др., Сигг 0рш Эгид Э|ксо Оеуе1, 5(4), 2002, сс. 562-570; 8ибЕор и др., Эгидк, 62(16), 2002, сс. 2333-2347; Ваук и 81еш, Ехрей 0рш РЕагтасоШег, 4(11), 2003, сс. 1901-1938; Как1е1ет, Ш 1 С1ш Ргас! 8ирр1, Маг(134), 2003, сс. 45-50; Тотоба и 0тига, РЕагтасо1 ТЕег, 115(3), 2007, сс. 375-389; ТепепЬаит и др., Абу Сагбю1, 45, 2008, сс. 127-153; Тоткш, Э|аЬе1ек Саге, 31(2), 2008, сс. 241-248; Ьее и др., 1 М1сгоЬю1 Вю1есЕпо1, 18(11), 2008, сс. 1785-1788; 0Е и др., АгсЕ РЕагт Кек, 32(1), 2009, сс. 43-47; В1гсЕ и др., 1 Меб СЕет, 52(6), 2009, сс. 1558-1568; и Вах1ег и ^еЬЬ, №1иге Кеу1е^к Эгид П1ксоуегу, 8, 2009, сс. 308320.
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела к РС8К9 или антигенсвязывающие молекулы, предлагаемые в изобретении, применяют в смеси со статином. Примерами статинов являются (но, не ограничиваясь только ими) аторвастатин, церивастатин, флувастатин, ловастатин, мевастатин, питавастатин, правастатин, росувастатин и симвастатин.
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела к РС8К9 или антигенсвязывающие молекулы, предлагаемые в изобретении, применяют в смеси с фармакологическим средством, которое индуцирует гиперхолестеринемию или триглицеридемию. Например, второе фармакологическое средство может представлять собой ингибитор протеазы, например саквинавир, ритонавир, индинавир, нелфинавир, ампренавир, лопинавир, атазанавир, фосампренавир, типранавир, дарунавир, абакавирламивудин-зидовудин (тризивир). В некоторых вариантах осуществления изобретения второе фармакологическое средство представляет собой такролимус.
5. Способ применения антител к РС8К9.
а) Состояния индивидуума, подлежащего лечению антителами к РС8К9.
Обладающие антагонистической активностью антитела к РС8К9 и антигенсвязывающие молекулы, предлагаемые в изобретении, можно применять для лечения любого болезненного состояния, опосредуемого активностью или сверхактивностью РС8К9.
Например, введение обладающих антагонистической активностью антител к РС8К9 и антигенсвязывающих молекул, предлагаемых в изобретении, может оказывать благоприятное действие на индивидуумов, которые страдают или имеют риск развития дислипидемии или гиперхолестеринемии любого происхождения или этиологии. Например, индивидуум может страдать семейной или генетически наследуемой гомозиготной или гетерозиготной гиперхолестеринемией, для которой характерно наличие функционально активного гена ЛПНПР. Сведения о генетических мутациях, ассоциированных с и/или являющихся причиной семейной или генетически наследуемой гиперхолестеринемией, обобщены, например, у Витей и Ноорег, С1ш ВюсЕет Кеу, 29(1), 2008, сс. 11-26. Индивидуум может иметь также другие болезненные состояния или отклонение в поведении, которое вносит вклад или повышает риск развития дислипидемии или гиперхолестеринемии. Например, индивидуум может быть тучным или страдать диабетом или метаболическим синдромом. Индивидуум может быть курильщиком, вести малоподвижный образ жизни или употреблять пищу с высоким содержанием холестерина.
Направленное воздействие на РС8К9 можно применять для снижения, реверсии, ингибирования или предупреждения дислипидемии, гиперхолестеринемии и возникающей после приема пищи триглицеридемии (см., например, Ье Мау и др., Аг1епокс1ег ТЕготЬ Vаκс Вю1., 29(5), 2009, сс. 684-690; 8е1бай, Ехрей 0рш ТЕег Тагде1к, 13(1), 2009, сс. 19-28 и Ротег и др., 1 Вю1. СЕет., РМГО 19635789, 2009). Таким образом, введение предлагаемых в настоящем изобретении обладающих антагонистической активностью антител к РС8К9 и антигенсвязывающих молекул можно применять для снижения, реверсии, ингибирования или предупреждения дислипидемии, гиперхолестеринемии и возникающей после приема пищи триглицеридемии у индивидуума, нуждающегося в этом.
Предлагаемые в настоящем изобретении обладающие антагонистической активностью антитела к РС8К9 и антигенсвязывающие молекулы можно применять для снижения или уменьшения уровней холестерина липопротеинов низкой плотности (ЛПНП-Х) у индивидуума, нуждающегося в этом. Индивидуум может постоянно иметь повышенные уровни ЛПНП-Х. В некоторых вариантах осуществления изо
- 25 032084 бретения индивидуум имеет уровни ЛПНП-Х в плазме, существенно превышающие 80 мг/дл, например составляющие более 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 мг/дл или более. Предлагаемые в настоящем изобретении обладающие антагонистической активностью антитела к РСδК9 и антигенсвязывающие молекулы можно применять также для снижения или уменьшения уровней холестерина не липопротеинов высокой плотности (не-ЛПВП-Х), или общего холестерина у индивидуума, нуждающегося в этом.
Индивидуум может уже принимать другое фармакологическое средство для снижения уровня холестерина и он может обладать устойчивостью или интолерантностью к указанному средству. Например, индивидуум может уже проходить курс терапевтического лечения статином, который может оказаться неэффективным для данного индивидуума с точки зрения снижения уровней ЛПНП-Х, не-ЛПВП-Х или общего холестерина до приемлемых уровней. Индивидуум может обладать также интолерантностью к введению статина. Совместное введение предлагаемых в настоящем изобретении обладающих антагонистической активностью антител к РСδК9 и антигенсвязывающих молекул с вторым средством, которое можно применять для снижения уровней ЛПНП-Х или не-ЛПВП-Х и/или повышения уровня ЛПВП-Х, может повышать эффективность и переносимость второго средства, например, может позволять снижать дозы второго средства, предназначенного для введения.
В некоторых вариантах осуществления изобретения индивидуум несет мутацию, приводящую к усилению функции по доминантно-негативному типу гена РСδК9, например мутацию, которая приводит к аномальному усилению расщепления ЛИНПР.
В некоторых вариантах осуществления изобретения индивидуум принимает фармакологическое средство, которое индуцирует у него дислипидемию или гиперхолестеринемию, т. е. индивидуум обладает индуцируемой лекарственным средством дислипидемией или гиперхолестеринемией. Например, индивидуум может проходить курс терапевтического лечения ингибиторами протеаз, например, с целью лечения ВИЧ-инфекции. Другим фармакологическим средством, в отношении которого известно, что оно повышает уровни триглицеридов в плазме, является такролимус, иммуносупрессорное лекарственное средство, которое вводят пациентам, подвергнутым трансплантации. Было установлено, что циклоспорин вызывает существенное повышение уровней ЛИНП (см., например, Βа11аηίуηе и др., 78(5), 1996, сс. 532-5). Установлено, что дислипидемия ассоциирована также с введением антипсихотических лекарственных средств второго поколения (таких, например, как арипипразол, клозапин, оланзапин, кветиапин, рисперидон и зипрасидон) (см., например, Неибегкои, 1 С11и РкусЫаБу, 69(2), 2008, е04 и Βι^Ι^ и др., Сигг Р8усй1а!гу Вер, 11(1), 2009, сс. 33-40).
б) Введение антител к РСδК9.
Лечащий врач или ветеринар может сначала использовать антитела, предлагаемые в изобретении, которые входят в фармацевтическую композицию, в более низких дозах, чем дозы, требуемые для достижения соответствующего терапевтического действия, и постепенно повышать дозу до достижения требуемого действия. В целом, эффективные дозы композиций, предлагаемых в настоящем изобретении, варьируют в зависимости от ряда различных факторов, включая конкретное заболевание или состояние, подлежащее лечению, пути введения, место действия, физиологическое состояние пациента, является ли пациент человеком или животным, другие применяемые медикаментозные средства и то, является ли лечение профилактически или терапевтическим. Предназначенную для введения дозу необходимо титровать для оптимизации безопасности и эффективности. Введение антитела осуществляют в дозах, составляющих примерно от 0,0001 до 100 мг/кг и более предпочтительно от 0,01 до 5 мг/кг веса тела хозяина. Например, дозы могут составлять 1 или 10 мг/кг веса тела или находиться в диапазоне 1-10 мг/кг. Схема приема лекарственного средства может предусматривать ежедневное, еженедельное введение, введение каждые две недели, один раз в месяц или чаще или реже, если это необходимо или желательно. Например, схема приема лекарственного средства может предусматривать введение один раз в неделю, один раз каждые две недели, или один раз в месяц, или один раз каждые 3-6 месяцев.
В некоторых вариантах осуществления изобретения вводят полинуклеотид, кодирующий антитело к РСδК9 или антигенсвязывающую молекулу, предлагаемое/предлагаемую в изобретение. В тех вариантах осуществления изобретения, в которых агент представляет собой нуклеиновую кислоту, как правило, дозы могут составлять от примерно 0,1 вплоть до включительно примерно 100 мг/кг веса тела, предпочтительно от примерно 1 до примерно 50 мг/кг веса тела. В некоторых вариантах осуществления изобретения дозы составляют примерно 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40 или 50 мг/кг веса тела.
Антитело можно вводить в виде одной дозы или в виде разделенных доз. Антитело, как правило, вводят многократно. Можно использовать, например, следующие интервалы между каждым введением доз: еженедельно, каждые две недели, ежемесячно, каждые три месяца или ежегодно, если это необходимо или желательно. Интервалы могут также быть нерегулярными в зависимости от измеренных в крови пациента уровней антитела к РСδК9. В некоторых вариантах способа дозу регулируют с целью достижения концентрации антитела в плазме, составляющей примерно 1-1000 мкг/мл, а в некоторых вариантах способа -концентрации, составляющей примерно 25-300 мкг/мл. В альтернативном варианте антитело можно вводить в виде формы с замедленным высвобождением, в этом случае требуется меньшая частота введения. Доза и частота введения варьируются в зависимости от времени полужизни антитела в
- 26 032084 организме пациента. В целом, гуманизированные антитела обладают более длительным временем полужизни, чем химерные антитела и антитела из организмов кроме человека. Доза и частота введения может варьироваться в зависимости от того, является ли лечение профилактическим или терапевтическим. При применении в профилактических целях вводят относительно низкую дозу с относительно редкими интервалами в течение длительного периода времени. Некоторые пациенты продолжают прием лекарственного средства в течение всей оставшейся жизни. При терапевтическом применении иногда требуется использование относительно высокой дозы с введением через относительно короткие интервалы времени вплоть до снижения скорости развития заболевания или прекращения его развития и предпочтительно до частичного или полного облегчения симптомов заболевания у пациента. После этого пациента можно переводить на профилактический режим применения. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело к РС8К9 или антигенсвязывающий агент вводят в том случае, когда уровни ЛПНП-Х в плазме пациента поднимаются выше установленного порогового уровня, например составляют по меньшей мере примерно 80 мг/дл, например по меньшей мере примерно 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 мг/дл или выше.
в) Совместное введение с вторым агентом.
Обладающее антагонистической активностью антитело к РС8К9 можно применять в комбинации с агентами, в отношении которых известно, что они оказывают благоприятное действие с точки зрения снижения уровня холестерина, включая ЛПНП-Х, не-ЛПВП-Х и общий холестерин, и/или повышения уровня ЛПВП-Х.
Действующие вещества можно вводить вместе в виде смеси с обладающим антагонистической активностью антителом к РС8К9 или каждый агент можно вводить по отдельности. Агент, представляющий собой антитело, и другое действующее вещество можно (но это не является необходимым) вводить совместно.
Примерами вторых агентов, которые можно использовать для совместного введения с предлагаемым/предлагаемой в настоящем изобретении антагонистическим антителом к РС8К9 или антигенсвязывающей молекулой, являются (но, не ограничиваясь только ими) ингибитор НМО-СоА редуктазы (т.е. статин), фибраты (например, клофибрат, гемфиброзил, фенофибрат, ципрофибрат, безафибрат), ниацин и его аналоги, ингибиторы абсорбции холестерина, секвестранты желчных кислот (например, холестирамин, колестипол, колесвелам), ингибитор транспорта желчных кислот в подвздошной кишке (ΙΒΑΤ), миметики тиреоидного гормона (например, соединение КВ2115), ингибитор микросомального белкапереносчика триглицеридов (МТР), двойной агонист активируемого пероксисомальным пролифератором рецептора (РРАК) типа альфа и гамма, ингибитор ацил-СоА:диацилглицеролацилтрансферазы (ΌΟΑΤ), ингибитор ацил-СоА:холестеринацилтрансферазы (АСАТ), ингибитор белка, подобного белку Нимана Пика типа 1 (№С1-Ь1) (например, эзетиниб), агонист, белков 05 или 08 АТФ-связывающей кассеты (АВС), ингибитор белка-переносчика эфиров холестерина (СЕТР), нуклеиновую кислоту-ингибитор, мишенью которой является РС8К9, и нуклеиновую кислоту-ингибитор, мишенью которой является ароВ100.
Другие пригодные для применения снижающие уровень липидов средства описаны и/или обобщены, например, в следующих публикациях: Сйаид и др., Сигг Ορίη Эгид ЭЬсо Όενεί, 5(4), 2002, сс. 562570; 8иййор и др., Эгидк, 62(16), 2002, сс. 2333-2347; Ваук и δΐείη, Εχρεή Ορίη РйагтасоФег, 4(11), 2003, сс. 1901-1938; Как1е1ет, Ιηΐ 1 С1ш Ргас! 8ирр1, Маг(134), 2003, сс. 45-50; Тотойа и Отига, Рйагтасо1 Тйег, 115(3), 2007, сс. 375-389; ТененЫ-шт и др., Айх Сагйю1, 45, 2008, сс. 127-153; Тоткт, Э|аЬе1ек Саге, 31(2), 2008, сс. 241-248; Ьее и др., 1 МкгоЬю1 В^есйш^ 18(11), 2008, сс. 1785-1788; Ой и др., Агсй Рйагт Кек, 32(1), 2009, сс. 43-47; Впсй и др., 1 Мей Сйет., 52(6), 2009, сс. 1558-1568 и Вах1ег и ^еЬЬ, №1иге Еехаеххк Эгид О1ксохегу, 8, 2009, сс. 308-320.
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела к РС8К9 или антигенсвязывающие молекулы, предлагаемые в изобретении, применяют в смеси со статином. Примерами статинов являются (но, не ограничиваясь только ими) аторвастатин, церивастатин, флувастатин, ловастатин, мевастатин, питавастатин, правастатин, росувастатин и симвастатин.
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела к РС8К9 или антигенсвязывающие молекулы, предлагаемые в изобретении, применяют в смеси с фармакологическим средством, которое индуцирует гиперхолестеринемию или триглицеридемию. Например, второе фармакологическое средство может представлять собой ингибитор протеазы, например саквинавир, ритонавир, индинавир, нелфинавир, ампренавир, лопинавир, атазанавир, фосампренавир, типранавир, дарунавир, абакавирламивудин-зидовудин (тризивир). В некоторых вариантах осуществления изобретения второе фармакологическое средство представляет собой такролимус.
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела к РС8К9 или антигенсвязывающие молекулы, предлагаемые в изобретении, вводят совместно с нуклеиновой кислотой-ингибитором (например, К1РНК, т1РНК, антисмысловой последовательностью, рибозимом), специфической мишенью которой является РС8К9 или ароВ100.
6. Наборы.
Фармацевтические композиции, предлагаемые в настоящем изобретении, можно включать в состав
- 27 032084 набора. В конкретных вариантах осуществления изобретения набор, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит представленное/представленную в настоящем описании антагонистическое антитело к РС8К9 или антигенсвязывающую молекулу, предлагаемое/предлагаемую в изобретении. Антитела к РС8К9 или антигенсвязывающие молекулы могут присутствовать в одинаковых или различных дозах.
В некоторых вариантах осуществления изобретения наборы содержат одно или несколько вторых фармакологических средств, указанных в настоящем описании. Второе фармакологическое средство может присутствовать в той же самой препаративной форме или в препаративных формах, отличных от тех, которые содержат антитела к РС8К9 или антигенсвязывающие молекулы. Дозы первого и второго средств независимо друг от друга могут быть одинаковыми или различными.
В некоторых вариантах осуществления изобретения наборы содержат обладающее антагонистической активностью антитело к РС8К9 и одно или несколько средств, в отношении которых известно, что они оказывают благоприятное действие с точки зрения снижения уровней холестерина, включая ЛПНПХ, не-ЛПВП-Х и общего холестерина, и/или повышения уровня ЛПВП-Х.
Примерами вторых агентов, которые можно включать в наборы с предлагаемым/предлагаемой в настоящем изобретении обладающим антагонистической активностью антителом к РС8К9 или антигенсвязывающей молекулой, являются (но, не ограничиваясь только ими) ингибитор НМС-СоА редуктазы (т.е. статин), фибраты (например, клофибрат, гемфиброзил, фенофибрат, ципрофибрат, безафибрат), ниацин и его аналоги, ингибиторы абсорбции холестерина, секвестранты желчных кислот (например, холестирамин, колестипол, колесвелам), ингибитор транспорта желчных кислот в подвздошной кишке (1ВАТ), миметики тиреоидного гормона (например, соединение КВ2115), ингибитор микросомального белкапереносчика триглицеридов (МТР), двойной агонист активируемого пероксисомальным пролифератором рецептора (РРАК) типа альфа и гамма, ингибитор ацил-СоА:диацилглицеролацилтрансферазы (ОСАТ), ингибитор ацил-СоА:холестеринацилтрансферазы (АСАТ), ингибитор белка, подобного белку Нимана Пика типа 1 (№С1-Ь1) (например, эзетиниб), агонист, белков С5 или С8 АТФ-связывающей кассеты (АВС), ингибитор белка-переносчика эфиров холестерина (СЕТР), нуклеиновую кислоту-ингибитор, мишенью которой является РС8К9, и нуклеиновую кислоту-ингибитор, мишенью которой является ароВ100.
Дополнительные пригодные для включения в наборы снижающие уровень липидов средства описаны и/или обобщены, например, в следующих публикациях: Сйапд и др., Сигг Орт Эгид Э|ксо Оемек 5(4), 2002, сс. 562-570; 8иб1юр и др., Эгидк, 62(16), 2002, сс. 2333-2347; Ваук и 8!ет, Ехрей Орт РйагтасоФег, 4(11), 2003, сс. 1901-1938; Как!е1еш, 1п1 1 С1ш Ргас! 8ирр1, Маг(134), 2003, сс. 45-50; Тотоба и Отига, Рйагтасо1 Тйег, 115(3), 2007, сс. 375-389; ТепепЬаит и др., Абу Сагбю1, 45, 2008, сс. 127-153; Тоткт, Э|аЬе1ек Саге, 31(2), 2008, сс. 241-248; Ьее и др., 1 МкгоЬю1 Вю!есЬпо1, 18(11), 2008, сс. 1785-1788; Ой и др., Агсй Рйагт Кек, 32(1), 2009, сс. 43-47; Вйс11 и др., 1 Меб Сйет, 52(6), 2009, сс. 1558-1568 и Вах!ег и ^еЬЬ, №11иге Кеу1е^к Эгид П1ксоуегу, 8, 2009, сс. 308-320.
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела к РС8К9 антитела или антигенсвязывающие молекулы, предлагаемые в изобретении, включают в наборы вместе со статином. Примерами статинов являются (но, не ограничиваясь только ими) аторвастатин, церивастатин, флувастатин, ловастатин, мевастатин, питавастатин, правастатин, росувастатин и симвастатин.
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела к РС8К9 или антигенсвязывающие молекулы, предлагаемые в изобретении, включают в наборы вместе с фармакологическим средством, которое индуцирует гиперхолестеринемию или триглицеридемию. Например, второе фармакологическое средство может представлять собой ингибитор протеазы, например саквинавир, ритонавир, индинавир, нелфинавир, ампренавир, лопинавир, атазанавир, фосампренавир, типранавир, дарунавир, абакавирламивудин-зидовудин (тризивир). В некоторых вариантах осуществления изобретения второе фармакологическое средство представляет собой такролимус.
Примеры
Приведенные ниже примеры предназначены для иллюстрации изобретения, но они не ограничивают объем заявленного изобретения.
Пример 1. Создание и идентификация антагониста РС8К9 КУРЬРи720.
Краткое изложение.
Были проведены исследования с целью создания функционального обладающего антагонистической активностью антитела к РС8К9. Был идентифицирован целый ряд гибридом, которые секретировали антитело, обладающее способностью связываться с несущей Н1к-метку версией белка. Антитела, полученные с использованием гибридом, оценивали с точки зрения их функциональной антагонистической активности по их способности ингибировать опосредуемое РС8К9 расщепление рецептора ИПНП на клетках линии НерС2, в результате которого повышается способность указанных клеток поглощать холестерин ЛПНП. Было идентифицировано обладающее выраженной функциональной способностью мышиное моноклональное антитело к человеческой РС8К9 в виде 1дС1 -каппа, которое обозначили как КУР-ЬРи720 (ЕРИ720).
Методы.
Антиген и другие белки.
- 28 032084
Создавали стабильно экспрессирующую клеточную линию, которая секретировала человеческий белок РСδК9, путем трансфекции клеток НЕК293 Егее§!у1е™ (фирма Iиν^ΐ^одеи, Карлсбад, шт. Калифорния). В целом метод заключался в следующем: клетки, которые культивировали в среде Егее§!у1е™ (фирма Шуиодеп), дополненной 10% фетальной телячьей сыворотки, в виде прикрепленной культуры в колбах типа ВюСоа! (фирма ВесЮп Оюкпъоп) трансфектировали с использованием реагента для трансфекции ЫроГес1атте 2000™ и рекомбинантной плазмиды, несущей сигнальную последовательность меллитина, зрелую кДНК РСδК9 (ак 31-692) и метку Ы§6 (δΕΟ ΙΌ N0: 57) на С-конце последовательности (клонирование осуществлялось Е.Натр!ои, СИЕ, НРИ 010051). Через 48 ч после трансфекции начинали отбор позитивных трансфектантов, для чего в среду для культивирования добавляли 100 мкг/мл зеоцина. Через четыре недели было выявлено четыре стабильных клеточных пула клеток, продуцирующих РСδК9. Пул 4, оказавшийся наиболее эффективным продуцентом, адаптировали к условиям суспензионного культивирования в бессывороточной среде Егеейу1е™, и затем масштаб производства увеличивали до крупномасштабного производства с использованием биореактора типа \¥ауе'™, позволяющего получать продукт в объеме, составляющем 10-20 л.
В течение определенного периода времени осуществляли несколько циклов производства, получая рекомбинантный белок с выходом от 12 до 30 мг/л. Собирали клеточные супернатанты и концентрировали путем фильтрации в поперечном потоке. Полученный концентрат вносили на №№ГА НЦ-ВшП διψο Г1о\\-колонку объемом 25 мл (уравновешенную с помощью смеси 50 мМ Трис/300 мМ N<10/1 мМ СаС12/2 мМ β-меркаптоэтанол, рН 7,4) при скорости потока 0,5 мл/мин. После исходной промывки с использованием смеси 50 мМ Трис/300 мМ №1С1/20 мМ имидазол, рН 7,4, осуществляли элюцию связанного продукта с использованием смеси 50 мМ Трис/300 мМ №1С1/250 мМ имидазол, рН 7,4. Полученный элюат подвергали диализу в противотоке ЗФР, рН 7,3, стерилизовали фильтрацией и разделяли на аликвоты. Образец анализировали с помощью аналитической гель-фильтрации с целью определения степени олигомеризации. На ЖХВР-хроматограмме, полученной для очищенного белка, видны два пика, на долю основного пика приходилось 85%. Анализ с помощью ЖХВР-ΕδI-ΜС позволил установить, что масса полноразмерного белка составляла 58176,0 Да, что находилось в соответствии с ожидаемой массой белка меллитин-ЫРс8к9, ак31-692-Н18, в котором все остатки цистеина окислены. Часть белков в образце была дополнительно ^гликозилирована. Представлявший собой примесь белок, масса которого составляла примерно 13 кДа, наиболее вероятно представлял собой свободный пре-домен белка. Соответствующие гомологи Рсзк9 мыши и обезьяны циномолгус получали путем крупномасштабной кратковременной экспрессии также с использованием клеток НЕК293 Егее§!у1е, которые культивировали в бессывороточной среде Егееь(у1е в виде суспензионной культуры. Егее8!у1е-клеткн трансфектировали рекомбинантными плазмидами, несущими кДНК Рсзк9 мыши с нативной лидерной последовательностью и Ы§6-меткой (δΕΟ ΙΌ N0: 57) на С-конце и Рсзк9 обезьяны циномолгус (супо Рсзк9) с лидерной последовательностью СО33 и С-концевой Ы§6-меткой (δΕΟ ΙΌ N0: 57), с использованием полиэтиленимина в качестве носителя плазмидной ДНК в соотношении 1:3 (ДНК:ПЭИ, мкг/мл). Циклы производства осуществляли в биореакторах типа \Уауе'™ объемом 10 л; очистку и характеризацию белка проводили согласно протоколам, аналогичным тем, которые описаны выше для человеческого белка Рсзк9. Выход мышиного белка Рсзк9 составлял от 0,7 до 2,7 мг/л культуры, выход белка супо Рсзк9 составлял 3,1 мг/л.
Создание гибридом.
Иммунизация мышей и получение гибридом.
Очищенный белок Рсзк9 разводили в соотношении 1:1 неполным адъювантом Фрейнда перед осуществлением иммунизации трансгенных мышей линии Вс1-2 (штамм С57ВЬ/6-Тдп (Ьс1-2) 22 \\ге1и). Мышей иммунизировали с помощью процедуры, которую называют повторной иммунизацией в нескольких сайтах (КереШуе ИптишхаИоп а! Μи1ΐ^р1е δ^ΐе8, ΚΙΜΜδ). В целом метод заключался в следующем: мышам вводили 1-3 мкг антигена путем инъекции в 8 определенных сайтов, расположенных вблизи перифернческнх лимфатических узлов (РВУ). Эту процедуру повторяли 6 раз в течение 12-дневного периода. В день 12 отбирали образцы крови и определяли с помощью ΕΝδΆ титр антитела в сыворотке. В день 15 удаляли объединенные РИН из мышей с высоким титром. Для сбора лимфоцитов РИН дважды отмывали чистой средой ΌΜΕΜ и затем подвергали диссоциации, пропуская через сито с размером отверстий 0,22 мкм (фирма Еа1соп, № 352350). Полученные лимфоциты дополнительно отмывали два раза перед осуществлением слияния. Клетки миеломы линии №0/Вс1-2 смешивали с лимфоцитами в соотношении 2,5:1 (лимфоциты:№0-клетки). Смесь клеток центрифугировали, и затем к клеточному дебрису добавляли по каплям в течение 1 мин 1 мл ПЭГ 1500. Через 30 с медленно добавляли 1 мл среды ΌΜΕΜ и спустя 1 мин добавляли 19 мл среды ΌΜΕΜ в течение 5 мин. Слитые клетки пеллетировали, ресуспендировали с плотностью 2х105 клеток/мл в среде НАТ (ΌΜΕΜ+20% ΕВδ, Реп^!гер/С1и, 1х№АА, 1хНАТ, 0,5xНΕСδ) и выдерживали при 37°С в течение 1 ч. Затем клетки высевали в 384-луночные планшеты из расчета 60 мкл/лунку.
