EA009746B1 - ВАРИАНТЫ УЧАСТКА Fc - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение обеспечивает варианты участка Fc полипептида и олигонуклеотиды, кодирующие варианты участка Fc. Конкретно, настоящее изобретение относится к композициям, которые включают новые варианты участка Fc, способы идентификации полезных вариантов участка Fc и способы применения вариантов участка Fc для лечения заболевания.

Description

Настоящее изобретение относится к вариантам участка Ес и олигонуклеотидам, кодирующим варианты участка Ес. Конкретно, настоящее изобретение относится к композициям, которые включают новые варианты участка Ес, способам идентификации полезных вариантов участка Ес, а также к способам применения вариантов участка Ес (например, для лечения заболевания).

Уровень техники

У человека обнаружено пять типов иммуноглобулинов. Эти группы известны как 1дС. 1дМ, Ι§ϋ, 1дА и 1дЕ и различаются изотипами гена тяжелой цепи (гамма, мю, дельта, альфа и эпсилон соответственно). Наиболее распространенным изотипом является 1дС, который состоит из двух идентичных полипептидов тяжелой цепи и двух идентичных полипептидов легкой цепи. Две тяжелых цепи ковалентно связаны друг с другом с помощью дисульфидных связей, а каждая легкая цепь связана с тяжелой цепью с помощью дисульфидной связи. Каждая тяжелая цепь содержит приблизительно 445 аминокислотных остатков, и каждая легкая цепь содержит приблизительно 215 аминокислотных остатков.

Каждая тяжелая цепь содержит четыре разных домена, которые обычно называют вариабельным доменом (ΥΗ), константным доменом 1 тяжелой цепи (СН1), константным доменом 2 тяжелой цепи (СН2) и константным доменом 3 тяжелой цепи (СНЗ). Домены СН1 и СН2 соединены шарнирным участком (междоменные секции), который придает иммуноглобулину гибкость. Каждая легкая цепь содержит два различных домена, которые обычно называют вариабельным доменом легкой цепи (УЪ) и константным доменом легкой цепи (СЬ).

Вариабельные домены тяжелых и легких цепей непосредственно связываются с антигеном и ответственны за разнообразие и специфичность иммуноглобулинов. Каждый УЪ и УН содержит три участка, определяющих комплементарность (СЭЯ, также известны, как гипервариабельные участки). Если УЪ и УН сходятся в результате взаимодействия тяжелой и легкой цепи, то участки СЭК. формируют поверхность связывания, которая вступает в контакт с антигеном.

В то время как вариабельные домены вовлечены в связывание антигена, константные домены тяжелой цепи, в первую очередь СН2 и СНЗ, выполняют другие функции, помимо связывания антигенов. Этот участок, в основном известный как участок Ес, выполняет много важных функций. Например, участок Ес связывает комплемент, который может запускать фагоцитоз или опосредованную комплементом цитотоксичность (СЭС). Участок Ес также связывается с рецепторами Ес, которые могут запускать фагоцитоз или опосредованную антителами клеточную цитотоксичность (АЭСС). Участок Ес также способствует удержанию иммуноглобулина в циркуляции и взаимодействует с протеином А, который обычно используется для сорбции иммуноглобулина.

В последнее время усилия направлены на улучшения иммуногенных качеств и антигенсвязывающих характеристик антител. Например, для иммунотерапии созданы моноклональные, химерные и гуманизированные антитела. Примеры антител, которые разрешены для иммунотерапии человека при соответствующих заболеваниях включают Ритуксан (ΚΙΤϋΧΑΝ, лимфома), Синагис (8ΥΝΑΟΙ8, инфекционное заболевание), Зенепакс (ΖΕΝΕΡΑΧ, пересадка почки), Ремикад (КЕМ1САЭЕ, болезнь Крона и ревматоидный артрит), Герцептин (ΗΕΚΕΕΡΤΙΝ, карцинома молочной железы) и Эдреколомаб (ЕОКЕСОЬОМАВ, рак толстого кишечника). Однако существует много антител, для которых были проведены клинические испытания, но которые не были разрешены из-за недостаточной эффективности или других проблем, связанных с их применением.

Для улучшения эффективности и ускорения разрешения к применению дополнительных лечебных антител необходимы композиции и способы изменения участков Ес для создания вариантов полипептидов с улучшенными свойствами.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение относится к вариантам участка Ес полипептида и к олигонуклеотидам, кодирующим варианты участка Ес, а также их части. Конкретно настоящее изобретение относится к композициям, которые включают новые варианты участка Ес, способы идентификации полезных вариантов участка Ес и способы применения вариантов участка Ес.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, которые включают вариант (или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариант) исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Ес, причем вариант опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (АЭСС) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 247 участка Ес. В конкретных вариантах осуществления вариант включает антитело (например, антитело против СЭ20). В предпочтительных вариантах осуществления модификация аминокислоты представляет собой Р247Ь.

В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, которые включают вариант (или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариант) исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Ес, где вариант опосредует антителозависимую клеточную цитотоксичность (АЭСС) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении

- 1 009746

251 участка Ес. В конкретных вариантах осуществления вариант включает антитело (например, антитело против ί.Ό20). В предпочтительных вариантах осуществления модификация аминокислоты представляет собой Ь251Е.

В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, которые включают вариант (или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариант) исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Ес, где вариант опосредует антителозависимую клеточную цитотоксичность (ЛЭСС) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 256 участка Ес. В конкретных вариантах осуществления вариант включает антитело (например, антитело против ί.Ό20). В предпочтительных вариантах осуществления модификация аминокислоты представляет собой Т256М.

В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, которые включают вариант (или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариант) исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Ес, где вариант опосредует антителозависимую клеточную цитотоксичность (ЛЭСС) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 268 участка Ес. В конкретных вариантах осуществления вариант включает антитело (например, антитело против ί.Ό20). В предпочтительных вариантах осуществления модификация аминокислоты представляет собой Н268Е.

В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, которые включают вариант (или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариант) исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Ес, где вариант опосредует антителозависимую клеточную цитотоксичность (ЛЭСС) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 280 участка Ес. В конкретных вариантах осуществления вариант включает антитело (например, антитело против ί.Ό20). В предпочтительных вариантах осуществления модификация аминокислоты представляет собой Ό280Ά.

В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, которые включают вариант (или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариант) исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Ес, где вариант опосредует антителозависимую клеточную цитотоксичность (ЛЭСС) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 330 участка Ес. В конкретных вариантах осуществления вариант включает антитело (например, антитело против ί.Ό20). В предпочтительных вариантах осуществления модификация аминокислоты представляет собой А330К.

В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, которые включают вариант (или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариант) исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Ес, где вариант опосредует антителозависимую клеточную цитотоксичность (ЛЭСС) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 332 участка Ес. В конкретных вариантах осуществления вариант включает антитело (например, антитело против ί.Ό20). В предпочтительных вариантах осуществления модификация аминокислоты представляет собой Ι332Ε.

В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, которые включают вариант (или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариант) исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Ес, где вариант опосредует антителозависимую клеточную цитотоксичность (ЛЭСС) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 339 участка Ес. В конкретных вариантах осуществления вариант включает антитело (например, антитело против ί.Ό20). В предпочтительных вариантах осуществления модификация аминокислоты представляет собой А339Т.

В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, которые включают вариант (или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариант) исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Ес, где вариант опосредует истощение клеток-мишеней (например, В-клеток) в пробе цельной крови более эффективно, чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 378 участка Ес. В конкретных вариантах осуществления вариант включает антитело (например, антитело против ί.Ό20). В предпочтительных вариантах осуществления модификация аминокислоты представляет собой Ά378Ό.

В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, которые включают вариант (или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариант) исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Ес, где вариант опосредует антителозависимую клеточную цитотоксичность (ЛЭСС) в присутствии эффекторных клеток более эффективно,

- 2 009746 чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 440 участка Ес. В конкретных вариантах осуществления вариант включает антитело (например, антитело против ί.Ό20). В предпочтительных вариантах осуществления модификация аминокислоты представляет собой 8440Υ.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к пептиду (содержащему модификацию аминокислоты Р247Ь), который включает последовательность 8ΕΟ ΙΌ N0:15. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей участок СН2 с модификацией Р247Ь (например, 8Ε0 ΙΌ N0:40). В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к аминокислотной последовательности, кодирующей участок СН2 с модификацией Р247Ь, которая включает 8Ε0 ΙΌ N0:15. В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к пептиду (содержащему модификацию аминокислоты Ь251Е) с последовательностью 8Ε0 ΙΌ N0:16. В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей участок СН2 с модификацией Ь251Е (например, 8Ε0 ΙΌ N0:41). В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к аминокислотной последовательности, кодирующей участок СН2 с модификацией Ь251Е, которая включает 8Ε0 ΙΌ N0:16.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к пептиду (содержащему модификацию аминокислоты Т256М), который включает последовательность 8Ε0 ΙΌ N0:17. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей участок СН2 с модификацией Т256М (например, 8Ε0 ΙΌ N0:42). В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к аминокислотной последовательности, кодирующей участок СН2 с модификацией Т256М, которая включает 8Ε0 ΙΌ N0:17. В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к пептиду (содержащему модификацию аминокислоты Н268Е), содержащему последовательность 8Ε0 ΙΌ N0:20. В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей участок СН2 с модификацией Н268Е (например, 8Ε0 ΙΌ N0:45). В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к аминокислотной последовательности, кодирующей участок СН2 с модификацией Н268Е, которая включает 8Ε0 ΙΌ N0:20.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к пептиду (содержащему модификацию аминокислоты Ό280Ά), который включает последовательность 8Ε0 ΙΌ N0:21. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей участок СН2 с модификацией Ό280Ά (например, 8Ε0 ΙΌ N0:46). В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к аминокислотной последовательности, кодирующей участок СН2 с модификацией Ό280Ά, которая включает 8Ε0 ΙΌ N0:21. В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к пептиду (содержащему модификацию аминокислоты А330К), содержащему последовательность 8Ε0 ΙΌ N0:23. В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей участок СН2 с модификацией А330К (например, 8Ε0 ΙΌ N0:48). В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к аминокислотной последовательности, кодирующей участок СН2 с модификацией А330К, которая включает 8Ε0 ΙΌ N0:23.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к пептиду (содержащему модификацию аминокислоты Ι332Ε), который включает последовательность 8Ε0 ΙΌ N0:26. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей участок СН2 с модификацией Ι332Ε (например, 8Ε0 ΙΌ N0:51). В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к аминокислотной последовательности, кодирующей участок СН2 с модификацией Ι332Ε, которая включает 8Ε0 ΙΌ N0:26. В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к пептиду (содержащему модификацию аминокислоты А339Т), содержащему последовательность 8Ε0 ΙΌ N0:29. В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей участок СН2 с модификацией А339Т (например, 8Ε0 ΙΌ N0:54). В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к аминокислотной последовательности, кодирующей участок СН2 с модификацией А339Т, которая включает 8Ε0 ΙΌ N0:29.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к пептиду (содержащему модификацию аминокислоты Ά378Ό), который включает последовательность 8Ε0 ΙΌ N0:30. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей участок СН2 с модификацией Ά378Ό (например, 8Ε0 ΙΌ N0:55). В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к аминокислотной последовательности, кодирующей участок СН2 с модификацией 8440Υ, которая включает 8Ε0 ΙΌ N0:30.

В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к пептиду (содержащему модификацию аминокислоты 8440Υ), который включает последовательность 8Ε0 ΙΌ N0:31. В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей участок СН2 с модификацией 8440Υ (например, 8Ε0 ΙΌ N0:56). В до- 3 009746 полнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к аминокислотной последовательности, кодирующей участок СН2 с модификацией 8440Υ, которая включает 8Еф ΙΌ N0:31.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, включающим вариант (или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариант) исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Ес, где вариант включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 247 участка Ес, выбранную из Р247Н, Ρ247Ι и Р247Ь. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, включающим вариант (или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариант) исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Ес, где вариант включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 251 участка Ес, выбранную из Ь251Е. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, включающим вариант (или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариант) исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Ес, где вариант включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 256 участка Ес, выбранную из Т256М и Т256Р. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, включающим вариант (или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариант) исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Ес, где вариант включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 268 участка Ес, выбранную из Η268Ό и Н268Е. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, включающим вариант (или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариант) исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Ес, где вариант включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 280 участка Ес, выбранную из Ό280Ά и Ό280Κ. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, включающим вариант (или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариант) исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Ес, где вариант включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 330 участка Ес, выбранную из А330К и Ά330Κ. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, включающим вариант (или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариант) исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Ес, где вариант включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 332 участка Ес, выбранную из Ι332Ό и Ι332Ε. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, включающим вариант (или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариант) исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Ес, где вариант включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 339 участка Ес, выбранную из А339Т. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, включающим вариант (или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариант) исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Ес, где вариант включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 378 участка Ес, выбранную из Ά378Ό. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, включающим вариант (или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариант) исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Ес, где вариант включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 440 участка Ес, выбранную из 8440Υ.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, включающим вариант исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Ес, где вариант опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (АЭСС) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 247 участка Ес. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам, предусматривающим: а) наличие ί) композиции, которая включает вариант исходного полипептида, содержащий по меньшей мере часть участка Ес, где вариант опосредует антителозависимую клеточную цитотоксичность (АЭСС) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 247 участка Ес, и н) субъекта, у которого присутствует один или несколько симптомов заболевания; и Ь) введение композиции субъекту в таких условиях, что по меньшей мере один из симптомов ослабляется. В конкретных вариантах осуществления вариант включает антитело или иммуноадгезин, и у субъекта присутствуют симптомы заболевания, отвечающего на антитело или иммуноадгезин.

В определенных вариантах осуществления вариант включает по меньшей мере часть участка Ес (например, 40, 50, 60, 80, 90% или больше участка Ес, содержащего модификацию аминокислот). В некоторых вариантах осуществления варианты полипептида включают участок СН2 или СН3. В других вариантах осуществления композиции включают аминокислотную последовательность, содержащую 8Еф ΙΌ N0:13. В некоторых вариантах осуществления композиции включают аминокислотную последовательность, которая содержит 8Еф ΙΌ N0: 14. В некоторых вариантах осуществления композиции включают аминокислотную последовательность, которая содержит 8Еф ΙΌ N0: 15. В некоторых вариантах осуществления композиции включают последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит 8Еф ΙΌ

- 4 009746

N0: 38 и/или 8ЕЦ ΙΌ N0: 39, и/или 8ЕЦ ΙΌ N0: 40, или комплементарную последовательность любой из них, или последовательности, которые связываются с 8ЕЦ ΙΌ N0: 38, 8ЕЦ ΙΌ N0: 39 или 8ЕЦ ΙΌ N0: 40 в условиях высокой жесткости. В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к клеткам-хозяевам (например, к клеткам СНО) и векторам, которые включают 8ЕЦ ΙΌ N0: 38 и/или 8ЕЦ ΙΌ N0: 39, и/или 8ЕЦ ΙΌ N0: 40. В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к машиночитаемому носителю, причем машиночитаемый носитель кодирует представление 8ЕО ΙΌ N0: 13, 14, 15, 38, 39 или 40.

В определенных вариантах осуществления вариант полипептида опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ЛЭСС) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида включает антитело или фрагмент антитела (например, поликлональное антитело, моноклональное антитело, химерное антитело, гуманизированное антитело или фрагмент Ее). В некоторых вариантах осуществления исходный полипептид включает участок Ес ЦС человека. В некоторых вариантах осуществления исходный полипептид включает участок Ес !дС1, ЦСБ. [дС3 или ЦС4 человека. В других вариантах осуществления исходный полипептид включает аминокислотную последовательность, выбранную из 8ЕЦ ΙΌ N0: 1-12.

В предпочтительных вариантах осуществления аминокислотной модификацией является Р247Н, Ρ247Ι или Р247Ь. В определенных вариантах осуществления вариант полипептида включает вторую, третью, четвертую и т.д. модификацию аминокислот на участке Ес (см., например, табл. 1). В некоторых вариантах осуществления вариант представляет собой СНО-экспрессированный полипептид.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, включающим вариант исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Ес, где вариант опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ЛОСС) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 251 участка Ес. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам, предусматривающим: а) наличие 1) композиции, которая включает вариант исходного полипептида, содержащий по меньшей мере часть участка Ес, где вариант опосредует антителозависимую клеточную цитотоксичность (ЛЭСС) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 251 участка Ес, и п) субъекта, у которого присутствует один или несколько симптомов заболевания; и Ь) введение композиции субъекту в таких условиях, что по меньшей мере один из симптомов ослабляется. В конкретных вариантах осуществления вариант включает антитело или иммуноадгезин, и у субъекта присутствуют симптомы заболевания, отвечающего на антитело или иммуноадгезин.

В определенных вариантах осуществления вариант включает по меньшей мере часть участка Ес (например, 40, 50, 60, 80, 90% или больше участка Ес, содержащего модификацию аминокислот). В некоторых вариантах осуществления варианты полипептида включают участок СН2 или СН3. В других вариантах осуществления композиции включают аминокислотную последовательность, которая содержит 8ЕЦ ΙΌ N0:16. В определенных вариантах осуществления композиции включают последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит 8ЕЦ ΙΌ N0: 41, или ее комплементарную последовательность, или последовательность, которая связывается с 8ЕЦ ΙΌ N0: 41 в условиях высокой жесткости. В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к клеткам-хозяевам (например, к клеткам СНО) и векторам, которые включают 8ЕЦ ΙΌ N0: 41. В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к машиночитаемому носителю, причем машиночитаемый носитель кодирует представление 8ЕЦ ΙΌ N0: 16 или 41.

В определенных вариантах осуществления вариант полипептида опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ЛЭСС) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида включает антитело или фрагмент антитела (например, поликлональное антитело, моноклональное антитело, химерное антитело, гуманизированное антитело или фрагмент Ес). В некоторых вариантах осуществления исходный полипептид включает участок Ес ЦС человека. В некоторых вариантах осуществления исходный полипептид включает участок Ес !дС1, ЦСБ, [дС3 или ЦС4 человека. В других вариантах осуществления исходный полипептид включает аминокислотную последовательность, выбранную из 8ЕЦ ΙΌ N0: 1-12.

В предпочтительных вариантах осуществления аминокислотной модификацией является Ь251Е. В определенных вариантах осуществления вариант полипептида включает вторую, третью, четвертую и т.д. модификацию аминокислот на участке Ес (см., например, табл. 1). В некоторых вариантах осуществления вариант представляет собой СНО-экспрессированный полипептид.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, включающим вариант исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Ес, где вариант опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ЛЭСС) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 256 участка Ес. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам, предусматривающим: а) наличие 1) композиции, которая включает вариант исходного полипептида, содержащий по меньшей мере часть участка Ес, где вариант опосредует антитело

- 5 009746 зависимую клеточную цитотоксичность (ЛЭСС) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 256 участка Ес, и ίί) субъекта, у которого присутствует один или несколько симптомов заболевания; и Ь) введение композиции субъекту в таких условиях, что по меньшей мере один из симптомов ослабляется. В конкретных вариантах осуществления вариант включает антитело или иммуноадгезин, и у субъекта присутствуют симптомы заболевания, отвечающего на антитело или иммуноадгезин.

В определенных вариантах осуществления вариант включает по меньшей мере часть участка Ес (например, 40, 50, 60, 80, 90% или больше участка Ес, содержащего модификацию аминокислот). В некоторых вариантах осуществления варианты полипептида включают участок СН2 или СНЗ. В других вариантах осуществления композиции включают аминокислотную последовательность, которая содержит 8ЕО ГО N0:17. В некоторых вариантах осуществления композиции включают аминокислотную последовательность, которая содержит 8ЕО ГО N0: 18. В некоторых вариантах осуществления композиции включают последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит 8Е0 ГО N0: 42, и/или 8Е0 ГО N0: 43, или комплементарную последовательность любой из них, или последовательности, которые связываются с 8Е0 ГО N0: 41 или 8Е0 ГО N0: 43 в условиях высокой жесткости. В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к клеткам-хозяевам (например, к клеткам СНО) и векторам, которые включают 8Е0 ГО N0: 42 и/или 8Е0 ГО N0: 43. В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к машиночитаемому носителю, причем машиночитаемый носитель кодирует представление 8Е0 ГО N0: 17, 18, 42 или 43.

В определенных вариантах осуществления вариант полипептида опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ЛЭСС) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида включает антитело или фрагмент антитела (например, поликлональное антитело, моноклональное антитело, химерное антитело, гуманизированное антитело или фрагмент Ес). В некоторых вариантах осуществления исходный полипептид включает участок Ес 1дС человека. В некоторых вариантах осуществления исходный полипептид включает участок Ес 1дС1, 1дС2, 1дС3 или 1дС4 человека. В других вариантах осуществления исходный полипептид включает аминокислотную последовательность, выбранную из 8Е0 ГО N0: 1-12.

В предпочтительных вариантах осуществления аминокислотной модификацией является Т256М или Т256Р. В определенных вариантах осуществления вариант полипептида включает вторую, третью, четвертую и т.д. модификацию аминокислот на участке Ес (см., например, табл. 1). В некоторых вариантах осуществления вариант представляет собой СНО-экспрессированный полипептид.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, включающим вариант исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Ес, где вариант опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ЛЭСС) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 268 участка Ес. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам, предусматривающим: а) наличие ί) композиции, которая включает вариант исходного полипептида, содержащий по меньшей мере часть участка Ес, где вариант опосредует антителозависимую клеточную цитотоксичность (ЛЭСС) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 268 участка Ес, и ίί) субъекта, у которого присутствует один или несколько симптомов заболевания; и Ь) введение композиции субъекту в таких условиях, что по меньшей мере один из симптомов ослабляется. В конкретных вариантах осуществления вариант включает антитело или иммуноадгезин, и у субъекта присутствуют симптомы заболевания, отвечающего на антитело или иммуноадгезин.

В определенных вариантах осуществления вариант включает по меньшей мере часть участка Ес (например, 40, 50, 60, 80, 90% или больше участка Ес, содержащего модификацию аминокислот). В некоторых вариантах осуществления варианты полипептида включают участок СН2 или СН3. В других вариантах осуществления композиции включают аминокислотную последовательность, которая содержит 8Е0 ГО N0:19. В некоторых вариантах осуществления композиции включают аминокислотную последовательность, которая содержит 8Е0 ГО N0: 20. В некоторых вариантах осуществления композиции включают последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит 8Е0 ГО N0: 44, и/или 8Е0 ГО N0: 45, или комплементарную последовательность любой из них, или последовательности, которые связываются с 8Е0 ГО N0: 44 или 8Е0 ГО N0: 45 в условиях высокой жесткости. В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к клеткам-хозяевам (например, к клеткам СН0) и векторам, которые включают 8Е0 ГО N0: 44 и/или 8Е0 ГО N0: 45. В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к машиночитаемому носителю, причем машиночитаемый носитель кодирует представление 8Е0 ГО N0: 19, 20, 44 или 45.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, которые включают вариант исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Ес, где вариант опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ЛЭСС) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 332 участка Ес. В конкретных вариантах осуществления по меньшей

- 6 009746 мере одна модификация аминокислоты представляет собой Ι332Κ или Ι332Κ.

В определенных вариантах осуществления вариант полипептида опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (АОСС) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида включает антитело или фрагмент антитела (например, поликлональное антитело, моноклональное антитело, химерное антитело, гуманизированное антитело или фрагмент Ес). В некоторых вариантах осуществления исходный полипептид включает участок Ес 1дС человека. В некоторых вариантах осуществления исходный полипептид включает участок Ес 1дС1, 1дС2, 1дС3 или 1дС4 человека. В других вариантах осуществления исходный полипептид включает аминокислотную последовательность, выбранную из 8Е0 ГО N0: 1-12.

В предпочтительных вариантах осуществления аминокислотная модификация представляет собой Η268Ό или Н268Е. В определенных вариантах осуществления вариант полипептида включает вторую, третью, четвертую и т.д. модификацию аминокислот на участке Ес (см., например, табл. 1). В некоторых вариантах осуществления вариант представляет собой СНО-экспрессированный полипептид.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, включающим вариант исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Ес, где вариант опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (АОСС) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 280 участка Ес. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам, предусматривающим: а) наличие ί) композиции, которая включает вариант исходного полипептида, содержащий по меньшей мере часть участка Ес, где вариант опосредует антителозависимую клеточную цитотоксичность (АЭСС) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 280 участка Ес, и ίί) субъекта, у которого присутствует один или несколько симптомов заболевания; и Ь) введение композиции субъекту в таких условиях, что по меньшей мере один из симптомов ослабляется. В конкретных вариантах осуществления вариант включает антитело или иммуноадгезин, и у субъекта присутствуют симптомы заболевания, отвечающего на антитело или иммуноадгезин.

В определенных вариантах осуществления вариант включает по меньшей мере часть участка Ес (например, 40, 50, 60, 80, 90% или больше участка Ес, содержащего модификацию аминокислот). В некоторых вариантах осуществления варианты полипептида включают участок СН2 или СН3. В других вариантах осуществления композиции включают аминокислотную последовательность, которая содержит 8ЕО ГО N0:21. В некоторых вариантах осуществления композиции включают аминокислотную последовательность, которая содержит 8Е0 ГО N0: 22. В некоторых вариантах осуществления композиции включают последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит 8Е0 ГО N0: 46, и/или 8Е0 ГО N0: 47, или комплементарную последовательность любой из них, или последовательности, которые связываются с 8Е0 ГО N0: 46 или 8Е0 ГО N0: 47 в условиях высокой жесткости. В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к клеткам-хозяевам (например, к клеткам СНО) и векторам, которые включают 8Е0 ГО N0: 46 и/или 8Е0 ГО N0: 47. В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к машиночитаемому носителю, причем машиночитаемый носитель кодирует представление 8Е0 ГО N0: 21, 22, 46 или 47.

В определенных вариантах осуществления вариант полипептида опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (АОСС) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида включает антитело или фрагмент антитела (например, поликлональное антитело, моноклональное антитело, химерное антитело, гуманизированное антитело или фрагмент Ес). В некоторых вариантах осуществления исходный полипептид включает участок Ес 1дС человека. В некоторых вариантах осуществления исходный полипептид включает участок Ес 1дС1, 1дС2, 1дС3 или 1дС4 человека. В других вариантах осуществления исходный полипептид включает аминокислотную последовательность, выбранную из 8Е0 ГО N0: 1-12.

В предпочтительных вариантах осуществления аминокислотной модификацией является Э280А или Ό280Κ. В определенных вариантах осуществления вариант полипептида включает вторую, третью, четвертую и т. д. модификацию аминокислот на участке Ес (см., например, табл. 1). В некоторых вариантах осуществления вариант представляет собой СНО-экспрессированный полипептид.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, включающим вариант исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Ес, где вариант опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (АОСС) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 330 участка Ес. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам, предусматривающим: а) наличие ί) композиции, которая включает вариант исходного полипептида, содержащий по меньшей мере часть участка Ес, где вариант опосредует антителозависимую клеточную цитотоксичность (АЭСС) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 330 участка Ес, и ίί) субъекта, у которого присутствует один или несколько симптомов заболевания; и Ь) введение композиции субъекту в таких условиях, что по меньшей мере один из симптомов ослабляется.

- 7 009746

В конкретных вариантах осуществления вариант включает антитело или иммуноадгезин, и у субъекта присутствуют симптомы заболевания, отвечающего на антитело или иммуноадгезин.

В определенных вариантах осуществления вариант включает по меньшей мере часть участка Ес (например, 40, 50, 60, 80, 90% или больше участка Ес, содержащего модификацию аминокислот). В некоторых вариантах осуществления варианты полипептида включают участок СН2 или СН3. В других вариантах осуществления композиции включают аминокислотную последовательность, которая содержит 8ΕΟ ГО N0:23. В некоторых вариантах осуществления композиции включают аминокислотную последовательность, которая содержит 8Ε0 ГО N0: 24. В некоторых вариантах осуществления композиции включают последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит 8Ε0 ГО N0: 48, и/или 8Ε0 ГО N0: 49, или комплементарную последовательность любой из них, или последовательности, которые связываются с 8Ε0 ГО N0: 48 или 8Ε0 ГО N0: 49 в условиях высокой жесткости. В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к клеткам-хозяевам (например, к клеткам СНО) и векторам, которые включают 8Ε0 ГО N0: 48 и/или 8Ε0 ГО N0: 49. В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к машиночитаемому носителю, причем машиночитаемый носитель кодирует представление δΕΟ ΙΌ N0: 23, 24, 48 или 49.

В определенных вариантах осуществления вариант полипептида опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ЛЭСС) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида включает антитело или фрагмент антитела (например, поликлональное антитело, моноклональное антитело, химерное антитело, гуманизированное антитело или фрагмент Ес). В некоторых вариантах осуществления исходный полипептид включает участок Ес 1дС человека. В дополнительных вариантах осуществления исходный полипептид включает участок Ес 1дС1, 1дС2, 1дС3 или 1дС4 человека. В других вариантах осуществления исходный полипептид включает аминокислотную последовательность, выбранную из 8Ε0 ГО N0: 1-12.

В предпочтительных вариантах осуществления аминокислотной модификацией является А330К или Л330К. В определенных вариантах осуществления вариант полипептида включает вторую, третью, четвертую и т.д. модификацию аминокислот на участке Ес (см., например, табл. 1). В некоторых вариантах осуществления вариант представляет собой СНО-экспрессированный полипептид.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, включающим вариант исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Ес, где вариант опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ЛЭСС) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 332 участка Ес. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам, предусматривающим: а) наличие ί) композиции, которая включает вариант исходного полипептида, содержащий по меньшей мере часть участка Ес, где вариант опосредует антителозависимую клеточную цитотоксичность (ΆΌΟΟ) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 332 участка Ес, и ίί) субъекта, у которого присутствует один или несколько симптомов заболевания; и Ь) введение композиции субъекту в таких условиях, что по меньшей мере один из симптомов ослабляется. В конкретных вариантах осуществления вариант включает антитело или иммуноадгезин, и у субъекта присутствуют симптомы заболевания, отвечающего на антитело или иммуноадгезин.

В определенных вариантах осуществления вариант включает по меньшей мере часть участка Ес (например, 40, 50, 60, 80, 90% или больше участка Ес, содержащего модификацию аминокислот). В некоторых вариантах осуществления варианты полипептида включают участок СН2 или СН3. В дополнительных вариантах осуществления композиции включают аминокислотную последовательность, которая содержит 8Ε0 ГО N0:25. В некоторых вариантах осуществления композиции включают аминокислотную последовательность, которая содержит 8Ε0 ГО N0: 26. В некоторых вариантах осуществления композиции включают последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит 8Ε0 ГО N0: 50, и/или 8Ε0 ГО N0: 51, или комплементарную последовательность любой из них, или последовательности, которые связываются с 8Ε0 ГО N0: 50 или 8Ε0 ГО N0: 51 в условиях высокой жесткости. В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к клеткам-хозяевам (например, к клеткам СНО) и векторам, которые включают 8Ε0 ГО N0: 50 и/или 8Ε0 ГО N0: 51. В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к машиночитаемому носителю, причем машиночитаемый носитель кодирует представление 8Ε0 ГО N0: 25, 26, 50 или 51.

В определенных вариантах осуществления вариант полипептида опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ЛЭСС) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида включает антитело или фрагмент антитела (например, поликлональное антитело, моноклональное антитело, химерное антитело, гуманизированное антитело или фрагмент Ес). В некоторых вариантах осуществления исходный полипептид включает участок Ес 1дС человека. В дополнительных вариантах осуществления исходный полипептид включает участок Ес 1дС1, 1дС2, 1дС3 или 1дС4 человека. В других вариантах осуществления исходный полипептид включает аминокислотную последовательность, выбранную из 8Ε0 ГО N0: 1-12.

В предпочтительных вариантах осуществления аминокислотной модификацией является Ι332Ό или

- 8 009746

Ι332Ε. В определенных вариантах осуществления вариант полипептида включает вторую, третью, четвертую и т.д. модификацию аминокислот на участке Ес (см., например, табл. 1). В некоторых вариантах осуществления вариант представляет собой СНО-экспрессированный полипептид.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, включающим вариант исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Ес, где вариант опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ЛОСС) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 339 участка Ес. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам, предусматривающим: а) наличие 1) композиции, которая включает вариант исходного полипептида, содержащий по меньшей мере часть участка Ес, где вариант опосредует антителозависимую клеточную цитотоксичность (ЛЭСС) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 339 участка Ес, и и) субъекта, у которого присутствует один или несколько симптомов заболевания; и Ь) введение композиции субъекту в таких условиях, что по меньшей мере один из симптомов ослабляется. В конкретных вариантах осуществления вариант включает антитело или иммуноадгезин, и у субъекта присутствуют симптомы заболевания, отвечающего на антитело или иммуноадгезин.

В определенных вариантах осуществления вариант включает по меньшей мере часть участка Ес (например, 40, 50, 60, 80, 90% или больше участка Ес, содержащего модификацию аминокислот). В некоторых вариантах осуществления варианты полипептида включают участок СН2 или СН3. В других вариантах осуществления композиции включают аминокислотную последовательность, которая содержит 8ΕΟ ГО N0:29. В некоторых вариантах осуществления композиции включают последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит 8ΕΟ ГО N0: 54 или ее комплементарную последовательность, или последовательности, которые связываются с 8Ε0 ГО N0: 54 в условиях высокой жесткости. В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к клеткам-хозяевам (например, к клеткам СНО) и векторам, которые включают 8Ε0 ГО N0: 54. В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к машиночитаемому носителю, причем машиночитаемый носитель кодирует представление 8Ε0 ГО N0: 29 или 54.

В определенных вариантах осуществления вариант полипептида опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ЛОСС) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида включает антитело или фрагмент антитела (например, поликлональное антитело, моноклональное антитело, химерное антитело, гуманизированное антитело или фрагмент Ес). В некоторых вариантах осуществления исходный полипептид включает участок Ес ΙβΟ человека. В дополнительных вариантах осуществления исходный полипептид включает участок Ес 1дС1, 1дС2, 1дС3 или 1дС4 человека. В других вариантах осуществления исходный полипептид включает аминокислотную последовательность, выбранную из 8Ε0 ГО N0: 1-12.

В предпочтительных вариантах осуществления аминокислотной модификацией является А339Т. В определенных вариантах осуществления вариант полипептида включает вторую, третью, четвертую и т.д. модификацию аминокислот на участке Ес (см., например, табл. 1). В некоторых вариантах осуществления вариант представляет собой СНО-экспрессированный полипептид.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, включающим вариант исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Ес, где вариант опосредует истощение клеток-мишеней в пробе цельной крови более эффективно, чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 378 участка Ес. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам, предусматривающим: а) наличие 1) композиции, которая включает вариант исходного полипептида, содержащий по меньшей мере часть участка Ес, где вариант опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ЛОСС) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 378 участка Ес, и и) субъекта, у которого присутствует один или несколько симптомов заболевания; и Ь) введение композиции субъекту в таких условиях, что по меньшей мере один из симптомов ослабляется. В конкретных вариантах осуществления вариант включает антитело или иммуноадгезин, и у субъекта присутствуют симптомы заболевания, отвечающего на антитело или иммуноадгезин.

В определенных вариантах осуществления вариант включает по меньшей мере часть участка Ес (например, 40, 50, 60, 80, 90% или больше участка Ес, содержащего модификацию аминокислот). В некоторых вариантах осуществления варианты полипептида включают участок СН2 или СН3. В других вариантах осуществления композиции включают аминокислотную последовательность, которая содержит 8Ε0 ГО N0:30. В некоторых вариантах осуществления композиции включают последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит 8Ε0 ГО N0: 55 или ее комплементарную последовательность, или последовательности, которые связываются с 8Ε0 ГО N0: 55 в условиях высокой жесткости. В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к клеткам-хозяевам (например, к клеткам СНО) и векторам, которые включают 8Ε0 ГО N0: 55. В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к машиночитаемому носителю, причем машиночитаемый носитель кодирует

- 9 009746 представление δΕΟ ΙΌ N0: 30 или 55.

В определенных вариантах осуществления вариант полипептида опосредует истощение клетокмишеней в пробе цельной крови более эффективно, чем исходный полипептид. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида включает антитело или фрагмент антитела (например, поликлональное антитело, моноклональное антитело, химерное антитело, гуманизированное антитело или фрагмент Ее). В некоторых вариантах осуществления исходный полипептид включает участок Ес 1дС человека. В дополнительных вариантах осуществления исходный полипептид включает участок Ес 1дС1, 1дС2, ЦС3 или 1дС4 человека. В других вариантах осуществления исходный полипептид включает аминокислотную последовательность, выбранную из 8ЕЦ ГО N0: 1-12. В предпочтительных вариантах осуществления аминокислотной модификацией является Ά378Ό. В определенных вариантах осуществления вариант полипептида включает вторую, третью, четвертую и т.д. модификацию аминокислот на участке Ес (см., например, табл. 1). В некоторых вариантах осуществления вариант представляет собой СНОэкспрессированный полипептид.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, включающим вариант исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Ес, где вариант опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ЛОСС) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 440 участка Ес. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам, предусматривающим: а) наличие ί) композиции, которая включает вариант исходного полипептида, содержащий по меньшей мере часть участка Ес, где вариант опосредует антителозависимую клеточную цитотоксичность (ЛЭСС) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 440 участка Ес, и ίί) субъекта, у которого присутствует один или несколько симптомов заболевания; и Ь) введение композиции субъекту в таких условиях, что по меньшей мере один из симптомов ослабляется. В конкретных вариантах осуществления вариант включает антитело или иммуноадгезин, и у субъекта присутствуют симптомы заболевания, отвечающего на антитело или иммуноадгезин.

В определенных вариантах осуществления вариант включает по меньшей мере часть участка Ес (например, 40, 50, 60, 80, 90% или больше участка Ес, содержащего модификацию аминокислот). В некоторых вариантах осуществления варианты полипептида включают участок СН2 или СНЗ. В других вариантах осуществления композиции включают аминокислотную последовательность, которая содержит 8ЕЦ ГО N0:31. В некоторых вариантах осуществления композиции включают последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит 8ЕЦ ГО N0: 56 или ее комплементарную последовательность, или последовательности, которые связываются с 8ЕЦ ГО N0: 56 в условиях высокой жесткости. В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к клеткам-хозяевам (например, к клеткам СНО) и векторам, которые включают 8ЕЦ ГО N0: 56. В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к машиночитаемому носителю, причем машиночитаемый носитель кодирует представление 8Ε0 ГО N0: 31 или 56.

В определенных вариантах осуществления вариант полипептида опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ЛОСС) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида включает антитело или фрагмент антитела (например, поликлональное антитело, моноклональное антитело, химерное антитело, гуманизированное антитело или фрагмент Ес). В некоторых вариантах осуществления исходный полипептид включает участок Ес 1дС человека. В дополнительных вариантах осуществления исходный полипептид включает участок Ес 1дС1, 1дС2, 1дС3 или 1дС4 человека. В других вариантах осуществления исходный полипептид включает аминокислотную последовательность, выбранную из 8ЕЦ ГО N0: 1-12.

В предпочтительных вариантах осуществления аминокислотной модификацией является 8440Υ. В определенных вариантах осуществления вариант полипептида включает вторую, третью, четвертую и т.д. модификацию аминокислот на участке Ес (см., например, табл. 1). В некоторых вариантах осуществления вариант представляет собой СНО-экспрессированный полипептид.

В дополнительных вариантах осуществления композиции включают последовательность нуклеиновых кислот, кодирующую варианты исходного полипептида, который включает по меньшей мере часть участка Ес, где вариант опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (АЭСС) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 247, 251, 256, 268, 280, 330, 332, 339, 378 или 440 или их сочетания на участке Ес. В некоторых вариантах осуществления композиции включают последовательность нуклеиновых кислот, кодирующую варианты Ес полипептида, который опосредует антителозависимую клеточную цитотоксичность (АЭСС) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид, где вариант Ес полипептида включает модификацию аминокислоты в положении аминокислоты 247, 251, 256, 268, 280, 330, 332, 339, 378 или 440 или их сочетания.

В дополнительных вариантах осуществления композиции включают последовательность нуклеиновых кислот, кодирующую варианты исходного полипептида, который включает по меньшей мере часть участка Ес, где вариант опосредует истощение клеток-мишеней в образце цельной крови более эффек

- 10 009746 тивно, чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 247, 251, 256, 268, 280, 330, 332, 339, 378 или 440 или их сочетания на участке Ес. В некоторых вариантах осуществления композиции включают последовательность нуклеиновых кислот, кодирующую варианты Ес полипептида, который опосредует истощение клеток-мишеней в образце цельной крови более эффективно, чем исходный полипептид, где вариант Ес полипептида включает модификацию аминокислоты в положении аминокислоты 247, 251, 256, 268, 280, 330, 332, 339, 378 или 440 или их сочетания.

В определенных вариантах осуществления варианты по данному изобретению и нуклеиновые последовательности, кодирующие варианты, представлены по меньшей мере еще одним компонентом в наборе. Например, набор может содержать по меньшей мере один тип варианта и инструкции по применению вариантов. Набор также может содержать буферы и другие используемые реактивы.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам, предусматривающим: а) наличие ί) клеток, экспрессирующих мишеневый антиген (например, СЭ20). и) композиции, включающей вариант исходного полипептида, содержащий по меньшей мере часть участка Ес, где вариант включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты на участке Ес, и ίίί) эффекторных клеток (обогащенных РВМС от донора(ов)-человека, например), и Ь) контакт клеток-мишеней с композицией и эффекторных клеток при таких условиях, что вариант связывается с клетками-мишенями (например, через лиганд, экспрессированный на поверхности клетки) и с) оценку гибели клеток-мишеней (по высвобождению ЛДГ или хрома 51, например).

В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам, предусматривающим: а) наличие ί) образцов цельной крови, которые содержат клетки, экспрессирующие мишеневый антиген (например, В-клеток, экспрессирующих СЭ20) и и) композиции, включающей вариант исходного полипептида, содержащий по меньшей мере часть участка Ес, где вариант включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты на участке Ес и Ь) контакт клеток-мишеней с композицией при таких условиях, что вариант связывается с клетками-мишенями (например, через ί.Ό20 лиганд, экспрессированный на поверхности клетки) и с) измерение исчезновения клеток-мишеней (например, путем анализа Еаск с другим маркером В-клетки, таким как СЭ19).

