KR20130010117A - Ｂ７―ｈ３에 반응성인 항체, 면역학적으로 활성인 이들의 단편 및 이들의 사용법 - Google Patents

Ｂ７―ｈ３에 반응성인 항체, 면역학적으로 활성인 이들의 단편 및 이들의 사용법 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 특히 함 및 염증의 치료에서, 포유 동물, 및 더 특히, 이들의 사람 B7-H3 수용체에 대해 면역 반응성인 항체 및 그들의 단편과 관련된다. 따라서 본 발명은 특히 다양한 사람의 암과 연관된 암 세포에 대한 면역계의 활성화를 매개할 수 있는, 및 더 바람직하게 향상시킬 수 있는, 사람화된 B7-H3 반응성 항체 및 그들의 면역 반응성 단편에 영향을 미친다.

Description

Ｂ７―Ｈ３에 반응성인 항체, 면역학적으로 활성인 이들의 단편 및 이들의 사용법{ANTIBODIES REACTIVE WITH B7-H3, IMMUNOLOGICALLY ACTIVE FRAGMENTS THEREOF AND USES THEREOF}
관련된 출원에 대한 교차-참조:
본 출원은 미국 특허 출원 일련번호 61/310, 692 (2010년 3월 4일에 출원됨; 미결); 61/310, 695 (2010년 3월 4일에 출원됨; 미결); 61/311, 057 (2010년 3월 5일에 출원됨; 미결)의 우선권을 주장하며, 각각의 출원은 전체 내용이 본원에 참고로 포함된다.
서열 목록에 대한 참고 문헌:
본 출원은 37 C.F.R.1.821 이하 참조에 의한 하나 이상의 서열 목록을 포함하는데, 이것은 서면 및 컴퓨터로 읽을 수 있는 매체에 둘 다 개시되고, 이 서면 및 컴퓨터로 읽을 수 있는 개시는 전체 내용이 본원에 참고로 포함되다.
본 발명의 기술 분야:
본 발명은 포유동물, 더 특이적으로, 사람 B7-H3 수용체에 면역 반응성인 항체 및 그들의 단편 및 이들의 사용, 특히 암 및 염증의 치료와 관련된다. 따라서 본 발명은 특히 다양한 사람 암과 연관된 암 세포에 대한 면역계의 활성화를 매개하고 더 바람직하게 향상시킬 수 있는 사람화된 B7-H3-반응성 항체 및 그들의 면역 반응성 단편과 관련된다.
종양의 성장 및 전이는 숙주 면역 감시를 피하고 숙주 방어를 극복하는 그들의 능력의 큰 정도에 따라 다르다. 대부분 종양은 숙주 면역계에 의해 가변적인 정도로 인식될 수 있는 종양을 발현하지만, 많은 경우에서, 효과기 T 세포의 효과적이지 못한 활성화 때문에 불충분한 면역 반응이 일어난다 (Khawli, L.A. et al. (2008) "Cytokine, Chemokine, and Co-Stimulatory Fusion Proteins for the Immunotherapy of Solid Tumors" Exper. Pharmacol. 181: 291-328).
CD4+ T-림프 세포는 대부분 포유동물 면역 및 자동면역 반응의 본질적인 형성체이다 (Dong, C. et al. (2003) "Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules " Immunolog. Res. 28(l): 39-48). CD4+ 헬퍼 T- 세포의 활성화는 항원 제시 세포 및 원래의 CD4+ T-림프 세포 사이의 동시-자극 상호작용을 통해 매개된다는 것이 알려져 있다. 두 개의 상호작용이 필요하다 (Viglietta, V. et al. (2007) "Modulating Co-Stimulation " Neurotherapeutics 4: 666-675; Korman, A.J. et al. (2007) "Checkpoint Blockade in Cancer Immunotherapy " Adv. Immunol. 90: 297-339). 첫 번째 상호작용에서, 항원 제시 세포는 원래의 CCD4+ T-림프 세포의 T- 세포 수용체 ("TCR")와의 결합할 수 있도록 세포의 주요 조직적합성 복합체와의 결합된 표적 항원을 나타내야 한다. 두 번째 상호작용에서, 항원 제시 세포의 리간드는 CD4+ T-림프 세포의 CD28 수용체와의 결합해야 한다 (Dong, C. et al. (2003) "Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules" Immunolog. Res. 28(l): 39-48; Lindley, P.S. et al. (2009) "The Clinical Utility Of Inhibiting CD28-Mediated Costimulation" Immunol. Rev. 229: 307-321). 두 개의 자극 시그널을 모두 경험한 CD4+ 헬퍼 T- 세포는 Th1 세포로 개발되기 위해 시토킨 (인터루킨-2 및 인터루킨-12와 같은)과 반응할 수 있다. 이러한 세포는 인터페론 감마 (IFN-γ) 및 표적 항원을 발현하는 표적 세포와 염증 반응을 매개하는, 종양 괴사 인자-알파 (TNF-a)를 생산한다. B- 세포 활성화 및 분화 또한 일어나는데, 표적 항원에 특이적인 항체 생산으로 이어진다 (Bernard, A. et al. (2005) "T and B Cell Cooperation: A Dance of Life and Death " Transplantation 79: S8-S11). TCR 자극 중에 동시-자극 시그널이 없으면, T 세포는 기능적으로 반응하지 않는 상태로 들어가고, 클론 무반응 (clonal anergy)로 나타난다 (Khawli, L.A. et al. (2008) "Cytokine, Chemokine, and Co-Stimulatory Fusion Proteins for the Immunotherapy of Solid Tumors" Exper. Pharmacol. 181: 291-328). 병리학적 상태에서, Thl 세포는 타입 I 당뇨병, 류마티스성 관절염, 및 다양한 경화증과 같은 다양한 기관-특이적 자동면역 질환의 키플레이어이다 (Dong, C. et al. (2003) "Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules" Immunolog. Res. 28(l): 39-48).
I. B7 상과 및 B7-H3
CD28 수용체의 리간드에 대한 조사는 B7 상과로 알려진 관련된 분자 세트의 특징으로 이어진다 (Coyle, A.J. et al. (2001) "The Expanding B7 Superfamily: Increasing Complexity In Costimulatory Signals Regulating T Cell Function" Nature Immunol. 2(3): 203-209; Sharpe, A.H. et al. (2002) "The B7-CD28 Superfamily " Nature Rev. Immunol. 2: 116-126; Greenwald, R.J. et al. (2005) "The B 7 Family Revisited" Ann. Rev. Immunol. 23: 515-548; Collins, M. et al. (2005) "The B 7 Family Of Immune-Regulatory Ligands" Genome Biol. 6: 223.1-223.7; Loke, P. et al. (2004) "Emerging Mechanisms Of Immune Regulation: The Extended B7 Family and Regulatory T Cells." Arthritis Res. Ther. 6: 208-214; Korman, A.J. et al. (2007) "Checkpoint Blockade in Cancer Immunotherapy" Adv. Immunol. 90: 297-339; Flies, D.B. et al. (2007) "The New B7s: Playing a Pivotal Role in Tumor Immunity" J. Immunother. 30(3): 251-260; Agarwal, A. et al. (2008) "The Role Of Positive Costimulatory Molecules In Transplantation and Tolerance " Curr. Opin. Organ Transplant. 13: 366-372; Lenschow, D.J. et al. (1996) "CD28/B7 System of T Cell Costimulation " Ann. Rev. Immunol. 14: 233-258; Wang, S. et al. (2004) "Co-Signaling Molecules Of The B7-CD28 Family In Positive and Negative Regulation Of T Lymphocyte Responses" Microbes Infect. 6: 759-766). 현재 과의 7 가지의 알려진 멤버가 있다: B7.1 (CD80), B7.2 (CD86), 유발 가능한 동시-자극기 리간드 (ICOS-L), 프로그램된 사망-1 리간드 (PD-L1), 프로그램된 사망-2 리간드 (PD-L2), B7-H3 and B7-H4 (Collins, M. et al. (2005) "The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands" Genome Biol. 6: 223.1-223.7).
B7 과 멤버는 면역글로불린-V-유사 and an 면역글로불린-C-유사 도메인 (예를 들어, IgV-IgC)를 갖는 면역글로불린 상과 멤버이다 (Sharpe, A.H. et al. (2002) "The B7-CD28 Superfamily" Nature Rev. Immunol. 2: 116-126). B7-과 멤버의 IgV 및 IgC 도메인은 각각 선도 서열, 막관통 및 세포질 도메인을 암호화하는 추가적인 엑손과 함께, 단일 엑손에 의해 암호화된다. 세포질 도메인은 짧고, 19 내지 62 아미노산 잔기의 길이의 범위이고 다양한 엑손에 의해 암호화될 수 있다 (Collins, M. et al. (2005) "The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands " Genome Biol. 6: 223.1-223.7). B7-H3는 주요 사람 형태가 두 개의 세포 외 직렬 IgV-IgC 도메인을 함유하는 점에서 독특하다 (즉, IgV-IgC-IgV-IgC) (Collins, M. et al. (2005) "The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands" Genome Biol. 6: 223.1-223.7). B7 과의 멤버는 세포 표면에 연속적인, 비-공유결합의 호모다이머를 형성할 것으로 예상되고, 이러한 다이머는 B7-1 (CD80) 및 B7-2 (CD86)에 대하여 발견되었다.
B7-1 (CD80) 및 B7-2 (CD86) 전시는 자극 CD28 수용체 및 억제 CTLA-4 (CD 152) 수용체에 대해 이중 특이성을 갖는다 (Sharpe, A.H. et al. (2002) "The B7-CD28 Superfamily" Nature Rev. Immunol. 2: 116-126).
초기에 단지 2개의 Ig 도메인 (IgV-IgC)을 포함할 것으로 생각됐지만 (Chapoval, A. et al. (2001) "B7-H3: A Costimulatory Molecule For T Cell Activation and IFN-γ Production" Nature Immunol. 2: 269-274; Sun, M. et al. (2002) "Characterization of Mouse and Human B7-H3 Genes" J. Immunol. 168: 6294-6297) 4개의 면역글로불린 세포 외 도메인 변이체 ("4Ig-B7-H3")가 확인되었고 단백질의 더 일반적인 사람 형태인 것이 발견되었다 (Sharpe, A.H. et al. (2002) "The B7-CD28 Superfamily" Nature Rev. Immunol. 2: 116-126). 자연적 쥐 형태 (2Ig) 및 사람 4Ig 형태가 비슷한 기능을 나타내지만, 이들 2개의 형태 사이에 기능적인 차이는 발견되지 않았다 (Hofmeyer, K. et al. (2008) "The Contrasting Role Of B7-H3" Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 105(30): 10277- 10278). 4Ig-B7-H3 분자는 자연적 킬러 세포 매개된 암 세포의 용해를 억제한다 (Castriconi, R. et al. "Identification Of 4Ig-B7-H3 As A Neuroblastoma-Associated Molecule That Exerts A Protective Role From An NK Cell-Mediated Lysis" Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 101 (34): 12640-12645). 사람 B7-H3 (2Ig 형태)는 활성화된 T 세포 상에 추정상 수용체와의 결합함으로써 T- 세포 활성화 및 IFN-γ 생산을 촉진하는 것이 발견되었다 (Chapoval, A. et al. (2001) "B7-H3: A Costimulatory Molecule For T Cell Activation and IFN-y Production " Nature Immunol. 2: 269-274; Xu, H. et al. (2009) "MicroRNA miR-29 Modulates Expression of Immunoinhibitory Molecule B7-H3: Potential Implications for Immune Based Therapy of Human Solid Tumors" Cancer Res. 69(15): 5275-6281). B7-H4 및 B7-H1 둘 다는 종양 세포에서 발현될 때 면역 기능의 잠재적 억제자이다 (Flies, D.B. et al. (2007) "The New B7s: Playing a Pivotal Role in Tumor Immunity" J. Immunother. 30(3): 251-260).
B7-H3의 작용 방식은 단백질이 T 세포 동시-자극 및 동시-억제를 매개하기 때문에, 복잡하다 (Hofmeyer, K. et al. (2008) "The Contrasting Role Of B7-H3" Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 105(30): 10277-10278; Martin-Orozco, N. et al. (2007) "Inhibitory Costimulation and Anti-Tumor Immunity " Semin. Cancer Biol. 17(4): 288-298; Subudhi, S.K. et al. (2005) "The Balance Of Immune Responses: Costimulation Verse Coinhibition" J. Mol. Med. 83: 193-202). B7-H3는 (TREM)-유사 전사 2 (TLT-2)와의 결합하고 T 세포 활성화를 동시-자극하지만, 또한 T 세포의 동시-억제를 매개하기 위해 아직 확인되지 않은 수용체 (들)과의 결합한다. 게다가, B7-H3는, 알려지지 않은 수용체 (들)와 상호작용을 통한, 자연적 킬러 세포 및 골모 세포에 대해 억제자이다 (Hofmeyer, K. et al. (2008) "The Contrasting Role OfB7-H3 " Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 105(30): 10277-10278). 억제는 T 세포 수용체 (TCR)가 유전자 전사를 조절하는 주요 시그널링 경로의 멤버 (예를 들어, NFTA, NF-κΒ, 또는 AP-1 인자)와 상호작용을 통해 작동할 수도 있다.
B7-H3는 CD4+ 및 CD8+ T- 세포 분화을 동시-자극한다. B7-H3는 또한 IFN-γ 생산 및 CD8+ 용해 활성을 자극한다 (Chapoval, A. et al. (2001) "B7-H3: A Costimulatory Molecule For T Cell Activation and IFN-y Production" Nature Immunol. 2: 269-274; Sharpe, A.H. et al. (2002) "The B7-CD28 Superfamily" Nature Rev. Immunol. 2: 116-126). 하지만, 단백질은 또한 T- 세포 활성화를 억제하기 위해 NFAT (활성화된 T 세포에 대한 핵인자), NF-κΒ (핵인자 카파 B), 및 AP-1 (활성화제 단백질-1) 인자를 통해 가능하게 작용한다 (Yi. K.H. et al. (2009) "Fine Tuning The Immune Response Through B7-H3 and B7-H4" Immunol. Rev. 229: 145-151). B7-H3는 또한 생체 내에서 Thl1, Thl2, 또는 Thl7을 억제하는 것으로 생각된다. (Prasad, D.V. et al. (2004) "Murine B7-H3 Is A Negative Regulator Of T Cells " J. Immunol. 173: 2500-2506; Fukushima, A. et al. (2007) "B7-H3 Regulates The Development Of Experimental Allergic Conjunctivitis In Mice" Immunol. Lett. 113: 52-57; Yi. K.H. et al. (2009) "Fine Tuning The Immune Response Through B7-H3 and B7-H4" Immunol. Rev. 229: 145-151). 여러 독립적인 연구는 사람 악성 종양 세포는 B7-H3 단백질 발현의 현저한 증가를 나타내고 이 증가된 발현은 증가된 질환 심각성과 연관된다는 것을 나타냈다 (Zang, X. et al. (2007) "The B7 Family and Cancer Therapy: Costimulation and Coinhibition " Clin. Cancer Res. 13: 5271-5279), suggesting that B7-H3 is exploited by tumors as an immune evasion pathway (Hofmeyer, K. et al. (2008) "The Contrasting Role OfB7-H3 " Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 105(30): 10277-10278).
T- 세포 수용체 (예를 들어, CD28)와의 결합하는 B7 분자의 능력을 블록하는 분자는 면역계를 억제하고 자동 면역 질환에 대한 치료법으로 제안되었다 (Linsley, P.S. et al. (2009) "The Clinical Utility Of Inhibiting CD28-Mediated Co-Stimulation" Immunolog. Rev. 229: 307-321). 항-4Ig-B7-H3 항체가 처리된 4Ig-B7-H3를 발현하는 신경아 세포종 세포는 NK 세포에 더 민감하다. 하지만, 이 활성은 4Ig-B7-H3에 대해 상승한 보고된 모든 항체가 또한 2개의 B7H3의 Ig-유사 형태와의 결합하기 때문에 4Ig-B7-H3 형태에 대한 유일한 항체로 나타낼 수 있는지는 불확실하다 (Steinberger, P. et al. (2004) "Molecular Characterization of Human 4Ig-B7-H3, a Member of the B7 Family with Four Ig-유사 도메인s" J. Immunol. 172(4): 2352-2359 and Castriconi et al. (2004) "Identification Of 4Ig-B7-H3 As A Neuroblastoma-Associated Molecule That Exerts A Protective Role From An NK Cell-Mediated Lysis" Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 101(34): 12640-12645).
B7-H3는 휴면 B 또는 T 세포, 단핵 백혈구, 또는 수지상 세포에 발현되지 않지만 IFN-γ에 의해 수지상 세포 상에 및 GM-CSF에 의해 단핵 백혈구 상에 유발된다 (Sharpe, A.H. et al. (2002) "The B7-CD28 Superfamily" Nature Rev. Immunol. 2: 116-126). B7-H3와의 결합하는 수용체 (들)는 완전히 특징지어지지 않았다. 초기 작업은 하나의 이러한 수용체가 활성화 후 T 세포를 빠르게 및 일시적으로 상향 조절할 필요가 있다는 것을 제안한다 (Loke, P. et al. (2004) "Emerging Mechanisms Of Immune Regulation: The Extended B7 Family and Regulatory T Cells." Arthritis Res. Ther. 6: 208-214). 최근, 골수 세포에서 발현되는, (TREM)-유사 전사 2 (TLT-2, 또는 TREML2) 수용체 (King, R.G. et al. (2006) "Trem-유사 Transcript 2 Is Expressed On Cells Of The Myeloid/Granuloid and B Lymphoid Lineage and Is Up-Regulated In Response To Inflammation" J. Immunol. 176: 6012-6021; Klesney-Tait, J. et al. (2006) "The TREM Receptor Family and Signal Integration" Nat. Immunol. 7: 1266-1273; Yi. K.H. et al. (2009) "Fine Tuning The Immune Response Through B7-H3 and B7-H4" Immunol. Rev. 229: 145-151)는 B7-H3와의 결합할 수 있고, 그로 인해 특히 CD8+ T 세포의 활성화를 동시-자극하는 것을 나타냈다 (Zang, X. et al. (2003) "B7x: A Widely Expressed B7 Family Member That Inhibits T Cell Activation" Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 100: 10388-10392; Hashiguchi, M. et al. (2008) "Triggering Receptor Expressed On Myeloid Cell-유사 Transcript 2 (TLT-2) Is A Counter-Receptor For B7-H3 and Enhances T Cell Responses " Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 105(30): 10495-10500; Hofmeyer, K. et al. (2008) "The Contrasting Role OfB7-H3 " Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 105(30): 10277-10278).
신경아 세포종 세포에서 그것의 발현에 더하여, 사람 B7-H3은 또한 다양한 다른 암 세포에서 발현되는 것으로 알려져 있다 (예를 들어, 위, 난소 및 비-소 세포 폐암). B7-H3 단백질 발현은 종양 세포주에서 면역조직학적으로 검출되었다 (Chapoval, A. et al. (2001) "B7-H3: A Costimulatory Molecule For T Cell Activation and IFN-y Production" Nature Immunol. 2: 269-274; Saatian, B. et al. (2004) "Expression Of Genes For B7-H3 and Other T Cell Ligands By Nasal Epithelial Cells During Differentiation and Activation" Amer. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 287: L217-L225; Castriconi et al. (2004) "Identification Of 4Ig-B7-H3 As A Neuroblastoma-Associated Molecule That Exerts A Protective Role From An NK Cell-Mediated Lysis" Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 101(34): 12640-12645); Sun, M. et al. (2002) "Characterization of Mouse and Human B7-H3 Genes" J. Immunol. 168: 6294-6297). mRNA 발현은 심장, 신장, 고환, 폐, 간, 췌장, 전립선, 결장, 및 골아 세포에서 발견되었다 (Collins, M. et al. (2005) "The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands" Genome Biol. 6: 223.1-223.7). 단백질 레벨에서, B7-H3는 사람 간, 폐, 방광, 고환, 전립선, 유방, 태반, 및 림프 기관에서 발견된다 (Hofmeyer, K. et al. (2008) "The Contrasting Role Of B7-H3 " Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 105(30): 10277-10278).
II. 치료적 항체
진단에서 그들의 알려진 사용법에 더하여, 항체는 치료제로서 유용하다는 것을 나타냈다. 예를 들어, 면역치료, 또는 치료적 목적으로 항체의 사용은 암을 치료하기 위해 근년에 사용되었다. 수동적 면역 치료는 암 치료에 단클론성 항체의 사용을 수반한다 (예를 들어, DEVlTA, HELLMAN, 및 ROSENBERG'S CANCER: PRINCIPLES & PRACTICE OF ONCOLOGY, EIGHTH EDITION (2008), DeVita, V. et al. Eds., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, pp. 537-547, 2979-2990 참조). 이 항체는 종양 세포 성장 또는 생존의 직접적인 억제에 의한 및 신체의 면역계의 자연적 세포 살해 활성을 회복하는 그들의 능력에 의한 고유의 치료적 생물학적 활성을 가질 수 있다. 이 약제는 단독으로 또는 방사성 치료제 또는 화학치료제와 함께 투여될 수 있다. 비-호지킨 림프종 및 유방암의 치료에 대해 입증된, 리툭시맙 및 트라스투쥬맙은, 각각, 이러한 치료제의 예다. 대안으로, 항체는 항체가 독성제와의 결합하고, 종양에 특이적으로 결합함으로써 종양에 대한 약제를 나타내는 항체 접합체를 만드는데 사용될 수 있다. 젬투쥬맙 오조가미신은 백혈병의 치료에 사용된 입증된 항체 접합체의 예이다.
암 세포와의 결합하고 진단 및 치료에 잠재적으로 사용되는 단클론성 항체는 개시되었다 (예를 들어, 그 중에서도, 특정 분자량의 표적 단백질을 개시한 다음 특허 출원: 미국 특허 번호 6,054,561 (200 kD c-erbB-2 (Her2), 크기가 40-200 KD인 다른 알려지지 않은 항원및 미국 특허 번호 5,656,444 (50 kD and 55 kD 종양성 태아성 단백질 참조). 임상 실험에서 및/또는 고체 종양의 치료에 대해 입증된 항체의 예는 트라스투쥬맙 (항원: 180 kD, HER2/neu), 에드레콜로맙 (항원: 40-50 kD, Ep-CAM), 항-사람 유지방구 (HMFG1) (항원 > 200 kD, HMW 무친), 세툭시맙 (항원: 150 kD 및 170 kD, EGF 수용체), 알레투쥬맙 (항원: 21-28 kD, CD52), 및 리툭시맙 (항원: 35 kD, CD20)을 포함한다.
유방암 치료에 사용된, 트라스투쥬맙 (Her-2 수용체) 및 여러 암의 치료에 대해 임상 실험 중인, 세툭시맙 (EGF 수용체)의 항원 표적은 피부, 결장, 폐, 난소, 간, 및 췌장을 포함하는, 많은 수의 정상 사람 성인 조직에서 일부 검출 가능한 레벨로 존재한다. 이들 치료제를 사용하는데 있어서 안전성의 차이는 항원 발현 레벨의 차이 또는 이 부위에서 항체의 접촉 또는 활성의 차이에 의해 가능하게 제공된다.
면역 치료의 또 다른 타입은 특이적 암 (들) 또는 항원의 발현을 나타내는 DNA 구조상에 존재하는 항원으로 활성 면역 치료, 또는 백신 접종인데, 그때 이것은 개별적으로 면역 반응을 일으킨다, 즉, 각 개체가 그들 자체 그들 자신의 암에 대한 항체를 활발하게 생산하는 것을 유발한다. 활성 면역화는 수동적 면역 치료 또는 항독소만큼 자주 사용되지 않는다.
질환 (암을 포함) 진행의 여러 모델이 제안되었다. 이론은 단일 전염성/형질전환 이벤트에 의한 원인으로부터 궁극적으로 완전히 병원성 또는 악성 능력이 있는 것으로 이어지는 점점 더 "질환-유사" 또는 "암-유사" 조직 타입의 진화까지 다양하다. 다음 변화에 대한 다른 논쟁은 또한 필수적이지만, 일부 암에 대한 논쟁, 예를 들어, 단일 돌연변이성 이벤트는 악정 종양을 유발하기 충분하다. 일부 다른 사람은 증가하는 돌연변이성 로드 및 종양 등급은 개시뿐만 아니라 세포 레벨에서 돌연변이-선택 이벤트의 연속체를 통한 신생물 형성의 진행에도 필수적이다는 것을 제안하였다. 일부 암 표적은 종양 조직에서만 발견되지만, 다른 것들은 정상적인 조직에 존재하고 종양 조직에서 상향 조절 및/또는 과-발현된다. 이러한 상황에서, 일부 연구원은 과발현이 악성 종양의 습득과 연관된다는 것을 제안하지만 다른 사람은 과발현은 단지 증가하는 병의 상태로 가는 길을 따르는 추세의 마커인 것을 제안한다.
일부 경우에서, 종양에서 발현되거나 과-발현되는 발암단백질과 같은, 암 표적은 배아 및 태아의 발달 중에 존재하였고 성장 및 분화의 조절기로서 제공된다. 일부 연구원은 배아 및 태아 단계 중에 이 발암단백질들의 발현이 특이적 조직에 대해 제한되고 또한 발전의 특이적 발전 단계에 대해 제한되는 것으로 나타난다는 것을 발견하였다. 반대로, 성인의 이들 발암단백질의 발현은 종양 성장에서 과-발현 및/또는 종양 억제 단백질의 기능부전과 연관된다는 것을 나타낸다.
이상적인 진단적 및/또는 치료적 항체는 많은 수의 암에 존재하지만, 어느 정상적인 조직에서 부재 또는 낮은 레벨로만 존재하는 항원에 대해 특이적일 것이다. 암 (들)과 특이적으로 연관된 항원과의 결합할 수 있는 새로운 항체의 발견, 특징 설명, 및 분리는 많은 방법에서 유용할 것이다. 첫 번째, 항체는 이러한 암 세포에 대한 생물학적 활성을 갖고 면역계의 반응을 모아서 질환을 치료할 수 있다. 항체는 치료제 단독으로 또는 독성 물질과 연관된 면역접합체를 제조하기 위한 현재의 치료 또는 사용된 치료와 조합으로 투여될 수 있다. 같은 특이성을 갖지만 단독으로 투여될 때 생물학적 활성이 낮거나 없는 항체는 또한 항체가 항원 함유 세포로 독소를 보내는 항체의 장점에 의해 생물학적으로 활성인 접합된 형태로, 방사성 동위원소, 독소, 또는 화학치료제 또는 화학치료제를 함유한 리포솜과 면역접합체를 제조하는데 사용될 수 있다는 점에서 유용할 수 있다.
상기 논의된 바와 같이, 항체 및 B7-H3와 특이적으로 결합하는 다른 분자가 설명되었다 (미국 특허 번호 7,527,969; 7,368,554; 7,358,354; 및 7,279, 567; 미국 특허 출원 공개 번호 US 20090087416; US 20090022747; US 20090018315; US2008116219; US20080081346; US 20050202536; US20030103963; US20020168762; PCT 공개 번호 WO 2008/116219; WO 2006/016276; WO 2004/093894; WO 04/001381; WO 2002/32375; WO 2002/10187 및 WO 2001/094413; EP 1292619B; Modak, S. et al. (March 1999) "Disialoganglioside GD2 and Antigen 8H9: Potential Targets For Antibody-Based Immunotherapy Against Desmoplastic Small Round Cell Tumor (DSRCT) and Rhabdomyosarcoma (RMS)" Proceedings Of The American Association For Cancer Research Annual Meeting, Vol. 40: 474 (90th Annual Meeting Of The American Association For Cancer Research; Philadelphia, Pennsylvania, US; April 10-14, 1999; Modak, S. et al. (March 2000) "Radioimmunotargeting To Human Rhabdomyosarcoma Using Monoclonal Antibody 8H9" Proc. Am. Assoc. Cancer Res.41: 724; Modak, S. et al. (2001) "Monoclonal Antibody 8H9 Targets A Novel Cell Surface Antigen Expressed By A Wide Spectrum Of Human Solid Tumors" Cancer Res. 61(10): 4048-4054; Steinberger, P. et al. (2004) "Molecular Characterization of Human 4Ig-B7-H3, a Member of the B7 Family with Four Ig-like Domains" J. Immunol. 172(4): 2352-2359; Xu, H. et al. (2009) "MicroRNA miR-29 Modulates Expression of Immunoinhibitory Molecule B7-H3: Potential Implications for Immune Based Therapy of Human Solid Tumors" Cancer Res. 69(15): 5275-6281 참조).
그럼에도 불구하고, 이상적인 진단적 및/또는 치료적 항체에 대해 바람직한 한 양태는 다양한 암과 연관된 암 세포 (특히 사람 암 세포)에 대한 면역계의 활성화를 매개할 수 있고, 특히 향상시킬 수 있는 새로운 항체의 발견 및 특징 설명일 것이다. 이러한 조성물은 또한 약 발견 (예를 들어, 작은 분자) 및 세포의 조절, 성장, 및 분화의 추가적인 특징 설명에 유용할 것이다.
따라서, 모든 이전의 진보에도 불구하고, 암 세포와의 결합할 수 있고 암 세포에 대한 면역 반응을 촉진하거나 매개할 수 있는 향상된 조성물에 대한 필요가 남아있다. 이러한 조성물은 이러한 암 세포를 진단하고 치료하는데 사용될 수도 있다. 여기에 개시된 발견에 기초하여, 세포의 표면 상에 이중 표적을 특이적으로 인식하는 새로운 조성물에 대한 추가적인 필요가 존재하고, 그로 인해 이것은 T- 세포 활성화를 매개하는 B7-H3의 능력을 감소 또는 향상시킴으로써 또는 B7-H3을 발현하는 암 세포를 인식하고 살해함으로써 조절할 수 있다. 이러한 조성물을 확인하는 것은 본 발명의 목적이다. B7-H3 발현의 검정에 사용을 위한 새로운 화합물을 제공하는 것은 또 다른 목적이다.
하기 상세하게 설명된 바와 같이, 본 발명은 특히 이중 친화도 재표적화제 ("DART™ s")를 포함하는, B7-H3 T- 세포 활성화의 조절기를 포함하고, T- 세포 활성에 영향을 미칠 수 있는 새로운 항체뿐만 아니라 암 세포의 B7-H3 수용체와의 결합하고 이러한 세포의 사망을 촉진하거나 매개하는 새로운 항체와 관련된다. 본 발명은 이러한 조성물 및 암과 같은 질환의 진단 및 치료에 그들의 사용과 관련된다.
본 발명은 포유동물, 및 더 특히 사람 B7-H3 수용체에 면역 반응성인 항체 및 그들의 단편 및 이들의 사용, 특히 암 및 염증의 치료에 관련된다. 따라서 본 발명은 특히 사람화 B7-H3-반응성 항체 및 다양한 사람 암과 연관된 암 세포에 대한 면역계의 활성화를 매개할 수 있고, 더 바람직하게 향상시킬 수 있는 그들의 면역 반응성 단편과 관련된다.
상세하게, 본 발명은 분리된 항체 또는 이들의 면역 반응성 단편과 관련되는데, 분리된 항체 또는 단편은 특이적으로 B7-H3의 세포 외 도메인과의 결합하는 다양한 도메인을 포함하고, 항체는 B7-H3와의 결합을 위해 항체 BRCA69D, BRCA84D, 또는 PRCA157 중 하나와 경쟁한다.
본 발명은 상기 설명된 분리된 항체 또는 이들의 면역 반응성 단편과 더 관련되는데, 항체 또는 단편은 다음을 포함하는 다양한 도메인을 포함한다:
(A) BRCA69D의 경쇄의 CDR1 (SEQ ID NO: 21), CDR2 (SEQ ID NO: 23) 및 CDR3 (SEQ ID NO: 25) 및 BRCA69D의 중쇄의 CDR1 (SEQ ID NO: 29), CDR2 (SEQ ID NO: 31) 및 CDR3 (SEQ ID NO: 33);
(B) BRCA84D의 경쇄의 CDR1 (SEQ ID NO: 5), CDR2 (SEQ ID NO: 7) 및 CDR3 (SEQ ID NO: 9) 및 BRCA84D의 중쇄의 CDR1 (SEQ ID NO: 13), CDR2 (SEQ ID NO: 15) 및 CDR3 (SEQ ID NO: 17); 또는
(C) PRCA157의 경쇄의 CDR1 (SEQ ID NO: 37), CDR2 (SEQ ID NO: 39) 및 CDR3 (SEQ ID NO: 41) 및 PRCA157의 중쇄의 CDR1 (SEQ ID NO: 45), CDR2 (SEQ ID NO: 47) and CDR3 (SEQ ID NO: 49).
본 발명은 상기 설명된 분리된 항체 또는 이들의 면역 반응성 단편 중 하나와 관련되는데, 항체는 암 세포의 표면상에 내인성으로 발현되는 B7-H3와의 결합한다.
본 발명은 상기 설명된 분리된 항체 또는 이들의 면역 반응성 단편 중 하나와 관련되는데, 항체는 암 세포의 표면상에 발현되는 B7-H3와의 결합을 내면화한다.
본 발명은 상기 설명된 분리된 항체 또는 이들의 면역 반응성 단편 중 하나와 관련되는데, 이것은 사람화된 단클론성 항체이다.
본 발명은 상기 설명된 분리된 항체 또는 이들의 면역 반응성 단편 중 하나와 관련되는데, 항체는 변종 IgG1 Fc 영역을 포함하는 변형된 항체이고, 변종 사람 IgG1 Fc 영역은 항체의 모체의 Fc 영역과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 변형, 변형된 항체가 모체 항체와 비교하여 향상된 작용 기능을 나타내는 FcγR과의 결합에 대한 변종 Fc 영역의 친화도 또는 결합력이 변하는 아미노산 변형 (들)을 포함하는 아미노산 변형 (들)을 포함한다.
본 발명은 상기 설명된 분리된 항체 또는 이들의 면역 반응성 단편 중 하나와 관련되는데, Fc 영역 변형은 다음을 포함한다:
(A) (1) F243L; (2) D270E; (3) R292P; (4) S298N; (5) Y300L; (6) V305I; (7) A330V; 및 (8) P396L로 구성된 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 치환;
(B) 두 개의 아미노산 잔기의 적어도 하나의 치환, (1) F243L 및 P396L; (2) F243L 및 R292P; 및 (3) R292P 및 V305I로 구성된 그룹으로부터 선택되는 치환;
(C) 세 개의 아미노산 잔기의 적어도 하나의 치환, (1) F243L, R292P 및 Y300L; (2) F243L, R292P 및 V305I; (3) F243L, R292P 및 P396L; 및 (4) R292P, V305I 및 P396L로 구성된 그룹으로부터 선택되는 치환;
(D) 네 개의 아미노산 잔기의 적어도 하나의 치환, (1) F243L, R292P, Y300L 및 P396L; 및 (2) F243L, R292P, V305I 및 P396L로 구성된 그룹으로부터 선택되는 치환; 또는
(E) 적어도 다섯 개의 아미노산 잔기의 치환 F243L, R292P, Y300L, V305I 및 P396.
본 발명은 상기 설명된 항체와 더 관련되는데, 항체는 다음의 치환을 포함한다:
(A) F243L, R292P, 및 Y300L;
(B) L235V, F243L, R292P, Y300L, 및 P396L; 또는
(C) F243L, R292P, Y300L, V305I, 및 P396L.
본 발명은 상기 설명된 항체와 더 관련되는데, 항체는 다음을 포함한다:
(A) BRCA84D의 경쇄의 CDR1 (SEQ ID NO: 5), CDR2 (SEQ ID NO: 7) 및 CDR3 (SEQ ID NO: 9) 및 BRCA84D의 중쇄의 CDR1 (SEQ ID NO: 13), CDR2 (SEQ ID NO: 15) 및 CDR3 (SEQ ID NO: 17)을 포함하는 가변 도메인; 및
(B) 치환을 포함하는 Fc 영역 변형: L235V, F243L, R292P, Y300L, 및 P396L.
본 발명은 상기 설명된 항체와 더 관련되는데, 항체는 키메라 항체 또는 사람화 항체이다.
본 발명은 상기 설명된 분리된 항체 또는 이들의 면역 반응성 단편과 더 관련되는데, 항체는 다음을 포함한다:
(A) hBRCA84D-2 VL (SEQ ID NO: 89)의 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄;
(B) hBRCA84D-2 VH (SEQ ID NO: 99)의 아미노산 서열을 갖는 가변 중쇄; 및
(C) 치환을 갖는 Fc-영역: L235V, F243L, R292P, Y300L, and P396L.
본 발명은 B7-H3의 세포 외 도메인과 특이적으로 결합하는 단클론성 항체를 분비하는 하이브리도마와 더 관련되는데, 항체는 B7-H3와의 결합을 위해 항체 BRCA69D, BRCA84D, 또는 PRCA157 중 하나와 경쟁한다.
본 발명은 상기 설명된 분리된 항체 또는 면역 반응성 단편 중 하나를 암호화하는 핵산 분자와 더 관련된다.
본 발명은 이중 친화도 재표적화제 (DART™)인,
(A) B7-H3와의 결합에 특이적인 면역글로불린 VL 에피토프 결합 도메인 및 B7-H3 이외의 분자와의 결합에 특이적인 VH 에피토프 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드 사슬 I; 및
(B) B7-H3와의 결합에 특이적인 면역글로불린 VH 에피토프 결합 도메인 및 B7-H3 이외의 분자와의 결합에 특이적인 VL 에피토프 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드 사슬 II;
를 포함하는 시약과 더 관련되는데, 폴리펩티드 사슬 I 및 II는 B7-H3 및 B7-H3 이외의 분자와의 결합할 수 있는 기능적인 에피토프 결합 도메인을 형성하기 위해 함께 연관된다.
본 발명은 상기 설명된 이중 친화도 재표적화제 (DART™)와 더 관련되는데, B7-H3 이외의 DART™ 에 의해 결합될 수도 있는 분자는 헵텐이고, 특히 헵텐은 플루오레세인 이소티오시안산염이다.
본 발명은 상기 설명된 이중 친화도 재표적화제 (DART™)와 더 관련되는데, B7-H3 이외의 DART™ 에 의해 결합될 수도 있는 분자는 T- 세포 수용체 또는 NKG2D 수용체이다.
본 발명은 상기 설명된 이중 친화도 재표적화제 (DART™)와 더 관련되는데, B7-H3 이외의 DART™ 에 의해 결합될 수도 있는 분자는 종양 연관된 항원이고, 특히, 종양 연관된 항원은 A33; ADAM-9; ALCAM; BAGE; 베타-카테닌; CA125; 카르복시펩티다제 M; CD103; CD19; CD20; CD22; CD23; CD25; CD27; CD28; CD36; CD40/CD154; CD45; CD46; CD5; CD56; CD79a/CD79b; CDK4; CEA; CTLA4; 시토케라틴 8; EGF-R; EphA2; ErbB1; ErbB3; ErbB4; GAGE-1; GAGE-2; GD2/GD3/GM2; gp1OO; HER-2/neu; 사람 파필로마바이러스 (human papillomavirus)-E6; 사람 파필로마바이러스-E7; 인테그린 알파-V-베타-6; JAM-3; KID3; KID31; KSA (17-1A); LUCA-2; MAGE-1; MAGE-3; MART; MUC-1; MUM-1; N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제; 온코스타틴 M; pi 5; PIPA; PSA; PSMA; ROR1; sTn; TNF-β 수용체; TNF-α 수용체; TNF-γ 수용체; 트랜스페린 수용체; 및 VEGF 수용체로 구성된 그룹으로부터 선택되는다.
본 발명은 상기 설명된 이중 친화도 재표적화제 (DART™) 중 하나의 폴리펩티드 사슬을 암호화하는 핵산 분자와 더 관련된다.
본 발명은 (i) 상기 설명된 분리된 항체 또는 면역 반응성 단편 또는 이중 친화도 재표적화제 (DART™) 중 하나의 치료상 유효량 및 (ii) 약학적으로 수용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물과 더 관련된다.
본 발명은 상기 설명된 약학적 조성물과 더 관련되는데, 항체는 다음을 포함하는 사람화된 항체이다:
(A) BRCA84D의 경쇄의 CDR1 (SEQ ID NO: 5), CDR2 (SEQ ID NO: 7) and CDR3 (SEQ ID NO: 9) 및 BRCA84D의 중쇄의 CDR1 (SEQ ID NO: 13), CDR2 (SEQ ID NO: 15) and CDR3 (SEQ ID NO: 17)를 포함하는 가변 도메인; 및
(B) 치환 L235V, F243L, R292P, Y300L, 및 P396L를 포함하는 Fc 영역 변형.
본 발명은 상기 설명된 약학적 조성물과 더 관련되는데, 항체는 다음을 포함하는 사람화된 항체이다:
(A) hBRCA84D-2 VL (SEQ ID NO: 89)의 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄;
(B) hBRCA84D-2 VH (SEQ ID NO: 99)의 아미노산 서열을 갖는 가변 중쇄; 및
(C) 치환 L235V, F243L, R292P, Y300L, and P396L를 갖는 Fc 영역.
본 발명은 상기 설명된 약학적 조성물 중 하나와 더 관련되는데, 이것은 하나 이상의 추가적인 항암제를 포함하고, 특히 추가적인 항암제는 화학치료제, 방사선 치료제, 호르몬 치료제, 또는 면역치료제이다.
본 발명은 암의 진단에서 상기 설명된 항체 또는 면역 반응성 단편 또는 이중 친화도 재표적화제 (DART™) 중 하나의 사용과 더 관련되는데, 분리된 항체, 면역 반응성 단편 또는 DART™ 는 검출 가능하게 표지된다.
본 발명은 부신 종양 (adrenal gland tumor), 에이즈 관련 암 (AIDS-associated cancer), 꽈리 연부 육종 (alveolar soft part sarcoma), 성상 세포 종양 (astrocytic tumor), 방광암 (bladder cancer), 뼈암 (bone cancer), 뇌척수암 (brain and spinal cord cancer), 뇌전이암 (metastatic brain tumor), 유방암 (breast cancer), 경동맥체 종양 (carotid body tumors), 자궁경부암 (cervical cancer), 연골육종 (chondrosarcoma), 척색종 (chordoma), 혐색소 세포신암종 (chromophobe renal cell carcinoma), 투명 세포암 (clear cell carcinoma), 결장암 (colon cancer), 대장암 (colorectal cancer), 양성 피부 섬유종 (cutaneous benign fibrous histiocytoma), 결체조직 소원형 세포암 (desmoplastic small round cell tumor), 상의 세포종 (ependymoma), 유윙 종양 (Ewing's tumor), 골격 외 점액성 연골육종 (extraskeletal myxoid chondrosarcoma), 섬유 조직 형성 부전증 (fibrogenesis imperfecta ossium), 뼈의 섬유성 이형성증 (fibrous dysplasia of the bone), 담낭암 또는 담관암 (gallbladder or bile duct cancer), 위암 (gastric cancer), 임신성 융모질환 (gestational trophoblastic disease), 생식 세포 종양 (germ cell tumor), 두경부암 (head and neck cancer), 간암 (hepatocellular carcinoma), 도 세포 종양 (islet cell tumor), 카포시 육종 (Kaposi's Sarcoma), 신장암 (kidney cancer), 백혈병 (leukemia), 지방종/산후 지방종성 종양 (lipoma/benign lipomatous tumor), 지방육종/악성 지방성 종양 (liposarcoma/malignant lipomatous tumor), 간암 (liver cancer), 림프종 (lymphoma), 폐암 (lung cancer), 수모 세포종 (medulloblastoma), 흑색종 (melanoma), 뇌수막종 (meningioma), 다발성 내분비 종양증 (multiple endocrine neoplasia), 다발성 골수종 (multiple myeloma), 골수형성이상 증후군 (myelodysplasia syndrome), 신경아 세포종 (neuroblastoma), 신경계 내분비 종양 (neuroendocrine tumors), 난소암 (ovarian cancer), 췌장암 (pancreatic cancer), 갑상선 유두암 (papillary thyroid carcinoma), 부갑상선 종양 (parathyroid tumor), 소아암 (pediatric cancer), 말초신경초종양 (peripheral nerve sheath tumor), 크롬친화 세포종 (phaeochromocytoma), 뇌하수체 종양 (pituitary tumor), 전립선암 (prostate cancer), 후포도막 흑색종 (posterior uveal melanoma), 희귀 적혈구 장애 (rare hematologic disorder), 신장전이암 (renal metastatic cancer), 횡문양 신장 종양 (rhabdoid tumor), 횡문근육종 (rhabdomysarcoma), 육종 (sarcoma), 피부암 (skin cancer), 연부조직육종 (soft-tissue sarcoma), 편평상피 세포암 (squamous cell cancer), 위암 (stomach cancer), 활막육종 (synovial sarcoma), 고환암 (testicular cancer), 흉선암 (thymic carcinoma), 흉선종 (thymoma), 갑상선전이암 (thyroid metastatic cancer), 및 자궁암 (uterine cancer)의 세포로 구성된 그룹으로부터 선택되는 암 세포의 존재에 의해 특징지어진 암인 점에서 특징지어진 상기 설명된 사용법과 더 관련된다.
본 발명은 환자의 암을 치료 또는 예방하기 위해 약을 제조하는데 있어서 상기 설명된 항체 또는 면역 반응성 단편 또는 이중 친화도 재표적화제 (DART™) 중 하나의 사용법과 더 관련된다. 본 발명은 부신 종양, 에이즈 관련 암, 꽈리 연부 육종, 성상 세포 종양, 방광암, 뼈암, 뇌척수암, 뇌전이암, 유방암, 경동맥체 종양, 자궁경부암, 연골육종, 척색종, 혐색소 세포신암종, 투명 세포암, 결장암, 대장암, 양성 피부 섬유종, 결체조직 소원형 세포암, 상의 세포종, 유윙 종양, 골격 외 점액성 연골육종, 섬유 조직 형성 부전증, 뼈의 섬유성 이형성증, 담낭암 또는 담관암, 위암, 임신성 융모질환, 생식 세포 종양, 두경부암, 간암, 도 세포 종양, 카포시 육종, 신장암, 백혈병, 지방종/산후 지방종성 종양, 지방육종/악성 지방성 종양, 간암, 림프종, 폐암, 수모 세포종, 흑색종, 뇌수막종, 다발성 내분비 종양증, 다발성 골수종, 골수형성이상 증후군, 신경아 세포종, 신경계 내분비 종양, 난소암, 췌장암, 갑상선 유두암, 부갑상선 종양, 소아암, 말초신경초종양, 크롬친화 세포종, 뇌하수체 종양, 전립선암, 후포도막 흑색종, 희귀 적혈구 장애, 신장전이암, 횡문양 신장 종양, 횡문근육종, 육종, 피부암, 연부조직육종, 편평상피 세포암, 위암, 활막육종, 고환암, 흉선암, 흉선종, 갑상선전이암, 및 자궁암의 세포로 구성된 그룹으로부터 선택되는 암 세포의 존재에 의해 특징지어진 암인 점에서 특징지어진 이러한 사용법과 더 관련된다.
본 발명은 화학치료, 면역치료, 방사선 치료, 호르몬 치료, 및 수술로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 추가적인 암 치료의 투여를 더 포함하는 사용법인 점에서 특징지어진 상기 설명된 사용법과 더 관련된다.
도 1a-1b는 0.625 μg/ml 및 0.078 μg/ml의 BRCA84D가 있는 정상적인 췌장, 간 및 결장 조직 표본 (도 1a) 및 0.625 μg/ml의 BRCA84D가 있는 정상 심장, 신장 및 부신 조직 (도 1b)을 사용하여 실시된 IHC 조사의 결과를 나타낸다.
도 2는 0.625 μg/ml 및 0.078 μg/ml의 BRCA84D가 있는 암에 걸린 췌장, 유방, 결장 및 폐 조직 표본을 사용하여 실시된 IHC 조사의 결과를 나타낸다.
도 3a-3d는 본 발명의 항체에 의해 매개된 농도-의존적 재이동 살해를 나타낸다. 도 3a-3b는 B7-H3에 대해 반응성인 단클론성 항체 (20:1의 효과기: 표적 비율)에 의한 A498 신장암 세포 (18시간에 남은 PBMC와 함께 (LDH))의 농도-의존적 재이동 살해를 나타낸다 (도 3a: BRCA68D, BRCA69D, PRCA157, GB8, TCR-4420; 도 3b: OVCA22, BRCA84D, TDH6, TES7, TCR-4420). 도 3c-3d는 B7-H3에 대해 반응성인 단클론성 항체 (30:1의 효과기: 표적 비율)에 의한, A549 폐암 세포 (18시간에 남은 PBMC와 함께 (LDH))의 농도-의존적 재이동 살해를 나타낸다 (도 3c: BRCA84D, OVCA22, PRCA157, TES7; 도 3d: TDH6, BRCA68D, BRCA69D).