Скрининг гибридом, секретирующих функциональные антитела к Рсзк9.
Через 10 дней после слияния осуществляли скрининг гибридом на планшетах в присутствии Рсзк9специфического антитела. Для осуществления скрининга методом Ε^IδА 384-луночные планшеты типа
- 29 032084
Мах^гр (фирма №пс, № 464718) сенсибилизировали с помощью 50 мкл белка Рс§к9 (разведенного до концентрации 15 нг/лунку в ЗФР) и инкубировали в течение ночи при 4°С. Оставшийся белок удаляли путем аспирации, и лунки блокировали с использованием 1% БСА в ЗФР. После инкубации в течение 30 мин при комнатной температуре лунки четыре раза отмывали с помощью ЗФР+0,05% Твин (ЗФРТ). 15 мкл супернатанта гибридом переносили на планшеты для ЕЬ18А. 15 мкл мышиной сыворотки, взятой в момент удаления РБН разводили в соотношении 1:1000 в ЗФР и добавляли в качестве положительного контроля. Во все лунки на планшетах для ЕЫ8А добавляли по 50 мкл вторичного антитела (козье антимышиное антитело в виде 1дС, конъюгированное с НКР (фирма .Гасктоп Ιιηιηιιπο Кекеагск, № 115-035071), разведенное в соотношении 1:5000 в ЗФР). После инкубации при комнатной температуре в течение 1 ч планшеты отмывали восемь раз с помощью ЗФРТ. Добавляли 25 мкл ТМВ (фирма КРЬ, № 50-76-05), и после инкубации в течение 30 мин при комнатной температуре осуществляли считывание планшетов при длине волны поглощения 605 нм. Клетки из положительных лунок размножали на 24-луночных планшетах в среде НТ (ΌΜΕΜ+20% РВ8, Реп/81гер/С1и, 1хИЕАА, 1хНТ, 0,5хНРС8).
Очистка антитела.
Супернатант, содержащий ЬРи720, очищали с помощью хроматографии на белке С (фирма Ир^ае, № 16-266 (Биллерика, шт. Массачусетс)). Перед внесением супернатанта смолу уравновешивали с использованием ЗФР, взятого в объеме, равном 10 объемам колонки. После связывания образца колонку промывали ЗФР, взятым в объеме, равном 10 объемам колонки, и затем осуществляли элюцию антитела с использованием 0,1М глицина, рН 2,0, в объеме, равном 5 объемам колонки. Вышедшие из колонки фракции сразу нейтрализовали с использованием Трис-НС1, рН 9,0, в объеме, равном 1/10 объема колонки. Измеряли ОП280 фракций, позитивные фракции объединяли и подвергали в течение ночи диализу в противотоке ЗФР, рН 7,2.
Кинетические характеристики связывания и В1атоге-анализ.
Определение кинетических параметров связывания осуществляли методом поверхностного плазмонного резонанса с использованием оптического биосенсора В|атоге 851. Эта технология позволяет определять без использования метки микроскопические константы связывания (ассоциации) (ка) и диссоциации (кб) лиганда с рецептором. Поэтому указанная технология наиболее пригодна для характеризации взаимодействий антитело-антиген.
Изучение связывания Рс§к9 с ЬРИ720 (2 мкг/мл) проводили, осуществляя захват мышиного антитела кроличьим антителом к мышиному Рсу (фирма В1атоге, №ВК-1005-14), которое предварительно иммобилизовали на сенсорном чипе (сертифицированном) В|атоге 8ег1е§ 8 СМ-5 (фирма В1атоге, № ВК1005-30). Ковалентное связывание захватывающего антитела к Рсу осуществляли с использованием набора для аминного сочетания (фирма В1атоге, каталожный номер ВК-1000-50). Захватывающее антитело (кроличье антимышиное антитело) присоединяли к покрытой декстраном, активированным ЕЭС (этил-3[1-диметиламинопропил]карбодиимид), поверхности с использованием 50 мкг/мл раствора антитела к Рсу в 10 мМ ацетате натрия, рН 5 (фирма В1атоге, № ВК-1003-51) при скорости потока 10 мкл/мин. Белок Рс51<9 в диапазоне концентраций от 0,5 мкМ до 7,8 нМ (2-кратные серийные разведения) в ЗФР плюс 100 мМ №С1, 0,005% Р20 (фирма В1атоге, № ВК-1000-54) пропускали по поверхности чипа с иммобилизованным ЬРИ720. Полученные сенсограммы анализировали с помощью программного обеспечения В1атоге 851 Еуа1иа1юп. Осуществляли глобальную аппроксимацию результатов, полученных для всех концентраций, с использованием модели связывания 1:1 по Лэнгмюру.
ТК-РКЕТ-анализ.
ТК-РКЕТ-анализ осуществляли в 384-луночных белых неглубоких планшетах (фирма Регкт Е1тег, № 6008280). НРс5к9-АЕ (10,7 нМ) инкубировали с серийными разведениями немеченого белка НРс§к9, пептидом ЕСР-А или антителом ХУР-БЕи720-АХ-1 в течение 30 мин при комнатной температуре в 15 мкл буфера для анализа (20 мМ НЕРЕ8, рН 7,2, 150 мМ №С1, 1 мМ СаС12, 0,1 об.% Твин 20 и 0,1 мас./об.% БСА). После этого добавляли 5 мкл Н ЛПНПР-Еи (4 нМ) в буфере для анализа к предварительно инкубированному комплексу НРток9 и ХУР-БЕи720-АХ-1 и инкубировали при комнатной температуре в течение 90 мин. Конечные концентрации указанных меченых белков составляли 8 нМ для НРс5к9-АЕ и 1 нМ для Н ЛПНПР-Еи. ТК-РКЕТ-сигнал измеряли с помощью ридера для нескольких меток ЕпУщюп 2100 (фирмы Регк1п Е1тег) при длине волны возбуждения 330 нм и длине волны испускания 665 нм. Данные превращали в стандартизованные величины с использованием следующей формулы:
(величина, измеренная при 665 нм,х10000)/(величина, измеренная при 615 нм).
Процент ингибирования рассчитывали по следующей формуле:
100-[(стандартизованная величина для обработанного образца/средняя стандартизованная величина для необработанных образцов)х100].
Графики зависимости процента ингибирования от дозы строили с помощью программы Ргщт, версия 5, с использованием формулы
Υ=Вοΐΐοт+(Тор-Вοйοт)/(1+10Λ((^οдIС50-X)хН^1181οре))(программное обеспечение СгарНРаб Рпкт). Анализ оборачиваемости ЛПНПР.
Клетки линии НерС2 обрабатывали трипсином и высевали из расчета 6х104 клеток/лунку в 100 мкл
- 30 032084 культуральной среды в плоскодонные 96-луночные планшеты (фирма Со^η^ηд. № 3595), предварительно сенсибилизированные 1 об.% коллагена), затем инкубировали в течение 24 ч при 37°С в атмосфере, содержащей 5% С02. В целом, клетки обрабатывали 100 мкл бессывороточной среды, содержащей либо белок 1Рскк9, либо пептид ЕСЕ-А и/или антитело КУР-ЬЕи720-АХ-1. После обработки среду отбрасывали, и клетки отмывали с использованием 100 мкл ЗФР. Для сбора клеток добавляли 100 мкл Уегкте (фирма Вю^Ыйакег, № 17-771Е) и инкубировали в течение 1 ч при 37°С в атмосфере, содержащей 5% С02, после чего добавляли 100 мкл буфера для ЕАС8. Клетки переносили в 96-луночные планшеты с Vобразным дном (фирма Согшид, каталожный номер 3894) и центрифугировали при 1200 об/мин в течение 5 мин для пеллетирования клеток. Для того чтобы блокировать сайты неспецифического связывания на клетках, в каждую лунку добавляли по 50 мкл (100 мкг/мл) нормального кроличьего 1дС(фирма МР Ь1отеб1са18, № 55944) и мышиного 1дС (фирма 81дта, № Ι5381) в буфере для ЕАС8 и инкубировали в течение 30 мин на льду. Клетки центрифугировали при 1200 об/мин в течение 5 мин, и удаляли буфер путем стряхивания с планшета. Для мечения клеток в каждую лунку добавляли по 10 мкл меченного с помощью А1еха 647 кроличьего антитела к 11 ЛПНПР в виде 1дС (5 мкг/мл) и 10 мкл меченного с помощью фикоэритрина (РЕ) мышиного антитела к трансферрину-Н в виде 1дС (2 мкг/мл) (СЭ71, фирма Вес1ом Оюкпъои Еюкаеисек, № 624048) в буфере для ЕАС8 и инкубировали в течение 60 мин на льду. Клетки центрифугировали при 1200 об/мин в течение 5 мин, и удаляли буфер путем стряхивания с планшета. Несвязанные антитела удаляли путем двукратной отмывки клеток с использованием 200 мкл/лунку буфера для ЕАС8. Клетки фиксировали в 1% параформальдегида в ЗФР, жизнеспособные клетки выделяли с помощью дискриминационного окна (5000) и анализировали с использованием проточного цитометра ВО Ь8Н II и программного обеспечения ЕАС8Э1УА (фирма Вес1ои Пккткои). Медианные величины РЕфлуоресценции измеряли при длине волны возбуждения 488 нм и длине волны испускания 575 нм. Медианные величины А1еха 647-флуоресценции измеряли при длине волны возбуждения 488 нм и длине волны испускания 633 нм. Поликлональное кроличье антитело 583 в виде 1дС к 1 ЛПНПР было создано на заказ на фирме Соуаисе (Денвер, шт. Пенсильвания, США) для обнаружения методом ЕАС8 1 ЛПНПР, присутствующего на поверхности клеток линии НерС2. Кроличье антитело 583 в виде 1дС к 1 ЛПНПР характеризовалось примерно в 7 раз большим окном для обнаружения 1 ЛПНПР на поверхности клеток линии НерС2 по сравнению с нормальным кроличьем 1дС. Для определения специфичности антитела 583 в виде 1дС к 1 ЛПНПР в отношении ЛПНПР, присутствующих на поверхности клеток линии НерС2, проводили эксперимент с использованием белка 1 ЛПНПР в качестве конкурента для связывания с указанным 1дС. Было выявлено зависящее от дозы уменьшение средней флуоресценции антитела 583 в виде 1дС к 1 ЛПНПР в среде по сравнению с флуоресценцией от клеток линии НерС2 при увеличении концентраций белка 1 ЛПНПР. Это свидетельствует о том, что антитело 583 в виде 1дС к 1 ЛПНПР специфически распознает ЛПНПР, присутствующие на поверхности клеток линии НерС2, по данным ЕАС8-анализа. В последующих исследованиях использовали непосредственно меченное с помощью А1еха 647 антитело в виде 1дС к 1 ЛПНПР-583 для количественной оценки методом ЕАС8 ЛПНПР, присутствующих на поверхности клеток линии НерС2.
Поглощение ЛПНП-Х.
Клетки линии НерС2 обрабатывали трипсином и высевали из расчета 6х104 клеток на лунку в 100 мкл культуральной среды в плоскодонные 96-луночные планшеты (фирма Согишд, № 3595, которые предварительно сенсибилизировали 1 об.% коллагена), затем инкубировали в течение 24 ч при 37°С в атмосфере, содержащей 5% С02. Если не указано иное, то клетки обрабатывали 100 мкл бессывороточной среды, содержащей либо белок 1Рскк9, либо пептид ЕСЕ-А и/или антитело КУР-ЬЕи720-АХ-1. После обработки в каждую лунку вносили по 20 мкл (30 мкг/мл) меченного с помощью 3,3'диоктадецилиндолинкарбоцианина липопротеина низкой плотности (ΌίΙ-ЛПНП) (фирма 1и!гасе11, каталожный номер НР-077-175) в бессывороточной среде и инкубировали в течение 2 ч при 37°С в атмосфере, содержащей 5% С02. Среду удаляли путем стряхивания с планшетов, и лунки отмывали 100 мкл забуференного фосфатом физиологического раствора (ЗФР без кальция или магния, фирма Шуйгодеи, № 14190-144). ЗФР удаляли путем стряхивания с планшетов и в каждую лунку добавляли по 100 мкл смеси 0,25% трипсина-ЭДТК и инкубировали в течение 5 мин при 37°С в атмосфере, содержащей 5% С02. В каждую лунку добавляли по 100 мкл буфера для ЕАС8 (ЗФР, дополненный 5% ЕВ8, 2мМ ЭДТК и 0,2% азида натрия), и клетки пеллетировали путем центрифугирования при 1200 об/мин в течение 5 мин. Среду отбрасывали путем стряхивания с планшетов, и клетки фиксировали путем добавления 50 мкл/лунку 1% параформальдегида (фирма Е1ес!гои Мкгоксору 8^1^5, № 15710) в ЗФР. Жизнеспособные клетки выделяли с помощью дискриминационного окна и анализировали с помощью проточного цитометра ВЭ Ь8Н II и программного обеспечения ЕАС8Э1УА (фирма Вес!ои Оюкпъои). Медианную величину ΌίΙЛПНП-флуоресценции измеряли при длине волны возбуждения 488 нм и длине волны испускания 575 нм, при этом анализировали 5000 клеток. Столбиковые диаграммы строили с помощью программы Μίсгокой Ехсе1 2002 (фирма Мюгокой Согрогайои). Процент активации рассчитывали согласно следующей формуле: % активации=[1-(Х>А)]х100, где X обозначает среднюю величину флуоресценции от лунки, содержащей образец, и А обозначает среднюю величину флуоресценции от лунки, обработанной только
- 31 032084
ЬРсзк9.
Строили график зависимости процента активации от обработки для того, чтобы на основе кривых дозовой зависимости определять величины ЕС50 с использованием уравнения У=Во11от+(ТорВойот)/(1+10Л((ЬодЕС50-Х)хНШЗ1оре)) и программы СгаркРаб Рйзт, версия 5 (пакет программ СгаркРаб Зой^ате).
Результаты.
Создание моноклонального антитела к человеческому белку Рсзк9.
Собирали В-клетки из первичных лимфатических узлов животных, иммунизированных белком Рсзк9. Гибридомы создавали посредством стандартного опосредуемого ПЭГ слияния. Образовавшийся в результате слияния продукт анализировали с помощью ЕЫЗА, идентифицировали политивные в отношении связывания с человеческим Рсзк9 клоны и размножали, получая супернатанты. Было идентифицировано несколько позитивных по результатам ЕЫЗА клонов, которые затем сортировали с помощью функциональных анализов. Клон, который был идентифицирован в качестве наиболее перспективного кандидата, был обозначен как ЬЕИ720. Помимо указанного наиболее перспективного кандидата, т.е. ЬЕИ720, было идентифицировано несколько других клонов, которые не обладали способностью блокировать взаимодействие между Рсзк9 и ЛПНПР (по данным ЕЯЕТ-анализа), но которые после связывания с Рсзк9 могли блокировать способность Рсзк9 опосредовать расщепление ЛПНПР (по результатам оценки поглощения ЛПНП-Х), к ним относились клоны 21Ό6, 5А4-С1 и 13Е1. Было установлено, что клон 21Ό6 также обладал способностью блокировать опосредуемое Рсзк9 расщепление ЛПНПР ш у1уо.
Скрининг ЬЕИ720 в отношении специфичности связывания с Рсзк9.
Изучали специфичность ЬЕИ720 путем оценки методом ЕЫЗА его способности к связыванию с рядом других белков. Связывание ЬЕИ720 с тремя другими несущими ШЗ-метку белками сравнивали с его связыванием с Рсзк9-Н[З. Полученные результаты свидетельствовали о том, что связывание с Рсзк9 является специфическим и что антитело не связывается с ШЗ-меткой.
Оценка связывания ЬЕИ720 с Рсзк9 обезьяны циномолгус.
Оценивали связывание ЬЕИ720 с гомологом Рсзк9 из организма обезьяны циномолгус. Для этого анализа применяли супернатанты клеток, экспрессирующих несущий ШЗ-метку Рсзк9 обезьяны циномолгус, а также планшет с иммобилизованным N1, что позволило избежать необходимости осуществлять очистку материала. Человеческий Рсзк9 разводили и также иммобилизовали посредством его ШЗ-метки. Было установлено, что ЬЕИ720 обладал способностью связываться как с Рсзк9 человека, так и Рсзк9 обезьяны циномолгус. Клон 5Р20 по данным ЕЫЗА не обладал также способностью связываться с человеческим ЛННПР или мышиным Рсзк9.
Кинетические характеристики связывания ЬЕИ720.
Мышиное антитело ЬЕи720, которое распознает человеческий белок Рсзк9, анализировали в отношении его аффинности связывания с помощью метода на основе оптического биосенсора (фирма В1асоге). Было установлено, что ЬЕИ720 связывался с рекомбинантным человеческим Рсзк9 с высокой аффинностью, величина аффинности находилась в субнаномолярном диапазоне концентраций (Кс=200 пМ).
Скрининг ЬЕИ720 в отношении способности блокировать взаимодействие Рсзк9/ЛПНПР.
Для решения вопроса о том, может ли антитело к ЬРсзк9 НУР-ЫШ20 нарушать взаимодействие между мечеными белками 11Рсзк9-АЕ и к ЛПНПР-Ей, применяли ТЯ-ЕЯЕТ-анализ. Проводили оценку немеченого белка йРсзк9 или пептида ЕСЕ-А для демонстрации того, что анализ позволяет обнаруживать нарушение ТЯ-ЕЯЕТ-сигнала, создаваемого в результате взаимодействия меченых белков к ЛННПР-Еи и 11Рсзк9-АЕ. Было установлено, что немеченый кРсзк9, применяемый в возрастающих концентрациях, конкурировал с 11Рсзк9-АЕ за связывание с к ЛПНПР-Еи, что приводило к уменьшению ТЯ-ЕЯЕТсигнала. Пептид ЕСЕ-А нарушал взаимодействие между к ЛПНПР-Еи и ЬРс5к9-АЕ, что характеризовалось величиной КУо 2,5 мкМ. В отличие от этого антитело НУР-Ыи720 лишь незначительно снижало ТЯ-ЕЯЕТ-сигнал, генерируемый в результате взаимодействия между йРс5к9-Еи и к ЛПНПР-АЕ, что характеризовалось величиной ΙΟ50, превышающей 1000 нМ, и для него был характерен ϋ-образный ответ при низких концентрациях антитела.
Скрининг ЬЕи720 в отношении ингибирования опосредуемого Рсзк9 расщепления ЛПНПР.
Было продемонстрировано, что связывание Рсзк9 с ЛННПР приводило к расщеплению ЛПНПР, и это было подтверждено с использованием клеток линии НерС2 и рекомбинантного человеческого белка Рсзк9. Было установлено, что антитело ЬЕи720 обладало способностью связываться с Рсзк9 и блокировать его воздействие. Антитело НУР-Ыи720 ингибировало обработанные экзогенным 11Рсзк9 клетки линии НерС2 и приводило к увеличению количества находящихся на клеточной поверхности ЛПНПР.
Скрининг ЬЕи720 в отношении ингибирования Рсзк9 и восстановления поглощения ЛННП.
Ингибирование опосредуемого Рсзк9 расщепления ЛПНПР должно приводить к восстановлению способности клеток линии НерС2 интернализировать ЛПНП-Х. Было установлено, что антитело NVРЬЕи720 предупреждало опосредуемое Рсзк9 расщепление ЛПНПР на клетках линии НерС2, обработанных экзогенным йРсзк9, и приводило к повышению поглощения ΌίΙ-ЛПНП, что характеризовалось величиной ЕС50, составлявшей 99 нМ.
- 32 032084
Пример 2. Создание обладающих антагонистической активностью антител к РС8К9 NУР-^СТ209, У\Т-1.(. .Т210 и \АТ-1.(. .Т2И.
Введение.
В данном примере описано создание человеческих антител NУР-^СТ209, NУР-^СТ210 и NУР ЬСТ211 путем придания методами генной инженерии обладающему антагонистической активностью мышиному моноклональному антителу к РС8К9 NУР-^Рυ720 большей гомологии с последовательностью антитела человеческой зародышевой линии. Антитела NУР-^СТ209, NУР-^СТ210 и NУР ЬСТ211 сохраняли специфичность в отношении эпитопа, аффинность и перекрестную реактивность к РС8К9 макака циномолгус, характерную для родительского мышиного антитела, а именно NУР-^Рυ720. Последовательности антител NУР-^СТ209, NУР-^СТ210 и NУР ЬСТ211 обладали намного более высокой степенью гомологии с последовательностью человеческой зародышевой линии, чем исходное мышиное антитело, и следовательно человеческая иммунная система должна обладать большей толерантностью к ним.
Мышиное моноклональное антитело ЕРИ720 подвергали модификации с использованием нитапеегеб™-технологии (в результате чего создавали нитапеегеб™-антитело) для придания его белковой последовательности большего сходства с последовательностью человеческой зародышевой линии и снижения ее иммуногенности. нитапеегеб™-технология была разработана фирмой Ка1оВюк, Южный Сан-Франциско (см. меЬ-сайт ка1оЬюк.еот в сети Интернет). Применение нитапеегеб™-технологии к антителам позволяет создавать человеческие антитела, последовательности У-области которых обладают более высокой степенью гомологии с последовательностью человеческой зародышевой линии, сохраняя при этом специфичность и аффинность, характерные для родительского или референс-антитела (публикации патентов США 2005/0255552 и 2006/0134098). При осуществлении этого процесса сначала идентифицируют минимальные детерминанты специфического связывания с антигеном (Вшбшд 8рее1йейу Ве1егттап1, В8О) в вариабельных областях тяжелой и легкой цепей референс-РаЬ-фрагмента (как правило, они представляют собой участки последовательности, расположенные в С.ТЖ3 тяжелой цепи и С.ТЖ3 легкой цепи). Поскольку при конструировании всех библиотек с применением нитапееппд™процесса указанные В8Е) тяжелой и легкой цепей сохраняются, то каждая библиотека является эпитопсфокусированной, и в результате конечные полностью нитапеегеб™-антитела сохраняют специфичность в отношении эпитопа, характерную для исходного мышиного антитела.
Затем создавали библиотеки полноразмерных цепей (в которых вариабельная область легкой или тяжелой цепи целиком заменена на библиотеку соответствующих человеческих последовательностей) и/или кассетные библиотеки (в которых часть вариабельной области тяжелой или легкой цепи мышиного РаЬ-фрагмента заменена на библиотеку соответствующих человеческих последовательностей). Для экспрессии представителей библиотеки, представляющих собой РаЬ-фрагменты антитела, применяли бактериальную систему экспрессии, и осуществляли скрининг библиотеки для выявления РаЬ-фрагментов, которые связываются с антигеном, применяя метод анализа связывания с использованием переноса колоний (Со1опу-Ый Вшбшд Аккау, СЕВА). Осуществляли дополнительную характеризацию позитивных клонов для идентификации клонов, обладающих наиболее высокой аффинностью. Затем идентифицированные человеческие кассеты, которые сохраняли способность к связыванию, определяемую оставшимися частями мышиных последовательностей, объединяли для проведения конечного скрининга библиотеки с целью создания полностью человеческих У-областей.
Полученные нитапеегеб™-РаЬ-фрагменты, которые имели последовательности У-сегментов, выведенные из человеческих библиотек, сохраняли короткие В8О-последовательности, идентифицированные в СОК3-участках, и имели каркасные участки 4 человеческой зародышевой линии. Указанные РаЬфрагменты превращали в полноразмерные ^С путем клонирования вариабельных областей тяжелой и легкой цепей в векторах, предназначенных для экспрессии Ι§& Полноразмерные нитапеегеб™-антитела сохраняли специфичность связывания, присущую родительскому мышиному антителу, как правило, обладали эквивалентной или более высокой по сравнению с родительским антителом аффинностью к антигену и имели последовательности У-областей, обладающие на белковом уровне более высокой степенью идентичности с генами антител человеческой зародышевой линии.
Методы.
Клонирование мышиных У-областей.
Амплифицировали с помощью ОТ-ПЦР ДНК У-области мышиного моноклонального антитела NУР-^Рυ720 из РНК, выделенной из клеточной линии гибридомы с применением стандартных методов. В качестве праймеров, которые успешно применяли для ПЦР-амплификации вариабельной области тяжелой цепи из кДНК гибридомы, использовали УЫ4 (5’-СТТССТОАТООСАОТООТТ-3’· цд ΝΟ: 5$) (Сйагбек Т. и др., РЕВ8 Еейегк; 1999, 452(3) е. 386-394) и нСеопк1ап! (5’-ОСОТСТАОААУСТССАСАСАСА(3(ЖК.сСА(ЗТООАТАОАС-3’· ц) ΝΟ: 59). В качестве праймеров, которые успешно применяли для ПЦР-амплификации вариабельной области легкой (каппа) цепи из кДНК гибридомы, использовали Ук4/5 (5’-тсаосттсутостаатсаото-з’; 8Е(^ ΙΌ ΝΟ: 60) (Сйагбез Т. и др., 1999, выше) и ЕСсоп81аи1 (5’-ОСОТСТАОААСТООАТООТОООААОАТОО-3’; §Е(^ ΙΌ ΝΟ: 61). Амплифицированные
- 33 032084 вариабельные области тяжелой и легкой цепей подвергали секвенированию. Затем применяли ПЦР для амплификации ν-генов и интродукции распознаваемых рестриктазами сайтов, необходимых для клонирования в векторах фирмы КаЪВюз: Vк в КВ1292-Н18 (модифицированная версия КВ 1292, которая кодирует С-концевой гибкий линкер и метку 6-Н18 (8ЕО ГО N0: 57) аминокислотной последовательности ААОА8НННННН 1О N0: 62) на Сш) В сайтах ΝοοΙ (5') и ΝΙιεΙ (3'); Ук в КВ1296 в сайтах ΝοοΙ (5') и ΙΓίνΊ (3'). Затем указанные отдельные векторы для тяжелой и легкой цепей объединяли с получением одного дицистронного экспрессионного вектора фирмы КаЬВюк для экспрессии ЕаЬ-фрагмента посредством расщепления с помощью ВккНП и СШ и последующего встраивания путем лигирования. С использованием указанного вектора осуществляли экспрессию ЕаЬ-фрагментов в Е. с()Н. Полученный ЕаЬфрагмент тестировали в отношении его способности к связыванию с антигеном РС8К9 и его обозначили как референс-ЕаЬ-фрагмент 8К032.
Очистка ЕаЬ-фрагментов.
Экспрессию ЕаЬ-фрагментов осуществляли путем секреции из Е. шН с использованием экспрессионных векторов фирмы КаЬВюк. Клетки выращивали в 2xΥТ-среде до достижения ОП600 ~0,6. Экспрессию индуцировали путем добавления изопропилтиогалактозида (ИПТГ) до достижения концентрации 100 мкМ и встряхивания в течение 4 ч при 33°С. Полученный в результате сборки ЕаЬ-фрагмент выделяли из периплазматических фракций посредством осмотического лизиса и очистки с помощью аффинной хроматографии с использованием Χί-ХТА-ко.юнок (ΚκΊτιρ НР-колонки; фирма ОЕ НеаЙксаге, № 175247-01) согласно стандартным методам. ЕаЬ-фрагменты элюировали с использованием буфера, содержащего 500 мМ имидазол, и подвергали тщательному диализу в противотоке ЗФР, ρΗ 7,4, без кальция и магния.
Создание библиотеки.
В качестве первого этапа создания библиотеки конструировали эпитопсфокусированные библиотеки полноразмерных человеческих ν-областей путем ПЦР-амплификации последовательностей человеческих ν-сегментов из КаЬВюк-библиотеки. Для получения указанных библиотек полноразмерных цепей уникальные СПК3-ЕК4-участки, содержащие В81), и последовательности 1-сегмента человеческой зародышевой линии из оптимизированного референс-ЕаЬ-фрагмента 8К038 присоединяли к библиотекам человеческих ν-сегментов с помощью перекрывающейся ПЦР. Эти библиотеки полноразмерных Vобластей не подвергали непосредственному скринингу; вместо этого их использовали в качестве матриц для конструирования промежуточных Хк- и Vк-библиотек. КаЬВюк-библиотеки человеческих Vсегментов, используемые для создания библиотек полноразмерных цепей, отбирали таким образом, чтобы они обладали максимальным сходством с исходными мышиными Vк и Vк в СЭК-участках. Последовательности СЭК исходной мышиной Vк антитела NХР-^Ευ720 наиболее близки к последовательностям СЭК Х'111-02 человеческой зародышевой линии, поэтому для получения библиотеки полноразмерной Vк использовали смесь двух КаЬВюк-библиотек, которые содержали представителей подгруппы \'Ιι 1 (КВ 1410 и КВ1411). Аналогично этому, поскольку последовательности СЭК Vк NХР-^Ευ720 оказались наиболее сходными с последовательностями СЭК Vк3 1.6 человеческой зародышевой линии, то для получения библиотеки полноразмерной Vк использовали смесь двух Ка^Вюк-библиотек человеческих Vсегментов, которые содержали представителей подгруппы Vк3 (КВ 1423 и КВ 1424). Затем указанные библиотеки полноразмерных Vк и Vк использовали в качестве матриц для конструирования кассетных библиотек, в которых только часть родительского мышиного ν-сегмента заменяли на библиотеку человеческих последовательностей. С помощью мостиковой ПЦР конструировали кассеты двух типов: кассеты типа ГгопГепб, содержащие человеческие последовательности в ЕК1, С1Ж1 и первой части ЕК2, амплифицировали из смеси библиотек \'Ιι1 (КВ1410 и КВ1411) или смеси библиотек Vк3 (КВ1423 и КВ1424), описанных выше, используя их в качестве матриц. Кассеты типа т1бб1е, содержащие человеческие последовательности в последней части ЕК2, С1Ж2 и ЕК3, амплифицировали, используя описанные выше библиотеки полноразмерных человеческих Хк- или Vк-областей в качестве матриц. Хккассеты содержали перекрывающиеся общие последовательности в ЕК2 в аминокислотных положениях 45-49 (нумерация по Кэботу); Vк-кассеты содержали перекрывающиеся общие последовательности в ЕК2 в аминокислотных положениях 35-39 (нумерация по Кэботу). Таким путем с помощью ПЦР конструировали библиотеки человеческих кассет типа ΓΐΌΐιΙ-етГ и шикПе для человеческих изотипов Vобласти тяжелой цепи 1 и ν-области легкой каппа-цепи 3. Каждую библиотеку Хк-кассет клонировали в векторе КВ1292-Н18 в NсοI (5') и (3'); каждую библиотеку Хк-кассет клонировали в векторе
