BR112012022210B1 - Anticorpo isolado ou seu fragmento imunorreativo, molécula de ácido nucleico, composição farmacêutica, e, uso do anticorpo isolado - Google Patents

Abstract

anticorpo isolado ou seu fragmento imunorreativo, hibridoma, molécula de ácido nucleico, reagente de redirecionamento de dupla afinidade (dartth), composição farmacêutica, e, uso do anticorpo isolado a presente invenção se refere a anticorpos e seus fragmentos que são imunorreativos para os mamíferos, e mais particularmente, o receptor b7-h3 humano e o uso dos mesmos, particularmente no tratamento de câncer e inflamação. a invenção assim particularmente diz respeito a anticorpos humanizados b7-h3 reativos e seus fragmentos imunorreativos que são capazes de mediar, e mais preferivelmente aumentar a ativação do sistema imune contra células cancerígenas que estão associadas com uma variedade de câncera humanos;

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS:

[001] Esse pedido de patente reivindica a prioridade dos Números Seriais dos Pedidos de Patente Norte- Americana 61/310. 692 (depositado em 4 de março de 2010; pendente); 61/310 .695 (depositado em 4 de março de 2010; pendente) 61/311. 057 (depositado em 5 de março de 2010; pendente), cada um desses pedidos de patente é incorporado aqui por referência em sua totalidade.

REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIA:

[002] Esse pedido de patente inclui uma ou mais Listagens de Sequência nos termos da C.F.R. 37 1.821 et seq., as quais são descritas tanto em papel quanto em mídia legível em computador, e cujas descrições em papel e legíveis em computador são incorporadas aqui por referência em sua totalidade.

HISTÓRICO DA INVENÇÃO: CAMPO DA INVENÇÃO

[003] A presente invenção se refere a anticorpos e seus fragmentos que são imunorreativos ao mamífero, e mais particularmente, ao receptor humano de B7-H3 e a seus usos, particularmente no tratamento de câncer e inflamação. A invenção assim particularmente se refere a anticorpos humanizados reativos a B7-H3 e seus fragmentos imunorreativos que são capazes de mediar, e mais preferencialmente aumentar a ativação do sistema imune contra as células cancerosas que estão associadas com uma variedade de cânceres humanos.

DESCRIÇÃO DA MATÉRIA RELACIONADA:

[004] O crescimento e a metástase de tumores dependem de uma ampla extensão em sua capacidade de evadir a vigilância imunológica do hospedeiro e superar as defesas do hospedeiro. A maior parte dos tumores expressa antígenos que podem ser reconhecidos a uma extensão variável pelo sistema imune do hospedeiro, mas em muitos casos, uma resposta imune inadequada é suscitada por causa da ativação ineficaz das células T efetoras (Khawli, L.A. et al. (2008) “Cytokine, Chemokine, and Co-Stimulatory Fusion Proteins for the Immunotherapy of Solid Tumors,” Exper. Pharmacol. 181:291-328).

[005] Linfócitos T CD4+ são os organizadores essenciais da maior parte das respostas imune e autoimune dos mamíferos (Dong, C. et al. (2003) “Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules” Immunolog. Res. 28(l):39-48). Foi descoberto que a ativação das células T auxiliares CD4+ é mediada através de interações coestimulatórias entre as Células Apresentadoras de Antígeno e linfócitos T CD4+ naturais. Duas interações são requeridas (Viglietta, V. et al. (2007) “Modulating Co-Stimulation” Neurotherapeutics 4:666-675; Korman, A.J. et al. (2007) “Checkpoint Blockade in Cancer Immunotherapy” Adv. Immunol. 90:297-339). Na primeira interação, uma Célula Apresentadora de Antígeno deve exibir o antígeno alvo relevante ligado ao complexo de histocompatibilidade principal da célula de modo que ele possa se unir ao receptor de célula T (“TCR”) de um linfócito T CD4+ natural. Na segunda interação, um ligante da Célula Apresentadora de Antígeno deve se unir a um receptor CD28 do linfócito T CD4+ (Dong, C. et al. (2003) “Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules,” Immunolog. Res. 28(l):39- 48; Lindley, P.S. et al. (2009) “The Clinical Utility Of Inhibiting CD28-Mediated Costimulation,” Immunol. Rev. 229:307-321). As células T auxiliares CD4+ que experimentam ambos os sinais estimulatórios são então capazes de responder as citocinas (tais como Interleucina-2 e Interleucina-12 para desenvolver em células Th1). Tais células produzem interferon-gama (IFN-y) e fator-alfa de necrose de tumor (TNF-α), que medeiam as respostas inflamatórias para as células alvo que expressam o antígeno alvo. A ativação da célula B e proliferação também ocorre, resultando na produção do anticorpo específico para o antígeno alvo (Bernard, A. et al. (2005) “T and B Cell Cooperation: A Dance of Life and Death” Transplantation 79:S8-S11). Na ausência de ambos os sinais coestimulatórios durante envolvimento do TCR, as células T entram em um estado funcionalmente sem resposta, referidas como uma anergia clonal (Khawli, L.A. et al. (2008) “Cytokine, Chemokine, and Co-Stimulatory Fusion Proteins for the Immunotherapy of Solid Tumors,” Exper. Pharmacol. 181:291-328). Em estados patológicos, as células Th1 são as protagonistas de várias doenças autoimunes específicas do órgão, tais como diabetes tipo I, artrite reumatoide, e esclerose múltipla (Dong, C. et al. (2003) “Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules,” Immunolog. Res. 28(l):39- 48).

I. A SUPERFAMÍLIA B7 E B7—H3

[006] As investigações nos ligantes do receptor CD28 levaram à caracterização de um conjunto de moléculas relacionadas conhecidas como a superfamília B7 (Coyle, A.J. et al. (2001) “The Expanding B7 Superfamily: Increasing Complexity In Costimulatory Signals Regulating T Cell Function,” Nature Immunol. 2(3):203-209; Sharpe, A.H. et al. (2002) “The B7-CD28 Superfamily” Nature Rev. Immunol. 2:116-126; Greenwald, R.J. et al. (2005) “The B7 Family Revisited,” Ann. Rev. Immunol. 23:515-548; Collins, M. et al. (2005) “The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands,” Genome Biol. 6:223.1-223.7; Loke, P. et al. (2004) “Emerging Mechanisms Of Immune Regulation: The Extended B7 Family And Regulatory T Cells.” Arthritis Res. Ther. 6:208-214; Korman, A.J. et al. (2007) “Checkpoint Blockade in Cancer Immunotherapy,” Adv. Immunol. 90:297-339; Flies, D.B. et al. (2007) “The New B7s: Playing a Pivotal Role in Tumor Immunity,” J. Immunother. 30(3):251-260; Agarwal, A. et al. (2008) “The Role Of Positive Costimulatory Molecules In Transplantation And Tolerance” Curr. Opin. Organ Transplant. 13:366-372; Lenschow, D.J. et al. (1996) “CD28/B7 System of T Cell Costimulation” Ann. Rev. Immunol. 14:233-258; Wang, S. et al. (2004) “Co-Signaling Molecules Of The B7-CD28 Family In Positive And Negative Regulation Of T Lymphocyte Responses,” Microbes Infect. 6:759-766). Atualmente, há sete membros conhecidos da família: B7.1 (CD80), B7.2 (CD86), o ligante coestimulador induzível (ICOS-L), o ligante 1 de morte programada (PD-L1), o ligante 2 de morte programada (PD-L2), B7-H3 e B7-H4 (Collins, M. et al. (2005) “The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands,” Genome Biol. 6:223,1-223,7).

[007] Os membros da família B7 são membros da superfamília da imunoglobulina com um domínio tipo imunoglobulina V e tipo imunoglobulina C (por exemplo, IgV- IgC) (Sharpe, A.H. et al. (2002) “The B7-CD28 Superfamily,” Nature Rev. Immunol. 2:116-126). Os domínios IgV e IgC dos membros da família B7 são cada um codificados pelos éxons individuais, com éxons adicionais que codificam as sequências líder, os domínios da transmembrana e citoplásmicos. Os domínios citoplásmicos são curtos, variando em comprimento de 19 a 62 resíduos de aminoácidos e podem ser codificados pelos éxons múltiplos (Collins, M. et al. (2005) “The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands” Genome Biol. 6:223,1-223,7). B7-H3 é a simples em que a forma humana principal contém dois domínios IgV-IgC paralelos extracelulares (isto é, IgV-IgC- IgV-IgC) (Collins, M. et al. (2005) “The B7 Family Of Immune- Regulatory Ligands,” Genome Biol. 6:223,1-223,7). Os membros da família B7 são previstos para formar homodímeros não covalentes, do tipo back-to-back, na superfície da célula, e tais dímeros foram encontrados com respeito a B7-1 (CD80) e B7-2 (CD86).

[008] A exibição de B7-1 (CD80) e B7-2 (CD86) tem especificidade dupla para o receptor CD28 estimulatório e o receptor CTLA-4 (CD 152) inibitório (Sharpe, A.H. et al. (2002) “The B7-CD28 Superfamily,” Nature Rev. Immunol. 2:116-126).

[009] Embora inicialmente pensado em compreender apenas 2 domínios Ig (IgV-IgC) (Chapoval, A. et al. (2001) “B7-H3: A Costimulatory Molecule For T Cell Activation and IFN-y Production,” Nature Immunol. 2:269-274; Sun, M. et al. (2002) “Characterization of Mouse and Human B7-H3 Genes,” J. Immunol. 168:6294-6297), uma variável de domínio extracelular de quatro imunoglobulinas (“4Ig-B7-H3”) foi identificada e descobriu-se ser a forma humana mais comum da proteína (Sharpe, A.H. et al. (2002) “The B7-CD28 Superfamily,” Nature Rev. Immunol. 2:116-126). Nenhuma diferença funcional foi observada entre essas duas formas, uma vez que a forma murina natural (2Ig) e a forma humana de 4Ig exibem função similar (Hofmeyer, K. et al. (2008) “The Contrasting Role Of B7-H3,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 105(30):10277-10278). A molécula 4Ig-B7-H3 inibe a lise mediada por célula exterminadora natural de células cancerosas (Castriconi, R. et al. “Identification Of 4Ig-B7- H3 As A Neuroblastoma-Associated Molecule That Exerts A Protective Role From An NK Cell-Mediated Lysis,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 101 (34): 12640- 12645). Descobriu-se que a B7-H3 humana (forma 2Ig) promove a ativação da célula T e produção de IFN-Y ligando a um receptor putativo em células T ativadas (Chapoval, A. et al. (2001) “B7-H3: A Costimulatory Molecule For T Cell Activation and IFN-y Production” Nature Immunol. 2:269-274; Xu, H. et al. (2009) “MicroRNA miR-29 Modulates Expression of Immunoinhibitory Molecule B7-H3: Potential Implications for Immune Based Therapy of Human Solid Tumors,” Cancer Res. 69(15):5275-6281). Ambas B7-H4 e B7-H1 são inibidores potentes de função imune quando expressas em células tumorais (Flies, D.B. et al. (2007) “The New B7s: Playing a Pivotal Role in Tumor Immunity,” J. Immunother. 30(3):251-260).

[0010] O modo de ação da B7-H3 é complexo, já que a proteína medeia tanto a coestimulação quanto a coinibição da célula T (Hofmeyer, K. et al. (2008) “The Contrasting Role Of B7-H3,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 105(30):10277-10278; Martin-Orozco, N. et al. (2007) “Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity” Semin. Cancer Biol. 17(4):288-298; Subudhi, S.K. et al. (2005) “The Balance Of Immune Responses: Costimulation Verse Coinhibition,” J. Mol. Med. 83:193-202). B7-H3 se une ao transcrito 2 tipo (TREM) (TLT-2) e coestimula a ativação da célula T, mas também se une ao(s) receptor(es) como não identificado para mediar a coinibição das células T. Além disso, B7-H3, através de interações com receptor(es) desconhecidos, é um inibidor para células exterminadoras naturais e células osteoblásticas (Hofmeyer, K. et al. (2008) “The Contrasting Role Of B7-H3” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 105(30):10277-10278). A inibição pode operar através de interações com membros das principais vias de sinalização através das quais o receptor de célula T (TCR) regula a transcrição do gene (por exemplo, fatores NFTA, NF-KB, ou AP- 1).

[0011] B7-H3 coestimula a proliferação de célula T CD4+ e CD8+. B7-H3 também estimula a produção de IFN-Y e atividade lítica de CD8+ (Chapoval, A. et al. (2001) “B7-H3: A Costimulatory Molecule For T Cell Activation and IFN-y Production,” Nature Immunol. 2:269-274; Sharpe, A.H. et al. (2002) “The B7-CD28 Superfamily,” Nature Rev. Immunol. 2:116-126). Entretanto, a proteína também possivelmente age através de fatores NFAT (fator nuclear para células T ativadas), NF- kB (fator nuclear kappa B), e AP-1 (Proteína-1 Ativadora) para inibir a ativação da célula T (Yi. K.H. et al. (2009) “Fine Tuning The Immune Response Through B7-H3 And B7-H4,” Immunol. Rev. 229:145-151). Acredita-se também que B7-H3 iniba Th1, Th2, ou Th17 in vivo (Prasad, D.V. et al. (2004) “Murine B7-H3 Is A Negative Regulator Of T Cells” J. Immunol. 173:2500-2506; Fukushima, A. et al. (2007) “B7-H3 Regulates The Development Of Experimental Allergic Conjunctivitis In Mice,” Immunol. Lett. 113:52-57; Yi. K.H. et al. (2009) “Fine Tuning The Immune Response Through B7-H3 And B7-H4,” Immunol. Rev. 229:145-151). Diversos estudos independentes mostraram que células tumorais malignas humanas exibem um aumento marcado na expressão da proteína B7-H3 e que essa expressão aumentada estava associada com gravidade aumentada da doença (Zang, X. et al. (2007) “The B7 Family And Cancer Therapy: Costimulation And Coinhibition” Clin. Cancer Res. 13:5271-5279), sugerindo que a B7-H3 é explorada pelos tumores como uma via de evasão imune (Hofmeyer, K. et al. (2008) “The Contrasting Role Of B7-H3” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 105(30):10277-10278).

[0012] Moléculas que bloqueiam a habilidade de uma molécula B7 para ligar a um receptor de célula T (por exemplo, CD28) inibem o sistema imune e foram propostas como tratamentos para doença autoimune (Linsley, P.S. et al. (2009) “The Clinical Utility Of Inhibiting CD28-Mediated Co-Stimulation,” Immunolog. Rev. 229:307-321). As células de neuroblastoma que expressam 4Ig-B7-H3 tratada com anticorpos anti-4Ig-B7-H3 foram mais suscetíveis a células NK. Entretanto, não está claro se essa atividade pode ser atribuída a apenas anticorpos contra a forma 4Ig-B7-H3 porque todos os anticorpos relatados produzidos contra a 4Ig-B7-H3 também se uniram à forma tipo Ig da B7H3 (Steinberger, P. et al. (2004) “Molecular Characterization of Human 4Ig-B7-H3, a Member of the B7 Family with Four Ig-Like Domains,” J. Immunol. 172(4): 2352-2359 e Castriconi et al. (2004) “Identification Of 4Ig-B7-H3 As A Neuroblastoma-Associated Molecule That Exerts A Protective Role From An NK Cell- Mediated Lysis,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 101(34): 12640-12645).

[0013] B7-H3 não é expressa nas células B ou T em repouso, monócitos, ou células dendríticas, mas é induzida em células dendríticas por IFN-Y e em monócitos por GM-CSF (Sharpe, A.H. et al. (2002) “The B7-CD28 Superfamily,” Nature Rev. Immunol. 2:116-126). O(s) receptor(es) que se une(m) ao B7-H3 não foi(foram) completamente caracterizado(s). Trabalhos recentes sugeriram que um receptor precisaria ser rápido e transitoriamente regulado em células T depois da ativação (Loke, P. et al. (2004) “Emerging Mechanisms Of Immune Regulation: The Extended B7 Family And Regulatory T Cells.” Arthritis Res. Ther. 6:208-214). Recentemente, o receptor de transcrito 2 tipo (TREM) (TLT-2, ou TREML2) (King, R.G. et al. (2006) “Trem-Like Transcript 2 Is Expressed On Cells Of The Myeloid/Granuloid And B Lymphoid Lineage And Is Up-Regulated In Response To Inflammation,” J. Immunol. 176:6012-6021; Klesney-Tait, J. et al. (2006) “The TREM Receptor Family And Signal Integration,” Nat. Immunol. 7:1266-1273; Yi. K.H. et al. (2009) “Fine Tuning The Immune Response Through B7-H3 And B7-H4,” Immunol. Rev. 229:145-151, o qual é expresso em células mieloides, foi mostrado ser capaz de se unir a B7-H3, e desta forma coestimular a ativação das células T CD8+ em particular (Zang, X. et al. (2003) “B7x: A Widely Expressed B7 Family Member That Inhibits T Cell Activation,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 100:10388-10392; Hashiguchi, M. et al. (2008) “Triggering Receptor Expressed On Myeloid Cell-Like Transcript 2 (TLT-2) Is A Counter-Receptor For B7-H3 And Enhances T Cell Responses” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 105(30):10495-10500; Hofmeyer, K. et al. (2008) “The Contrasting Role Of B7-H3” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 105(30):10277-10278).

[0014] Além da sua expressão em células de neuroblastoma, sabe-se também que B7-H3 humana é expressa em uma variedade de outras células cancerosas (por exemplo, cânceres gástricos, de ovário e de pulmão de células não pequenas). A expressão da proteína B7-H3 foi imuno- histologicamente detectada em linhagens de célula tumoral (Chapoval, A. et al. (2001) “B7-H3: A Costimulatory Molecule For T Cell Activation and IFN-y Production,” Nature Immunol. 2:269-274; Saatian, B. et al. (2004) “Expression Of Genes For B7-H3 And Other T Cell Ligands By Nasal Epithelial Cells During Differentiation And Activation,” Amer. J. Physiol. Pulmão Cell. Mol. Physiol. 287:L217-L225; Castriconi et al. (2004) “Identification Of 4Ig-B7-H3 As A Neuroblastoma-Associated Molecule That Exerts A Protective Role From An NK Cell-Mediated Lysis,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 101(34):12640-12645); Sun, M. et al. (2002) “Characterization of Mouse and Human B7-H3 Genes,” J. Immunol. 168:6294-6297). A expressão de mRNA foi descoberta em células do coração, rim, pulmão, fígado, pâncreas, próstata, colo e osteoblasto (Collins, M. et al. (2005) “The B7 Family Of Immune- Regulatory Ligands,” Genome Biol. 6:223,1-223,7). No nível da proteína, B7-H3 é encontrada no fígado, pulmão, bexiga, testículos, próstata, mama, placenta humana e órgãos linfoides (Hofmeyer, K. et al. (2008) “The Contrasting Role Of B7-H3” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 105(30):10277-10278).

II. ANTICORPOS TERAPÊUTICOS

[0015] Além de seus usos conhecidos em diagnósticos, os anticorpos foram mostrados serem úteis como agentes terapêuticos. Por exemplo, a imunoterapia, ou o uso de anticorpos para fins terapêuticos, tem sido usada nos últimos anos para tratar o câncer. A imunoterapia passiva envolve o uso de anticorpos monoclonais em tratamentos de câncer (ver, por exemplo, DEVITA, HELLMAN, E CÂNCER DE ROSENBERG: PRINCÍPIOS & PRÁTICA DE ONCOLOGIA, OITAVA EDIÇÃO (2008), DeVita, V. et al. Eds., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, pp. 537-547, 2979-2990). Esses anticorpos podem ter atividade terapêutica biológica inerente tanto pela inibição direta do crescimento ou sobrevivência da célula tumoral quanto pela sua habilidade para recrutar a atividade exterminadora de célula natural do sistema imune do corpo. Esses agentes podem ser administrados sozinhos ou em conjunto com radiação ou agentes terapêuticos. Rituximabe e Trastuzumabe, aprovados para o tratamento de linfoma de não Hodgkin e câncer de mama, respectivamente, são exemplos de tais terapêuticos. Alternativamente, os anticorpos podem ser usados para fazer conjugados de anticorpo em que o anticorpo se une a um agente tóxico e direciona aquele agente ao tumor se unindo especificamente ao tumor. Gemtuzumabe ozogamicina é um exemplo de um anticorpo aprovado conjugado usado para o tratamento de leucemia.

[0016] Os anticorpos monoclonais que se unem às células cancerosas e têm usos potenciais para diagnóstico e terapia foram descritos (ver, por exemplo, os pedidos de patente a seguir que descrevem, entre outros, alguns pesos moleculares de proteínas alvo: Patente Norte-Americana n° 6.054.561 (200 kD c-erbB-2 (Her2), e outros antígenos desconhecidos de 40 a 200 KD de tamanho) e Patente Norte- Americana n° 5.656.444 (50 kD e 55 kD de proteína oncofetal)). Exemplos de anticorpos em ensaios clínicos e/ou aprovados para tratamento de tumores sólidos incluem: Trastuzumabe (antígeno: 180 kD, HER2/neu), Edrecolomabe (antígeno: 40 a 50 kD, Ep-CAM), glóbulos de gordura do leite anti-humano (HMFG1) (antígeno >200 kD, HMW Mucin), Cetuximabe (antígenos: 150 kD e 170 kD, receptor EGF), Alemtuzumabe (antígeno: 21 a 28 kD, CD52), e Rituximabe (antígeno: 35 kD, CD20).

[0017] Os alvos de antígeno de Trastuzumabe (receptor Her-2), que é usado para tratar câncer de mama, e Cetuximabe (receptor EGF), que está em ensaios clínicos para o tratamento de diversos cânceres, estão presentes em alguns níveis detectáveis em um grande número de tecidos normais de adulto humano incluindo pele, colo, pulmão, ovário, fígado e pâncreas. A margem de segurança no uso desses terapêuticos é possivelmente provida pela diferença nos níveis de expressão de antígeno ou no acesso de ou atividade do anticorpo nesses locais.

[0018] Outro tipo de imunoterapia é imunoterapia ativa, ou vacinação, com um antígeno presente em um(uns) câncer(es) específico(s) ou um construto de DNA que direciona a expressão do antígeno, o qual então evoca a resposta imune no indivíduo, isto é, induz o indivíduo a produzir ativamente anticorpos contra seu próprio câncer. A imunização ativa não tem sido usada com tanta frequência quanto à imunoterapia ou imunotoxinas.

[0019] Diversos modelos de progressão de doença (incluindo câncer) têm sido sugeridos. Teorias variam de causa por um simples evento contagioso/ de transformação para a evolução do tipo de tecido crescente “como doença” ou “como câncer” conduzindo por fim a um com capacidade totalmente patogênica ou maligna. Alguns argumentam que com câncer, por exemplo, um evento simples mutacional é suficiente para causar malignidade, enquanto outros argumentam que alterações subsequentes também são necessárias. Alguns outros têm sugerido que aumentar a carga mutacional e o grau do tumor é necessário para ambas a iniciação bem como a progressão da neoplasia através de uma continuidade de eventos de seleção de mutação no nível celular. Alguns alvos de câncer são encontrados apenas em tecidos tumorais, enquanto outros estão presentes em tecidos normais e são regulados e/ou superexpressos em tecidos tumorais. Em tais situações, alguns pesquisadores sugeriram que a superexpressão está ligada à aquisição de malignidade, enquanto outros sugerem que a superexpressão é meramente um marcador de uma tendência junto a uma via para um estado de doença aumentado.

[0020] Em alguns casos, mostrou-se que os alvos de câncer, tais como oncoproteínas expressas ou superexpressas em tumores, estão presentes durante o desenvolvimento embrionário e fetal e servem como um regulador de crescimento e diferenciação. Alguns pesquisadores descobriram que a expressão dessas oncoproteínas durante o desenvolvimento embrionário e fetal parece ser restrita a tecidos específicos, e também restrita a estágios específicos do desenvolvimento. Em contraste, foi mostrado que a expressão dessas oncoproteínas no adulto está associada com superexpressão no crescimento do tumor e/ou um malfuncionamento das proteínas supressoras do tumor.

[0021] Um diagnóstico ideal e/ou anticorpo terapêutico seria específico para um antígeno presente em um grande número de cânceres, mas ausente ou presente apenas em níveis baixos em qualquer tecido normal. A descoberta, caracterização e isolamento de um novo anticorpo capaz de se unir a um antígeno que está especificamente associado com câncer(es) seriam úteis em muitas maneiras. Primeiro, o anticorpo teria atividade biológica contra tais células cancerosas e seria capaz de recrutar a resposta do sistema imune para desta forma tratar a doença. O anticorpo poderia ser administrado como um terapêutico sozinho ou em combinação com tratamentos atuais, ou usado para preparar imunoconjugados ligados aos agentes tóxicos. Um anticorpo com a mesma especificidade, mas com baixa ou nenhuma atividade biológica quando administrado sozinho, também poderia ser útil em que um anticorpo poderia ser usado para preparar um imunoconjugado com um radioisótopo, uma toxina ou um agente quimioterápico ou lipossoma contendo um agente quimioterápico, com a forma conjugada estando biologicamente ativa em virtude de o anticorpo direcionar a toxina para as células contendo antígeno.

[0022] Conforme discutido acima, os anticorpos e outras moléculas que especificamente se unem a B7-H3 foram descritos (ver, Patente Norte-Americana n° 7.527.969; 7.368.554; 7.358.354; e 7.279.567; Publicações dos Pedidos de Patente Norte-Americana n°s US 20090087416; US 20090022747; US20090018315; US2008116219; US20080081346; US 20050202536; US20030103963; US20020168762; Publicações do PCT n°s WO 2008/116219; WO 2006/016276; WO 2004/093894; WO 04/001381; WO 2002/32375; WO 2002/10187 e WO 2001/094413; EP 1292619B; Modak, S. et al. (March 1999) “Disialoganglioside GD2 And Antigen 8H9: Potential Targets For Antibody-Based Immunotherapy Against Desmoplastic Small Round Cell Tumor (DSRCT) And Rhabdomyosarcoma (RMS),” Proceedings Of The American Association For Cancer Research Annual Meeting, Vol. 40:474 (90th Annual Meeting Of The American Association For Cancer Research; Philadelphia, Pennsylvania, US; April 10-14, 1999; Modak, S. et al. (March 2000) “Radioimmunotargeting To Human Rhabdomyosarcoma Using Monoclonal Antibody 8H9,” Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 41:724; Modak, S. et al. (2001) “Monoclonal Antibody 8H9 Targets A Novel Cell Surface Antigen Expressed By A Wide Spectrum Of Human Solid Tumors,” Cancer Res. 61(10):4048-4054; Steinberger, P. et al. (2004) “Molecular Characterization of Human 4Ig-B7-H3, a Member of the B7 Family with Four Ig-Like Domains,” J. Immunol. 172(4):2352-2359; Xu, H. et al. (2009) “MicroRNA miR-29 Modulates Expression of Immunoinhibitory Molecule B7-H3: Potential Implications for Immune Based Therapy of Human Solid Tumors,” Cancer Res. 69(15):5275-6281).

[0023] Não obstante, um aspecto desejável de um diagnóstico ideal e/ou anticorpo terapêutico seria a descoberta e a caracterização de novos anticorpos capazes de mediar e, particularmente, aumentar à ativação do sistema imune contra as células cancerosas (especialmente as células cancerosas humanas) que estão associadas com uma variedade de cânceres. Tais composições também seriam úteis para descoberta de fármaco (por exemplo, moléculas pequenas) e para mais caracterização de regulação celular, crescimento, e diferenciação.

[0024] Assim, apesar de todos os avanços anteriores, uma necessidade permanece para composições melhoradas capazes de se unirem às células cancerosas e de facilitar ou mediar uma resposta imune contra as células cancerosas. Tais composições podem ser usadas para diagnosticar e tratar tais cânceres. Existe uma necessidade adicional, com base nas descobertas descritas aqui, para novas composições que especificamente reconhecem alvos duplos na superfície das células, e que podem desta forma modular, quer reduzindo ou aumentando, as capacidades de B7-H3 para mediar a ativação da célula T ou pelo reconhecimento e extermínio das células cancerosas que expressam B7-H3. Um objetivo dessa invenção é identificar tais composições. Outro objetivo é prover novos compostos para uso no ensaio de expressão de B7-H3.

[0025] Conforme descrito em detalhes abaixo, a presente invenção se refere a novos anticorpos, incluindo, em particular, reagentes de redirecionamento de dupla afinidade (“DARTTMs”) que compreendem moduladores de ativação de célula T B7-H3, que são capazes de influenciar a ativação de célula T bem como novos anticorpos que se unem aos receptores de B7- H3 de células cancerosas e facilitam ou medeiam a morte de tais células. A presente invenção é direcionada a tais composições e aos seus usos em diagnósticos e no tratamento de doenças tal como câncer.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO:

[0026] A presente invenção se refere a anticorpos e seus fragmentos que são imunorreativos ao mamífero, e mais particularmente, ao receptor humano de B7-H3 e a seus usos, particularmente no tratamento de câncer e inflamação. A invenção assim, particularmente, diz respeito a anticorpos reativos humanizados de B7-H3 e seus fragmentos imunorreativos que são capazes de mediar e, mais preferencialmente, aumentar a ativação do sistema imune contra as células cancerosas que estão associadas com uma variedade de cânceres humanos.

[0027] Em detalhe, a invenção diz respeito a um anticorpo isolado ou seu fragmento imunorreativo, em que o anticorpo isolado ou o fragmento compreende um domínio variável que especificamente se une a um domínio extracelular de B7-H3, em que o anticorpo concorre para se unir a B7-H3 com quaisquer anticorpos: BRCA69D, BRCA84D, ou PRCA157.

[0028] A invenção ainda diz respeito ao anticorpo isolado descrito acima ou seu fragmento imunorreativo, em que o anticorpo ou o fragmento compreende um domínio variável que compreende:(A) CDRi (SEQ ID NO: 21), CDR2 (SEQ ID NO: 23) e CDR3 (SEQ ID NO: 25) da cadeia leve de BRCA69D e CDRi (SEQ ID NO: 29), CDR2 (SEQ ID NO: 31) e CDR3 (SEQ ID NO: 33) da cadeia pesada de BRCA69D; (B) CDRi (SEQ ID NO: 5), CDR2 (SEQ ID NO: 7) e CDR3 (SEQ ID NO: 9) da cadeia leve de BRCA84D e CDRi (SEQ ID NO: 13), CDR2 (SEQ ID NO: 15) e CDR3 (SEQ ID NO: 17) da cadeia pesada de BRCA84D; ou (C) CDRi (SEQ ID NO: 37), CDR2 (SEQ ID NO: 39) e CDR3 (SEQ ID NO: 41) da cadeia leve de PRCA157 e CDRi (SEQ ID NO: 45), CDR2 (SEQ ID NO: 47) e CDR3 (SEQ ID NO: 49) da cadeia pesada de PRCAi57.

[0029] A invenção ainda diz respeito a qualquer um dos anticorpos isolados descritos acima ou seus fragmentos imunorreativos, em que o anticorpo se une a B7-H3 que é endogenamente expressa na superfície de uma célula cancerosa.

[0030] A invenção ainda diz respeito a qualquer um dos anticorpos isolados descritos acima ou seus fragmentos imunorreativos, em que o anticorpo se une a B7-H3 que está internalizada ao se unir a B7-H3 expressa na superfície da célula cancerosa.

[0031] A invenção ainda diz respeito a qualquer um dos anticorpos isolados descritos acima ou seus fragmentos imunorreativos, o qual é um anticorpo monoclonal humanizado.

[0032] A invenção ainda diz respeito a qualquer um dos anticorpos isolados descritos acima ou seus fragmentos imunorreativos, em que o anticorpo é um anticorpo modificado que compreende uma região Fc da IgG 1 humana, em que a região Fc variável da IgG 1 humana compreende pelo menos uma modificação de aminoácido com relação à região Fc de origem do anticorpo, a(s) modificação(ões) de aminoácido compreendendo modificação(ões) de aminoácido que alteram a afinidade ou avidez da região Fc variável para ligar a um FcyR de modo que o anticorpo modificado exibe função efetora relativa ao anticorpo natural.

[0033] A invenção ainda diz respeito a qualquer um dos anticorpos isolados descritos acima ou seus fragmentos imunorreativos, e que a modificação da região Fc compreende:(A) pelo menos uma substituição selecionada do grupo consistindo em:(1) F243L; (5) Y300L;(2) D270E; (6) V305I;(3) R292P; (7) A330V; e(4) S298N; (8) P396L;(B) pelo menos uma substituição de dois resíduos de aminoácido, as substituições sendo selecionadas do grupo consistindo em:(1) F243L e P396L; (2) F243L e R292P; e(3) R292P e V305I;(C) pelo menos uma substituição de três resíduos de aminoácido, as substituições sendo selecionadas do grupo consistindo em:(1) F243L, R292P e Y300L;(2) F243L, R292P e V305I;(3) F243L, R292P e P396L; e(4) R292P, V305I e P396L;(D) pelo menos uma substituição de quatro resíduos de aminoácido, as substituições sendo selecionadas do grupo consistindo em:(1) F243L, R292P, Y300L e P396L; e(2) F243L, R292P, V305I e P396L; ou(E) uma substituição de pelo menos cinco resíduos de aminoácido: F243L, R292P, Y300L, V305I e P396.

[0034] A invenção ainda diz respeito ao anticorpo descrito acima, em que o anticorpo compreende substituições de:(A) F243L, R292P, e Y300L;(B) L235V, F243L, R292P, Y300L, e P396L; ou(C) F243L, R292P, Y300L, V305I, e P396L.A invenção ainda diz respeito ao anticorpo descrito acima, em que o anticorpo compreende:(A) um domínio variável que compreende CDR1 (SEQ ID NO: 5) , CDR2 (SEQ ID NO: 7) e CDR3 (SEQ ID NO: 9) da cadeialeve de BRCA84D e CDRi (SEQ ID NO: 13), CDR2 (SEQ ID NO: 15) eCDR3 (SEQ ID NO: 17) da cadeia pesada de BRCA84D; e(B) uma modificação da região Fc que compreende as substituições: L235V, F243L, R292P, Y300L, e P396L.

[0035] A invenção ainda diz respeito ao anticorpo descrito acima, em que o anticorpo é um anticorpo quimérico ou um anticorpo humanizado.

[0036] A invenção ainda diz respeito aos anticorpos isolados descritos acima ou seus fragmentos imunorreativos, em que o anticorpo compreende:(A) uma cadeia leve variável que tem a sequência de aminoácido de hBRCA84D-2 VL (SEQ ID NO: 89) ;(B) uma cadeia pesada variável que tem a sequência de aminoácido de hBRCA84D-2 VH (SEQ ID NO: 99) ; e(C) uma região Fc que tem as substituições: L235V, F243L, R292P, Y300L, e P396L.

[0037] A invenção ainda diz respeito a um hibridoma que secreta um anticorpo monoclonal que especificamente se une a um domínio extracelular de B7-H3, em que o anticorpo concorre para a ligação da B7-H3 com qualquer um dos anticorpos: BRCA69D, BRCA84D, ou PRCA157.

[0038] A invenção ainda diz respeito a uma molécula de ácido nucleico que codifica qualquer um dos anticorpos isolados descritos acima ou fragmentos imunorreativos.

[0039] A invenção ainda diz respeito a um reagente de redirecionamento de dupla afinidade (DARTTM), o reagente compreendendo:(A) uma cadeia de polipeptídeo I que compreende um domínio de ligação de epítopo VL de imunoglobulina específico para ligar a B7-H3 e um domínio de ligação de epítopo VH específico para ligar uma molécula diferente de B7-H3; e(B) uma cadeia de polipeptídeo II que compreende um domínio de ligação de epítopo VH de imunoglobulina específico para ligar a B7-H3 e um domínio de ligação de epítopo VL específico para ligar uma molécula diferente de B7-H3;em que as cadeias de polipeptídeo I e II estão associadas juntas de modo a formar domínios de ligação de epítopo funcionais capazes de se unirem a B7-H3 e a molécula diferente de B7-H3.

[0040] A invenção ainda diz respeito ao reagente de redirecionamento de dupla afinidade (DARTTM) descrito acima, em que a molécula diferente de B7-H3 que pode ser ligada ao DARTTM é um hapteno, e particularmente em que o hapteno é isotiocianato de fluoresceína...

[0041] A invenção ainda diz respeito ao reagente de redirecionamento de dupla afinidade (DARTTM) descrito acima, em que a molécula diferente de B7-H3 que pode ser ligada pelo DARTTM é um Receptor de Célula T ou o receptor NKG2D.

[0042] A invenção ainda diz respeito ao reagente de redirecionamento de dupla afinidade (DARTTM) descrito acima, em que a molécula diferente de B7-H3 que pode ser ligada ao DARTTM é um antígeno associado ao tumor, e particularmente, em que o antígeno associado ao tumor é selecionado do grupo consistindo em A33; ADAM-9; ALCAM; BAGE; beta-catenina; CA125; Carboxipeptidase M; CD103; CD19; CD20; CD22; CD23; CD25; CD27; CD28; CD36; CD40/CD154; CD45; CD46; CD5; CD56; CD79a/CD79b; CDK4; CEA; CTLA4; Citoqueratina 8; EGF-R; EphA2; ErbB1; ErbB3; ErbB4; GAGE-1 ; GAGE-2; GD2/GD3/GM2; gp100; HER-2/neu; papilomavírus-E6 humano; papilomavírus-E7 humano; Alfa-V-Beta-6 Integrina; JAM-3; KID3; KID31; KSA (17-1A); LUCA-2; MAGE-1 ; MAGE-3; MART; MUC- 1; MUM-1; N-acetilglucosaminiltransferase; Oncostatina M; p15; PIPA; PSA; PSMA; ROR1; sTn; receptor TNF-β; receptor TNF-α; receptor TNF—Y; Receptor Transferrina; e receptor VEGF.

[0043] A invenção ainda diz respeito a uma molécula de ácido nucleico que codifica uma cadeia de polipeptídeo de qualquer um dos reagentes de redirecionamento de dupla afinidade (DARTTMs) descritos acima.

[0044] A invenção ainda diz respeito a uma composição farmacêutica compreendendo (i) uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer um dos anticorpos isolados ou fragmentos imunorreativos descritos acima ou reagentes de redirecionamento de dupla afinidade (DARTTMs) e (ii) um carreador farmaceuticamente aceitável.

[0045] A invenção ainda diz respeito à composição farmacêutica descrita acima, em que o anticorpo é um anticorpo humanizado que compreende:(A) um domínio variável que compreende CDR1 (SEQ ID NO: 5) , CDR2 (SEQ ID NO: 7) e CDR3 (SEQ ID NO: 9) da cadeia leve de BRCA84D e CDRi (SEQ ID NO: 13), CDR2 (SEQ ID NO: 15) e CDR3 (SEQ ID NO: 17) da cadeia pesada de BRCA84D; e(B) uma modificação da região Fc que compreende as substituições: L235V, F243L, R292P, Y300L, e P396L.

[0046] A invenção ainda diz respeito à composição farmacêutica descrita acima, em que o anticorpo é um anticorpo humanizado que compreende:(A) uma cadeia leve variável que tem a sequência de aminoácido de hBRCA84D-2 VL (SEQ ID NO: 89) ;(B) uma cadeia pesada variável que tem a sequência de aminoácido de hBRCA84D-2 VH (SEQ ID NO: 99) ; e (C) uma região Fc que tem as substituições: L235V, F243L, R292P, Y300L, e P396L.

[0047] A invenção ainda diz respeito a qualquer uma das composições farmacêuticas descritas acima, as quais ainda compreendem um ou mais agentes anticâncer adicionais, e particularmente em que o agente anticâncer adicional é um agente quimioterápico, um agente terapêutico de radiação, um agente terapêutico hormonal ou um agente imunoterapêutico.

[0048] A invenção ainda diz respeito ao uso de qualquer um dos anticorpos ou fragmentos imunorreativos ou reagentes de redirecionamento de dupla afinidade (DARTTMs) descritos acima no diagnóstico de câncer, em que o anticorpo isolado, fragmento imunorreativo, ou DARTTM é detectavelmente rotulado.

[0049] A invenção ainda diz respeito ao uso descrito acima caracterizado em que o câncer é caracterizado pela presença de uma célula cancerosa selecionada do grupo consistindo em uma célula de um tumor da glande adrenal, um câncer associado à AIDS, um sarcoma alveolar de parte mole, um tumor astrocítico, câncer de bexiga, câncer ósseo, câncer cerebral e da medula espinhal, um tumor cerebral metastático, um câncer de mama, tumores corporais carotídeos, um câncer cervical, um condrossarcoma, um cordoma, um carcinoma de células renais cromófobo, um carcinoma de células claras, um câncer de colo, um câncer colorretal, um histiocitoma fibroso benigno cutâneo, um tumor desmoplásico de pequenas células redondas, um ependimoma, um tumor de Ewing, um condrossarcoma mixoide extraesquelético, uma fibrinogênese imperfeita do osso, uma displasia fibrosa do osso, um câncer da vesícula biliar ou do duto biliar, câncer gástrico, uma doença trofoblásica gestacional, um tumor de célula germinativa, um câncer de cabeça e pescoço, carcinoma hepatocelular, um tumor de célula da ilhota, um Sarcoma de Kaposi, um câncer de rins, uma leucemia, um lipoma/tumor lipomatoso benigno, um lipossarcoma/tumor lipomatoso maligno, um câncer de fígado, um linfoma, um câncer pulmonar, um meduloblastoma, um melanoma, um meningioma, uma neoplasia endócrina múltipla, um mieloma múltiplo, uma síndrome mielodisplásica, um neuroblastoma, tumores neuroendócrinos, um câncer de ovário, um câncer pancreático, um carcinoma da tireoide papilar, um tumor da paratireoide, um câncer pediátrico, um tumor da bainha do nervo periférico, um faeocromocitoma, um tumor pituitário, um câncer de próstata, um melanoma uveal posterior, um distúrbio hematológico raro, um câncer metastático renal, um tumor rabdoide, um rabdomiossarcoma, um sarcoma, um câncer de pele, um sarcoma de tecido mole, um câncer de célula escamosa, a câncer de estômago, um sarcoma sinovial, um câncer testicular, um carcinoma tímico, um timoma, um câncer metastático da tireoide, e um câncer uterino.

[0050] A invenção ainda diz respeito ao uso de qualquer um dos anticorpos ou fragmentos imunorreativos ou reagentes de redirecionamento de dupla afinidade (DARTTMs) descritos acima na preparação de um medicamento para o tratamento ou a prevenção de câncer em um paciente. A invenção ainda diz respeito a tais usos caracterizados em que o câncer é caracterizado pela presença de uma célula cancerosa selecionada do grupo consistindo em uma célula de um tumor da glande adrenal, um câncer associado à AIDS, um sarcoma alveolar de tecido mole, um tumor astrocítico, câncer de bexiga, câncer ósseo, câncer cerebral e da medula espinhal, um tumor cerebral metastático, um câncer de mama, tumores corporais carotídeos, um câncer cervical, um condrossarcoma, um cordoma, um carcinoma de células renais cromófobo, um carcinoma de células claras, um câncer de colo, um câncer colorretal, um histiocitoma fibroso benigno cutâneo, um tumor desmoplásico de pequenas células redondas, um ependimoma, um tumor de Ewing, um condrossarcoma mixoide extraesquelético, uma fibrinogênese imperfeita do osso, uma displasia fibrosa do osso, um câncer da vesícula biliar ou do duto biliar, câncer gástrico, uma doença trofoblásica gestacional, um tumor de célula germinativa, um câncer de cabeça e pescoço, carcinoma hepatocelular, um tumor de célula da ilhota, um Sarcoma de Kaposi, um câncer de rins, uma leucemia, um lipoma/tumor lipomatoso benigno, um lipossarcoma/tumor lipomatoso maligno, um câncer de fígado, um linfoma, um câncer pulmonar, um meduloblastoma, um melanoma, um meningioma, uma neoplasia endócrina múltipla, um mieloma múltiplo, uma síndrome mielodisplásica, um neuroblastoma, tumores neuroendócrinos, um câncer de ovário, um câncer pancreático, um carcinoma da tireoide papilar, um tumor da paratireoide, um câncer pediátrico, um tumor da bainha do nervo periférico, um faeocromocitoma, um tumor pituitário, um câncer de próstata, um melanoma uveal posterior, um distúrbio hematológico raro, um câncer metastático renal, um tumor rabdoide, um rabdomiossarcoma, um sarcoma, um câncer de pele, um sarcoma de tecido mole, um câncer de célula escamosa, um câncer de estômago, um sarcoma sinovial, um câncer testicular, um carcinoma tímico, um timoma, um câncer metastático da tireoide, e um câncer uterino.

[0051] A invenção ainda diz respeito aos usos descritos acima, caracterizado em que o uso ainda compreende a administração de uma ou mais terapias adicionais de câncer selecionadas do grupo consistindo em quimioterapia, imunoterapia, terapia por radiação, terapia hormonal, e cirurgia.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS:

[0052] As figuras 1A e 1B mostram os resultados das investigações IHC conduzidas usando espécimes de tecido normal do pâncreas, fígado, pulmão e colo com BRCA84D a 0,625 μg/ml e 0,078 μg/ml (figura 1A) e tecido normal do coração, rim e adrenal com BRCA84D a 0,625 μg/ml (figura 1B).

[0053] A figura 2 mostra os resultados das investigações IHC conduzidas usando espécimes de tecido canceroso do pâncreas, da mama, do colo e do pulmão com BRCA84D a 0,625 μg/ml e 0,078 μg/ml.