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам идентификации улучшенных вариантов с двойной специфичностью, которые предусматривают: а) наличие ί) клетокмишеней, и) композиции, которая включает вариант-кандидат исходного полипептида, содержащего участок Ес, где вариант-кандидат включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты на участке Ес, и где вариант-кандидат опосредует цитотоксичность клеток-мишеней в присутствии эффекторных клеток первого вида более эффективно, чем исходный полипептид, и ίίί) эффекторных клеток второго вида, и Ь) инкубирование композиции с клетками-мишенями при таких условиях, что варианткандидат связывается с клетками-мишенями, образуя, таким образом, клетки-мишени, связанные с вариантом-кандидатом, с) смешивание эффекторных клеток второго вида с клетками-мишенями, связанными с вариантом-кандидатом, б) измерение цитотоксичности клеток-мишеней (например, опосредованной вариантом-кандидатом), е) определение того, опосредует ли вариант-кандидат цитотоксичность клетокмишеней в присутствии эффекторных клеток второго вида более эффективно, чем исходный полипептид. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает аналогичный скрининг исходного полипептида с эффекторными клетками второго вида. В дополнительных вариантах осуществления стадии Ь) и с) проводятся одновременно. В конкретных вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает стадию Г) идентификации варианта-кандидата как улучшенного варианта с двойной специфичностью, который опосредует цитотоксичность клеток-мишеней в присутствии эффекторных клеток второго вида более эффективно, чем исходный полипептид. В других вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает стадию Г) идентификации варианта-кандидата как улучшенного варианта с двойной специфичностью, который опосредует цитотоксичность клеток-мишеней в присутствии эффекторных клеток второго вида приблизительно в 1,2 раза (или приблизительно в 1,5 раз, в 5 раз или приблизительно в 10 раз) более эффективно, чем исходный полипептид (например, наблюдается повышение лизиса клеток-мишеней приблизительно в 1,2 раза).

В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам идентификации улучшенных вариантов с двойной специфичностью, которые предусматривают: а) наличие ί) клетокмишеней, ίί) композиции, которая включает вариант-кандидат исходного полипептида, содержащего участок Ес, где вариант-кандидат включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты на участке Ес, ίίί) эффекторных клеток первого вида, и ίν) эффекторных клеток второго вида, и Ь) инкубирование композиции с клетками-мишенями при таких условиях, что вариант-кандидат связывается с клеткамимишенями, образуя, таким образом, клетки-мишени, связанные с вариантом-кандидатом, с) смешивание эффекторных клеток первого вида с клетками-мишенями, связанными с вариантом-кандидатом, б) измерение цитотоксичности клеток-мишеней (например, опосредованной вариантом-кандидатом), е) определение того, что вариант-кандидат опосредует цитотоксичность клеток-мишеней в присутствии эффекторных клеток первого вида более эффективно, чем исходный полипептид, Г) смешивание эффекторных клеток второго вида с клетками-мишенями, связанными с вариантом-кандидатом (например, полученными на стадии Ь), д) измерение цитотоксичности клеток-мишеней (например, опосредованной вариан

- 11 009746 том-кандидатом), Н) определение того, опосредует ли вариант-кандидат цитотоксичность клетокмишеней в присутствии эффекторных клеток второго вида более эффективно, чем исходный полипептид.

В конкретных вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает стадию определения способности исходного полипептида опосредовать цитотоксичность клеток-мишеней в присутствии первого вида и/или второго вида. Например, способы могут дополнительно предусматривать смешивание эффекторных клеток первого или второго вида с клетками-мишенями, связанными с исходным полипептидом, и затем измерение цитотоксичности клеток-мишеней (например, определение такого значения, которое является значением для сравнения вариантов).

В определенных вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает стадию д) введения улучшенного варианта с двойной специфичностью подопытному животному, где подопытное животное принадлежит второму виду. В других вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает перед стадией а) стадию скрининга варианта-кандидата в пробе связывания с Ес рецептором (ЕсЕ). В определенных вариантах осуществления анализ связывания ЕсЕ представляет собой анализ связывания с неонатальным рецептором Ес (ЕсЕп).

В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает перед стадией а) стадию скрининга варианта-кандидата в пробе СПС (см., например, раздел IV ниже). В некоторых вариантах осуществления эффекторные клетки первого вида представляют собой мононуклеарные клетки периферической крови человека (РВМС). В других вариантах осуществления эффекторные клетки первого вида представляют собой РВМС мыши или РВМС крысы. В определенных вариантах осуществления эффекторные клетки второго вида представляют собой РВМС мыши или РВМС крысы. В конкретных вариантах осуществления эффекторные клетки второго вида представляют собой РВМС человека.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам идентификации улучшенных вариантов с двойной специфичностью, которые предусматривают: а) наличие ί) композиции, которая включает вариант-кандидат исходного полипептида, содержащего участок Ес, где вариант-кандидат включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты на участке Ес, и где варианткандидат опосредует СЭС более эффективно, чем исходный полипептид, и ίίί) источник комплемента второго вида; и Ь) инкубирование композиции с комплементом второго вида; и с) определение того, опосредует ли вариант-кандидат СЭС более эффективно, чем исходный полипептид. В конкретных вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает стадию ά) идентификации вариантакандидата как улучшенного варианта с двойной специфичностью.

В некоторых вариантах осуществления клетки-мишени представляют собой клетки человека (например, клетки со сверхэкспрессией одного или более следующих ассоциированных с опухолью антигенов: СП20, СП22, СЭ33, СП40, СП63, рецептор ЕСЕ, рецептор Нсг-2. специфический для простаты мембранный антиген, углевод Υ Льюиса, ганглиозиды СП₂ и СП₃, 1атр-1, СО-029, Ь6 и ерНА2). В определенных вариантах осуществления вариант включает антитело или его часть, специфичную для клетокмишеней. В других вариантах осуществления вариант-кандидат опосредует цитотоксичность клетокмишеней в присутствии эффекторных клеток первого вида приблизительно в 1,2 раза более эффективно, чем исходный полипептид. В некоторых вариантах осуществления стадия е) включает проведение контрольной реакции с исходным полипептидом. В дополнительных вариантах осуществления измерение включает количественное определение гибели или лизиса клеток-мишеней. В других вариантах осуществления клетки-мишени инфицированы вирусом (например, ВИЧ, СМУ, вирус гепатита В или Εδν) или микробными организмами (например, 81арйу1ососси5, 81гер1ососсц5, Ркеиботоиак и т.д.). В определенных вариантах осуществления клетки-мишени представляют собой микробные организмы (например, 81ар11у1ососсц§, 81гер1ососси8, Ркеиботоиак и т.д.). В некоторых вариантах осуществления клетки мишени заменены вирусами (например, ВИЧ, СМУ, вирус гепатита В или Εδν).

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, которые включают полипептид, где полипептид включает: ί) немодифицированную каркасную область человека (например, в природном каркасе человека не было сделано изменений), и ίί) вариант участка Ес. В определенных вариантах осуществления немодифицированная каркасная область человека представляет собой каркас зародышевой линии человека.

В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, которые включают полипептид, где полипептид включает: ί) по меньшей мере одну рандомизированную СПЕ последовательность и ίί) вариант участка Ес. В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, которые включают полипептид, где полипептид включает: ί) немодифицированную каркасную область человека (например, каркас зародышевой линии человека), ίί) по меньшей мере одну рандомизированную СПЕ последовательность и ίίί) вариант участка Ес.

Определения

Для лучшего понимания изобретения некоторые термины определены ниже.

Используемые в описании термины субъект и пациент обозначают любое животное, такое как млекопитающее, например собака, кошка, птица, домашний скот и предпочтительно человек (например, человек, страдающий заболеванием).

Используемые в настоящем описании термины молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая,

- 12 009746 последовательность ДНК, кодирующая и ДНК, кодирующая обозначают порядок или последовательность дезоксирибонуклеотидов в цепи дезоксирибонуклеиновой кислоты. Порядок этих дезоксирибонуклеотидов определяет порядок аминокислот в полипептидной (белковой) цепи. Последовательность ДНК, таким образом, кодирует аминокислотную последовательность.

Говорят, что молекулы ДНК имеют 5' концы и 3' концы, поскольку мононуклеотиды взаимодействуют с образованием олигонуклеотидов или полинуклеотидов таким образом, что 5'-фосфат одного мононуклеотидного кольца пентозы присоединен к соседнему 3'-кислороду в одном направлении посредством фосфодиэфирной связи. Следовательно, конец олигонуклеотида или полинуклеотида называют 5'-концом, если его 5'-фосфат не связан с 3'-кислородом пентозного кольца мононуклеотида, и 3'концом, если его 3'-кислород не связан с 5'-фосфатом следующего пентозного кольца мононуклеотида. В настоящем описании последовательность нуклеиновой кислоты, даже если она является внутренней по отношению к олигонуклеотиду или полинуклеотиду большего размера, также может называться последовательностью, содержащей 5'- и 3'-концы. В линейной или круговой молекуле ДНК отдельные элементы обозначают элементы, расположенные в направлении 3'-5' (или просто 5') или в направлении 5'-3' (или просто 3'). Такая терминология отображает тот факт, что транскрипция осуществляется по способу от 5' к 3' вдоль цепи ДНК. Промоторные и энхансерные элементы, которые осуществляют непосредственную транскрипцию связанного гена, в общем, расположены в направлении 5' (от) кодирующего участка. Однако энхансерные элементы могут оказывать свое влияние даже при расположении 3' от промоторного элемента и кодирующего участка. Терминация транскрипции и сигналы полиаденилирования расположены в направлении 3' (от) кодирующего участка.

Используемый в настоящем описании термин кодон или триплет относится к триплету трех смежных мономеров нуклеотида, который обозначает одну из двадцати природных аминокислот, обнаруженных в ходе биосинтеза полипептидов. Термин также включает несмысловые кодоны, которые не обозначают никакой аминокислоты.

Используемые в настоящем описании термины олигонуклеотид с нуклеотидной последовательностью, кодирующей полипептид полинуклеотид с нуклеотидной последовательностью, кодирующей полипептид и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид обозначает последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит участок, кодирующий конкретный полипептид. Кодирующий участок присутствует в форме кДНК, геномной ДНК или РНК. Если кодирующий участок присутствует в форме ДНК, то олигонуклеотид или полинуклеотид может быть одноцепочечным (т.е. смысловая цепь) или двухцепочечным. Подходящие контролирующие элементы, такие как энхансеры/промоторы, экзон-интронное сочленение, сигналы полиаденилирования и т.д. при необходимости могут быть расположены в непосредственной близости от кодирующей области гена для осуществления надлежащей инициации транскрипции и/или правильного процессинга первичного транскрипта РНК.

Альтернативно, кодирующий участок, используемый в экспрессирующих векторах по данному изобретению, может содержать эндогенные энхансеры/промотеры, экзон-интронные сочленения, прерывающие последовательности, сигналы полиаденилирования и т. д. или комбинацию эндогенных и экзогенных контролирующих элементов.

В настоящем описании термины комплементарный или комплементарность используются для обозначения полинуклеотидов (т.е. последовательности нуклеотидов) в соответствии с правилами спаривания нуклеотидов. Например, последовательность А-С-Т комплементарна последовательности Т-СА. Комплементарность может быть частичной, когда только некоторые из оснований нуклеиновых кислот совпадают в соответствии с правилами спаривания нуклеотидов. Или может присутствовать «полная» комплементарность между нуклеиновыми кислотами. Степень комплементарности между цепями нуклеиновой кислоты оказывает значительное влияние на эффективность и прочность гибридизации между цепями нуклеиновой кислоты. Это особенно важно для реакций амплификации, а также для способов обнаружения, которые зависят от связывания между нуклеиновыми кислотами.

В настоящем описании термин комплемент данной последовательности используется для обозначения последовательности, которая полностью комплементарна последовательности по всей длине. Например, последовательность А-С-Т-А является комплементом последовательности Т-С-А-Т.

Термин гомология (в отношении последовательностей нуклеиновых кислот) относится к степени комплементарности. Может существовать частичная гомология или полная гомология (т.е. идентичность). Частично комплементарная последовательность представляет собой последовательность, которая по меньшей мере частично ингибирует гибридизацию полностью комплементарной последовательности с нуклеиновой кислотой-мишенью и обозначается функциональным термином по существу гомологичная. Термин ингибирование связывания в отношении связывания нуклеиновой кислоты относится к ингибированию связывания, вызванному конкуренцией гомологичных последовательностей за связывание с последовательностью-мишенью. Ингибирование гибридизации полностью комплементарной последовательности с последовательностью-мишенью может быть исследовано с использованием гибридизационного анализа (Саузерн- или Нозерн-блоттинг, жидкофазная гибридизация и т.п.) в условиях низкой жесткости. По существу гомологичная последовательность или зонд конкурируют за связывание и ингибируют связывание (т.е. гибридизацию) полностью гомологичной последовательности с мишенью в

- 13 009746 условиях низкой жесткости. Это не говоря о том, что условия низкой жесткости таковы, что разрешено неспецифическое связывание; условия низкой жесткости требуют, чтобы связывание двух последовательностей друг с другом было специфичным (т.е. селективным) взаимодействием. В отсутствии неспецифического связывания можно убедиться путем использования второй мишени, где отсутствует даже частичная степень комплементарности (например, идентичность менее приблизительно 30%); в отсутствие неспецифического связывания зонд не гибридизуется со второй некомплементарной мишенью.

Из уровня техники хорошо известно, что многочисленные эквивалентные условия могут использоваться для создания условий низкой жесткости; рассматриваются такие факторы, как длина и природа (ДНК, РНК, нуклеотидный состав) зонда и природа мишени (ДНК, РНК, нуклеотидный состав, находится в растворе или иммобилизирован, и т.д.) и концентрация солей и других компонентов (например, присутствие или отсутствие формамида, декстрана сульфата, полиэтиленгликоля), и раствор для гибридизации может варьироваться для создания условий гибридизации низкой жесткости, которые отличаются от приведенных выше условий, но эквивалентны им. Кроме того, из уровня техники известны условия, которые способствуют гибридизации в условиях высокой жесткости (например, повышение температуры гибридизации и/или стадии отмывки, использование формамида в гибридизационном растворе и т.д.).

Последовательность нуклеиновой кислоты (например, кодирующей вариант участка Рс или его часть) может образовывать множество типов РНК, которые создаются путем альтернативного сплайсинга первичного транскрипта РНК. кДНК, которые являются вариантами сплайсинга одного гена, содержат идентичные или полностью гомологичные участки последовательности (являющиеся следствием наличия одинаковых экзона или части экзона в обеих кДНК) и участки полной неидентичности (например, являющиеся следствием наличия экзона А в кДНК 1, причем кДНК 2 вместо этого содержит экзон В). Поскольку две кДНК содержат участки идентичности последовательности, они оба будут гибридизоваться с зондом, полученным из целого гена или частей гена, содержащих последовательности, имеющиеся в обеих кДНК; два варианта сплайсинга, таким образом, являются по существу гомологичными с таким зондом и друг с другом.

Термин по существу гомологичный в отношении одноцепочечной последовательности нуклеиновой кислоты относится к любому зонду, который может гибридизоваться (т.е. является комплементарным) с одноцепочечной последовательностью нуклеиновой кислоты в условиях низкой жесткости.

В настоящем описании термин «гибридизация» используется для обозначения спаривания комплементарных нуклеиновых кислот. На гибридизацию и прочность гибридизации (т. е. прочность связи между нуклеиновыми кислотами) влияют такие факторы, как степень комплементарности между нуклеиновыми кислотами, жесткость используемых условий, Т_пл образованного гибрида и соотношение С:С в нуклеиновых кислотах.

В настоящем описании термин Т_пл используется для обозначения температуры плавления. Температура плавления представляет собой температуру, при которой популяция двухцепочечных молекул нуклеиновой кислоты диссоциирует на одинарные цепи. Уравнение для расчета Т_пл нуклеиновых кислот хорошо известно из уровня техники. Как указано в стандартных источниках, простая оценка значения Т_пл может быть рассчитана по уравнению: Т_пл=81,5+0,41(%С+С), если нуклеиновая кислота находится в водном растворе с 1 М Ναί'Ί (см., например, Лпбег^оп аиб Уоиид, ОнапШабуе ЕШег Ηνόπ6ίζαΙίοη. ίη Νιιс1е1с Ас1б Ηνόπ6ίζ;·ιΙίοη [1985]). В других источниках сообщается о более сложных вычислениях, которые принимают в расчет структурные характеристики и характеристики последовательности для расчета Тпл; и в некоторых случаях Т_пл может быть определена эмпирически, исходя из расчетной Т_пл путем повышения или понижения температуры с малым шагом и определения воздействия на популяцию молекул нуклеиновых кислот.

В настоящем описании термин жесткость в отношении условий температуры, ионной силы и присутствия других соединений, таких как органические растворители, при которых проводится гибридизация нуклеиновых кислот. Специалистам в данной области очевидно, что жесткость условий может быть изменена путем варьирования описанных выше параметров по отдельности или в совокупности. При условиях высокой жесткости спаривание оснований нуклеиновой кислоты будет происходить только между фрагментами нуклеиновой кислоты, имеющими высокую частоту комплементарных нуклеотидных последовательностей (например, гибридизация в условиях высокой жесткости может возникать между гомологами с идентичностью 80-100%, предпочтительно с идентичностью приблизительно 70-100%). При условиях средней жесткости спаривание оснований нуклеиновой кислоты будет происходить между нуклеиновыми кислотами со средней частотой комплементарных нуклеотидных последовательностей (например, гибридизация в условиях средней жесткости будет происходить между гомологами с идентичностью приблизительно 50-70%). Таким образом, условия слабой или низкой жесткости часто необходимы при использовании нуклеиновых кислот, которые получены из генетически отличных организмов, так как частота комплементарных последовательностей в них обычно меньше.

Термин условия высокой жесткости в отношении гибридизации нуклеиновой кислоты включает условия, эквивалентные связыванию или гибридизации при 42°С в растворе, состоящем из 5Х 88РЕ (43,8 г/л №С1, 6,9 г/л ΝαΗ₂ΡΟ₄ Н₂О и 1,85 г/л ЭДТА, рН доведена до 7,4 с помощью ΝαΟΗ), 0,5% натрия додецилсульфата, 5Х реактив Денхардта и 100 мкг/мл денатурированной ДНК из молок лосося, с последую

- 14 009746 щей отмывкой в растворе, который включает 0,1Х 88РЕ, 1,0% 8Ό8 при 42°С, когда используется зонд длиной приблизительно 500 нуклеотидов длиной. Термин условия средней жесткости в отношении гибридизации нуклеиновой кислоты включает условия, эквивалентные связыванию или гибридизации при 42°С в растворе, состоящем из 5Х 88РЕ (43,8 г/л №С1, 6,9 г/л NаН₂Ρ0₄ Н₂0 и 1,85 г/л ЭДТА, рН доведена до 7,4 с помощью №0Н), 0,5% натрия додецилсульфата, 5Х реактив Денхардта и 100 мкг/мл денатурированной ДНК из молок лосося, с последующей отмывкой в растворе, который включает 1,0Х 88РЕ, 1,0% натрия додецилсульфата при 42°С, когда используется зонд длиной приблизительно 500 нуклеотидов.

Условия низкой жесткости включают условия, эквивалентные связыванию или гибридизации при 42°С в растворе, состоящем из 5Х 88РЕ (43,8 г/л №С1, 6,9 г/л NаН₂Ρ0₄ Н₂0 и 1,85 г/л ЭДТА, рН доведена до 7,4 с помощью №0Н), 0,1% натрия додецилсульфата, 5Х реактив Денхардта [50Х содержит на 500 мл: 5 г Е1со11 (тип 400, Рйагтас1а), 5 г В8Л (фракция V; 8Цта)| и 100 г/мл денатурированной ДНК из молок лосося, с последующей отмывкой в растворе, который включает 5Х 88РЕ, 0,1% натрия додецилсульфата при 42°С, когда используется зонд длиной приблизительно 500 нуклеотидов.

Следующие термины используются для описания соотношений последовательностей между двумя или больше полинуклеотидами: ссылочная последовательность, идентичность последовательностей и процент идентичности последовательности. Ссылочная последовательность представляет собой определенную последовательность, которая используется как основа для сравнения последовательностей; ссылочная последовательность может быть подмножеством последовательности большего размера, например, в качестве сегмента полноразмерной последовательности кДНК, приведенной в перечне последовательностей, или может включать полную последовательность гена. В общем, длина ссылочной последовательности составляет по меньшей мере 20 нуклеотидов, часто по меньшей мере 25 нуклеотидов, и часто по меньшей мере 50 нуклеотидов (например, любая из 8ЕЦ ΙΌ N0: 32-37 может использоваться как ссылочная последовательность). Поскольку каждый из двух полинуклеотидов (1) может содержать последовательность (т.е. часть полной последовательности полинуклеотида), которая является сходной для двух полинуклеотидов, и (2) может дополнительно включать последовательность, которая будет различной для двух полинуклеотидов, сравнение последовательностей между двумя (или несколькими) полинуклеотидами обычно осуществляется путем сравнения последовательностей двух полинуклеотидов на протяжении окна сравнения, предназначенного для идентификации сходства и сравнения локальных участков последовательностей. Окно сравнения в настоящем описании относится к схематичному сегменту длиной по меньшей мере 20 смежных нуклеотидных положений, причем полинуклеотидная последовательность может сравниваться с ссылочной последовательностью длиной по меньшей мере 20 смежных нуклеотидов, и причем часть полинуклеотидной последовательности в окне сравнения может включать добавление или делецию (т. е. промежутки), составляющие 20 или меньше процентов от длины ссылочной последовательности (которая не включает добавление или делецию) для оптимального выравнивания двух последовательностей. Оптимальное выравнивание последовательностей для выравнивания окна сравнения может проводиться по алгоритму локальной гомологии 8ιηί11ι и \Уа1егшап |8тЦ11 аиб ^а!егтап, Λάν. Арр1. МаШ 2: 482 (1981)] по алгоритму гомологичного выравнивания №еб1етап и \Уип5с11 [№еб1етап апб ХУипзск 1. Мо1. Вю1. 48:443 (1970)], методом поиска сходства Реагзоп и Ыртап [Реагзоп апб Ыртап, Ргос. №11. Асаб. 8ск (И.8.А.) 85:2444 (1988)], с помощью компьютеризованных воплощений данных алгоритмов (САР, ВЕЗТНТ, ЕА8ТА, и ТЕА8ТА ш 1Не ХУксопзю Сепейсз 8оП\уаге Раскаде КЦеазе 7,0, Сепексз Сотри1ег Сгоир, 575 8аепсе Όγ., Майкоп, \Ук.) или просмотром, и выбирают наилучшее выравнивание (т. е. приводящее к наибольшему проценту гомологии на протяжении окна сравнения) из полученных с помощью различных методов. Термин идентичность последовательностей означает, что две последовательности полинуклеотидов являются идентичными (т.е. по каждому «нуклеотиду») на протяжении окна сравнения. Процент идентичности последовательностей рассчитывают путем сравнения двух оптимально выровненных последовательностей на протяжении окна сравнения, определения количества положений, при которых идентичные основания нуклеиновой кислоты (например, А, Т, С, С, и или Ι) встречаются в обеих последовательностях с получением количества соответствующих положений, делением количества соответствующих положений на общее количество положений в окне сравнения (т. е. размер окна) и умножением результата на 100 с получением процента идентичности последовательности. Окно сравнения в данной заявке представляет собой полную длину упомянутой ссылочной последовательности (т.е. если 8ЕЦ ΙΌ N0:33 упоминается как ссылочная последовательность, процент идентичности последовательности сравнивают на протяжении полной длины 8ЕЦ ΙΌ N0:33).

В настоящем описании термин зонд относится к олигонуклеотиду (т.е. последовательности нуклеотидов), который встречается в природе и который получают в виде рестрикционного фрагмента или получен синтетическим путем, рекомбинантным способом или путем ПЦР амплификации, который способен гибридизоваться с другим интересующим олигонуклеотидом. Зонд может быть одноцепочечным или двухцепочечным. Зонды применимы для обнаружения, идентификации и выделения последовательностей конкретных генов. Считается, что любой зонд, который используется в соответствии с настоящим изобретением, может быть помечен любой репортерной молекулой, таким образом, что он может быть обнаружен в любой системе обнаружения, включая без ограничения ферментные (например, ЕЫ8А, а

- 15 009746 также гистохимические анализы на основе ферментов), флуоресцентные, радиоактивные и люминесцентные системы. Настоящее изобретение не ограничивается какой-либо конкретной системой обнаружения или меткой.

В настоящем описании термин полимеразная цепная реакция (ПЦР) относится к способу, описанному в патентах США №№ 4683195, 4683202 и 4965188, которые включены в настоящее описание посредством ссылки, в которых раскрыт способ увеличения концентрации сегмента последовательностимишени в смеси геномной ДНК без клонирования или очистки. Этот способ амплификации последовательности-мишени состоит из введения большого избытка двух олигонуклеотидных праймеров в смесь ДНК, которая содержит желаемую последовательность-мишень, с последующей точной последовательностью циклов термической обработки в присутствии ДНК-полимеразы. Два праймера комлементарны соответствующим цепям двухцепочечной последовательности-мишени. Для осуществления амплификации смесь денатурируют и праймеры затем отжигают с комплементарными последовательностями в молекуле-мишени. После отжига праймеры удлиняют с помощью полимеразы таким образом, чтобы образовать новую пару комплементарных цепей. Стадии денатурации, отжига праймера и полимеразного удлинения могут повторяться несколько раз (т.е. денатурация, отжиг и удлинение составляют один цикл; и может присутствовать много циклов) для получения высокой концентрации амплифицированного сегмента желаемой последовательности-мишени. Длину амплифицированного сегмента желаемой последовательности-мишени определяют по относительным положениям праймеров друг относительно друга, и, таким образом, эта длина является контролируемым параметром. Из-за аспекта повторяемости процесса способ называется полимеразной цепной реакцией (в настоящем описании ПЦР). Поскольку желаемые амплифицированные сегменты последовательности-мишени становятся преобладающими в смеси последовательностями (по концентрации), их называют ПЦР-амплифицированными.

ПЦР позволяет амплифицировать единственную копию конкретной последовательности-мишени в геномной ДНК до уровня, который может быть обнаружен с помощью нескольких различных методик (например, гибридизации с меченым зондом; включения биотинилированных праймеров с последующим обнаружением с помощью авидин-ферментного конъюгата; включения меченых ³²Р дезоксинуклеотидтрифосфатов, таких как дЦТФ или дАТФ, в амплифицированный сегмент). Помимо геномной ДНК, любая олигонуклеотидная или полинуклеотидная последовательность может быть амплифицирована с помощью подходящего набора молекул праймеров. Конкретно, амплифицированные сегменты, созданные с помощью процесса ПЦР, сами по себе являются эффективными матрицами для последующей ПЦРамплификации.

Термин выделенный в отношении нуклеиновой кислоты, как в выражениях выделенный олигонуклеотид или выделенный полипептид, относится к последовательности нуклеиновой кислоты, которая идентифицирована и отделена по меньшей мере от одной загрязняющей нуклеиновой кислоты, с которой она обычно встречается в их природном источнике. Выделенная нуклеиновая кислота находится в виде или состоянии, которое отличается от того, в котором она встречается в природе. Выделенные молекулы нуклеиновой кислоты, таким образом, отличаются от молекулы нуклеиновой кислоты, которая существует в природных клетках. Однако выделенная молекула нуклеиновой кислоты включает молекулу нуклеиновой кислоты, содержащуюся в клетках, которые обычно экспрессируют полипептид, причем, например, молекула нуклеиновой кислоты находится в хромосомном локусе, отличном от локуса в природных клетках. Выделенная нуклеиновая кислота, олигонуклеотид или полинуклеотид может существовать в одноцепочечной или двухцепочечной форме. Если выделенная нуклеиновая кислота, олигонуклеотид или полинуклеотид используются для экспрессии белка, олигонуклеотид или полинуклеотид будет содержать по меньшей мере смысловую или кодирующую цепь (т.е. олигонуклеотид или полинуклеотид может быть одноцепочечным), но могут содержать смысловую и антисмысловую цепи (т.е. олигонуклеотид или полинуклеотид может быть двухцепочечным).

В настоящем описании термин часть в отношении нуклеотидной последовательности (как в выражениях часть данной нуклеотидной последовательности) относится к фрагментам такой последовательности. Фрагменты могут варьировать по размеру от 10 нуклеотидов до полной нуклеотидной последовательности минус один нуклеотид (например, 10 нуклеотидов, 20, 30, 40, 50, 100, 200 и т.д.).

В настоящем описании термин часть в отношении аминокислотной последовательности (как в выражениях часть данной аминокислотной последовательности) относится к фрагментам такой последовательности. Фрагменты могут варьировать по размеру от 6 аминокислот до полной аминокислотной последовательности минус одна аминокислота (например, 6 аминокислот, 10, 20, 30, 40, 75, 200 и т.д.).

В настоящем описании термин очищенный или очищать означает удаление загрязняющих веществ из образца. Например, антиген-специфические антитела могут быть очищены удалением загрязняющих белков, отличных от иммуноглобулинов; их также очищают удалением иммуноглобулина, который не связывается с тем же антигеном. Удаление белков, отличных от иммуноглобулинов, и/или удаление иммуноглобулинов, которые не связываются с конкретным антигеном, приводит к увеличению процентного содержания антиген-специфических иммуноглобулинов в образце. В другом примере рекомбинантные антиген-специфические полипептиды экспрессируются в бактериальных клеткаххозяевах, и полипептиды очищают удалением белков клеток-хозяев; процент рекомбинантных антиген

- 16 009746 специфических полипептидов в образце таким образом повышается.

Термин рекомбинантная молекула ДНК в настоящем описании относится к молекуле ДНК, которая включает сегменты ДНК, соединенные вместе в соответствии с молекулярно-биологическими методиками.

Термин рекомбинантный белок или рекомбинантный полипептид в настоящем описании относится к молекуле белка, который экспрессируется молекулой рекомбинантной ДНК.

Термин нативный белок в настоящем описании показывает, что белок не содержит остатков аминокислот, кодируемых векторными последовательностями; т.е. нативный белок содержит только аминокислоты, присутствующие в белке, который обычно встречается в природе. Нативный белок может быть получен рекомбинатными средствами или может быть выделен из природного источника.

Термин Саузерн-блоттинг относится к анализу ДНК на агарозных или акриламидных гелях для фракционирования ДНК в соответствии с размером с последующим переносом ДНК из геля на твердую подложку, такую как нитроцеллюлоза или нейлоновая мембрана. Иммобилизированную ДНК затем зондируют меченым зондом для обнаружения молекул ДНК, комплементарных используемому зонду. ДНК может быть расщеплена рестриктазами до проведения электрофореза. После электрофореза ДНК может быть частично депуринирована и денатурирована до или во время переноса на твердую подложку. Саузерн-блоттинг представляет собой стандартный инструмент молекулярных биологов (1. 8атЬгоок с1 а1., Мо1еси1аг С1ошид: А ЬаЬога1огу Мапиа1, СоИ 8ргтд НагЬог Ргезз, ΝΥ, рр 9.31-9.58 [1989]).

Термин Нозерн-блоттинг в настоящем описании относится к анализу РНК путем электрофореза РНК на агарозных гелях для фракционирования РНК в соответствии с размером с последующим переносом РНК из геля на твердую подложку, такую как нитроцеллюлоза или нейлоновая мембрана. Иммобилизированную РНК затем зондируют меченым зондом для выявления молекул РНК, комплементарных используемому зонду. Нозерн-блоттинг представляет собой стандартный инструмент молекулярных биологов (1. 8атЬгоок, е! а1., зирга, рр 7.39-7.52 [1989]).

Термин Вестерн-блоттинг относится к анализу белка(ов) (или полипептидов), иммобилизированных на подложке, такой как нитроцеллюлоза или мембрана. Белки обрабатывают на акриламидных гелях для разделения, с последующим переносом белка из геля на твердую подложку, такую как нитроцеллюлоза или нейлоновая мембрана. Иммобилизированные белки затем контактируют с антителами, реагирующими с интересующим антигеном. Связывание антител можно выявить различными способами, включая использование радиоактивно меченых антител.

Термин антигенная детерминанта в настоящем описании относится к такой части антигена, которая контактирует с конкретным антителом (т.е. эпитопу). Если белок или фрагмент белка используют для иммунизации животного-хозяина, многочисленные участки белка могут индуцировать продукцию антител, которые специфически связываются с данным участком или трехмерной структурой белка; данные участки или структуры обозначают как антигенные детерминанты. Антигенная детерминанта может конкурировать с интактным антигеном (т.е. «иммуногеном», который используется для индукции иммунного ответа) за связывание с антителом.

Термин трансген в настоящем описании относится к чужеродному, гетерологичному или аутологичному гену, который вводят в организм путем введения гена в только что оплодотворенные яйца или эмбрионы на ранних стадиях. Термин чужеродный ген относится к любой нуклеиновой кислоте (например, генной последовательности), которая введена в геном животного с помощью экспериментальных манипуляций и может включать генные последовательности, имеющиеся у такого животного при условии, что введенный ген имеет локализацию, отличную от таковой природного гена. Термин аутологичный ген включает варианты (например, полиморфы или мутанты) природного гена. Термин «трансген», таким образом, включает замещение природного гена вариантной формой гена.

В настоящем описании термин вектор используется для обозначения молекул нуклеиновой кислоты, которые переносят сегмент(ы) ДНК от одной клетки к другой. Термин носитель иногда используется взаимозаменяемо с термином вектор.

Термин экспрессирующий вектор в настоящем описании относится к молекуле рекомбинантной ДНК, содержащей желаемую кодирующую последовательность и соответствующие последовательности нуклеиновой кислоты, необходимые для экспрессии функционально присоединенной кодирующей последовательности в конкретном организме-хозяине.

Последовательности нуклеиновых кислот, необходимые для экспрессии в прокариотах, обычно включают промотор, оператор (необязательно) и сайт связывания рибосомы, часто вместе с другими последовательностями. Известно, что эукариотические клетки используют промоторы, энхансеры и сигналы терминации и полиаденилирования.

В настоящем описании термин клетка-хозяин относится к любой эукариотической или прокариотической клетке (например, бактериальным клеткам, таким как Е. сой, клетки СНО, дрожжевые клетки, клетки млекопитающих, клетки птиц, клетки амфибий, клетки растений, клетки рыб и клетки насекомых), находящейся ίη νίΙΐΌ или ίη у1уо. Например, клетки-хозяева могут находиться в трансгенном животном.

Термины трансфекция и трансформация в настоящем описании означают введение чужеродной

- 17 009746

ДНК в клетки (например, эукариотические или прокариотические клетки). Трансфекция может достигаться с помощью разнообразных средств, известных из уровня техники, включая соосаждение фосфата кальция-ДНК, опосредованную ОЕАЕ-декстраном трансфекцию, опосредованную полибреном трансфекцию, электропорацию, микроинъекцию, слияние липосомы, липофекцию, слияние протопласта, ретровирусную инфекцию и биолистику.

Термин стабильная трансфекция или стабильно трансфицированный относится к введению и интеграции чужеродной ДНК в геном трансфицированной клетки. Термин стабильный трансфектант относится к клетке, которая содержит чужеродную ДНК, стабильно встроенную в геномную ДНК.

Термин временная трансфекция или временно трансфицированный относится к введению чужеродной ДНК в клетку, где чужеродная ДНК не способна встроиться в геном трансфицированной клетки. Чужеродная ДНК сохраняется в ядре трансфицированной клетки в течение нескольких дней. В течение этого времени чужеродная ДНК подвергается регуляторному контролю, который управляет экспрессией эндогенных генов в хромосомах. Термин временный трансфектант относится к клеткам, которые захватили чужеродную ДНК, но оказались не способны интегрировать эту ДНК.

Термин соосаждение с фосфатом кальция относится к технике введения нуклеиновых кислот в клетку. Захват нуклеиновых кислот клетками усиливается, если нуклеиновая кислота присутствует в виде соосадка фосфат кальция-нуклеиновая кислота. Исходная методика Сгайат и уаи бег ЕЬ (Сгайат и уаи бег ЕЬ, У1го1., 52:456 [1973]) была модифицирована несколькими группами для оптимизации условий для конкретных типов клеток. Эти многочисленные модификации хорошо известны из уровня техники.

Термин композиция, которая включает данную последовательность полинуклеотида в настоящем описании относится к любой композиции, включающей данную последовательность полинуклеотида. Композиция может включать водный раствор. Композиция, включающая последовательности полинуклеотида, кодирующие, например, вариант участка Ес или его фрагмент, может применяться как зонд гибридизации. В этом случае последовательности полинуклеотида, кодирующие вариант участка Ес, обычно применяются в водном растворе, содержащем соли (например, ИаС1), детергенты (например, натрия додецилсульфат) и другие компоненты (например, раствор Денхардта, сухое молоко, ДНК молоки лосося и т.д.).

Термины исследуемое соединение или соединение-кандидат обозначают любое химическое вещество, фармацевтический препарат, лекарственное средство и т.п., которые могут быть применены для лечения или профилактики заболевания, недомогания, болезни или расстройства функций организма или другим образом изменяет физиологический или клеточный статус образца. Исследуемые соединения включают известные и потенциальные лекарственные соединения. Терапевтические свойства исследуемого соединения могут быть определены путем скрининга с применением способа скрининга по данному изобретению. Термин «известное терапевтическое соединение относится к соединению с доказанными лечебными свойствами (например, в результате исследований на животных или предварительного опыта введения людям) как эффективное для такого лечения или профилактики.

В настоящем описании термин ответ в отношении анализа относится к генерации детектируемого сигнала (например, накопление репортерного белка, повышение концентрации иона, накопление детектируемого химического продукта).

В настоящем описании термин репортерный ген относится к гену, кодирующему белок, который может быть обнаружен с помощью анализа. Примеры репортерных генов включают без ограничения люциферазу (см., например, бе\Уе1 е! а1., Мо1. Се11. Вю1., 7:725 [1987] и патент США № 6074859, включенные в настоящее описание посредством ссылки), зеленый флуоресцентный белок (СЕР, например, СепВаик Ассеззюи ЫитЬег И43284; множество вариантов СЕР коммерчески доступны от СЬОИТЕСН ЬаЬога1ог1е8, Ра1о А1!о, СА), хлорамфеникол ацетилтрансферазу, β-галактозидазу, щелочную фосфатазу и пероксидазу хрена.

В настоящем описании термины компьютерная память и устройство компьютерной памяти обозначает любые средства для хранения, которые могут быть считаны процессором компьютера. Примеры компьютерной памяти включают без ограничения ПЗУ, ОЗУ, компьютерные микросхемы, цифровые видеодиски (ОУО), компакт-диски (СО), жесткие диски (НЭЭ) и магнитную ленту.

В настоящем описании термин машиночитаемый носитель относится к любому устройству или системе для хранения и доставки информации (например, данные и инструкции) процессору компьютера. Примеры машиночитаемых носителей включают без ограничения ЭУО, СО, жесткие диски, магнитную ленту и серверы для распределения носителей по компьютерным сетям.

В настоящем описании фраза машиночитаемый носитель кодирует представление последовательности нуклеиновой кислоты или аминокислотной последовательности относится к машиночитаемому носителю, на котором хранится информация, которая при доставке процессору позволяет показать пользователю (например, распечатать или представить на экране дисплея) последовательность нуклеиновой кислоты или аминокислот.

В настоящем описании термины процессор и модуль центрального процессора или СРИ используются взаимозаменяемо и обозначают устройство, способное считывать программу из памяти компьютера (например, ПЗУ или другой вид компьютерной памяти) и выполнять набор шагов в соответст

- 18 009746 вии с программой.

В настоящем описании нумерация аминокислотных остатков в тяжелой цепи иммуноглобулина использует формат индекса ЕС, как в КаЬа! с1 а1., 8сс.|испес5 о£ Рго1еш8 о£ 11птшю1ощса1 1п1сгсь(. 5111 Еб. РиЬНс Неа11й 8егу1се, Ыабопа1 ПъШШех о£ НеаИй, ВеШекба, ΜΌ (1991), специально включенной в настоящее описание посредством ссылки. Термин формат индекса ЕС согласно КаЬа! относится к нумерации остатков антитела человеческого 1дС1 ЕС.

В настоящем описании термин исходный полипептид представляет собой полипептид, включающий аминокислотную последовательность, которая может быть заменена или изменена (например, осуществлены замена, добавление или делеция аминокислоты) для создания варианта. В предпочтительных вариантах осуществления исходный полипептид включает по меньшей мере часть природного участка Ес или участок Ес с модификациями аминокислотной последовательности (например, добавление, делеция и/или замена). В некоторых вариантах осуществления конкретно рассматриваются варианты, которые короче или длиннее, чем исходный полипептид. В особенно предпочтительных вариантах осуществления исходный полипептид отличается по функции (например, эффекторная функция, связывание и т.д.) в сравнении с вариантом.

В настоящем описании термин вариант исходного полипептида относится к пептиду, включающему аминокислотную последовательность, которая отличается от таковой исходного полипептида по меньшей мере одной модификацией аминокислоты. В определенных вариантах осуществления вариант включает по меньшей мере часть участка Ес (например, по меньшей мере 40, 50, 75 или 90% или участок Ес). В предпочтительных вариантах осуществления вариант включает участок Ес исходного полипептида по меньшей мере с одной модификацией аминокислоты.

В настоящем описании термин участок Ес относится к С-концевому участку тяжелой цепи иммуноглобулина. Участок Ес может быть участком Ес с нативной последовательностью или вариантом участка Ес. Хотя общепринятые границы участка Ес тяжелой цепи иммуноглобулина могут варьировать, участок Ес тяжелой цепи 1дС человека обычно определяется промежутком от остатка аминокислоты в положении Су§226 или от Рго230 до его карбоксильного конца. В некоторых вариантах осуществления варианты включают только части участка Ес и могут включать или не включать карбоксильный конец. Участок Ес иммуноглобулина, в общем, включает два константных домена, СН2 и СН3. В некоторых вариантах осуществления рассматриваются варианты, содержащие один или несколько константных доменов. В других вариантах осуществления рассматриваются варианты без таких константных доменов (или только с частью таких константных доменов).

В настоящем описании СН2 домен (также обозначается как Су2 домен), как правило, включает промежуток остатков, который продолжается приблизительно от аминокислоты 231 приблизительно до аминокислоты 340 на участке Ес (например, в человеческом участке Ес 1дС). Домен СН2 является уникальным в том, что он не является тесно спаренным с другим доменом. Скорее, две Ν-связанные разветвленные углеводные цепи встроены между двумя доменами СН2 интактной молекулы нативного 1дС.

В настоящем описании СН3 домен (также обозначается как Су3 домен), как правило, включает промежуток остатков С-концевого по отношению к СН2 домену участка Ес (например, приблизительно от остатка аминокислоты 341 приблизительно до остатка аминокислоты 447 участка Ес 1дС человека).

В настоящем описании участок Ес может обладать эффекторными функциями, которые ответственны за активацию или снижение биологической активности (например, у субъекта). Примеры эффекторных функций включают без ограничения С1с.|: связывание; комплемент-зависимую цитотоксичность (СЭС); связывание с рецептором Ес; антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ЛОСС); фагоцитоз; понижающую регуляцию рецепторов на поверхности клетки (например, В-клеточного рецептора; ВСЕ) и т.д. Такие эффекторные функции могут требовать, чтобы участок Ес был объединен с доменом связывания (например, вариабельный домен антитела), и могут быть оценены с применением различных анализов (например, анализа связывания Ес, анализа ЛЭСС. анализа СЭС, истощение клеток-мишеней из образцов цельной или фракционированной крови и т. д.).