КВ1296-В (модифицированная версия КаЬВюк-вектора КВ 1296, содержащая молчащий сайт НтбШ, добавленный в ЕК4) в NсοI (5') и НтбШ (3'). Затем полученные библиотеки Хк- или Хк-плазмид объединяли с комплементарной цепью из оптимизированного референс-ЕаЬ-фрагмента 8К038 (например, Хкбиблиотеку типа ГгопЕепб объединяли с вектором, несущим оптимизированную референс-Хк-кассету) путем расщепления с помощью ВккНП и СШ и последующего встраивания путем лигирования с получением библиотек дицистронных векторов, экспрессирующих полноразмерные ЕаЬ-фрагменты.
Общая процедура ЕЫ8А.
Для всех анализов, проводимых методом ЕЬЕА, использовали рекомбинантный человеческий антиген РС8К9-Н1к6 или антиген РС8К9-Н1к6 макака циномолгус. Как правило, антиген РС8К9-Н1к6, раз
- 34 032084 веденный в ЗФР, рН 7,4, связывали в количестве 300 нг/лунку с поверхностью 96-луночного титрационного микропланшета путем инкубации в течение ночи при 4°С. Планшет блокировали с помощью 3%ного раствора БСА в ЗФР в течение 1 ч при 37°С и затем однократно отмывали с помощью ЗФРТ. После этого в каждую лунку добавляли содержащую РаЬ-фрагмент индуцированную клеточную среду или разведенный очищенный РаЬ-фрагмент (50 мкл). После инкубации в течение 1 ч при 37°С планшет трижды отмывали с помощью ЗФРТ. В каждую лунку добавляли конъюгат антитело к человеческой каппа-цепиНКР (фирма 81§та, № А7164), разведенный в соотношении 1:5000 в ЗФР (50 мкл), и планшет инкубировали в течение 45 мин при комнатной температуре. Планшет трижды отмывали с помощью ЗФРТ, затем добавляли 100 мкл субстрата 8игеВ1ие ТМВ (фирма КРЕ, № 52-00-03), и планшет инкубировали в течение примерно 10 мин при комнатной температуре. Планшет считывали при длине волны 650 нм с помощью спектрофотометра.
Для оценки специфичности методом ЕЫ8А очищенных человеческих и мышиных φ(.ι 384луночный планшет сенсибилизировали с использованием панели очищенных человеческих и мышиных антигенов из расчета 88 нг/лунку и инкубировали в течение ночи при 4°С. Планшет блокировали и отмывали согласно описанной выше процедуре, после чего в каждую лунку добавляли по 22 мкл очищенного мышиного или человеческого антитела к РС8К9, разведенного до концентрации 2 мкг/мл в ЗФР. Планшет инкубировали в течение 1 ч при 37°С, затем отмывали с помощью ЗФРТ. Антитело к мышиной Рс-области (фирма 1асккоп ^тимКе^ащЕ ЬаЬк, № 115-035-071) или антитело к человеческой каппацепи (фирма 81§та, № А7164), конъютированное с НКР, разводили в соотношении 1:5000 в ЗФР (25 мкл) и добавляли в каждую лунку. Планшет инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре, затем отмывали и проявляли согласно описанной выше процедуре.
Анализ связывания с использованием переноса колоний (СЕВА).
Скрининг библиотек Нитапеегеб™-РаЬ-фрагментов осуществляли практически следуя методу, описанному в публикациях патентов США 2005/0255552 и 2006/0134098, с использованием нитроцеллюлозных фильтров, сенсибилизированных РС8К9-НЕ6 в концентрации 6 мкг/мл. РаЬ-фрагменты, связанные с сенсибилизированным антигеном фильтром, обнаруживали с помощью конъюгированного с щелочной фосфатазой антитела к человеческой легкой каппа-цепи (фирма 8щта, каталожный номер А3813), разбавленного в соотношении 1:5000 в ЗФРТ, и блоты проявляли с использованием хемилюминесцентного субстрата ОиоЕих для щелочной фосфатазы (фирма Vесΐο^ ЕаЬога1опек, № 8К-6605).
Создание биотинилированного рекомбинантного белка РС8К9 и измерения аффинности.
Белок РС8К9, несущий С-концевую Άνΐ-метку (для сайт-направленного биотинилирования) и Н1к6метку (8ЕР ГО N0: 57) (РС8К9-.;\\т-1 Нк6), создавали путем встраивания сайта рестрикции ЕсоК между геном, кодирующим РС8К9, и Н1к6- (8ЕР ГО N0: 57) меткой в плазмиде рК85а/РС8К9; которая экспрессировала аминокислоты 31-692 РС8К9, регистрационный номер Ршрго! ^8NВР7, с С-концевой Н1к6(81'Т) ГО N0: 57) меткой). Олигонуклеотиды, кодирующие Άν^-метку (аминокислотная последовательность: θθθΡΝϋΙΡΕΑρκΐΕ\νΗΕ; ц) νο: 53) и фланкированные выступающими сайтами ЕсоК1, фосфорилировали с использованием полинуклеотидкиназы Т4 (фирма Iην^ΐ^οβеη), отжигали и затем встраивали путем лигирования в плазмиду рК85а/РС8К9 с использованием нового встроенного сайта ЕсоКР Клоны, содержащие Ап-метку, подтверждали путем анализа последовательности. Экспрессию РС8К9-Ау1-Н1к6 осуществляли в экспрессионной системе 293 Ргеек!у1е (фирма Iην^ΐ^οβеη), и секретированный рекомбинантный белок очищали с использованием смолы №-ЫТА (фирма ОЕАСИ'Х). После очистки белок РС8К9-Ау1-Н1к6 подвергали диализу в противотоке 10 мМ Трис, рН 8,0, 50 мМ №С1. Белок биотинилировали ш ν Иго с использованием биотин-протеинлигазы (фирма Άν^б^ίу) согласно протоколу производителя. После завершения продукт реакции подвергали диализу в противотоке ЗФР, рН 7,2, и наличие биотинилирования проверяли методом Вестерн-блоттинга, осуществляя зондирование конъюгированным с НКР стрептавидином.
Кинетические характеристики связывания ΦΑι- и РаЬ-фрагментов анализировали методом уравновешивающего титрования раствора (8о1ийоп ЕдиШЬпит Тйгайоп, 8ЕТ). В целом метод заключался в следующем: серийные разведения ЕРС8К9 добавляли к или РаЬ в концентрации 60 пМ и инкубировали в течение ночи. 96-луночный титрационный микропланшет типа 81апбагб Втб (фирма Меко 8са1е [)1ксо\'ечу) сенсибилизировали с помощью 1 мкг/мл ЕРС8К9 и инкубировали в течение ночи, отмывали с помощью ЗФР/0,05 мас./об.% Твин 20, блокировали с помощью ЗФР/5 мас./об.% БСА и снова отмывали. Препарат антитело-антиген вносили на сенсибилизированный с помощью РС8К9 планшет типа 81апбагб Втб и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. После осуществления трех дополнительных стадий отмывки добавляли меченное с помощью 8и1Го-Тад козье античеловеческое идентифицирующее антитело (К32А1-5, фирма Меко 8са1е ^^κсονе^у) и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. После трехкратной отмывки планшета добавляли буфер Кеаб (фирма Меко 8са1е ^^κсονе^у), и измеряли электрохемилюминесцентные сигналы (ЕСЬ-сигналы) с помощью устройства 8ес!ог ^адег 6000 (фирма Меко 8са1е ^^κсονе^у). Результаты измерений ВСЕ обрабатывали с помощью программы ехсе1 абб-т ХЕРН 4.3.2 (фирма ГО Виктекк 8о1иЕопк) с использованием аппроксимирующей модели, пригодной для антител, которая описана у Р1еЬ1ег и др., I Iттиηο1 МеЛобк 201, 1997, сс. 189-206. Было уста
- 35 032084 новлено, что имела место высокая аффинность связывания человеческого белка РСδК9 антителами ЙСТ209, ЙСТ210 и ЙСТ211 в растворе, это характеризовалось рассчитанными для каждого антитела величинами Кс, составлявшими 150-190 пМ.
Получение и очистка антител.
Полностью Нитаиеегеб™-антитела NVР-^СТ209. NVР-^СТ210 и NVР-^СТ211 (1дС1 с молчащей каппа-цепью) создавали путем котрансфекции указанными ниже векторами 293 Ргеейу1е-клеток с использованием реагента для трансфекции, 293 фектина (фирма Ιΐ'ΐνίΙΐΌ^ΐ'ΐ. каталожный номер 51-0031), согласно протоколу производителя:
ЬСТ-209 - р.1С>04 (Уй)-р.1С10 (Ук),
ЬСТ-210 - р.1С>04 (Уй)+р1С01 (Ук),
ЬОТ-211 - рδВ74 (Уй)+р1С10 (Ук).
Антитело очищали из супернатанта 293 Ргеейу1е-клеток с использованием Н1Тгар Рго!ет А НРколонки, 5 мл (фирма СЕ Неаййсаге, каталожный номер 17-0403-03). Элюцию антитела осуществляли с использованием буфера для элюции 1дС (фирма Р1егсе, № 21004), и буфер заменяли на ЗФР путем диализа. Аффинную хроматографию на белке А осуществляли с использованием системы для жидкостной хроматографии АКТАРРЬС (фирма СЕ Неаййсаге).
Анализ конкуренции за связывание с эпитопом.
Анализ конкуренции между исходным мышиным антителом NVР-^Ρυ720 и его Нитаиеегеб™производным NУР-ЙСТ209 за связывание с эпитопом на РСδК9 проводили с использованием системы ΡοήеΒ^ο Ос!е! ОК и стрептавидиновых биосенсоров с высокой связывающей способностью, сенсибилизированных биотинилированным РСЪК9-А\з-Н|56. Затем три различных антитела связывали с отдельными сенсибилизированными РСδК9 сенсорами до достижения насыщения: мышиное ЬРИ720, полностью человеческое ЬСТ209 или контрольное мышиное антитело 7Ό16 (которое, как известно, распознает эпитоп, отличный от эпитопа, распознаваемого антителом ЬРИ720). Затем все сенсоры погружали в лунки, содержащие мышиное антитело ЬРИ720 для определения того, обладает ли первое антитело способностью блокировать связывание ЬРИ720.
Результаты.
Мышиная аминокислотная последовательность ν-области и аминокислотная референспоследовательность ν-области.
Полученные с помощью ОТ-ПЦР продукты из клеток гибридомы, экспрессирующих NVР-^Ρυ720, подвергали секвенированию, и с использованием масс-спектрометра типа ТйегтоЕ1ес!гои ЬТО-ОгЬйгар было установлено, что на белковом уровне они в основном (на 95% или более) имели правильную последовательность. Затем вариабельные области тяжелых и легких цепей ЬРИ720 клонировали в Ка1οΒ^ο5векторах для получения референс-РаЬ-фрагмента δВ032. Первую аминокислоту в Ук NVР-^Ρυ720, которая представляла собой глутамин (0), оказалось необходимым заменить на глутаминовую кислоту (Е) для того, чтобы иметь возможность осуществлять клонирование в Ка1οΒ^ο8-векторах для получения референс-РаЬ-фрагмента δВ032; поэтому в первом положении Ук-последовательности Ук δВ032 присутствовала глутаминовая кислота. РаЬ-фрагмент δВ032 имел интактные мышиные У-области из ΝνΤЬРи720, слитые с человеческими константными областями, и его очищали из Е. сой. При проведении анализа связывания антигена РСЪК9-Н|56 методом ЕЬКА с использованием разведений было установлено, что кривые связывания, полученные для клонированного референс-РаЬ-фрагмента δВ032, зависели от концентрации РаЬ-фрагмента. Помимо референс-РаЬ-фрагмента (δΕ032) конструировали оптимизированный референс-РаЬ-фрагмент, а именно δВ038. При создании δВ038 несколько аминокислотных остатков в каркасной области δВ032 были изменены на остатки человеческой зародышевой линии.
Аффинный анализ референс-РаЬ-фрагмента и оптимизированного референс-РаЬ-фрагмента.
Остатки человеческой зародышевой линии, встроенные в РВ1 и РВ3 оптимизированного референсРаЬ-фрагмента δВ038, представляли собой остатки, которые определялись ПЦР-праймерами, применяемыми для амплификации спектра человеческих У-сегментов, и поэтому они присутствовали во всех представителях Нитаиеегеб™-библиотек У-области. Оптимизированный референс-РаЬ-фрагмент создавали для того, чтобы оценить изменяют ли замены на остатки человеческой зародышевой линии способность к связыванию РаЬ. Путем анализа методом ЕЬКА с использованием разведений очищенных РаЬфрагментов было установлено, что аффинности δВ032 и δВ038 к рекомбинантному антигену РСδК9 оказались идентичными, это свидетельствовало о том, что аминокислотные замены в δВ038 являются допустимыми.
Создание библиотеки и отбор полностью Нитаиеегеб™-РаЬ-фрагментов.
Создавали подгруппу библиотек кассет тяжелых и легких цепей типа Ггои!-еиб и т1бб1е, включающих только Уй1 или Ук3, и осуществляли их скрининг с помощью С^ΒА. В случае Уй были идентифицированы с помощью анализа связывания с использованием переноса колоний кассеты типа ГгоШеиб, которые сохраняли связывание с антигеном РСδК9, но не были идентифицированы содержащие Уй кассеты типа т1бб1е. В случае Ук методом переноса колоний были идентифицированы кассеты как Ггои!-еиб-типа, так и т1бб1е-типа, и, кроме того, были идентифицированы несколько полноразмерных
- 36 032084 клонов Ук (это было обусловлено загрязнением содержащей Ук Ггоп!-епб-библиотеки клонами Ук с полноразмерной цепью). Многие обладающие способностью к связыванию клоны из каждой библиотеки были повторно подтверждены с помощью анализа методом ЕБ18А с использованием содержащих БаЬфрагменты клеточных супернатантов, и несколько БаЬ-фрагментов из каждой библиотеки очищали из периплазматических фракций и ранжировали по уровню аффинности с помощью Бойе-анализа.
Поскольку не было выявлено ни одной содержащей У-область тяжелой цепи кассеты типа т1бб1е, сохраняющей связывание с РС8К9, то были созданы две мутагенные библиотеки, которые кодировали либо родительский мышиный остаток, либо наиболее близкий остаток человеческой зародышевой линии во всех положениях в С1Ж2 или БК3 тяжелой цепи. Таким путем была создана сконструированная человеческая библиотека кассет типа т1бб1е, ее подвергали скринингу и идентифицировали антигенсвязывающие клоны. Затем объединяли индивидуальные клоны из содержащих Уй кассет типа т1бб1е, которые после замены на остатки человеческой зародышевой линии сохраняли способность к связыванию, получая одну конечную кассету типа т1бб1е, и в контексте оптимизированного референс-БаЬфрагмента подтверждали аффинность связывания БаЬ, содержащего эту кассету, как и в случае оптимизированного референс-БаЬ-фрагмента, с помощью Бойе-анализа.
В созданных библиотеках были успешно идентифицированы с помощью СБВА человеческие кассеты типа ГгопБепб и т1бб1е как тяжелых, так и легких цепей, которые сохраняли способность к связыванию с антигеном РС8К9. Все эти обладающие способностью к связыванию клоны подтверждали с помощью ЕБ18А, после чего БаЬ-фрагменты очищали и ранжировались помощью системы БойеВю Ос!е1. Кассеты тяжелых и легких цепей с высоким рангом объединяли в одну конечную библиотеку с помощью мостиковой ПЦР, и из этой библиотеки с помощью СБВА отбирали полностью Нитапеегеб™БаЬ-фрагменты, которые сохраняли способность к связыванию с РС8К9. Параллельно с этим объединяли вместе все характеризующиеся наиболее высоким рангом кассеты или цепи (наилучшую Уй-кассету типа ГгопБепб, сконструированную Уй-кассету типа т1бб1е и наилучшую полноразмерную цепь) с получением одного БаЬ-фрагмента 8К066, который, как предполагалось, должен сохранять высокую аффинность к связыванию.
Последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепей родительского мышиного МАт КУР-ББШ20 и Нитапеегеб™-антител КУР-БПТ209, КУР-БПТ210 и КУР-БПТ211 представлены на фиг. 1-4 соответственно.
Тестирование аффинности полностью Нитапеегеб™-БаЬ-фрагментов к антигену РС8К9 с помощью БойеВю Ос^еБанализа.
Нитапеегеб™-БаЬ-фрагмент 8К066 и три БаЬ-фрагмента, выделенные из конечной комбинаторной библиотеки (№ 1-2, № 3-2 и № 4-2), экспрессировали и очищали. Затем сравнивали кинетические характеристики связывания указанных четырех человеческих БаЬ-фрагментов с кинетическими характеристиками оптимизированного референс-БаЬ-фрагмента 8К038 с использованием системы БойеВю Ос!е! (результаты в численном виде обобщены в табл. 1).
Таблица 1
Аффинность полностью Нитапеегеб™-БаЬ-фрагментов к РС8К9
РаЬ ка Ко
8К038 1,39ЕЗ 5Д2Е-4 3,69Е-7
8К066 3,25ЕЗ 1,08Е-3 3,ЗЗЕ-7
№ 1-2 6,91ЕЗ 2Д6Е-3 ЗДЗЕ-7
№3-2 5,92ЕЗ 1,46Е-3 2,47Е-7
№4-2 *** *** ***
*** - для БаЬ-фрагмента № 4-2 выявленный уровень связывания оказался слишком малым для того, чтобы получить достоверные кинетические характеристики.
Определение концентрации белка для указанных БаЬ-фрагментов оказалось трудной задачей; по существу, данные о скорости диссоциации (кб) намного более достоверны, чем данные о скорости ассоциации (ка) и величины Ко (от концентрации не зависели только скорости диссоциации). По-видимому, для всех четырех протестированных Нитапеегеб™-БаЬ-фрагментов скорости диссоциации были в 3-4 раза хуже (т.е. диссоциация происходила быстрее) по сравнению с оптимизированным референс-БаЬфрагментом. Вероятно, что такое снижение аффинности обусловлено присутствием в этих клонах тяжелых цепей Ггоп!-епб-типа, поскольку все обладающие способностью к связыванию БаЬ-фрагменты, выбранные из исходной библиотеки кассет тяжелых цепей типа ГгопБепб, по-видимому, характеризуются худшими по сравнению с оптимизированным референс-БаЬ-фрагментом скоростями диссоциации (данные не представлены). Поскольку тяжелая цепь в кассетах типа ГгопБепб содержит СЭК1, то изменения, внесенные в этот СЭК в кассетах Уй Ггоп!-епб-типа, могли являться возможной причиной снижения аффинности конечных Нитапеегеб™-БаЬ-фрагментов. Среди полностью Нитапеегеб™-БаЬфрагментов 8К066 характеризовался наилучшей скоростью диссоциации (табл. 1), при этом между последовательностями СЭК1 тяжелой цепи 8К066 и мышиной референс-последовательности имелись три различия. Для проверки идеи о том, что эти изменения, внесенные в СЭКН1, ответственны за снижение аффинности, наблюдаемое для всех предлагаемых в настоящем изобретении Нитапеегеб™-БаЬ
- 37 032084 фрагментов, при создании изобретения одновременно проводили обратные замены двух остатков в СБКШ 8К066 на остатки исходной мышиной последовательности и осуществляли экспрессию и очистку полученных измененных БаЬ-фрагментов для осуществления Бог1е-анализа кинетических характеристик.
Один БаЬ-фрагмент с двумя одновременно проведенными заменами в СЭКШ (8К079) (табл. 2) обладал существенно улучшенными кинетическими характеристиками по сравнению с 8К066 (результаты в численном виде обобщены в табл. 3). Фактически было установлено, что БаЬ-фрагмент 8К079 обладал скоростью диссоциации, эквивалентной скорости диссоциации оптимизированного (мышиного) референс-БаЬ-фрагмента 8К038.
Таблица 2
Последовательность СЭКН1 варианта 1аЬ-фрагмента 8К079 с измененным СЭКН1*
8К066 (Нитапеегес!™) ΤΥΥΜΝ 8Εζ) Ш N0: 64
8К038 (мышиный) ΌΜΥΜ8 8Εζ) Ш N0: 65
8К079 (Нитапеегес!™) ΤΜΥΜ8 8Εζ) Ш N0: 66
* - человеческие (выведенные из 8К066) или инвариантные остатки выделены жирным шрифтом; мышиные остатки указаны обычным шрифтом.
Таблица 3
Аффинность БаЬ-фрагмента 8К079 к РС8К9
ГаЬ ка ка Ко
8К038 2,69ЕЗ 3,68Е-4 1,37Е-7
8К079 6,01ЕЗ 3,26Е-4 5,42Е-8
В СЭКН2 Нитапее^ей™-БаЬ-фрагментов 8К066, № 1-2, № 3-2 и № 4-2 присутствует аминокислотная последовательность А§п-О1у (ΝΟ), происходящая из исходного мышиного антитела. Известно, что эта последовательность может подвергаться деаминированию, это свойство является нежелательным при производстве антител. Поэтому одновременно с усилиями по улучшению аффинности Нитапеегей'|Л'-1'аЬ-фрагмента 8К066 создавали две мутагенные библиотеки на основе 8К066, в которых аминокислотные остатки Ν или О заменяли на любые возможные аминокислоты, за исключением исходной аминокислоты (например, в библиотеке с удаленным остатком Ν остаток Ν заменяли на любую аминокислоту, за исключением Ν). Затем клеточные супернатанты, содержащие БаЬ-фрагменты из этой библиотеки, подвергали скринингу с помощью ЕЙ18А для идентификации клонов, которые не содержали последовательность ΝΟ, но все еще сохраняли уровень способности к связыванию, присущий 8К066 (который был ниже уровня, характерного для оптимизированного референс-БаЬ-фрагмента 8К038). Библиотека с удаленным остатком Ν не позволила получить никаких БаЬ-фрагментов, обладающих такой же способностью к связыванию, что и 8К066, однако библиотека с удаленной О позволила выявить обладающие достаточной способностью к связыванию 1аЬ-фрагменты, которые имели целый ряд других замен в положении, в котором присутствовал остаток О. Из них были отобраны БаЬфрагменты, которые имели замены ΝΟ на ΝΕ, ’^А и ’^М, для очистки и проведения Бог1е-анализа кинетических характеристик, в результате чего было установлено, что они имели кинетические характеристики, сходные с характеристиками родительского БаЬ-фрагмента 8К066.
Конструирование клона 7472 человеческого 1дО с целью повышения аффинности. Конструирование Ук.
Для создания полностью человеческого 1дО амплифицировали участок последовательности Уй 8К079 (модифицированная версия 8К066, обладающая повышенной аффинностью), простирающийся вплоть до СЭКН2, и сшивали с помощью мостиковой ПЦР с последовательностью клона из библиотеки с удаленным остатком О (который содержал ΝΕ в СЭКН2), начинающейся от СЭКН2 и захватывающей большую часть БК4. Эту последовательность Уй клонировали в рК85а-й1дО1 1.А1.А+1<ри1 (клонирующий вектор, несущий молчащий 1дО1, который был модифицирован путем добавления сайта Крп1 в БК4 без нарушения аминокислотной последовательности Уй) в №и1 (5') и Крп1 (3') с получением р8К074. Участок Ук (начинающийся от БК1 и частично захватывающий БК4) из 8К066 амплифицировали и клонировали в рК85а-йкарра в Аде1 и В81Ш1 с получением р8К072. Эти векторы проверяли путем секвенирования и использовали для котрансфекции клеток линии 293 Бгее§1у1е. Полученный 1дО (обозначен как 7472) очищали из содержащей антитело клеточной среды. Неожиданно было установлено, что антитело 7472 характеризовалось по данным В1асоге-анализа существенно более медленной скоростью ассоциации по сравнению с родительским мышиным антителом Ι.1·Ό720 (данные не приведены). Путем замены каждой человеческой цепи на комплементарную родительскую мышиную цепь было установлено, что обнаруженный недостаток, касающийся скорости ассоциации, был обусловлен проблемой, связанной с человеческой легкой цепью. С целью спасения аффинности были внесены изменения в человеческую легкую цепь, содержащуюся в р8К072 (табл. 4): первые четыре остатка легкой цепи были заменены снова на остатки мышиной последовательности и остатки во второй половине СЭК1 заменены снова на остатки мышиной последовательности. Полученную легкую цепь клонировали в рК85а
- 38 032084 йкарра согласно описанному выше методу с получением рЛС10 и рЛС01, и полноразмерный Ι§Ο получали путем котрансфекции с использованием рδК074 (Нс-вектор) и рЛС10 (Бс-вектор) или рЛС01 (Бсвектор). Когда указанные замены присутствовали вместе, то они частично восстанавливали аффинность Нитапеегей™-антитела по данным Вгасоге-анализа.
Таблица 4
Замены, сделанные в легкой цепи Ι§Ο 7472
Ν-конец ЬС (ЗЕО Ю N0: ) СОК1 ЬС (ЗЕО ΙΌ ΝΟ:)
7472 Е1УМ (67) 7472 КАЗОЗУЗЗЗНУА (68)
ЪЕи720 <21УЬ (69) ЬЕИ720 3Α333ν3--ΥΜΗ (70)
рЛ310 <21УЬ (69) рЛЗЮ ΚΑ303Υ3--ΥΜΗ (71)
В табл. 4 представлены выровненные участки последовательностей легких цепей человеческого антитела 7472, родительского мышиного антитела БЕИ720 и легкой цепи, кодируемой рЛС10. Этот участок идентичен участку легкой цепи, кодируемой рЛС01. Кодирующие легкую цепь векторы использовали для экспрессии конечных Нитапеегей™-антител NУР-^СТ209, NУР-^СТ210 и NУР-^СТ-211.
Созревание аффинности СЭКНЭ.
Параллельно с модификациями легкой цепи конструировали библиотеку ЕаЬ-фрагментов для созревания аффинности СЭК3 тяжелой цепи рδК074. При создании этой библиотеки остатки в С1)И3 заменяли по одному на любую другую аминокислоту, за исключением исходного остатка. Созданную таким путем библиотеку подвергали скринингу с помощью СБВА, обладающие способностью связываться клоны проверяли с помощью ΕΕΙδΛ, и полученные в результате ЕаЬ-фрагменты очищали и тестировали с помощью интерферометрии для слоев биологических субстанций (метод Вю-Бауег ШегГеготе^) с целью определения того, обладают ли они улучшенными кинетическими характеристиками связывания по сравнению с родительским человеческим ЕаЬ-фрагментом.
Была идентифицирована одна замена в СПКН3, которая существенно повышала аффинность: замена А на N (табл. 5). Затем эту замену осуществляли в контексте плазмиды, экспрессирующей тяжелую цепь Ι§Ο, рδК074; полученную новую конструкцию обозначили как р.1С04. Конечное Нитапеегей™антитело NУР-^СТ209 (БСТ209) получали путем котрансфекции с использованием р.1С04 (Нс) и рЛС10 и последующей очистки. Конечное Нитапеегей™-антитело NУР-^СТ210 (БСТ210) получали путем котрансфекции с использованием рЛС04 (Нс) и рЛС01 и последующей очистки. Указанную замену не вносили в антитело NУР-^СТ211 (БСТ211).
Таблица 5
Замены, сделанные в СЭК3 тяжелой цепи Ι§Ο 7472
Последовательность СОКНЗ 8ЕО ГО ΝΟ:
7472 ΟΑΚδΥΥΥΥΑΜϋΥ 72
1447720 ΟΑΚδΥΥΥΥΑΜϋΥ 72
рЮ04 ΟΑΚδΥΥΥΥΝΜΌΥ 73
В табл. 5 представлены выровненные последовательности СЭКЗ тяжелой цепи человеческого антитела 7472, родительского мышиного антитела БЕИ720 и тяжелой цепи, кодируемой рЛС04 (вектор тяжелой цепи, который использовали для экспрессии конечных Нитапеегей™-антител NУР-^СТ209 и NУРБСТ210). Замена А на N подчеркнута.
Анализ кинетических характеристик связывания NУР-^СТ209, NУР-^СТ210 и NУР-^СТ211 с использованием системы уравновешивающего титрования раствора (δΕΣ).
С помощью δΕТ-анализа было установлено, что аффинность связывания антител NУР-^СТ209, NУР-^СТ210 и NУР-^СТ211 с человеческим РСδК9 характеризовалась величиной Ко, составлявшей 150-190 пМ, как указано в табл. 6. Это свидетельствует о том, что имеет место высокоаффинное взаимодействие между антителами и РСδК9 в растворе.
Таблица 6
Антитело Ко [пМ]
БОТ209 190 ± 50
БОТ2Ю 150 ± 50
БОТ211 190 ± 50
Анализ антигенной специфичности NУР-^СТ209 с помощью Ε^IδΛ.