[0054] As figuras 3A a 3D mostram morte redirecionada dependente de dose mediada pelos anticorpos da presente invenção. As figuras 3A e 3B mostram morte redirecionada dependente de dose de células de carcinoma renal A498 (com PBMC restante há 18 horas (LDH)) pelos anticorpos monoclonais reativos contra a B7-H3 (proporção efetor: alvo de 20:1) (figura 3A: BRCA68D, BRCA69D, PRCA157, GB8, TCR-4420; figura 3B: OVCA22, BRCA84D, TDH6, TES7, TCR- 4420). As figuras 3C e 3D mostram morte redirecionada dependente de dose de células cancerosas pulmonares A549 (com PBMC restante há 18 horas (LDH)) por anticorpos monoclonais reativos contra a B7-H3 (proporção efetor:alvo de 30:1) (figura 3C: BRCA84D, OVCA22, PRCA157, TES7; figura 3D: TDH6, BRCA68D, BRCA69D).

[0055] As figuras 4A e 4B mostram as habilidades dos anticorpos anti-B7-H3 de se unirem ao B7H3-2Ig solúvel (figura 4A) e B7H3-4Ig B7-H3 solúvel (figura 4B) (concentração do anticorpo é 100 nM). Legenda: (A) BLA8; (B) BRCA165; (C) BRCA68D; (D) BRCA69D; (E) BRCA84D; (F) GB8; (G) LUCA1; (H) LUCA50; (I) OVCA21; (J) OVCA22; (K) PA20; (L) PRCA123; (M) SG24; (N) SG27; (O) ST09; (P) TDH4 (184-192); (Q) TDH4; (R) TDH5; (S) TES7. A posição vertical da legenda correlaciona-se com a posição da curva correspondente.

[0056] As figuras 5A a 5S demonstram a afinidade de ligação entre os antígenos na solução e os anticorpos monoclonais capturados (linhas sólidas; B7-H3(4Ig) 100 nM; linhas tracejadas; B7-H3, 100 nM).

[0057] As figuras 6A a 6I mostram os resultados das análises de BIACORETM dos anticorpos B7-H3 imobilizados para B7-H3-2Ig (linhas cinza tracejadas) ou B7-H3-4Ig (linhas pretas sólidas). Os anticorpos foram titulados de 0,063 μM a 1 μM. O tempo está em segundos.

[0058] A figura 7 provê uma comparação da análise de BIACORETM dos anticorpos PRCA157, BRCA69D, BLA8, PA20, BRCA84D, GB8 e SG27.

[0059] A figura 8 provê uma análise de BIACORETM demonstrando que os anticorpos BRCA68D, BRCA69D, e PRCA157 não competem com BRCA84D para ligar a B7-H3 humana.

[0060] As figuras 9A e 9B mostram os resultados dos estudos na habilidade dos anticorpos anti-B7-H3 da presente invenção de se tornarem internalizados ao se unirem às células cancerosas (figura 9A, células CSC da próstata; figura 9B, células pancreáticas Hs700t).

[0061] As figuras 10A a 10F mostram a habilidade dos anticorpos anti-B7-H3 da presente invenção de atravessar o bloco um do outro, revelando assim a sobreposição ou epítopos distintos. Um excesso de dez vezes do anticorpo competidor foi empregado.

[0062] As figuras 11A e 11B mostram o alinhamento dos resíduos de aminoácido das cadeias leves variáveis (figura 11A) ou cadeias pesadas variáveis (figura 11B) de BRCA84D e seu derivado humanizado, hBRCA84D.

[0063] A figura 12 mostra as afinidades de ligação relativas dos derivados de cadeia leve hBRCA84D BRCA84D-3VL, BRCA84D-4VL e BRCA84D-5VL para a B7-H3 humana.

[0064] A figura 13 mostra as afinidades de ligação relativas dos derivados de cadeia pesada BRCA84D-2VH, BRCA84D-3VH e BRCA84D-4VH para B7-H3 humana.

[0065] A figura 14 mostra as afinidades de ligação relativas de (1) anticorpos contendo hBRCA84D-2VL e hBRCA84D-2VH (ensaios 1 e 2), (2) BRCA84D quimérico, (3) anticorpo contendo hBRCA84D-5VL e BRCA84D-HC quimérico e (4) anticorpo contendo hBRCA84D-5VL e hBRCA84D-2VH.

[0066] A figura 15 mostra a habilidade dos anticorpos anti-B7-H3 humanizados modificados por Fc de inibir o crescimento do tumor de células do carcinoma de bexiga urinária HT-1197 in vivo em um sistema de modelo de xenoenxerto de murino. O anticorpo hBRCA84D-2 modificado por Fc (compreendendo modificações por Fc L235V, F243L, R292P, Y300L, e P396L) foi administrado aos camundongos (em uma dose de 1 μg/kg, 10 μg/kg, ou 20 μg/kg) 7 dias, 14 dias, 21 dias e 28 dias após o implante das células cancerosas.

[0067] A figura 16 mostra a habilidade dos anticorpos anti-B7-H3 humanizados modificados por Fc de inibir o crescimento do tumor de células de carcinoma renal A498 in vivo em um sistema de modelo de xenoenxerto de murino. O anticorpo hBRCA84D-2 modificado por Fc (compreendendo modificações de Fc L235V, F243L, R292P, Y300L, e P396L) foi administrado aos camundongos (em uma dose de 1 μg/kg, 10 μg/kg, ou 20 μg/kg) 7 dias, 14 dias, 21 dias e 28 dias depois do implante das células cancerosas.

[0068] As figuras 17A a 17D demonstram a habilidade do hBRCA84D-2 / anti-TCR DARTTM (“T-DARTTM”) de mediar a morte redirecionada das células cancerosas pulmonares SK-MES-1, células de carcinoma renal A498, células cancerosas da próstata LNCaP e células de melanoma UACC-62.

[0069] As figuras 18A a 18C mostram o decaimento farmacocinético de ofanti-B7-H3 Mab1 no soro de camundongos mCD16-/-, hCD16A_FOXNl machos livres de tumor (figuras 18A e 18B). A figura 18C mostra os perfis farmacocinéticos previstos gerados usando um modelo comportamental 2 com parâmetros dos 5mg/kg de dose a 0,1, 0,5, 1,5, e 10 mg/kg.

[0070] A figura 19 mostra a expressão relativa de HER2 e PRCA135 pela linhagem de câncer de bexiga HT-1197.

[0071] A figura 20 mostra a afinidade de ligação das variáveis hBRCA84D do anticorpo anti-B7-H3 para as células HT-1197.

[0072] As figuras 21A a 21C mostram os resultados de uma análise de xenoenxerto de murino para HT- 1197. Grupos de 8 camundongos fêmeas receberam veículo ou 10 mg/kg de controle de IgG, ou centuximabe em uma dose de 1, 5, ou 15 mg/kg ou anticorpo anti-B7-H3 Mab1 em uma dose de 0,1, 0,5, 1,5, ou 10 mg/kg (Q7D x5). As medições do tumor foram feitas a cada 3-4 dias. A figura 21A mostra a habilidade do anticorpo anti-B7-H3 Mab1 de prevenir ou inibir o desenvolvimento do tumor no modelo de xenoenxerto de murino. Comparações versus controle IgG: Mab1 (1 e 5 mg/kg) versus controle IgG *** do dia 51 ; Mab1 (10 mg/kg) versus controle IgG ** do dia 48. A figura 21B mostra a habilidade do centuximabe de prevenir ou inibir o desenvolvimento do tumor no modelo de xenoenxerto de murino. Cetuximabe (7 mg/kg) versus Controle IgG ** do dia 51; Cetuximabe (15 mg/kg) versus controle IgG *** do dia 58. A figura 21C compara os resultados obtidos nas doses máximas testadas.

[0073] As figuras 22A e 22B mostram a expressão relativa de HER2 e PMSA pela linhagem de câncer de bexiga HT- 1376.

[0074] A figura 23 mostra os resultados de uma análise de xenoenxerto de murino para HT-1376. Grupos de camundongos receberam veículo ou 1,0 mg/kg de anticorpo anti- B7-H3 Mab1 (Q7D x4).

[0075] A figura 24 mostra os resultados de uma análise de xenoenxerto de murino para AGS. Grupos de camundongos receberam veículo ou 10 mg/kg de anticorpo anti- B7-H3 Mab1 em uma dose de 0,5, 1,5, ou 10 mg/kg (Q7D x5).

[0076] A figura 25 mostra os resultados de um ensaio de citotoxicidade in vitro de células cancerosas pulmonares A549 em incubação com anticorpos anti-B7-H3 variáveis hBRCA84D, chBRCA84D e hBRCA84 (Fc Varl) (Proporção E:T = 25:1; Efetor = PBMC Humano; leitura do Ensaio LDH).

[0077] A figura 26 mostra os resultados de uma análise de xenoenxerto de murino para A549. Grupos de camundongos receberam veículo ou 1,0 mg/kg de anticorpo anti- B7-H3 Mab1 (Q7D x4).

[0078] A figura 27 mostra os resultados de uma análise de xenoenxerto de murino para CaLu3. Grupos de camundongos receberam veículo ou 0,5, 1, ou 5 mg/kg (Q7D x5) de anticorpo anti-B7-H3 Mab1 ou controle IgG (10 mg/ml).

[0079] As figuras 28A a 28C mostram os resultados de uma análise de xenoenxerto de murino para células cancerosas de melanoma LOX-IMVI. Grupos de 8 camundongos fêmeas receberam veículo ou 5 mg/kg de controle IgG, ou Docetaxel em uma dose de 5, 10 ou 20 mg/kg ou anticorpo anti-B7-H3 Mab1 em uma dose de 0,5, 1,5, ou 10 mg/kg. A figura 28A mostra a habilidade do anticorpo anti-B7- H3 Mab1 de prevenir ou inibir o desenvolvimento do tumor no modelo de xenoenxerto de murino. A figura 28B mostra a habilidade de Docetaxel de prevenir ou inibir o desenvolvimento do tumor no modelo de xenoenxerto de murino. A figura 28C compara os resultados obtidos nas doses máximas testadas.

[0080] A figura 29 mostra o resultado de uma análise de xenoenxerto de murino para células cancerosas de melanoma UACC-62. Grupos de camundongos receberam veículo ou 5 mg/kg de controle IgG, ou anticorpo anti-B7-H3 Mab1 em uma dose de 0,5, 1, 5, ou 10 mg/kg.

[0081] As figuras 30A a 30C mostram os resultados de uma análise de xenoenxerto de murino para células cancerosas da próstata 2rv. Grupos de 8 camundongos fêmeas receberam veículo ou 10 mg/kg de controle IgG, ou Trastuzumabe em uma dose de 1,7 ou 15 mg/kg ou anticorpo anti-B7-H3 Mab1 em uma dose de 0,5, 1,5, ou 10 mg/kg. A figura 30A mostra a habilidade do anticorpo anti-B7-H3 Mab1 de prevenir ou inibir o desenvolvimento do tumor no modelo de xenoenxerto de murino. A figura 30B mostra a habilidade de Trastuzumabe de prevenir ou inibir o desenvolvimento do tumor no modelo de xenoenxerto de murino. A figura 30C compara os resultados obtidos nas doses máximas testadas.

[0082] A figura 31 mostra os resultados de um ensaio de citotoxicidade in vitro de células cancerosas renais A498 em incubação com anticorpos anti-B7-H3 variáveis hBRCA84D, chBRCA84D e hBRCA84 (Fc Varl) (Proporção E:T = 25:1; Efetor = PBMC Humano; leitura de Ensaio LDH).

[0083] A figura 32 mostra o resultado de uma análise de xenoenxerto de murino para células cancerosas renais A498. Grupos de camundongos receberam veículo ou 10 mg/kg de controle IgG, ou anticorpo anti-B7-H3 Mab1 em uma dose de 0,1, 0,5, 1,5, ou 10 mg/kg. Centuximabe (anticorpo anti-EGRF) foi administrado a um grupo de controle de camundongos em doses de 1,7, ou 15 mg/kg.

[0084] As figuras 33A e 33B mostram o resultado de uma análise de xenoenxerto de murino para células cancerosas renais 786-0 comparadas a centuximab. Grupos de camundongos receberam veículo ou 10 mg/kg de controle IgG, ou anticorpo anti-B7-H3 Mab1 em uma dose de 0,1, 0,5, 1,5, ou 10 mg/kg. Centuximabe (anticorpo anti-EGRF) foi administrado a um grupo de controle camundongos em doses de 1,7, ou 15 mg/kg.

[0085] A figura 34 mostra o resultado de uma análise de xenoenxerto de murino para células cancerosas renais 786-0 comparadas a paclitaxel. Grupos de camundongos receberam veículo ou 5 mg/kg de controle IgG, ou anticorpo anti-B7-H3 Mab1 em uma dose de 0,1, 0,5, 1, 5, ou 10 mg/kg. Paclitaxel foi administrado a um grupo de controle de tais oito camundongos em uma dose de 2,5 mg/kg.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO:

[0086] A presente invenção se refere a anticorpos e seus fragmentos que são imunorreativos ao mamífero, e mais particularmente, ao receptor humano de B7-H3 e a seus usos, particularmente no tratamento de câncer e inflamação. A invenção assim particularmente diz respeito aos anticorpos humanizados reativos de B7-H3 e seus fragmentos imunorreativos que são capazes de mediar, e mais preferencialmente aumentar a ativação do sistema imune contra as células cancerosas que estão associadas com uma variedade de cânceres humanos.

I. TÉCNICAS GERAIS

[0087] A prática da presente invenção empregará, a menos que indicado o contrário, técnicas convencionais de biologia molecular (incluindo técnicas recombinantes), microbiologia, biologia celular, bioquímica e imunologia, as quais estão dentro da habilidade do assunto. Tais técnicas são explicadas completamente na literatura, tais como, CLONAGEM MOLECULAR: UMA MANUAL DE LABORATÓRIO, Terceira Edição (Sambrook et al. Eds., 2001) Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY; SÍNTESE DE OLIGONUCLEOTÍDEO: MÉTODOS E APLICAÇÕES (Métodos em Biologia Molecular), Herdewijn, P., Ed., Human Press, Totowa, NJ; SÍNTESE DE OLIGONUCLEOTÍDEO (Gait, M.J., Ed., 1984); MÉTODOS EM BIOLOGIA MOLECULAR, Human Press, Totowa, NJ; BIOLOGIA CELULAR: UM CADENO DE LABORATÓRIO (Cellis, J.E., Ed., 1998) Academic Press, New York, NY; CULTURA CELULAR ANIMAL (Freshney, R.I., Ed., 1987); INTRODUÇÃO À CULTURA DE CÉLULA E TECIDO (Mather, J.P. E Roberts, P.E., Eds., 1998) Plenum Press, New York, NY; CULTURA DE CÉLULA E TECIDO: PROCEDIMENTOS DE LABORATÓRIO (Doyle, A. et al, Eds., 1993-8) John Wiley and Sons, Hoboken, NJ; MÉTODOS EM ENZIMOLOGIA (Academic Press, Inc.) New York, NY; GUIA DE WEIR DE IMUNOLOGIA EXPERIMENTAL (Herzenberg, L.A. et al Eds. 1997) Wiley-Blackwell Publishers, New York, NY; VETORES DE TRANSFERÊNCIA DE GENE PARA CÉLULAS DE MAMÍFERO (Miller, J.M. et al Eds., 1987) Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY; PROTOCOLOS ATUAIS EM BIOLOGIA MOLECULAR (Ausubel, F.M. et al, Eds., 1987) Greene Pub. Associates, New York, NY; PCR: A REAÇÃO EM CADEIA POLIMERASE, (Mullis, K. et al, Eds., 1994) Birkhauser, Boston MA; PROTOCOLOS ATUAIS EM IMUNOLOGIA (Coligan, J.E. et al, eds., 1991) John Wiley and Sons, Hoboken, NJ; PROTOCOLOS CURTOS EM BIOLOGIA MOLECULAR (John Wiley and Sons, 1999) Hoboken, NJ; IMUNOBIOLOGIA 7 (Janeway, C.A. et al 2007) Garland Science, London, UK; Anticorpos (P. Finch, 1997) Stride Publications, Devoran, UK; ANTICORPOS: UMA ABORDAGEM PRÁTICA (D. Catty., ed., 1989) Oxford University Press, USA, New York NY); ANTICORPOS MONOCLONAIS: UMA ABORDAGEM PRÁTICA (Shepherd, P. et al Eds., 2000) Oxford University Press, USA, New York NY; USANDO ANTICORPOS: UM MANUAL DE LABORATÓRIO (Harlow, E. et al Eds., 1998) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; OS ANTICORPOS (Zanetti, M. et al Eds. 1995) Harwood Academic Publishers, London, UK); e DEVITA, HELLMAN, E CÂNCER DE ROSENBERG: PRINCÍPIOS & PRÁTICA DE ONCOLOGIA, OITAVA EDIÇÃO, DeVita, V. et al. Eds. 2008, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA.

II. DEFINIÇÕES

[0088] Como usado aqui, o termo “B7-H3” se refere a um membro da família de proteínas B7 humanas, uma proteína de membrana tipo I com domínios tipo Ig também conhecidos como CD276. O termo “2Ig-B7-H3” denota a forma de B7-H3 que apenas compreende dois domínios tipo Ig; o termo “4Ig-B7-H3” denota a forma de B7-H3 que compreende quatro domínios tipo Ig (ver, Sun, M. et al. (2002) “Characterization of Mouse and Human B7-H3 Genes,” J. Immunol. 168:6294-6297; Steinberger et al. (2004), “Molecular Characterization Of Human 4Ig-B7-H3, A Member Of The B7 Family With Four Ig-Like Domains,” J. Immunol. 2004, 172(4):2352-2359 e Castriconi et al. (2004) “Identification Of 4Ig-B7-H3 As A Neuroblastoma-Associated Molecule That Exerts A Protective Role From An NK Cell-Mediated Lysis;” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 101(34): 12640-12645). O antígeno “TES7” (WO 2008/066691) é um antígeno que divide as características do 4Ig-B7-H3. Consequentemente, os anticorpos que especificamente se unem ao TES7 se unem à 4Ig-B7-H3. O antígeno TES7 pode ter mais que um epítopo diferente, e epítopos podem ser não lineares. Vários anticorpos anti-B7-H3 são conhecidos por se unirem aos epítopos não lineares, incluindo alguns apenas presentes na isoforma de 4Ig-B7-H3. Acredita-se atualmente que TES7 pode ser superexpresso em certas células cancerosas em comparação às suas contrapartes de tecido normal.

[0089] Agonistas, antagonistas, e outros moduladores da função de B7-H3 são expressamente incluídos dentro do escopo dessa invenção. Esses agonistas, antagonistas e moduladores são polipetídeos que compreendem um ou mais dos locais determinantes antigênicos de B7-H3, ou compreendem um ou mais fragmentos de tais locais, variáveis de tais locais, ou peptidomiméticos de tais locais. Esses compostos modulatórios agonísticos, antagonísticos e de B7- H37 são providos em forma linear ou cíclica, e opcionalmente compreendem pelo menos um resíduo de aminoácido que não é comumente encontrado na natureza ou pelo menos um isóstero de amida. Esses compostos podem ser glicosilados...

[0090] Mais especificamente, os termos “moduladores de B7-H3”, como usados aqui, são definidos como qualquer composto que (1) seja capaz de interromper ou bloquear a interação entre a B7-H3 humana e seus ligantes naturais ou um anticorpo anti-B7-H3; (2) seja capaz de ligar- se a B7-H3 humana e seus ligantes naturais ou um anticorpo anti-B7-H3; (3) contenha um local antigênico que possa ser usado na elevação de anticorpos capazes de ligarem-se a B7-H3 humana e seus ligantes naturais ou um anticorpo anti-B7-H3; (4) contenha um local antigênico que possa ser usado no rastreamento dos anticorpos capazes de ligarem-se a B7-H3 humana e seus ligantes naturais ou um anticorpo anti-B7-H3; (5) contenha um local antigênico que possa ser usado na elevação de anticorpos capazes de interromper ou bloquear a interação entre a B7-H3 humana e seus ligantes naturais ou um anticorpo anti-B7-H3; (6) contenha um local antigênico que possa ser usado no rastreamento dos anticorpos capazes de interromper ou bloquear a interação entre a B7-H3 humana e seus ligantes naturais ou um anticorpo anti-B7-H3. Os moduladores de B7-H3 podem ser “agonistas de B7-H3” ou “antagonistas de B7-H3” dependendo se sua atividade aumenta a ativação da célula T ou inibe a ativação da célula T, respectivamente.

[0091] Os agonistas, antagonistas e moduladores de B7-H3 incluem variáveis de B7-H3, antagonistas peptídeos de B7-H3, peptidomiméticos, e moléculas pequenas, anticorpos anti-B7-H3 e variáveis de imunoglobulina, variáveis de aminoácido de B7-H3 humana incluindo variáveis de substituição de aminoácido, deleção e adição, ou qualquer combinação deles, e imunoglobulinas quiméricas. Os agonistas, antagonistas e moduladores de B7-H3 dessa invenção são baseados na identificação dos domínios de B7-H3 envolvidos na ligação da B7-H3 humana em seus ligantes naturais ou anticorpos anti-B7-H3. Assim, a invenção provê agonistas, antagonistas e moduladores de B7-H3 com estruturas moleculares que duplicam ou imitam um ou mais dos domínios de ligação anti-B7-H3 de B7-H3 humana.

[0092] Conforme usado aqui, o termo “variável de B7-H3” denota qualquer variável de aminoácido de B7-H3 humana, incluindo variáveis de substituição de aminoácido, deleção e adição, ou qualquer combinação deles. A definição engloba moléculas quiméricas tais como B7-H3 humana / quimeras não humanas e outras moléculas híbridas. Também está incluído na definição qualquer fragmento de uma molécula variável de B7-H3 que compreende o variável ou região(ões) híbridas(s) da molécula.

[0093] Conforme usado aqui, um “anticorpo” é uma molécula de imunoglobulina capaz de se unir especificamente a um alvo, tal como um carboidrato, polinucleotídeo, lipídeo, polipeptídeo, etc., através de pelo menos um local de reconhecimento de antígeno, localizado na região variável da molécula de imunoglobulina. Conforme usado aqui, o termo engloba não apenas anticorpos policlonais ou monoclonais intactos, mas também seus fragmentos (tais como Fab, Fab”, F(ab”)2 Fv), cadeia simples (ScFv), seus mutantes, variáveis de ocorrência natural, proteínas de fusão compreendendo uma porção do anticorpo com um local de reconhecimento de antígeno da especificidade requerida, anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos, “BiTEs®,” moléculas de “DARTTM” e qualquer outra configuração modificada da molécula de imunoglobulina que compreende um local de reconhecimento de antígeno da especificidade requerida.

[0094] O termo “BiTEs” (ligadores de célula T biespecíficos) se refere a uma molécula de cadeia de simples que tendo dois domínios de ligação de antígeno, um dos quais se une ao antígeno de célula T e o segundo se une a um antígeno presente na superfície de um alvo (WO 05/061547; Baeuerle, P et al. (2008) “BiTE®: A New Class Of Antibodies That Recruit T Cells” Drugs of the Future 33:137-147; Bargou, et al. (2008) “Tumor Regression in Cancer Patients by Very Low Doses of a T Cell-Engaging Antibody ,” Science 321:974-977).

[0095] O termo “DARTTM” (reagente de redirecionamento de dupla afinidade) se refere a uma molécula de imunoglobulina que compreende pelo menos duas cadeias de polipeptídeo que se associam (especialmente através de uma interação covalente) para formar pelo menos dois locais de ligação de epítopo, os quais podem reconhecer os mesmos ou diferentes epítopos. Cada uma das cadeias de polipeptídeo de um DARTTM compreende uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina e uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina, mas essas regiões não interagem para formar um local de ligação de epítopo. Antes, a região variável de cadeia pesada de imunoglobulina de uma (por exemplo, a primeira) das cadeias de polipeptídeo de DARTTM interage com a região variável de cadeia leve de imunoglobulina de uma cadeia de polipeptídeo (por exemplo, a segunda) de DARTTM diferente para formar um local de ligação do epítopo. Similarmente, a região variável de cadeia leve de imunoglobulina de uma (por exemplo, a primeira) das cadeias de polipeptídeo de DARTTM interage com a região variável de cadeia pesada de imunoglobulina de uma cadeia de polipeptídeo (por exemplo, a segunda) de DARTTM diferente para formar um local de ligação de epítopo. Os DARTTMs podem ser monoespecíficos, biespecíficos, triespecíficos, etc., assim sendo capazes de se unirem simultaneamente a um, dois, três ou mais epítopos diferentes (os quais podem ser dos mesmos ou de antígenos diferentes). Os DARTTMs podem ser adicionalmente monovalentes, bivalentes, trivalentes, tetravalentes, pentavalentes, hexavalentes, etc., assim sendo capazes de se unirem simultaneamente a uma, duas, três, quatro, cinco, seis ou mais moléculas. Esses dois atributos dos DARTTMs (isto é, grau de especificidade e valência podem ser combinados, por exemplo, para produzir anticorpos biespecíficos (isto é, capazes de ligar dois epítopos) que são tetravalentes (isto é, capazes de ligar quatro conjuntos de epítopos), etc. As moléculas de DARTTM estão descritas nas Publicações de PCT WO 2006/113665, WO 2008/157379, e WO 2010/080538.

[0096] O termo “anticorpo monoclonal” se refere a uma população de anticorpo homogêneo em que o anticorpo monoclonal é compreendido de aminoácidos (de ocorrência natural ou não) que estão envolvidos na ligação seletiva de um antígeno. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo direcionados contra um local antigênico simples. O termo “anticorpo monoclonal” engloba não apenas anticorpos monoclonais intactos e anticorpos monoclonais de comprimento total, mas também seus fragmentos (tais como Fab, Fab”, F(ab”)2 Fv), cadeia simples (ScFv), seus mutantes, proteínas de fusão compreendendo uma porção do anticorpo, anticorpos monoclonais humanizados, anticorpos monoclonais quiméricos, e qualquer outra configuração modificada da molécula de imunoglobulina que compreende um local de reconhecimento de antígeno da especificidade requerida e a habilidade de se unir a um antígeno. Não se destina a ser limitado no que se refere à fonte do anticorpo ou a maneira em que é feito (por exemplo, por hibridoma, seleção de fagos, expressão recombinante, animais transgênicos, etc.). O termo inclui imunoglobulinas totais bem como os fragmentos etc. descritos acima sob a definição de “anticorpo”.

[0097] O termo “anticorpo humanizado” se refere a uma molécula quimérica, geralmente preparada usando técnicas recombinantes, tendo um local de ligação de antígeno derivado de uma imunoglobulina de uma espécie não humana e a estrutura restante da imunoglobulina da molécula com base na estrutura e/ou sequência de uma imunoglobulina humana. O local de ligação de antígeno pode compreender quer domínios variáveis completos fundidos em domínios constantes ou apenas as regiões de determinação de complementaridade (CDRs) enxertadas em regiões de estruturas apropriadas nos domínios variáveis. Os locais de ligação de antígeno podem ser do tipo selvagem ou modificado por uma ou mais substituições de aminoácido. Isso elimina a região constante como um imunógeno em indivíduos humanos, mas a possibilidade de uma resposta imune para a região variável externa permanece (LoBuglio, A.F. et al. (1989) “Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224). Outra abordagem foca não apenas na provisão de regiões constantes derivadas de humanos, mas na modificação das regiões variáveis bem como na reformulação delas tão perto quanto possível à forma humana. Sabe-se que as regiões variáveis de ambas as cadeias leve e pesada contêm três regiões de determinação de complementaridade (CDRs) que variam em resposta aos antígenos em questão e determinam a capacidade de ligação, flanqueadas por quatro regiões de estrutura (FRs) que são relativamente conservadas em uma espécie dada e que provê putativamente um suporte para as CDRs. Quando anticorpos não humanos são preparados com respeito a um antígeno particular, as regiões variáveis podem ser “reformuladas” ou “humanizadas” através do enxerto de CDRs derivadas de anticorpo não humano nas FRs presentes no anticorpo humano a ser modificado. A aplicação dessa abordagem a vários anticorpos foi relatada por Sato, K. et al. (1993) Cancer Res 53:851-856. Riechmann, L. et al. (1988) “Reshaping Human Antibodies for Therapy” Nature 332:323-327; Verhoeyen, M. et al. (1988) “Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity” Science 239:1534-1536; Kettleborough, C. A. et al. (1991) “Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR-Grafting: The Importance Of Framework Residues On Loop Conformation “ Protein Engineering 4:773-3783; Maeda, H. et al. (1991) “Construction Of Reshaped Human Antibodies With HIV-Neutralizing Activity ,” Human Antibodies Hybridoma 2:124-134; Gorman, S. D. et al. (1991) “Reshaping A Therapeutic CD4 Antibody,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:4181-4185; Tempest, P.R. et al. (1991) “Reshaping A Human Monoclonal Antibody To Inhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection in vivo,” Bio/Technology 9:266-271 ; Co, M. S. et al. (1991) “Humanized Antibodies For Antiviral Therapy,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:2869-2873; Carter, P. et al. (1992) “Humanization Of An Anti-pl85her2 Antibody For Human Cancer Therapy “ Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 89:4285-4289; e Co, M.S. et al.(1992) “Chimeric And Humanized Antibodies With Specificity For The CD33 Antigen,” J. Immunol. 148: 1 149-1154. Em algumas realizações, os anticorpos humanizados preservam todas as sequências de CDR (por exemplo, um anticorpo humanizado de camundongo que contém todas as seis CDRs dos anticorpos do camundongo). Em outras realizações, os anticorpos humanizados têm uma ou mais CDRs (uma, duas, três, quarto, cinco, seis) que são alteradas com relação ao anticorpo original, que também denominados uma ou mais CDRs “derivadas de” uma ou mais CDRs do anticorpo original.

[0098] Conforme usado aqui, um anticorpo ou um polipeptídeo é dito “especificamente” ligar uma região de outra molécula (isto é, um epítopo) se ele reagir ou associar mais frequentemente, mais rapidamente, com maior duração e/ou com maior afinidade com aquele epítopo relativo aos epítopos alternativos. Por exemplo, um anticorpo que especificamente se une a um epítopo de B7-H3 é um anticorpo que se une a esse epítopo de B7-H3 com maior afinidade, adivez, mais prontamente e /ou com maior duração do que se une com outros epítopos de B7-H3 ou epítopos de não B7-H3. Também é entendido pela leitura dessa definição que, por exemplo, um anticorpo (ou porção ou epítopo) que se une especificamente a um primeiro alvo ou não pode especificamente ou preferencialmente se unir a um segundo alvo. Como tal, “ligação específica” não necessariamente requer (embora possa incluir) ligação exclusiva. Geralmente, mas não necessariamente, referência à ligação significa ligação “específica”.

[0099] Conforme usado aqui, o termo “imunologicamente ativo” em referência a um epítopo sendo ou “permanecendo imunologicamente ativo” se refere à habilidade de um anticorpo (por exemplo, um anticorpo anti-B7-H3) de se unir ao epítopo em condições diferentes, por exemplo, depois de o epítopo ter sido submetido à redução e condições de desnaturantes.

[00100] Funções biológicas diferentes estão associadas com anticorpos anti-B7-H3, incluindo, mas não limitado a uma ou mais de: uma habilidade para especificamente se unir a B7-H3 (e em particular molécula de B7-H3 que são expressas nas superfícies das células cancerosas, incluindo, mas não limitado a, rim, próstata ou pulmão, células cancerosas); uma habilidade de inibir competitivamente ligação preferencial de um anticorpo anti- B7-H3 conhecido para B7-H3, incluindo a habilidade de preferencialmente se unir ao mesmo epítopo de B7-H3 ao qual o anticorpo original preferencialmente se une; uma habilidade de se unir a uma porção de B7-H3 que é exposta na superfície de uma célula viva in vitro ou in vivo; uma habilidade de se unir a uma porção de B7-H3 que é exposta na superfície de células cancerosas vivas, tais como, mas não limitado a, células cancerosas da próstata, do pulmão ou do rim; uma habilidade de liberar um agente quimioterápico em células cancerosas (tais como células cancerosas do rim, próstata, ou pulmão) expressando B7-H3 em sua superfície; e/ou uma habilidade de liberar um agente terapêutico ou marcador detectável em células cancerosas expressando B7-H3 em sua superfície. Conforme discutido aqui, os polipeptídeos (incluindo anticorpos) da invenção podem ter qualquer uma ou mais dessas características.

[00101] Um “anticorpo equivalente a anti-B7-H3” ou “polipeptídeo equivalente a anti-B7-H3” se refere a um anticorpo ou um polipeptídeo tendo uma ou mais funções biológicas associadas com um anticorpo anti-B7-H3, tal como, por exemplo, especificidade de ligação.

[00102] Conforme usado aqui, o termo “agente” se refere a um composto biológico, farmacêutico ou químico. Exemplos não limitantes incluem molécula orgânica ou inorgânica complexa, a peptídeo, uma proteína, um oligonucleotídeo, um anticorpo, um derivado de anticorpo, fragmento de anticorpo, um derivado de vitamina, um carboidrato, uma toxina, ou um composto quimioterápico. Vários compostos podem ser sintetizados, por exemplo, por moléculas pequenas e oligômeros (por exemplo, oligopeptídeos e oligonucleotídeos), e compostos orgânicos sintéticos com base em várias estruturas de núcleo. Além disso, as várias fontes naturais podem prover compostos para triage, tais como extratos vegetais e animais, e similares.

[00103] Os agentes que são empregados nos métodos dessa invenção podem ser aleatoriamente selecionados ou racionalmente selecionados ou projetados. Conforme usado aqui, um agente é dito ser aleatoriamente selecionado quando o agente é escolhido sem consideração anterior ou conhecimento do aminoácido específico ou outras porções químicas envolvidas na associação da molécula com seu(s) parceiro(s) de ligação natural(is) ou anticorpos conhecidos. Um exemplo de um agente aleatoriamente selecionado é um agente que é identificado através do uso e triage de uma biblioteca química ou uma biblioteca combinatória de peptídeo.

[00104] Conforme usado aqui, um agente é dito ser racionalmente selecionado ou projetado quando o agente é escolhido em uma base não aleatória que leva em consideração a sequência do local alvo e/ou sua conformação em conexão com a ação do agente. Com relação aos agentes anti-B7-H3, acredita-se atualmente que há pelo menos três epítopos em B7- H3 contra os quais os anticorpos podem ser elevados e, portanto, pelo menos três locais de ação para os agentes que bloqueiam a interação B7-H3/anti-B7-H3. Essa invenção também engloba agentes que agem nos locais de interação entre B7-H3 e seu parceiro de ligação natural, embora outros ligantes e seus locais ativos interativos com B7-H3 também sejam englobados dentro do escopo dessa invenção, se atualmente conhecido ou identificado posteriormente. Os agentes podem ser racionalmente selecionados ou racionalmente projetados pela utilização das sequências de peptídeo que compõem os locais de contato do receptor/ligante e/ou complexo de anticorpo B7-H3/anti-B7-H3. Por exemplo, um agente peptídeo racionalmente selecionado pode ser um peptídeo cuja sequência de aminoácido é idêntica a um epítopo que aparece em B7-H3 conforme ele é exposto na superfície de uma célula viva em seu ambiente natural. Tal agente reduzirá ou bloqueará a associação do anticorpo anti-B7-H3 com B7-H3, ou a associação de B7-H3 com seu ligante natural, conforme desejado, através da ligação ao anticorpo anti-B7-H3 ou ao ligante natural.

[00105] Conforme usado aqui, o termo “rotulado,” com relação a um anticorpo, pretende englobar rotulagem direta do anticorpo através de acoplamento (isto é, ligando fisicamente) uma substância detectável, tal como um agente radioativo ou um fluoróforo (por exemplo, ficoeritrina (PE) ou isotiocianato de fluoresceína (também conhecido como fluoroisotiocianato ou FITC)) ao anticorpo, bem como rotulagem indireta da sonda ou anticorpo pela reatividade com uma substância detectável.

[00106] Conforme usado aqui, o termo “associação”, com relação a um anticorpo, inclui anexo covalente e não covalente ou ligação de um agente (por exemplo, agente quimioterápico) ao anticorpo. O anticorpo pode estar associado com um agente (por exemplo, agente quimioterápico) pela ligação direta ou ligação indireta através do anexo a uma plataforma comum, de modo que o anticorpo direciona a localização do agente à célula cancerosa a qual o anticorpo se une e em que o anticorpo e o agente não dissociam substancialmente em condições psicológicas de modo que o agente não é direcionado para a mesma célula cancerosa a qual o anticorpo se une ou de modo que a potência do agente não seja reduzida.

[00107] O termo “amostra biológica” engloba uma variedade de tipos de amostra obtida de um indivíduo e pode ser usado em um ensaio de diagnóstico ou monitoramento. A definição engloba saliva, sangue e outras amostras líquidas de origem biológica, amostras de tecido sólido tais como um espécime de biópsia ou culturas de tecido ou células derivadas deles, e sua progenitura, por exemplo, células obtidas a partir de amostra de tecido coletada de um indivíduo com suspeita de ter câncer, em realizações preferidas de tecido do ovário, pulmão, próstata, pâncreas, colo, e mama. A definição também inclui amostras que foram manipuladas de qualquer maneira depois de sua obtenção, tal como por tratamento com reagentes, solubilização, ou enriquecimento para certos componentes, tais como proteínas ou polinucleotídeos, ou incorporando em uma matriz sólida ou semissólida para fins de seccionamento. O termo “amostra biológica” engloba uma amostra clínica, e também inclui células em cultura, sobrenadantes de célula, lisados de célula, soro, plasma, fluido biológico, e amostras de tecido.

[00108] O termo “célula hospedeira” inclui uma célula individual ou cultura de célula que pode ser ou tenha sido um recipiente para vetor(es) para incorporação de inserções de polinucleotídeo. As células hospedeiras incluem progenitura de uma célula hospedeira simples, e a progenitura pode não ser necessariamente completamente idêntica (em morfologia ou em complemento de DNA genômico) à célula original devido à mutação natural, acidental ou deliberada. Uma célula hospedeira inclui células transfectadas in vivo com polinucleotídeo(s) dessa invenção.

[00109] Conforme usado aqui, o termo “atraso no desenvolvimento da metástase” significa adiar, impedir, reduzir, retardar, estabilizar e/ou postergar o desenvolvimento da metástase. Essa demora pode ser de diferentes períodos de tempo, dependendo do histórico do câncer e/ou do indivíduo que está sendo tratado. Conforme está evidente para alguém especialista na matéria, uma demora suficiente ou significativa pode, na realidade, englobar prevenção, em que o indivíduo não desenvolve a metástase.

[00110] Conforme usado aqui, uma “quantidade eficaz” de uma composição farmacêutica, em uma realização, é uma quantidade suficiente para efetuar resultados benéficos ou desejados incluindo, sem limitação, resultados clínicos tais como encolhimento no tamanho do tumor (no contexto de câncer, por exemplo, câncer de mama ou próstata), retardo do crescimento de célula cancerosa, atraso no desenvolvimento de metástase, diminuição dos sintomas resultantes da doença, aumento da qualidade de vida daqueles que sofrem da doença, diminuição da dose de outras medicações requeridas para tratar a doença, aumento do efeito de outra medicação tal como através de focalização e/ou internalização, atraso no progresso da doença, e/ou prolongamento da sobrevivência dos indivíduos. Uma quantidade eficaz pode ser administrada em uma ou mais administrações. Para fins dessa invenção, uma quantidade eficaz de fármaco, composto ou composição farmacêutica é uma quantidade suficiente para reduzir a proliferação de (ou destruição) células cancerosas e para reduzir e/ou atrasar o desenvolvimento, ou crescimento, de metástases de células cancerosas, quer diretamente ou indiretamente. Em algumas realizações, uma quantidade eficaz de um fármaco, composto, ou composição farmacêutica pode ou não ser alcançada em conjunto com outro fármaco, composto, ou composição farmacêutica. Assim, uma “quantidade eficaz” pode ser considerada no contexto de administração de um ou mais agentes quimioterápicos, e pode-se considerar que um agente simples é dado em uma quantidade eficaz se, em conjunto com um ou mais outros agentes, um resultado desejável pode ser ou é alcançado. Enquanto as necessidades individuais variam, determinação de faixas ideiais de quantidades eficazes de cada componente está dentro da habilidade do assunto. As dosagens típicas compreendem de 1 a 100 mg/kg/peso corporal. As dosagens mais preferidas compreendem de 10 a 100 mg/kg/peso corporal.

[00111] Conforme usado aqui, um agente ou molécula de ácido nucleico, anticorpo, composição ou célula, etc., é dito ser “isolado” quando aquela molécula de ácido nucleico, agente, anticorpo, composição, ou célula, etc. é substancialmente separada das moléculas de ácido nucleico contaminantes, anticorpos, agentes, composições, ou células, etc. naturalmente presentes em sua fonte original.

[00112] O termo “indivíduo” se refere a um animal vertebrado, preferencialmente um mamífero. Os mamíferos incluem, mas não são limitados a, humanos, animais de fazenda, animais esportivos, animais de estimação, primatas, camundongos e ratos. Na realização mais preferida, o termo indivíduo significa um humano.

[00113] Os termos “polipeptídeo,” “oligopeptídeo,” “peptídeo” e “proteína” são usados alternadamente aqui para se referir a polímeros de aminoácidos de qualquer comprimento. O polímero pode ser linear ou ramificado, pode compreender aminoácidos modificados, e pode ser interrompido pelos não aminoácidos. Os termos também englobam um polímero de aminoácido que foi modificado naturalmente ou por intervenção; por exemplo, formação de ligação de dissulfeto, glicosilação, lipidação, acetilação, fosforilação, ou qualquer outra manipulação ou modificação, tais como conjugação com um componente de rotulagem. Também estão incluídos na definição, por exemplo, os polipeptídeos que contêm um ou mais análogos de um aminoácido (incluindo, por exemplo, aminoácidos não naturais, etc.), bem como outras modificações conhecidas na matéria. Entende-se que, porque os polipeptídeos dessa invenção são baseados em um anticorpo, os polipeptídeos podem ocorrer como cadeias simples ou como cadeias associadas.

[00114] Também são englobados dentro do escopo da invenção os peptidomiméticos dos agonistas, antagonistas e moduladores de peptídeo B7-H3 (incluindo anticorpos anti-B7- H3) descritos aqui. Tais peptidomiméticos incluem peptídeos em que pelo menos um resíduo de aminoácido é substituído com um resíduo de aminoácido que não é comumente encontrado na natureza, tal como o isômero D do aminoácido ou uma espécie N-alquilada do aminoácido. Em outras realizações, os peptidomiméticos são construídos pela substituição de pelo menos uma ligação de amida (-C(=O)-NH-) em um agonista, antagonista ou moduladores de peptídeo B7-H3 com um isóstero de amida. Isóstero de amido adequados incluem -CH2-NH-, -CH2- S-, -CH2-S(O)-, -CH2-S(O)2-, -CH2-CH2- -CH=CH- (forma E ou Z), -C(=O)-CH2- -CH(CN)-NH--C(OH)-CH2-, e -O-C(=O)-NH-. As ligações de amida em um agonista, antagonista ou modulador de peptídeo de B7-H3 que são candidatos adequados para substituição com isósteros de amida incluem ligações que são hidrolisáveis pelas esterases ou proteases endógenas do sujeito pretendido do tratamento com agonista, antagonista ou modulador de peptídeo B7-H3.

[00115] Conforme usado aqui, o termo “substancialmente puro” se refere ao material que é pelo menos 50% puro (isto é, livre de contaminantes), mais preferencialmente pelo menos 90% puro, mais preferencialmente pelo menos 95% puro, mais preferencialmente pelo menos 98% puro, mais preferencialmente pelo menos 99% puro, e mais preferencialmente mais que 99% puro.

[00116] Conforme usado aqui, o termo “toxina” se refere a qualquer substancia que efetua uma resposta adversa dentro de uma célula. Por exemplo, uma toxina direcionada a uma célula cancerosa teria um efeito adverso, às vezes prejudicial, na célula cancerosa. Exemplos de toxinas incluem, mas não são limitados a, um taxano, um maitansinoide, uma auristatina (por exemplo, auristatina de monometila (MMAE), auristatina de monometila F (MMAF), auristatina E (AE), etc.) (tais como aquelas descritas nas Patentes Norte-Americanas n°s 5.208.020; 5.416.064; 6.333.410; 6.340.701; 6.372.738; 6.436.931; 6.441.163; 6.596.757; 7.276.497; 7.585.857; ou 7.851.432), uma caliqueamicina, uma antraciclina (por exemplo, doxorrubicina), um análogo CC-1065, docetaxel; catepsina B ou E; ricina, gelonina, exotoxina Pseudomonas, toxina da difteria, e RNase; anticorpos radiomarcados (por exemplo, tiuxetano conjugado ou marcado com um radioisótopo tóxico (por exemplo, 90Y; 131I, 177Lu, 186Re, 188Re, 211At, 212Bi, 213Bi, 225Ac, etc.).

[00117] Conforme usado aqui, os termos “tratamento” ou “tratando” significa uma abordagem para obter um resultado benéfico ou desejado incluindo, e preferencialmente, um resultado clínico benéfico ou desejado. Tais resultados clínicos benéficos ou desejados, mas não são limitados a, um ou mais dos seguintes: redução da proliferação de (ou destruição) células cancerosas ou outras doenças, redução da metástase de células cancerosas encontradas em cânceres, encolhimento do tamanho do tumor, diminuição dos sintomas resultantes da doença, aumento da qualidade de vida daqueles que sofrem da doença, diminuição da dose de outras medicações requeridas para tratar a doença, atraso na progressão da doença, e/ou prolongamento da sobrevivência de indivíduos.