В настоящем описании термин натаивная последовательность участка Ес или участок Ес дикого типа относится к аминокислотной последовательности, идентичной аминокислотной последовательности участка Ес, обычно встречающейся в природе. Показательные нативные последовательности участка Ес человека и включают нативную последовательность участка Ес человеческого 1дС1 (£ и а, ζ аллотипы); нативную последовательность участка Ес человеческого 1дС2; нативную последовательность участка Ес человеческого 1дС3 и нативную последовательность участка Ес человеческого 1дС4, а также их природные варианты. Другие последовательности также рассматриваются и могут быть легко получены с различных веб-сайтов (например, веб-сайт Νί,’ΒΙ).

В настоящем описании термин вариант участка Ес относится к аминокислотной последовательности, которая отличается от таковой участка Ес с нативной последовательностью (или их части) по меньшей мере одной модификацией аминокислоты (например, заменой, вставкой или делецией), включая гетеродимерные варианты, причем последовательности субъединиц тяжелой цепи могут отличаться друг от друга. В предпочтительных вариантах осуществления вариант участка Ес включает по меньшей мере

- 19 009746 одну замену аминокислоты в сравнении с участком Ес с нативной последовательностью (например, заменено приблизительно от 1 приблизительно до 10 аминокислот и предпочтительно заменено приблизительно от 1 приблизительно до 5 аминокислот в нативной последовательности участка Ес). В предпочтительных вариантах осуществления варианты участка Ес будут обладать по меньшей мере приблизительно 80% гомологии с нативной последовательностью участка Ес, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 90% гомологии и более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 95% гомологии.

В настоящем описании термин гомология в отношении аминокислотных последовательностей относится к проценту остатков в варианте аминокислотной последовательности, которые являются идентичными с нативной аминокислотной последовательностью после выравнивания последовательностей и введения при необходимости пропусков для достижения максимального процента гомологии.

Термин полипептид, содержащий участок Ес относится к полипептиду, такому как антитело или иммуноадгезин (см. определения ниже), который включает участок Ес.

Термины Ес-рецептор и ЕсК используются для описания рецептора, который связывается с участком Ес (например, участок Ес антитела или фрагмента антитела). Термин включает рецептор новорожденных, ЕсКп, который отвечает за перенос иммуноглобулинов Ι§0 от матери плоду.

В настоящем описании фраза антитело-зависимая клеточная цитотоксичность и термин АЭСС означают клеточно-опосредованную реакцию, в которой цитотоксические клетки (например, неспецифические), которые экспрессируют ЕсКк (например, природные клетки-киллеры (МК), нейтрофилы и макрофаги), распознают связанное антитело на клетке-мишени и далее вызывают лизис клеток-мишеней. Основные клетки для опосредования АЭСС, клетки ИК, экспрессируют ЕсуКШ, тогда как моноциты экспрессируют ЕсуШ, ЕсуКН и ЕсуКШ.

В настоящем описании фраза эффекторные клетки относится к лейкоцитам, которые экспрессируют один или больше ЕсК и выполняют эффекторные функции. Предпочтительно клетки экспрессируют по меньшей мере ЕсуКШ и выполняют эффекторную функцию АЭСС. Примеры лейкоцитов, которые опосредуют АЭСС, включают мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС), природные клетки-киллеры (КК), моноциты, цитотоксические Т-клетки и нейтрофилы. Эффекторные клетки могут быть выделены из природного источника (например, из крови).

В настоящем описании фраза цельная кровь относится к образцам нефракционированной крови.

В настоящем описании вариант полипептида с измененной ЕсК связывающей активностью или АЭСС активностью представляет собой такой, который обладает увеличенной (т.е. повышенной) или уменьшенной (т.е. сниженной) ЕсК-связывающей активностью и/или активностью ЛЭСС в сравнении с исходным полипептидом или полипептидом, включающим участок Ес с нативной последовательностью. Вариант полипептида, который демонстрирует повышенное связывание с ЕсК, связывается по меньшей мере с одним ЕсК с лучшим сродством, чем исходный полипептид. Вариант полипептида, который демонстрирует сниженное связывание с ЕсК, связывается по меньшей мере с одним ЕсК с худшим сродством, чем исходный полипептид. Такие варианты, которые демонстрируют сниженное связывание с ЕсК, могут проявлять небольшое или не проявлять совсем заметного связывания с ЕсК, например 0-20% связывание с ЕсК в сравнении с исходным полипептидом. Вариант полипептида, который связывает ЕсК с лучшим сродством», чем исходный полипептид, представляет собой полипептид, который связывает любой один или несколько из идентифицированных выше ЕсК с более высоким сродством связывания, чем исходное антитело, когда количества варианта полипептида и исходный полипептид в пробе связывания по существу являются сходными, и все другие условия являются идентичными. Например, вариант полипептида с улучшенным сродством связывания с ЕсК может демонстрировать приблизительно от 1,10-кратного приблизительно до 100-кратного (чаще приблизительно от 1,2-кратного приблизительно до 50-кратного) улучшения (т.е. повышения) сродства связывания с ЕсК в сравнении с исходным полипептидом, где ЕсК связывающую активность определяют, например, в анализе ЕЫ8Л.

В настоящем описании модификация аминокислоты относится к изменению в аминокислотной последовательности данной аминокислотной последовательности. Показательные модификации включают без ограничения замену, вставку и/или делецию аминокислоты. В предпочтительных вариантах осуществления модификация аминокислоты представляет собой замену (например, в участке Ес исходного полипептида).

В настоящем описании модификация аминокислоты в указанном положении (например, в участке Ес) относится к замене или делеции обозначенного остатка или вставку по меньшей мере одного аминокислотного остатка, смежного с обозначенным остатком. Вставка смежного с указанным остатка означает вставку с одним или двумя его остатками. Вставка может быть ^концевой или С-концевой по отношению к указанному остатку.

В настоящем описании замена аминокислоты относится к замене по меньшей мере одного существующего остатка аминокислоты в данной аминокислотной последовательности другим отличным заменяющим остатком аминокислоты. Заменяющий остаток или остатки могут представлять собой природные остатки аминокислот (т.е. кодируемые генетическим кодом) и выбранные из: аланина (А1а); аргинина (Агд); аспарагина (Аки); аспарагиновой кислоты (Акр); цистеина (Сук); глутамина (С1п); глутами

- 20 009746 новой кислоты (С1и); глицина (С1у); гистидина (Н18); изолейцина (11е); лейцина (Ьеи); лизина (Ьук); метионина (Ме!); фенилаланина (РЬе); пролина (Рго); серина (8ег); треонина (ТЬг); триптофана (Тгр); тирозина (Туг) и валина (Уа1). Замена одним или несколькими остатками неприродных аминокислот также охватывается определением аминокислотной замены в настоящем описании. Термин неприродный аминокислотный остаток относится к остатку, отличному от природных аминокислотных остатков, перечисленных выше, который способен ковалентно связываться со смежным остатком(ами) аминокислот в полипептидной цепи. Примеры неприродных аминокислотных остатков включают норлейцин, орнитин, норвалин, гомосерин и другие аналоги остатков аминокислот, такие как описаны в Е11тап е! а1. Ме!Ь. Епхут. 202: 301-336 (1991), включенной сюда посредством ссылки.

В настоящем описании термин вставка аминокислоты относится к включению по меньшей мере одной аминокислоты в данной аминокислотной последовательности. В предпочтительных вариантах осуществления вставка обычно представляет собой вставку одного или двух остатков аминокислот. В других вариантах осуществления вставка включает вставки большего пептида (например, вставку приблизительно от 3 приблизительно до 5 или даже приблизительно 10 аминокислотных остатков).

В настоящем описании термин делеция аминокислоты относится к делеции по меньшей мере одного аминокислотного остатка из данной аминокислотной последовательности.

Термин аналитический сигнал относится к выходу любого способа обнаружения белок-белкового взаимодействия, включая без ограничения измерение поглощения колориметрических анализов, интенсивности флуоресценции или распадов в минуту. Форматы анализов могут включать ЕЬ18А, Еаск или другие способы. Изменение в аналитическом сигнале может отображать изменение жизнеспособности клеток и/или изменение в кинетике образования связей, кинетике диссоциации связей или обеих. Термин более сильный аналитический сигнал относится к измеренному значению выхода, большему, чем другое число (например, вариант может иметь более высокое (большее) измеренное значение в анализе ЕЫ8А в сравнении с исходным полипептидом). Термин более слабый аналитический сигнал относится к измеренному значению выхода, более низкому, чем другое число (например, вариант может иметь более низкое (меньшее) измеренное значение в анализе ЕЫ8А в сравнении с исходным полипептидом).

Термин связывающая активность относится к константе равновесия диссоциации (выражается в единицах концентрации), связанной с каждым связывающим взаимодействием Ес рецептор-Ес. Сродство связывания имеет непосредственное отношение к соотношению кинетики образования связей (в общем регистрируется в единицах обратного времени, например с^-1), разделенных на кинетику диссоциации связей (в общем регистрируется в единицах концентрации на единицу времени, например, мол./с). Обычно невозможно однозначно утверждать, являются ли изменения констант равновесия диссоциации следствием отличий в образовании связей, диссоциации связей или обоих параметрах, за исключением случая, когда каждый из этих параметров определен экспериментально (например, с помощью измерений В1АС0ВЕ или 8АР1ИУИЕ).

В настоящем описании термин шарнирный участок относится к промежутку аминокислот в 1дС1 человека, который простирается от С1и216 до Рго230 человеческого 1дС1. Шарнирные участки других изотипов 1дС могут быть выровнены с последовательностью 1дС1 размещением первого и последнего остатков цистеина, образующих 8-8 связи между тяжелыми цепями в одних и тех же положениях.

В настоящем описании термин нижний шарнирный участок участка Ес относится к промежутку аминокислотных остатков непосредственно С-концевых по отношению к шарнирному участку (например, остатки 233-239 участка Ес 1§С1).

С1с.| представляет собой полипептид, который включает сайт связывания для участка Ес иммуноглобулина. С1с.| вместе с двумя сериновыми протеазами, С1г и СП. образует комплекс С1, первый компонент пути комплемент-зависимой цитотоксичности (СЭС).

В настоящем описании термин антитело используется в самом широком смысле и, в частности, охватывает моноклональные антитела (включая полноразмерные моноклональные антитела), поликлональные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела) и фрагменты антител при условии, что они проявляют желаемую биологическую активность.

В настоящем описании термин фрагменты антител относится к части интактного антитела. Примеры фрагментов антител включают без ограничения линейные антитела; одноцепочечные молекулы антител; пептиды Ес или Ес', ЕаЬ и ЕаЬ фрагменты и мультиспецифичные антитела, образованные из фрагментов антител. Фрагменты антител предпочтительно сохраняют по меньшей мере часть шарнирного и необязательно СН1 участка тяжелой цепи 1дС. В других предпочтительных вариантах осуществления фрагменты антитела включают по меньшей мере часть участка СН2 или полностью участок СН2.

В настоящем описании термин функциональный фрагмент в отношении моноклонального антитела относится к части моноклонального антитела, которая все еще сохраняет функциональную активность. Функциональная активность может быть, например, антиген-связывающей активностью или специфичностью. Функциональные фрагменты моноклонального антитела включают, например, отдельные тяжелые или легкие цепи и их фрагменты, такие как УЪ, УН и Ей; моновалентные фрагменты, такие как Еу, ЕаЬ, и ЕаЬ'; двухвалентные фрагменты, такие как Е(аЬ')₂; одноцепочечные Еу (ксЕу) и фрагменты Ес. Такие термины описаны, например, в Нат1о^е аий Ьапе, АийЬоФек: А ЬаЬота!огу Мапиа1, Со1й 8рппд НагЬог ЬаЬота!огу, №\ν Уотк (1989); Мо1ес. Вю1о§у апй Вю!ескио1о§у: А Сотртекепыуе Эе^к ВеГегепсе

- 21 009746 (Муегк, КА. (еб.), №\ν Уогк: УСН РиЬНккег, Кс.); НикРоп еР а1., Се11 ВюрЬуккк, 22:189-224 (1993); Р1искРкии апб 8кегга, МеРк. Еихуток, 178:497-515 (1989) и в Иау, Е.И., Абуаисеб Iттиηоскет^8ΐ^у, 8есопб Еб., ^беу-Ь188, Кс.. №\ν Уогк, ΚΥ (1990), каждая из которых включена сюда посредством ссылки. Термин «функциональный фрагмент» включает, например, фрагменты, образованные путем расщепления протеазой или восстановления моноклонального антитела и с помощью методов рекомбинантных ДНК, известных специалистам в данной области.

В настоящем описании гуманизированные формы, отличные от человеческих (например, мышиных) антител, представляют собой антитела, которые содержат минимальную последовательность, происходящую из отличного от человеческого иммуноглобулина, или она отсутствует. По большей части гуманизированные антитела представляют собой человеческие иммуноглобулины (антитело-реципиент), в котором остатки гипервариабельного участка реципиента замещены остатками гипервариабельного участка отличных от человеческих видов (антитело-донор), таких как мышь, кролик или нечеловекообразный примат, имеющих желаемую специфичность, сродство и емкость. В некоторых случаях остатки каркасной области Еу (ЕЯ) иммуноглобулина человека замещены соответствующими отличными от человеческих остатками. Кроме того, гуманизированные антитела могут включать остатки, которые не содержатся в антителе-реципиенте или в антителе-доноре. Такие модификации, как правило, осуществляют для дальнейшего улучшения функциональности антитела. Обычно гуманизированное антитело будет включать, по существу, все, по меньшей мере один и обычно два вариабельных домена, где все или, по существу, все гипервариабельные петли соответствуют таковым отличного от человеческого иммуноглобулина и все или, по существу, все остатки ЕК являются таковыми последовательности человеческих иммуноглобулинов. Гуманизированное антитело может также включать по меньшей мере часть константного участка иммуноглобулина (Ес), обычно человеческого иммуноглобулина. Примеры способов, которые используются для создания гуманизированного антитела, описаны в патенте США № 5225539, выданном ^У1п1ег еР а1. (включен сюда посредством ссылки).

В настоящем описании термин гипервариабельный участок относится к аминокислотным остаткам антитела, которые ответственны за связывание с антигеном. Гипервариабельный участок включает аминокислотные остатки из определяющего комплементарность участка или СИЯ (т.е. остатки 24-34 (Ь1), 50-56 (Ь2) и 89-97 (Ъ3) в вариабельном домене легкой цепи и 31-35 (Н1), 50-65 (Н2) и 95-102 (Н3) в вариабельном домене тяжелой цепи; КаЬаР еР а1., 8ециепсек оГ РгоРетк оГ К11пипо1од1са1 КРегекР, 5111 Еб. РиЬкс Неа1Рк 8егу1се, №1бопа1 [п8111и1ек оГ Неакк, ВеРкекба, ΜΌ. (1991)) и/или такие остатки из гипервариабельной петли (т.е. остатки 26-32 (Ь1), 50-52 (Ъ2) и 91-96 (Ь3) в вариабельном домене легкой цепи и 26-32 (Н1), 53-55 (Н2) и 96-101 (Н3) в вариабельном домене тяжелой цепи; СкоРк1а и Ьекк I. Мо1. В1о1. 196: 901-917 (1987)). Каркасные или ЕЯ остатки являются остатками вариабельного домена, другими чем остатки гипервариабельного участка, как определено в настоящем описании.

В настоящем описании термин иммуноадгезин обозначает антитело-подобные молекулы, которые сочетают домен связывания гетерологичного адгезина белка (например, рецептор, лиганд или фермент) с константным доменом иммуноглобулина. Структурно, иммуноадгезины включают гибрид аминокислотной последовательности с желаемой специфичностью связывания, которая отличается от сайта распознавания и связывания антигена (антиген-связывающего сайта) антитела (т.е. является гетерологичным) по отношению к последовательности константного домена иммуноглобулина.

В настоящем описании термин лиганд-связывающий домен относится к любому нативному рецептору или любому участку или его производному, которое сохраняет по меньшей мере качественную лиганд-связывающую способность соответствующего нативного рецептора. В определенных вариантах осуществления рецептор происходит из полипептида клеточной поверхности, который содержит внеклеточный домен и является гомологичным члену надсемейства иммуноглобулинов. Другие рецепторы, которые не являются членами надсемейства иммуноглобулинов, но, тем не менее, конкретно охватываются данным определением, представляют собой рецепторы цитокинов, и, конкретно, рецепторы с тирозинкиназной активностью (рецепторы тирозинкиназы), члены надсемейств рецепторов гематопоэтинов и факторов роста нервов, и молекулы клеточной адгезии (например, Е-, Ь- и Р- селектины).

В настоящем описании термин рецептор-связывающий домен относится к любому нативному лиганду рецептора, включая молекулы клеточной адгезии или любой участок или производное такого природного лиганда, сохраняющему по меньшей мере качественную способность к связыванию соответствующего нативного лиганда.

В настоящем описании термин антитело-иммуноадгезиновая химера включает молекулу, которая сочетает по меньшей мере один домен связывания антитела по меньшей мере с одним иммуноадгезином. Примеры включают без ограничения биспецифические 0Ό4-Ι§Ο химеры, описанные в Вегд еР а1., ΡNА8 (И8А) 88:4723-4727 (1991) и С.’11агпо\у еР а1., I. Iттипо1., 153:4268 (1994), каждая из которых включена сюда посредством ссылки.

В настоящем описании выделенный полипептид представляет собой полипептид, который был идентифицирован и отделен и/или выделен от компонента его природного окружения. Загрязняющие компоненты его природного окружения представляют собой вещества, которые будут мешать диагностическому или терапевтическому применению полипептида, и могут включать ферменты, гормоны и

- 22 009746 другие белковые или небелковые вещества. В определенных вариантах осуществления выделенный полипептид очищают до (1) более 95 мас.% полипептидов, как определено по методу Лоури, и предпочтительно более 99 мас.%, (2) достаточной степени для получения по меньшей мере 15 остатков ^концевой или внутренней аминокислотной последовательности путем использования колпачного секвенатора или (3) до гомогенности с помощью электрофореза на полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия в восстанавливающих или невосстанавливающих условиях с использованием Кумасси голубого или окрашивания серебром. Выделенный полипептид включает полипептид ίη δίΐιι в рекомбинантных клетках, поскольку по меньшей мере один компонент природного окружения полипептида будет отсутствовать. Обычно, однако, выделенный полипептид будет получен с помощью по меньшей мере одной стадии очистки.

В настоящем описании термин лечение относится к лечебным и профилактическим или превентивным мерам. Те, кто нуждается в лечении, включают тех, у кого уже имеется нарушение, а также тех, у кого нарушение должно быть предупреждено.

В настоящем описании термин нарушение относится к любому состоянию, при котором пациент будет получать пользу от лечения вариантом полипептида, включая хронические и острые нарушения или заболевания (например, патологические состояния, которые предрасполагают пациента к конкретному расстройству). В определенных вариантах осуществления нарушение представляет собой злокачественную опухоль.

В настоящем описании термины злокачественная опухоль и злокачественный относятся или описывают физиологическое состояние у млекопитающих, которое обычно характеризуется нерегулируемым ростом клеток. Примеры злокачественной опухоли включают без ограничения карциному, лимфому, бластому, саркому и лейкоз. Более конкретные примеры таких видов злокачественной опухоли включают чешуйчатоклеточный рак, мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, аденокарциному легкого, чешуйчатую карциному легкого, рак брюшины, печеночноклеточный рак, рак желудочно-кишечного тракта, рак поджелудочной железы, глиобластому, рак шейки матки, рак яичника, рак печени, рак мочевого пузыря, гепатому, рак молочной железы, рак толстого кишечника, рак колоректальный, карциному эндометрия или матки, карциному слюнной железы, рак почки, рак печени, рак предстательной железы, рак вульвы, рак щитовидной железы, карциному печени и различные виды рака головы и шеи.

В настоящем описании фраза НЕК2-экспрессирующая злокачественную опухоль обозначает вид злокачественной опухоли, включающий клетки, которые содержат белок НЕК2 рецептора (например, номер доступа СспсЬапк Х03363) на клеточной поверхности, таким образом, что антитело против НЕК2 способно связываться со злокачественной опухолью.

В настоящем описании термин метка относится к детектируемым соединению или композиции, конъюгированным непосредственно или непрямым способом с полипептидом. Метка может сама по себе обнаруживаться (например, радиоизотопные метки или флуоресцентные метки) или, в случае ферментной метки, может катализировать химическое изменение детектируемых соединения-субстрата или композиции.

В настоящем описании термины контрольный элемент», «контрольная последовательность и регуляторный элемент относятся к генному элементу, который контролирует определенный аспект экспрессии последовательностей нуклеиновой кислоты. Например, промотор представляет собой регуляторный элемент, который способствует инициации транскрипции действующего присоединенного кодирующего участка. Другие регуляторные элементы включают сигналы сплайсинга, сигналы полиаденилирования, сигналы терминации и т.д. Контрольные элементы, которые являются подходящими для прокариот, например, включают промотор, необязательно оператор последовательности, и сайт связывания рибосомы. Известно, что эукариотические клетки используют промоторы, сигналы полиаденилирования и энхансеры.

В настоящем описании нуклеиновая кислота является функционально присоединенной, если ее помещают в функциональную взаимосвязь с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, ДНК для предпоследовательности или секреторной лидерной последовательности функционально связана с ДНК полипептида, если она экспрессируется как пребелок, который участвует в секреции полипептида; промотор или энхансер функционально связаны с кодирующей последовательностью, если они влияют на транскрипцию последовательности; или сайт связывания рибосомы функционально связан с кодирующей последовательностью, если она расположена таким образом, что способствует трансляции. В предпочтительных вариантах осуществления функционально связанный означает, что присоединенные последовательности ДНК являются смежными, и, в случае секреторного лидера, смежными и в рамке считывания.

Однако энхансеры, например, не обязательно должны быть смежными. Присоединение может достигаться, например, путем лигирования в традиционных сайтах рестрикции. Если такие сайты отсутствуют, могут использоваться синтетические адапторы или линкеры олигонуклеотида в соответствии с традиционной практикой.

В настоящем описании выражения клетка, линия клеток и культура клеток используются

- 23 009746 взаимозаменяемо, и все такие обозначения включают потомство. Таким образом, слова трансформанты и трансформированные клетки включают клетку первичного субъекта и полученные из нее культуры безотносительно к количеству переносов. Также понятно, что все потомство может не быть точно идентичным по составу ДНК вследствие произвольных или случайных мутаций. Также предусмотрено мутантное потомство, которое обладает такими же функциями или биологической активностью, которые были показаны скринингом для первоначально трансформированной клетки. Если подразумеваются разные обозначения, это будет понятно из контекста.

В настоящем описании термин исследуемое вещество относится к веществу, которое подлежит анализу. Предпочтительно исследуемое вещество представляет собой участок Ес, содержащий полипептид, который подлежит анализу на предмет способности связываться с рецептором Ес.

В настоящем описании термин рецептор относится к полипептиду, способному связываться по меньшей мере с одним лигандом. Предпочтительный рецептор представляет собой рецептор на поверхности клетки или растворимый рецептор, содержащий внеклеточный лиганд-домен связывания и, необязательно, другие домены (например, трансмембранный домен, внутриклеточный домен и/или мембранный якорь). Рецептор, подлежащий оценке в анализах, раскрытых в настоящем описании, может быть интактным рецептором, его фрагментом или производным (например, слитый белок, который включает домен связывания рецептора, который используется с одним или больше гетерологичными полипептидами). Более того, рецептор, подлежащий оценке на предмет свойств связывания, может существовать в клетке или изолированно и необязательно быть нанесенным на аналитический планшет или какую-либо другую твердую фазу или непосредственно помечен, и который используется как зонд.

В настоящем описании фраза СНО-экспрессированный полипептид относится к полипептиду, который был рекомбинантным способом экспрессирован в клетках яичника китайского хомяка (СНО).

В настоящем описании термин заболевание, которое отвечает на антитело относится к любому заболеванию или медицинскому состоянию, которое лечится, по крайней мере, частично с помощью лечения антителами. Примеры такого заболевания и медицинских состояний включают без ограничения лимфому (лечится с помощью ШТИХЛЧ), инфекционные заболевания (лечатся с помощью 8ΥNЛСI8), почечный трансплантат (ΖΕNЛΡЛX обладает полезным эффектом), болезнь Крона и ревматоидный артрит (лечится с помощью ЯЕМ1САПЕ), карциному молочной железы (лечится с помощью НЕЯСЕРТШ) и рак толстого кишечника (лечится с помощью ЕПЯЕС0Ь0МАВ). В настоящем описании термин заболевание, которое отвечает на иммуноадгезин относится к любому заболеванию или медицинскому состоянию, которое лечится, по меньшей мере, частично терапией иммуноадгезином.

В настоящем описании вариант полипептида, который опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (АОСС) в присутствии эффекторных клеток человека более эффективно, чем исходное антитело, представляет собой полипептид, который ίη νίίτο или ίη νίνο значительно более эффективен в опосредовании АОСС, когда количества варианта полипептида и исходного антитела, которые используются в анализе, по существу являются сходными. Например, такой вариант вызывает лизис большего количества клеток-мишеней в данном анализе АЭСС, чем исходный полипептид в идентичном анализе АОСС. Такие варианты могут быть идентифицированы, например, с применением анализа АОСС, но другие анализы или методы определения активности АОСС также могут использоваться (например, модели на животных). В предпочтительных вариантах осуществления вариант полипептида от приблизительно в 1,2, 1,5, 50, 100 раз, приблизительно в 500 раз или приблизительно в 1000 раз более эффективен в опосредовании АОСС, чем исходный полипептид.

В настоящем описании вариант полипептида, который опосредует зависящее от антител истощение В-клеток из цельной крови более эффективно, чем исходное антитело представляет собой полипептид, который ίη νίίτο или ίη νίνο значительно более эффективен в опосредовании истощения В-клеток, когда количества варианта полипептида и исходного антитела, которые используются в анализе, по существу являются сходными. Например, такой вариант вызывает более высокую степень истощения Вклеток в данном анализе, чем исходный полипептид в идентичном анализе. Кроме того, такой вариант может истощать В-клетки в такой же степени, но при более низких концентрациях, чем те, которых требует исходный полипептид в идентичном анализе. Такие варианты могут быть идентифицированы, например, с применением анализа АОСС, но также могут использоваться другие анализы или методы определения активности АОСС (например, модели на животных). В предпочтительных вариантах осуществления усиление истощения относительно исходного полипептида не зависит от генотипа ЕсЯШа в положении 158 (У или Е) и генотип ЕсЯНа в положении 131 (Н или Я), и полипептидный вариант приблизительно в 1,2 раза, 1,5 раза, 50 раз, 100 раз, приблизительно в 500 раз или приблизительно в 1000 раз более эффективен в опосредовании истощения В-клеток, чем исходный полипептид.

Термин симптомы заболевания, которое отвечает на антитело или иммуноадгезин относится к симптомам, как правило, связанным с конкретным заболеванием. Например, симптомы, которые обычно связаны с болезнью Крона, включают: боль в животе, диарею, ректальное кровотечение, снижение массы тела, лихорадку, снижение аппетита, обезвоживание, анемию, вздутие живота, фиброз, воспаление кишечника и истощение.

Фраза при таких условиях, что симптомы ослабляются относится к любой степени качественного

- 24 009746 или количественного ослабления детектируемых симптомов любого заболевания, которое отвечает на антитело или иммуноадгезин, включая без ограничения детектируемое влияние на скорость выздоровления от заболевания (например, скорость увеличения массы тела) или ослабление по меньшей мере одного из симптомов, которые обычно сопровождают конкретное заболевание (например, если заболевание, которое отвечает на антитело или иммуноадгезин, представляет собой болезнь Крона, ослабление по меньшей мере одного из следующих симптомов: боли в животе, диареи, ректального кровотечения, снижения массы тела, лихорадки, снижения аппетита, обезвоживания, анемии, вздутия живота, фиброза, воспаления кишечника и истощения).

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение обеспечивает варианты участка Ес полипептида и олигонуклеотидов, кодирующие варианты участка Ес. Конкретно, настоящее изобретение относится к композициям, которые включают новые варианты участка Ес, способы идентификации применяемых вариантов участка Ес и способы применения вариантов участка Ес для лечения заболевания. Описание изобретения изложено ниже в следующих разделах: Ι) участки Ес антитела; ΙΙ) варианты участка Ес; ΙΙΙ) комбинированные варианты; IV) анализы варианта полипептида; V) показательные молекулы, содержащие вариант участка Ес; VI) нуклеиновые последовательности, кодирующие варианты участка Ес; VII) терапевтическое применение и препараты; VIII) дополнительное применение вариантов участка Ес.

I. Участки Ес антитела

Как описано выше, антитела содержат участки, в основном участки СН2 и СН3, которые принимают участие в других функциях, помимо связывания антигенов. Взятые вместе, такие участки собирательно известны как участок Ес и выполняют некоторые эффекторные функции, опосредованные связыванием эффекторных молекул.

Эффекторные функции, опосредованные участком Ес антитела, могут быть разделены на две категории: (1) эффекторные функции, которые выполняются после связывания антитела с антигеном (такие функции включают, например, участие каскада комплемента или клеток, несущих рецептор Ес (ЕсЯ)); и (2) эффекторные функции, которые выполняются независимо от связывания антигена (эти функции обеспечивают, например, удержание в циркуляции и способность проникать через клеточные барьеры путем трансцитоза). Например, связывание компонента С1 комплемента с антителами активирует систему комплемента. После опсокизации активация комплемента играет важную роль в лизисе клеточных патогенов. Активация комплемента стимулирует воспалительную реакцию и может также вовлекаться в аутоиммунные реакции гиперчувствительности. Кроме того, антитела связываются с клетками через участок Ес, с сайтом связывания с рецептором Ес на участке антитела Ес, который связывается с рецептором ЕсЯ (ЕсЯ) на клетке. Существует большое количество рецепторов Ес, которые являются специфичными для антител различных классов, включая ЦС (гамма рецепторы), !дЕ (эта рецепторы), !дА (альфа рецепторы) и ЦМ (мю рецепторы). Хотя настоящее изобретение не ограничивается конкретным механизмом, связывание антитела с рецепторами Ес на поверхности клеток запускает множество важных и разнообразных биологических реакций, включая поглощение и разрушение покрытых антителами частиц, выведение иммунных комплексов, лизис клетками-киллерами покрытых антителами клеток-мишеней (так называемую антитело-зависимую клеточную цитотоксичность или АЭСС), высвобождение медиаторов воспаления, перенос через плаценту и контроль выработки иммуноглобулина.

Некоторые эффекторные функции антитела опосредуются рецепторами Ес (ЕсЯ§), которые связываются с участком Ес антитела. ЕсЯ§ определяются их специфичностью по отношению к изотипам иммуноглобулина; Ес рецепторы антител ЦС обозначают как ЕсуЯ, ЦЕ как ЕсеЯ, ЦА как ЕсаЯ и т.д. Были идентифицированы три подкласса ЕсуЯ: ЕсуЯ! (СЭ64). ЕсуЯП (С.П32) и ЕсуЯШ (С.П16).

Поскольку каждый подкласс ЕсуЯ кодируется двумя или тремя генами, и альтернативный сплайсинг РНК приводит к образованию множества транскриптов, существует широкое разнообразие изоформ ЕсуЯ. Три гена, кодирующие подкласс ЕсуЯ! (ЕсуЯ^, ЕсуЯШ и ЕсуЯШ), собраны в кластер в области 1Ц21.1 длинного плеча хромосомы 1; гены, кодирующие ЕсуЯП изоформы (ЕсуЯПА, ЕсуЯПВ и ЕсуЯПС), и два гена, кодирующие ЕсуЯШ (ЕсуЯША и ЕсуЯШВ), собраны в кластер в области 1с.|22. Указанные различные подтипы ЕсЯ экспрессируются на различных типах клеток (см., например, Яауе!сй апб Кте!, Аппи. Яеу. Iттипο1. 9: 457-492 (1991)). Например, у людей, ЕсуЯШВ наблюдаются только на нейтрофилах, тогда как ЕсуЯША наблюдаются на макрофагах, моноцитах, природных клетках-киллерах (КК) и субпопуляции Т-клеток. Следует отметить, что ЕсуЯША присутствует на клетках ПК, одном из видов клеток, вовлеченных в АЭСС.

Рецептор ЕсуЯША (С.П16) человека обладает распространенным полиморфизмом в положении 158 во внеклеточном домене, который кодирует фенилаланин или валин в этом положении. Аллель V ЕсуЯША имеет более высокое сродство к ЦС1 человека, чем аллель Е. Аллель V158 также опосредует АЭСС более эффективно. Данные клинических исследований показали корреляцию между генотипом рецептора ЕсуЯШ у пациентов, получающих лечение Ритуксаном (Яйихап), и терапевтическим ответом. Продемонстрировано, что клинический и молекулярный ответ, а также период до прогрессирования были лучше у пациентов, гомозиготных по генотипу ЕсуЯША-158V (приблизительно 20% населения). И

- 25 009746 наоборот, пациенты, гетерозиготные или гомозиготные по гену ЕсуКША-158Е, определяющим более низкое сродство (приблизительно 80% населения), отвечают хуже. Эти данные указывают на то, что мутации Ес, которые усиливают активность ЛЭСС носителей 158Е, могут усиливать клиническую эффективность лечения злокачественной опухоли с помощью антител. Генный полиморфизм также присутствует в рецепторе ЕсуКПА (СЭ32) человека в положении 131 во внеклеточном домене, который кодирует гистидин (Н) или аргинин (К) в этом положении. Обнаружено, что полиморфизм в положении 131 влияет на способность связываться с 1дС человека. Недавно полученные данные также показывают корреляцию между полиморфизмом ЕсуКПА в положении 131 и клиническим ответом на Ритуксан (Кйихап). Пациенты, гомозиготные по аллели Н131, давали значительно более высокую частоту ответа, чем 2 другие группы.

ЕсуК1, ЕсуКИ и ЕсуКШ представляют собой рецепторы надсемейства иммуноглобулинов (1д8Е); ЕсуК1 содержит три домена 1д8Е во внеклеточном домене, тогда как ЕсуКИ и ЕсуКШ содержат только два 1д8Е домена среди внеклеточных доменов.

Другой тип рецептора Ес представляет собой рецептор Ес новорожденных (ЕсКп). ЕсКп является структурно сходным с главным комплексом гистосовместимости (МНС) и состоит из α-цепи, нековалентно связанной с в2-микроглобулином.

II. Варианты участка Ес

Настоящее изобретение обеспечивает варианты полипептида, последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие варианты полипептида, и способы создания вариантов полипептида. Предпочтительно, варианты полипептида по данному изобретению отличаются от исходного полипептида по меньшей мере одной модификацией аминокислоты. Исходный, дикого типа, начальный или невариантный полипептид предпочтительно включает по меньшей мере часть участка Ес антитела и может быть получен с применением методик, доступных из уровня техники для создания полипептидов, включающих участок Ес или его часть. В предпочтительных вариантах осуществления исходный полипептид представляет собой антитело. Исходный полипептид может, однако, быть любым другим полипептидом, который включает по меньшей мере часть участка Ес (например, иммуноадгезин). В определенных вариантах осуществления вариант участка Ес может быть создан (например, в соответствии со способами, раскрытыми в настоящем описании) и может использоваться для выбранного гетерологичного полипептида, такого как вариабельный домен антитела или домен связывания рецептора или лиганда.

В предпочтительных вариантах осуществления исходный полипептид включает участок Ес или его функциональную часть. Как правило, участок Ес исходного полипептида будет включать участок Ес с нативной последовательностью и предпочтительно нативную последовательность участка Ес человека. Однако участок Ес исходного полипептида может содержать одно или несколько предварительно существовавших изменений или модификаций аминокислотной последовательности в сравнении с нативной последовательностью участка Ес. Например, С1с.|-связывающая активность участка Ес может быть предварительно изменена или ЕсуК связывающая активность участка Ес может быть изменена. В дополнительных вариантах осуществления исходный участок Ес полипептида является схематичным (например, умственное размышление или визуальное представление на компьютере или на бумаге) и, хотя он физически не существует, конструктор антител может выбрать желаемый вариант аминокислотной последовательности участка Ес и создать полипептид, включающий такую последовательность или ДНК, кодирующую желаемый вариант аминокислотной последовательности участка Ес. Однако в предпочтительных вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая участок Ес исходного полипептида, доступна, и данную последовательность нуклеиновой кислоты изменяют для создания варианта последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей вариант участка Ес.

Нуклеиновая кислота, кодирующая вариант исходного полипептида, может быть приготовлена способами, известными из уровня техники, с использованием указаний данного описания для конкретных последовательностей. Такие способы включают без ограничения получение путем сайт-специфического (или олигонуклеотид-опосредованного) мутагенеза, ПЦР-мутагекеза и кассетного мутагенеза ранее полученной нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид. Сайт-специфический мутагенез представляет собой предпочтительный способ получения вариантов. Данная техника хорошо известна из уровня техники (см., например, Сайег е! а1. №с1ею Аабк Кек. 13: 4431-4443 (1985) и Кипке1 е1. а1., Ргос. №11. Асаб. 8сЕ И8А 82: 488 (1987), каждая из которых включена посредством ссылки). Вкратце, при осуществлении сайт-специфического мутагенеза ДНК, исходную ДНК изменяют, во-первых, одновременно гибридизацией одного или больше олигонуклеотида(ов), кодирующего желаемую мутацию(и) для одной цепи такой исходной ДНК. После гибридизации ДНК-полимераза используется для синтеза полной второй цепи, с использованием гибридизованного олигонуклеотида(ов) в качестве праймера, с использованием одиночной цепи исходной ДНК в качестве шаблона, и ДНК-лигаза используется для лигирования второй цепи с образованием кольцевой, двухцепочечной ДНК. Таким образом, олигонуклеотид, кодирующий желаемую мутацию, встраивается в полученную двухцепочечную ДНК.

ПЦР-мутагенез также подходит для получения вариантов аминокислотной последовательности исходного полипептида (см., например, УаИейе е! а1., №с. Ас1бк Кек. 17: 723-733 (1989), таким образом,

- 26 009746 включена как ссылка). Вкратце, если в качестве исходного материала для ПЦР используют малые количества матричной ДНК, праймеры, которые слегка отличаются по последовательности от соответствующего участка в матричной ДНК, могут быть использованы для получения относительно больших количеств специфичного фрагмента ДНК, который отличается от последовательности матрицы только в положениях, в которых праймеры отличаются от матрицы.

Другой способ получения вариантов, кассетный мутагенез, основан на методике, описанной \Уе11к с1 а1., Сепе 34: 315-323 (1985), которая включена сюда посредством ссылки. Исходное вещество представляет собой плазмиду (или другой вектор), который включает ДНК исходного полипептида, подлежащую мутации. Идентифицируют кодон(ы) в исходной ДНК, подлежащие мутации. С каждой стороны идентифицированного сайта(ов) мутации должен находиться уникальный сайт рестрикции. Если такие сайты рестрикции отсутствуют, они могут быть созданы с использованием описанного выше метода олигонуклеотид-опосредованного мутагенеза для введения их в надлежащие места в ДНК исходного полипептида. ДНК-плазмиды разрезают в этих местах для линеаризации. Двухцепочечный олигонуклеотид, кодирующий ДНК между сайтами рестрикции и содержащий желаемую мутацию(и), синтезируют с использованием стандартных методик, где две цепи олигонуклеотида синтезированы отдельно и затем гибридизованы вместе с использованием стандартных техник. Этот двухцепочечный нуклеотид обозначается как кассета. Данная кассета сконструирована таким образом, что содержит 5'- и 3'-концы, совместимые с концами линеаризованной плазмиды, таким образом, что она может быть непосредственно лигирована в плазмиду. Данная плазмида теперь содержит мутантную последовательность ДНК.

Альтернативно или дополнительно, желаемая аминокислотная последовательность, кодирующая вариант полипептида, может быть определена, и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая такой вариант аминокислотной последовательности, может быть создана синтетическим путем.

Аминокислотная последовательность исходного полипептида может быть модифицирована для того, чтобы создать вариант участка Ес с измененной активностью связывания Ес рецептора или активностью ίη νΐΐΓΟ и/или ίη νίνο, и/или измененной активностью, зависящей от антител клеточноопосредованной цитотоксичности (ЛОСС) ίη νίΐτο и/или ίη νίνο. Аминокислотная последовательность исходного полипептида также может быть модифицирована для того, чтобы создать вариант участка Ес с измененными свойствами связывания комплемента и/или периодом полувыведения из циркуляции.

Значительные модификации биологических свойств участка Ес могут достигаться путем выбора вариантов замены, которые значительно отличаются по действию на изменение (а) структуры скелета полипептида в области замены, например, в виде складчатой или спиральной конформации, (Ь) заряда или гидрофобности молекулы в сайте-мишени или объема боковой цепи, (б) взаимодействия с углеводом или (е) гибкости движений домена. Остатки природного происхождения делят на классы на базе общих свойств боковой цепи:

(1) гидрофобные: норлейцин, шс1. а1а, να1, 1еи, 11е;

(2) нейтральные гидрофильные: сук, кег, 1Нг;

(3) кислые: акр, д1и;

(4) основные: акп, д1п, 1нк, 1ук, агд;

(5) остатки, которые влияют на ориентацию цепи: д1у, рго; и (6) ароматические: 1гр, 1уг, рйе.

Неконсервативные варианты замены влекут за собой замену члена одного из этих классов на член другого класса. Консервативные варианты замены влекут за собой замену члена одного из этих классов на другого члена того же класса.

Как показано в примерах ниже, можно создать вариант участка Ес с измененной активностью (эффекторная функция (Ь) и фармакокинетика). Можно, например, модифицировать один или больше аминокислотных остатков участка Ес с целью изменения (например, увеличение или уменьшение) активности ЛЭСС. В предпочтительных вариантах осуществления модификация включает один или больше остатков участка Ес, идентифицированных в настоящем описании (см., например, пример 2, и νΘ0042072, включена как ссылка для всех целей). В общем, будет осуществлено замещение аминокислоты в одном или более остатках участков Ес, идентифицированных в настоящем описании как влияющие на активность ЛЭСС для того, чтобы создать такой вариант участка Ес. В предпочтительных вариантах осуществления не более чем от 1 до приблизительно 10 остатков на участке Ес будут удалены или заменены. В настоящем описании участок Еск, который включает одну или больше модификаций аминокислот (например, замен), предпочтительно будет сохранять по меньшей мере приблизительно 80%, и предпочтительно по меньшей мере приблизительно 90%, и наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно 95%, исходной последовательности участка Ес или нативной последовательности участка Ес человека.

Можно также приготовить варианты участка Ес с вставкой аминокислот, которые будут вариантами с измененной эффекторной функцией. Например, можно ввести по меньшей мере один аминокислотный остаток (например, один или два аминокислотных остатка и, в общем, не более 10 остатков) смежно с одним или больше положениями участка Ес, идентифицированными в настоящем описании как влияющие на связывание с ЕсЕ. Смежно означает в пределах одного или двух аминокислотных остатков уча

- 27 009746 стка Ес, идентифицированного в настоящем описании. Такие варианты участка Ес могут демонстрировать усиленное или ослабленное связывание с ЕсЕ и/или активности АЭСС по отношению к исходной молекуле. С целью создания таких вариантов вставки можно оценить сокристаллическую структуру полипептида, который включает участок связывания с ЕсЕ (например, внеклеточный домен интересующего ЕсЕ) и участок Ес, в который должен быть вставлен аминокислотный остаток(ки) (см., например, 8оийегтапп е! а1. №11иге 406:267 (2000); □еЕепНоГег В1осйет181ту 20 (9): 2361-2370 (1981); и Впгте151ег е! а1., ИаШге 342: 379-383, (1994), все из которых включены как ссылки) с целью рационализации проектирования варианта участка Ес, например, с улучшенной способностью связывания ЕсЕ. В предпочтительных вариантах осуществления такая вставка(и) осуществлена на участке Ес петли, но не во вторичной структуре (т.е. в β-цепи) участка Ес.