Для тестирования того, сохраняется ли антигенная специфичность, присущая родительскому мышиному антителу БЕИ720, у конечных Нитаиее^ей™-IдС, а именно БСТ209, БСТ210 БСТ211, оценивали путем анализа методом Ε^IδΛ связывание антител с панелью человеческих и мышиных антигенов (а также с человеческим белком РСδК9). Результаты этого анализа (фиг. 5А-5В) свидетельствуют о том, что БСТ209, БСТ210 БСТ211 сохраняют высокую специфичность в отношении РСδК9, сходную со специфичностью мышиного антитела БЕИ720.
Оценка связывания антител с белком Рсзк9 человека и макака крабоеда методом Ε^IδΛ.
Оценивали специфичность связывания антител БСТ209, БСТ210 и БСТ211 с Рсзк9 человека и ма
- 39 032084 кака крабоеда (супе) Рсзк9). Результаты этого анализа, проведенного методом ЕЫ8А, продемонстрировали, что аналогично родительскому мышиному антителу БРЦ720 Нитапеегеб™-антитела БСТ209, БСТ210 и БСТ211 обладали сходной способностью связываться как с Рсзк9 человека, так и с сутю Рсзк9 (фиг. 6А-6В).
Анализ конкуренции за связывание с эпитопом с помощью метода на основе технологии ВюЬауег ТиегГеготейу.
Для тестирования того, сохраняют ли конечные Нитапеегеб™-антитела БСТ209, БСТ210 и БСТ211 специфичность в отношении эпитопа, присущую родительскому мышиному антителу КУР-РРи720, был разработан метод конкурентного анализа с использованием системы 0с1е1 фирмы Βοι^^ίο. Было установлено, что Нитапеегеб™-антитела БСТ209, БСТ210 и БСТ211 блокировали связывание родительского мышиного антитела КУР-РРи720, это свидетельствовало о том, что Нитапеегеб™-антитела сохраняли специфичность в отношении эпитопа, присущую исходному мышиному антителу. Сходные результаты были получены и в том случае, когда изменяли порядок внесения антител, а именно когда сначала осуществляли связывание КУР-РРи720, а затем вносили Нитапеегеб™-антитело.
Аминокислотные последовательности Нитапеегеб™-антител БСТ209, БСТ210 и БСТ211 и процент их идентичности с последовательностью человеческой зародышевой линии.
Аминокислотные последовательности вариабельных областей конечных Нитапеегеб™-1дС, а именно БСТ209, БСТ210 и БСТ211, представлены на фиг 2-4 соответственно; СБК-участки подчеркнуты и выделены жирным шрифтом. Нуклеотидные последовательности включены в перечень последовательностей.
Процент идентичности последовательностей антител БСТ209, БСТ210 и БСТ211 с последовательностями человеческой зародышевой линии определяли путем выравнивания аминокислотных последовательностей УН и Ук с одной из последовательностей человеческой зародышевой линии (УН1 1-02 и Ук3 А27 соответственно, табл. 7). При расчете для каждой цепи исключали остатки, присутствующие в СБКНЭ и С1ЖР3.
Таблица 7
Процент идентичности последовательностей антител БСТ209, БСТ210 и БСТ211 с последовательностями человеческой зародышевой линии
УК по отношению к УЫ 1-02 Ук по отношению к УкЗ А27
89% 91%
Дополнительная информация касательно функциональной характеризации гуманизированных (Нитапеегеб™) антител представлена в описаниях фиг. 8-14.
Пример 3. Анализ мутаций обладающих антагонистической активностью антител к РС8К9 КУРБСТ209. КУР-ЕСТ210 и НУР-ЬСТ211.
Варианты обладающих антагонистической активностью антител к РС8К9 КУР-РС.1Т209, N79БСТ210 и NУР БСТ211 оценивали в отношении их способности связываться с РС8К9. Результаты можно обобщить следующим образом:
Касательно СБК1 тяжелой цепи ТΜΥΜ8 (8Е^ ΙΌ N0: 66): только клоны, которые содержат исходные остатки мышиной последовательности (выделены жирным шрифтом), сохраняют кинетические характеристики связывания, присущие мышиному Ат (по данным анализа методом Вю1ауег ТиегГеготейу). Следовательно, указанные остатки в СБК1 тяжелой цепи имеют значение для связывания.
Касательно СЭЕ2 тяжелой цепи ΚΙϋΡΑΝΕΗΤΝΥΑρκρρθ (8Е(} ГО N0: 74): остатки, выделенные жирным шрифтом, не были изменены в обладающих способностью к связыванию антителах, выделенных (путем скрининга с помощью ΡΡΙ8Λ) из библиотеки, кодирующей либо исходный (мышиный) остаток, либо соответствующий остаток в наиболее близкой последовательности человеческой зародышевой линии в каждом положении. Следовательно, выделенные жирным шрифтом остатки имеют значение для связывания. В положении, в котором находится подчеркнутый остаток С1и, допустимы консервативные замены, например, в этом положении может присутствовать А, Е или Ό, что было определено с помощью ЕЫ8А и подтверждено методом Вю1ауег ТиегГеготейу.
Касательно СЭЕЗ тяжелой цепи 8ΥΥΥΥ(Α/Ν)ΜϋΥ (8Ер Ю N0: 75): остатки, выделенные жирным шрифтом, не были изменены в клонах, выделенных из библиотеки для созревания аффинности, кодирующей все возможные аминокислоты (за исключением исходной ак) в каждом положении. Следовательно, выделенные жирным шрифтом остатки имеют значение для связывания. В положениях, в которых находятся подчеркнутые остатки А1а или Азп, допустимы консервативные замены, например в этих положениях могут присутствовать А, N или р, что было определено с помощью Вхаоге-анализа. В положении, в котором находится подчеркнутый остаток Туг, например, допустимы консервативные замены, например в этом положении может присутствовать А, Р, 8, У или Υ, что было определено с помощью Вхаоге-анализа.
Касательно РК1 легкой цепи (Е/£)1У(М/й)Тр8РАТЕ8У8Р(лЕКАТЕ8С (8Е(^ ГО N0: 76): в подчеркнутых положениях 1 и 4 допустимы консервативные замены, что было определено с помощью
- 40 032084
Например, аминокислота в положении 1 может представлять собой А, Ό, Е, N или С). Аминокислота в положении 4 может представлять собой V, I, Ь или М. Аминокислоты О1ХГ в положениях 1-4 (8ЕР ГО N0: 69) (которые присутствуют в Хк мышиного родительского ЬЕи720, ЬОТ209 и ЬОТ211) обеспечивают улучшенные характеристики связывания по сравнению с аминокислотами ЫХМ в положениях 1-4 (8ЕР ГО N0: 67) (которые присутствуют в Хк ЬОТ210), что было определено с помощью ΙΛκοϊΌанализа.
Касательно СЭК/1 легкой цепи ΚΑδΟδνδΥΜΗ (8Е0 ГО N0: 71): разделение выделенных остатков оказывает влияние на связывание, поскольку человеческий клон, несущий 2 дополнительные встроенные аминокислоты в этом положении СГОК1 Ьс, обладал более низкой аффинностью. Следовательно, выделенные жирным шрифтом остатки имеют значение для связывания.
Касательно СЭК.З легкой цепи ΕΩ^ν§8θΡΡΤ (8Е0 ГО N0: 26): замены в указанных положениях на аминокислотные остатки человеческой зародышевой линии недопустимы, что определено с помощью ЕЫ8А. Следовательно, выделенные жирным шрифтом остатки имеют значение для связывания.
Следует иметь в виду, что представленные в настоящем описании примеры и варианты осуществления изобретения даны только с целью иллюстрации, и что специалисты в данной области могут предложить на основе указанного описания различные модификации или изменения, которые следует рассматривать как соответствующие сущности и подпадающие под сферу действия настоящей заявки и подпадающие под объем изобретения, определяемый прилагаемой формулой изобретения. Все публикации, патенты, заявки на патент, зарегистрированные в базах данных о последовательностях, которые процитированы в настоящем описании, полностью и для всех целей включены в настоящее описание в качестве ссылки.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> АЙРМ ЛЛК
Новартис АГ <120> Антагонисты РСВК9 <130> 021288-006410РС <140> №0 еще не назначен <141> Еще не назначен <150> ИВ 61/285,942 <151> 2009-12-11 <160> 76 <170> ЕазбВЕО для Шп^омз, версия 4.0 <210> 1 <211> 118 <212> РЕТ <213> Миз тизси1из <220>
<223> Вариабельная область тяжелой цепи (ЕК1-ЕК4)мышиного моноклонального антитела к РСВК9 ЬЕИ720 <400> 1
О1и Уа1 О1п Ьеи О1п О1п Вег О1у А1а О1и Ьеи Меб Ьуз Рго О1у А1а
1 5 10 15
Вег Уа1 Ьуз Ьеи Вег Суз ТЕг А1а Вег О1у РЕе Азп 11е Ьуз Азр Меб
20 25 30
Туг Меб Вег Тгр Уа1 Агд О1п Агд Рго О1и О1п О1у Ьеи О1и Тгр 11е
35 40 45
О1у Агд 11е Азр Рго А1а Азп О1у Нгз ТЕг Азп Туг Азр Рго Ьуз РЕе
50 55 60
О1п А1а Ьуз А1а ТЕг 11е ТЕг ТЕг Азр ТЕг Вег Вег Ьуз ТЕг А1а Туг
65 70 75 80
Ьеи Н13 Ьеи Вег Вег Ьеи ТЕг Вег О1и Азр ТЕг А1а Уа1 Туг Туг Суз
- 41 032084
85 90 95
А1а Агд Вег Туг Туг Туг Туг А1а Меб Азр Туг Тгр О1у О1п О1у ТИг
100 105 110
Вег Да1 ТИг Да1 Вег Вег
115 <210> 2 <211> 118 <212> РРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Вариабельная область тяжелой цепи ДИ (РР1-РР4)синтетического моноклонального антитела к РСВК9 рИС04(клоны ЬСТ-209 и ЬСТ-210) <400> 2
О1п Да1 О1п Ьеи Да1 О1п Вег О1у А1а О1и Да1 Ьуз Ьуз Рго О1у А1а
1 5 10 15
Вег Да1 Ьуз Да1 Вег Суз Ьуз А1а Вег О1у Туг ТИг РИе Вег ТИг Меб
20 25 30
Туг Меб Вег Тгр Да1 Агд О1п А1а Рго О1у О1п О1у Ьеи О1и Тгр Меб
35 40 45
О1у Агд 11е Азр Рго А1а Азп О1и Н1з ТИг Азп Туг А1а О1п Ьуз РИе
50 55 60
О1п О1у Агд Да1 ТИг Меб ТИг Агд Азр ТИг Вег 11е Вег ТИг А1а Туг
65 70 75 80
Меб О1и Ьеи Вег Агд Ьеи ТИг Вег Азр Азр ТИг А1а Да1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Агд Вег Туг Туг Туг Туг Азп Меб Азр Туг Тгр О1у О1п О1у ТИг
100 105 110
Ьеи Да1 ТИг Да1 Вег Вег
115
<210> 3 <211> 448 <212> РРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ДИ тяжелой цепи, включающей константную цепь 1дО1,синтетического моноклонального антитела к РСВК9 рИС04(клоны ЬСТ-209 и ЬСТ-210) <220>
<221> Вариант <222> (235)...(236) <223> Хаа = А1а или Ьеи <400> 3
О1п Да1 О1п Ьеи Да1 О1п Вег О1у А1а О1и Да1 Ьуз Ьуз Рго О1у А1а
1 5 10 15
Вег Да1 Ьуз Да1 Вег Суз Ьуз А1а Вег О1у Туг ТИг РИе Вег ТИг Меб
20 25 30
Туг Меб Вег Тгр Да1 Агд О1п А1а Рго О1у О1п О1у Ьеи О1и Тгр Меб
35 40 45
О1у Агд 11е Азр Рго А1а Азп О1и Н1з ТИг Азп Туг А1а О1п Ьуз РИе
50 55 60
О1п О1у Агд Да1 ТИг Меб ТИг Агд Азр ТИг Вег 11е Вег ТИг А1а Туг
65 70 75 80
Меб О1и Ьеи Вег Агд Ьеи ТИг Вег Азр Азр ТИг А1а Да1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Агд Вег Туг Туг Туг Туг Азп Меб Азр Туг Тгр О1у О1п О1у ТИг
- 42 032084
100 105 110
Ьеи Ча1 ТИг Ча1 Вег Вег А1а Вег ТИг Ьуз О1у Рго Вег Ча1 РИе Рго
115 120 125
Ьеи А1а Рго Вег Вег Ьуз Вег ТИг Вег О1у О1у ТИг А1а А1а Ьеи О1у
130 135 140
Суз Ьеи Ча1 Ьуз Азр Туг РИе Рго О1и Рго Ча1 ТИг Ча1 Вег Тгр Азп
145 150 155 160
Вег О1у А1а Ьеи ТИг Вег О1у Ча1 Н1з ТИг РИе Рго А1а Ча1 Ьеи О1п
165 170 175
Вег Вег О1у Ьеи Туг Вег Ьеи Вег Вег Ча1 Ча1 ТИг Ча1 Рго Вег Вег
180 185 190
Вег Ьеи О1у ТИг О1п ТИг Туг 11е Суз Азп Ча1 Азп Н1з Ьуз Рго Вег
195 200 205
Азп ТИг Ьуз Ча1 Азр Ьуз Агд Ча1 О1и Рго Ьуз Вег Суз Азр Ьуз ТИг
210 215 220
Н1з ТИг Суз Рго Рго Суз Рго А1а Рго О1и Хаа Хаа О1у О1у Рго Вег
225 230 235 240
Ча1 РИе Ьеи РИе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТИг Ьеи МеЬ 11е Вег Агд
245 250 255
ТИг Рго О1и Ча1 ТИг Суз Ча1 Ча1 Ча1 Азр Ча1 Вег Н1з О1и Азр Рго
260 265 270
О1и Ча1 Ьуз РИе Азп Тгр Туг Ча1 Азр О1у Ча1 О1и Ча1 Н1з Азп А1а
275 280 285
Ьуз ТИг Ьуз Рго Агд О1и О1и О1п Туг Азп Вег ТИг Туг Агд Ча1 Ча1
290 295 300
Вег Ча1 Ьеи ТИг Ча1 Ьеи Н1з О1п Азр Тгр Ьеи Азп О1у Ьуз О1и Туг
305 310 315 320
Ьуз Суз Ьуз Ча1 Вег Азп Ьуз А1а Ьеи Рго А1а Рго 11е О1и Ьуз ТИг
325 330 335
11е Вег Ьуз А1а Ьуз О1у О1п Рго Агд О1и Рго О1п Ча1 Туг ТИг Ьеи
340 345 350
Рго Рго Вег Агд О1и О1и МеЬ ТИг Ьуз Азп О1п Ча1 Вег Ьеи ТИг Суз
355 360 365
Ьеи Ча1 Ьуз О1у РИе Туг Рго Вег Азр 11е А1а Ча1 О1и Тгр О1и Вег
370 375 380
Азп О1у О1п Рго О1и Азп Азп Туг Ьуз ТИг ТИг Рго Рго Ча1 Ьеи Азр
385 390 395 400
Вег Азр О1у Вег РИе РИе Ьеи Туг Вег Ьуз Ьеи ТИг Ча1 Азр Ьуз Вег
405 410 415
Агд Тгр О1п О1п О1у Азп Ча1 РИе Вег Суз Вег Ча1 МеЬ Н1з О1и А1а
420 425 430
Ьеи Нгз Азп Нгз Туг ТИг О1п Ьуз Вег Ьеи Вег Ьеи Вег Рго О1у Ьуз
435 440 445
<210> 4 <211> 118 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Вариабельная область тяжелой цепи ЧИ. (КК1-КК4)синтетического клонального антитела к РСВК9 рВК74(клон ЬСТ-211) моно<400> 4
О1п Ча1 О1п Ьеи Ча1 О1п Вег О1у А1а О1и Ча1 Ьуз Ьуз Рго О1у А1а
1 5 10 15
Вег Ча1 Ьуз Ча1 Вег Суз Ьуз А1а Вег О1у Туг ТИг РИе Вег ТИг МеЬ
20 25 30
Туг МеЬ Вег Тгр Ча1 Агд О1п А1а Рго О1у О1п О1у Ьеи О1и Тгр МеЬ
35 40 45
О1у Агд 11е Азр Рго А1а Азп О1и Нгз ТИг Азп Туг А1а О1п Ьуз РИе
50 55 60
- 43 032084
О1п О1у Агд Ца1 ТЪг МеЬ ТЪг Агд Азр ТЪг Вег 11е Вег ТЪг А1а Туг
65 70 75 80
МеЬ О1и Ьеи Вег Агд Ьеи ТЪг Вег Азр Азр ТЪг А1а Ца1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Агд Вег Туг Туг Туг Туг А1а МеЬ Азр Туг Тгр О1у О1п О1у ТЪг
100 105 110
Ьеи Ца1 ТЪг Ца1 Вег Вег
115 <210> 5 <211> 448 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ЦЪ. тяжелой цепи, включающей константную цепь 1дО1,синтетического ноклонального антитела к РСВК9 рВК74(клон ЬСТ-211) <220>
<221> Вариант <222> (235)...(236) <223> Хаа = А1а или Ьеи <400> 5 мо-
О1п Ца1 1 О1п Ьеи Ца1 5 О1п Вег О1у А1а О1и 10 Ца1 Ьуз Ьуз Рго О1у 15 А1а
Вег Ца1 Ьуз Ца1 Вег Суз Ьуз А1а Вег О1у Туг ТЪг РЪе Вег ТЪг МеЬ
20 25 30
Туг МеЬ Вег Тгр Ца1 Агд О1п А1а Рго О1у О1п О1у Ьеи О1и Тгр МеЬ
35 40 45
С1у Агд 11е Азр Рго А1а Азп О1и Н1з ТЪг Азп Туг А1а О1п Ьуз РЪе
50 55 60
О1п О1у Агд Ца1 ТЪг МеЬ ТЪг Агд Азр ТЪг Вег 11е Вег ТЪг А1а Туг
65 70 75 80
МеЬ О1и Ьеи Вег Агд Ьеи ТЪг Вег Азр Азр ТЪг А1а Ца1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Агд Вег Туг Туг Туг Туг А1а МеЬ Азр Туг Тгр О1у О1п О1у ТЪг
100 105 110
Ьеи Ца1 ТЪг Ца1 Вег Вег А1а Вег ТЪг Ьуз О1у Рго Вег Ца1 РЪе Рго
115 120 125
Ьеи А1а Рго Вег Вег Ьуз Вег ТЪг Вег О1у О1у ТЪг А1а А1а Ьеи О1у
130 135 140
Суз Ьеи Ца1 Ьуз Азр Туг РЪе Рго О1и Рго Ца1 ТЪг Ца1 Вег Тгр Азп
145 150 155 160
Вег О1у А1а Ьеи ТЪг Вег О1у Ца1 Н1з ТЪг РЪе Рго А1а Ца1 Ьеи О1п
165 170 175
Вег Вег О1у Ьеи Туг Вег Ьеи Вег Вег Ца1 Ца1 ТЪг Ца1 Рго Вег Вег
180 185 190
Вег Ьеи О1у ТЪг О1п ТЪг Туг 11е Суз Азп Ца1 Азп Н1з Ьуз Рго Вег
195 200 205
Азп ТЪг Ьуз Ца1 Азр Ьуз Агд Ца1 О1и Рго Ьуз Вег Суз Азр Ьуз ТЪг
210 215 220
Н1з ТЪг Суз Рго Рго Суз Рго А1а Рго О1и Хаа Хаа О1у О1у Рго Вег
225 230 235 240
Ца1 РЪе Ьеи РЪе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТЪг Ьеи МеЬ 11е Вег Агд
245 250 255
ТЪг Рго О1и Ца1 ТЪг Суз Ца1 Ца1 Ца1 Азр Ца1 Вег Н1з О1и Азр Рго
260 265 270
О1и Ца1 Ьуз РЪе Азп Тгр Туг Ца1 Азр О1у Ца1 О1и Ца1 Н1з Азп А1а
275 280 285
Ьуз ТЪг Ьуз Рго Агд О1и О1и О1п Туг Азп Вег ТЪг Туг Агд Ца1 Ца1
290 295 300
- 44 032084
Вег Уа1 Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи Н1в О1п Авр Тгр Ьеи Авп О1у Ьув О1и Туг
305 310 315 320
Ьув Сув Ьув Уа1 Вег Авп Ьув А1а Ьеи Рго А1а Рго 11е О1и Ьув ТЬг
325 330 335
11е Вег Ьув А1а Ьув О1у О1п Рго Агд О1и Рго О1п Уа1 Туг ТЬг Ьеи
340 345 350
Рго Рго Вег Агд О1и О1и Меб ТЬг Ьув Авп О1п Уа1 Вег Ьеи ТЬг Сув
355 360 365
Ьеи Уа1 Ьув О1у РЬе Туг Рго Вег Авр 11е А1а Уа1 О1и Тгр О1и Вег
370 375 380
Авп О1у О1п Рго О1и Авп Авп Туг Ьув ТЬг ТЬг Рго Рго Уа1 Ьеи Авр
385 390 395 400
Вег Авр О1у Вег РЬе РЬе Ьеи Туг Вег Ьув Ьеи ТЬг Уа1 Авр Ьув Вег
405 410 415
Агд Тгр О1п О1п О1у Авп Уа1 РЬе Вег Сув Вег Уа1 Меб Н1в О1и А1а
420 425 430
Ьеи Нгв Авп Нгв Туг ТЬг О1п Ьув Вег Ьеи Вег Ьеи Вег Рго О1у Ьув
435 440 445
<210> 6 <211> 5 <212> РВТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Гипервариабельный участок 1(СЕ>К1) тяжелой цепи го моноклонального антитела к РСВК9 ЬРи720 синтетического мышино<400> 6
Авр Меб Туг Меб Вег <210>
<211>
<212>
<213>
РРТ
Искусственная последовательность <220>
<223>
210 и <400>
Тйг Меб Туг Меб Вег
Гипервариабельный участок 1(СЬР1)
ЬОТ-211 моноклонального антитела тяжелой к РСВК9 цепи клонов ЬВТ-209, ЬВТ<210>
<211>
<212>
<213>
РРТ
Искусственная последовательность <220>
<223>
нального антитела к РСВК9
Гипервариабельный участок 1(СЕ>К1) консенсусной тяжелой цепи монокло<220>
<221> Вариант <222> (1)...(1) <223> Хаа = Авр или Тйг <400> 8
Хаа Меб Туг Меб Вег
5 <210> 9 <211> 17 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Гипервариабельный участок 2(СЕ>В2) тяжелой цепи синтетического мышиного моноклонального антитела к РС5К9 ЬГи270 <400> 9
Агд 11е Авр Рго А1а Азп О1у Н1з ТЬг Азп Туг Азр Рго Ьуз Рйе О1п
5 10 15
А1а <210> 10 <211> 17 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Гипервариабельный участок 2(СЬК2) тяжелой цепи клонов ЬОТ-209, ЬОТ210 и ЬОТ-211 синтетического моноклонального антитела к РС5К9 <400> 10
Агд 11е Азр Рго А1а Азп О1и Н1з Тйг Азп Туг А1а О1п Ьуз РЬе О1п
5 10 15
О1у <210> 11 <211> 17 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Гипервариабельный участок 2(СЬК2) консенсусной тяжелой цепи синтетического моноклонального антитела к РС5К9 <220>
<221> Вариант <222> (7)...(7) <223> Хаа = А1а, О1и или О1у <220>
<221> Вариант <222> (12)...(12) <223> Хаа = А1а или Азр <220>
<221> Вариант <222> (13)...(13) <223> Хаа = Рго или О1п <220>
<221> Вариант <222> (17)...(17) <223> Хаа = А1а или О1у <400> 11
Агд 11е Азр Рго А1а Азп Хаа Н1з ТЬг Азп Туг Хаа Хаа Ьуз РЬе О1п
5 10 15
Хаа
- 46 032084
<210> <211> <212> <213> 12 9 РРТ Искусственная последовательность
<220> <223> Гипервариабельный участок 3(СРР3) УЬ. тяжелой цепи синтетического мо-
ноклонального антитела к РС5К9 рйС04(клоны ЬСТ-209 и ЬСТ-210 <400> 12
5ег Туг Туг Туг Туг Азп МеГ Азр Туг
1 5
<210> <211> <212> <213> 13 9 РРТ Искусственная последовательность
<220> <223> Гипервариабельный участок 3(СРР3) УЬ тяжелой цепи синтетического мы-
шиного моноклонального антитела к РС5К9 ЬРи270 и моноклонального антитела к РС5К9 р5Р74 (клон ЬСТ-211) <400> 13
5ег Туг Туг Туг Туг А1а МеГ Азр Туг
1 5
<210> <211> <212> <213> 14 9 РРТ Искусственная последовательность
<220> <223> Гипервариабельный участок 3(СРР3) консенсусной тяжелой цепи синтети-
ческого моноклонального антитела к РС5К9
<220> <221> <222> <223> Вариант (6)...(6) Хаа = А1а или Азп
<220> <221> <222> <223> Вариант (9)...(9) Хаа = А1а, РЬе, 5ег, Уа1 или Туг
<400> 14
5ег Туг Туг Туг Туг Хаа МеГ Азр Хаа
1 5
<210> <211> <212> <213> 15 106 РРТ Миз тизси1из
<220> <223> Вариабельная область легкой цепи (РР1-РР4) мышиного моноклонального
антитела к РС5К9 ЬРи720 <400> 15
- 47 032084
О1п 1 11е Уа1 Ьеи ТЬг 5 О1п Вег Рго А1а 11е 10 Меб Вег А1а Вег Рго 15 О1у
О1и Ьуз Уа1 ТЬг Меб ТЬг Суз Вег А1а Вег Вег Вег Уа1 Вег Туг Меб
20 25 30
Н1з Тгр Туг О1п О1п Ьуз Рго О1у Вег Вег Рго Агд Ьеи Тгр 11е Туг
35 40 45
Ьеи ТЬг РЬе Азп Ьеи А1а Вег О1у Уа1 Рго А1а Агд РЬе Вег О1у Вег
50 55 60
О1у Вег О1у ТЬг Вег Туг Вег Ьеи Вег 11е Вег Вег Меб О1и А1а О1и
65 70 75 80
Азр А1а А1а ТЬг Туг Туг Суз Ьеи О1п Тгр Вег Вег Азр Рго Рго ТЬг
85 90 95
РЬе О1у Вег О1у ТЬг Ьуз Ьеи О1и 11е Ьуз
100 105
<210> 16 <211> 106 <212> РРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Вариабельная область легкой цепи Ук (РР1-РР4) синтетического моноклонального антитела к РСВК9 рИС10 (клоны ЬСТ-209 и ЬОТ-211) <400> 16
О1п 11е Уа1 Ьеи ТЬг О1п Вег Рго А1а ТЬг Ьеи Вег Уа1 Вег Рго О1у
1 5 10 15
О1и Агд А1а ТЬг Ьеи Вег Суз Агд А1а Вег О1п Вег Уа1 Вег Туг Меб
20 25 30
Н1з Тгр Туг О1п О1п Ьуз Рго О1у О1п А1а Рго Агд Ьеи Ьеи 11е Туг
35 40 45
О1у Уа1 РЬе Агд Агд А1а ТЬг О1у 11е Рго Азр Агд РЬе Вег О1у Вег
50 55 60
О1у Вег О1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 11е О1у Агд Ьеи О1и Рго О1и
65 70 75 80
Азр РЬе А1а Уа1 Туг Туг Суз Ьеи О1п Тгр Вег Вег Азр Рго Рго ТЬг
85 90 95
РЬе О1у О1п О1у ТЬг Ьуз Ьеи О1и 11е Ьуз
100 105
<210> 17 <211> 213 <212> РРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Ук легкой цепи, включающей константную область каппа-цепи, синтетического моноклонального антитела к РСВК9 рИС10(клоны ЬСТ-209 и ЬСТ-211) <400> 17
О1п 1 11е Уа1 Ьеи ТЬг 5 О1п Вег Рго А1а ТЬг 10 Ьеи Вег Уа1 Вег Рго 15 О1у
О1и Агд А1а ТЬг Ьеи Вег Суз Агд А1а Вег О1п Вег Уа1 Вег Туг Меб
20 25 30
Н1з Тгр Туг О1п О1п Ьуз Рго О1у О1п А1а Рго Агд Ьеи Ьеи 11е Туг
35 40 45
О1у Уа1 РЬе Агд Агд А1а ТЬг О1у 11е Рго Азр Агд РЬе Вег О1у Вег
50 55 60
О1у Вег О1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 11е О1у Агд Ьеи О1и Рго О1и
65 70 75 80
Азр РЬе А1а Уа1 Туг Туг Суз Ьеи О1п Тгр Вег Вег Азр Рго Рго ТЬг
85 90 95
- 48 032084
РЕе О1у О1п О1у ТЕг 100 Ьуз Ьеи О1и 11е 105 Ьуз Агд ТЕг Уа1 А1а 110 А1а Рго
Зег Уа1 РЕе 11е РЕе Рго Рго Вег Азр О1и О1п Ьеи Ьуз Вег О1у ТЕг
115 120 125
А1а Вег Уа1 Уа1 Суз Ьеи Ьеи Азп Азп РЕе Туг Рго Агд О1и А1а Ьуз
130 135 140
Уа1 О1п Тгр Ьуз Уа1 Азр Азп А1а Ьеи О1п Вег О1у Азп Вег О1п О1и
145 150 155 160
Зег Уа1 ТЕг О1и О1п Азр Вег Ьуз Азр Вег ТЕг Туг Вег Ьеи Вег Вег
165 170 175
ТЕг Ьеи ТЕг Ьеи Вег Ьуз А1а Азр Туг О1и Ьуз Н1з Ьуз Уа1 Туг А1а
180 185 190
Суз О1и Уа1 ТЕг Н1з О1п О1у Ьеи Вег Вег Рго Уа1 ТЕг Ьуз Вег РЕе
195 200 205
Азп Агд О1у О1и Суз
210 <210> 18 <211> 106 <212> РЕТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Вариабельная область легкой цепи Ук (РЕ1-РЕ4) синтетического моноклонального антитела к РСВК9 рИВ01(клон ЬВТ-210) <400> 18
О1и 11е Уа1 Меб ТЕг О1п Вег Рго А1а ТЕг Ьеи Вег Уа1 Вег Рго О1у
1 5 10 15
О1и Агд А1а ТЕг Ьеи Вег Суз Агд А1а Вег О1п Вег Уа1 Вег Туг Меб
20 25 30
Н1з Тгр Туг О1п О1п Ьуз Рго О1у О1п А1а Рго Агд Ьеи Ьеи 11е Туг
35 40 45
О1у Уа1 РЕе Агд Агд А1а ТЕг О1у 11е Рго Азр Агд РЕе Вег О1у Вег
50 55 60
О1у Вег О1у ТЕг Азр РЕе ТЕг Ьеи ТЕг 11е О1у Агд Ьеи О1и Рго О1и
65 70 75 80
Азр РЕе А1а Уа1 Туг Туг Суз Ьеи О1п Тгр Вег Вег Азр Рго Рго ТЕг
85 90 95
РЕе О1у О1п О1у ТЕг Ьуз Ьеи О1и 11е Ьуз
100 105
<210> 19 <211> 213 <212> РЕТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Ук легкой цепи, включающей константную область каппа-цепи, синтетического моноклонального антитела к РСВК9 рИВ01(клон ЬВТ-210) <400> 19
О1и 1 11е Уа1 Меб ТЕг 5 О1п Вег Рго А1а ТЕг 10 Ьеи Вег Уа1 Вег Рго 15 О1у
О1и Агд А1а ТЕг Ьеи Вег Суз Агд А1а Вег О1п Вег Уа1 Вег Туг Меб
20 25 30
Н1з Тгр Туг О1п О1п Ьуз Рго О1у О1п А1а Рго Агд Ьеи Ьеи 11е Туг
35 40 45
О1у Уа1 РЕе Агд Агд А1а ТЕг О1у 11е Рго Азр Агд РЕе Вег О1у Вег
50 55 60
О1у Вег О1у ТЕг Азр РЕе ТЕг Ьеи ТЕг 11е О1у Агд Ьеи О1и Рго О1и
65 70 75 80
Азр РЕе А1а Уа1 Туг Туг Суз Ьеи О1п Тгр Вег Вег Азр Рго Рго ТЕг
- 49 032084
85 90 95
РИе О1у О1п О1у ТИг Ьуз Ьеи О1и 11е Ьуз Агд ТИг Да1 А1а А1а Рго
100 105 110
Вег Да1 РИе 11е РИе Рго Рго Вег Азр О1и О1п Ьеи Ьуз Вег О1у ТИг
115 120 125
А1а Вег Да1 Да1 Суз Ьеи Ьеи Азп Азп РИе Туг Рго Агд О1и А1а Ьуз
130 135 140
Да1 О1п Тгр Ьуз Да1 Азр Азп А1а Ьеи О1п Вег О1у Азп Вег О1п О1и
145 150 155 160
Вег Да1 ТИг О1и О1п Азр Вег Ьуз Азр Вег ТИг Туг Вег Ьеи Вег Вег
165 170 175
ТИг Ьеи ТИг Ьеи Вег Ьуз А1а Азр Туг О1и Ьуз Н1з Ьуз Да1 Туг А1а
180 185 190
Суз О1и Да1 ТИг Н1з О1п О1у Ьеи Вег Вег Рго Да1 ТИг Ьуз Вег РИе
195 200 205
Азп Агд О1у О1и Суз
210 <210> 20 <211> 10 <212> РРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Гипервариабельный участок 1(СЕ>Р1)легкой цепи синтетического мышиного моноклонального антитела к РСВК9 ЬРи720 <400> 20
Вег А1а Вег Вег Вег Да1 Вег Туг Меб Н1з
5 10 <210> 21 <211> 10 <212> РРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Гипервариабельный участок 1(СЕ>Р1)легкой цепи клонов ЬСТ-209, ЬСТ-210 и ЬСТ-211 синтетического моноклонального антитела к РСВК9 <400> 21
Агд А1а Вег О1п Вег Да1 Вег Туг Меб Н1з
5 10 <210> 22 <211> 10 <212> РРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Гипервариабельный участок 1(СЕ>Р1)консенсусной легкой цепи синтетического моноклонального антитела к РСВК9 <220>
<221> Вариант <222> (1)...(1) <223> Хаа = Агд или Вег <220>
<221> Вариант <222> (4)...(4)
- 50 032084
<223> Хаа = О1п или 5ег
<400> 22
Хаа А1а 5ег Хаа 5ег Уа1 5ег Туг Меб Н1з
1 5 10
<210> 23 <211> 7 <212> РВТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Гипервариабельный участок 2(СЬК2)легкой цепи синтетического мышиного моноклонального антитела к РС5К9 ЬРи720 <400> 23
Ьеи ТЪг РИе Азп Ьеи А1а 5ег
5 <210> 24 <211> 7 <212> РРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Гипервариабельный участок 1(СЬР1)легкой цепи клонов ЬОТ-209, ЬОТ-210 и ЬОТ-211 синтетического моноклонального антитела к РС5К9 <400> 24
О1у Уа1 РИе Агд Агд А1а ТИг
5 <210> 25 <211> 7 <212> РРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Гипервариабельный участок 2(СЬР2)консенсусной легкой цепи синтетического моноклонального антитела к РС5К9 <220>
<221> Вариант
<222> <223> (1).. Хаа = .(1) О1у или Ьеи
<220>
<221> Вариант
<222> (2).. .(2)
<223> Хаа = ТИг или Уа1
<220>
<221> Вариант
<222> (4).. .(4)
<223> Хаа = Азп или Агд
<220>
<221> Вариант
<222> (5).. .(5)
<223> Хаа = Ьеи или Агд
- 51 032084 <220>
<221>
<222>
<223>
Вариант (7)...(7)
Хаа
Сег или
ТЬг <400>
Хаа Хаа РЬе
Хаа
Хаа
А1а Хаа <210>
<211>
<212>
<213>
РРТ
Искусственная последовательность <220>
<223> моноклонального антитела к РССК9 ЬРи720 и клонов ЬСТ-209, мышиного моноклонального антитела к РССК9
Гипервариабельный участок 3(СЬР3)легкой цепи синтетического мышиного
ЬСТ-210 и ЬСТ-211 <400> 26
Ьеи С1п Тгр Сег Сег Азр Рго Рго ТЬг <210>
<211>
<212>
<213>
РРТ
Искусственная последовательность <220>
<223>
Сегмент вариабельной области тяжелой цепи(РР1-РР3)клонов ЬСТ-209,
ЬСТ-210 и ЬСТ-211 синтетического моноклонального антитела к <400> 27
РССК9
С1п Уа1 С1п Ьеи Уа1 С1п Сег С1у А1а С1и Уа1 Ьуз Ьуз Рго С1у А1а
1 5 10 15
Сег Уа1 Ьуз Уа1 Сег Суз Ьуз А1а Сег С1у Туг ТЬг РЬе Сег ТЬг МеГ
20 25 30
Туг МеГ Сег Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у С1п С1у Ьеи С1и Тгр МеГ
35 40 45
С1у Агд 11е Азр Рго А1а Азп С1и Н1з ТЬг Азп Туг А1а С1п Ьуз РЬе
50 55 60
С1п С1у Агд Уа1 ТЬг МеГ ТЬг Агд Азр ТЬг Сег 11е Сег ТЬг А1а Туг
65 70 75 80
МеГ С1и Ьеи Сег Агд Ьеи ТЬг Сег Азр Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Агд
<210>
<211>
<212>
<213>
РРТ
Искусственная последовательность <220>
<223>
РР3)синтетического моноклонального антитела к РССК9
Сегмент вариабельной области консенсусной тяжелой цепи(РР1<220>
<221>
<222>
<223>
Вариант (31)...(31)
Хаа = Азр или ТЬг
- 52 032084 <220>
<221> Вариант <222> (56)...(56) <223> Хаа = А1а, О1и или О1у <220>
<221> Вариант <222> (61)...(61) <223> Хаа = А1а или Азр <220>
<221> Вариант <222> (62)...(62) <223> Хаа = Рго или О1п <220>
<221> Вариант <222> (66)...(66) <223> Хаа = А1а или О1у <400> 28
О1п 1 Уа1 О1п Ьеи Уа1 5 О1п Вег О1у А1а О1и 10 Уа1 Ьуз Ьуз Рго О1у 15 А1а