도 4a-4b는 항-B7-H3 항체의 가용성 B7H3-2Ig (도 4a) 및 가용성 B7H3-4Ig B7-H3 (도 4b)와의 결합하는 능력을 나타낸다 (항체 농도는 100 nM이다). 범례: (A) BLA8; (B) BRCA165; (C) BRCA68D; (D) BRCA69D; (E) BRCA84D; (F) GB8; (G) LUCA1; (H) LUCA50; (I) OVCA21; (J) OVCA22; (K) PA20; (L) PRCA123; (M) SG24; (N) SG27; (O) ST09; (P) TDH4 (184-192); (Q) TDH4; (R) TDH5; (S) TES7. 범례의 수직 위치는 해당하는 곡선의 위치와 연관성이 있다.
도 5a-5s는 용액의 항원 및 캡쳐된 단클론성 항체 사이의 결합 친화도를 입증한다 (실선: B7-H3(4Ig) 100 nM; 점선; B7-H3, 100 nM).
도 6a-6i는 B7-H3-2Ig (회색 점선) 또는 B7-H3-4Ig (검은 실선)에 고정화된 B7-H3 항체의 BIACORE™ 분석의 결과를 나타낸다. 항체는 0.063 μΜ 내지 1 μΜ로 적정되었다. 시간은 초이다.
도 7은 항체 PRCA157, BRCA69D, BLA8, PA20, BRCA84D, GB8 및 SG27의 비교 BIACORE™ 분석을 제공한다.
도 8은 항체 BRCA68D, BRCA69D, 및 PRCA157가 BRCA84D와 사람 B7-H3와의 결합을 위해 경쟁하지 않는다는 것을 입증하는 BIACORE™ 분석을 제공한다.
도 9a-9b는 본 발명의 항-B7-H3 항체의 암 세포와의 결합이 내면화되는 능력에 대한 연구의 결과를 나타낸다 (도 9a, 전립선 CSC 세포; 도 9b, Hs700t 췌장 세포).
도 10a-10f는 본 발명의 항-B7-H3 항체의 서로 교차-블록함으로 인해 중복 또는 뚜렷한 에피토프를 나타내는 능력을 나타낸다. 경쟁자 항체의 10배 초과량을 사용하였다.
도 11a-11b는 BRCA84D의 가변 경쇄 (도 11a) 또는 가변 중쇄 (도 11b)의 아미노산 잔기의 정렬 및 그것의 사람화된 유도체, hBRCA84D를 나타낸다.
도 12는 사람 B7-H3에 대해 hBRCA84D 경쇄 유도체 BRCA84D-3VH, BRCA84D-4VH 및 BRCA84D-5VH의 상대적인 결합 친화도를 나타낸다.
도 13은 사람 B7-H3에 대해 hBRCA84D 중쇄 유도체 BRCA84D-3VL, BRCA84D-4VL 및 BRCA84D-5VL의 상대적인 결합 친화도를 나타낸다.
도 14는 (1) hBRCA84D-2VL 및 hBRCA84D-2VH를 함유하는 항체 (실험 1 및 2), (2) 키메라 BRCA84D, (3) hBRCA84D-5VL 및 키메라 BRCA84D-HC를 함유하는 항체 및 (4) hBRCA84D-5VL 및 hBRCA84D-2VH를 함유하는 항체의 상대적인 결합 친화도를 나타낸다.
도 15는 Fc-변이체 사람화된 항-B7-H3 항체의 뮤린 이종이식 모델 시스템에서 생체 내 HT-1197 방광암 세포의 종양 성장을 억제하는 능력을 나타낸다. Fc 변형된 hBRCA84D-2 항체 (Fc 변형 L235V, F243L, R292P, Y300L, 및 P396L을 포함)를 암 세포의 이식 후 7일, 14일, 21일 및 28일에 (1 μg/kg, 10 μg/kg, 또는 20 μg/kg의 농도로) 마우스에 투여하였다.
도 16은 Fc-변이체 사람화된 항-B7-H3 항체의 뮤린 이종이식 모델 시스템에서 생체 내 A498 신장암 세포의 종양 성장을 억제하는 능력을 나타낸다. Fc 변형된 hBRCA84D-2 항체 (Fc 변형 L235V, F243L, R292P, Y300L, 및 P396L을 포함)를 암 세포의 이식 후 7일, 14일, 21일 및 28일에 (1 μg/kg, 10 μg/kg, 또는 20 μg/kg의 농도로) 마우스에 투여하였다.
도 17a-17d는 hBRCA84D-2/항-TCR DART™ ("T-DART™ ")의 SK-MES-1 폐암 세포, A498 신장암 세포, LNCaP 방광암 세포, 및 UACC-62 흑색종 세포의 재이동 살해를 매개하는 능력을 입증한다.
도 18a-18c는 수컷 종양 없는 수컷 mCD16-/-, hCD16A_FOXN1 마우스의 혈청에서 항-B7-H3 Mab1의 약물동력학적 감소를 나타낸다 (도 18a-18b). 도 18c는 0.1, 0.5, 1, 5, 및 10 mg/kg에서 5 mg/kg의 파라미터로 2-구획 모델을 사용하여 발생한 예측된 약물동력학적 프로파일을 나타낸다.
도 19는 HT-1197 방광암 세포주에 의한 HER2 및 PRCA135의 상대적인 발현을 나타낸다.
도 20은 HT-1197 세포에 대한 항-B7-H3 항체 hBRCA84D 변종의 결합 친화도를 나타낸다.
도 21a-21c는 HT-1197에 대한 뮤린 이종이식 분석의 결과를 나타낸다. 8마리의 암컷 마우스의 그룹은 비히클 또는 10 mg/kg IgG 컨트롤, 또는 1, 5, 또는 15 mg/kg의 농도로 세툭시맙 또는 0.1, 0.5, 1, 5, 또는 10 mg/kg의 농도로 항-B7-H3 항체 Mab1 (Q7D x5)를 받았다. 종양 측정은 매 3-4일 마다 이루어졌다. 도 21a는 뮤린 이종이식 모델에서 항-B7-H3 항체 Mab1의 종양 발전을 예방하거나 억제하는 능력을 나타낸다. 대조군 (comparison) 대 IgG 컨트롤: 51일의 Mab1 (1 및 5 mg/kg) 대 IgG 컨트롤 ***; 48일의 Mab1 (10 mg/kg) 대 IgG 컨트롤 **. 도 21b는 뮤린 이종이식 모델에서 세툭시맙의 종양 발전을 예방하거나 억제하는 능력을 나타낸다. 51일의 세툭시맙 (7 mg/kg) 대 IgG 컨트롤 **; 58일의 세툭시맙 (15 mg/kg) 대 IgG 컨트롤 ***. 도 21c는 테스트된 최대 농도에서 얻은 결과를 비교한다.
도 22a-22b는 HT-1376 방광암 세포주에 의한 HER2 및 PMSA의 상대적인 발현을 나타낸다.
도 23은 HT-1376에 대한 뮤린 이종이식 분석의 결과를 나타낸다. 마우스의 그룹은 비히클 또는 1.0 mg/kg의 항-B7-H3 항체 Mab1를 받았다 (Q7D x4).
도 24는 AGS에 대한 뮤린 이종이식 분석의 결과를 나타낸다. 마우스의 그룹은 비히클 또는 0.5, 1, 5, 또는 10 mg/kg의 농도에서 10 mg/kg의 항-B7-H3 항체 Mab1를 받았다 (Q7D x5).
도 25는 hBRCA84D, chBRCA84D 및 hBRCA84 (Fc Var1) 변종 항-B7-H3 항체와 함께 배양한 A549 폐암 세포의 시험관 내 세포 독성 검정의 결과를 나타낸다 (E: T 비율 = 25: 1; 효과기 = 사람 PBMC; LDH 검정 해석).
도 26은 A549에 대한 뮤린 이종이식 분석의 결과를 나타낸다. 마우스의 그룹은 비히클 또는 1.0 mg/kg의 항-B7-H3 항체 Mab1를 받았다 (Q7D x4).
도 27은 CaLu3에 대한 뮤린 이종이식 분석의 결과를 나타낸다. 마우스의 그룹은 비히클 또는 0.5, 1, 5, 또는 10 mg/kg의 농도에서 10 mg/kg의 항-B7-H3 항체 Mab1를 받았다 (Q7D x5).
도 28a-28c는 LOX-IMVI 흑색종 세포에 대한 뮤린 이종이식 분석의 결과를 나타낸다. 8마리의 암컷 마우스의 그룹은 비히클 또는 10 mg/kg IgG 컨트롤, 또는 5, 10, 또는 20 mg/kg의 농도로 도세탁셀 또는 0.1, 0.5, 1, 5, 또는 10 mg/kg의 농도로 항-B7-H3 항체 Mab1을 받았다. 도 28a는 뮤린 이종이식 모델에서 항-B7-H3 항체 Mab1의 종양 발전을 예방하거나 억제하는 능력을 나타낸다. 28b는 뮤린 이종이식 모델에서 도세탁셀의 종양 발전을 예방하거나 억제하는 능력을 나타낸다. 28c는 테스트된 최대 농도에서 얻은 결과를 비교한다.
도 29는 UACC-62 흑색종 세포에 대한 뮤린 이종이식 분석의 결과를 나타낸다. 마우스의 그룹은 비히클 또는 5 mg/kg IgG 컨트롤, 또는 0.5, 1, 5, 또는 10 mg/kg의 농도에서 항-B7-H3 항체 Mab1를 받았다.
도 30a-30c는 2rv 방광암 세포에 대한 뮤린 이종이식 분석의 결과를 나타낸다. 8마리의 암컷 마우스의 그룹은 비히클 또는 10 mg/kg IgG 컨트롤, 또는 1, 7, 또는 15 mg/kg의 농도로 트라스투쥬맙 또는 0.1, 0.5, 1, 5, 또는 10 mg/kg의 농도로 항-B7-H3 항체 Mab1을 받았다. 도 30a는 뮤린 이종이식 모델에서 항-B7-H3 항체 Mab1의 종양 발전을 예방하거나 억제하는 능력을 나타낸다. 30b는 뮤린 이종이식 모델에서 트라스투쥬맙의 종양 발전을 예방하거나 억제하는 능력을 나타낸다. 30c는 테스트된 최대 농도에서 얻은 결과를 비교한다.
도 31은 hBRCA84D, chBRCA84D 및 hBRCA84 (Fc Var1) 변종 항-B7-H3 항체와 함께 배양한 A498 신장암 세포의 시험관 내 세포 독성 검정의 결과를 나타낸다 (E: T 비율 = 25:1; 효과기 = 사람 PBMC; LDH 검정 해석).
도 32는 A498 신장암 세포에 대한 뮤린 이종이식 분석의 결과를 나타낸다. 마우스의 그룹은 비히클 또는 10 mg/kg IgG 컨트롤, 또는 0.5, 1, 5, 또는 10 mg/kg의 농도에서 항-B7-H3 항체 Mab1를 받았다. 세툭시맙 (항-EGRF 항체)을 1, 7, 또는 15 mg/kg의 농도로 마우스의 컨트롤 그룹에 투여하였다.
도 33a-33b는 세툭시맙과 비교하여 786-0 신장암 세포에 대한 뮤린 이종이식 분석의 결과를 나타낸다. 마우스의 그룹은 비히클 또는 10 mg/kg IgG 컨트롤, 또는 0.5, 1, 5, 또는 10 mg/kg의 농도에서 항-B7-H3 항체 Mab1를 받았다. 세툭시맙 (항-EGRF 항체)을 1, 7, 또는 15 mg/kg의 농도로 마우스의 컨트롤 그룹에 투여하였다.
도 34는 파클리탁셀과 비교하여 786-0 신장암 세포에 대한 뮤린 이종이식 분석의 결과를 나타낸다. 마우스의 그룹은 비히클 또는 10 mg/kg IgG 컨트롤, 또는 0.5, 1, 5, 또는 10 mg/kg의 농도에서 항-B7-H3 항체 Mab1를 받았다. 파클리탁셀을 2.5 mg/kg의 농도로 컨트롤 그룹의 8마리 마우스 각각에 투여하였다.
본 발명은 포유동물, 더 바람직하게, 사람 B7-H3 수용체에 면역 반응성인 항체 및 그들의 단편 및 이들의 사용법, 특히 암 및 염증의 치료와 관련된다. 따라서 본 발명은 특히 다양한 사람 암과 연관된 암 세포에 대한 면역계의 활성을 매개하고, 더 바람직하게 향상시킬 수 있는 사람화된 B7-H3-반응성 항체 및 그들의 면역 반응성 단편과 관련된다.
I. 일반적인 기술
본 발명의 실행은, 달리 지시되지 않으면, 분자생물학 (재조합 기술을 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 고전적인 기술들을 활용할 것인데, 이것은 업계의 기술 내에 있다. 이러한 기술은, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Third Edition (Sambrook et al. Eds., 2001) Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY; OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS: METHODS and APPLICATIONS (Methods in Molecular Biology), Herdewijn, P., Ed., Humana Press, Totowa, NJ; OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS (Gait, M.J., Ed., 1984); METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Humana Press, Totowa, NJ; CELL BIOLOGY: A LABORATORY NOTEBOOK (Cellis, J.E., Ed., 1998) Academic Press, New York, NY; ANIMAL CELL CULTURE (Freshney, R.I., Ed., 1987); INTRODUCTION TO CELL and TISSUE CULTURE (Mather, J.P. and Roberts, P.E., Eds., 1998) Plenum Press, New York, NY; CELL and TISSUE CULTURE: LABORATORY PROCEDURES (Doyle, A. et al, Eds., 1993-8) John Wiley and Sons, Hoboken, NJ; METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.) New York, NY; WEIR'S HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY (Herzenberg, L.A. et al Eds. 1997) Wiley-Blackwell Publishers, New York, NY; GENE TRANSFER VECTORS FOR MAMMALIAN CELLS (Miller, J.M. et al Eds., 1987) Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY; CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel, F.M. et al, Eds., 1987) Greene Pub. Associates, New York, NY; PCR: THE POLYMERASE CHAIN REACTION, (Mullis, K. et al, Eds., 1994) Birkhauser, Boston MA; CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY (Coligan, J.E. et al, eds., 1991) John Wiley and Sons, Hoboken, NJ; SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (John Wiley and Sons, 1999) Hoboken, NJ; IMMUNOBIOLOGY 7 (Janeway, C.A. et al 2007) Garland Science, London, UK; Antibodies (P. Finch, 1997) Stride Publications, Devoran, UK; ANTIBODIES: A PRACTICAL APPROACH (D. Catty., ed., 1989) Oxford University Press, USA, New York NY); MONOCLONAL ANTIBODIES: A PRACTICAL APPROACH (Shepherd, P. et al Eds., 2000) Oxford University Press, USA, New York NY; USING ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL (Harlow, E. et al Eds., 1998) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; THE ANTIBODIES (Zanetti, M. et al Eds. 1995) Harwood Academic Publishers, London, UK); and DEVlTA, HELLMAN, AND ROSENBERG'S CANCER: PRINCIPLES & PRACTICE OF ONCOLOGY, EIGHTH EDITION, DeVita, V. et al. Eds. 2008, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA.와 같은, 문헌에서 충분히 설명된다.
II. 정의
여기에 사용된 바와 같이, 용어 "B7-H3"은 단백질의 사람 B7 과의 멤버인, 또한 CD276으로 알려진 Ig-유사 도메인을 가진 타입 I 막단백질을 나타낸다.용어 "2Ig-B7-H3"는 단지 두 개의 Ig-유사 도메인을 포함하는 B7-H3 형태를 나타낸다; 용어 "4Ig-B7-H3"는 네 개의 유사-도메인을 포함하는 B7-H3 형태를 나타낸다 (Sun, M. et al. (2002) "Characterization of Mouse and Human B7-H3 Genes" J. Immunol. 168: 6294-6297; Steinberger et al. (2004)"Molecular Characterization Of Human 4Ig-B7-H3, A Member Of The B7 Family With Four Ig-유사 도메인s" J. Immunol. 2004, 172(4): 2352-2359 and Castriconi et al. (2004) "Identification Of 4Ig-B7-H3 As A Neuroblastoma-Associated Molecule That Exerts A Protective Role From An NK Cell-Mediated Lysis; " Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 101(34): 12640-12645 참조). 항원 "TES7" (WO 2008/066691)는 4Ig-B7-H3의 특징을 공유하는 항원이다. 따라서, 특이적으로 TES7과의 결합한 항체는 4Ig-B7-H3와의 결합한다. TES7 항원은 하나 이상의 다른 에피토프를 가질 수도 있고 에피토프는 비-선형일 수도 있다. 여러 항-B7-H3 항체는, 4Ig-B7-H3 이소폼에만 존재하는 몇몇을 포함하는, 비선형 에피토프와의 결합하는 것이 알려져 있다. TES7은 그들의 정상적인 조직 대응물과 비교하여 특정 암 세포에서 과발현 될 수도 있다고 현재 생각된다.
B7-H3 기능의 작용제, 길항제, 및 다른 조절기는 명확히 본 발명의 범위 내에 포함된다. 이 작용제, 반작용제 및 조절기는 B7-H3의 하나 이상의 항원성 결정 인자 부위를 포함하거나, 하나 이상의 이러한 부위, 이러한 부위의 변이체, 또는 이러한 부위의 펩티도미메틱을 포함하는 폴리펩티드이다. 이들 작용제, 길항제, 및 B7-H37 조절기 화합물은 선형 또는 원형으로 제공되고, 자연에서 일반적으로 발견되지 않는 적어도 하나의 아미노산 잔기 또는 적어도 하나의 아미드 등배전자체를 선택적으로 포함한다. 이들 화합물은 글리코실화될 수도 있다.
여기에 사용된 바와 같이, 더 특이적으로, 용어 "B7-H3 조절기"는 (1) 사람 B7-H3 및 그것의 원래의 리간드 또는 항-B7-H3 항체 사이의 상호작용을 방해하거나 차단할 수 있고; (2) 사람 B7-H3 및 그것의 원래의 리간드 또는 항-B7-H3 항체와의 결합할 수 있고; (3) 사람 B7-H3 및 그것의 원래의 리간드 또는 항-B7-H3 항체와의 결합할 수 있는 항체의 제조에 사용될 수 있는 항원성 부위를 함유하고; (4) 사람 B7-H3 및 그것의 원래의 리간드 또는 항-B7-H3 항체와의 결합할 수 있는 항체의 선별에 사용될 수 있는 항원성 부위를 함유하고; (5) 사람 B7-H3 및 그것의 원래의 리간드 또는 항-B7-H3 항체 사이의 상호작용을 방해하거나 차단할 수 있는 항체의 제조에 사용될 수 있는 항원성 부위를 함유하고; (6) 사람 B7-H3 및 그것의 원래의 리간드 또는 항-B7-H3 항체 사이의 상호작용을 방해하거나 차단할 수 있는 항체의 선별에 사용될 수 있는 항원성 부위를 함유하는 한 화합물로서 정의된다. B7-H3 조절기는 그들의 활성이, 각각, T 세포 활성화를 향상시키거나 T 세포 활성화를 억제하는지에 의존적인 "B7-H3 작용제" 또는 "B7-H3 길항제"일 수도 있다.
B7-H3 작용제, 길항제 및 조절기는 B7-H3 변이체, B7-H3 펩티드 길항제, 펩티도미메틱, 및 작은 분자, 항-B7-H3 항체 및 면역글로불린 변이체, 아미노산 치환, 삭제, 및 추가 변이체를 포함하는 사람 B7-H3의 아미노산 변이체, 및 추가적인 변이체, 또는 이들의 조합, 및 키메라 면역글로불린을 포함한다. 본 발명의 B7-H3 작용제, 길항제 및 조절기는 사람 B7-H3와 그것의 원래의 리간드 또는 항-B7-H3 항체의 결합에 수반되는 B7-H3 도메인의 확인에 기초한다. 따라서, 본 발명은 사람 B7-H3의 항-B7-H3 결합 도메인 중 하나 이상을 복제하거나 모방하는 분자 구조를 가진 B7-H3 작용제, 길항제 및 조절기를 제공한다.
여기에 사용된 바와 같이, 용어 "B7-H3 변이체"는 아미노산 치환, 삭제, 및 추가 변이체를 포함하는, 사람 B7-H3의 한 아미노산 변이체, 또는 이들의 조합을 나타낸다. 정의는 사람 B7-H3/비-사람 키메라 및 다른 잡종 분자와 같은 키메라 분자를 포함한다. 또한 정의에 포함된 것들은 분자의 변이체 또는 잡종 영역 (들)을 포함하는 B7-H3 변이체 분자의 단편이다.
여기에 사용된 바와 같이"항체"는 면역글로불린 분자의 가변 영역에 위치한, 적어도 하나의 항원 인식 부위를 통해, 카르보히드레이트, 폴리뉴클레오티드, 지질, 폴리펩티드, 등과 같은 표적과 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 분자이다. 여기에 사용된 바와 같이, 용어는 온전한 다클론성 또는 단클론성 항체뿐만 아니라, 이들의 단편 (Fab, Fab', F(ab')2 Fv와 같은), 단일 사슬 (ScFv), 이들의 돌연변이, 자연적으로 발생한 변이체, 원하는 특이성의 항원 인식 부위를 가진 항체 일부를 포함하는 융합 단백질, 사람화된 항체, 키메라 항체"BiTEs?" "DART™ " 분자 및 원하는 특이성의 항원 인식 부위를 포함하는 면역글로불린 분자의 다른 변형된 배열을 포함한다.
용어 "BiTEs" (이중 특이적인 T- 세포 인게이저 (engager))는 두 개의 항원 결합 도메인을 갖는 단일 폴리펩티드 사슬 분자를 나타내고, 이것들 중 하나는 T- 세포 항원과의 결합하고 이것들 중 두 번째는 표적의 표면상에 존재하는 항원과의 결합한다 (WO 05/061547; Baeuerle, P et al. (2008) "BiTE?: A New Class Of Antibodies That Recruit T Cells " Drugs of the Future 33: 137-147; Bargou, et al. 2008) "Tumor Regression in Cancer Patients by Very Low Doses of a T Cell-Engaging Antibody" Science 321: 974-977).
용어 "DART™ " (이중 특이적 재표적화제)는 적어도 두 개의 에피토프 결합 부위를 형성하기 위해 결합된 (특히 공유결합의 상호작용을 통해) 적어도 두 개의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 면역글로불린 분자를 나타내는데, 이것은 같거나 다른 에피토프를 인식할 수도 있다. DART™ 의 폴리펩티드 사슬 각각은 면역글로불린 경쇄 가변 영역 및 면역글로불린 중쇄 가변 영역을 포함하지만, 이 영역들은 에피토프 결합 부위를 형성하기 위해 상호작용하지 않는다. 오히려, DART™ 폴리펩티드 사슬 중 하나 (예를 들어, 첫 번째)의 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 에피토프 결합 부위를 형성하기 위해 다른 (예를 들어, 두 번째) DART™ 폴리펩티드 사슬의 면역글로불린 경쇄 가변 영역과 상호작용한다. 유사하게, DART™ 폴리펩티드 사슬의 하나 (예를 들어, 첫 번째)의 면역글로불린 가변 영역은 에피토프 결합 부위를 형성하기 위해 다른 (예를 들어, 두 번째) DART™ 폴리펩티드 사슬의 면역글로불린 중쇄 가변 영역과 상호작용한다. DART™ 는 단일 특이적, 이중 특이적, 삼중 특이적, 등일 수도 있어서, 동시에 하나, 둘, 셋 이상의 다른 에피토프와의 결합할 수 있다 (이것은 같은 또는 다른 항원일 수도 있다). DART™ 는 추가적으로 1가, 2가, 3가, 4가, 5가, 6가, 등일 수도 있어서, 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯 이상의 분자와의 결합할 수 있다. DART™ 의 이 두 개의 특성 (즉, 특이성의 정도 및 원자가는 예를 들어 3가 (즉, 에피토프 네 세트와의 결합할 수 있는) 등인 이중 특이적 항체를 생산하기 위해 결합될 수도 있다 (즉, 두 개의 에피토프와의 결합할 수 있다)). DART™ 분자는 PCT 공개 WO 2006/113665, WO 2008/157379, 및 WO 2010/080538에 개시된다.
용어 "단클론성 항체"는 동질의 항체 집단을 나타내는데 단클론성 항체는 항원의 선택적인 결합에 수반되는 아미노산 (자연적으로 발생한 및 비-자연적으로 발생한)으로 구성된다. 단클론성 항체는 고도로 특이적이고, 단일 항원성 부위로 유도된다. 용어 "단클론성 항체"는 온전한 단클론성 항체 및 전체-길이 단클론성 항체뿐만 아니라, 이들의 단편 (Fab, Fab', F(ab')2 Fv와 같은), 단일 사슬 (ScFv), 이들의 돌연변이, 항체 일부를 포함하는 융합 단백질, 사람화된 단클론성 항체, 키메라화 단클론성 항체, 및 원하는 특이성의 항원 인식 부위 및 항원과의 결합하는 능력을 포함하는 면역글로불린 분자의 다른 변형된 배열을 포함한다. 항체의 공급원 또는 그것이 만들어진 방식 (예를 들어, 하이브리도마, 단계 선택, 재조합 발현, 유전자 변형 동물, 등)에 관하여 제한되려고 하지 않는다. 용어는 전체 면역글로불린뿐만 아니라 "항체"의 정의 하에 상기 설명된 단편 등을 포함한다.
용어 "사람화된 항체"는, 일반적으로 재조합 기술을 사용하여 제조된, 비-사람 종의 면역글로불린으로부터 유래한 항원 결합 부위 및 구조 및/또는 사람 면역글로불린의 서열에 기초한 분자의 남은 면역글로불린 구조를 갖는 키메라 분자를 나타낸다. 항원 결합 부위는 불변 도메인과 융합된 완전 가변 도메인 또는 가변 도메인의 적절한 프레임워크 영역에 이식된 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함할 수도 있다. 항원 결합 부위는 야생형 또는 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 변형될 수도 있다. 이것은 사람 개개의 면역원으로서 불변 영역을 제거하지만, 외부 가변 영역에 대한 면역 반응의 가능성은 남아있다 (LoBuglio, A.F. et al. (1989) "Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics and Immune Response" Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86: 4220-4224). 또 다른 접근은 사람 유래 불변 영역을 제공할 뿐만 아니라 사람 형태에 가능한 가깝게 그것들의 모양을 바꾸도록 가변 영역을 변형하는 것에 초점을 맞춘다. 중쇄 및 경쇄 둘 다의 가변 영역이 문제의 항원에 반응하여 변화하고 특정 종에서 비교적 보존되고 추정상 CDR을 위한 발판을 제공하는, 네 개의 프레임워크 영역에 의해 플랭킹된, 결합 능력을 결정하는 세 개의 상보성 결정 영역 (CDR)을 함유한다는 것은 알려져 있다. 비사람 항체가 특정 항원에 대해 제조될 때, 변형되기 위해 사람 항체에 존재하는 FR 상에 비사람 항체로부터 유래한 CHR을 이식함으로써 가변 영역은 "모양이 바뀌거나" "사람화"될 수 있다. 다양한 항체로 이 접근의 적용은 Sato, K. et al. (1993) Cancer Res 53: 851-856. Riechmann, L. et al. (1988) "Reshaping Human Antibodies for Therapy " Nature 332: 323-327; Verhoeyen, M. et al. (1988) "Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity " Science 239: 1534-1536; Kettleborough, C. A. et al. (1991) "Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR-Grafting: The Importance Of Framework Residues On Loop Conformation " Protein Engineering 4: 773-3783; Maeda, H. et al. (1991) "Construction Of Reshaped Human Antibodies With HIV-Neutralizing Activity" Human Antibodies Hybridoma 2: 124-134; Gorman, S. D. et al. (1991) "Reshaping A Therapeutic CD4 Antibody" Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88: 4181-4185; Tempest, P.R. et al. (1991) "Reshaping A Human Monoclonal Antibody To Inhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection in vivo" Bio/Technology 9: 266-271; Co, M. S. et al. (1991) "Humanized Antibodies For Antiviral Therapy" Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88: 2869-2873; Carter, P. et al. (1992) "Humanization Of An Anti-pl85her2 Antibody For Human Cancer Therapy " Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 89: 4285-4289; 및 Co, M.S. et al. (1992) "Chimeric and Humanized Antibodies With Specificity For The CD33 Antigen" J. Immunol. 148: 1149-1154에 의해 보고되었다. 일부 구체예에서, 사람화된 항체는 모든 CDR 서열을 보존한다 (예를 들어, 마우스 항체의 모든 6개의 CDR을 함유하는 사람화된 마우스 항체). 다른 구체예에서, 사람화된 항체는 원래의 항체에 관해 변화된 하나 이상의 CDR (하나, 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯)을 갖는데, 이것은 또한 원래의 항체의 하나 이상의 CDR로부터 "유래한" 하나 이상의 CDR이라고 칭한다.
여기에 사용된 바와 같이, 항체 또는 폴리펩티드가 대안의 에피토프와 비교하여 에피토프와 더 큰 지속 및/또는 더 큰 친화도로, 더 자주, 더 빠르게 반응하거나 결합하면"특이적으로" 또 다른 분자의 영역 (즉, 에피토프)에 결합한다. 예를 들어, B7-H3 에피토프와 특이적으로 결합하는 항체는 이 B7-H3와 더 큰 친화도, 욕망으로 더 쉽게, 및/또는 다른 B7-H3 에피토프 또는 비-B7-H3 에피토프와의 결합하는 것보다 더 큰 지속시간으로 결합하는 항체이다. 또한 이 정의를 읽음으로써 예를 들어, 특이적으로 첫 번재 표적과의 결합하는 항체 (또는 모이어티 또는 에피토프)는 특이적으로 또는 우선적으로 두 번째 표적에 결합할 수도 있고 아닐 수도 있다는 것이 이해된다. 이와 같이"특이적인 결합"은 필수적으로 독점적인 결합을 필요로 한다 (그것이 포함할 수 있지만). 일반적으로, 반드시, 결합에 대한 참고는 "특이적" 결합을 의미한다.
여기에 사용된 바와 같이"면역학적으로 활성"으로 존재하는 또는 "남아있는" 에피토프에 대한 참고 문헌에서 용어 "면역학적으로 활성"은 항체 (예를 들어, 항-B7-H3 항체)의 다른 조건 하에, 예를 들어, 에피토프가 감소하고 변성된 후 에피토프와의 결합하는 능력을 나타낸다.
다른 생물학적 기능은 특이적으로 B7-H3와의 결합하는 능력 (및 특히 암 세포의 표면상에 발현되는 B7-H3 분자로, 신장암, 전립선암, 또는 폐암 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않음); 원래의 항체가 우선적으로 결합하는 같은 B7-H3 에피토프와 우선적으로 결합하는 능력을 포함하는, 알려진 항-B7-H3 항체와 B7-H3의 우선적인 결합을 경쟁적으로 억제하는 능력; 시험관 내에서 또는 생체 내에서 생 세포의 표면상에 노출된 B7-H3의 일부와의 결합하는 능력; 방광암, 폐암 또는 신장암 세포와 같이, 하지만 이에 제한되지 않는, 생 암 세포의 표면상에 노출된 B7-H3의 일부와의 결합하는 능력; 표면에 B7-H3를 발현하는 암 세포 (신장암, 방광암, 또는 폐암 세포와 같은)에 화학치료제를 전달하는 능력; 및/또는 표면에 B7-H3을 발현하는 암 세포에 치료제 또는 검출 가능한 마커를 전달하는 능력 중 하나 이상을 포함하지만 이제 제한되지 않는, 항-B7-H3 항체와 관련된다. 여기에 논의된 바와 같이, 본 발명의 폴리펩티드 (항체를 포함)는 이 성질들 중 하나 이상을 가질 수도 있다.
"항-B7-H3 동등한 항체" 또는 "항-B7-H3 동등한 폴리펩티드"는 항-B7-H3 항체와 연관된 하나 이상의 생물학적 기능, 예를 들어, 결합 특이성을 갖는 항체 또는 폴리펩티드를 나타낸다.
여기에 사용된 바와 같이, 용어 "약제"는 생물학적, 약학적, 또는 화학적 화합물을 나타낸다. 비-제한적 예는 간단한 또는 복잡한 유기물 또는 무기물 분자, 폴리펩티드, 단백질, 올리고뉴클레오티드, 항체, 항체 유도체, 항체 단편, 비타민 유도체, 탄수화물, 독소, 또는 화학치료 화합물을 포함한다. 다양한 화합물, 예를 들어, 작은 분자 및 올리고머 (예를 들어, 올리고펩티드 및 올리고뉴클레오티드), 및 다양한 코어 구조에 기초한 합성 유기화합물은 합성될 수 있다. 게다가, 다양한 자연적 공급원은 선별을 위해 식물 또는 동물 추출물, 등과 같은 화합물을 제공할 수 있다.
본 발명의 방법에서 활용된 약제는 무작위로 선택되거나 이성적으로 선택되거나 조작될 수 있다. 여기에 사용된 바와 같이, 약제는 원래의 결합 파트너 (들) 또는 알려진 항체를 가진 분자의 결합에 수반된 특정 아미노산 또는 다른 화학적 모이어티의 사전 이해 또는 지식 없이 선택될 때, 무작위로 선택된다고 한다. 무작위로 선택된 약제의 예는 화학적 라이브러리 또는 펩티드 조합 라이브러리의 사용 및 선별을 통해 확인된 약제이다.
여기에 사용된 바와 같이, 약제는 표적 부위의 서열 및/또는 약제의 작용과 연관된 형태를 고려한 비-무작위적 근거로 선택될 때 이성저으로 선택되거나 조작된다고 한다. 항-B7-H3 약제에 대하여, 항체가 발생될 수 있는 B7-H3에 적어도 세 개의 에피토프가 있고, 그러므로 B7-H3/항-B7-H3 상호작용을 블록하는 약제의 적어도 세 개의 작용 부위가 있다. 다른 리간드 및 그들의 활성 B7-H3-상호작용 부위가 또한, 현재 알려지거나 후에 확인되는, 본 발명의 범위에 포함되지만, 본 발명은 또한 B7-H3 및 그것의 원래의 결합 파트너 사이의 상호작용 부위에서 작용하는 약제를 포함한다. 약제는 수용체/리간드 및/또는 B7-H3/항-B7-H3 항체 복합체의 접촉 부위로 구성된 펩티드 서열을 활용함으로써 이성적으로 선택되거나 이성적으로 조작될 수 있다. 예를 들어, 이성적으로 선택된 펩티드제는 원래의 환경에서 생 세포의 표면에 노출되기 때문에 아미노산 서열이 B7-H3에 나타나는 에피토프와 동일한 펩티드일 수 있다. 이러한 약제는, 원하는 바와 같이, 항-B7-H3 항체 또는 원래의 리간드와의 결합함으로써 항-B7-H3 항체와 B7-H3의 결합, 또는 B7-H3와 그것의 원래의 리간드의 결합을 감소시키거나 블록할 것이다.
여기에 사용된 바와 같이, 항체에 관하여, 용어 "표지된"은 방사성 약제 또는 플루오로포어 (예를 들어, 피코에리트린 (PE) 또는 플루오레세인 이소티오시안산염 (또한 플루오로이소티오시안산염 또는 FITC로 알려짐))와 같은, 검출 가능한 물질과 항체의 커플링 (즉, 물리적인 결합)에 의한 항체의 직접적인 표지, 뿐만 아니라 검출 가능한 물질과의 반응성에 의한 프로브 또는 항체의 간접적인 표지를 포함하려고 한다.
여기에 사용된 바와 같이, 항체에 관하여, 용어 "결합"은 약제 (예를 들어, 화학치료제)와 항체의 공유 및 비-공유 부착 또는 결합을 포함한다. 항체는 직접적인 결합 또는 항체가 항체가 결합할 수 있는 암 세포에 대한 약제의 국부성으로 이끄는, 일반적인 플랫폼에 부착을 통한 간접적인 결합에 의해 약제 (예를 들어, 화학치료제)와의 결합될 수 있고 항체 및 약제는 실질적으로 약제가 항체가 결합하는 같은 암 세포를 표적화하지 않고 약제의 효능이 감소하지 않는 생리학적 조건 하에 분리하지 않는다.
용어 "생물학적 샘플은 개개로부터 얻은 다양한 샘플 타입을 포함하고 진단적 또는 관찰 검정에 사용될 수 있다. 정의는 타액, 혈액 및 생물학적 기원의 다른 액체 샘플, 생검 표본 또는 조직 배양 또는 그로부터 유래한 세포와 같은, 고체 조직 샘플, 및 난소, 폐, 전립선, 췌장, 결장, 및 유방 조직의 바람직한 구체예에서, 이들의 후대, 예를 들어, 암에 걸릴 것으로 예상되는 개개로부터 수거된 조직 샘플로부터 얻은 세포를 포함한다. 정의는 또한 조달 후, 약제의 처리, 가용성 시험, 또는 단백질 또는 폴리뉴클레오티드와 같은, 특정 성분의 농축, 절편의 목적을 위한 반-고체 또는 고체 매트릭스에서 포매와 같은, 어떤 방법으로든 조작된 샘플을 포함한다. 용어 "생물학적 샘플"은 임상적 샘플을 포함하고, 또한 배양 중인 세포, 세포 상층액, 세포 용해물, 혈청, 혈장, 생물학적 유체, 및 조직 샘플을 포함한다.
용어 "숙주 세포"는 폴리뉴클레오티드 삽입의 결합을 위한 벡터 (들)를 받는 것일 수도 있거나 또는 그것인 개개의 세포 또는 세포 배양을 포함한다. 숙주 세포는 단일 숙주 세포의 후대를 포함하고, 후대는 원래의 환자 세포와 반드시 완벽하게 동일하지 않을 수도 있다 (형태에서 또는 게놈 DNA 상보성에서). 숙주 세포는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 (들)을 생체 내에 트랜스펙션한 세포를 포함한다.
여기에 사용된 바와 같이, 용어 "전이의 발전 지연"은 전이의 발전을 연기, 저해, 늦춤, 지연, 안정화, 및/또는 연기하는 것을 의미한다. 이 지연은 암의 역사 및/또는 치료되는 개개에 의존적으로, 다양한 길이의 시간일 수 있다. 당업자에게 명백하기 때문에, 충분한 또는 중대한 지연은, 개개이 전이를 발전시키지 않는다는 점에서, 사실상, 방지를 포함한다.
여기에 사용된 바와 같이, 한 구체예에서, 약학적 조성물의 "유효량"은 제한 없이, 종양의 크기 감소 (예를 들어, 유방암 또는 전립선암과 같은 암의 맥락에서), 암 세포 성장의 지연, 전이의 발전의 지연, 질환으로부터 일어난 증상의 완화, 질환으로부터 고통받는 사람의 삶의 질 향상, 질환을 치료하는데 필요한 다른 약물 치료의 투여량 감소, 표적화 및/또는 내면화를 통하는 것과 같은 또 다른 약물 치료의 효과 향상, 질환의 진행 지연, 및/또는 개개의 생존 연장을 포함하는 이로운 또는 원하는 결과에 영향을 미치는데 충분한 양이다. 유효량은 하나 이상의 투여로 투여될 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 약, 화합물, 또는 약학적 조성물의 유효량은 직접적으로 또는 간접적으로, 암 세포의 증식을 감소시키고 (파괴하고) 암 세포의 전이의 발전, 또는 성장을 감소 및/또는 지연하는데 충분한 양이다. 일부 구체예에서, 약, 화합물, 또는 약학적 조성물의 유효량은 또 다른 약, 화합물, 또는 약학적 조성물의 결합으로 이루어질 수도 있고 아닐 수도 있다. 따라서"유효량"은 하나 이상의 화학치료제의 투여의 맥락에서 이해될 수도 있고, 하나 이상의 다른 약제와의 결합으로, 원하는 결과가 이루어질 수도 있고 이루어진다면, 단일 약제는 유효량으로 제공될 수도 있다. 개개의 필요는 다양하지만, 각 성분의 유효량의 최선의 범위의 결정은 업계의 기술 내에 있다. 전형적인 투여량은 0.1 내지 100 mg/kg/체중을 포함한다. 바람직한 투여량은 1 내지 100 mg/kg/체중을 포함한다. 가장 바람직한 투여량은 10 내지 100 mg/kg/체중을 포함한다.
여기에 사용된 바와 같이, 핵산 분자 또는 약제, 항체, 조성물 또는 세포 등은 "분리된" 것이다. 핵산 분자, 약제, 항체, 조성물, 또는 세포 등이 실질적으로 그것의 원래의 공급원에 자연적으로 존재하는 오염물질 핵산 분자, 항체, 약제, 조성물, 또는 세포 등으로부터 분리된다.
용어 "개개"는 척추동물, 바람직하게 포유동물을 나타낸다. 포유동물은 사람, 가축, 스포츠 동물, 애완동물, 영장류, 마우스 및 래트를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 가장 바람직한 구체예에서, 용어 개개는 사람을 나타낸다.
용어 "폴리펩티드""올리고펩티드""펩티드" 및 "단백질"은 어느 길이의 아미노산 폴리머를 나타내기 위해 여기에서 교체하여 사용될 수 있다. 폴리머는 선형 또는 분지형이고, 그것은 변형된 아미노산을 포함할 수도 있고, 그것은 비-아미노산에 의해 방해될 수도 있다. 용어는 또한 자연적으로 또는 간섭에 의해 변형된 아미노산 폴리머를 포함한다; 예를 들어, 이황화 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 표지 구성 요소와 접합과 같은 다른 조작 또는 변형. 또한 정의 내에 포함되는 것은, 예를 들어, 하나 이상의 아미노산 유사체 (예를 들어, 비자연적 아미노산 등을 포함), 뿐만 아니라 업계에 알려진 다른 변형을 함유하는 폴리펩티드이다. 본 발명의 폴리펩티드가 항체에 기초하기 때문에, 폴리펩티드는 단일 사슬으로서 또는 결합된 사슬으로서 발생할 수 있고 생각된다.
또한 본 발명의 범위 내에 포함된 것들은 여기에 설명된 B7-H3 펩티드 작용제, 길항체 및 조절기 (항-B7-H3 항체를 포함)의 펩티도미메틱스이다. 이러한 펩티도미메틱스는 펩티드를 포함하는데, 적어도 하나의 아미노산 잔기가 아미노산의 D 이성질체, 아미노산의 N-알킬화된 종과 같은, 자연에서 일반적으로 발견되지 않는 아미노산 잔기로 치환된다. 다른 구체예에서, 펩티도미메틱스는 B7-H3 펩티드 작용제, 길항체 및 조절기의 하나 이상의 아미드 결합 (-C(=0)-NH-)을 아미드 등배전자체로 대체함으로써 구성된다. 적합한 아미드 등배전자체는 -CH2-NH-, -CH2-S-, -CH2-S(0)-, -CH2-S(0)2-, -CH2-CH2- -CH=CH- (E 또는 Z 형), -C(=0)-CH2- -CH(CN)-NH--C(OH)-CH2-, 및 -0-C(=0)-NH-을 포함한다. 아미드 등배전자체로 대체를 위한 적합한 후보인 B7-H3 펩티드 작용제, 길항제 또는 조절기의 아미드 결합은 B7-H3 펩티드 작용제, 길항제 또는 조절기 처리의 의도된 대상체의 내인성 에스테라제 또는 프로테아제에 의해 가수분해할 수 있는 결합을 포함한다.
여기에 사용된 바와 같이, 용어 "실질적으로 순수"는 적어도 50% 순수한 (즉, 오염물질로부터 자유로움), 더 바람직하게 적얻 90% 순수한, 더 바람직하게 95% 순수한, 더 바람직하게 98% 순수한, 더 바람직하게 99% 순수한, 및 가장 바람직하게 99% 이상 순수한 물질을 나타낸다.
여기에 사용된 바와 같이, 용어 "독소"는 세포 내에 부정적인 반응을 일으키는 물질을 나타낸다. 예를 들어, 암 세포와 관련된 독소는 암 세포에 대한 부정적인, 가끔 유해한 효과를 갖는다. 독소의 예는 탁산, 메이탄시노이드, 아우리스타틴 (예를 들어, 일메틸 아우리스타틴 (MMAE), 일메틸 아우리스타틴 에프 (MMAF), 아우리스타틴 E (AE), 등) (미국 특허 번호 5,208,020; 5,416,064; 6,333,410; 6,340,701; 6,372,738; 6,436,931; 6,441,163; 6,596,757; 7,276,497; 7,585,857; 또는 7,851,432에 개시된 것들과 같은) 칼리키아마이신, 안트라사이클린 (예를 들어, 독소루비신), CC-1065 유사체, 도세탁셀; 카텝신 B 또는 E; 리신, 젤로닌, 슈도모나스 엑소톡신, 디프테리아 톡신, 및 RNA 분해효소; 방사성 표지된 항체 (예를 들어, 티욱세탄-접합된 또는 유독성 방사성동위원소 (예를 들어, 90Y; 131I, 177Lu, 186Re, 188Re, 211At, 212Bi, 213Bi, 225Ac, 등))을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
여기에 사용된 바와 같이, 용어 "치료" 또는 "치료하는"은 바람직하게 이로운 또는 원하는 임상적 결과를 포함하는, 이로운 또는 원하는 결과를 얻기 위한 접근을 나타낸다. 이러한 이로운 또는 원하는 임상적 결과는 다음 중 하나 이상을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다: 암 세포 또는 다른 질환 세포의 증식을 감소 (또는 파괴), 암에서 발견된 암 세포의 전이 감소, 종양의 크기 감소, 질환으로부터 일어난 증상의 완화, 질환으로부터 고통받는 사람의 삶의 질 향상, 질환을 치료하는데 필요한 다른 약물 치료의 투여량 감소, 질환의 진행 지연, 및/또는 개개의 생존 연장.
여기에 사용된 바와 같이, 용어 암은 부신 종양, AIDS 관련 암, 꽈리 연부 육종, 성상 세포 종양, 방광암 (편평 세포 암종 및 이행 상피암), 뼈암 (법랑질종 (adamantinoma), 동맥류 뼈낭종 (aneurismal bone cyst), 뼈연골증 (osteochondroma), 골육종 (osteosarcoma)), 뇌척수암, 뇌전이암, 유방암, 경동맥 체 종양, 자궁경부암, 연골육종, 척색종, 혐색소형 신 세포암, 투명 세포암, 결장암, 결장암, 대장암, 양성 피부 섬유종, 결체조직 소원형 세포암, 상의 세포종, 유윙 종양, 골격 외 점액성 연골육종, 섬유 조직 형성 부전증, 뼈의 섬유성 이형성증, 담낭암 또는 담관암, 위암, 임신성 융모질환, 생식 세포 종양, 두경부암, 간암, 도 세포 종양, 카포시 육종, 신장암 (신아 세포종 (nephroblastoma), 유두신 세포암 (papillary renal cell carcinoma)), 백혈병, 지방종/산후 지방종성 종양, 지방육종/악성 지방성 종양, 간암, 림프종, 폐암, 수모 세포종, 흑색종, 뇌수막종, 다발성 내분비 종양증, 다발성 골수종, 골수형성이상 증후군, 신경아 세포종, 신경계 내분비 종양, 난소암, 췌장암, 갑상선 유두암, 부갑상선 종양, 소아암, 말초신경초종양, 크롬친화 세포종, 뇌하수체 종양, 전립선암, 후포도막 흑색종, 희귀 적혈구 장애, 신장전이암, 횡문양 신장 종양, 횡문근육종, 육종, 피부암, 연부조직육종, 편평상피 세포암, 위암, 활막육종, 고환암, 흉선암, 흉선종, 갑상선전이암, 및 자궁암 (자궁경부암, 자궁내막암, 및 자궁근종)의 세포로 구성된 그룹으로부터 선택되는 암 세포의 존재에 의해 특징지어지는 암을 포함한다.
III. 항체 및 폴리펩티드를 만드는 방법
단클론성 항체를 만드는 방법은 업계에 알려져 있다. 활용될 수도 있는 한 방법은 Kohler, G. et al. (1975) "Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody Of Predefined Specificity " Nature 256: 495-497의 방법이거나 이들의 변형이다. 전형적으로, 단클론성 항체는 마우스와 같은, 비-사람 종에서 개발된다. 일반적으로, 마우스 또는 래트는 면역화에 사용되지만 다른 동물이 또한 사용될 수도 있다. 항체는 세포, 세포 추출물, 또는 사람 B7-H3을 함유하는 단백질 제조의 면역원성 양으로 마우스를 면역화함으로써 생산된다. 면역원은 1차 세포, 배양 세포주, 암 세포, 핵산, 또는 조직을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 한 구체예에서, 사람 폐 암종 세포를 사용하였다. 면역화에 사용된 세포, 예를 들어, 사람 고환 또는 췌장 선암 또는 위 세포는 면역원으로 사용 전 한동안 (예를 들어, 적어도 24시간) 배양될 수도 있다. 세포 (예를 들어, 사람 고환, 위, 또는 췌장 선암 세포)들은 자체로 또는 리비와 같은, 비-변성 보조제와의 결합하여 면역원으로서 사용될 수도 있다. 일반적으로, 세포는 온전하게 유지되어야 하고 면역원으로 사용될 때 바람직하게 실행 가능해야 한다. 온전한 세포는 면역화된 동물에 의해 파열된 세포보다 항원이 더 잘 검출되도록 허용한다. 변성된 또는 거친 보조제, 예를 들어, 프로이트 보조제는 세포를 파열시킬 수도 있고 그러므로 절망한다. 면역원은 격주, 또는 매주와 같이, 주기적인 간격으로 여러 번 투여될 수도 있거나, 동물에서 (예를 들어, 조직 재조합에서) 생존력을 유지하기 위해 이러한 방식으로 투여될 수도 있다.
한 구체예에서, B7-H3와의 결합하는 단클론성 항체는 면역원으로 B7-H3를 과발현하는 숙주 세포를 사용함으로써 얻어진다. 이러한 세포는 사람 폐 암종 세포 및 사람 결장 암 세포를 예의 방법으로 포함하지만 제한되지 않는다.
항체 반응을 관찰하기 위해서, 작은 생물학적 샘플 (예를 들어, 혈액)은 동물로부터 얻어질 수 있고 면역원에 대한 항체 적정 농도에 대해 테스트될 수도 있다. 비장 및/또는 여러 큰 림프절은 제거될 수 있고 단일 세포로 분리될 수 있다. 원한다면, 비장 세포는 항원으로 코팅된 플레이트 또는 웰에 세포 현탁액을 적용함으로써 (비-특이적 부착 세포의 제거 후) 선별될 수도 있다. 항원에 특이적인 막-결합 면역글로불린을 발현하는, B 세포는 플레이트와의 결합할 것이고, 현탁액 나머지와 함께 씻겨나가지 않는다. 결과로 얻은 B 세포, 또는 모든 분리된 비장 세포는 그때 골수종 세포 (예를 들어, X63- Ag8.653 및 Salk Institute, Cell Distribution Center, San Diego, CA의 것들)와 융합될 수 있다. 하이브리도마를 형성하기 위해 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)은 비장 또는 림프 세포와 골수종 세포가 융합하는데 사용될 수도 있다. 그때 하이브리도마는 선택 배지 (예를 들어, 하이포크산틴, 아미놉테린, 티미딘 배지"HAT 배지"로 알려진 다른 것들)에서 배양되었다. 결과로 얻은 하이브리도마는 제한된 희석으로 도말하였고, 예를 들어, FACS (형광발광 활성화된 세포 분류) 또는 면역조직화학법 (IHC) 선별을 사용하여, 면역원과 특이적으로 결합하는 항체의 생산에 대해 검정하였다. 선택된 단클론성 항체-분비 하이브리도마를 시험관 내에서 (예를 들어, 조직 배양 병 또는 실관 반응기에서), 또는 생체 내에서 (예를 들어, 마우스의 복수에서) 배양하였다.
세포 융합 기술에 대한 또 다른 대안으로서, 엡스타인-바 바이러스 (EBV)-불멸화된 B 세포는 본 발명의 단클론성 항체를 생산하기 위해 사용될 수도 있다. 하이브리도마는 확장되고, 원한다면, 계대배양되고, 상층액은 고전적인 검정 방법 (예를 들어, FACS, IHC, 방사성면역검정, 효소 면역검정, 형광발광 면역검정, 등)에 의해 항-면역원 활성에 대해 검정 된다.
또 다른 대안에서, 항-B7-H3 단클론성 항체 및 다른 동등한 항체는 서열화될 수 있고 업계에 알려진 수단 (예를 들어, 사람화, 완벽히 사람 항체를 생산하기 위해 유전자 변형 마우스의 사용, 파지 디스플레이 기술, 등)에 의해 재조합으로 생산될 수 있다. 한 구체예에서, 항-B7-H3 단클론성 항체는 서열화되고 폴리뉴클레오티드 서열은 발현 또는 증식을 위해 벡터로 클로닝된다. 원하는 항체를 암호화하는 서열은 숙주 세포의 벡터에서 유지될 수도 있고 숙주 세포는 미래의 사용을 위해 확장되고 얼려진다.
항-B7-H3 단클론성 항체 및 다른 동등한 항체의 폴리뉴클레오티드 서열은 "사람화된" 항체를 발생시키기 위해, 친화도, 또는 항체의 다른 특징을 향상시키기 위해 유전적인 조작에 사용될 수도 있다. 항체의 사람화에서 일반적인 원칙은 항체의 비-사람 나머지와 사람 항체 서열을 바꾸는 동안, 항체의 항원-결합 부분의 기본 서열을 유지하는 것을 수반한다. 단클론성 항체를 사람화하는 네 개의 일반적인 단계가 있다. (1) 시작 항체 경쇄 가변 도메인 및 중쇄 가변 도메인의 뉴클레오티드 및 예측된 아미노산 서열을 결정하는 단계 (2) 사람화된 항체를 조작하는 단계, 즉, 사람화 과정 중에 사용할 항체 프레임워크 영역을 결정하는 단계 (3) 실제의 사람화 방법론/기술 및 (4) 사람화 항체의 트랜스펙션 및 발현 단계가 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567; 5,807,715; 5,866, 692; 및 6,331,415 참조.
쥐 또는 사람 불변 도메인과 융합된 변형된 쥐 V 영역 및 그들의 연관된 상보성 결정 영역 (CDR)을 갖는 키메라 항체를 포함하는, 비-사람 면역글로불린으로부터 유래한 항원-결합 부위를 포함하는 많은 "사람화된" 항체 분자가 설명되었다 (예를 들어, Winter et al. (1991) "Man-made Antibodies" Nature 349: 293-299; Lobuglio et al. (1989) "Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics and Immune Response" Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86: 4220-4224 (1989), Shaw et al. (1987) "Characterization Of A Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody (17-1A) To A Colon Cancer Tumor-Associated Antigen" J. Immunol. 138: 4534-4538, 및 Brown et al. (1987) "Tumor-Specific Genetically Engineered Murine/Human Chimeric Monoclonal Antibody" Cancer Res. 47: 3577-3583 참조). 다른 참고문헌은 적절한 사람 항체 불변 도메인과 융합 전 사람 지지 프레임워크 영역 (FR)에 이식된 쥐 CDR을 설명한다 (Riechmann, L. et al. (1988) "Reshaping Human Antibodies for Therapy" Nature 332: 323-327; Verhoeyen, M. et al. (1988) "Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity" Science 239: 1534-1536; 및 Jones et al. (1986) "Replacing The Complementarity-Determining Regions In A Human Antibody With Those From A Mouse" Nature 321: 522-525 참조). 또 다른 참고문헌은 재조합으로 형식적인 쥐 프레임워크 영역에 의해 지지되는 쥐 CDR을 설명한다. 예를 들어, 유럽 특허 공개 번호 519,596 참조. 이 "사람화" 분자는 쥐 항-사람 항체 분자에 대한, 원하지 않는 면역학적 반응을 최소화하기 위해 조작되는데, 이것은 사람 수용체에서 그들의 모이어티의 치료적 적용의 기간 및 유효성을 제한한다. 또한 활용될 수 있는 항체를 사람화할 수 있는 다른 방법은 Daugherty et al. (1991) "Polymerase Chain Reaction Facilitates The Cloning, CDR-Grafting, and Rapid Expression Of A Murine Monoclonal Antibody Directed Against The CD18 Component Of Leukocyte Integrins" Nucl. Acids Res. 19: 2471-2476에 의해 및 미국 특허 번호 6,180, 377; 6,054,297; 5,997,867; 및 5,866,692에 개시된다.
본 발명은 또한 mu-항-B7-H3와 같은, 본 발명의 항체의 단일 사슬 가변 영역 단편 ("scFv")를 포함한다. 단일 사슬 가변 영역 단편은 짧은 결합 펩티드를 사용하여 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역을 결합함으로써 만들어진다. Bird et al. (1988) ("Single-Chain Antigen-Binding Proteins" Science 242: 423-426)는 한 가변 영역의 카르복시 말단 다른 가변 영역의 아미노 말단 사이의 약 3.5 nm를 연결하는 결합 펩티드의 예를 설명한다. 다른 서열의 결합자는 조작되고 사용되었다 (Bird et al. (1988) "Single-Chain Antigen-Binding Proteins" Science 242: 423-426). 결합기는 약의 부착 또는 고체 지지대에 부착과 같은, 추가적인 기능을 위해 차례로 변형될 수 있다. 단일 사슬 변이체는 재조합으로 또는 합성으로 생산될 수 있다. scFv의 합성 생산을 위해, 자동화된 합성기가 사용될 수 있다. scFv의 재조합 생산을 위해, scFv를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는, 효모, 식물, 곤충 또는 포유동물 세포와 같은, 진핵 세포, 또는 대장균과 같은, 원핵 세포인, 적합한 숙주 세포로 도입될 수 있다. 원하는 scFv를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드의 결찰과 같은 통상적인 조작에 의해 만들어질 수 있다. 결과로 생긴 scFv는 업계에 알려진 표준 단백질 정제 기술을 사용하여 분리될 수 있다.
본 발명은 성질과 향상된 또는 감소된 활성을 갖는 변이체에 크게 영향을 미치지 않는 기능적으로 동등한 항체 및 폴리펩티드를 포함하는, B7-H3 및 그것의 작용제, 길항제, 및 조절기와의 결합하는 항체 및 폴리펩티드에 대한 변형을 포함한다. 폴리펩티드의 변형은 업계에서 통상적인 실행이고 여기에 상세히 설명할 필요는 없다. 변형된 폴리펩티드의 예는 아미노산 잔기의 보존적 치환, 크게 유해하게 기능적 활성을 변화시키지 않는 아미노산의 하나 이상의 삭제 또는 추가를 갖는 폴리펩티드, 또는 화학적 유사체의 사용을 포함한다. 하나의 또 다른 것에 대해 보존적으로 치환될 수 있는 아미노산 잔기는 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 글리신/알라닌; 발린/이소루신/루신; 아스파라긴/글루타민; 아스파르트산/글루탐산; 세린/트레오닌; 리신/아르기닌; 및 페닐알라닌/티로신. 이 폴리펩티드는 또한 글리코실화 및 비글리코실화된 폴리펩티드, 뿐만 아니라, 예를 들어, 다른 당을 갖는 글리코실화, 아세틸화, 인산화와 같은, 다른 번역 후 변형을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 바람직하게, 아미노산 치환은 보존적이다, 즉, 치환된 아미노산은 원래의 아미노산과 유사한 화학적 성질을 갖는다. 이러한 보존적 치환은 업계에 알려져 있고, 예는 상기 제공되었다. 아미노산 변형은 하나 이상의 아미노산의 변화 또는 변형에서부터 가변 영역과 같은, 영역의 재조작을 완료하는 것일 수 있다. 가변 영역의 변화는 결합 친화도 및/또는 특이성이 달라질 수 있다. 변형의 다른 방법은 효소에 의한 방법, 산화의 치환 및 킬레이트화를 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 업계에 알려진 커플링 기술을 사용하는 단계를 포함한다. 변형은, 예를 들어, 방사성 면역 검정을 위한 방사성 모이어티의 부착과 같은, 면역 검정을 위한 표지의 부착에 사용될 수 있다. 변형된 폴리펩티드는 업계에서 기존의 과정을 사용하여 만들어지고 업계에 알려진 표준 검정을 사용하여 선별될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드 및 항체의 하나 이상의 단편 또는 영역을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 한 구체예에서, 가변 경쇄 영역의 적어도 10개의 인접한 아미노산 및 가변 중쇄 영역의 적어도 10개의 인접한 아미노산을 포함하는 융합 폴리펩티드가 제공된다. 또 다른 구체예에서, 융합 폴리펩티드는 이종 면역글로불린 불변 영역을 함유한다. 또 다른 구체예에서, 융합 폴리펩티드는 공개적으로 증착된 하이브리도마로부터 생산된 항체의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함한다. 본 발명의 목적에 대해, 항체 융합 단백질은 B7-H3 및 원래의 분자에서 그것이 부착되는 또 다른 아미노산 서열, 예를 들어, 이종 서열 또는 또 다른 영역의 동종 서열과 특이적으로 결합하는 하나 이상의 폴리펩티드 도메인을 함유한다.
항-B7-H3 폴리펩티드, 및 다른 B7-H3 작용제, 길항제 및 조절기는 업계에 알려진 방법에 의해, 예를 들어, 합성으로 또는 재조합으로 생성될 수 있다. B7-H3 펩티드 작용제, 길항제 및 조절기를 생산하는 한 방법은 폴리펩티드의 화학적 합성 후, 원래의 형태, 즉, 정확한 이황화 결합 연결을 얻기에 적절한 산화 조건 하에 처리를 수반한다. 이것은 당업자에 잘 알려진 방법론을 사용하여 성취될 수 있다 (Kelley, R. F. et al. (1990) In: GENETIC ENGINEERING PRINCIPLES and METHODS, Setlow, J.K. Ed., Plenum Press, N.Y., vol. 12, pp 1-19; Stewart, J.M et al. (1984) SOLID PHASE PEPTIDE SYNTHESIS, Pierce Chemical Co., Rockford, IL 참조; 미국 특허 번호 4,105,603; 3,972,859; 3,842,067; 및 3,862,925 또한 참조).
본 발명의 폴리펩티드는 고체상 펩티드 합성 (Merrifield, B. (1986) "Solid Phase Synthesis" Science 232(4748): 341-347; Houghten, R.A. (1985) "General Method For The Rapid Solid-Phase Synthesis Of Large Numbers Of Peptides: Specificity Of Antigen-Antibody Interaction At The Level Of Individual Amino Acids" Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 82(15): 5131-5135; Ganesan, A. (2006) "Solid-Phase Synthesis In The Twenty-First Century " Mini Rev. Med. Chem. 6(1): 3-10)을 사용하여 고전적으로 제조될 수도 있다.
또 다른 대안으로, 완벽한 사람 항체는 특이적 사람 면역글로불린 단백질을 발현하기 위해 조작된 상업적으로 사용 가능한 마우스의 사용을 통해 얻을 수 있다. 더 많은 원하는 (예를 들어, 완벽히 사람 항체) 또는 더 강력한 면역 반응을 생산하기 위해 조작된 유전자 변형 동물은 또한 사람화된 또는 사람 항체의 발생을 위해 사용될 수도 있다. 이러한 기술의 예는 XENOMOUSE™ (Abgenix, Inc., Fremont, CA) 및 HUMAB-MOUSE? 및 TC MOUSE™이다 (둘 다 Medarex, Inc., Princeton, NJ).
한 대안으로, 항체는 재조합으로 만들어질 수도 있고 업계에 알려진 어느 방법을 사용해서도 발현될 수 있다. 항체는 먼저 숙주 동물로부터 만들어진 항체를 분리하고, 유전자 서열을 얻고, 숙주 세포 (예를 들어, CHO 세포)에서 재조합으로 항체를 발현하기 위해 유전자 서열을 사용함으로써 재조합으로 만들어질 수 있다. 활용될 수도 있는 또 다른 방법은 식물 (예를 들어, 담배) 또는 유전자 변형 우유에서 항체 서열을 발현하는 것이다. 식물 또는 우유에서 재조합으로 항체를 발현에 적합한 방법이 개시되었다 (예를 들어, Peeters et al. (2001) "Production Of Antibodies and Antibody Fragments In Plants" Vaccine 19: 2756; Lonberg, N. et al. (1995) "Human Antibodies From Transgenic Mice" Int. Rev. Immunol 13: 65-93; 및 Pollock et al. (1999) "Transgenic Milk As A Method For The Production Of Recombinant Antibodies" J. Immunol Methods 231: 147-157 참조). 항체, 예를 들어, 사람화된, 단일 사슬, 등의 유도체를 만드는데 적합한 방법은 업계에 알려져 있다. 또 다른 대안으로, 항체는 파지 디스플레이 기술에 의해 재조합으로 만들어질 수도 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,565,332; 5,580,717; 5,733,743; 6,265,150; 및 Winter, G. et al. (1994) "Making Antibodies By Phage Display Technology " Annu. Rev. Immunol. 12.433-455 참조).
원하는 항체 또는 단백질은 Edman 분해법에 의해 시퀀싱될 수도 있는데, 이것은 당업자에 잘 알려져 있다. 질량 분석기 또는 Edman 분해법으로부터 발생된 펩티드 정보는 원하는 단백질의 클로닝에 사용되는 프로브 또는 프라이머를 조작하기 위해 사용될 수도 있다.
원하는 단백질을 클로닝하는 대안의 방법은 원하는 항체 또는 단백질을 발현하는 세포에 대해 정제된 B7-H3 또는 이들의 일부를 사용하는 "패닝 (panning)"에 의한 것이다. B7-H3은 "2Ig" 형태로 존재하고 "4Ig" 형태로서 존재한다. 사람 B7-H3의 "2Ig" 형태의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO: l)이다:
MLRRRGSPGM GVHVGAALGA LWFCLTGALE VQVPEDPWA LVGTDATLCC SFSPEPGFSL AQLNLIWQLT DTKQLVHSFA EGQDQGSAYA NRTALFPDLL AQGNASLRLQ RVRVADEGSF TCFVSIRDFG SAAVSLQVAA PYSKPSMTLE PNKDLRPGDT VTITCSSYRG YPEAEVFWQD GQGVPLTGNV TTSQMANEQG LFDVHSVLRV VLGANGTYSC LVRNPVLQQD AHGSVTITGQ PMTFPPEALW VTVGLSVCLI ALLVALAFVC WRKIKQSCEE ENAGAEDQDG EGEGSKTALQ PLKHSDSKED DGQEIA.
사람 B7-H3의 "2Ig" 형태를 암호화하는 cDNA 서열은 (SEQ ID NO: 2)이다:
atgctgcgtc ggcggggcag ccctggcatg ggtgtgcatg tgggtgcagc cctgggagca ctgtggttct gcctcacagg agccctggag gtccaggtcc ctgaagaccc agtggtggca ctggtgggca ccgatgccac cctgtgctgc tccttctccc ctgagcctgg cttcagcctg gcacagctca acctcatctg gcagctgaca gataccaaac agctggtgca cagctttgct gagggccagg accagggcag cgcctatgcc aaccgcacgg ccctcttccc ggacctgctg gcacagggca acgcatccct gaggctgcag cgcgtgcgtg tggcggacga gggcagcttc acctgcttcg tgagcatccg ggatttcggc agcgctgccg tcagcctgca ggtggccgct ccctactcga agcccagcat gaccctggag cccaacaagg acctgcggcc aggggacacg gtgaccatca cgtgctccag ctaccggggc taccctgagg ctgaggtgtt ctggcaggat gggcagggtg tgcccctgac tggcaacgtg accacgtcgc agatggccaa cgagcagggc ttgtttgatg tgcacagcgt cctgcgggtg gtgctgggtg cgaatggcac ctacagctgc ctggtgcgca accccgtgct gcagcaggat gcgcacggct ctgtcaccat cacagggcag cctatgacat tccccccaga ggccctgtgg gtgaccgtgg ggctgtctgt ctgtctcatt gcactgctgg tggccctggc tttcgtgtgc tggagaaaga tcaaacagag ctgtgaggag gagaatgcag gagctgagga ccaggatggg gagggagaag gctccaagac agccctgcag cctctgaaac actctgacag caaagaagat gatggacaag aaatagcc.
사람 B7-H3 (SEQ ID NO: l)의 "2Ig" 형태의 아미노산 서열 (하기 굵은 글씨 및 밑줄로 나타남)은 사람 B7-H3 (SEQ ID NO: 76)의 "4Ig" 형태 내에 완벽히 받아들여진다:
MLRRRGSPGM GVHVGAALGA LWFCLTGALE VQVPEDPWA LVGTDATLCC SFSPEPGFSL AQLNLIWQLT DTKQLVHSFA EGQDQGSAYA NRTALFPDLL AQGNASLRLQ RVRVADEGSF TCFVSIRDFG SAAVSLQVAA PYSKPSMTLE PNKDLRPGDT VTITCSSYQG YPEAEVFWQD GQGVPLTGNV TTSQMANEQG LFDVHSILRV VLGANGTYSC LVRNPVLQQD AHSSVTITPQ RSPTGAVEVQ VPEDPVVALV GTDATLCSF SPEPGFSLAQ LNLIWQLTDT KQLVHSFTEG RDQGSAYANR TALFPDLLAQ GNASLRLQRV RVADEGSFTC FVSIRDFGSA AVSLQVAAPY SKPSMTLEPN KDLRPGDTVT ITCSSYRGYP EAEVFWQDGQ GVPLTGNVTT SQMA EQGLF DVHSVLRWL GANGTYSCLV RNPVLQQDAH GSVTITGQPM TFPPEALWVT VGLSVCLIAL LVALAFVCWR KIKQSCEEEN AGAEDQDGEG EGSKTALQPL KHSDSKEDDG QEIA
사람 B7-H3의 "4Ig" 형태를 암호화하는 cDNA 서열은 (SEQ ID NO: 77); B7-H3의 "2Ig" 형태를 암호화하는 잔기는 굵은 글씨 및 밑줄로 나타난다:
atgctgcgtc ggcggggcag ccctggcatg ggtgtgcatg tgggtgcagc cctgggagca ctgtggttct gcctcacagg agccctggaq gtccaggtcc ctgaagaccc agtggtggca ctggtgggca ccgatgccac cctgtgctgc tccttctccc ctgagcctgg cttcagcctg gcacagctca acctcatctg gcagctgaca gataccaaac agctggtgca cagctttgct gagggccagg accagggcag cgcctatgcc aaccgcacgg ccctcttccc ggacctgctg gcacagggca acgcatccct gaggctgcag cgcgtgcgtg tggcggacga gggcagcttc acctgcttcg tgagcatccg ggatttcggc agcgctgccg tcagcctgca ggtggccgct ccctactcga agcccagcat gaccctggag cccaacaagg acctgcggcc aggggacacg gtgaccatca cgtgctccag ctaccagggc taccctgagg ctgaggtgtt ctggcaggat gggcagggtg tgcccctgac tggcaacgtg accacgtcgc agatggccaa cgagcagggc ttgtttgatg tgcacagcat cctgcgggtg gtgctgggtg caaatggcac ctacagctgc ctggtgcgca accccgtgct gcagcaggat gcgcacagct ctgtcaccat cacaccccag agaagcccca caggagccgt ggaggtccag gtccctgagg acccggtggt ggccctagtg ggcaccgatg ccaccctgcg ctgctccttc tcccccgagc ctggcttcag cctggcacag ctcaacctca tctggcagct gacagacacc aaacagctgg tgcacagttt caccgaaggc cgggaccagg gcagcgccta tgccaaccgc acggccctct tcccggacct gctggcacaa ggcaatgcat ccctgaggct gcagcgcgtg cgtgtggcgg acgagggcag cttcacctgc ttcgtgagca tccgggattt cggcagcgct gccgtcagcc tgcaggtggc cgctccctac tcgaagccca gcatgaccct ggagcccaac aaggacctgc ggccagggga cacggtgacc atcacgtgct ccagctaccg gggctaccct gaggctgagg tgttctggca ggatgggcag ggtgtgcccc tgactggcaa cgtgaccacg tcgcagatgg ccaacgagca gggcttgttt gatgtgcaca gcgtcctgcg ggtggtgctg ggtgcgaatg gcacctacag ctgcctggtg cgcaaccccg tgctgcagca ggatgcgcac ggctctgtca ccatcacagg gcagcctatg acattccccc cagaggccct gtgggtgacc gtggggctgt ctgtctgtct cattgcactg ctggtggccc tggctttcgt gtgctggaga aagatcaaac agagctgtga ggaggagaat gcaggagctg aggaccagga tggggaggga gaaggctcca agacagccct gcagcctctg aaacactctg acagcaaaga agatgatgga caagaaatag cc.
"패닝" 과정은 B7-H3을 발현하는 조직 또는 세포의 cDNA 라이브러리를 얻고, 두 번째 세포 타입에서 cDNA를 과발현하고, B7-H3와 특이적 결합을 위한 두 번째 세포 타입의 트랜스펙션된 세포를 선별함으로써 수행될 수도 있다. "패닝"에 의해 세포 표면 단백질을 암호화하는 포유동물 유전자의 클로닝에 사용된 방법의 상세한 설명은 업계에 발견될 수 있다 (예를 들어, Aruffo, A. et al. (1987) "Molecular Cloning Of A CD28 cDNA By A High-Efficiency COS Cell Expression System" Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 84: 8573-8577 및 Stephan, J. et al. (1999) "Selective Cloning Of Cell Surface Proteins Involved In Organ Development: Epithelial Glycoprotein Is Involved In Normal Epithelial Differentiation" Endocrinol. 140: 5841-5854 참조).
항-B7-H3 항체, 및 다른 B7-H3 펩티드 작용제, 길항제 및 조절기를 암호화하는 cDNA는 업계의 표준 방법에 따라 특정 세포 타입으로부터 mRNA를 역전사함으로써 얻어질 수 있다. 특이적으로, mRNA는 상기 Sambrook et al.에서 제시한 과정에 따라 다양한 용해 효소 또는 화학 용액을 사용하여 분리되거나 제조사에 의해 제공된 동봉된 지시에 따라 상업적으로 사용 가능한 핵산-결합 레진에 의해 추출될 수 있다 (예를 들어, Qiagen, Invitrogen, Promega). 합성된 cDNA는 두 번째 타입의 세포에서 원하는 항체 또는 단백질을 생산하기 위해 발현 벡터로 도입된다. 그것은 발현 벡터가 에피솜 또는 염색체 DNA의 필수적인 부분으로서 숙주 세포에서 복제 가능해야 한다는 것을 의미한다. 적합한 발현 벡터는 플라스미드, 아데노바이러스, 아데노-관련된 바이러스, 레트로바이러스를 포함하는, 바이러스성 벡터, 및 코스미드를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
원하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터는 전기 천공법, 염화칼슘, 염화루비듐, 인산칼슘, DEAE-덱스트란, 또는 다른 물질; 미크로발사체 충격; 리포펙타민; 및 감염 (예를 들어, 벡터가 백시니아 바이러스와 같은 감염원인 경우)을 활용한 트랜스펙션을 포함하는, 다수의 적절한 수단에 의해 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 도입 벡터 또는 폴리뉴클레오티드의 선택은 종종 숙주 세포의 특징에 의존할 것이다.
이형 DNA를 과발현할 수 있는 어느 숙주 세포도 원하는 항체, 폴리펩티드 또는 단백질을 암호화하는 유전자를 분리할 목적으로 사용될 수 있다. 적합한 포유동물 숙주 세포의 비-제한적 예는 COS, Hela 및 CHO 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 바람직하게 숙주 세포는, 존재하면, 원하는, 해당하는 내인성 항체 또는 단백질의 그것보다 숙주 세포에서 약 5배 이상의 레벨, 더 바람직하게 10배 이상, 더 바람직하게 20배 이상의 레벨의 cDNA를 발현한다. B7-H3와 특이적 결합을 위한 숙주 세포의 선별은 면역검정 또는 FACS에 의해 영향을 받는다. 원하는 항체 또는 단백질을 과발현하는 세포가 확인될 수 있다.
모체 B7-H3 펩티드 작용제, 길항제 또는 조절기 분자에 비해 결과로 얻은 단백질의 아미노산 서열에서 추가, 삭제, 또는 변화에 대해 암호화하는 돌연변이 B7-H3 펩티드 작용제, 길항제, 및 조절기를 생산하기 위해 활용될 수 있는 다양한 기술들이 또한 사용 가능하다.
본 발명은 본 발명의 항체의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명의 폴리펩티드는 업계에 알려진 과정에 의해 만들어질 수 있다. 폴리펩티드는 항체의 단백질 가수 분해 또는 다른 분해에 의해, 상기 설명된 바와 같이 재조합 방법 (즉, 단일 또는 융합 폴리펩티드)에 의해 또는 화학적 합성법에 의해생산될 수도 있다. 화학적 합성법의 방법은 업계에 알려져 있고 상업적으로 사용 가능하다. 예를 들어, 항-B7-H3 폴리펩티드는 고체상 방법을 활용하는 자동화된 폴리펩티드 합성기에 의해 생산될 수 있다.
IV. 폴리펩티드 및 단클론성 항체를 선별하는 방법
여러 방법이 B7-H3와의 결합하는 폴리펩티드 및 단클론성 항체를 선별하기 위해 사용될 수도 있다. "결합"은 생물학적으로 또는 면역학적으로 적절한 특이적 결합을 나타내고, 예를 들어 면역글로불린이 비-특이적 표적에 대해 아주 고농도로 사용될 때, 일어날 수도 있는 비-특이적 결합을 나타내지 않는다고 생각된다. 한 구체예에서, 단클론성 항체는 B7-H3와의 결합을 위해 표준 선별 기술을 사용하여 선별된다. 이 방식으로, 항-B7-H3 단클론성 항체를 얻었다. 본 발명의 바람직한 하이브리도마는 항체 BRCA69D, BRCA84D 또는 PRCA157를 생산하는 것들이다.
B7-H3와의 결합하는 추가적인 단클론성 항체가 확인될 수도 있다. 이 목적을 위해, 단클론성 항체는 암조직과의 결합하지만 비-암 세포와의 결합하지 않는 그들의 차별적인 능력에 대해 선별된다. 한 구체예에서, B7-H3와의 결합하고 또한 사람 암 세포 또는 조직과 교차 반응성이지만, 정상 세포 또는 조직과 같은 정도는 아닌 단클론성 항체가 선택된다. 선별에 활용될 수 있는 한 방법은 면역조직화학법 (IHC)이다. 표준 면역화학법 기술은 당업자에게 알려져 있다. 예를 들어, ANIMAL CELL CULTURE METHODS (J.P. Mather and D. Barnes, eds., Academic Press, NY, Vol. 57, Ch. 18 및 19, pp. 314-350, 1998) 참조. 생물학적 샘플 (예를 들어, 조직)은 생체검사, 검시, 또는 부검으로부터 얻을 수도 있다. 암으로 고통받는 개개의 다른 비-암 조직 또는 암에 걸리지 않은 개개의 조직이 대조군으로 사용되지만, B7-H3이 암 세포에만 존재하는지 알아내기 위해서, 항-B7-H3 항체는 암에 걸린 개개의 조직에서 B7-H3의 존재를 검출하는데 사용될 수도 있다. 조직의 냉동 중에 피해를 방지하는 고체 또는 반-고체 물질 (예를 들어, 아가로스 젤 또는 OCT)에 임베딩 (embedding)될 수 있고 염색을 위해 절편화할 수 있다. 다른 기관의 및 다른 등급의 암은 단클론성 항체를 선별하기 위해 사용될 수 있다. 선별의 목적을 위해 사용될 수 있는 조직의 예는 난소, 유방, 폐, 전립선, 결장, 신장, 피부, 갑상선, 뇌, 심장, 간, 위, 신경, 혈관, 뼈, 상부소화관, 및 췌장을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 선별의 목적을 위해 사용될 수 있는 다른 암 세포 타입의 예는 암종, 선암, 육종, 선육종, 림프종, 및 백혈병을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
또 다른 대안으로, HMEC (BioWhittaker CC- 2251), HUVEC (1차 내피 세포), BT-474 (ATCC# HTB-20), MCF7 (ATCC# HTB22), MDA-MB-175-VII (ATCC# HB-25), MDA-MB-361 (ATCC# HB-27), SKBR3 (ATCC# HTB-30), A549 (ATCC# CCL-185), Calu-3 (ATCC# HTB-55), SKMES-I (ATCC# HTB-58), ES-2 (ATCC# CRL-1978), SKOV3 (ATCC# HTB-77), Panc-1 (ATCC# CRL-1469), AsPC-I (ATCC# CRL-1682), HPAF-II (ATCC# CRL-1997), Hs700T (ATCC# HTB-174), Colo205 (ATCC# CCL-222), HT-29 (ATCC# HTB-38), SW480 (ATCC# CCL-228), SW948 (ATCC# CCL-237), 293 (ATCC # CRL-1573), 786-0 (ATCC# CRL-1932), A498 (ATCC# HTB-44), Caki-2 (ATCC# HTB-47), COS-7 (ATCC# CRL-1651), RL-65 (ATCC # CRL-10345), SV-T2 (ATCC# CCL-163.1), 22RV1 (ATCC# CRL-2505), DU145 (ATCC# HTB-81), LNCaP (ATCC# CRL-1740), PC-3 (ATCC# CRL-1435), HT29 (ATCC# HTB-38), Hs746T (ATCC# HTB-135), NCI-N87 (ATCC# CRL-5822)과 같은, 암 세포주 및 각각의 조직의 정상 세포는 암 조직에 대해 특이적인 단클론성 항체를 선별하는데 사용될 수도 있다. 신장, 난소, 유방, 폐, 전립선, 결장, 신장, 피부, 갑상선, 대동맥 평활근, 및 내피 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는, 다른 기관들의 정상 조직으로부터 유래한 1차, 또는 낮은 계대 배양, 세포 배양은 음성 대조군으로서 사용될 수 있다. 암 또는 비-암 세포는 WO 01/43869에 설명된 바와 같이, 유리 슬라이드 또는 커버 슬립, 또는 플라스틱 표면에서 자랄 수 있고, 또는 CellArray™ 장치에서 제조될 수 있고 조직에 대해 상기 설명된 바와 같이 IHC를 사용하여 항체의 결합에 대해 선별될 수 있다. 대안으로, 세포는 비-단백질 가수 분해 수단 및 펠렛으로 회전을 사용하여 성장 표면으로부터 제거될 수도 있는데, 이것은 상기 설명된 바와 같이 포함될 수 있고 IHC 분석에 대해 조직으로서 처리될 수 있다. 세포는 면역결핍 동물, 성장이 허용된 종양에 접종될 수도 있고, 이 종양은 수확되고, 포함되고, IHC 분석에 대한 조직 공급원으로서 사용될 수 있다. 또 다른 대안으로, 단일 세포는 1차 항체, 형광발광 분자와 연결된 2차 "리포터" 항체와 함께 배양함으로써 선별되고 형광발광 활성화 세포-분류 (FACS) 기계를 사용하여 분석될 수도 있다.
여러 다른 검출 시스템 중 하나는 항체와 조직 절편의 결합을 검출하는데 활용될 수도 있다. 전형적으로, 면역조직화학법은 1차 항체와 조직의 결합을 수반하고 그때 1차 항체로부터 종에 반응하는 2차 항체가 발생되고 검출 가능한 마커와 접합되었다 (예를 들어, 홀스래디쉬 퍼옥시다제, HRP, 또는 디아미노벤제딘, DAB). 사용될 수도 있는 한 대안의 방법은 다클론성 거울상 상보성 항체 또는 polyMICA™ (다클론성 Mirror Image Complementary Antibodies; The Binding Site Limited, Birmingham, UK; Mangham, D.C. et al. (1999) " Novel Immunohistochemical Detection System Using Mirror Image Complementary Antibodies (MICA)" Histopathology 35(2): 129-33)이다. PolyMICA™ 기술은 1차 항체 (예를 들어, 항-B7-H3 항체)와 정상 및 암 조직의 결합을 테스트하기 위해 사용될 수 있다. 여러 종류의 polyMICA™ Detection 키트가 상업적으로 사용 가능하다: 제품 번호 HK004.D은 DAB 크로마겐을 사용하는 polyMICA™ Detection 키트이다; 제품 번호 HK004.A는 AEC 크로마겐을 사용하는 polyMICA™ Detection 키트이다. 대안으로, 1차 항체는 검출 가능한 마커로 직접적으로 표지될 수도 있다.
적절한 항체를 선택하기 위한 IHC 선별의 첫 번째 단계는 마우스에서 발생된 1차 항체 (예를 들어, 항-B7-H3 항체)와 하나 이상의 면역원 (예를 들어, 세포 또는 조직 샘플)의 결합이다. 한 구체예에서, 조직 샘플은 다른 기관의 냉동 조직의 절편이다. 세포 또는 조직 샘플은 암 또는 비-암일 수 있다.
냉동 샘플은 제조되고, 고정 여부에 상관없이, 절편화되고, IHC는 당업자에 알려진 많은 기술 중 하나에 의해 수행될 수 있다 (예를 들어, Stephan et al. (1999) "Distribution and Function Of The Adhesion Molecule BEN During Rat Development" Dev. Biol. 212: 264-277 및 Stephan et al. (1999) "Selective Cloning Of Cell Surface Proteins Involved In Organ Development: Epithelial Glycoprotein Is Involved In Normal Epithelial Differentiation" Endocrinology 140: 5841-5854 참조).
V. 항-B7-H3 항체를 특성화하는 방법
여러 방법 중 하나도 항-B7-H3 항체를 특성화하기 위해 사용될 수 있다. 한 방법은 그것이 결합하는 에피토프를 확인하는 것이다. 에피토프 매핑 (mapping)은 다양한 공급원, 예를 들어, Pepscan System (Lelystad, The Netherlands)으로부터 상업적으로 사용 가능하다. 에피토프 매핑은 항-B7-H3 항체가 결합하는 서열을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 에피토프는 선형, 즉, 아미노산의 단일 스트레치에 함유된 에피토프, 또는 단일 스트레치에 필수적으로 함유되지 않을 수도 있는 아미노산의 3-차원 상호작용에 의해 형성된 구조적 에피토프일 수 있다.
다양한 길이 (예를 들어, 바람직하게 적어도 4-6 아미노산 길이)의 펩티드는 분리되거나 합성 (예를 들어, 재조합으로) 될 수 있고 항-B7-H3 항체와 함께 결합 검정에 사용될 수 있다. 항-B7-H3 항체가 결합하는 에피토프는 세포 외 서열로부터 유래한 중복 펩티드의 사용 및 항-B7-H3 항체에 의한 결합의 결정함으로써 체계적인 선별로 결정될 수 있다.
항-B7-H3 항체를 특성화하기 위해 사용될 수 있는 또 다른 방법은 항-B7-H3 항체가 다른 항체와 같은 에피토프와의 결합하는지 결정하기 위해 같은 항원과의 결합하는 것으로 알려진 다른 항체, 즉, B7-H3로 경쟁 검정을 사용하는 것이다. B7-H3에 대하여 상업적으로 사용 가능한 항체의 예는 사용 가능할 수도 있고 여기에서 가르친 결합 검정을 사용하여 확인될 수도 있다. 결합 검정은 당업자들에게 잘 알려져 있고, 이러한 과정 및 도시적인 데이터는 실시예에서 더 상세히 설명된다. 항-B7-H3 항체는 그들이 결합하는 조직, 암의 타입 또는 종양의 타입에 의해 더 특성화될 수 있다.
항-B7-H3 항체를 특성화하는 또 다른 방법은 그것이 결합하는 항원에 의한 것이다. 다양한 사람 암의 세포 용해물과 함께 항-B7-H3 항체를 웨스턴 블롯에 사용하였다. 당업자에 알려진 바와 같이, 웨스턴 블롯은 변성 또는 비변성 젤 상에 세포 용해물 및/또는 세포 분획을 런닝 (running)하는 단계, 단백질을 니트로셀룰로스 종이로 옮기는 단계, 및 어느 단백질이 항체와의 결합되는지 보기 위해 블롯을 항체 (예를 들어, 항-B7-H3 항체)로 탐지하는 단계를 수반할 수 있다. B7-H3는 결장, 유방, 난소, 췌장 및 폐를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 다른 조직의 다양한 사람 암과 관련된다.
VI. 항-B7-H3 항체 및 B7-H3 조절기를 사용하여 암을 진단하는 방법
여기에 개시된 방법에 의해 만들어진 B7-H3에 대한 단클론성 항체는 진단의 목적을 위해, 난소, 유방, 폐, 전립선, 결장, 신장, 췌장, 피부, 갑상선, 뇌, 심장, 간, 위, 신경, 혈관, 뼈, 및 상부소화관을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 다양한 조직에서 암 세포의 존재 또는 부재를 확인하기 위해 사용될 수도 있다. 여기에 개시된 방법에 의해 만들어진 B7-H3에 대한 단클론성 항체는 또한 암 세포의 존재 또는 부재, 또는 이들의 레벨을 확인하기 위해 사용될 수도 있는데, 이것들은 고체 종양으로부터 분비된 후 혈액에서 순환한다. 이러한 순환 항원은 여기에서 가르친 방법에 따라 검출되는 능력을 유지하는 온전한 B7-H3 항원, 또는 이들의 단편일 수도 있다. 이러한 검출은 업계에 보통 사용되는 표준 방법을 사용하여 FACS 분석에 의해 영향을 받을 수 있다.
이 사용법들은 B7-H3 및 B7-H3와 특이적으로 결합하는 항체 사이의 복합체의 형성을 수반할 수 있다. 이러한 항체의 예는 하이브리도마 BRCA84D, BRCA69D, 및 PRCA157에 의해 생산된 항-B7-H3 단클론성 항체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이러한 복합체의 형성은 시험관 내 또는 생체 내에서 가능하다. 이론에 의해 구속되지 않고, 단클론성 항체 항-B7-H3은 B7-H3의 세포 외 도메인을 통해 B7-H3와의 결합하고 내면화될 수도 있다.
본 발명의 진단적 방법의 바람직한 구체예에서, 항체는 검출 가능한 표지를 낳는다. 사용될 수도 있는 표지의 예는 방사성 약제 또는 피코에리트린 또는 플루오레세인 이소티오시안산염 (플루오로이소티오시안산염 또는 FITC로 또한 알려짐)과 같은, 형광단을 포함한다.
진단적 및 치료적 목적을 위해 상업적으로 사용된 다른 알려진 항체와 마찬가지로, 본 발명의 표적 항원은 정상 조직에서 널리 발현된다. 그것은 또한 일부 종양에서 상향 조절된다. 그러므로, 진단제 또는 치료제로 사용된 바와 같이 본 발명의 항체의 특정 투여량 및 전달의 루트는 특정 종양 또는 가까운 질환 상태, 뿐만 아니라 치료받고 있는 특정 개개에 맞춰질 것이다.
진단을 위한 항체를 사용하는 한 방법은 항체와 방사성 약제 또는 방사성 불투과성 약제의 결합, 개개에 항체의 투여 및 항원을 발현하는 암 세포의 표면에 표지된 항체의 위치를 시각화하기 위해 x-선 또는 다른 이미지화 기계의 사용에 의한 생체 내 종양 이미지화이다. 항체는 생리학적인 조건에서 결합을 촉진하는 농도로 투여된다.
시험관 내 B7-H3의 검출에 대한 기술은 업계에서 통상적이고 효소 연결 면역흡수측정 검정 (ELISAs), 면역침강법, 면역형광검사, 효소 면역 검정 (EIA), 방사성면역검정 (RIA), 및 웨스턴 블롯 분석을 포함한다.
본 발명의 양태에서, 본 발명의 실행에 따라 방사성 표지된, 종양-특이적 항체를 개개에 투여하는 단계를 포함하는, 종양, 또는 신생물의 방사성 이미지화 방법, 또는 방사성 표지된 항체의 처리 방법의 효과를 측정하는 방법. 방사성 표지된 항체는 방사성 표지를 포함하는, 바람직하게 Technetium-99m, Indium-111, Iodine-131, Rhenium-186, Rhenium-188, Samarium-153, Lutetium-177, Copper-64, Scandium-47, Yttrium-90로 구성된 그룹으로부터 선택되는 단클론성 또는 다클론성 항체일 수도 있다. 생체 내에서 항체의 면역 반응성을 포함하지 않고 고장나지 않는, Iodine-131, Rhenium-188, Holmium-166, Samarium-153 and Scandium-47과 같은 치료적 방사성 핵종으로 표지된 단클론성 항체는 특히 바람직하다. 당업자는 다른 방사성 동위원소가 알려져 있고, 특이적 적용에 적합할 수도 있다는 것을 인정할 것이다. 방사성 이미지화는 Single Photon Emission Computer Tomography (SPECT), Position Emission Tomography (PET), Computer Tomography (CT) 또는 Magnetic Resonance Imaging (MRI)을 사용하여 수행될 수도 있다. 방사성 면역 이미지화에 의해 국부적인 메타스타제 (metastase)의 위치에 더 큰 해부학적 정의를 허용하는, 상관관계의 이미지화가 또한 고려된다.
다른 방법으로, 암 세포는 제거되고 면역조직화학법을 위해 업계에 잘 알려진 방법 (예를 들어, 냉동 화합물에 임베딩 단계, 고정 여부에 상관없이, 냉동 및 절편화 단계; 항원 회수 및 대비 염색 여부에 상관없이 고정 및 파라핀 임베딩)에 의해 조직을 제조한다. 단클론성 항체는 또한 발달의 다른 단계에서 암 세포를 확인하기 위해 사용될 수도 있다. 항체는 또한 개개의 종양이 사전 결정 레벨에서 그들의 표면에서 항원을 발현하는지 및 따라서 상기 항원에 대한 항체를 사용하는 면역치료를 위한 후보인지 결정하기 위해 사용될 수도 있다. 항체는 B7-H3을 발현하는 1차 및 전이하는 암을 인식할 수도 있다. 여기에 사용된 바와 같이, 검출은 질적인 및/또는 양적인 검출을 포함할 수도 있고 암 세포에서 B7-H3의 발현의 증가된 레벨에 대해 측정된 레벨을 정상 세포와 비교하는 것을 포함할 수도 있다.
본 발명은 또한 B7-H3와의 결합하는 항체를 사용하여 개개의 B7-H3을 발현하는 암 세포에 의해 특성화된 암의 진단을 돕는 방법을 제공하고 사용될 수 있는 또 다른 방법은 B7-H3 발현의 레벨을 결정한다. 여기에 사용된 바와 같이"진단을 돕는" 방법은 이 방법들이 암의 분류, 또는 성질에 대하여 임상적인 결정을 하는 것을 돕는다는 것을 의미하고, 명확한 진단에 대해 결정적일 수도 있고 아닐 수도 있다. 따라서, 암의 진단을 돕는 방법은 개개의 생물학적 샘플에서 B7-H3의 레벨을 검출하는 단계 및/또는 샘플에서 B7-H3 발현의 레벨을 결정하는 단계를 포함할 수도 있다. 항원 또는 이들의 일부를 인식하는 항체는 또한 혈액, 타액, 오줌, 폐액, 또는 복수액을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 체액에서 살아있는 또는 죽은 암 세포로부터 방출된 또는 분비된 항원을 검출하기 위한 진단적 면역 검정을 생성하기 위해 사용될 수도 있다.
원하는 특정 종양의 모든 세포가 B7-H3를 발현하지 않을 것이고, 다른 조직의 암 세포는 B7-H3를 발현할 수도 있는데, 따라서 개개에서 면역 치료의 유용성을 결정하기 위해 개개는 암 세포에 B7-H3의 존재 또는 부재에 대해 선별되어야 한다. 여기에 개시된 방법에 의해 만들어진 항-B7-H3 항체는 암으로 진단된 개개가 B7-H3에 대한 항체를 사용하는 면역 치료에 대한 후보로 간주할 수도 있는지 결정하기 위해 사용될 수도 있다. 한 구체예에서, 암 종양 또는 생체 검사 샘플은 B7-H3에 대한 항체를 사용하여, B7-H3의 발현에 대해 테스트 될 수도 있다. B7-H3를 발현하는 암 세포를 가진 개개는 B7-H3에 대한 항체를 사용하는 면역 치료에 대한 적합한 후보이다. 항-B7-H3 항체로 염색하는 것은 또한 정상 조직으로부터 암 조직을 구별하기 위해 사용될 수도 있다.
진단의 목적을 위해 항-B7-H3 항체를 사용하는 방법은, 어느 종양이 특정 치료, 암, 종양 서브타입 또는 전이성 질환의 기원에 걸린 개인에 대한 예후, 및 질환의 진행 또는 치료에 대한 반응에 대해 가장 잘 반응할지 결정하기 위해, 어느 형태의 항-암 치료, 예를 들어, 화학 치료 또는 방사성 치료 전 및 후 둘 다 유용하다.
본 발명의 조성물은 또한 상기 다른 질환의 (비암) 세포에 적용에서 일반적으로 설명된 방법을 사용하여, 암 이외의 질환 상태의 진단에 적합하다. 본 발명의 방법의 사용에 적합한 질환 상태는 개개의 염증과 관련된 질환 또는 장애 또는 자동면역 반응을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 상기 설명된 방법은 개개의 염증 또는 자동 면역 반응을 조절하기 위해 사용될 수도 있다. 본 발명의 조성물 및 방법을 사용하여 진단 및/또는 치료될 수도 있는 염증 및 자동 면역 장애로부터 일어난 질환 및 상태는, 도시의 방법에 의해 및 제한 없이, 다발성 경화증 (multiple sclerosis), 수막염 (meningitis), 뇌염 (encephalitis), 뇌졸중 (stroke), 다른 뇌 외상, 궤양성 대장염 (ulcerative colitis) 및 크론병 (Crohn's disease)을 포함하는 염증성 장 질환 (inflammatory bowel disease), 중증 근무력증 (myasthenia gravis), 낭창 (lupus), 류마티스성 관절염 (rheumatoid arthritis), 천식 (asthma), 급성 연소자형 당뇨병 (acute juvenile onset diabetes), 에이즈 치매 (AIDS dementia), 아테롬성 동맥 경화증 (atherosclerosis), 신염 (nephritis), 망막염 (retinitis), 아토피성 피부염 (atopic dermatitis), 건선 (psoriasis), 심근허혈 (myocardial ischemia) 및 급성 백혈구-매개 폐 손상을 포함한다.
본 발명의 항체 및 치료제의 진단적 및/또는 치료적 사용에 대한 다른 지시는 장기 또는 이식 거부의 위험에서 개개에 투여를 포함한다. 최근 수년 동안 피부, 신장, 간, 심장, 폐, 췌장 및 골수와 같은 조직 및 기관을 이식하는 외과 기술의 효능의 상당한 향상이 있었다. 아마도 원칙적인 미해결 문제는 이식된 동종이식 또는 기관을 받는 사람의 면역 내성을 유발하는 만족할만한 약제의 부족이다. 동종이계의 세포 또는 기관이 숙주로 이식될 때 (즉, 기증자 및 증여자는 같은 종의 다른 개개이다), 숙주 면역계는 이식된 조직의 파괴로 이어지는, 이식에서 외부 항원에 대한 면역 반응이 증가할 것이다 (숙주-대-이식 질환).
항-B7-H3 항체에 대하여 본 출원에서 어디에든 설명된 사용은 또한 여기에 설명된 바와 같이 다른 B7-H3 작용제, 길항제 및 조절기의 사용을 포함한다. 이러한 구체예에서, B7-H3 작용제, 길항제 또는 다른 비-항체 조절기는 설명된 단계에서 B7-H3 항체로 대체되고, 대체된 B7-H3 조절기 조성물에 방법을 맞추기 위해 일반적으로 숙련된 당업자의 범위 내에서 변화가 이루어진다.
여기에 개시된 방법에 의해 만들어진 B7-H3에 대한 단클론성 항체는 다양한 조직에서 사람 암 줄기 세포의 존재 또는 부재를 확인하기 위해 사용될 수도 있다. 암 줄기 세포 (CSC)는 종양 성장 및 전이에서 역할을 하는 것으로 추정되었다 (Ghotra, V.P. et al. (2009) "The Cancer Stem Cell Microenvironment and Anti-Cancer Therapy " Int. J. Radiat. Biol. 85(11): 955-962; Gupta, P.B. et al. (2009) "Cancer Stem Cells: Mirage Or RealityV Nat. Med. 15(9): 1010-1012; Lawson, J.C. et al. (2009) "Cancer Stem Cells In Breast Cancer and Metastasis " Breast Cancer Res. Treat. 118(2): 241-254; Hermann, P.C. et al. (2009) "Pancreatic Cancer Stem Cells? Insights and Perspectives " Expert Opin. Biol. Ther. 9(10): 1271-1278; Schatton, T. et al. (2009) "Identification and Targeting Of Cancer Stem Cells" Bioessays 31(10): 1038-1049; Mittal, S. et al. (2009) "Cancer Stem Cells: The Other Face Of Janus" Amer. J. Med. Sci. 338(2): 107-112; Alison, M.R. et al. (2009) "Stem Cells and Lung Cancer: Future Therapeutic Targets?" Expert Opin. Biol. Ther. 9(9): 1127-1141; Charafe-Jauffret, E. et al. (2009) "Breast Cancer Stem Cells: Tools and Models To Rely On" BMC Cancer 9: 202; Scopelliti, A. et al. (2009) "Therapeutic Implications Of Cancer Initiating Cells" Expert Opin. Biol. Ther. 9(8): 1005-1016; PCT 공개 WO 2008/091908). 이 가설 하에, CSC는
무기한의 자기 재생이 가능하고 비교적 복제 능력이 제한된 더 많은 성인 종양 세포를 발달시킬 수 있는 각 종양 내에 세포의 작고, 뚜렷한 서브세트를 제공한다. 이 암 줄기 세포들은 화학치료제, 방사선 또는 다른 독성 상태에 더 저항성이 강하고, 따라서, 임상 치료 후 계속 유지되고 후에 2차 종양, 메타스타제로 성장하거나 재발할 수도 있다고 추정되었다. CSC는 '정상' 조직 줄기 세포로부터 또는 더 분화된 조직의 간 세포로부터 발생할 수 있다고 제안되었다.
사람 암 줄기 세포는 여러 정의 특성을 갖는다. 이러한 특정은 PCT 공개 2008/091908에 설명되고 본원에 참고로 포함된다. 암 줄기 세포에 세포 표면 표적에 대한 단클론성 항체는 다양한 조직의 암 줄기 세포의 존재 또는 부재를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 여기에 개시된 방법에 의해 만들어진 B7-H3에 대한 단클론성 항체는 또한 샘플 또는 조직에서 또는 고체 종양으로부터 방출 후 순환에서 암 줄기 세포의 존재 또는 부재, 또는 암 줄기 세포의 레벨을 확인하기 위해 사용될 수도 있다. 이러한 순환하는 항원은 온전한 B7-H3 항원, 또는 여기에서 가르친 방법에 따라 검출되는 능력을 유지한 이들의 단편일 수도 있다. 이러한 검출은 업계에 보통 사용되는 표준 방법을 사용하여 FACS에 의해 영향을 받을 수도 있다. 또 다른 구체예에서, 이러한 검출은 업계에서 보통 사용되는 표준 방법을 사용하여 조직 샘플의 면역조직화학적 분석에 의해 영향을 받을 수도 있다.
이 사용들은 B7-H3 및 암 줄기 세포에서 B7-H3와 특이적으로 결합하는 항체 사이의 복합체의 형성을 수반할 수 있다. 이러한 항체의 예는 하이브리도마 BRCA84D, BRCA69D, 및 PRCA157에 의해 생산된 항-B7-H3 단클론성 항체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이러한 복합체의 형성은 시험관 내 또는 생체 내에서 가능하다.
암 줄기 세포의 확인 및 치료의 사용에 대해 여기에 설명된 바와 같이 항-B7-H3 항체에 대한 사용을 나열한 본 출원에 설명된 사용은 또한 다른 B7-H3 작용제, 길항제 및 조절기의 사용을 포함한다. 이러한 구체예에서, 항-B7-H3 항체 및 다른 B7-H3 작용제, 길항제 및 조절기는 설명된 유사한 방법을 사용하여 암 줄기 세포의 확인, 진단적 또는 치료적 사용을 위해 사용되고, 일반적인 숙련자의 범위 내에서 변화는 암 줄기 세포의 확인/진단 또는 치료에 대한 방법을 맞추기 위해 이루어진다.
VII. 본 발명의 바람직한 조성물
본 발명은 항-B7-H3 항체, 항-B7-H3 항체로부터 유래한 폴리펩티드, 항-B7-H3 항체를 암호화하는 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 여기에 설명된 바와 같이 다른 약제를 포함하는, 약학적 조성물을 포함하는, 조성물을 포함한다. 여기에 사용된 바와 같이, 조성물은 B7-H3와의 결합하는 하나 이상의 항체, 폴리펩티드 및/또는 단백질, B7-H3 작용제, 길항제, 조절기 및/또는 B7-H3와의 결합하는 하나 이상의 항체, 폴리펩티드 및 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 하나 이상의 폴리펩티드를 더 포함한다.
본 발명은 어느 B7-H3 펩티드 작용제, 길항제 또는 조절기, 및 의도된 기능 또는 특정 B7-H3 펩티드 작용제, 길항제 또는 조절기의 기능을 지지하는 추가적인 화학적 구조의 접합을 더 제공한다.
이 접합체는 여기에 논의된 진단, 선별 또는 정제 과정에 사용된 불용성, 고체 지지 매트릭스와 같은 고분자와 공유결합된 B7-H3 펩티드 작용제, 길항제 또는 조절기를 포함한다. 적합한 매트릭스 물질은 화학적으로 비활성이고, 높은 다공성을 갖고 펩티드 리간드와 공유 결합을 형성할 수 있는 다수의 작용기를 갖는 물질을 포함한다. 매트릭스 물질 및 매트릭스-리간드 접합체의 제조 과정의 예는 Dean et al. (Eds) AFFINITY CHROMATOGRAPHY: A PRACTICAL APPROACH, IRL Press (1985); Lowe" ≪ Introduction to Affinity Chromatography" in Work et al. (eds) LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY and MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 7, Part II, North-Holland (1979); Porath et al"Biospecific Affinity Chromatography" in Neurath, H. et al. (eds), THE PROTEINS, 3rd ed., Vol. 1, pp. 95-178 (1975); 및 Schott, H. AFFINITY CHROMATOGRAPHY, Macel Dekker, Inc. NY (1984)에 설명된다.
또한 여기에 제공된 것들은 여기에 논의된 진단적 과정에 사용된 B7-H3 펩티드 작용제, 길항제 또는 조절기 및 리포터 모이어티의 접합체이다. 항-B7-H3 항체를 포함하는, 본 발명의 B7-H3 펩티드 작용제, 길항제 또는 조절제, 폴리펩티드 및 단백질은 다음의 기준 중 하나 (하나 이상)에 의해 더 확인되고 특성화된다:
(a) B7-H3와 특이적으로 결합하는 능력 (및 신장, 전립선, 또는 페 암 세포를 포함하지만 이에 제하노디지 않는, 암 세포의 표면에 발현되는 특정 B7-H3 분자에서);
(b) 원래의 항체가 우선적으로 결합하는 같은 에피토프와 우선적으로 결합하는 능력을 포함하는, 알려진 항-B7-H3 항체와 B7-H3의 우선적인 결합을 경쟁적으로 억제하는 능력;
(c) 시험관 내 또는 생체 내에서 생 세포의 표면에 노출된 B7-H3의 일부와의 결합하는 능력;
(d) B7-H3를 발현하는 생 암 세포의 표면에 노출된 B7-H3의 일부와의 결합하는 능력;
(e) 그들의 표면상에 B7-H3를 발현하는 암 세포 (신장, 전립선, 또는 폐 암 세포와 같은)에 대한 화학치료제를 전달하는 능력; 및
(f) 그들의 표면상에 B7-H3를 발현하는 암 세포 (전립선 암 세포에 제한되지 않는 것과 같은)로 치료제 또는 검출 가능한 마커를 전달하는 능력.
본 발명의 바람직한 항체는 정상, 비-암 조직에 비해 종양 세포의 차별적인 IHC 염색을 나타낼 것이고, 게다가 항체 효능의 영장류 (및 특히 게먹이 원숭이) 모델에서 테스트 될 수 있을 것이다. 본 발명의 바람직한 항체는 추가적으로 친화도 및 항원 특이성의 바람직한 레벨을 나타낼 것이다. 본 발명의 바람직한 항체는 추가적으로 면역조절기 활성 및 세포의 내면화의 바람직한 레벨을 나타낼 것이다.
일부 구체예에서, 본 발명의 항체는 하이브리도마 BRCA84D, BRCA69D, 또는 PRCA157, 또는 이들의 자손에 의해 생산된 항체이다. 본 발명은 또한 이 증착된 하이브리도마 및 동등한 항체 또는 폴리펩티드 단편 (예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2 Fv, Fc, 등), 키메라 항체, 단일 사슬 (scFv), 이들의 돌연변이, 항체 일부를 포함하는 융합 단백질, 사람화된 항체, 및 항원 (B7-H3), 필수적인 특이성의 인식 부위를 포함하는, 이 또는 동등한 항체 중 하나의 다른 변형된 배열에 의해 생산된 다양한 제제의 항체를 포함한다. 본 발명은 또한 항-B7-H3 과 멤버의 생물학적 특징 중 하나 이상을 나타내는 사람 항체를 제공한다. 항-B7-H3 과 (사람화된 항체 및 사람 항체를 포함)의 동등한 항체, 폴리펩티드 단편, 및 이 단편들 중 하나를 포함하는 폴리펩티드는 상기 설명된 5개의 기준 중 하나 (하나 이상)에 의해 확인되고 특성화된다. 항-B7-H3 항체의 쥐 및 모범적인 사람화된 가변 도메인 서열은 PCT 공개 WO 2008/066691에 설명된다. 이러한 서열은 도시에 제한되지 않는 방법에 의해 제공되고, 다른 서열뿐만 아니라 제공된 서열의 단편 및 변이체는 본 발명의 범위 내에 포함된다.
BRCA84D, BRCA69D, 및 PRCA157는 그들의 클리너 정상 조직 IHC 프로파일, 더 강한 종양/정상 IHC 차이, BIACORE™/IHC의 강한 결합의 완화, 게먹이 원숭이의 B7-H3에 대한 교차-반응성 및 다른 항체에 비해 보편적인 DART™ 분자 ("UDART™ s")에 대한 강한 활성 때문에 본 발명의 바람직한 B7-H3 항체이다. 특히 바람직한 구체예에서, 본 발명은 이 바람직한 항체의 키메라 및 사람화된 변이체를 포함할 뿐만 아니라 하기 설명된 바와 같이 변형된 Fc 영역을 소유하는 이 바람직한 항체의 원래의 및 키메라 및 사람화된 변이체를 포함한다. 본 발명은 추가적으로 이러한 항체의 에피토프 결합 영역을 소유하는, DART™ 분자를 포함하는데, 특히 T- 세포 수용체, NKG2D 수용체, 또는 종양-관련된 항원 또는 플루오레세인 (예를 들어, 플루오레세인 이소티오시안산염 (플루오로이소티오시안산염 또는 FITC로 또한 알려짐))과 같은 헵텐과의 결합하는 에피토프 결합 영역 (들)과 협력으로 DART™ 분자를 포함한다.
일부 구체예에서, B7-H3와의 결합하는 본 발명의 항체, 폴리펩티드 및 단백질은 여기에 명시된 항-B7-H3 항체와 B7-H3의 우선적인 결합을 경쟁적으로 억제하는 항체, 폴리펩티드 및 단백질이다. 일부 구체예에서, 항체, 폴리펩티드 및 단백질은 항체 mu-항-B7-H3가 바람직하게 결합하는 것과, B7-H3상의 같은 에피토프와 바람직하게 결합한다.
따라서, 본 발명은 다음 중 하나 (또는 다음 중 하나를 포함하는, 약학적 조성물을 포함하는, 조성물)를 제공한다: (a) 상기 확인된 증착 수를 가진 숙주 세포 또는 그것의 자손에 의해 생산된 항체; (b) 이러한 항체의 사람화된 형태; (c) 이러한 항체의 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역 중 하나 이상을 포함하는 항체; (d) 이러한 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 상동체를 포함하거나 가변 영역으로부터 유래한, 및 사람 항체의 중쇄 및 경쇄의 불변 영역 상동체를 포함하거나 불변 영역으로부터 유래한 키메라 항체; (e) 이러한 항체의 경쇄 및/또는 중쇄 CDR 중 하나 이상 (적어도 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯, 또는 여섯)을 포함하는 항체; (f) 이러한 항체의 중쇄 및/또는 경쇄를 포함하는 항체; (g) 이러한 항체와 동등한 사람 항체. 항체의 사람화된 형태는 원래의 항체, 또는 상기 확인된 증착 수를 가진 숙주 세포에 의해 생산된 항체와 동일한 CDR을 가질 수도 있고 아닐 수도 있다. CDR 영역의 결정은 업계의 범위 내에 있다. 일부 구체예에서, 본 발명은 상기-확인된 증착된 하이브리도마 중 하나에 의해 생산된, 또는 상기 확인된 증착 수를 가진 숙주 세포에 의해 생산된 항체의 적어도 하나의 CDR, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개의 CDR과 실질적으로 동일한 적어도 하나의 CDR을 포함하는 항체를 제공한다 (또는, 일부 구체예에서 이 항체들 중 하나의 모든 6개의 CDR과 실질적으로 상동체, 또는 이 항체들 중 하나로부터 유래한). 다른 구체예는 여기에 확인된 바와 같이 증착된 하이브리도마로부터 생산된, 또는 이러한 항체로부터 유래한 항체의 적어도 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개와 실질적으로 상동인 적어도 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 CDR (들)을 갖는 항체를 포함한다. 본 발명의 목적에 대해, 결합 특이성 및/또는 전체적인 활성 (이것은 암 세포의 성장 및/또는 증식을 감소시키기 위해, 암 세포에서 아폽토시스성 세포사를 유발하기 위해, 전이의 발달을 지연하기 위해, 암 세포로 또는 암 세포 내로 화학치료제의 전달, 및/또는 일시적으로 치료의 측면에 관한 것일 수도 있다)은 활성의 정도가 증착된 하이브리도마에 의해 생산된 항체와 비교하여 다를 수도 있지만 (더 크거나 더 작을 수도 있다), 일반적으로 유지된다. 본 발명은 또한 이 항체들 중 하나를 만드는 방법을 제공한다. 항체를 만드는 방법은 업게에 알려져 있고 여기에 설명된다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다일부 구체예에서, HFFLVPQXLEM는 항체의 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역 중 하나를 포함한다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드는 항체의 경쇄 CDR 및/또는 중쇄 CDR 중 하나 이상을 포함한다. 일부부 구체예에서, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄의 3개의 CDR을 포함한다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드는 원래 항체의 서열의 적어도 5개의 인접한 아미노산, 적어도 10개의 인접한 아미노산, 적어도 15개의 인접한 아미노산, 적어도 20개의 인접한 아미노산, 적어도 25개의 인접한 아미노산, 적어도 30개의 인접한 아미노산 중 하나를 갖는 항체의 아미노산 서열을 포함하는데, 아미노산의 적어도 3개는 항체의 가변 영역에서 온 것이다. 한 구체예에서, 가변 영역은 원래 항체의 경쇄로부터 온다. 또 다른 구체예에서, 가변 영역은 항체의 중쇄로부터 온다. 또 다른 구체예에서, 5개의 (또는 이상) 인접한 아미노산은 항체의 상보성 결정 영역 (CDR)로부터 온다.
본 발명의 일부 구체예에서, 본 발명의 B7-H3, B7-H3의 일부, 항-B7-H3 항체 또는 다른 B7-H3-결합 폴리펩티드를 발현하는 본 발명의 세포는 생체 내에서 B7-H3 생물학적 활성을 조절하기 위해 개개에 직접적으로 투여된다.
본 발명의 바람직한 항-B7-H3 항체는 BRCA84D, BRCA69D 및 PRCA157인데, 이 항체들 모두는 사람 B7-H3 분자와 반응성인 쥐 항체이다. BRCA84D, BRCA69D 및 PRCA157의 가변 경쇄 및 가변 중쇄의 아미노산 및 폴리뉴클레오티드 암호화 서열은 하기 각각의 이러한 사슬의 각각의 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인과 함께 나타난다. 그러므로 당업자들은 BRCA84D, BRCA69D 및 PRCA157에 의해 인식된 에피토프와의 결합할 수 있는, 이러한 CDR, 뿐만 아니라 이들의 유도체를 갖는 항체를 구성할 수 있을 것이다.
A. BRCA84D의 서열
(1) BRCA84D 경쇄 서열
BRCA84D 가변 경쇄 (SEQ ID NO: 3)의 아미노산 서열:
DIAMTQSQKF MSTSVGDRVS VTCKASQNVD TNVAWYQQKP GQSPKALIYS ASYRYSGVPD RFTGSGSGTD FTLTINNVQS EDLAEYFCQQ YNNYPFTFGS GTKLEIK
BRCA84D 가변 경쇄 (SEQ ID NO: 4)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열:
gacattgcga tgacccagtc tcaaaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc gtcacctgca aggccagtca gaatgtggat actaatgtag cctggtatca acagaaacca gggcaatctc ctaaagcact gatttactcg gcatcctacc ggtacagtgg agtccctgat cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcaacaa tgtgcagtct gaagacttgg cagagtattt ctgtcagcaa tataacaact atccattcac gttcggctcg gggacaaagt tggaaataaa a
BRCA84D 가변 경쇄 CDR1 (SEQ ID NO: 5): KASQNVDTNVA
BRCA84D 가변 경쇄 CDR1 (SEQ ID NO: 6)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열: aaggccagtc agaatgtgga tactaatgta gcc
BRCA84D 가변 경쇄 CDR2 (SEQ ID NO: 7): SASYRYS
BRCA84D 가변 경쇄 CDR2 (SEQ ID NO: 8)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열: tcggcatcct accggtacag t
BRCA84D 가변 경쇄 CDR3 (SEQ ID NO: 9): QQYNNYPFT
BRCA84D 가변 경쇄 CDR3 (SEQ ID NO: 10)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열: cagcaatata acaactatcc attcacg
(2) BRCA84D 중쇄 서열
BRCA84D 가변 중쇄 (SEQ ID NO: ll)의 아미노산 서열:
DVQLVESGGG LVQPGGSRKL SCAASGFTFS SFGMHWVRQA PEKGLEWVAY ISSDSSAIYY ADTVKGRFTI SRDNPKNTLF LQMTSLRSED TAMYYCGRGR ENIYYGSRLD YWGQGTTLTV SS
BRCA84D 가변 중쇄 (SEQ ID NO: 12)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열:
gatgtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgcagc ctggagggtc ccggaaactc tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctttggaa tgcactgggt tcgtcaggct ccagagaagg ggctggagtg ggtcgcatac attagtagtg acagtagtgc catctactat gcagacacag tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atcccaagaa caccctgttc ctgcaaatga ccagtctaag gtctgaggac acggccatgt attactgtgg aagagggagg gaaaacattt actacggtag taggcttgac tactggggcc aaggcaccac tctcacagtc tcctca
BRCA84D 가변 중쇄 CDR1 (SEQ ID NO: 13): FGMH
BRCA84D 가변 중쇄 CDR1 (SEQ ID NO: 14)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열: tttggaatgcac
BRCA84D 가변 중쇄 CDR2 (SEQ ID NO: 15): YISSDSSAIYYADTVK
BRCA84D 가변 중쇄 CDR2 (SEQ ID NO: 16)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열: tacattagta gtgacagtag tgccatctac tatgcagaca cagtgaag
BRCA84D 가변 중쇄 CDR3 (SEQ ID NO: 17): GRENIYYGSRLDY
BRCA84D 가변 중쇄 CDR3 (SEQ ID NO: 18)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열: gggagggaaa acatttacta cggtagtagg cttgactac
B. BRCA69D의 서열
(1) BRCA69D 경쇄 서열
BRCA69D 가변 경쇄 (SEQ ID NO: 19)의 아미노산 서열:
DIQMTQTTSS LSASLGDRVT ISCRASQDIS NYLNWYQQKP DGTVKLLIYY TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD YSLTIDNLEQ EDIATYFCQQ GNTLPPTFGG GTKLEIK
BRCA69D 가변 경쇄 (SEQ ID NO: 20)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열:
gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc atcagttgca gggcaagtca ggacattagt aattatttaa actggtatca gcagaaacca gatggaactg ttaaactcct gatctactac acatcacgat tacactcagg agtcccatca aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattgacaa cctggagcaa gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttcctccgac gttcggtgga ggcaccaaac tggaaatcaa a
BRCA69D 가변 경쇄 CDR1 (SEQ ID NO: 21): RASQDISNYLN
BRCA69D 가변 경쇄 CDR1 (SEQ ID NO: 22)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열: agggcaagtc aggacattag taattattta aac
BRCA69D 가변 경쇄 CDR2 (SEQ ID NO: 23): YTSRLHS
BRCA69D 가변 경쇄 CDR2 (SEQ ID NO: 24)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열: tacacatcac gattacactc a
BRCA69D 가변 경쇄 CDR3 (SEQ ID NO: 25): QQGNTLPPT
BRCA69D 가변 경쇄 CDR3 (SEQ ID NO: 26)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열: caacagggta atacgcttcc tccgacg
(2) BRCA69D 중쇄 서열
BRCA69D 가변 중쇄 (SEQ ID NO: 27)의 아미노산 서열:
QVQLQQSGAE LARPGASVKL SCKASGYTFT SYWMQWVKQR PGQGLEWIGT IYPGDGDTRY TQKFKGKATL TADKSSSTAY MQLSSLASED SAVYYCARRG IPRLWYFDVW GAGTTVTVSS
BRCA69D 가변 중쇄 (SEQ ID NO: 28)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열:
caggttcagc tccagcagtc tggggctgag ctggcaagac ctggggcttc agtgaagttg tcctgcaagg cttctggcta cacctttact agctactgga tgcagtgggt aaaacagagg cctggacagg gtctggaatg gattgggact atttatcctg gagatggtga tactaggtac actcagaagt tcaagggcaa ggccacattg actgcagata aatcctccag cacagcctac atgcaactca gcagcttggc atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagaagaggg attccacggc tttggtactt cgatgtctgg ggcgcaggga ccacggtcac cgtctcctca
BRCA69D 가변 경쇄 CDR1 (SEQ ID NO: 29): SYWMQ
BRCA69D 가변 경쇄 CDR1 (SEQ ID NO: 30)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열: agctactgga tgcag
BRCA69D 가변 경쇄 CDR2 (SEQ ID NO: 31): TIYPGDGDTR YTQKFKG
BRCA69D 가변 경쇄 CDR2 (SEQ ID NO: 32)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열: actatttatc ctggagatgg tgatactagg tacactcag aagttcaagg gc
BRCA69D 가변 경쇄 CDR3 (SEQ ID NO: 33): RGIPRLWYFD V
BRCA69D 가변 경쇄 CDR3 (SEQ ID NO: 34)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열: agagggattc cacggctttg gtacttcgat gtc
C. PRCA157의 서열
(1) PRCA157 경쇄 서열
PRCA157 가변 경쇄 (SEQ ID NO: 35)의 아미노산 서열:
DIQMTQSPAS LSVSVGETVT ITCRASESIY SYLAWYQQKQ GKSPQLLVYN TKTLPEGVPS RFSGSGSGTQ FSLKINSLQP EDFGRYYCQH HYGTPPWTFG GGTNLEIK
PRCA157 가변 경쇄 (SEQ ID NO: 36)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열:
gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgtat ctgtgggaga aactgtcacc attacatgtc gagcaagtga gagtatttac agttatttag catggtatca gcagaaacag ggaaaatctc ctcagctcct ggtctataat acaaaaacct taccagaggg tgtgccatca aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag ttttctctga agatcaacag cctgcagcct gaagattttg
PRCA157 가변 경쇄 CDR1 (SEQ ID NO: 37): RASESIYSYLA
PRCA157 가변 경쇄 CDR1 (SEQ ID NO: 38)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열: cgagcaagtg agagtattta cagttattta gca
PRCA157 가변 경쇄 CDR2 (SEQ ID NO: 39): NTKTLPE
PRCA157 가변 경쇄 CDR2 (SEQ ID NO: 40)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열: aatacaaaaa ccttaccaga g
PRCA157 가변 경쇄 CDR3 (SEQ ID NO: 41): QHHYGTPPW
PRCA157 가변 경쇄 CDR3 (SEQ ID NO: 42)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열: caacatcatt atggtactcc tccgtgg
(2) PRCA157 중쇄 서열
PRCA157 가변 중쇄 (SEQ ID NO: 43)의 아미노산 서열:
EVQQVESGGD LVKPGGSLKL SCAASGFTFS SYGMSWVRQT PDKRLEWVAT INSGGSNTYY PDSLKGRFTI SRDNAKNTLY LQMRSLKSED TAMYYCARHD GGAMDYWGQG TSVTVSS
PRCA157 가변 중쇄 (SEQ ID NO: 44)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열:
gaggtgcagc aggtggagtc ggggggagac ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt tcctatggca tgtcttgggt tcgccagact ccagacaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attaatagtg gtggaagtaa cacctactat ccagacagtt tgaaggggcg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctttac ctgcaaatgc gcagtctgaa gtctgaggac acagccatgt attactgtgc aagacatgac gggggagcta tggactactg gggtcaagga acctcagtca ccgtctcctc a
PRCA157 가변 중쇄 CDR1 (SEQ ID NO: 45): SYGMS
PRCA157 가변 중쇄 CDR1 (SEQ ID NO: 46)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열: tcctatggca tgtct
PRCA157 가변 중쇄 CDR2 (SEQ ID NO: 47): VATINSGGSN TYYPDSLKG
PRCA157 가변 중쇄 CDR2 (SEQ ID NO: 48)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열: gtcgcaacca ttaatagtgg tggaagtaac acctactatc cagacagttt gaagggg
PRCA157 가변 중쇄 CDR3 (SEQ ID NO: 49): HDGGAMDY
PRCA157 가변 중쇄 CDR3 (SEQ ID NO: 50)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열: catgacgggg gagctatgga ctac
D. Fc-조작된 B7-H3 항체
전통적인 면역 기능으로, 면역계의 세포와 함께 항체-항원 복합체의 상호작용은 항체-의존적 세포 독성, 비만 세포 탈과립, 및 식균작용과 같은 작용 기능부터 림프 세포 증식 및 항체 분비와 같은 면역 조절 시그널까지 범위의, 넓은 배열의 반응으로 이어진다. 모든 상호작용은 항체 또는 면역 복합체의 Fc 도메인과 조혈 세포의 전문화된 세포 표면 수용체의 결합을 통해 개시된다. 항체 및 면역 복합체에 의해 일어난 다양한 세포 반응은 3개의 Fc 수용체 FcγRI (CD64), FcγRII (CD32), 및 FcγRIII (CD16)의 구조적 이종으로부터 일어난다. FcγRI (CD64), FcγRIIA (CD32A) 및 FcγRIII (CD16)는 활성화된 (즉, 면역계 향상) 수용체이다; FcγRIIB (CD32B)는 억제된 (즉, 면역계 약화) 수용체이다. IgG1 Fc 영역의 아미노산 서열은 하기 나타난다 (SEQ ID NO: 51, Kabat et al, SEQUENCE OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th Ed. Public Health Service, NIH, MD (1991)에 따라 번호를 매겼고, 표현적으로 참고로 본원에 포함되고, 이후 "Kabat EU"로 나타난다):
SEQ ID NO: 51
PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCWVDVSHE DPEVKFNWYV
230 240 250 260 270
DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRWSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP
280 290 300 310 320
APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSREEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV
330 340 350 360 370
EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH
380 390 400 410 420
EALHNHYTQK SLSLSPGK
430 440
잔기 230-341은 Fc CH2 영역이다. 잔기 342-447은 Fc CH3 영역이다.
본 발명은 하나 이상의 부분에서 하나 이상의 아미노산 변형 (예를 들어, 치환, 삭제, 삽입)을 갖는 변이체 Fc 영역을 포함하는 B7-H3와 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는데, 이 변형은 FcγR에 대한 변이체 Fc 영역의 친화도 및 결합력을 증가시킨다 (활성화 및 억제 FcγR을 포함). 일부 구체예에서, 상기 하나 이상의 아미노산 변형은 FcγRIIIA 및/또는 FcγRIIA에 대한 변이체 Fc 영역의 친화도를 증가시킨다. 또 다른 구체예에서, 변이체 Fc 영역은 비교 가능한 모체 항체 (즉, Fc 영역에서 하나 이상의 아미노산 변형을 제외한 본 발명의 항체와 같은 아미노산 서열을 가진 항체)의 Fc 영역보다 낮은 친화도로 FcγRIIB와 더 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 이러한 변형은 모체 항체에 비해 FcγRIIIA 및/또는 FcγRIIA에 대한 변이체 Fc 영역의 친화도를 증가시키고 또한 FcyRIIB에 대한 변이체 Fc 영역의 친화도를 향상시킨다. 다른 구체예에서, 상기 하나 이상의 아미노산 변형은 FcγRIIIA 및/또는 FcγRIIA에 대한 변이체 Fc 영역의 친화도를 증가시키지만 모체 항체의 Fc 영역에 비해 FcγRIIB에 대한 변이체 Fc 영역의 친화도를 변화시키지 않는다. 또 다른 구체예에서, 상기 하나 이상의 아미노산 변형은 FcγRIIIA 및 FcγRIIA에 대한 변이체 Fc 영역의 친화도를 향상시키지만 모체 항체에 비해 FcγRIIB에 대한 친화도를 감소시킨다. 모체 분자의 결합 활성 (변형된 Fc 영역 없이)이 세포에서 검출될 수 없을 때 증가된 친화도 및/또는 결합력은 낮은 레벨의 FcγR를 발현하는 세포에서 검출 가능한 FcγR와의 결합 또는 FcγR-관련된 활성으로 이어진다. 다른 구체예에서, 변형된 분자는 30,000 내지 20,000 분자/ 세포의 밀도로, 20,000 내지 10,000 분자/ 세포의 밀도로, 10,000 내지 5,000 분자/ 세포의 밀도로, 5,000 내지 1,000 분자/ 세포의 밀도로, 1,000 내지 200 분자/ 세포의 밀도로 또는 200 분자/ 세포 이하의 밀도로 (하지만 적어도 10, 50, 100 또는 150 분자/ 세포) 비-FcγR 수용체 표적 항원을 발현하는 세포에서 검출 가능한 결과를 나타낸다.
또 다른 구체예에서, Fc 영역의 아미노산에 대한 상기 하나 이상의 변형은 하나 이상의 FcγR 수용체에 대한 항체의 친화도 및 결합력을 감소시킨다. 특이적 구체예에서, 본 발명은 변이체 Fc 영역을 포함하는 항체를 포함하는데, 상기 변이체 Fc 영역은 야생형 Fc 영역에 비해 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하고, 이 변이체 Fc 영역은 단지 FcγR과의 결합하는데, 상기 FcγR은 FcγRIIIA이다. 또 다른 특정 구체예에서, 본 발명은 변이체 Fc 영역을 포함하는 항체를 포함하는데, 상기 변이체 Fc 영역은 야생형 Fc 영역에 비해 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하고, 이 변이체 Fc 영역은 단지 하나의 FcγR과의 결합하고, 상기 FcγR은 RcyRIIA이다.
바람직하게, 본 발명의 분자의 결합성은 하나 이상의 FcγR 매개자 작용 세포 기능을 결정하기 위해 (섹션 5.2.7 참조) 시험관 내 기능 검정에 의해 시험관 내에서 기능적 검정에 의해 특성화된다. FcγR에 대한 본 발명의 분자, 예를 들어, 항체의 친화도 및 결합성은 항체-항원 또는 Fc-FcγR 상호작용, 즉, 각각 항원과 항체의 특이적인 결합 또는 Fc 영역과 FcγR의 특이적인 결합을 결정하기 위해, ELISA 검정, 표면 플라스몬 공명 검정, 면역 침강 검정을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 업계에 알려진 생체 내 검정 (생화학적 또는 면역학적 기초한 검정)을 사용하여 결정될 수 있다. 가장 바람직한 구체예에서, 본 발명의 분자는 시험관 내 기초한 검정과 유사한 생체 내 모델 (여기에 설명되고 개시된 것들과 같은)의 결합성을 갖는다. 하지만, 본 발명은 시험관 내 기초한 검정에서 원하는 표현형을 나타내지 않지만 생체 내에서 원하는 표현형을 나타내는 본 발명의 분자를 제외하지 않는다.
일부 구체예에서, 변이체 Fc 영역을 포함하는 본 발명의 분자는 Fc 영역의 CH3 도메인에서 적어도 하나의 아미노산 변형 (예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 이상의 아미노산 변형을 소유함)을 포함하고, 이것은 아미노산 342-447로부터 확장으로 정의된다. 다른 구체예에서, 변이체 Fc 영역을 포함하는 본 발명의 분자는 Fc 영역의 CH2 도메인에서 적어도 하나의 아미노산 변형 (예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 이상의 아미노산 변형을 소유함)을 포함하는데, 이것은 아미노산 231-341로부터 확장으로 정의된다. 일부 구체예에서, 본 발명의 분자는 적어도 2개의 아미노산 변형 (예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 이상의 아미노산 변형을 소유함)을 포함하는데, 적어도 하나의 이러한 변형은 CH3 영역에 있고 적어도 하나의 이러한 변형은 CH2 영역에 있다. 본 발명은 경첩 영역의 아미노산 변형을 더 포함한다. 특정 구체예에서, 본 발명은 Fc 영역의 CH1에서 아미노산 변형을 포함하는데, 이것은 아미노산 216-230으로부터 확장으로 정의된다.
특히 바람직한 구체예에서, 본 발명은 변이체 Fc 영역을 포함하는 분자를 포함하는데 상기 변이체는 당업자에 알려진 방법을 사용하여 측정하고 여기에 예시된 바와 같이, 증가한 ADCC 활성 및/또는 증가한 FcγRIIA (CD32A)와의 결합을 제공하거나 갖는다. 본 발명의 방법에 따라 사용된 ADCC 검정은 NK 의존적 또는 마크로파지 의존적일 수도 있다.
특히 바람직한 구체예에서, 본 발명은 변이체 Fc 영역을 포함하는 분자를 포함하는데 상기 변이체는 당업자에 알려진 방법을 사용하여 측정하고 여기에 예시된 바와 같이, 증가한 ADCC 활성 및/또는 증가한 FcγRIIIA (CD16A)와의 결합을 제공하거나 갖는다. 본 발명의 방법에 따라 사용된 ADCC 검정은 NK 의존적 또는 마크로파지 의존적일 수도 있다.
본 발명의 Fc 변이체는 미국 특허 번호 7,632,497; 7,521,542; 7,425,619; 7,416,727; 7,371,826; 7,355,008; 7,335,742; 7,332,581; 7,183,387; 7,122,637; 및 6,737,056; PCT 공개 번호 WO 2008/105886; WO 2008/002933; WO 2007/021841; WO 2007/106707; WO 06/088494; WO 05/115452; WO 05/110474; WO 04/1032269; 및 WO 04/063351; 및 Presta, L.G. et al. (2002) "Engineering therapeutic antibodies for improved function" Biochem. Soc. Trans. 30(4): 487-490; Shields, R.L. et al. (2002) "Lack of fucose on human IgGl N-linked oligosaccharide improves binding to human Fcgamma RIII and antibody-dependent cellular toxicity" J. Biol. Chem. 26; 277(30): 26733-26740 및 Shields, R.L. et al. (2001) "High resolution mapping of the binding site on human IgGl for Fc gamma RI, Fc gamma RII, Fc gamma RIII, and FcRn and design of IgGl variants with improved binding to the Fc gamma R" J. Biol. Chem. 276(9): 6591-6604)에 개시된 것들과 같은, 다른 Fc 변형과의 결합할 수도 있다. 본 발명은 변형된 항체에 대한 추가적인, 시너지의, 또는 새로운 성질을 제공하기 위해 본 발명의 Fc 변이체와 다른 Fc 변형이 결합하는 것을 포함한다. 바람직하게, 본 발명의 Fc 변이체는 그들이 결합하는 변형의 표현형을 향상시킨다. 예를 들어, 본 발명의 Fc 변이체가 비교 가능한 야생형 Fc 영역보다 더 높은 친화도로 FcγRIIIA와의 결합하는 것으로 알려진 돌연변이와의 결합하면, 본 발명의 돌연변이와 조합은 FcγRIIIA 친화도의 더 큰 향상으로 이어진다.
본 발명은 변이체 Fc 영역을 포함하는 B7-H3와 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는데, 변이체 Fc 영역은 위치 243, 255, 256, 258, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 300, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 320, 322, 326, 329, 330, 332, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 339, 340, 359, 360, 373, 376, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438, 439 중 하나 이상에서 단독으로 치환을 갖지 않거나 치환이 아닌 것이 제공되는, 야생형 Fc 영역을 포함하는 분자에 비해 분자가 향상된 작용 기능을 갖는, 야생형 Fc 영역에 비해 적어도 하나의 아미노산 변형 (예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 이상의 아미노산 변형을 소유함)을 포함한다. 특이적 구체예에서, 본 발명은 변이체 Fc 영역을 포함하는 이러한 항체를 포함하는데, 변이체 Fc 영역은 위치 243, 255, 258, 267, 269, 270, 276, 278, 280, 283, 285, 289, 292, 293, 294, 295, 296, 300, 303, 305, 307, 309, 320, 322, 329, 332, 331, 337, 338, 340, 373, 376, 416, 419, 434, 435, 437, 438, 439 중 하나 이상에서 단독으로 치환을 갖지 않거나 이것이 아니고 위치 256, 290, 298, 312, 326, 333, 334, 359, 360, 또는 430 중 하나에서 알라닌; 위치 268에서 아스파라긴; 위치 272에서 글루타민; 위치 286에서 글루타민, 세린 또는 아스파르트산; 위치 290에서 세린; 위치 301에서 메티오닌; 위치 320에서 메티오닌, 글루타민, 글루탐산, 또는 아르기닌; 위치 322에서 글루탐산; 위치 326에서 아스파라긴, 세린, 글루탐산, 또는 아스파르트산; 위치 330에서 리신; 위치 334에서 메티오닌; 위치 334에서 히스티딘; 위치 334에서 발린; 위치 334에서 루신; 위치 335에서 글루타민; 위치 335에서 리신; 또는 위치 339에서 트레오닌을 갖지 않는 것이 제공되는, 야생형 Fc 영역을 포함하는 분자에 비해 분자가 다른 친화도로 FcγR과의 결합하는, 야생형 Fc 영역에 비해 적어도 하나의 아미노산 변형 (예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 이상의 아미노산 변형을 소유함)을 포함한다.
본 발명은 또한 변이체 Fc 영역을 포함하는 B7-H3와 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는데, 변이체 Fc 영역은 변이체 Fc 영역을 포함하는 이러한 항체를 포함하고, 변이체 Fc 영역은 위치 268, 269, 270, 272, 276, 278, 283, 285, 286, 289, 292, 293, 301, 303, 305, 307, 309, 320, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 또는 439 중 하나 이상에서 단독으로 치환을 갖지 않거나 이것이 아니고 위치 280에서 히스티딘, 글루타민, 또는 티로신; 위치 290에서 세린, 글리신, 트레오닌 또는 티로신, 위치 294에서 아스파라긴, 위치 295에서 리신, 위치 296에서 프롤린; 위치 298에서 프롤린, 아스파라긴, 아스파르트산, 또는 발린, 또는 위치 300에서 루신 또는 이소루신을 갖지 않는다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 변이체 Fc 영역을 포함하는 이러한 항체를 포함하는데, 위치 243, 252, 254, 265, 268, 269, 270, 278, 289, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 300, 301, 303, 322, 324, 327, 329, 333, 335, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 414, 416, 419, 434, 435, 437, 438, 또는 439 중 하나 이상에서 단독으로 치환을 갖지 않거나 치환이 아닌 것이 제공되는 야생형 Fc 영역을 포함하는 분자에 비해 분자가 감소된 친화도로 FcγR과의 결합하는, 야생형 Fc 영역에 비해 변이체 Fc 영역은 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 변이체 Fc 영역을 포함하는 이러한 항체를 포함하는데, 위치 280, 283, 285, 286, 290, 294, 295, 298, 300, 301, 305, 307, 309, 312, 315, 331, 333, 334, 337, 340, 360, 378, 398, 또는 430 중 하나 이상에서 단독으로 치환을 갖지 않거나 치환이 아닌 것이 제공되는 야생형 Fc 영역을 포함하는 분자에 비해 분자가 향상된 친화도로 FcγR과의 결합하는, 야생형 Fc 영역에 비해 변이체 Fc 영역은 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함한다.
본 발명은 또한 변이체 Fc 영역을 포함하는 B7-H3와 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는데, 변이체 Fc 영역은 위치 330, 243, 247, 298, 241, 240, 244, 263, 262, 235, 269, 또는 328 중 하나 이상에서 단독으로 치환을 포함하지 않거나 치환이 아니고 위치 243에서 루신, 위치 298에서 아스파라긴, 위치 241에서 루신, 및 위치 240에서 이소루신 또는 알라닌, 위치 244에서 히스티딘, 위치 330에서 발린, 또는 위치 328에서 이소루신을 갖지 않는다.
본 발명은 특히 활성화 및/또는 억제에 대한 향상된 작용 기능 및/또는 변화된 친화도를 갖는 변이체 Fc 영역을 포함하는 B7-H3와 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는데, 변이체 Fc 영역은 (a) 다음 치환들: S239D, S298A, A330L, I332E, E333A, 또는 K334A 중 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개; 또는 (b) 치환의 조합: (1) S298A, E333A, 및 K334A; (2) S239D 및 I332E; 또는 (3) S239D, A330L 및 I332E 중 하나를 포함한다.
본 발명은 특히 활성화 및/또는 억제에 대한 향상된 작용 기능 및/또는 변화된 친화도를 갖는 변이체 Fc 영역을 포함하는 B7-H3와 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는데, 변이체 Fc 영역은 치환을 포함한다:
(1) 위치 288에서 아스파라긴, 위치 330에서 세린 및 위치 396에서 루신;
(2) 위치 334에서 글루탐산, 위치 359에서 아스파라긴, 및 위치 366에서 세린;
(3) 위치 316에서 아스파르트산, 위치 378에서 발린, 및 위치 399에서 글루탐산;
(4) 위치 247에서 루신, 및 치환 위치 421에서 리신;
(5) 위치 392에서 트레오닌, 및 위치 396에서 루신;
(6) 위치 221에서 글루탐산, 위치 270에서 글루탐산, 위치 308에서 알라닌, 위치 311에서 히스티딘, 위치 396에서 루신, 및 위치 402에서 아스파르트산;
(7) 위치 419에서 히스티딘, 및 치환 위치 396에서 루신;
(8) 위치 240에서 알라닌, 및 위치 396에서 루신;
(9) 위치 410에서 히스티딘, 및 위치 396에서 루신;
(10) 위치 243에서 루신, 위치 305에서 이소루신, 위치 378에서 아스파르트산, 위치 404에서 세린, 및 위치 396에서 루신;
(11) 위치 255에서 이소루신, 및 위치 396에서 루신;
(12) 위치 370에서 글루탐산, 및 위치 396에서 루신;
(13) 위치 270에서 글루탐산; 또는
(14) 상기 (1)-(12) 치환의 조합.
특이적 구체예에서, 본 발명은 치환 F243L, R292P, 및 Y300L을 포함하는 변이체 Fc 영역을 포함하는 B7-H3와 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다. 추가적인 특이적 구체예에서, 본 발명은 치환 L235V, F243L, R292P, Y300L, 및 P396L을 포함하는 변이체 Fc 영역을 포함하는 B7-H3와 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다. 추가적인 특이적 구체예에서, 본 발명은 치환 F243L, R292P, Y300L, V305I, 및 P396L를 포함하는 변이체 Fc 영역을 포함하는 B7-H3와 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다.
추가적인 특이적 구체예에서, 본 발명은 위치 396에서 루신, 위치 270에서 글루탐산 및 위치 243에서 루신으로 치환을 포함하는 변이체 Fc 영역을 포함하는 B7-H3와 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다. 또 다른 특이적 구체예에서 분자는 여기에 개시된 것과 같은 하나 이상의 아미노산 변형을 더 포함한다.
본 발명은 특히 다음 위치 119, 125, 132, 133, 141, 142, 147, 149, 162, 166, 185, 192, 202, 205, 210, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 221, 222, 223, 224, 225, 227, 229, 231, 232, 233, 235, 240, 241, 242, 243, 244, 246, 247, 248, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 258, 261, 262, 263, 268, 269, 270, 272, 274, 275, 276, 279, 280, 281, 282, 284, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 295, 298, 301, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 323, 326, 327, 328, 330, 333, 334, 335, 337, 339, 340, 343, 344, 345, 347, 348, 352, 353, 354, 355, 358, 359, 360, 361, 362, 365, 366, 367, 369, 370, 371, 372, 375, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 404, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 414, 415, 416, 417, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 427, 428, 431, 433, 435, 436, 438, 440, 441, 442, 443, 446, 또는 447 중 하나 이상에서 아미노산 변형을 갖는, 활성화 및/또는 억제 수용체에 대한 향상된 작용 기능 및/또는 변화된 친화도를 갖는 변이체 Fc 영역을 포함하는 B7-H3와 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다. 바람직하게이러한 돌연변이는 작용 세포 매개된 기능이 제공되는 분자로 이어지고, 선택적으로, 여기에 개시되고 예시되고 당업자에 알려진 방법을 사용하여 결정된 바와 같이 FcγR에 대한 변화된 친화도를 갖는다.
본 발명은 특히 활성화 및/또는 억제 수용체에 대한 변화된 작용 기능 및/또는 변화된 친화도를 갖는 변이체 Fc 영역을 포함하는 B7-H3와 특이적으로 결합하고,
(I) 이러한 항체는 이러한 변형이 결핍된 야생형 Fc 영역을 갖는 항체에 비해 변화된 작용 기능을 나타내는, 다음 위치: 235, 240, 241, 243, 244, 247, 262, 263, 269, 298, 328, 또는 330 중 하나 이상에서 및 더 바람직하게 다음 변형: V240A, V240I, F241L, F243L, P244H, S298N, L328I, A330V 중 하나 이상에서 아미노산 변형;
(II) 이러한 항체는 이러한 변형이 결핍된 야생형 Fc 영역을 갖는 항체에 비해 변화된 작용 기능을 나타내는, 다음 위치: 268, 269, 270, 272, 276, 278, 283, 285, 286, 289, 292, 293, 301, 303, 305, 307, 309, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 또는 439 중 하나 이상에서 및 더 바람직하게 다음 변형: D280H, D280Q, D280Y, K290G, K290S, K290T, K290Y, E294N, Q295K, Y296P, S298D, S298N, S298P, S298V, Y300I, Y300L 중 하나 이상에서 아미노산 변형;
(III) 이러한 항체는 이러한 변형이 결핍된 야생형 Fc 영역을 갖는 항체에 비해 변화된 작용 기능을 나타내는, 다음 위치: 255, 256, 258, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 300, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 320, 322, 326, 329, 330, 332, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 339, 340, 359, 360, 373, 376, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438, 439 중 하나 이상에서 및 더 바람직하게 다음 변형: T256A, H268N, E272Q, N286D, N286Q, N286S, K290A, K290S, S298A, R301M, D312A, K320E, K320M, K320Q, K320R, K322E, K326A, K326D, K326E, K326N, K326S, A330K, A339T, E333A, K334A, K334E, K334H, K334L, K334M, K334Q, K334V, T335K, T335Q, T359A, K360A, E430A 중 하나 이상에서 아미노산 변형;
(IV) 이러한 항체는 이러한 변형이 결핍된 야생형 Fc 영역을 갖는 항체에 비해 감소된 작용 기능을 나타내는, 다음 위치: 252, 254, 265, 268, 269, 270, 278, 289, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 300, 301, 303, 322, 324, 327, 329, 333, 335, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 414, 416, 419, 434, 435, 437, 438, 또는 439 중 하나 이상에서 아미노산 변형;
(V) 이러한 항체는 이러한 변형이 결핍된 야생형 Fc 영역을 갖는 항체에 비해 향상된 작용 기능을 나타내는, 다음 위치: 280, 283, 285, 286, 290, 294, 295, 298, 300, 301, 305, 307, 309, 312, 315, 331, 333, 334, 337, 340, 360, 378, 398, 또는 430 중 하나 이상에서 아미노산 변형; 또는
(VI) 이러한 항체는 이러한 변형이 결핍된 야생형 Fc 영역을 갖는 항체에 비해 향상된 작용 기능을 나타내는, 다음 위치: R255A, T256A, E258A, S267A, H268A, H268N, E272A, E272Q, N276A, D280A, E283A, H285A, N286A, N286D, N286Q, N286S, K290A, K290S, R301M, K320E, K320M, K320Q, K320R, K322E, K326A, K326D, K326E, K326S, A330K, P331A, T335Q, S337A, E430A 중 하나 이상에서 아미노산 변형;
을 갖는 항체를 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 Jefferis, B.J. et al. (2002) "Interaction Sites On Human IgG-Fc For FcgammaR: Current Models Immunol. Lett. 82: 57-65; Presta, L.G. et al. (2002) "Engineering Therapeutic Antibodies For Improved Function Biochem. Soc. Trans. 30: 487-90; Idusogie, E.E. et al. (2001) "Engineered Antibodies With Increased Activity To Recruit Complement? J. Immunol. 166: 2571-75; Shields, R.L. et al. (2001) "High Resolution Mapping Of The Binding Site On Human IgGl For Fc Gamma RI, Fc Gamma RII, Fc Gamma RIII, and FcRn and Design Of IgGl Variants With Improved Binding To The Fc gamma R? J. Biol. Chem. 276: 6591-6604; Idusogie, E.E. et al. (2000) "Mapping Of The Clq Binding Site On Rituxan, A Chimeric Antibody With A Human IgG Fc? J. Immunol. 164: 4178-84; Reddy, M.P. et al. (2000) "Elimination Of Fc Receptor-Dependent Effector Functions Of A Modified IgG4 Monoclonal Antibody To Human CD4? J. Immunol. 164: 1925-1933; Xu, D. et al. (2000) "In Vitro Characterization of Five Humanized OKT3 Effector Function Variant Antibodies? Cell. Immunol. 200: 16-26; Armour, K.L. et al. (1999) "Recombinant human IgG Molecules Lacking Fcgamma Receptor I Binding and Monocyte Triggering Activities? Eur. J. Immunol. 29: 2613-24; Jefferis, R. et al. (1996) "Modulation Of Fc(Gamma)R and Human Complement Activation By IgG3-Core Oligosaccharide Interactions? Immunol. Lett. 54: 101-04; Lund, J. et al. (1996) "Multiple Interactions Of IgG With Its Core Oligosaccharide Can Modulate Recognition By Complement and Human Fc Gamma Receptor I and Influence The Synthesis Of Its Oligosaccharide Chains? J. Immunol. 157: 4963-4969; Hutchins et al. (1995) "Improved Biodistribution, Tumor Targeting, and Reduced Immunogenicity In Mice With A Gamma 4 Variant Of Campath-1H? Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 92: 11980-84; Jefferis, R. et al. (1995) "Recognition Sites On Human IgG For Fc Gamma Receptors: The Role Of Glycosylation? Immunol. Lett. 44: 111-17; Lund, J. et al. (1995) "Oligosaccharide-Protein Interactions In IgG Can Modulate Recognition By Fc Gamma Receptors? FASEB J. 9: 115-19; Alegre, M.L. et al. (1994) "A Non-Activating "Humanized" Anti-CD3 Monoclonal Antibody Retains Immunosuppressive Properties In Vivo? Transplantation 57: 1537-1543; Lund et al. (1992) "Multiple Binding Sites On The CH2 Domain Of IgG For Mouse Fc Gamma Rll" Mol. Immunol. 29: 53-59; Lund et al. (1991) "Human Fc Gamma RI and Fc Gamma RII Interact With Distinct But Overlapping Sites On Human IgG" J. Immunol. 147: 2657-2662; Duncan, A.R. et al. (1988) "Localization Of The Binding Site For The Human High-Affinity Fc Receptor On IgG" Nature 332: 563-564; 미국 특허 번호 5,624,821; 5,885,573; 6,194,551; 7,276,586; 및 7,317,091; 및 PCT 공개 WO 00/42072 및 PCT WO 99/58572에 개시된 바와 같이, 업계에 알려진 Fc 변이체의 사용을 포함한다.
본 발명은 하기 표 1에 나열된 돌연변이 중 하나로 구성되거나 이를 포함하는 변이체 Fc 영역을 포함하는 분자를 포함한다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
특이적 구체예에서, 이러한 항-B7-H3 항체의 변이체 Fc 영역은 다음을 갖는다:
(1) 위치 247에 루신, 위치 421에 리신 및 위치 270에 글루탐산;
(2) 위치 392에 트레오닌, 위치 396에 루신, 위치 270에 글루탐산, 및 위치 243에 루신;
(3) 위치 419에 히스티딘, 위치 396에 루신, 및 위치 270에 글루탐산;
(4) 위치 419에 히스티딘, 위치 396에 루신, 위치 270에 글루탐산, 및 위치 243에서 루신;
(5) 위치 240에 알라닌, 위치 396에 루신, 및 위치 270에 글루탐산;
(6) 위치 255에 리신 및 위치 396에 루신;
(7) 위치 255에 리신, 위치 396에 루신, 및 위치 270에 글루탐산;
(8) 위치 255에 리신, 위치 396에 루신, 위치 270에 글루탐산, 및 위치 300에 리신;
(9) 위치 255에 리신, 위치 396에 루신, 위치 270에 글루탐산, 및 위치 292에 글리신;
(10) 위치 255에 리신, 위치 396에 루신, 위치 270에 글루탐산, 및 위치 243에 루신;
(11) 위치 370에 글루탐산, 위치 396에 루신, 및 위치 270에 글루;
(12) 위치 270에 글루탐산, 위치 316에 아스파르트산, 및 위치 416에 글리신;
(13) 위치 243에 루신, 위치 292에 프롤린, 위치 305에 이소루신, 및 위치 396에 루신;
(14) 위치 243에 루신, 위치 270에 글루탐산, 위치 392에 아스파라긴 및 위치 396에 루신;
(15) 위치 243에 루신, 위치 255에 루신, 위치 270에 글루탐산 및 위치 396에서 루신;
(16) 위치 297에 글루타민; 또는
(17) 상기 (1)-(16) 치환의 조합
일부 구체예에서, 하나 이상의 탄수화물 모이어티가 분자에 공유 결합으로 부착되기 위해서, 본 발명의 분자는 하나 이상의 글리코실화 부위를 더 포함한다. 바람직하게, 하나 이상의 글리코실화 부위 및/또는 Fc 영역에서 하나 이상의 변형을 갖는 본 발명의 분자는 모체 항체와 비교하여 향상된 항체 매개 작용 기능, 예를 들어, 향상된 ADCC 활성을 제공하거나 갖는다. 일부 구체예에서, 본 발명은 위치 241, 243, 244, 245, 245, 249, 256, 258, 260, 262, 264, 265, 296, 299, 및 301에서 아미노산을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 항체의 탄수화물 모이어티와 직접적으로 또는 간접적으로 상호작용하는 것으로 알려진 아미노산의 하나 이상의 변형을 포함하는 분자를 더 포함한다. 항체의 탄수화물 모이어티와 직접적으로 또는 간접적으로 상호작용하는 아미노산은 업계에 알려져 있고, 예를 들어, Jefferis et ah, 1995 Immunology Letters, 44: 111-7을 참조하고, 이것은 전문이 본원에 참고로 포함된다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 바람직하게 분자의 기능성, 예를 들어, 표적 항원 또는 FcγR에 대한 결합 활성을 변화시키지 않고, 분자의 하나 이상의 부위로 하나 이상의 글리코실화 부위를 도입함으로써 변형된 분자를 포함한다. 글리코실화 부위는 본 발명의 분자의 가변 영역 및/또는 불변 영역으로 도입될 수도 있다. 여기에 사용된 바와 같이, "글리코실화 부위"는 올리고당 (즉, 함께 결합된 두 개 이상의 단당류를 함유하는 탄수화물)이 특이적으로 및 공유 결합으로 부착될 항체의 특이적 아미노산을 포함한다. 올리고당 측쇄는 전형적으로 N- 또는 O-결합을 통해 항체의 백본과 연결된다. N-결합된 글리코실화는 아스파라긴 잔기의 측쇄에 올리고당 모이어티의 부착을 나타낸다. O-결합된 글리코실화는 히드록시아미노산, 예를 들어, 세린, 트레오닌에 올리고당 모이어티의 부착을 나타낸다. 본 발명의 분자는 N-결합된 및 O-결합된 글리코실화 부위를 포함하는, 하나 이상의 글리코실화 부위를 포함할 수도 있다. 업계에 알려진 N-결합된 또는 O-결합된 글리코실화를 위한 글리코실화 부위는 본 발명에 따라 사용될 수도 있다. 본 발명의 방법에 따라 유용한 모범적인 N-결합된 글리코실화 부위는 아미노산 서열: Asn-X-Thr/Ser인데, X는 어느 아미노산일 수도 있고 Thr/Ser은 트레오닌 또는 세린을 나타낸다. 이러한 부위 또는 부위들은 본 발명이 존재하는 업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 본 발명의 분자 내로 도입될 수도 있다 (예를 들어, IN VITRO MUTAGENESIS, RECOMBINANT DNA: A SHORT COURSE, J. D. Watson, et al. W.H. Freeman and Company, New York, 1983, chapter 8, pp. 106-116 참조, 이것은 전문이 본원에 참고로 포함된다). 글리코실화 부위를 본 발명의 분자 내로 도입하는 모범적인 방법은 원하는 Asn-X-Thr/Ser 서열을 얻기 위해서 분자의 아미노산 서열을 변형하거나 돌연변이를 만드는 단계를 포함할 수도 있다.
일부 구체예에서, 본 발명은 글리코실화 부위를 추가하거나 삭제함으로써 본 발명의 분자의 탄수화물 함량을 바꾸는 방법을 포함한다. 항체의 탄수화물 함량을 바꾸는 방법은 업계에 잘 알려져 있고 본 발명 내에 포함되고, 예를 들어, 예를 들어, 미국 특허 번호 6,218,149; EP 0 359 096 B1; 미국 공개 번호 US 2002/0028486; WO 03/035835; 미국 공개 번호 2003/0115614; 미국 특허 번호 6,218,149; 미국 특허 번호 6,472,511 참조; 이것들 모두는 전문이 본원에 참고로 포함된다. 다른 구체예에서, 본 발명은 분자의 하나 이상의 내인성 탄수화물 모이어티를 삭제함으로써 본 발명의 분자의 탄수화물 함량을 바꾸는 방법을 포함한다. 특이적 구체예에서, 본 발명은 297에 인접한 위치를 변화시킴으로써, 항체의 Fc 영역의 글리코실화 부위를 이동시키는 것을 포함한다. 특이적 구체예에서, 본 발명은 위치 296이 글리코실화되고 위치 297은 글리코실화되지 않기 위해서 위치 296을 변화시키는 것을 포함한다.
작용 기능은 또한 개선된 내면화 능력 및/또는 증가된 보체-매개된 세포 살해 및 ADCC를 가질 수도 있는 호모다이머성 항체의 발생으로 이어지는, Fc 영역으로 하나 이상의 시스테인 잔기의 도입으로 인한, 발생하는 이 영역에 쇄내 이황화 결합 형성을 허용하는 것과 같은 기술에 의해 변형될 수 있다 (Caron, P.C. et al. (1992) "Engineered Humanized Dimeric Forms Of IgG Are More Effective Antibodies " J. Exp. Med. 176: 1191-1195; Shopes, B. (1992) A Genetically Engineered Human IgG Mutant With Enhanced Cytolytic Activity " J. Immunol. 148(9): 2918-2922).
향상된 항-종양 활성을 가진 호모다이머성 항체는 또한 Wolff, E.A. et al. (1993) Monoclonal Antibody Homodimers: Enhanced Antitumor Activity In Nude Mice " Cancer Research 53: 2560-2565에 설명된 바와 같이 헤테로 이기능 (heterobifunctional) 교차-결합을 사용하여 제조될 수도 있다. 대안으로, 이중 Fc 영역을 갖는 항체는 조작될 수 있고 그것으로 인해 향상된 보체 용해 및 ADCC 능력을 가질 수도 있다 (Stevenson, G.T. et al. (1989) A Chimeric Antibody With Dual Fc Regions (bisFabFc) Prepared By Manipulations At The IgG Hinge " Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230).
E. B7-H3 DART™ (이중 친화도 재표적화제)
상기 논의된 바와 같이, 본 발명은 추가적으로 적어도 두 개의 에피토프 결합 부위, 적어도 하나의 B7-H3와 특이적으로 결합하는 것을 형성하는 적어도 두 개의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 "DART™ " ( 이중 친화도 재표적화제) 분자를 포함한다.
바람직한 구체예에서, DART™ 의 1차 폴리펩티드 사슬은 다음을 포함한다:
(i) 에피토프 (1)에 대해 특이적인 1차 면역글로불린 (VL1)의 경쇄 가변 도메인의 결합 영역을 포함하는 도메인 (A);
(ii) 에피토프 (2)에 대해 특이적인 2차 면역글로불린 (VH2)의 중쇄 가변 도메인의 결합 영역을 포함하는 도메인 (B); 및
(iii) 도메인 (C).
이러한 DART™ 의 2차 폴리펩티드 사슬은 다음을 포함한다:
(i) 에피토프 (2)에 대해 특이적인 2차 면역글로불린 (VL2)의 경쇄 가변 도메인의 결합 영역을 포함하는 도메인 (D);
(ii) 에피토프 (1)에 대해 특이적인 1차 면역글로불린 (VH1)의 중쇄 가변 도메인의 결합 영역을 포함하는 도메인 (E); 및
(iii) 도메인 (F).
DART™ 도메인 (A) 및 (B)는 에피토프 결합 부위를 형성하기 위해 서로 결합하지 않는다. 유사하게, DART™ 도메인 (D) 및 (E)는 에피토프 결합 부위를 형성하기 위해 서로 결합하지 않는다. 오히려, DART™ 도메인 (A) 및 (E)는 에피토프 (1)과의 결합하는 결합 부위를 형성하기 위해 결합한다; 상기 DART™ 도메인 (B) 및 (D)는 상기 에피토프 (2)와의 결합하는 결합 부위를 형성하기 위해 결합한다. 도메인 (C) 및 (F)는 함께 공유 결합한다.
DART™ 분자의 각 폴리펩티드 사슬은 VL 도메인 및 VH 도메인을 포함하는데, 이것은 도메인이 자가 조립체로부터 제한되는 공유 결합으로 결합한다. 폴리펩티드 사슬 중 두 개의 상호작용은 두 개의 에피토프 결합 부위, 즉, 이가 분자를 형성하는, 2개의 VL-VH 쌍을 생산할 것이다. VH 또는 VL 도메인은 폴리펩티드 사슬 내에 어느 위치에도 제한, 즉, 아미노 (N) 또는 카르복시 (C) 말단에 제한되지 않고, 아무것도 서로 그들의 상대적인 위치에서 제한되지 않는다, 즉, VL 도메인은 VH 도메인에 대한 N-말단 및 그 반대일 수도 있다. 유일한 제한은 상보성 폴리펩티드 사슬이 기능적 DART™ 를 형성하기 위해 사용 가능하다는 것이다. VL 및 VH 도메인이 같은 항체로부터 유래된 경우, 2개의 상보성 폴리펩티드 사슬은 동일할 수도 있다. 예를 들어, 결합 도메인이 에피토프 A에 대해 특이적인 항체로부터 유래한 경우 (즉, 결합 도메인은 VLA-VHA 상호작용으로부터 유래한다), 각각의 폴리펩티드는 VHA 및 VLA를 포함할 것이다. 항체의 2개의 폴리펩티드 사슬의 호모다이머화는 2개의 VLA-VHA 결합 부위가 형성되고, 이가의 단일특이적 항체가 될 것이다. VL 및 VH 도메인이 다른 항원에 대해 특이적인 항체로부터 유래한 경우, 기능적 이중특이적 DART™ 는 2개의 다른 폴리펩티드 사슬의 상호작용, 즉, 헤테로다이머의 형성을 필요로 한다. 예를 들어, 이중 특이적 DART™ 에 대해, 한 폴리펩티드 사슬은 VLA 및 VLB를 포함할 것이다; 상기 사슬의 호모다이머화는 2개의 VLA-VHB 결합 부위, 비결합 또는 예측할 수 없는 결합 중 하나를 형성할 것이다. 반대로, 2개의 다른 폴리펩티드 사슬이 상호작용에서 자유로운 경우, 예를 들어, 재조합 발현 시스템에서, VLA 및 VHB를 포함하는 것과 VLB 및 VHA를 포함하는 것인, 2개의 다른 결합 부위: VLA-VHA 및 VLB-VHB가 형성될 것이다. 모든 DART™ 폴리펩티드 사슬에 대해, 2개의 사슬의 정렬 불량 (misalignment) 또는 잘못된 짝짓기 (mispairing)는 가능성, 즉 VL-VL 또는 VH-VH 도메인의 상호작용이다; 하지만, 기능적 디아바디 (diabody)의 정제는 업계에 알려진 또는 여기에 예시된 친화도 기초한 방법, 예를 들어, 친화도 크로마토그래피를 사용하여 적절히 다이머화된 결합 부위의 면역특이성에 기초하여 쉽게 관리된다.
DART™ 의 폴리펩티드 사슬 중 하나 이상은 선택적으로 Fc 도메인 또는 이들의 일부를 포함한다 (예를 들어, CH2 도메인, 또는 CH3 도메인). Fc 도메인 및 이들의 일부는 IgA, IgD, IgG, IgE 및 IgM을 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 어느 면역글로불린 이소타입 (isotype) 또는 알로타입 (allotype)으로부터 유래할 수 있다. 바람직한 구체예에서, Fc 도메인 (또는 이들의 일부)는 IgG로부터 유래한다. 특이적 구체예에서, IgG 이소타입은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 또는 이들의 알로타입이다. 한 구체예에서, 디아바디 분자는 Fc 도메인을 포함하는데, 이 Fc 도메인은 어느 면역글로불린 이소타입으로부터 독립적으로 선택된 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함한다 (즉, IgG로부터 유래한 CH2 도메인 및 IgE로부터 유래한 CH3 도메인, 또는 IgG1로부터 유래한 CH2 도메인 및 IgG2로부터 유래한 CH3, 등을 포함하는 Fc 도메인). Fc 도메인은 상기 폴리펩티드 사슬의 다른 도메인 또는 일부에 비해 어느 위치에서도 본 발명의 디아바디 분자를 포함하는 폴리펩티드 사슬로 조작될 수도 있다 (예를 들어, Fc 도메인, 또는 이들의 일부는 사슬의 폴리펩티드의 VL 및 VH 도메인에 대한 C-말단일 수도 있다; VL 및 VH 도메인 둘 다에 대한 N-말단일 수도 있다; 또는 한 도메인에 대한 N-말단 및 또 다른 것에 대한 C-말단일 수도 있다 (즉, 폴리펩티드 사슬의 두 도메인 사이)).
DART™ 분자의 폴리펩티드 사슬에서 Fc 도메인은 우선적으로 다이머화되고, 면역글로불린-유사 성질, 예를 들어, Fc-RcyR 상호작용을 나타내는 DART™ 분자의 형성으로 이어진다. 디아바디를 포함하는 Fc는 예를 들어, 2개의 폴리펩티드 사슬로 구성된 다이머일 수도 있는데, 각각 VH 도메인, VL 도메인 및 Fc 도메인을 포함한다. 변형되지 않은 이가 항체의 그것과 별개의 구조에도 불구하고, 상기 폴리펩티드 사슬의 다이머화는 Fc 도메인 이가의 DART™ 를 낳는다. 이러한 DART™ 분자는 야생형 면역글로불린에 비해 변화된 표현형, 예를 들어, 변화된 혈청 반감기, 결합성, 등을 나타낼 것이다. 다른 구체예에서, Fc 도메인을 포함하는 DART™ 분자는 테트라머일 수도 있다. 이러한 테트라머는 2개의 '더 무거운' 폴리펩티드 사슬, 즉, VL, VH 및 Fc 도메인을 포함하는 폴리펩티드 사슬, 및 2개의 '더 가벼운' 폴리펩티드 사슬, 즉, VL 및 VH를 포함하는 폴리펩티드 사슬을 포함한다. 더 가벼운 및 더 무거운 사슬은 모노머를 형성하기 위해 상호작용하고, 상기 모노머는 그들의 짝이 없는 Fc 도메인을 통해 Ig-유사 분자를 형성하기 위해 상호작용한다. 이러한 Ig-유사 DART™ 는 4가이고 단일 특이적, 이중 특이적 또는 사중 특이적일 수도 있다.
상기 설명된 바와 같이 사중 특이적 디아바디 분자의 형성은 4개의 다른 폴리펩티드 사슬의 상호작용을 필요로 한다. 이러한 상호작용은 잠재적인 사슬 잘못된 짝짓기의 많은 변이체 때문에, 단일 세포 재조합 생산 시스템 내에 효과를 달성하기 어렵다. 잘못된 짝짓기의 확률을 증가시키는 한 해결책은 "구멍에 손잡이 (knobs-into-holes)" 타입 돌연변이를 원하는 폴리펩티드 사슬 쌍으로 조작하는 것이다. 이러한 돌연변이는 호모다이머화를 통해 헤테로다이머화를 선호한다. 예를 들어, Fc-Fc 상호작용에 관하여, 아미노산 치환 (바람직하게 '손잡이', 예를 들어, 트립토판을 형성하는 부피 큰 곁가지 분자 (side group)을 포함하는 아미노산으로 치환)은 입체적 간섭이 유사하게 돌연변이된 도메인과 상호작용을 막고 돌연변이된 도메인이 상보성, 또는 협조적인 돌연변이가 조작된 도메인, 즉, '구멍' (예를 들어, 글리신으로 치환)과 짝을 이룰 수 있게 하는 CH2 또는 CH3 도메인으로 도입될 수 있다. 돌연변이의 이러한 세트는 디아바디 분자를 포함하는 폴리펩티드의 어느 쌍으로도 조작될 수 있고, 추가로, 상기 쌍의 폴리펩티드 사슬의 어느 부분으로도 조작될 수 있다. 호모다이머화를 통해 선호하는 헤테로다이머화로 단백질을 조작하는 방법은, 특히 면역글로불린-유사 분자의 조작에 관하여, 업계에 잘 알려져 있고 여기에 포함된다 (예를 들어, Ridgway et al. (1996) "'Knobs-Into-Holes' Engineering Of Antibody CH3 Domains For Heavy Chain Heterodimerization, " Protein Engr. 9: 617-621, Atwell et al. (1997) "Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library, "J. Mol. Biol. 270: 26-35, and Xie et al. (2005) "A New Format Of Bispecific Antibody: Highly Efficient Heterodimerization, Expression and Tumor Cell Lysis, " J. Immunol. Methods 296: 95-101 참조; 이것들 각각은 그것의 전문이 본원에 참고로 포함된다.
본 발명은 또한 변이체 Fc 또는 변이체 경첩-Fc 도메인 (또는 이들의 일부)들을 포함하는 디아바디 분자를 포함하는데, 이 변이체 Fc 도메인은 비교 가능한 야생형 Fc 도메인 또는 경첩-Fc 도메인 (또는 이들의 일부)에 비해 적어도 하나의 아미노산 변형 (예를 들어, 치환, 삽입, 삭제)을 포함한다. 변이체 Fc 도메인 또는 경첩-Fc 도메인 (또는 이들의 일부)를 포함하는 분자 (예를 들어, 항체)는 정상적으로 야생형 Fc 도메인 또는 경첩-Fc 도메인 또는 이들의 일부를 포함하는 분자에 비해 변화된 표현형을 갖는다. 변이체 표현형은 NK 의존적 또는 마크로파지 의존적 검정에서 검정된 바와 같이 변화된 혈청 반감기, 변화된 안정성, 세포 효소에 대한 변화된 민감도 또는 변화된 작용 기능으로 표현될 수도 있다. 변화하는 작용 기능으로 확인된 Fc 도메인 변형은 상기 개시된다.
본 발명은 또한 경첩 도메인을 포함하는 분자를 포함한다. 경첩 도메인은 IgA, IgD, IgG, IgE 및 IgM을 포함하는 어느 면역글로불린 이소타입 또는 알로타입으로부터 유래한다. 바람직한 구체예에서, 경첩 도메인은 IgG로부터 유래하고, IgG 이소타입은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4이거나 이들의 알로타입이다. 상기 경첩 도메인은 디아바디 분자가 경첩-Fc 도메인을 포함하는 Fc 도메인과 함께 디아바디 분자를 포함하는 폴리펩티드 사슬로 조작될 수도 있다. 특정 구체예에서, 경첩 및 Fc 도메인은 업계에 알려지거나 여기에 예시된 어느 면역글로불린 이소타입으로부터 독립적으로 선택된다. 다른 구체예에서, 경첩 및 Fc 도메인은 폴리펩티드 사슬의 적어도 하나의 다른 도메인, 예를 들어, VL 도메인에 의해 분리된다. 경첩 도메인, 또는 선택적으로 경첩-Fc 도메인은 다른 도메인 또는 상기 폴리펩티드 사슬의 일부에 비해 어느 위치에서도 본 발명의 폴리펩티드로 조작될 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드 사슬은 경첩 도메인을 포함하는데, 경첩 도메인은 폴리펩티드 사슬의 C-말단에 있고, 상기 폴리펩티드 사슬은 Fc 도메인을 포함하지 않는다. 다른 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드 사슬은 경첩-Fc 도메인을 포함하는데, 경첩-Fc 도메인을 포함하는데, 경첩-Fc 도메인은 폴리펩티드 사슬의 C-말단에 있다. 추가적인 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드 사슬은 경첩-Fc 도메인을 포함하는데, 경첩-Fc 도메인은 폴리펩티드 사슬의 N-말단에 있다.
DART™ 의 폴리펩티드 사슬의 각각의 도메인, 즉, VL, VH 및 Fc 도메인은 펩티드 연결자에 의해 분리될 수도 있다. 펩티드 연결자는 길이가 0개, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 또는 9개의 아미노산일 수도 있다. 특정 구체예에서 아미노산 연결자 서열은 핵산 서열 ggaggcggat ccggaggcgg aggc (SEQ ID NO: 53)에 의해 암호화되는 GGGS GGGG (SEQ ID NO: 52)이다. DART™ 분자의 폴리펩티드 사슬은 쇄내의 이황화 결합을 형성하기 위해 DART™ 의 2차 폴리펩티드상의 대응물 시스테인 잔기와 상호작용하는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하도록 조작될 수도 있다. 이러한 쇄내의 이황화 결합은 DART™ 분자를 안정화하기 위해 제공됨으로써, 재조합 시스템에서 발현 및 회수를 향상시키고, 결과로 안정하고 일정한 제제를 낳고 생체 내에서 분리된 및/또는 정제된 생성물의 안정성을 향상시킨다. 시스테인 잔기는 폴리펩티드 사슬의 어느 부분에서도, 단일 아미노산으로서 또는 더 큰 아미노산 서열, 예를 들어 경첩 도메인의 일부로서 도입될 수 있다. 특이적 구체예에서, 시스테인 잔기는 폴리펩티드 사슬의 C-말단에서 발생하도록 조작될 수도 있다. 일부 구체예에서, 시스테인 잔기는 아미노산 서열 LGGC 내에 폴리펩티드 사슬로 도입된다. 특이적 구체예에서, 본 발명의 DART™ 분자를 포함하는 폴리펩티드 사슬의 C-말단은 아미노산 서열 LGGC (SEQ ID NO: 54)를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 시스테인 잔기는 경첩 도메인, 예를 들어, EPKSCDKTHTCPP (SEQ ID NO: 55) 또는 ESKYGPPCPS (SEQ ID NO: 56)을 포함하는 아미노산 서열 내에 폴리펩티드로 도입된다. 특이적 구체예에서, 본 발명의 DART™ 분자의 폴리펩티드 사슬의 C-말단은 IgG 경첩 도메인, 예를 들어, SEQ ID NO: 55 또는 SEQ ID NO: 56의 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 DART™ 분자의 폴리펩티드 사슬의 C-말단은 아미노산 서열 VEPKSC (SEQ ID NO: 57)를 포함하는데, 이것은 뉴클레오티드 서열 gttgagccca aatcttgt (SEQ ID NO: 58)에 의해 암호화될 수 있다. 다른 구체예에서, 시스테인 잔기는 아미노산 서열 LGGCFNRGEC (SEQ ID NO: 59) 내의 폴리펩티드 사슬로 도입되고, 이것은 뉴클레오티드 서열 ctgggaggct gcttcaacag gggagagtgt (SEQ ID NO: 60)에 의해 암호화될 수 있다. 특이적 구체예에서, 본 발명의 DART™ 를 포함하는 폴리펩티드 사슬의 C-말단은 아미노산 서열 LGGCFNRGEC (SEQ ID NO: 59)를 포함한다. 다른 구체예에서, 시스테인 잔기는 아미노산 서열 FNRGEC (SEQ ID NO: 61) 내에 폴리펩티드 사슬로 도입되고, 이것은 뉴클레오티드 서열 ttcaacaggg gagagtgt (SEQ ID NO: 62)에 의해 암호화될 수 있다. 특이적 구체예에서, 본 발명의 DART™ 를 포함하는 폴리펩티드 사슬의 C-말단은 아미노산 서열 FNRGEC (SEQ ID NO: 61)를 포함한다.
특정 구체예에서, 디아바디 분자는 적어도 2개의 폴리펩티드 사슬을 포함하고, 이것들 각각은 아미노산 서열 LGGC (SEQ ID NO: 54)를 포함하고 LGGC (SEQ ID NO: 54) 서열에서 시스테인 잔기 사이의 이황화 결합에 의해 공유 결합된다. 또 다른 특이적 구체예에서, 디아바디 분자는 적어도 2개의 폴리펩티드 사슬을 포함하고, 이것들 중 하나는 서열 FNRGEC (SEQ ID NO: 61)를 포함하지만 다른 것은 겨첩 도메인 (적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는)을 포함하는데, 상기 적어도 2개의 폴리펩티드 사슬은 FNRGEC (SEQ ID NO: 61의 시스테인 잔기 및 경첩 도메인의 시스테인 잔기 사이의 이황화 결합에 의해 공유 결합된다. 특정 양태에서, 시스테인 잔기
경첩 도메인에 위치한 이황화 결합에 대한 원인이 되는 시스테인 잔기는 Cys-128 (Kabat EU에 따라 번호 매겨짐; 변형되지 않는, 온전한 IgG 중쇄의 경첩 도메인에 위치함)이고 대응물 시스테인 잔기는 Cys-214 (Kabat EU에 따라 번호 매겨짐; 변형되지 않는, 온전한 IgG 경쇄의 C-말단에 위치함)이다 (Elkabetz et al. (2005) "Cysteines In CHI Underlie Retention Of Unassembled Ig Heavy Chains " J. Biol. Chem. 280: 14402-14412). 다른 구체예에서, 적어도 하나의 시스테인 잔기는 아미노산 사슬의 N-말단에서 발생하도록 조작된다. 다른 구체예에서, 적어도 하나의 시스테인 잔기는 디아바디 분자의 폴리펩티드 사슬의 연결자 부분에서 발생하도록 조작된다. 추가적인 구체예에서, VH 또는 VL 도메인은 상기 아미노산 변형이 모체 아미노산의 시스테인으로 치환을 포함하는 모체의 VH 또는 VL 도메인에 비해 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하도록 조작된다.
이 구체예의 또 다른 양태에서, 사람 IgG의 경첩 도메인으로부터 유래한, 1차 폴리펩티드 사슬의 도메인 (C)은 아미노산 서열 VEPKSC (SEQ ID NO: 57)를 포함하고, 이것은 뉴클레오티드 서열 gttgagccca aatcttgt (SEQ ID NO: 58)에 의해 암호화될 수 있다. 이 구체예의 또 다른 양태에서, 2차 폴리펩티드 사슬의 도메인은 아미노산 서열 VEPKSC (SEQ ID NO: 57)를 포함한다. 이 구체예의 특정 양태에서, 1차 폴리펩티드 사슬의 도메인 (C)은 사람 카파 경쇄 FNRGEC (SEQ ID NO: 61)의 C-말단 6개의 아미노산을 포함하고; 2차 폴리펩티드 사슬의 도메인 (F)는 아미노산 서열 VEPKSC (SEQ ID NO: 57) 또는 경첩 도메인을 포함한다. 이 발명의 다른 양태에서, 2차 폴리펩티드 사슬의 도메인 (F)은 사람 카파 경쇄, FNRGEC (SEQ ID NO: 61)의 C-말단 6개의 아미노산을 포함하고; 1차 폴리펩티드의 도메인 (C)은 아미노산 서열 VEPKSC (SEQ ID NO: 57) 또는 경첩 도메인을 포함한다.
상기의 관점에서 인정되는 바와 같이, 이중 특이적 DART™ 의 개개의 폴리펩티드는 2 종의 호모다이머 및 1 종의 헤테로다이머를 형성할 수 있다. 본 발명의 한 구체예에서, 전하를 띈 폴리펩티드는 하나 이상의 바람직하게, DART™ 폴리펩티드 둘 다의 C-말단에 추가될 수 있다. 이중 특이적 DART™ 의 개개의 폴리펩티드에 대한 반대 전하를 띈 폴리펩티드를 선택함으로써, 이러한 전하를 띈 폴리펩티드에 포함된 것은 헤테로다이머의 형성을 선호하고 호모다이머의 형성이 줄어든다. 바람직하게, 양전하를 띈 폴리펩티드는 많은 아르기닌, 글루타민, 히스티딘 및/또는 리신 (또는 이러한 아미노산의 혼합물)의 함량을 함유할 것이고 음전하를 띈 폴리펩티드는 많은 아스파르트산염 또는 글루타메이트 (또는 이러한 아미노산의 혼합물)의 함량을 함유할 것이다. 많은 리신 함량을 함유하는 양전하를 띈 폴리펩티드 및 많은 아스파르트산염 또는 글루타메이트 함량을 함유하는 음전하를 띈 폴리펩티드가 특히 바람직하다. 이러한 대항하여 전하를 띈 폴리펩티드 사이의 정전기 인력을 최대화하기 위해, 자연스럽게 가령 나선형 구조로 가정할 수 있는 폴리펩티드를 활용하는 것이 바람직하다.
따라서, 바람직한 구체예에서, 양전하를 띈, "E-코일"은 이중 특이적 DART™ 를 형성하기 위해 사용된 폴리펩티드 중 하나에 첨부될 것이고 음전하를 띈 "K-코일"은 DART™ 의 폴리펩티드의 두 번째에 첨부될 것이다. 특히 바람직한 E-코일은 서열: (EVAALEK)4 [즉 (SEQ ID NO: 63) EVAALEKEVAALEKEVAALEKEVAALEK]를 가질 것이다. 특히 바람직한 K-코일은 서열: (KVAALKE)4 [즉, (SEQ ID NO: 64) KVAALKEKVAALKEKVAALKEKVAALKE]를 가질 것이다.
VL이 DART™ 의 가변 가벼운 Ig 도메인이고, GGGSGGGG는 SEQ ID NO: 52이고, VH는 DART™ 의 가변 무거운 Ig 도메인이고, (EVAALEK)4는 SEQ ID NO: 63이고, GGGNS는 SEQ ID NO: 65인 경우, 이러한 E-코일을 소유하는 바람직한 DART™ 폴리펩티드는 일반적인 서열: [VL 도메인]-[GGGSGGGG]-[VH 도메인]-[(EVAALEK)4]-GGGNS를 가질 것이다. VL이 DART™ 의 가변 가벼운 Ig 도메인이고, GGGSGGGG는 SEQ ID NO: 52이고, VH는 DART™ 의 가변 무거운 Ig 도메인이고, (KVAALEK)4는 SEQ ID NO: 64이고, GGGNS는 SEQ ID NO: 65인 경우, 이러한 K-코일을 소유하는 바람직한 DART™ 폴리펩티드는 일반적인 서열: [VL 도메인]-[GGGSGGGG]-[VH 도메인]-[(KVAALKE)4]-GGGNS를 가질 것이다.
추가적인 구체예에서, Fc-영역은 E-코일 또는 K-코일 DART™ 의 E 및/또는 K 코일과 연결될 수도 있다. Fc-함유 DART™ 의 Fc 도메인 및 DART™ VH 도메인 사이의 분리를 발전시키는 것은 이러한 도메인의 덜 분리된 정리가 이러한 도메인 및 그들의 결합 리간드사이의 감소된 상호작용으로 이어지거나 그렇지 않으면 DART™ 조립체를 방해하는 경우에 바람직하다. 어느 아미노산 서열의 분리기도 활용될 수 있지만, 최대한 Fc 도메인을 확장하고 가변 도메인으로부터 떨어진 Fc 도메인을 예측하기 위해, 나선형 코일을 형성하는 분리기를 활용하는 것이 바람직하다. 상기-설명된 반대 전하를 띈 꼬인 폴리펩티드 추가적으로 헤테로다이머 형성을 촉진시키고, 이러한 분자는 특히 바람직한 분리기이다. 이러한 코일-함유 Fc-DART™ 분자는 향상된 혈청 반감기 및 작용 기능 모집을 포함하는, Fc-DART™ 의 그것과 유사한 이익을 제공한다. 상기-설명된 E-코일 및 K-코일 폴리펩티드는 이러한 목적을 위해 특히 바람직하다. 따라서, 바람직한 구체예에서, VL은 DART™ 의 가변 가벼운 Ig 도메인이고, GGGSGGGG는 SEQ ID NO: 52이고, VH는 DART™ 의 가변 무거운 Ig 도메인이고 (EVAALEK)4는 SEQ ID NO: 63인 경우, E-코일 Fc 함유 DART™ 는 D234 (Kabat 번호 매기기)로 시작하는 일반적인 서열: [VL 도메인]-[GGGSGGGG]-[VH 도메인]-[(EVAALEK)4]-GGG-Fc 도메인을 가질 것이다. 유사하게, 바람직한 구체예에서, VL은 DART™ 의 가변 가벼운 Ig 도메인이고, GGGSGGGG는 SEQ ID NO: 51이고, VH는 DART™ 의 가변 무거운 Ig 도메인이고 (KVAALEK)4는 SEQ ID NO: 64인 경우, E-코일 Fc 함유 DART™ 는 D234 (Kabat 번호 매기기)로 시작하는 일반적인 서열: [VL 도메인]-[GGGSGGGG]-[VH 도메인]-[(KVAALEK)4]-GGG-Fc 도메인을 가질 것이다.
상기 지시된 바와 같이, 코일-함유 DART™ 분자 또는 코일-함유 Fc-함유 DART™ 분자는 단지 이러한 단일 코일 분리기만을 함유할 수도 있고, 또는 그것은 하나 이상의 이러한 분리기를 함유할 수도 있다 (예를 들어, DART™ 의 폴리펩티드의 각각의 VH 도메인과의 결합된, 바람직하게 반대 전하를 띈, 2개의 분리기). Fc 영역과 이러한 분리기 분자 (들)을 결합함으로써, 사슬 교환으로 인한 Fc-DART™ 의 2가, 4가, 등의 버전을 만드는 능력이 향상된다. 따라서 Fc 도메인이 DART™ VH 도메인 중 하나 또는 둘 다와의 결합하는지에 의존적으로 모노머 또는 다이머를 형성하는 Fc-DART™ 분자가 생산될 수도 있다.
1. B7-H3 DART™ 분자의 다기능성
본 발명의 이중 특이적 DART™ 는 동시에 2개의 분리된 및 별개의 에피토프와의 결합할 수 있다. 특정 구체예에서 에피토프는 같은 항원으로부터 온다. 다른 구체예에서, 에피토프는 다른 항원으로부터 온다. 바람직한 구체예에서, 적어도 하나의 에피토프 결합 부위는 T 림프 세포, 자연 킬러 (NK) 세포 또는 다른 단핵 세포에서 발현되는 면역 작용 세포에서 발현되는 결정 인자 (예를 들어, CD3, CD16, CD32, CD64, T- 세포 수용체, 등)에 대해 특이적이다. 한 구체예에서, DART™ 분자는 작용 세포 결정 인자와의 결합하고 또한 상기 작용 세포를 활성화시킨다. 이 점에서, 본 발명의 DART™ 분자는 그들이 Fc 도메인 (예를 들어, 업계에 알려진 어느 작용 기능 검정에서도 검정되거나 여기에 예시된 (예를 들어, ADCC 검정) 바와 같이)을 더 포함하는지에 독립적인 Ig-유사 기능성을 나타낼 수도 있다. 특정 구체예에서, 본 발명의 이중 특이적 DART™ 는 종양 세포의 암 항원 및 상기 세포를 활성화하는 동안 작용 세포 결정 인자 둘 다와의 결합한다. 대안의 구체예에서, 상기 설명된 바와 같이 (배경 기술 섹션 참조) 이중 특이적 DART™ 또는 본 발명의 DART™ 분자는 동시에 같은 세포의 활성화 수용체 및 억제 수용체를 결합하고, 따라서 연결함으로써 (예를 들어, CD32A 및 CD32B 둘 다, BCR 및 CD32B 둘 다, 또는 IgERI 및 CD32B 둘 다) 표적, 예를 들어, 효과기, 작용 세포의 활성을 억제할 수도 있다. 이 구체예의 추가적인 양태에서, 이중 특이적 DART™ 는 바이러스의 2개의 중화 에피토프 (예를 들어, RSV 에피토프; E16 및 E53과 같은 WNV 에피토프)와 동시에 결합에 의한 항-바이러스성 성질을 나타낸다.
2. 일반적인 B7-H3 DART™ 분자
한 구체예에서, 본 발명의 이중 특이적 DART™ 분자는 B7-H3와 특이적으로 결합하는 한 에피토프 결합 도메인 및 헵텐, 예를 들어, 플루오레세인 이소티오시안산염 (플루오로이소티오시안산염 또는 FITC로 또한 알려짐)과 특이적으로 결합하는 두 번째 에피토프 결합 도메인을 포함하도록 구성될 수도 있다. 이러한 DART™ 는 B7-H3을 플루오레세인-접합된 결합 파트너와 상호작용하는 분자와 동시-결찰할 수 있는, 일반적인 어댑터 ("UDART™ ")로서 제공된다. 예를 들어, DART™ 의 FITC-반응성 팔은 세포 내 뭉침, 세포 내 모집, 세포 없는 모집, 다양한 표적, 등에 수반되는 비-B7-H3 표적과의 결합된 FITC 표지된 항체와의 결합하는데 사용될 수도 있다. 항-플루오레세인 Mab, 4420의 키메라 마우스 Fv/사람 Fc 버전은 FITC-특이적 CDR 도메인의 공급원으로서 활용될 수도 있다 (Gruber, M. et al. (1994) "Efficient Tumor Cell Lysis Mediated By A Bispecific Single Chain Antibody Expressed In Escherichia coli, " J. Immunol. 152(11): 5368-5374).
3. 세포-표적 특이적 B7-H3 DART™ 분자
본 발명의 이중 특이적 DART™ 분자는 특이적 세포 타입을 표적화하는 독특한 기회를 제안한다. 예를 들어, 이중 특이적 DART™ 또는 DART™ 분자는 표적 세포 또는 조직 타입에 대해 독특한 항원의 세트를 인식하는 에피토프 결합 부위의 조합을 포함하도록 조작될 수 있다. 추가적으로, 개개의 항원 중 하나 또는 둘 다는 다른 조직 및/또는 세포 타입에서와 별개로 아주 일반적이고, 낮은 친화도 결합 도메인은 DART™ 또는 DART™ 분자를 구성하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 낮은 친화도 결합 도메인은 개개의 에피토프 또는 항원과 치료적 목적을 위한 충분한 결합력으로 결합할 수 없을 것이다. 하지만, 에피토프 또는 항원 둘 다가 단일 표적 세포 또는 조직에 존재하는 경우, 단지 하나의 항원만을 발현하는 세포 또는 조직에 비해 본 발명에 의해 상기 세포 또는 조직이 효과적으로 표적화될 수 있는, 세포 또는 조직에 대한 DART™ 또는 DART™ 분자의 결합력이 증가할 것이다. 이러한 이중 특이적 분자는 단일 특이적 DART™ 또는 단지 하나의 항원에 특이성을 갖는 항체에 비해 상기 항원 둘 다를 발현하는 세포에서 그것의 표적 항원의 하나 또는 둘 다와 향상된 결합을 나타낼 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 B7-H3 특이적 DART™ 는 자연 킬러 그룹 2D (NKG2D) 수용체에 대한 결합 리간드인 도메인을 포함하도록 구성될 수 있다. NKG2D 수용체는 모든 사람 (및 다른 포유동물) 자연 킬러 세포에서 발현된다 (Bauer, S. et al. (1999) "Activation OfNK Cells and T Cells By NKG2D, A Receptor For Stress-Inducible MICA, " Science 285(5428): 727-729; Jamieson, A.M. et al. (2002) "The Role Of The NKG2D Immunoreceptor In Immune Cell Activation and Natural Killing, " Immunity 17(1): 19-29) as well as on all CD8+ T cells (Groh, V. et al. (2001) "Costimulation Of CD8afi T Cells By NKG2D Via Engagement By MIC Induced On Virus-Infected Cells " Nat. Immunol. 2(3): 255-260; Jamieson, A.M. et al. (2002) "The Role Of The NKG2D Immunoreceptor In Immune Cell Activation and Natural Killing, " Immunity 17(1): 19-29). 이러한 결합 리간드, 및 특히 정상 세포에서 발현되지 않는 것들은 조직적합성 60 (H60) 분자, 레티노산 초기 유발 가능 유전자-1 (RAE-1)의 생성물, 및 쥐 UL16-결합 단백질유사 전사 1 (MULT1)을 포함한다 (Raulet D.H. (2003) "Roles Of The NKG2D Immunoreceptor and Its Ligands, " Nature Rev. Immunol. 3: 781-790; Coudert, J.D. et al. (2005) "Altered NKG2D Function In NK Cells Induced By Chronic Exposure To Altered NKG2D Ligand-Expressing Tumor Cells, " Blood 106: 1711-1717). NKG2D에 반응성인 추가적인 리간드는 다형성 MHC 클래스 I 사슬-관련된 분자 MICA 및 MICB를 포함한다 (Diefenbach, A. et al. (1999) "Natural Killer Cells: Stress Out, Turn On, Tune In, " Curr. Biol. 9(22): R851-R8533; Bauer, S. et al. (1999) "Activation Of NK Cells and T Cells By NKG2D, A Receptor For Stress-Inducible MICA, " Science 285(5428): 727-729; Stephens, H.A. (2001) "MICA And MICB Genes: Can The Enigma Of Their Polymorphism Be Resolved?" Trends Immunol. 22: 378- 385). MICA의 서열은 SEQ ID NO: 66 이다:
MGLGPVFLLL AGIFPFAPPG AAAEPHSLRY NLTVLSWDGS VQSGFLTEVH
LDGQPFLRCD RQKCRAKPQG QWAEDVLGNK TWDRETRDLT GNGKDLRMTL
AHIKDQKEGL HSLQEIRVCE IHEDNSTRSS QHFYYDGELF LSQNLETKEW
TMPQSSRAQT LAMNVRNFLK EDAMKTKTHY HAMHADCLQE LRRYLKSGVV
LRRTVPPMVN VTRSEASEGN ITVTCRASGF YPWNITLSWR QDGVSLSHDT
QQWGDVLPDG NGTYQTWVAT RICQGEEQRF TCYMEHSGNH STHPVPSGKV
LVLQSHWQTF HVSAVAAAAI FVIIIFYVRC CKKKTSAAEG PELVSLQVLD
QHPVGTSDHR DATQLGFQPL MSDLGSTGST EGA
MICB의 서열은 SEQ ID NO: 67이다:
PHSLRYNLMV LSQDGSVQSG FLAEGHLDGQ PFLRYDRQKR RAKPQGQWAE
DVLGAKTWDT ETEDLTENGQ DLRRTLTHIK DQKGGLHSLQ EIRVCEIHED
SSTRGSRHFY YDGELFLSQN LETQESTVPQ SSRAQTLAMN VTNFWKEDAM
KTKTHYRAMQ ADCLQKLQLP PMVNVICSEV SEGNITVTCR ASSFYPRNIT
LTWRQDGVSL SHNTQQWGDV LPDGNGTYQT WVATRIRQGE EQRFTCYMEH
SGNHGTHPVP SGKALVLQSQ RTDFPYVSAA MPCFVIIIIL CVPCCKKKTS
AAEGP
대안으로, 본 발명의 DART™ 분자는 T- 세포 수용체 ("TCR") 또는 CD3 (T- 세포 동시-수용체)에 대한 결합 리간드인 도메인을 포함하도록 구성될 수도 있다. TCR은 선천적으로 CD4+ 또는 CD8+ T- 세포에 의해 발현되고, 이러한 세포들이 항원-제시 세포의 클래스 I 또는 클래스 II MHC 단백질에 의해 결합되고 제공되는 항원성 펩티드를 인식하는 것을 허용한다. TCR에 의한 pMHC (펩티드-MHC) 복합체의 인식은 시토킨의 생산 및 항원-제시 세포의 용해로 이끄는 세포의 면역 반응의 증식을 개시한다 (예를 들어, Armstrong, K.M. et al. (2008) "Conformational Changes and Flexibility In T-Cell Receptor Recognition Of Peptide-MHC Complexes, " Biochem. J. 415(Pt 2): 183-196; Willemsen, R. (2008) "Selection Of Human Antibody Fragments Directed Against Tumor T-Cell Epitopes For Adoptive T-Cell Therapy, " Cytometry A. 73(11): 1093-1099; Beier, K.C. et al. (2007) "Master Switches Of T-Cell Activation and Differentiation, " Eur. Respir. J. 29: 804-812; Mallone, R. et al. (2005) "Targeting T Lymphocytes For Immune Monitoring and Intervention In Autoimmune Diabetes, " Am. J. Ther. 12(6): 534-550 참조). CD3은 TCR과의 결합하는 수용체이다 (Thomas, S. et al. (2010) "Molecular Immunology Lessons From Therapeutic T-Cell Receptor Gene Transfer, " Immunology 129(2): 170-177; Guy, C.S. et al. (2009) "Organization Of Proximal Signal Initiation At The TCR: CD 3 Complex, " Immunol. Rev. 232(1): 7-21; St. Clair, E.W. (Epub 2009 Oct 12) "Novel Targeted Therapies For Autoimmunity, " Curr. Opin. Immunol. 21(6): 648-657; Baeuerle, P.A. et al. (Epub 2009 Jun 9) "Bispecific T-Cell Engaging Antibodies For Cancer Therapy, " Cancer Res. 69(12): 4941-4944; Smith-Garvin, J.E. et al. (2009) "T Cell Activation; " Annu. Rev. Immunol. 27: 591-619; Renders, L. et al. (2003) "Engineered CD3 Antibodies For Immunosuppression " Clin. Exp. Immunol. 133(3): 307-309).
예를 들어, 표적 세포의 표면 상에 존재하는 수용체와의 결합 할 수 있는 적어도 하나의 에피토프-결합 도메인을 포함하도록 이러한 DART™ 분자를 구성함으로써, 이러한 DART™ 분자는 DART™ 분자일 것이고 따라서 표적 세포와의 결합할 수 있고 그로 인해 표적 세포가 자연적 킬러 그룹 2D (NKG2D) 수용체를 위한 또는 TCR에 대한 결합 리간드를 일으킨다 (어느 쪽이든 표적 세포-결합 DART™ 에 존재한다) (예를 들어, Germain, C. et al. (2008) "Redirecting NK Cells Mediated Tumor Cell Lysis By A New Recombinant Bifunctional Protein^ Prot. Engineer. Design Selection 21(11): 665-672 참조). 이러한 DART™ 는 NK 세포 매개된 세포 용해 또는 T- 세포 매개된 시포 독성으로 원하는 표적 세포를 전송하기 위해 사용될 수 있다. 한 구체예에서, 표적 세포의 표면상에 존재하는 수용체와의 결합할 수 있는 DART™ 의 에피토프 결합 도메인은 이러한 암 세포를 NK 세포-매개된 세포 용해 또는 T- 세포 매개된 세포 독성에 대한 기질로 전송하기 위해 종양-연관된 항원과의 결합하는 에피토프이다. 특히 원하는 것은 유방 암 항원, 난소 암 항원, 전립선 암 항원, 자궁 암 항원, 췌장 암 항원, 폐 암 항원, 방광 암 항원, 결장 암 항원, 고환 암 항원, 교모 세포종 항원, B 세포 악성과 연관된 항원, 다양한 골수종과 연관된 항원, 비-호지킨 림프종과 연관된 항원, 또는 만성 림프성 백혈병인 종양-연관된 항원이다.
이러한 사용을 위한 적합한 종양-연관된 항원은 A33 (결장 암종 항원; Almqvist, Y. 2006, Nucl Med Biol. Nov; 33(8): 991-998); B1 (Egloff, A.M. et al. 2006, Cancer Res. 66(l): 6-9); BAGE (Bodey, B. 2002 Expert Opin Biol Ther. 2(6): 577-84); 베타-카테닌 (Prange W. et al. 2003 J Pathol. 201(2): 250-9); CA125 (Bast, R.C. Jr. et al. 2005 Int J Gynecol Cancer 15 Suppl 3: 274-81); CD5 (Calin, G.A. et al. 2006 Semin Oncol. 33(2): 167-73; CD19 (Troussard, X. et al. 1998 Hematol Cell Ther. 40(4): 139-48); CD20 (Thomas, D.A. et al. 2006 Hematol Oncol Clin North Am. 20(5): 1125-36); CD22 (Kreitman, R.J. 2006 AAPS J. 18; 8(3): E532-51); CD23 (Rosati, S. et al. 2005 Curr Top Microbiol Immunol. 5; 294: 91-107); CD25 (Troussard, X. et al. 1998 Hematol Cell Ther. 40(4): 139-48); CD27 (Bataille, R. 2006 Haematologica 91(9): 1234-40); CD28 (Bataille, R. 2006 Haematologica 91(9): 1234-40); CD36 (Ge, Y. 2005 Lab Hematol. l l(l): 31-7); CD40/CD154 (Messmer, D. et al. 2005 Ann N Y Acad Sci. 1062: 51-60); CD45 (Jurcic, J.G. 2005 Curr Oncol Rep. 7(5): 339-46); CD56 (Bataille, R. 2006 Haematologica 91(9): 1234-40); CD79a/CD79b (Troussard, X. et al. 1998 Hematol Cell Ther. 40(4): 139-48; Chu, P.G. et al. 2001 Appl Immunohistochem Mol Morphol. 9(2): 97-106); CD103 (Troussard, X. et al. 1998 Hematol Cell Ther. 40(4): 139-48); CDK4 (Lee, Y.M. et al. 2006 Cell Cycle 5(18): 2110-4); CEA (암배 항원; Mathelin, C. 2006 Gynecol Obstet Fertil. 34(7-8): 638-46; Tellez-Avila, F.I. et al. 2005 Rev Invest Clin. 57(6): 814-9); CTLA4 (Peggs, K.S. et al. 2006 Curr Opin Immunol. 18(2): 206-13); EGF-R (표피 성장 인자 수용체; Adenis, A. et al. 2003 Bull Cancer. 90 Spec No: S228-32); Erb (ErbBl; ErbB3; ErbB4; Zhou, H. et al. 2002 Oncogene 21(57): 8732-40; Rimon, E. et al. 2004 Int J Oncol. 24(5): 1325-38); GAGE (GAGE-1; GAGE-2; Akcakanat, A. et al. 2006 Int J Cancer. 118(1): 123-8); GD2/GD3/GM2 (Livingston, P.O. et al. 2005 Cancer Immunol Immunother. 54(10): 1018-25); gplOO (Lotem, M. et al. 2006 J Immunother. 29(6): 616-27); HER-2/neu (Kumar, Pal S et al. 2006 Semin Oncol. 33(4): 386-91); 사람 파필로마바이러스-E6/사람 파필로마바이러스-E7 (DiMaio, D. et al. 2006 Adv Virus Res. 66: 125-59; KSA (17-1A) (Ragupathi, G. 2005 Cancer Treat Res. 123: 157-80); MAGE (MAGE-1; MAGE-3; (Bodey, B. 2002 Expert Opin Biol Ther. 2(6): 577-84); MART (Kounalakis, N. et al. 2005 Curr Oncol Rep. 7(5): 377-82; MUC-1 (Mathelin, C. 2006 Gynecol Obstet Fertil. 34(7-8): 638-46); MUM-1 (Castelli, C. et al. 2000 J Cell Physiol. 182(3): 323-31); N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 (Dennis, J.W. 1999 Biochim Biophys Acta. 6; 1473(1): 21-34); p15 (Gil, J. et al. 2006 Nat Rev Mol Cell Biol. 7(9): 667-77); PSA (prostate specific antigen; Cracco, CM. et al. 2005 Minerva Urol Nefrol. 57(4): 301-11); PSMA (Ragupathi, G. 2005 Cancer Treat Res. 123: 157-80); sTn (Holmberg, L.A. 2001 Expert Opin Biol Ther. 1(5): 881-91); TNF-수용체 (TNF-α 수용체, TNF-β 수용체; 또는 TNF-γ 수용체; van Horssen, R. et al. 2006 Oncologist. 11(4): 397-408; Gardnerova, M. et al. 2000 Curr Drug Targets. 1(4): 327-64); 또는 VEGF 수용체 (O'Dwyer. P.J. 2006 Oncologist. 11(9): 992-8)를 포함한다.
이러한 사용을 위한 추가적인 종양-연관된 항원 (및 이러한 항원에 대해 특이적으로 반응성인 항체를 개시한 공개)은 ADAM-9 (미국 특허 공개 번호 2006/0172350; PCT 공개 번호 WO 06/084075); ALCAM (PCT 공개 번호 WO 03/093443); 카르복시펩티다제 M (미국 특허 공개 번호 2006/0166291); CD46 (미국 특허 번호 7,148,038; PCT 공개 번호 WO 03/032814); 시토케라틴 8 (PCT 공개 번호 WO 03/024191); 에프린 수용체 (및 특히 EphA2 (미국 특허 번호 7,569,672; PCT 공개 번호 WO 06/084226); 인테그린 알파-V-베타-6 (PCT 공개 번호 WO 03/087340); JAM-3 (PCT 공개 번호 WO 06/084078); KID3 (PCT 공개 번호 WO 05/028498); KID31 (PCT 공개 번호 WO 06/076584); LUCA-2 (미국 특허 공개 번호 2006/0172349; PCT 공개 번호 WO 06/083852); 온코스타틴 M (온코스타틴 수용체 베타) (미국 특허 번호 7,572,896; PCT 공개 번호 WO 06/084092); PIPA (미국 특허 번호 7,405,061; PCT 공개 번호 WO 04/043239); ROR1 (미국 특허 번호 5,843,749); 및 트랜스페린 수용체 (미국 특허 번호 7,572,895; PCT 공개 번호 WO 05/121179)를 포함한다.
또한 원하는 것은 특정 감염원, 예를 들어, 사람 면역결핍 바이러스 (HIV), 간염 B 바이러스 (HBV), 인플루엔자, 사람 파필로마 바이러스 (HPV), 구제역 (foot and mouth; 콕사키바이러스), 광견병 바이러스 (the rabies virus), 단순 헤르페스 바이러스 (herpes simplex virus; HSV), 및 로타바이러스 (rotavirus), 아데노바이러스 (adenovirus), 칼리키바이러스 (calicivirus), 아스트로바이러스 (astrovirus) 및 노로바이러스 (Norwalk virus)를 포함하는, 위장염 (gastroenteritis)의 유발제; 대장균, 살모넬라성 설사 (Salmonella thyphimurium), 녹농균 (Pseudomonas aeruginosa), 콜레라균 (Vibrio cholerae), 임질균 (Neisseria gonorrhoeae), 헬리코박터 파일로리 (Helicobacter pylori), 헤모필루스 인플루엔자 (Hemophilus influenzae), 시겔라 디센테라 (Shigella dysenteriae), 포도상구균 (Staphylococcus aureus), 결핵균 (Mycobacterium tuberculosis) 및 폐렴구균 (Streptococcus pneumoniae), 진균제 (fungal agents) 및 원충류 (Giardia)와 같은 기생충을 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 바이러스성 약제에 특이적인 항원이다.
일부 구체예에서, 본 발명의 분자는 주형 분자의 비교 가능한 부분에 비해 변화된 글리코실화 패턴 또는 변화된 글리로폼을 포함하도록 조작된다. 조작된 글리코폼은 작용 기을 향상시키는 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 다양한 목적에 대해 유용할 수도 있다. 조작된 글리코폼은 당업자에 알려진 어느 방법에 의해서도, 예를 들어, 조작된 또는 변이체 발현 균주를 사용함으로써, 하나 이상의 효소, 예를 들어, DI N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III (GnTI11)와 함께 동시 발현에 의해, 다양한 유기체 또는 세포주에서 본 발명의 DART™ 를 발현함으로써, 또는 DART™ 가 발현되고 정제된 후 탄수화물 (들)을 변형함으로써 발생할 수 있다. 조작된 글리코폼을 발생시키는 방법은 업계에 알려져 있고 Umana et al. (1999) "Engineered Glycoforms Of An Antineuroblastoma IgGl With Optimized Antibody-Dependent Cellular Cytotoxic Activity, " Nat. Biotechnol 17: 176-180; Davies et al. (2001) "Expression Of GnTIII In A Recombinant Anti-CD20 CHO Production Cell Line: Expression Of Antibodies With Altered Glycoforms Leads To An Increase In Adcc Through Higher Affinity For Fc Gamma RIII, " Biotechnol Bioeng 74: 288-294; Shields et al. (2002) "Lack Of Fucose On Human IgGl N-Linked Oligosaccharide Improves Binding To Human Fcgamma RIII and Antibody-Dependent Cellular Toxicity, "J Biol Chem 277: 26733-26740; Shinkawa et al. (2003) "The Absence Of Fucose But Not The Presence Of Galactose Or Bisecting N-Acetylglucosamine Of Human IgGl Complex-Type Oligosaccharides Shows The Critical Role Of Enhancing Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity, " J Biol Chem 278: 3466-3473); US 6, 602, 684; USSN 10/277, 370; USSN 10/113, 929; PCT WO 00/61739A1; PCT WO 01/292246A1; PCT WO 02/311140A1; PCT WO 02/30954A1; Potillegent™ 기술 (Biowa, Inc. Princeton, NJ); GlycoMAb™ 글리코실화 조작 기술 (GLYCART biotechnology AG, Zurich, Switzerland)에 설명된 것들을 포함하지만, 이에 제한되지 않고, 이것들 각각은 그것의 전문이 본원에 참고로 포함된다. 예를 들어, WO 00061739; EA01229125; US 20030115614; Okazaki et al. (2004) "Fucose Depletion From Human IgGl Oligosaccharide Enhances Binding Enthalpy and Association Rate Between IgGl and FcGammaRIIIA, " JMB, 336: 1239-49를 참조하고, 이것들 각각은 그것의 전문이 본원에 참고로 포함된다.
본 발명은 본 발명의 DART™ 을 발생시키는 비자연적인 아미노산의 결합을 더 포함한다. 비자연적인 아미노산을 단백질로 합성을 허용하는 자연적인 생합성수단을 사용하는 것과 같은 이러한 방법은 당업자에 알려져 있는데, 예를 들어, Wang et al. (2002) "Expanding The Genetic Code, " Chem. Comm. 1: 1-11; Wang et al. (2001) "Expanding The Genetic Code Of Escherichia coli, " Science, 292: 498-500; van Hest et al. (2001) "Protein-Based Materials, Toward A New Level Of Structural Control, " Chem. Comm. 19: 1897-1904를 참조하고, 이것들 각각은 전문이 본원에 참고로 포함된다. 대안의 계획은 아미노 아실-tRNA의 생합성의 원인이 되는 효소에 초점을 맞추는데, 예를 들어, Tang et al. (2001) "Biosynthesis Of A Highly Stable Coiled-Coil Protein Containing Hexafluoroleucin In An Engineered Bacterial Host, "J. Am. Chem. Soc. 123(44): 11089-11090; Kiick et al. (2001) "Identification Of An Expanded Set Of Translationally Active Methionine Analogues In Escherichia coli, " FEBS Lett. 502(l-2): 25-30을 참조하고, 이것들 각각은 전문이 본원에 참고로 포함된다. 일부 구체예에서, 본 발명은 글리코실화 부위를 추가하거나 삭제함으로써 본 발명의 분자의 VL, VH 또는 Fc 도메인을 변형시키는 방법을 포함한다. 단백질의 탄수화물을 변형시키는 방법은 업계에 알려져 있고 본 발명 내에 포함되고, 예를 들어, 미국 특허 번호 6,218,149; EP 0 359 096 Bl; 미국 공개 번호 US 2002/0028486; WO 03/035835; 미국 공개 번호 2003/0115614; 미국 특허 번호 6,218,149; 미국 특허 번호 6,472,511을 참조하고, 이것들 모두가 전문이 본원에 참조로 포함된다.
VIII. 치료적 목적을 위해 B7-H3 조절기 및 항-B7-H3 항체를 사용하는 방법
B7-H3에 대한 단클론성 항체는 개개의 암 또는 다른 질환의 치료적 목적을 위해 사용될 수도 있다. 항-B7-H3 항체로 치료는 상기 설명된 바와 같이 시험관 내 및 생체 내 둘 다에서 복합체의 형성을 수반할 수 있다. 한 구체예에서, 단클론성 항체 항-B7-H3는 암 세포와의 결합하고 암 세포의 증식을 감소시킬 수 있다. 항체는 생리학적 (예를 들어, 생체 내) 조건에서 결합을 촉진시키는 농도로 투여된다고 생각된다. 또 다른 구체예에서, B7-H3에 대한 단클론성 항체는 결장, 폐, 유방, 전립선, 난소, 췌장, 신장 또는 육종과 같은 다른 타입의 암과 같은 다른 조직의 암 세포에 대한 면역 치료를 위해 사용될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 단클론성 항체 항-B7-H3는 암 세포에 결합할 수 있고, 전이의 발전을 지연시킨다. 또 다른 구체예에서, 암에 걸린 개개는 항-B7-H3로 일시적인 치료가 주어진다. 암에 걸린 개개의 일시적인 치료는 질환의 해로운 증상, 또는 암 진행에 직접적으로 영향을 미치지 않는 질환에 대해 제공된 다른 치료로부터 일어난 의원성 증상을 치료하거나 완화시키는 것을 수반한다. 이것은 고통의 완화, 영양상의 지원, 성적인 문제, 심리적인 고통, 우울증, 피로, 정신 의학적 장애, 욕지기, 구토, 등에 대한 치료를 포함한다.
이러한 상황에서, 항-B7-H3 항체는 ADCC를 강화하는 약제와 같은, 개개 자신의 면역 반응을 향상시키거나 이로 향하는 약제와 함께 투여될 수도 있다.
또 다른 구체예에서, 항-B7-H3 항체는 방사성 분자, 독소 (예를 들어, 칼리키아마이신), 화학치료 분자, 리포솜 또는 화학치료 화합물을 함유하고 항체에 의해 인식되는 항원을 함유하는 암 세포에 이 화합물을 표적화하는 치료가 필요한 개인에게 투여되고 따라서 암 또는 질환 세포를 제거하는 다른 소낭과 접합되거나 연관된다. 어느 특정 이론에 제한되지 않고, 항-B7-H3 항체는 표면에 B7-H3를 낳는 세포에 의해 내면화되고, 따라서 치료적 효과를 유발하기 위해 접합된 모이어티를 세포로 전달한다. 또 다른 구체예에서, 항체는 전이의 발달을 지연시키기 위해 항원을 발현하는 암의 제거 수술 시 보조 치료로서 활용될 수 있다. 항체는 또한 수술 전 (수술 전 치료 요법) 종양의 크기를 감소시키기 위해 항원을 발현하는 종양에 걸린 개개에 투여될 수 있고 따라서 수술이 가능하거나 간단하게 하거나, 수술 중 조직을 아끼고, 및/또는 결과로 얻어지는 미관 손상을 감소시키기 위해 투여될 수 있다.
세포 주기 투여는 본 발명의 실행에 고려된다. 이러한 구체예에서, 화학치료제는 선결 단계에서 종양 또는 다른 표적 질환 세포의 세포 주기를 동기화하기 위해 사용된다. 다음에, 본 발명의 항-B7-H3 항체 (단독으로 또는 추가적인 치료적 모이어티와 함께)가 만들어진다. 대안의 구체예에서, 항-B7-H3 항체는 세포 주기를 동기화하고 2차 치료의 투여 전 세포 분열을 감소시키기 위해 사용된다; 2차 치료는 항-B7-H3 항체 및/또는 추가적인 치료적 모이어티의 투여일 수도 있다.
화학치료제는 방사성 분자, 독소를 포함하고, 또한 세포 독소 또는 세포 독성제로서 나타나는데, 이것은 암 세포, 약제, 및 리포솜 또는 화학치료적 화합물을 함유한 다른 소낭의 생존에 해로운 약제를 포함한다. 적합한 화학치료제의 예는 1-디히드로테스토스테론, 5-플루오로우라실 데카르바진, 6-메르캅토퓨린, 6-티오구아닌, 액티도마이신 D, 아드리아마이신, 알데스루킨, 알킬화제, 알로퓨리놀 나트륨, 알트레타민, 아미포스틴, 아나스트로졸, 안트라마이신 (SMC), 항유사분열제, 씨스-디클로디아민 플라티늄 (II) (DDP) 시스플라틴, 디아미노디클로로플라티늄, 안트라시클린, 항생제, 항대사물질, 아스파라기나제, 생 BCG (방광 내), 베타메타손 나트륨 인산염 및 베타메타손 아세트산염, 비칼루타미드, 블레오마이신 황산염, 부설판, 칼슘 루코우오린, 칼리키아마이신, 카페시타빈, 카르보플라틴, 로무스틴 (CCNU), 카르무스틴 (BSNU), 클로로람부실, 시스플라틴, 클라드리빈, 콜히친, 접합된 에스트로겐, 시클로포스파미드, 시클로토스파미드, 시타라빈, 시타라빈, 시토칼라신 B, 시톡산, 다카르바진, 닥티노마이신, 닥티노마이신 (예전에 액티노마이신), 다우니루비신 HCL, 다우노루비신 시트르산염, 데닐루킨 디프티톡스, 덱사라족산, 디브로모만니톨, 디히드록시안트라신디온, 도세탁셀, 돌라세트론메실화, 독소루비신 HCL, 드로나비놀, 대장균 L-아스파라기나제, 에메틴, 에포에틴 알파, 에르비니아 L-아스파라기나제, 에스테르화제된 에스트로겐, 에스트라디올, 에스트라무스틴, 인산염 나트륨, 에티듐 브로미드, 에티닐 에스트라디올, 에티드로네이트, 에토포시드 시트로로륨 인자, 에토포시드 인산염, 필그라스팀, 플록수리딘, 플루코나졸, 플루다라빈 인산염, 플루오로우라실, 플루타미드, 폴린산, 젬시타빈 HCL, 글루코코르티코이드, 고세렐린 아세트산염, 그라미시딘 D, 그라니세트론 HCL, 히드록시유레아, 이다루비신 HCL, 이포스파미드, 인터페론 알파-2b, 이리노테칸 HCL, 레트로졸, 루코보린 칼슘, 루프롤리드 아세테이트, 레바미솔 HCL, 리도카인, 로무스틴, 마이탄시노이드, 메클로레타민 HCL, 메드록시프로게스테론 아세테이트, 메게스트롤 아세테이트, 멜팔란 HCL, 메르캅티퓨린, 메스나, 메토트렉세이트, 메틸테스토스테론, 미트라마이신, 미토마이신 C, 미토탄, 미톡산트론, 닐루타미드, 옥트레오티드 아세트산염, 온단세트론 HCL, 파클리탁셀, 파미드로네이트 이나트륨, 골흡수 억제제 (파미드로네이트 이나트륨), 펜토스타틴, 필로카르핀 HCL, 플리마이신, 포흐페프로산 20 (카르무스틴 임플란트와 함께), 포르피머 나트륨, 프로카인, 프로카르바진 HCL, 프로프란놀롤, 리툭시맙, 사르그라모스팀, 스트렙토조토신, 타목시펜, 탁솔, 테니포시드, 테노포시드, 테스톨락톤, 테트라카인, 티오에파 클로람부실, 티오구아닌, 티오테파, 토포테칸 HCL, 토레미펜 시트르산염, 트레테노인, 발루비신, 빈블라스틴 황산염, 빈크리스틴 황산염, 및 비노렐빈 타르트레이트를 포함한다.
바람직한 구체예에서, 미분열 세포가 독소 효과로부터 비교적 남은, 세포 독소는 분열 중이거나 빠르게 분열하는 세포에서 특히 효과적이다.
본 발명의 항체는 그들이 결합하는 질환 또는 암종 세포 내에 내면화될 수 있고 그러므로 특히 치료적 적용, 예를 들어, 불리한 활성에 대해 내면화될 필요가 있는 세포 독성을 전달하는 것을 위해 유용하다. 이러한 독소의 예는 사포린, 칼리키아마이신, 아우리스타틴, 및 마이탄시노이드를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 항체 또는 폴리펩티드는 방사성 분자, 독소, 또는 다른 치료제, 또는 리포솜 또는 공유 결합으로 또는 비-공유 결합으로, 직접적으로 또는 간접적으로 치료제를 함유하는 다른 소낭과의 결합할 수 있다 (접합되거나 연결되는 것을 포함). 항체는 그것의 표적인 B7-H3와의 결합할 수 있는 동안 항체의 어느 위치에서도 방사성 분자, 독소, 또는 화학치료적 분자와 연결될 수도 있다.
독소 또는 화학치료제는 직접적으로 또는 간접적으로 (예를 들어, 링커를 통해, 또는 대안으로, 미국 특허 번호 5,552,391에 설명된 바와 같은 플랫폼 분자와 같은, 적절한 부착 부위의 분자의 연결을 통해) 적합한 단클론성 항체와 동시에 (투여 전, 후, 또는 도중), 또는 커플링되어 (예를 들어, 공유 결합) 투여될 수도 있다. 본 발명의 독소 및 화학치료제는 업계에 알려진 방법을 사용하여 특정 표적화 단백질과 직접적으로 커플링될 수 있다. 예를 들어, 약제 및 항체의 직접적인 반응은 각각이 다른 것과 반응할 수 있는 치환을 소유할 때 가능하다. 예를 들어, 하나에서 아미노기 또는 메르캅토기와 같은, 친핵기는 다른 것에서 무수물 또는 산 할로겐화물, 또는 좋은 이탈기 (예를 들어, 할로젠화물)를 함유하는 알킬기와 같은, 카르보닐-함유 기와 반응할 수도 있다.
항체 또는 폴리펩티드는 또한 미크로담체 (microcarrier)를 통해 화학치료제와 연결될 수 있다. 용어 "미크로담체"는 물에 불용성이고 크기가 약 150 μm, 120 μm, 100 μm 미만, 더 일반적으로 약 50 - 60 μm 미만, 바람직하게 약 10, 5, 2.5, 2 또는 1.5 μm 미만의 크기를 갖는 생분해 가능하거나 생분해 가능하지 않은 입자를 나타낸다. 미크로담체는 "나노담체"를 포함하는데, 이것은 약 1 μm 미만, 바람직하게 약 500 nm 미만의 크기를 갖는 미크로담체이다. 이러한 입자는 업계에 알려져 있다. 고체상 미크로담체는 생체에 적합한 자연적으로 발생한 폴리머, 합성 폴리머 또는 합성 코폴리머로부터 형성될 수도 있는데, 이것은 아가로스 또는 교차결합된 아가로스, 뿐만 아니라 업계에 알려진 다른 생분해 가능한 물질로부터 형성된 미크로담체를 포함하거나 제외할 수도 있다. 생분해 가능한 고체상 미크로담체는 포유 동물의 생리학적 조건 하에 분해 가능한 (예를 들어, 폴리(젖산), 폴리(글리콜산) 및 이들의 코폴리머) 또는 침식 가능한 (예를 들어, 3, 9-디에틸리덴-2, 4, 8, 10-테트라옥사스피로[5.5]운데칸 (DETOSU)과 같은 폴리(오르토에스테르) 또는 세바스산의 폴리(무수물)과 같은, 폴리(무수물))폴리머로부터 형성될 수도 있다. 미크로담체는 또한 항원이 없는 리포솜, ISCOMS (면역-자극 복합체, 이것은 콜레스테롤, 및 인지질, 보조제-활성 사포닌의 안정한 복합체이다) 또는 수중유 또는 유중수 에멀젼에서 발견되는 방울 또는 미셀과 같은, 액체상 (예를 들어, 오일 또는 지질 기초)일 수도 있고 제공된 액체상 미크로담체는 생분해 가능하다. 생분해 가능한 액체상 미크로담체는 전형적으로 스쿠알렌 및 식물성 오일을 포함하는, 생분해 가능한 오일을 포함하는데, 이것의 많은 수는 업계에 알려져 있다. 미크로담체는 전형적으로 모양이 구형이지만, 구형 모양에서 벗어난 미크로담체 또한 수용 가능하다 (예를 들어, 타원체, 막대기 모양, 등). 그들의 불용성 (물에 대한) 때문에, 미크로담체는 물 및 물-기초한 (수성의) 용액들로부터 여과 가능하다.
본 발명의 항체 또는 폴리펩티드 접합체는 독성제 또는 화학치료제와 커플링될 수 있는 기 및 항체와 커플링될 수 있는 기 둘 다를 함유하는 이중기능성 링커를 포함할 수도 있다. 링커는 결합 능력의 방해를 피하기 위해약제로부터 항체의 거리에 격자로서 작용할 수 있다. 링커는 쪼갤 수 있거나 쪼갤 수 없을 수 있다. 링커는 또한 약제 또는 항원 상에 치환의 화학 반응성을 증가시키기 위해 제공될 수 있고, 따라서 커플링 효율을 증가시킨다. 화학 반응성의 증가는 또한 약제, 또는 약제의 작용기의 사용을 가능하게 할 수도 있는데, 이것은 그렇지 않으면 가능하지 않을 것이다. 이중기능적 링커는 업계에 알려진 수단에 의해 항체와 커플링될 수 있다. 예를 들어, N-히드록시숙시니미드 에스테르와 같은, 활성 에스테르 모이어티를 함유하는 링커는 아미드 링커를 통한 항체의 리신 잔기와 커플링에 사용될 수 있다. 또 다른 예에서, 친핵성 아민 또는 히드라진 잔기를 함유하는 링커는 항체 탄수화물 잔기의 당분해 산화에 의해 생산되는 알데히드기와 커플링될 수 있다. 이 직접적인 방법의 커플링에 추가로, 링커는 아미노덱스트란과 같은 중간의 담체의 수단에 의해 항체와 간접적으로 커플링될 수 있다. 이 구체예에서, 변형된 결합은 리신, 탄수화물, 또는 중간의 담체를 통한다. 한 구체예에서, 링커는 단백질에서 유리된 티올 잔기와 선택적으로 커플링되는 부위이다. 단백질 상의 티올기와 선택적으로 커플링에 적합한 모이어티는 업계에 잘 알려져 있다. 예는 이황화 화합물, α-할로카르보닐 화합물 및 α-할로카르복실 화합물, 및 말레이미드를 포함한다. 친핵성 아민 기능은 &#945-할로 카르보닐기 또는 &#945-할로 카르복실기와 같이 같은 분자에 존재할 때, 잠재력은 아민의 분자 내의 알킬화를 통해 발생시키기 위한 고리화를 위해 존재한다. 이 문제를 방지하기 위한 방법은 당업자에 잘 알려져 있는데, 예를 들어, 아릴기 또는 트랜스 알켄과 같은, 입체 화학적으로 싫어하는 원하지 않는 고리화를 만드는 불변 기에 의해 아민기 및 α -할로 기능이 분리되는 분자의 제조에 의한 것이다. 이황화 모이어티를 통한 마이탄시노이드 및 항체의 접합체의 제조를 위해 예를 들어, 미국 특허 번호 6,441,163를 참조한다.
항체-약 접합체의 제조에 사용될 수 있는, 쪼갤 수 있는 링커 중 하나는 수용체 매개된 식균 작용 (endocytosis) 중에 접촉한 엔도솜 및 리소솜과 같은 다른 세포 내 구획의 산성 환경의 이점을 갖는 시스-아코니트산에 기초한 산-불안정한 링커이다. 예를 들어, 다우노루비신과 거대 분자 담체의 접합체의 제조를 위해 Shen, W.C. et al. (1981) ("cis-Aconityl Spacer Between Daunomycin and Macromolecular Carriers: A Model Of pH-Sensitive Linkage Releasing Drug From A Lysosomotropic Conjugate, " Biochem. Biophys. Res. Comtnun. 102: 1048-1054 (1981)); 다우노루비신과 항-흑색종 항체의 접합체의 제조를 위해 Yang et al. (1988) ("Pharmacokinetics and Mechanism Of Action Of A Doxorubicin-Monoclonal Antibody 9.2.27 Conjugate Directed To A Human Melanoma Proteoglycan, " J. Natl. Cane. Inst. 80: 1154-1159); 다우노루비신 및 항-T 세포 항체의 접합체의 제조를 위한 유사한 방식의 산-불안정한 링커의 사용을 위해 Dillman et al. (1988) ("Superiority Of An Acid-Labile Daunorubicin-Monoclonal Antibody Immunoconjugate Compared To Free Drug, " Cancer Res. 48: 6097-6102); 및 펩티드 격자 팔을 통한 다우노루비신과 항체의 연결을 위해 Trouet et al. (1982) "Covalent Linkage Between Daunorubicin and Proteins That Is Stable In Serum and Reversible By Lysosomal Hydrolases, As Required For A Lysosomotropic Drug-Carrier Conjugate: In Vitro and In Vivo Studies, " Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 79: 626-629)를 참조한다.
본 발명의 항체 (또는 폴리펩티드)는 업계에 알려진 어느 방법에 의해서 방사성 분자 또는 독소와 접합 (연결)될 수도 있다. 항체를 방사성 표지하는 방법의 논의를 위해, CANCER THERAPY WITH MONOCLONAL ANTIBODIES, D.M. Goldenberg (Ed.) CRC Press, Boca Raton, 1995를 참조한다. 적합한 독소는 탁산, 마이탄시노이드, 아우리스타틴 (예를 들어, 일메틸 아우리스타틴 (MMAE), 일메틸 아우리스타틴 F (MMAF), 아우리스타틴 E (AE), 등)(미국 특허 번호 5,208,020; 5,416,064; 6,333,410; 6,340,701; 6,372,738; 6,436,931; 6,441,163; 6,596,757; 7,276,497; 7,585,857; 또는 7,851,432에 개시된 것과 같은), 칼리키아미신, 안트라시클린, 예를 들어, 독소루비신), CC-1065 아날로그, 도세탁셀, 카텝신 B 또는 E; 리신, 젤로닌, 슈도모나스 외독소, 디프테리아 독소, 및 RN아제; 티욱세탄 또는 유독성 방사성 동위원소 (90Y, 131I, 177Lu, 186Re, 188Re, 211At, 212Bi, 213Bi, 225Ac, 등과 같은)를 포함한다.
대안으로, 항체는 미국 특허 번호 4,676,980에 개시된 바와 같은 항체 헤테로접합체 (heteroconjugate)를 형성하기 위해 2차 항체와 접합될 수 있다. 교차-연결된 항체의 형성은 특이적 타입의 세포, 예를 들어, B7-H3을 발현하는 암 또는 질환 세포에 대한 면역계를 표적화할 수 있다.
본 발명은 또한 항-B7-H3 항체 또는 화학치료제와 조합으로, 또는 화학치료제와 연결되어 B7-H3와의 결합하는 다른 구체예를 사용하여 암 (전립선, 폐, 또는 신장 암을 포함하지만, 이에 제한되지 않는)에 걸린 개개에서 전이의 발달을 지연시키는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 항체는 비-사람 항-B7-H3 항체의 사람화 또는 키메라 형태이다.
또 다른 구체예에서, 항체는 전이의 발달을 지연시키기 위해 항원을 발현하는 암의 제거 수술 시 보조 치료로서 활용될 수 있다. 항체는 또한 수술 전 (수술 전 치료 요법) 종양의 크기를 감소시키기 위해 항원을 발현하는 종양에 걸린 개개에 투여될 수 있고 따라서 수술이 가능하거나 간단하게 하거나, 수술 중 조직을 아끼고, 및/또는 결과로 얻어지는 미관 손상을 감소시키기 위해 투여될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 여기에 설명된 B7-H3 결합 조성물 중 하나는 B7-H3-발현 암 세포와의 결합할 수 있고 B7-H3을 발현하는 암 세포에 대한 활성 면역 반응을 유발할 수 있다. 일부 경우에서, 활성 면역 반응은 암 세포의 사망을 일으킬 수 있고 (예를 들어, 아폽토시스성 세포사를 포함하는 암 세포와의 결합하는 항체), 또는 암 제포의 성장을 억제할 수 있다 (예를 들어, 세포 주기 진행을 블록). 다른 경우에서, 여기에 설명된 독특한 항체 중 하나는 암 세포와의 결합할 수 있고 세포 독성에 의존적인 항체 (ADCC)는 항-B7-H3와의 결합하는 암 세포를 제거할 수 있다. 따라서, 본 발명은 여기에 설명된 조성물 중 하나를 투여하는 단계를 포함하는 면역반응을 자극하는 방법을 제공한다.
일부 경우에서, 항체 결합은 또한 세포적 및 체액의 면역 반응 둘 다를 활성화할 수 있고 더 자연적 킬러 세포 또는 암 세포를 파괴하는 개개의 면역계를 더 활성화하는 증가된 시토킨의 생산 (예를 들어, IL-2, IFN-감마, IL-12, TNF-알파, TNF-베타, 등)을 모집할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 항-B7-H3 항체는 암 세포와의 결합할 수 있고, 마크로파지 또는 다른 식 세포는 암 세포를 옵소니화 (opsonize)할 수 있다.
다양한 제제의 항-B7-H3 항체 또는 이들의 단편은 투여에 사용될 수도 있다. 일부 구체예에서, 항-B7-H3 항체 똔느 이들의 단편은 투여된 니트 (neat)일 수도 있다. 약학적으로 활성인 약제에 추가하여, 본 발명의 조성물은 업계에 잘 알려지고 약학적으로 효과적인 물질의 투여를 가능하게 하거나 작용의 부위로 전달을 위해 약학적으로 사용될 수 있는 활성인 화합물의 제조를 가능하게 하는, 비교적 비활성인 물질인 첨가제 및 보조물을 포함하는 적합한 약학적으로 수용 가능한 담체를 함유할 수도 있다. 예를 들어, 첨가제는 형식 또는 일관성을 제공할 수 있고, 또는 희석액으로서 작용할 수 있다. 적합한 첨가제는 안정화제, 습윤제, 에멀젼화제, 다양한 삼투압을 위한 염, 캡슐화제, 완충액, 및 피부 침투 향상제를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
비경구 투여를 위한 적합한 제제는 수용성 형태, 예를 들어, 수용성 염의 활성 화합물의 수성 용액을 포함한다. 게다가, 오일 주사 현탁액에 적절한 활성 화합물의 현탁액이 투여될 수도 있다. 적합한 친유성 용매 또는 비히클은 지방유, 예를 들어, 참기름, 또는 합성 지방산 에스테르, 예를 들어, 에틸 올레산염 또는 트리글리세리드를 포함한다. 수성 주사 현탁액은 현탁액의 점도를 증가시키는 물질을 함유하고, 예를 들어, 나트륨 카르복시메틸 셀룰로스, 소르비톨, 및/또는 덱스트란을 포함할 수도 있다. 선택적으로, 현탁액은 안정화제를 함유할 수도 있다. 리포솜은 또한 세포에 전달을 위한 약제의 캡슐화를 위해 사용될 수 있다.
본 발명에 따라 전신의 투여를 위한 약학적 제형은 장 내, 비경구 또는 국부적 투여를 위해 제제될 수도 있다. 참으로, 모든 3가지 타입의 제형은 활성 성분의 전신의 투여를 이루기 위해 동시에 사용될 수도 있다. 비경구 및 경구 약 전달을 위한 첨가제뿐만 아니라 제형은 REMINGTON: THE SCIENCE and PRACTICE OF PHARMACY, 21st Edition, Lippincott Williams & Wilkins Publishing (2005)에 설명된다. 구강 투여를 위한 적합한 제형은 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐, 알약, 코팅된 타블렛, 엘릭시르제, 현탁액, 시럽 또는 흡입제와 같은, 타블렛 및 이들의 제어된 방출 형태를 포함한다. 다른 형태의 투여 (예를 들어, 구강, 점막, 등)가 또한 사용될 수 있지만, 일반적으로, 이 약제들은 주사에 의한 투여 (복강 내, 정맥 내, 피하로, 근육 내, 등)를 위해 제제된다. 따라서, 항-B7-H3 항체는 바람직하게 식염수, 링거액, 덱스트로스 용액, 등과 같은 약학적으로 수용 가능한 비히클과 조합될 수 있다.
특정 투여 방법, 즉, 투여량, 시기 및 반복은 특정 개개의 의학적 역사에 의존적일 것이다. 일반적으로 적어도 약 100 μg/kg 체중, 더 바람직하게 적어도 약 250 μg/kg 체중, 더 바람직하게 적어도 약 750 μg/kg 체중, 더 바람직하게 적어도 약 3 mg/kg 체중, 더 바람직하게 적어도 약 5 mg/kg 체중, 더 바람직하게 약 10 mg/kg 체중의 투여량이 투여된다.
반감기와 같은, 경험에 의한 고려 사항은 일반적으로 투여량의 결정에 기여할 것이다. 사람화된 항체 또는 완벽히 사람 항체와 같은 사람 면역계에 적합한, 항체는 항체의 반감기를 연장하기 위해 및 숙주의 면역계에 의해 항체가 공격당하는 것을 방지하기 위해 사용될 수도 있다. 투여의 빈도는 치료의 코스를 통해 결정되고 조정될 수도 있고, 암 세포의 수를 감소시키는 단계, 암 세포의 감소를 유지하는 단계, 암 세포의 증식을 감소시키는 단계, 또는 전이의 발달을 지연시키는 단계에 기초한다. 대안으로, 항-B7-H3 항체의 지속적인 방출 제형이 적절할 수도 있다. 지속적인 방출을 이루기 위한 다양한 제형 및 장치는 업계에 알려져 있다.
한 구체예에서, 항-B7-H3 항체의 투여량은 하나 이상의 투여 (들)를 받은 개개에서 경험적으로 결정될 수도 있다. 개개는 항-B7-H3 항체의 증가하는 투여량을 받는다. 항-B7-H3 항체의 효능을 평가하기 위해, 특이적 암 질환 상태의 마커가 추적할 수 있다. 이것은 촉진, 또는 시각적 관찰을 통한 종양 크기의 직접적인 측정, x-선 또는 다른 이미지화 기술에 의한 종양 크기의 간접적인 측정; 직접적인 종양 생검 및 종양 샘플의 현미경 검사에 의해 평가된 바와 같은 향상; 간접적인 종양 마커 (예를 들어, 전립선 암에 대한 PSA)의 측정, 고통 또는 마비의 감소; 향상된 언어 능력, 시야, 호흡 또는 종양과 연관된 다른 장애; 증가된 식욕; 또는 수용된 테스트에 의해 측정된 바와 같은 삶의 질의 증가 또는 생존의 연장을 포함한다. 당업자에게 투여량이 개개, 암의 타입, 암의 단계, 개개에서 암이 다른 위치로 전이하는 것을 시작하였는지, 및 과거 및 현재에 사용된 치료에 의존적으로 달라질 것이라는 것은 명백하다.
다른 제형은 리포솜과 같은 담체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 업계에 알려진 적합한 전달 형태를 포함한다. 예를 들어, Mahato et al. (1997) "Cationic Lipid-Based Gene Delivery Systems: Pharmaceutical Perspectives " Pharm. Res. 14: 853-859를 참조한다. 리포솜의 제조는 세포 감염, 중층라멜라 소낭, 및 단층라멜라 소낭을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 구체예에서, 하나 이상의 항체가 존재할 수도 있다. 항체는 단클론성 또는 다클론성일 수 있다. 이러한 조성물은 암종, 선암, 육종, 또는 선육종에 대해 반응성인 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개의 다른 항체를 함유할 수도 있다. 항-B7-H3 항체는 난소, 유방, 폐, 전립선, 결장, 신장, 피부, 갑상선, 뼈, 상부소화관, 및 췌장을 포함하지만 이에 제한되지 않는 기관에서 암종, 선암, 육종, 또는 선육종에 대해 반응성인 하나 이상의 항체와 혼합될 수 있다. 한 구체예에서, 다른 항-B7-H3 항체의 혼합물이 사용된다. 업계에 종종 나타나는 바와 같이, 항체의 혼합물은 광범위한 개개의 집단에 특히 유용할 수도 있다.
지금 일반적으로 발명을 설명하는 데 있어서, 같은 것은 다음의 예에 대한 참고 문헌을 통해 더 쉽게 이해될 것인데, 이것은 도식의 방법으로 제공되고 명시하지 않는 한 본 발명에 제한되도록 의도되지 않는다.
실시예 1
면역조직적합성 조사
49개의 mAbs의 패널은 종양 세포/태아 간 세포 면역화로부터 발생하였다. 항체를 정상, 비-암 조직에 비해 종양 세포의 차별된 IHC 염색을 나타내는 능력, 항체 효능, 친화도의 레벨 및 항원 특이성, 및 면역 조절기 활성의 영장류 (및 특히 게먹이 원숭이) 모델에서 사용의 능력 및 세포의 내면화에 대해 평가하였다. 21개의 mAbs를 처음에 MS 분석 및/또는 B7-H3-CHO 세포와의 결합에 의해 확인하였다. 남은 28개의 mAbs를 B7-H3 단백질로 ELISA에 의한 라이브러리를 재선별함으로써 확인하였다. 패널의 49개의 멤버 중 46개의 특징은 표2에 제공된다.
Figure pct00005
Figure pct00006
패널이 많은 확인된 항체에서 차별된 종양과 정상 조직의 강한 결합을 이끌어내는 항체를 포함한다는 것이 확인된 IHC 염색은 BIACORE™ 분석에 의해 결합성의 범위를 나타내고, 중복 및 비-중복 에피토프의 범위에 대한 반응성을 나타내고 4Ig 대 2Ig B7-H3에 대한 특이성의 범위를 나타내었다. 9개의 최고의 후보의 특징은 표 3 및 표 4에 나타난다.
Figure pct00007
Figure pct00009
표 5는 이 항체들의 활성 프로파일의 요약을 제공한다.
Figure pct00010
표 6에 나타난 항체의 활성의 분석은 그들 각각의 프로파일이 다르고 각각의 항체는 서로에 비해 장점 및 단점 둘 다와 연관된다는 것을 나타내었다 (표 6)
Figure pct00011
BRCA84D, BRCA68D, BRCA69D 및 PRCA157은 클리너 정상 조직 IHC 프로파일, 더 강한 종양/정상 IHC 차이, 강한 결합의 중간 (BIACORE™ / IHC), 게먹이 원숭이의 B7-H3에 대한 교차-반응, 잠재적인 UDART™ 활성을 나타내고 이 항체 종을 추가적인 발달을 위해 선택하였다. 이 항체들은, 낮은 친화도 (BIACORE™ 검정에서)를 나타내고, 게먹이 원숭이의 B7-H3에 대한 교차-반응을 하지 않는, TES7 및 OVCA2와 달랐다. 이 항체들은, 낮은 친화도 (BIACORE™ 검정에서), 낮은 IHC 수행 (약한 결합) 및 더 낮은 UDART™ 활성을 나타내는, SG27과 달랐다. 이 항체들은, 낮은 친화도 (BIACORE™ 검정에서), 낮은 종양/정상 IHC 차이, 및 더 낮은 UDART™ 활성을 나타내는 GB8과 달랐다.
Caki-2 및 Hs700T 양성 대조군 세포를 사용하여, IHC 조사는 서로에 비해 다른 최선의 농도 및 다른 별도의 농도를 나타내는 각각의 항체를 나타내었다 (표 7).
Figure pct00012
* OVCA22는 caki2와의 결합만을 나타냈고 Hs700T와의 결합을 나타내지 않았다. caki2 세포와의 결합에 기초한 최적화 결정.
** SG27이 2개의 작동기 사이에서 불변 적정 분석 결과를 나타내지 않았기 때문에, 낮은 친화도 및 차등 농도가 결정되지 않았다.
*** 양성 대조군 세포에 대해 너무 낮은 친화도 때문에 수행되지 않은 TDH6 연구
표 7에 지시된 최선의 및 별도의 농도를 사용하여, 사람 조직의 B7-H3 항체의 IHC 반응을 결정하였다. 부신, 간, 췌장, 신장, 폐, 및 결장에 대한 이 분석의 결과는 표 8a-8b 및 표 9a-9b에 나타난다 (모든 항체는 심장조직에 대한 음성 IHC 반응을 나타내었다).
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
암 표본을 사용하여 수행된 IHC 조사는 본 발명의 B7-H3 항체가 다양한 조직 공급원에서 암을 확인하고 진단하기 위해 사용될 수 있다는 것을 나타내었다 (표 10). 표 10에서, 숫자는 플러스 부호의 수를 나타낸다 (1 = +, 2 = ++, 3 = +++); 각각의 숫자는 다른 테스트된 샘플을 나타낸다.
Figure pct00018
B7-H3 항체 BRCA84D를 처리한 전립선, 유방, 결장 및 폐 암 세포에 대해, 종양 세포 염색은 종양 세포 및 기질 세포에 존재하였고, 종양 맥관 구조를 포함하였다. 일부 종양 샘플에서 기질 염색은 종양 세포보다 훨씬 더 강했다. BRCA84D mAb 는 낮은 농도로 적정되었고, 일부 경우는 종양 세포에서 감소된 염색을 나타냈지만, 여전히 강한 기질 염색을 나타내었다. 0.625 μg/ml의 BRCA84D로 염색 시, 전립선 암 세포는 3/3+의 IHC를 나타내었다; 유방 암 세포는 4/4+의 IHC를 나타내었다; 결장 암 세포는 4/4+의 IHC를 나타내었고 폐 암 세포는 4/4+의 IHC를 나타내었다. 0.078 μg/ml의 BRCA84D로 염색 시, 전립선 암 세포는 3/4+의 IHC를 나타내었다; 유방 암 세포는 5/5+의 IHC를 나타내었다; 결장 암 세포는 4/4+의 IHC를 나타내었고 폐 암 세포는 3/4+의 IHC를 나타내었다.
정상 간은 B7-H3 항체 BRCA68D를 처리하였고, 간 세포 및 동양 혈관 표층 세포 (sinusoid lining cell)에서 염색을 보았다. B7-H3 항체 BRCA68D로 염색한 정상 췌장은 콜라겐 섬유 및 상피에서 다양한-초점의 염색을 나타내었다. B7-H3 항체 BRCA68D 처리된 정상 부신 세포는 피질에서 염색을 나타내었다. 0.156 μg/ml의 BRCA68D로 염색 시, 위, 신장 및 난소 암은 모두 5/5+의 IHC를 나타내었다.
추가적인 IHC 염색 분석을 위, 신장 및 난소 암 조직의 샘플에서 수행하였다. 이러한 분석의 결과는 표 12에 나타난다. 표 11에서, 숫자는 플러스 부호의 수를 나타낸다 (1 = +, 2 = ++, 3 = +++); 각각의 숫자는 다른 테스트된 샘플을 나타낸다.
Figure pct00019
요약하면, 모든 테스트된 mAbs는 정상 간, 췌장, 결장 및 폐에서 다양한 정도의 염색 강도를 나타냈다. 도 1a는 정상 췌장, 간, 폐 및 결장 조직 표본을 사용하여 0.625 μg/ml 및 0.078 μg/ml의 BRCA84D로 수행된 IHC 조사의 결과를 나타낸다. BRCA84D 및 TES7로 간 염색은 혈관 표층 세포 (섬유모 세포 및 쿠퍼 세포 (kupffer cell))에서 상대적으로 제한되었다. OVCA22는 최선의 농도에서 혈관 표층 세포를 제외한 막 간 세포 염색을 나타냈다. 하지만, 간 세포의 염색은 차등 농도에서 사라졌다. 모든 다른 mAbs는 최선의 및 차등 농도 둘 다에서 막 또는 세포질염색을 포함하는 간 세포에서 염색을 나타내었다. 췌장 염색을 주로 콜라겐 섬유에서 및 낮은 퍼센트의 상피 (선방 세포 (acinar cell) 또는/및 사이 관 세포 (intercalated duct cell))에서 관찰하였다. 상피의 염색은 차등 농도에서 감소되거나 사라졌다. 결장 염색은 점막의 소낭성 상피 (crypt epithelium) 및 섬유모 세포의 첨단막 (apical membrane)에서 상대적으로 제한되었다. 결장의 림프 소절에서 결합이 관찰되지 않았다. 폐는 상피에서 BRCA84D, BRCA68D, BRCA69D 및 GB8로 아주 약한 및 군데군데 있는 염색을 나타내었다. 하지만, 염색은 차등 농도에서 사라졌다. 폐에서 둘 다의 농도의 TES7, OVCA22 및 PRCA157로 염색이 관찰되지 않았다. 부신 피질 염색을 VRCA84D를 제외하고, 최선의 농도의 대부분의 모든 mAbs로 관찰하였다. 차등 농도의 TES7 및 OVCA22로 부신의 염색은 명백히 감소되었다. 심장 및 신장은 모든 mAbs로 명백한 염색을 나타내지 않았다 (도 1b). 이러한 성질에 비추어, BRCA84D는 최고의 mAbs라고 생각되었고, 뒤 이어 (2) TES7, (3) OVCA22, (4) 그룹 BRCA68D, BRCA69D 및 PRCA157, 및 마지막으로 (5) GB8였다.
본 연구에 포함된 모든 mAbs는 4개의 암 타입에서 최선의 농도에서 양성 염색을 나타내었다. 차등 농도에서, BRCA84D는 전립선 암, 유방암, 및 결장 암에서 여전히 좋은 염색을 유지하였다. TES7은 4개의 연구 암 타입에서 좋은 염색을 유지하였다. 유지한 mAbs는 다른 종양 타입에서 다양한 염색 강도를 나타내었다. 종양 샘플 염색을 종양 세포 및 맥관 구조를 포함하는, 기질 세포에서 관찰하였다. 일부 종양 샘플은 맥관 구조, 즉, BRCA84D, BRCA69D, TES7, 및 PRCA157에서만 양성 염색을 나타내었다. 일부 종양은 종양 세포 염색보다 더 강한 기질 염색을 나타내었다. mAbs가 이 샘플들에서 더 낮은 농도로 적정될 때, 일부 경우는 종양 세포에서 감소되거나 염색되지 않는 것을 나타내었지만, 여전히 강한 기질 염색은 유지되었다. 일반적으로, 사람 정상 조직에서 발현 및 정상 대 종양 조직의 차등 발현에 관하여, 최고의 IHC 수행으로부터 가장 저조한 수행까지 mAb 순서는 다음과 같다: (1) BRCA84D, (2) TES7, (3) OVCA22, (4) 그룹 BRCA68D, BRCA69D 및 PRCA157, 및 마지막으로 (5) GB8. 표 12 및 도 2는 항체 BRCA84D에 대한 결과를 나타낸다.
Figure pct00020
실시예 2
게먹이 원숭이 B7- H3 교차 반응
게먹이 원숭이 B7-H3의 서열은 그것의 사람 대응물과 약 90% 상동성을 공유하는데, 게먹이 원숭이는 사람 B7-H3 상호작용에 대한 훌륭한 모델이라는 것을 제안한다. 어느 교차-반응과 사람의 조직에 대해 관찰된 염색 강도 및 염색 패턴을 비교하기 위해, B7-H3 후보 물질 BRCA84D, BRCA68D, BRCA69D, TES7, OVCA22 및 PRCA157와 게먹이 원숭이의 부신, 간, 신장, 췌장 및 간뿐만 아니라 한 가지 사례의 만삭 태반과 교차-반응을 평가하기 위해 조사를 수행하였다.
각각 테스트된 Mab에 대한 염색 농도는 Caki-2 및 Hs700T 양성 대조군 세포에서 결정되는 최선의 농도이다 (표 8 참조). 상업적인 염소 항 사람 B7-H3 (개와 교차-반응된)를 게먹이 태반 조직을 염색하기 위한 양성 대조군 항체로서 선택하였다. 해당하는 이소타입 대조군을 실험의 각각의 실행에 적용하였다. 이 조사의 결과는 표 13에 나타난다.
Figure pct00021
주: BRCD84D는 5 μg/ml까지에서 간 및 췌장에서 음성 염색을 나타내었다. OVCA22는 IHC에서 게먹이 조직과의 결합하지 않았고, 적당한 결합은 CHO 세포의 재조합 게먹이 B7H3에서 관찰되었다. 정상 조직에서 IHC 점수는 음성, 1+, 2+ 및 3+ 4 등급 시스템이다; m = 막; 2/2 = 2개의 경우 중 2개, 1/2= 2개의 경우 중 1개
게먹이 태반에서 BRCA84D (0.625 μg/ml) IHC 염색의 조사는 탈락막 세포 (decidual cell)의 염색을 나타내었지만, 융모에서는 아니다. 게먹이 간 및 췌장에서 염색이 관찰되지 않았지만, 혈관 표층 세포의 염색을 사람 간에서 관찰하였고 사람 췌장 조직에서 국부적인 섬유소 및 상피 염색을 관찰하였다.
게먹이 태반에서 BRCA68D (0.156 μg/ml) IHC 염색의 조사는 탈락막 세포 (decidual cell), 간엽 세포 (mesenchymal cell) (내피 및 섬유모 세포) 및 융모의 염색을 나타내었다. 염색은 간 세포 및 간 섬유모 세포의 세포질, 뿐만 아니라 췌장 섬유소에 및 췌장 내피의 세포질에 존재한다. 따라서, 사람 및 게먹이 간 및 췌장 조직은 BRCA68D와 유사한 염색 패턴을 나타낸다.
요약하면, BRCA84D, BRCA68D, BRCA69D 및 PRCA157 모두는 게먹이 조직에서 교차-반응을 나타낸다. BRCA84D는 원숭이 간 및 췌장에서 염색을 나타내지 않았다; 이러한 염색을 사람 간 및 췌장 조직에서 관찰하였다. BRCA68D 및 BRCA69D는 원숭이 조직에서 유사한 염색 강도 및 유사한 염색 패턴을 나타내었다. BRCA68D, BRCA69D 및 PRCA157가 사람 조직과 비교 가능한 염색 패턴을 나타내었지만, 최선의 조건에서 염색 강도는 사람 조직과 동일하지 않다. 최선의 조건에서 TES7 및 OVCA22는 원숭이 조직에서 어느 염색도 나타내지 않았다.
게먹이 조직 및 사람 조직에서 IHC 염색의 상대적인 결과의 요약은 표 14에 제공된다.
Figure pct00022
실시예 3
B7- H3 mAbs 는 다양한 ATCC 암 세포주와의 결합한다
본 발명의 항체는 American Type Culture Collection의 컬렉션에 함유된 다양한 암 세포주와의 결합할 수 있다는 것을 발견하였다. 표 15 및 표 16은 결합 결과를 요약한다.
Figure pct00023
Figure pct00024
실시예 4
B7- H3 mAbs 재이동 살해
본 발명의 항체는 암 세포의 표면상에 존재하는 B7-H3와의 결합한다. 상기 설명된 바와 같이, 고전적인 방법을 사용하여, 플루오레세인으로 표지될 수도 있다. 이러한 표지된 분자가 T- 세포 수용체와의 결합하는 에피토프 결합 도메인 및 플루오레세인 ("TCR-UDART™ ")과의 결합하는 에피토프 결합 도메인을 갖는 UDART™ 의 존재 시 이러한 항체가 배양될 때, 그들은 DART™ 분자와의 결합할 수 있고 그로 인해 B7-H3을 발현하고 그들을 재이동 살해를 일으키는 세포의 표면에 국한시킨다.
A. A498 신장 암종 세포의 재이동 살해
이러한 재이동 살해를 입증하기 위해, 플루오레세인-표지된 B7-H3 항체를 이러한 TCR-UDART™ 분자와 함께 배양하였고 A498 신장 암종 세포의 세포 독성을 매개하는 분자의 능력을 평가하였다 (표 17). 얻은 결과에 기초하여, 1위 후보는 RECA13, BRCA68D, BRCA69D 및 TDH6로 결론을 내렸다.
Figure pct00025
Figure pct00026
항체에 의해 매개된 투여량-의존적인 재이동 살해를 결정하기 위해 A498 신장 암종 세포를 B7-H3에 대해 반응성인 다른 농도의 단클론성 항체와 함께 배양하였다. 실험의 결과 (도 3a-3b)는 재이동 살해는 농도-의존적이었다는 것을 나타낸다.
B. A549 폐 암 세포의 재이동 살해
이러한 재이동 살해를 더 입증하기 위해, 플루오레세인-표지된 B7-H3 항체를 CD16과의 결합하는 에피토프 결합 도메인 및 플루오레세인 ("CD16-UDART™ ")과의 결합하는 에피토프 결합 도메인을 갖는, 상기 설명된 TCR-UDART™ 분자와 함께 배양하였고, A549 폐 암 세포의 세포 독성을 매개하는 분자의 능력을 평가하였다 (표 18). 실험의 결과 (도 3c-3d)는 재이동 살해는 농도-의존적이었다는 것을 나타낸다. 얻은 결과에 기초하여, 1위 후보는 BLA8, BRCA68D, BRCA69D 및 BRCA84D로 결론을 내렸다.
Figure pct00027
Figure pct00028
C. LNcap 전립선 암 세포의 재이동 살해
이러한 재이동 살해를 더 입증하기 위해, 플루오레세인-표지된 B7-H3 항체를 CD16과의 결합하는 에피토프 결합 도메인 및 플루오레세인 ("CD16-UDART™ ")과의 결합하는 에피토프 결합 도메인을 갖는, 상기 설명된 TCR-UDART™ 분자와 함께 배양하였고, LNcap 전립선 암 세포의 세포 독성을 매개하는 분자의 능력을 평가하였다 (표 19). 얻은 결과에 기초하여, 1위 후보는 BRCA68D, BRCA69D, BRCA84D 및 PRCA157로 결론을 내렸다.
Figure pct00029
Figure pct00030
실시예 5
가용성 B7H3-2 Ig 및 가용성 B7H3-4 Ig 와의 결합하는 B7- H3 mAbs 의 능력
상기 논의된 바와 같이, B7-H3은 4 Ig 도메인-함유 형태 (B7H3-4Ig) 및 2 Ig 도메인-함유 형태 (B7H3-2Ig) 둘 다로 존재한다. 본 발명의 항-B7-H3 항체를 가용성 B7H3-2Ig (도 4a) 및 가용성 B7H3-4Ig B7-H3 (도 4b)와의 결합하는 그들의 능력에 대해 테스트하였다. 항체는 넓은 범위의 결합 특징을 나타내는 것이 발견되었다. 항체 PRCA123, TDH5, BLA8, BRCA68D 및 SG24는 가용성 B7H3-2Ig와 가장 강한 결합을 나타내는 것이 발견되었고 항체 TES7, LUCA50, BRCA165, OVCA22, ST09 및 PA20는 가용성 B7H3-2Ig와 가장 약한 결합을 나타내는 것이 발견되었다. 항체 PRCA123, BRCA69A, BLA8 및 BRCA68D는 가용성 B7H3-4Ig와 가장 강한 결합을 나타내는 것이 발견되었고 항체 TES7, OVCA21 BRCA165 및 ST09는 가용성 B7H3-4Ig와 가장 약한 결합을 나타내는 것이 발견되었다.
실시예 6
용액의 항원과 캡쳐된 단클론성 항체의 친화도 결합
용액의 항원 및 캡쳐된 단클론성 항체 사이의 결합 친화도를 입증하기 위해, 100-200 RU의 레벨에서 고정화된 IgG Fc-특이적 Fab2 단편에서 항체를 캡쳐하였다. 항원 B7-H3 및 B7-H3 (4Ig)를 농도 100 nM로 캡쳐된 항체를 통해 주사하였다 (120초 동안 100 μl/분, 및 결합을 측정하였다. 결합 반응을 캡쳐된 mAb의 같은 레벨로 정규화하였고 m2B6 항체 (mIgG1) 대조군과의 결합 반응은 블랭크로서 뺐다. 이 분석의 결과 (도 5a-5s; 실선; B7-H3(4Ig) 100 nM; 점선; B7-H3, 100 nM))는 본 발명의 항체가 B7-H3 (4Ig)와 강한 결합을 나타낸다는 것을 입증하였다.
실시예 7
BIACORE ™ 분석: 고정화된 B7- H3 에 대한 B7- H3 mAbs 의 적정 to Immobilized B7- H3
본 발명의 항체에 대해 B7-H3-2Ig 및 B7-H3-4Ig의 상대적인 결합 친화도를 입증하기 위해, BIACORE™ 분석을 수행하였다. 본 발명의 B7-H3 항체는 고정화된 B7-H3-2Ig 또는 B7-H3-4Ig와의 결합하는 것이 허용되고 시간이 지남에 따라 결합의 적정을 평가하였다 (도 6a-6i). TDH5, PRCA123, BLA8, BRCA69은 B7-H3-2Ig 및 B7-H3-4Ig 둘 다에 대한 높은 친화도를 갖는 것이 발견되었다. 하지만 그들의 에피토프 (들)는 B7-H3-4Ig 분자에서 대부분 금지되고 단지 몇 개만 사용 가능하다는 것이 발견되었다. OVCA22는 B7-H3-2Ig 및 B7-H3-4Ig 두 분자에서 똑같이 사용 가능한 에피토프를 가진 B7-H3-2Ig 및 B7-H3-4Ig 둘 다에 대한 아주 낮은 친화도를 갖는 것이 발견되었다. 하지만 단지 B7-H3-4Ig 형태는 이가 결합한 항체에 대한 충분한 근접 (낮은 오프-레이트)을 제공하지만, B7-H3-2Ig는 단지 일가 공유 결합될 수 있다. TDH6은 이 포맷에서, 비특이적인 것 같은 2Ig와의 결합으로, 거의 친화도를 갖지 않는다. TES7 및 PA20은 낮은 친화도를 갖는 B7-H4-4Ig 특이적 항체인 것이 발견되었다. TES7은 PA20보다 아마 낮은 온-레이트 및 더 높은 오프-레이트를 가진다. BRCA84D는 B7-H3-2Ig and B7-H3-4Ig 둘 다에서 다양한 결합 부위의 가능성을 가진 중간 친화도 항체인 것이 발견되었다. BIACORE ™ 분석에 기초하여, 특이한 결합 부위 때문에 BRCA84D는 바람직한 항체라고 생각되었다. TES7 및 PA20는 높은 밀도의 항원 표면에 특이적으로 결합하는 후보자, 및 높은 친화도-낮은 특이성의 항체 중 하나라고 생각되었다 (예를 들어, BRCA69D 또는 다른 것).
도 7은 항체 PRCA157, BRCA69D, BLA8, PA20, BRCA84D, GB8 및 SG27의 비교 BIACORE™ 분석을 제공하고, 본 발명의 항-B7-H3 항체는 결합성의 범위를 나타낼 수 있다는 것을 도시한다.
도 8은 본 발명의 여러 항-B7-H3 항체의 비-경쟁적 특이성을 입증한다. 실험에서, 사람 B7-H3 분자를 항체 BRCA84D 존재시 배양하였고 BIACORE™ 분석의 대상이 되었다. 약 3분 후 2차 항-B7-H3 항체를 반응에 추가하였다. 만약 2차 항체가 BRCA84D와 경쟁하면, B7-H3 부위가 막혔고 결합할 수 없다는 것이 발견될 것이다. 결과는 항체 BRCA68D, BRCA69D, 및 PRCA157이 사람 B7-H3와의 결합에 대해 BRCA84D와 경쟁하지 않는 다는 것을 나타낸다.
실시예 8
항-B7- H3 mAbs 는 CSC 및 ATCC 세포주에 내면화한다
본 발명의 항-B7-H3 항체의 암 세포와의 결합에서 내면화되는 능력을 조사하였다. 전립선 CSC 세포 및 HS700t 췌장 세포를 항-B7-H3 항체와 함께 배양하였다. 1차 항체와의 결합하여 내면화하면 세포에 독성일 것인, 사포린-접합 항-마우스 2차 항체의 존재시 배양 후 세포의 생존력을 결정하였다. 전립선 CSC 세포 (도 9a) 및Hs700t 췌장 세포 (도 9b)에 대한 본 조사의 결과는 본 발명의 항체의 세포 내로 내면화하는 능력을 입증하였다.
실시예 9
B7- H3 mAb 결합 및 ELISA 에 의한 교차-블록 분석
본 발명의 항체의 교차-반응성 및 이러한 항체에 의해 인식된 에피토프를 탐험하기 위해, 경쟁자 B7-H3 항체의 존재시 발생하는 결합의 정도를 측정하였다. 이 분석의 결과는 도 10a-10f에 나타나고, BRCA68D는 BRCA69D와 경쟁한다. TES7 및 OVCA22는 또한 서로 경쟁하는 것이 발견되었고, TES7는 또한 BRCA68D 및 BRCA69D 둘 다와 경쟁하지만 OVCA22는 아닌 것이 발견되었다. GB8은 B7-H3-2Ig와의 결합에 대해 SG27과 경쟁하지만 B7-H3-4Ig와의 결합에 대해서는 아닌 것이 발견되었다. 데이터는 표 20에 요약되고 B7-H3-4Ig에 대해 적어도 4개의 분명한 에피토프 (SG27에 의해 인식된 에피토프, GB8에 의해 인식된 에피토프, OVCA22 및 TES7에 의해 인식된 에피토프) 및 B7-H3-2Ig에 대해 적어도 2개의 에피토프 (즉, SG27 및 GB8에 의해 인식된 에피토프, BRCA68D 및 BRCA69D에 의해 인식된 에피토프)를 나타낸다.
Figure pct00031
본 발명의 주요 항-B7-H3 항체의 속성은 표 21에 나타난다. 정상 및 암 조직에서 나타난 차등 염색에 기초하여, B7-H3-4Ig뿐만 아니라 B7-H3-2Ig와의 결합하는 그들의 능력, 상기 설명된 BIACORE™ 분석에 의해 측정된 바와 같은 그들의 결합 친화도 및 게먹이 B7H3, 항체, BRCA68D, BRCA69D, BRCA84D, 및 PRCA157와의 결합하는 그들의 능력을 가장 바람직한 항체로 판단하였다.
Figure pct00032
실시예 10
사람화된 항-B7- H3 항체
단클론성 항체 BRCA84D는 향상된 사람 치료적 잠재력을 제공하는 항체 (일반적으로 "hBRCA84D"로서 여기에서 조작된다)를 생산하기 위해 사람화된다. 가변 경쇄, 및 가변 중쇄의 서열, 및 결과로 얻은 사람화 항체 (일반적으로 "hBRCA84D-1"로서 여기에서 조작된다)의 아미노산 및 폴리뉴클레오티드 서열은 하기 제공된다:
사람화된 BRCA84D-1 가변 경쇄 (SEQ ID NO: 68):
DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCKASQNVD TNVAWYQQKP GKAPKLLIYS
ASYRYSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YNNYPFTFGQ
GTKLEIK
사람화된 BRCA84D-1 가변 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열 (SEQ ID NO: 69):
gacatccagc tgacccagtc cccctccttc ctgtctgcct ccgtgggcga
cagagtgacc atcacatgca aggcctccca gaacgtggac accaacgtgg
cctggtatca gcagaagcct ggcaaggccc ctaagctgct gatctactcc
gcctcctacc ggtactccgg cgtgccttcc aggttctccg gctccggctc
tggcaccgac ttcaccctga ccatctccag cctgcagcct gaggacttcg
ccacctacta ctgccagcag tacaacaact accctttcac cttcggccag
ggcaccaagc tggaaatcaa g
사람화된 BRCA84D-1 가변 경쇄 CDR1 (SEQ ID NO: 70): KASQNVDTNVA
사람화된 BRCA84D-1 가변 경쇄 CDR1을 암호화하는 폴리뉴클레외티드 서열 (SEQ ID NO: 71): aaggccagtc agaatgtgga tactaatgta gcc
사람화된 BRCA84D-1 가변 경쇄 CDR2 (SEQ ID NO: 72): SASYRYS
사람화된 BRCA84D-1 가변 경쇄 CDR2를 암호화하는 폴리뉴클레외티드 서열 (SEQ ID NO: 73): tcggcatcct accggtacag t
사람화된 BRCA84D-1 가변 경쇄 CDR3 (SEQ ID NO: 74): QQYNNYPFT
사람화된 BRCA84D-1 가변 경쇄 CDR3을 암호화하는 폴리뉴클레외티드 서열 (SEQ ID NO: 75): cagcaatata acaactatcc attcacg
사람화된 BRCA84D-1 가변 중쇄의 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 80):
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SFGMHWVRQA PGKGLEWVAY
ISSDSSAIYY ADTVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRDED TAVYYCARGR
ENIYYGSRLD YWGQGTTVTV SS
사람화된 BRCA84D-1 가변 중쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열 (SEQ ID NO: 81):
gaggtgcagc tggtcgagtc tggcggagga ctggtgcagc ctggcggctc
cctgagactg tcttgcgccg cctccggctt caccttctcc agcttcggca
tgcactgggt ccgccaggct ccaggcaagg gactggaatg ggtggcctac
atctcctccg actcctccgc catctactac gccgacaccg tgaagggcag
gttcaccatc tcccgggaca acgccaagaa ctccctgtac ctgcagatga
actccctgcg ggacgaggac accgccgtgt actactgcgc cagaggccgg
gagaatatct actacggctc ccggctggat tattggggcc agggcaccac
cgtgaccgtg tcctct
사람화된 BRCA84D-1 가변 중쇄 CDR1 (SEQ ID NO: 82): FGMH
사람화된 BRCA84D-1 가변 중쇄 CDR1을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열 (SEQ ID NO: 83): tttggaatgcac
사람화된 BRCA84D-1 가변 중쇄 CDR2 (SEQ ID NO: 84): YISSDSSAIYYADTVK
사람화된 BRCA84D-1 가변 중쇄 CDR2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열 (SEQ ID NO: 85): tacattagta gtgacagtag tgccatctac tatgcagaca cagtgaag
사람화된 BRCA84D-1 가변 중쇄 CDR3 (SEQ ID NO: 86): GRENIYYGSRLDY
사람화된 BRCA84D-1 가변 중쇄 CDR3을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열 (SEQ ID NO: 87): gggagggaaa acatttacta cggtagtagg cttgactac
도 11a-11b는 BRCA84D 및 그들의 사람화된 유도체, hBRCA84D의 가변 경쇄 (도 11a) 또는 가변 중쇄 (도 11b)의 아미노산 잔기의 정렬을 나타낸다.
사람 B7-H3에 대한 향상된 친화도를 나타내는 hBRCA84D 종을 얻기 위해, hBRCA84D-1 (즉, hBRCA84D-1VL 또는 hBRCA84D-1VH, 각각)의 경쇄 또는 중쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 전이의 대상이 되었고, 돌연변이된 hBRCA84D-1 경쇄 유도체 hBRCA84D-2VL, hBRCA84D-3VL, hBRCA84D-4VL, hBRCA84D-5VL, 및 hBRCA84D-6VL 및 돌연변이된 hBRCA84D-1 중쇄 유도체 hBRCA84D-2VH, hBRCA84D-3VH, 및 hBRCA84D-4VH를 분리하였고 특성화하였다. 이 항체들의 가변 경쇄 및 중쇄의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 하기 제공된다:
hBRCA84D-2VL (SEQ ID NO: 89):
DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCKASQNVD TNVAWYQQKP GKAPKALIYS
ASYRYSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YNNYPFTFGQ
GTKLEIK
hBRCA84D-2VL을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 (SEQ ID NO: 90):
gacatccagc tgacccagtc cccctccttc ctgtctgcct ccgtgggcga
cagagtgacc atcacatgca aggcctccca gaacgtggac accaacgtgg
cctggtatca gcagaagcct ggcaaggccc ctaaggcgct gatctactcc
gcctcctacc ggtactccgg cgtgccttcc aggttctccg gctccggctc
tggcaccgac ttcaccctga ccatctccag cctgcagcct gaggacttcg
cacctacta ctgccagcag tacaacaact accctttcac cttcggccag
ggcaccaagc tggaaatcaa g
hBRCA84D-3VL (SEQ ID NO: 91):
DIQLTQSPSF LSASVGDRVS VTCKASQNVD TNVAWYQQKP GKAPKLLIYS
ASYRYSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YNNYPFTFGQ
GTKLEIK
hBRCA84D-3VL을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 (SEQ ID NO: 92):
gacatccagc tgacccagtc cccctccttc ctgtctgcct ccgtgggcga
cagagtgtcc gtcacatgca aggcctccca gaacgtggac accaacgtgg
cctggtatca gcagaagcct ggcaaggccc ctaagctgct gatctactcc
gcctcctacc ggtactccgg cgtgccttcc aggttctccg gctccggctc
tggcaccgac ttcaccctga ccatctccag cctgcagcct gaggacttcg
ccacctacta ctgccagcag tacaacaact accctttcac cttcggccag
ggcaccaagc tggaaatcaa g
hBRCA84D-4VL (SEQ ID NO: 93):
DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCKASQNVD TNVAWYQQKP GQAPKLLIYS
ASYRYSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YNNYPFTFGQ
GTKLEIK
hBRCA84D-4VL을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 (SEQ ID NO: 94):
gacatccagc tgacccagtc cccctccttc ctgtctgcct ccgtgggcga
cagagtgacc atcacatgca aggcctccca gaacgtggac accaacgtgg
cctggtatca gcagaagcct ggccaggccc ctaagctgct gatctactcc
gcctcctacc ggtactccgg cgtgccttcc aggttctccg gctccggctc
tggcaccgac ttcaccctga ccatctccag cctgcagcct gaggacttcg
ccacctacta ctgccagcag tacaacaact accctttcac cttcggccag
ggcaccaagc tggaaatcaa g
hBRCA84D-5VL (SEQ ID NO: 95):
DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCKASQNVD TNVAWYQQKP GQAPKALIYS
ASYRYSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YNNYPFTFGQ
GTKLEIK
hBRCA84D-5VL을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 (SEQ ID NO: 96):
gacatccagc tgacccagtc cccctccttc ctgtctgcct ccgtgggcga
cagagtgacc atcacatgca aggcctccca gaacgtggac accaacgtgg
cctggtatca gcagaagcct ggccaggccc ctaaggcgct gatctactcc
gcctcctacc ggtactccgg cgtgccttcc aggttctccg gctccggctc
tggcaccgac ttcaccctga ccatctccag cctgcagcct gaggacttcg
ccacctacta ctgccagcag tacaacaact accctttcac cttcggccag
ggcaccaagc tggaaatcaa g
hBRCA84D-6VL (SEQ ID NO: 97):
DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCKASQNVD TNVAWYQQKP GKAPKLLIYS ASYRYSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFAEYYCQQ YNNYPFTFGQ GTKLEIK
hBRCA84D-6VL을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 (SEQ ID NO: 98):
gacatccagc tgacccagtc cccctccttc ctgtctgcct ccgtgggcga
cagagtgacc atcacatgca aggcctccca gaacgtggac accaacgtgg
cctggtatca gcagaagcct ggcaaggccc ctaagctgct gatctactcc
gcctcctacc ggtactccgg cgtgccttcc aggttctccg gctccggctc
tggcaccgac ttcaccctga ccatctccag cctgcagcct gaggacttcg
ccgagtacta ctgccagcag tacaacaact accctttcac cttcggccag
ggcaccaagc tggaaatcaa g
hBRCA84D-2VH (SEQ ID NO: 99):
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SFGMHWVRQA PGKGLEWVAY
ISSDSSAIYY ADTVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRDED TAVYYCGRGR
ENIYYGSRLD YWGQGTTVTV SS
hBRCA84D-2VH를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 (SEQ ID NO: 100):
gaggtgcagc tggtcgagtc tggcggagga ctggtgcagc ctggcggctc
cctgagactg tcttgcgccg cctccggctt caccttctcc agcttcggca
tgcactgggt ccgccaggct ccaggcaagg gactggaatg ggtggcctac
atctcctccg actcctccgc catctactac gccgacaccg tgaagggcag
gttcaccatc tcccgggaca acgccaagaa ctccctgtac ctgcagatga
actccctgcg ggacgaggac accgccgtgt actactgcgg cagaggccgg
gagaatatct actacggctc ccggctggat tattggggcc agggcaccac
cgtgaccgtg tcctct
hBRCA84D-3VH (SEQ ID NO: 101):
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SFGMHWVRQA PGKGLEWVAY
ISSDSSAIYY ADTVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRDED TAMYYCGRGR
ENIYYGSRLD YWGQGTTVTV SS
hBRCA84D-3VH를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 (SEQ ID NO: 102):
gaggtgcagc tggtcgagtc tggcggagga ctggtgcagc ctggcggctc
cctgagactg tcttgcgccg cctccggctt caccttctcc agcttcggca
tgcactgggt ccgccaggct ccaggcaagg gactggaatg ggtggcctac
atctcctccg actcctccgc catctactac gccgacaccg tgaagggcag
gttcaccatc tcccgggaca acgccaagaa ctccctgtac ctgcagatga
actccctgcg ggacgaggac accgccatgt actactgcgg cagaggccgg
gagaatatct actacggctc ccggctggat tattggggcc agggcaccac
cgtgaccgtg tcctct
hBRCA84D-4VH (SEQ ID NO: 103):
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SFGMHWVRQA PGKGLEWVAY
ISSDSSAIYY ADTVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRSED TAVYYCARGR
ENIYYGSRLD YWGQGTTVTV SS
hBRCA84D-4VH를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 (SEQ ID NO: 104):
gaggtgcagc tggtcgagtc tggcggagga ctggtgcagc ctggcggctc
cctgagactg tcttgcgccg cctccggctt caccttctcc agcttcggca
tgcactgggt ccgccaggct ccaggcaagg gactggaatg ggtggcctac
atctcctccg actcctccgc catctactac gccgacaccg tgaagggcag
gttcaccatc tcccgggaca acgccaagaa ctccctgtac ctgcagatga
actccctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgcgc cagaggccgg
gagaatatct actacggctc ccggctggat tattggggcc agggcaccac
cgtgaccgtg tcctct
표 22는 연구된 hBRCA84D 가변 경쇄 및 가변 중쇄 돌연변이를 나열한다; 숫자는 도 11a 및 11b에 사용된 Kabat 번호 매기기 시스템을 나타낸다.
Figure pct00033
사람 B7-H3에 대한 hBRCA84D 경쇄 유도체 hBRCA84D-3VL, hBRCA84D-4VL 및 hBRCA84D-5VL의 상대적인 결합 친화도를 이 경쇄 가변 영역 및 키메라 BRCA84D-1VH 중쇄를 함유하는 항체의 형성에 의해 결정하였다 (도 12). BRCA84D-5VL (K42Q, L46A)는 테스트된 hBRCA84D-VL 중 가장 높은 결합 친화도를 갖는 것이 발견되었다. 그러므로 BRCA84D-5VL를 사람 B7-H3에 대한 hBRCA84D-1VH, hBRCA84D-2VH, hBRCA84D-3VH 및 hBRCA84D-4VH의 hBRCA84D 중쇄의 상대적인 결합 친화도를 조사하는 경쇄로서 사용하였다 (도 13). hBRCA84D-2VH (A93G)는 테스트된 hBRCA84D-VH 중 가장 높은 결합 친화도를 갖는 것이 발견되었다.
키메라 BRCA84D-1의 아미노산 및 암호화 폴리뉴클레오티드 서열은 다음과 같다:
chBRCA84D 경쇄 (SEQ ID NO: 105):
DIAMTQSQKF MSTSVGDRVS VTCKASQNVD TNVAWYQQKP GQSPKALIYS
ASYRYSGVPD RFTGSGSGTD FTLTINNVQS EDLAEYFCQQ YNNYPFTFGS
GTKLEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SWCLLNNFY PREAKVQWKV
DNALQSGNSQ ESVTEQDSK
chBRCA84D 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 (SEQ ID NO: 106):
gacattgcga tgacccagtc tcaaaaattc atgtccacat cagtaggaga
cagggtcagc gtcacctgca aggccagtca gaatgtggat actaatgtag
cctggtatca acagaaacca gggcaatctc ctaaagcact gatttactcg
gcatcctacc ggtacagtgg agtccctgat cgcttcacag gcagtggatc
tgggacagat ttcactctca ccatcaacaa tgtgcagtct gaagacttgg
cagagtattt ctgtcagcaa tataacaact atccattcac gttcggctcg
gggacaaagt tggaaataaa acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat
cttcccgcca tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt
gcctgctgaa taacttctat cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg
gataacgccc tccaatcggg taactcccag gagagtgtca cagagcagga
cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg ctgagcaaag
cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc
ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag
chBRCA84D 경쇄 (SEQ ID NO: 107):
DVQLVESGGG LVQPGGSRKL SCAASGFTFS SFGMHWVRQA PEKGLEWVAY
ISSDSSAIYY ADTVKGRFTI SRDNPKNTLF LQMTSLRSED TAMYYCGRGR
ENIYYGSRLD YWGQGTTLTV SSASTKGPSV FPLAPSSKST SGGTAALGCL
VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ SSGLYSLSSV VTVPSSSLGT
QTYICNVNHK PSNTKVDKRV EPKSCDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP
KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ
YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE
PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP
PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP
GK
chBRCA84D 중쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 (SEQ ID NO: 108):
gatgtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgcagc ctggagggtc
ccggaaactc tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctttggaa
tgcactgggt tcgtcaggct ccagagaagg ggctggagtg ggtcgcatac
attagtagtg acagtagtgc catctactat gcagacacag tgaagggccg
attcaccatc tccagagaca atcccaagaa caccctgttc ctgcaaatga
ccagtctaag gtctgaggac acggccatgt attactgtgg aagagggagg
gaaaacattt actacggtag taggcttgac tactggggcc aaggcaccac
tctcacagtc tcctcagcct ccaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg
caccctcctc caagagcacc tctgggggca cagcggccct gggctgcctg
gtcaaggact acttccccga accggtgacg gtgtcgtgga actcaggcgc
cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag tcctcaggac
tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc
cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga
caagagagtt gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt
gcccagcacc tgaactcctg gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca
aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt
ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg
tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag
tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga
ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc
cagcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa
ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg gatgagctga ccaagaacca
ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg
tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct
cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt
ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc
atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg
ggtaaatga
(1) hBRCA84D-2VL 및 hBRCA84D-2VH (2번의 실험)를 함유하는 항체, (2) 키메라 BRCA84D, (3) hBRCA84D-5VL 및 키메라 BRCA84D-HC를 함유하는 항체, 및 (4) hBRCA84D-5VL 및 hBRCA84D-2VH를 함유하는 항체의 상대적인 결합 친화도를 비교하였다. 결과는 도 14에 나타난다.
실시예 11
사람화된 항-B7- H3 항체는 이종이식에서 종양 성장을 억제한다
사람화된 항-B7-H3 항체의 생체 내에서 종양 성장을 억제하는 능력을 입증하기 위해, HT-1197 방광 암종 세포 및 A498 신장 암종 세포의 종양 성장을 쥐 이종이식에서 연구하였다. 사람화된 항체 hBRCA84D-2 (hBRCA84D-2 VL 사슬/ hBRCA84D-2 VL 사슬)을 치환 L235V, F243L, R292P, Y300L, 및 P396L를 갖는 Fc 영역을 포함하도록 변형하였다. 암 세포의 이식 후 7일, 14일, 21일 및 28일에 Fc-변형된 hBRCA84D-2 항체를 마우스에 투여하였다 (1 μg/kg, 10 μg/kg, 또는 20 μg/kg의 농도로). 결과는 모든 투여량에서 투여된 Fc-변형된 hBRCA84D-2 항체는 HT-1197 방광 암종 세포 (도 15) 및 A498 신장 암종 세포 (도 16)의 종양 성장을 억제할 수 있었다는 것을 나타낸다.
실시예 12
B7- H3 및 T- 세포 수용체에 대해 특이적인 이중 친화도 재표적화제 ( DART ™)는 잠재적인 재이동 T- 세포 살해를 매개한다
B7-H3 및 T- 세포 수용체 ("TCR")에 대해 및 자연적 킬러 그룹 2D (NKG2D) 수용제에 대해 특이적인 이중 친화도 재표적화제 (DART™)를 제조하였다. 이러한 DART™ 는 암 세포의 위치로 (이러한 암 세포가 DART™ 의 B7-H3-결합 부분의 결합에 의해) T- 세포를 국부화 (이러한 T- 세포와 TCR-결합 DART™ 의 TCR-결합 부분의 결합에 의해) 또한 NK- 세포를 국부화 (이러한 NK 세포와 NKG2D-결합 DART™ 의 NKG2D-결합 부분의 결합에 의해)하는 능력을 갖는다. 국부화된 T- 세포 및 NK 세포는 여기에서 "재이동" 살해로 불리는 과정에서 암 세포의 살해를 매개할 수 있다.
hBRCA84D-2의 항-B7-H3 가변 도메인 및 항-TCR 가변 도메인을 갖는, B7-H3 및 T- 세포 수용체 ("TCR")에 대해 특이적인 이중 특이성 재표적화제 (DART™)를 구성하였다:
TCR VL x hBRCA84D VH-2-E 코일 DART™ 사슬 (SEQ ID NO: 109):
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCSATSSVS YMHWYQQKPG KAPKRWIYDT
SKLASGVPSR FSGSGSGTEF TLTISSLQPE DFATYYCQQW SSNPLTFGQG
TKLEIK GGGS GGGG EVQLVE SGGGLVQPGG SLRLSCAASG FTFSSFGMHW
VRQAPGKGLE WVAYISSDSS AIYYADTVKG RFTISRDNAK NSLYLQMNSL
RDEDTAVYYC GRGRENIYYG SRLDYWGQGT TVTVSS GGCG GG EVAALEKE
VAALEKEVAA LEKEVAALEK
TCR VL x hBRCA84D VH-2-E 코일 DART™ 사슬을 암호화하는 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 110):
gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga
aagagccacc ctctcctgca gtgccacctc aagtgtaagt tacatgcact
ggtatcagca gaaaccaggg aaagccccta agcgctggat ctatgacaca
tccaaactgg cttctggggt cccatcaagg ttcagcggca gtggatctgg
gacagaattt actctcacaa tcagcagcct gcagcctgaa gattttgcaa
cttattactg tcagcagtgg agtagtaacc cgctcacgtt tggccagggg
accaagcttg agatcaaa gg aggcggatcc ggcggcggag gc gaggtgca
gctggtcgag tctggcggag gactggtgca gcctggcggc tccctgagac
tgtcttgcgc cgcctccggc ttcaccttct ccagcttcgg catgcactgg
gtccgccagg ctccaggcaa gggactggaa tgggtggcct acatctcctc
cgactcctcc gccatctact acgccgacac cgtgaagggc aggttcacca
tctcccggga caacgccaag aactccctgt acctgcagat gaactccctg
cgggacgagg acaccgccgt gtactactgc ggcagaggcc gggagaatat
ctactacggc tcccggctgg attattgggg ccagggcacc accgtgaccg
tgtcctcc gg aggatgtggc ggtgga gaag tggccgcact ggagaaagag
gttgctgctt tggagaagga ggtcgctgca cttgaaaagg aggtcgcagc
cctggagaaa
hBRCA84DVL-2 x TCR VH - K 코일 사슬 (SEQ ID NO: 111):
DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCKASQNVD TNVAWYQQKP GKAPKALIYS
ASYRYSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YNNYPFTFGQ
GTKLEIK GGG SGGGG QVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYKFTSYVMH
WVRQAPGQGL EWIGYINPYN DVTKYNEKFK GRVTITADKS TSTAYLQMNS
LRSEDTAVHY CARGSYYDYD GFVYWGQGTL VTVSS GGCGG G KVAALKEKV
AALKEKVAAL KEKVAALKE
hBRCA84DVL-2 x TCR VH - K 코일 사슬을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 (SEQ ID NO: 112):
gacatccagc tgacccagtc cccctccttc ctgtctgcct ccgtgggcga
cagagtgacc atcacatgca aggcctccca gaacgtggac accaacgtgg
cctggtatca gcagaagcct ggcaaggccc ctaaggcgct gatctactcc
gcctcctacc ggtactccgg cgtgccttcc aggttctccg gctccggctc
tggcaccgac ttcaccctga ccatctccag cctgcagcct gaggacttcg
ccacctacta ctgccagcag tacaacaact accctttcac cttcggccag
ggcaccaagc tggaaatcaa g ggaggcgga tccggcggcg gaggc caggt
tcagctggtg cagtctggag ctgaggtgaa gaagcctggg gcctcagtga
aggtctcctg caaggccagc ggttacaagt ttaccagcta cgtgatgcac
tgggtgcgac aggcccctgg acaagggctt gagtggatcg gatatattaa
tccttacaat gatgttacta agtacaatga gaagttcaaa ggcagagtca
cgattaccgc ggacaaatcc acgagcacag cctacctgca gatgaacagc
ctgagatccg aggacacggc cgtgcactac tgtgcgagag ggagctacta
tgattacgac gggtttgttt actggggcca agggactctg gtcactgtga
gctcc ggagg atgtggcggt gga aaagtgg ccgcactgaa ggagaaagtt
gctgctttga aagagaaggt cgccgcactt aaggaaaagg tcgcagccct
gaaagag
hBRCA84D-2의 항-B7-H3 가변 도메인 및 항-TCR 가변 도메인을 갖는, B7-H3 및 자연적 킬러 그룹 2D (NKG2D 수용체에 대해 특이적인 이중 특이적 재표적화제 (DART™)를 구성하였다:
NKG2D VL x hBRCA84D VH-2-E 코일 DART™ 체인 (SEQ ID NO: 113):
QSALTQPASV SGSPGQSITI SCSGSSSNIG NNAVNWYQQL PGKAPKLLIY
YDDLLPSGVS DRFSGSKSGT SAFLAISGLQ SEDEADYYCA AWDDSLNGPV
FGGGTKLTVL GGGSGGGG EV QLVESGGGLV QPGGSLRLSC AASGFTFSSF
GMHWVRQAPG KGLEWVAYIS SDSSAIYYAD TVKGRFTISR DNAKNSLYLQ
MNSLRDEDTA VYYCGRGREN IYYGSRLDYW GQGTTVTVSS GGCGGG EVAA
LEKEVAALEKE VAALEKEVA ALEK
NKG2D VL x hBRCA84D VH-2-E 코일 DART™ 체인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 (SEQ ID NO: 114):
cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc
aatcaccatc tcctgttctg gaagcagctc caacatcgga aataatgctg
ttaactggta ccagcagctc ccaggaaagg ctcccaaact cctcatctat
tatgatgacc tactgccctc aggggtctct gaccgattct ctggctccaa
gtctggcacc tcagccttcc tggccatcag tgggctccag tctgaggatg
aggctgatta ttactgtgca gcatgggatg acagcctgaa tggtccagtg
ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta ggaggcggat ccggcggcgg
aggc gaggtg cagctggtcg agtctggcgg aggactggtg cagcctggcg
gctccctgag actgtcttgc gccgcctccg gcttcacctt ctccagcttc
ggcatgcact gggtccgcca ggctccaggc aagggactgg aatgggtggc
ctacatctcc tccgactcct ccgccatcta ctacgccgac accgtgaagg
gcaggttcac catctcccgg gacaacgcca agaactccct gtacctgcag
atgaactccc tgcgggacga ggacaccgcc gtgtactact gcggcagagg
ccgggagaat atctactacg gctcccggct ggattattgg ggccagggca
ccaccgtgac cgtgtcctcc ggaggatgtg gcggtgga ga agtggccgca
ctggagaaag aggttgctgc tttggagaag gaggtcgctg cacttgaaaa
ggaggtcgca gccctggaga aa
hBRCA84DVL-2 x NKG2D VH - K 코일 체인 (SEQ ID NO: 115):
DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCKASQNVD TNVAWYQQKP GKAPKALIYS
ASYRYSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YNNYPFTFGQ
GTKLEIKGGG SGGGGQVQLV ESGGGLVKPG GSLRLSCAAS GFTFSSYGMH
WVRQAPGKGL EWVAFIRYDG SNKYYADSVK GRFTISRDNS KNTLYLQMNS
LRAEDTAVYY CAKDRGLGDG TYFDYWGQGT TVTVSS GGCG GG KVAALKEK
VAALKEKVAA LKEKVAALKE
hBRCA84DVL-2 x NKG2D VH - K 코일 체인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 (SEQ ID NO: 116):
gacatccagc tgacccagtc cccctccttc ctgtctgcct ccgtgggcga
cagagtgacc atcacatgca aggcctccca gaacgtggac accaacgtgg
cctggtatca gcagaagcct ggcaaggccc ctaaggcgct gatctactcc
gcctcctacc ggtactccgg cgtgccttcc aggttctccg gctccggctc
tggcaccgac ttcaccctga ccatctccag cctgcagcct gaggacttcg
ccacctacta ctgccagcag tacaacaact accctttcac cttcggccag
ggcaccaagc tggaaatcaa g ggaggcgga tccggcggcg gaggc caggt
acagctggtg gagtctgggg gaggcctggt caagcctgga gggtccctga
gactctcctg tgcagcgtct ggattcacct tcagtagcta tggcatgcac
tgggtccgcc aggctccagg caaggggctg gagtgggtgg catttatacg
gtatgatgga agtaataaat actatgcaga ctccgtgaag ggccgattca
ccatctccag agacaattcc aagaacacgc tgtatctgca aatgaacagc
ctgagagctg aggacacggc tgtgtattac tgtgcgaaag atcgaggttt
gggggatgga acctactttg actactgggg ccaagggacc acggtcaccg
tctcctcc gg aggatgtggc ggtgga aaag tggccgcact gaaggagaaa
gttgctgctt tgaaagagaa ggtcgccgca cttaaggaaa aggtcgcagc
cctgaaagag
DART™의 암 세포의 이러한 재이동 살해를 매개하는 능력을 입증하기 위해, 상기 설명된 hBRCA84D-2/항-TCR DART™ ("T-DART™"), hBRCA84D-2, hBRCA84D-2 (Fc-변형된: L235V, F243L, R292P, Y300L, 및 P396L), 및 TCR-DART™ 대조군을 표적 암 세포 (SK-MES-1 폐 암 세포, A498 신장 암종 세포, LNCaP 전립선 암 세포, 또는 USAC-62 흑색종 세포)와 함께 배양하였고 PBMC 정지 효과기 (E: T 비율 = 30:1) 및 세포 독성을 결정하였다 (LDH 검정). 본 발명의 결과는 도 17a-17d에 나타나고 hBRCA84D-2/항-TCR DART™ ("T-DART™")의 암 세포의 재이동 살해를 매개하는 능력을 입증한다.
실시예 13
종양 없는 마우스의 약물동력학적 프로파일
항-B7-H3 항체 (Mab1)를 수컷 mCD16-/-, hCD16A_FOXN1 마우스로 주사하였고 (5 mg/kg; IV) 주사 2분, 15분, 30분, 및 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 및 1일, 2일, 3일, 6일, 8일, 14일, 21일, 및 28일 후 혈청을 검정하였다 (투여 전 및). 항체는 10.54일의 T½ 및 43.493 μg/ml의 Cmax를 갖는 것이 발견되었다. 시간이 지남에 따라 항체의 농도는 이상성이고 2-성분 모델에 맞춰지는 것이 발견되었다 (도 18a-18b). 5 mg/kg 투여량의 파라미터로 2-구획 모델을 사용하여 발생한, 예측된 약물동력학적 프로파일은 도 18c에 나타난다.
실시예 14
쥐 이종이식 모델에서 항-B7- H3 항체의 HT -1197 방광 암 세포와의 결합하고 종양 발달을 방지하거나 억제하는 능력
상기 설명된 항-B7-H3 항체 (Mab1)를 HT-1197, 사람 B7-H3-발현 방광 암종 세포주와의 결합하는 그것의 능력에 대해 평가하였다. 도 19에 나타난 바와 같이, 이러한 세포는 HER2보다 PRCA135의 더 큰 발현을 나타내고, 따라서 HT-1197 종양을 치료하는데 있어서 본 발명의 항체의 치료적 잠재력의 평가에 특히 적합하다. 이 결론에 따라, 항-B7-H3 항체 hBRCA84D 변이체는 HT-1197 세포와의 결합할 수 있다는 것이 발견되었다. 도 20은 HT-1197 세포에 대한 Mab1 항체의 결합 친화도를 나타낸다.
마우스 (mCD16-/-, hCD16A+_FoxN1)는 그들의 측면에 피하로 8 x 106 HT-1197 세포가 이식되었다. 종양 세포는 MATRIGELTM과 1:1로 희석된 200 μl의 Ham's F12 Medium으로 이식되었다. 이식 후 7일 내에 iv Q7D x5를 통해 0.1, 0.5, 1, 5, 또는 10 mg/kg의 투여 (투여 당 8마리의 암컷 마우스)를 사용하여 Mab1의 처치를 시작하였다. 세툭시맙 (항-EGRF 항체)를 1, 5, 또는 15 mg/kg의 농도로 마우스의 대조군에 투여하였다 (투여 당 8 마리의 암컷 마우스). 8마리의 암컷 마우스에 또한 비히클 또는 10 mg/kg IgG 대조군을 주사하였다. 종양 측정은 매 3-4일마다 이루어졌다. 실험의 결과 (도 21a)는 Mab1이 쥐 이종이식 모델에서 방광 종양 발달을 방지하거나 억제할 수 있다는 것을 나타낸다. 도 21b는 센티맙을 사용하여 얻은 결과를 나타낸다. 도 21a 및 21b의 비교는 본 발명의 항체가 쥐 이종이식 모델에서 방광 종양 발달을 방지하거나 억제하는데 있어서 센티맙보다 더 효과적이다는 것을 입증한다. 도 21c는 테스트된 최대 농도에서 얻은 결과를 비교한다.
실시예 15
쥐 이종이식 모델에서 항-B7- H3 항체의 HT -1376 방광 암 세포와의 결합하고 종양 발달을 방지하거나 억제하는 능력
상기 설명된 항-B7-H3 항체 (Mab1)를 HT-1376, 사람 B7-H3-발현 방광 암종 세포주와의 결합하는 그것의 능력에 대해 평가하였다. 도 22a-22b에 나타난 바와 같이, 이러한 세포는 HER2 또는 PMSA보다 PRCA135의 더 큰 발현을 나타내고, 따라서 HT-1376 종양을 치료하는데 있어서 본 발명의 항체의 치료적 잠재력의 평가에 특히 적합하다. 도 22a-22b는 HT-1197 세포에 대한 Mab1 항체의 결합 친화도를 나타낸다.
마우스 (mCD16-/-, hCD16A+_FoxN1)는 그들의 측면에 피하로 5 x 106 HT-1376 세포가 이식되었다. 종양 세포는 MATRIGELTM과 1:1로 희석된 200 μl의 Ham's F12 Medium으로 이식되었다. 이식 후 7일 내에 iv Q7D x4를 통해 1 mg/kg의 투여로 Mab1의 처치를 시작하였다. 실험의 결과 (도 23)는 Mab1이 쥐 이종이식 모델에서 방광 종양 발달을 방지하거나 억제할 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 16
항-B7- H3 의 암 세포와의 결합하는 능력
항-B7-H3 항체 BRCA84D를 FACS 분석을 통해 그것의 SW480 및 SW620 결장 암 세포; AGS 위 암 세포; M-14 및 LOX IMVI 흑색종 세포; 22rv 전립선 암 세포; AsPC-1 및 BxPc-3 췌장 암 세포; A498 및 786-0 신장 암 세포와의 결합하는 능력에 대해 평가하였다. 항체는 모든 이러한 세포와의 결합할 수 있는 것이 발견되었다.
실시예 17
쥐 이종이식 모델에서 항-B7- H3 항체의 능력은 위 종양 발달을 방지하거나 억제한다
마우스 (mCD16-/-, hCD16A+_FoxN1)는 그들의 측면에 피하로 5 x 106 AGS 세포가 이식되었다. 종양 세포는 MATRIGELTM과 1:1로 희석된 200 μl의 Ham's F12 Medium으로 이식되었다. 이식 후 7일 내에 iv Q7D x5를 통해 0.1, 0.5, 1, 5, 또는 10 mg/kg의 투여를 사용하여 Mab1의 처치를 시작하였다. 실험의 결과 (도 24)는 Mab1이 쥐 이종이식 모델에서 위 종양 발달을 방지하거나 억제할 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 18
쥐 이종이식 모델에서 항-B7- H3 항체의 폐 암 세포와의 결합하고 종양 발달을 방지하거나 억제하는 능력
A549 폐 암 세포를 hBRCA84D, chBRCA84D 및 hBRCA84 (0264 Fc) 변이체 존재시 배양하였고 이 항체들의 세포 독성 효과를 결정하였다. 이 실험의 결과는 도 25에 나타나고, 3개의 항체 모두는 A549 세포에 세포 독성이라는 것을 나타낸다.
마우스 (mCD16-/-, hCD16A+_FoxN1)는 그들의 측면에 피하로 8 x 106 A549 세포가 이식되었다. 종양 세포는 MATRIGELTM과 1:1로 희석된 200 μl의 Ham's F12 Medium으로 이식되었다. 이식 후 7일 내에 iv Q7D x4를 통해 1 mg/kg의 투여를 사용하여 Mab1의 처치를 시작하였다. 실험의 결과 (도 26)는 Mab1이 쥐 이종이식 모델에서 폐 종양 발달을 방지하거나 억제할 수 있다는 것을 나타낸다.
이러한 세포가 항-B7-H3 항체와의 결합하는지 결정하기 위해 CaLu3 폐 암 세포에서 FACS 분석을 수행하였다. 실험은 이러한 세포가 B7-H3을 발현하고 본 발명의 항체와의 결합한다는 것을 확인하였다. 본 발명의 항체가 폐 암 종양 발달을 방지하거나 억제하는데 효과적인지 결정하기 위해, 마우스 (mCD16-/-, hCD16A+_FoxN1)는 그들의 측면에 피하로 5 x 106 CaLu3 세포가 이식되었다. 종양 세포는 MATRIGELTM과 1:1로 희석된 200 μl의 Ham's F12 Medium으로 이식되었다. 이식 후 7일 내에 iv Q7D x4를 통해 0.5, 1 또는 5 mg/kg의 투여를 사용하여 Mab1의 처치를 시작하였다. 실험의 결과 (도 27)는 Mab1이 쥐 이종이식 모델에서 폐 암 종양 발달을 방지하거나 억제할 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 19
쥐 이종이식 모델에서 항-B7- H3 항체의 LOX 흑색종 종양 발달을 방지하거나 억제하는 능력
마우스 (8마리의 암컷 mCD16-/-, hCD16A+_FoxN1)는 그들의 측면에 피하로 LOX-IMVI 흑색종 암 세포가 이식되었고 PBS 대조군, IgG 대조군 (5 mg/kg), Mab1 (0.5, 1, 5 또는 10 mg/kg)과 함께 iv/Q7D x3, 또는 도세탁셀 (5, 10 또는 20 mg/kg)과 함께 ip/BIW x2를 접종하였다. 종양 세포는 MATRIGELTM과 1:1로 희석된 200 μl의 Ham's F12 Medium으로 이식되었다. 이식 후 7일 내에 Mab1의 처치를 시작하였다. 실험의 결과 (도 28a-28c)는 Mab1이 쥐 이종이식 모델에서 흑색종 암 종양 발달을 방지하거나 억제할 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 20
쥐 이종이식 모델에서 항-B7- H3 항체의 UACC -62 흑색종 종양 발달을 방지하거나 억제하는 능력
마우스 (8마리의 암컷 mCD16-/-, hCD16A+_FoxN1)는 그들의 측면에 피하로 UACC-62 흑색종 암 세포가 이식되었고 PBS 대조군, IgG 대조군 (5 mg/kg) 또는 Mab1 (0.5, 1, 5 또는 10 mg/kg)과 함께 iv/Q7D x5를 접종하였다. 종양 세포는 MATRIGELTM과 1:1로 희석된 200 μl의 Ham's F12 Medium으로 이식되었다. 이식 후 7일 내에 Mab1의 처치를 시작하였다. 실험의 결과 (도 29)는 Mab1이 쥐 이종이식 모델에서 흑색종 암 종양 발달을 방지하거나 억제할 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 21
쥐 이종이식 모델에서 항-B7- H3 항체의 22 rv 전립선 종양 발달을 방지하거나 억제하는 능력
마우스 (mCD16-/-, hCD16A+_FoxN1)는 그들의 측면에 피하로 6 x 106 22rv 전립선 암 세포가 이식되었고 PBS 대조군, IgG 대조군 (10 mg/kg), Mab1 (0.5, 1, 5 또는 10 mg/kg; Q7D x5) 또는 트라스투쥬맙 (1, 7 또는 15 mg/kg)과 함께 iv/Q7D x4를 접종하였다. 종양 세포는 MATRIGELTM과 1:1로 희석된 200 μl의 Ham's F12 Medium으로 이식되었다. 이식 후 7일 내에 Mab1의 처치를 시작하였다. 실험의 결과 (도 30a-30c)는 Mab1이 쥐 이종이식 모델에서 전립선 암 종양 발달을 방지하거나 억제할 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 22
쥐 이종이식 모델에서 항-B7- H3 항체의 신장 암 세포와의 결합하고 종양 발달을 방지하거나 억제하는 능력
A498 신장 암 세포를 hBRCA84D, chBRCA84D 및 hBRCA84 (0264 Fc) 변이체 존재시 배양하였고 이 항체들의 세포 독성 효과를 결정하였다. 이 실험의 결과는 도 31에 나타나고, 3개의 항체 모두는 A498 세포에 세포 독성이라는 것을 나타낸다.
A498 신장 암 세포를 hBRCA84D, chBRCA84D 및 hBRCA84 (0264 Fc) 변이체 존재시 배양하였고 이 항체들의 세포 독성 효과를 결정하였다. 이 실험의 결과는 도 31에 나타나고, 3개의 항체 모두는 A498 세포에 세포 독성이라는 것을 나타낸다.
A498 이종이식 종양 조직의 IHC 분석을 바이오티닐화된 BRCA84D 항체 (20 μg/ml), BRCA69D (5 μg/ml) 및 항-Her2 항체 (20 μg/ml)를 사용하여 수행하였다. BRCA84D 항체는 종양 조직의 20-40%와의 결합한다 (약하게 내지 중간으로: + 또는 ++)는 것이 발견되었다; BRCA69D는 BRCA69D는 80-100%의 종양 조직과의 결합한다 (중간으로 내지 강하게: ++ 또는 +++)는 것이 발견되었다. BRCA84D는 40%의 UMUC-3 종양 세포와 약하게 결합하는 것이 발견되었다 (+); BRCA69D는 70%의 UMUC-3 종양 세포와 중간으로 또는 강하게 결합하는 것이 발견되었다 (++ 또는 +++); 항-Her2 항체는 20%의 이러한 종양 조직과 다양하게 결합하는 것이 발견되었다 (+ - +++). 대조군으로서, 항-Her2 항체는 SKBR-3 세포와의 결합한다 (+++)는 것이 발견되었고 BRCA84D 및 BRCA69D는 Hs700T 세포와의 결합 (+++)할 수 있다는 것이 발견되었다.
마우스 (mCD16-/-, hCD16A+_FoxN1)는 그들의 측면에 피하로 5 x 106 A498 신장 암 세포가 이식되었다. 종양 세포는 MATRIGELTM과 1:1로 희석된 200 μl의 Ham's F12 Medium으로 이식되었다. 이식 후 7일 내에 iv Q7D x5를 통해 0.1, 0.5, 1, 5, 또는 10 mg/kg의 투여를 사용하여 Mab1의 처치를 시작하였다. 세툭시맙 (항-EGFR 항체)를 1, 7, 또는 15 mg/kg의 농도로 마우스 대조군에 투여하였다. 추가적인 대조군 마우스에 비히클 또는 10 mg/kg IgG 컨트롤을 주사하였다. 실험의 결과 (도 32)는 Mab1이 쥐 이종이식 모델에서 신장 암 종양 발달을 방지하거나 억제할 수 있다는 것을 나타낸다.
마우스 (mCD16-/-, hCD16A+_FoxN1)는 대안으로 그들의 측면에 피하로 5 x 106 786-0 신장 암 세포가 이식되었다. 종양 세포는 MATRIGELTM과 1:1로 희석된 200 μl의 Ham's F12 Medium으로 이식되었다. 이식 후 7일 내에 iv Q7D x5를 통해 0.1, 0.5, 1, 5, 또는 10 mg/kg의 투여를 사용하여 Mab1의 처치를 시작하였다. 세툭시맙 (항-EGFR 항체)를 1, 7, 또는 15 mg/kg의 농도로 마우스 대조군에 투여하였다. 추가적인 대조군 마우스에 비히클 또는 10 mg/kg IgG 컨트롤을 주사하였다. 실험의 결과 (도 33a-33b)는 Mab1이 쥐 이종이식 모델에서 신장 암 종양 발달을 방지하거나 억제할 수 있다는 것을 나타낸다.
Mab1의 활성을 암 화학치료에 사용된 유사분열 억제제인, 파클리탁셀의 그것과 비교하였다. 8마리 마우스 (mCD16-/-, hCD16A+_FoxN1)의 그룹은 그들의 측면에 ㅍ에 피하로786-0 신장 암 세포가 이식되었고 iv Q7D를 통해 0.1, 0.5, 1, 5, 또는 10 mg/kg의 Mab1을 제공하였다. 파클리탁셀을 2.5 mg/kg의 농도로 이러한 8마리 마리 마우스 대조군 그룹에 투여하였다. 추가적인 대조군 마우스 (그룹 당 7마리 암컷)에 비히클 또는 5 mg/kg IgG 컨트롤을 주사하였다. 실험의 결과 (도 34)는 Mab1이 쥐 이종이식 모델에서 신장 암 종양 발달을 방지하거나 억제할 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 23
게먹이 원숭이 독성학 연구
Mab1의 단일 투여 후 급성 독성학 프로파일을 평가하고, Mab1에 대한 약물동력학적 프로파일을 결정하고, 효과기 세포 활성과 연관된 세토킨의 유발에 대한 시간 대 투여량 관계를 설립하고, 순환하는 백혈구 (예를 들어, NK 및 T- 세포)의 레벨에서 약 처치의 효과를 평가하기 위해 게먹이 원숭이 독성학 연구를 수행하였다.
이러한 연구를 6마리의 원숭이 (3마리 수컷 및 3마리 암컷)의 4개의 그룹을 수반하고 처음의 처치부터 최종의 부검까지 7주를 연장하도록 조작할 수도 있다. 그룹 1은 주 1 및 2 동안 비히클만 받는 대조군 그룹을 포함한다. 그룹 1의 4 마리의 멤버 (2마리 수컷 및 2마리 암컷)을 주 3에 희생시킬 것이다. 그룹 1의 남은 멤버는 주 3에 추가적인 비히클을 받고 주 7에 부검을 위해 희생될 것이다. 그룹 2-4는 주 1에 비히클을 받고, 주 2에 B7-H3 항체 (1, 30, 또는 100 mg/kg, 각각)를 받는 실험군이다. 각 그룹의 4 마리 (2마리 수컷 및 2마리 암컷)를 주 3에 희생시킬 것이다. 각 그룹의 남은 멤버는 주 3에 추가적이니 비히클을 받고 주 7에 부검을 위해 희생될 것이다.
모든 투입은 잘 용납되고 치사 또는 체중의 큰 변화는 없고, 임상적 징후 또는 혈청 화학이 관찰되었다. 순환하는 NK 세포의 농도-의존적 감소는 관찰되지만 순환하는 B- 및 T- 세포에서는 아니다.
본 연구는 적합한 독성학적 종으로서 게먹이 원숭이의 확인을 제공한다. 정상 사람 조직과 접촉하면, 항체 BRCA84D는 간, 췌장, 결장, 폐 및 부신피질에서 다양한 정도의 염색 강도를 나타내었다. 간 염색은 상대적으로 혈관 표층 세포 (섬유모 세포 및 쿠퍼 세포)에 제한되었다. 췌장 염색은 콜라겐 섬유에서 및 낮은 퍼센트의 상피 (선방 세포 또는/및 사이 관 세포)에서 관찰되었다. 결장 염색은 점막의 소낭성 상피 및 섬유모 세포의 첨단막에서 상대적으로 제한되었다. 폐는 상피에서 아주 약한 및 군데군데 있는 염색을 나타내었다. BRCA84D는 사람 조직과 비교하여 게먹이 원숭이 조직에서 간 및 췌장에서 염색의 부족을 제외하고 좋은 교차-반응성, 및 게먹이 원숭이 뇌하수체 세포에서 B7-H3의 가능한 발현을 나타내었다.
각각의 개개 출판물 또는 특허 출원이 특이적으로 및 개별적으로 전문이 참고로 포함되는 것을 나타내면, 이 설명에 언급된 모든 출판물 및 특허는 참고와 같은 정도로 본원에 포함된다. 본 발명이 이들의 특이적 구체예와의 연결에 대해 설명하였지만, 추가적인 변형이 가능하고 이 출원은 일반적으로, 발명의 원칙에 따라, 본 발명이 허용하는 업계 내에 알려진 또는 관례적인 수행에서 온 바와 같이, 및 상기 본질적인 설명에 적용될 수도 있는 바와 같이, 본 개시의 이러한 출발을 포함하는, 발명의 변이체, 사용, 적용을 커버하려고 한다.
SEQUENCE LISTING <110> MacroGenics, Inc. Loo, Deryk Huang, Ling <120> Antibodies Reactive with B7-H3, Immunologically Active Fragments Thereof and Uses Thereof <130> 1301.0071I <150> US 61/311,057 <151> 2010-03-05 <150> US 61/310,695 <151> 2010-03-04 <150> US 61/310,692 <151> 2010-03-04 <160> 116 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 316 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Leu Arg Arg Arg Gly Ser Pro Gly Met Gly Val His Val Gly Ala 1 5 10 15 Ala Leu Gly Ala Leu Trp Phe Cys Leu Thr Gly Ala Leu Glu Val Gln 20 25 30 Val Pro Glu Asp Pro Val Val Ala Leu Val Gly Thr Asp Ala Thr Leu 35 40 45 Cys Cys Ser Phe Ser Pro Glu Pro Gly Phe Ser Leu Ala Gln Leu Asn 50 55 60 Leu Ile Trp Gln Leu Thr Asp Thr Lys Gln Leu Val His Ser Phe Ala 65 70 75 80 Glu Gly Gln Asp Gln Gly Ser Ala Tyr Ala Asn Arg Thr Ala Leu Phe 85 90 95 Pro Asp Leu Leu Ala Gln Gly Asn Ala Ser Leu Arg Leu Gln Arg Val 100 105 110 Arg Val Ala Asp Glu Gly Ser Phe Thr Cys Phe Val Ser Ile Arg Asp 115 120 125 Phe Gly Ser Ala Ala Val Ser Leu Gln Val Ala Ala Pro Tyr Ser Lys 130 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Polynucleotide Sequence Encoding BRCA84D Variable Light Chain CDR3 <400> 10 cagcaatata acaactatcc attcacg 27 <210> 11 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino Acid Sequence of BRCA84D Variable Heavy Chain <400> 11 Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Ser Ser Asp Ser Ser Ala Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Thr Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Gly Arg Gly Arg Glu Asn Ile Tyr Tyr Gly Ser Arg Leu Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 12 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide Sequence Encoding BRCA84D Variable Heavy Chain <400> 12 gatgtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgcagc ctggagggtc ccggaaactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctttggaa tgcactgggt tcgtcaggct 120 ccagagaagg ggctggagtg ggtcgcatac attagtagtg acagtagtgc catctactat 180 gcagacacag tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atcccaagaa caccctgttc 240 ctgcaaatga ccagtctaag gtctgaggac acggccatgt attactgtgg aagagggagg 300 gaaaacattt actacggtag taggcttgac tactggggcc aaggcaccac tctcacagtc 360 tcctca 366 <210> 13 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BRCA84D Variable Heavy Chain CDR1 <400> 13 Phe Gly Met His 1 <210> 14 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide Sequence Encoding BRCA84D Variable Heavy Chain CDR1 <400> 14 tttggaatgc ac 12 <210> 15 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BRCA84D Variable Heavy Chain CDR2 <400> 15 Tyr Ile Ser Ser Asp Ser Ser Ala Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Lys 1 5 10 15 <210> 16 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide Sequence Encoding BRCA84D Variable Heavy Chain CDR2 <400> 16 tacattagta gtgacagtag tgccatctac tatgcagaca cagtgaag 48 <210> 17 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BRCA84D Variable Heavy Chain CDR3 <400> 17 Gly Arg Glu Asn Ile Tyr Tyr Gly Ser Arg Leu Asp Tyr 1 5 10 <210> 18 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide Sequence Encoding BRCA84D Variable Heavy Chain CDR3 <400> 18 gggagggaaa acatttacta cggtagtagg cttgactac 39 <210> 19 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino Acid Sequence of BRCA69D Variable Light Chain <400> 19 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Asp Asn Leu Glu Gln 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys 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ctgcaaatgc gcagtctgaa gtctgaggac acagccatgt attactgtgc aagacatgac 300 gggggagcta tggactactg gggtcaagga acctcagtca ccgtctcctc a 351 <210> 45 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PRCA157 Variable Heavy Chain CDR1 <400> 45 Ser Tyr Gly Met Ser 1 5 <210> 46 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide Sequence Encoding PRCA157 Variable Heavy Chain CDR1 <400> 46 tcctatggca tgtct 15 <210> 47 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PRCA157 Variable Heavy Chain CDR2 <400> 47 Val Ala Thr Ile Asn Ser Gly Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser 1 5 10 15 Leu Lys Gly <210> 48 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide Sequence Encoding PRCA157 Variable Heavy Chain CDR2 <400> 48 gtcgcaacca ttaatagtgg tggaagtaac acctactatc cagacagttt gaagggg 57 <210> 49 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PRCA157 Variable Heavy Chain CDR3 <400> 49 His Asp Gly Gly Ala Met Asp Tyr 1 5 <210> 50 <211> 24 <212> DNA 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ctgtcagcaa tataacaact atccattcac gttcggctcg 300 gggacaaagt tggaaataaa acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 645 <210> 107 <211> 452 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chBRCA84D Heavy Chain <400> 107 Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Ser Ser Asp Ser Ser Ala Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Thr Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Gly Arg Gly Arg Glu Asn Ile Tyr Tyr Gly Ser Arg Leu Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 130 135 140 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 180 185 190 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 195 200 205 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser 210 215 220 Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 225 230 235 240 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 245 250 255 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 260 265 270 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 275 280 285 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 290 295 300 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 305 310 315 320 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 325 330 335 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 340 345 350 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val 355 360 365 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 370 375 380 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 385 390 395 400 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 405 410 415 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 420 425 430 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 435 440 445 Ser Pro Gly Lys 450 <210> 108 <211> 1359 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide Encoding chBRCA84D Heavy Chain <400> 108 gatgtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgcagc ctggagggtc ccggaaactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctttggaa tgcactgggt tcgtcaggct 120 ccagagaagg ggctggagtg ggtcgcatac attagtagtg acagtagtgc catctactat 180 gcagacacag tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atcccaagaa caccctgttc 240 ctgcaaatga ccagtctaag gtctgaggac acggccatgt attactgtgg aagagggagg 300 gaaaacattt actacggtag taggcttgac tactggggcc aaggcaccac tctcacagtc 360 tcctcagcct ccaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 420 tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 480 gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 540 tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc 600 cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagagagtt 660 gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 720 gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 780 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 840 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 900 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 960 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1020 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1080 gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1140 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1200 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 1260 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1320 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaatga 1359 <210> 109 <211> 270 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TCR VL x hBRCA84D VH-2-E Coil DART Chain <400> 109 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Thr Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly 100 105 110 Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro 115 120 125 Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 130 135 140 Ser Phe Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 145 150 155 160 Trp Val Ala Tyr Ile Ser Ser Asp Ser Ser Ala Ile Tyr Tyr Ala Asp 165 170 175 Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser 180 185 190 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr 195 200 205 Tyr Cys Gly Arg Gly Arg Glu Asn Ile Tyr Tyr Gly Ser Arg Leu Asp 210 215 220 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Cys Gly 225 230 235 240 Gly Gly Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys 245 250 255 Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys 260 265 270 <210> 110 <211> 810 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide Encoding TCR VL x hBRCA84D VH-2-E Coil DART Chain <400> 110 gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gtgccacctc aagtgtaagt tacatgcact ggtatcagca gaaaccaggg 120 aaagccccta agcgctggat ctatgacaca tccaaactgg cttctggggt cccatcaagg 180 ttcagcggca gtggatctgg gacagaattt actctcacaa tcagcagcct gcagcctgaa 240 gattttgcaa cttattactg tcagcagtgg agtagtaacc cgctcacgtt tggccagggg 300 accaagcttg agatcaaagg aggcggatcc ggcggcggag gcgaggtgca gctggtcgag 360 tctggcggag gactggtgca gcctggcggc tccctgagac tgtcttgcgc cgcctccggc 420 ttcaccttct ccagcttcgg catgcactgg gtccgccagg ctccaggcaa gggactggaa 480 tgggtggcct acatctcctc cgactcctcc gccatctact acgccgacac cgtgaagggc 540 aggttcacca tctcccggga caacgccaag aactccctgt acctgcagat gaactccctg 600 cgggacgagg acaccgccgt gtactactgc ggcagaggcc gggagaatat ctactacggc 660 tcccggctgg attattgggg ccagggcacc accgtgaccg tgtcctccgg aggatgtggc 720 ggtggagaag tggccgcact ggagaaagag gttgctgctt tggagaagga ggtcgctgca 780 cttgaaaagg aggtcgcagc cctggagaaa 810 <210> 111 <211> 269 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hBRCA84DVL-2 x TCR VH - K coil Chain <400> 111 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Asn 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Tyr Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 115 120 125 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe 130 135 140 Thr Ser Tyr Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 145 150 155 160 Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Val Thr Lys Tyr Asn 165 170 175 Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser 180 185 190 Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 195 200 205 His Tyr Cys Ala Arg Gly Ser Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Phe Val Tyr 210 215 220 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Cys Gly Gly 225 230 235 240 Gly Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys 245 250 255 Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu 260 265 <210> 112 <211> 807 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide Encoding hBRCA84DVL-2 x TCR VH - K coil Chain <400> 112 gacatccagc tgacccagtc cccctccttc ctgtctgcct ccgtgggcga cagagtgacc 60 atcacatgca aggcctccca gaacgtggac accaacgtgg cctggtatca gcagaagcct 120 ggcaaggccc ctaaggcgct gatctactcc gcctcctacc ggtactccgg cgtgccttcc 180 aggttctccg gctccggctc tggcaccgac ttcaccctga ccatctccag cctgcagcct 240 gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag tacaacaact accctttcac cttcggccag 300 ggcaccaagc tggaaatcaa gggaggcgga tccggcggcg gaggccaggt tcagctggtg 360 cagtctggag ctgaggtgaa gaagcctggg gcctcagtga aggtctcctg caaggccagc 420 ggttacaagt ttaccagcta cgtgatgcac tgggtgcgac aggcccctgg acaagggctt 480 gagtggatcg gatatattaa tccttacaat gatgttacta agtacaatga gaagttcaaa 540 ggcagagtca cgattaccgc ggacaaatcc acgagcacag cctacctgca gatgaacagc 600 ctgagatccg aggacacggc cgtgcactac tgtgcgagag ggagctacta tgattacgac 660 gggtttgttt actggggcca agggactctg gtcactgtga gctccggagg atgtggcggt 720 ggaaaagtgg ccgcactgaa ggagaaagtt gctgctttga aagagaaggt cgccgcactt 780 aaggaaaagg tcgcagccct gaaagag 807 <210> 113 <211> 274 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NKG2D VL x hBRCA84D VH-2-E Coil DART Chain <400> 113 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 20 25 30 Ala Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Tyr Asp Asp Leu Leu Pro Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Phe Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Asn Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly 100 105 110 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 130 135 140 Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 145 150 155 160 Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Tyr Ile Ser Ser Asp Ser Ser Ala Ile 165 170 175 Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn 180 185 190 Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp 195 200 205 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Arg Gly Arg Glu Asn Ile Tyr Tyr Gly 210 215 220 Ser Arg Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 225 230 235 240 Gly Gly Cys Gly Gly Gly Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala 245 250 255 Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu 260 265 270 Glu Lys <210> 114 <211> 822 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide Encoding NKG2D VL x hBRCA84D VH-2-E Coil DART Chain <400> 114 cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc aatcaccatc 60 tcctgttctg gaagcagctc caacatcgga aataatgctg ttaactggta ccagcagctc 120 ccaggaaagg ctcccaaact cctcatctat tatgatgacc tactgccctc aggggtctct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagccttcc tggccatcag tgggctccag 240 tctgaggatg aggctgatta ttactgtgca gcatgggatg acagcctgaa tggtccagtg 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta ggaggcggat ccggcggcgg aggcgaggtg 360 cagctggtcg agtctggcgg aggactggtg cagcctggcg gctccctgag actgtcttgc 420 gccgcctccg gcttcacctt ctccagcttc ggcatgcact gggtccgcca ggctccaggc 480 aagggactgg aatgggtggc ctacatctcc tccgactcct ccgccatcta ctacgccgac 540 accgtgaagg gcaggttcac catctcccgg gacaacgcca agaactccct gtacctgcag 600 atgaactccc tgcgggacga ggacaccgcc gtgtactact gcggcagagg ccgggagaat 660 atctactacg gctcccggct ggattattgg ggccagggca ccaccgtgac cgtgtcctcc 720 ggaggatgtg gcggtggaga agtggccgca ctggagaaag aggttgctgc tttggagaag 780 gaggtcgctg cacttgaaaa ggaggtcgca gccctggaga aa 822 <210> 115 <211> 270 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hBRCA84DVL-2 x NKG2D VH - K coil Chain <400> 115 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Asn 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Tyr Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys 115 120 125 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 130 135 140 Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 145 150 155 160 Glu Trp Val Ala Phe Ile Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala 165 170 175 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 180 185 190 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 195 200 205 Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Arg Gly Leu Gly Asp Gly Thr Tyr Phe Asp 210 215 220 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Cys Gly 225 230 235 240 Gly Gly Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu 245 250 255 Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu 260 265 270 <210> 116 <211> 810 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide Encoding hBRCA84DVL-2 x NKG2D VH - K coil Chain <400> 116 gacatccagc tgacccagtc cccctccttc ctgtctgcct ccgtgggcga cagagtgacc 60 atcacatgca aggcctccca gaacgtggac accaacgtgg cctggtatca gcagaagcct 120 ggcaaggccc ctaaggcgct gatctactcc gcctcctacc ggtactccgg cgtgccttcc 180 aggttctccg gctccggctc tggcaccgac ttcaccctga ccatctccag cctgcagcct 240 gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag tacaacaact accctttcac cttcggccag 300 ggcaccaagc tggaaatcaa gggaggcgga tccggcggcg gaggccaggt acagctggtg 360 gagtctgggg gaggcctggt caagcctgga gggtccctga gactctcctg tgcagcgtct 420 ggattcacct tcagtagcta tggcatgcac tgggtccgcc aggctccagg caaggggctg 480 gagtgggtgg catttatacg gtatgatgga agtaataaat actatgcaga ctccgtgaag 540 ggccgattca ccatctccag agacaattcc aagaacacgc tgtatctgca aatgaacagc 600 ctgagagctg aggacacggc tgtgtattac tgtgcgaaag atcgaggttt gggggatgga 660 acctactttg actactgggg ccaagggacc acggtcaccg tctcctccgg aggatgtggc 720 ggtggaaaag tggccgcact gaaggagaaa gttgctgctt tgaaagagaa ggtcgccgca 780 cttaaggaaa aggtcgcagc cctgaaagag 810

Claims (32)

  1. B7-H3의 세포 외 도메인과 특이적으로 결합하는 가변 도메인을 포함하고, BRCA69D, BRCA84D, 또는 PRCA157 중 하나와 상기 B7-H3와의 결합을 위해 경쟁하는, 분리된 항체 또는 이들의 면역 반응성 단편.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 항체 또는 단편은
    (A) BRCA69D의 경쇄의 CDR1 (SEQ ID NO: 21), CDR2 (SEQ ID NO: 23) 및 CDR3 (SEQ ID NO: 25) 및 BRCA69D의 중쇄의 CDR1 (SEQ ID NO: 29), CDR2 (SEQ ID NO: 31) 및 CDR3 (SEQ ID NO: 33);
    (B) BRCA84D의 경쇄의 CDR1 (SEQ ID NO: 5), CDR2 (SEQ ID NO: 7) 및 CDR3 (SEQ ID NO: 9) 및 BRCA84D의 중쇄의 CDR1 (SEQ ID NO: 13), CDR2 (SEQ ID NO: 15) 및 CDR3 (SEQ ID NO: 17); 또는
    (C) PRCA157의 경쇄의 CDR1 (SEQ ID NO: 37), CDR2 (SEQ ID NO: 39) 및 CDR3 (SEQ ID NO: 41) 및 PRCA157의 중쇄의 CDR1 (SEQ ID NO: 45), CDR2 (SEQ ID NO: 47) 및 CDR3 (SEQ ID NO: 49);
    를 포함하는 가변 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 단편 및 이들의 면역 반응성 단편.
  3. 제 1항 또는 제 2항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 암 세포의 표면상에 내인성으로 발현되는 B7-H3와의 결합하는 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또는 이들의 면역 반응성 단편.
  4. 제 1항 또는 제 2항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 암 세포의 표면상에 발현되는 B7-H3와의 결합시 내면화되는 B7-H3와의 결합하는 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또는 이들의 면역 반응성 단편.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 사람화된 단클론성 항체인 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또는 이들의 면역 반응성 단편.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 변이체 사람 IgG1 Fc 영역을 포함하는 변형된 항체이고, 상기 변이체 사람 IgG Fc 영역은 상기 항체의 모체의 Fc 영역과 관련된 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하고, 상기 아미노산 변형 (들)은 상기 변형된 항체가 상기 모체 항체에 비해 향상된 작용 기능을 나타내도록 FcγR과의 결합을 위해 상기 변이체 Fc 영역의 친화도 또는 결합성을 바꾸는 아미노산 변형 (들)을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 항체.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 Fc 영역 변형은:
    (A)
    (1) F243L;
    (2) D270E;
    (3) R292P;
    (4) S298N;
    (5) Y300L;
    (6) V305I;
    (7) A330V; 및
    (8) P396L;
    로 구성된 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 치환;
    (B)
    (1) F243L 및 P396L;
    (2) F243L 및 R292P; 및
    (3) R292P 및 V305I;
    로 구성된 그룹으로부터 선택되는 치환인 2개의 아미노산 잔기의 적어도 하나의 치환;
    (C)
    (1) F243L, R292P 및 Y300L;
    (2) F243L, R292P 및 V305I;
    (3) F243L, R292P 및 P396L; 및
    (4) R292P, V305I 및 P396L;
    로 구성된 그룹으로부터 선택되는 치환인 3개의 아미노산 잔기의 적어도 하나의 치환;
    (D)
    (1) F243L, R292P, Y300L 및 P396L; 및
    (2) F243L, R292P, V305I 및 P396L;
    로 구성된 그룹으로부터 선택되는 치환인 4개의 아미노산 잔기의 적어도 하나의 치환; 또는
    (E) 적어도 5개의 아미노산 잔기의 치환 F243L, R292P, Y300L, V305I 및 P396;
    을 포함하는 것을 특징으로 하는, 분리된 항체
  8. 제 7항에 있어서, 상기 항체는
    (A) F243L, R292P, 및 Y300L;
    (B) L235V, F243L, R292P, Y300L, 및 P396L; 또는
    (C) F243L, R292P, Y300L, V305I, 및 P396L;
    의 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는, 분리된 항체.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 항체는
    (A) BRCA84D의 경쇄의 CDR1 (SEQ ID NO: 5), CDR2 (SEQ ID NO: 7) 및 CDR3 (SEQ ID NO: 9) 및 BRCA84D의 중쇄의 CDR1 (SEQ ID NO: 13), CDR2 (SEQ ID NO: 15) 및 CDR3 (SEQ ID NO: 17)을 포함하는 가변 도메인; 및
    (B) 치환 L235V, F243L, R292P, Y300L, 및 P396L를 포함하는 Fc 영역 변형; 을 포함하는 것을 특징으로 하는, 분리된 항체.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 항체는 키메라 항체인 것을 특징으로 하는, 분리된 항체.
  11. 제 9항에 있어서, 상기 항체는 사람화된 항체인 것을 특징으로 하는, 분리된 항체.
  12. 제 1항에 있어서, 상기 항체는;
    (A) hBRCA84D-2 VL (SEQ ID NO: 89)의 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄;
    (B) hBRCA84D-2 VH (SEQ ID NO: 99)의 아미노산 서열을 갖는 가변 중쇄; 및
    (C) 치환 L235V, F243L, R292P, Y300L, 및 P396L을 갖는 Fc 영역;
    을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또는 이들의 면역 반응성 단편.
  13. B7-H3의 결합에 대해 항체: BRCA69D, BRCA84D, 또는 PRCA157 중 하나와 경쟁하는, B7-H3의 세포 외 도메인과 특이적으로 결합하는 단클론성 항체를 분비하는 하이브리도마.
  14. 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항의 분리된 항체를 암호화하거나, 또는 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 면역 반응성 단편을 암호화하는 핵산 분자.
  15. (A) B7-H3과의 결합에 대해 특이적인 면역글로불린 VL 에피토프 결합 도메인 및 B7-H3 이외의 분자와의 결합에 대해 특이적인 VH 에피토프 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드 사슬 I; 및
    (B) B7-H3과의 결합에 대해 특이적인 면역글로불린 VH 에피토프 결합 도메인 및 B7-H3 이외의 분자와의 결합에 대해 특이적인 VL 에피토프 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드 사슬 II;
    를 포함하는 이중 친화도 재표적화제 (DART™)로서, 상기 폴리펩티드 사슬 I 및 II는 B7-H3 및 B7-H3 이외의 분자와의 결합할 수 있는 기능적 에피토프 결합 도메인을 형성하기 위해 서로 결합된 이중 친화도 재표적화제 (DART™).
  16. 제 15항에 있어서, 상기 DART™에 의해 결합될 수도 있는 B7-H3 이외의 상기 분자는 헵텐인 것을 특징으로 하는 이중 친화도 재표적화제 (DART™).
  17. 제 16항에 있어서, 상기 헵텐은 플루오레세인 이소티오시안산염인 것을 특징으로 하는 이중 친화도 재표적화제 (DART™).
  18. 제 15항에 있어서, 상기 DART™에 의해 결합될 수도 있는 B7-H3 이외의 분자는 T- 세포 수용체 또는 NKG2D 수용체인 것을 특징으로 하는 이중 친화도 재표적화제 (DART™).
  19. 제 15항에 있어서, 상기 DART™에 의해 결합될 수도 있는, 상기 B7-H3 이외의 분자는 종양-연관된 항원인 것을 특징으로 하는 이중 친화도 재표적화제 (DART™).
  20. 제 19항에 있어서, 상기 종양-연관된 항원은 A33; ADAM-9; ALCAM; BAGE; 베타-카테닌; CA125; 카르복시펩티다제 M; CD103; CD19; CD20; CD22; CD23; CD25; CD27; CD28; CD36; CD40/CD154; CD45; CD46; CD5; CD56; CD79a/CD79b; CDK4; CEA; CTLA4; 시토케라틴 8; EGF-R; EphA2; ErbB1; ErbB3; ErbB4; GAGE-1; GAGE-2; GD2/GD3/GM2; gp1OO; HER-2/neu; 사람 파필로마바이러스-E6; 사람 파필로마바이러스-E7; 인테그린 알파-V-베타-6; JAM-3; KID3; KID31; KSA(17-1A); LUCA-2; MAGE-1; MAGE-3; MART; MUC-1; MUM-1; N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제; 온코스타틴 M; p15; PIPA; PSA; PSMA; ROR1; sTn; TNF-β 수용체; TNF-α 수용체; TNF-γ 수용체; 트랜스페린 수용체; 및 VEGF 수용체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 이중 친화도 재표적화제 (DART™).
  21. 제 15항 내지 제 20항 중 어느 한 항의 이중 친화도 재표적화제 (DART™)의 폴리펩티드 사슬을 암호화하는 핵산 분자.
  22. (i) 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항의 분리된 항체 또는 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 면역 반응성 단편 또는 제 15항 내지 제 20항 중 어느 한 항의 이중 친화도 재표적화제 (DART™)의 치료적으로 유효량 및 (ii) 약학적으로 수용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.
  23. 제 22항에 있어서, 상기 항체는;
    (A) BRCA84D의 경쇄의 CDR1 (SEQ ID NO: 5), CDR2 (SEQ ID NO: 7) 및 CDR3 (SEQ ID NO: 9) 및 BRCA84D의 중쇄의 CDR1 (SEQ ID NO: 13), CDR2 (SEQ ID NO: 15) 및 CDR3 (SEQ ID NO: 17)을 포함하는 가변 도메인; 및
    (B) 치환 L235V, F243L, R292P, Y300L, 및 P396L을 포함하는 Fc 영역 변형;
    을 포함하는 사람화된 항체인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  24. 제 22항에 있어서, 상기 항체는;
    (A) hBRCA84D-2 VL (SEQ ID NO: 89)의 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄;
    (B) hBRCA84D-2 VH (SEQ ID NO: 99)의 아미노산 서열을 갖는 가변 중쇄; 및
    (C) 치환 L235V, F243L, R292P, Y300L, 및 P396L을 갖는 Fc 영역;
    을 포함하는 사람화된 항체인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  25. 제 22항 내지 제 24항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 추가적인 항암제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  26. 제 22항 내지 제 24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 추가적인 항암제는 화학치료제, 방사성치료제, 호르몬치료제, 독소 또는 면역치료제인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  27. 제 22항 내지 제 24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 추가적인 항암제는 탁산, 마이탄시노이드, 아우리스타틴, 칼리키아미신, 안트라시클린, CC-1065 유사체, 도세탁셀, 카텝신, 리신, 젤로닌, 슈도모나스 외독소, 디프테리아 독소, RN아제, 및 유독성 방사성 동위원소인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  28. 분리된 항체, 면역 반응성 단편, 또는 DART™은 검출 가능하게 표지된, 암의 진단에서 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항의 분리된 항체 또는 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 면역 반응성 단편, 또는 제 15항 내지 제 20항 중 어느 한 항의 이중 친화도 재표적화제 (DART™)의 사용.
  29. 제 28항에 있어서, 상기 암은 부신 종양, AIDS-연관된 암, 꽈리 연부 육종, 성상 세포 종양, 방광 암, 뼈 암, 뇌척수암, 뇌전이암, 유방암, 경동맥 체 종양, 자궁경부암, 연골육종, 척색종, 혐색소형 신 세포암, 투명 세포암, 결장암, 결장암, 대장암, 양성 피부 섬유종, 결체조직 소원형 세포암, 상의 세포종, 유윙 종양, 골격 외 점색성 연골육종, 섬유 조직 형성 부전증, 뼈의 섬유성 이형성증, 담낭암 또는 담관암, 위암, 임신성 융모질환, 생식 세포 종양, 두경부암, 간암, 도 세포 종양, 카포시 육종, 신장암, 백혈병, 지방종/산후 지방종성 종양, 지방육종/악성 지방성 종양, 간암, 림프종, 폐암, 수모 세포종, 흑색종, 뇌수막종, 다발성 내분비 종양증, 다발성 골수종, 골수형성이상 증후군, 신경아 세포종, 신경계 내분비 종양, 난소암, 췌장암, 갑상선 유두암, 부갑상선 종양, 소아암, 말초신경초종양, 크롬친화 세포종, 뇌하수체 종양, 전립선암, 후포도막 흑색종, 희귀 적혈구 장애, 신장전이암, 횡문양 신장 종양, 횡문근육종, 육종, 피부암, 연부조직육종, 편평상피 세포암, 위암, 활막육종, 고환암, 흉선암, 흉선종, 갑상선전이암, 및 자궁암의 세포로 구성된 그룹으로부터 선택되는 암 세포의 존재에 의해 특성화되는 것을 특징으로 하는 사용.
  30. 환자의 암 치료를 위한 의약의 제조에서, 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항의 분리된 항체, 또는 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 면역 반응성 단편, 또는 제 15항 내지 제 20항 중 어느 한 항의 이중 친화도 재표적화제 (DART™), 또는 제 22항 내지 제 27항 중 어느 한 항의 약학적 조성물의 사용.
  31. 제 29항 또는 제 30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 부신 종양, AIDS-연관된 암, 꽈리 연부 육종, 성상 세포 종양, 방광 암, 뼈 암, 뇌척수암, 뇌전이암, 유방암, 경동맥 체 종양, 자궁경부암, 연골육종, 척색종, 혐색소형 신 세포암, 투명 세포암, 결장암, 결장암, 대장암, 양성 피부 섬유종, 결체조직 소원형 세포암, 상의 세포종, 유윙 종양, 골격 외 점색성 연골육종, 섬유 조직 형성 부전증, 뼈의 섬유성 이형성증, 담낭암 또는 담관암, 위암, 임신성 융모질환, 생식 세포 종양, 두경부암, 간암, 도 세포 종양, 카포시 육종, 신장암, 백혈병, 지방종/산후 지방종성 종양, 지방육종/악성 지방성 종양, 간암, 림프종, 폐암, 수모 세포종, 흑색종, 뇌수막종, 다발성 내분비 종양증, 다발성 골수종, 골수형성이상 증후군, 신경아 세포종, 신경계 내분비 종양, 난소암, 췌장암, 갑상선 유두암, 부갑상선 종양, 소아암, 말초신경초종양, 크롬친화 세포종, 뇌하수체 종양, 전립선암, 후포도막 흑색종, 희귀 적혈구 장애, 신장전이암, 횡문양 신장 종양, 횡문근육종, 육종, 피부암, 연부조직육종, 편평상피 세포암, 위암, 활막육종, 고환암, 흉선암, 흉선종, 갑상선전이암, 및 자궁암의 세포로 구성된 그룹으로부터 선택되는 암 세포의 존재에 의해 특성화되는 것을 특징으로 하는 사용.
  32. 제 29항 내지 제 31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 사용법은 화학치료, 면역치료, 방사성치료, 호르몬치료, 및 수술로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 추가적인 암 치료의 투여를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 사용.
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