Путем введения подходящей модификации(й) последовательности в исходном участке Ес можно создать вариант участка Ес, который (а) опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (АОСС) в присутствии эффекторных клеток человека более или менее эффективно, и/или (Ь) опосредует зависящую от комплемента цитотоксичность (СПС) в присутствии комплемента человека более или менее эффективно, и/или (с) связывает Ес гамма рецептор (ЕсуЕ) или рецептор Ес новорожденных (ЕсЕп) с желаемым сродством при других значениях рН, чем исходный полипептид. Такие варианты участка Ес будут, в общем, включать по меньшей мере одну модификацию аминокислоты на участке Ес.

В предпочтительных вариантах осуществления исходный участок Ес полипептида представляет собой участок Ес человека, например природный участок Ес 1дС1 человека (£ и а, ζ аллотипы), 1дС2, 1дС3, 1дС4 и все аллотипы, известные или обнаруженные в любых видах. Такие участки имеют последовательности 8ЕО ГО N0:1-8, 8ЕО ГО N0:9-12 и 8ЕЕ) ГО N0:32-37.

В определенных вариантах осуществления с целью создания участка Ес с улучшенной АЭСС активностью исходный полипептид предпочтительно имеет предварительно существовавшую АЭСС активность (например, исходный полипептид включает человеческий 1дС1 или участок Ес человеческого 1дС3). В некоторых вариантах осуществления вариант с улучшенным АЭСС опосредует АЭСС значительно более эффективно, чем антитело с нативной последовательностью 1дС1 или участок Ес 1дС3 (например, Р247Ь и 1332Е варианты).

В предпочтительных вариантах осуществления модификацию(и) аминокислоты вводят в домены СН2 и/или СН3 участка Ес. Примененные положения аминокислот для модификации с целью создания варианта участка Ес 1дС с измененной АЭСС активностью включают любое одно или несколько положений аминокислот: 247, 251, 256, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 300 301, 303, 305, 307, 309, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 337, 338, 339, 340, 360, 373, 376, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438, 439 или 440 участка Ес. В предпочтительных вариантах осуществления исходный участок Ес, используемый как матрица для создания таких вариантов, включает участок Ес 1дС человека.

В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, которые включают вариант исходного полипептида, содержащего участок Ес, где вариант опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (АЭСС) в присутствии эффекторных клеток и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 247 на участке Ес. В определенных вариантах осуществления модификация аминокислоты представляет собой Р247Ь. В других вариантах осуществления модификация аминокислоты представляет собой Р2471 или Р247Н.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, которые включают вариант исходного полипептида, содержащего участок Ес, где вариант опосредует антителозависимую клеточную цитотоксичность (АОСС) в присутствии эффекторных клеток и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 251 на участке Ес. В определенных вариантах осуществления модификация аминокислоты представляет собой Ь251Е.

В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, которые включают вариант исходного полипептида, содержащего участок Ес, где вариант опосредует антителозависимую клеточную цитотоксичность (АОСС) в присутствии эффекторных клеток и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 256 на участке Ес. В определенных вариантах осуществления модификация аминокислоты представляет собой Т256М или Т256Р.

В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, которые включают вариант исходного полипептида, содержащего участок Ес, где вариант опосредует антителозависимую клеточную цитотоксичность (АОСС) в присутствии эффекторных клеток и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 268 на участке Ес. В определенных вариантах осуществления модификация аминокислоты представляет собой Η268Ό или Н268Е.

В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, которые включают вариант исходного полипептида, содержащего участок Ес, где вариант опосредует антителозависимую клеточную цитотоксичность (АОСС) в присутствии эффекторных клеток и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 280 на участке Ес. В определенных вариантах осуществления модификация аминокислоты представляет собой О280А или Ό280Κ.

- 28 009746

В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, которые включают вариант исходного полипептида, содержащего участок Рс, где вариант опосредует антителозависимую клеточную цитотоксичность (ЛЭСС) в присутствии эффекторных клеток и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 330 на участке Рс. В определенных вариантах осуществления модификация аминокислоты представляет собой А330К или А330К.

В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, которые включают вариант исходного полипептида, содержащего участок Рс, где вариант опосредует антителозависимую клеточную цитотоксичность (ЛЭСС) в присутствии эффекторных клеток и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 332 на участке Рс. В определенных вариантах осуществления модификация аминокислоты представляет собой Ι332Ό, 1332Е, Ι332Κ или Ι332Κ.

В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, которые включают вариант исходного полипептида, содержащего участок Рс, где вариант опосредует антителозависимую клеточную цитотоксичность (ЛЭСС) в присутствии эффекторных клеток и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 339 на участке Рс. В определенных вариантах осуществления модификация аминокислоты представляет собой А339Т.

В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, которые включают вариант исходного полипептида, содержащего участок Рс, где вариант опосредует антителозависимую клеточную цитотоксичность (ЛЭСС) в присутствии эффекторных клеток и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 378 на участке Рс. В определенных вариантах осуществления модификация аминокислоты представляет собой Α378Ό.

В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, которые включают вариант исходного полипептида, содержащего участок Рс, где вариант опосредует антителозависимую клеточную цитотоксичность (ЛЭСС) в присутствии эффекторных клеток и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 440 на участке Рс. В определенных вариантах осуществления модификация аминокислоты представляет собой 8440Υ.

Описанные выше варианты полипептида могут подвергаться дальнейшим модификациям, в зависимости от желаемого или предусмотренного применения полипептида. Такие модификации могут включать, например, дальнейшее изменение аминокислотной последовательности (замена, вставка и/или делеция аминокислотных остатков), модификации углеводов, слияние с гетерологичным полипептидом(ами) и/или ковалентные модификации. Такие дополнительные модификации могут быть осуществлены до, одновременно или после модификации аминокислоты(ы), раскрытой выше, которая ведет к изменению связывания с рецептором Рс и/или активности ЛЭСС.

Альтернативно или дополнительно может быть полезно сочетать модификации аминокислот с одной или больше дополнительными модификациями аминокислот, которые изменяют связывание С1 с| и/или функцию зависящей от комплемента цитотоксичности участка Рс. Особенно интересный исходный полипептид в настоящем описании представляет собой такой, который связывается с С1с.| и который демонстрирует комплемент-зависящую цитотоксичность (ΟΌΟ). Варианты замены аминокислот, раскрытые в настоящем описании, могут служить для изменения способности исходного полипептида связываться с С1 с.| и/или модификации его функции комплемент-зависящей цитотоксичности (например, уменьшать и предпочтительно устранять такие эффекторные функции). Однако полипептиды, которые включают варианты замены в одном или более описанных положений с улучшенным связыванием С1 с.| и/или функцию комплемент-зависящей цитотоксичности (ΟΌΟ), рассматриваются в настоящем описании. Например, исходный полипептид может быть не способен связываться с С1 с.| и/или опосредовать СЭС и может быть модифицирован в соответствии с указаниями в настоящем описании таким образом, что он приобретает эти дополнительные эффекторные функции. Более того, полипептид с предварительно существующей активностью связывания ΟΊς, необязательно дополнительно обладающий способностью опосредовывать СЭС, может быть модифицирован таким образом, что один или оба из этих видов активности усиливаются. Аминокислотные последовательности, которые изменяют С1с.| и/или модифицируют его функцию комплемент-зависимой цитотоксичности, описаны, например, в ^00042072, которая, таким образом, включена как ссылка.

Как было описано выше, можно сконструировать участок Рс или его часть с измененной эффекторной функцией, например, путем модификации активности СЭС и/или активности ЛЭСС. Например, можно создать вариант участка Рс с улучшенной СЭС активностью и улучшенной ЛЭСС активностью (например, с улучшенной активностью ЛЭСС и улучшенной активностью СЭС). Альтернативно, если будет желательным снижение или устранение эффекторной функции, можно сконструировать вариант участка Рс со сниженной СЭС активностью и/или сниженной ЛЭСС активностью. В других вариантах осуществления можно повысить только один из этих видов активности и необязательно также снизить другой вид активности, например, для создания участка Рс с улучшенной ЛЭСС активностью, но сниженной активностью СЭС и наоборот. Кроме того, можно создать вариант участка Рс, обладающего модифицированным сродством связывания с РсКп, белком А и/или другими белками, которые связываются с Рс.

Другой вид замены аминокислот служит для изменения структуры гликозилирования полипептида.

- 29 009746

Это может быть достигнуто, например, путем удаления одного или больше углеводных остатков, связанных с полипептидом, и/или добавлением одного или больше сайтов гликозилирования, которые отсутствуют в полипептиде. Альтернативно, этого можно достигнуть непрямым способом, путем изменения аминокислот, не являющихся сайтом гликозилирования или проектированием клеток. Гликозилирование полипептидов обычно является Ν-связанным или О-связанным. Ν-Связанный относится к присоединению углеводного фрагмента к боковой цепи аспарагинового остатка. Пептидные последовательности аспарагин-Х-серин и аспарагин-Х-треонин, где X представляет собой любую аминокислоту, за исключением пролина, представляют собой последовательности распознавания для ферментативного присоединения углеводного фрагмента к боковой цепи аспарагина. Таким образом, присутствие любой из этих пептидных последовательностей в полипептиде создает потенциальный сайт гликозилирования. ОСвязанное гликозилирование относится к присоединению одного из сахаров Ν-ацетилгалоктазамина, галактозы или ксилозы к гидроксиаминокислоте, чаще всего серину или треонину, хотя также могут быть использованы 5-гидроксипролин или 5-гидроксилизин.

Добавление сайтов гликозилирования к полипептиду традиционно сопровождается изменением аминокислотной последовательности таким образом, что она содержит один или несколько из описанных выше трипептидных последовательностей (для Ν-связанных сайтов гликозилирования). Изменения также могут быть осуществлены путем добавления (или замещения) одного или больше остатков серина или треонина к последовательности оригинального полипептида (для О-связанных сайтов гликозилирования). Показательный вариант гликозилирования содержит замену аминокислоты остатка Азп 297 тяжелой цепи.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, которые включают вариант исходного полипептида, содержащего участок Гс, где вариант включает по меньшей мере одну модификацию остатка поверхностной аминокислоты (см., например, Ое1зеп1юГег. В1осйет1з1гу, 28;20(9):2361-70, Арп1 1981, и ^00042072, каждая из которых включена сюда посредством ссылки). В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, которые включают вариант исходного полипептида, содержащего участок Рс, где вариант включает по меньшей мере одну модификацию остатка не поверхностной аминокислоты. В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение включает вариант исходного полипептида, содержащего участок Рс, где вариант включает по меньшей мере одну модификацию поверхностной аминокислоты и по меньшей мере одну модификацию не поверхностной аминокислоты.

III. Комбинированные варианты

В некоторых вариантах осуществления варианты по настоящему изобретению включают две или больше модификаций аминокислот (например, замен). Такие комбинированные варианты могут быть получены, например, путем выбора двух или больше модификаций аминокислот, описанных выше. В таблице 1 ниже приведены примерные комбинации замен двух или больше аминокислот. Например, первый ряд таблице 1 показывает возможные комбинации Р247Н с заменой другой аминокислоты в положениях 251, 256, 268, 280, 330, 332, 339, 378 и 440 (таким образом, данный ряд показывает комбинации двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти и десяти модификаций аминокислот).

- 30 009746

Таблица 1. Примерные комбинированные варианты

Мутация	Положение
247	251	256	268	280	330	332	339	378	440
Р247Н		к	М, Р	β, Е	А, К	к, к	β, Е	Т	β	¥
Ρ247Ι		Р	М, Р	β, е	А, К	к, к	β, Е	Т	β	Υ
Р247Б		г	М, Р	β, Е	А, К	к, к	β, Е	т	β	Υ
Ъ251Г	Н, I, ь		М, Р	О, Е	А, К	к, к	β, Е	т	β	ϊ
Т256М	Н, I, ь	Е		0, Е	А, К	к, я	β, Е	т	β	Υ
Т256Р	Н, I, ь	г		β, Е	А, К	к, к	β, Е	т	β	¥
Η268β	Н, I, ь	г	М, Р		А, К	к, в	β, Е	т	β	Υ
Н268Е	н, I, ь	Е	М, Р		А, К	к, в	0, Е	т	β	Υ
Б28 0А	н, I, ь	Е	М, Р	β, Е		к, к	β, Е	т	β	Υ
В280К	н, I, ь	Е	М, Р	β, Е		к, в	β, Е	т	β	Υ
АЗЗОК	Н, I, ь	Е	М, Р	β, Е	А, К		β, Е	т	β	Υ
АЗЗОВ	н, I, ь	Г	М, Р	β, Е	А, К		β, Е	т	Β	Υ
Ι332Ε	н, I, 1	Г	М, Р	βΓ Е	А, К	к, к		т	β	Υ
Ι332β	Н, I, ь	Е	М, Р	β, Е	А, К	к, к		т	β	Υ
А339Т	Н, I, п	Е	М, Р	β, Е	А, К	к, к	β, Е		β	Υ
Α378β	н, I, п	Е	М, Р	β, Е	А, К	к, в	β, Е	т		Υ
5440Υ	н, I, ь	Г	М, Р	β, Е	А, К	к, в	β, Е	т	β

** Примечание: в данной таблице используется нумерация ЕС, как в соотетствии с КаЬа1.

Комбинации вариантов, приведенные в таблице 1, и другие комбинации вариантов (такие как раскрытые в \νϋ()04 2072) могут быть исследованы на предмет данной активности (например, ЕсЯсвязывающая активность, активность АЭСС и активность СЭС) в разнообразных анализах (см., Раздел IV ниже). В этой связи могут быть идентифицированы полезные комбинированные варианты.

В определенных предпочтительных вариантах осуществления комбинированные варианты по данному изобретению содержат одну модификацию аминокислоты, которая повышает АПСС активность, и одну модификацию аминокислоты, которая повышает активность связывания с рецептором Ес новорожденных (ЕсЯп) (например, при рН 6,0, но не при рН 7,0 или 7,4). В других вариантах осуществления комбинированные варианты по данному изобретению содержат одну модификацию поверхностной аминокислоты и одну модификацию не поверхностной аминокислоты. Дополнительные комбинированные варианты могут быть созданы путем комбинирования двух или больше модификаций аминокислот, раскрытых в настоящем описании или по меньшей мере одной модификации аминокислот, раскрытой в настоящем описании с описанными в νθ0042072.

IV. Анализы варианта полипептида

Настоящее изобретение обеспечивает различные анализы для скрининга вариантов участка Ес. Скрининговые анализы могут использоваться для поиска или подтверждения полезных вариантов. Например, комбинированные варианты (см. табл. 1) могут подвергаться скринингу для поиска вариантов с измененным связыванием ЕсЯ, и/или измененной АПСС, и/или измененной СЭС активностью (напри

- 31 009746 мер, повышенная или сниженная активность АЭСС или активность СЭС), и/или модифицированной способностью истощать клетки-мишени (например, В-клетки) из цельной крови. Кроме того, как описано ниже, пробы по данному изобретению могут применяться для поиска или подтверждения вариантов, которые обладают полезной терапевтической активностью для субъекта (например, такого как человек с симптомами заболевания, которое отвечает на антитело или иммуноадгезин). Разнообразные виды анализов могут применяться для оценки любого изменения в варианте в сравнении с исходным полипептидом (см. скрининговые анализы, приведенные в УО0042072, включена как ссылка). Кроме того, примерные анализы описаны ниже.

В предпочтительных вариантах осуществления варианты по данному изобретению представляют собой антитела, которые по существу сохраняют способность связывать антиген (через немодифицированный антиген-связывающий участок или модифицированный антигенсвязывающий участок) в сравнении с невариантным (исходным) полипептидом (например, емкость связывания предпочтительно не менее чем приблизительно в 20 раз превышает или не менее чем приблизительно в 5 раз превышает таковую исходного полипептида). Емкость связывания варианта полипептида с антигеном может быть определена с использованием таких техник, как, например, ЕЬ18А, сортировочный анализ, флуоресценция активированных клеток (ЕАС8) или радиоиммуноосаждение (ША).

Анализы связывания рецептора Ес (ЕсЕ) могут применяться для оценки вариантов по данному изобретению. Например, связывание с Ес рецептором, таким как ЕсуШ, ЕсуЕПа, ЕсуЕПЬ, ЕсуЕШ, ЕсЕп и т.д., можно измерить титрованием варианта полипептида и измерением связанного варианта полипептида с использованием антитела, которое специфически связывается с вариантом полипептида в формате ЕЫ8А (см. примеры ниже). Например, может быть проведен скрининг варианта, который включает антитело, в стандартном анализе ЕЫ8А для определения связывания с ЕсЕп при рН 6,0 и рН 7,0 или 7,4. Твердая поверхность, покрытая Стрептавидином или Нейтравидином, может использоваться для захвата меченного биотином ЕсЕп любых видов, таких как мышь или человек. После блокирования захвата рецептор может инкубироваться с вариантами полипептида (антителами) разведенными в буферных растворах при рН 6,0 или рН 7,0. На следующей стадии добавляют молекулы, специфичные для человеческих антител (например, козьи (ЕаЬ')2 против человеческих-ЕаЬ, конъюгированные с ферментом). После этого можно добавлять субстрат для определения количества связывания варианта полипептида с иммобилизованным ЕсЕп при рН 6,0, или рН 7,0, или рН 7,4. Результаты данного анализа можно сравнивать со способностью исходного полипептида (невариантного) связывать такой же ЕсЕ. В других предпочтительных вариантах осуществления компоненты для проведения ЕЫ8А (например, с ЕсЕп) для скрининга вариантов упакованы в набор (например, с инструкцией по применению).

Анализ зависимой от антител клеточной цитотоксичности (АЭСС) также может использоваться для скрининга вариантов по данному изобретению. Анализы АЭСС могут проводиться ш уПго или ш у1уо. Для оценки активности АЭСС варианта полипептида анализ АЭСС ш уПго может проводиться с использованием различных соотношений эффектор/мишень. Примерный анализ АЭСС может использовать линию клеток-мишеней, экспрессирующих один из следующих антигенов-мишеней: СЭ20, СЭ22, СЭ33, СЭ40, СЭ63, рецептор ЕСЕ, рецептор Еег-2, специфичный для предстательной железы мембранный антиген, углевод Льюиса Υ, ганглиозиды СЭ2 и СЭ3, 1атр-1, СО-029, Ь6 и ер11А2. Эффекторные клетки могут быть получены от здорового донора (например, в день эксперимента) и РВМС очищены с использованием Н|51орас.|ие (81дта). Далее клетки-мишени предварительно инкубируют с вариантом 1дС, например, с концентрацией 0,1-1000 нг/мл в течение приблизительно 30 мин перед смешиванием с эффекторными клетками при соотношениях эффектор/мишень, например, 40:1, 20:1 и 10:1. Затем активность АЭСС может быть измерена колориметрически с использованием Су1о(ох1с11у Эе1ес11оп Κίΐ (ЕосЕе Мо1еси1аг ВюсЕетюак) для количественного определения гибели и лизиса клеток на базе измерения активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ), высвобожденной из цитозоля поврежденных клеток в супернатант. Активность АЭСС также может быть измерена в анализах нагруженных хромом 51 клеток-мишеней путем измерения результирующего высвобождения хрома 51. Независимая от антител клеточная цитотоксичность может быть определена измерением активности ЛДГ из клеток-мишеней и эффекторных клеток в отсутствие антитела. Общее высвобождение может быть измерено после добавления 1% Тритона Х-100 к смеси клеток-мишеней и эффекторных клеток. Инкубация клеток-мишеней и эффекторных клеток может проводиться в течение оптимизированного периода времени (0,54-18 ч) при 37°С в 5,0% СО₂, с последующим центрифугированием аналитических планшетов. Далее супернатант может быть перенесен в 96-луночные планшеты и инкубироваться с реактивом для обнаружения ЛДГ в течение 30 мин при 25°С. Затем измеряют поглощение образца при 490 нм с применением микропланшетного ридера. Затем рассчитывают процент цитотоксичности с использованием следующего уравнения: % цитотоксичности = экспериментальное значение - низкий контроль/высокий контроль - низкий контроль х 100. Процент цитотоксичности против СЭ20 и вариантом затем можно сравнить непосредственно с равным количеством Ритуксана для получения относительной эффективности. Примерный анализ АЭСС может использовать клетки 8КУ6.4, избыточно экспрессирующие антиген ί.Ό20 (например, приобретенные у Атепсап Туре Си11иге Со11есЕоп) в качестве источника клеток-мишеней. Многие вариации данного анализа известны из уровня техники (см., например, 2искегтап е! а1., СЕС Сп1 Ееу МюгоЬю1 1978; 7(1):1-26, включена как

- 32 009746 ссылка).

Применимые эффекторные клетки для таких анализов включают без ограничения природные клетки-киллеры (ИК), макрофаги и другие мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС). Альтернативно или дополнительно активность АЭСС вариантов полипептида по данному изобретению может быть оценена ш νίνΌ, например на животной модели, такой как раскрыта в С1упез е1 а1. РИА8 (И8А) 95:652-656 (1998), которая включена сюда посредством ссылки.

Также может быть осуществлен скрининг вариантов настоящего изобретения на предмет активации комплемента. Для оценки активации комплемента может быть выполнен анализ зависимой от комплемента цитотоксичности (см., например, Саххапо-8ап1ого е1 а1., 1. ^типок МеШойз, 202:163 (1996), включена как ссылка). Например, различные концентрации варианта полипептида и человеческого комплемента могут быть разбавлены буферным раствором. Клетки, экспрессирующие антиген, с которым связывается вариант полипептида, могут быть разбавлены до плотности приблизительно 1х10⁶ клеток/мл. Смеси варианта полипептида, разбавленного человеческого комплемента и клеток, экспрессирующих антиген, могут быть добавлены в плоскодонный 96-луночный планшет для культуры клеток и инкубироваться в течение 2 ч при 37°С и 5% С0₂ для облегчения опосредованного комплементом лизиса клеток. Затем добавляют 50 мкл аламара голубого (Асситеб И'ИегпаЬопа!) в каждую лунку и инкубируют в течение ночи при 37°С. Поглощение можно измерить с помощью флуориметра для 96-луночных планшетов с возбуждением при длине волны 530 нм и излучением при длине волны 590 нм. Результаты могут быть выражены в относительных единицах флуоресценции (КЕИ). Концентрация образца может быть рассчитана на основе стандартной кривой и для интересующего варианта может быть рассчитан процент активности в сравнении с невариантным пептидом.

В определенных вариантах осуществления варианты по данному изобретению не активируют комплемент. Например, вариант полипептида, который демонстрирует приблизительно 0-10% активность СИС в данном анализе в сравнении с контрольным антителом, содержит немутантный участок Ес ЦСЕ

Предпочтительно, вариант не проявляет никакой активности СЭС (например, выше фоновой) в описанном выше анализе СЭС. В других вариантах осуществления варианты по данному изобретению обладают усиленной активностью СЭС в сравнении с исходным полипептидом (например, показывают от приблизительно в 2 раза до приблизительно в 100 раз (или больше) улучшение активности СЭС ш νίΙΐΌ или 1п νί\Ό при сравнении значений Ιϋ₅₀).

Также может быть проведен скрининг вариантов по данному изобретению на предмет истощения клеток-мишеней в образце цельной крови. Например, может быть проведен скрининг различных концентраций варианта полипептида со специфичностью к мишени СЭ20 на предмет истощения В-клеток в образце цельной крови с применением анализа Еасз ^идтеу81ег е1 а1., 2003 Су1оте1гу 52А, 101-109). Свежеотобранную кровь инкубируют с различными концентрациями варианта полипептида при 37°С и 5% С02 в течение 4 ч (время может варьировать). После инкубации красные кровяные клетки лизируют согласно инструкции производителя с помощью реактива хлорида аммония (ВескЮп-Июктзоп кат. №555899) и В-клетки определяют с помощью Еасз с использованием флуоресцентно меченого антитела, специфичного для В-клеток (например, анти-С19). Результаты могут быть выражены как % истощения В-клеток относительно или необработанного образца, или образца, инкубированного с не относящимся к делу (неистощающим) антителом.

В предпочтительных вариантах осуществления вариант истощает В-клетки более эффективно, чем исходный полипептид. Вариант может истощать В-клетки, например, в 2 или больше раз сильнее, предпочтительно в 5 или больше раз сильнее. Также вариант может демонстрировать большую мощность в истощении В-клеток. Например, вариант может истощать такой же процент В-клеток, как и исходный полипептид, но при этом используется приблизительно в 5 раз меньше, и предпочтительно приблизительно в 10 раз меньше антител. Истощение клеток-мишеней, опосредованное вариантами, может быть от приблизительно в 5 раз до приблизительно в 100 раз, предпочтительно от приблизительно в 5 раз до приблизительно в 1000 раз улучшено в сравнении с исходным полипептидом.

Также может быть проведен скрининг вариантов по настоящему изобретению ш νί\Ό. Может применяться любой вид анализа ш νί\Ό. Конкретный пример одного вида анализа приведен ниже. Этот показательный анализ позволяет осуществить доклиническую оценку вариантов Ес ш νί\Ό. Вариант, подлежащий изучению, может быть встроен в участок Ес конкретного антитела, относительно которого известно, что оно обладает определенной активностью. Например, вариант может быть встроен в участок Ес против СИ20 ЦС путем мутагенеза. Это позволяет сравнить исходный ЦС и вариант Ес ЦС непосредственно с Ритуксаном (вещество, которое вызывает регресс опухоли). Доклиническая оценка может быть проведена в 2 фазы (фармакокинетическая и фармакодинамическая фаза). Цель фармакокинетических исследований в фазе Ι состоит в определении наличия расхождений в скорости клиренса между вариантом Ес ЦС и антителом с доказанной активностью ш νί\Ό (например, Ритуксан). Различия в скорости клиренса могут быть причиной различий в уровне ЦС в сыворотке в фазе плато. Соответственно, если обнаружены различия в концентрациях фазы плато, данные должны быть нормализованы для выполнения точных сравнений. Целью фармакодинамических исследований фазы ΙΙ является определение влияния мутаций Ес, в данном случае, на рост опухоли. В предварительных исследованиях применялась

- 33 009746 однократная доза Ритуксана, которая полностью ингибировала рост опухоли. Поскольку это не позволяет измерить количественные различия, следует использовать интервал доз.

Фармакокинетическое сравнение в фазе I для варианта Рс, исходного Рс дикого типа и Ритуксана может быть выполнено следующим образом. Во-первых, 40 мкг может быть введено внутривенно каждому животному с количественным определением уровня в плазме через 0, 0,25, 0,5, 1, 24, 48, 72, 96, 120, 168 и 336 ч. Эти данные могут быть обработаны, например, с использованием фармакокинетической программы (^ИЫоиЬш) и двухкомпартментной фармакокинетической модели со снижением до нуля для получения скорости клиренса. Скорость клиренса может использоваться для определения уровня концентрации в плазме в фазе плато по следующему уравнению: С=доза/(Скорость клиренса х τ), где τ представляет собой интервал между введением доз и С представляет собой уровень в плазме в фазе плато. Фармакокинетические эксперименты могут быть проведены на мышах без опухоли, например, с минимальным количеством 5 мышей в каждой временной точке.

Для следующей фазы модель на животных может быть использована следующим образом. В правый бок мыши СВ17-8СГО могут быть подкожно имплантированы 10⁶ клеток Кар. Немедленно после имплантации вводят внутривенно болюс варианта Рс, дикого типа Рс или Ритуксана и продолжают введение препарата до достижения опухолью более 2 см в диаметре. Объем опухоли может определяться каждый понедельник, среду и пятницу путем измерения длины, ширины и глубины опухоли с использованием капилляра (объем опухоли = длина х ширина х глубина). График «объем опухоли-время» дает скорость роста опухоли для фармакодинамических расчетов. Должно использоваться по меньшей мере около 10 животных в каждой группе.

Фаза II фармакодинамического сравнения варианта Рс, дикого типа Рс и Ритуксана может проводиться следующим образом. На базе опубликованных данных Ритуксан в дозе 10 мкг/г 1 раз в неделю полностью ингибировал рост опухоли ίη у1уо (С1уиез е! а1., №11. Мей. 2000 Арг; 6(4):443-6, 2000, которая включена посредством ссылка). Таким образом, могут исследоваться еженедельные дозы в интервале 10 мкг/г, 5 мкг/г, 1 мкг/г, 0,5 мкг/г и 0 мкг/г. Уровень в плазме в фазе плато, при котором рост опухоли ингибируется на 50%, может быть определен графически на основе взаимосвязи между уровнем в плазме в фазе плато и эффективностью. Уровень в плазме в фазе плато может быть рассчитан, как описано выше. При необходимости % может корректироваться соответствующим образом для каждого варианта Рс и Рс дикого типа, в зависимости от их фармакокинетических свойств, для достижения сравнимой концентрации в плазме в фазе плато с Ритуксаном. Статистически улучшенные фармакодинамические значения для варианта Рс в сравнении с исходным полипептидом (например, Рс дикого типа) и Ритуксаном в целом будут показывать, что вариант Рс демонстрирует улучшенную активность ίη у1уо.

Дополнительное фармакодинамическое сравнение вариантов Рс, Рс дикого типа и Ритуксана может быть проведено на обезьянах, как было описано ранее (КеГГ е! а1., В1оой 83, 435-445, 1994). Зависимость «доза-ответ» для истощения периферических В-клеток и В-клеток лимфатического узла может использоваться для сравнения относительной мощности вариантов Рс с Рс дикого типа и Ритуксаном, которые вводятся внутривенно и/или подкожно. Статистически улучшенные фармакодинамические значения варианта Рс в сравнении с исходным полипептидом (например, Рс дикого типа) и Ритуксана в целом будут показывать, что вариант Рс демонстрирует улучшенную активность ίη у1уо.

В дополнительных вариантах осуществления осуществляют скрининг вариантов по данному изобретению таким образом, что варианты, которые применимы для терапевтических целей, идентифицируют по меньшей мере в двух видах. Такие варианты обозначают в настоящем описании как улучшенные варианты с двойной специфичностью, и они особенно применимы для идентификации вариантов, которые являются лечебными для людей, и также демонстрируют (или вероятно будут демонстрировать) эффективность на животной модели. В этой связи настоящее изобретение относится к способам идентификации вариантов, которые имеют высокие шансы быть одобренными для клинических испытаний на людях, поскольку данные на животных моделях, вероятно, будут поддерживать любые заявки на тестирование на людях в правительственные регулирующие органы (например, Управление лекарств и пищевых продуктов США).

В определенных вариантах осуществления улучшенные варианты с двойной специфичностью идентифицируют, во-первых, проведением анализа АЭСС с использованием эффекторных клеток человека для поиска улучшенных вариантов и затем проведением второго анализа АЭСС с использованием эффекторных клеток мышей, крыс или нечеловекообразных приматов для идентификации подмножества улучшенных вариантов, которые представляют собой улучшенные варианты с двойной специфичностью. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам для идентификации улучшенных вариантов с двойной специфичностью, которые включают: а) наличие :ί) клеток-мишеней, ίί) композицию, которая включает вариант-кандидат исходного полипептида, содержащий по меньшей мере часть участка Рс, где вариант-кандидат включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты на участке Рс и где вариант-кандидат опосредует цитотоксичность клеток-мишеней в присутствии эффекторных клеток первого вида (например, человека) более эффективно, чем исходный полипептид, и ίίί) эффекторные клетки второго вида (например, мыши, крысы или нечеловекообразного примата), и Ь)

- 34 009746 инкубирование композиции с клетками-мишенями при таких условиях, что вариант-кандидат связывается с клетками-мишенями, таким образом, образуя клетки-мишени, связанные с вариантом-кандидатом, с) смешивание эффекторных клеток второго вида с клетками-мишенями, связанными с вариантомкандидатом, и ά) измерение цитотоксичности клеток-мишеней, опосредованной вариантом-кандидатом. В определенных вариантах осуществления способ дополнительно включает стадию е) определения того, опосредует ли вариант-кандидат цитотоксичность клеток-мишеней в присутствии эффекторных клеток второго вида более эффективно, чем исходный полипептид. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает стадию ί) идентификации варианта-кандидата как улучшенного варианта с двойной специфичностью, который опосредует цитотоксичность клеток-мишеней в присутствии эффекторных клеток второго вида более эффективно, чем исходный полипептид. В предпочтительных вариантах осуществления идентифицированные варианты с двойной специфичностью затем подвергают скринингу ίη νίνο в одном или нескольких анализах на животных.

В определенных вариантах осуществления улучшенные варианты с двойной специфичностью идентифицируют, во-первых, проведением анализа цельной крови с использованием крови человека для поиска улучшенных вариантов и затем проведением второго анализа цельной крови с использованием крови мыши, крысы или нечеловекообразного примата для идентификации подмножества улучшенных вариантов, которые представляют собой улучшенные варианты с двойной специфичностью. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам для идентификации улучшенных вариантов с двойной специфичностью, которые включают: а) наличие ί) клеток-мишеней, ίί) композиции, которая включает вариант-кандидат исходного полипептида, содержащий по меньшей мере часть участка Ес, где вариант-кандидат включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты на участке Ес и где вариант-кандидат опосредует истощение клеток-мишеней в присутствии крови первого вида (например, человек) более эффективно, чем исходный полипептид, и ίίί) крови второго вида (например, мыши, крысы или нечеловекообразного примата), и Ь) инкубирование композиции с клеткамимишенями при таких условиях, что вариант-кандидат связывается с клетками-мишенями, таким образом, образуя клетки-мишени, связанные с вариантом-кандидатом, с) смешивание крови второго вида с клетками-мишенями, связанными с вариантом-кандидатом, и ά) измерение истощения клеток-мишеней опосредованной вариантом-кандидатом. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает стадию е) определения того, опосредует ли вариант-кандидат истощение клеток-мишеней в присутствии крови второго вида более эффективно, чем исходный полипептид. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает стадию ί) идентификации варианта-кандидата как улучшенного варианта с двойной специфичностью, который опосредует истощение клеток-мишеней в присутствии крови второго вида более эффективно, чем исходный полипептид. В предпочтительных вариантах осуществления идентифицированные варианты с двойной специфичностью затем подвергают скринингу ίη νίνο в одном или нескольких анализах на животных.

В определенных вариантах осуществления улучшенные варианты с двойной специфичностью идентифицируют проведением любым из описанных выше анализов с использованием человеческих компонентов (например, клетки человека, рецепторы Ес человека и т. д.) для идентификации улучшенных вариантов и затем выполняют такой же анализ (или другой анализ) с компонентами отличных от человека животных (например, мышиные клетки, мышиные Ес рецепторы и т.д.). В этой связи может быть идентифицировано подмножество вариантов, которые показывают хороший эффект в соответствии с данными критериями как в анализе, на основе человеческих материалов, так и в анализе, на основе материалов второго вида.

Примерный процесс для идентификации улучшенных вариантов с двойной специфичностью представляет собой следующее. Во-первых, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей по меньшей мере часть участка Ес 1дС. мутирована таким образом, что аминокислотная последовательность экспрессирует по меньшей мере одно изменение аминокислоты, таким образом, образуя вариант. Экспрессированный 1дС вариант затем характеризуют в анализе ЛЭСС с использованием РВМС человека или их подмножества (например, ИК клетки или макрофаги). Если обнаружена повышенная АЭСС активность, то осуществляют скрининг варианта во втором анализе ЛЭСС с использованием мышиных или крысиных РВМС.

Альтернативно или дополнительно, анализ может быть выполнен с вариантом для связывания с клонированными рецепторами грызунов или клеточными линиями. В конечном итоге, если найденный вариант является улучшенным по данным второго анализа, что делает его вдвойне улучшенным, то осуществляют скрининг варианта ίη νίνο на мышах или крысах.

V. Показательные молекулы, содержащие вариант участка Ес

Вариант Ес участка по данному изобретению может быть частью молекулы большего размера. Молекулы большего размера могут быть, например, моноклональными антителами, поликлональными антителами, химерными антителами, гуманизированными антителами, биспецифическими антителами, иммуноадгезинами, что предоставляет широкий спектр применения для вариантов участка Ес по данному изобретению.

- 35 009746

А. Антитела, содержащие вариант участков Ес

В предпочтительных вариантах осуществления молекула, содержащая вариант участка Ес (например, полипептид) представляет собой антитело. Техники создания антител описаны ниже.

(ί) Выбор и подготовка антигена

Как правило, если вариант участка Ес, содержащий молекулу, представляет собой антитело, антитело направлено против интересующего антигена. Предпочтительно антиген представляет собой полипептид и введение антитела млекопитающему, которое страдает от заболевания или нарушения, может приводить к терапевтической пользе для такого млекопитающего. Однако также могут применяться антитела, направленные против неполипептидных антигенов (таких как связанные с опухолью гликолипидные антигены; см. патент США № 5091178, включенный посредством ссылки).

Примеры антигенов включают без ограничения такие молекулы, как ренин; гормон роста, включая гормон роста человека и бычий гормон роста; фактор высвобождения гормона роста; паратиреоидный гормон; тироидстимулирующий гормон; липопротеиды; альфа-1-антитрипсин; инсулина А-цепь; инсулина В-цепь; проинсулин; фолликулостимулирующий гормон; кальцитонин, лютеинизирующий гормон; глюкагон; факторы свертывания, такие как фактор УШС, фактор ΙΧ, тканевой фактор (ТЕ) и фактор вон Виллебранда; противосвертывающие факторы, такие как Протеин С; предсердный натрийуретический фактор; легочный сурфактант; активатор плазминогена, такой как урокиназа, или моча человека, или активатор плазминогена тканевого типа (ΐ-РА); бомбезин; тромбин; гемопоэтический фактор роста; факторы некроза опухоли альфа и бета; энкефалиназа; КАНТЕ8 (регулирует активацию нормальной экспрессии и секреции Т-клетки); воспалительный протеин макрофага человека (МГР-1 -альфа); альбумин сыворотки, такой как альбумин сыворотки человека; ингибирующая субстанция Мюллера; А-цепь релаксина; В-цепь релаксина; прорелаксин; мышиный гонадотропин-ассоциированный пептид; микробный белок, такой как бета-лактамаза; ДНКаза; ΙβΕ; цитотоксический Т-лимфоцит ассоциированный антиген СТЬА, такой как СТЬА-4; ингибин; активин; фактор роста эндотелия сосудов (УЕСЕ); рецепторы для гормонов или факторов роста; белок А или Ό; ревматоидные факторы; нейротрофический фактор, такой как костный нейротрофический фактор (ВОХЕ), нейротрофин-3,-4,-5 или -6 (ХТ-3, ЭТ-4, №-5 или ΝΤ-6) или фактор роста нервов; тромбоцитарный фактор роста (РОСЕ); фактор роста фибробластов, такой как аЕСЕ и вЕСЕ; эпидермальный фактор роста (ЕСЕ); трансформирующий фактор роста (ТСЕ), такой как ТСЕ-альфа и ТСЕ-бета, включая ТСЕ-1, ТСЕ-2, ТСЕ-3, ТСЕ-4 или ТСЕ-5; инсулиноподобный фактор роста-Ι и -ΙΙ (ЧСЕ-Ι и ЮЕ-ΙΙ); дес(1-3)-ЮЕ-1 (мозговой ЮЕ-Ι), белки, связывающиеся с инсулиноподобным фактором роста; белки СО, такие как СЭ3, СЭ4, СЭ8, СЭ19 и СЭ20; эритропоэтин; остеоиндуктивные факторы; иммунотоксины; костный морфогенный белок (ВМР); интерферон, такой как интерферональфа, -бета и -гамма; колониестимулирующие факторы (С8Е), например, М-С8Е, СМ-С8Е и С-С8Е; интерлейкины (ГЬ), например, от Ш-1 до ЕС-10; супероксиддисмутаза; рецепторы Т-клеток; поверхностные белки мембраны; фактор ускорения кариеса; вирусный антиген, такой как, например, часть оболочки ВИЧ; транспортные белки; домашние рецепторы; адрессины; регуляторные белки; интегрины, такие как СЭ11 а, СЭ11 Ь, СЭ11 с, СЭ18, ШАМ, УБА-4 и УСАМ; ассоциированный с опухолью антиген, такой как НЕК2, НЕК3 или НЕК4 рецептор; звено пути апоптоза; и фрагменты любого из перечисленных пептидов.

Предпочтительные антигены включают без ограничения белки СО, такие как СЭ3, СЭ4, СЭ8, СЭ19, СЭ20 и СЭ34; члены семейства рецепторов ЕгЬВ, такие как рецептор ЕСЕ, рецептор НЕК2, НЕК3 или НЕК4; молекулы адгезии клеток, такие как ЬЕА-1, Мас1, р150.95, УЪА-4, ТСАМ-1, УСАМ, а4/р7 интегрин и (Χνφ3 интегрин, включая их или их субъединицы (например, анти-СЭ11а, анти-СО 18 или антиСЭ11Ь антитела); факторы роста, такие как УЕСЕ; фактор роста (ТЕ); альфа-интерферон (а-ШЫ); интерлейкин, такой как Ш-8; Ι§Ε; антигены групп крови; рецептор Дк2/Дк3; рецептор ожирения (ОВ); рецептор тр1; СТЬА-4, белок С и т.д.

Растворимые антигены или их фрагменты необязательно конъюгированы с другими молекулами, могут применяться как иммуногены для создания антител. Для трансмембранных молекул, таких как рецепторы, их фрагменты (например, внеклеточный домен рецептора) могут применяться как иммуногены. Альтернативно, клетки, экспрессирующие трансмембранную молекулу, могут применяться как иммуноген. Такие клетки могут быть получены из природного источника (например, линии злокачественных клеток) или могут быть клетками, которые трансформируются в соответствии с рекомбинантными методами для экспрессии трансмембранной молекулы. Другие антигены и их формы полезны для приготовления антител, будут понятны специалистам в данной области.

(ίί) Поликлональные антитела

Настоящее изобретение обеспечивает поликлональные антитела с вариантами участка Ес. Например, репертуар человеческого иммуноглобулина, содержащий модифицированные константные участки С1, может быть пересажен активированным иммуноглобулином мышам, что приведет к экспрессии мышами репертуара ΙβΛ содержащего модифицированные участки Ес (см., например, Мспбсх, с1 а1., НаГите Сспсйск 15:146 (1997), включена посредством ссылки). Предпочтительно повышение уровня поликлональных антител у животных вызывают множественными подкожными (п/к) или внутрибрюшинными инъекциями соответствующего антигена и вспомогательного вещества. Может быть полезно конъюгировать соответствующий антиген с белком, который является иммуногенным для вида, подлежащего

- 36 009746 иммунизации (например, гемоцианин, альбумин сыворотки, бычий тироглобулин или соевый ингибитор трипсина) с использованием бифункционального или дериватизирующего агента (например, малеимидобензоил сульфосукцинимидного эфира для конъюгации через остцистеиновые остатки, N гидроксисукцинимид для конъюгации через лизиновые остатки, глутаральдегид, сукциновый ангидрид, 80С1₂ или К1N=С=NК. где Я и Я1 представляют собой различные алкильные группы.