Вег Уа1 Ьуз Уа1 Вег Суз Ьуз А1а Вег О1у Туг ТЬг РЬе Вег Хаа Меб
20 25 30
Туг Меб Вег Тгр Уа1 Агд О1п А1а Рго О1у О1п О1у Ьеи О1и Тгр Меб
35 40 45
О1у Агд 11е Азр Рго А1а Азп Хаа Н1з ТЬг Азп Туг Хаа Хаа Ьуз РЬе
50 55 60
О1п Хаа Агд Уа1 ТЬг Меб ТЬг Агд Азр ТЬг Вег 11е Вег ТЬг А1а Туг
65 70 75 80
Меб О1и Ьеи Вег Агд Ьеи ТЬг Вег Азр Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Агд
<210> 29 <211> 87 <212> РРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Сегмент вариабельной области Ук легкой цепи(РР1-РР3) синтетического моноклонального антитела к РСВК9 рйС10(клоны ЬСТ-209 и ЬСТ-211) <400> 29
О1п 11е Уа1 Ьеи ТЬг О1п Вег Рго А1а ТЬг Ьеи Вег Уа1 Вег Рго О1у
1 5 10 15
О1и Агд А1а ТЬг Ьеи Вег Суз Агд А1а Вег О1п Вег Уа1 Вег Туг Меб
20 25 30
Н1з Тгр Туг О1п О1п Ьуз Рго О1у О1п А1а Рго Агд Ьеи Ьеи 11е Туг
35 40 45
О1у Уа1 РЬе Агд Агд А1а ТЬг О1у 11е Рго Азр Агд РЬе Вег О1у Вег
50 55 60
О1у Вег О1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 11е О1у Агд Ьеи О1и Рго О1и
65 70 75 80
Азр РЬе А1а Уа1 Туг Туг Суз
85
<210> 30 <211> 87 <212> РРТ
- 53 032084 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Сегмент вариабельной области Дк легкой цепи(РР1-РР3)синтетического моноклонального антитела к РСВК9 рЭС01 (клон ЬСТ-210) <400> 30
О1и 11е Да1 Меб ТИг О1п Вег Рго А1а ТИг Ьеи Вег Да1 Вег Рго О1у
1 5 10 15
О1и Агд А1а ТИг Ьеи Вег Суз Агд А1а Вег О1п Вег Да1 Вег Туг Меб
20 25 30
Н1з Тгр Туг О1п О1п Ьуз Рго О1у О1п А1а Рго Агд Ьеи Ьеи 11е Туг
35 40 45
О1у Да1 РИе Агд Агд А1а ТИг О1у 11е Рго Азр Агд РИе Вег О1у Вег
50 55 60
О1у Вег О1у ТИг Азр РИе ТИг Ьеи ТИг 11е О1у Агд Ьеи О1и Рго О1и
65 70 75 80
Азр РИе А1а Да1 Туг Туг Суз
85
<210> 31 <211> 87 <212> РРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Сегмент консенсусной вариабельной области Дк легкой цепи(РР1РР3)синтетического моноклонального антитела к РСВК9 рЭС01(клоны ЬСТ-209, ЬСТ-210 и ЬОТ-211)
<220> <221> <222> <223> Вариант (4)...(4) Хаа = Ьеи или Меб
<220>
<221> Вариант
<222> (24)...(24)
<223> Хаа = Агд или Вег
<220>
<221> Вариант
<222> (27)...(27)
<223> Хаа = О1п или Вег
<220>
<221> Вариант
<222> (49)...(49)
<223> Хаа = О1у или Ьеи
<220>
<221> Вариант
<222> (50)...(50)
<223> Хаа = ТИг или Да1
<220>
<221> Вариант
<222> (52)...(52)
<223> Хаа = Азп или Агд
<220>
<221> Вариант
- 54 032084 <222> (53)...(53) <223> Хаа = Ьеи или Агд <220>
<221> Вариант <222> (55)...(55) <223> Хаа = Вег или Ткг <400> 31
О1х 1 11е Уа1 Хаа ТЬг 5 О1п Вег Рго А1а ТЬг 10 Ьеи Вег Уа1 Вег Рго 15 О1у
О1и Агд А1а ТЬг Ьеи Вег Сув Хаа А1а Вег Хаа Вег Уа1 Вег Туг МеЕ
20 25 30
Н13 Тгр Туг О1п О1п Ьув Рго О1у О1п А1а Рго Агд Ьеи Ьеи 11е Туг
35 40 45
Хаа Хаа РЬе Хаа Хаа А1а Хаа О1у 11е Рго Авр Агд РЬе Вег О1у Вег
50 55 60
О1у Вег О1у ТЬг Авр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 11е О1у Агд Ьеи О1и Рго О1и
65 70 75 80
Авр РЬе А1а Уа1 Туг Туг Сув
<210> 32 <211> 30 <212> РРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Каркасный участок 1(РР1) тяжелой цепи клонов ЬВТ-209, ЬВТ-210 и ЬВТ211 синтетического моноклонального антитела к РСВК9 <400> 32
О1п Уа1 О1п Ьеи Уа1 О1п Вег О1у А1а О1и Уа1 Ьув Ьув Рго О1у А1а
1 5 10 15
Вег Уа1 Ьув Уа1 Вег Сув Ьув А1а Вег О1у Туг ТЬг РЬе Вег
20 25 30
<210> 33 <211> 14 <212> РРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Каркасный участок 2(РР2) тяжелой цепи клонов ЬВТ-209, ЬВТ-210 и ЬВТ211 синтетического моноклонального антитела к РСВК9 <400> 33
Тгр Уа1 Агд О1п А1а Рго О1у О1п О1у Ьеи О1и Тгр МеЕ О1у
5 10 <210> 34 <211> 32 <212> РРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Каркасный участок 3(РР3) тяжелой цепи клонов ЬВТ-209, ЬВТ-210 и ЬВТ211 синтетического моноклонального антитела к РСВК9 <400> 34
- 55 032084
Агд Уа1 ТИг Меб ТИг Агд Азр ТИг 5ег 11е 5ег ТИг А1а Туг Меб О1и
1 5 10 15
Ьеи 5ег Агд Ьеи ТИг 5ег Азр Азр ТИг А1а Уа1 Туг Туг Суз А1а Агд
20 25 30
210> 35 <211> 11 <212> РРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Каркасный участок 4(РР4) тяжелой цепи клонов ЬОТ-209, ЬОТ-210 и ЬОТ211 синтетического моноклонального антитела к РС5К9 <400> 35
Тгр О1у О1п О1у ТИг Ьеи Уа1 ТИг Уа1 5ег 5ег
5 10 <210> 36 <211> 22 <212> РРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Каркасный участок 1(РР1) легкой цепи клонов ЬОТ-209, ЬОТ-210 и ЬОТ211 синтетического моноклонального антитела к РС5К9 <220>
<221> Вариант
<222> <223> (4)... Хаа = (4) Ьеи или Меб
<400> 36
О1х 11е Уа1 Хаа ТИг О1п 5ег Рго А1а ТИг Ьеи 5ег Уа1 5ег Рго О1у
1 5 10 15
О1и Агд А1а ТИг Ьеи 5ег
20
<210> 37 <211> 15 <212> РРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Каркасный участок 2(РР2) легкой цепи клонов ЬОТ-209, ЬОТ-210 и ЬОТ211 синтетического моноклонального антитела к РС5К9 <400> 37
Тгр Туг О1п О1п Ьуз Рго О1у О1п А1а Рго Агд Ьеи Ьеи 11е Туг
5 10 15 <210> 38 <211> 32 <212> РРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Каркасный участок 3(РР3) легкой цепи клонов ЬОТ-209, ЬОТ-210 и ЬОТ211 синтетического моноклонального антитела к РС5К9 <400> 38
- 56 032084
О1у 11е Рго Азр Агд РЬе Вег О1у Вег О1у Вег О1у ТЬг Азр РЬе ТЬг
1 5 10 15
Ьеи Ткг 11е О1у Агд Ьеи О1и Рго О1и Азр РЬе А1а Уа1 Туг Туг Суз
20 25 30
<210> 39 <211> 10 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Каркасный участок 4(РК4) легкой цепи клонов ЬСТ-209, ЬСТ-210 и ЬСТ211 синтетического моноклонального антитела к РСВК9 <400> 39
Рйе О1у О1п О1у ТЬг Ьуз Ьеи О1и 11е Ьуз
5 10 <210> 40 <211> 118 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Вариабельная область консенсусной тяжелой цепи (РК1-РК4) синтетического моноклонального антитела к РСВК9 <220>
<221> Вариант <222> (31)...(31) <223> Хаа = Азр или ТЬг <220>
<221> Вариант <222> (56)...(56) <223> Хаа = А1а, О1и или О1у <220>
<221> Вариант <222> (61)...(61) <223> Хаа = А1а или Азр <220>
<221> Вариант <222> (62)...(62) <223> Хаа = Рго или О1п <220>
<221> Вариант <222> (66)...(66) <223> Хаа = А1а или О1у <220>
<221> Вариант <222> (104)...(104) <223> Хаа = А1а или Азп <220>
<221> Вариант <222> (107)...(107) <223> Хаа = А1а, РЬе, Вег, Уа1 или Туг
- 57 032084
<400> 40
О1п Уа1 О1п Ьеи Уа1 О1п Вег О1у А1а О1и Уа1 Ьуз Ьуз Рго О1у А1а
1 5 10 15
Вег Уа1 Ьуз Уа1 Вег Суз Ьуз А1а Вег О1у Туг ТЬг РЬе Вег Хаа Меб
20 25 30
Туг Меб Вег Тгр Уа1 Агд О1п А1а Рго О1у О1п О1у Ьеи О1и Тгр Меб
35 40 45
О1у Агд 11е Азр Рго А1а Азп Хаа Н1з ТЬг Азп Туг Хаа Хаа Ьуз РЬе
50 55 60
О1п Хаа Агд Уа1 ТЬг Меб ТЬг Агд Азр ТЬг Вег 11е Вег ТЬг А1а Туг
65 70 75 80
Меб О1и Ьеи Вег Агд Ьеи ТЬг Вег Азр Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Агд Вег Туг Туг Туг Туг Хаа Меб Азр Хаа Тгр О1у О1п О1у ТЬг
100 105 110
Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Вег Вег
115 <210> 41 <211> 106 <212> РРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Вариабельная область консенсусной легкой цепи (РР1-РР4) синтетического моноклонального антитела к РСВК9
<220>
<221> Вариант
<222> (4)...(4)
<223> Хаа = Ьеи или Меб
<220>
<221> Вариант
<222> (24)...(24)
<223> Хаа = Агд или Вег
<220>
<221> Вариант
<222> (27)...(27)
<223> Хаа = О1п или Вег
<220>
<221> Вариант
<222> (49)...(49)
<223> Хаа = О1у или Ьеи
<220>
<221> Вариант
<222> (50)...(50)
<223> Хаа = ТЬг или Уа1
<220>
<221> Вариант
<222> (52)...(52)
<223> Хаа = Азп или Агд
<220>
<221> Вариант
<222> (53)...(53)
<223> Хаа = Ьеи или Агд
- 58 032084 <220>
<221> Вариант <222> (55)...(55) <223> Хаа = Вег или ТЕг <400> 41
О1х 1 11е Уа1 Хаа ТЕг 5 О1п Вег Рго А1а ТЕг 10 Ьеи Вег Уа1 Вег Рго 15 О1у
О1и Агд А1а ТЕг Ьеи Вег Суз Хаа А1а Вег Хаа Вег Уа1 Вег Туг Меб
20 25 30
Н1з Тгр Туг О1п О1п Ьуз Рго О1у О1п А1а Рго Агд Ьеи Ьеи 11е Туг
35 40 45
Хаа Хаа РЕе Хаа Хаа А1а Хаа О1у 11е Рго Азр Агд РЕе Вег О1у Вег
50 55 60
О1у Вег О1у ТЕг Азр РЕе ТЕг Ьеи ТЕг 11е О1у Агд Ьеи О1и Рго О1и
65 70 75 80
Азр РЕе А1а Уа1 Туг Туг Суз Ьеи О1п Тгр Вег Вег Азр Рго Рго ТЕг
85 90 95
РЕе О1у О1п О1у ТЕг Ьуз Ьеи О1и 11е Ьуз
100 105
<210> 42 <211> 354 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Тяжелая цепь синтетического моноклонального антитела к РСВК9 рЭС04 (клоны ЬОТ-209 и ЬСТ-210) <400> 42 саддббсадс бддбдсадбс бддддсбдад дбдаадаадс сбддддссбс адбдааддбс60 бссбдсаадд сббсбддаба сассббсадс асбабдбаба бдбсббдддб дсдасаддсс120 ссбддасаад ддсббдадбд дабдддаадд абсдабссбд ссаабдадса сасбаасбаб180 дсссадаадб бссаддддад ддбдасбабд асаадддаса сабссабсад сасадссбас240 абддадсбса дсаддсбдас дбсбдасдас асбдссдбсб аббасбдбдс бадаадббас300 баббасбаба асабддасба сбддддбсаа ддбасссбдд бдассдбсад сбса354 <210> 43 <211> 354 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Тяжелая цепь синтетического моноклонального антитела к РСВК9 рВЕ74 (клон ЬОТ-211) <400> 43 саддббсадс бддбдсадбс бддддсбдад дбдаадаадс сбддддссбс адбдааддбс60 бссбдсаадд сббсбддаба сассббсадс асбабдбаба бдбсббдддб дсдасаддсс120 ссбддасаад ддсббдадбд дабдддаадд абсдабссбд ссаабдадса сасбаасбаб180 дсссадаадб бссаддддад ддбдасбабд асаадддаса сабссабсад сасадссбас240 абддадсбса дсаддсбдас дбсбдасдас асбдссдбсб аббасбдбдс бадаадббас300 баббасбабд сбабддасба сбддддбсаа ддбасссбдд бдассдбсад сбса354 <210> 44 <211> 318 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Легкая цепь синтетического моноклонального антитела к РСВК9 рЭС01
- 59 032084 (клон ЬОТ-210) <400> 44 дааабадбда бдасдсадбс бссадссасс сбдбсбдбдб сбссадддда аададссасс60 сбсбссбдса дддссадбса дадбдббадс бабабдсабб ддбассадса даадссаддс120 саддсбссса ддсбссбсаб абабддбдбб ббсадааддд ссасбддсаб сссадасадд180 ббсадбддса дбдддбсбдд дасадасббс асбсбсасса бсддсадасб ддадссбдаа240 даббббдсад бдбасбасбд ссбасадбдд адбадбдасс сасссасдбб бддссааддб300 асдаадсббд аааббааа318 <210> 45 <211> 318 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Легкая цепь синтетического моноклонального антитела к РСВК9 рЭО10 (клоны ЬОТ-209 и ЬОТ-211) <400> 45 садаббдббс бсасссадбс бссадссасс сбдбсбдбдб сбссадддда аададссасс60 сбсбссбдса дддссадбса дадбдббадс бабабдсабб ддбассадса даадссаддс120 саддсбссса ддсбссбсаб абабддбдбб ббсадааддд ссасбддсаб сссадасадд180 ббсадбддса дбдддбсбдд дасадасббс асбсбсасса бсддсадасб ддадссбдаа240 даббббдсад бдбасбасбд ссбасадбдд адбадбдасс сасссасдбб бддссааддб300 асдаадсббд аааббааа318 <210> 46 <211> 13 <212> РРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Эпитоп синтетического моноклонального антитела к РСВК9 <400> 46
Агд Вег Агд Н1з Ьеи А1а О1п А1а Вег О1п О1и Ьеи О1п
5 10 <210> 47 <211> 692 <212> РРТ <213> Ното зарчепз <220>
<223> Препропротеин человеческой пропротеин-конвертазы субтилизин/кексин типа 9 (РСВК9) (синонимы: пропротеин-конвертаза 9 (РС9), нейтральная апоптоз-регулируемая конвертаза 1 (ЫАРС1, ЫАРС-1), РН3, НСНОЬА3, ЬЬЬС<Э1) <220>
<221> ВЬОЫАЬ <222> (1)...(30) <223> Сигнальный пептид <220>
<221> РРОРЕР <222> (31)...(692) <223> Пропротеин <220>
<221> СНАЬЫ <222> (153)...(692) <223> Зрелый белок
- 60 032084 <400> 47
Меб О1у ТИг Уа1 5ег 5ег Агд Агд 5ег Тгр Тгр Рго Ьеи Рго Ьеи Ьеи
-30 -25 -20 -15
Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи О1у Рго А1а О1у А1а Агд А1а О1п О1и
-10 -5 1
Азр О1и Азр О1у Азр Туг О1и О1и Ьеи Уа1 Ьеи А1а Ьеи Агд 5ег О1и
5 10 15
О1и Азр О1у Ьеи А1а О1и А1а Рго О1и Н1з О1у ТИг ТИг А1а ТИг РИе
20 25 30
Н1з Агд Суз А1а Ьуз Азр Рго Тгр Агд Ьеи Рго О1у ТИг Туг Уа1 Уа1
35 40 45 50
Уа1 Ьеи Ьуз О1и О1и ТИг Н1з Ьеи 5ег О1п 5ег О1и Агд ТИг А1а Агд
55 60 65
Агд Ьеи О1п А1а О1п А1а А1а Агд Агд О1у Туг Ьеи ТИг Ьуз 11е Ьеи
70 75 80
Н1з Уа1 РИе Н1з О1у Ьеи Ьеи Рго О1у РИе Ьеи Уа1 Ьуз Меб 5ег О1у
85 90 95
Азр Ьеи Ьеи О1и Ьеи А1а Ьеи Ьуз Ьеи Рго Н1з Уа1 Азр Туг 11е О1и
100 105 110
О1и Азр 5ег 5ег Уа1 РИе А1а О1п 5ег 11е Рго Тгр Азп Ьеи О1и Агд
115 120 125 130
11е ТИг Рго Рго Агд Туг Агд А1а Азр О1и Туг О1п Рго Рго Азр О1у
135 140 145
О1у 5ег Ьеи Уа1 О1и Уа1 Туг Ьеи Ьеи Азр ТИг 5ег 11е О1п 5ег Азр
150 155 160
Н1з Агд О1и 11е О1и О1у Агд Уа1 Меб Уа1 ТИг Азр РИе О1и Азп Уа1
165 170 175
Рго О1и О1и Азр О1у ТИг Агд РИе Н1з Агд О1п А1а 5ег Ьуз Суз Азр
180 185 190
5ег Н1з О1у ТИг Н1з Ьеи А1а О1у Уа1 Уа1 5ег О1у Агд Азр А1а О1у
195 200 205 210
Уа1 А1а Ьуз О1у А1а 5ег Меб Агд 5ег Ьеи Агд Уа1 Ьеи Азп Суз О1п
215 220 225
О1у Ьуз О1у ТИг Уа1 5ег О1у ТИг Ьеи 11е О1у Ьеи О1и РИе 11е Агд
230 235 240
Ьуз 5ег О1п Ьеи Уа1 О1п Рго Уа1 О1у Рго Ьеи Уа1 Уа1 Ьеи Ьеи Рго
245 250 255
Ьеи А1а О1у О1у Туг 5ег Агд Уа1 Ьеи Азп А1а А1а Суз О1п Агд Ьеи
260 265 270
А1а Агд А1а О1у Уа1 Уа1 Ьеи Уа1 ТИг А1а А1а О1у Азп РИе Агд Азр
275 280 285 290
Азр А1а Суз Ьеи Туг 5ег Рго А1а 5ег А1а Рго О1и Уа1 11е ТИг Уа1
295 300 305
О1у А1а ТИг Азп А1а О1п Азр О1п Рго Уа1 ТИг Ьеи О1у ТИг Ьеи О1у
310 315 320
ТИг Азп РИе О1у Агд Суз Уа1 Азр Ьеи РИе А1а Рго О1у О1и Азр 11е
325 330 335
11е О1у А1а 5ег 5ег Азр Суз 5ег ТИг Суз РИе Уа1 5ег О1п 5ег О1у
340 345 350
ТИг 5ег О1п А1а А1а А1а Н1з Уа1 А1а О1у 11е А1а А1а Меб Меб Ьеи
355 360 365 370
5ег А1а О1и Рго О1и Ьеи ТИг Ьеи А1а О1и Ьеи Агд О1п Агд Ьеи 11е
375 380 385
Н1з РИе 5ег А1а Ьуз Азр Уа1 11е Азп О1и А1а Тгр РИе Рго О1и Азр
390 395 400
О1п Агд Уа1 Ьеи ТИг Рго Азп Ьеи Уа1 А1а А1а Ьеи Рго Рго 5ег ТИг
405 410 415
Н1з О1у А1а О1у Тгр О1п Ьеи РИе Суз Агд ТИг Уа1 Тгр 5ег А1а Н1з
420 425 430
5ег О1у Рго ТИг Агд Меб А1а ТИг А1а Уа1 А1а Агд Суз А1а Рго Азр
435 440 445 450
О1и О1и Ьеи Ьеи 5ег Суз 5ег 5ег РИе 5ег Агд 5ег О1у Ьуз Агд Агд
- 61 032084
455 460 465
О1у О1и Агд Меб О1и А1а О1п О1у О1у Ьув Ьеи Уа1 Сув Агд А1а Н1в
470 475 480
Авп А1а РЬе О1у О1у О1и О1у Уа1 Туг А1а 11е А1а Агд Сув Сув Ьеи
485 490 495
Ьеи Рго О1п А1а Авп Сув Вег Уа1 Н1в ТЬг А1а Рго Рго А1а О1и А1а
500 505 510
Вег Меб О1у ТЬг Агд Уа1 Н1в Сув Н1в О1п О1п О1у Н1в Уа1 Ьеи ТЬг
515 520 525 530
О1у Сув Вег Вег Н1в Тгр О1и Уа1 О1и Авр Ьеи О1у ТЬг Н1в Ьув Рго
535 540 545
Рго Уа1 Ьеи Агд Рго Агд О1у О1п Рго Авп О1п Сув Уа1 О1у Н1в Агд
550 555 560
О1и А1а Вег 11е Н1в А1а Вег Сув Сув Н1в А1а Рго О1у Ьеи О1и Сув
565 570 575
Ьув Уа1 Ьув О1и Н1в О1у 11е Рго А1а Рго О1п О1и О1п Уа1 ТЬг Уа1
580 585 590
А1а Сув О1и О1и О1у Тгр ТЬг Ьеи ТЬг О1у Сув Вег А1а Ьеи Рго О1у
595 600 605 610
ТЬг Вег Н1в Уа1 Ьеи О1у А1а Туг А1а Уа1 Авр Авп ТЬг Сув Уа1 Уа1
615 620 625
Агд Вег Агд Авр Уа1 Вег ТЬг ТЬг О1у Вег ТЬг Вег О1и О1у А1а Уа1
630 635 640
ТЬг А1а Уа1 А1а 11е Сув Сув Агд Вег Агд Н1в Ьеи А1а О1п А1а Вег
645 650 655
О1п О1и Ьеи О1п
660
<210> 48 <211> 3636 <212> ДНК <213> Ното варяепв <220>
<221> СРВ <222> (292)...(2370) <223> Препропротеин человеческой пропротеин-конвертазы субтилизин/кексин типа 9 (РСВК9) (синонимы: пропротеин-конвертаза 9 (РС9), нейтральная апоптоз-регулируемая конвертаза 1 (ЫАРС1, ЫАРС-1), РН3, НСНОБА3, ЬЬЬС<21) <220>
<221> втд рербШе <222> (292)...(381) <223> Сигнальный пептид <220>
<221> т1вс_вбгисбиге <222> (382)...(2367) <223> Пропротеин <220>
<221> таб рербШе <222> (538)...(2367) <223> Зрелый белок <400> 48 садсдасдбс даддсдсбса бддббдсадд сдддсдссдс сдббсадббс адддбсбдад60 ссбддаддад бдадссаддс адбдадасбд дсбсдддсдд дссдддасдс дбсдббдсад120 садсддсбсс садсбсссад ссаддаббсс дсдсдссссб бсасдсдссс бдсбссбдаа180 сббсадсбсс бдсасадбсс бссссассдс ааддсбсаад дсдссдссдд сдбддассдс240 дсасддссбс баддбсбссб сдссаддаса дсаассбсбс сссбддсссб сабдддсасс300 дбсадсбсса ддсддбссбд дбддссдсбд ссасбдсбдс бдсбдсбдсб дсбдсбссбд360 ддбсссдсдд дсдсссдбдс дсаддаддас даддасддсд асбасдадда дсбддбдсба420
- 62 032084 дссббдсдбб ббссассдсб даддадассс сдссддддаб дбдаадабда даддаддасб ссасддбасс сбссбадаса дасббсдада дасадбсабд ддбдссадса асссбсабад дбддбдсбдс сбддсдаддд сбсбасбссс садссддбда ссаддддадд дддасабсас ссддадсбса абсаабдадд сбдсссссса сасбсддддс сбдадсбдсб дддддсаадс дссаддбдсб дссадсабдд бсссасбддд садсссаасс ссаддбсбдд дбддссбдсд дбссбддддд асаддсадса сбддсдсадд дддбсааддд абддссбддс бдадбддддс аддбдссадд дбдсбсдддб ббдадсбсбб сббсссабдд адбдбдааад сссбдаббаа сдссссбддб ссаддсбдбд сддсадбдбд асасаббсдс саадсбсаса сбсббсббас дддаасасад бббббссдбб бсдддддада сабббабсбб ббббдсбббб бдасббббба ссдаддадда дсдссаадда ассбсбсдса ассбсассаа дбддсдассб ссбсбдбсбб дддсддабда ссадсабаса абдбдсссда дсасссассб бдсдсадссб дссбддадбб бдссссбддс сбддддбсдб садссбсадс сссбддддас асабсаббдд аддсбдсбдс сссбддссда ссбддббссс дсасссабдд сбасасддаб ссадбббсбс бддбсбдссд дссбдсбасс ддасссдбдб аддбддадда адбдсдбддд аабдсааадб аддадддсбд ссбасдссдб ссадсдаадд ссбсссадда сбддддсбда асдаддддаб адссбссббд аадсбсссбс дсбдссадсб дббссдбдсс абаддддадд дбдсбдабдд бддаддсбба ддбсасаддс сбадсаасас садбддбдса ассссбасбб садсаддаас ббсасссддс ассаддаадс абсасссадд дддссаасаа ббдддбсбдб дбаасббдаа ааабааааас сддссбддсс бссдбддадд дбсададсдс дабссбдсаб дсбддадсбд бдсссададс абассадссс дадбдассас ддаддасддд ддсаддддбд дсдсдбдсбс баббсддааа дддбдддбас дсбддбсасс бсссдаддбс бббддддасс бдссбссадс ссасдбддсб дббдаддсад бдаддассад ддсаддббдд ддссасадсс саддадбддд ддсссасаас ссаддссаас ссасбдссас ссббддсасс ссасадддад сааддадсаб дасссбдасб адасаасасд ддссдбдаса дсбссадбда дсбббааааб ддддабдсбб ссбддаасбс ссбсасбдбд дсбсссаабд аддсаббсаа дддсддбадд сссбсабсбс дсбббсбдда бдбдссббдд ссаааддбдд бдсасбдбсб сасададдаа бдадссадаа бдддсбссбс бсддбдадбд ссбдаббсас сбдбсссбсс ссбсбсбдбб дабабббабб ааасааасдб даадсасссд ббдссбддса асбдсссдсс дбсббссабд дссббдаадб абсссдбдда сссдасддад сдддааабсд асссдсббсс дбсадсддсс аасбдссаад адссадсбдд адссдсдбсс дсбдссддса абсасадббд аасбббддсс дасбдсадса ддсаббдсад адасбдабсс сдддбасбда садсбдбббб дбсдсссдсб аадсддсддд дсббббдддд бдсадсдбсс саасадддсс сасаадссдс дссадсабсс ддаабсссдд ддсбдсадбд бдбдбадбса дссдббдсса садссссабс ддббссдасб ссдссбббсс асбсасбсбд дддсабббса бдссдабдбс бссбсаддбс ддсбдсаддд садсбаасбд бддсабсбад бббссбдадс ссбдсдддда садссаассс дааассбдда асдсадаббд абббббасдд абддсадаас бддссбддсд ббдадсасса дссбббббас сбдддббббд бдбссб адсасддаас ссбасдбддб дссбдсаддс дссббсббсс бдссссабдб ассбддадсд дсадссбддб адддсадддб асадасаддс дддабдссдд ддаадддсас бссадссбдб бсаасдссдс асббссддда дддссассаа дсбдбдбдда ссбдсбббдб ссабдабдсб асббсбсбдс сссссаассб дсаддасбдб дсдссссада дсдадсдсаб дбдадддбдб асасадсбсс асдбссбсас сбдбдсбдад асдсббссбд ссссбсадда сссбсссбдд ддадссддда бсбдсбдссд ссаддабддд бдбсссбсбс ддддсбдсбд ддбдссбссб ссаббсааас сдбдддсада бссассаадд асааасабсд бддадаадсс ссададдсбд сассбббасб дссабсассб дсбссасбас ассададддд ддсбддсбсб дбаасадбда дабдссбдса дадабдсббс дссссассса адссаасббб бадсаббббб сасадссасс ддбдсбдаад ссаддсбдсс бддсббссбд сдасбасабс даббассссб ддаддбдбаб сабддбсасс садсаадбдб сдбддссаад ддббадсддс ддддссасбд сбдссадсдс сдабдссбдс бдсссаадас ссбсбббдсс дбсасададб дбсбдссдад сааадабдбс ддбддссдсс абддбсадса бдаддадсбд ддаддсссаа сбасдссабб ассадсбдад аддсбдсадс дссасдаддб сбдссабдсс дсаддбдасс дассбсссас сдбсадсасб дадссддсас бдбсбдддда бсадсссбсс дссбддсссб ссссаддбдд аддбсдадсб абдасбббба аддсаддабб ббддддддбд ссбдддддсб дадасаддбд сбдсбсбабд аддасбдасб ссддсадддб дсдбдссбдс даадссаадс ддсбдддаад ддсабддаас бааддсабдд адсаадсада бсбадассбд аббаабабдд
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
1320
1380
1440
1500
1560
1620
1680
1740
1800
1860
1920
1980
2040
2100
2160
2220
2280
2340
2400
2460
2520
2580
2640
2700
2760
2820
2880
2940
3000
3060
3120
3180
3240
3300
3360
3420
3480
3540
3600
3636 <210> 49 <211> 13 <212> РРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> С-концевой эпитоп, остатки 680-692, для синтетического антитела к
РСВК9
- 63 032084 <400> 49
Агд Вег Агд Н1з Ьеи А1а О1п А1а Вег О1п О1и Ьеи О1п
5 10 <210> 50 <211> 11 <212> РРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая частичная последовательность человеческой зародышевой линии ЛН4, входящая в Л-сегмент тяжелой цепи антитела к РСВК9 <400> 50
Тгр О1у О1п О1у ТИг Ьеи Да1 ТИг Да1 Вег Вег
5 10 <210> 51 <211> 15 <212> РРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический полноразмерный Л-сегмент из человеческой зародышевой линии ЛН4 <400> 51
Туг РИе Азр Туг Тгр О1у О1п О1у ТИг Ьеи Да1 ТИг Да1 Вег Вег
5 10 15 <210> 52 <211> 10 <212> РРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая частичная последовательность человеческой зародышевой линии Лк2, входящая в Л-сегмент легкой цепи антитела к РСВК9 <400> 52
РИе О1у О1п О1у ТИг Ьуз Ьеи О1и 11е Ьуз
5 10 <210> 53 <211> 12 <212> РРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический полноразмерный Л-сегмент из человеческой зародышевой линии Лк2 <400> 53
Туг ТИг РИе О1у О1п О1у ТИг Ьуз Ьеи О1и 11е Ьуз
5 10 <210> 54
- 64 032084 <211> 354 <212> ДНК <213> Миз тизси1из <220>
<223> Вариабельная область тяжелой цепи мышиного моноклонального антитела к
РСВК9 ЬРИ270 <400> 54 даддббсадс бдсадсадбс бддддсадад сббабдаадс саддддссбс адбсаадббд60 бссбдсасад сббсбддсбб саасабсааа дасабдбаба бдадсбдддб даддсададд120 ссбдаасадд дссбддадбд даббддаадд абсдабссбд сдаабддбса басбаасбаб180 дасссдаадб бссаддссаа ддссасбаба асаасадаса сабссбссаа аасадссбас240 сбдсабсбса дсадссбдас абсбдаддас асбдссдбсб аббасбдбдс бадаадббас300 баббасбабд сбабддасба сбддддбсаа ддаассбсад бсассдбсбс ббса354 <210> 55 <211> 318 <212> ДНК <213> Миз тизси1из <220>
<223> Вариабельная область легкой цепи мышиного моноклонального антитела к
РСВК9 ЬРИ270 <400> 55 саааббдббс бсасссадбс бссадсаабс абдбсбдсаб сбссадддда дааддбсасс60 абдассбдса дбдссадсбс аадбдбаадб басабдсасб ддбассадса даадссадда120 бссбссссса дасбсбддаб ббабббааса ббсаасббдд сббсбддадб сссбдсбсдс180 ббсадбддса дбдддбсбдд дассбсббас бсбсбсбсаа бсадсадсаб ддаддсбдаа240 дабдсбдсса сббаббасбд бсбасадбдд адбадбдасс сасссасдбб сддсбсдддд300 асааадббдд ааабаааа318 <210> 56 <211> 5 <212> РЕТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический С-концевой мутант РСВК9 А685Х <400> 56
Агд Вег Агд Н1з Ьеи
5 <210> 57 <211> 6 <212> РЕТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая С-концевая Е1з6-метка, 6-Н1з-метка, Н1В-метка <400> 57
Н1з Н1з Н1з Н1з Н1з Н1з
5 <210> 58 <211> 19 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
- 65 032084 <220>
<223> Синтетический праймер Д-Н14 для ОТ-ПЦР-амплификации вариабельной области тяжелой цепи <400> 58 сббссбдабд дсадбддбб 19 <210> 59 <211> 39 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер НСсопзбапб для ОТ-ПЦР-амплификации вариабельной области тяжелой цепи <400> 59 дсдбсбадаа усбссасаса саддггссад бддабадас 39 <210> 60 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер Дкарра4/5 для ОТ-ПЦР-амплификации вариабельной области легкой цепи <400> 60 бсадсббсуб дсбаабсадб д <210> 61 <211> 29 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер ЬСсопзбапб для ОТ-ПЦР-амплификации вариабельной области легкой цепи <400> 61 дсдбсбадаа сбддабддбд ддаадабдд <210> 62 <211> 11 <212> РРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический С-концевой гибкий линкер и 6-Н1з-метка <400> 62
А1а А1а О1у А1а Вег Н1з Н1з Н1з Н1з Н1з Н1з
5 10 <210> 63 <211> 17 <212> РРТ <213> Искусственная последовательность
- 66 032084 <220>
<223> Синтетическая Ач1-метка для сайтнаправленного биотинилирования <400> 63
С1у С1у С1у Ьеи Азп Азр 11е РЬе С1и А1а С1п Ьуз 11е С1и Тгр Н1з
5 10 15
С1и
<210> 64
<211> 5
<212> РРТ
<213> Искусственная последовательность
<220> ТМ СОРН1 клона СР066 (Нитапееге^
<223> Синтетический
<400> 64
ТЬг Туг Туг МеГ Азп
1 5
<210> 65
<211> 5
<212> РРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический СОРН1 клона СР038 (мышиный)
<400> 65
Азр МеГ Туг МеГ Сег
1 5
<210> <211> <212> <213> 66 5 РРТ Искусственная последовательность
<220> ТМ СОРН1 клона СР079 (Нитапееге^.
<223> Синтетический
<400> 66
ТЬг МеГ Туг МеГ Сег
1 5
<210> 67 <211> 4 <212> РРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Ν-конец легкой цепи (ЬС) синтетического клона 7472 <400> 67
С1и 11е Уа1 МеГ <210> 68 <211> 12 <212> РРТ
- 67 032084 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> СВК1 легкой цепи (ЬС) синтетического клона 7472 <400> 68
Агд А1а Вег О1п Вег Уа1 Вег Вег Вег Н1з Уа1 А1а
5 10 <210> 69 <211> 4 <212> РЕТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Ν-конец легкой цепи (ЬС) синтетического клона ЬРи720 и рЭС10 <400> 69
О1п 11е Уа1 Ьеи <210> 70 <211> 10 <212> РЕТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Гипервариабельный участок 1(СЕ>К1) легкой цепи (ЬС) клона ЬРИ720 синтетического <400> 70
Вег А1а Вег Вег Вег Уа1 Вег Туг Меб Н1з
5 10
<210> 71
<211> 10
<212> РЕТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Гипервариабельный участок 1(СЕ>К1) легкой цепи (ЬС) синтетического
клона рЭС10
<400> 71
Агд А1а Вег О1п Вег Уа1 Вег Туг Меб Н1з
1 5 10
<210> 72 <211> 12 <212> РЕТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> СВК3 тяжелой цепи (СЬЕН3)синтетического клона 7472 и ЬРИ720 <400> 72
Суз А1а Агд Вег Туг Туг Туг Туг А1а Меб Азр Туг
5 10
- 68 032084 <210> 73 <211> 12 <212> РРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> СВР3 тяжелой цепи (СЬРН3)синтетического клона рДС04 <400> 73
Суз А1а Агд Вег Туг Туг Туг Туг Азп Меб Азр Туг
5 10 <210> 74 <211> 17 <212> РРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> СВР2 тяжелой цепи синтетического антитела к РСВК9 <400> 74
Агд 11е Азр Рго А1а Азп О1и Н1з ТЬг Азп Туг А1а О1п Ьуз РЬе О1п
5 10 15
О1у <210> 75 <211> 9 <212> РРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> СВР3 тяжелой цепи синтетического антитела к РСВК9
<221> Вариант
<222> <223> (6)... Хаа = . (6) А1а или Азп
<400> 75
Вег Туг Туг Туг Туг Хаа Меб Азр Туг
1 5
<210> 76 <211> 23 <212> РРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> РР1 легкой цепи синтетического антитела к РСВК9 <220>
<221> Вариант <222> (4)...(4) <223> Хаа = Меб или Ьеи <400> 76
О1х 11е Уа1 Хаа ТЬг О1п Вег Рго А1а ТЬг Ьеи Вег Уа1 Вег Рго О1у
1 5 10 15
О1и Агд А1а ТЬг Ьеи Вег Суз
20
- 69 032084