[00118] Conforme usado aqui, o termo câncer pretende englobar cânceres caracterizados pela presença de uma célula cancerosa selecionada do grupo consistindo em uma célula de um tumor da glande adrenal, um câncer associado à AIDS, um sarcoma alveolar de tecido mole, um tumor astrocítico, câncer de bexiga (carcinoma de célula escamosa e carcinoma de célula transicional), câncer ósseo (adamantinoma, cistos ósseos aneurismáticos, osteocondroma, osteossarcoma), câncer cerebral e da medula espinhal, um tumor cerebral metastático, um câncer de mama, tumores corporais carotídeos, um câncer cervical, um condrossarcoma, um cordoma, um carcinoma de células renais cromófobo, um carcinoma de células claras, um câncer de colo, um câncer colorretal, um histiocitoma fibroso benigno cutâneo, um tumor desmoplásico de pequenas células redondas, um ependimoma, um tumor de Ewing, um condrossarcoma mixoide extraesquelético, uma fibrinogênese imperfeita do osso, uma displasia fibrosa do osso, um câncer da vesícula biliar ou do duto biliar, câncer gástrico, uma doença trofoblásica gestacional, um tumor de célula germinativa, um câncer de cabeça e pescoço, carcinoma hepatocelular, um tumor de célula da ilhota, um sarcoma de Kaposi, um câncer de rins (nefroblastoma, carcinoma célula renal papilar), uma leucemia, um lipoma/tumor lipomatoso benigno, um lipossarcoma/tumor lipomatoso maligno, um câncer de fígado (hepatoblastoma, carcinoma hepatocelular), um linfoma, um câncer pulmonar, um meduloblastoma, um melanoma, um meningioma, uma neoplasia endócrina múltipla, um mieloma múltiplo, uma síndrome mielodisplásica, um neuroblastoma, tumores neuroendócrinos, um câncer de ovário, um câncer pancreático, um carcinoma da tireoide papilar, um tumor da paratireoide, um câncer pediátrico, um tumor da bainha do nervo periférico, um faeocromocitoma, um tumor pituitário, um câncer de próstata, um melanoma uveal posterior, um distúrbio hematológico raro, um câncer metastático renal, um tumor rabdoide, um rabdomiossarcoma, um sarcoma, um câncer de pele, um sarcoma tecido mole, um câncer de célula escamosa, um câncer de estômago, um sarcoma sinovial, um câncer testicular, um carcinoma tímico, um timoma, um câncer metastático da tireoide, e um câncer uterino (carcinoma da cérvix, carcinoma endometrial, e leiomioma).

III. MÉTODOS DE FABRICAÇÃO DE ANTICORPOS E POLIPEPTÍDEOS

[00119] Os métodos de fabricação de anticorpos monoclonais são conhecidos na matéria. Um método que pode ser empregado é o método Kohler, G. et al. (1975) “Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody Of Predefined Specificity” Nature 256:495-497 ou sua modificação. Tipicamente, anticorpos monoclonais são desenvolvidos em espécies não humanas, tais como camundongos. Em geral, um camundongo ou rato é usado para imunização, mas outros animais também podem ser usados. Os anticorpos são produzidos através da imunização dos camundongos com uma quantidade imunogênica de células, extratos de célula, ou preparações de proteína que contenham B7-H3 humana. O imunógeno pode ser, mas não é limitado a, células primárias, linhagens de célula cultivadas, células cancerosas, ácidos nucleicos ou tecidos. Em uma realização, células de carcinoma pulmonar humano são usadas. As células usadas para imunização, por exemplo, testículos humanos ou adenocarcinoma pancreático ou células de estômago, podem ser cultivadas por um período de tempo (por exemplo, pelo menos 24 horas) antes de seu uso como um imunógeno. As células (por exemplo, células de testículos humanos, estômago, ou adenocarcinoma pancreático) podem ser usadas como imunógenos por elas mesmas ou em combinação com um adjuvante não desnaturante, tal como Ribi. Em geral, as células devem se mantidas intactas e preferencialmente viáveis quando usadas como imunógenos. As células intactas podem permitir que os antígenos sejam mais bem detectados do que as células rompidas pelo animal imunizado. O uso de adjuvantes desnaturantes ou ásperos, por exemplo, adjuvante de Freud, pode romper as células e, portanto, ser desencorajado. O imunógeno pode ser administrado várias vezes em intervalos periódicos tais como quinzenalmente ou semanalmente, ou pode ser administrado de tal maneira para manter viabilidade no animal (por exemplo, em um recombinante de tecido).

[00120] Em uma realização, os anticorpos monoclonais que se unem a B7-H3 são obtidos usando células hospedeiras que superexpressam B7-H3 como um imunógeno. Tais células incluem, a título de exemplo e não por limitação, células de carcinoma pulmonar humano e células cancerosas de colo humano.

[00121] Para monitorar a resposta do anticorpo, uma pequena amostra biológica (por exemplo, sangue) pode ser obtida do animal e testada para titulação do anticorpo contra o imunógeno. O baço e/ou diversos linfonodos grandes podem ser removidos e dissociados em células simples. Se desejado, as células do baço podem ser selecionadas (depois da remoção das células não especificamente aderentes) aplicando uma suspensão de célula em uma placa ou em uma cavidade revestida com o antígeno. As células B, que expressam imunoglobulina ligada à membrana específica para o antígeno, se unirão à placa, e não são lavadas com o resto da suspensão. As células B resultantes, ou todas as células do baço dissociadas, podem então ser fundidas com células do mieloma (por exemplo, X63- Ag8.653 e aquelas de Salk Institute, Centro de Distribuição de Célula, San Diego, CA). Polietileno glicol (PEG) pode ser usado para unir baço e linfócitos com células de mieloma para formar um hibridoma. O hibridoma é então cultivado em um meio seletivo (por exemplo, hipoxantina, aminopterina, meio de timidina, também conhecido como “meio HAT”). Os hibridomas resultantes são então colocados em placas limitando a diluição, e são ensaiados para a produção de anticorpos que se unem especificamente ao imunógeno, usando, por exemplo, rastreamento de FACS (separação de célula ativada por fluorescência) ou imuno-histoquímica (IHC). Os hibridomas que secretam anticorpo monoclonal selecionado são então cultivados quer in vitro (por exemplo, em garrafas de cultura de tecido ou reatores de fibra oca), ou in vivo (por exemplo, como ascite em camundongos).

[00122] Como outra alternativa para a técnica de fusão de célula, as células B imortalizadas pelo Vírus Epstein-Barr (EBV) podem ser usadas para produzir anticorpos monoclonais da presente invenção. Os hibridomas são expandidos e subclonados, se desejado, e sobrenadantes são ensaiados para atividade anti-imunogênica através de procedimentos de ensaio convencionais (por exemplo, FACS, IHC, radioimunoensaio, imunoensaio de enzima, imunoensaio de fluorescência, etc.).

[00123] Em outra alternativa, anticorpo monoclonal anti-B7-H3 e quaisquer outros anticorpos equivalentes podem ser sequenciados e produzidos de forma recombinante por quaisquer meios conhecidos no asssunto (por exemplo, humanização, uso de camundongos transgênicos para produzir anticorpos completamente humanos, tecnologia de exibição de fago, etc.). Em uma realização, o anticorpo monoclonal anti-B7-H3 é sequenciado e a sequência de polinucleotídeo é então clonada em um vetor para expressão ou propagação. A sequência que codifica o anticorpo de interesse pode ser mantida em um vetor em uma célula hospedeira e a célula hospedeira pode então ser expandida e congelada para uso futuro.

[00124] A sequência de polinucleotídeo de anticorpo monoclonal anti-B7-H3 e quaisquer outros anticorpos equivalentes pode ser usada para manipulação genética para gerar um anticorpo “humanizado”, para melhorar a afinidade ou outras características do anticorpo. O princípio geral na humanização de um anticorpo envolver reter a sequência básica da porção de ligação do antígeno do anticorpo, enquanto troca o restante não humano do anticorpo com sequências de anticorpo humano. Há quatro etapas gerais para humanizar um anticorpo monoclonal. São elas: (1) determinar o nucleotídeo e sequência de aminoácido prevista dos domínios variáveis leves e pesados do anticorpo de partida (2) projetar o anticorpo humanizado, isto é, decidir qual região da estrutura do anticorpo usar durante o processo de humanização (3) humanizar as metodologias/técnicas atuais e (4) transfectar e expressar o anticorpo humanizado. Ver, por exemplo, Patentes Norte-Americanas n°s 4.816.567; 5.807.715; 5.866.692; and 6.331.415.

[00125] Um número de moléculas de anticorpo “humanizado” compreendendo um local de ligação de antígeno derivado de uma imunoglobulina não humana foi descrito, incluindo anticorpos quiméricos que têm regiões V de roedores ou roedores modificados e suas regiões de determinação de complementaridade associada (CDRs) unidas aos domínios humanos constantes (ver, por exemplo, Winter et al. (1991) “Man-made Antibody,” Nature 349:293-299; Lobuglio et al. (1989) “Mouse/Human Chimeric Antibot monoclonal In Man: Kinetics And Immune Response,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224 (1989), Shaw et al. (1987) “Characterization Of A Mouse/Human Chimeric Antibody monoclonal (17-1 A) To A Colon Cancer Tumor-Associated Antigen,” J. Immunol. 138:4534-4538, e Brown et al. (1987) “Tumor-Specific Genetically Engineered Murine/Human Chimeric Antibody monoclonal,” Cancer Res. 47:3577-3583). Outras referências descrevem CDRs de roedores enxertadas em uma região de estrutura de suporte humano (FR) antes da fusão com um domínio constante de anticorpo humano apropriado (ver, por exemplo, Riechmann, L. et al. (1988) “Reshaping Human Antibodies for Therapy,” Nature 332:323-327; Verhoeyen, M. et al. (1988) “Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity,” Science 239:1534-1536; e Jones et al. (1986) “Replacing The Complementarity-Determining Regions In A Human Antibody With From A Mouse,” Nature 321:522-525). Outra referência descreve CDRs de roedores suportadas pelas regiões de estrutura de roedores recombinantemente folheada. Ver, por exemplo, Publicação de Patente Europeia n° 519.596. Essas moléculas “humanizadas” são projetadas para minimizar a resposta imunológica indesejada para as moléculas de anticorpo anti-humano de roedor, que limita a duração e eficácia das aplicações terapêuticas daquelas porções em recipientes humanos. Outros métodos de humanização dos anticorpos que também podem ser utilizados são descritos por Daugherty et al. (1991) “Polymerase Chain Reaction Facilitates The Cloning, CDR-Grafting, And Rapid Expression Of A Murine Antiboy monoclonal Directed Against The CD18 Component Of Leukocyte Integrins,” Nucl. Acids Res. 19:2471-2476 e nas Patentes Norte-Americanas n°s 6. 180.377;6.054.297; 5.997.867; e 5.866.692.

[00126] A invenção também engloba fragmentos de região variável de cadeia simples (“scFv”) de anticorpos dessa invenção, tais como mu-anti-B7-H3. Os fragmentos de região variável de cadeia simples são feitos através da ligação de regiões variáveis de cadeia leve e/ou pesada usando um peptídeo de ligação pequeno. Bird et al. (1988) (“Single-Chain Antigen-Binding Proteins,” Science 242:423426) descrevem exemplo de peptídeos de ligação que abrem caminho aproximadamente 3,5 nm entre o terminal carbóxi de uma região variável e o terminal amino de outra região variável. Os ligantes de outros sequencias foram projetados e usados (Bird et al. (1988) “Single-Chain Antigen-Binding Proteins,” Science 242:423-426). Os ligantes podem, por sua vez, ser modificados para funções adicionais, tais como fixação de fármacos ou fixação para suportes sólidos. As variáveis de cadeia simples podem ser produzidas quer de forma recombinante ou sintética. Para produção sintética de scFv, um sintetizador automático pode ser usado. Para produção recombinante de scFv, um plasmídeo adequado contendo polinucleotídeo que codifica o scFv pode ser introduzido em uma célula hospedeira adequada, eucariótica, tal como células de levedura, planta, inseto ou mamífero, ou procariótica, tal como E. coli. Os polinucleotídeos que codificam o scFv de interesse podem ser feitos através de manipulações de rotina tais como ligação de polinucleotídeos. O scFv resultante pode ser isolado usando técnica de purificação de proteína padrão conhecida na matéria.

[00127] A invenção inclui modificações a anticorpos e polipeptídeos que se unem a B7-H3 e seus agonistas, antagonistas, e moduladores, incluindo anticorpos e polipeptídeos funcionalmente equivalentes que não afetam significativamente suas propriedades e variáveis que tiveram atividade aumentada ou diminuída. A modificação de polipeptídeos é prática de rotina na matéria e não precisa ser descrita em detalhes aqui. Exemplos de polipeptídeos modificados incluem polipeptídeos com substituições conservadoras de resíduos de aminoácido, um ou mais exclusões ou adições de aminoácidos que não mudam significativamente prejudicialmente a atividade funcional, ou uso de análogos químicos. Os resíduos de aminoácido que podem ser substituídos de forma conservadora um pelo outro incluem, mas não são limitados a: glicina/alanina; valina/isoleucina/ leucina; asparagina/glutamina; ácido aspártico/ácido glutâmico; serina/treonina; lisina/arginina; e fenilalanina/triosina. Esses polipeptídeos também incluem polipeptídeos glicosilados e não glicosilados, bem como polipeptídeos com outras modificações pós-traducional, tais como, por exemplo, glicosilação com diferentes açúcares, acetilação, e fosforilação. Preferencialmente, as substituições de aminoácido seriam conservadoras, isto é, o aminoácido substituído possuiria propriedades químicas similares como aquele do aminoácido original. Tais substituições conservadoras são conhecidas na matéria, e exemplos foram providos acima. A modificação de aminoácidos pode variar de alteração ou modificação de um ou mais aminoácidos para completar o reprojeto de uma região, tal como a região variável. Mudanças na região variável podem alterar a afinidade e/ou especificidade de ligação. Outros métodos de modificação incluem usar técnicas de acoplamento conhecidas na matéria, incluindo, mas não limitado a, meios enzimáticos, substituição e quelação oxidativa. As modificações podem ser usadas, por exemplo, para anexar os rótulos para imunoensaio, tais como o anexo de porções radioativas para radioimunoensaio. Os polipeptídeos modificados são feitos usando procedimentos estabelecidos na matéria e podem ser selecionados usando ensaios padronizados conhecidos na matéria.

[00128] A invenção também engloba proteínas de fusão compreendendo um ou mais fragmentos ou regiões dos polipeptídeos e anticorpos dessa invenção. Em uma realização, um polipeptídeo de fusão está previsto que compreende pelo menos 10 aminoácidos contíguos de região variável de cadeia leve e pelo menos 10 aminoácidos de região variável de cadeia pesada. Em outra realização, um polipeptídeo de fusão contém uma região constante de imunoglobulina heteróloga. Em outra realização, o polipeptídeo de fusão contém uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada de um anticorpo produzido de um hibridoma publicamente depositado. Para fins dessa invenção, uma proteína de fusão de anticorpo contém um ou mais domínios de polipeptídeo que especificamente se unem a B7-H3 e outra sequência de aminoácido a qual não está anexada na molécula natural, por exemplo, uma sequência heteróloga ou uma sequência homóloga de outra região.

[00129] Um polipeptídeo anti-B7-H3, e outros agonistas, antagonistas e moduladores de B7-H3 podem ser criados pelos métodos conhecidos no assunto, por exemplo, de forma sintética ou recombinante. Um método de produção de agonistas, antagonistas e moduladores de peptídeo B7-H3 envolve síntese química do polipeptídeo, seguido pelo tratamento em condições oxidantes apropriadas para obter a conformação natural, isto é, as ligações de dissulfeto corretas. Isso pode ser realizado usando metodologias bem conhecidas daqueles técnicos no assunto (ver, por exemplo, Kelley, R. F. et al. (1990) em: MÉTODOS E PRINCÍPIOS DA ENGENHARIA GENÉTICA, Setlow, J.K. Ed., Plenum Press, N.Y., vol. 12, pp 1-19; Stewart, J.M et al. (1984) SÍNTESE DE PEPTÍDEO DE FASE SÓLIDA, Pierce Chemical Co., Rockford, IL; ver também Patentes Norte-Americanas n°s 4.105.603; 3.972.859; 3.842.067; e 3.862.925).

[00130] Os polipeptídeos da invenção podem ser convenientemente preparados usando síntese de peptídeo de fase sólida (Merrifield, B. (1986) “Síntese de Fase Sólida,” Science 232(4748):341-347; Houghten, R.A. (1985) “General Method For The Rapid Solid-Phase Synthesis Of Large Numbers Of Peptides: Specificity Of Antigen-Antibody Interaction At The Level Of Individual Amino Acids,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 82(15):5131-5135; Ganesan, A. (2006) “Solid-Phase Synthesis In The Twenty-First Century” Mini Rev. Med. Chem. 6(1):3-10).

[00131] Ainda em outra alternativa, os anticorpos completamente humanos podem ser obtidos através do uso de camundongos comercialmente disponíveis que foram projetados para expressar proteínas de imunoglobulina humana específicas. Os animais transgênicos que são projetados para produzir resposta imune mais desejável (por exemplo, anticorpos completamente humanos) ou mais robusta também podem ser usados para gerar anticorpos humanos ou humanizados. Exemplos de tal tecnologia são XENOMOUSETM (Abgenix, Inc., Fremont, CA) e HUMAB-MOUSE® e TC MOUSETM (ambos da Medarex, Inc., Princeton, NJ).

[00132] Em uma alternativa, os anticorpos podem ser feitos de forma recombinante e expressos usando qualquer método conhecido na matéria. Os anticorpos podem ser feitos de forma recombinante primeiro isolando os anticorpos feitos de animais hospedeiros, obtendo a sequência de gene e usando a sequência de gene para expressar o anticorpo de forma recombinante em células hospedeiras (por exemplo, células CHO). Outro método que pode ser empregado é expressar a sequência de anticorpo em plantas (por exemplo, tabaco) ou leite transgênico. Os métodos adequados para expressar os anticorpos de forma recombinante em plantas ou leite foram descritos (ver, por exemplo, Peeters et al. (2001) “Production Of Antibodies And Antibody Fragments In Plants,” Vaccine 19:2756; Lonberg, N. et al. (1995) “Human Antibodies From Transgenic Mice,” Int. Rev. Immunol 13:65-93; e Pollock et al. (1999) “Transgenic Milk As A Method For The Production Of Recombinant Antibodies,” J. Immunol Methods 231:147-157). Os métodos adequados para fazer derivados de anticorpos, por exemplo, humanizado, cadeia simples, etc. são conhecidos na matéria. Em outra alternativa, os anticorpos podem ser feitos de forma recombinante por tecnologia de exibição de fago (ver, por exemplo, Patentes Norte-Americanas n°s 5.565.332; 5.580.717; 5.733.743; 6.265.150; e Winter, G. et al. (1994) “Making Antibodies By Phage Display Technology” Annu. Rev. Immunol. 12.433-455).

[00133] Os anticorpos ou proteína de interesse podem ser submetidos ao sequenciamento por degradação de Edman, que é bem conhecido daqueles técnicos no assunto. A informação do peptídeo gerada da espectrometria de massa ou degradação de Edman pode ser usada para projetar sondas e iniciadores que são usados para clonar a proteína de interesse.

[00134] Um método alternativo de clonar a proteína de interesse é através de “filtração” usando B7-H3 purificada ou porções dela para células que expressam o anticorpo ou a proteína de interesse. B7-H3 existe em uma forma “2Ig” e como uma forma “4Ig”. A sequência de aminoácido da forma “2Ig” da B7-H3 humana é (SEQ ID No:1): ML .RR RG S F GM GVfl VG A AT ,G A I ,W FC LT GA I. E VQVFE D PWA T ,VG T D AT L C C SFSPEPGFSL AQLNLIWQLT DTKQLVH5FA EGQDQGSAYA NRTALFPDLL AQGNASLRW RVRVADEGSF TCFVSIRDFG SAAVSLQVAA PYSKPSMTLE PNKDLRPGDT VTITCSSYRG YPEAEVFWQD GQGVPLTGNV TTSQMANEQG LFDVHSVLRV VLGANGTYSC LVRNPVLQQD AHGSVTITGQ PMTFPPEALW VTVGLSVCLI ALLVALAFVC WRKIKQSCEE ENAGAEDQDG EGEGSKTALQ PLKHSDSKED DGQEIA

[00135] A sequência de cDNA que codifica a forma “21g”” da B7-H3 humana é (SEQ ID N0:2) : atgctgcgtc ggcggggcp.g ccctggcatg ggtgtgcatg tgggtgαagc cctgggagca ctgtggttct gcctcacagg agccctggag gtααaggtcc ctgaagaccc agtggtggca ctggtgggca ccgatgccac cctgtgctgc tccttctccc ctgagcctgg cttcagcctg gcacagctca acctcatctg gcagctgaca gataccaaac agctggtgca cagctttgct gagggccagg accagggcag cgcctatgcc aaccgcacgg ccctcttccc ggacctgctg gcacagggca acgcatccct gaggctgcag cgcgtgcgtg tggcggacga gggcagcttc acctgcttcg tgagcatccg ggatttcggc agcgctgccg tcagcctgca ggtggccgct ccctactcga agcccagcat gaccctggag cccaacaagg acctgcggcc aggggacacg gtgaccatca cgtgctccag ctaccggggc taccctgagg ctgaggtgtt ctggcaggat gggcagggtg tgcccctgac tggcaacgtg accacgtcgc agatggccaa cgagcagggc ttgtttgatg tgcacagcgt cctgcgggtg gtgctgggtg cgaatggcac ctacagctgc cbggLgcgtd accccgtgct gcagcaggat gcgcacggct ctgtcaccat αaαagggcag cctatgacat tccccccaga ggccctgtgg gtgaccgtgg ggctgtctgt ctgtctcatt gcactgctgg tggccctggc tttcgtgtgt tggagaaaga tcaaacagag ctgtgaggag gagaatgcag gagctgagga ccaggatggg gagggagaaq gctccaagac agccctgcag cctctgaaac actctgacag caaagaagat gatggacaag aaatagcc

[00136] A sequência de aminoácido da forma “2Ig” de B7-H3 humana (SEQ ID No:1) (mostrada em negrito e sublinhada abaixo) está completamente incluída na forma “4Ig” de B7-H3 humana (SEQ ID NO:76): MLRRRGSPGM GVHVGAALGA LWFCLTGAL- VQVPEDPWA LVGTDATLCC SFSPEPGFSL AQLNLIWQLT DTKQLVH5FA EGQDQGSAYA NRTALFPDLL AQGTJASLRLQ RVRVADEGSF TCFVSIRDFG SAAVSLQVAA PYSKPSMTLE PNKDLRPGDT VTITCSSYRG YPEAEVFWOD GQGVPLTGNV TTSQMANEQG L F■ DVH S1LRV V LGANGTYSC LVRN?VLQQD AH££VTIT PQ RSPIGAVEVQ VPEDPWALV GTDATLRCSF SPEPGFSLAQ LNLIWQLTDT KQLVHSFTEG RDQGSAYANR TALFPDLLAQ GtJASLRLQRV RVADEG3FTÇ FVSIRDFGSA ÃVSLQVAAPY SKPSMTLBPN KDLRPGDTVT ITCSSYRGYP RAEVFWQDGQ GVPLTGNVTT SQMANEQGLF Ç>VH3VLRWIJ GANGTYSCLV RNFVIQQDAH GSVTITGQPM TFPPEALWVT VGLSVCLIAL LVALAFVCWR KIKQSCEEEN AJSAEDQDGEG EGSKTALQPL KBSDSKEDDG QEIA

[00137] A sequência de cDNA que codifica a forma “4Ig” da B7-H3 humana é (SEQ ID No:77); os resíduos que codificam a forma “2Ig” de B7-H3 são mostrados em negrito e sublinhado: atgctgcgte ggcggggcag ccctggoatg ggtgtgcatq tgggtqcaqc cctggqaqca ctqtqqttct gcctcacagg aqccctgqa g g t cca g g t cc c t g a a g a ccc agtggtggca ctggtgggca ccgatgccac cctgtgctgc tccttctccc ctgagcctgg cttcagcctg gcacagctca acctcatctg gcagctgaca gataccaaac agctggtgca cagctttgct gagggccagg accagggcag cgcctatgcc aaccgcacgg αcctottccc ggaαctgctg gcacagggca acgcatccct gaggctgcag cgcgtgcgtg tggcggacga gggcagcttc acctgcttcg tgagcatccg ggatttcggc agcgctgccg tcagcctgca ggtggccgct ccctactcga agcccagcat gaccctggag eecaaeaagg acctgcggcc aggggacacg gtgaccatca cgtgctccag ctaccagggc taccctgagg ctgaggtgtt ctggcaggat gggcagggtg tgcccctgac tggcaacgtg accacgtcgc agatggccaa cgagcagggc ttgtttgatg tgcacagcat cctgcgggtg gtgctgggtg caaa-ggcac ctacagctgc ctggtgcgca accccgtgct gcagcaggat gc gc a eager, ctgtcaccat cacaccccag agaagcccca caggagccgt ggaggtccag gtccctgagg acccggtggt ggccctagtg ggcaccgatg ccaccctqcq ctqctccttc tccsaαgaga ctqqcttcaq αciLqqcacaq ctπaacctca tctqqcaqct qacagacacc aaasaqatqg tqcacagttt caccqaagqc cgggaccagg gcagcgccta tgccaaaαgci aαggcsaatat taccggaaat gatggaacaa ggeaatgeat ccctαagqct qeagcqoqtq cqtqtqqcqg acgaqggcaq cttcacctqc ttcqtgaqca tccgqqattt ogqcaqogct gccgtcagcc tgcaggtggc cgctccctac tcgaagccca gcatgaccct gqagcccaac aaggacctgc ggccagggga cacggtgacc atcacqtgct ccagctaccg gggctaccct gaggetgagg tgttctggca ggatgggcag g~gtg^gcccc tgactggcaa cgtgaccacg tcgcagatgg ccaacgagca gggcttgttt gatgtgcaca gcgtcctgcg ggtggtgctg ggtgcgaatg gcacctacag ctgcctggtg □qcaacππcq tcctqcagca ggatgcgcac ggctctgtca ccatcacagg gcagcctatg a.cattccccc ca.qa.gqccct qtqqqtgacscs gtgqqgatgt argrergtat aattgaactg ctggtggccc tggctttcgt gtgctggaga aagatcaaac agagctgtga ggaggagaat gcaggaqctq agga-ccaqga tggggaggga gaaggctcca agacagccct gcagcctctg a-aaca-ctctg acagcaaaga agatgatgga caagaaatag cc

[00138] O Procedimento de “filtração” pode ser conduzido pela obtenção de uma biblioteca de cDNA dos tecidos ou células que expressam B7-H3, superexpressando os cDNAs em um segundo tipo de célula, e triando as células transfectadas do segundo tipo de célula para uma ligação específica a B7- H3. As descrições detalhadas dos métodos usados na clonagem de genes de mamífero codificando para proteínas de superfície de célula através de “filtração” podem ser encontradas na matéria (ver, por exemplo, Aruffo, A. et al. (1987) “Molecular Cloning Of A CD28 cDNA By A High-Efficiency COS Célula Expression System,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 84:8573-8577 e Stephan, J. et al. (1999) “Selective Cloning Of Célula Surface Proteins Involved In Organ Development: Epithelial Glycoprotein Is Involved In Normal Epithelial Differentiation,” Endocrinol. 140:5841 -5854).

[00139] cDNAs que codificam os anticorpos anti- B7-H3, e outros agonistas, antagonistas e moduladores de peptídeo B7-H3 podem ser obtidos por transcrição reversa dos mRNAs de um tipo de célula particular de acordo com os métodos padronizados na matéria. Especificamente, mRNA pode ser isolado usando várias enzimas líticas ou soluções químicas de acordo com os procedimentos estabelecidos em Sambrook et al. supra ou extraídos por resinas de ligação de ácido nucleico comercialmente disponíveis seguindo as instruções anexas providas pelos fabricantes (por exemplo, Qiagen, Invitrogen, Promega). Os cDNAs sintetizados são então introduzidos em um vetor de expressão para produzir o anticorpo ou proteína de interesse em células de um segundo tipo. Está implícito que um vetor de expressão deve ser replicável nas células hospedeiras quer como epissomas ou como uma parte integral do DNA cromossômico. Os vetores de expressão adequados incluem, mas não são limitados a, plasmídeos, vetores virais, incluindo adenovírus, adenovírus associados, retrovírus, e cosmídeos.

[00140] Os vetores contendo os polinucleotídeos de interesse podem ser introduzidos na célula hospedeira por qualquer número de meios apropriados, incluindo eletroporação, transfecção, emprego de cloreto de cálcio, cloreto de rubídio, fosfato de cálcio, DEAE-dextrano, ou outras substâncias; bombardeamento de microprojéteis; lipofecção; e infecção (por exemplo, onde o vetor é um agente infeccioso tal como vaccinia vírus). A escolha de vetores introdutores ou polinucleotídeos frequentemente dependerá dos aspectos da célula hospedeira.

[00141] Quaisquer células hospedeiras capazes de superexpressar os DNAs heterólogos podem ser usadas com o fim de isolar os genes que codificam o anticorpo, polipeptídeo ou proteína de interesse. Exemplos não limitantes de células hospedeiras de mamífero adequadas incluem, mas não são limitados a, células COS, HeLa, e CHO. Preferencialmente, as células hospedeiras expressam os cDNAs em um nível de cerca de 5 vezes mais alto, mais preferencialmente 10 vezes mais alto, ainda mais preferencialmente 20 vezes mais alto do que aquele do anticorpo endógeno ou proteína de interesse correspondente, se presente, nas células hospedeiras. O rastreamento das células hospedeiras para uma ligação específica a B7-H3 é efetuado por um imunoensaio ou FACS. Uma célula superexpressando o anticorpo ou proteína de interesse pode ser identificada.

[00142] Várias técnicas também estão disponíveis que podem agora ser empregadas para produzir agonistas, antagonistas, e moduladores de peptídeo B7-H3 mutante que codifica para adições, exclusões ou mudanças na sequência de aminoácido da proteína resultante relativa à molécula do agonista, antagonista ou modulador do peptídeo B7-H3 de principal.

[00143] A invenção inclui polipeptídeos compreendendo uma sequência de aminoácido dos anticorpos dessa invenção. Os polipeptídeos dessa invenção podem ser feitos por procedimentos conhecidos na matéria. Os polipeptídeos podem ser produzidos por proteolítico ou outra degradação dos anticorpos, por métodos recombinantes (isto é, polipeptídeos simples ou de fusão) conforme descrito acima ou por síntese química. Os polipeptídeos dos anticorpos, especialmente os polipeptídeos mais curtos até cerca de 50 aminoácidos, são convenientemente feitos por síntese química. Os métodos de síntese química são conhecidos na matéria e estão comercialmente disponíveis. Por exemplo, um polipeptídeo anti-B7-H3 poderia ser produzido por um sintetizador de polipeptídeo automático empregando o método de fase sólida.

IV. MÉTODOS PARA RASTREAMENTO DE POLIPEPTÍDEOS E ANTICORPOS MONOCLONAIS

[00144] Vários métodos podem ser usados para rastrear os polipeptídeos e anticorpos monoclonais que se unem a B7-H3. Entende-se que “ligação” se refere à ligação específica biológica ou imunologicamente relevante, e não se refere à ligação não específica que pode ocorrer, por exemplo, quando uma imunoglobulina é usada em uma concentração muito alta contra um alvo não específico. Em uma realização, os anticorpos monoclonais são rastreados para ligação com a B7-H3 usando técnica de rastreamento padrão. Dessa maneira, o anticorpo monoclonal anti-B7-H3 foi obtido. Os hibridomas preferidos da presente invenção são aqueles que produzem anticorpos BRCA69D, BRCA84D ou PRCA157.

[00145] Os anticorpos monoclonais adicionais que se unem a B7-H3 podem ser identificados. Para este fim, os anticorpos monoclonais são rastreados por sua habilidade diferencial de se unir em tecidos cancerosos, mas não em células não cancerosas. Em uma realização, os anticorpos monoclonais que se unem a B7-H3 e que também têm reação cruzada a células ou tecidos cancerosos humanos, mas não em células ou tecidos normais no mesmo grau, são selecionados. Um método que pode ser empregado para rastreamento é imuno- histoquímica (IHC). Técnicas de imuno-histoquímica padrão são conhecidas daqueles especialistas medianos na matéria. Ver, por exemplo, MÉTODOS DE CULTURA DE CÉLULA ANIMAL (J.P. Mather e D. Barnes, eds., Academic Press, NY, Vol. 57, Ch. 18 e 19, pp. 314-350, 1998). Amostras biológicas (por exemplo, tecidos) podem ser obtidas a partir de biópsias, autópsias, ou necropsia. Para verificar se B7-H3 está presente apenas em células cancerosas, os anticorpos anti-B7-H3 podem ser usados para detectar a presença de B7-H3 nos tecidos dos indivíduos com câncer, enquanto outros tecidos não cancerosos do indivíduo que sofre de câncer ou tecidos de indivíduos sem câncer são usados como um controle. O tecido pode ser integrado em uma substância sólida ou semissólida que previne dano durante o congelamento (por exemplo, agarose gel ou OCT) e então seccionado para tingimento. Os cânceres de diferentes órgãos e em diferentes graus podem ser usados para rastrear anticorpos monoclonais. Exemplos de tecidos que podem ser usados para fins de rastreamento incluem, mas não são limitados a, ovário, mama, pulmão, próstata, colo, rim, pele, tireoide, cérebro, coração, fígado, estômago, nervo, vasos sanguíneos, osso, trato digestivo superior e pâncreas. Exemplos de diferentes tipos de câncer que podem ser usados para fins de rastreamento incluem, mas não são limitados a, carcinomas, adenocarcinomas, sarcomas, adenossarcomas, linfomas, e leucemias.

[00146] Ainda em outra alternativa, as linhagens de células cancerosas tais como HMEC (BioWhittaker CC-2251), HUVEC (células edoteliais primárias), BT-474 (ATCC# HTB-20), MCF7 (ATCC# HTB22), MDA-MB- 175-VII (ATCC# HB-25), MDA-MB-361 (ATCC# HB-27), SKBR3 (ATCC# HTB-30), A549 (ATCC# CCL-185), Calu-3 (ATCC# HTB-55), SKMES-I (ATCC# HTB-58), ES-2 (ATCC# CRL-1978), SKOV3 (ATCC# HTB- 77), Panc-1 (ATCC# CRL-1469), AsPC-I (ATCC# CRL-1682), HPAF-II (ATCC# CRL- 1997), Hs700T (ATCC# HTB- 174), Colo205 (ATCC# CCL-222), HT-29 (ATCC# HTB- 38), SW480 (ATCC# CCL-228), SW948 (ATCC# CCL-237), 293 (ATCC # CRL-1573), 786-0 (ATCC# CRL-1932), A498 (ATCC# HTB-44), Caki-2 (ATCC# HTB-47), COS-7 (ATCC# CRL-1651), RL-65 (ATCC # CRL-10345), SV-T2 (ATCC# CCL-163,1), 22RV1 (ATCC# CRL-2505), DU145 (ATCC# HTB-81), LNCaP (ATCC# CRL-1740), PC-3 (ATCC# CRL-1435), HT29 (ATCC# HTB-38), Hs746T (ATCC# HTB- 135), NCI- N87 (ATCC# CRL-5822) e células normais de seus respectivos tecidos podem ser usadas para rastrear os anticorpos monoclonais que são específicos para tecido canceroso. Primeiro, ou passagem baixa, as culturas de célula derivadas de tecidos normais de diferentes órgãos incluindo, mas não limitado a, rim, ovário, mama, pulmão, próstata, colo, rim, pele, tireoide, músculo liso da aorta, e células edoteliais podem ser usadas como controles negativos. As células cancerosas ou não cancerosas podem ser desenvolvidas em lâminas de vidro ou lamelas, ou em superfícies plásticas, ou preparadas em um dispositivo CellArrayTM, conforme descrito em WO 01/43869, e rastreado para a ligação do anticorpo usando IHC conforme descrito acima para os tecidos. Alternativamente, as células podem ser removidas da superfície de crescimento usando meios não proteolíticos e giradas em um pélete, que é então integrado e tratado como tecidos para análise de IHC conforme descrito acima. As células podem ser inoculadas em animais imunodeficientes, um tumor deixado crescer, e então esse tumor pode ser colhido, integrado e usado como uma fonte de tecido para análise de IHC. Em outra alternativa, as células simples podem ser rastreadas por incubação com o anticorpo primário, um anticorpo “repórter” secundário ligado a uma molécula fluorescente e então analisado usando uma máquina de classificação de célula ativada fluorescente (FACS).

[00147] Qualquer um dos diversos sistemas de detecção pode ser utilizado para detectar a ligação dos anticorpos à seção do tecido. Tipicamente, imuno-histoquímica envolve a ligação de um anticorpo primário ao tecido e então um anticorpo secundário reativo contra a espécie do anticorpo primário foi gerado e conjugado a um marcador detectável (por exemplo, peroxidase de rábano, HRP, ou diaminobenzedina, DAB). Um método alternativo que pode ser usado são anticorpos complementares de imagem de espelho policlonal ou polyMICATM (Anticorpos Complementares de Imagem de Espelho policlonal; The Binding Site Limited, Birmingham, UK; Mangham, D.C. et al. (1999) “Novel Immunohistochemical Detection System Using Mirror Image Complementary Antibodies (MICA),” Histopathology 35(2):129-33). A técnica de PolyMICATM pode ser usada para testar a ligação dos anticorpos primários (por exemplo, anticorpos anti-B7-H3) ao tecido normal e canceroso. Diversos tipos de kits de Detecção de polyMICA™ estão comercialmente disponíveis: n° do produto HK004.D é um kit de Detecção de polyMICATM que usa cromógeno DAB; n° do produto. HK004.A é um kit de Detecção de polyMICATM que usa cromógeno AEC. Alternativamente, o anticorpo primário pode ser diretamente rotulado com o marcador detectável...

[00148] A primeira etapa no rastreamento de IHC para selecionar um anticorpo apropriado é a ligação dos anticorpos primários elevados em camundongos (por exemplo, anticorpos anti-B7-H3) a um ou mais imunógenos (por exemplo, amostras de células ou tecido). Em uma realização, a amostra de tecido são seções de tecido congelado de diferentes órgãos. As amostras de células ou tecido podem ser cancerosas ou não cancerosas.

[00149] Os tecidos congelados podem ser preparados, seccionados, com ou sem fixação, e IHC realizado por qualquer uma variedade de métodos conhecidos de alguém familiar com a técnica (ver, por exemplo, Stephan et al. (1999) “Distribution And Function Of The Adhesion Molecule BEN During Rat Development,” Dev. Biol. 212:264-277 e Stephan et al. (1999) “Selective Cloning Of Cell Surface Proteins Involved In Organ Development: Epithelial Glycoprotein Is Involved In Normal Epithelial Differentiation,” Endocrinology 140:5841-5854).

V. MÉTODOS DE CARACTERIZAÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-B7- H3

[00150] Qualquer um dos diversos métodos pode ser usado para caracterizar os anticorpos anti-B7-H3. Um método é identificar o epítopo ao qual ele se une. O mapeamento do epítopo está comercialmente disponível de várias fontes, por exemplo, Pepscan Systems (Lelystad, The Netherlands). O mapeamento do epítopo pode ser usado para determinar a sequência a qual um anticorpo anti-B7-H3 se une. O epítopo pode ser um epítopo linear, isto é, contido em um trecho simples de aminoácidos, ou um epítopo conformacional formado por uma interação tridimensional de aminoácidos que podem não ser necessariamente contidos em um trecho simples.

[00151] Peptídeos de comprimentos variados (por exemplo, preferencialmente pelo menos 4 a 6 aminoácidos de comprimento) podem ser isolados ou sintetizados (por exemplo, de forma recombinante) e usados para ligar os ensaios com o anticorpo anti-B7-H3. O epítopo ao qual o anticorpo anti-B7- H3 se une pode ser determinado em um rastreamento sistemático usando peptídeos sobrepostos derivados da sequência extra- celular e determinando a ligação pelo anticorpo anti-B7-H3.

[00152] Ainda outro método que pode ser usado para caracterizar um anticorpo anti-B7-H3 é usar ensaios de competição com outros anticorpos conhecidos por se unirem ao mesmo antígeno, isto é, B7-H3 para determinar se os anticorpos anti-B7-H3 se unem ao mesmo epítopo como os outros anticorpos. Exemplos de anticorpos comercialmente disponíveis para B7-H3 podem estar disponível e podem ser identificados usando os ensaios de ligação ensinados aqui. Os ensaios de competição são bem conhecidos daqueles técnicos no assunto, e tais procedimentos e dados ilustrativos são detalhados ainda nos Exemplos. Os anticorpos anti-B7-H3 podem ser ainda caracterizado pelos tecidos, tipo de câncer ou tipo de tumor ao qual eles se unem.

[00153] Outro método de caracterização dos anticorpos anti-B7-H3 é pelo antígeno ao qual eles se unem. Os anticorpos anti-B7-H3 foram usados em Western blots com lisados de célula de vários cânceres humanos. Conforme é conhecido de alguém especialista na matéria, Western blotting pode envolver lisados de célula contínuas e/ou frações de célula em um gel desnaturante ou não desnaturante, transferência de proteínas para papel de nitrocelulose, e então sondagem da mancha com um anticorpo (por exemplo, anticorpo anti-B7-H3) para ver quais proteínas são ligadas pelo anticorpo. B7-H3 está associada com vários cânceres humanos de diferente tecidos incluindo, mas não limitado, colo, mama, ovário, pâncreas e pulmão.

VI. MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO DE CÂNCER USANDO ANTICORPOS ANTI-B7-H3 E MODULADORES DE B7-H3

[00154] Os anticorpos monoclonais para B7-H3 feitos pelos métodos descritos aqui podem ser usados para identificar a presença ou ausência de células cancerosas em uma variedade de tecidos, incluindo, mas não limitado a, ovário, mama, pulmão, próstata, colo, rim, pâncreas, pele, tireoide, cérebro, coração, fígado, estômago, nervo, vasos sanguíneos, osso, e trato digestivo superior. Os anticorpos monoclonais para B7-H3 feitos pelos métodos descritos aqui também podem ser usados para identificar a presença ou ausência de células cancerosas, ou o seu nível, que estão circulando no sangue depois de sua liberação de um tumor sólido. Tal antígeno em circulação pode ser um antígeno B7-H3 intacto, ou o seu fragmento que retém a habilidade de ser detectado de acordo com os métodos ensinados aqui. Tal detecção pode ser efetuada pela análise de FACS usando métodos padronizados comumente usados na matéria.

[00155] Esses usos podem envolver a formação de um complexo entre B7-H3 e um anticorpo que se une especificamente em B7-H3. Exemplos de tais anticorpos incluem, mas não são limitados a, aqueles anticorpos monoclonais anti-B7-H3 produzidos pelos hibridomas BRCA84D, BRCA69D, e PRCA157. A formação de tal complexo pode ser in vitro ou in vivo. Sem estar limitado pela teoria, o anticorpo monoclonal anti-B7-H3 pode se unir a B7-H3 através do domínio extracelular de B7-H3 e pode então ser internalizado.

[00156] Em uma realização preferida dos métodos de diagnóstico dessa invenção, o anticorpo carrega uma etiqueta detectável. Exemplos de etiquetas que podem ser usadas incluem um agente radioativo ou um fluoróforo, tal como isotiocianato de ficoeritrina ou fluoresceína (também conhecidos como fluoroisotiocianato ou FITC).

[00157] Conforme com outros anticorpos conhecidos usados comercialmente para diagnóstico e fins terapêuticos, o antígeno alvo dessa invenção é amplamente expresso em tecido normal. Ele também é regulado em alguns tumores. Portanto, as dosagens particulares e vias de administração dos anticorpos dessa invenção, conforme usados para diagnósticos ou agentes terapêuticos, será adaptado ao tumor particular ou estado de doença em questão, bem como ao indivíduo particular que está sendo tratado.

[00158] Um método de uso dos anticorpos para diagnóstico é imageamento do tumor in vivo ligando o anticorpo a um agente radioativo ou radio-opaco, administrando ao indivíduo e usando um aparelho de raios-X ou outra máquina de imageamento para visualizar a localização do anticorpo marcado na superfície das células cancerosas que expressam o antígeno. O anticorpo é administrado em uma concentração que promove a ligação em condições fisiológicas.

[00159] Técnicas in vitro para detecção de B7-H3 são rotina na matéria e incluem ensaios imunoabsorventes ligados à enzima (ELISAs), imunoprecipitações, imunofluorescência, imunoensaio de enzima (EIA), radioimunoensaio (RIA), e análise Western blot.

[00160] Nos aspectos dessa invenção, os métodos de imagem radiológica de tumores ou neoplasmas, ou de medição da eficácia de um método de tratamento com um anticorpo radiomarcado, compreendendo a etapa de administrar um anticorpo específico do tumor, radiomarcado, a um indivíduo seguindo a prática dessa invenção. O anticorpo radiomarcado pode ser um anticorpo monoclonal ou policlonal compreendendo um radiomarcador, preferencialmente selecionado do grupo consistindo em Tecnécio-99m, Índio-111, Iodo-131, Rênio-186, Rênio-188, Samário-153, Lutécio-177, Cobre-64, Escândio-47, Ítrio-90. Os anticorpos monoclonais marcados com radionuclídeos terapêuticos tais como Iodo-131, Rênio-188, Hólmio-166, Samário-153 e Escândio-47, que não comprometem a imunorreatividade de anticorpos e não são quebrados in vivo, são especialmente preferidos. A pessoa especialista na matéria apreciará que outros isótopos radioativos são conhecidos, e podem ser adequados para aplicações específicas. A imagem radiológica pode ser conduzida usando Tomografia Computadorizada por Emissão de Fóton Único (SPECT - Single Photon Emission Computer Tomography), Tomografia por Emissão de Pósitrons (PET - Positron Emission Tomography), Tomografia Computadorizada (CT - Computer Tomography) ou Imageamento por Ressonância Nuclear (MRI - Magnetic Resonance Imaging). Imageamento correlativo, que permite definição anatômica maior de localização de metástases localizadas por imagem de radioimunoensaio, também é contemplado.

[00161] Em outros métodos, as células cancerosas são removidas e o tecido preparado por imuno-histoquímica pelos métodos bem conhecidos na matéria (por exemplo, integração em um composto de congelamento, congelamento e seccionamento, com ou sem fixação; fixação e parafina integrada com ou sem vários métodos de recuperação e contracoloração de antígeno). Os anticorpos monoclonais também podem ser usados para identificar células cancerosas em diferentes estágios de desenvolvimento. Os anticorpos também podem ser usados para determinar quais tumores dos indivíduos expressam o antígeno em sua superfície em um nível predeterminado e são assim candidatos para imunoterapia usando anticorpos direcionados contra o dito antígeno. Os anticorpos podem reconhecer tanto os cânceres primários quanto os em metástase que expressam B7-H3. Conforme usado aqui, a detecção pode incluir detecção qualitativa e/ou quantitativa, e pode incluir comparação do nível medido em uma célula normal para nível aumentado de expressão de B7-H3 em células cancerosas.

[00162] A invenção também provê métodos de auxílio para diagnóstico de câncer caracterizado pelas células cancerosas que expressam B7-H3 em um indivíduo usando qualquer anticorpo que se une a B7-H3 e quaisquer outros métodos que podem ser usados para determinar o nível de expressão de B7-H3. Conforme usado aqui, os métodos para “auxiliar a diagnóstico” significam que esses métodos ajudam a fazer uma determinação clínica com relação à classificação, ou natureza, do câncer, e pode ou não ser conclusiva com respeito ao diagnóstico definitivo. Consequentemente, um método para auxiliar o diagnóstico de câncer pode compreender a etapa de detecção do nível de B7-H3 em uma amostra biológica do indivíduo e/ou determinação do nível de expressão de B7-H3 na amostra. Os anticorpos que reconhecem o antígeno, ou sua porção, também podem ser usados para criar imunoensaios diagnósticos para detectar o antígeno liberado ou secretado das células cancerosas vivas ou mortas em fluidos corporais, incluindo, mas não limitado a, sangue, saliva, urina, fluido pulmonar, ou fluido ascítico.

[00163] Nem todas as células em um tumor de interesse particular expressarão B7-H3, e as células cancerosas em outros tecidos podem expressar B7-H3, assim um indivíduo deveria ser rastreado para a presença ou ausência de B7-H3 em células cancerosas para determinar a utilidade da imunoterapia no indivíduo. Os anticorpos anti-B7-H3 feitos pelos métodos descritos aqui podem ser usados para determinar se um indivíduo diagnosticado com câncer pode ser considerado um candidato para imunoterapia usando anticorpos direcionados contra B7-H3. Em uma realização, um tumor canceroso ou uma amostra de biópsia pode ser testado para expressão de B7-H3, usando anticorpos direcionados contra B7-H3. Os indivíduos com células cancerosas que expressam B7-H3 são candidatos adequados para imunoterapia usando anticorpos direcionados contra B7-H3. A coloração com anticorpo anti-B7-H3 também pode ser usada para distinguir os tecidos cancerosos dos tecidos normais.

[00164] Métodos de uso de anticorpos anti-B7-H3 para fins de diagnóstico são úteis tanto antes quando depois de qualquer forma de tratamento anticâncer, por exemplo, quimioterapia ou radioterapia, para determinar quais tumores são mais prováveis de responder a um dado tratamento, prognóstico para indivíduo com câncer, subtipo do tumor ou origem da doença metastática, e progressão da doença ou resposta ao tratamento.

[00165] As composições dessa invenção também são adequadas para diagnóstico de estados de doença diferentes de câncer, usando os métodos geralmente descritos acima na aplicação com outras células doentes (não cancerosas). Os estados de doença adequados para uso nos métodos dessa invenção incluem, mas não são limitados a, doenças ou distúrbios associados com respostas inflamatórias ou autoimunes em indivíduos. Os métodos descritos acima podem ser usados para modular respostas inflamatórias ou autoimunes em indivíduos. Doenças e condições resultantes de inflamação e distúrbios autoimunes que podem ser submetidos a diagnóstico e/ou tratamento usando as composições e métodos da invenção incluem, por meio de ilustração e não de limitação, esclerose múltipla, meningite, encefalite, acidente vascular encefálico, outros traumas cerebrais, doença do intestino inflamatório incluindo colite ulcerativa e doença de Crohn, miastenia grave, lúpus, artrite reumatoide, asma, diabetes juvenil aguda, demência por AIDS, aterosclerose, nefrite, retinite, dermatite atópica, psoríase, isquemia do miocárdio e lesão pulmonar mediada por leucócito aguda.

[00166] Ainda outras indicações para uso diagnóstico e/ou terapêutico de anticorpos e outros agentes terapêuticos da invenção incluem administração a indivíduos com risco de rejeição de órgão ou enxerto. Nos últimos anos, tem havido uma melhora considerável na eficiência de técnicas de cirurgia para transplante de tecidos e órgãos tais como pele, rim, fígado, coração, pulmão, pâncreas e medula óssea. Talvez o problema notável principal seja a falta de agentes satisfatórios para induzir imunotolerância no beneficiário para o órgão ou aloenxerto transplantado. Quando células ou órgãos alogênicos são transplantados em um hospedeiro (isto é, o doador e o donatário são indivíduos diferentes da mesma espécie), o sistema imune do hospedeiro é suscetível a montar uma resposta imune para antígenos externos no transplante (hospedeiro versus doença do enxerto) levando à destruição do tecido transplantado.

[00167] Os usos descritos em qualquer lugar dessa aplicação para anticorpos anti-B7-H3 também englobam o uso de outros agonistas, antagonistas e moduladores de B7-H3 conforme descrito aqui. Em tais realizações, o agonista, antagonista ou outro modulador não anticorpo de B7-H3 é substituído para o anticorpo B7-H3 nas etapas descritas, e alterações dentro do escopo do perito comumente especializado são feitas para adaptar o método para a composição modulatória de B7-H3 substituída.

[00168] Os anticorpos monoclonais para B7-H3 feitos pelos métodos descritos aqui podem ser usado para identificar a presença ou ausência de células-tronco cancerosas humanas em uma variedade de tecidos. Foi levantada a hipótese de as células-tronco cancerosas (CSCs) desempenharem um papel no crescimento do tumor e metástase (Ghotra, V.P. et al. (2009) “The Cancer Stem Cell Microenvironment And Anti-Cancer Therapy “ Int. J. Radiat. Biol. 85(11):955-962; Gupta, P.B. et al. (2009) “Cancer Stem Cells: Mirage Or Reality?” Nat. Med. 15(9): 1010-1012; Lawson, J.C. et al. (2009) “Cancer Stem Cells In Breast Cancer And Metastase “ Breast Cancer Res. Treat. 118(2):241- 254; Hermann, P.C. et al. (2009) “Pancreatic Cancer Stem Cells— Insights And Perspectives” Expert Opin. Biol. Ther. 9(10):1271-1278; Schatton, T. et al. (2009) “Identification And Targeting Of Cancer Stem Cells,” Bioessays 31(10):1038- 1049; Mittal, S. et al. (2009) “Cancer Stem Cells: The Other Face Of Janus,” Amer. J. Med. Sci. 338(2):107- 112; Alison, M.R. et al. (2009) “Stem Cells And Lung Cancer: Future Therapeutic Targets?” Expert Opin. Biol. Ther. 9(9):1127- 1141; Charafe-Jauffret, E. et al. (2009) “Breast Cancer Stem Cells: Tools And Models To Rely On,” BMC Cancer 9:202; Scopelliti, A. et al. (2009) “Therapeutic Implications Of Cancer Initiating Cells,” Expert Opin. Biol. Ther. 9(8): 1005-1016; Publicação do PCT WO 2008/091908). Sob esta hipótese, as CSCs proveem um subconjunto de células distintas, pequenas dentro de cada tumor que são capazes de autorregeneração indeterminada e de desenvolvimento na(s) célula(s) de tumor mais adultas que são relativamente limitadas em capacidade de replicação. Foi levantada a hipótese de que essas células-tronco cancerosas podem ser mais resistente a agentes quimioterápicos, radiação ou outras condições tóxicas, e assim, persistirem depois de terapias clínicas e crescimento posterior em tumores secundários, metástase ou ser responsável por recidiva. Foi sugerido que as CSCs podem elevar as células-tronco do tecido “normal” ou de células progenitoras de tecido mais diferenciado.

[00169] As células-tronco cancerosas humanas têm diversas características de definição. Tais características estão descritas na Publicação do PCT WO 2008/091908 e são incorporadas aqui por referência. Os anticorpos monoclonais para alvos na superfície da célula em células-tronco cancerosas podem ser usados para identificar a presença ou ausência de células-tronco cancerosas em uma variedade de tecidos. Os anticorpos monoclonais para B7-H3 feitos pelos métodos descritos aqui também podem ser usados para identificar a presença ou ausência de células-tronco cancerosas, ou o nível das células-tronco cancerosas em uma amostra ou tecido ou em circulação depois de sua liberação de um tumor sólido. Tal antígeno em circulação pode ser um antígeno B7-H3 intacto, ou seu fragmento que retém a habilidade de ser detectado de acordo com os métodos ensinados aqui. Tal detecção pode ser efetuada pela análise FACS usando métodos padronizados comumente usados na matéria. Em outra realização, tal detecção pode ser efetuada pela análise imuno-histoquímica de amostras de tecido usando métodos padronizados comumente usados na matéria.

[00170] Esses usos podem envolver a formação de um complexo entre B7-H3 e um anticorpo que se une especificamente a B7-H3 em células-tronco cancerosas. Exemplos de tais anticorpos incluem, mas não são limitados a, aqueles anticorpos anti-B7-H3 monoclonais produzidos pelos hibridomas BRCA84D, BRCA69D, e PRCA157. A formação de tal complexo pode ser in vitro ou in vivo.

[00171] Os usos descritos nessa aplicação que dizem o seu uso para anticorpos anti-B7-H3 também englobam o uso de outros agonistas, antagonistas e moduladores de B7-H3 conforme descrito aqui para o uso da identificação e tratamento de células-tronco cancerosas. Em tais realizações, anticorpos anti-B7-H3 e outros agonistas, antagonistas e moduladores de B7-H3 são usados para identificação, diagnóstico ou tratamento terapêutico de células-tronco cancerosas usando métodos similares descritos, e alterações dentro do escopo do perito especializado comum são feitas par adaptar o método para a identificação/diagnóstico ou tratamento das células-tronco cancerosas.

VII. COMPOSIÇÕES PREFERIDAS DA PRESENTE INVENÇÃO

[00172] A presente invenção engloba composições, incluindo composições farmacêuticas, compreendendo anticorpos anti-B7-H3, polipeptídeos derivados de anticorpos anti-B7-H3, polinucleotídeos compreendendo sequência que codifica anticorpos anti-B7-H3, e outros agentes conforme descrito aqui. Conforme usadas aqui, as composições ainda compreendem um ou mais anticorpos, polipeptídeos e/ou proteínas que se unem a B7-H3, agonistas, antagonistas, moduladores de B7-H3, e/ou um ou mais polinucleotídeos compreendendo sequências que codificam um ou mais anticorpos, polipeptídeos e proteínas que se unem a B7-H3.

[00173] A invenção ainda provê para conjugados de qualquer agonista, antagonista ou modulador de peptídeo B7- H3, e estruturas químicas adicionais que suportam a função ou as funções pretendida do particular agonista, antagonista ou modulador de peptídeo B7-H3.

[00174] Esses conjugados incluem agonista, antagonista ou modulador de peptídeo B7-H3 covalentemente ligado a uma macromolécula tal como qualquer matriz de suporte sólido, insolúvel usada nos procedimentos de diagnóstico, rastreamento ou purificação discutido aqui. Os materiais de matriz adequados incluem qualquer substância que seja quimicamente inerte, tenha alta porosidade e tenha grandes números de grupos funcionais capazes de formar ligações covalentes com ligantes de peptídeo. Exemplos de materiais de matriz e procedimento para preparação de conjugados de ligante estão descritos em Dean et al. (Eds) CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE: UMA ABORDAGEM PRÁTICA, IRL Press (1985); Lowe, “Introduction to Affinity Chromatography”, EM Work et al. (eds) TÉCNICAS DE LABORATÓRIO EM BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR, Vol. 7, Parte II, North-Holland (1979); Porath et al, “Biospecific Affinity Chromatography”, in Neurath, H. et al. (eds), AS PROTEÍNAS, 3rd ed., Vol. 1, pp. 95-178 (1975); e Schott, H. CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE, Macel Dekker, Inc. NY (1984).

[00175] Também são providos aqui conjugados de agonista, antagonista ou modulador de peptídeo B7-H3 e qualquer porção repórter usada nos procedimentos diagnósticos discutidos aqui. Os agentes de agonista, antagonista ou modulador de peptídeo B7-H3, polipeptídeos e proteínas dessa invenção, incluindo anticorpos anti-B7-H3, são ainda identificados e caracterizados por qualquer (um ou mais) dos seguintes critérios:(a) uma habilidade para se unir especificamente a B7-H3 (e em particular moléculas B7-H3 que são expressas nas superfícies das células cancerosas, incluindo, mas não limitado a, células cancerosas do rim, próstata, ou pulmão);(b) uma habilidade para inibir competitivamente ligação preferencial de um anticorpo anti-B7-H3 conhecido para B7-H3, incluindo a habilidade de se unir preferencialmente ao mesmo epítopo de B7-H3 ao qual o anticorpo original preferencialmente se une;(c) uma habilidade de se unir a uma porção de B7-H3 que é exposta na superfície de uma célula viva in vitro ou in vivo;(d) uma habilidade de se unir a uma porção de B7-H3 que é exposta na superfície de células cancerosas vivas que expressam B7-H3; (e) uma habilidade de liberar um agente quimioterápico nas células cancerosas (tais como células cancerosas do rim, próstata, ou pulmão) expressando B7-H3 em sua superfície; e/ou(f) uma habilidade de liberar um agente terapêutico ou marcador detectável em células cancerosas (tais como, mas não limitado a, células cancerosas da próstata) expressando B7-H3 em sua superfície.

[00176] Um anticorpo preferido da invenção exibirá coloração de IHC diferencial com relação ao tecido não canceroso, normal, e, além disso, será capaz de testar em modelos de primatas (e, particularmente, macaco caranguejeiro) de eficácia do anticorpo. Os anticorpos preferidos da presente invenção adicionalmente exibirão níveis desejáveis de afinidade e especificidade de antígeno. Os anticorpos preferidos da presente invenção adicionalmente exibirão níveis desejáveis de atividade imunomodulatória e internalização celular.

[00177] Em algumas realizações, o anticorpo da invenção é um anticorpo que é produzido por hibridoma BRCA84D, BRCA69D, ou PRCA157, ou sua progenitura. A presente invenção também engloba várias formulações de anticorpos produzidos por esses hibridomas depositados e anticorpos equivalentes ou fragmentos de polipeptídeo (por exemplo, Fab, Fab”, F(ab”)2 Fv, Fc, etc.), anticorpos quiméricos, cadeia simples (scFv), seus mutantes, proteínas de fusão compreendendo uma porção de anticorpo, anticorpos humanizados, e qualquer outra configuração modificada de qualquer desses anticorpos ou equivalentes que compreendem um antígeno (B7-H3), local de reconhecimento da especificidade requerida. A invenção também provê anticorpos humanos que mostram uma ou mais das características biológicas de um membro da família anti-B7-H3. Os anticorpos equivalentes da família anti-B7-H3 (incluindo anticorpos humanizados e anticorpos humanos), fragmentos de polipeptídeo, e polipeptídeos compreendendo qualquer um desses fragmentos são identificados e caracterizados por qualquer (um ou mais) dos cinco critérios descritos acima. As sequências de domínio variável humanizado exemplar e de murino de um anticorpo anti-B7-H3 são providas na Publicação do PCT WO 2008/066691. Tais sequências são providas por meio de ilustração e não limitação, e sequências diferentes, bem como fragmentos e variáveis de sequências providas, estão englobadas dentro do escopo dessa invenção.

[00178] BRCA84D, BRCA69D, e PRCA157 são os anticorpos B7-H3 preferidos da presente invenção devido aos seus perfis IHC de tecido normal claros, tumor mais forte/IHC normal diferencial, ligação de moderada a forte (BIACORETM)/IHC), reatividade cruzada a B7-H3 de macacos caranguejeiros e atividade potente para moléculas DARTTM universais (“UDARTTMs”) com relação a outros anticorpos. Em realizações particularmente preferidas, a invenção engloba variáveis quiméricas e humanizadas desses anticorpos preferidos, bem como variáveis naturais e quiméricas e humanizadas desses anticorpos preferidos que possuem regiões Fc modificadas conforme descrito abaixo. A invenção adicionalmente engloba moléculas DARTTM que possuem as regiões de ligação de epítopo de tais anticorpos, particularmente em conjunto com região(ões) de ligação de epítopo que se une(m) ao receptor de célula T, receptor de NKG2D, ou a um antígeno associado ao tumor ou a um hapteno tal como fluoresceína (por exemplo, isotiocianato de fluoresceína (também conhecidos como fluoroisotiocianato ou FITC).

[00179] Em algumas realizações, os anticorpos, polipeptídeos e proteínas da invenção que se unem a B7-H3 são anticorpos, polipeptídeos e proteínas que competitivamente inibem a ligação preferencial de um anticorpo anti-B7-H3 especificado aqui para B7-H3. Em algumas realizações, os anticorpos, os polipeptídeos e as proteínas preferencialmente se unem ao mesmo epítopo em B7-H3 conforme o anticorpo mu- anti-B7-H3 preferencialmente se une.

[00180] Consequentemente, a invenção provê qualquer dos seguintes (ou composições, incluindo composições farmacêuticas, compreendendo qualquer dos seguintes): (a) um anticorpo produzido pela célula hospedeira com um número de depósito identificado acima ou sua progenitura; (b) uma forma humanizada de tal anticorpo; (c) um anticorpo compreendendo uma ou mais das regiões variáveis de cadeia leve e/ou cadeia pesada de tal anticorpo; (d) um anticorpo quimérico compreendendo regiões variáveis homólogas ou derivadas de regiões variáveis de uma cadeia pesada e uma cadeia leve de tal anticorpo, e regiões constantes homólogas ou derivadas de regiões constantes de uma cadeia pesada e uma cadeia leve de um anticorpo humano; (e) um anticorpo compreendendo uma ou mais das CDRs de cadeia leve e/ou cadeia pesada (pelo menos um, dois, três, quatro, cinco, ou seis) de tal anticorpo; (f) um anticorpo compreendendo uma cadeia leve e/ou uma pesada de tal anticorpo; (g) um anticorpo humano que é equivalente a tal anticorpo. Uma forma humanizada do anticorpo pode ou não ter CDRs idênticas ao anticorpo original, ou anticorpo produzido por uma célula hospedeira com um número de depósito identificado acima. A determinação das regiões de CDR está bem dentro da habilidade na matéria. Em algumas realizações, a invenção provê um anticorpo que compreende pelo menos uma CDR que é substancialmente homóloga a pelo menos uma CDR, pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos 5 CDRs de um anticorpo produzido por um dos hibridomas depositados acima identificados (ou, em algumas realizações substancialmente homólogas a todas as 6 CDRs de um desses anticorpos, ou derivados de um desses anticorpos), ou anticorpo produzido pela célula hospedeira com um número de depósito identificado acima. Outras realizações incluem anticorpos que têm pelo menos duas, três, quatro, cinco ou seis CDR(s) que são substancialmente homólogas a pelo menos duas, três, quatro, cinco ou seis CDRs de um anticorpo produzido de um hibridoma depositado conforme identificado aqui, ou derivados de tal anticorpo. Entende-se que, para fins dessa invenção, a especificidade de ligação e/ou atividade total (que pode ser em termos de liberação de um agente quimioterápico a ou em células cancerosas para reduzir o crescimento e/ou proliferação de células cancerosas, para induzir a morte de célula apoptótica na célula cancerosa, para retardar o desenvolvimento da metástase, e/ou tratamento paliativamente) é geralmente retida, embora a extensão da atividade possa variar comparada a um anticorpo produzido por um hibridoma depositado (pode ser maior ou menor). A invenção também provê métodos de fabricação de qualquer um desses anticorpos. Métodos de fabricação de anticorpos são conhecidos na matéria e são descritos aqui.

[00181] A invenção também provê polipeptídeos compreendendo uma sequência de aminoácido dos anticorpos da invenção. Em algumas realizações, o polipeptídeo compreende uma ou mais regiões variáveis da cadeia leve e/ou cadeia pesada do anticorpo. Em algumas realizações, o polipeptídeo compreende uma ou mais das CDRs de cadeia leve e/ou cadeia pesada do anticorpo. Em algumas realizações, o polipeptídeo compreende três CDRs da cadeia leve e/ou cadeia pesada do anticorpo. Em algumas realizações, o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácido do anticorpo que tem qualquer dos seguintes: pelo menos 5 aminoácidos contíguos de uma sequência do anticorpo original, pelo menos 8 aminoácidos contíguos, pelo menos cerca de 10 aminoácidos contíguos, pelo menos cerca de 15 aminoácidos contíguos, pelo menos cerca de 20 aminoácidos contíguos, pelo menos cerca de 25 aminoácidos contíguos, pelo menos cerca de 30 aminoácidos contíguos, em que pelo menos 3 dos aminoácidos são de uma região variável do anticorpo. Em uma realização, a região variável é de uma cadeia leve do anticorpo original. Em outra realização, a região variável é de uma cadeia pesada do anticorpo. Em outra realização, os 5 (ou mais) aminoácidos contíguos são de uma região de determinação de complementaridade (CDR) do anticorpo.

[00182] Em algumas realizações dessa invenção, as células dessa invenção que expressam B7-H3, uma porção de B7- H3, anticorpos anti-B7-H3 ou outros polipeptídeos de ligação de B7-H3 dessa invenção são administradas diretamente a um indivíduo para modular atividade biológica de B7-H3 in vivo.

[00183] Os anticorpos anti-B7-H3 preferidos da presente invenção são BRCA84D, BRCA69D e PRCA157, todos os tais anticorpos são anticorpos de murino para a molécula B7- H3 humana. As sequências de aminoácido e que codificam polinucleotídeo da cadeia leve variável e cadeia pesada variável de BRCA84D, BRCA69D e PRCA157 são mostradas abaixo junto aos domínios CDR1, CDR2 e CDR3 respectivos de cada cadeia. Aqueles técnicos no assunto, portanto, serão capazes de construir anticorpos que têm tais CDRs, bem como seus derivados, capazes de ligar aos epítopos por BRCA84D, BRCA69D e PRCA157.

A. SEQUÊNCIAS DE BRCA84D (1) SEQUÊNCIAS DE CADEIA LEVE BRCA84D

[00184] Sequência de aminoácido de Cadeia Leve Variável BRCA84D (SEQ ID N0:3): DIAMTQSQKF M S T £ V GDRV S VTCKASQNVD INVAWY QQK P GO £PK ALIY S ASYRYSGVPD RFTGSGSGTD FTLTINNVQS EDLAEYFCQQ YWYPFTFGS GTKLEIK

[00185] Sequência de Polinucleotídeo Codificando Cadeia Leve Variável BRCA84D (SEQ ID NO:4): gacattgcga tgacccagtc tcaaaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc gtcacctgca aggccagtca gaatgtggat actaatgtag cctggtatca acagaaacca gggcaatctc ctaaagcact gatttactcg gcatcctacc ggtacagtgg agtccctgat cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcaacaa tgtgcagtct gaagacttgg cagagtattt ctgtcagcaa tataacaact atccattcac gttcggctcg gggacaaagt tggaaataaa a

[00186] CDR1 de Cadeia Leve Variável BRCA84D (SEQ ID NO:5) :

[00187] Sequência de Polinucleotídeo Codificando CDR1 de Cadeia Leve Variável BRCA84D (SEQ ID NO: 6): aaggccagte agaatgtgga tactaatgta gee

[00188] CDR2 de Cadeia Leve Variável BRCA84D (SEQ ID No: 7) :

[00189] Sequência de Polinucleotídeo Codificando CDR2 de BRCA84D Cadeia Leve Variável (SEQ ID NO:8) : tcggcatcct accggtacag t.

[00190] CDR3 de Cadeia Leve Variável BRCA84D (SEQ ID NO: 9) :

[00191] Sequência de Polinucleotídeo Codificando CDR3 de Cadeia Leve Variável BRCA84D (SEQ ID NO:10): cagcaatat.a acaactatcc attcacg

(2) SEQUÊNCIAS DE CADEIA PESADA BRCA84D

[00192] Sequência de aminoácido de Cadeia Pesada Variável BRCA84D (SEQ ID NO:11) : DVQLVESGGG LVQPGGSRKL SCAASGFTFS SFGMHWVRQA PEKGLEWVAY ISSDSSAIYY ADTVKGRFTI SRDWPKNTLF LQNTSLR5ED TAMYYCGRGR ENIYYGSRLD YWGQGTTLTV SS

[00193] Sequência de Polinucleotídeo Codificando Cadeia Pesada Variável BRCA84D (SEQ ID NO: 12) : gatgtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgcagc ctggagggtc ccggaaactc tcctgtgcag cctctggatx cactttcagt agctttggaa tgcactgggt tcgtcaggct ccagagaagg ggctggagtg ggtcgcatac attagtagtg acagtagtgc catctactat gcagacacag tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atcccaagaa caccctgttc ctgcaaatga ccagtctaag gtctgaggac acggccatgt attactgtgg aagagggagg gaaaaeattt actaeggtag taggcttgac tactggggcô aaggcaeaac -tatcacagti; tcctca

[00194] CDR1 de Cadeia Pesada Variável BRCA84D (SEQ ID NO:13):

[00195] Sequência de Polinucleotídeo Codificando CDR1 de Cadeia Pesada Variável BRCA84D (SEQ ID NO:14): tttggaatgcac

[00196] CDR2 de Cadeia Pesada Variável BRCA84D (SEQ ID NO:15) :

[00197] Sequência de Polinucleotídeo CodificandoCDR2 de Cadeia Pesada Variável BRCA84D (SEQ ID NO:16): tacattagta gtgacagtag tgccatctac tatgcagaca cagtgaag

[00198] CDR3 de Cadeia Pesada Variável BRCA84D(SEQ ID NO:17) :

[00199] Sequência de Polinucleotídeo Codificando CDR3 de Cadeia Pesada Variável BRCA84D (SEQ ID N0:18): gggagggaaa acatttacta cggtagtagg cttgactac

B. SEQUÊNCIAS de BRCA69D (1) SEQUÊNCIAS DE CADEIA LEVE BRCA69D

[00200] Sequência de aminoácido de Cadeia Leve Variável BRCA69D (SEQ ID N0:19): DIQMTQTTSS LSASLGDRVT ISCRASQDIS NYLNWYQQKP DGTVKLLIYY TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD YSLTIDNLEQ EDIATYFCQQ GNTLPPTFGG GTKLEIK

[00201] Sequência de Polinucleotídeo Codificando Cadeia Leve Variável BRCA69D (SEQ ID NO:20): gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcaca atcagttgca gggcaagtca ggacattagt aattatttaa actggtatca gcagaaaaca gatggaactg ttaaactcct gatctactac acatcacgat tacactcagg agtcccatca aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattgacaa cctggagcaa gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttcctccgac gttcggtgga ggcaccaaac tggaaatcaa a

[00202] CDR1 de Cadeia Leve Variável BRCA69D (SEQ ID N0:21) :

[00203] Sequência de Polinucleotídeo Codificando CDR1 de Cadeia Leve Variável BRCA69D (SEQ ID NO:22): agggcaagtc aggacattag taattattta aac

[00204] CDR2 de Cadeia Leve Variável BRCA69D (SEQ ID NO:23) :

[00205] Sequência de Polinucleotídeo Codificando CDR2 de Cadeia Leve BRCA69D (SEQ ID NO:24) : tacacatcac gattacactc a

[00206] CDR3 de Cadeia Leve Variável BRCA69D (SEQ ID NO:25) :

[00207] Sequência de Polinucleotídeo Codificando CDR3 de Cadeia Leve Variável BRCA69D (SEQ ID NO:26): caacagggta atacgcttcc tccgacg

(2) SEQUÊNCIAS DE CADEIA PESADA BRCA69D

[00208] Sequência de aminoácido de Cadeia Pesada Variável BRCA69D (SEQ ID NO:27): QVQLQQSGAE LARPGASVKL SCKASGYTFT SYWMQWVKQR PGQGLEWIGT IYPGDGDTRY TQKFKGKATL TADKSSSTAY MQLSSLASED SAVYYCARRG 1PRLW Y F D VW G AG T T VI VS S

[00209] Sequência de Polinucleotídeo Codificando Cadeia Pesada Variável BRCA69D (SEQ ID NO:28): caggttcagc tccagcagtc tggggctgag ctggcaagac ctggggcttc agtgaagttg tcctgaaagg cttctggcta cacctttact agctactgga tgcagtgggt aaaacagagg cctggacagg gtctggaatg gattgggact atttatcctg gagatggtga tactaggtac actcagaagt tcaagcgcaa ggccacat-g act.gçagata aatctztccaα cacagcc∑ac atgcaactca gcagcttggc atctgaggac tútgcggtct attactgtgc aagaagaggg attccacggc tttggtactt cgatgtctgg ggcgcaggga ccacggtcac cgtctcctca

[00210] CDR1 de Cadeia Pesada Variável BRCA69D (SEQ ID NO:2 9) :

[00211] Sequência de Polinucleotídeo Codificando CDRi de Cadeia Pesada Variável BRCA69D (SEQ ID NO:30): agctactgga tgcag

[00212] CDR2 de Cadeia Pesada Variável BRCA69D (SEQ ID N0:31) :

[00213] Sequência de Polinucleotídeo Codificando CDR2 de Cadeia Pesada Variável BRCA69D (SEQ ID NO:32): actatttatc ctggagatgg tgatactagg tacactcag aagttcaagg gc

[00214] CDR3 de Cadeia Pesada Variável BRCA69D (SEQ ID NO:33):

[00215] Sequência de Polinucleotídeo Codificando CDR3 de Cadeia Pesada Variável BRCA69D (SEQ ID NO:34): agagggattc cacggctttg gtacttcgat gtc

C. SEQUÊNCIAS DE PRCA157 (1) PRCA157 CADEIA LEVE SEQUÊNCIAS

[00216] Sequência de aminoácido de Cadeia Leve Variável PRCA157 (SEQ ID N0:35): DTQMTQSFAS LSVSVGETVT ITCRASESIY SYLAWYQQKQ GKSPQLLVYN TKTLPEGVPS RFSGSGSGTQ FSLKINSLQP EDFGRYYCQH HYGTPPWTFG GGTNLEIK

[00217] Sequência de Polinucleotídeo Codificando Cadeia Leve Variável PRCA157 (SEQ ID NO:36): gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgtat ctgtgggaga aactgtcacc attacatgtc gagcaagtga gagtatttac agttatttag catggtatca gcagaaacag ggaaaatctc ctcagctcct ggtctataat acaaaaacct taccagaggg tgtgccatca aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag ttt.tct.ctga agatcaacag cctgcagcct gaagattttg ggagatatta ctgtcaacat cattatggta ctcctccgtg gacgttcggt ggaggcacca acctggaaat caaa

[00218] CDR1 de Cadeia Leve Variável PRCA157 (SEQ ID NO:37):

[00219] Sequência de Polinucleotídeo Codificando CDR1 de Cadeia Leve Variável PRCA157 (SEQ ID NO:38): cgagcaagtg agagtattta cagttattta gca

[00220] CDR2 de Cadeia Leve Variável PRCA157 (SEQ ID NO:39) :

[00221] Sequência de Polinucleotídeo Codificando CDR2 de Cadeia Leve Variável PRCA157 (SEQ ID NO:40): aatacaaaaa ccttaccaga g

[00222] CDR3 de Cadeia Leve Variável PRCA157 (SEQ ID Nθ:41) :

[00223] Sequência de Polinucleotídeo Codificando CDR3 de Cadeia Leve Variável PRCA157 (SEQ ID NO:42): caacatcatt atggtactcc tccgtgg

(2) SEQUÊNCIAS DE CADEIA PESADA PRCA157

[00224] Sequência de aminoácido de Cadeia Pesada Variável PRCA157 (SEQ ID NO:43): EVQQVESGGD LVKPGGSLKL SCAASGFTFS SYGMSWVRQT PDKRLEWVAT INSGGSNTYY PDSLKGRFTI SRDMAKNTLY LQMRSLKSED TAMYYCARHD GGAMDYWGQ G T sV T V SS

[00225] Sequência de Polinucleotídeo Codificando Cadeia Pesada Variável PRCA157 (SEQ ID No:44): gaggtgcagc aggtggagtc ggggggagac ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt tcctatggca tg tc11ggg t tcgccaga ct cc a gaca aga ggctggagtg ggt cgc a acc attaatagtg gtggaagtaa eacctactat ccagaeagtt tgaaggggcg a 11 c a c ca t c t cc a g aga c a a t gc c a a ga a c a c c c 111 a c c t g ca a a t g c gcagtctgaa gtctgaggac acagccatgt attactgtgc aagacatgac gggggagcta tggactactg gggtcaagga acctcagtca ccgtctcctc a

[00226] CDR1 de Cadeia Pesada Variável PRCA157 (SEQ ID N0:45) :

[00227] Sequência de Polinucleotídeo Codificando CDR1 de Cadeia Pesada Variável PRCA157 (SEQ ID NO:46): tcctatggca tgtct

[00228] CDR2 de Cadeia Pesada Variável PRCA157 (SEQ ID N0:47) :

[00229] Sequência de Polinucleotídeo Codificando CDR2 de Cadeia Pesada Variável PRCA157 (SEQ ID NO:48): gtcgcaacca ttaatagtgg tggaagtaac acctactatc cagacagttt gaagggg

[00230] CDR3 de Cadeia Pesada Variável PRCA157 (SEQ ID NO:49) :

[00231] Sequência de Polinucleotídeo Codificando CDR3 de Cadeia Pesada Variável PRCA157 (SEQ ID NO:50): catgacgggg gagctatgga ctac

D. ANTICORPOS B7-H3 PROJETADOS POR FC

[00232] Em função imune tradicional, a interação dos complexos de anticorpo-antígeno com células do sistema imune resulta em uma grande variedade de respostas, variando de funções efetoras tais como citotoxicidade dependente do anticorpo, desgranulação de mastócitos, e fagocitose para sinais imunomodulatórios tais como proliferação de linfócito de regulação e secreção de anticorpo. Todas essas interações são iniciadas através da ligação do domínio Fc dos anticorpos ou complexos imune para receptores de célula especializados em células hematopoiéticas. A diversidade de respostas celulares desencadeadas pelos anticorpos e complexos imune resulta da heterogenicidade estrutural dos três receptores Fc: FcyRI (CD64), FcyRII (CD32), e FcyRIII (CD 16). FcyRI (CD64), FcyRIIA (CD32A) e FcyRIII (CD 16) são receptores de ativação (isto é, aumento do sistema imune); FcyRIIB (CD32B) é um receptor de inibição (isto é, atenuação do sistema imune). A sequência de aminoácido da região Fc da IgG1 Fc é mostrada abaixo (como SEQ ID No:51, numerada de acordo com Kabat et al, SEQUENCE OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th Ed. Public Health Service, NIH, MD (1991), expressamente incorporada aqui por referência, e a seguir referida como “Kabat EU”):SEQ ID N0:51PAPELLGGPS230 VFLFPPKFKD 240 TLMISRTPEV 250 TCVWDVSHE260 DPEVKFNWYV 270DGVEVHNAKT230 KPREEQYNST 290 YRWSVLTVL 300 HQDWLNGKEY 310 KCKVSNKALP 32CAFIEKTlSKft330 KGQFREFQVY 340 TLFFSREEMT350 KNQVSLTCLV 360 KGFYFSDIftV 370EWESNGQFEM 380 NYKTTFFVLD 390 SDGSFFLYSK 0 0 LTVDKSRWQQ410 GNVFSCSVMH 420EALHNHYTQK SLSLSPGK 4.30 440

[00233] Os resíduos 230 a 341 são a região Fc CH2. Os resíduos 342 a 447 são a região Fc CH3.

[00234] A presente invenção inclui anticorpos que especificamente se unem a B7-H3 que compreende uma região Fc variável tendo uma ou mais modificação de aminoácidos (por exemplo, substituições, exclusões, inserções) em uma ou mais porções, modificações que aumentam a afinidade e avidez da região Fc variável para um FcyR (incluindo FcyRs de ativação e inibitórios). Em algumas realizações, as ditas uma ou mais modificações de aminoácido aumentam a afinidade da região Fc variável para FcyRIIIA e/ou FcyRIIA. Em outra realização, a região Fc variável ainda especificamente se une a FcyRIIB com uma afinidade menor do que a região Fc do anticorpo principal comparável (isto é, um anticorpo que tem a mesma sequência de aminoácido como o anticorpo da invenção exceto para as uma ou mais modificações de aminoácido na região Fc). Em algumas realizações, tais modificações aumentam a afinidade da região Fc variável para FcyRIIIA e/ou FcyRIIA e também aumentam a afinidade da região Fc variável para FcyRIIB com relação ao anticorpo principal. Em outras realizações, as ditas uma ou mais modificações de aminoácido aumentam a afinidade da região Fc variável para FcyRIIIA e/ou FcyRIIA mas não alteram a afinidade da região Fc variável para FcyRIIB com relação à região Fc do anticorpo principal. Em outra realização, as ditas uma ou mais modificações de aminoácido aumentam a afinidade da região Fc variável para FcyRIIIA e FcyRIIA, mas reduz a afinidade para FcyRIIB com relação ao anticorpo principal. Afinidade e/ou avidez resulta em ligação detectável à atividade relacionada a FcyR ou FcyR em células que expressam baixos níveis do FcyR quando a atividade de ligação da molécula principal (sem a região Fc modificada) não pode ser detectada nas células. Em outras realizações, a molécula modificada exibe ligação detectável em células que expressam antígenos alvo do receptor não FcyR em uma densidade de 30.000 a 20.000 moléculas/célula, em umadensidade de 20.000 a 10.000 moléculas/célula, em umadensidade de 10.000 a 5.000 moléculas/célula, em umadensidade de 5 .000 a 1 .000 moléculas/célula, em uma densidadede 1.000 a 200 moléculas/célula ou em uma densidade de 200 moléculas/célula ou menos (mas pelo menos 10, 50, 100 ou 150 moléculas/célula).

[00235] Em outra realização, as ditas uma ou mais modificações para os aminoácidos da região Fc reduzem a afinidade e avidez do anticorpo para um ou mais receptores FcyR. Em uma realização específica, a invenção engloba anticorpos compreendendo uma região Fc variável, em que a dita região Fc variável compreende pelo menos uma modificação de aminoácido com relação a uma região Fc tipo selvagem, região Fc variável que apenas se une a um FcyR, em que o dito FcyR é FcyRIIIA. Em outra realização específica, a invenção engloba anticorpos compreendendo uma região Fc variável, em que a dita região Fc variável compreende pelo menos uma modificação de aminoácido com relação à região Fc tipo selvagem, região Fc variável que apenas se une a um FcyR, em que o dito FcyR é FcyRIIA...

[00236] Preferencialmente, as propriedades de ligação das moléculas da invenção são caracterizadas por ensaios funcionais in vitro para determinar uma ou mais funções de célula efetora de mediador FcyR (Ver Seção 5.2.7). As afinidades e propriedades de ligação das moléculas, por exemplo, anticorpos, da invenção para um FcyR podem ser determinadas usando ensaios in vitro (ensaios com base bioquímica ou imunológica) conhecidos na matéria para determinar as interações do anticorpo-antígeno ou Fc-FcyR, isto é, ligação específica de um antígeno em um anticorpo ou ligação específica de uma região Fc para um FcyR, respectivamente, incluindo, mas não limitado a, ensaio ELISA, ensaio de ressonância de plasma de superfície, ensaios de imunoprecipitação. Em realizações mais preferidas, as moléculas da invenção têm propriedades de ligação similares em modelos in vivo (tais como aqueles aqui descritos e revelados) como aqueles em ensaios com base in vitro. Entretanto, a presente invenção não exclui as moléculas da invenção que não exibem o fenótipo desejado em ensaios com in vitro, mas não exibem o fenótipo desejado in vivo.

[00237] Em algumas realizações, as moléculas da invenção compreendendo uma região Fc variável compreende pelo menos uma modificação de aminoácido (por exemplo, possuindo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou mais modificações de aminoácido) no domínio CH3 da região Fc, que é definida como uma extensão dos aminoácidos 342 a 447. Em outras realizações, as moléculas da invenção compreendendo uma região Fc variável compreendem pelo menos uma modificação de aminoácido (por exemplo, possuindo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou mais modificações de aminoácido) no domínio CH2 da região Fc, que é definida como uma extensão dos aminoácidos 231 a 341. Em algumas realizações, as moléculas da invenção compreendem pelo menos duas modificações de aminoácido (por exemplo, possuindo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou mais modificações de aminoácido), em que pelo menos tal modificação esteja na região CH3 e pelo menos tal modificação esteja na região CH2. A invenção ainda engloba modificação de aminoácido na região articular. Em uma realização particular, a invenção engloba modificação de aminoácido no domínio CH1 da região Fc, que é definida como a extensão dos aminoácidos 216 a 230.

[00238] Em realizações particularmente preferidas, a invenção engloba moléculas compreendendo uma região Fc variável em que a dita variável confere ou tem uma atividade ADCC aumentada e/ou uma ligação aumentada para FcyRIIA (CD32A), conforme medida usando métodos conhecidos de alguém especialista na matéria e exemplificados aqui. Os ensaios ADCC usados de acordo com os métodos da invenção podem ser dependentes de NK ou dependentes de macrófago.

[00239] Em realizações particularmente preferidas, a invenção engloba moléculas compreendendo uma região Fc variável em que a dita variável confere ou tem uma atividade ADCC aumentada e/ou uma ligação aumentada para FcyRIIIA (CD16A), conforme medida usando métodos conhecidos de alguém especialista na técnica exemplificada aqui. Os ensaios ADCC usados de acordo com os métodos da invenção podem ser dependentes de NK ou dependentes de macrófago.

[00240] As variáveis Fc da presente invenção podem ser combinadas com outras modificações de Fc, tais como aquelas descritas nas Patentes Norte-Americanas n°s 7.632.497; 7.521.542; 7.425.619; 7.416.727; 7.371.826; 7.355.008; 7.335.742; 7.332.581; 7.183.387; 7.122.637; e 6.737.056; nas Publicações de PCT n°s WO 2008/105886; WO 2008/002933; WO 2007/021841; WO 2007/106707; WO 06/088494; WO 05/115452; WO 05/110474; WO 04/1032269; e em WO 04/063351; e em Presta, L.G. et al. (2002) “Engineering Therapeutic antibodies for improved function,” Biochem. Soc. Trans. 30(4):487-490; Shields, R.L. et al. (2002) “Lack of fucose on human IgG1 N-linked oligosaccharide improves binding to human Fcgamma RIII e antibody-dependent cellular toxicity,” J. Biol. Chem. 26;277(30):26733-26740 e Shields, R.L. et al. (2001) “High resolution mapping of the binding site on human IgG1 for Fc gamma RI, Fc gamma RII, Fc gamma RIII, e FcRn e design of IgG1 variants com improved binding to the Fc gamma R,” J. Biol. Chem. 276(9):6591-6604). A invenção engloba a combinação de uma variável Fc da invenção com outras modificações de Fc para prover propriedades aditivas, sinérgicas ou novas para o anticorpo modificado. Preferencialmente, as variáveis Fc da invenção aumentam o fenótipo da modificação com o qual elas são combinadas. Por exemplo, se uma variável Fc da invenção é combinada com um mutante conhecido por ligar FcyRIIIA com uma afinidade maior que uma região Fc tipo selvagem comparável; a combinação com um mutante da invenção resulta em um maior aperfeiçoamento de vezes na afinidade de FcyRIIIA.

[00241] A invenção engloba anticorpos que especificamente se unem a B7-H3 que compreende uma região Fc variável, em que a região Fc variável compreende pelo menos uma modificação de aminoácido (por exemplo, possuindo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou mais modificações de aminoácido) relativa a uma região Fc tipo selvagem, de modo que a molécula tenha uma função efetora aumentada relativa a uma molécula compreendendo uma região Fc tipo selvagem, contantoque a região Fc variável não tenha ou não seja apenas umasubstituição em qualquer uma ou mais das posições 243, 255,256, 258, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285,286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 300, 301, 303,305, 307, 309, 312, 320, 322, 326, 329, 330, 332, 331, 333,334, 335, 337, 338, 339, 340, 359, 360, 373, 376, 416, 419,430, 434, 435, 437, 438, 439. Em uma realização específica, a invenção engloba tais anticorpos compreendendo uma região Fc variável, em que a região Fc variável compreende pelo menos uma modificação de aminoácido (por exemplo, possuindo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou mais modificações de aminoácido) relativa a uma região Fc tipo selvagem, de modo que a molécula se ligue a um FcyR com uma afinidade alterada relativa a uma molécula compreendendo uma região Fc tipo selvagem, contanto que a região Fc variável não tenha ou nãoseja apenas uma substituição em qualquer uma ou mais dasposi ções 243, 255, 258, 267, 269, 270, 276, 278, 280, 283,285, 289, 292, 293, 294, 295, 296, 300, 303, 305, 307, 309,320, 322, 329, 332, 331, 337, 338, 340, 373, 376, 416, 419,434, 435, 437, 438, 439 e não tenha uma alanina e qualqueruma das posições 256, 290, 298, 312 , 326, 333, 334, 359, 360,ou 430; uma asparagina na posição 268; uma glutamina naposição 272; uma glutamina, serina, ou ácido aspártico naposição 286; uma serina na posição 290; uma metionina naposição 301; uma metionina, glutamina, ácido glutâmico, ouarginina na posição 320; um ácido glutâmico na posição 322; uma asparagina, serina, ácido glutâmico, ou ácido aspártico na posição 326; uma lisina na posição 330; uma glutamina na posição 334; um ácido glutâmico na posição 334; uma metionina na posição 334; uma histidina na posição 334; uma valina na posição 334; uma leucina na posição 334; uma glutamina na posição 335; uma lisina na posição 335; ou uma treonina na posição 339.

[00242] A invenção também engloba anticorpos que especificamente se unem a B7-H3 que compreendem uma região Fc variável, em que a região Fc variável compreende tais anticorpos compreendendo uma região Fc variável, em que a região Fc variável não tem ou não é apenas uma substituição em qualquer uma ou mais das posições 268, 269, 270, 272, 276, 278, 283, 285, 286, 289, 292, 293, 301, 303, 305, 307, 309, 320, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 ou 439 e não tem uma histidina, glutamina, ou tirosina na posição 280; uma serina, glicina, treonina ou tirosina na posição 290, uma asparagina na posição 294, uma lisina na posição 295; uma prolina na posição 296; uma prolina, asparagina, ácido aspártico, ou valina na posição 298; ou uma leucina ou isoleucina na posição 300. Em outra realização, a invenção engloba tais anticorpos compreendendo uma região Fc variável, em que a região Fc variável compreende pelo menos uma modificação de aminoácido com relação à região Fc tipo selvagem, de modo que a molécula se une a um FcyR com uma afinidade reduzida com relação à molécula compreendendo uma região Fc tipo selvagem contanto que a região Fc variável não tenha ou não seja apenas uma substituição em qualquer uma ou mais da posições243, 252, 254, 265, 268, 269, 270, 278, 289, 292, 293, 294,295, 296, 298, 300, 301, 303, 322, 324, 327, 329, 333, 335,338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 414, 416, 419, 434, 435,437, 438, ou 439. Ainda em outra realização, a invençãoengloba tais anticorpos compreendendo uma região Fc variável, em que a região Fc variável compreende pelo menos uma modificação de aminoácido com relação à região Fc tipo selvagem, de modo que a molécula se une a FcyR com uma afinidade aumentada com relação à molécula compreendendo uma região Fc tipo selvagem contanto que a região Fc variável não tenha e não seja apenas uma substituição em qualquer uma ou mais da posições 280, 283, 285, 286, 290, 294, 295, 298, 300, 301, 305, 307, 309, 312, 315, 331, 333, 334, 337, 340, 360, 378, 398, ou 430.

[00243] A invenção também engloba anticorpos que especificamente se unem a B7-H3 que compreendem uma região Fc variável, em que a região Fc variável não inclui ou não são apenas uma substituição em qualquer uma ou mais das posições 330, 243, 247, 298, 241, 240, 244, 263, 262, 235, 269, ou 328 e não tem uma leucina na posição 243, uma asparagina na posição 298, uma leucina na posição 241, e isoleucina ou uma alanina na posição 240, uma histidina na posição 244, uma valina na posição 330, ou uma isoleucina na posição 328.

[00244] A invenção particularmente engloba anticorpos que especificamente se unem a B7-H3 que compreendem uma região Fc variável com função efetora aumentada e/ou afinidades alteradas para receptores de ativação e/ou inibitórios, em que a região Fc variável compreende: (a) qualquer 1, 2, 3, 4, 5, ou 6 das seguintes substituições: S239D, S298A, A330L, I332E, E333A, ou K334A; ou (b) qualquer uma das combinações de substituições: (1) S298A, E333A, e K334A; (2) S239D e I332E; ou (3) S239D, A330L e I332E.

[00245] A invenção particularmente engloba anticorpos que especificamente se une a B7-H3 que compreende uma região Fc variável com função efetora aumentada e/ou afinidades alteradas para ativação e/ou receptores inibitórios, em que a região Fc variável compreende uma substituição:(1) na posição 288 com asparagina, na posição 330 com serina e na posição 396 com leucina;(2) na posição 334 com ácido glutâmico, na posição 359 com asparagina, e na posição 366 com serina;(3) na posição 316 com ácido aspártico, na posição 378 com valina, e na posição 399 com ácido glutâmico; (4) na posição 247 com leucina, e uma substituição na posição 421 com lisina;(5) na posição 392 com treonina, e na posição 396 com leucina;(6) na posição 221 com ácido glutâmico, na posição270 com ácido glutâmico, na posição 308 com alanina, na posição 311 com histidina, na posição 396 com leucina, e na posição 402 com ácido aspártico;(7) na posição 419 com histidina, e uma substituição na posição 396 com leucina;(8) na posição 240 com alanina, e na posição 396 com leucina;(9) na posição 410 com histidina, e na posição 396 com leucina;(10) na posição 243 com leucina, na posição 305 com isoleucina, na posição 378 com ácido aspártico, na posição 404 com serina, e na posição 396 com leucina;(11) na posição 255 com isoleucina, e na posição 396 com leucina;(12) na posição 370 com ácido glutâmico e na posição 396 com leucina;(13) na posição 270 com ácido glutâmico;ou(14) qualquer combinação das substituições acima (1) a (12).

[00246] Em uma realização específica, a invenção engloba um anticorpo que especificamente se une a B7-H3 que compreende uma região Fc variável que compreende a substituição: F243L, R292P, e Y300L. Ainda em uma realização específica, a invenção engloba um anticorpo que especificamente se une a B7-H3 que compreende uma região Fc variável que compreende a substituição: L235V, F243L, R292P, Y300L, e P396L. Ainda em uma realização específica, a invenção engloba um anticorpo que especificamente se une a B7-H3 que compreende uma região Fc variável que compreende a substituição F243L, R292P, Y300L, V305I, e P396L.

[00247] Ainda em uma realização específica, a invenção engloba um anticorpo que especificamente se une a B7-H3 que compreende uma região Fc variável que compreende uma substituição na posição 396 com leucina, na posição 270 com ácido glutâmico e na posição 243 com leucina. Em outra realização específica, a molécula ainda compreende uma ou mais modificações de aminoácido tais como aquelas descritas aqui.

[00248] A invenção particularmente engloba anticorpos que especificamente se unem a B7-H3 que compreende uma região Fc variável com função efetora aumentada e/ou afinidades alteradas para receptores de ativação e/ou inibitórios, que têm uma modificação de aminoácido em uma ou mais das segui ntes posiç ões: 119, 125, 132, 133, 141, 142,147, 149, 162, 166, 185, 192, 202, 205, 210, 214, 215, 216,217, 218, 219, 221, 222, 223, 224, 225, 227, 229, 231, 232,233, 235, 240, 241, 242, 243, 244, 246, 247, 248, 250, 251,252, 253, 254, 255, 256, 258, 261, 262, 263, 268, 269, 270,272, 274, 275, 276, 279, 280, 281, 282, 284, 287, 288, 289,290, 291, 292, 293, 295, 298, 301, 303, 304, 305, 306, 307,308, 309, 310, 31 1 , 312, 313, 315, 316, 317, 318, 319, 320,323, 326, 327, 328, 330, 333, 334, 335, 337, 339, 340, 343,344, 345, 347, 348, 352, 353, 354, 355, 358, 359, 360, 361,362, 365, 366, 367, 369, 370, 371, 372, 375, 377, 378, 379,380, 381, 382, 383, 384 , 385 , 386, 387, 388, 389, 390, 392,393, 394, 395, 396, 397 , 398 , 399, 400, 401, 402, 404, 406,407, 408, 409, 410, 411 , 412 , 414, 415, 416, 417, 419, 420,421, 422, 423, 424, 427 , 428 , 431, 433, 435, 436, 438, 440,441, 442, 443, 446, ou 447. Preferencialmente tais mutaçõesresultam em moléculas que foram conferidas com função mediada por célula efetora e, opcionalmente, têm uma afinidade alterada por um FcyR conforme determinado usando métodos descritos e exemplificados aqui e conhecidos de alguém especialista na matéria.

[00249] A invenção particularmente englobaanticorpos que especificamente se unem a B7-H3 que compreende uma região Fc variável com função efetora alterada e/ou afinidades alteradas para receptores de ativação e/ou inibição, que tem:(I) uma modificação de aminoácido em uma ou mais das seguintes posições: 235, 240, 241, 243, 244, 247, 262, 263, 269, 298, 328, ou 330 e mais preferencialmente uma ou mais das seguintes modificações: V240A, V240I, F241L, F243L, P244H, S298N, L328I, A330V; em que tais anticorpos exibem função efetora alterada com relação aos anticorpos que têm uma região Fc tipo selvagem que carece de tal modificação;(II) uma modificação de aminoácido em uma ou mais das seguintes posições: 268, 269, 270, 272, 276, 278, 283, 285, 286, 289, 292, 293, 301, 303, 305, 307, 309, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 ou 439 e mais preferencialmente uma ou mais das seguintes modificações: D280H, D280Q, D280Y, K290G, K290S, K290T, K290Y, E294N, Q295K, Y296P, S298D, S298N, S298P,S298V, Y300I, Y300L; em que tais anticorpos exibem função efetora alterada com relação aos anticorpos que têm uma região Fc tipo selvagem que carece de tal modificação;(III) uma modificação de aminoácido em uma ou maisdas seguintes posições: 255, 256, 258, 267, 268, 269, 270,272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294,295, 296, 298, 300, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 320, 322,326, 329, 330, 332, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 339, 340,359, 360, 373, 376, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438, 439, emais preferencialmente uma ou mais das seguintesmodificações: T256A, H268N, E272Q, N286D, N286Q, N286S,K290A, K290S, S298A, R301M, D312A, K320E, K320M, K320Q,K320R, K322E, K326A, K326D, K326E, K326N, K326S, A330K,A339T, E333A, K334A, K334E, K334H, K334L, K334M, K334Q,K334V, T335K, T335Q, T359A, K360A, E430A; em que taisanticorpos exibem função efetora alterada com relação aos anticorpos que têm uma região Fc tipo selvagem que carece de tal modificação;(IV) uma modificação de aminoácido em uma ou maisdas seguintes posições: 252, 254, 265, 268, 269, 270, 278,289, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 300, 301, 303, 322, 324,327, 329, 333, 335, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 414,416, 419, 434, 435, 437, 438, ou 439; em que tais anticorposexibem função efetora reduzida com relação aos anticorpos quetêm uma região Fc tipo selvagem que carece de tal modificação;(V) uma modificação de aminoácido em uma ou mais das seguintes posições: 280, 283, 285, 286, 290, 294, 295, 298, 300, 301, 305, 307, 309, 312, 315, 331, 333, 334, 337, 340, 360, 378, 398, ou 430; em que tais anticorpos exibem função efetora aumentada com relação aos anticorpos que têm ou(VI) uma modificação de aminoácido em uma ou maisdas seguintes posições : R255A, T256A , E258A, S267A, H268A,H268N, E272A, E272Q, N276A, D280A, E283A, H285A, N286A,N286D, N286Q, N286S, K290A, K290S, R301M, K320E, K320M,K320Q, K320R, K322E, K326A, K326D, K326E, K326S, A330K,P331A, T335Q, S337A, E430A; em que tais anticorpos exibemfunção efetora aumentada com relação aos anticorpos que têmuma região Fc tipo selvagem que carece de tal modificação.

[00250] Em outras realizações, a invenção engloba o uso de qualquer variável Fc conhecida na matéria, tal como aquelas descritas em Jefferis, B.J. et al. (2002) “Interaction Sites On Human IgG-Fc For FcgammaR: Current Models”, Immunol. Lett. 82:57-65; Presta, L.G. et al. (2002) “Engineering Therapeutic Antibodies For Improved Function”, Biochem. Soc. Trans. 30:487-90; Idusogie, E.E. et al. (2001) “Engineered Antibodies With Increased Activity To Recruit Complement”, J. Immunol. 166:2571-75; Shields, R.L. et al. (2001) “High Resolution Mapping Of The Binding Site On Human IgG1 For Fc Gamma RI, Fc Gamma RII, Fc Gamma RIII, And FcRn And Design Of IgG1 Variants Com Improved Binding To The Fc gamma R”, J. Biol. Chem. 276:6591-6604; Idusogie, E.E. et al. (2000) “Mapping Of The Clq Binding Site On Rituxan, A Chimeric Antibody With A Human IgG Fc”, J. Immunol. 164:417884; Reddy, M.P. et al. (2000) “Elimination Of Fc ReceptorDependent Effector Functions Of A Modified IgG4 Antibody monoclonal To Human CD4”, J. Immunol. 164:1925-1933; Xu, D. et al. (2000) “In Vitro Characterization of Five Humanized OKT3 Effector Function Variant Antibodies”, Cell. Immunol. 200:16-26; Armour, K.L. et al. (1999) “Recombinant human IgG Molecules Lacking Fcgamma Receptor I Binding And Monocyte Triggering Activities”, Eur. J. Immunol. 29:2613-24; Jefferis, R. et al. (1996) “Modulation Of Fc(Gamma)R And Human Complement Activation By IgG3-Core Oligosaccharide Interactions”, Immunol. Lett. 54:101-04; Lund, J. et al. (1996) “Multiple Interactions Of IgG With Its Core Oligosaccharide Can Modulate Recognition By Complement And Human Fc Gamma Receptor I And Influence The Synthesis Of Its Oligosaccharide Chains”, J. Immunol. 157:4963-4969; Hutchins et al. (1995) “Improved Biodistribution, Tumor Targeting, And Reduced Immunogenicity In Mice With A Gamma 4 Variant Of Campath-1H”, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 92: 1 1980-84; Jefferis, R. et al. (1995) “Recognition Sites On Human IgG For Fc Gamma Receptors: The Role Of Glycosylation”, Immunol. Lett. 44:111-17; Lund, J. et al. (1995) “Oligosaccharide- Protein Interactions In IgG Can Modulate Recognition By Fc Gamma Receptors”, FASEB J. 9:115-19; Alegre, M.L. et al. (1994) “A Non-Activating “Humanized” Anti-CD3 Monoclonal Antibody Retains Immunosuppressive Properties In Vivo”, Transplantation 57:1537-1543; Lund et al. (1992) “Multiple Binding Sites On The CH2 Domain Of IgG For Mouse Fc Gamma R11,” Mol. Immunol. 29:53-59; Lund et al. (1991) “Human Fc Gamma RI And Fc Gamma RII Interact With Distinct But Overlapping Sites On Human IgG,” J. Immunol. 147:2657-2662; Duncan, A.R. et al. (1988) “Localization Of The Binding Site For The Human High-Affinity Fc Receptor On IgG,” Nature 332:563-564; Patente Norte-Americana n°s 5.624.821; 5.885.573; 6.194.551; 7.276.586; e 7.317.091; e Publicações de PCT WO 00/42072 e PCT WO 99/58572.

[00251] A invenção engloba moléculas compreendendo regiões Fc variáveis consistindo em ou compreendendo qualquer uma das mutações listadas na tabela abaixo na Tabela 1.

[00252] Em realizações específicas, a região Fc variável de tais anticorpos anti-B7-H3 tem:(1) uma leucina na posição 247, uma lisina na posição 421 e um ácido glutâmico na posição 270;(2) uma treonina na posição 392, uma leucina na posição 396, um ácido glutâmico na posição 270, e uma leucina na posição 243;..(3) uma histidina na posição 419, uma leucina na posição 396, e um ácido glutâmico na posição 270;(4) uma histidina na posição 419, uma leucina na posição 396, um ácido glutâmico na posição 270, e uma leucina na posição 243;(5) uma alanina na posição 240, uma leucina na posição 396, e um ácido glutâmico na posição 270;(6) uma lisina na posição 255 e uma leucina na posição 396;(7) umaa lisina na posição 255, uma leucina na posição 396, e um ácido glutâmico na posição 270;(8) uma lisina na posição 255, uma leucina na posição 396, um ácido glutâmico na posição 270, e uma lisina na posição 300;(9) uma lisina na posição 255, uma leucina na posição 396, um ácido glutâmico na posição 270, e uma glicina na posição 292;(10) uma lisina na posição 255, uma leucina na posição 396, um ácido glutâmico na posição 270, e uma leucina na posição 243;(11) um ácido glutâmico na posição 370, uma leucina na posição 396, e um ácido glutâmico na posição 270;(12) um ácido glutâmico na posição 270, um ácido aspártico na posição 316, e uma glicina na posição 416;(13) uma leucina na posição 243, uma prolina na posição 292, uma isoleucina na posição 305, e uma leucina na posição 396;(14) uma leucina na posição 243, um ácido glutâmico na posição 270, uma asparagina na posição 392 e uma leucina na posição 396;(15) uma leucina na posição 243, uma leucina na posição 255, um ácido glutâmico na posição 270 e uma leucina na posição 396;(16) uma glutamina na posição 297; ou(17) qualquer combinação das substituições (1) a (16) anteriores.

[00253] Em algumas realizações, as moléculas da invenção ainda compreendem um ou mais locais de glicosilação, de modo que uma ou mais porções de carboidrato sejam covalentemente anexadas à molécula. Preferencialmente, as moléculas da invenção com um ou mais locais de glicosilação e/ou uma ou mais modificações na região Fc conferem ou têm uma função efetora mediada por anticorpo aumentado, por exemplo, atividade ADCC aumentada, comparado a um anticorpo principal. Em algumas realizações, a invenção ainda compreende moléculas compreendendo uma ou mais modificações de aminoácidos que são direta ou indiretamente conhecidas por interagir com uma porção de carboidrato do anticorpo, incluindo, mas não limitado a, aminoácidos nas posições 241, 243, 244, 245, 245, 249, 256, 258, 260, 262, 264, 265, 296, 299, e 301. Aminoácidos que direta ou indiretamente interagem com uma porção de carboidrato de um anticorpo são conhecidos na matéria, ver, por exemplo, Jefferis et al., 1995 Immunology Letters, 44:111-7, que é incorporado aqui por referência em sua totalidade.

[00254] Em outra realização, a invenção engloba moléculas que foram modificadas pela introdução de um ou mais locais de glicosilação em um ou mais locais das moléculas, preferencialmente sem alterar a funcionalidade das moléculas, por exemplo, ligando a atividade ao antígeno alvo ou FcyR. Os locais de glicosilação podem ser introduzidos na região variável e/ou constante das moléculas da invenção. Conforme usado aqui, “locais de glicosilação” incluem qualquer sequência de aminoácido em um anticorpo ao qual um oligossacarídeo (isto é, carboidratos contendo dois ou mais açúcares simples ligados juntos) se anexará específica e covalentemente. As cadeias laterais de oligossacarídeo são tipicamente ligadas à coluna vertebral através de ligações de N ou O. A glicosilação ligada ao N se refere à fixação de uma porção de oligossacarídeo à cadeia lateral de um resíduo de asparagina. A glicosilação ligada ao O se refere à fixação de uma porção de oligossacarídeo a um hidroxiaminoácido, por exemplo, serina, treonina. As moléculas da invenção podem compreender um ou mais locais de glicosilação, incluindo locais de glicosilação ligados ao N e ligados ao O. Qualquer local de glicosilação para glicosilação ligada ao N ou ligada ao O conhecido na matéria pode ser usado de acordo com a invenção imediata. Um local de glicosilação exemplar ligado ao N que é de acordo com os da presente invenção é a sequência de aminoácido: Asn-X-Thr/Ser, em que X pode ser qualquer aminoácido e Thr/Ser indicada uma treonina ou uma serina. Tal local ou locais podem ser introduzidos em uma molécula da invenção usando métodos bem conhecidos na matéria ao quais essa invenção pertence (ver, por exemplo, MUTAGÊNESE IN VITRO, DNA RECOMBINANTE: UM CURSO RÁPIDO, J. D. Watson, et al. W.H. Freeman e Company, New York, 1983, chapter 8, pp. 106-116, que é incorporada aqui por referência em sua totalidade. Um método exemplar para introduzir um local de glicosilação em uma molécula da invenção pode compreender: modificação ou mutação de uma sequência de aminoácido da molécula de modo que seja obtida a sequência desejada Asn-X- Thr/Ser.

[00255] Em algumas realizações, a invenção engloba métodos de modificação do conteúdo de carboidrato de uma molécula da invenção adicionando ou excluindo um local de glicosilação. Os métodos para modificar o conteúdo de carboidrato dos anticorpos são bem conhecidos na matéria e englobados dentro da invenção, ver, por exemplo, Patente Norte-Americana n° 6.218.149; EP 0 359 096 B1; Publicação Norte-Americana n° US 2002/0028486; WO 03/035835; Publicação Norte-Americana n° 2003/0115614; Patente Norte-Americana n° 6.218.149; Patente Norte-Americana n° 6.472.511; todas as quais são incorporadas aqui por referência em sua totalidade. Em outras realizações, a invenção engloba métodos de modificação do conteúdo de carboidrato de uma molécula da invenção excluindo uma ou mais porções de carboidrato endógeno da molécula. Em uma realização específica, a invenção engloba a mudança do local de glicosilação da região Fc de um anticorpo, modificando as posições adjacentes para 297. Em uma realização específica, a invenção engloba modificar a posição 296 de modo que a posição 296 e não a posição 297 seja glicosilada.

[00256] A função efetora também pode ser modificada por técnicas tais como pela introdução de um ou mais resíduos de cisteína na região Fc, desta forma permitindo que ocorra a formação de ligação de dissulfeto intercadeia nessa região, resultando na geração de um anticorpo homodimérico que pode ter a capacidade de internalização melhorada e/ou morte celular mediada por complemento aumentada e ADCC (Caron, P.C. et al. (1992) “Engineered Humanized Dimeric Forms Of IgG Are More Effective Antibodies” J. Exp. Med. 176:1191-1195; Shopes, B. (1992) “A Genetically Engineered Human IgG Mutant With Enhanced Cytolytic Activity” J. Immunol. 148(9):2918-2922. Os anticorpos homodiméricos com atividade antitumor aumentada também podem ser preparados usando reticuladores heterobifuncionais conforme descrito em Wolff, E.A. et al. (1993) “Monoclonal Antibody Homodimers: Enhanced Antitumor Activity In Nude Mice” Cancer Research 53:2560-2565. Alternativamente, um anticorpo pode ser projetado, o qual tem regiões Fc duplas e podem, desta forma, ter lise complementar aumentada e capacidades de ADCC (Stevenson, G.T. et al. (1989) “A Chimeric Antibody With Dual Fc Regions (bisFabFc) Prepared By Manipulations At The IgG Hinge” Anti-Cancer Drug Design 3:219-230).

E. DARTTM (REAGENTE DE REDIRECIONAMENTO DE DUPLA AFINIDADE) DE B7-H3

[00257] Conforme discutido acima, a presente invenção adicionalmente engloba moléculas de “DARTTM” (reagente de redirecionamento de dupla afinidade) que compreendem pelo menos duas cadeias de polipeptídeo que formam pelo menos dois locais de ligação de epítopo, pelo menos um dos quais especificamente se une a B7-H3.

[00258] Em realizações preferidas, a primeira cadeia de polipeptídeo do DARTTM compreende: (i) um domínio (A) compreendendo uma região de ligação de um domínio variável de cadeia leve de uma primeira imunoglobulina (VL1) específica para um epítopo (1);(ii) um domínio (B) compreendendo uma região de ligação de um domínio variável de cadeia pesada de uma segunda imunoglobulina (VH2) específica para um epítopo (2); e(iii) um domínio (C).

[00259] A segunda cadeia de polipeptídeo de tal DARTTM compreende:(i) um domínio (D) compreendendo uma região de ligação de um domínio variável de cadeia leve da segunda imunoglobulina (VL2) específica para epítopo (2);(ii) um domínio (E) compreendendo uma região de ligação de um domínio variável de cadeia da primeira imunoglobulina (VH1) específica para epítopo (1); e(iii) um domínio (F).

[00260] Os domínios de DARTTM (A) e (B) não se associam um com o outro para formar um local de ligação de epítopo. Similarmente, os domínios de DARTTM (D) e (E) não se associam um com o outro para formar um local de ligação deepítopo. Em vez disso, os domínios de DARTTM (A) e (E) seassociam para formar um local de ligação que se une aoepítopo (1); os ditos domínios de DARTTM (B) e (D) seassociam para formar um local de ligação que se une ao ditoepítopo (2). Os domínios (C) e (F) são covalentementeassociados juntos.

[00261] Cada cadeia de polipeptídeo da molécula de DARTTM compreende um domínio VL e um domínio VH, os quais são covalentemente ligados de modo que domínios são restritos a partir da automontagem. A interação de duas das cadeias de polipeptídeo produzirá dois pareamentos VL-VH, formando dois locais de ligação de epítopo, isto é, uma molécula bivalente. Nem o domínio VH ou VL é restrito a qualquer posição dentro da cadeia de polipeptídeo, isto é, restrito ao terminal amino (N) ou carbóxi (C), nem são os domínios restritos em suas posições relativas de um para o outro, isto é, o domínio VL pode ser um N-terminal para o domínio VH e vice-versa. A única restrição é que a cadeia de polipeptídeo complementar esteja disponível a fim de formar DARTTMs funcionais. Onde os domínios VL e VH são derivados do mesmo anticorpo, as duas cadeias de polipeptídeo complementar podem ser idênticas. Por exemplo, onde os domínios de ligação são derivados de um anticorpo específico para o epítopo A (isto é, o domínio de ligação é formado de uma interação VLA-VHA), cada polipeptídeo compreenderá um VHA e um VLA. Homodimerização de duas cadeias de polipeptídeo do anticorpo resultará na formação de dois locais de ligação VLA-VHA, resultando em um anticorpo monoespecífico bivalente. Onde os domínios VL e VH são derivados de anticorpos específicos para diferentes antígenos, a formação de um DARTTM biespecífico funcional requer a interação de duas cadeias de polipeptídeo diferentes, isto é, a formação de um heterodímero. Por exemplo, para um DARTTM biespecífico, uma cadeia de polipeptídeo compreenderá um VLA e um VLB; homodimerização da dita cadeia resultará na formação de dois locais de ligação VLA-VHB, que sem ligação ou de ligação imprevisível. Em contraste, onde duas cadeias de polipeptídeo diferentes são livres para interagir, por exemplo, em um sistema de expressão recombinante, uma compreendendo um VLA e um VHB e a outra compreendendo um VLB e um VHA, dois locais de ligação diferentes formarão: VLA-VHA e VLB-VHB. Para todos os pares de cadeia de polipeptídeo de DARTTM, o possível desalinhamento ou desligamento de duas cadeias é uma possibilidade, isto é, interação dos domínios VL-VL ou VH-VH; entretanto, a purificação de diacorpos funcionais é facilmente gerenciada com base na imunoespecificidade do local de ligação devidamente dimerizado, usando qualquer afinidade com base no método conhecido na matéria ou exemplificado aqui, por exemplo, cromatografia de afinidade.

[00262] Uma ou mais das cadeias de polipeptídeo do DARTTM pode opcionalmente compreender um domínio Fc ou sua porção (por exemplo, um domínio CH2, ou domínio CH3). O domínio Fc ou sua porção pode ser derivado de qualquer isótipo ou alótipo de imunoglobulina incluindo, mas não limitado a, IgA, IgD, IgG, IgE e IgM. Em realizações preferidas, o domínio Fc (ou sua porção) é derivado de IgG. Em realizações específicas, o isótipo IgG é IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 ou seu alótipo. Em uma realização, a molécula de diacorpo compreende um domínio Fc, Fc domínio que compreende um domínio CH2 e domínio CH3 independentemente selecionado de qualquer isótipo de imunoglobulina (isto é, um domínio Fc compreendendo o domínio CH2 derivado de IgG, e o domínio CH3 derivado de IgE, ou o domínio CH2 derivado de IgG1 e o domínio CH3 derivado de IgG2, etc.). O domínio Fc pode ser projetado em uma cadeia de polipeptídeo compreendendo a molécula de diacorpo da invenção em qualquer posição relativa a outros domínios ou porções da dita cadeia de polipeptídeo (por exemplo, the domínio Fc, ou sua porção pode ser c- terminal para ambos os domínios VL e VH do polipeptídeo da cadeia; pode ser n-terminal para ambos os domínios VL e VH; ou pode ser N-terminal para um domínio e c-terminal para outro (isto é, entre dois domínios da cadeia de polipeptídeo)).

[00263] Os domínios Fc nas cadeias de polipeptídeo das moléculas de DARTTM preferencialmente dimerizam, resultando na formação de uma molécula de DARTTM que exibe propriedades tipo imunoglobulina, por exemplo, interações Fc-FcyR. Fc compreendendo diacorpos pode ser dímeros, por exemplo, compreendidos de duas cadeias de polipeptídeo, cada compreendendo um domínio VH, um domínio VL e um domínio Fc. A dimerização das ditas cadeias de polipeptídeo resulta em um DARTTM bivalente compreendendo um domínio Fc, embora com uma estrutura distinta daquela de um anticorpo bivalente não modificado. Tais moléculas de DARTTM exibirão fenótipos alterados com relação a uma imunoglobulina tipo selvagem, por exemplo, meia vida de soro alterada, propriedades de ligação, etc. Em outras realizações, moléculas de DARTTM compreendendo domínios Fc podem ser tetrâmeros. Tais tetrâmeros compreendem duas cadeias de polipeptídeo “mais pesadas”, isto é, uma cadeia de polipeptídeo compreendendo um domínio VL, um VH e um Fc, e duas cadeias de polipeptídeo “mais leves”, isto é, cadeia de polipeptídeo compreendendo um VL e um VH. As cadeias mais leves e mais pesadas interagem para formar um monômero, e os ditos monômeros interagem através de seus domínios Fc não pareados para formar uma molécula tipo Ig. Tal DARTTM tipo Ig é tetravalente e pode ser monoespecífico, biespecífico ou tetraespecífico.

[00264] A formação de uma molécula de diacorpo tetraespecífica conforme descrito acima requer a interação de quatro cadeias de polipeptídeo diferentes. Tais interações são difíceis para alcançar com eficiência dentro de um sistema de produção recombinante de célula simples, devido a muitas variáveis de despareamentos de cadeia potencial. Uma solução para aumentar a probabilidade de despareamento é projetar mutações tipo “botões-em-furos” nos pares de cadeia de polipeptídeo desejados. Tais mutações favorecem a heterodimerização acima da homodimerização. Por exemplo, com respeito às interações Fc-Fc, uma substituição de aminoácido (preferencialmente, uma substituição com um aminoácido compreendendo um grupo lateral volumoso formando um “botão”, por exemplo, triptofano) pode ser introduzida no domínio CH2 ou CH3 de modo que a interferência estérica prevenirá a interação com um domínio similarmente mutado e obrigará o domínio mutado a parear com um domínio no qual uma mutação complementar, ou confortável tenha sido projetada, isto é, “o furo” (por exemplo, uma substituição com glicina). Tais conjuntos de mutações podem ser projetados em qualquer par de polipeptídeos compreendendo a molécula de diacorpo, e ainda, projetados em qualquer porção das cadeias de polipeptídeos do dito par. Os métodos de engenharia de proteína para favorecer a heterodimerização acima da homodimerização são bem conhecidos na matéria, em particular com relação à engenharia de moléculas tipo imunoglobulina, e estão englobados aqui (ver, por exemplo, Ridgway et al. (1996) ““Knobs-Into-Holes” Engineering Of Antibody CH3 Domain For Heacy Chain Heterodimerization,” Protein Engr. 9:617-621, Atwell et al. (1997) “Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library,” J. Mol. Biol. 270: 26-35, e Xie et al. (2005) “A New Format Of Biespecific Antiboy: Highly Efficient Heterodimerization, Expression And Tumor Cell Lysis,” J. Immunol. Methods 296:95-101; cada qual é aqui incorporado por referência em sua totalidade.

[00265] A invenção também engloba moléculas de diacorpos compreendendo domínios Fc variáveis ou Fc articulares variáveis (ou sua porção), domínio Fc variável que compreende pelo menos uma modificação de aminoácido (por exemplo, substituição, inserção ou exclusão) relativo a um domínio Fc tipo selvagem comparável ou domínio Fc articular (ou sua porção). Moléculas compreendendo domínios Fc variáveis ou domínios Fc articulares (ou sua porção) (por exemplo, anticorpos) normalmente têm fenótipos alterados relativos às moléculas compreendendo domínios Fc tipo selvagem ou domínios Fc articulares ou suas porções. O fenótipo variável pode ser expresso conforme a meia-vida de soro alterada, estabilidade alterada, suscetibilidade alterada a enzimas celulares ou função efetora alterada conforme ensaiada em ensaio de pendente de macrófago ou dependente de NK. As modificações de domínio Fc identificadas como função efetora de alteração são descritas acima.

[00266] A presente invenção também engloba moléculas compreendendo um domínio articular. O domínio articular pode ser derivado de qualquer isótipo ou alótipo de imunoglobulina incluindo IgA, IgD, IgG, IgE e IgM. Em realizações preferidas, o domínios articular é derivado de IgG, em que o isótipo de IgG é IgG1 , IgG2, IgG3 ou IgG4, ou seu alótipo. Os ditos domínios articulares podem ser projetados em uma cadeia de polipeptídeo compreendendo a molécula de diacorpo com “um domínio Fc de modo que a molécula de diacorpo compreende um domínio Fc articular. Em certas realizações, o domínio Fc e articular são independentemente selecionados de qualquer isótipo de imunoglobulina conhecido na matéria ou exemplificados aqui. Em outras realizações, o domínio Fc e articular são separadamente por pelo menos outro domínio da cadeia de polipeptídeo, por exemplo, o domínio VL. Os domínios articulares, ou opcionalmente o domínio Fc articular, podem ser projetados em um polipeptídeo da invenção em qualquer posição relativa a outros domínios ou porções da dita cadeia de polipeptídeo. Em certas realizações, uma cadeia de polipeptídeo da invenção compreende um domínio articular, domínio articular que está no C-terminal da cadeia de polipeptídeo, em que a dita cadeia de polipeptídeo não compreende um domínio Fc. Ainda em outras realizações, uma cadeia de polipeptídeo da invenção compreende um domínio Fc articular, domínio Fc articular que está no C-terminal da cadeia de polipeptídeo. Em outras realizações, uma cadeia de polipeptídeo da invenção compreende um domínio Fc articular, domínio Fc articular que está N-terminal da cadeia de polipeptídeo.

[00267] Cada domínio da cadeia de polipeptídeo do DARTTM, isto é, o domínio VL, VH e Fc pode ser separado por um ligante de peptídeo. O ligante de peptídeo pode ser 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ou 9 aminoácidos de comprimento. Em certas realizações, a sequência de ligante de aminoácido é GGGSGGGG (SEQ ID No:52) codificada pela sequência de ácido nucleico ggaggcggat ccggaggcgg aggc (SEQ ID No:53). As cadeias de polipeptídeo da molécula de DARTTM podem ser projetadas para compreender pelo menos um resíduo de cisteína que interagirá com um resíduo de cisteína de contraparte em uma segunda cadeia de polipeptídeo do DARTTM para formar uma ligação de dissulfeto intercadeia. Tais ligações de dissulfeto intercadeia servem para estabilizar a molécula de DARTTM, desta forma melhorando a expressão e recuperação nos sistemas recombinantes, resultando em uma formulação estável e consistente, e melhorando a estabilidade do produto isolado e/ou purificado in vivo. O resíduo de cisteína pode ser introduzido como um aminoácido simples ou como parte de uma sequência de aminoácido maior, por exemplo, um domínio articular, em qualquer porção da cadeia de polipeptídeo. Em uma realização específica, o resíduo de cisteína pode ser projetado para ocorrer no C-terminal da cadeia de polipeptídeo. Em algumas realizações, o resíduo de cisteína é introduzido na cadeia de polipeptídeo dentro da sequência de aminoácido LGGC. Em uma realização específica, o C-terminal das cadeias de polipeptídeo compreendendo a molécula DARTTM da invenção compreende a sequência de aminoácido LGGC (SEQ ID No:54). Em outra realização, o resíduo de cisteína é introduzido no polipeptídeo dentro de uma sequência de aminoácido compreendendo um domínio articular, por exemplo, EPKSCDKTHTCPP (SEQ ID N0:55) ou ESKYGPPCPS (SEQ ID NO:56). Em uma realização específica, o C-terminal de uma cadeia de polipeptídeo da molécula de DARTTM da invenção compreende a sequência de aminoácido de um domínio articular de IgG, por exemplo, SEQ ID No:55 ou SEQ ID No:56. Em outra realização, o C-terminal de uma cadeia de polipeptídeo de uma molécula de DARTTM da invenção compreende a sequência de aminoácido VEPKSC (SEQ ID No:57), que pode ser codificada pela sequência de nucleotídeo gttgagccca aatcttgt (SEQ ID No:58). Em outras realizações, o resíduo de cisteína é introduzido na cadeia de polipeptídeo dentro da sequência de aminoácido LGGCFNRGEC (SEQ ID No:59), que pode ser codificada pela sequência de nucleotídeo ctgggaggct gcttcaacag gggagagtgt (SEQ ID No:60). Em uma realização específica, o C-terminal de uma cadeia de polipeptídeo compreendendo o DARTTM da invenção compreende a sequência de aminoácido LGGCFNRGEC (SEQ ID No:59). Ainda em outras realizações, o resíduo de cisteína é introduzido na cadeia de polipeptídeo dentro da sequência de aminoácido FNRGEC (SEQ ID No:61), que pode ser codificada pela sequência de nucleotídeo ttcaacaggg gagagtgt (SEQ ID No:62) . Em uma realização específica, o C-terminal de uma cadeia de polipeptídeo compreendendo o DARTTM da invenção compreende a sequência de aminoácido FNRGEC (SEQ ID No: 61) .

[00268] Em certas realizações, a molécula de diacorpo compreende pelo menos duas cadeias de polipeptídeo, cada uma que compreende uma sequência de aminoácido LGGC (SEQ ID No:54) e são covalentemente ligadas pela ligação de dissulfeto entre os resíduos de cisteína nas sequências LGGC (SEQ ID No:54). Em outra realização específica, a molécula de diacorpo compreende pelo menos duas cadeias de polipeptídeo, uma que compreende a sequência FNRGEC (SEQ ID No:61) enquanto a outra compreende um domínio articular (contendo pelo menos um resíduo de cisteína), em que as ditas pelo menos duas cadeias de polipeptídeo são covalentemente ligadas por uma ligação de dissulfeto entre o resíduo de cisteína em FNRGEC (SEQ ID No:61) e um resíduo de cisteína no domínio articular. Em aspectos particulares, o resíduo de cisteína responsável por uma ligação de dissulfeto localizada no domínio articular é Cys-128 (conforme numerado de acordo com Kabat EU; localizado no domínio articular de uma cadeia pesada de IgG intacta, não modificada) e o resíduo de cisteína de contraparte em SEQ ID No:23 é Cys-214 (conforme numerado de acordo com Kabat EU; localizado no C-terminal de uma cadeia leve de IgG intacta, não modificada) (Elkabetz et al. (2005) “Cysteines In CHI Underlie Retention Of Unassembled Ig Heavy Chains” J. Biol. Chem. 280: 14402-14412). Ainda em outras realizações, o pelo menos um resíduo de cisteína é projetado para ocorrer no N-terminal da cadeia de aminoácido. Ainda em outras realizações, o pelo menos um resíduo de cisteína é projetado para ocorrer na porção do ligante da cadeia de polipeptídeo da molécula de diacorpo. Ainda em realizações, o domínio VH ou VL é projetado para compreender pelo menos uma modificação de aminoácido com relação ao domínio VH ou VL parental de modo que a dita modificação de aminoácido compreende uma substituição de um aminoácido parental com cisteína.

[00269] Ainda em outro aspecto dessa realização, o domínio (C) da primeira cadeia de polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido VEPKSC (SEQ ID No:57), derivada do domínio articular de uma IgG humana, e que pode ser codificada pela sequência de nucleotídeo gttgagccca aatcttgt (SEQ ID No:58). Em outro aspecto dessa realização, o domínio (F) da segunda cadeia de polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido VEPKSC (SEQ ID No:57). Em certos aspectos dessa realização, o domínio (C) da primeira cadeia de polipeptídeo compreende os 6 aminoácidos do C-terminal da cadeia leve kappa humana, FNRGEC (SEQ ID No:61); e o domínio (F) da segunda cadeia de polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido VEPKSC (SEQ ID No:57) ou um domínio articular. Em outros aspectos dessa realização, o domínio (F) da segunda cadeia de polipeptídeo compreende os 6 aminoácidos do C- terminal da cadeia leve kappa humana, FNRGEC (SEQ ID No:61); e o domínio (C) da primeira cadeia de polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido VEPKSC (SEQ ID No: 57) ou um domínio articular.

[00270] Conforme serão apreciados em vista do anterior, os polipeptídeos individuais de um DARTTM biespecífico podem formar duas espécies de homodímeros e uma espécie de heterodímero. Em uma realização da presente invenção, um polipeptídeo carregado pode ser adicionado ao C- terminal de um, ou mais preferencialmente, ambos os polipeptídeos DARTTM. Ao selecionar os polipeptídeos carregados da carga oposta para os polipeptídeos individuais do DARTTM biespecífico, a inclusão de tais polipeptídeos carregados favorece a formação de heterodímeros e diminui a formação de homodímeros. Preferencialmente, um polipeptídeo positivamente carregado conterá um conteúdo substancial de arginina, glutamina, histidina e/ou lisina (ou misturas de tais aminoácidos) e um polipeptídeo negativamente carregado conterá um conteúdo substancial de aspartato ou glutamato (ou uma mistura de tais aminoácidos). Os polipeptídeos positivamente carregados que contêm um conteúdo substancial de lisina e polipeptídeos negativamente carregados que contêm um conteúdo substancial de glutamato são particularmente preferidos. A fim de maximizar a atração eletrostática entre tais polipeptídeos opostamente carregados, é preferido empregar os polipeptídeos capazes de assumir espontaneamente uma conformação helicoidal.

[00271] Assim, em uma realização preferida, uma “bobina E” positivamente carregada estará anexa a um dos polipeptídeos que estão sendo usados para formar um DARTTM biespecífico e uma “bobina K” negativamente carregada estará anexa ao segundo dos polipeptídeos de DARTTMs. Uma bobina E particularmente preferida terá a sequência: (EVAALEK)4 [isto é (SEQ ID NO:63) EVAALEKEVAALEKEVAALEKEVAALEK]. Uma bobina K particularmente preferida terá a sequência: (KVAALKE)4 [isto é (SEQ ID NO:64) KVAALKEKVAALKEKVAALKEKVAALKE].

[00272] Um polipeptídeo de DARTTM preferido que possui tal bobina E terá a sequência geral: [Domínio VL]— [GGGSGGGG]— [Domínio VH]— [(EVAALEK)4]— GGGNS, onde VL é o domínio de Ig leve variável de DARTTMs, GGGSGGGG é SEQ ID No:52, VH é o domínio de LG pesado variável de DARTTMs, (EVAALEK)4 é SEQ ID NO:63, e GGGNS é SEQ ID NO:65. Um polipeptídeo de DARTTM preferido que possui tal Bobina K terá a sequência geral: [Domínio VL]— [GGGSGGGG]— [Domínio VH]— [(KVAALKE)4]— GGGNS, onde VL é o domínio de LG leve variável de DARTTMs, GGGSGGGG é SEQ ID NO:52, VH é o domínio de LG pesado variável de DARTTMs, (KVAALKE)4 é SEQ ID NO:64, e GGGNS é SEQ ID NO:65.

[00273] Ainda em uma realização, as regiões FHC podem ser ligadas às bobinas E e/ou K dos DARTTMs de bobina E ou bobina K. Além disso, a separação entre as regiões Fc e o domínio VH de DARTTM de um DARTTM contendo Fc é desejável em casos em que um arranjo menos separado de tais domínios resulta em interação diminuída entre tais domínios e seus ligantes de ligação ou caso contrário interfere na montagem de DARTTM. Embora os separadores de qualquer sequência de aminoácido possam ser empregados, é desejável empregar os separadores que formem bobinas helicoidais, de modo a estender de forma máxima e projetar o domínio Fc para longe dos domínios variáveis. Porque os polipeptídeos enrolados descritos acima de carga oposta adicionalmente funcionam para promover a formação heterodimérica, tais moléculas são separadores particularmente preferidos. Tais moléculas de Fc- DARTTM contendo bonina proveem benefícios similares àqueles de Fc-DARTTMs, incluindo meia-vida de soro melhorada e recrutamento de função efetora. Os polipeptídeos da bobina E e bobina K descritos acima são particularmente preferidos para essa finalidade. Assim, em uma realização preferida, o DARTTM contendo Fc de bobina E terá a sequência general: [Domínio VL]— [GGGSGGGG]—[Domínio VH]— [(EVAALEK)4]—GGG— Domínio Fc começando com D234 (numeração Kabat), onde VL é o domínio de LG leve variável de DARTTMs, GGGSGGGG é SEQ ID No:52, VH é o domínio de LG pesado variável de DARTTMs e (EVAALEK)4 é SEQ ID No:63. Similarmente, em uma realização preferida, o DARTTM contendo Fc de bobina K terá a sequência geral: [Domínio VL]— [GGGSGGGG]— [Domínio VH]— [(KVAALKE)4]— GGG—Domínio Fc começando com D234 (numeração Kabat), onde VL é o domínio de LG variável de DARTTMs, GGGSGGGG é SEQ ID No:51, VH é o domínio de LG pesado variável de DARTTMs e (KVAALKE)4 é SEQ ID NO:64.

[00274] Conforme indicado acima, uma molécula de DARTTM contendo bobina ou uma molécula de DARTTM contendo Fc contendo bobina pode conter apenas um separador de bobina simples, ou ela pode conter mais que um de tais separadores (por exemplo, dois separadores, preferencialmente de carga oposta, dos quais um é ligado a cada um do domínio VH dos polipeptídeos de DARTTMs). Ao ligar a região Fc em tal(is) molécula (s) separadora(s), a habilidade em fazer versões bivalente, tetravalente, etc. das moléculas de Fc-DARTTM por troca de cadeia é aumentada. As moléculas de Fc-DARTTM podem assim ser produzidas que formem monômeros ou dímeros dependendo de se o Domínio Fc é ligado a um ou ambos os domínios VH de DARTTM.

1. VERSATILIDADE DAS MOLÉCULAS B7-H3 DE DART™

[00275] Os DARTTMs biespecíficos da invenção podem simultaneamente ligar dois epítopos distintos e separados. Em certas realizações, os epítopos são do mesmo antígeno. Em outras realizações, os epítopos são de antígenos diferentes. Em realizações preferidas, pelo menos um local de ligação de epítopo é específico para um determinante expresso em uma célula efetora imune (por exemplo, CD3, CD 16, CD32, CD64, receptor de célula T, etc.), que é expressa em linfócitos T, células exterminadoras naturais (NK) ou outras células mononucleares. Em uma realização, a molécula de DARTTM se une ao determinante de célula efetora e também ativa a dita célula efetora. Neste sentido, as moléculas de DARTTM da invenção podem exibir funcionalidade tipo LG independente de se elas ainda compreendem um domínio Fc (por exemplo, conforme ensaiado em qualquer ensaio de função efetora conhecido na matéria ou exemplificado aqui (por exemplo, ensaio ADCC)). Em certas realizações, o DARTTM biespecífico da invenção liga tanto um antígeno de câncer em uma célula tumoral quanto um determinante de célula efetora enquanto ativa a dita célula. Em realizações alternativas, o DARTTM biespecífico ou molécula de DARTTM da invenção pode inibir a ativação de um alvo, por exemplo, efetor, célula ao unir simultaneamente, e assim ligar, um receptor de ativação e inibitório na mesma célula (por exemplo, ligar ambos CD32A e CD32B, BCR e CD32B, ou IgERI e CD32B) conforme descrito acima (ver, Seção do Histórico). Ainda em um aspecto dessa realização, o DARTTM biespecífico pode exibir propriedades antivirais ligando simultaneamente dois epítopos neutralizantes em um vírus (por exemplo, epítopos RSV; epítopos WNV tais como E16 e E53).

2. MOLÉCULAS UNIVERSAIS B7-H3 DE DARTTM

[00276] Em uma realização, as moléculas de DARTTM biespecífico da invenção podem ser construídas para compreender um domínio de ligação de epítopo que especificamente se une a B7-H3 e um segundo domínio de ligação de epítopo que especificamente se une a um hapteno, por exemplo, isotiocianato de fluoresceína (também conhecidos como fluoroisotiocianato ou FITC). Tal DARTTM serve como um adaptador universal (“UDARTTM”), capaz de coligar B7-H3 com moléculas que interagem com parceiros de ligação de conjugados de fluoresceína. Por exemplo, o braço reativo de FITC do DARTTM pode ser usado para ligar um anticorpo marcado com FITC que é ligado a um alvo não B7-H3 envolvido em agrupamento intercelular, recrutamento intercelular, recrutamento livre de célula, alvos múltiplos, etc. A versão Fc Fv/humano de camundongo quimérico da antifluoresceína MAb, 4420 pode ser empregada como uma fonte de domínios de CDR específico de FITC (Gruber, M. et al. (1994) “Efficient Tumor Cell Lysis Mediated By A Bispecific Single Chain Antibody Expressed In Escherichia coli,” J. Immunol. 152(11):5368- 5374).

3. MOLÉCULAS B7-H3 DE DART™ DE CÉLULA-ALVO ESPECÍFICA

[00277] As moléculas de DARTTM biespecífico da invenção oferecem oportunidades únicas para atingir os tipos de célula específicos. Por exemplo, o DARTTM biespecífico ou molécula de DARTTM pode ser projetado para compreender uma combinação de locais de ligação de epítopo que reconhecem um conjunto de antígenos únicos para uma célula alvo ou tipo de tecido. Adicionalmente, onde um ou ambos os antígenos individuais é/são bastante comuns separadamente em outro tecido e/ou tipos de célula, domínios de ligação de baixa afinidade podem ser usados para construir o DARTTM ou a molécula de DARTTM. Tais domínios de ligação de baixa afinidade serão incapazes de se unirem ao epítopo individual ou antígeno com avidez suficiente para fins terapêuticos. Entretanto, onde ambos os epítopos ou antígenos estão presentes em uma célula alvo simples ou tecido, a avidez do DARTTM ou molécula de DARTTM para a célula ou tecido, com relação a uma célula ou tecido que expressa apenas um dos antígenos, será aumentada de modo que a dita célula ou tecido possa ser eficazmente direcionado pela invenção. Tal molécula biespecífica pode exibir ligação aumentada a um ou ambos de seus antígenos alvo em células que expressam ambos os ditos antígenos com relação a um DARTTM monoespecífico ou um anticorpo com uma especificidade para apenas um dos antígenos.

[00278] Por exemplo, os DARTTMs específico de B7- H3 da presente invenção podem ser construídos para compreender um domínio que é um ligante de ligação para um receptor do Grupo Exterminador Natural 2D (NKG2D). O receptor de NKG2D é expresso em Células exterminadoras naturais humanas (e outro mamífero) (Bauer, S. et al. (1999) “Activation Of NK Cells And T Cells By NKG2D, A Receptor For Stress-Inducible MICA,” Science 285(5428):727-729; Jamieson, A.M. et al. (2002) “The Role Of The NKG2D Immunoreceptor In Immune Cell Activation And Natural Killing,” Immunity 17(1):19-29) bem como em todas as células T CD8+ (Groh, V. et al. (2001) “Costimulation Of CD8αβ T Cells By NKG2D Via Engagement By MIC Induced On Virus-Infected Cells” Nat. Immunol. 2(3):255-260; Jamieson, A.M. et al. (2002) “The Role Of The NKG2D Immunoreceptor In Immune Cell Activation And Natural Killing,” Immunity 17(1): 19-29). Tais ligantes de ligação, e particularmente aqueles que não são expressos em células normais, incluem a molécula de histocompatibilidade 60 (H60), o produto do gene 1 recém-induzível por ácido retinoico (RAE-1), e o transcrito 1 tipo proteína de ligação de UL16 de murino (MULT1) (Raulet D.H. (2003) “Roles Of The NKG2D Immunoreceptor And Its Ligands ,” Nature Rev. Immunol. 3:781-790; Coudert, J.D. et al. (2005) “Altered NKG2D Function In NK Cells Induced By Chronic Exposure To Altered NKG2D Ligand-Expressing Tumor Cells,” Blood 106: 1711-1717). Os ligantes adicionais reativos com NKG2D humano incluem as moléculas MICA e MICB relacionadas à cadeia de classe I MHC polimórficas (Diefenbach, A. et al. (1999) “Natural Killer Cells: Stress Out, Turn On, Tune In,” Curr. Biol. 9(22):R851- R8533; Bauer, S. et al. (1999) “Activation Of NK Cells And T Cells By NKG2D, A Receptor For Stress-Inducible MICA,” Science 285(5428):727-729; Stephens, H.A. (2001) “MICA AND MICB Genes: Can The Enigma Of Their Polymorphism Be Resolved?” Trends Immunol. 22:378-385. A sequência de MICA é SEQ ID NO:66: MGLGPV FLLL AG I FPFAPPG AAAE P HS LRY N LTVLSHDG S VQSGFLTEVH L DÇQP F LRC E RQKC JAK FQ G QW AE EV LG M K T W E 1’2! T R DL T GM GK DLRMT L AHIKDQKEGL HSLQEIRVCE IHEDNSTR5S QEFYYDGELF LSQNLETKEW TMPQSSRAQT LAMNVRNFLK EDAMKTKTHY HAMHADCLQE LRRYLKÊGW LRRTVPPMVM VTRSEASEGN ITVTCRASGF YPWNITLSWR QDGVSLSHDT QQWGDVLPDG NGTYQTWVAT RICQGEEQRF TCYMEHSGNH STHPVPSGKV LVLQSHWQTF HVSAVAAAAI FVIIIFYVRC CKKKTSAAEG PELVSLQVLD QHPVGTSDHR DATQLGFQPL MSDLGSTGST EGA

[00279] A sequência de MICB é SEQ ID NO:67: P H S LRYNLMV L S QDGSVQSG FLAE G H LDGQ P FL RY DRQK R RAKPQGQWAE DVLGAKTWDT ETEDLTENGQ DLRRTLTHIK DQKGGLHSLQ EIRVCEIHED SSTRGSRHFY YDGELFLSQH LETQESTVPQ 55RAQTLAMN VTKFWKEDAM KTKTHYRAMQ ADCLQKLQLP PMVWVICSEV SEGNITVTCR ASSFYPRNIT LTWRQD GV S L S Hl-J TQQWGDV L P DG NG1 TY QT W VATRIRQG E EQ RFTC YME H 5GNHGTHPVP SGKALVLOSO RTDFFYVSAA MPCFVTTTT7, CVFCCKKKTS AAEGP

[00280] Alternativamente, as moléculas de DARTTM da presente invenção podem ser construídas para compreender um domínio que é um ligante de ligação para o receptor de célula T (“TCR”) ou para CD3 (o correceptor de célula T). O TCR é expresso naturalmente por células T CD4+ ou CD8+, e permite tais células reconhecer peptídeos antigênicos que são ligados e apresentados por proteínas MHC de classe I ou classe II de células de apresentação de antígeno. Reconhecimento de um complexo de pMHC (peptídeo-MHC) por um TCR inicia a propagação de uma resposta imune celular que leva à produção de citocinas e à lise da célula de apresentação de antígeno (ver, por exemplo, Armstrong, K.M. et al. (2008) “Conformational Changes And Flexibility In T- Cell Receptor Recognition Of Peptide-MHC Complexes,” Biochem. J. 415(Pt 2):183-196; Willemsen, R. (2008) “Selection Of Human Antibody Fragmentos Directed Against Tumor T-Cell Epitopes For Adoptive T-Cell Therapy,” Cytometry A. 73(11):1093-1099; Beier, K.C. et al. (2007) “Master Switches Of T-Cell Activation And Differentiation,” Eur. Respir. J. 29:804-812; Mallone, R. et al. (2005) “Targeting T Lymphocytes For Immune Monitoring And Intervention In Autoimmune Diabetes,” Am. J. Ther. 12(6):534-550). CD3 é o receptor que se une ao TCR (Thomas, S. et al. (2010) “Molecular Immunology Lessons From Therapeutic T-Cell Receptor Gene Transfer,” Immunology 129(2): 170-177; Guy, C.S. et al. (2009) “Organization Of Proximal Signal Initiation At The TCR: CD 3 Complex,” Immunol. Rev. 232(1):7- 21 ; St. Clair, E.W. (Epub 2009 Oct 12) “Novel Targeted Therapies For Autoimmunity,” Curr. Opin. Immunol. 21(6):648- 657; Baeuerle, P.A. et al. (Epub 2009 Jun 9) “Bispecific T- Cell Engaging Antibodies For Cancer Therapy,” Cancer Res. 69(12):4941-4944; Smith-Garvin, J.E. et al. (2009) “T Cell Activation;” Annu. Rev. Immunol. 27:591-619; Renders, L. et al. (2003) “Engineered CD3 Antibodies For Immunosuppression” Clin. Exp. Immunol. 133(3):307-309).

[00281] Ao construir tais moléculas de DARTTM para adicionalmente compreender pelo menos um domínio de ligação de epítopo capaz de se unir a, por exemplo, um receptor presente na superfície de uma célula alvo, tais moléculas de DARTTM serão moléculas de DARTTM e assim serão capazes de se ligar às células alvo e desta forma causar a exibição das células alvo do ligante de ligação para o receptor do Grupo Exterminador Natural 2D (NKG2D) ou para o TCR (seja qual for que estiver presente no DARTTM de ligação de célula alvo) (ver, por exemplo, Germain, C. et al. (2008) “Redirecting NK Cells Mediated Tumor Cell Lysis By A New Recombinant Bifunctional Protein”, Prot. Engineer. Design Selection 21(11):665-672). Tais DARTTMs podem ser usados para redirecionar qualquer célula alvo desejada em uma célula que seja alvo de lise de célula mediada por célula NK ou citotoxicidade mediada por célula T. Em uma realização, o domínio de ligação do epítopo do DARTTM capaz de se unir a um receptor presente na superfície de uma célula alvo é um epítopo que se une a um antígeno associado ao tumor de modo a redirecionar tais células cancerosas em substratos para a lise de célula mediada por célula NK ou citotoxicidade mediada por célula T. De interesse particular são antígenos associados a tumor que é um antígeno de câncer de mama, um antígeno de câncer de ovário, um antígeno de câncer de próstata, um antígeno de câncer cervical, um antígeno de carcinoma pancreático, um antígeno de câncer pulmonar, um antígeno de câncer de bexiga, um antígeno de câncer de cólon, um antígeno câncer de testículo, um antígeno de câncer de glioblastoma, um antígeno associado com uma malignidade de célula B, um antígeno associado com mieloma múltiplo, um antígeno associado com linfoma de não Hodgkins, ou um antígeno associado com leucemia linfocítica crônica.

[00282] Os antígenos adequados associados ao tumor para tal uso incluem A33 (um antígeno de carcinoma colorretal; Almqvist, Y. 2006, Nucl Med Biol. Nov;33(8):991- 998); B1 (Egloff, A.M. et al. 2006, Cancer Res. 66(l):6-9); BAGE (Bodey, B. 2002 Expert Opin Biol Ther. 2(6):577-84); beta-catenina (Prange W. et al. 2003 J Pathol. 201(2):250-9); CA125 (Bast, R.C. Jr. et al. 2005 Int J Gynecol Cancer 15 Suppl 3:274-81); CD5 (Calin, G.A. et al. 2006 Semin Oncol. 33(2): 167-73; CD19 (Troussard, X. et al. 1998 Hematol Cell Ther. 40(4):139-48); CD20 (Thomas, D.A. et al. 2006 Hematol Oncol Clin North Am. 20(5):1125-36); CD22 (Kreitman, R.J. 2006 AAPS J. 18;8(3):E532-51); CD23 (Rosati, S. et al. 2005 Curr Top Microbiol Immunol. 5;294:91-107); CD25 (Troussard, X. et al. 1998 Hematol Cell Ther. 40(4): 139-48); CD27 (Bataille, R. 2006 Haematologica 91(9): 1234-40); CD28 (Bataille, R. 2006 Haematologica 91(9): 1234-40); CD36 (Ge, Y. 2005 Lab Hematol. l l(l):31-7); CD40/CD154 (Messmer, D. et al. 2005 Ann N Y Acad Sci. 1062:51-60); CD45 (Jurcic, J.G. 2005 Curr Oncol Rep. 7(5):339-46); CD56 (Bataille, R. 2006 Haematologica 91(9): 1234-40); CD79a/CD79b (Troussard, X. et al. 1998 Hematol Cell Ther. 40(4): 139-48; Chu, P.G. et al. 2001 Appl Immunohistochem Mol Morphol. 9(2):97-106); CD 103 (Troussard, X. et al. 1998 Hematol Cell Ther. 40(4): 139-48); CDK4 (Lee, Y.M. et al. 2006 Cell Cycle 5(18):2110-4); CEA (antígeno carcinoembriônico; Mathelin, C. 2006 Gynecol Obstet Fertil. 34(7-8):638-46; Tellez-Avila, F.I. et al. 2005 Rev Invest Clin. 57(6):814-9); CTLA4 (Peggs, K.S. et al. 2006 Curr Opin Immunol. 18(2):206- 13); EGF-R (receptor do fator de crescimento epidérmico; Adenis, A. et al. 2003 Bull Cancer. 90 Spec No:S228-32); Erb (ErbB1 ; ErbB3; ErbB4; Zhou, H. et al. 2002 Oncogene 21(57):8732-40; Rimon, E. et al. 2004 Int J Oncol. 24(5): 1325-38); GAGE (GAGE-1 ; GAGE-2;Akcakanat, A. et al. 2006 Int J Cancer. 118(1):123-8); GD2/GD3/GM2 (Livingston, P.O. et al. 2005 Cancer Immunol Immunother. 54(10): 1018-25); gp100 (Lotem, M. et al. 2006 J Immunother. 29(6):616-27); HER-2/neu (Kumar, Pal S et al. 2006 Semin Oncol. 33(4):386-91); papilomavírus-E6 humano/papilomavírus-E7 humano (DiMaio, D. et al. 2006 Adv Virus Res. 66:125-59; KSA (17-lA) (Ragupathi, G. 2005 Cancer Treat Res. 123:157-80); MAGE (MAGE- 1 ; MAGE-3; (Bodey, B. 2002 Expert Opin Biol Ther. 2(6):577-84); MART (Kounalakis, N. et al. 2005 Curr Oncol Rep. 7(5):377-82; MUC-1 (Mathelin, C. 2006 Gynecol Obstet Fertil. 34(7-8):638-46); MUM-1 (Castelli, C. et al. 2000 J Cell Physiol. 182(3):323-31); N- acetilglucosaminiltransferase (Dennis, J.W. 1999 Biochim Biophys Acta. 6; 1473(1):21-34); p15 (Gil, J. et al. 2006 Nat Rev Mol Cell Biol. 7(9):667-77); PSA (antígeno específico da próstata; Cracco, CM. et al. 2005 Minerva Urol Nefrol. 57(4):301-11); PSMA (Ragupathi, G. 2005 Cancer Treat Res. 123:157-80); sTn (Holmberg, L.A. 2001 Expert Opin Biol Ther. 1(5):881-91); receptor TNF (receptor TNF-α, receptor TNF-β; ou receptor TNF-Y; van Horssen, R. et al. 2006 Oncologist. 11(4):397-408; Gardnerova, M. et al. 2000 Curr Drug Targets. l(4):327-64); ou receptor VEGF (O'Dwyer. P.J. 2006 Oncologist. 11(9):992-8).

[00283] Os antígenos adicionais associados ao tumor para tal uso (e publicações descrevendo anticorpos especificamente reativos para tais antígenos) incluem ADAM-9 (Publicação de Patente Norte-Americana n° 2006/0172350; Publicação do PCT n° WO 06/084075); ALCAM (Publicação do PCT n° WO 03/093443); Carboxipeptidase M (Publicação de Patente Norte-Americana n° 2006/0166291); CD46 (Patente Norte- Americana n° 7.148.038; Publicação do PCT n° WO 03/032814); Citoqueratina 8 (Publicação do PCT n° WO 03/024191); receptores de Efrina (e, em particular, EphA2 (Patente Norte- Americana n° 7.569.672; Publicação do PCT n° WO 06/084226); Integrina Alfa-V-Beta-6 (Publicação do PCT n° WO 03/087340); JAM-3 (Publicação do PCT n° WO 06/084078); KID3 (Publicação do PCT n° WO 05/028498); KID31 (Publicação do PCT n° WO 06/076584); LUCA-2 (Publicação de Patente Norte-Americana n° 2006/0172349; Publicação do PCT n° WO 06/083852); Oncostatina M (Receptor Beta de Oncostatina) (Patente Norte-Americana n° 7,572,896; Publicação do PCT n° WO 06/084092); PIPA (Patente Norte-Americana n° 7.405,061; Publicação do PCT n° WO 04/043239); ROR1 (Patente Norte-Americana n° 5.843.749); e o Receptor Transferrina (Patente Norte-Americana n° 7.572.895; Publicação do PCT n° WO 05/121179).

[00284] Também de interesse são os antígenos específicos para agentes infecciosos particulares, por exemplo, agentes virais incluindo, mas não limitado a, vírus da imunodeficiência humana (HIV), vírus da hepatite B (HBV), gripe, papiloma vírus humano (HPV), pé e boca (coxsackieviruses), o vírus da raiva, vírus simples da herpes (HSV), e os agentes causadores da gastroenterite, incluindo rotavírus, adenovírus, calicivírus, astrovírus e vírus Norwalk; agentes bacterianos incluindo, mas não limitado a, E. coli, Salmonella thyphimurium, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae, Neisseria gonorrhoeae, Helicobacter pylori, Hemophilus influenzae, Shigella dysenteriae, Staphylococcus aureus, Mycobacterium tuberculosis e Streptococcus pneumoniae, agente fúngicos e parasitas tais como Giardi.

[00285] Em algumas realizações, as moléculas da invenção são projetadas para compreender um padrão de glicosilação alterado ou uma glicoforma alterada com relação à porção comparável da molécula modelo. As glicoformas projetadas podem ser úteis para uma variedade de finalidades, incluindo, mas não limitado a, função efetora de aumento. As glicoformas projetadas podem ser geradas por qualquer método conhecido de alguém especialista na matéria, por exemplo, ao usar cepas de expressão variante ou projetada, por coexpressão com uma ou mais enzimas, por exemplo, N- acetilglicosaminiltransferase III DI (GnTI11), expressando um DARTTM da invenção em vários organismos ou linhagens de célula de vários organismos, ou modificando o(s) carboidrato(s) depois de o DARTTM ter sido expresso e purificado. Os métodos para gerar glicoformas projetadas são conhecidos na matéria, e incluem, mas não são limitados a, aqueles descritos em Umana et al. (1999) “Engineered Glycoforms Of An Antineuroblastoma IgG1 Com Optimized Antibody-Dependent Cellular Cytotoxic Activity,” Nat. Biotechnol 17:176-180; Davies et al. (2001) “Expression Of GnTIII In A Recombinant Anti-CD20 CHO Production Cell Line: Expression Of Antibodies With Altered Glycoforms Leads To An Increase In Adcc Through Higher Affinity For Fc Gamma RIII,” Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields et al. (2002) “Lack Of Fucose On Human IgG1 N-Linked Oligosaccharide Improves Binding To Human Fcgamma RIII And Antibody-Dependent Cellular Toxicity,” J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa et al. (2003) “The Absence Of Fucose But Not The Presence Of Galactose Or Bisecting N-Acetylglucosamine Of Human IgG1 Complex-Type Oligosaccharides Show The Critical Role Of Enhancing Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity,” J Biol Chem 278:3466-3473) US 6.602.684; USSN 10/277.370; USSN 10/113,929; PCT WO 00/61739A1; PCT WO 01/292246A1; PCT WO 02/311140A1; PCT WO 02/30954A1; tecnologia PotillegentTM (Biowa, Inc. Princeton, NJ); tecnologia de engenharia de glicosilação GlycoMAbTM (GLYCART biotechnology AG, Zurich, Switzerland); cada qual é incorporado aqui por referência em sua totalidade. Ver, por exemplo, WO 00061739; EA01229125; US 20030115614; Okazaki et al. (2004) “Fucose Depletion From Human IgG1 Oligosaccharide Enhances Binding Enthalpy And Association Rate Between IgG1 E FcGammaRIIIA,” JMB, 336: 1239-49 cada qual é incorporado aqui por referência em sua totalidade.

[00286] A invenção ainda engloba incorporação de aminoácidos não naturais para gerar os DARTTMs da invenção. Tais métodos são conhecidos para aqueles técnicos no assunto tais como aqueles que usam a maquinaria bissintética natural para permitir a incorporação de todos os aminoácidos não naturais em proteínas, ver, por exemplo, Wang et al. (2002) “Expanding The Genetic Code, “ Chem. Comm. 1:1-11; Wang et al. (2001) “Expanding The Genetic Code Of Escherichia coli, “ Science, 292: 498-500; van Hest et al. (2001) “Protein-Based Materials, Toward A New Level Of Structural Control,” Chem. Comm. 19:1897-1904, cada qual é incorporado aqui por referência em sua totalidade. Estratégias alternativas focam em suas enzimas responsáveis pela biossíntese de amino acil- tRNA, ver, por exemplo, Tang et al. (2001) “Biosynthesis Of A Highly Stable Coiled-Coil Protein Containing Hexafluoroleucine In An Engineered Bacterial Host”, J. Am. Chem. Soc. 123(44):11089-11090; Kiick et al. (2001) “Identification Of An Expanded Set Of Translationally Active Methionine Analogues In Escherichia coli,” FEBS Lett. 502(1- 2):25-30; cada qual é incorporado aqui por referência em sua totalidade. Em algumas realizações, a invenção engloba métodos de modificação de um domínio VL, VH ou Fc de uma molécula da invenção adicionando ou excluindo um local de glicosilação. Os métodos para modificar o carboidrato de proteínas são bem conhecidos na matéria e englobam a invenção, ver, por exemplo, Patente Norte-Americana No. 6.218.149; EP 0 359 096 B1; Publicação Norte-Americana n° US 2002/0028486; WO 03/035835; Publicação Norte-Americana n° 2003/0115614; Patente Norte-Americana No. 6.218.149; Patente Norte-Americana No. 6.472.511; todas as quais são incorporadas aqui por referência em sua totalidade.

VIII. MÉTODOS DE USO DE MODULADORES DE B7-H3 E ANTICORPOS ANTI-B7-H3 PARA FINS TERAPÊUTICOS

[00287] Os anticorpos monoclonais para B7-H3 podem ser usados para fins terapêuticos em indivíduos com câncer ou outras doenças. A terapia com anticorpos anti-B7-H3 pode envolver formação de ambos os complexos in vitro e in vivo como descrito acima. Em uma realização, o anticorpo monoclonal anti-B7-H3 pode se unir a e reduzir a proliferação de células cancerosas. Entende-se que o anticorpo é administrado em uma concentração que promove ligação em condições fisiológicas (por exemplo, in vivo). Em outra realização, os anticorpos monoclonais para B7-H3 podem ser usados para imunoterapia direcionada às células cancerosas de tecidos diferentes com cólon, pulmão, mama, próstata, ovário, pâncreas, rim e outros tipos de câncer como sarcoma. Em outra realização, o anticorpo monoclonal anti-B7-H3 sozinho pode ligar e reduzir a divisão de células na célula cancerosa. Em outra realização, anticorpo monoclonal anti-B7-H3 pode ligar as células cancerosas e retardar o desenvolvimento de metástases. Em ainda outra realização, um indivíduo com câncer recebe tratamento paliativo com anticorpo anti-B7-H3. O tratamento paliativo de um indivíduo com câncer envolve tratar ou diminuir os sintomas adversos da doença, ou sintomas iatrogênicos resultantes de outros tratamentos dados para a doença sem afetar diretamente o progresso do câncer. Isto inclui tratamentos para alívio de dor, suporte nutricional, problemas sexuais, sofrimento psicológico, depressão, fadiga, distúrbios psiquiátricos, náusea, vômito, etc.

[00288] Em tais situações, o anticorpo anti-B7-H3 pode ser administrado com agentes que intensificam ou direcionam uma resposta imune do próprio indivíduo, como um agente que fortalece ADCC...

[00289] Ainda em outra realização, o anticorpo anti-B7-H3 pode ser conjugado ou associado com uma molécula radioativa, toxina (por exemplo, caliqueamicina), molécula quimioterápica, lipossomas ou outros veículos contendo compostos quimioterápicos e administrados para um indivíduo com necessidade de tal tratamento para alvejar esses compostos na célula cancerosa contendo o antígeno reconhecido pelo anticorpo e desse modo eliminar células cancerosas ou doentes. Sem ser limitado a qualquer teoria particular, o anticorpo anti-B7-H3 é internalizado pela célula portando B7- H3 em sua superfície, dessa maneira distribuindo a porção conjugada para a célula para induzir o efeito terapêutico. Em ainda outra realização, o anticorpo pode ser empregado como uma terapia adjuvante na hora da remoção cirúrgica de um câncer expressando o antígeno a fim de retardar o desenvolvimento da metástase. O anticorpo pode também ser administrado antes da cirurgia (terapia neoadjuvante) em um indivíduo com um tumor expressando o antígeno a fim de diminuir o tamanho do tumor e dessa maneira possibilitar ou simplificar a cirurgia, poupar tecido durante a cirurgia, e /ou diminuir o desfiguramento resultante.

[00290] Dosar o ciclo da célula é considerado na prática desta invenção. Em tais realizações, um agente quimioterápico é usado para sincronizar o ciclo da célula do tumor ou outras células doentes alvo em um estágio pré- determinado. Subsequentemente, a administração do anticorpo anti-B7-H3 desta invenção (sozinho ou em uma porção terapêutica adicional) é feita. Em realizações alternativas, um anticorpo anti-B7-H3 é usado para sincronizar o ciclo da célula e reduzir a divisão das células antes da administração de uma segunda fase de tratamento; a segunda fase pode ser a administração de um anticorpo anti-B7-H3 e/ou uma porção terapêutica adicional.

[00291] Os agentes quimioterápicos incluem moléculas radioativas, toxinas, também referidas como citotoxinas ou agentes citotóxicos, que inclui qualquer agente que seja prejudicial para a viabilidade de células cancerosas, agentes e lipossomas ou outras vesículas contendo compostos quimioterápicos. Exemplos de agentes quimioterápicos apropriados incluem, mas não são limitados a, 1-deidrotestosterona, 5-fluorouracil decarbazina, 6- mercaptopurina, 6-tioguanina, actinomicina D, adriamicina, aldesleucina, agentes alquilantes, alopurinol de sódio, altretamina, amifostina, anastrozol, antramicina (AMC)), agentes antimitóticos, cis-diclorodiamina platina (II) (DDP) cisplatina), diaminodicloroplatina, antraciclinas, antibióticos, antimetabólitos, asparaginase, BCG vivo (intravesicular), fosfato de sódio de betametasona e acetato de betametasona, bicalutamida, sulfato de bleomicina, bussulfano, leucouorina de cálcio, caliqueamicina, capecitabina, carboplatina, lomustina (CCNU), carmustina (BSNU), Clorambucil, Cisplatina, Cladribina, Colcicina, estrógenos conjugados, Ciclofosfamida, Ciclotosfamida, Citarabina, Citarabina, citocalasina B, Citoxano, Dacarbazina, Dactinomicina, dactinomicina (anteriormente actinomicina), daunirrubicina HCL, citrato de daunorrucbicina, denileucina diftitox, Dexrazoxano, Dibromomanitol, diidroxiantracindiona, Docetaxel, dolasetromesilato, doxorrubicina HCL, dronabinol, E. coli L- asparaginase, emetina, epoetina alfa, Erwinia L-asparaginase, estrógenos esterificados, estradiol, fosfato de sódio de estramustina, brometo de etidio, etinil estradiol, etidronato, fator de citrororo etoposídeo, fosfato de etoposídeo, filgrastim, floxuridina, fluconazol, fosfato de fludarabina, fluorouracil, flutamida, ácido folínico, gemcitabina HCL, glicocorticoide, acetato de goserelina, gramicidina D, granisetron HCL, hidroxiureia, idarrubicina HCL, ifosfamida, interferona alfa-2b, irinotecan HCL, letrozol, leucovorina de cálcio, acetato de leuprolídeo, levamisol HCL, lidocaína, lomustina, maitansinoide, mecloretamina HCL, acetato de medroxiprogesterona, acetato de megestrol, melfalan HCL, mercaptipurina, mesna, metotrexato, metiltestosterona, mitramicina, mitomicina C, mitotano, mitoxantrona, nilutamida, acetato de octreotídeo, ondansetrona HCL, paclitaxel, pamidronato de dissódio, pentostatina, pilocarpina HCL, plimicina, polifeprosano 20 (com implante de carmustina), porfimer de sódio, procaína, procarbazina HCL, propanolol, rituximabe, sargramostim, estreptozotocina, tamoxifeno, taxol, teniposídeo, tenoposídeo, testolactona, tetracaína, tioepa clorambucila, tioguanina, tiotepa, topotecan HCL, citrato de toremifeno, trastuzumabe, tretinoina, valrubicina, sulfato de vinblastina, sulfato de vincristina, e tartarato de vinorelbina.

[00292] Em uma realização preferida, a citotoxina é especialmente eficaz em dividir ou rapidamente dividir células, de tal maneira que não dividir as células são relativamente liberadas de efeitos tóxicos.

[00293] Os anticorpos da invenção podem ser internalizados dentro das células de carcinoma ou doentes às quais eles se ligam e são, desta maneira, particularmente úteis para aplicações terapêuticas, por exemplo, distribuição nas toxinas das células que necessitam ser internalizadas por suas atividades adversas. Exemplos de tais toxinas incluem, mas não são limitados a, saporina, caliqueamicina, auristatina, e maitansinoide.

[00294] Os anticorpos ou polipeptídeos da invenção podem ser associados (incluindo conjugados ou ligados) a uma molécula radioativa, uma toxina, ou outros agentes terapêuticos, ou a lipossomas ou outras vesículas contendo agentes terapêuticos covalentemente ou não covalentemente, diretamente ou indiretamente. O anticorpo pode ser ligado a uma molécula radioativa, a toxina, ou a molécula quimioterapêutica em qualquer lugar ao longo do anticorpo desde que o anticorpo seja capaz de se unir ao seu alvo B7-H3.

[00295] Uma toxina ou um agente quimioterápico pode ser administrado concomitantemente com (antes, depois, ou durante a administração), ou acoplado (por exemplo, covalentemente ligado) a um anticorpo monoclonal apropriado diretamente ou indiretamente (por exemplo, através de um grupo ligante, ou, alternativamente, através de uma molécula de ligação com locais de acoplamento apropriados, como uma molécula de plataforma como descrito na Patente Norte- Americana n° 5.552.391). A toxina e o agente quimioterápico da presente invenção podem ser acoplados diretamente às proteínas alvo particulares usando métodos conhecidos na matéria. Por exemplo, uma reação direta entre um agente e um anticorpo é possível quando cada um possui um substituinte capaz de reagir com o outro. Por exemplo, um grupo nucleofílico, como um grupo amino ou sulfidrila, como um pode ser capaz de reagir com um grupo contendo carbonila, como um anidrido ou um ácido haleto, ou com um grupo alquila contendo um bom grupo de partida (por exemplo, um haleto) no outro.

[00296] Os anticorpos ou polipeptídeos podem também ser ligados a um agente quimioterápico através de um microveículo. O termo “microveículo” se refere a uma partícula biodegradável ou não biodegradável que é insolúvel na água e que tem um tamanho de menos do que cerca de 150 μm, 120 μm ou 100 μm em tamanho, mais comumente menos que cerca de 50 a 60 μm, preferivelmente menos do que cerca de 10, 5, 2,5, 2 ou 1,5 μm. Os microveículos incluem “nanoveículos”, que são microveículos tendo um tamanho de menos do que cerca de 1 μm, preferivelmente menos do que cerca de 500 nm. Tais partículas são conhecidas na matéria. Os microveículos de fase sólida podem ser partículas formadas de polímeros biocompatíveis de ocorrência natural, polímeros sintéticos ou copolímeros sintéticos, que podem incluir ou excluir microveículos formados de agarose ou agarose de ligação cruzada, como também outros materiais biodegradáveis conhecidos na matéria. Os microveículos biodegradáveis de fase sólida podem ser formados de polímeros que são degradáveis (por exemplo, ácido poli(láctico), ácido poli(glicólico) e copolímeros dos mesmos) ou que causam erosão (por exemplo, poli(ortoésteres), como 3,9-dietilideno-2,4,8,10-tetraoxaspiro[5.5]undecano (DETOSU) ou poli(anidridos), como poli(anidridos) de ácido sebácio) sob condições fisiológicas mamíferas.Os microveículos podem também ser de fase líquida (por exemplo, óleo ou baseado em lipídeo), como lipossomas, iscomas (complexos de estimulação de imunidade, que são complexos estáveis de colesterol, e fosfolipídeo, saponina adjuvante ativa) sem antígeno, ou gotículas ou moléculas encontradas em emulsões de óleo em água ou água em óleo, providas de microveículos de fase líquida são biodegradáveis. Os microveículos de fase líquida biodegradáveis tipicamente incorporam um óleo biodegradável, um número dos quais são conhecidos na matéria, incluindo esqualeno e óleos vegetais. Os microveículos são tipicamente esféricos na forma, mas microveículos que se desviam da forma esférica são também aceitáveis (por exemplo, elipsoide, formato de roda, etc.). Devido a sua natureza insolúvel (com respeito à água), os microveículos são soluções filtráveis da água e baseadas na água (aquosas).

[00297] O anticorpo ou polipeptídeo conjugados da presente invenção podem incluir um ligante bifuncional que contém ambos, um grupo capaz de se acoplar a um agente tóxico ou agente quimioterápico e um grupo capaz de se acoplar a um anticorpo. Um ligante pode funcionar como um espaçador para distanciar um anticorpo de um agente a fim de evitar interferência com as capacidades de ligação. Um ligante pode ser clivável ou não clivável. Um ligante também serve para aumentar a reatividade química de um substituinte ou de um agente ou um anticorpo, e desse modo aumentar a eficiência de acoplamento. Um aumento em reatividade química pode também facilitar o uso de agentes, ou grupos funcionais em agentes, que de outra maneira não seria possível. O ligante bifuncional pode ser acoplado ao anticorpo por meios que são conhecidos na técnica. Por exemplo, um ligante contendo uma porção de éter ativo, como um éster N-hidroxossuccinimida, pode ser usado para acoplar aos resíduos de lisina no anticorpo através de uma ligação de amida. Em outro exemplo, um ligante contendo uma amina nucleofílica ou resíduo de hidrazina pode ser acoplado a grupos aldeído produzidos pela oxidação glicolítica de resíduos de carboidrato de anticorpo. Em adição a esses métodos diretos de acoplamento, o ligante pode ser indiretamente acoplado ao anticorpo por meio de um veículo intermediário como um aminodextrano. Nessas realizações o ligante modificado é através de lisina, carboidrato, ou um veículo intermediário. Em uma realização, o ligante é acoplado sitio- seletivamente para libertar resíduos de tiol na proteína. Porções que são apropriadas para acoplamento seletivo aos grupos tiol em proteínas são bem conhecidas na técnica. Exemplos incluem compostos de dissulfito, compostos de a-halocarbonila e a-halocarboxila, e maleimidas. Quando uma função de amina nucleofílica está presente na mesma molécula como um grupo α-halo carbonila ou carboxila, existe o potencial para ciclização ocorrer através de alquilação intramolecular da amina. Métodos para prevenir esse problema são bem conhecidos da pessoa de habilidade comum na técnica, por exemplo, através da preparação de moléculas em que as funções de amina e α-halo são separadas por grupos inflexíveis, como grupos arila ou transalcenos, que fazem a indesejável ciclização estereoquimicamente desfavorável. Ver, por exemplo, Patente Norte Americana No. 6.441.163 para preparação de conjugados de maitansinoides e anticorpo através de uma porção de dissulfeto.

[00298] Um dos ligantes cliváveis que podem ser usados para a preparação de conjugados de anticorpo-fármaco é um ligante de ácido instável baseado em ácido cis-aconítico que tira vantagem do ambiente acídico de diferentes compartimentos intracelulares como os endossomas encontrados durante a endocitose mediada por receptor e as lipossomas. Ver, por exemplo, Shen, W.C. et al. (1981) (“cis-Aconityl Spacer Between Daunomycin And Macromolecular Carriers: A Model Of pH-Sensitive Linkage Releasing Drug From A Lysosomotropic Conjugado” Biochem. Biophys. Res. Comtnun. 102:1048-1054 (1981)) para a preparação de conjugados de daunorrubicina com veículos macromoleculares; Yang et al (1988) “Pharmacokinetics And Mechanism Of Action Of A Doxorubicin-Antibody monoclonal 9.2.27 Conjugate Directed To A Human Melanoma Proteoglycan” J. Natl. Cane. Inst. 80:11541159) para a preparação de conjugados de daunorubicina para um anticorpo anti-melanoma; Dillman et al. (1988) (*Superiority Of An Acid-Labile Daunorubicin-Antibody monoclonal Immunoconjugate Compared To Free Drug” Câncer Res. 48:6097-6102) para usar um ligante ácido-instável em uma forma similar para preparar conjugados de daunorubicina com um anticorpo de anti- célula T; e Trouet et al. (1982) “A Covalent Linkage Between Daunorubicin And Proteínas That Is Stabela In Serum And Reversible By Lysosomal Hydrolases, As Required For A Lysosomotropic Drug-Carrier Conjugate: In Vitro And In Vivo Studies” Proc. Natl. Acad. Sci. (E.U.A.) 79:626-629) para ligar daunorubicina a um anticorpo através de um braço espaçador de peptídeo.

[00299] Um anticorpo (ou polipeptídeo) desta invenção pode ser conjugado (ligado) a uma molécula radioativa ou toxina por qualquer método conhecido na técnica. Para uma discussão de métodos para anticorpo marcado radioativamente (ver, CANCER THERAPY WITH MONOCLONAL ANTIBODIES, D.M. Goldenberg (Ed.) CRC Press, Boca Raton, 1995). Toxinas apropriadas incluem taxanos, maitansinóides, auristatinas (por exemplo, monometil auristatina (MMAE), monometil auristatina F (MMAF), auristatina E (AE), etc) (como aquelas descritas nas Patentes Norte Americanas Nos. 5.208.020; 5.416.064; 6.333.410; 6.340.701; 6.372.738; 6.436.931;6.441.163; 6.596.757; 7.276.497; 7.585.857; ou 7.851.432), caliqueamicina, antraciclinas (por exemplo, doxorrubicina), CC-1065 análogo, docetaxel,; catepsina B ou E; ricina, gelonina, Pseudomonas exotoxina, difteria toxina, e RNase; tiuxetano ou radioisótopo tóxico (como 90Y; 131I, 177Lu, 186Re, 188Re, 211At,212Bi,213Bi, 225Ac, etc.).

[00300] Alternativamente, um anticorpo pode ser conjugado a um segundo anticorpo para formar um anticorpo heteroconjugado como descrito na Patente Norte-Americana n° 4.676.980. A formação de anticorpos reticulados pode alvejar o sistema imune para tipos de células específicos, por exemplo, células doentes ou de câncer expressando B7-H3.

[00301] Esta invenção também provê métodos de retardar o desenvolvimento de metástases em um indivíduo com câncer (incluindo, mas entre outros, câncer de próstata, pulmão, ou rim) usando um anticorpo anti-B7-H3 ou outras realizações que ligam à B7-H3 em combinação com um agente quimioterápico, ou ligadas a um agente quimioterápico. Em algumas realizações, o anticorpo é uma forma humanizada ou quimérica de um anticorpo anti-B7-H3 não humano.

[00302] Em ainda outra realização, o anticorpo pode ser empregado como terapia adjuvante na ocasião da remoção cirúrgica de um câncer expressando o antígeno a fim de retardar o desenvolvimento de metástases. O anticorpo ou anticorpo associado com um agente quimioterápico pode também ser administrado antes da cirurgia (terapia neoadjuvante) em um indivíduo com um tumor expressando o antígeno a fim de diminuir o tamanho do tumor e dessa maneira possibilitar ou simplificar a cirurgia, poupar tecido durante a cirurgia, e /ou diminuir o desfiguramento resultante.

[00303] Em ainda outra realização, quaisquer uma das composições de ligação B7-H3 descritas aqui podem ligar a B7-H3-expressando células cancerosas e induzir uma resposta ativa imune contra as células cancerosas expressando B7-H3. Em alguns casos, a resposta ativa imune pode causar a morte das células cancerosas (por exemplo, ligação de anticorpo às células cancerosas induzindo a morte de células apoptóticas), ou inibir o crescimento (por exemplo, bloquear a progressão do ciclo das células) das células cancerosas. Em outros casos, qualquer um dos novos anticorpos descritos aqui podem se ligar a células cancerosas e anticorpo dependente de citotoxicidade celular (ADCC) podem eliminar células cancerosas às quais o anti-B7-H3 se liga. Por conseguinte, a invenção provê métodos de estimular uma resposta imune compreendendo administrar qualquer uma das composições descritas aqui.

[00304] Em alguns casos, a ligação de anticorpo pode também ativar ambas as resposta celular e tumoral e recrutar mais células exterminadoras naturais ou produção aumentada de citocinas (por exemplo, IL-2, IFN-gamma, IL-12, TNF-alfa, TNF-beta, etc.) que ainda ativam um sistema imune do indivíduo para destruir as células cancerosas. Em ainda outra realização, o anticorpo anti-B7-H3s pode se ligar às células cancerosas, e macrófagos ou outra célula fagocítica podem opsonizar as células cancerosas.

[00305] Várias formulações de anticorpos anti-B7- H3s ou fragmentos dos mesmos podem ser usadas para administração. Em algumas realizações, o anticorpo anti-B7- H3s ou fragmentos do mesmo podem ser administrados puros. Em adição ao agente farmacologicamente ativo, as composições da presente invenção podem conter veículos apropriados farmaceuticamente aceitáveis compreendendo excipientes e auxiliares que são bem conhecidos na técnica e são substâncias relativamente inertes que facilitam a administração de uma substância farmacologicamente eficaz ou que facilita o processamento dos compostos ativos em preparações que podem ser usadas farmaceuticamente para distribuição para o local de ação. Por exemplo, um excipiente pode dar forma ou consistência, ou atuar como um diluente. Excipientes apropriados incluem, mas não são limitados a agentes de estabilização, agentes umidificantes e emulsificantes, sais para variar a osmolaridade, agentes encapsulantes, tampões, e intensificadores de penetração na pele.

[00306] Formulações apropriadas para administração parenteral incluem soluções dos compostos ativos na forma solúvel na água, por exemplo, sais solúveis na água. Em adição, suspensões dos compostos ativos como apropriado para suspensões de injeção oleosa podem ser administrados. Solventes ou veículos lipofílicos apropriados incluem óleos graxos, por exemplo, óleo de gergelim, ou ésteres de ácido graxo sintético, por exemplo, etil oleato ou triglicerídeos. Suspensões de injeção aquosas podem conter substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão e incluem, por exemplo, carboximetil celulose de sódio, sorbitol, e/ou dextrano. Opcionalmente, a suspensão pode também conter estabilizadores. Lipossomas podem também ser usados para encapsular o agente para distribuição na célula.

[00307] A formulação farmacêutica para administração sistêmica, de acordo com a invenção pode ser formulada para administração enteral, parenteral ou tópica. Na verdade, todos os três tipos de formulação podem ser usados simultaneamente para realizar administração sistêmica do ingrediente ativo. Excipientes como também formulações para distribuição parenteral e não parenteral de fármacos são estabelecidas em REMINGTON: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY, 21a Edição, Lippincott Williams & Wilkins Publishing (2005). Formulações apropriadas para administração oral incluem cápsulas de gelatina dura ou mole, pílulas, comprimidos, incluindo comprimidos revestidos, elixires, suspensões, xaropes ou inalações e formas de liberação controlada dos mesmos. Geralmente, esses agentes são formulados para administração por injeção {por exemplo, intraperitonealmente, intravenosamente, subcutaneamente, intramuscularmente, etc.), embora outras formas de administração (por exemplo, oral, mucosal, etc) podem ser também usadas. Por conseguinte, os anticorpos anti-B7-H3 são preferivelmente combinados com veículos farmaceuticamente aceitáveis como solução salina, solução de Ringer, solução de dextrose, e similares.

[00308] O regime de dosagem particular, isto é, dose, horário e repetição, dependerá do indivíduo particular e do histórico médico daquele indivíduo. Geralmente, uma dose de pelo menos cerca de 100 μg/kg do peso corporal, mais preferivelmente pelo menos cerca de 250 μg/kg do peso corporal, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 750 μg/kg do peso corporal, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 3 mg/kg do peso corporal, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 5 mg/kg do peso corporal, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 10 mg/kg do peso corporal é administrado.

[00309] Considerações empíricas, como a média de vida, geralmente contribuirão para a determinação da dosagem. Anticorpos, que são compatíveis com o sistema imune humano, como anticorpos humanizados ou anticorpos totalmente humanos, podem ser usados para prolongar a média de vida do anticorpo e para prevenir o anticorpo de ser atacado pelo sistema imune do hospedeiro. A frequência da administração pode ser determinada e ajustada durante o curso da terapia, e é baseada na redução do número de células cancerosas, mantendo a redução de células cancerosas, reduzindo a proliferação de células cancerosas, ou retardando o desenvolvimento de metástase. Alternativamente, formulações de liberação contínua sustentada do anticorpo anti-B7-H3s podem ser apropriadas. Várias formulações e dispositivos para realização de liberação sustentada são conhecidos na técnica.

[00310] Em uma realização, dosagens para anticorpos anti-B7-H3 podem ser determinadas empiricamente em indivíduos que receberam uma ou mais administrações. Indivíduos recebem dosagens aumentadas de um anticorpo anti- B7-H3. Para acessar a eficácia do anticorpo anti-B7-H3s, um marcador de estado de doença de câncer específica pode ser seguido. Esses incluem medições diretas do tamanho do tumor através de apalpar ou observação visual, medições indiretas do tamanho do tumor por raio X ou outras técnicas de formação de imagem; um melhoramento como acessado por biópsia direta do tumor e exame microscópico da amostra do tumor; a medição de um marcador indireto do tumor (por exemplo, PSA para câncer de próstata), uma diminuição na dor ou paralisia; fala, visão, respiração e outras deficiências associadas com o tumor melhoradas; apetite melhorado; ou um aumento na qualidade de vida como medido pelos testes aceitos ou prolongamento da sobrevivência. Será evidente para a pessoa especialista na matéria que a dosagem vai variar dependendo do indivíduo, do tipo de câncer, o estágio do câncer, se o câncer começou a metástase em outro local no indivíduo, e os tratamentos passados e atuais sendo usados.

[00311] Outras formulações incluem formas de distribuição apropriadas conhecidas na técnica incluindo, mas não limitadas a, veículos como lipossomas. Ver, por exemplo, Mahato et al. (1997) “Cationic Lipid-Based Gene Delivery Systems: Pharmaceutical Perspectives” Pharm. Res. 14:853-859. Preparações lipossomais incluem, mas não são limitados a, citofectinas, vesículas multilamelares e unilamelares.

[00312] Em algumas realizações, mais de um anticorpo pode estar presente. Os anticorpos podem ser monoclonais ou policlonais. Tais composições podem conter pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco anticorpos diferentes que são reativos contra carcinomas, adenocarcinomas, sarcomas, ou adenossarcomas. Anticorpo anti-B7-H3 pode ser misturado com um ou mais anticorpos reativos contra carcinomas, adenocarcinomas, sarcomas, ou adenossarcomas em órgãos incluindo, mas não limitados a ovário, mama, pulmão, próstata, cólon, rim, pele, tireoide, osso, trato digestivo superior, e pâncreas. Em uma realização, uma mistura de anticorpo diferente anti-B7-H3s é usada. Uma mistura de anticorpos, como eles são muitas vezes denotados na técnica, pode ser particularmente útil para tratar uma ampla faixa da população de indivíduos.

[00313] Tendo agora descrito geralmente a invenção, a mesma será mais prontamente entendida através da referência aos exemplos a seguir, que são providos a título de ilustração e não são destinados a ser limitantes da presente invenção a menos que especificado...

EXEMPLO 1 INVESTIGAÇÕES DE IMUNOISTOCOMPATABILIDADE

[00314] Um painel de 49 mAbs foi gerado a partir de célula de tumor / imunizações de célula progenitora fetal. Os anticorpos foram avaliados por sua capacidade de exibir diferencial IHC corante de tecido de tumor em relação ao tecido normal, não canceroso, capacidade de uso em primata (e particularmente macaco cinomólogo) modelos de eficácia de anticorpo, níveis de afinidade de especificidade e níveis de antígenos de atividade imunomoduladora e internalização celular. 21 das mAbs foram inicialmente identificadas por análise e/ou ligação de MS para células B7-H3-CHO. As 28 mAbs restantes foram identificadas re-escaneando a biblioteca por ELISA com proteína B7-H3. Características de 46 dos 49 membros do painel são providas na Tabela 2.

[00315] A coloração do IHC confirmou que o painel compreende anticorpos que extrairam um tumor forte para diferencial de ligação de tecido normal em muitos dos anticorpos identificados, exibiram uma faixa de propriedades de ligação por análise de BIACORE™, exibiram reatividade para variação de epítopos de sobreposição e não sobreposição e exibiram uma faixa de especificidade para 4Ig vs. 2Ig B7-H3. As características dos nove melhores candidatos são mostradas na Tabela 3 e Tabela 4.

[00316] A tabela 5 provê um sumário dos perfis de atividade desses anticorpos.

[00317] Uma análise das atividades dos anticorpos mostrados na Tabela 6 revelou que seus respectivos perfis diferiam e que cada anticorpo foi associado com ambas as vantagens e desvantagens relativas uma a outra (Tabela 6).

[00318] Por causa de BRCA84D, BRCA68D, BRCA69D e PRCA157 exibirem perfis de IHC de tecido normal mais limpos, diferencial de IHC de ligação de tumor/normal mais forte, moderada a forte (BIACORETM / IHC), reatividade cruzada a B7- H3 de macacos cionomólogos, e atividade de UDARTTM potente, essas espécies de anticorpos foram selecionadas para desenvolvimento adicional. Esses anticorpos diferiram de TES7 e OVCA2, que exibiram baixa afinidade (no ensaio de BIACORETM), e a reatividade não cruzada para B7-H3 de macacos cinomólogos. Esses anticorpos diferiram de SG27, que exibiu baixa afinidade (no ensaio de BIACORETM), desempenho de IHC inferior (ligação fraca) e atividade de UDARTTM inferior. Esses anticorpos diferiram de GB8, que exibiu baixa afinidade (no ensaio de BIACORETM), diferencial de IHC de tumor/normal deficiente, e atividade de UDARTTM inferior.

[00319] Usando células de controle positivo Caki- 2 e Hs700T, as investigações de IHC revelaram que cada um dos anticorpos exibiu uma concentração ideal diferente e uma concentração diferencial diferente em relação uma a outra (Tabela 7).

[00320] Usando as concentrações ideais e diferenciais indicadas na Tabela 7, as respostas de IHC dos anticorpos B7-H3 em tecidos de ser humano foram determinadas. Os resultados dessas análises para Adrenal, Fígado, Pancreática, Rim, Pulmão e Cólon são mostradas nas Tabelas 8A-8B e Tabelas 9A-9B (todos os anticorpos exibiram respostas de IHC negativas para o tecido do coração).

[00321] As investigações conduzidas usando espécies de câncer mostraram que os anticorpos B7-H3 da presente invenção poderiam ser usados para identificar um diagnóstico de câncer em fontes múltiplas de tecido (Tabela 10). Na Tabela 10, os números indicam o número de sinais de mais (1 = +, 2 = ++, 3 = +++); cada número se referindo a uma amostra testada diferente.

[00322] Para células cancerosas de próstata,mama, cólon e pulmão tratadas com o anticorpo B7-H3 BRCA84D, corante de amostra de tumor estava presente nas células do tumor e células estromais, incluindo a vasculatura do tumor. Em algumas amostras de tumor, a coloração estromal foi mais forte do que as células do tumor. Quando BRCA84D mAb foi titulado para concentração inferior, alguns caos mostraram coloração reduzida nas células do tumor, mas ainda mantendo corante estromal forte. Mediante coloração com BRCA84D em 0, 625 μg/ml, células cancerosas de próstata exibiram um IHC de 3/3+; células cancerosas de mama exibiram um IHC de 4/4+; células cancerosas de cólon exibiram um IHC de 4/4+ e células cancerosas de pulmão exibiram um IHC de 4/4+. Mediante coloração com BRCA84D a 0,078 μg/ml, as células cancerosas da próstata exibiram um IHC de 3/4+; células cancerosas de mama exibiram um IHC de 5/5+; células cancerosas de cólon exibiram um IHC de 4/4+ e células cancerosas de pulmão exibiram um IHC de 3/4+.

[00323] O fígado normal foi tratado com B7-H3 anticorpo BRCA68D, e a coloração foi vista nos hepatócitos e Células de revestimento sinusoidais. Pâncreas normal corado com B7-H3 anticorpo BRCA68D exibiram coloração multifocal na fibra de colágeno e epitélio. Células adrenais normais tratadas com B7-H3 anticorpo BRCA68D, exibiram coloração no córtex. Mediante coloração com BRCA68D a 0,156 μg/ml, células cancerosas gástricas, renais e ovarianas todas exibiram um IHC de 5/5+.

[00324] Análises de coloração de IHC adicional foram conduzidas em amostras de tecidos de câncer gástrico, de rim e ovariano. Os resultados de cada análise são mostrados na Tabela 12. Na Tabela 11, os números indicam o número de sinais de mais (1= +, 2= ++, 3 = +++); cada número se referindo a uma amostra testada diferente.

[00325] No sumário, todas as mAbs testadas mostraram vários graus de intensidade de coloração em fígado, pâncreas, cólon e pulmão normais. Figura 1A mostra os resultados das investigações de IHC conduzidas usando espécimes de tecido de pâncreas, fígado, pulmão e cólon normais com BRCA84D a 0,625 μg/ml e 0,078 μg/ml. A coloração do fígado foi relativamente restrita em Células de revestimento sinusoidais (fibroblasto e células kupffer) com BRCA84D e TES7. OVCA22 mostrou coloração de hepatócito de membrana além daquela das Células de revestimento sinusoidais em concentração ideal. Entretanto, a coloração em hepatócitos desapareceu na concentração diferencial. Todas as outras mAbs mostraram coloração em hepatócitos incluindo coloração de membrana ou citoplasma em ambas as concentrações, ideal e diferencial. A coloração do pâncreas foi observada em fibra de colágeno principalmente e uma percentagem pequena do epitélio (células acinar ou/e células de dutos intercaladas). A coloração no epitélio diminuiu ou desapareceu em concentração diferencial. A coloração do cólon foi relativamente restrita na membrana apical do epitélio de cripto e fibroblasto na mucosa. Nenhuma ligação foi observada em nódulos linfoides do cólon. O pulmão mostrou coloração muito fraca e desigual no epitélio com BRCA84D, BRCA68D, BRCA69D e GB8. Entretanto, a coloração desapareceu na concentração diferencial. Nenhuma coloração foi observada no pulmão com TES7, OVCA22 e PRCA157 em ambas as concentrações. A coloração do córtex adrenal foi observada com quase todas as mAbs em concentração ideal, exceto BRCA84D. A coloração em adrenal obviamente diminuiu com TES7 e OVCA22 em concentração diferencial. Coloração do coração e rim não mostraram coloração óbvia com todas as mAbs (Figura IB). Em vista dessas propriedades, BRCA84D foi considerada a melhor das mAbs, seguida em ordem por (2) TES7, (3) OVCA22, (4) o grupo BRCA68D, BRCA69D e PRCA157, e por último (5) GB8.

[00326] Todas as mAbs incluídas no estudo mostraram coloração positiva em 4 tipos de câncer na concentração ideal. Na concentração diferencial, BRCA84D ainda manteve boa coloração no câncer de próstata, câncer de mama, e câncer de cólon. TES7 mantiveram coloração boa em 4 tipos de estudo de câncer. As mAbs remanescentes mostraram várias intensidades de coloração em diferentes tipos de tumor. Coloração de amostra de tumor foi observada em células do tumor e células estromais, incluindo vasculatura. Algumas amostras de tumor mostraram coloração positiva somente na vasculatura, isto é, BRCA84D, BRCA69D, TES7, e PRCA157. Alguns tumores mostraram coloração estromal mais forte do que a coloração da célula do tumor. Quando mAbs foram tituladas para concentração mais baixa nessas amostras, alguns casos mostraram coloração diminuída ou nenhuma nas células do tumor, mas ainda mantiveram coloração estromal forte. Em geral, em termos de expressão em tecidos normais de ser humano e expressão diferencial em tecidos normais vs. de tumor, a ordem de mAb a partir do melhor desempenho de IHC para o pior desempenho é como a seguir: (1) BRCA84D, (2) TES7, (3) OVCA22, (4) o grupo BRCA68D, BRCA69D e PRCA157, e por último (5) GB8. A tabela 12 e a figura 2 mostram resultados para anticorpo BRCA84D.

EXEMPLO 2 REATIVIDADE CRUZADA B7-H3 DE MACACO CINOMÓLOGO

[00327] A sequência de macacos cinomólogos B7-H3 compartilha aproximadamente 90% de homologia para sua equivalente humana, sugerindo que o macaco cinomólogo é um excelente modelo para interações humanas B7-H3. Investigações foram conduzidas para avaliar a reatividade cruzada de B7H3 de candidatos BRCA84D, BRCA68D, BRCA69D, TES7, OVCA22 e PRCA157 com adrenal, fígado, rim, pâncreas e pulmão como também um caso de placenta de prazo natural de macaco cinomólogo, a fim de comparar qualquer reatividade cruzada com a intensidade de coloração e padrões de coloração observados para tecidos de seres humanos.

[00328] A concentração de coloração para cada Mab testado é a concentração ideal que foi determinada em células de controle positivo Caki-2 e Hs700T (ver, Tabela 8). Cabra comercial anti-humana B7-H3 (reação cruzada com cino) foi selecionada como um anticorpo de controle positivo para tecido de placenta de cinomólogo corado. Controles de isótopos correspondentes foram aplicados em cada execução dos experimentos. Os resultados dessas investigações são mostrados na Tabela 13.

[00329] A investigação de coloração IHC de BRCA84D (0,625 μg/ml) em placenta de cinomólogo exibiu coloração em células deciduais, mas não em vilosidades. Nenhuma coloração foi observada em fígado e pâncreas de cino, entretanto, coloração de células sinusoidais foi observada em fígado de ser humano e fibra localizada e a coloração de epitélio foi observada no tecido do pâncreas de ser humano.

[00330] A investigação coloração IHC de BRCA68D (0.156 μg/ml) em placenta de cinomólogo exibiu coloração em células deciduais, células mesenquimais (endotélio e fibroblastos) e vilosidades. A coloração estava presente na membrana de hepatócitos e citoplasma de fibroblastos de fígado, como também em fibra pancreática em no citoplasma de epitélio pancreático. Desse modo, tecido pancreático e de fígado de ser humano e cino exibem padrões de coloração similares com BRCA68D.

[00331] Resumindo, BRCA84D, BRCA68D, BRCA69D e PRCA157 todos mostraram reatividade cruzada em tecidos de cino. BRCA84D não mostrou coloração em fígado e pâncreas de macaco; tal coloração foi observada em tecidos pancreáticos e de fígado de ser humano. BRCA68D e BRCA69D mostraram intensidade de coloração similar e padrões de coloração em tecidos de macaco. Embora BRCA68D, BRCA69D e PRCA157 mostraram padrão de coloração comparável com os tecidos de ser humano, a intensidade de coloração não é idêntica aos tecidos de ser humano em condições ideais. TES7 e OVCA22 não mostraram qualquer coloração em tecidos de macaco em condições ideais.

[00332] Um resumo dos resultados comparativos de coloração de IHC em tecido de cinomólogo e de tecido de ser humano é provido na Tabela 14.

EXEMPLO 3 B7-H3 mAbs SE UNE A MÚLTIPLAS LINHAGENS DE CÉLULAS CANCEROSAS ATCC

[00333] Descobriu-se que os anticorpos da presente invenção são capazes de se unirem a múltiplas linhagens de células cancerosas contidas nas coleções da American Type Culture Collection. A tabela 15 e a tabela 16 resumem os resultados da ligação.

EXEMPLO 4 EXTERMÍNIO REDIRECIONADO DE B7-H3 MABS

[00334] Os anticorpos da presente invenção se unem a B7-H3 presente na superfície de células cancerosas. Usando métodos convencionais como anticorpos podem ser rotulados com fluoresceína, como descrito acima. Usando tais moléculas rotuladas são incubadas na presença de moléculas UDARTTM tendo um domínio de ligação de epítopo que liga para o receptor da célula T e uma ligação de epítopo que liga para fluoresceína (“TCR-UDARTTM”), elas podem ligar para moléculas DARTTM e desta maneira as localizam para a superfície de células que expressam B7-H3 e causam extermínio redirecionado.

A. EXTERMÍNIO REDIRECIONADO DE CÉLULAS DE CARCINOMA RENAL A498

[00335] Para demonstrar tal extermínio redirecionado, anticorpos B7-H3 rotulados de fluoresceína foram incubados com tais moléculas de TCR-UDARTTM e a capacidade das moléculas para mediar citotoxicidade de células de carcinoma renal A498 foi avaliada (Tabela 17). Com base nos resultados alcançados, os candidatos do topo foram concluídos como sendo: RECA13, BRCA68D, BRCA69D e TDH6.

[00336] As células A498 de carcinoma renal foram incubadas com diferentes concentrações de anticorpos monoclonais reativos contra B7-H3 a fim de determinar o extermínio redirecionado dependente da dose mediada pelos anticorpos. Os resultados dos experimentos (Figuras 3A-3B) mostraram que o extermínio redirecionado era dependente da dose.

B. EXTERMÍNIO REDIRECIONADO DE CÉLULAS CANCEROSAS DE PULMÃO A549

[00337] Para ainda demonstrar tal extermínio redirecionado, os anticorpos B7-H3 rotulados de fluoresceína foram incubados com as moléculas TCR-UDARTTM descritas acima ou com moléculas UDARTTM tendo um domínio de ligação de epítopo que liga para CD 16 e um domínio de ligação de epítopo que liga para fluoresceína (“CD 16-UDARTTM”), e a capacidade das moléculas mediarem citotoxicidade de células cancerosas de pulmão A549 foi avaliada (Tabela 18). Os resultados dos experimentos (Figuras 3C-3D) mostraram que o extermínio redirecionado foi dependente da dose. Com base nos resultados alcançados, os candidatos de topo foram concluídos como sendo: BLA8, BRCA68D, BRCA69D e BRCA84D.

C. EXTERMÍNIO REDIRECIONADO DE CÉLULAS CANCEROSAS DE PRÓSTATA LNCAP

[00338] Para ainda demonstrar tal extermínio redirecionado, os anticorpos B7-H3 rotulados de fluoresceína foram incubados com as moléculas TCR-UDART™ descritas acima ou com moléculas UDART™ tendo um domínio de ligação de epítopo que liga à CD 16 e um domínio de ligação de epítopo que liga para fluoresceína (“CD 16-UDART™”), e a capacidade das moléculas para mediar citotoxicidade de células cancerosas de próstata LNcap foi avaliada (Tabela 19). Com base nos resultados alcançados, os candidatos de topo foram concluídos como sendo: BRCA68D, BRCA69D, BRCA84D e PRCA157.

EXEMPLO 5 CAPACIDADE DE MABS B7-H3 SE UNIR A B7H3-2IG SOLÚVEL E B7H3- 4IG SOLÚVEL

[00339] Como discutido acima, B7-H3 existe em ambas, uma forma contendo domínio 4Ig (B7H3-4Ig) e uma forma contendo domínio 2Ig (B7H3-2Ig). Os anticorpos anti-B7-H3 da presente invenção foram testados por suas capacidades para se unir a B7H3-2Ig solúvel (Figura 4A) e B7H3-4Ig B7-H3 solúvel (Figura 4B). Descobriu-se que os anticorpos exibem uma ampla faixa de características de ligação. Descobriu-se que os anticorpos PRCA123, TDH5, BLA8, BRCA68D e SG24 exibem a ligação mais forte para anticorpos B7H3-2Ig e descobriu-se que os anticorpos TES7, LUCA50, BRCA165, OVCA22, ST09 e PA20 exibem a ligação mais fraca para B7H3-2Ig solúvel. Descobriu- se que os anticorpos PRCA123, BRCA69A, BLA8 e BRCA68D exibem a ligação mais forte para B7H3-4Ig solúvel e descobriu-se que os anticorpos TES7, OVCA21, BRCA 165 e ST09 exibem a ligação mais fraca para B7H3-4Ig solúvel.

EXEMPLO 6 LIGAÇÃO DE AFINIDADE DE ANTÍGENOS EM SOLUÇÃO PARA ANTICORPOS MONOCLONAIS CAPTURADOS

[00340] A fim de demonstrar a afinidade de ligação entre antígenos em solução e anticorpos monoclonais capturados, anticorpos foram capturados fragmentos de IgG Fc- específico Fab2 imobilizados em um nível de 100-200 RU. Antígenos B7-H3 e B7-H3(4Ig) foram injetados sobre anticorpos capturados em uma concentração de 100 nM (taxa de fluxo 20 μl/min por 120 seg, e a ligação foi medida. Respostas de ligação foram normalizadas para o mesmo nível de mAb capturada e a resposta de ligação para o controle do anticorpo m2B6 (mlgGl) foi subtraída como vazia. Os resultados dessa análise (Figuras 5A-5S; linhas sólidas; B7- H3(4Ig) 100 nM; linhas pontilhadas; B7-H3, 100 nM)) demonstraram que os anticorpos da presente invenção exibiram forte ligação a B7-H3(4Ig)...

EXEMPLO 7 ANÁLISE DE BIACORETM: TITULAÇÃO DE B7-H3 MABS PARA B7-H3 IMOBILIZADA

[00341] A fim de demonstrar as afinidades de ligação relativas de B7-H3-2Ig e B7-H3-4Ig para os anticorpos da presente invenção, uma análise de BIACORETM foi realizada. Os anticorpos B7-H3 da presente invenção foram permitidos ligar para B7-H3-2Ig imobilizada ou para B7-H3-4Ig e a titulação de ligação durante o tempo foi acessada (Figuras 6A-6I). Descobriu-se que TDH5, PRCA123, BLA8, BRCA69 têm alta afinidade para ambas B7-H3-2Ig e B7-H3-4Ig. Entretanto, descobriu-se que seu(s) epítopo(s) é(são) principalmente barrado(s) na molécula B7-H3-4Ig, com apenas um pouco estando disponível. Descobriu-se que OVCA22 tem uma afinidade muito baixa para ambas B7-H3-2Ig e B7-H3-4Ig com seu epítopo estando igualmente disponível em ambas as moléculas. Entretanto, é provável que somente a forma B7-H3-4Ig proveja proximidade suficiente para ligação bivalente de anticorpo (fora de taxa baixa), enquanto que a B7-H3-2Ig pode ser ligada só monovalentemente. Descobriu-se que TDH6 tem apenas qualquer afinidade nesse formato, com ligação para 2Ig provável ser não específica. Descobriu-se que TES7 e PA20 são anticorpos específicos B7-H4-4Ig com afinidade baixa. TES7 provavelmente tem uma baixa na taxa e uma fora da taxa mais elevada do que PA20. BRCA84D foi descoberto ser um anticorpo de afinidade intermediária com uma possibilidade de sítios de múltiplas ligações em ambos B7-H3-2Ig e B7-H3-4Ig. Com base na análise de BIACORE ™, BRCA84D devido seu sítio de ligação incomum foi considerado um dito anticorpo. TES7 e PA20 foram considerados candidatos para ligação específica pra superfícies de antígenos de alta densidade, e um de anticorpo de alta afinidade-baixa especificidade (por exemplo, BRCA69D ou outro).

[00342] A figura 7 provê uma comparação de análise de BIACORETM de anticorpos PRCA157, BRCA69D, BLA8, PA20, BRCA84D, GB8 e SG27, ilustrando que o anticorpo anti- B7-H3s da presente invenção pode exibir uma variação de propriedades de ligação.

[00343] A figura 8 demonstra a especificidade de não competição de diversos dos anticorpos anti-B7-H3s da presente invenção. No experimento, moléculas B7-H3 de ser humano foram incubadas na presença de anticorpo BRCA84D e submetidas à análise de BIACORE™. Depois de aproximadamente 3 minutos um segundo anticorpo anti-B7-H3 foi adicionado para a reação. Se o segundo anticorpo competiu com BRCA84D, ele encontrou os sítios B7-H3 ocluíram e foram incapazes de ligar. Os resultados indicam que os anticorpos BRCA68D, BRCA69D, e PRCA157 não competem com BRCA84D para ligação para B7-H3 de ser humano.

EXEMPLO 8 mAbs ANTI-B7-H3 INTERNALIZAM NAS LINHAGENS DE CÉLULAS CSC E ATCC

[00344] A capacidade do anticorpo anti-B7-H3s da presente invenção se tornar internalizado mediante ligação para células cancerosas foi investigada. Células CSC de próstata e células pancreáticas Hs700t foram incubadas com um anticorpo anti-B7-H3. A viabilidade das células foi determinada depois da incubação na presença de um anticorpo secundário anticamundongo saporina-conjugado que será tóxico para as células se ligado ao anticorpo primário e internalizado. Os resultados desta investigação para células CSC de próstata (Figura 9A) e para células pancreáticas Hs700t (Figura 9B) demonstram a capacidade dos anticorpos da presente invenção se tornarem internalizados nas células.

EXEMPLO 9 LIGAÇÃO DE B7-H3 mAb E ANÁLISE DE BLOQUEIO CRUZADO POR ELISA

[00345] A fim de explorar a reatividade cruzada dos anticorpos da presente invenção e os epítopos reconhecidos por tais anticorpos, a extensão da ligação ocorrendo na presença de um anticorpo competidor B7-H3 foi medida. Os resultados desta análise são mostrados nas Figuras 10A-10F, e mostram que BRCA68D compete com BRCA69D. TES7 e OVCA22 foram também descobertos para competir um com o outro, mas TES7 e não OVCA22 foi descoberto também para competir com ambos BRCA68D e BRCA69D. GB8 foi descoberto para competir com SG27 para ligação para B7-H3-2Ig mas não para B7-H3-4Ig. Os dados são resumidos na Tabela 20 e mostram pelo menos quatro epítopos distintos para B7-H3-4Ig (isto é, o epítopo reconhecido por SG27, o epítopo reconhecido por GB8, o epítopo reconhecido por OVCA22 e TES7, e o epítopo reconhecido por BRCA68D, BRCA69D e TES7) e pelo menos dois epítopos para B7-H3-2Ig (isto é, o epítopo reconhecido por SG27 e GB8, e o epítopo reconhecido por BRCA68D e BRCA69D).

[00346] Os atributos do anticorpo chave anti-B7- H3s da presente invenção são mostrados na Tabela 21. Com base em sua coloração diferencial exibida de tecidos normais e de câncer, suas capacidades para ligar B7-H3-4Ig como também B7- H3-2Ig, suas afinidades de ligação são medidas pela análise BIACORE™ descrita acima e suas capacidades para ligar para cinomólogos B7H3, anticorpos, BRCA68D, BRCA69D, BRCA84D, e PRCA157 foram julgados ser os anticorpos mais preferidos.

EXEMPLO 10 ANTICORPO HUMANIZADO ANTI-B7-H3S

[00347] O anticorpo monoclonal BRCA84D foi humanizado a fim de produzir anticorpos (genericamente designados aqui como “hBRCA84D”) oferecendo potencial terapêutico de ser humano aprimorado. As sequencias da cadeia leve variável, e a cadeia pesada variável, e suas respectivas sequências de aminoácidos e polinucleotídeos do anticorpo humanizado resultante (designado aqui como “hBRCA84D-l”) são providas abaixo:

[00348] Cadeia Leve Variável BRCA84D-1 Humanizada (SEQ ID NO:68): DI QLTQS P 3 E L S A3V GDRVT 1TCK ASQNVD TNVAWY QQK P GKAPKLLIY S ASYRYSGVPS EFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YNNYPFTFGQ GTKLEIK

[00349] Sequência de Polinucleotídeos Codificando Cadeia Leve Variável BRCA84D-1 Humanizada (SEQ ID No:69): gacatccagc tgacccagtc cccctccttc ctgtctgcct ccgtgggcga cagagtgacc atcacatgca aggcctccca gaacgtggac accaacgtgg cctggtatca gcagaagcct ggcaaggccc ctaagctgct gatctactcc gcctcctacc ggtactccgg cgtgccttcc aggttctccg gctccggctc tggcaccgac ttcaccctga ccatctccag cctgcagcct gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag tacaacaact accctttcac cttcggccag ggcaccaagc tggaaatcaa g

[00350] Cadeia Leve Variável BRCA84D-1 Humanizada CDRi (SEQ ID Nθ:70):

[00351] Sequência de Polinucleotídeos Codificando Cadeia Leve Variável BRCA84D-1 CDRi (SEQ ID N0:71): aaggccagtc agaatgtgga tactaatgta gcc

[00352] Cadeia Leve Variável BRCA84D-1 Humanizada CDR2 (SEQ ID NO:72):

[00353] Sequência de Polinucleotídeos Codificando Cadeia Leve Variável BRCA84D-1 Humanizada CDR2 (SEQ ID NO:73): tcggcatcct accggtacag t

[00354] Cadeia Leve Variável BRCA84D-1 Humanizada CDR3 (SEQ ID N0:74):

[00355] Sequência de Polinucleotídeos Codificando Cadeia Leve Variável BRCA84D-1 Humanizada CDR3 (SEQ ID N0:75):

[00356] Sequência de Aminoácidos de Cadeia Pesada Variável BRCA84D-1 Humanizada (SEQ ID NO:80): EVQLVESGGG LVQFGGSLRL SCAASGFTFS SFGMHWVRQA PGKGLEWVAY IS S DS S A1Y Y A DT V K GR E 'TI SR DM A K t J S1Y L QMM S LR DE D T AV Y Y C ARGR ENIYYGSRLD YWGQGTTVTV SS

[00357] Sequência de Polinucleotídeos Codificando Cadeia Pesada Variável BRCA84D-1 Humanizada (SEQ ID No:81):gaggtgeagc tggtcgagtc tggcggagga ctggtgcagc ctggcggctc cctgagactg tcttgcgccg cctccggctt caccttctcc agcttcggca tgcactgggt ccgccaggct ccaggcaagg gactggaatg ggtggcctac atctcctccg actcctccgc catctactac gccgacaccg tgaagggcag gttcàôcatc túccgggaca acgccaagaa ctccótgtàí; etgeagatga actccôtgeg ggacgaggae accgccgtgt act act gogó eagaggecgg gagaatatct aetacggctc ccggctggat tattggggcc agggcaccac cgtgaccgtg LccLcL

[00358] Cadeia Pesada Variável BRCA84D-1 Humanizada CDR1 (SEQ ID NO:82):

[00359] Sequência de Polinucleotídeos Codificando Cadeia Pesada Variável BRCA84D-1 Humanizada CDR1 (SEQ ID No:83):

[00360] Cadeia Pesada Variável BRCA84D-1 Humanizada CDR2 (SEQ ID NO:84):

[00361] Sequência de Polinucleotídeos Codificando Cadeia Pesada Variável BRCA84D-1 Humanizada CDR2 (SEQ ID 85): tacattagta gtgacagtag tgccatctac tatgcagaca cagtgaag

[00362] Cadeia Pesada Variável BRCA84D-1 Humanizada CDR3 (SEQ ID NO:86):

[00363] Sequência de Polinucleotídeos Codificando Cadeia Pesada Variável BRCA84D-1 Humanizada CDR3 (SEQ ID NO:87):

[00364] Figuras 11A-11B mostram o alinhamento dos resíduos de aminoácidos de cadeias leves variáveis (Figura 11 A) ou cadeias pesadas variáveis (Figura 11B) de BRCA84D e seu derivado humanizado, hBRCA84D...

[00365] A fim de obter espécies de hBRCA84D que exibem afinidade melhorada para B7-H3 de ser humano, polinucleotídeos codificando cadeias leves ou pesadas de hBRCA84D-l (isto é, hBRCA84D-1VL ou hBRCA84D-1VH, respectivamente) foram submetidas à mutagênese e derivados de cadeia leve hBRCA84D-l mudados hBRCA84D-2VL, hBRCA84D-3VL, hBRCA84D-4VL, hBRCA84D-5VL, e hBRCA84D-6VL e derivados de cadeia pesada hBRCA84D-l mudados hBRCA84D-2VH, hBRCA84D-3VH, e hBRCA84D-4VH foram isolados e caracterizados. As sequências de aminoácidos e polinucleotídeos das cadeias leves e pesadas variáveis desses anticorpos são apresentadas abaixo:

[00366] hBRCA84D-2VL (SEQ ID NO:89): DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCKASQNVD TNVAWYQQKP GKAPKALIYS ASYRYSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YNNYPFTFGQ GTKLEIK

[00367] Polinucleotídeo Codificando hBRCA84D-2VL (SEQ ID NO: 90) :gacatccagc tgacccagtc cccctccttc ctgtctgcct ccgtgggcga cagagtgacc atcacatgca aggcctccca gaacgtggac accaacgtgg cctggtatca gcagaagcct ggcaaggccc ctaaggcgct gatctactcc gcctectacc ggtactcegg egtgccttee aggttctceg getαcggetc tggcaccgac ttcaccctga ccatctccag cctgcagcct gaggaetteg ccacctaeta ctgccagcag tacaacaact accctttcac ctteggccag ggcaccaagc tggaaatcaa g

[00368] hBRCA84D-3VL (SEQ ID NO:91): DIQLTQSPSF LSASVGDRVS VTCKASQNVD TNVAWYQQKP GKAPKLLIYS AS YRYSGVPS RF■ SGSGSGTD FTLTISSLQP E DFATYYCQQ Y N N Y P E’TFGQ GTKLEIK

[00369] Polinucleotídeo Codificando hBRCA84D-3VL (SEQ ID NO:92) : gacatccagc tgacccagtc cccctccttc ctgtctgcct ccgtgggcga cagagtgtcc gtcacatgca aggcctccca gaacgtggac accaacgtgg cetggtatca gcagaagcct ggcaaggcce etaagetget gatetactce gcctcctacc ggtactccgg cgtgccttcc aggtteteeg gctccggctc tggcaccgac ttcaccctga ccatctccag cctgcagcct gaggaetteg ceacctacta ctgccagcag tacaaeaact accctttcac cttcggccag ggcaccaagc tggaaatcaa g

[00370] hBRCA84D-4VL (SEQ ID NO:93): DIQLTQSPSF LSASVCDRVT ITCKASQNVD TNVAWYQQKP GQAPKLLIYS ASYRYSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDEATYYCQQ YNNYPFTFGQ GTKLEIK

[00371] Polinucleotídeo Codificando hBRCA84D-4VL (SEQ ID NO:94) : gacatccagc tgacccagtc cccctccttc ctgtctgcct ccgtgggcga cagagtgac e a t c a c atgca aggcc t c eca gaaegtggac a c ca a cgtgg cctggtatca geagaagcct ggccaggccc etaagetget gateLaci.cc gcctcctacc ggtactccgg cgtgccttcc aggtteteeg gctccggctc tggcaccgac ttcaccctga ccatctccag cctgcagcct gaggaetteg ceacctacta ctgccagcag tacaacaact accctttcac cttcggccag ggcaccaagc tggaaatcaa g

[00372] hBRCA84D-5VL (SEQ ID NO:95): DIQLTQSFSF LSASVGDRVT ITCKASONVD TNVAWYQQKF GQAPKALIYS AS ¥ RY S GV P S R F' S G S G S GT D FT LTIS S LQP E DE AT ¥ Y CQQ Y N N Y P FF GQ GTKLEIK

[00373] Polinucleotídeo Codificando hBRCA84D-5VL (SEQ ID NO: 96) : gacatccagc tgacαcagtc cccctccttc ctgtctgcct ccgtgggcga cagagtgacc atcacatgca aggcctccca gaacgtggac accaacgtgg ectggtatca gcagaagcct ggccaggccc ctaaggcgct gatctactcc gcctcctacc ggtactccgg cgtgccttcc aggttctccg gctccggctctggcaccgac ttcaccctga ccatctccag cctgcagcct gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag tacaacaact accctttcac cttcggccag ggcaccaagc tggaaatcaa g

[00374] hBRCA84D-6VL (SEQ ID NO:97): DIQLTQSFSF LSASVGDRVT ITCKASQNVD TNVAWYQQKP GKAPKLLIYS ASYRYSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFAEYYCQQ YNNYFFTFGQ GTKLEIK

[00375] Polinucleotídeo Codificando hBRCA84D-6VL (SEQ ID NO: 98) : gacatccagc tgacαcagtc cccctcct tc ctgtctgcat ccgtgggcga cagagtgacc atcacatgca aggcctccca gaacgtggac accaacgtgg cctggtatca gcagaagcct ggcaaggccc ctaagctgct gatctactcc gcctcctacc ggtactccgg cgtgccttcc aggttctccg gctccggctc tggcaccgac ttcaccctga ccatctccag cctgcagcct gaggacttcg ccgagtacta ctgccagcag tacaacaact accctttcac cttcggccag ggcaccaagc tggaaatcaa g

[00376] hBRCA84D-2VH (SEQ ID NO:99): EVQLVESGGG LVQPGGSLFL SCAASGFTFS SFGMHWVRQA PGKGLEWVAY 1S S DS S AIY Y A DT VK GR F'T1 S R DN AKNS LY LQMN S LR DE D T AV Y Y C GRGR ENIYYGSRLD YWGQGTTVTV SS

[00377] Polinucleotídeo Codificando hBRCA84D-2VH (SEQ ID NO:100) : gaggtgcagc tggtcgagtc tggcggagga ctggtgcagc ctggcggctc cctgagactg tcttgcgccg cctccggctt caccttctcc agcttcggca tgcactgggt ccgccaggct ccaggcaagg gactggaatg ggtggcctac atctcctccg actcctccgc catctactac gccgacaccg tgaagggcag gttcaccatc tcccgggaca acgccaagaa ctccctgtac ctgcagatga actccctgcg ggacgaggac accgccgtgt actactgcgg cagaggccgg gagaatatct actacggctc ccggctggat tattggggcc agggcaccac eg t ga c egt g t ec tet

[00378] hBRCA84D-3VH (SEQ ID Nθ:101): EVQL VE S GGG L VQ P G G S LRL S C AASG ∑'T ES S F'GMHW VRQ A PGKG LE WVAY ISSDSSAIYY ADTVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRDED TAMYYCGRGR ENIYYGSRLD YWGQGTJVTV SS

[00379] Polinucleotídeo Codificando hBRCA84D-3VH (SEQ ID NO:102) : gaggtgcagc tggtcgagtc tggcggagga ctggtgcagc ctggcggctccctgagactg tcttgcgccg cctccggctt caccttctcc agcttcggcatgcactgggt ccgccaggct ccaggcaagg gactggaatg ggtggcctacatctcctccg actcctccgc catctactac gccgacaccg tgaagggcaggttcaccatc tcccgggaca acgccaagaa ctccctgtac ctgcagatgaactccctgcg ggacgaggac accgccatgt actactgcgg cagaggccgggagaatatct actacggctc ccggctggat tattggggcc agggcaccaccgtgaccgtg tcctct

[00380] hBRCA84D-4VH (SEQ ID Nθ:103): E VQI. VP, 5 GGG LVQ PG G S LR L SC AA S G PT RS S FGMf 1WVRQ A PG KG LE WV A Y ISSDSSA1YY ADTVKGRE'TI SRDNAKNSLY LQMNSENSED TAVYYCARGR ENIYYGSRLD YWGQGTTVTV SS

[00381] Polinucleotídeo Codificando hBRCA84D-4VH (SEQ ID Nθ:104) : gaggtgcagc tggtcgagtc tggcggagga ctggtgcagc ctggcggctccctgagactg tcttgcgccg cctccggctt caccttctcc agcttcggcatgcactgggt ccgccaggct ccaggcaagg gactggaatg ggtggcctacatctcctccg actcctccgc catαtactac gccgacaccg tgaagggcaggttcaccatc tcccgggaca acgccaagaa ctccctgtac ctgcagatgaactccctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgcgc cagaggccgggagaatatct actacggctc ccggctggat tattggggcc agggcaccaccgtgaccgtg tcctct

[00382] A tabela 22 lista a cadeia leve variável hBRCA84D e mutações de cadeia pesada variáveis estudadas, os números se referem ao sistema de numeração de Kabat utilizado nas Figuras 11A e 11B.

[00383] As afinidades de ligação relativa dos derivados da cadeia leve hBRCA84D, hBRCA84D-3VL, hBRCA84D-4VL e hBRCA84D-5VL para B7-H3 de ser humano forame determinadas pela formação de anticorpos contendo essas regiões variáveis de cadeia leve e uma cadeia pesada BRCA84D-1VH quimérica (Figura 12). BRCA84D-5VL (K42Q, L46A) foi descoberta ter a mais alta afinidade de ligação do hBRCA84D-VL testado. BRCA84D-5VL foi desta maneira usado como a cadeia leve para investigar as afinidades de ligação relativas às cadeias pesadas hBRCA84D de hBRCA84D-1VH, hBRCA84D-2VH, hBRCA84D-3VH e hBRCA84D-4VH para B7-H3 de ser humano (Figura 13). Descobriu-se que hBRCA84D-2VH (A93G) tem a mais alta afinidade de ligação do hBRCA84D-VH testado.

[00384] O aminoácido e as sequências codificando polinucleotídeos de BRCA84D-1 quimérico são como a seguir:

[00385] Cadeia Leve chBRCA84D (SEQ ID NO:105): DTAMTQSOKF MSTSVGDRVS VTCKASQMVD TNVAWYQQKP GQSPKALIYS ASYRYSGVFD RFTGSGSGTD FTLTINNVQS EDLAEYFCQQ YNNYPFTFGS GTKLEIKRTV AAPSVFIFEE SDEQLKSGTA SWCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC

[00386] Polinucleotídeo Codificando Cadeia Leve chBRCA84D (SEQ ID NO:106): gacattgcga tgacccagtc tcaaaaattc atgtccacat cagtaggaga, cagggtcagc gtcacctgca aggccagtca gaatgtggat actaatgtag cctggtatca acagaaacca gggcaatctc ctaaagcact gatttactcg gcatcctacc ggtacagtgg agtccctgat cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcaacaa tgtgcagtct gaagacttgg cagagtattt ctgtcagcaa tataacaact atccattcac gttcggctcg gggacaaagt tggaaataaa acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag

[00387] Cadeia Pesada chBRCA84D (SEQ ID NO:107):L VOL VE S GGG LVQ PG G S RKL S C AASG FT t'S S FGMHWVROA PE KG LE WVAY IS SDSSA1YY ADTVKGRE"I11 SRDNP.:<NTL,F LQMTS LR.SED TAMY YCGRGR ENIY Y G S RAD YWGQGTTLT V SSASTKGP£V F PLAP $$KST SGGTAAL G CL VK DY FPE F VT V S HNS GA T ,TS GV FTP PAVLQ S S G I. Y S T.S SV VTV P S S S L GT QTYICFIVNHK PSNTKVDKFV EPKSCDKTHT CPPCPAPELL GGPSVELFPP KPKDTLMISR TPEVTCWVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GA

[00388] Polinucleotídeo Codificando Cadeia Pesada chBRCA84D (SEQ ID NO:108): gatgtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgcagc ctggagggtc ccggaaactc tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctttggaa tgcactgggt tcgtcaggct ccagagaagg ggctggagtg ggtcgcatac attagtagtg acagtagtgc catctactat gcagacacag tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atcccaagaa caccctgttc ctgcaaatga ccagtctaag gtctgaggac acggccatgt attactgtgg aagagggagg gaaaacattt actacggtag taggcttgac tactggggcc aaggcaccac t c t caca gt. c t cc t c a g c c t c c a c ca a gg g c c c ate ggt c 11 c c cc c t g g caccctcctc caagagcacc tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagagagtt gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt ÇÇtggtggac gtgagccacg aagacectga ggtcaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct

[00389] As afinidades de ligação relativas de anticorpos contendo: (1) hBRCA84D-2VL e hBRCA84D-2VH (dois testes), (2) BRCA84D quimérica, (3) anticorpo contendo hBRCA84D-5VL e BRCA84D-HC quimérico, e (4) anticorpo contendo hBRCA84D-5VL e hBRCA84D-2VH foram comparados. Os resultados são mostrados na Figura 14.

EXEMPLO 11 ANTICORPOS ANTI-B7-H3S HUMANIZADOS INIBEM O CRESCIMENTO DE TUMOR EM XENOENXERTOS

[00390] A fim de demonstrar a capacidade dos anticorpos anti-B7-H3 humanizados para inibir crescimento de tumor in vivo, o crescimento de tumor de células de carcinoma urinário de bexiga HT-1197 e de células de carcinoma renal A498 foi estudado em um xenoenxerto de murino. O anticorpo hBRCA84D-2 humanizado (cadeia VL hBRCA84D-2 / cadeia VL hBRCA84D-2) foi modificado para compreender uma região de Fc tendo substituições L235V, F243L, R292P, Y300L, e P396L. O Fc- modificado de anticorpo hBRCA84D-2 foi administrado para camundongos (em uma dose de 1 μg/kg, 10 μg/kg, ou 20 μg/kg) 7 dias, 14 dias, 21 dias e 28 dias depois do implante das células cancerosas. Os resultados mostram que em todas as doses o anticorpo hBRCA84D-2 Fc-modificado administrado foi capaz de inibir o crescimento do tumor de células de carcinoma urinário de bexiga HT-1197 (Figura 15) e de células A498 de carcinoma renal (Figura 16).

EXEMPLO 12 REAGENTES DE REDIRECIONAMENO DE AFINIDADE DUPLA (DARTTMS) ESPECÍFICOS PARA RECEPTOR B7-H3 E DE CÉLULA T MEDEIAM EXTERMÍNIO DE CÉLULA T REDIRECIONADA POTENTE

[00391] Os reagentes de redirecionamento de afinidade dupla (DARTTMs) específico para B7-H3 e o receptor de célula T- (“TCR”) e para o Grupo receptor de Células Exterminadoras Naturais 2D (NKG2D) foram preparadas. Tais DARTTMs têm a capacidade para localizar uma célula T (pela ligação de tal célula T para a porção de ligação de TCR de um DARTTM de ligação de TCR) ou localizar uma célula NK (por ligação de tal célula NK para a porção de ligação de NKG2D de um DARTTM de ligação de NKG2D) para o local de uma célula cancerosa (pela ligação de tal célula cancerosa à porção de ligação B7-H3- do DARTTM). A célula T ou célula NK localizadas podem depois mediar o exterminador da célula cancerosa em um processo denominado aqui exterminador “redirecionado”.

[00392] O reagente de redirecionamento de afinidade dupla (DARTTM) específico para B7-H3 e o receptor de célula T (“TCR”) foi considerado tendo os domínios variáveis de anti-B7-H3 de hBRCA84D-2 e domínios variáveis anti-TCR:

[00393] Cadeia DARTTM de bobina TCR VL x hBRCA84D VH-2-E (SEQ ID Nθ:109): ETVLTQSFAT LSLSPGERAT LSCSATSSVS YMHWYQQKPG KAPKRWIYDT SKLASGVFSR FSGSGSGTEF TLTISSLQPE DFATYYCQQW SSNPLTFGQG T K LEIKCGGS CGCGE VQLV E S G G G LVQ P G G S LRL S CA AS G FT FS S F'GMHW VRQAPGKGLE WVAYISSDSS AIYYADTVKG RFTISRDNAK NSLYLQMWSL RDE.DTAVYYC GRGRENIYYG SRLDYWGQGT TVTVSSGGCG GGEVAALEKE VAALEKZVAA LEKEVAALEK

[00394] Polinucleotídeo Codificando TCR VL x Cadeia de bobina hBRCA84D VH-2-E DART™ (SEQ ID NO:110): gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccaggggaaagagccacc ctctcctgca gtgccacctc aagtgtaagt tacatgcactggtatcagca gaaaccaggg aaagccccta agcgctggat ctatgacacatccaaactgg cttctggggt c^catcaagg ttcagcggca gtggatctgggacagaattt actctcacaa tcagcagcct gcagcctgaa gattttgcaacttattactg tcagcagtgg agtagtaacc cgctcacgtt tggccaggggaccaagcttg aqa"caaagg aggcggatcc ggcggcggag gcgaqgLqcagctggtcgag tctggcggag gactggtgca gcctggcggc tccctgagactgtcttgcgc cgcctccggc ttcaccttct ccagcttcgg catgcactgggtccgccagg ctccaggcaa gggactggaa tgggtggcct acatctcctccgactcctcc gccatctact acgccgacac cgtgaagggc aggttcaαcatcL cccgg g a caacgccaa g aact c c c t g t a c c tg ca g a t g a a c tccc t.gcgggacgagg acaccgccgt gtactactgc ggcagaggcc gggagaatatctactacggc tcccggctgg attattgggg ccagggcacc accgtgaccgtqtcctccqg aggat-gtggc gqtggagaag tcgccgcact ggag^a^xgagStt^ctcjctt t^gagaagga ct-tja-aaagr^cctcpgagaaa

[00395] Cadeia de bobina hBRCA84DVL-2 x TCR VH -K (SEQ ID NO:111) : DIQLTQSFSF LSASVGDRVT ITCKASQNVD TNVAWYQQKP GKAPKALIYS ASYRYSGVPS RPSGSGSGTD FTLTISSLQP EDEATYYCQQ YMNYPPTFGQ CTKLEIKOGfi SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYKFTSYVMH WVRQAPGQGL EwIGYIN PY N DVT K YNEK FK G RVTITA DKS T STAY L Q MNS LRSEDTAVHY CARGSYYDYD GEVYWGQGTL VTVSSgQCGC ÇKVAALKEKV AALKEKVAAL KEKVAAT.KE

[00396] Polinucleotídeo Codificando hBRCA84DVL-2 x Cadeia de bobina TCR VH - K (SEQ ID NO:112): gacatccagc tgacccagtc cccctccttc ctgtctgcct ccgtgggcga cagagtgacc atcacatgca aggcctccca gaacgtggac accaacgtgg cctggtatca gcagaagcct ggcaaggccc ctaaggcgct gatctactcc gcctcctacc ggtactccgg cgtgccttcc aggttctccg gctccggctc tggcaccgac ttcaccctga ccatctccag cctgcagcct gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag tacaacaact accctttcac cttcggccag ggcaccaagc tggaaatcaa gggaggcgga tccggcggcg gaggecaggt tcagctggtg cagtctggag ctgaggtgaa gaagcctggg gcctcagtga aggtctcctg caaggccagc ggttacaagt ttaccagcta cgtgatgcac tgggtgcgac aggcccctgg acaagggctt gagtggatcg gatatattaa tccttacaat gatgttacta agtacaatga gaagttcaaa ggcagagtca cgattaccge ggacaaatce acgagcacag cctacctgca gatgaacagc ctgagatccg aggacacggc cgtgcactac tgtgcgagag ggagctacta tgattacgac gggtttgttt actggggcca agggactctg gtcactgtga gctccggagg atgtggcggt gqaaaagtgg ccscactgaa gg^aaacj-.t Sctcjαtttcja aac_agaagg_t cgççgcactt aac^aaaagg tcgcacjccct

[00397] Um reagente de redirecionamento de afinidade dupla (DARTTM) específico para B7-H3 e o receptor do Grupo 2D de Exterminadores Naturais (NKG2D) foi considerado tendo os domínios variáveis anti-B7-H3 de hBRCA84D-2 e domínios variáveis anti-TCR:

[00398] Cadeia DARTTM de Bobina NKG2D VL x hBRCA84D VH-2-E (SEQ ID NO: 113) : QSALIQ PASV S GS P GQ SITI SCSGSSSMIG NMA V N WY QQ L PGKAPKLL1Y YDDLLPsGVs DRFSGSKSGT SAF'LAISGLQ SEUEADYYCA AWDDSLNGPV FGGGTKLTVL GGGSGGGGEV QLVESGGGLV QPGGSLRLSC AASGFTFSSF GM H WVRQ A PG KGLE W V AY T 5 S D5 5 AIYY AD T VK GE FT IS R DN A K l-151. Y 7 .Q MN S LRDEDTA V Y YCGRGREM IY Y G SR LDYW G QG TIVT V SS GGCGGGEVAA LEKEVAALEKE VAALEKEVA ALEK

[00399] Polinucleotídeo Codificando Cadeia DARTTM de Bobina NKG2D VL x hBRCA84D VH-2-E (SEQ ID NO: 114) : cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc aatcaccatc tcctgttctg gaagcagctc caacatcgga aataatgctg ttaactggta ccagcagctc ccaggaaagg ctcccaaact cctcatctat tatgatgacc tactgccctc aggggtctct gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagccttcc tggαcatcag tgggctccag tctgaggatg aggctgatta ttactgtgca gcatgggatg acagcctgaa tggtcriagtg ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta ggaggcggat ccggcggcgg aggcgaqgLq cagctggtcg agtαtggcgg aggactggtg cagcctggcg gctccctgag actgtcttgc gccgcctccg gcttcacctt ctccagcttc ggcatgcact gggtccgcca ggctccaggc aagggactgg aatgggtggc ctacatctcc tccgactcct ccgccatcta ctacgccgac accgtgaagg gcaggttcac catctcccgg gacaacgcca agaactccct gtacctgcag atgaactccc tgcgggacga ggacaccgcc gtgtactact gcggcagagg ccgggagaat atctactacg gctcccggct ggattattgg ggccagggca ccaccgtgac cgtgtcctcc ggaggatgtg gcggtggaga ac∑£cjccgca ctggagaaag ag^ttgctgc tttggacjaag cacttjaaaa Sc_g:ritggaiga. aa

[00400] Cadeia de bobina hBRCA84DVL-2 x NKG2D VH - K (SEQ ID NO: 115):

[00401] Polinucleotídeo Codificando Cadeia de bobina hBRCA84DVL-2 x NKG2D VH-K (SEQ ID NO: 116) : gacatccagc tgacccagtc cccctccttc ctgtctgcct ccgtgggcga cagagtgacc a t c acatgca aggcctccca gaacgtggac a c ca a cgtgg cctggtatca gcagaagcct ggcaaggccc ctaaggcgct gatctactcc gcctcctacc ggtactccgg cgtgccttcc aggtteteeg gctccggctc tggcaccgac ttcaccctga ccatctccag cctgcagcct gaggaetteg ccacctacta ctgccagcag tacaacaact accctttcac cttcggccag ggcaccaagc tggaaatcaa gggaggcgga tccggcggcg gaggccaggt acagctggtg gagtctgggg gaggcctggt caagcctgga gggtccctga gactctcctg tgcagcgtct ggattcacct tcagtagcta tggcatgcac tgggtccgcc aggctccagg caaggggctg gagtgggtgg catttatacg gtatgatgga agtaataaat actatgeaga ctccgtgaag ggccgattca ccatctccag agacaattcc aagaacacgc tgtatctgca aatgaacagc ctgagagctg aggacacggc tgtgtattac tgtgcgaaag atcgaggttt gggggatgga acctactttg aetactgggg ecaagggacc acggtcaccg cctcctccgg aggatgtggc ggtgga: iag tcgccgcact ^aaggagaaa gttgctgctt tgaaagagaa ggtcgccgca cttaaggaaa aggtcgcagc 2£tc|aaacjací

[00402] A fim de demonstrar a capacidade de DARTTMs para mediar tal extermínio redirecionado de células cancerosas, os acima descritos hBRCA84D-2 / anti-TCR DART™ (“T-DART™”), hBRCA84D-2, hBRCA84D-2 (Fc-modificado: L235V, F243L, R292P, Y300L, e P396L), e um controle de TCR-DARTTM foram incubados em várias concentrações com células cancerosas alvo (SK-MES-1 célula cancerosas de pulmão, A498 células de carcinoma renal, LNCaP células cancerosas de próstata, ou células de melanoma UACC-62) e efetor remanescente PBMC (E:T proporção = 30:1) e citotoxicidade foi determinada (Ensaio de LDH). Os resultados dessas investigações são mostrados nas Figuras 17A-17D e demonstram capacidade de hBRCA84D-2 / anti-TCR DART™ (“T-DARTTM”) para mediar extermínio redirecionado de células cancerosas.

EXEMPLO 13 PERFIL FARMACOCINÉTICO EM CAMUNONGOS SEM TUMOR

[00403] O anticorpo anti-B7-H3 (Mab1) foi injetado em camundongos machos mCD16-/-, hCD16A_FOXN1 (5 mg/kg; IV) e soro foi ensaiado (pré-dose e) em 2, 15, 30 min, e 1, 2, 4, 6 horas, e 1, 2, 3, 6, 8, 14, 21, e 28 dias depois da injeção. Descobriu-se que o anticorpo tem um T ^ de 10,54 dias e um de 43,493 μg/ml. A concentração de anticorpo durante o tempo foi descoberta ser bifásica, se ajustando em um modelo de dois componentes (Figuras 18A-18B). Os perfis farmacocinéticos previstos gerados usando um modelo de 2 compartimentos com parâmetros de 5 mg/kg de dose são mostrados na Figura 18C.

EXEMPLO 14 HABILIDADE DE ANTICORPO ANTI-B7-H3 DE SE UNIR ÀS CÉLULAS CANCEROSAS DE BEXIGA URINÁRIA HT-1197 E PREVENIR OU INIBIR O DESENVOLVIMENTO DO TUMOR EM UM MODELO DE XENOENXERTO DE MURINO

[00404] O anticorpo anti-B7-H3 (Mab1) descrito acima foi acessado por sua capacidade de ligar HT-1197, uma linha de carcinoma de bexiga urinária expressando B7-H3 de ser humano. Como mostrado na Figura 19, tais células exibem maior expressão de PRCA135 do que HER2, e dessa maneira são particularmente apropriados para acessar o potencial terapêutico dos anticorpos da presente invenção para remediar tumores HT-1197. De acordo com esta conclusão, variantes de anticorpo anti-B7-H3 hBRCA84D foram encontrados sendo capazes de ligação para células HT-1197. Figura 20 mostra a afinidade de ligação de anticorpos Mab1 para células HT-1197.

[00405] Camundongos (mCD16-/-, hCD16A+_FoxN1) foram implantados subcutaneamente em seus flancos com células 8 x 106 HT-1197. As células do tumor foram implantadas em 200 μl de Meio F12 de Ham diluído 1:1 com MATRIGEL™. Tratamento com Mab 1 foi iniciado dentro de 7 dias de implante através de iv Q7D x5 usando doses de 0.1, 0.5, 1, 5, ou 10 mg/kg (oito camundongos fêmeas por dose). Centuximabe (anticorpo anti-EGRF) foi administrado para um grupo de controle de camundongos em doses de 1, 5, ou 15 mg/kg (oito camundongos fêmeas por dose). Oito camundongos fêmeas foram também injetadas com veículo ou com controle de 10 mg/kg IgG. Medições de tumor foram feitas a cada 3-4 dias. Os resultados do experimento (Figura 21A) mostram que Mab 1 foi capaz de prevenir ou inibir o desenvolvimento de tumor de bexiga urinária em modelo de enxerto murino. Figura 21B mostra os resultados obtidos usando centimab. Uma comparação das figuras 21A e 21B demonstra que os anticorpos da presente invenção são mais eficazes do que centimab par prevenir ou inibir desenvolvimento de tumor de bexiga urinária mo modelo de xenoenxerto de murino. A figura 21C compara os resultados obtidos nas doses máximas testadas.

EXEMPLO 15 HABILIDADE DO ANTICORPO ANTI-B7-H3 DE SE UNIR ÀS CÉLULAS CANCEROSAS DE BEXIGA URINÁRIA HT-1376 E PREVENIR OU INIBIR O DESENVOLVIMENTO DE TUMOR EM UM MODELO DE XENOENXERTO DE MURINO

[00406] O anticorpo anti-B7-H3 (Mab1) descrito acima foi acessado por sua capacidade de ligar HT-1376, uma linha de célula de carcinoma de bexiga urinária B7-H3- humana. Como mostrado nas Figuras 22A-22B, tais células exibem maior expressão de PRCA135 do que HER2 ou PMSA, e dessa maneira são particularmente apropriados para acessar o potencial terapêutico dos anticorpos da presente invenção em remediar tumores HT-1376. De acordo com essa conclusão, descobriu-se que as variáveis de anticorpo anti-B7-H3 hBRCA84D são capazes de ligação às células HT-1197. Figuras 22A-22B mostram a afinidade de ligação de anticorpos Mab1 para células HT-1197.

[00407] Camundongos (mCD16-/-, hCD16A+_FoxN1) foram implantados subcutaneamente em seus flancos com células 5 x 106 HT-1376. As células do tumor foram implantadas em 200 μl de Meio F12 de Ham diluído 1:1 com MATRIGEL™. Tratamento com Mab 1 foi iniciado dentro de 7 dias de implante através de iv Q7D x4 em uma dose de 1 mg/kg. Os resultados do experimento (Figura 23) mostra que Mab1 foi capaz de prevenir ou inibir o desenvolvimento de tumor de bexiga urinária no modelo de xenoenxerto de murino.

EXEMPLO 16 HABILIDADE DO ANTICORPO ANTI-B7-H3 DE SE UNIR ÀS CÉLULAS CANCEROSAS

[00408] O anticorpo anti-B7-H3 BRCA84D foi acessado através de análise de FACS por sua capacidade para ligar: células cancerosas colorretais SW480 e SW620; células cancerosas gástricas AGS; melanoma de célula M-14 e LOX IMVI; células cancerosas de próstata 22rv; e células cancerosas pancreáticas AsPC-1 e BxPc-3; e células cancerosas renais A498 e 786-0. Descobriu-se que o anticorpo é capaz de se unir a todas as tais células.

EXEMPLO 17 HABILIDADE DO ANTICORPO ANTI-B7-H3 DE PREVENIR OU INIBIR O DESENVOLVIMENTO DE TUMOR GÁSTRICO EM UM MODELO DE XENOENXERTO DE MURINO

[00409] Os camundongos (mCD16-/-, hCD16A+_FoxN1) foram implantados subcutaneamente em seus flancos com 5 x 106 células AGS. As células do tumor foram implantadas em 200 μl de Meio F12 de Ham diluído 1:1 com MATRIGELTM. Tratamento com Mab1 foi iniciado dentro de 7 dias do implante através de iv Q7D x5 usando doses de 0,5, 1, 5, ou 10 mg/kg. Os resultados do experimento (Figura 24) mostraram que Mab1 foi capaz de prevenir ou inibir o desenvolvimento de tumor gástrico em um modelo de xenoenxerto de murino.

EXEMPLO 18 HABILIDADE DO ANTICORPO ANTI-B7-H3 DE SE UNIR ÀS CÉLULAS CANCEROSAS DE PULMÃO E PREVENIR OU INIBIR DESENVOLVIMENTO DE TUMOR EM UM MODELO DE XENOENXERTO DE MURINO

[00410] As células cancerosas de pulmão A549 foram incubadas na presença de variáveis de hBRCA84D, chBRCA84D e hBRCA84 (0264 Fc) e o efeito citotóxico desses anticorpos foi determinado. Os resultados desse experimento são mostrados na Figura 25, e indicam que todos os três dos anticorpos eram citotóxicos para as células A549.

[00411] Os camundongos (mCD16-/-, hCD16A+_FoxN1) foram implantados subcutaneamente em seus flancos com 8 x 106 células A549. As células do tumor foram implantadas em 200 μl de Meio F12 de Ham diluído 1:1 com MATRIGEL™. Tratamento com Mab1 foi iniciado dentro de 7 dias do implante através de iv Q7D x4 usando uma dose de 1 mg/kg. Os resultados do experimento (Figura 26) mostram que Mab1 foi capaz de prevenir ou inibir o desenvolvimento do tumor canceroso de pulmão no modelo de xenoenxerto de murino.

[00412] Análise de FACS foi conduzida em células cancerosas de pulmão CaLu3 a fim de determinar se tais células ligam anticorpo anti-B7-H3s. O experimento confirmou que tais células expressam B7-H3 e se unem aos anticorpos da presente invenção. Para determinar se os anticorpos da presente invenção foram eficazes para prevenir ou inibir desenvolvimento de tumor de câncer de pulmão, camundongos (mCD16-/-, hCD16A+_FoxN1) foram implantados subcutaneamente em seus flancos com 5 x 106 de células CaLu3. As células do tumor foram implantadas em 200 μl de Meio F12 de Ham diluído 1:1 com MATRIGELTM. Tratamento com Mab1 foi iniciado dentro de 7 dias de implante via iv Q7D x4 usando uma dose de 0,5, 1, ou 5 mg/kg. Os resultados do experimento (Figura 27) mostram que Mab1 foi capaz de prevenir ou inibir o desenvolvimento de tumor de câncer de pulmão no modelo de xenoenxerto de murino.

EXEMPLO 19 HABILIDADE DO ANTICORPO ANTI-B7-H3 PARA PREVENIR OU INIBIR O DESENVOLVIMENTO DE TUMOR DE MELANOMA LOX EM UM MODELO DE XENOENXERTO DE MURINO

[00413] Os camundongos (oito fêmeas mCD16-/-, hCD16A+_FoxN1) foram implantados subcutaneamente em seus flancos com células cancerosas de melanoma LOX-IMVI e depois inoculados com iv/Q7D x3 com controle de PBS, controle de IgG (5/mg/kg), Mab1 (0,5, 1, 5 ou 10 mg/kg), ou ip/BIWx2 com Doxetaxel (5, 10 ou 20 mg/kg). As células do tumor foram implantadas em 200 μl de Meio F12 de Ham diluído 1:1 com MATRIGEL™. Tratamento com Mab1 foi iniciado dentro de 7 dias do implante. Os resultados do experimento (Figuras 28A-28C) mostram que Mab1 foi capaz de prevenir ou inibir o desenvolvimento do tumor de câncer de melanoma em modelo de xenoenxerto de murino.

EXEMPLO 20 HABILIDADE DO ANTICORPO ANTI-B7-H3 PARA PREVENIR OU INIBIR O DESENVOLVIMENTO DE TUMOR DE MELANOMA UACC-62 EM UM MODELO DE XENOENXERTO DE MURINO

[00414] Os camundongos (oito fêmeas mCD16-/-, hCD16A+_FoxN1) foram implantados subcutaneamente em seus flancos com células cancerosas de melanoma UACC-62 e depois inoculados iv/Q7D x5 com controle PBS, controle IgG (5/mg/kg) ou Mab1 (0,5, 1, 5 ou 10 mg/kg). As células do tumor foram implantadas em 200 μl de Meio F12 de Ham diluído 1:1 com MATRIGEL™. Tratamento com Mab1 foi iniciado dentro de 7 dias do implante. Os resultados do experimento (Figura 29) mostram que Mab1 foi capaz de prevenir ou inibir o desenvolvimento de tumor de câncer de próstata no modelo de xenoenxerto de murino.

EXEMPLO 21 HABILIDADE DO ANTICORPO ANTI-B7-H3 DE PREVENIR OU INIBIR O DESENVOLVIMENTO DE TUMOR DE PRÓSTATA 22RV EM UM MODELO DE XENOENXERTO DE MURINO

[00415] Os camundongos (mCD16-/-, hCD16A+_FoxN1) foram implantados subcutaneamente em seus flancos com 6 x 106 22rv de células cancerosas de próstata e depois inoculados iv/Q7D x4 com controle PBS, IgG (10 mg/kg), Mab1 (0,5, 1, 5, ou 10 mg/kg; Q7D x5) ou Trastuzumabe (1,7 ou 15 mg/kg). As células do tumor foram implantadas em 200 μl De Meio F12 de Ham diluído 1:1 com MATRIGELTM. Tratamento com Mab1 foi iniciado dentro de 7 dias do implante. Os resultados do experimento (Figuras 30A-30C) mostram que Mab1 foi capaz de prevenir ou inibir o desenvolvimento de tumor de câncer de próstata no modelo de xenoenxerto de murino.

EXEMPLO 22 HABILIDADE DO ANTICORPO ANTI-B7-H3 DE SE UNIR ÀS CÉLULAS CANCEROSAS RENAIS E PREVENIR OU INIBIR O DESENVOLVIMENTO DE TUMOR EM UM MODELO DE XENOENXERTO DE MURINO

[00416] As células cancerosas renais A498 foram incubadas na presença das variantes hBRCA84D, chBRCA84D e hBRCA84 (0264 Fc) e o efeito citotóxico desses anticorpos foi determinado. Os resultados desse experimento são mostrados na Figura 31, e indicam que todos os três dos anticorpos eram citotóxicos para células A498.

[00417] As células cancerosas renais A498 foram incubadas na presença das variantes hBRCA84D, chBRCA84D e hBRCA84 (0264 Fc) e o efeito citotóxico desses anticorpos foi determinado. Os resultados desse experimento são mostrados na Figura 31, e indicam que todos os três dos anticorpos eram citotóxicos para as células A498.

[00418] A análise de IHC do tecido de tumor de enxerto A498 foi conduzida usando anticorpo BRCA84D biotinilado (20 μg/ml), BRCA69D (5 μg/ml) e anticorpo anti- Her2 (20 μg/ml). Descobriu-se que o anticorpo BRCA84D se une em 20 a 40% do tecido do tumor (semanalmente ou moderadamente: + ou ++); descobriui-se que BRCA69D se une em 80 a 100% do tecido do tumor (moderadamente para fortemente: ++ ou +++). Descobriu-se que o anticorpo BRCA84D se une fracamente em 40% do tecido do tumor UMUC-3 (+); descobriu-se que BRCA69D moderadamente ou fortemente se une em 70% de cada tecido de tumor (++ ou +++); descobriu-se que o anticorpo anti-Her2 variavelmente se une em 20% de tal tecido de tumor (+ -+++). Como controles, descobriu-se que o anticorpo anti- Her2 se une às células SKBR-3 (+++) e descobriu-se que BRCA84D e BRCA69D são capazes de se unir às células Hs 700T (+++)

[00419] Os camundongos (mCD16-/-, hCD16A+_FoxN1) foram implantados subcutaneamente em seus flancos com 5 x 106 de células cancerosas renais A498. As células de tumor foram implantadas em 200 μl de Meio F12 de Ham diluído 1:1 com MATRIGELTM. Tratamento com Mab1 foi iniciado dentro de 7 dias de implante através de iv Q7D x5 usando doses de 0,1, 0,5, 1, 5, ou 10 mg/kg. Centuximabe (anticorpo anti-EGRF) foi administrado para um grupo de controle de camundongos em doses de 1, 7, ou 15 mg/kg. Os camundongos de controle adicional foram injetados com veículo ou com 10 mg/kg de controle de IgG. Os resultados do experimento (Figura 32) mostram que Mab1 foi capaz de prevenir ou inibir o desenvolvimento de tumor de câncer renal no modelo de xenoenxerto de murino.

[00420] Os camundongos (mCD16-/-, hCD16A+_FoxN1) foram alternativamente implantados subcutaneamente em seus flancos com 5 x 106 de células cancerosas renais 786-0. As células do tumor foram implantadas em 200 μl do Meio F12 de Ham diluído 1:1 com MATRIGELTM. Tratamento com Mab1 foi iniciado dentro de 7 dias do implante através de iv Q7D x5 usando doses de 0,1, 0,5, 1, 5, ou 10 mg/kg. Centuximabe (anticorpo anti-EGRF) foi administrado para um grupo de controle de camundongos em doses de 1, 7, ou 15 mg/kg.Camundongos de controle adicional foram injetados com veículo ou com 10 mg/kg de controle IgG. Os resultados do experimento (Figuras 33A-33B) mostram que Mab1 foi capaz de prevenir ou inibir o desenvolvimento de tumor de câncer renal no modelo de xenoenxerto de murino.

[00421] A atividade de Mab1 foi comparada com aquela de paclitaxel, um inibidor mitótico usado em quimioterapia de câncer. Grupos de oito camundongos fêmeas (mCD16-/-, hCD16A+_FoxN1) foram implantados subcutaneamente em seus flancos com 786-0 de células cancerosas renais e depois providos com Mab1 através de iv Q7D em doses de 0.1, 0.5, 1, 5, ou 10 mg/kg. Paclitaxel foi administrado para um grupo de controle de oito dos tais camundongos em uma dose de 2,5 mg/kg nos dias 21, 28, e 35 de estudo. Camundongos de controle adicional (sete fêmeas por grupo) foram injetados com veículo ou com 5 mg/kg de controle IgG. Os resultados do experimento (Figura 34) mostra que Mab 1 foi capaz de prevenir ou inibir o desenvolvimento de tumor de câncer renal no modelo de xenoenxerto de murino.

EXEMPLO 23 ESTUDO DE TOXICOLOGIA DE MACACOS CINOMÓLOGOS

[00422] Um estudo de toxicologia de macacos cinomólogos é conduzido a fim de acessar perfil de toxicologia aguda depois de uma única dose de Mab1, determina o perfil farmacocinético para Mab1, estabelece um relacionamento de tempo vs. dose para indução de citocinas associadas com ativação de célula efetora, e acessar o efeito do tratamento do fármaco no nível dos leucócitos circulando (por exemplo, NK e células T-).

[00423] Tal estudo pode ser projetado para envolve quatro grupos de 6 macacos (3 machos e 3 fêmeas) e para estender 7 semanas a partir do tratamento inicial para a necropsia final. O Grupo 1 compreenderia um grupo de controle que receberia somente veículo para as semanas 1 e 2. Quatro membros do Grupo 1 (dois machos e duas fêmeas) seriam sacrificados na semana 3. Os membros remanescentes do Grupo 1 receberiam veículo adicional na semana 3 e seriam sacrificados para necropsia na semana 7. Grupos 2-4 são grupo experimentais que receberiam veículo na semana 1, e anticorpo B7-H3 (1, 30, ou 100 mg/kg, respectivamente) na semana 2. Quatro membros de cada Grupo (dois machos e duas fêmeas) seriam sacrificados na semana 3. Os membros remanescentes de cada Grupo receberiam veículo adicional na semana 3 e seriam sacrificados para necropsia na semana 7.

[00424] Todas as infusões são bem toleradas e nenhuma mortalidade ou mudanças significativas em peso corporal, sinais clínicos ou química de soro são observados. Reduções dependentes de doses em células NK circulando, mas não circulando células B e T- são observadas.

[00425] O estudo provê verificação de macaco cinomólogo como uma espécie toxicológica relevante. Quando contatado com tecido de ser humano normal, o anticorpo BRCA84D mostrou vários graus de intensidade de coloração no fígado, pâncreas, cólon, pulmão e córtex adrenal. Coloração de fígado foi relativamente restrito às células de revestimento sinusoidais (fibroblasto e células kupffer). A coloração de pâncreas foi observada principalmente na fibra de colágeno e uma pequena percentagem do epitélio (células acinar e/ou células de duto intercaladas). A coloração do cólon foi relativamente restrita na membrana apical do epitélio cripto e fibroblasto na mucosa. O pulmão mostrou coloração muito fraca e desigual no epitélio. BRCA84D mostrou boa reatividade cruzada nos tecidos de macacos cinomólogos em comparação ao perfil de tecido de ser humano com a exceção da falta de coloração no fígado e pâncreas, e possível expressão de B7-H3 nas células pituitárias de macacos cinomólogos.

[00426] Todas as publicações e patentes mencionadas nesse relatório descritivo são aqui incorporadas por referência quanto à mesma extensão como se cada publicação individual ou pedido de patente fosse especificamente e individualmente indicado para ser incorporado por referência em sua totalidade. Embora a invenção tenha sido descrita em conexão com realizações específicas da mesma, será compreendido que ela é capaz de modificações adicionais e este pedido é destinado a cobrir quaisquer variações, usos, ou adaptações da invenção seguindo, em geral, os princípios da invenção e incluindo tais desvios da presente descrição como venha dentro da prática habitual conhecida dentro da técnica a qual a invenção pertence e como pode ser aplicado às características essenciais daqui em diante estabelecidas.

Claims (24)

1. ANTICORPO ISOLADO OU SEU FRAGMENTO IMUNORREATIVO, caracterizado pelo dito anticorpo isolado ou o dito fragmento compreender um domínio variável que especificamente se liga a um domínio extracelular de B7-H3, em que o dito anticorpo ou o dito fragmento do mesmo compreende:(A) um domínio variável de cadeia leve que compreende CDR1 (SEQ ID NO: 21), CDR2 (SEQ ID NO: 23) e CDR3 (SEQ ID NO: 25), e um domínio variável de cadeia pesada que compreende CDR1 (SEQ ID NO: 29), CDR2 (SEQ ID NO: 31) e CDR3 (SEQ ID NO: 33); ou(B) um domínio variável de cadeia leve que compreende CDR1 (SEQ ID NO: 5), CDR2 (SEQ ID NO: 7) e CDR3 (SEQ ID NO: 9) e um domínio variável de cadeia pesada que compreende CDR1 (SEQ ID NO: 13), CDR2 (SEQ ID NO: 15) e CDR3 (SEQ ID NO: 17); ou(C) um domínio variável de cadeia leve que compreende CDR1 (SEQ ID NO: 37), CDR2 (SEQ ID NO: 39) e CDR3 (SEQ ID NO: 41) e um domínio variável de cadeia pesada que compreende CDR1 (SEQ ID NO: 45), CDR2 (SEQ ID NO: 47) e CDR3 (SEQ ID NO: 49).

2. ANTICORPO ISOLADO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo referido anticorpo ou seu fragmento compreender o referido domínio variável de cadeia leve que compreende CDR1 (SEQ ID NO: 21), CDR2 (SEQ ID NO: 23) e CDR3 (SEQ ID NO: 25), e o referido domínio variável de cadeia pesada que compreende CDR1 (SEQ ID NO: 29), CDR2 (SEQ ID NO: 31) e CDR3 (SEQ ID NO: 33).

3. ANTICORPO ISOLADO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo referido anticorpo ou seu fragmento compreender o referido domínio variável de cadeia leve que compreende CDR1 (SEQ ID NO: 5), CDR2 (SEQ ID NO: 7) e CDR3 (SEQ ID NO: 9), e o referido domínio variável de cadeia pesada que compreende CDR1 (SEQ ID NO: 13), CDR2 (SEQ ID NO: 15) e CDR3 (SEQ ID NO: 17).

4. ANTICORPO ISOLADO, de acordo com a reivindicação1, caracterizado pelo referido anticorpo ou seu fragmento compreender o referido domínio variável de cadeia leve que compreende CDR1 (SEQ ID NO: 37), CDR2 (SEQ ID NO: 39) e CDR3 (SEQ ID NO: 41), e o referido domínio variável de cadeia pesada que compreende CDR1 (SEQ ID NO: 45), CDR2 (SEQ ID NO: 47) e CDR3 (SEQ ID NO: 49).

5. ANTICORPO ISOLADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por se ligar a B7-H3 que é expresso endogenamente na superfície de uma célula cancerosa.

6. ANTICORPO ISOLADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo referido anticorpo ou seu fragmento ser internalizado após a ligação ao referido B7-H3 expresso na superfície da referida célula cancerosa.

7. ANTICORPO ISOLADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo dito anticorpo compreender uma região variante de Fc IgG1 humana, em que a dita região variante de Fc IgG1 humano compreende pelo menos umamodificação(ões) do aminoácido com relação a uma região de Fc tipo selvagem, a(s) dita(s) modificação(ões) de aminoácido compreendendo modificação(ões) de aminoácido que altera(m) a afinidade ou avidez da dita região variante de Fc para ligar a um FCYR de modo que o dito anticorpo exiba função efetora aumentada com relação a dita região de Fc tipo selvagem.

8. ANTICORPO ISOLADO, de acordo com a reivindicação7, caracterizado pela dita modificação da região de Fc compreender:(A) pelo menos uma substituição do grupo consistindo em:(1) F243L;(2) D270E;(3) R292P;(4) S298N;(5) Y300L;(6) V305I;(7) A330V; e(8) P396L;(B) pelo menos uma substituição de dois resíduos de aminoácido, as ditas substituições sendo selecionadas do grupo consistindo em:(1) F243L e P396L;(2) F243L e R292P; e(3) R292P e V305I;(C) pelo menos uma substituição de três resíduos deaminoácido, as ditas substituições sendo selecionadas do grupo consistindo em:(1) F243L, R292P e Y300L;(2) F243L, R292P e V305I;(3) F243L, R292P e P396L; e(4) R292P, V305I e P396L;(D) pelo menos uma substituição de quatro resíduosde aminoácido, as ditas substituições sendo selecionadas do grupo consistindo em:(1) F243L, R292P, Y300L e P396L; e(2) F243L, R292P, V305I e P396L; ou(E) uma substituição de pelo menos cinco resíduos de aminoácido: F243L, R292P, Y300L, V305I e P396L;em que a dita numeração é de acordo com o esquema de numeração de Kabat.

9. ANTICORPO ISOLADO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo dito anticorpo compreender as substituições de:(A) F243L, R292P, e Y300L;(B) L235V, F243L, R292P, Y300L, e P396L; ou(C) F243L, R292P, Y300L, V305I, e P396L;em que a dita numeração é de acordo com o esquema de numeração de Kabat.

10. ANTICORPO ISOLADO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo referido anticorpo compreender substituições de: L235V, F243L, R292P, Y300L e P396L, em que a referida numeração está de acordo com o esquema de numeração de Kabat.

11. ANTICORPO ISOLADO, de acordo com areivindicação 9, caracterizado pelo dito anticorpocompreender:(A) um domínio variável de cadeia leve quecompreende CDR1 (SEQ ID NO: 5), CDR2 (SEQ ID NO: 7) e CDR3(SEQ ID NO: 9) e um domínio variável de cadeia pesada quecompreende CDR1 (SEQ ID NO: 13), CDR2 (SEQ ID NO: 15) e CDR3(SEQ ID NO: 17); e(B) uma modificação da região de Fc que compreende as substituições: L235V, F243L, R292P, Y300L, e P396L;em que a numeração é de acordo com o esquema de numeração de Kabat.

12. ANTICORPO ISOLADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo dito anticorpo ser um anticorpo quimérico.

13. ANTICORPO ISOLADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo dito anticorpo ser um anticorpo humanizado.

14. ANTICORPO ISOLADO OU SEU FRAGMENTO IMUNORREATIVO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo dito anticorpo compreender:(A) um domínio variável de cadeia leve tendo a sequência de aminoácido SEQ ID NO: 89;(B) um domínio variável de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácido SEQ ID NO: 99; e(C) uma região de FC tendo as substituições: L235V, F243L, R292P, Y300L, e P396L;em que a numeração é de acordo com o esquema de numeração de Kabat.

15. ANTICORPO ISOLADO OU SEU FRAGMENTO IMUNORREATIVO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo referido anticorpo ou seu fragmento se ligar a B7 H3 que é expresso por uma célula cancerosa, e em que a referida célula cancerosa é selecionada a partir do grupo que consiste em um célula de um câncer de bexiga, um câncer cervical, um câncer de cólon, um câncer colorretal, um câncer gástrico, um câncer de fígado, um câncer de pulmão, um câncer de ovário, um câncer pancreático, um câncer de próstata, um câncer de rim, um câncer de mama, um câncer de cabeça e pescoço, um câncer de pele, um sarcoma, um tumor cerebral, um câncer do cérebro e da medula espinhal, um câncer adrenal, um câncer uterino, um neuroblastoma, um pequeno tumor de células redondas, um tumor da bainha do nervo periférico, um câncer ósseo, um tumor rabdóide, um linfoma, um mieloma múltiplo, uma leucemia, um tumor neuroendócrino e um melanoma.

16. MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO, caracterizada por codificar o anticorpo isolado, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15, ou o fragmento imunorreativo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.

17. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreender (i) uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo isolado ou do fragmento imunorreativo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15, e (ii) um veículo farmaceuticamente aceitável.

18. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada por compreender adicionalmente um agente anticancerígeno.

19. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo dito agente anticancerígeno ser um agente quimioterapêutico, um agente terapêutico de radiação, um agente terapêutico hormonal, uma toxina ou um agente imunoterapêutico.

20. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo dito agente anticancerígeno ser uma toxina selecionada do grupo consistindo em: um taxano, um maitansinoide, uma auristatina, uma caliqueamicina, um antraciclina, um análogo CC-1065, docetaxel, uma catepsina, ricina, gelonina, exotoxina PSEUDOMONAS, toxina de difteria, RNase e um radioisótopo tóxico.

21. USO DO ANTICORPO ISOLADO ou do fragmento imunorreativo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15, ou da composição farmacêutica, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 17 a 20, em um método EX VIVO de diagnóstico de câncer, caracterizado pelo dito anticorpo isolado, dito fragmento imunorreativo ou dito diacorpo ser detectavelmente marcado.

22. USO, acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo dito câncer ser selecionado do grupo consistindo em um tumor da glândula adrenal, um câncer associado à AIDS, um sarcoma alveolar de partes moles, um tumor astrocítico, câncer de bexiga, câncer ósseo, câncer cerebral ou da medula espinhal, um tumor cerebral metastático, um câncer de mama, tumores corporais carotídeos, um câncer cervical, um condrossarcoma, um cordoma, um carcinoma de célula renal cromófobo, um carcinoma de célula clara, um câncer de colo, um câncer colorretal, um tumor desmoplásico de pequena célula redonda, um ependinoma, um tumor de Ewing, um condrossarcoma mixóide extraesquelético, um câncer da vesícula biliar ou do duto biliar, câncer gástrico, uma doença trofoblásica gestacional, um tumor de célula germinativa, um câncer de cabeça e pescoço, carcinoma hepatocelular, um tumor de célula da ilhota, um Sarcoma de Kaposi, um câncer de rins, uma leucemia, um lipossarcoma/tumor lipomatoso maligno, um câncer de fígado, um linfoma, um câncer pulmonar, um meduloblastoma, um melanoma, um meningioma, uma neoplasia endócrina múltipla, um mieloma múltiplo, uma síndrome mielodisplásica, um neuroblastoma, tumores neuroendócrinos, um câncer de ovário, um câncer pancreático, um carcinoma papilar da tireóide, um tumor da paratireóide, um câncer pediátrico, um tumor da bainha do nervo periférico, um feocromocitoma, um tumor pituitário, um câncer de próstata, um melanoma uveal posterior, um câncer metastático renal, um tumor rabdóide, um rabdomiossarcoma, um sarcoma, um câncer de pele, um sarcoma de tecido mole, um câncer de célula escamosa, um câncer de estômago, um sarcoma sinovial, um câncer testicular, um carcinoma tímico, um timoma, um câncer metastático da tireóide e um câncer uterino.

23. USO DO ANTICORPO ISOLADO ou do fragmento imunorreativo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15, ou da composição farmacêutica, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 17 a 20, caracterizado por ser na preparação de um medicamento para o tratamento de câncer em um paciente.

24. USO, de acordo com a reivindicação 23,caracterizado pelo dito câncer ser selecionado do grupoconsistindo em um tumor da glândula adrenal, um câncerassociado à AIDS, um sarcoma alveolar de partes moles, um tumor astrocítico, câncer de bexiga, câncer ósseo, câncercerebral ou da medula espinhal, um tumor cerebral metastático, um câncer de mama, tumores corporais carotídeos, um câncer cervical, um condrossarcoma, um cordoma, um carcinoma de célula renal cromófoba, um carcinoma de célula clara, um câncer de colo, um câncer colorretal, um tumor desmoplásico de pequena célula redonda, um ependinoma, um tumor de Ewing, um condrossarcoma mixóide extraesquelético, um câncer da vesícula biliar ou do duto biliar, câncer gástrico, uma doença trofoblásica gestacional, um tumor de célula germinativa, um câncer de cabeça e pescoço, carcinoma hepatocelular, um tumor de célula da ilhota, um Sarcoma de Kaposi, um câncer de rins, uma leucemia, um lipossarcoma/tumor lipomatoso maligno, um câncer de fígado, um linfoma, um câncer pulmonar, um meduloblastoma, um melanoma, um meningioma, uma neoplasia endócrina múltipla, um mieloma múltiplo, uma síndrome mielodisplásica, um neuroblastoma, tumores neuroendócrinos, um câncer de ovário, um câncer pancreático, um carcinoma papilar da tireóide, um tumor da paratireóide, um câncer pediátrico, um tumor da bainha do nervo periférico, um feocromocitoma, um tumor pituitário, um câncer de próstata, um melanoma uveal posterior, um câncer metastático renal, um tumor rabdóide, um rabdomiossarcoma, um sarcoma, um câncer de pele, um sarcoma de tecido mole, um câncer de célula escamosa, um câncer de estômago, um sarcoma sinovial, um câncer testicular, um carcinoma tímico, um timoma, um câncer metastático da tireóide e um câncer uterino.

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