Примеры общего протокола иммунизации для кролика и мыши следующие. Животных иммунизируют против антигена, иммуногенных конъюгатов или производных путем комбинирования, например 100 мкг или 5 мкг белка или конъюгата (например, для кролика или мыши, соответственно) с 3 объемами полного адъюванта Фрейнда, и раствор вводят внутрикожно во множество мест. Через месяц животным вводят усиливающую дозу 1/5 или 1/10 от исходного количества пептида или конъюгата в полном адъюванте Фрейнда путем подкожной инъекции во множество мест. Через 7-14 дней животных забивают и определяют титр антител в сыворотке. Животным вводят усиливающие дозы до достижения титром антител фазы плато. Предпочтительно животному вводят усиливающие дозы конъюгата того же антигена, но конъюгированного с другим белком и/или через различный сшивающий реагент. Конъюгаты также могут быть приготовлены в культуре рекомбинантных клеток, например, слиянием с белками. Кроме того, для применения с целью увеличения иммунного ответа подходящими являются агрегирующие агенты.

(ίίί) Моноклональные антитела

Настоящее изобретение обеспечивает моноклональные антитела с вариантами участка Ес. Моноклональные антитела могут быть приготовлены многими способами, включая использование гибридомного метода (например, описанного в ΚοΙιΕτ с1 а1., Мите, 256: 495, 1975, включена посредством ссылки) или методов рекомбинантных ДНК (например, патент США № 4 816567, включенный посредством ссылки).

В гибридомном методе мышь или другое подходящее животное-хозяин, такое как хомяк или обезьяна-макак, иммунизируют для образования лимфоцитов, которые вырабатывают или способны вырабатывать антитела, которые будут специфично связываться с белком, который использовался для иммунизации. Альтернативно, лимфоциты могут быть иммунизированы ίη νίίτο. Затем лимфоциты сливают с клетками миеломы, используя подходящий агент для слияния, такой как полиэтиленгликоль, для образования клетки гибридомы. Клетки гибридомы, приготовленные таким образом, засевают и выращивают в подходящей культуральной среде, которая предпочтительно содержит одно или несколько веществ, которые ингибируют рост или выживание не слитых исходных клеток миеломы. Например, если в исходных клетках миеломы отсутствует фермент гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансфераза (НСРЯТ или НРЯТ), культуральная среда для таких гибридом, как правило, будет включать гипоксантин, аминоптерин и тимидин (среда НАТ), что будет предупреждать рост НСРЯТ-дефицитных клеток.

Предпочтительными клетками миеломы являются клетки, которые эффективно сливаются, поддерживают стабильную продукцию антител на высоком уровне выбранными антитело-продуцирующими клетками и являются чувствительными к среде, такой как среда НАТ. Среди них предпочтительными клеточными линиями миеломы являются клетки миеломы мышей, такие как происходящие из мышиных опухолей МОРС-21 и МРС-11, доступных от 8а1к ИъШШе Се11 ΟΜτΦιιΙίοη СеШет, 8ан Оте^, ί.’;·ι1ίΓοτηί;·ι и8А, и клетки 8Р-2 или Х63-Ад8-653, доступные от Атенсаи Туре СиИите ΤοΙ^Ιίοΐ! Яοскν^11е, Магуктб Ы8А. Клеточные линии миеломы человека и гетеромиеломы мыши/человека также описаны для продукции человеческих моноклональных антител (например, ΚοζЬο^, ί. Iттиηο1., 133: 3001 (1984), включена как ссылка).

Культуральную среду, в которой растут клетки гибридомы, подбирают для продукции моноклональных антител, направленных против антигена. Предпочтительно, специфичность связывания моноклональных антител, продуцированных клетками гибридомы, определяют с помощью иммунопреципитации или с помощью анализа связывания ίη νίίτο, такого как радиоиммунный анализ (Я1А) или твердофазный иммуноферментный анализ (ЕЫ8А). После того как определено, что клетки гибридомы продуцируют антитела с желаемой специфичностью, сродством и/или активностью, могут быть субклонированы клоны с помощью методик ограниченного разведения и выращены стандартными способами. Подходящие для этой цели среды культивирования включают, например, Ό-МЕМ или среду ЯРМ1-1640. Кроме того, клетки гибридомы могут быть выращены ίη νίνο как асцитные опухоли у животного. Моноклональные антитела, которые секретируют субклоны, подходящим способом отделяют от среды культивирования, асцитной жидкости или сыворотки путем традиционных методик очистки иммуноглобулина, таких как, например, очистка белка с помощью А-сефарозы, хроматография на гидроксиапатите, гельэлектрофорез, диализ или аффинная хроматография.

ДНК, кодирующая моноклональные антитела, легко выделяется и секвенируется с использованием традиционных методик (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, которые способны связываться специфично с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи моноклональных антител). Клетки гибридомы служат предпочтительным источником такой ДНК. После выделения ДНК может быть помещена в экспрессирующие векторы, которыми затем трансфицируют клетки-хозяева, такие как клетки Е. той, обезьяньи клетки С08, клетки яичника китайского хомячка (СНО) или клетки миеломы, которые

- 37 009746 иначе не продуцируют белок иммуноглобулин, для достижения синтеза моноклональных антител в рекомбинантных клетках-хозяевах. Рекомбинантная продукция антител более подробно описана ниже.

В некоторых вариантах осуществления антитела или фрагменты антител выделяют из фаговых библиотек антител с применением техник, описанных, например, в МсСаГГейу е1 а1., ЫаШге, 348: 552554 (1990). С1асккоп е! а1., Ыа1иге, 352:624-628 (1991) и Магкк е! а1., 1. Мо1. Вю1., 222: 581-597 (1991) описывают выделение мышиных и человеческих антител, соответственно, с использованием фаговых библиотек. Последующие публикации описывают продукцию человеческих антител (интервал нМ) с высоким сродством путем цепи ЗНИЕЕПЫС (Магкк е1 а1., ВюТесЬпо1оду, 10: 779-783 (1992)) а также сочетанную инфекцию и рекомбинацию ш νί\Ό как стратегию конструирования очень больших фаговых библиотек (например, \Уа1ег1юике е1 а1., Ыис. Ас1бк. Яек., 21: 2265-2266 (1993)). Таким образом, эти техники и подобные техники представляют собой жизнеспособные альтернативы традиционным гибридомным методам для выделения моноклональных антител.

Также молекула ДНК может быть модифицирована, например, заменой кодирующей последовательности константных доменов тяжелой и легкой цепи человека на гомологичные последовательности мыши (например, патент США № 4816567 и Моткоп, е! а1., Ргос. №11. Асаб. 8с1 И8А, 81: 6851 (1984), каждая из которых включена сюда в качестве ссылки) или ковалентным присоединением ко всей или к части кодирующей последовательности иммуноглобулина кодирующей последовательности неиммуноглобулинового полипептида.

Как правило, такие неиммуноглобулиновые полипептиды замещены константными доменами антитела или они замещены вариабельными доменами одного антиген-сочетающего сайта антитела для создания химерного двухвалентного антитела, которое включает один антиген-сочетающий сайт, обладающий специфичностью в отношении антигена, и другой антиген-сочетающий сайт, обладающий специфичностью в отношении другого антигена.

(ίν) Гуманизированные и человеческие антитела

Настоящее изобретение относится к гуманизированным и человеческим антителам с вариантами участка Ес. В предпочтительных вариантах осуществления гуманизированное антитело включает аминокислотные последовательности человеческого антитела вместе с остатками аминокислот, которые не происходят из организма человека. В некоторых вариантах осуществления человеческие последовательности в гуманизированном антителе включают каркасные участки (ЕЕ) и последовательности или остатки, которые не происходят из организма человека, включающие один или несколько определяющих комплементарность участков (СОЯ).

ЕЕ и СОЯ могут быть определены на основе нумерации остатков аминокислоты в вариабельных участках тяжелой и легкой цепи. Термин определяющий комплементарность участок или СОЯ предназначен для обозначения несмежных антиген-связывающих сайтов, содержащихся в вариабельных участках полипептидов тяжелой и легкой цепей. Такие участки были определены КаЬа! е1 а1. (1. Вю1. СНет. 252:6609-6616 (1977) и КаЬа! е1 а1. 8ес.|иепсек оГ РгоШпк оГ 1штипо1одюа1 1п1егек1 (1991); КаЬаГ'), С’Нобиа е! а1. (1. Мо1. Вю1. 196:901-917 (1987); СНо1Ыа) и МасСа11ит е! а1. (1. Мо1. Вю1. 262:732-745 (1996); МасСа11ит), где определения включают перекрывание или подмножества аминокислотных остатков при сравнении друг с другом. В любом случае, применение любого из этих определений отдельно (например, определение КаЬа!) или в сочетании (например, комбинированное определение КаЬа! и СНобиа) относится к СОЯ антител (включая гуманизированное антитело), обозначенным в рамках термина, который используется в настоящем описании. Остатки аминокислот, которые включают СОЯ, как определено каждой из цитированных выше ссылок, приведены ниже в сравнительной табл. 6.

Таблица 6. Определения СОЯ

	КаЬа!
νΗ СРВ!	31-35
Ун СРВ2	50-65
νΗ СРЕЗ	95-102
νΓ СРВ1	24-34
СРК2	50-56
\\ СРЕЗ	89-97

СЬоВЫа	МасСаИит
26-32	30-35
53-55	47-58
96-101	93-101
26-32	30-36
50-52	46-55
91-96	89-96

Кроме того, термин каркас в отношении вариабельного участка антитела означает все остатки аминокислот вне участков СОЯ в вариабельном участке антитела. Следовательно, длина каркаса вариабельного участка составляет приблизительно 100-120 аминокислот, но он предназначен только для обозначения аминокислот вне СОЯ. Термин каркасный участок предназначен для обозначения каждого домена каркаса, отличного от СОЯ. Следовательно, для конкретного примера вариабельного участка тяжелой цепи и для СОЯ, как определено ЯаЬа!, каркасный участок 1 (ЕЯ1) соответствует домену вариабельного участка, который охватывает аминокислоты 1-30; участок 2 (ЕЯ2) соответствует домену вариа

- 38 009746 бельного участка, который охватывает аминокислоты 36-49; участок 3 (ЕК3) соответствует домену вариабельного участка, который охватывает аминокислоты 66-94, а участок 4 (ЕК4) соответствует домену вариабельного участка от аминокислоты 103 до конца вариабельного участка. Каркасные участки легкой цепи подобным образом отделены от СОК вариабельного участка каждой легкой цепи. Подобным образом, с использованием определения СОК С1ю11иа или МасСаИит или любой комбинации определений СОК, границы каркаса определяются соответствующими концами СОК, как описано выше. Несмотря на многочисленные определения СОК, в некоторых вариантах осуществления предпочтительно использовать определение КаЬа! для определения СОК.

Остатки в гуманизированном антителе, которые не происходят из организма человека, могут быть остатками или последовательностями, привнесенными или происходящими от других видов (включая без ограничения мышь), или данные последовательности могут быть случайными последовательностями аминокислот (например, созданными из случайных последовательностей нуклеиновой кислоты), которые встроены в последовательность гуманизированного антитела. Как отмечено выше, аминокислотные последовательности в гуманизированном антителе предпочтительно представляют собой каркасные области, хотя остатки, которые не происходят от человеческого антитела (происходящие из других видов или случайные аминокислотные последовательности), предпочтительно соответствуют СОК. Однако в некоторых вариантах осуществления одна или несколько каркасных областей могут содержать один или несколько остатков аминокислот, не встречающихся в организме человека. В случае изменений или модификаций (например, путем введения остатка, не встречающегося в организме человека) каркас, в остальном являющийся человеческим, может в случае измененной или модифицированной каркасной области располагаться смежно с модифицированным СОК из других видов или случайной последовательностью СОК, хотя в других вариантах осуществления измененный каркасный участок не является смежным с измененной последовательностью СОК из других видов или случайной последовательности СОК. В некоторых вариантах осуществления каркасные последовательности гуманизированного антитела являются полностью человеческими (т.е. никаких изменений каркаса человеческого антитела не произведено). В предпочтительных вариантах осуществления каркасные последовательности гуманизированного антитела являются полностью человеческой зародышевой линией (т.е. никаких изменений не осуществлено в каркасе зародышевой линии человека).

Остатки аминокислот, не встречающиеся в организме человека, из других видов или случайную последовательность часто называют импортированными остатками, которые обычно берут в импортном вариабельном домене. Гуманизация может быть осуществлена в значительной степени в соответствии со способом ХУйНег и соавт. (например, Ьопек е( а1., №11иге. 321: 522-525 (1986); К1есйтапп е( а1., №(иге, 332: 323-327 (1988); Уегйоеуеп е( а1., 8с1епсе, 239: 1534-1536 (1988), каждая из которых включена в настоящее описание посредством ссылки), с замещением СОК грызуна (или другого млекопитающего) или соответствующей последовательностью СОК человеческого антитела. Кроме того, могут быть созданы антитела, в которых значительно меньшая часть, чем интактный вариабельный домен человека, замещена соответствующей последовательностью, происходящей от вида, отличного от человека (например, патент США № 4816567, включенный в настоящее описание посредством ссылки). На практике гуманизированные антитела обычно представляют собой антитела человека, в которых некоторые остатки СОК и, возможно, некоторые остатки ЕК заменены остатками из аналогичных сайтов антител грызунов или, как отмечено выше, в которых последовательности СОК заменены случайными последовательностями. Например, но без ограничения, способы обеспечения связывающей активности СЭК-донора на каркасе вариабельного участка антитела-акцептора описаны в \У0 01/27160 А1, включенном в настоящее описание посредством ссылки, и в заявках США 09/434,870 и 09/982,464, каждая из которых включена в настоящее описание посредством ссылки.

При выборе вариабельных доменов легкой и тяжелой цепей человека, которые используются в получении гуманизированных антител, важно снизить антигенность. В соответствии с так называемым методом наилучшего соответствия осуществляют скрининг последовательности вариабельного домена антитела грызуна, подлежащего гуманизации, против полной библиотеки известных последовательностей вариабельных доменов человека. Затем человеческая последовательность, ближайшая к последовательности грызуна, принимается как человеческий каркас (ЕК) для гуманизированного антитела (например, 81тк е( а1., I. 1ттипо1., 151: 2296 (1993), и С1ю11иа е( а1., I. Мо1. Вю1., 196: 901 (1987), каждая из которых включена в настоящее описание посредством ссылки). В другом способе используется конкретный каркас, полученный из консенсусной последовательности всех человеческих антител конкретной подгруппы легких или тяжелых цепей. Такой же каркас может использоваться для нескольких различных гуманизированных антител (например, Сайег е( а1., Ргос. №(1. Асаб. 8ск И8А, 89: 4285 (1992); Ргейа е( а1., I. 1ттипо1., 151: 2623 (1993), каждая из которых включена в настоящее описание посредством ссылки).

В других представленных вариантах осуществления нет необходимости в предварительном выборе конкретного каркаса антитела человека (т.е. нет необходимости выбирать человеческий каркас с максимальной гомологией или последовательность, идентичную с данным антителом-кандидатом, которое должно быть гуманизировано). В таких вариантах осуществления общий или универсальный человече

- 39 009746 ский каркас может использоваться для принятия одного или нескольких отличных от человеческих СОЯ. В предпочтительном варианте осуществления единый универсальный полностью человеческий каркас используется в качестве каркаса для всех антител, которые должны быть гуманизированы, независимо от его гомологичности с каркасной последовательностью(ями) антител-кандидатов. В этой связи гуманизированные антитела могут быть созданы без внесения изменения в каркасную область. Данный универсальный полностью человеческий каркас может затем принять одну или несколько последовательностей СОЯ. В одном варианте осуществления одна или несколько последовательностей СОЯ представляют собой последовательности СОЯ антител из других видов (например), мыши или крысы), которые должны быть модифицированы в сравнении с соответствующим СОЯ в интактном антителе других видов (т.е. одновременное введение СОЯ и модификация СОЯ, введенного в универсальный человеческий каркас). Модификация соответствует одному или нескольким изменениям аминокислот (в модифицированном СОЯ) в сравнении с соответствующим СОЯ в интактном антителе другого вида. В одном варианте осуществления все остатки аминокислот СОЯ включены в библиотеку, хотя в других вариантах осуществления в библиотеку включены не все остатки аминокислот СОЯ. В другом варианте осуществления одна или несколько последовательностей СОЯ представляют собой случайные последовательности, заменившие последовательности СОЯ.

В предпочтительных вариантах осуществления антитела гуманизированы с сохранением высокого сродства к антигену и других полезных биологических свойств. В некоторых вариантах осуществления сродство гуманизированного антитела к антигену выше, чем сродство соответствующего негуманизированного интактного антитела или фрагмента или его части (например, антитела-кандидата грызуна). В этой связи, в некоторых вариантах осуществления гуманизированные антитела получают с помощью анализа исходной последовательности и различных схематичных гуманизированных продуктов с использованием трехмерных моделей исходной и гуманизированной последовательности. Трехмерные модели иммуноглобулина широко доступны и хорошо знакомы специалистам в данной области. Доступны компьютерные программы, которые иллюстрируют и демонстрируют вероятные трехмерные конформационные структуры выбранных последовательностей иммуноглобулинов-кандидатов. Их проверка позволяет провести анализ вероятной роли остатков в функционировании последовательности иммуноглобулина-кандидата, т.е. анализ остатков, влияющих на способность иммуноглобулина-кандидата связываться со своим антигеном. Таким способом, остатки ЕЯ могут быть выбраны, а последовательности реципиента объединены с импортированными последовательностями, которые обладают желаемыми характеристиками антитела, такими как повышенное сродство к целевому антигену(ам). Обычно, остатки СЭЯ непосредственно и наиболее значительно влияют на связывание антигена.

Разнообразные конкретные способы, хорошо известные специалистам в данной области из уровня техники, могут применяться для введения СОЯ антитела (или случайной последовательности, заменяющей СОЯ антитела) в каркасы антител (см., например, заявки на выдачу патента США 09/434 379 и 09/982464). В некоторых вариантах осуществления перекрывание олигонуклеотидов может использоваться для синтеза гена антитела или его части (например, гена, кодирующего гуманизированное антитело). В других вариантах осуществления может быть осуществлен мутагенез матрицы антитела с использованием способа Кипке1 (ниже), например, для введения модифицированного СОЯ или случайной последовательности для замены СОЯ. В некоторых вариантах осуществления вариабельные участки легкой и тяжелой цепи гуманизированы отдельно, а затем коэкспрессированы как гуманизированные вариабельные участки. В других вариантах осуществления гуманизированные вариабельные участки маскируют вариабельный участок интактного антитела. В некоторых вариантах осуществления участок Ес интактного антитела, который включает гуманизированный вариабельный участок, модифицирован (например, по меньшей мере одна модификация аминокислоты осуществлена в участке Ес). Например, антитело, гуманизированное случайным СОЯ и без изменений каркаса, может включать по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в участке Ес.

В других вариантах осуществления применяются трансгенные животные (например, мыши), которые способны после иммунизации вырабатывать полный репертуар человеческих антител в отсутствие выработки эндогенного иммуноглобулина. Например, была описана гомозиготная делеция гена соединяющего участка (ЕН) тяжелой цепи антитела в химерной и зародышевой мутантных мышах, приводящая к полному ингибированию эндогенной выработки антител. Перенос генного массива зародышевой линии человеческого иммуноглобулина в зародышевую линию мутантных мышей будет приводить к выработке человеческих антител при антигенной нагрузке (см., например, 1акоЬоуЙ8 е! а1., Ргос. №11. Асаб. 8ск И8А, 90: 2551 (1993), и 1акоЬоуЙ8 е! а1., №!иге, 362: 255-258 (1993), каждая из которых включена в настоящее описание посредством ссылки). Человеческие антитела могут также быть произведены из фаговодисплейных библиотек (например, НоодепЬоот е! а1., 1. Мо1. Вю1., 227: 381 (1991), и Vаидйаη е! а1. №1иге Вю!есй 14: 309 (1996), каждая из которых включена в настоящее описание посредством ссылки).

Настоящее изобретение относится к способам создания гуманизированных антител (и фрагментов антител), которые включают по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в участке Ес (в сравнении с исходным полипептидом, содержащим участок Ес). Ниже обсуждаются дополнительные способы

- 40 009746 создания такого гуманизированного антитела. Настоящее изобретение также обеспечивает композиции, которые включают антитела и фрагменты антител, созданные такими способами. Важно, что обсуждаемые ниже способы гуманизации и другие способы гуманизации (например, обсужденные выше), могут сочетаться с вариантами Ес по настоящему изобретению. В этой связи, гуманизированные антитела с измененными уникальными Ес участками могут быть сконструированы в соответствии с данным изобретением.

В некоторых вариантах осуществления обеспечивается способ конструирования популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок тяжелой цепи, который предусматривает: а) обеспечение представления первой и второй ссылочных последовательностей аминокислот, причем первая ссылочная последовательность включает последовательность вариабельного участка тяжелой цепи донора, вариабельный участок донора, который включает ί) каркасные области и ίί) три определяющих комлементарность участка, как определено согласно комбинированным определениям КаЬа! и С1ю11иа; вторая ссылочная последовательность включает последовательность вариабельного участка тяжелой цепи акцептора, который включает каркасные участки; Ь) синтез а) первых олигонуклеотидов, кодирующих части каркасных областей вариабельного участка тяжелой цепи акцептора, где последовательность части каркасных областей при сравнении со второй ссылочной последовательностью является немодифицированной; и Ь) популяции вторых олигонуклеотидов, каждый из которых кодирует ί) по меньшей мере часть первого определяющего комплементарность участка, который был модифицирован, причем первый определяющий комплементарность участок выбран из группы, которая состоит из НСЭК1, НСЭР2 и НСОК3, где модифицированный первый определяющий комплементарность участок включает различные аминокислоты в одном или нескольких положениях в сравнении с соответствующими определяющими комплементарность участками донора первой ссылочной последовательности и ίί) одну или несколько частей немодифицированного каркасного участка, которые способны гибридизоваться с первыми олигонуклеотидами; с) смешивание первых олигонуклеотидов с популяцией вторых олигонуклеотидов для создания перекрывающихся олигонуклеотидов; и б) обработку перекрывающихся олигонуклеотидов при таких условиях, что создается популяция нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок тяжелой цепи, где каркасные области, которые кодируются измененным вариабельным участком тяжелой цепи кодирующей нуклеиновой кислоты, являются немодифицированными в соответствии со второй ссылочной последовательностью.

В некоторых вариантах осуществления представление первой и второй ссылочных последовательностей существует в электронной форме. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает стадию (е) коэкспрессии популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок тяжелой цепи, с нуклеиновой кислотой, кодирующей вариабельный участок легкой цепи, таким образом, чтобы создать разнообразную популяцию измененных гетеромерных вариабельных участков. В некоторых вариантах осуществления синтез включает химический синтез. В некоторых вариантах осуществления акцептор является человеком. В некоторых вариантах осуществления обработка на стадии б) включает удлинение с помощью полимеразы.

В других вариантах осуществления обеспечивается способ конструирования популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок легкой цепи, который предусматривает: а) обеспечение представления первой и второй ссылочных последовательностей аминокислот, причем первая ссылочная последовательность включает последовательность вариабельного участка легкой цепи донора, вариабельный участок донора, который включает ί) каркасные области и ίί) три определяющих комлементарность участка, как определено согласно комбинированным определениям КаЬа! и С1ю11иа; вторая ссылочная последовательность включает последовательность вариабельного участка легкой цепи акцептора, который включает каркасные участки; Ь) синтез а) первых олигонуклеотидов, кодирующих части каркасных областей вариабельного участка легкой цепи акцептора, где последовательность части каркасных областей при сравнении со второй ссылочной последовательностью является немодифицированной; и Ь) популяции вторых олигонуклеотидов, каждый из которых кодирует ί) по меньшей мере часть первого определяющего комплементарность участка, который был модифицирован, причем первый определяющий комплементарность участок выбран из группы, которая состоит из ЬСОКТ, ЬСОК2 и ЬСОКЗ, где модифицированный первый определяющий комплементарность участок включает различные аминокислоты в одном или нескольких положениях в сравнении с соответствующими определяющими комплементарность участками донора первой ссылочной последовательности и ίί) одну или несколько частей немодифицированного каркасного участка, которые способны гибридизоваться с первыми олигонуклеотидами; с) смешивание первых олигонуклеотидов с популяцией вторых олигонуклеотидов для создания перекрывающихся олигонуклеотидов; и б) обработку перекрывающихся олигонуклеотидов при таких условиях, что конструируется популяция нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок легкой цепи, где каркасные области, которые кодируются нуклеиновыми кислотами, кодирующими измененный вариабельный участок легкой цепи, являются немодифицированными в соответствии со второй ссылочной последовательностью.

В некоторых вариантах осуществления представление первой и второй ссылочных последовательностей существует в электронной форме. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно

- 41 009746 включает стадию (е) коэкспрессии популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок легкой цепи с вариабельным участком тяжелой цепи, кодирующий нуклеиновую кислоту таким образом, чтобы создать разнообразную популяцию измененных гетеромерных вариабельных участков. В некоторых вариантах осуществления синтез включает химический синтез. В некоторых вариантах осуществления акцептор является человеком. В некоторых вариантах осуществления обработка на стадии ά) включает удлинение с помощью полимеразы.

В некоторых вариантах осуществления рассматривается способ конструирования популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок тяжелой цепи, который предусматривает: А) обеспечение представления первой и второй ссылочных последовательностей аминокислот, причем первая ссылочная последовательность включает последовательность вариабельного участка тяжелой цепи донора, вариабельный участок донора, который включает ί) каркасные области и ίί) три определяющих комлементарность участка, как определено согласно комбинированным определениям КаЬа! и СНо11иа; вторая ссылочная последовательность включает последовательность вариабельного участка тяжелой цепи акцептора, который включает каркасные участки; В) синтез а) популяции первых олигонуклеотидов, каждый из которых кодирует по меньшей мере часть первого определяющего комплементарность участка, выбранного из группы, которая состоит из НСОЕ1, НСОЕ2 и НСОЕ3, где модифицированный первый определяющий комплементарность участок включает различные аминокислоты в одном или нескольких положениях в сравнении с соответствующими определяющими комплементарность участками донора первой ссылочной последовательности; и Ь) вторых олигонуклеотидов, кодирующих ί) части каркасных областей вариабельного участка тяжелой цепи акцептора, где части каркасных областей при сравнении с ссылочной последовательностью являются немодифицированными, и ίί) одну или несколько частей определяющего комплементарность участка, которые способны гибридизоваться с популяцией первых олигонуклеотидов; С) смешивание популяции первых олигонуклеотидов со вторыми олигонуклеотидами для создания перекрывающихся олигонуклеотидов и Ό) обработку перекрывающихся олигонуклеотидов при таких условиях, что создается популяция нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок тяжелой цепи, где каркасные области, которые кодируются измененной нуклеиновой кислотой, кодирующей вариабельный участок тяжелой цепи, являются немодифицированными в соответствии со второй ссылочной последовательностью.

В некоторых вариантах осуществления представление первой и второй ссылочных последовательностей существует в электронной форме. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает стадию (Е) коэкспрессии популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок тяжелой цепи, с нуклеиновой кислотой, кодирующей вариабельный участок легкой цепи, таким образом, чтобы создать разнообразную популяцию измененных гетеромерных вариабельных участков. В некоторых вариантах осуществления синтез включает химический синтез. В некоторых вариантах осуществления акцептор является человеком. В некоторых вариантах осуществления обработка на стадии Ό) включает удлинение с помощью полимеразы.

В других вариантах осуществления обеспечивается способ конструирования популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок легкой цепи, который предусматривает: А) обеспечение представления первой и второй ссылочных последовательностей аминокислот, причем первая ссылочная последовательность включает последовательность вариабельного участка легкой цепи донора, вариабельный участок донора, который включает ί) каркасные области и ίί) три определяющих комлементарность участка, как определено согласно комбинированным определениям КаЬа! и СНо11иа; вторая ссылочная последовательность включает последовательность вариабельного участка легкой цепи акцептора, который включает каркасные участки; В) синтез а) популяции первых олигонуклеотидов, каждый из которых кодирует по меньшей мере часть первого определяющего комплементарность участка, выбранного из группы, которая состоит из ЬСОЕ1, ЬСОЕ2 и ЬСОЕ3, где модифицированный первый определяющий комплементарность участок включает различные аминокислоты в одном или нескольких положениях в сравнении с соответствующими определяющими комплементарность участками донора первой ссылочной последовательности; и Ь) вторых олигонуклеотидов, кодирующих ί) части каркасных областей вариабельного участка легкой цепи акцептора, где части каркасных областей при сравнении с ссылочной последовательностью являются немодифицированными и ίί) одну или несколько частей определяющего комплементарность участка, которые способны гибридизоваться с популяцией первых олигонуклеотидов; С) смешивание популяции первых олигонуклеотидов со вторыми олигонуклеотидами для создания перекрывающихся олигонуклеотидов и Ό) обработку перекрывающихся олигонуклеотидов при таких условиях, что конструируется популяция нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок легкой цепи, где каркасные области, которые кодируются нуклеиновыми кислотами, кодирующими измененный вариабельный участок легкой цепи, являются немодифицированными в соответствии со второй ссылочной последовательностью.

В некоторых вариантах осуществления представление первой и второй ссылочных последовательностей существует в электронной форме. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает стадию (Е) коэкспрессии популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок легкой цепи, с нуклеиновой кислотой, кодирующей вариабельный участок тяжелой це

- 42 009746 пи, таким образом, чтобы создать разнообразную популяцию измененных гетеромерных вариабельных участков. В некоторых вариантах осуществления синтез включает химический синтез. В некоторых вариантах осуществления акцептор является человеком. В некоторых вариантах осуществления обработка на стадии Ό) включает удлинение с помощью полимеразы.

В других вариантах осуществления рассматривается способ конструирования популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок тяжелой цепи, который предусматривает: а) обеспечение представления первой и второй ссылочных последовательностей аминокислот, причем первая ссылочная последовательность включает последовательность вариабельного участка тяжелой цепи донора, вариабельный участок донора, который включает ί) каркасные области и ίί) три определяющих комлементарность участка, вторая ссылочная последовательность включает вариабельный участок тяжелой цепи; Ь) синтез популяции генных последовательностей антитела с измененным вариабельным участком тяжелой цепи, где каркасные области измененных вариабельных участков тяжелой цепи являются идентичными каркасным участкам второй ссылочной последовательности и по меньшей мере первый СИЯ измененных вариабельных участков антитела был модифицирован, где модифицированный первый СИЯ включает различные аминокислоты в одном или нескольких положениях в сравнении с соответствующим донором СИЯ первой ссылочной последовательности.

В некоторых вариантах осуществления представление первой и второй ссылочных последовательностей существует в электронной форме. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает стадию (Е) коэкспрессии популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок тяжелой цепи, с нуклеиновой кислотой, кодирующей вариабельный участок легкой цепи, таким образом, чтобы создать разнообразную популяцию измененных гетеромерных вариабельных участков. В некоторых вариантах осуществления акцептор является человеком. В некоторых вариантах осуществления синтез включает использование перекрывающихся олигонуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления СИЯ определены согласно определению КаЬаР.

В некоторых вариантах осуществления рассматривается способ конструирования популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок легкой цепи, который предусматривает: а) обеспечение представления первой и второй ссылочных последовательностей аминокислот, причем первая ссылочная последовательность включает последовательность вариабельного участка легкой цепи донора, вариабельный участок донора, который включает ί) каркасные области и ίί) три определяющих комлементарность участка; вторая ссылочная последовательность включает последовательность вариабельного участка легкой цепи акцептора, который включает каркасные участки; Ь) синтез популяции генных последовательностей измененного вариабельного участка легкой цепи антитела, где каркасные области измененных вариабельных участков легкой цепи являются идентичными каркасным участкам второй ссылочной последовательности и по меньшей мере первый СИЯ измененного вариабельного участка легкой цепи антитела был модифицирован, где модифицированный первый СИЯ включает различные аминокислоты в одном или нескольких положениях в сравнении с соответствующим донором СИЯ первой ссылочной последовательности.

В некоторых вариантах осуществления представление первой и второй ссылочных последовательностей существует в электронной форме. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает стадию (Е) коэкспрессии популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок легкой цепи, с нуклеиновой кислотой, кодирующей вариабельный участок тяжелой цепи, таким образом, чтобы создать разнообразную популяцию измененных гетеромерных вариабельных участков. В некоторых вариантах осуществления акцептор является человеком. В некоторых вариантах осуществления синтез включает использование перекрывающихся олигонуклеотидов.

В других вариантах осуществления рассматривается способ конструирования популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок тяжелой цепи, которые предусматривают: а) обеспечение представления ссылочной аминокислотной последовательности, ссылочная последовательность включает последовательность вариабельного участка тяжелой цепи акцептора, который включает каркасные участки; Ь) синтез популяции генных последовательностей антитела с измененным вариабельным участком тяжелой цепи, где каркасные области измененных вариабельных участков тяжелой цепи являются идентичными каркасным участкам ссылочной последовательности и по меньшей мере первый СИЯ измененных вариабельных участков антитела включает случайную аминокислотную последовательность.

В некоторых вариантах осуществления представление ссылочной последовательности существует в электронной форме. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает стадию (Е) коэкспрессии популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок тяжелой цепи, с нуклеиновой кислотой, кодирующей вариабельный участок легкой цепи, таким образом, чтобы создать разнообразную популяцию измененных гетеромерных вариабельных участков. В некоторых вариантах осуществления акцептор является человеком. В некоторых вариантах осуществления синтез включает использование перекрывающихся олигонуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления СИЯ определены согласно определению КаЬаР.

В других вариантах осуществления рассматривается способ конструирования популяции нуклеино

- 43 009746 вых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок легкой цепи, который предусматривает: а) обеспечение представления ссылочной аминокислотной последовательности, ссылочная последовательность включает последовательность вариабельного участка легкой цепи акцептора, который включает каркасные участки; Ь) синтез популяции генных последовательностей измененного вариабельного участка легкой цепи антитела, где каркасные области измененных вариабельных участков легкой цепи являются идентичными каркасным участкам ссылочной последовательности и по меньшей мере первый СОЯ измененного вариабельного участка легкой цепи антитела включает случайную аминокислотную последовательность.

В некоторых вариантах осуществления представление ссылочной последовательности существует в электронной форме. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает стадию (Е) коэкспрессии популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок легкой цепи, с нуклеиновой кислотой, кодирующей вариабельный участок тяжелой цепи, таким образом, чтобы создать разнообразную популяцию измененных гетеромерных вариабельных участков. В некоторых вариантах осуществления акцептор является человеком. В некоторых вариантах осуществления синтез включает использование перекрывающихся олигонуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления СОЯ определены согласно определению КаЬа1.

В других вариантах осуществления рассматривается способ конструирования популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок тяжелой цепи, которые предусматривают: а) обеспечение представления ссылочной аминокислотной последовательности, причем ссылочная последовательность включает человеческую последовательность вариабельного участка тяжелой цепи акцептора, который включает каркасные участки; Ь) синтез популяции генных последовательностей антитела с измененным вариабельным участком тяжелой цепи, где каркасные области измененных вариабельных участков тяжелой цепи являются идентичными каркасным участкам ссылочной человеческой последовательности и по меньшей мере первый СОЯ измененных вариабельных участков антитела включает случайную аминокислотную последовательность. В некоторых вариантах осуществления представление ссылочной человеческой последовательности существует в электронной форме. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает стадию (Е) коэкспрессии популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок тяжелой цепи, с нуклеиновой кислотой, кодирующей вариабельный участок легкой цепи, таким образом, чтобы создать разнообразную популяцию измененных гетеромерных вариабельных участков. В некоторых вариантах осуществления синтез включает использование перекрывающихся олигонуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления СОЯ определены согласно определению КаЬа1.

В других вариантах осуществления рассматривается способ конструирования популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок легкой цепи, который предусматривает: а) обеспечение представления ссылочной аминокислотной последовательности, ссылочная последовательность включает человеческую последовательность вариабельного участка легкой цепи акцептора, который включает каркасные участки; Ь) синтез популяции генных последовательностей измененного вариабельного участка легкой цепи антитела, где каркасные области измененных вариабельных участков легкой цепи являются идентичными каркасным участкам ссылочной человеческой последовательности и по меньшей мере первый СОЯ измененного вариабельного участка легкой цепи антитела включает случайную аминокислотную последовательность.

В некоторых вариантах осуществления представление ссылочной последовательности существует в электронной форме. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает стадию (Е) коэкспрессии популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок легкой цепи, с нуклеиновой кислотой, кодирующей вариабельный участок тяжелой цепи, таким образом, чтобы создать разнообразную популяцию измененных гетеромерных вариабельных участков. В некоторых вариантах осуществления синтез включает использование перекрывающихся олигонуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления СОЯ определены согласно определению КаЬа1.

В некоторых вариантах осуществления одна или несколько каркасных областей модифицированы одновременно с введением одного или нескольких модифицированных СОЯ. В других вариантах осуществления модифицированные каркасы являются смежными с модифицированными СОЯ.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам конструирования популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок тяжелой цепи, которые предусматривают: а) обеспечение представления первой и второй ссылочных последовательностей аминокислот, причем первая ссылочная последовательность включает последовательность вариабельного участка тяжелой цепи донора, вариабельный участок донора включает ί) каркасные области и ίί) три определяющих комлементарность участка, как определено согласно комбинированным определениям КаЬа! и С1ю11иа; причем вторая ссылочная аминокислотная последовательность включает последовательность вариабельного участка тяжелой цепи акцептора, который включает каркасные участки; Ь) синтез а) первой популяции олигонуклеотидов, которая включает олигонуклеотиды, кодирующие каркасный участок модифицированного вариабельного участка тяжелой цепи или его часть, где вариабельный участок тяжелой цепи, каркасный участок или его часть, содержит множество измененных амино

- 44 009746 кислот в одном или нескольких положениях в сравнении с ссылочной последовательностью каркасного участка акцептора, где положения каркаса, которые были изменены, выбраны среди положений каркаса акцептора второй ссылочной последовательности, которая отличается в соответствующих положениях в сравнении с положениями каркаса донора первой ссылочной последовательности; и Ь) второй популяции олигонуклеотидов, каждый из которых кодирует ί) по меньшей мере один модифицированный определяющий комплементарность участок или его часть, где модифицированный участок, определяющий комплементарность или его часть, включает различные аминокислоты в одном или нескольких положениях в сравнении с соответствующей ссылочной последовательностью аминокислот определяющего комплементарность участка донора и ίί) одну или несколько частей смежных каркасных участков, которые способны гибридизоваться с первой популяцией олигонуклеотидов; и с) смешивание первой и второй популяции олигонуклеотидов таким образом, чтобы создать перекрывающиеся олигонуклеотиды; и б) обработку перекрывающихся олигонуклеотидов при таких условиях, что создается популяция нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок тяжелой цепи. В определенных вариантах осуществления представление первой и второй ссылочных последовательностей существует в электронной форме. В других вариантах осуществления способы дополнительно включают стадию (е) коэкспрессии популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок тяжелой цепи, с нуклеиновой кислотой, кодирующей вариабельный участок легкой цепи, таким образом, чтобы создать разнообразную популяцию измененных гетеромерных вариабельных участков. В дополнительных вариантах осуществления синтез включает химический синтез. В некоторых вариантах осуществления акцептор является человеком. В предпочтительных вариантах осуществления одна или несколько различных популяций измененных гетеромерных вариабельных участков представляют собой часть антитела, которая включает участок Рс, где участок Рс включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в сравнении с исходным полипептидом, содержащим участок Рс.

В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам конструирования популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок легкой цепи, который предусматривает: а) обеспечение представления первой и второй ссылочных последовательностей аминокислот, причем первая ссылочная аминокислотная последовательность включает последовательность вариабельного участка легкой цепи донора, вариабельный участок донора включает ί) каркасные области и ίί) три определяющих комлементарность участка, как определено согласно комбинированным определениям КаЬа! и С1ю11иа; вторая ссылочная аминокислотная последовательность включает последовательность вариабельного участка легкой цепи акцептора, который включает каркасные участки; Ь) синтез а) первой популяции олигонуклеотидов, которая включает олигонуклеотиды, кодирующие модифицированный каркасный участок вариабельного участка легкой цепи или его часть, где вариабельный участок легкой цепи, каркасный участок или его часть, содержит множество измененных аминокислот в одном или нескольких положениях в сравнении с ссылочной последовательностью каркасного участка акцептора, где положения каркаса, которые были изменены, выбраны среди положений каркаса акцептора второй ссылочной последовательности, которая отличается в соответствующих положениях в сравнении с положениями каркаса донора первой ссылочной последовательности и Ь) второй популяции олигонуклеотидов, каждый из которых кодирует ί) по меньшей мере один модифицированный определяющий комплементарность участок или его часть, где модифицированный участок, определяющий комплементарность или его часть, включает различные аминокислоты в одном или нескольких положениях в сравнении с соответствующей ссылочной последовательностью аминокислот определяющего комплементарность участка донора и ίί) одну или несколько частей смежных каркасных участков, которые способны гибридизоваться с первой популяцией олигонуклеотидов; и с) смешивание первой и второй популяции олигонуклеотидов таким образом, чтобы создать перекрывающиеся олигонуклеотиды; и б) обработку перекрывающихся олигонуклеотидов при таких условиях, что конструируется популяция нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок легкой цепи. В других вариантах осуществления представление первой и второй ссылочных последовательностей существует в электронной форме. В дополнительных вариантах осуществления способы дополнительно включают стадию (е) коэкспрессии популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок легкой цепи, с нуклеиновой кислотой, кодирующей вариабельный участок тяжелой цепи, таким образом, чтобы создать разнообразную популяцию измененных гетеромерных вариабельных участков.

В некоторых вариантах осуществления способы предусматривают а) обеспечение представления первой и второй ссылочных последовательностей аминокислот, причем первая ссылочная аминокислотная последовательность включает последовательность вариабельного участка тяжелой цепи донора, вариабельный участок донора включает ί) каркасные области и ίί) три определяющих комлементарность участка, как определено согласно комбинированным определениям КаЬа! и С1ю11иа; вторая ссылочная аминокислотная последовательность включает последовательность вариабельного участка тяжелой цепи акцептора, который включает каркасные участки; Ь) синтез а) первой популяции олигонуклеотидов, которая включает олигонуклеотиды, кодирующие каркасный участок модифицированного вариабельного участка тяжелой цепи или его часть, где вариабельный участок тяжелой цепи, каркасный участок или его часть, содержит множество измененных аминокислот в одном или нескольких положениях в сравнении с

- 45 009746 ссылочной последовательностью каркасного участка акцептора, где положения каркаса, которые были изменены, выбраны из положений каркаса акцептора второй ссылочной последовательности, которая отличается в соответствующих положениях в сравнении с положениями каркаса донора первой ссылочной последовательности; и Ь) второй популяции олигонуклеотидов, каждый из которых кодирует 1) по меньшей мере один модифицированный определяющий комплементарность участок или его часть, где модифицированный участок, определяющий комплементарность или его часть, включает различные аминокислоты в одном или нескольких положениях в сравнении с соответствующей ссылочной последовательностью аминокислот определяющего комплементарность участка донора и и) одну или несколько частей смежных каркасных участков, которые способны гибридизоваться с первой популяцией олигонуклеотидов; и с) смешивание первой и второй популяции олигонуклеотидов таким образом, чтобы создать перекрывающиеся олигонуклеотиды; и й) удлинение перекрывания олигонуклеотидов с помощью ДНК полимеразы при таких условиях, что создается популяция нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок тяжелой цепи.

В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам конструирования популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок легкой цепи, которые предусматривают: а) обеспечение представления первой и второй ссылочных последовательностей аминокислот, причем первая ссылочная последовательность включает последовательность вариабельного участка легкой цепи донора, вариабельный участок донора, который включает 1) каркасные области и и) три определяющих комлементарность участка, как определено согласно комбинированным определениям КаЬа! и СЬо!Ыа; вторая ссылочная аминокислотная последовательность включает последовательность вариабельного участка легкой цепи акцептора, который включает каркасные участки; Ь) синтез а) первой популяции олигонуклеотидов, которая включает олигонуклеотиды, кодирующие модифицированный каркасный участок вариабельного участка легкой цепи или его часть, где вариабельный участок легкой цепи каркасный участок или его часть содержит множество измененных аминокислот в одном или нескольких положениях в сравнении с ссылочной последовательностью каркасного участка акцептора, где положения каркаса, которые были изменены, выбраны среди положений каркаса акцептора второй ссылочной последовательности, которая отличается в соответствующих положениях в сравнении с положениями каркаса донора первой ссылочной последовательности; и Ь) второй популяции олигонуклеотидов, каждый из которых кодирует 1) по меньшей мере один модифицированный определяющий комплементарность участок или его часть, где модифицированный участок, определяющий комплементарность или его часть, включает различные аминокислоты в одном или нескольких положениях в сравнении с соответствующей ссылочной последовательностью аминокислот определяющего комплементарность участка донора и ίί) одну или несколько частей смежных каркасных участков, которые способны гибридизоваться с первой популяцией олигонуклеотидов; и с) смешивание первой и второй популяции олигонуклеотидов таким образом, чтобы создать перекрывающиеся олигонуклеотиды; и й) удлинение перекрывания олигонуклеотидов с помощью ДНК полимеразы при таких условиях, что конструируется популяция нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок легкой цепи.

В некоторых вариантах осуществления одну или несколько модификаций вводят в каркас, одновременно с введением одного или нескольких модифицированных СОЯ. Модифицированный СОЯ может включать одно или несколько изменений аминокислот в сравнении с соответствующей ссылочной последовательностью СОЯ. В определенных вариантах осуществления способы конструирования популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок тяжелой цепи, включают: а) обеспечение представления первой и второй ссылочных последовательностей аминокислот, причем первая ссылочная аминокислотная последовательность включает последовательность вариабельного участка тяжелой цепи донора, вариабельный участок донора включает 1) каркасные области и и) три определяющих комлементарность участка, как определено согласно комбинированным определениям КаЬа! и С1ю11иа; вторая ссылочная аминокислотная последовательность включает последовательность вариабельного участка тяжелой цепи акцептора, который включает каркасные участки; Ь) синтез 1) первой популяции олигонуклеотидов, каждый из которых кодирует по меньшей мере один модифицированный определяющий комплементарность участок, где модифицированный участок, определяющий комплементарность, включает различные аминокислоты в одном или нескольких положениях в сравнении с соответствующей ссылочной последовательностью аминокислот определяющего комплементарность участка донора; и и) второй популяции олигонуклеотидов, который включает олигонуклеотиды, кодирующие модифицированную часть вариабельного участка тяжелой цепи каркаса, модифицированная часть содержит множество измененных аминокислот в одном или нескольких положениях в сравнении с ссылочной последовательностью каркасного участка акцептора, где положения каркаса, которые были изменены, выбраны среди положений каркаса акцептора второй ссылочной последовательности, которая отличается в соответствующих положениях в сравнении с положениями каркаса донора первой ссылочной последовательности; с) смешивание первой и второй популяции олигонуклеотидов при таких условиях, что по меньшей мере часть олигонуклеотидов гибридизуются таким образом, чтобы создать перекрывающиеся олигонуклеотиды; и й) обработку перекрывающихся олигонуклеотидов при таких условиях, что создается популяция нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок тяжелой

- 46 009746 цепи. В определенных вариантах осуществления представление первой и второй ссылочных последовательностей существует в электронной форме. В дальнейших вариантах осуществления способы дополнительно предусматривают стадию (е) коэкспрессии популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок тяжелой цепи, с нуклеиновой кислотой, кодирующей вариабельный участок легкой цепи, таким образом, чтобы создать разнообразную популяцию измененных гетеромерных вариабельных участков. В других вариантах осуществления акцептор является человеком.

В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам конструирования популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок легкой цепи, которые предусматривают: а) обеспечение представления первой и второй ссылочных последовательностей аминокислот, причем первая ссылочная аминокислотная последовательность включает последовательность вариабельного участка легкой цепи донора, вариабельный участок донора включает ί) каркасные области и ίί) три определяющих комлементарность участка, как определено согласно комбинированным определениям КаЬа! и С1ю11иа; вторая ссылочная аминокислотная последовательность включает последовательность вариабельного участка легкой цепи акцептора, который включает каркасные участки; Ь) синтез ί) первой популяции олигонуклеотидов, каждый из которых кодирует по меньшей мере один модифицированный определяющий комплементарность участок, где модифицированный участок, определяющий комплементарность, включает различные аминокислоты в одном или нескольких положениях в сравнении с соответствующей ссылочной последовательностью аминокислот определяющего комплементарность участка донора; и ίί) второй популяции олигонуклеотидов, который включает олигонуклеотиды, кодирующие модифицированные части вариабельного участка легкой цепи каркаса, модифицированная часть содержит множество измененных аминокислот в одном или нескольких положениях в сравнении с ссылочной последовательностью каркасного участка акцептора, где положения каркаса, которые были изменены, выбраны среди положений каркаса акцептора второй ссылочной последовательности, которая отличается в соответствующих положениях в сравнении с положениями каркаса донора первой ссылочной последовательности; с) смешивание первой и второй популяции олигонуклеотидов при таких условиях, что по меньшей мере часть олигонуклеотидов гибридизуются таким образом, чтобы создать перекрывающиеся олигонуклеотиды; и й) обработку перекрывающихся олигонуклеотидов при таких условиях, что конструируется популяция нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок легкой цепи.

В определенных вариантах осуществления могут быть созданы антитела или фрагменты антител, которые включают вариант Рс и вариант участка измененной тяжелой цепи. Например, в некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам конструирования популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок тяжелой цепи, которые предусматривают: а) обеспечение представления первой и второй ссылочных последовательностей аминокислот, причем первая ссылочная последовательность включает последовательность вариабельного участка тяжелой цепи донора, вариабельный участок донора включает ί) каркасные области и ίί) три определяющих комлементарность участка, как определено согласно комбинированным определениям КаЬа! и С1ю11на; вторая ссылочная последовательность включает последовательность вариабельного участка тяжелой цепи акцептора, который включает каркасные участки; Ь) синтез А) первых олигонуклеотидов, кодирующих части каркасных областей вариабельного участка тяжелой цепи акцептора, где последовательность части каркасных областей при сравнении со второй ссылочной последовательностью является немодифицированной; и В) популяцию вторых олигонуклеотидов, каждый из которых кодирует ί) по меньшей мере часть первого определяющего комплементарность участка, который был модифицирован, первый определяющий комплементарность участок выбран из группы, которая состоит из НСПК1, НСЭК2 и НСОКЗ, где модифицированный первый определяющий комплементарность участок включает различные аминокислоты в одном или нескольких положениях в сравнении с соответствующими определяющими комплементарность участками донора первой ссылочной последовательности и ίί) одну или несколько частей немодифицированного каркасного участка, которые способны гибридизоваться с первыми олигонуклеотидами; с) смешивание первых олигонуклеотидов с популяцией вторых олигонуклеотидов для создания перекрывающихся олигонуклеотидов; и й) обработку перекрывающихся олигонуклеотидов при таких условиях, что создается популяция нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок тяжелой цепи, где каркасные области, которые кодируются измененным вариабельным участком тяжелой цепи кодирующей нуклеиновой кислоты, являются немодифицированными в соответствии со второй ссылочной последовательностью. В некоторых вариантах осуществления способы дополнительно включают стадию (Е) коэкспрессии популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок тяжелой цепи, с нуклеиновой кислотой, кодирующей вариабельный участок легкой цепи, таким образом, чтобы создать разнообразную популяцию измененных гетеромерных вариабельных участков.

В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам конструирования популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок легкой цепи, которые предусматривают: а) обеспечение представления первой и второй ссылочных последовательностей аминокислот, причем первая ссылочная последовательность включает последовательность вариабельного

- 47 009746 участка легкой цепи донора, вариабельный участок донора включает 1) каркасные области и ίί) три определяющих комлементарность участка, как определено согласно комбинированным определениям КаЬа! и С1ю11на; вторая ссылочная последовательность включает последовательность вариабельного участка легкой цепи акцептора, который включает каркасные участки; Ь) синтез а) первых олигонуклеотидов, кодирующих части каркасных областей вариабельного участка легкой цепи акцептора, где последовательность части каркасных областей при сравнении со второй ссылочной последовательностью является немодифицированной; и Ь) популяции вторых олигонуклеотидов, каждый из которых кодирует 1) по меньшей мере часть первого определяющего комплементарность участка, который был модифицирован, первый определяющий комплементарность участок выбран из группы, которая состоит из ЬСОКТ, ЬСОК2 и ЬСОКЗ, где модифицированный первый определяющий комплементарность участок включает различные аминокислоты в одном или нескольких положениях в сравнении с соответствующими определяющими комплементарность участками донора первой ссылочной последовательности и ίί) одну или несколько частей немодифицированного каркасного участка, которые способны гибридизоваться с первыми олигонуклеотидами; с) смешивание первых олигонуклеотидов с популяцией вторых олигонуклеотидов для создания перекрывающихся олигонуклеотидов; и ά) обработку перекрывающихся олигонуклеотидов при таких условиях, что конструируется популяция нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок легкой цепи, где каркасные области, которые кодируются нуклеиновыми кислотами, кодирующими измененный вариабельный участок легкой цепи, являются немодифицированными в соответствии со второй ссылочной последовательностью.

В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам конструирования популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок тяжелой цепи, которые предусматривают: А) обеспечение представления первой и второй ссылочных последовательностей аминокислот, причем первая ссылочная аминокислотная последовательность включает последовательность вариабельного участка тяжелой цепи донора, вариабельный участок донора включает ί) каркасные области и ίί) три определяющих комлементарность участка, как определено согласно комбинированным определениям КаЬа1 и С1ю11на; вторая ссылочная последовательность включает последовательность вариабельного участка тяжелой цепи акцептора, который включает каркасные участки; В) синтез а) популяции первых олигонуклеотидов, каждый из которых кодирует по меньшей мере часть первого определяющего комплементарность участка, выбранного из группы, которая состоит из НСЭК.1, НСЭР2 и НСЭРЗ. где модифицированный первый определяющий комплементарность участок включает различные аминокислоты в одном или нескольких положениях в сравнении с соответствующими определяющими комплементарность участками донора первой ссылочной последовательности; и Ь) вторых олигонуклеотидов, кодирующих ί) части каркасных областей вариабельного участка тяжелой цепи акцептора, где части каркасных областей при сравнении с ссылочной последовательностью являются немодифицированными и ίί) одну или несколько частей определяющего комплементарность участка, которые способны гибридизоваться с популяцией первых олигонуклеотидов; С) смешивание популяции первых олигонуклеотидов со вторыми олигонуклеотидами, чтобы создать перекрывающиеся олигонуклеотиды; и Ό) обработку перекрывающихся олигонуклеотидов при таких условиях, что создается популяция нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок тяжелой цепи, где каркасные области, которые кодируются измененным вариабельным участком тяжелой цепи кодирующей нуклеиновой кислоты, являются немодифицированными в соответствии со второй ссылочной последовательностью. В определенных вариантах осуществления способы дополнительно включают стадию (Е) коэкспрессии популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок тяжелой цепи, с нуклеиновой кислотой, кодирующей вариабельный участок легкой цепи, таким образом, чтобы создать разнообразную популяцию измененных гетеромерных вариабельных участков.

В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам конструирования популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок легкой цепи, которые предусматривают: А) обеспечение представления первой и второй ссылочных последовательностей аминокислот, причем первая ссылочная последовательность включает последовательность вариабельного участка легкой цепи донора, вариабельный участок донора включает ί) каркасные области и ίί) три определяющих комлементарность участка, как определено согласно комбинированным определениям КаЬа1 и С1ю11на; вторая ссылочная последовательность включает последовательность вариабельного участка легкой цепи акцептора, который включает каркасные участки; В) синтез а) популяции первых олигонуклеотидов, каждый из которых кодирует по меньшей мере часть первого определяющего комплементарность участка, выбранного из группы, которая состоит из ЬСЭК!, ЬСОК2 и ЬСОКЗ, где модифицированный первый определяющий комплементарность участок включает различные аминокислоты в одном или нескольких положениях в сравнении с соответствующими определяющими комплементарность участками донора первой ссылочной последовательности; и Ь) вторых олигонуклеотидов, кодирующих ί) части каркасных областей вариабельного участка легкой цепи акцептора, где части каркасных областей при сравнении с ссылочной последовательностью являются немодифицированными и ίί) одну или несколько частей определяющего комплементарность участка, которые способны гибридизоваться с популяцией первых олигонуклеотидов; С) смешивание популяции первых олигонуклеотидов со вторыми олигонуклео

- 48 009746 тидами, чтобы создать перекрывающиеся олигонуклеотиды; и Ό) обработку перекрывающихся олигонуклеотидов при таких условиях, что конструируется популяция нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок легкой цепи, где каркасные области, которые кодируются нуклеиновыми кислотами, кодирующими измененный вариабельный участок легкой цепи, являются немодифицированными в соответствии со второй ссылочной последовательностью.

В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам улучшения связывающей активности вариабельного участка мутированного гуманизированного антитела, которые предусматривают: а) обеспечение последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей первый вариабельный участок мутантного гуманизированного антитела, мутантный вариабельный участок включает (ί) каркас антитела человека дикого типа, (ίί) три отличных от человеческих определяющих комплементарность участка тяжелой цепи и (ίίί) три отличных от человеческих определяющих комплементарность участка легкой цепи, где определяющие комплементарность участки определяются согласно комбинированным определениям КаЬа! и Сйо1Ыа, где по меньшей мере один определяющий комплементарность участок представляет собой содержащий мутацию определяющий комплементарность участок легкой цепи, который включает по меньшей мере одну отличную аминокислоту по меньшей мере в одном положении в сравнении с соответствующим отличным от человеческого определяющим комплементарность участком дикого типа, и где первый вариабельный участок мутантного антитела обладает более высокой связывающей активностью, чем соответствующий вариабельный участок немутантного антитела; Ь) мутацию последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей первый вариабельный участок мутантного антитела при таких условиях, что кодируется второй вариабельный участок мутантного гуманизированного антитела, второй вариабельный участок мутантного гуманизированного антитела, который включает по меньшей мере одну дополнительную отличную аминокислоту по меньшей мере в одном положении в определяющем комплементарность участке легкой цепи, содержащей мутацию, дополнительная мутация в сочетании с первой мутацией приводит к более высокой связывающей активности. В некоторых вариантах осуществления определяющий комплементарность участок содержащей мутацию легкой цепи первого вариабельного участка мутантного гуманизированного антитела представляет собой определяющий комплементарность участок 3 (ЬСИК3). В других вариантах осуществления по меньшей мере один из определяющих комплементарность участков отличной от человеческой тяжелой цепи первого мутантного вариабельного участка гуманизированного антитела включает мутацию, таким образом, другая аминокислота кодируется по меньшей мере в одном положении в сравнении с соответствующим отличным от человеческого определяющим комплементарность участком дикого типа. В дополнительных вариантах осуществления мутация определяющего коплементарность участка находится в НСИК3.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам одновременной модификации по меньшей мере одного определяющего комплементарность участка (СЭК) и по меньшей мере одной каркасной области (ЕК) при конструировании популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок тяжелой цепи, которые предусматривают: а) обеспечение представления первой и второй ссылочных последовательностей аминокислот, причем первая ссылочная аминокислотная последовательность включает последовательность вариабельного участка тяжелой цепи донора, вариабельный участок донора включает 1) четыре каркасных области и ίί) три определяющих комлементарность участка, как определено согласно комбинированным определениям КаЬа! и С1ю11иа; вторая ссылочная аминокислотная последовательность включает последовательность вариабельного участка тяжелой цепи акцептора, который включает четыре каркасных области, как определено согласно комбинированным определениям КаЬа! и С1то11иа; Ь) синтез ί) для каждой каркасной области, которая подлежит модификации, популяцию олигонуклеотидов, каждый из которых кодирует модифицированный каркасный участок или его часть, содержащую множество измененных аминокислот в одном или нескольких положениях в сравнении с соответствующей каркасной областью в ссылочной последовательности вариабельного участка тяжелой цепи акцептора, где положения каркасного участка, которые изменены, выбраны среди положений каркаса акцептора второй ссылочной последовательности, которая отличается в соответствующих положениях в сравнении с положениями каркасной области донора первой ссылочной последовательности; и ίί) для каждого определяющего комплементарность участка, который должен быть модифицирован, популяцию олигонуклеотидов, каждый из которых кодирует модифицированный определяющий комплементарность участок или его часть, где модифицированный участок, определяющий комплементарность, включает различные аминокислоты в одном или нескольких положениях в сравнении с соответствующей ссылочной последовательностью аминокислот определяющего комплементарность участка донора; и ίίί) для каждой из любых оставшихся и немодифицированных каркасных областей, олигонуклеотиды, кодирующие каркасный участок или его часть, с такой же последовательностью, как и соответствующая каркасная область второй ссылочной последовательности акцептора; и ίν) для каждого из любых оставшихся и немодифицированных определяющих комплементарность участков, олигонуклеотиды, кодирующие определяющий комплементарность участок или его часть, с такой же последовательностью, как соответствующий определяющий комплементарность участок первой ссылочной последовательности донора, где отдельные олигонуклеотиды от (ί) до (ίν), кото

- 49 009746 рые кодируют смежные участки вариабельного участка тяжелой цепи, содержат перекрывание последовательности на концах; и с) смешивание олигонуклеотидов и популяций олигонуклеотидов, синтезированных на стадии Ь) при таких условиях, что перекрывающие последовательности отдельных олигонуклеотидов гибридизуются таким образом, чтобы создать перекрывающиеся олигонуклеотиды; и б) обработку перекрывающихся олигонуклеотидов при таких условиях, что популяция нуклеотидов, кодирующих измененный вариабельный участок тяжелой цепи образуется. В определенных вариантах осуществления представление первой и второй ссылочных последовательностей существует в электронной форме. В дополнительных вариантах осуществления каркасная область, подлежащая модификации, выбирается из группы, которая состоит из НЕЕ1, НЕЕ2 и НЕЕ3. В других вариантах осуществления определяющий комплементарность участок, подлежащий модификации, представляет собой НСОЕ3. В других вариантах осуществления способ дополнительно включает стадию е) коэкспрессии популяции нуклеиновых кислот, кодирующих вариабельный участок тяжелой цепи, с нуклеиновой кислотой, кодирующей вариабельный участок легкой цепи, таким образом, чтобы создать разнообразную популяцию измененных гетеромерных вариабельных участков. В различных вариантах осуществления способ дополнительно включает стадию е) коэкспрессии популяции нуклеиновых кислот, кодирующих вариабельный участок тяжелой цепи с популяцией нуклеиновых кислот, кодирующих вариабельный участок легкой цепи, таким образом, чтобы создать разнообразную популяцию измененных гетеромерных вариабельных участков.

В других вариантах осуществления применяются способы одновременной модификации по меньшей мере одного определяющего комплементарность участка (СОЕ) и по меньшей мере одной каркасной области (ЕЕ) при конструировании популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок легкой цепи, где указанный способ включает: а) обеспечение представления первой и второй ссылочных последовательностей аминокислот, причем первая ссылочная последовательность включает последовательность вариабельного участка легкой цепи донора, вариабельный участок донора, который включает ί) четыре каркасных области и ίί) три определяющих комплементарность участка, как определено согласно комбинированным определениям КаЬа! и С1ю11иа; вторая ссылочная аминокислотная последовательность включает последовательность вариабельного участка легкой цепи акцептора, который включает четыре каркасных области, как определено согласно комбинированным определениям КаЬа! и СНобва; Ь) синтез ί) для каждой каркасной области, которая подлежит модификации, популяцию олигонуклеотидов, каждый из которых кодирует модифицированный каркасный участок или его часть, модифицированная каркасная область или ее часть, содержащая множество измененных аминокислот в одном или нескольких положениях в сравнении с соответствующей каркасной областью в ссылочной последовательности вариабельного участка легкой цепи акцептора, где измененные положения каркасного участка выбраны среди положений каркаса акцептора второй ссылочной последовательности, которая отличается в соответствующих положениях в сравнении с положениями каркасной области донора первой ссылочной последовательности; и ίί) для каждого определяющего комплементарность участка, который должен быть модифицирован, популяцию олигонуклеотидов, каждый из которых кодирует модифицированный определяющий комплементарность участок или его часть, где модифицированный участок, определяющий комплементарность, включает различные аминокислоты в одном или нескольких положениях в сравнении с соответствующей ссылочной последовательностью аминокислот определяющего комплементарность участка донора; и ίίί) для каждой из любых оставшихся и немодифицированных каркасных областей, олигонуклеотиды, кодирующие каркасный участок или его часть, с такой же последовательностью, как и соответствующая каркасная область второй ссылочной последовательности акцептора; и ίν) для каждого из любых оставшихся и немодифицированных определяющих комплементарность участков, олигонуклеотиды, кодирующие определяющий комплементарность участок или его часть, с такой же последовательностью, как соответствующий определяющий комплементарность участок первой ссылочной последовательности донора, где отдельные олигонуклеотиды от (ί) до (ίν), которые кодируют смежные участки вариабельного участка легкой цепи, содержат на концах перекрывающиеся последовательности, и с) смешивание олигонуклеотидов и популяций олигонуклеотидов, синтезированных на стадии Ь) при таких условиях, что перекрывающие последовательности отдельных олигонуклеотидов гибридизуются таким образом, чтобы создать перекрывающиеся олигонуклеотиды; и б) обработку перекрывающихся олигонуклеотидов при таких условиях, что популяция нуклеотидов кодирует измененный вариабельный участок легкой цепи. В определенных вариантах осуществления способы дополнительно включают стадию е) коэкспрессии популяции нуклеиновых кислот, кодирующих вариабельный участок легкой цепи с популяцией нуклеиновых кислот, кодирующих вариабельный участок тяжелой цепи, таким образом, чтобы создать разнообразную популяцию измененных гетеромерных вариабельных участков.

(ν) Мультиспецифические антитела

Настоящее изобретение относится к мультиспецифическим антителам, включающим вариант участка Ес. Тогда как мультиспецифические антитела в норме связывают только два антигена (т.е. биспецифические антитела, ВкАЬ), антитела с дополнительной специфичностью, такие как триспецифические антитела, также охватываются данным термином при его использовании. Примеры ВкАЬ включают без

- 50 009746 ограничения антитела с одним плечом, направленным против антигена опухолевой клетки, тогда как другое плечо направлено против молекулы цитотоксического триггера, такие как анти-Есу ЯЕанти-СП^, анти-р185НЕЯ2/ЕсуЯШ (СИ16), анти-СП3/антитело против злокачественной В-клетки (1б10), антиСП3/анти-р185НЕЯ2, анти-СП3/анти-р97, анти-СП3/антитело против почечноклеточной карциномы, анти-СП3/анти-0УСАЯ-3, анти-СП3/Ь-О1 (антитело против карциномы толстого кишечника), антиСО3/антитело против аналога меланоцитостимулирующего гормона, анти-ЕСЕ рецептор/анти-СП3, антиСИ3/анти-САМА1, анти-СО3/анти-СП19, анти-СИ3/МоУ18, антитело против молекулы нейрональной клеточной адгезии ^САМ)/анти-СП3, антитело против фолатсвязывающего белка (ЕВР)/анти-СП3, антитело против ассоциированного с карциномой антигена (АМОС-31)/анти-СО3; ВкАЬ с одним плечом связывается специфично с антигеном опухоли и вторым плечом связывается с токсином, таким как антисапорин/анти-1б-1, анти-СП22/антисапорин, анти-СП7/антисапорин, анти-СП33/антисапорин, антиСЕА/антирицин А цепь, антиинтерферон-альфа (ШЫ-альфа)/против идиотипа гибридомы, антиСЕА/против алкалоид барвинка; В8АЬ для превращения активированных ферментом пролекарств, таких как анти-СО30/против щелочной фосфатазы (которая катализирует превращение пролекарства митомицина фосфата до митомицинового спирта); В8АЬ, которые могут использоваться как фибринолитические агенты, такие как антифибрин/против тканевого активатора плазминогена (РРА), антифибрин/против активатора плазминогена типа урокиназы (иРа); ВкАЬ для направления иммунных комплексов к рецепторам на поверхности клеток, таких как антитело против липопротеина низкой плотности (ЬПЬ)/анти-Ес рецептор (например, ЕсуЯД ЕсуЯН или ЕсуЯШ); ВкАЬ для применения в лечении инфекционных заболеваний, такие как анти-СО3/против вируса простого герпеса (Н8У), против рецептора Т-клеток: 0Ό3 комплекс/против вируса гриппа, анти-ЕсуЯ/анти-ВИЧ; ВкАЬ для обнаружения опухоли ίπ νίίτο или ίπ νίνο, такие как анти-СЕА/анти-Е0ТиВЕ, анти-СЕА/анти-ЭРТА, анти-р185НЕР2/анти-гаптен; ВкАЬ, как адъюванты вакцины; и ВкАЬ, как диагностические инструменты, такие как анти-кроличий ^С/анти-ферритин, против пероксидазы хрена (НЯР)/антигормон, анти-соматостатин/против вещества Р, анти-НЯР/антиПТС анти-СЕА/против р-галактозидазы. Примеры триспецифических антител включают, не ограничиваясь ими, анти-СП3/анти-СП4/анти-СП37, анти-СО3/анти-СО5/анти-СО37 и анти-СО3/анти-СО8/антиΟΌ37. Биспецифические антитела могут быть получены как полноразмерные антитела или фрагменты антител (например, биспефицические антитела Е(аЬ)'2).

Способы получения биспецифических антител известны из уровня техники. Традиционная продукция биспецифических полноразмерных антител основана на коэкспрессии двух пар тяжелой цепи-легкой цепи иммуноглобулина, где две цепи имеют различную специфичность (например, МШкРет еР а1., №Риге, 305: 537-539 (1983), включена в настоящее описание посредством ссылки). Из-за случайной сортировки тяжелых и легких цепей иммуноглобулина эти гибридомы (квадромы) продуцируют потенциальную смесь из 10 различных молекул антител, только одна из которых имеет правильную биспецифическую структуру. Выделение правильной молекулы может быть проведено в соответствии с методом аффинной хроматографии. Подобные методики раскрыты в \У0 93/08829 и в Тгаипескег еР а1., ЕМВ0 Е, 10: 36553659 (1991), каждая из которых включена в настоящее описание посредством ссылки.

В другом подходе вариабельные домены антитела с желаемой специфичностью связывания (сайты сочетания антитело-антиген) используются для последовательностей константных доменов иммуноглобулина. Слияние предпочтительно производится с константным доменом тяжелой цепи иммуноглобулина, который включает по меньшей мере часть шарнира, участки СН2 и СН3. Предпочтительным является включение первого константного участка тяжелой цепи (СН1), содержащей сайт, необходимый для связывания легкой цепи, по меньшей мере в один из гибридов. ДНК, кодирующие гибриды тяжелой цепи иммуноглобулина и, при желании, легкой цепи иммуноглобулина, встроены в отдельные экспрессирующие векторы и котрансфицированы в подходящие организмы-хозяева. Это обеспечивает большую гибкость в коррекции взаимного расположения трех полипептидных фрагментов в вариантах осуществления, когда неравные соотношения трех полипептидных цепей используются в конструировании для обеспечения оптимального выхода. Однако можно встроить последовательности, кодирующие две или все три полипептидные цепи в один экспрессирующий вектор, когда экспрессия по меньшей мере двух полипептидных цепей в равных соотношениях приводит к высоким выходам или когда соотношения не имеют особого значения. В предпочтительном варианте осуществления настоящего подхода биспецифические антитела составлены из гибридной тяжелой цепи иммуноглобулина с первой специфичностью связывания на одном плече и гибридной парой тяжелой цепи-легкой цепи иммуноглобулина (обеспечение второй специфичности связывания) на другом плече (см., например, XV0 94/04690, включена как ссылка). В соответствии с другим подходом, описанным в ν096/27011 (таким образом, включена как ссылка), граница между парой молекул антител может быть сконструирована для максимизации процента гетеродимеров, которые извлекаются из культуры рекомбинантных клеток. Биспецифические антитела также включают сшитые или гетероконъюгированные антитела. Например, одно антитело в гетероконъюгате может быть спарено с авидином, а другое - с биотином.

В. Молекулы иммуноадгезина

Настоящее изобретение также относится к молекулам иммуноадгезина, которые включают вариант

- 51 009746 участка Ес. Один вид конструирования иммуноадгезина сочетает домен связывания адгезина (например, внеклеточный домен (ЕСП) рецептора) с участком Ес тяжелой цепи иммуноглобулина (например, вариант участка Ес). Обычно при получении иммуноадгезинов по настоящему изобретению нуклеиновая кислота, кодирующая домен связывания адгезина, будет использоваться С-концом по отношению к нуклеиновой кислоте, кодирующей Ν-концевую последовательность константного домена иммуноглобулина, однако Ν-концевые слияния также возможны.

Типично, при таком слиянии закодированный химерный полипептид будет сохранять по меньшей мере функционально активный шарнир, домены СН2 и СН3 константного участка тяжелой цепи иммуноглобулина. Слияние также осуществляют с С-концом части константного домена Ес или непосредственно Ν-конца с СН1 тяжелой цепи или соответствующим участком легкой цепи. Выбор сайта, у которого осуществляется слияние, не является критичным; конкретные сайты хорошо известны и могут быть выбраны с целью оптимизации биологической активности, секреции или параметров связывания иммуноадгезина.

В некоторых вариантах осуществления последовательность слита с Ν-концом варианта участка Ес иммуноглобулина С1. Возможно слияние целого константного участка тяжелой цепи с последовательностью адгезина. Однако в предпочтительных вариантах осуществления в слиянии используется последовательность, которая начинается в шарнирном участке непосредственно выше сайта расщепления папаином, который химически определяет Ес 1дС (т.е. остаток 216, принимая первый остаток константного участка тяжелой цепи как 114) или аналогичные сайты других иммуноглобулинов. В определенных предпочтительных вариантах осуществления аминокислотная последовательность аминоадгезина используется для слияния с (а) шарнирным участком и СН2 и СН3 или (Ь) СН1, шарниром, доменами СН2 и СН3 тяжелой цепи 1дС. В некоторых вариантах осуществления иммуноадгезины являются биспецифичными.

Альтернативно, последовательности адгезина могут быть вставлены между последовательностями тяжелой и легкой цепи иммуноглобулина, таким образом, что иммуноглобулин, включает образованную химерную тяжелую цепь. В таких вариантах осуществления последовательность адгезина может использоваться с 3'-концом тяжелой цепи иммуноглобулина в каждом плече иммуноглобулина, между шарниром и доменом СН2 или между доменами СН2 и СН3 (см., например, НоодепЬоот е! а1., Мо1. 1ттипо1. 28:1027-1037 (1991), включена как ссылка).

Хотя присутствие легкой цепи иммуноглобулина не является необходимым в иммуноадгезинах по настоящему изобретению, легкая цепь иммуноглобулина может присутствовать ковалентно связанной с полипептидом слияния адгезина-тяжелой цепи иммуноглобулина или непосредственно использоваться для адгезина. В последнем случае ДНК, кодирующая легкую цепь иммуноглобулина, обычно коэкспрессируется с ДНК, кодирующей белок слияния адгезина - тяжелой цепи иммуноглобулина. В процессе секреции гибридная тяжелая цепь и легкая цепь будут ковалентно связаны для обеспечения иммуноглобулин-подобной структуры, которая включает две пары тяжелой цепи - легкой цепи иммуноглобулина, связанных дисульфидными связями. Способы, подходящие для получения таких структур, раскрыты, например, в патенте США № 4816567, включенном в настоящее описание посредством ссылки.

В предпочтительных вариантах осуществления иммуноадгезины сконструированы с использованием последовательности кДНК, кодирующей часть адгезина с последовательностью кДНК иммуноглобулина. Также может применяться слияние с геномными фрагментами иммуноглобулина. Как правило, последний тип слияния требует присутствия регуляторной последовательности 1д для экспрессии. кДНК, кодирующие константные участки тяжелой цепи 1дС, могут быть выделены на базе опубликованной последовательности из библиотек кДНК, полученных из селезенки или лимфоцитов периферической крови, с помощью гибридизации или полимеризационной цепной реакции (ПЦР). кДНК, кодирующие адгезиновую и иммуноглобулиновую части иммуноадгезина, могут быть встроены в тандеме в плазмидный вектор, который направляет эффективную экспрессию в выбранных клетках-хозяевах.

VI. Нуклеиновые последовательности, кодирующие варианты участка Ес

Настоящее изобретение также относится к последовательностям нуклеиновой кислоты, кодирующим варианты участка Ес, а также композициям, векторам и клеткам-хозяевам, которые включают последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие варианты участка Ес. Настоящее изобретение также относится к рекомбинантным способам создания вариантов участка Ес.

В общем, для создания рекомбинантных вариантов нуклеиновую кислоту, кодирующую вариант, выделяют и встраивают в вектор. Клетки-хозяева могут быть трансфицированы вектором, что позволяет амплификацию последовательности нуклеиновой кислоты и/или получение варианта пептида. Последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие варианты пептида по настоящему изобретению, могут быть выделены и секвенированы с использованием традиционных методик (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, которые способны связываться конкретно с нуклеиновой кислотой, кодирующей вариант). В общем, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая вариант, действующим образом связана с другими элементами, такими как сигнальная последовательность (например, секреторные сигнальные последовательности), источник репликации, по меньшей мере один маркерный ген, энхансер, промотор или терминатор транскрипции. В определенных вариантах осуществления клетки

- 52 009746 хозяева стабильно трансфицированы нуклеиновой кислотой, кодирующей вариант для создания клеточной линии, экспрессирующей конкретный вариант. В предпочтительных вариантах осуществления варианты экспрессируются в клетках СНО, N80, 8р2/0, РЕЯ.С6 или НЕК293. Способы рекомбинирования хорошо известны из уровня техники.

Последовательности нуклеиновых кислот могут быть мутированы таким образом, что могут быть получены варианты участка Ес. Например, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая исходный участок Ес (например, 8ЕЦ ГО N0:32), может быть мутирована таким образом, что по меньшей мере одна аминокислота изменена, если экспрессируется последовательность нуклеиновой кислоты. Кроме того, последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие по меньшей мере часть исходного участка Ес, могут мутировать с образованием аминокислотной последовательности, которая включает по меньшей мере часть варианта участка Ес. Например, 8ЕЦ ГО N0:32 может быть мутирована таким образом, что по меньшей мере одна аминокислотная последовательность образуется (см., например, 8ЕЦ ГО N0:38, 8ΕΟ ГО N0:39, 8ΕΟ ГО N0:40, 8ΕΟ ГО N0:41, 8ΕΟ ГО N0:42, 8ΕΟ ГО N0:43, 8ΕΟ ГО N0:44, 8ΕΟ ГО N0:45, 8ΕΟ ГО N0:46, 8ΕΟ ГО N0:47, 8ΕΟ ГО N0:48, 8ΕΟ ГО N0:49, 8ΕΟ ГО N0:50, 8ΕΟ ГО N0:51, 8ΕΟ ГО N0:52, 8ΕΟ ГО N0:53, 8ΕΟ ГО N0:54, 8ΕΟ ГО N0:55, и 8ΕΟ ГО N0:56).

В определенных вариантах осуществления синтез на базе кодонов используется для создания мутантной последовательности. Примеры синтеза на базе кодонов включают, например, описанные в патентах США №№ 5264563, 5523388 и 5808022, каждый из которых включен в настоящее описание посредством ссылки. Вкратце, синтез на базе кодонов может быть выполнен последовательным взаимодействием мономеров на отдельных подложках с образованием по меньшей мере двух разных наборов. Взаимодействие может быть осуществлено в отдельных реакционных сосудах с последующим смешиванием подложек реакционных сосудов и разделением смешанных подложек на два и более реакционных сосудов с повторением стадий взаимодействия, смешивания и разделения один или несколько раз в реакционных сосудах с конечной стадией смешивания или разделения. Кроме того, олигонуклеотиды могут быть сняты с подложек.

νΙΙ. Терапевтические применения и композиции

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к лекарственным составам, которые включают варианты, раскрытые в настоящем описании. Такие варианты не предназначены для ограничения настоящего изобретения конкретной природой терапевтической композиции. Например, такие композиции могут включать вариант полипептида (или его часть) вместе с физиологически приемлемыми жидкостями, гелями, твердыми носителями, разбавителями, адъювантами и вспомогательными веществами, а также их комбинациями (см., например, ΡαηίηβΙοηΑ Ркагтасеийса1 8с1снсс5 1611 βάίΐίοη, 0§ο1, Α. Εά. (1980), включена в настоящее описание посредством ссылки).

Кроме того, варианты полипептида могут использоваться вместе с другими терапевтическими агентами, включая без ограничения салицилаты, стероиды, иммуносупрессанты, антитела или антибиотики. Конкретные лекарственные средства, которые могут использоваться с вариантами по настоящему изобретению, включают без ограничения следующие соединения: соединения азобензола (патент США № 4312806, включен в настоящее описание посредством ссылки), бензил-замещенные производные родамина (патент США № 5216002, включен в настоящее описание посредством ссылки), соли цинк Ькарнозина (патент США № 5238931, включен в настоящее описание посредством ссылки), 3-фенил-5карбоксипиразолы и изотиазолы (патент США № 5294630, включен в настоящее описание посредством ссылки), ГС-10 (патент США № 5368854, включен в настоящее описание посредством ссылки), хинолиновые ингибиторы синтеза лейкотриена (патент США № 5391555, включен в настоящее описание посредством ссылки), 2'-галоген-2'-дезоксиаденозин (патент США № 5506213, включен в настоящее описание посредством ссылки), соединения фенола и бензамида (патент США № 5552439, включен в настоящее описание посредством ссылки), трибутирин (патент США № 5569680, включен в настоящее описание посредством ссылки), некоторые пептиды (патент США № 5756449, включен в настоящее описание посредством ссылки), омега-3-полиненасыщенные кислоты (патент США № 5792795, включен в настоящее описание посредством ссылки), νΣΑ-4 блокаторы (патент США № 5932214, включен в настоящее описание посредством ссылки), преднизолона метасульфобензоат (патент США № 5834021, включен в настоящее описание посредством ссылки), ингибиторы цитокинов (патент США № 5888969, включен в настоящее описание посредством ссылки) и никотин (патент США № 588 9028, включен в настоящее описание посредством ссылки).

Варианты полипептида могут использоваться вместе со средствами, которые снижают жизнеспособность или пролиферативный потенциал клетки. Средства, которые снижают жизнеспособность или пролиферативный потенциал клетки, могут функционировать множеством способов, включая, например, ингибирование синтеза ДНК, ингибирование деления клетки, индуцирование апоптоза или индуцирование неапоптотической гибели клеток. Конкретные примеры цитотоксических и цитостатических агентов, включают без ограничения: противовирусный белок лаконоса, абрин, рицин и каждую из их А-цепей, доксорубицин, цисплатин, йод-131, иттрий-90, рений-188, висмут-212, таксол, 5-фторурацил, νΡ-16, блеомицин, метотрексат, виндезин, адриамицин, винкристин, винбластин, ОСНи, митомицин, циклофосфамид и некоторые цитокины, такие как фактор некроза опухоли (Т№-а и ТЖ-в). Таким образом, цито

- 53 009746 токсические или цитостатические агенты могут включать, например, радионуклиды, химиотерапевтические средства, белки и лектины.

Терапевтические композиции могут содержать, например, такие обычно применяемые добавки, как связующие агенты, наполнители, носители, консерванты, стабилизирующие агенты, эмульгаторы, буферы и вспомогательные вещества, например манит, лактозу, крахмал, магния стеарат, натрия сахаринат, целлюлозу, магния карбонат и т.п. фармацевтической чистоты. Эти композиции обычно содержат 1-95% активного ингредиента, предпочтительно 2-70% активного ингредиента.

Варианты полипептида по настоящему изобретению можно также смешивать с разбавителями или вспомогательными веществами, которые являются совместимыми и физиологически приемлемыми. Подходящие разбавители и вспомогательные вещества представляют собой, например, воду, физиологический раствор, декстрозу, глицерин и т.п., а также их комбинации. Кроме того, при желании, композиции могут содержать небольшие количества вспомогательных веществ, таких как увлажняющие или эмульгирующие агенты, стабилизирующие или забуферивающие агенты.

В некоторых вариантах осуществления терапевтические композиции по настоящему изобретению приготовлены в виде жидких растворов или суспензий, спреев или твердых форм. Препараты для перорального применения обычно включают такие широко применяемые добавки, как связующие агенты, наполнители, носители, консерванты, стабилизирующие агенты, эмульгаторы, буферы и вспомогательные вещества, например маннит, лактоза, крахмал, магния стеарат, натрия сахаринат, целлюлоза, магния карбонат и т.п. фармацевтической чистоты. Эти композиции принимают форму растворов, суспензий, таблеток, пилюль, капсул, препаратов длительного высвобождения или порошков и обычно содержат 195% активного ингредиента, предпочтительно 2-70%. Один из примеров композиции для перорального применения, полезной для введения терапевтических композиций по настоящему изобретению, описан в патенте США № 5643602 (включен в настоящее описание посредством ссылки).

Дополнительные препараты, применимые для других способов введения, таких как местное применение, включают мази, настойки, кремы, лосьоны, чрескожные пластыри и суппозитории. Для мазей и кремов традиционные связующие вещества, носители и вспомогательные вещества могут включать, например, полиалкенгликоли или триглицериды. Пример способа местного применения описан в патенте США № 5834016 (включен в настоящее описание посредством ссылки). Другие способы липосомальной доставки также могут использоваться (см., например, патенты США №№ 5851548 и 5711964, каждый из которых включен в настоящее описание посредством ссылки).

Препараты также могут содержать больше одного активного соединения, если это необходимо для конкретного показания, которое подлежит лечению, предпочтительно с дополняющей активностью, причем активные соединения не вступают в нежелательные взаимодействия. Такие молекулы могут присутствовать в количествах, которые являются эффективными для достижения поставленной цели.

Также могут быть приготовлены препараты замедленного высвобождения. Подходящие примеры препаратов замедленного высвобождения включают полупроницаемые матрицы твердых гидрофобных полимеров, которые содержат вариант полипептида, причем такие матрицы имеют определенную форму, например, пленки или микрокапсулы. Примеры матриц замедленного высвобождения включают, не ограничиваясь ими, полиэфиры, гидрогели (например, поли(2-гидроксиэтил-метакрилат) или поливиниловый спирт)), полилактиды, сополимеры Ь-глутаминовой кислоты и этил-Ь-глутамата, неперевариваемый этилвинилацетат, перевариваемые сополимеры молочной кислоты/гликолевой кислоты, такие как ΕυΡΚΌΝ ЭЕ РОТ (инъекционные микросферы, состоящие из сополимера молочной кислоты/гликолевой кислоты сополимера и лейпролида ацетата) и поли-Э-(-)-3-гиброксимасляная кислота. Если полимеры, такие как этилвинилацетат и молочная кислота/гликолевая кислота, позволяют высвобождение молекул на протяжении периода 100 дней, то некоторые гидрогели высвобождают белки за более короткие промежутки времени.

Варианты полипептида по настоящему изобретению могут применяться для лечения субъекта. Такое лечение может вводиться субъекту с заболеванием или может вводиться субъекту профилактически (например, субъекту, склонному к заболеванию). Примеры состояний, которые могут поддаваться лечению, включают без ограничения злокачественную опухоль (например, если вариант полипептида связывается с рецептором НЕК2, СЭ20 или фактором роста эндотелия сосудов (УЕОЕ)); аллергические состояния, такие как астма (с анти-1дЕ антителом); и ЬЕЛ-1-опосредованные заболевания (например, если вариант полипептида представляет собой анти-ТЕЛ-1 или анти-1САМ-1 антитело) и т.д.

В предпочтительных вариантах осуществления варианты, применяемые для лечения субъектов, включают антитела или иммуноадгезины. Также в предпочтительных вариантах осуществления заболевания, которые лечат, представляют собой заболевания, которые отвечают на антитело или иммуноадгезин. Примеры заболеваний, которые отвечают на антитело или иммуноадгезин, включают такие заболевания и медицинские состояния, как лимфома (лечится с помощью ΚΙΤυΧΑΝ, анти-СЭ20 антитело), инфекционное заболевание (лечится с помощью 8ΎΜΑΟΙ8, антитело, направленное на Е белок респираторного синцитиального вируса), почечный трансплантат (ΖЕNΑΡΑX, анти-1Ь-2 рецептор антитело), болезнь Крона и ревматоидный артрит (лечится с помощью КЕМ1САЭЕ, анти-Т№ альфа антитело), карцинома молочной железы (лечится с помощью НЕКСЕРТШ, анти-НЕР2 антитело) и рак толстого кишеч

- 54 009746 ника (лечится с помощью ЕПКЕС0Ь0МАВ, анти-17-1А антитело).

В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида с улучшенной А ЭСС активностью (например, вариант Р247Ь или Г332Е) используется в лечении заболеваний или нарушений, где разрушение или выведение ткани или чужеродного микроорганизма является желаемым. Например, вариант может использоваться для лечения злокачественных опухолей; воспалительных заболеваний; инфекций (например, бактериальных, вирусных, грибковых или дрожжевых инфекций); и других состояний (таких как зоб), где удаление ткани является желаемым. В других вариантах осуществления вариант полипептида обладает сниженной активностью АЭСС (например, вариант К32Я или К32К). Такие варианты могут применяться для лечения заболевания или нарушения, где полипептид, содержащий участок Ес, с длительным периодом полувыведения является желаемым, но полипептид предпочтительно не обладает нежелательными эффекторными функциями. Например, полипептид, содержащий участок Ес, может быть антителом против тканевого фактора (ТЕ); анти-ЦЕ антителом; и анти-интегриновым антителом (например, анти-а4в7 антитело). Желательный механизм действия такого полипептида, содержащего участок Ес, может быть блокирован связыванием пары лиганд-рецептор. Более того, полипептид, содержащий Ес участок со сниженной АЭСС активностью, может быть антителом-агонистом.

Варианты полипептида по настоящему изобретению могут вводиться любым пригодным способом, в том числе парентерально, подкожно, местно, внутрибрюшинно, внутрилегочно и интраназально, а также непосредственно в очаг поражения (например, для местного иммуносупрессивного лечения).

Парентеральные инфузии включают внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное или подкожное введение. Кроме того, для введения варианта полипептида может подходить пульсирующая инфузия, конкретно, с уменьшением доз варианта полипептида. Предпочтительно дозы вводятся инъекционным способом, наиболее предпочтительно путем внутривенных или подкожных инъекций, частично в зависимости от того, будет ли введение кратким или хроническим.

Для профилактики или лечения заболевания подходящая схема дозирования варианта полипептида будет зависеть от вида заболевания, которое подлежит лечению, выраженности и протекания заболевания, вводится ли вариант полипептида для профилактических или лечебных целей, предыдущего лечения, анамнеза пациента и ответа на вариант полипептида, а также частоты посещения врача. Вариант полипептида пригоден для введения пациенту однократно или в виде курсового лечения.

Например, в зависимости от вида и выраженности заболевания около 1 мкг/кг до 15 мг/кг (например, 0,120 мг/кг) варианта полипептида составляет начальную дозу-кандидат для введения пациенту в виде одного или нескольких приемов или путем непрерывной инфузии. Типичная дневная доза может варьировать от приблизительно 1 мкг/кг до 100 мг/кг или больше, в зависимости от вышеупомянутых факторов. Для повторного введения в течение нескольких дней или дольше, в зависимости от состояния, лечение продолжают до достаточного уменьшения или устранения симптомов. Прогресс такого лечения легко контролировать с помощью традиционных методик и анализов, которые могут использоваться для коррекции дозы с целью достижения терапевтического эффекта. Терапевтически эффективное количество варианта полипептида для введения представляет собой уровень доз, необходимый пациенту, таким образом, чтобы уменьшить симптомы заболевания, подлежащего лечению. Вариант полипептида необязательно может сочетаться с одним или несколькими агентами, которые в настоящее время используются для профилактики или лечения данного нарушения. Эффективное количество таких агентов зависит от количества варианта полипептида, присутствующего в препарате, вида нарушения или лечения и других факторов, которые обсуждались выше.

VIII. Дополнительные виды применения варианта участка Ес

Варианты и последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие варианты по настоящему изобретению, могут применяться множеством способов. Например, варианты по настоящему изобретению могут применять в анализах скрининга лекарственных средств. Например, соединения-кандидаты могут оцениваться на предмет способности изменять или препятствовать эффекторным функциям Ес путем контакта варианта с соединением-кандидатом и определения связывания соединения-кандидата с вариантом. Вариант может быть иммобилизирован с применением способов, известных из уровня техники, таких как связывание белка С8Т-варианта, слитого с полимерными гранулами, содержащими глутатион. Химерный ген, кодирующий слитый белок С8Т, конструируется путем слияния ДНК, кодирующей интересующий вариант, с ДНК, кодирующей карбоксильный конец С8Т (см., например, 8т1!й е! а1., Сепе 67:31 [1988]). Слитым конструктом затем трансформируют подходящую экспрессирующую систему (например, Е. сой ХА90), в которой экспрессия слитого С8Т белка может быть индуцирована с помощью изопропил-в-Э-тиогалактопиранозида (ГРТС). Индукция с помощью ГРТС должна давать слитый белок как основную составляющую растворимых клеточных белков. Слитые белки могут быть очищены способами, известными специалистам в данной области, включая очистку глутатион-аффинной хроматографией. Связывание соединения-кандидата с вариантом коррелирует со способностью соединения разрушать одну или несколько эффекторных функций.

В другом способе скрининга вариант или выбранный ЕсЯ иммобилизируют с использованием способов, известных из уровня техники, таких как адсорбция на пластиковом планшете для микротитрова

- 55 009746 ния или специфического связывания белка слияния С8Т с полимерными гранулами, содержащими глутатион. Например, вариант С8Т связывают с глутатион-сефарозными гранулами. Иммобилизированный вариант затем контактирует с рецептором Рс и соединением-кандидатом. Далее несвязанный пептид удаляют и комплекс солюбилизируют и анализируют для определения количества связанного меченого пептида. Уменьшение связывания является показателем того, что соединение-кандидат ингибирует взаимодействие варианта с рецептором Рс. Этот способ скрининга является особенно применимым при использовании вариантов по настоящему изобретению, которые демонстрируют повышенный уровень связывания с рецептором Рс (например, поскольку многие исходные рецепторы Рс представляют собой рецепторы с низким сродством, такие как РсуКШ, РсуКПЬ и РсуКНа). Вариация данного способа позволяет скрининг соединений, которые способны разрушать предварительно образованный комплекс вариант/рецептор Рс. Например, в некоторых вариантах осуществления комплекс, включающий вариант, связанный с рецептором Рс, иммобилизируют, как описано выше, и приводят в контакт с соединениемкандидатом. Растворение комплекса соединением-кандидатом коррелирует со способностью соединения разрушать или ингибировать взаимодействие между исследуемым вариантом и рецептором Рс. С этой точки зрения соединения с терапевтическим потенциалом (например, у людей) могут быть идентифицированы (например, соединения, полезные для лечения заболеваний у человека, таких как аутоиммунные заболевания).

Другая техника скрининга обеспечивает высокопроизводительный скрининг для соединений, обладающих подходящей связывающей способностью с вариантами пептида, и подробно описана в XVО 84/03564, включена как ссылка. Вкратце, большое количество различных исследуемых пептидных соединений небольшого размера синтезируется на твердом субстрате, таком как пластиковые иглы или другая поверхность. Исследуемые пептидные соединения затем вводят в реакцию с вариантами пептида и промывают. Далее связанные варианты пептида обнаруживают с помощью способов, хорошо известных из уровня техники.

В другой технике используют антитела, направленные на вариантные пептиды. Такие антитела способны специфически связываться с вариантными пептидами, конкурируя с исследуемым соединением за связывание с данным вариантом. Таким способом антитела могут применяться для обнаружения присутствия любого пептида, который разделяет одну или несколько антигенных детерминант вариантного пептида.

Настоящее изобретение рассматривает многие другие средства скрининга соединений. Приведенные выше примеры представлены только для иллюстрации спектра существующих техник. Средний специалист в данной области будет понимать, что могут применяться многие другие способы скрининга.

Конкретно, настоящее изобретение относится к применению линий клеток, трансфицированных нуклеиновой кислотой, кодирующей по меньшей мере один вариант участка Рс для скрининга соединений на предмет активности и конкретно для высокого производительного скрининга соединений из комбинаторных библиотек (например, библиотеки, содержащие свыше 10⁴ соединений). Линии клеток по настоящему изобретению могут применяться в разнообразных способах скрининга.

Варианты по настоящему изобретению могут применяться как агент для аффинной очистки. Например, вариант может быть иммобилизирован на твердой фазе, такой как смола 8ерНабех или фильтровальная бумага, с применением способов, хорошо известных из уровня техники. Иммобилизированный вариант затем вводится в контакт с образцом, содержащим антиген, который подлежит очистке, и после этого подложку промывают подходящим растворителем, который удаляет по существу все вещества образца за исключением антигена, который подлежит выделению, связанного с иммобилизированным вариантом полипептида. В конечном итоге подложку промывают другим подходящим растворителем, таким как глициновый буфер, рН 5,0, который будет высвобождать антиген из варианта полипептида.

Вариант полипептида также может быть полезным в диагностических анализах (например, для определения экспрессии интересующего антигена в специфических клетках, тканях или сыворотке). Для диагностического применения вариант, как правило, метят детектируемым фрагментом (такие метки также применимы в анализах участка Рс, описанных выше). Существуют многочисленные метки, в том числе без ограничения радиоизотопы (например, ³⁵8, ¹⁴С, ¹²⁵Ι, ³Н и ¹³¹Ι), флуоресцентные метки (например, хелаты редкоземельных металлов (хелаты европия) или флуоресцеин и его производные, родамин и его производные, дансил, лиссамин, фикоэритрин и техасский красный), различные ферментсубстратные метки (см., например, патент США № 4275149, включенный в настоящее описание посредством ссылки, люцифераза, люциферин, 2,3-дигидрофталазиндионы, малатдегидрогеназа, уреаза, пероксидаза, такая как пероксидаза хрена (НКРО), щелочная фосфатаза, β-галактозидаза, глюкоамилаза, лизоцим, оксидазы сахаров (например, глюкозооксидаза, галактозоосидаза и глюкозо-6фосфатдегидрогеназа), гетероциклические оксидазы (такие как уриказа и ксантиноксидаза), лактопероксидаза, микропероксидаза и т.п.). Примеры фермент-субстратных комбинаций включают, например, (ί) пероксидазу хрена (НКРО) с пероксидом водорода в качестве субстрата, где пероксид водорода окисляет предшественник красителя (например, ортофенилендиамин (ΟΡΌ) или 3,3',5,5'-тетраметилбензидина гидрохлорид (ТМВ)), (ίί) щелочную фосфатазу (АР) с паранитрофенилфосфатом в качестве хромогенного

- 56 009746 субстрата и (ίίί) Ό-галактозидаза (Я-Э-Са1) с хромогенным субстратом или флуорогенным субстратом.

Варианты настоящего изобретения также могут применяться для диагностических анализов ίη νίνο. Например, полипептидный вариант, помеченный радионуклидом таким образом, что локализация антигена или экспрессирующих его клеток может быть определена с помощью иммуносцинтиографии.

Экспериментальная часть

Следующие примеры приведены с целью демонстрации и дальнейшей иллюстрации предпочтительных вариантов осуществления и аспектов настоящего изобретения и не предназначены для ограничения объема изобретения.

В нижеследующем описании экспериментов применяются следующие сокращения: н (нормальный), М (молярный), мМ (миллимолярный), мкМ (микромолярный), моль (моль), ммоль (миллимоль), мкмоль (микромоль), нмоль (наномоль), пмоль (пикомоль); г (граммы), мг (миллиграммы), мкг (микрограммы), нг (нанограммы); л (литры)/ мл (миллилитры), мкл (микролитры), см (сантиметры), мм (миллиметры), мкм (микрометры), нм (нанометры), Ό8 (декстрана сульфат) и °С (градусы по шкале Цельсия).

Пример 1. Скрининг вариантов в анализах АОСС

Данный пример описывает скрининг вариантов в анализе АОСС. Все варианты, для которых проводился скрининг, представляли собой анти-СО20 антитела (на основе специфичности вариабельного участка).

1. Выделение РВМС (мононуклеарные клетки периферической крови)

Около 50 мл периферической крови, полученной от здорового донора, разбавляли в соотношении 1:2 фосфатно-буферным раствором (ЕВ8) с рН 7,0. Растворы смешивали осторожным вращением пробирки. Около 12 мл Н|5Юрас.|ие-1077 (81§та кат. № 1077-1) аккуратно наслаивают под разбавленный образец крови с последующим центрифугированием в центрифуге 8οΓν;·ιΙΙ ЯТ6000В с качающимся черпачным ротором при 1000 об./мин в течение 10 мин. Верхнюю фазу градиента отбрасывали с помощью аспирации и межфазную поверхность белого цвета, содержащую РМВС, собирали и промывали трижды сбалансированным солевым раствором Хэнкса (СЛот кат. № 14025-092). Промытые гранулы клеток суспендировали приблизительно в 20 мл среды ЯРМ1 1640, содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки (ЕВ8) (0теда 8с1еШ1йс кат. № ЕВ-01). Ресуспендированные РВМС делили на две колбы культуры Т-175 и 30 мл ЯРМ1, содержащей 10% ЕВ8, добавляли в каждую из них с последующей инкубацией в течение ночи при 37°С в инкубаторе с содержанием 5% С0₂. На следующий день неклейкие РВМС собирали в пробирки Фалкона объемом 50 мл, центрифугировали, как описано выше, и ресуспендировали в ЯРМ1, содержащей 1% ЕВ8 без фенольного красного. Малую порцию ресуспендированных клеток разбавляли в 10 раз и подсчитывали с использованием гемоцитометра. Оставшиеся РВМС помещали в инкубатор до использования.

й. Линия клеток-мишеней (специфичны для анализов анти-СЭ20 АОСС) ^νίΙ.2 и 8Κ\ν6.4 СЭ20-экспрессирующие линии В-клеток получали из АТСС и выращивали в соответствии с инструкциями. За день перед использованием клетки разделяли на 2 части. На следующий день количество клеток доводили до 4х10⁵ клеток/мл и аликвоты 50 мкл (20000 клеток/ячейку) добавляли в 96-луночный культуральный планшет.

ϊϊΐ. Разведения 1дО

Перед скринингом варианты 1дО экспрессировали и количественно определяли с использованием стандартного твердофазного иммуноферментного анализа (ЕЫ8А). Для первичного точечного скрининга АОСС варианты 1дО разбавляли до 40 нг/мл в среде ЯМР1, содержащей 1% ЕВ8 без фенольного красного. Конечная концентрация 1дО в анализе разбавлена в 4 раза (т.е. конечная концентрация 10 нг/мл). Аликвоты 50 мкл 1дО добавляли к клеткам-мишеням и инкубировали в течение 15 мин при 37°С перед добавлением эффекторных клеток к опсонизированным клеткам-мишеням.

При проведении титрования 1дО концентрацию 1дО варьировали в интервале от приблизительно 0,0001 до 1 мкг/мл. Готовили разведения 1дО с использованием 96-луночного микротитровального планшета путем разведения образцов в ЯРМ1, содержащей 1% ЕВ8 без фенольного красного. Разбавленные образцы 1дО затем добавляли в аналитический планшет, содержащий клетки-мишени.

ίν. Эффекторные клетки

Концентрацию РВМС корректировали таким образом, чтобы соотношение эффекторные клетки/клетки-мишени находилось в интервале 10-20:1 (т.е. 2-4 х 10⁶ клеток/мл). 100 мкл ресуспендированных РВМС добавляли в каждую лунку опсонизированных клеток-мишеней. Планшеты инкубировали при 37°С в присутствии 5% С0₂ в течение 3-4 ч.

ν. Определение высвобождения лактатдегидрогеназы (ЛДГ)

Лизис клеток-мишеней измеряли определением высвобождения фермента лактатдегидрогеназа из цитоплазмы поврежденных клеток в супернатант культуры. После инкубирования опсонизированных клеток-мишеней с эффекторными клетками аналитические планшеты центрифугировали при 2000 об./мин в течение 5 мин. Около 75 мкл супернатанта клеточной культуры осторожно извлекали, избегая гранулированных клеток и мусора. Данный супернатант добавляли непосредственно на микротитровальный планшет и к полученному раствору добавляли 75 мкл реактива для обнаружения ЛДГ (Яοсйе, кат. №

- 57 009746

1644793). Затем планшет инкубировали в течение приблизительно 15-30 мин и считывали поглощение при 490 нм с использованием микропланшетного ридера Утах Ктейс от Мо1еси1аг Эеу1се5.

νί. Анализ данных

Все точечные анализы скрининга АЭСС проводили в двух повторениях. Каждый аналитический планшет содержал контроль для определения спонтанного лизиса клеток-мишеней, спонтанного лизиса эффекторных клеток плюс спонтанного лизиса клеток-мишеней в отсутствие ΙβΟ и общего лизиса клеток-мишеней. Общий лизис клеток мишеней получали добавлением 1% Тритон Х-100 к клеткаммишеням. Три контроля дикого типа включали в каждый анализ на аналитическом планшете и сигнал анализа АЭСС усредняли. Базовое значение, полученное для контроля спонтанного лизиса, вычитали из каждого образца. Базовое значение, полученное для разведенного 1дС. вычитали для каждого образца. Данные конвертировали из значений поглощения в процент специфического лизиса на базе контроля спонтанного и общего лизиса. Процент специфического лизиса рассчитывали на основе следующего уравнения: процент специфического лизиса (экспериментальный А490 - базовый А490)/(максимальный А490 - базовый А490)х100, где базовый А490 представляет собой сумму значений А490, полученных для эффекторных клеток и клеток-мишеней в отсутствие ΙβΟ и базового значения 1дС вследствие загрязнения ЛДГ, присутствующей в сырых супернатантах ΙβΟ. Процент активности варианта Ес нормализовали относительно средних значений контроля дикого типа. Процент нормализованной активности для двойных аналитических планшетов усредняли и для каждого образца рассчитывали стандартное отклонение между индивидуальными аналитическими планшетами.

νίί. Результаты

Относительная специфическая активность АЭСС показана в табл. 2. Значения СЭС приведенные в данной таблице, были получены, как описано в примере 4, и значения анализа связывания ЕсЯп, приведенные в данной таблице, получены, как описано в примере 5.

Таблица 2

Вариант	АОСС	ГсКп 6,0	ЕсЕп 7,0	С ОС
Исходный	100	100	100	100
Р247Н	161	79	73	81
Ρ247Ι	163	89	74	42
Р2471	166	92	78	49
Б251Е	123	102	100	138

Т256М	126	72	82	167
Т256Р	115	132	121	315
Η268ϋ	127	87	84	137
Н268Е	129	90	81	108
ϋ280Α	144	91	84	141
ϋ280Κ	140	103	93	144
АЗЗОК	129	104	99	43
Ά330Κ	123	77	101	31
13320	145	91	102	146
Ι332Ε	161	99	97	150
Ι332Κ	12	109	97	67
Ι332Κ	12	97	92	88
А339Т	130	115	109	189
Α37θϋ	101	122	93	28
Ξ440Υ	116	106	102	199

В данном эксперименте клетки 8К\У6.4 опсонизировали с использованием одинарных и двойных вариантов аминокислот участка Ес с последующим добавлением РВМС в соотношении 15:1. Аналитический планшет инкубировали при 37°С в присутствии 5% С0₂ в течение 3 ч с последующим центрифугированием. Часть супернатанта собирали и переносили на планшет для микротитрования и активность ЛДГ в супернатанте определяли с помощью добавления равного объема субстрата ЛДГ. После образования окрашивания измеряли поглощение при 490 нм. Измеряли базовое значение в результате загрязнения

- 58 009746

ЛДГ сырых ^С супернатантов и эти базовые значения вычитали из сырых данных А490. Эти данные показывают, что в сравнении с диким типом анти-СО20 антитела активность АЭСС А330К, А330К и Ι332Ε одиночных вариантов аминокислот повышена. Комбинация А330К или А330К с вариантом Ι332Ε дополнительно улучшает активность АЭСС. Неспецифический ^С не проявляет активности в этих условиях анализа. Активность варианта 1332 может быть далее усилена с изменением гликозилирования (например, путем повышения содержания двухсекционного С1сNАс).

Процент цитотоксичности рассчитывали на основе следующего уравнения: % цитотоксичности = (экспериментальный А490 базовый А490)/(максимальный А490 - базовый А490)х100, где базовый А490 получен на основе эффекторных клеток и клеток-мишеней в отсутствие ΙβΛ Данные показывают, что активность АОСС вариантов Ι332Ό и Ι332Ε усилена в сравнении с диким типом. В данном эксперименте использовали клетки-мишени 8К\У6.4 и в стандартном 3-часовом анализе АОСС соотношение эффекторных клеток/клеток-мишеней 15:1.

Активность АОСС с данной конкретной анти-СО20-специфичностью и клеточные линии \νί1-2 и 8К\У6.4 являются независимыми от сродства вариабельного участка.

Внеклеточную часть человеческого рецептора Ес гамма К! (СЭ64) с С-концом 6-1ик свободного конца добавляли вместо предполагаемого трансмембранного домена, экспрессировали в клетках НЕК293А и очищали с использованием №-колонки. Рецептором покрывали в течение ночи при 4°С планшет ЕЫ8А и затем планшет блокировали с использованием 8ирсгЬ1оск. После блокирования и промывания готовили разведения ^С и добавляли на покрытый рецепторами планшет с последующей инкубацией при 37°С в течение 2 ч. Несвязанный ^С удаляли путем промывания и связывания обнаруженного антитела с использованием вторичного конъюгированного антитела против человеческой каппа щелочной фосфатазы 1:1000. После промывания связанный ΙβΟ определяли добавлением субстрата фосфатазы (фенолфталеин монофосфат) (РРМР) (ГВЬ δααιΐίίχ) с поглощением, определенным колориметрически при 560 нм с помощью микропланшетного ридера УМАХ (Мо1сси1аг ОсСсск, δиηиуνа1с, СА). Данные изображали в виде графика зависимости логарифма концентрации Ι§0 от поглощения.

Пример 2. Анализ скрининга вариантов на предмет истощения В-клеток в цельной крови

В этом примере описан анализ скрининга вариантов на предмет истощения В-клеток в цельной крови.

1. Генотипирование ЕсуКЛА

Геномную ДНК выделяли из образцов периферической крови с использованием набора ΟίηΑιηρ (Р1адсп, кат. № 51104). ЕсуКЛА амплифицировали с помощью ПЦР с использованием праймеров (5' ССААААТСССАСАААТТСТССС 3' - δ ЕС) ΙΌ N0:61) и (5'СААСАСССТСАСТАССТАТТАССС 3' δΕΟ ΙΌ N0:62). Продукты ПЦР очищали с использованием набора для очистки М1пЕ1и1с РСК (Р1адси, кат. № 28006) и расщепляли рестриктазой ВкО при 60°С в течение 12 ч. Расщепленные образцы анализировали на 3% агарозных гелях. Все продукты ПЦР разрезали по внутреннему сайту ΒκΐϋΙ, независимому от генотипа Н или К. Продукты, которые демонстрировали К аллель, разрезали по дополнительному сайту ВкО. Это приводило к генотипу Н/Н, идентифицированному по одному фрагменту размером 337 п.н., Н/К был идентифицирован по двум фрагментам размером 337 п.н. и 316 п.н. и К/К идентифицирована по одному фрагменту размером 316 п.н.

ίί. Генотипирование ЕсуКША

Геномную ДНК выделяли из образцов периферической крови с применением набора ΟίηΑιηρ (Р1адсп, кат. № 51104). ЕсуКША амплифицировали из геномной ДНК с помощью ПЦР с использованием праймеров (5' АТАТТТАСАСААТСССА 3' - δ ЕС) Ш N0:63) и (5' ССТСАТСТТСАСАСТСТСТСА САСаСаТТТТТАСТСТСАА 3' - δΕ^ Ш N0:64). Продукты ПЦР очищали с использованием набора очистки М1иЕ1и1с РСК (Р1адсп, кат. № 28006) и расщепляли рестриктазой НшсП при 37°С в течение 16 ч. Расщепленные образцы анализировали на 3% агарозных гелях ^δίον^ НшсП разрезает У аллель, но не Е аллель. Следовательно, Е/Е дает один фрагмент размером 148 п.н., Е/У дает три фрагмента размером 148, 109 и 39 п.н., и У/У дает два фрагмента размером 109 и 39 п.н.

ίίί. Анализ истощения В-клеток (с использованием цельной крови)

Гепаринизированную периферическую кровь отбирали у здоровых добровольцев. Кровь смешивали с вариантом, Ритуксаном или неспецифическим Ι§0 (отрицательный контроль), разведенными в буфере ЕАСδ (фосфатный буферный солевой раствор + 2% эмбриональной бычьей сыворотки). Пробирки инкубировали в течение 4 ч при 37°С и затем окрашивали флуоресцеин-анти-СО45 (для идентификации лейкоцитов) (ΒΌ, кат. № 555482) и фикоэритрин-анти-СО 19 (для идентификации В-клеток) (ВС, кат. № 555413) в течение 30 мин при комнатной температуре. Красные кровяные клетки лизировали добавлением ΒΌ РйагтЕукс, (ΒΌ, кат. № 555899), образцы промывали и ресуспендировали в буфере для анализа ЕАСδ в проточном цитометре ВссГои Оюкшкои. Непосредственно перед анализом к образцам добавляли пропидия йодид (ΕΙ) в конечной концентрации 0,1 мкг/мл для распознавания живых и мертвых клеток. Контроль включает клетки, инкубированные только с буфером ЕАСδ, неокрашенные и окрашенные одним цветом образцы. Каждое определение проводили в трех повторениях и собирали 10000 РЕ отрицательных событий, которые приходились внутри интервала разброса лимфоцитов (ЕδСδδС). Дан

- 59 009746 ные анализировали с использование программного обеспечения Х+шМОк Для анализа живые лимфоциты идентифицировали по положительному окрашиванию с помощью +045, негативного результата Р1 и характеристик Е8С/88С. В каждом образце процент клеток СО19+ с этими характеристиками идентифицировали. Данные выражали как средний % клеток СО19+ плюс/минус 1 стандартное отклонение. Альтернативно, для облегчения сравнения между донорами, данные выражали как % от начального количества клеток СО19+ оставшийся, т.е. (% лимфоцитов СО19+, оставшиеся после обработки)/(% лимфоцитов СО19+ в образце, обработанном буфером ЕАС8) х 100%.

Вариант Ι332Ε истощает В-клетки более мощно и в большей степени, чем Ритуксан, в образце цельной крови, содержащей генотип УУ (высокое сродство) рецептора ЕсуКШа.

Вариант Ι332Ε истощает В-клетки более мощно и в большей степени, чем Ритуксан, в образце цельной крови, содержащем генотип ЕЕ (низкое сродство) рецептора ЕсуКШа. Подобные результаты получены для анализа цельной крови, с генотипом УЕ (гетерозиготный) рецептора ЕсуКШа или генотипами НН, НК или КК рецептора ЕсуКПа (табл. 3).

Таблица 3. Процент оставшихся В-клеток при максимальном истощении

Рецептор	Генотип	Ι332Ε	Ритуксан	Неспецифический 1дС	η
ЕсуКШа	νν	40	60	98	5
	V?	51	70	94	6
	ГЕ	52	73	95	6
ЕсуКПа	КК	53	77	96	5
	КН	49	69	95	9
	НН	38	53	95	3

Вариант А378О неожиданно истощает В-клетки более мощно и в большей степени, чем варианты с равной или большей активностью в анализах АОСС и СОС ш νίΙΐΌ.

Пример 3. Определение сродства варианта

Данные примеры описывают, каким образом определяли сродство (Кб) взаимодействия между ЕсуКШа (генотип ЕЕ) и дикого типа или исходного Ес и варианта Ι332Ε.

ί. Анализ Кб ЕсуКШа (158Е)

Растворимый внеклеточный домен человеческого ЕсуКШа (158Е) экспрессировался в клетках 293 и его очищали с помощью смолы М-ИТА, связанной с 6-гистидиновым свободным концом.

Одну пробирку гранул Ах1асЮпе (8ар1бупе) спаривали с 1 мг ЕсуКШа (158Е) в натрий бикарбонатном буфере с рН 9,3. Суспензию встряхивали в течение ночи при 4°С, дважды промывали ЕВ8 и блокировали с помощью блокирующего буфера (1М трис рН 7,4 + 1% В8А) в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем гранулы трижды промывали ЕВ8 и ресуспендировали в 50 мл ЕВ8 с 0,01% азида. Двенадцать равновесных образцов, каждый из которых содержал 7,5 нМ 1дС и ЕсуКШ, титровали от 4 мкМ до 1,95 нМ, готовили в аналитическом буфере (ЕВ8 рН 7,4, 0,1% В8А 0,01% азида) и уравновешивали в течение 16 ч при комнатной температуре. Все эксперименты проводили в аналитическом буфере при комнатной температуре со скоростью потока 0,5 мл/мин. После помещения гранул ЕсуКШ в проточную кювету прибора свободный 1дС захватывался из первого равновесного образца. Затем гранулы промывали и связанный 1дС определяли с использованием конъюгата козьего антитела против человеческого Ес (ЕаЬ')2-Е1ТС (Засккоп 1ттипосЬеткак). Затем процесс повторяли для оставшихся 11 равновесных образцов и после анализа определяли Кб с помощью программного обеспечения Ктеха Рго. С применением такого подхода сродство (Кб) взаимодействия между ЕсуКШа (генотип ЕЕ) и диким типом (или исходным) Ес определяли на уровне 387 нМ, тогда как сродство варианта Ι332Ε составляло 52 нМ. Гликосконструированное антитело (СпТШ) показывает Кб 83 нМ, тогда как комбинаторный вариант (Ь256Р, Ι332Ε) показывает Кб 21 нМ.

Пример 4. Характеристика активности СОС вариантов

Данный пример описывает, как определяли активность различных вариантов участка Ес.

ί. Анализ

Данный анализ проводили с использованием комплемента человека Юшбе1 Согр., кат. №А113) на клетках Каток (КА №1) (АТСС кат. № СКЬ-1596). Клетки Каток культивировали в среде 61Ьсо КРМП640, содержащей 10% ЕВ8 при 37°С и 5% С0₂. За день до пробы клетки засевали при 1х 10⁶ клетки в колбу Т175. На следующий день клетки ресуспендировали в количестве 3,57х10⁵ клеток/мл в среде КРМП640 без фенольного красного, содержащей 1% ЕВ8. Клетки распределяли по 70 мкл в лунке плоскодонного планшета Сок1аг 3917. Для кривой титрования вариант ΙβΟ готовили с 3-кратным серийным разведением в среде КРМП640. Для точечного библиотечного скрининга анализа временно экспрессиро

- 60 009746 ванный вариант !§С в супернатанте культуры нормализовали до 1 мкг/мл среды. 30 мкл варианта !дС (конечная концентрация 200 нг/мл) и 50 мкл комплемента человека (Ошйе1 Согр., кат №А113) 1:5 разбавляли средой КРМП640 + 1% РВ8 и добавляли к клеткам-мишеням, осторожно и тщательно перемешивая пипетированием. Планшеты инкубировали при 37°С в присутствии 5% С0₂ в течение 1,5 ч. После добавления 15 мкл на лунку аламара голубого (8его!ес, кат. №ВИР012В) инкубацию продолжали в течение ночи. На следующее утро сигнал флуоресценции измеряли с помощью многометочного ридера Регкш Е1тег Еиу1зюи 2100 с возбуждением при 560 нм и эмиссией при 590 нм.

ίί. Анализ данных

Все одноточечные анализы проводили в двойном повторении. Каждый аналитический планшет содержал контроль для определения спонтанного лизиса клеток-мишеней комплементом человека в отсутствие ^С и максимального лизиса в присутствии 1% Тритона Х-100.

Три контроля дикого типа включали в каждый анализ на аналитическом планшете и сигнал пробы АОСС усредняли. Базовое значение, полученное для контроля спонтанного лизиса, вычитали из каждого образца. Базовое значение, полученное для разведенного ^С, вычитали для каждого образца. Данные конвертировали из значений поглощения в процент специфического лизиса на основе контроля спонтанного и общего лизиса. Процент специфического лизиса рассчитывали на основе следующего уравнения: процент специфического лизиса = (экспериментальный сигнал флуоресценции - базовый сигнал флуоресценции)/(максимальный сигнал лизиса - спонтанный сигнал) х 100. Оценку активности варианта Рс рассчитывали относительно средних значений трех контролей дикого типа. Процент нормализованной активности для дикого типа для двойных аналитических планшетов усредняли и для каждого образца рассчитывали стандартное отклонение между индивидуальными аналитическими планшетами.

Репрезентативные данные СЭС получены после титрования вариантов !§С. В данном эксперименте клетки Катоз лизировали с применением вариантов участка Рс !дС с по одной или двум аминокислотам и комплемента человека. Аналитический планшет инкубировали при 37°С в присутствии 5% С0₂ в течение 1,5 ч с последующим добавлением 15 мкл на лунку аламара голубого и инкубацией в течение ночи. Сигнал флуоресценции измеряли и строили кривую зависимости от концентрации. Полученные данные выявили, что в сравнении с анти-СО20 антителами дикого типа активность СЭС слегка выше в случае одинарных аминокислотных вариантов Κ32Ό, К32Е и значительно выше в случаях повышены Т256Р и 8440Υ и комбинации Т256Р с К32Е. В случае варианта Λ378Ω активность СЭС снижена (табл. 2).

Пример 5. Характеристика связывания с РсКи

Данный пример описывает анализы связывания рецептора Рс новорожденных (РсКи) с вариантом ^С. На покрытый 96-луночный планшет для ЕЫ8А с ϋ-образным дном (Соз!аг) наносили 50 мкл на лунку 2 мкг/мл Нейтравидина (Р1егсе Вю1есЬио1о§у, кат. №31000) в 50 мМ карбонатного буфера (рН 9,3) при 4°С в течение ночи. Несвязанный Нейтравидин удаляли и планшет трижды промывали РВ8Т (РВ8, содержащий 0,1% Твина 20). 50 мкл на лунку меченого биотином растворимого РсКи при 2,5 мкг/мл в РВ8 наносили и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч. 75 мкл казеинового блокирующего буфера (Р1егсе Вю1есЬио1о§у, кат. №37528) затем добавляли на планшет на 1 ч. Затем планшет ЕЫ8А промывали РВ8Т и инкубировали с 50 мкл на лунку варианта ^С. Для построения кривой титрования вариант ^С готовили путем 3-кратного серийного разведения в буфере связывания с РсКи (100 мМ №1РО₊ 0,05% Твина 20 при различных рН (от 6,0 до 7,4)). Для одноточечного скрининга временно экспрессированный вариант ^С в супернатанте культуры нормализовали до конечной концентрации 50 нг/мл (связывание 200 нг/мл при рН 7,4) и рН доводили с помощью буфера связывания РсКи до 6,0. На следующей стадии буфер связывания РсКи при соответствующих значениях рН использовали для промывания планшета и разбавления реактивов. Реакцию связывания проводили при комнатной температуре в течение 1 ч. После трех промываний связанный ^С определяли с помощью козьего антитела против человеческого (РаЬ')₂ РаЬ-НКР конъюгата в течение 1 ч. Активность НКР развивается в субстрате НКР Пирса (ТигЬо ТМВ-ЕЫ8А, кат. №34022) в течение 5-30 мин. Реакцию останавливали добавлением 50 мкл 2 М Н₂80₄ и измеряли поглощение при 450 нм с помощью микропланшетного ридера УМАХ (Мо1еси1аг Эеу1сез).

Пример 6. Лечение человека анти-С^20-I332Е вариантом Рс

Исследования ίη νίΙΐΌ и на мышиных моделях опухолей (С1уиез КА, е! а1. №1 Мей. 6:443 (2000)) обеспечивают доказательство того, что АОСС играет роль в противоопухолевых эффектах анти-СЭ20 антител, таких как Ритуксан. Пациентов-людей можно лечить вариантом Рс антител анти-СЭ20-1332Е или Ритуксаном, по способу, сходному с раскрытым в работе Сайгон е! а1., В1оой 99:754 (2002), включенной в настоящее описание посредством ссылки. Например, пациентов со стадией ИМУ заболевания в соответствии с классификацией Анн-Арбор, которые имеют по меньшей мере один измеряемый очаг заболевания и низкую опухолевую нагрузку в соответствии с критериями СЕЬР, можно лечить в целом приблизительно четырьмя дозами 375 мг/м² анти-С^20-I332Е Рс варианта или Ритуксана, которые вводят внутривенной инфузией (в дни 1, 8, 15 и 22). Первичная конечная точка эффективности представляет собой частоту объективного ответа, т.е. долю пациентов, достигших или полного выздоровления (СК), неподтвержденного СК (Сги), или частичного ответа (РК) в соответствии с критериями, недавно предложенными международным экспертным комитетом. Клинический ответ может быть оценен через 1-2 мес

- 61 009746 (М2). Пациенты также могут быть оценены на предмет прогресса через 1 год (М12).

Объективная частота ответа в точках М2 и М12 для пациентов, леченных Ритуксаном или антиСЭ20-1332Е, может сравниваться таким образом, что улучшенные значения АЭСС активности, обеспеченные вариантами Ι332Ε, могут быть оценены количественно. Этот пример может быть повторен с другими анти-СЭ20 вариантами (например, Ι332Ό, Р247Ь А330К, А339Т, Α378Ό или комбинаторные, как показано в табл. 1).

Кроме того, повышенная эффективность вариантов может позволять различные способы введения, меньшую частоту инъекций и/или введение меньших доз.

Все публикации и патенты, упомянутые в приведенном выше описании, включены в настоящее описание посредством ссылки.

Различные модификации и вариации описанного способа и системы изобретения будут очевидны специалистам в данной области без выхода за рамки объема и сущности изобретения. Хотя изобретение было описано в связи с конкретными предпочтительными вариантами осуществления, следует понимать, что изобретение, изложенное в пунктах формулы, не должно ограничиваться такими конкретными вариантами осуществления. Наоборот, подразумевается, что различные модификации описанных режимов осуществления изобретения, которые очевидны специалистам в области химии и молекулярной биологии или родственных областях, подпадают под объем следующей формулы изобретения.

Claims (13)

1. Антитело, содержащее вариант исходного человеческого участка Ес или его часть, причем вариант содержит по меньшей мере одну замену аминокислоты по сравнению с исходным участком Ес, причем замена аминокислоты проведена в положении 247 последовательности Ес человека.

2. Антитело по п.1, в котором замена выбрана из группы, состоящей из 247Ь, 247Н и 247Ι.

3. Антитело по п.1, в котором по меньшей мере одна замена аминокислоты в варианте участка Ес представляет собой 247Ι.

4. Антитело по любому из пп.1-3, причем антитело, содержащее вариант исходного участка Ес, опосредует антителозависимую клеточную цитотоксичность (АЭСС) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем антитело, содержащее исходный участок Ес.

5. Антитело по п.4, причем антитело, содержащее вариант участка Ес, проявляет значения относительной удельной активности АЭСС больше 100, тогда как антитело, содержащее исходный участок Ес, проявляет относительную удельную активность, равную 100, при измерении в том же анализе.

6. Антитело по любому из пп.1-5, причем антитело, содержащее вариант исходного участка Ес, опосредует зависимую от комплемента цитотоксичность (СЭС) более эффективно, чем антитело, содержащее исходный участок Ес.

7. Антитело по п.6, причем антитело, содержащее вариант исходного участка Ес, проявляет значения относительной удельной активности СЭС меньше 100, тогда как антитело, содержащее исходный участок Ес, проявляет относительную удельную активность, равную 100, при измерении в том же анализе.

8. Антитело по любому из пп.1-7, в котором исходный участок Ес относится к классу, выбранному из группы, состоящей из 1д6, 1дМ, 1дА, 1дЭ и 1дЕ.

9. Антитело по любому из пп.1-8, в котором исходный участок Ес относится к подклассу, выбранному из группы, состоящей из 1дС1, 1дС2, 1дС3 и 1дС4.

10. Антитело по любому из пп.1-9, причем антитело представляет собой моноклональное антитело.

11. Моноклональное антитело по п.10, отличающееся тем, что содержит два идентичных полипептида тяжелой цепи и два идентичных полипептида легкой цепи.

12. Антитело по любому из пп.1-11, отличающееся тем, что оно специфично связывается с СЭ20 человека.

13. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело по любому из пп.1-12.

- 62 009746

Список последовательностей <110> Αρρίϊβά Мо1еси1ах Ενο1υ6ίοη <120> Варианты участка Гс <130> Х-16757 <150> 60/535,764 <151> 2004-01-12 <160> 56 <170> РаСеЫ1п уегехоп 3.3 <210> 1 <211> 218 <212> БЕЛОК <213> Человеческий <400> 1

Рго 1 АЬа Рго 61и Ьеи 5 Ьеи 61у СЬу Рго Зег 10 УаЬ РЬе Ьеи РЬе Рго 15 Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг Ьеи Мек 11е Зег Агд ТЬг Рго СЬи УаЬ ТЫ Суз 20 25 30 УаЬ УаЬ УаЬ Азр УаЬ 5ег НЬз СЬи Азр Рго 61и Уа1 Ьуз РЬе Азп Тгр 35 40 45 Туг УаЬ Азр СЬу УаЬ С1и УаЬ Ηίβ Азп АЬа Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд СЬи 50 55 60 61и С1п Туг Азп Зег ТЬг Тук Агд Уа1 Уа1 Зег УаЬ Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи 65 70 75 80 Ηίε 61п Азр Тгр Ьеи Αεη 61 у Ьуз 61 и Туг Ьуз Суз Ьуз УаЬ Зег Азп 85 90 95 Ьуз АЬа Ьеи Рго А1а Рго Не СЬи Ьуз ТЫ 11е Зег Ьуз АЬа Ьуз СЬу 100 105 110 εΐη Рго Агд 51и Рго УаЬ Туг ТЫ Ьеи Рго Рго Зег Агд СЬи СЬи 115 120 125 Мек ТВ г Ьуз Азп 51П Уа1 Зег Ьеи ТЬг Суз Ьеи УаЬ Ьуз 61 у РЬе Туг 130 135 140 Рго Зег Азр Не А1а Уа1 СЬи Тгр СЬи Зег Азп СЬу СЬп Рго СЬи Азп 145 150 155 160 Азп Туг Ьуз ТЬг ТЬг Рго Рго УаЬ Ьеи Азр Зет Азр 61 у Зег РЬе РЬе 165 170 175

- 63 009746

Ьеи Туг Зег Ьуз 180 Ьеи ТЬг УаБ Азр Ьуз 185 Зег Агд Тгр СБп СБп 190 СБу Азп УаБ РЬе Зег Суз Зег УаБ Меб НБз СБи АБа Ьеи НБз Азп НБз Туг ТЬг 195 200 205 61п Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго 61у Ьуз 210 215 <210> 2 <2Б1> 217 <212> : БЕЛОК <213> ’ Человеческий <400> 9 Рго АБа Рго РГО УаБ АБа СБу Рго Зег УаБ РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз 1 5 10 15 Рго Ьуз Азр ТЬг Ьеи Меб 11е Зег Агд ТЬг Рго СБи УаБ ТЬг Суз УаБ 20 25 30 Уа1 УаБ Азр УаБ Зег НБз СБи Азр Рго СБи УаБ 61п РЬе Азп Тгр Тух 35 40 45 УаБ Азр СБу УаБ 61 и УаБ НБз Азп АБа Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд СБи СБи 50 55 60 σΐη РЬе Азп Зег ТЬг РЬе Агд УаБ УаБ Зег УаБ Ьеи ТЬг УаБ УаБ НБз 65 70 75 80 СБп Азр Тгр Ьеи Азп 61у Ьуз СБи Туг Ьуз Суз Ьуз УаБ Зег Азп Ьуз 85 90 95 СБу Ьеи Рго АБа Рго 11е СБи Ьуз ТЬг 11е Зег Ьуз ТЬг Ьуз СБу СБп 100 105 110 Р£О Агд СБи Рго 61п УаБ Туг ТЬг Ьеи Рсо Рго Зег Агд СБи СБи Меб 115 120 125 ТЬг Ьуз Азп СБп УаБ Зег Ьеи ТЬг Суз Ьеи УаБ Ьуз СБу РЬе Туг Рго 130 Б35 140 Зег Азр Не АБа УаБ СБи Тгр СБи Зег Азп СБу СБп Рго СБи Азп Азп 145 150 155 160 Туг Ьуз ТЬг ТЬг Рго Рго Меб Ьеи Азр Зег Азр СБу 5ег РЬе РЬе Ьеи 165 170 175

- 64 009746

Туг Зег Ьуз Ьеи 180 ТЬг Уа! Азр Ьу5 Зег 185 Агд Тгр 61п 61п 61у 190 Азп Уа1 РЬе 5ег Суз Зег Уа1 Ме! Н1з 61и А1а Ьеи Н1з Азп Н1з Туг ТЬг 61 п 195 200 205 Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго 61у Ьуз 210 215 <210> 3 <211> 216 <212> БЕЛОК <213> Человеческий <400> 3 Рго А1а Рго <51и Ьеи Ьеи 61у 61у Рго Зег Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго 1 5 10 15 Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг Ьеи Ме! 11е Зег Агд ТЬг Рго 61и Уа1 ТЬг Суз 20 25 30 Уа1 Уа1 Уа1 Азр Уа1 Зег ΗΪΕ 61и Азр Рго 61и Уа1 61 п РЬе Ьуз Тгр 35 40 45 Туг νβΐ Азр 61у Уа1 61 и Уа1 ΗΪ3 Азп А1а Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд 61 и 50 55 60 С1и С1п РЬе Азп Зег ТЬг РЬе Агд Уа1 Уа1 Зег Уа1 Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи 65 70 75 80 Нбз 61 п Азр Тгр Ьеи Азп 61у Ьуз 61и Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Зег Азп 85 90 95 Ьуз А1а Ьеи Рго А1а Рго 11е 61и Ьуз ТЬг 11е Зег Ьуз ТЬг Ьуз 61 у 100 105 110 61п Рго Агд 61и Рго 61п Уа1 Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Зег Агд С1и 61и 115 120 125 Ме! ТЬг Ьуз Азп 61 п Уа1 Зег Ьеи ТЬг Суз Ьеи Уа1 Ьуз 61у РЬе Туг 130 135 140 Рго Зег Азр Не А1а Уа1 61и Тгр 51 и Зег Зег 61 у С1п Рго С1и Азп 145 150 155 160 Азп Туг Азп ТЬг ТЬг Рго Рго Ме! Ьеи Азр Зег Азр 61 у Зег РЬе РЬе 165 170 175

- 65 009746

Ьеи Туг Зег Ьуз 18 0 Ьеи ТЬг Уа1 Азр Ьуз 165 Зег Ахд Тгр 61П 61п 190 С1у Азп Т1е РЬе Зег Суз Зег Уа1 Меб Нхз 51и А1а Ьеи Н1з Азп Агд РЬе ТЬг 195 200 205 61п Ьуз Зех Ьеи Зег Ьеи Зег Рго 61 у Ьуз 210 215 <210> 4 <211> . 21Θ <212> : БЕЛОК <213> ' Человеческий <400> 4 Рго А1а Рго 61и РЬе Ьеи 61у С1у Рхо Зег Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рхо Рго 1 5 10 15 Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг Ьеи МеЬ 11е Зех Агд ТЬг Рго 61и Уа1 ТЬг Суз 20 25 30 Уа1 Уа1 1Га1 Азр Уа1 Зег 61П 61и Азр Рго 61и Уа1 61п РЬе Азп Тхр 35 40 45 Тух Уа1 Азр 51 у Уа1 С1и Уа1 Н13 Азп А1а Ьуз ТЬг Ьуз Рхо Агд б1и 50 55 60 61и 61п РЬе Азп Зег ТНг Туг Агд Уа1 Уа1 Зег Уа1 Ьеи ТЬх Уа1 Ьеи 65 70 75 60 Н1з 61п Азр Тгр Ьеи Азп 61 у Ьуз 51 и Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Зех Азп 65 90 95 Ьуз 51у Ьеи Рхо Зег Зех 11е С1и Ьуз ТЬх 11е Зех Ьуз А1а Ьуз 61у 100 105 110 С1п Рго Агд С1и Рго е1п Уа1 Тух ТЬг Ьеи Рхо Рхо Зех 61п 61и 61 и 115 120 125 МеЪ ТЬг Ьуз Азп 61п Уа1 Зег Ьеи ТЬх Суз Ьеи Уа1 Ьуз 61у РЬе Тух 130 135 140 Рго Зех Азр Не А1а Уа1 61и Тхр 61х Зег Азп 61у 61п Рго 61и Азп 145 150 155 160 Азп Туг Ьуз ТЬх ТЬх Рхо Рго Уа1 Ьеи Азр Зех Азр 51у Зег РЬе РЬе 165 170 175 Ьеи Туг Зег Агд Ьеи ТЬг Уа1 Азр Ьуз Зег Агд Тгр 61п 61 и 61 у Азп

- 66 009746

180 185 19й УаЬ РЬе Зег Су® Зег УаЬ МеС НЬз 01 и АЬа Ьеи НЬз Ави НЬз Туг ТЬг 195 200 205 СЬп Ьу® Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Ьеи СЬу Ьуз 210 215

<210>5 <2Η>215 <212> БЕЛОК <213> Мышиный <400>5

ТЫ 1 УаЬ Рго СЬи УаЬ 5 Зег Зег УаЬ РЬе Не РЬе 10 Рго Рго Ьуз Рго 15 Ьуз Азр УаЬ Ьеи ТЬг 11е ТЬг Ьеи ТЬг Рго Ьуз УаЬ ТЬг Суз УаЬ УаЬ УаЬ 20 25 30 Азр Не Зег Ьуз Азр Азр Рго СЬи УаЬ СЬп РЬе Зег Тгр РЬе УаЬ Азр 35 40 45 Азр УаЬ СЬи УаЬ НЬз ТЬг АЬа СЬп ТЬг СЬп Рго Агд СЬи СЬи СЬп РЬе 50 55 60 Аза Зег ТЬг РЬе Агд Зег УаЬ Зег СЬи Ьеи Рго Не МеС НЬз СЬп Азр 65 70 75 80 Суз Ьеи Азп СЬу Ьуз СЬи РЬе Ьуз Суз Агд УаЬ Азп Зег АЬа АЬа РЬе 05 90 95 Рго АЬа Рго ГЬе СЬи Ьуз ТЬг Не Зег Ьуз ТЬг Ьуз СЬу Агд Рго Ьуз 100 105 110 АЬа Рго С1п УаЬ Туг ТЫ 11е Рго Рго Рго Ьуз СЬи СЬп мес АЬа Ьуз 115 120 125 Азр Ьуз УаЬ Зег Ьеи ТЬг Сув МеС Не ТЬг Азр РЬе РЬе Рго СЬи Αερ 130 135 140 Не ТЬг УаЬ СЬи Тгр СЬп Тгр Азп СЬу 01 п Рго АЬа СЬи Азп Туг Ьуз 145 150 155 Ь60 Азп ТЬг СЬп Рго Не МеС Азр ТЬг Азр СЬу Зег Туг РЬе УаЬ Туг Зег 165 170 Ь75 Ьуз Ьеи Азп УаЬ СЬп Ьуз Зег Азп Тгр СЬи А1а СЬу Азп ТЬг РЬе ТЬг 180 185 190

- 67 009746

Суз Зег Уа1 Ьеи Н1з 61и 61 у Ьеи ΗΪ5 Азп НИ НЬз ТЬг 01и Ьуз Зег

195 200 205

Ьеи Зег Ηϊξ Зег Рго 61у Ьуз

210 215 <210> б <211> 218 <212> БЕЛОК <213> Мышиный <4О0> б

Рго 1 А1а Рго Азп Ьеи 5 Ьеи 61у 61у Рго Зег 10 Уа1 РЬе Не РЬе Рго 15 рго Ьуз Не Ьуз Азр Уа1 Ьеи Меб Не Зег Ьеи Зег Рго 11е Уа1 ТЬг Суз 20 25 30 νβΐ Уа1 Уа1 Азр Уа1 Зег С1и Азр Азр Рго Азр Уа1 61п Не Зег Тгр 35 40 45 РЬе Уа1 Азп Азп Уа1 61и Уа1 Н1з ТЬг А1а С1П ТЬг 61п ТЬг ΗΪ5 Агд 50 55 60 61 и Азр Туг Азп Зег ТЬг Ьеи Агд Уа1 Уа1 Зег А1а Ьеи Рго 11е 61п 65 70 75 80 Н1з 61 п Азр Тгр Меб Зег <31у Ьуз 61и РЬе Ьуз Суз Ьуз Уа1 Азп Азп 85 90 95 Ьуз Азр Ьеи Рго А1а Рго Не С1и Агд ТЬг Не Зег Ьуз Рго Ьуз 61у 100 105 НО Зег Уа1 Агд А1а Рго 61 п Уа1 Туг Уа1 Ьеи Рбо Рго Рго 61 и 61и 61и 115 120 125 Меб ТЬг Ьуз Ьуз 61п Уа1 ТЬг Ьеи ТЫ Суз Меб Уа1 ТЬг Азр РЬе Меб 130 135 140 Рго 61 и Азр Не Туг Уа1 61 и Тгр ТЬг Азп Азп 61у Ьуз ТЬг 61 и Ьеи 145 150 155 160 Азп Туг Ьуз Азп ТЬг С1и Рго Уа1 Ьеи Азр Зег Азр 61у Зег Туг РЬе 165 170 175 Меб Туг Зег Ьуз Ьеи Агд Уа1 61и Ьуз Ьуз Азп Тгр νβΐ 61и Агд Азп 190 195 190

- 68 009746

Зег Туг Зег Суз Зег УаБ УаБ НБз С1и 61у Беи НБз Азп Н1з НБз ТЬг

195 200205

ТЬг Еуз Зег РЬе Зег Агд ТЬг Рго СБу Еуз

210215 <210>7 <211> 218 <212> БЕЛОК <213> Мышиный <400>7

Рго 1 А1а Рго Азп Ееи СБи 5 СБу СБу Рго Зег 10 УаБ РЬе 11е РЬе Рго 15 Рго Азп Не Ьуз Азр УаБ Ееи Мег Не Зег Беи ТЬг Рго Буз УаБ ТЬг Суз 20 25 30 УаБ УаБ УаБ Азр УаБ Зег СБи Азр Азр Рго Азр УаБ СБп Не Зег Тгр 35 40 45 РЬе УаБ Азп Азп УаБ СБи УаБ НБз ТЬг АБа СБп ТЬг СБп ТЬг НБз Агд 50 55 60 СБи Азр туг Аэп Зег ТЬг Не Агд УаБ УаБ Зег НБз Ееи Рго Не СБп 65 70 75 80 НБз СБп Азр Тгр Мер Зег С1у Ьуз СБи РЬе Буз Суз Еуз УаБ Азп Азп 85 90 95 Еуз Азр Ееи Рго Зег Рго 11е СБи Агд ТЬг 11е Зег Буз Рго Еуз СБу 100 105 Б10 Беи УаБ Агд А1а Рго СБп УаБ Туг ТЬг Беи Рго Рго Рго АБа СБи СБп 115 120 125 Беи Зег Агд Буз Азр УаБ Зег Ееи ТЬг Суз Беи УаБ УаБ СБу РЬе Азп 130 135 140 Рго СБу Азр Не Зег УаБ СБи Тгр ТЬг Зег Азп С1у НБз ТЬг СБи СБи 145 150 155 160 Азп Туг Буз Азр ТЬг АБа Рго УаБ Беи Азр Зег Азр СБу Зег Туг РЬе 165 Б70 Б75 Не Туг Зег Буз Ееи Азп Мер Буз ТЬг Зег Еуз Тгр СБи Ьуз ТЬг Азр

180 185 190

- 69 009746

Зег РЬе Зег Суз Азп УаД Агд НДз СДи СДу Деи Дуз Азп Туг Туг Деи

195 200 205

Дув Дуз ТЬг Не Зег Агд Зег Рго СДу Дуз

210 215 <210> В <211> 218 <212> БЕЛОК <213> Мышиный <400> 8

Рго Рго 1 61 у Азп Не 5 Деи СДу С1у Рго Зег 10 УаД РЬе 11е РЬе Рго 15 Рго Дуз Рго 1уз Азр А1а Деи Ме! Не Зег Деи ТЬг Рго Дуз УаД ТЬг Суз 20 25 30 УаД УаД УаД Азр УаД Зег СДи Азр Азр Рго Азр УаД НДз УаД Зег Тгр 35 40 45 РЬе УаД Азр Азп Дуз СДи УаД НДз ТЬг АДа Тгр ТЬг С1п Рго Агд СДи 50 55 60 А1а СДп Туг Азп Зег ТЬг РЬе Агд УаД УаД Зег АДа Деи Рго Не СДп 65 70 75 80 НДз СДп Азр Тгр МеЬ Агд СДу Дуз 01 и РЬе Дуз Суз Дуз УаД Азп Азп 85 90 95 Дуз АДа Деи Рго АДа Рго Не СДи Агд ТЬг Не Зег Дуэ Рго Дуз СДу 100 105 110 Агд АДа СДп ТЬг Рго СДп УаД Туг ТЬг 11е Рго Рго Рго Агд СДи СДп 115 120 125 МеЬ Зег Дуз Дуз Дуз УаД Зег Деи ТЬг Суз Деи УаД ТЬг Азп Рке РЬе 130 135 140 Зег СДи АДа 11е Зег УаД СДи Тгр СДи Агд Азп 51у СДи Деи СДи СДп 145 150 155 160 Азр Туг Дуз Азп ТЬг Рго Рго Не Деи Азр Зег Азр СДу ТЬг Туг РЬе 165 170 175 Деи Тух Зег Дуз Деи ТЬг УаД Азр ТЬг Азр Зег Тгр Деи СДп СДу СДи 180 1В5 190 Не РЪ.е ТЬг Суз Зег УаД УаД НДз СДи АДа Деи НДз Азп НДз НДз ТЬг

- 70 009746

195 200 205 С1п Ьуз Азп Ьеи Бег Агд Бег Рго 61 у Ьуз 210 215 <210> 9 <211> 110 <212> БЕЛОК <213> Человеческий <4 00> 9 А1а Рго 61и Ьеи Ьеи СЬу 01 у Рго Зег Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз 1 5 10 15 Рго Ьуэ Азр ТЬг Ьеи МеС Не Зег Агд ТЫ Рго СЬи Уа1 ТЬг Суз Уа1 20 25 30 Уа1 Уа1 Азр Уа1 Бег НЬз СЬи Азр Рго С1и Уа1 Ьуз РЬе Азп Тгр Туг 35 40 45 Уа1 Азр СЬу Уа1 <51и Уа1 НЬз Азп А1а Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд С1и С1и 50 55 60 61п Туг Азп Зег ТЬг Туг Агд Уа1 Уа1 Бег УаЬ Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи И13 65 70 75 80 <31п Азр Тгр Ьеи Азп 01 у Ьуз СЬи Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Зег Азп Ьуз 85 90 95 А1а Ьеи Рго АЬа Рго Не СЬи Ьуз ТЬг Не Бег Ьуз А1а Ьуз 100 105 110 <210> 10 <211> 107 <212> : БЕЛОК <213> Человеческий <400> 10 СЬу С1п Рго Агд <31и Рго Й1п νβΐ Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Зег Агд С1и 1 5 10 15 С1и Мес ТЬг Ьуз Азп С1п Уа1 Бег Ьеи ТЬг Суз Ьеи Уа1 Ьуз С1у РЬе 20 25 30 Туг Рго Зег Азр Не А1а Уа1 <31 и Тгр 61и Зег Азп С1у СЬп Рго 51 и 35 40 45 Азп Азп Туг Ьуз ТЬг ТЬг Рго Рго Уа1 Ьеи Азр Зег Азр 61у Зег РЬе 50 55 60

- 71 009746

РЬе 65 Ьеи Туг Зег Ьуз Ьеи 70 ТЬг Уа1 Азр Ьуз Зег 75 Агд Тгр С1п 51п СЬу 80 Азп Уа1 РЬе Зег Суз Зег Уа1 Мер НЬз СЬи А1а Ьеи Нхз Азп НЬз Туг 85 90 95 ТЬг 61п Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго СЬу Ьуз 100 105 <210> 11 <211> 330 <212> БЕЛОК <213> Человеческий <400> 11 А1а Зех ТЬг Ьуз 01 у Рго Зег Уа1 РЬе Рго Ьеи АЬа Рго Зег Зег Ьуз 1 5 10 15 Зег ТЬг Зег СЬу СЬу ТЬг АЬа А1а Ьеи СЬу Суз Ьеи Уа1 Ьуз Азр Туг 20 25 30 РЬе Рго С1и Рго Уа1 ТЬг Уа1 Зег Тгр Азп Зег СЬу А1а Ьеи ТЬг Зег 35 40 45 51у Уа1 НЬз ТЬг РЬе Рго АЬа Уа1 Ьеи 51п Зег Зег С1у Ьеи Туг Зег 50 55 60 Ьеи Зег Зег Уа1 Уа1 ТЬг Уа1 Рго Зег 5ег Зег Ьеи СЬу ТЬг СЬп ТЬг 65 70 75 80 Туг Не Суз Азп Уа1 Азп Нхз Ьуз Рго Зег Азп ТЬг Ьуз Уа1 Азр Ьуз 85 90 95 Агд Уа1 б!и Рго Ьуз Зег Суз Азр Ьуз ТЬг НЬз ТЬг Суз Рго Рго Суз 100 105 ыо Рго А1а Рго С1и Ьеи Ьеи 61 у 61у Рго Зег Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго 115 120 125 Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг Ьеи Мер 11е Зег Агд ТЬг Рго С1и Уа1 ТЬг Суз 130 135 140 Уа1 Уа1 Уа1 Азр Уа1 Зег ΗΪ8 СЬи Азр Рго С1и Уа1 Ьуз РЬе Азп Тгр 145 150 155 160 Туг Уа1 Азр С1у Уа1 С1и Уа1 НЬз Азп А1а Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд СЬи 165 170 175

- 72 009746

СЬи σΐη Туг Азп 180 Зег ТЬг Туг Агд УаЬ 185 УаЬ Зег УаЬ Ьеи ТЬг 190 УаЬ Ьеи НЬз СЬп Азр Тгр Ьеи Азп СЬу Ьуз С1и Туг Ьуз Суз Ьуз УаЬ Зег Азп 195 200 205 Ьуз АЬа Ьеи Рго АЬа Рго Ые СЬи Ьуз ТЬс Ые Зег Ьуз АЬа Ьуз СЬу 210 215 22 0 СЬп Рго Агд СЬи Рго 61 п УаЬ Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Зег Агд СЬи СЬи 225 230 235 240 Меб ТЬг Ьуз Азп СЬп УаЬ Зег Ьеи ТЬг Суз Ьеи УаЬ Ьуз 61 у РЬе Туг 245 250 255 Его Зег Азр Не АЬа УаЬ СЬи Тгр СЬи Зег Азп СЬу СЬп Рго СЬи Азп 260 265 270 Азп Туг Ьуз ТЫ ТЬг Рго Рго УаЬ Ьеи Азр Зег Азр СЬу Зег РЬе РЬе 275 280 285 Ьеи Туг Зег Ьуз Ьеи ТЬг УаЬ Азр Ьуз Зег Агд Тгр СЬп СЬп СЬу Азп 290 295 300 УаЬ РЬе Зег Суз Зег УаЬ Меб НЬз СЬи АЬа Ьеи НЬз Азп НЬз Туг ТЬг 305 310 315 320 61 η Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго СЬу Ьуз

325 330 <210> 12 <2Ы> 330 <212> БЕЛОК <213> Человеческий <400> 12

АЬа 1 Зег ТЬг Ьуз СЬу 5 Рго Зег УаЬ РЬе Рго 10 Ьеи АЬа Рго Зег Зег 15 Ьуз Зег ТЬг Зег СЬу 20 61 у ТЬг АЬа АЬа Ьеи 25 СЬу Суз Ьеи УаЬ Ьуз 30 Азр Туг РЬе Рго СЬи 35 Рго УаЬ ТЬг УаЬ Зег 40 Тгр Азп Зег СЬу АЬа 45 Ьеи ТЬг Зег СЬу УаЬ 50 НЬз ТЬг РЬе Рго АЬа 55 УаЬ Ьеи СЬп Зег Зег 60 СЬу Ьеи Туг Зег Ьеи Зег Зег УаЬ УаЬ ТЬГ УаЬ Рго Зег Зег Зег Ьеи еьу ТЬг СЬп ТЬг

- 73 009746

65 70 75 80

Туг Не Суз Азп УаЬ Азп НЬз 85 Ьуз Рго Зег 90 Азп ТЬг Ьуз УаЬ Азр 95 Ьуз Ьуз Уа1 СЬи Рго Ьуз Бег Суз Азр Ьуз ТЬг НЬз ТЬг Суз Рго Рго Суз 100 105 110 Рго АЬа Рго СЬи Ьеи Ьеи СЬу СЬу Рго Зег УаЬ РЬе Ьеи РЬе Рго Рго 115 120 125 Ьуз Рго Ьуз Аэр ТЬг Ьеи Неб Ые Зег Агд ТЬг Рго СЬи УаЬ ТЬг Суе 130 135 140 УаЬ УаЬ УаЬ Азр УаЬ Зег НЬз СЬи Азр Рго СЬи УаЬ Ьуз РЬе Азп Тгр 145 150 155 160 Туг УаЬ Азр СЬу УаЬ СЬи УаЬ НЬз Азп А1а Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд СЬи 165 170 175 СЬи СЬп Туг Азп Зег ТЬг Туг Агд Уа1 УаЬ Зег УаЬ Ьеи ТЬг УаЬ Ьеи 180 185 190 НЬз СЬп Агр Тгр Ьеи Азп СЬу Ьуз СЬи Туг Ьуз Суз Ьуз УаЬ Бег Азп 195 200 205 Ьуз АЬа Ьеи Рго АЬа Рго 11е СЬи Ьуз ТЬг 11е Зег Ьуз АЬа Ьуз СЬу 210 215 220 СЬп Рго Агд СЬи Рго СЬп УаЬ Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Бег Агд Азр СЬи 225 230 235 240 Ьеи ТЬг Ьуз Азп СЬп УаЬ Зег Ьеи ТЬг Суз Ьеи УаЬ Ьуз СЬу РЬе Туг 245 250 255 Рго Зег Азр Не АЬа УаЬ СЬи Тгр СЬи Зег Азп СЬу СЬп Рго СЬи Азп 260 265 270 Азп Туг Ьуз ТЬг ТЬг Рго Рго УаЬ Ьеи Азр Зег Азр СЬу Зег РЬе РЬе 275 280 285 Ьеи Туг Бег Ьуз Ьеи ТЬг УаЬ Азр Ьуз Бег Агд Тгр СЬп СЬп С1 у Азп 290 295 300 УаЬ РЬе Бег Суз Зег УаЬ Меб НЬз СЬи А1а Ьеи НЬз Азп НЬз Туг ТЬг 305 310 315 320 СЬп Ьуз Бег Ьеи Бег Ьеи Зег Рго СЬу Ьуз

- 74 009746

325330 <210>13 <211>31 <212> БЕЛОК <213> Человеческий <400> 13

АЬа Рго СЬи Ьеи Ьеи СЬу СЬу Рго Зег УаЬ РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз 1 5 10 15 НЬз Ьуз Азр ТЬг Ьеи МеС 11е Зег Агд ТЬг Рго СЬи УаЬ ТЬг Суз 20 25 30 <210> 14 <211> 31 <212> БЕЛОК <213> Человеческий <400> 14 АЬа Рго СЬи Ьеи Ьеи СЬу СЬу Рго Зег УаЬ РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз 1 5 10 15 Не Ьуз Азр ТЬг Ьеи МеЬ 11е Зег Агд ТЬг Рго СЬи УаЬ ТЬг Суз 20 25 30 <210> 15 <211> 31 <212> БЕЛОК <213> Человеческий <400> 15 АЬа Рго СЬи Ьеи Ьеи СЬу СЬу Рго Зег УаЬ РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Ь 5 10 15 Ьеи Ьуз Азр ТЬг Ьеи МеЬ Не Зег Агд ТЬг Рго СЬи УаЬ ТЬг Суз 20 25 30 <210> 16 <211> 31 <2Ь2> БЕЛОК <213> Человеческий <400> 16 АЬа Рго СЬи Ьеи Ьеи СЬу СЬу Рго Зег УаЬ РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз 1 5 10 15 Рго Ьуз Азр ТЬг РЬе Мер 11е Зег Агд ТЬг Рго СЬи УаЬ ТЬг Суз 20 25 30

<210>17

- 75 009746 <211> 31 <212> БЕЛОК <213> Человеческий <400> 17

А1а Рго 61и Ьеи Ьеи 01 у 51у Рго Зег Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз 1 5 10 15 Рго Ьуз Азр ТЬг Ьеи Неб Не Зег Агд Меб Рго 61и Уа1 ТЬг Суз 20 25 30 <210> 18 <211> 31 <212> БЕЛОК <213> Человеческий <400> 18 А1а Рго 61и Ьеи Ьеи 61у 61 у Рго Зег Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго РГО Ьуз 1 5 10 15 Рго Ьуз Азр ТЬг Ьеи Меб Не Зег Агд Рго Рго 61 и Уа1 ТЬг Суз 20 25 30 <210> 19 <211> 29 <212> БЕЛОК <213> Человеческий <400> 19 Уа1 Уа1 Уа1 Азр Уа1 Зег Азр 61 и Азр Рго 61и Уа1 Ьуз РЬе Азп Тгр 1 5 10 15 Туг Уа1 Азр 61у Уа1 С1и Уа1 ΗΪ5 Азп А1а Ьуз ТЬг Ьуз 20 25 <210> 20 <211> 29 <212> БЕЛОК <213> Человеческий <400> 20 Уа1 Уа1 Уа1 Азр Уа1 Зег 61 и 61 и Азр Рго б1и Уа1 Ьуз РЬе Азп Тгр 1 5 10 15 Туг Уа1 Азр С1у Уа1 61и Уа1 Ηί3 Азп А1а Ьуз ТЬг Ьуз 20 25

<210> 21 <211> 29 <212> БЕЛОК <213> Человеческий

- 76 009746 <400> 21

Уа1 Уа1 Уа1 Азр Уа1 Зег НЬз СЬи Азр Рго 10 61и Уа1 Ьуз РЬе Азп Тгр 15 1 5 Туг Уа1 . АЬа 61у УаЬ С1и УаЬ НЬз Азп АЬа Ьуз ТЬг Ьуз 20 25 <210> 22 <211> 29 <212> БЕЛОК <213> Человеческий <400> 22 УаЬ Уа! УаЬ Азр УаЬ Зег Н13 СЬи Азр Рго СЬи УаЬ Ьуз РЬе Азп Тгр 1 5 10 15 Туг Уа! Ьуз 61у Уа1 61и УаЬ НЬз Азп АЬа Ьуз ТЬг Ьуз 20 25 <210> 23 <211> 30 <212> БЕЛОК <213> Человеческий <400> 23 Суз Ьуз УаЬ Зег Азп Ьуз АЬа Ьеи Рго Ьуз Рго Не СЬи Ьуз ТЬг Не 1 5 10 15 Бег Ьуз А1а Ьуз 61у Б1п Рго Агд 61 и Рго Б1п УаЬ Туг ТЬг 20 25 30 <210 24 <211> 30 <212> БЕЛОК <213> Человеческий <400> 24 Суз Ьуз УаЬ Зег Азп Ьуз АЬа Ьеи Рго Агд Рго 1Ье СЬи Ьуз ТЬг 11е 1 5 10 15 Бег Ьуз АЬа Ьуз СЬу СЬп Рго Агд СЬи Рго СЬп УаЬ Туг ТЬг 20 25 30 <210> 25 <211> 30 <212> БЕЛОК <213> Человеческий <400> 25 Суз Ьуз УаЬ Зег Азп Ьуз АЬа Ьеи Рго АЬа Рго Азр 61 и Ьуз ТЬг Не 1 5 10 15

- 77 009746

Зег Ьуз ι АЬа Ьуз СЬу СЬп РГО Агд СЬи Рго СЬп УаЬ Туг ТЬг 20 25 30 <210> 26 <211> 30 <212> БЕЛОК <213> Человеческий <400> 26 Суа Дуг ; УаЬ Зег Азп Ьуз АЬа Ьеи Рго АЬа Рго СЬи СЬи Ьуз ТЬг 11е 1 5 10 15 Зег Ьуз АЬа Ьуз СЬу еьп Рго Агд СЬи Рго СЬп УаЬ Туг ТЬг 20 25 30 <210> 27 <211> 30 <212> БЕЛОК <213> Человеческий <400> 27 Суз Ьуз УаЬ Зег Азп Ьуз АЬа Ьеи Рго АЬа Рго Ьуз СЬи Ьуз ТЬг Не 1 5 10 15 Зег Ьуз АЬа Ьуз СЬу СЬп Рго Агд СЬи Рго СЬп УаЬ Туг ТЬг 20 25 30 <210> 28 <211> 30 <212> БЕЛОК <213> Человеческий <400> 28 Суз Ьуз УаЬ Зег Азп Ьуз АЬа Ьеи Рго АЬа Рго Агд СЬи Ьуз ТЬг 11е 1 5 10 15 Зег Ьуз АЬа Ьуз СЬу СЬп Рго Агд СЬи Рго СЬп УаЬ Туг ТЬг 20 25 30 <210> 29 <211> 30 <212> БЕЛОК <213> Человеческий <400> 29 Суз Ьуз УаЬ Зег Азп ьуз АЬа Ьеи Рго АЬа Рго Не СЬи Ьуз ТЬг Ые 1 5 10 15 Зег Ьуз ТЬг Ьуз СЬу СЬп Рго Агд СЬи Рго СЬп УаЬ Туг ТЬг 20 25 30

- 78 009746 <210>30 <211> 22 <212> БЕЛОК <213> Человеческий <400>30

Суз Леи УаБ

Ьуз 01у РЬе Туг Рго Зег Аар 11е Азр УаБ СБи Тгр С1и

5 1015

Зег Азп СБу СБп Рго СБи <210>31 <211>23 <212> БЕЛОК <213> Человеческий <400>31

Суз Зег УаБ Меб НБз СБи АБа Ьеи НБз Азп НБа Туг ТЬг СБп Ьуз Туг 15 1015

Ьеи Зег Ьеи Зег Рго СБу Ьуз <210>32 <211>990 <212> ДНК <213> ЧЕЛОВЕЧЕСКИЙ <400> 32

дссбссасса адддсссабс ддбсббсссс сХддсассск ссбссаадад сассбсбддд 60 ддсасадсдд сссбдддсбд ссбддбсаад дасЬасЪ^сс ссдаассддб дасддбдбсд 120 бддаасбсад дсдсссбдас садсддсдбд сасасс^Ъсс сддсбдбссб асадбссбса 180 ддасбсбасб сссбсадсад сдбддбдасс дСдссс^-сса дсадсббддд сасссадасс 240 басабсбдса асдбдаабса саадсссадс аасассаадд бддасаадаа ддббдадссс 300 ааабсббдбд асаааасбса сасабдссса ссд^дсссад сассбдаасб ссбдддддда 360 ссдбсадбсб бссбсббссс сссаааассс ааддасассс бсабдабсбс ссддассссб 420 даддбсасаб дсдбддбддб ддасдбдадс сасдаадасс сбдаддбсаа дббсаасбдд 480 басдбддасд дсдбддаддб дсабаабдсс аадасааадс сдсдддадда дсадбасаас 540 адсасдбасс дбдбддбсад сдбссбсасс д^сс^дсасс аддасбддсб даабддсаад 630 дадбасаадб дсааддбсбс саасааадсс сЕсссадссс ссабсдадаа аассабсбсс 660 ааадссааад ддсадссссд адаассасад дЬдЕасассс бдсссссабс ссдддасдад 720 сбдассаада ассаддбсад ссбдассбдс с±дд£сааад дсббсбабсс садсдасабс 780

- 79 009746

дссдЪддадП дддададсаа Едддсадссд дадаасаасг асаадассас дссЕсссдЕд 840 сГддасСссд асддсЕссЕЕ сЕЕссЕсЕаЕ адсаадсЕса ссдЕддасаа дадсаддЕдд 900 садсадддда. асдЕсЕЕсЕс аЕдсЕссдЕд аЕдсаЕдадд сЕсЕдсасаа ссасЕасасд 960 садаададсс ЕсЕсссЕдЕс ЕссдддЕааа 990

<210>

<211>

<212>

<213>

ДНК

ЧЕЛОВЕЧЕСКИЙ <400> дсассЕдаас ЕссЕдддддд ассдЕсадГс

ГЕссЕсГГсс ссссаааасс сааддасасс сЕсаГдаЕсЕ сссддасссс

ЕдаддЕсаса

Еде <210>

<211>

<212>

<213>

ДНК

ЧЕЛОВЕЧЕСКИЙ <400>

дЕддЕддЕдд асдЕдадсса сдаадасссЕ даддЕсаадГ

ЕсаасЕддЕа сдЕддасддс дЕддаддГдс аЕааЕдссаа дасааад <210> <211>

<212>

<213>

ДНК

ЧЕЛОВЕЧЕСКИЙ <400>

ЕдсааддЕсЕ ссаасааадс ссЕсссадсс сссаЕсдада ааассаЕсЕс сааадссааа дддсадсссс дадаассаса ддЕдЕасасс <210>

<211>

<212>

<213>

ДНК

ЧЕЛОВЕЧЕСКИЙ <400>

ЕдсЕссдЕда ЕдсаЕдаддс

ГсЕдсасаас сасЕасасдс адаададссГ сЕсссЕдЕсЕ ссдддЕааа <210>

<211>

<212>

<213>

ДНК

ЧЕЛОВЕЧЕСКИЙ <400>

ЕдссЕддЕса ааддсЕЕсЕа

Есссадсдас аЕсдссдЕдд адЕдддадад сааЕдддсад ссддад

- 80 009746

<210> 38 <211> 93 <212> ДНК <213> ЧЕЛОВЕЧЕСКИЙ <400> 38 дсассЬдаас СссСдддддд ассдСсадСс ЬЬссСсСЕсс ссссааааса сааддасасс 60 сСсаСдаСсС сссддасссс СдаддСсаса Ьдс 93 <210> 39 <211> 93 <212> ДНК <213> ЧЕЛОВЕЧЕСКИЙ <400> 39 дсассСдаас СссСдддддд ассд+садСс СЬссСсССсс ссссаааааН сааддасасс 60 сЬсаЬдаСсС сссддасссс СдаддСсаса Где 93 <210> 40 <211> 93 <212> ДНК <213> ЧЕЛОВЕЧЕСКИЙ <400> 40 дсассгдаас СссЬдддддд ассдСсадбс НссШссс ссссаааас'С дааддасасс 60 сСсаСдаСсС сссддасссс СдаддЬсаса Сде 93 <210> 41 <211> 93 <212> ДНК <213> ЧЕЛОВЕЧЕСКИЙ <400> 41 дсассСдаас ЬссСдддддд ассдЬсадСс ССссСсССсс ссссаааасс сааддасасс 60 ССсаСдаСсС сссддасссс СдаддСсаса Сде 93 <210> 42 <211> 93 <212> ДНК <213> ЧЕЛОВЕЧЕСКИЙ <400> 42 дсассбдаас ЪссСдддддд ассдСсадСс ССссЁсССсс ссссаааасс сааддасасс 60 сСсаСдаСсЬ сссддаЬдсс СдаддСсаса Ьдс 93 <210> 43 <211> 93 <212> ДНК <213> ЧЕЛОВЕЧЕСКИЙ <400> 43 дсасс+даас СссСдддддд ассд+сад+с ССссСсССсс ссссаааасс сааддасасс 60 сЬсаСдаСсС сссддссасс СдаддЬсаса Сде 93

- 81 009746 <210> 44 <211> 87 <212> ДНК <213> ЧЕЛОВЕЧЕСКИЙ <400> 44

дЪддкддкдд асдбдадсда дСддаддкдс акаакдссаа сдаадасссЬ дасааад даддксаад! ксааскддСа сд+ддасддс 60 87 <210> 45 <211> 87 <212> ДНК <213> ЧЕЛОВЕЧЕСКИЙ <400> 45 дкддЬддкдд асдбдадсда ддаадасссЪ даддксаад! !саас!дд!а сдкддасддс 60 д^ддадд+дс акаакдссаа дасааад 87 <210> 46 <211> 87 <212> ДНК <213> ЧЕЛОВЕЧЕСКИЙ <4 00> 46 дкддКддкдд асдЕдадсса сдаадасссЪ даддЪсаад! Ьсаас!дд!а сдГддссддс 60 дСддадд-Ьдс аЪааЬдссаа дасааад 87 <210> 47 <211> 87 <212> ДНК <213> ЧЕЛОВЕЧЕСКИЙ <400> 47 дДддкддкдд асдЬдадсса сдаадассс1: даддЪсаадк ЬсаасиддОа сдрдаааддс 60 дкддаддкдс аГаакдссаа дасааад 87 <210> 48 <211> 90 <212> ДНК <213> ЧЕЛОВЕЧЕСКИЙ <400 48 ЬдсааддЪсЪ ссаасааадс сс^сссаааа ссса+сдада ааассаксСс сааадссааа 60 дддсадсссс дадаассаса. дд£д£асасс 90 <210> 49 <211> 90 <212> ДНК <213> ЧЕЛОВЕЧЕСКИЙ <400 49 ЬдсааддЪс! ссаасааадс сс^сссасдс ссса-Ссдада ааассакскс сааадссааа 60

- 82 009746

дддсадсссс дадаассаса ддбдбасасс 90 <210> 50 <211> 90 <212> ДНК <213> ЧЕЛОВЕЧЕСКИЙ <400> 50 ^дсаадд^сЬ ссаасааадс ссбсссадсс сссдасдада ааассаСсбс сааадссааа 60 дддсадсссс дадаассаса ддЬдбасасс 90 <210> 51 <211> 90 <212> ДНК <213> ЧЕЛОВЕЧЕСКИЙ <4 00> 51 Ъдсаадд^сЪ ссаасааадс ссбсссадсс сссдаддада ааассабсбс сааадссааа 60 дддсадсссс дадаассаса ддбдбасасс 90 <210> 52 <211> 90 <212> ДНК <213> ЧЕЛОВЕЧЕСКИЙ <400> 52 ЪдсааддЪсТ: ссаасааадс ссбсссадсс сссааадада ааассабсСс сааадссааа 60 дддсадсссс дадаассаса ддбдбасасс 90 <210> 53 <211> 90 <212> ДНК <213> ЧЕЛОВЕЧЕСКИЙ <4 00> 53 ЬдсааддЬсЪ ссаасааадс ссбсссадсс ссссдсдада ааассабсбс сааадссааа 60 дддсадсссс дадаассаса ддбдбасасс 90 <210> 54 <211> 90 <212> ДНК <213> ЧЕЛОВЕЧЕСКИЙ <400> 54 ЬдсааддЪсЪ ссаасааадс ссбсссадсс сссаЬсдада ааассабсбс саааассааа 60 дддсадсссс дадаассаса ддбдбасасс 90 <210> 55 <211> 66 <212> ДНК <213> ЧЕЛОВЕЧЕСКИЙ

- 83 009746 <400>55 бдссбддбса ааддсббсба бсссадсдас абсдасдбдд адбдддадад саабдддсад 60 ссддад66 <210>56 <211>69 <212> ДНК <213> ЧЕЛОВЕЧЕСКИЙ <400>56