Claims (36)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Антитело, которое связывается с пропротеин-конвертазой субтилизин/кексин типа 9 (РС8К9), где антитело содержит:
    I) гипервариабельный участок 1 (СИРТ) тяжелой цепи, содержащий 8Е0 ГО N0: 7;
    II) гипервариабельный участок 2 (СИК2) тяжелой цепи, содержащий 8Е0 ГО N0: 10;
    III) гипервариабельный участок 3 (СИК3) тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей 8Е0 ГО N0: 12 и 8Е0 ГО N0: 13;
    IV) СОРТ легкой цепи, содержащий 8Е0 ГО N0: 21;
    V) СИК2 легкой цепи, содержащий 8Е0 ГО N0: 24; и
    VI) СИКЗ легкой цепи, содержащий 8Е0 ГО N0: 26.
  2. 2. Антитело по п.1, в котором аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи идентична по меньшей мере на 90% аминокислотной последовательности вариабельной области, представленной в 8Е0 ГО N0: 40, и аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи идентична по меньшей мере на 90% аминокислотной последовательности вариабельной области, представленной в 8Е0 ГО N0: 41.
  3. 3. Антитело по п.1, в котором аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи идентична по меньшей мере на 95% аминокислотной последовательности вариабельной области, представленной в 8Е0 ГО N0: 40, и аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи идентична по меньшей мере на 95% аминокислотной последовательности вариабельной области, представленной в 8Е0 ГО N0: 41.
  4. 4. Антитело по п.1, где антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит 8Е0 ГО N0: 40, и вариабельную область легкой цепи, которая содержит 8Е0 ГО N0: 41.
  5. 5. Антитело по п.1, в котором аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи идентична по меньшей мере на 90% аминокислотной последовательности вариабельной области, выбранной из группы, включающей 8Е0 ГО N0: 2 и 8Е0 ГО N0: 4, и аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи идентична по меньшей мере на 90% аминокислотной последовательности вариабельной области, выбранной из группы, включающей 8Е0 ГО N0: 16 и 8Е0 ГО N0: 18.
  6. 6. Антитело по п.1, в котором аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи идентична по меньшей мере на 95% аминокислотной последовательности вариабельной области, выбранной из группы, включающей 8Е0 ГО N0: 2 и 8Е0 ГО N0: 4, и аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи идентична по меньшей мере на 95% аминокислотной последовательности вариабельной области, выбранной из группы, включающей 8Е0 ГО N0: 16 и 8Е0 ГО N0: 18.
  7. 7. Антитело по п.1, в котором вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей 8Е0 ГО N0: 2 и 8Е0 ГО N0: 4, и вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей 8Е0 ГО N0: 16 и 8Е0 ГО N0: 18.
  8. 8. ЕаЬ'-фрагмент антитела по п.1.
  9. 9. Антитело по п.1, где антитело представляет собой ^С.
  10. 10. Антитело по п.1, где антитело представляет собой одноцепочечное антитело (ксЕу).
  11. 11. Антитело по п.1, где антитело содержит человеческие константные области.
  12. 12. Антитело по п.1, где антитело связано с белком-носителем.
  13. 13. Антитело по п.1, где антитело является ПЭГилированным.
  14. 14. Антитело, которое специфически связывается с РС8К9, где антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи, каждая, содержат три следующих гипервариабельных участка (СИК): С1)Р1. СПИ2 и С1Ж3. где
    I) СИК1 вариабельной области тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей 8Е0 ГО N0: 6 и 8Е0 ГО N0: 7;
    II) СИК2 вариабельной области тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей 8Е0 ГО N0: 9 и 8Е0 ГО N0: 10;
    III) СИК3 вариабельной области тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей 8Е0 ГО N0: 12 и 8Е0 ГО N0: 13;
    IV) СЭК 1 вариабельной области легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей 8Е0 ГО N0: 20 и 8Е0 ГО N0: 21;
    V) СИК2 вариабельной области легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей 8Е0 ГО N0: 23 и 8Е0 ГО N0: 24;
    VI) СЭК3 вариабельной области легкой цепи содержит аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 26.
  15. 15. Композиция для снижения холестерина липопротеинов низкой плотности (ЛПНП-Х) у индивидуума, нуждающегося в этом, содержащая антитело по п.1 или 14 и физиологически совместимый эксципиент.
    - 70 032084
  16. 16. Композиция по п.15, где композиция содержит также второй агент, который снижает уровень ЛПНП-Х у индивидуума.
  17. 17. Композиция по п.16, в которой второй агент представляет собой статин.
  18. 18. Композиция по п.17, в которой статин выбран из группы, включающей аторвастатин, церивастатин, флувастатин, ловастатин, мевастатин, питавастатин, правастатин, розувастатин и симвастатин.
  19. 19. Композиция по п.16, в которой второй агент выбран из группы, включающей фибраты, ниацин и его аналоги, ингибиторы абсорбции холестерина, секвестранты желчных кислот, миметики тиреоидного гормона, ингибитор микросомального белка-переносчика триглицеридов (МТР), ингибитор диацилглицеролацилтрансферазы (БСАТ), нуклеиновую кислоту-ингибитор, мишенью которой является РС8К9, и нуклеиновую кислоту-ингибитор, мишенью которой является ароВ100.
  20. 20. Способ снижения уровня ЛПНП-Х у индивидуума, который нуждается в этом, заключающийся в том, что индивидууму вводят в терапевтически эффективном количестве антитело по п.1 или 14.
  21. 21. Способ по п.20, в котором индивидуум обладает пониженной чувствительностью или устойчивостью к терапии статинами.
  22. 22. Способ по п.20, в котором индивидуум обладает интолерантностью к терапии статинами.
  23. 23. Способ по п.20, в котором у индивидуума исходный уровень ЛПНП-Х составляет по меньшей мере примерно 100 мг/дл.
  24. 24. Способ по п.20, в котором индивидуум страдает семейной гиперхолестеринемией.
  25. 25. Способ по п.20, в котором общий уровень холестерина также снижается вместе с ЛПНП-Х.
  26. 26. Способ по п.20, в котором индивидуум страдает триглицеридемией.
  27. 27. Способ по п.20, в котором индивидуум имеет мутацию, приводящую к усилению функции по доминантно-негативному типу гена РС8К9.
  28. 28. Способ по п.20, в котором индивидуум страдает индуцируемой лекарственными средствами дислипидемией.
  29. 29. Способ по п.20, дополнительно заключающийся в том, что индивидууму вводят в терапевтически эффективном количестве второй агент, снижающий уровень ЛПНП-Х.
  30. 30. Способ по п.29, в котором второй агент представляет собой статин.
  31. 31. Способ по п.30, в котором статин выбирают из группы, включающей аторвастатин, церивастатин, флувастатин, ловастатин, мевастатин, питавастатин, правастатин, розувастатин и симвастатин.
  32. 32. Способ по п.29, в котором второй агент выбирают из группы, включающей фибраты, ниацин и его аналоги, ингибиторы абсорбции холестерина, секвестранты желчных кислот, миметики тиреоидного гормона, ингибитор микросомального белка-переносчика триглицеридов (МТР), ингибитор диацилглицеролацилтрансферазы (БСАТ), нуклеиновую кислоту-ингибитор, мишенью которой является РС8К9, и нуклеиновую кислоту-ингибитор, мишенью которой является ароВ100.
  33. 33. Способ по п.29, в котором антитело и второй агент применяют совместно в виде смеси.
  34. 34. Способ по п.29, в котором антитело и второй агент применяют совместно, но вводят раздельно.
  35. 35. Способ по п.20, в котором антитело вводят внутривенно.
  36. 36. Способ по п.20, в котором антитело вводят подкожно.
    Последовательности вариабельных областей родительского мышиного МАт ЬРи720
    Вариабельная область тяжелой цепи ЬРЦ720
    Εν0Ε0080ΑΕΕΜΚΡΒΑ8νΚΕ8(ΠΑ8(3ΡΝΙΚΡΜΥΜ8\¥νΚ0ΚΡΕ06ΕΕ\νΐ6ΚΙΡΡΑΝ 6ΗΤΝΥΡΡΚΕ0ΑΚΑΤΙΤΤΡΤ88ΚΤΑΥΕΗΕ88ΕΤ8ΕΡΤΑνΥΥ0ΑΚ8ΥΥΥΥΑΜΡΥ1¥ΟΟ ОТ8УТУ88
    Вариабельная область легкой цепи ЬГЦ720
    О1УЬТО8РА1М8А8РСЕКУТМТС8А888У8УМНВ¥УООКРО88РКЕ\У1УЬТРМЕА 8СУРАКР8О8С8ОТ8У8Ь8188МЕАЕРААТУУСЬОУУ88РРРТРО8ОТКЕЕ1К
EA201200861A 2009-12-11 2010-12-10 Антагонисты pcsk9 EA032084B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US28594209P 2009-12-11 2009-12-11
PCT/US2010/059959 WO2011072263A1 (en) 2009-12-11 2010-12-10 Pcsk9 antagonists

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201200861A1 EA201200861A1 (ru) 2013-01-30
EA032084B1 true EA032084B1 (ru) 2019-04-30

Family

ID=43466865

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201200861A EA032084B1 (ru) 2009-12-11 2010-12-10 Антагонисты pcsk9

Country Status (31)

Country Link
US (1) US8710192B2 (ru)
EP (1) EP2510013B1 (ru)
JP (2) JP5981347B2 (ru)
KR (1) KR101915496B1 (ru)
CN (1) CN102652139B (ru)
AR (1) AR079336A1 (ru)
AU (1) AU2010327924B2 (ru)
BR (1) BR112012013782A8 (ru)
CA (1) CA2781050C (ru)
CL (1) CL2012001529A1 (ru)
CO (1) CO6571886A2 (ru)
CR (1) CR20120371A (ru)
CU (1) CU24058B1 (ru)
EA (1) EA032084B1 (ru)
EC (1) ECSP12012034A (ru)
ES (1) ES2726040T3 (ru)
GT (1) GT201200189A (ru)
HN (1) HN2012001223A (ru)
IL (1) IL220091A0 (ru)
IN (1) IN2012DN05237A (ru)
MA (1) MA33903B1 (ru)
MX (1) MX2012006648A (ru)
NZ (2) NZ625433A (ru)
PE (1) PE20121361A1 (ru)
PL (1) PL2510013T3 (ru)
PT (1) PT2510013T (ru)
TN (1) TN2012000243A1 (ru)
TR (1) TR201906696T4 (ru)
TW (1) TWI523662B (ru)
UY (1) UY33102A (ru)
WO (1) WO2011072263A1 (ru)

Families Citing this family (137)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JOP20080381B1 (ar) 2007-08-23 2023-03-28 Amgen Inc بروتينات مرتبطة بمولدات مضادات تتفاعل مع بروبروتين كونفيرتاز سيتيليزين ككسين من النوع 9 (pcsk9)
US20130064834A1 (en) 2008-12-15 2013-03-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating hypercholesterolemia using antibodies to pcsk9
JO3672B1 (ar) 2008-12-15 2020-08-27 Regeneron Pharma أجسام مضادة بشرية عالية التفاعل الكيماوي بالنسبة لإنزيم سبتيليسين كنفرتيز بروبروتين / كيكسين نوع 9 (pcsk9).
MX367075B (es) 2011-01-28 2019-08-05 Sanofi Biotechnology Anticuerpos humanos frente a pcsk9 para su uso en metodos de tratamiento de grupos concretos de pacientes.
US20140004142A1 (en) * 2011-03-02 2014-01-02 Pfizer Inc. Pcsk9 vaccine
AR088782A1 (es) * 2011-04-29 2014-07-10 Sanofi Sa Sistemas de ensayo y metodos para identificar y caracterizar farmacos hipolipemiantes
WO2012168491A1 (en) 2011-06-10 2012-12-13 Novartis Ag Pharmaceutical formulations of pcsk9 antagonists
WO2012170607A2 (en) * 2011-06-10 2012-12-13 Novartis Ag Use of pcsk9 antagonists
CN104093423A (zh) * 2011-07-14 2014-10-08 辉瑞公司 使用抗pcsk9抗体的治疗
AR087305A1 (es) 2011-07-28 2014-03-12 Regeneron Pharma Formulaciones estabilizadas que contienen anticuerpos anti-pcsk9, metodo de preparacion y kit
CA2848201C (en) 2011-09-16 2020-10-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for reducing lipoprotein(a) levels by administering an inhibitor of proprotein convertase subtilisin kexin-9 (pcsk9)
AR087715A1 (es) 2011-09-16 2014-04-09 Lilly Co Eli Anticuerpos anti pcsk9 y usos de los mismos
EP2788384B1 (en) 2011-12-08 2017-08-09 Amgen Inc. Agonistic human lcat antigen binding proteins and their use in therapy
WO2013091103A1 (en) * 2011-12-20 2013-06-27 Adaerata, Limited Partnership Single domain antibodies as inhibitors of pcsk9
US9255154B2 (en) * 2012-05-08 2016-02-09 Alderbio Holdings, Llc Anti-PCSK9 antibodies and use thereof
MX2014014830A (es) * 2012-06-15 2015-05-11 Genentech Inc Anticuerpos anti-pcsk9, formulaciones, dosificacion y metodos de uso.
JP6309521B2 (ja) 2012-08-13 2018-04-11 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． ｐＨ依存性結合特性を有する抗ＰＣＳＫ９抗体
EP2703009A1 (en) * 2012-08-31 2014-03-05 Sanofi Combination treatments involving antibodies to human PCSK9
EP2706070A1 (en) * 2012-09-06 2014-03-12 Sanofi Combination treatments involving antibodies to human PCSK9
AU2013348071B2 (en) 2012-11-21 2018-05-24 Amgen Inc. Drug delivery device
US10287317B2 (en) * 2013-02-15 2019-05-14 Srx Cardio, Llc Proprotein convertase subtilisin kexin type 9 (PCSK9) allosteric binding ligands to modulate serum low density lipoprotein (LDL) levels
TWI592183B (zh) 2013-03-15 2017-07-21 安美基公司 本體輪廓可調適之自動注射器裝置
WO2014143815A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Amgen Inc. Drug cassette, autoinjector, and autoinjector system
EP2968760B1 (en) 2013-03-15 2024-01-03 Amgen Inc. Drug cassette, autoinjector, and autoinjector system
LT2976117T (lt) 2013-03-22 2021-02-25 Amgen Inc. Purkštuvas ir surinkimo būdas
US10111953B2 (en) 2013-05-30 2018-10-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for reducing remnant cholesterol and other lipoprotein fractions by administering an inhibitor of proprotein convertase subtilisin kexin-9 (PCSK9)
TWI682780B (zh) * 2013-05-30 2020-01-21 美商再生元醫藥公司 醫藥組成物用於製造治療與ｐｃｓｋ９功能獲得性突變有關之體染色體顯性高膽固醇血症的藥物之用途
EP2862877A1 (en) 2013-10-18 2015-04-22 Sanofi Methods for inhibiting atherosclerosis by administering an inhibitor of PCSK9
KR20160024906A (ko) 2013-06-07 2016-03-07 사노피 바이오테크놀로지 Ｐｃｓｋ9의 억제제를 투여함에 의한 죽상경화증의 억제 방법
US20150004174A1 (en) * 2013-06-28 2015-01-01 Amgen Inc. Methods for treating homozygous familial hypercholesterolemia
BR112016008946B1 (pt) 2013-10-24 2022-12-27 Amgen Inc Injetores e método para montar os injetor
EP3501575B1 (en) 2013-10-24 2021-12-01 Amgen Inc. Drug delivery system with temperature-sensitive-control
US10428157B2 (en) 2013-11-12 2019-10-01 Sanofi Biotechnology Dosing regimens for use with PCSK9 inhibitors
US9023359B1 (en) 2014-07-15 2015-05-05 Kymab Limited Targeting rare human PCSK9 variants for cholesterol treatment
US9914769B2 (en) 2014-07-15 2018-03-13 Kymab Limited Precision medicine for cholesterol treatment
US8986691B1 (en) 2014-07-15 2015-03-24 Kymab Limited Method of treating atopic dermatitis or asthma using antibody to IL4RA
US9034332B1 (en) 2014-07-15 2015-05-19 Kymab Limited Precision medicine by targeting rare human PCSK9 variants for cholesterol treatment
US9051378B1 (en) 2014-07-15 2015-06-09 Kymab Limited Targeting rare human PCSK9 variants for cholesterol treatment
US8883157B1 (en) 2013-12-17 2014-11-11 Kymab Limited Targeting rare human PCSK9 variants for cholesterol treatment
US9045548B1 (en) 2014-07-15 2015-06-02 Kymab Limited Precision Medicine by targeting rare human PCSK9 variants for cholesterol treatment
FR3014695A1 (ru) * 2013-12-17 2015-06-19 Kymab Ltd
US8992927B1 (en) 2014-07-15 2015-03-31 Kymab Limited Targeting human NAV1.7 variants for treatment of pain
US9017678B1 (en) 2014-07-15 2015-04-28 Kymab Limited Method of treating rheumatoid arthritis using antibody to IL6R
DE202014010499U1 (de) 2013-12-17 2015-10-20 Kymab Limited Targeting von humaner PCSK9 zur Cholesterinbehandlung
US8945560B1 (en) 2014-07-15 2015-02-03 Kymab Limited Method of treating rheumatoid arthritis using antibody to IL6R
US9067998B1 (en) 2014-07-15 2015-06-30 Kymab Limited Targeting PD-1 variants for treatment of cancer
US8986694B1 (en) 2014-07-15 2015-03-24 Kymab Limited Targeting human nav1.7 variants for treatment of pain
US8980273B1 (en) 2014-07-15 2015-03-17 Kymab Limited Method of treating atopic dermatitis or asthma using antibody to IL4RA
US9045545B1 (en) 2014-07-15 2015-06-02 Kymab Limited Precision medicine by targeting PD-L1 variants for treatment of cancer
WO2015119906A1 (en) 2014-02-05 2015-08-13 Amgen Inc. Drug delivery system with electromagnetic field generator
GB201403775D0 (en) 2014-03-04 2014-04-16 Kymab Ltd Antibodies, uses & methods
EP3139977B1 (en) 2014-05-07 2021-02-17 Amgen Inc. Autoinjector with shock reducing elements
SG11201609966SA (en) 2014-06-03 2016-12-29 Amgen Inc Drug delivery system and method of use
US9139648B1 (en) 2014-07-15 2015-09-22 Kymab Limited Precision medicine by targeting human NAV1.9 variants for treatment of pain
US9150660B1 (en) 2014-07-15 2015-10-06 Kymab Limited Precision Medicine by targeting human NAV1.8 variants for treatment of pain
DE202015009002U1 (de) 2014-07-15 2016-08-18 Kymab Limited Targeting von humaner PCSK9 zur Cholesterinbehandlung
EP4328245A3 (en) 2014-07-15 2024-06-05 Kymab Ltd. Antibodies for use in treating conditions related to specific pcsk9 variants in specific patients populations
EP2975059A1 (en) 2014-07-15 2016-01-20 Kymab Limited Antibodies for use in treating conditions related to specific pcsk9 variants in specific patients populations
AU2015289613B2 (en) 2014-07-16 2021-07-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating patients with heterozygous familial hypercholesterolemia (heFH)
WO2016023916A1 (en) 2014-08-12 2016-02-18 Kymab Limited Treatment of disease using ligand binding to targets of interest
WO2016046684A1 (en) * 2014-09-23 2016-03-31 Pfizer Inc. Treatment with anti-pcsk9 antibodies
MX2021014323A (es) 2014-10-14 2023-02-02 Amgen Inc Dispositivo de inyección de fármaco con indicadores visuales y audibles.
WO2016071701A1 (en) 2014-11-07 2016-05-12 Kymab Limited Treatment of disease using ligand binding to targets of interest
EP3848072A1 (en) 2014-12-19 2021-07-14 Amgen Inc. Drug delivery device with proximity sensor
EP3689394A1 (en) 2014-12-19 2020-08-05 Amgen Inc. Drug delivery device with live button or user interface field
EP3556411B1 (en) 2015-02-17 2021-06-30 Amgen Inc. Drug delivery device with vacuum assisted securement and/or feedback
EP3261690B1 (en) 2015-02-27 2021-12-15 Amgen Inc. Drug delivery device having a needle guard mechanism with a tunable threshold of resistance to needle guard movement
BR112017020091A2 (pt) * 2015-03-20 2018-11-06 Aarhus Universitet inibidores de pcsk9 para tratamento de distúrbios do metabolismo de lipoproteínas
CN106084058B (zh) * 2015-07-15 2019-08-27 北京天广实生物技术股份有限公司 抗人pcsk9单克隆抗体
CN107922507B (zh) 2015-08-18 2022-04-05 瑞泽恩制药公司 抗pcsk9抑制性抗体用来治疗接受脂蛋白单采的高脂血症患者
WO2017039786A1 (en) 2015-09-02 2017-03-09 Amgen Inc. Syringe assembly adapter for a syringe
US11351308B2 (en) 2015-12-09 2022-06-07 Amgen Inc. Auto-injector with signaling cap
WO2017114230A1 (zh) 2015-12-31 2017-07-06 江苏恒瑞医药股份有限公司 Pcsk9抗体、其抗原结合片段及其医药用途
CN107531795B (zh) 2016-01-05 2021-01-19 江苏恒瑞医药股份有限公司 Pcsk9抗体、其抗原结合片段及其医药用途
WO2017120178A1 (en) 2016-01-06 2017-07-13 Amgen Inc. Auto-injector with signaling electronics
ES2814287T3 (es) 2016-03-15 2021-03-26 Amgen Inc Reducir la probabilidad de rotura de cristal en dispositivos de administración de fármaco
CN105801701B (zh) * 2016-03-31 2019-03-29 河北仁博科技有限公司 一种pcsk9抗体的重链和轻链可变区及其应用
WO2017189089A1 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Amgen Inc. Drug delivery device with messaging label
US11389588B2 (en) 2016-05-02 2022-07-19 Amgen Inc. Syringe adapter and guide for filling an on-body injector
WO2017197222A1 (en) 2016-05-13 2017-11-16 Amgen Inc. Vial sleeve assembly
WO2017200989A1 (en) 2016-05-16 2017-11-23 Amgen Inc. Data encryption in medical devices with limited computational capability
WO2017209899A1 (en) 2016-06-03 2017-12-07 Amgen Inc. Impact testing apparatuses and methods for drug delivery devices
EP3478342A1 (en) 2016-07-01 2019-05-08 Amgen Inc. Drug delivery device having minimized risk of component fracture upon impact events
WO2018034784A1 (en) 2016-08-17 2018-02-22 Amgen Inc. Drug delivery device with placement detection
WO2018081234A1 (en) 2016-10-25 2018-05-03 Amgen Inc. On-body injector
EP3534947A1 (en) 2016-11-03 2019-09-11 Kymab Limited Antibodies, combinations comprising antibodies, biomarkers, uses & methods
JOP20190112A1 (ar) 2016-11-14 2019-05-14 Amgen Inc علاجات مدمجة لتصلب الشرايين، شاملة مرض قلبي وعائي تصلبي
AU2018210301A1 (en) 2017-01-17 2019-08-01 Amgen Inc. Injection devices and related methods of use and assembly
US11369736B2 (en) 2017-02-17 2022-06-28 Amgen Inc. Cannula insertion and retraction mechanisms
CA3048520A1 (en) 2017-02-17 2018-08-23 Amgen Inc. Drug delivery device with sterile fluid flowpath and related method of assembly
JP2020508803A (ja) 2017-03-06 2020-03-26 アムジエン・インコーポレーテツド 作動防止特徴部を備える薬物送達デバイス
SG11201908058UA (en) 2017-03-07 2019-09-27 Amgen Inc Needle insertion by overpressure
KR102619150B1 (ko) 2017-03-09 2023-12-27 암겐 인코포레이티드 약물 전달 장치용 삽입 메커니즘
SI3600491T1 (sl) 2017-03-28 2023-11-30 Amgen Inc. Sistem in postopek za sestavljanja droga bata in brizge
CA3058567A1 (en) 2017-04-13 2018-10-18 Cadila Healthcare Limited Novel peptide based pcsk9 vaccine
AU2018280054B2 (en) 2017-06-08 2023-07-13 Amgen Inc. Syringe assembly for a drug delivery device and method of assembly
CN110709121B (zh) 2017-06-08 2022-06-24 安进公司 扭矩驱动式药物递送装置
MX2019015472A (es) 2017-06-22 2020-02-19 Amgen Inc Reduccion del impacto/choque de la activacion del mecanismo.
WO2018237225A1 (en) 2017-06-23 2018-12-27 Amgen Inc. ELECTRONIC DRUG DELIVERY DEVICE COMPRISING A CAP ACTIVATED BY A SWITCH ASSEMBLY
EP3651832B1 (en) 2017-07-14 2023-12-13 Amgen Inc. Needle insertion-retraction system having dual torsion spring system
MA49626A (fr) 2017-07-21 2020-05-27 Amgen Inc Élément d'étanchéité perméable aux gaz pour récipient à médicament et procédés d'assemblage
MA49676A (fr) 2017-07-25 2020-06-03 Amgen Inc Dispositif d'administration de médicament doté d'un système d'accès à un récipient et procédé d'assemblage associé
EP3658203B1 (en) 2017-07-25 2022-08-31 Amgen Inc. Drug delivery device with gear module and related method of assembly
WO2019032482A2 (en) 2017-08-09 2019-02-14 Amgen Inc. HYDRAULIC-PNEUMATIC PRESSURE CHAMBER DELIVERY SYSTEM
EP3668567A1 (en) 2017-08-18 2020-06-24 Amgen Inc. Wearable injector with sterile adhesive patch
US11103636B2 (en) 2017-08-22 2021-08-31 Amgen Inc. Needle insertion mechanism for drug delivery device
MA50611A (fr) 2017-10-04 2020-08-12 Amgen Inc Adaptateur d'écoulement destiné à un dispositif d'administration de médicament
WO2019070552A1 (en) 2017-10-06 2019-04-11 Amgen Inc. DRUG DELIVERY DEVICE COMPRISING A LOCKOUT ASSEMBLY AND ASSOCIATED ASSEMBLY METHOD
US11464903B2 (en) 2017-10-09 2022-10-11 Amgen Inc. Drug delivery device with drive assembly and related method of assembly
MA50527A (fr) 2017-11-03 2020-09-09 Amgen Inc Système et approches pour stériliser un dispositif d'administration de médicament
EP3706830B1 (en) 2017-11-06 2024-08-07 Amgen Inc. Drug delivery device with placement and flow sensing
EP3707075A1 (en) 2017-11-06 2020-09-16 Amgen Inc. Fill-finish assemblies and related methods
CN111225696B (zh) 2017-11-10 2023-07-18 安进公司 用于药物递送装置的柱塞
AU2018368340B2 (en) 2017-11-16 2024-03-07 Amgen Inc. Door latch mechanism for drug delivery device
AU2018368338B2 (en) 2017-11-16 2024-07-25 Amgen Inc. Autoinjector with stall and end point detection
US10835685B2 (en) 2018-05-30 2020-11-17 Amgen Inc. Thermal spring release mechanism for a drug delivery device
US11083840B2 (en) 2018-06-01 2021-08-10 Amgen Inc. Modular fluid path assemblies for drug delivery devices
MA53379A (fr) 2018-07-24 2021-06-02 Amgen Inc Dispositifs d'administration pour l'administration de médicaments
MA53375A (fr) 2018-07-24 2021-06-02 Amgen Inc Dispositifs d'administration pour l'administration de médicaments
US12115360B2 (en) 2018-07-24 2024-10-15 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with grip portion
WO2020023220A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with tacky skin attachment portion and related method of preparation
US12109389B2 (en) 2018-07-31 2024-10-08 Amgen Inc. Fluid path assembly for a drug delivery device
US20210346601A1 (en) 2018-09-24 2021-11-11 Amgen Inc. Interventional dosing systems and methods
AU2019350660B2 (en) 2018-09-28 2024-09-26 Amgen Inc. Muscle wire escapement activation assembly for a drug delivery device
CN117159846A (zh) 2018-10-02 2023-12-05 安进公司 具有内部力传递的用于药物递送的注射系统
WO2020072698A1 (en) * 2018-10-02 2020-04-09 Exosome Therapeutics, Inc. Compositions and methods for producing exosome loaded therapeutics for treating cardiovascular disease
CA3112214A1 (en) 2018-10-05 2020-04-09 Amgen Inc. Drug delivery device having dose indicator
MX2021002791A (es) 2018-10-15 2021-05-12 Amgen Inc Proceso de ensamblaje de plataforma para un dispositivo de administracion de farmacos.
MA53912A (fr) 2018-10-15 2022-01-19 Amgen Inc Dispositif d'administration de médicament comprenant un mécanisme d'amortissement
EP3873563A1 (en) 2018-11-01 2021-09-08 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
TWI831847B (zh) 2018-11-01 2024-02-11 美商安進公司 部分針頭縮回之藥物遞送裝置及其操作方法
US11213620B2 (en) 2018-11-01 2022-01-04 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
BR112021013807A2 (pt) 2019-01-18 2021-11-30 Astrazeneca Ab Inibidores de pcsk9 e seus métodos de uso
CA3137360A1 (en) 2019-04-24 2020-10-29 Amgen Inc. Syringe sterilization verification assemblies and methods
JP2022532423A (ja) 2019-05-17 2022-07-14 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 心血管系リスクを減らすためのゲノムに基づく方法
WO2021041067A2 (en) 2019-08-23 2021-03-04 Amgen Inc. Drug delivery device with configurable needle shield engagement components and related methods
US20240208680A1 (en) 2021-05-21 2024-06-27 Amgen Inc. Method of optimizing a filling recipe for a drug container

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008057459A2 (en) * 2006-11-07 2008-05-15 Merck & Co., Inc. Antagonists of pcsk9
WO2009026558A1 (en) * 2007-08-23 2009-02-26 Amgen Inc. Antigen binding proteins to proprotein convertase subtilisin kexin type 9 (pcsk9)
WO2009100297A1 (en) * 2008-02-07 2009-08-13 Merck & Co., Inc. 1d05 pcsk9 antagonists
WO2010068526A1 (en) * 2008-12-12 2010-06-17 Merck Sharp & Dohme Corp. Pcsk9 immunoassay

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5612114B2 (ru) 1974-06-07 1981-03-18
AU548996B2 (en) 1980-02-04 1986-01-09 Merck & Co., Inc. Tetrahydro-2h-pyran-2-one derivatives
US4444784A (en) 1980-08-05 1984-04-24 Merck & Co., Inc. Antihypercholesterolemic compounds
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
WO1988007089A1 (en) 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
NO177005C (no) 1988-01-20 1995-07-05 Bayer Ag Analogifremgangsmåte for fremstilling av substituerte pyridiner, samt mellomprodukter til bruk ved fremstillingen
FI94339C (fi) 1989-07-21 1995-08-25 Warner Lambert Co Menetelmä farmaseuttisesti käyttökelpoisen /R-(R*,R*)/-2-(4-fluorifenyyli)- , -dihydroksi-5-(1-metyylietyyli)-3-fenyyli-4-/(fenyyliamino)karbonyyli/-1H-pyrroli-1-heptaanihapon ja sen farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen valmistamiseksi
US5177080A (en) 1990-12-14 1993-01-05 Bayer Aktiengesellschaft Substituted pyridyl-dihydroxy-heptenoic acid and its salts
JP2648897B2 (ja) 1991-07-01 1997-09-03 塩野義製薬株式会社 ピリミジン誘導体
US20110230392A1 (en) 1999-10-22 2011-09-22 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Novel narc sc1, narc 10a, narc 1, narc 12, narc 13, narc17, narc 25, narc 3, narc 4, narc 7, narc 8, narc 11, narc 14a, narc 15, narc 16, narc 19, narc 20, narc 26, narc 27, narc 28, narc 30, narc 5, narc 6, narc 9, narc 10c, narc 8b, narc 9, narc2a, narc 16b, narc 1c, narc 1a, and narc 25 molecules and uses therefor
EP1257572A2 (en) 2000-02-07 2002-11-20 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Narc-1, subtilase-like homologs
AU2005207003C1 (en) 2004-01-20 2013-06-13 Humanigen, Inc. Antibody specificity transfer using minimal essential binding determinants
PL3540062T3 (pl) 2004-11-16 2021-12-27 Humanigen, Inc. Wymiana kasety dla regionu zmiennego immunoglobuliny
US8211648B2 (en) 2005-07-22 2012-07-03 Kalobios Pharmaceuticals, Inc. Secretion of antibodies without signal peptides from bacteria
ES2366974T3 (es) * 2006-05-05 2011-10-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compuestos y procedimientos para modular la expresión de sglt2.
JP5570806B2 (ja) * 2006-05-11 2014-08-13 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド Ｐｃｓｋ９遺伝子の発現を阻害するための組成物および方法
EP2083859A4 (en) 2006-11-07 2010-11-24 Merck Sharp & Dohme ANTAGONISTS OF PCSK9
WO2008057458A2 (en) 2006-11-07 2008-05-15 Merck & Co., Inc. Antagonists of pcsk9
AR070315A1 (es) 2008-02-07 2010-03-31 Merck & Co Inc Anticuerpos 1b20 antagonistas de pcsk9
AU2009273768B2 (en) 2008-07-25 2016-07-14 Spp Industries Holdings Pty Ltd A head rail for a blind
TWI516501B (zh) 2008-09-12 2016-01-11 禮納特神經系統科學公司 Ｐｃｓｋ９拮抗劑類
JO3672B1 (ar) 2008-12-15 2020-08-27 Regeneron Pharma أجسام مضادة بشرية عالية التفاعل الكيماوي بالنسبة لإنزيم سبتيليسين كنفرتيز بروبروتين / كيكسين نوع 9 (pcsk9).

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008057459A2 (en) * 2006-11-07 2008-05-15 Merck & Co., Inc. Antagonists of pcsk9
WO2009026558A1 (en) * 2007-08-23 2009-02-26 Amgen Inc. Antigen binding proteins to proprotein convertase subtilisin kexin type 9 (pcsk9)
WO2009100297A1 (en) * 2008-02-07 2009-08-13 Merck & Co., Inc. 1d05 pcsk9 antagonists
WO2010068526A1 (en) * 2008-12-12 2010-06-17 Merck Sharp & Dohme Corp. Pcsk9 immunoassay

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DUFF CHRISTOPHER J ET AL: "Antibody-mediated disruption of the interaction between PCSK9 and the low-density lipoprotein receptor.", BIOCHEMICAL JOURNAL, PUBLISHED BY PORTLAND PRESS ON BEHALF OF THE BIOCHEMICAL SOCIETY., vol. 419, no. 3, 1 May 2009 (2009-05-01), pages 577 - 584, XP002619050, ISSN: 0264-6021 *
LI HAI ET AL: "Recent patents on PCSK9: a new target for treating hypercholesterolemia.", RECENT PATENTS ON DNA & GENE SEQUENCES, BENTHAM SCIENCE PUBLISHERS LTD., NL, vol. 3, no. 3, 1 November 2009 (2009-11-01), NL, pages 201 - 212, XP002619049, ISSN: 1872-2156, DOI: 10.2174/187221509789318388 *
NI YAN G ET AL: "A PCSK9 C-terminal Domain Binding Fab Inhibits PCSK9 Internalization and Restores LDL-uptake", CIRCULATION, AMERICAN HEART ASSOCIATION, US, vol. 120, no. 18, Suppl. 2, 1 November 2009 (2009-11-01), US, pages S477, XP008121212, ISSN: 0009-7322 *
NI YAN G ET AL: "A proprotein convertase subtilisin-like/kexin type 9 (PCSK9) C-terminal domain antibody antigen-binding fragment inhibits PCSK9 internalization and restores low density lipoprotein uptake.", J. BIOL. CHEM., vol. 285, no. 17, 23 April 2010 (2010-04-23), pages 12882 - 12891, XP002619048, ISSN: 1083-351X, DOI: 10.1074/JBC.M110.113035 *

Also Published As

Publication number Publication date
IL220091A0 (en) 2012-09-24
TW201136605A (en) 2011-11-01
NZ625433A (en) 2015-12-24
US8710192B2 (en) 2014-04-29
BR112012013782A8 (pt) 2017-12-26
ES2726040T3 (es) 2019-10-01
IN2012DN05237A (ru) 2015-10-23
UY33102A (es) 2011-07-29
MA33903B1 (fr) 2013-01-02
CA2781050C (en) 2019-06-11
JP5981347B2 (ja) 2016-08-31
TWI523662B (zh) 2016-03-01
HN2012001223A (es) 2015-08-24
EP2510013B1 (en) 2019-02-13
CO6571886A2 (es) 2012-11-30
MX2012006648A (es) 2013-05-30
KR101915496B1 (ko) 2018-11-08
AU2010327924A1 (en) 2012-07-05
JP2016179979A (ja) 2016-10-13
CR20120371A (es) 2016-07-20
CN102652139B (zh) 2014-11-05
KR20120098873A (ko) 2012-09-05
CU24058B1 (es) 2014-12-26
CL2012001529A1 (es) 2012-08-03
TN2012000243A1 (en) 2013-12-12
WO2011072263A1 (en) 2011-06-16
BR112012013782A2 (pt) 2017-01-10
EP2510013A1 (en) 2012-10-17
AU2010327924B2 (en) 2014-09-04
CU20120095A7 (es) 2013-02-26
ECSP12012034A (es) 2012-08-31
US20110142849A1 (en) 2011-06-16
TR201906696T4 (tr) 2019-05-21
GT201200189A (es) 2014-06-06
CA2781050A1 (en) 2011-06-16
JP2013513620A (ja) 2013-04-22
PE20121361A1 (es) 2012-10-13
CN102652139A (zh) 2012-08-29
PT2510013T (pt) 2019-05-30
NZ601084A (en) 2014-06-27
PL2510013T3 (pl) 2019-08-30
EA201200861A1 (ru) 2013-01-30
JP6297088B2 (ja) 2018-03-20
AR079336A1 (es) 2012-01-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA032084B1 (ru) Антагонисты pcsk9
US11859000B2 (en) Anti-CCR8 antibodies and uses thereof
TWI743039B (zh) 凝血因子ｘｉ抗體及使用方法
US11359021B2 (en) PD-L1 antibody, antigen-binding fragment thereof, and pharmaceutical use thereof
WO2012170607A2 (en) Use of pcsk9 antagonists
EA009746B1 (ru) ВАРИАНТЫ УЧАСТКА Fc
KR20140006022A (ko) Pcsk9 길항제
EA027502B1 (ru) Антитела против flt3 и способы их применения
KR20140031938A (ko) 콜레스테롤 관련 질환을 치료 또는 예방하는 방법
US20160244511A1 (en) Cross-reactive staphylococcus aureus antibody sequences
JP6267792B2 (ja) ホモ接合性家族性高コレステロール血症の治療方法
UA123773C2 (uk) ВИДІЛЕНЕ АНТИТІЛО ПРОТИ HtrA1 ТА ЙОГО ЗАСТОСУВАННЯ ПРИ ЛІКУВАННІ ПОВ&#39;ЯЗАНОГО З HtrA1 ПОРУШЕННЯ АБО ХВОРОБИ ОКА
CN108699156A (zh) 具有降低的adcp的奥滨尤妥珠单抗和利妥昔单抗变体
EP3083679B1 (en) Antibodies directed against the lukgh (lukab) toxin of staphylococcus aureus and antibody sequences
KR20160021823A (ko) 렉틴-유사 산화된 ldl 수용체1 항체 및 사용 방법
RU2549700C1 (ru) ГУМАНИЗИРОВАННЫЕ АНТИТЕЛА ПРОТИВ TNFα
TW201904996A (zh) Ｐｃｓｋ９抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途
WO2017118307A1 (zh) Pcsk9抗体、其抗原结合片段及其医药用途
JP2024534269A (ja) 神経変性疾患を治療するための方法および物質
CN114375308B (zh) 针对tfpi的单克隆抗体
US20180105584A1 (en) Antibody directed against immunoglobulin-binding proteins of s. aureus
Takauchi et al. The trans‐chromosomic mouse‐derived human monoclonal antibody promotes phagocytosis of Porphyromonas gingivalis by neutrophils
US20170342136A1 (en) Monoclonal antibody against muramyl peptides in prevention and treatment of immune-mediated diseases
US20220348652A1 (en) Recombinant antibodies, pharmaceutical compositions comprising the same, and uses thereof
JP6639463B2 (ja) ホモ接合性家族性高コレステロール血症の治療方法

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM