JP2008515780A - 抗ＦｃγＲＩＩＢレセプター抗体およびその使用 - Google Patents

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Abstract

本出願は、選択的にヒトＦｃガンマＲＩＩＢに結合し、他のヒトＦｃガンマＲ類、例えばヒトＦｃガンマＲＩＩＡにはほとんど、または全く結合しない抗体を記載する。本発明はまた、ＦｃガンマＲＩＩＢに選択的に結合する抗体および活性化受容体に特異的に結合する第２の抗体を含む単離二重機能性抗体を提供する。抗腫瘍抗体と一緒の投与ならびに免疫応答を阻害する方法およびヒスタミン放出を抑制する方法を含む治療的使用を含むそれらの抗体に関する種々の使用法もまた記載する。

Description

本出願は、連邦法施行規則第３７巻１．５３（ｂ）（１）に基づいて出願された非仮特許出願であり、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、米国仮特許出願第６０／６０６，８５１号（２００５年９月２日出願）に対する優先権を主張し、この仮特許出願の内容全体は、本明細書中で参考として援用される。
（発明の分野）
本発明は、ヒトＦｃγＲＩＩＡよりもヒトＦｃγＲＩＩＢに優先的に結合する抗体、ならびにそれらの抗体に関する使用法に関する。
（発明の背景）
抗体は、抗原に結合し、抗原がその内在性標的（例えば、受容体またはリガンド）に結合することを防ぐことにより、または抗原除去に導くエフェクター応答を誘導することにより、抗原を中和する。身体にとって異物である抗原を効率的に除去し、および／または破壊するために、抗体は、その抗原に対する高親和性と効率的なエフェクター機能の双方を示す必要がある。多特異性を有する抗体（例えば二重特異性抗体など）は、複数の抗原の補完的または相乗的応答の媒介にとって有用である。
抗体のエフェクター機能は、抗体のＦｃ領域によって媒介される。エフェクター機能は、２つのカテゴリーに分けられる：（１）抗原への抗体結合後に働くエフェクター機能（これらの機能は、補体カスケードおよびＦｃ受容体（ＦｃＲ）所持細胞の関与を含む）；および（２）抗原結合と独立に働くエフェクター機能（これらの機能により、循環における抗体の存続、および経細胞輸送による細胞バリアを超えて移送される抗体能力が与えられている）。例えば、非特許文献１を参照されたい。抗体および抗体−抗原複合体と免疫系細胞との相互作用によって、例えば、抗体依存性細胞媒介細胞障害性（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞障害性（ＣＤＣ）などの応答が生じる（非特許文献２；非特許文献１；非特許文献３；および非特許文献４に概説されている）。
Ｆｃ受容体は、その受容体の同族抗体のＦｃ領域に結合することによって抗体エフェクター機能を媒介するため、ＦｃＲ類は、免疫グロブリンのイソタイプに対するそれらの特異性によって定義されており、例えば、ＩｇＧ抗体に特異的なＦｃ受容体はＦｃγＲと称され；ＩｇＥ抗体に特異的なＦｃ受容体はＦｃεＲと称され；ＩｇＡ抗体に特異的なＦｃ受容体はＦｃαＲと称される。
ＦｃγＲの３つのサブクラスは、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）と識別されている。各ＦｃγＲサブクラスは、二者択一的ＲＮＡスプライシングを受ける２つまたは３つの遺伝子によってコードされており、それによって、複数の転写体が導かれ、多様なＦｃγＲイソ体が存在することになる。ヒトＦｃγＲＩサブクラス（ＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩｂおよびＦｃγＲＩｃ）をコードする３つの遺伝子は、染色体１長アームの領域１ｑ２１．１に集合しており、ヒトＦｃγＲＩＩイソ体（ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂおよびＦｃγＲＩＩｃ）をコードする遺伝子は、領域１ｑ２３〜２４にあり；ヒトＦｃγＲＩＩＩ（ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦｃγＲＩＩＩｂ）をコードする２つの遺伝子は、領域１ｑ２２に集合している。ＦｃγＲＩＩＣは、ＦｃγＲＩＩＡとＦｃγＲＩＩＢとの間の不等遺伝子の交差から形成され、ＦｃγＲＩＩＢの細胞外領域およびＦｃγＲＩＩＡの細胞質領域からなる。
ＦｃγＲＩＩＡは、膜貫通受容体ＦｃγＲＩＩＡ１をコード化する。二者択一的ＲＮＡスプライシングによって、膜貫通領域を欠いたＦｃγＲＩＩＡ２が生じる。ＦｃγＲＩＩＡの対立遺伝子改変体により、ＩｇＧに結合する能力に違いのある高レスポンダー（ＨＲ）分子と低レスポンダー（ＬＲ）分子とが生じる。ＨＲおよびＬＲのＦｃγＲＩＩＡ分子は、２７位と１３１位に相当する２つのアミノ酸に違いがある。ＦｃγＲＩＩＢは、スプライス改変体ＦｃγＲＩＩＢ１、ＦｃγＲＩＩＢ２およびＦｃγＲＩＩＢ３をコード化する。ＦｃγＲＩＩＢ１とＦｃγＲＩＩＢ２とは、ＦｃγＲＩＩＢ１の細胞質ドメインにおける１９個のアミノ酸挿入が違っており；ＦｃγＲＩＩＢ３は、推定上のシグナルペプチダーゼ開裂部位に関する情報を欠いていること以外は、ＦｃγＲＩＩＢ２と同じである。
該受容体はまた、ＩｇＧに対するそれらの親和性によって識別されている。ＦｃγＲＩは、ＩｇＧに対する高親和性、Ｋａ＝１０８〜１０９Ｍ−１を示し（非特許文献５）、単量体ＩｇＧに結合できる。対照的に、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩは、単量体ＩｇＧには、比較的弱い親和性、Ｋａ≦１０７Ｍ−１をしめし（非特許文献５）、多量体の免疫複合体とのみ効率的に相互作用する。異なるＦｃγＲサブタイプは、異なる細胞型に発現する（非特許文献６に概説されている）。例えば、ＮＫ細胞には、ＦｃγＲＩＩＩＡのみが発現する。この受容体に対する抗体の結合により、ＮＫ細胞に典型的なＡＤＣＣ活性が導かれる。ヒトＦｃγＲＩＩＩＢは、好中球にのみ見られ、一方、ＦｃγＲＩＩＩＡは、マクロファージ、単球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、およびＴ細胞の亜集団に見られる。他方、単量体のＩｇＧに対して低親和性のＦｃγＲＩＩ受容体は、最も広く分布しているＦｃＲであり、通常、同じ細胞に同時発現する。ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２によってコードされる）は、Ｂ細胞、単球、顆粒球、肥満細胞、および血小板に強く発現するが、一部のＴ細胞は、該受容体を低レベルで発現する（非特許文献７；および非特許文献８）。例えば、ヒトＦｃγＲＩＩＢ受容体は、主にＢ細胞、骨髄細胞、および肥満細胞に分布している（非特許文献４）。
ＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＢイソ体は、極めて類似した細胞外ドメイン（およそ９２％のアミノ酸配列同一性）を含有するが、それらの細胞質領域が違っており、「活性化受容体」（ＦｃγＲＩＩＡ）と「抑制性受容体」（ＦｃγＲＩＩＢ）という機能的な違いに至る。ＦｃγＲＩ受容体およびＦｃγＲＩＩＩ受容体もまた、活性化受容体として働く。これらの活性化受容体は、細胞質ドメイン中に、１９のアミノ酸免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する。ＩＴＡＭ配列は、チロシンキナーゼのｓｒｃおよびｓｙｋファミリーの活性化を引き起こし、次いでこれが、Ｐ１３Ｋ、ＰＬＣγ、およびＴｅｃキナーゼなどの種々の細胞伝達物質を活性化する。これらの活性化ステップの最終的な結果として、、小胞体貯蔵物からの細胞内カルシウム放出を増加させ、キャパシタンス結合カルシウムチャネルを開き、そのことによって、持続的なカルシウム応答を生み出すこととなる。これらのカルシウム流は、顆粒内容物のエキソサイトーシス、食作用の促進、ＡＤＣＣ応答、および特異的核転写因子の活性化にとって重要である。
ＦｃγＲ類の活性化により媒介された細胞応答は、末梢寛容性の維持、活性化応答閾値の調節、最終的には、ＩｇＧ媒介エフェクター刺激の終結において、抑制性ＦｃγＲＩＩＢ受容体によって調節される（非特許文献９）。このような調節は、抗原−ＩｇＧ抗体免疫複合体を介した、活性化受容体と抑制性ＦｃγＲＩＩＢ受容体との交差結合によって開始される（例えば、非特許文献４を参照）。ＩＴＡＭ含有活性化受容体の交差結合により、ＦｃγＲＩＩＢ細胞質ドメイン中の１３個のアミノ酸免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ内のチロシンリン酸化がもたらされる。ＦｃγＲＩＩＢのこの「活性化」により、特異的ＳＨ２含有イノシトールポリホスフェート−５−ホスファターゼ（ＳＨＩＰ）の動員が開始される。ＳＨＩＰは、膜イノシトール脂質ＰＩＰ３の加水分解を触媒し、そのことによってＰＬＣγおよびＴｅｃキナーゼの活性化を防ぎ、キャパシタンス結合チャネルを通るカルシウム流入によって媒介された持続的カルシウム流を抑止する。ＦｃγＲＩＩＢは、ＩＴＡＭ含有活性化受容体を負に調節する（非特許文献１０）が、それはまた、ＲＴＫ媒介媒介細胞増殖の制御において、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）ｃ−ｋｉｔを負に調節することも示されている（非特許文献１１）。
ＦｃγＲＩＩ受容体に結合する抗体は、非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６；非特許文献１７；非特許文献１８；非特許文献１９；および２００４年２月２６日発行の特許文献１に記載されている。高親和性ＩｇＥＲ１受容体、ＦｃεＲＩは、例えばアレルギー反応時、ＩｇＥの結合の際の抗原誘導ヒスタミン放出に関するシグナル伝達を媒介する（非特許文献２０）。ＦｃγＲＩＩＢ受容体は、ＦｃγＲＩＩＢ ＩＴＩＭドメインを介して、ＦｃεＲＩと相互作用し、ＦｃεＲＩの活性を阻害することが示されている（非特許文献２１；非特許文献２２）；および非特許文献２３）。ヒトＦｃγＲＩＩＢに結合する抗体は、研究のためだけでなく、疾病の治療にＦｃγＲＩＩＢおよびＦｃεＲＩを操作するためにも必要とされている。
国際公開第２００４／０１６７５０号パンフレット ＷａｒｄおよびＧｈｅｔｉｅ、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９５年、第２巻、ｐ．７７−９４ Ｄａｅｒｏｎ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９７年、第１５巻、ｐ．２０３−２３４ Ｒａｖｅｔｃｈら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９１年、第９巻、ｐ．４５７−４９２ Ｒａｖｅｔｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０００年、第２９０巻、ｐ．８４−８９ Ｒａｖｅｔｃｈら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００１年、第１９巻、ｐ．２７５−２９０ Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｊ．Ｖ．ら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００１年、第９巻、ｐ．４５７−４９２ Ｍａｎｔｚｉｏｒｉｓ，Ｂ．Ｘ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９３年、第１５０巻、ｐ．５１７５−５１８４ Ｚｏｌａ，Ｈ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｇｕｌ．Ｈｏｍｅｏｓｔ．Ａｇｅｎｔｓ、２０００年、第１４巻、ｐ．３１１−３１６ Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｊ．Ｖ．ら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１年、第９巻、ｐ．２７５−２９０ Ｄａｅｒｏｎ，Ｍ．ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、１９９５年、第３巻、ｐ．６３５−６４６ Ｍａｌｂｅｃ，Ｏ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９９年、第１６２巻、ｐ．４４２４−４４２９ Ｌｏｏｎｅｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９８６年、第１３６巻、ｐ．１６４１−１６４７ Ｚｉｐｆら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９８３年、第１３１巻、ｐ．３０６４−３０７２ Ｐｕｌｆｏｒｄら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９８６年、第５７巻、ｐ．７１−７６ Ｇｒｅｅｎｍａｎら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９１年、第２８巻、ｐ．１２４３−１２５４ Ｉｅｒｉｎｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９３年、第１５０巻、ｐ．１７９４−１８０３ Ｗｅｉｎｒｉｃｈら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、１９９６年、第１５巻、ｐ．１０９−１１６ Ｓｏｎｄｅｒｍａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９９年、第３８巻、ｐ．８４６９−８４７７ Ｌｙｄｅｎ，Ｔ．Ｗ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００１年、第１６６巻、ｐ．３８８２−３８８９ ｖｏｎ Ｂｕｂｎｏｆｆ，Ｄ．ら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ ＆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ．、２００３年、第２８巻、第２号、ｐ．１８４−１８７ Ｄａｅｒｏｎ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１９９５年、第９５巻、ｐ．５７７−５８５ Ｍａｌｂｅｃ，Ｏ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９８年、第１６０巻、ｐ．１６４７−１６５８ Ｔａｍ，Ｓ．Ｗ．ら、Ａｌｌｅｒｇｙ、２００４年、第５９巻、ｐ．７７２−７８０
（発明の概要）
本発明は、ヒトＦｃγＲＩＩＢに選択的に結合する抗原結合ポリペプチドまたは抗体を提供する。本発明の抗原結合ポリペプチドまたは抗体は、ヒトＦｃγＲＩＩＢに、他のヒトＦｃγＲ類に結合するよりも有意に良好な親和性で結合し、いくつかの実施形態においては、ヒトＦｃγＲＩＩＡと本質的に交差反応できない。
いくつかの実施形態において、ヒトＦｃγＲＩＩＢに選択的に結合する本発明の抗原結合ポリペプチドまたは抗体は、少なくとも１つまたは複数のＣＤＲ（配列番号１、２、３、４、５、および６の抗体相補性決定領域を含んでなり、さらなる実施形態において、配列番号１、２、および３の重鎖ＣＤＲ、および／または配列番号４、５、および６の軽鎖ＣＤＲを含む。さらなる実施形態において、本発明の抗体は、配列番号１、２、３、４、５、および６の１つまたは複数のＣＤＲの改変体である１つまたは複数のＣＤＲを含んでなり、該改変体は、配列番号１、２、３、４、５、および６の１つまたは複数のＣＤＲと、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する。さらなる実施形態において、該改変体の抗原結合ポリペプチドまたは抗体は、ＦｃγＲＩＩＢに対する抗体５Ａ６の親和性よりも、およそ１０倍小さい親和性から、およそ少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍大きな親和性でＦｃγＲＩＩＢに結合するが、ヒトＦｃγＲＩＩＡと本質的に交差反応することはできないままである。さらなる実施形態において、本発明の抗原結合ポリペプチドまたは抗体は、配列番号７の重鎖可変ドメインおよび／または配列番号８の軽鎖可変ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、本発明の抗原結合ポリペプチドまたは抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体もしくはヒト化抗体、またはモノクローナル抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体の断片である。いくつかの実施形態において、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体もしくは多特異性抗体、またはそれらの断片などの本発明の抗原結合ポリペプチドまたは抗体は、ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−４６１４を有するハイブリドーマ細胞株から産生された抗体に由来する。
本発明の抗原結合ポリペプチドまたは抗体は、治療的抗体または化学療法剤によって処置される疾患または障害の治療方法において、治療的抗体または化学療法剤とともに投与される。
本発明は、上記のものなどの、ＦｃγＲＩＩＢに選択的に結合する抗体または抗原結合ポリペプチド、およびＦｃεＲＩなどの活性化受容体に特異的に結合する第２の抗体または抗原結合ポリペプチドを含む単離二重特異性抗体を提供する。
本発明の二重特異性抗体は、例えば、アレルギー、喘息、および炎症に関連した免疫応答阻害およびヒスタミン放出抑制の方法に有用である。本発明のいくつかの実施形態において、本発明の二重特異性抗体は、哺乳動物細胞におけるＦｃγＲＩＩＢ受容体と活性化受容体との共凝集による哺乳動物細胞中のＦｃγＲＩＩＢ受容体の活性化に有用である。いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞はヒト細胞であり、さらなる実施形態において、ヒト細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、肥満細胞、好塩基球、抗原提示細胞、マクロファージおよび／または単球である。全身ＩＴＩＭタンパク質媒介阻害を含む実施形態では、このような阻害は典型的に、Ｔ細胞、Ｂ細胞、肥満細胞、好塩基球、および抗原提示細胞に生じる。阻害が、ＦｃγＲＩＩＢに媒介される実施形態では、このような阻害は典型的に、肥満細胞、好塩基球、抗原提示細胞、単球、マクロファージ、およびＢ細胞に生じる。いくつかの実施形態において、本発明の二重特異性抗体は、ＦｃγＲＩＩＢ受容体の活性不活化、阻害または該受容体発現のダウンレギュレーションに有用である。ＦｃεＲＩが阻害またはダウンレギュレートされる実施形態では、この阻害またはダウンレギュレーションは典型的に、哺乳動物の肥満細胞、好塩基球、および抗原提示細胞に生じる。
一態様において、本発明は、薬学的キャリア中に、単離抗ｈｕＦｃγＲＩＩＢ／抗ｈｕＦｃεＲＩ二重特異性抗体を含む組成物を包含する。他の実施形態において、本発明は、単離抗ｈｕＦｃγＲＩＩＢ／抗ｈｕＦｃεＲＩ二重特異性抗体および単離抗ＩｇＥ抗体を含む組成物を包含する。組み合わせ組成物における抗ｈｕＦｃγＲＩＩＢ／抗ｈｕＦｃεＲＩ二重特異性抗体対抗ＩｇＥ抗体の有用な比率は、各患者に関して容易に決定される。この比率は、典型的に、およそ０．０１：１から１００：１の範囲内にある。該組成物の抗体は、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体であり得る。
他の態様において、本発明は、抗ｈｕＦｃγＲＩＩＢ／抗ｈｕＦｃεＲＩ二重特異性抗体を投与することにより哺乳動物における免疫障害を治療する治療的方法を包含する。一実施形態において、該哺乳動物は、アレルギー障害、喘息および／または炎症の治療を必要としているヒト患者などのヒト患者である。他の実施形態において、該治療方法はさらに、免疫障害、アレルギー、喘息を経験しているか、またはヒスタミン放出の抑制を必要としている哺乳動物に、本発明の抗ｈｕＦｃγＲＩＩＢ／抗ｈｕＦｃεＲＩ二重特異性抗体を投与することを含む。さらなる実施形態において、本発明の抗ｈｕＦｃγＲＩＩＢ／抗ｈｕＦｃεＲＩ二重特異性抗体は、抗ＩｇＥ抗体と組み合わせて投与され、該投与は、時間を離してなされるか、または連続的になされる。一実施形態において、抗ＩｇＥ抗体は、モノクローナル抗体である。さらなる一実施形態において、抗ＩｇＥ抗体は、Ｘｏｌａｉｒ（登録商標）である。さらなる一実施形態において、該二重特異性抗体は、進行中の免疫障害に対する治療的処置の一部として（例えば、同じ治療法の一部として）抗ＩｇＥ抗体と組み合わせて投与され、該二重特異性抗体は、抗ＩｇＥ抗体とは別に（同時ではなく）投与される。他の実施形態において、該二重特異性抗体と抗ＩｇＥ抗体とは同時に投与される。組み合わせ投与における抗ｈｕＦｃγＲＩＩＢ／抗ｈｕＦｃεＲＩ二重特異性抗体対抗ＩｇＥ抗体の有用な比率は（投与が別々の時間に行われても、同時に行われても）、各患者に関して容易に決定される。本発明の目的に関して、この比率は、およそ０．０１：１から１００：１および患者に対して決定されるその範囲内の任意の比率である。有用な比率は、例えば、０．０５：１、０．１：１、０．５：１、１：１、１：０．５、１：０．１、および１：０．０５であり得るが、標準的な臨床的方法によって決定され得る有用な比率を排除するものではない。
本発明はさらに、該抗体をコードする単離核酸、その核酸を含むベクターまたは宿主細胞、ならびに該宿主細胞の培養を含んでなり、および任意に、該宿主細胞培養物から（例えば、宿主細胞培地または宿主細胞培養培地から）該抗体を回収することをさらに含む抗体作製方法を提供する。
（詳細な説明）
Ｉ．定義
アレルギーとは、環境抗原に対する免疫応答が、組織の炎症および器官の機能障害を引き起こす一定の疾患を言う。アレルゲンは、アレルギーを引き起こす何らかの抗原である。したがって、それは、抗原性分子自体、または花粉粒、動物のふけ、昆虫毒、もしくは食品などの抗原分子源のいずれかであり得る。ＩｇＥは、アレルギー障害において中心的な役割を演じている。ＩｇＥ高親和性受容体（ＦｃεＲＩ）は、アレルギー性疾患の症状発現の多くを生み出す炎症伝達物質のさらなる放出を刺激する抗原性標的として働く肥満細胞および好塩基球上に位置している。
ＩｇＥに媒介された炎症は、肥満細胞上のＦｃεＲＩ受容体を占拠するＩｇＥ抗体に抗原が結合する際に生じる。この結合により、数分以内に肥満細胞の脱顆粒が生じ、一定の遂行伝達物質が放出する。引き続き、この脱顆粒細胞はさらなる伝達物質のデノボ合成および放出を開始する。結果に２つの段階がある。すなわち、血管、平滑筋、および腺分泌に及ぼす最初の即時的作用（即時的過敏症）、その２、３時間後に続く関係部位の細胞浸潤である。ＩｇＥ媒介炎症は、アトピー性アレルギー（枯草熱、喘息およびアトピー性皮膚炎など）、全身性アナフィラキシー反応およびアレルギー性じんま疹（蕁麻疹）の基礎をなす機構である。それは、急速な血管拡張、抗原接触部位への循環可溶性因子および細胞の進入促進を生じさせるため、通常、免疫防御の第一戦線としての役割を演じる。アレルギー性疾患の最も破壊的起因の多くは、化学遊走したロイコサイトの作用による。
用語の「抗体」と免疫グロブリンとは、最も広義において交換可能に用いられ、モノクローナル抗体（例えば、完全長または完全モノクローナル抗体）、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば、所望の生物学的活性を示す限りは、二重特異性抗体）を含み、また、例えば、抗体の断片であり得る抗原結合ポリペプチドなどの一定の抗体断片（本明細書により詳細に記載されている）もまた含み得る。一実施形態において、本発明の抗体および免疫グロブリンは、ジスルフィド結合を減少（より少なく）させた。一実施形態において、本発明の抗体および免疫グロブリンは、少なくとも１つのシステイン残基がジスルフィド結合を形成することを不能にされるヒンジ領域を含んでなり、該ジスルフィド結合は、好ましくは分子内にあり、好ましくは重鎖間にある。ヒンジ領域は、限定はしないが、システイン残基の欠失または他のアミノ酸によるシステインの置換など、当業界に公知の種々の好適な方法のいずれかによってジスルフィド結合形成不能にすることができ、それらのいくつかは、本明細書に記載されている。
抗体（免疫グロブリン）は、重鎖定常ドメインのアミノ酸配列に依り、種々のクラスに割り当てられている。免疫グロブリンは大きく５つのクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭが記載されている。これらをさらに、サブクラス（イソタイプ）、例えば、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＡ−１、ＩｇＡ２などに分けることができる。各免疫グロブリンクラスに対応する重鎖定常ドメインは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおびＩｇＭに関して、それぞれ、α、δ、ε、γおよびμと称される。免疫グロブリンの種々のクラスのサブユニット構造および三次元立体配置は十分に知られており、一般的に、例えば、Ａｂｂａｓら、２０００年、Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第４版に記載されている。抗体は、該抗体と、１つまたは複数の他のタンパク質またはペプチドとの共有または非共有結合により形成されたより大きな融合分子の一部であり得る。
用語の「完全長抗体」、「完全抗体」および「抗体全体」は、本明細書において交換可能に用いられ、その実質的に完全な形態にあり、以下に定義される抗体断片ではない抗体を言う。これらの用語は特に、Ｆｃ領域を含有する重鎖を有する抗体を言う。本発明の抗体改変体は完全長抗体であり得る。完全長抗体は、ヒト、ヒト化、キメラ、および／または親和性成熟であり得る。
「親和性成熟」抗体は、その１つまたは複数のＣＤＲに１つまたは複数の変化を有し、その結果、それらの変化を有しない親抗体に比較して、抗原に対する抗体の親和性が改善されるものである。好ましい親和性成熟抗体は、標的抗原に対して、ナノモルまたはさらにピコモルの親和性を有する。親和性成熟抗体は、公知の方法で作製される。例えば、可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）のドメインシャッフリングによる親和性成熟を記載しているＭａｒｋｓら、１９９２年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７７９−７８３頁を参照されたい。ＣＤＲおよび／またはフレームワーク残基のランダム変異誘発は、例えば、Ｂａｒｂａｓら、１９９４年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：３８０９−３８１３頁；Ｓｈｉｅｒら、１９９５年、Ｇｅｎｅ １６９：１４７−１５５頁；Ｙｅｌｔｏｎら、１９９５年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：１９９４−２００４頁；Ｊａｃｋｓｏｎら、１９９５年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４（７）：３３１０−９頁；およびＨａｗｋｉｎｓら、１９９２年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９−８９６頁に記載されている。
「アゴニスト抗体」は、受容体などの抗原に結合し、活性化する抗体である。一般に、アゴニスト抗体の受容体活性化能力は、該受容体の天然アゴニストリガンドのそれと、少なくとも質的に同様である（また本質的に量的に同様であり得る）。
「抗体断片」は、完全抗体の部分だけを含んでなり、その部分は、完全抗体に存在する場合に通常その部分に伴う機能の少なくとも１つを保持し、かつ、それらの多くまたは全てを保持し得る。本発明の抗体断片は、例えば、重鎖内ジスルフィド結合に通常は関与するヒンジシステインの少なくとも１つが本明細書に記載されているように変更されている、ジスルフィド結合能力の減少した重鎖の二量体化（または多量体化）を可能にする定常領域の十分な部分を含み得る。一実施形態において、抗体断片は、完全抗体の抗原結合部位または可変ドメインを含んでなり、したがって、抗原に結合する能力を保持している。他の実施形態において、抗体断片、例えば、Ｆｃ領域を含むものは、完全抗体に存在する場合にＦｃ領域に通常伴う、ＦｃＲｎ結合性、抗体半減期モジュレーション、ＡＤＣＣ機能、および／または補体結合性（例えば、該抗体がＡＤＣＣ機能または補体結合性に必要なグリコシル化プロフィルを有する場合）などの生物学的機能の少なくとも１つを保持する。抗体断片の例としては、線形抗体；単鎖抗体分子；および抗体断片から形成される多特異性抗体が挙げられる。
「抗体依存性細胞媒介細胞障害性」および「ＡＤＣＣ」とは、ＦｃＲ類を発現する非特異的細胞障害細胞（ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージ）が標的細胞上の結合抗体を認識し、引き続き、標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介反応を言う。ＡＤＣＣを媒介する主要細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、一方、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上のＦｃＲ発現は、Ｒａｖｒｔｃｈら、１９９１年、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−９２頁の４６４頁、表３にまとめられている。対象となっている分子のＡＤＣＣ活性を評価するためには、米国特許第５，５００，３６２号または第５，８２１，３３７号に記載されているようなインビトロＡＤＣＣアッセイが実施できる。このようなアッセイにとって有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。あるいは、または追加して、対象となっている分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓら、１９９８年、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９５：６５２−６５６頁に開示されているものなどの動物モデルにおいて評価できる。
「抗体免疫アドヘシンキメラ」は、抗体の少なくとも１つの結合ドメイン（本明細書に定義されている）と、少なくとも１つの免疫アドヘシン（本出願に定義されている）とを組み合わせている分子を含む。代表的な抗体−免疫アドヘシンキメラは、Ｂｅｒｇら、１９９１年、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８８：４７２３頁およびＣｈａｍｏｗら、１９９４年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：４２６８頁に記載されている二重特異性ＣＤ４−ＩｇＧキメラである。
本明細書で用いられる「自己免疫疾患」は、個体自身の組織から生じ、それに向けられた非悪性疾患である。本明細書に記載された自己免疫疾患では、特に、悪性もしくは癌性の疾患または病態が除外され、具体的に、Ｂ細胞リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、毛様細胞性白血病、および慢性骨髄芽球性白血病が除外される。自己免疫疾患または自己免疫障害の例としては、限定はしないが、乾癬や皮膚炎（例えばアトピー性皮膚炎）などの炎症性皮膚疾患；全身性強皮症および硬化症；炎症性腸疾患に関連する応答（クローン病や潰瘍性大腸炎など）；呼吸窮迫症候群（成人呼吸窮迫症候群：ＡＲＤＳなど）；髄膜炎；脳炎；ブドウ膜炎；大腸炎；腎炎；湿疹や喘息およびＴ細胞の浸潤に関与する他の病態ならびに慢性炎症性応答などのアレルギー性病態；アテローム硬化症；白血球接着不全；慢性関節リウマチ；全身性エリトマトーデス（ＳＬＥ）；真性糖尿病（例えば、Ｉ型真性糖尿病またはインスリン依存性真性糖尿病）；多発性硬化症；レーノー（Ｒｅｙｎａｕｄ’ｓ）症候群；自己免疫甲状腺炎；アレルギー性脳脊髄炎；シェーグレン（Ｓｊｏｒｇｅｎ’ｓ）症候群；若年発症糖尿病；ならびに、結核、サルコイドーシス、多発性筋炎、肉芽腫症および血管炎に典型的に見られるサイトカインおよびＴリンパ球によって媒介される急性および遅発性過敏症に関連する免疫応答；悪性貧血（アジソン病）；白血球漏出に関与する疾患；中枢神経系（ＣＮＳ）炎症性障害；多臓器障害症候群；溶血性貧血（限定はしないが、クリオグロビネミア（ｃｒｙｏｇｌｏｂｉｎｅｍｉａ）またはクームズ陽性貧血など）；筋無力症；抗原−抗体複合体媒介疾患；抗糸球体基底膜疾患；抗リン脂質症候群；アレルギー性神経炎；グレーブス病；ランバートイートン筋無力症候群；天疱瘡状水疱；天疱瘡；自己免疫多腺性内分泌障害；ライター病；スティッフマン症候群；ベーチェット病；巨細胞動脈炎；免疫複合体腎炎；ＩｇＡ腎症；ＩｇＭ多発性神経障害；免疫血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）；または自己免疫血小板減少症が挙げられる。
「生物学的に活性な」または「機能的な」免疫グロブリンは、構造的、調節的、生化学的または生物物理的事象において、天然活性の１つまたは複数を発揮することのできる免疫グロブリンである。例えば、生物学的に活性な抗体は、抗原に特異的に結合する能力を有することができ、その結合により、シグナル伝達または酵素活性などの細胞事象または分子事象を誘発または変更することができる。また、生物学的に活性な抗体は、受容体のリガンド活性化を阻害するか、またはアゴニスト抗体として作用することもできる。天然活性の１つまたは複数を発揮する抗体の能力は、ポリペプチド鎖の適切なフォールディングおよび組み立てなどのいくつかの因子に依存している。
「結合親和性」とは一般に、分子（例えば抗体）の単一結合部位とその結合相手（例えば抗原またはＦｃＲｎ受容体）との間の非共有的相互作用の合計の強さを言う。分子Ｘのその相手Ｙに対する親和性は、一般に、解離定数（Ｋｄ）によって表すことができる。親和性は、本明細書に記載されたものを含めて、当業界に公知の一般的方法によって測定することができる。低親和性抗体は、抗原（またはＦｃＲｎ受容体）に対する結合が弱く、解離し易い傾向があり、一方、高親和性抗体は、抗原（またはＦｃＲｎ受容体）に対する結合がより緊密で、より長く結合状態を保つ。
「阻害」抗体または「アンタゴニスト」抗体は、それが結合する抗原の生物活性を阻害するか、または減少させる抗体である。このような阻害は、任意の手段により、例えば、受容体へのリガンド結合、受容体複合体の形成、受容体複合体におけるチロシンキナーゼ受容体のチロシンキナーゼ活性および／または受容体におけるまたは受容体によるチロシンキナーゼ残基のリン酸化、を妨害することによって生じ得る。例えば、ＦｃγＲＩＩＢアンタゴニスト抗体は、ＦｃγＲＩＩＢに結合し、ＦｃγＲＩＩＢに結合するＩｇＧの能力を抑制し、そのことによって免疫エフェクター応答を抑制する。好ましい阻害抗体またはアンタゴニスト抗体は、抗原の生物活性を実質的に、または完全に抑制する。
用語の「癌」および「癌性」とは、哺乳動物における、無調節な細胞増殖を典型的に特徴とする生理学的病態を称するか、または記述する。癌の例としては、限定はしないが、癌腫、リンパ腫、芽球腫、肉腫、および白血病が挙げられる。このような癌のより具体的な例としては、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌、腹膜の癌、肝細胞癌、胃腸癌、膵臓癌、グリア芽細胞腫、子宮頚癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮体癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌、および種々のタイプの頭部ならびに頚部の癌が挙げられる。
用語の「キメラ」抗体とは、重鎖および／または軽鎖の一部が、ある特定の種に由来するか、または特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一であるか、もしくは相同であり、一方、該鎖の残部が、他の種に由来するか、または他の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一であるか、もしくは相同である抗体を言い、ならびに、所望の生物活性を示す限り、このような抗体の断片を言う（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、１９８４年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１−６８５５頁を参照）。
本明細書に用いられる語句の「細胞」、「細胞株」、および「細胞培養物」は交換可能に用いられ、このような呼称は全て、後代を含む。したがって、「形質転換体」および「形質転換細胞」という語は、移しの数に関係なく、第一次対象細胞およびそれに由来する培養物を含む。また、当然のことながら、故意の、または偶発的な変異のため、全ての後代が正確に同一でない可能性もある。もとの形質転換細胞においてスクリーンされたものと同じ機能または生物活性を有する変異後代が含まれる。異なる呼称が意図される場合は、文脈から明らかであろう。
語句の「制御配列」とは、作動可能に結合したコード配列の、特定の宿主生物における発現にとって必要なＤＮＡ配列を言う。原核生物にとって好適な制御配列としては、例えば、プロモーター、任意にオペレーター配列、およびリボソーム結合部位が挙げられる。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーを利用していることが知られている。
「障害」は、治療的抗体による治療から利益を得ると考えられる任意の病態である。これには、哺乳動物に問題の障害への素因を与える病態などの慢性および急性の障害または疾患が含まれる。一実施形態において、この障害は、癌または自己免疫疾患である。
「細胞外ドメイン」は、本明細書において、細胞の外部にあるＦｃＲなどの膜貫通ポリペプチドの領域と定義される。
用語の「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を記述するために用いられる。好ましいＦｃＲは、天然配列ヒトＦｃＲである。また、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（ガンマ受容体）に結合するものであり、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体を含み、これらの受容体の突然変異体、あるいはスプライスされた形体も含む。本明細書の「ＦｃＲ」には、将来同定されるものを含めて他のＦｃＲも包含される。この用語はまた、胎児への母親のＩｇＧ移行を担っている新生子受容体、ＦｃＲｎも含む（Ｇｕｙｅｒら、１９７６年、Ｊ．Ｉｍｕｎｏｌ．１１７−５８７頁およびＫｉｍら、１９９４年、Ｊ．Ｉｍｕｎｏｌ．２４：２４９頁を参照）。
用語の「Ｆｃ領域」は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域の定義に用いられる。「Ｆｃ領域」は、天然配列のＦｃ領域でも改変体のＦｃ領域でもよい。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変化し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、Ｃｙｓ２２６位、またはＰｒｏ２３０のアミノ酸残基から、そのカルボキシ末端までの延伸部と定義される。免疫グロブリンのＦｃ領域は、図１に示されるように、一般に、２つの定常ドメイン、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。「機能的Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域の「エフェクター機能」を有する。代表的な「エフェクター機能」としては、Ｃ１ｑ結合；補体依存性細胞障害性；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介細胞障害性（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体；ＢＣＲ）のダウンレギュレーションなどが挙げられる。このようなエフェクター機能には、一般に、Ｆｃ領域が結合ドメイン（例えば、抗体可変ドメイン）と組み合わされることが必要であり、例えば、本明細書に開示されているものなどの種々のアッセイを用いて評価できる。「天然配列Ｆｃ領域」は、天然で見られるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。天然配列ヒトＦｃ領域は、図３に示されており、天然配列ヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域（非ＡおよびＡアロタイプ）；天然配列ヒトＩｇＧ２Ｆｃ領域；天然配列ヒトＩｇＧ３Ｆｃ領域；および天然配列ヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域、ならびにそれらの天然改変体が挙げられる。「改変Ｆｃ領域」は、本明細書に定義された少なくとも１つの「アミノ酸修飾」の点で、天然配列Ｆｃ領域と異なるアミノ酸配列を含む。改変Ｆｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域、または親抗体のＦｃ領域に比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換を有し得、例えば、天然配列Ｆｃ領域、または親抗体のＦｃ領域に、約１つから約１０のアミノ酸置換、または約１つから約５つのアミノ酸置換を有し得る。改変Ｆｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域、および／または親抗体のＦｃ領域と、少なくともや８０％の同一性を有し得、それと少なくともや９０％の同一性を有し得るか、または少なくとも約９５％の同一性を有し得る。
用語の「ＦｃγＲＩＩＡ」は、別に指示されない限り、ヒトＦｃγＲＩＩａ遺伝子によってコードされるポリペプチドであるヒトＦｃγＲＩＩＡ（ｈｕＦｃγＲＩＩＡ）を言い、限定はしないが、ＦｃγＲＩＩＡ１およびＦｃγＲＩＩＡ２、ならびにそれらの対立形質改変体が挙げられる。ヒトＦｃγＲＩＩＡは、「活性化」ＦｃＲであり、その細胞質ドメイン内に、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する。最も好ましいヒトＦｃγＲＩＩＡは、配列番号９またはその高レスポンダー（ＨＲ）および低レスポンダー（ＬＲ）対立形質改変体などの、その対立形質改変体を含むヒトＦｃγＲＩＩＡ１である。
用語の「ＦｃγＲＩＩＢ」は、別に指示されない限り、ヒトＦｃγＲＩＩＢ遺伝子によってコードされるポリペプチドを言い、限定はしないが、ＦｃγＲＩＩＢ１およびＦｃγＲＩＩＢ２、ＦｃγＲＩＩＢ３ならびにそれらの対立形質改変体が挙げられる。好ましいＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメイン内に、免疫受容体チロシンベース抑制モチーフ（ＩＴＩＭ）を含有する「抑制性」ＦｃＲ受容体（Ｉ／Ｖ／ＬｘＹｘｘＬ／Ｖ）である（Ｓａｔｈｉｓｈら、２００１年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６、１７６３）。好ましいヒトＦｃγＲＩＩＢは、それぞれ配列番号１０または配列番号１１のアミノ酸配列を有するヒトＦｃγＲＩＩＢ２（ｈｕＦｃγＲＩＩＢ２）またはＦｃγＲＩＩＢ１（ｈｕＦｃγＲＩＩＢ１）、ならびにその対立形質改変体である。ＦｃγＲＩＩＢ１配列とＦｃγＲＩＩＢ２配列とは、ＦｃγＲＩＩＢ１の細胞質ドメイン内に、１９のアミノ酸配列、ＬＰＧＹＰＥＣＲＥＭＧＥＴＬＰＥＫＰＡ（配列番号２９）の挿入で、互いに異なっている。
本明細書に用いられる「ＦｃＲ依存性病態」としては、ＩＩ型炎症、ＩｇＥ媒介アレルギー、喘息、アナフィラキー、自己免疫疾患、ＩｇＧ媒介細胞毒作用、または発疹が挙げられる。
本明細書に用いられる「ヒンジ領域」およびその変型は、例えば、Ｊａｎｅｗａｙら、１９９９年、Ｉｍｍｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ社、ニューヨーク、第４版；Ｂｌｏｏｍら、１９９７年、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、６：４０７−４１５頁；Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓら、１９９７年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０９：１９３−２０２頁に示されている、当業界に公知の意味を含む。
「相同性」は、配列のアラインメントをし、最大の相同性パーセントを得るために、必要ならばギャップを導入した後の、アミノ酸配列改変体における同一な残基のパーセンテージとして定義される。アラインメントのための方法およびコンピュータプログラムは当業界に十分に知られている。そのようなコンピュータプログラムの１つは、１９９１年１２月１０日にＧｅｎｅｎｔｅｃｈ社により製作された「Ａｌｉｇｎ ２」であり、ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ Ｏｆｆｉｃｅ、ワシントンＤＣ ２０５５９に、利用者文書と共に保管されている。
本明細書に用いられる用語の「宿主細胞」（または「組換え宿主細胞」）とは、組換えプラスミドまたはベクターなどの外来ポリヌクレオチドの導入により、遺伝的に変化させたか、または遺伝的に変化させることができる細胞を言う。当然のことながら、このような用語により、特定の対象細胞だけではなく、このような細胞の後代も称されることが意図されている。突然変異または環境的影響によって、後続世代において一定の改変が生じ得るため、このような後代は、実際、親細胞と同一でない場合があるが、それでも、本明細書に用いられる「宿主細胞」という用語の範囲内に含まれる。
「ヒトエフェクター細胞」は、１つまたは複数のＦｃＲを発現し、エフェクター機能を発揮する白血球である。該細胞は、少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を発揮することが好ましい。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞障害性Ｔ細胞、および好中球が挙げられるが、ＰＢＭＣ類およびＮＫ細胞が好ましい。エフェクター細胞は、本明細書の記載されているとおり、天然源から、例えば、血液またはＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）から単離できる。
非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」形体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最少配列を含有するキメラ抗体である。多くの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域の残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の高頻度可変領域の残基によって置換されているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基が、対応する非ヒト残基によって置換されている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体に見られない残基を含み得る。これらの改変は、抗体の性能をさらに改良するためになされる。一般に、ヒト化抗体は、高頻度可変ループの全部または実質的に全部が、非ヒト免疫グロブリンのそれに相当し、ＦＲ領域の全部または実質的に全部が、ヒト免疫グロブリン配列のそれらである少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全部を含む。ヒト化抗体はまた、任意に、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的には、ヒト免疫グロブリンのそれを含む。さらなる詳細に関しては、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５頁（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２９頁（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６頁（１９９２）を参照されたい。
「ヒト抗体」は、ヒトによって産生された抗体のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有し、および／または本明細書に開示されたヒト抗体を作製するための方法のいずれかを用いて作製された抗体である。この定義により、具体的に、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体は除外される。
本明細書に用いられる用語の「高血糖障害」とは、Ｉ型およびＩＩ型糖尿病などのインスリン抵抗性から生じる糖尿病および障害、ならびに重篤なインスリン抵抗性、高インスリン血症、および高脂血症、例えば、肥満対象、およびメンデンホール症候群（Ｍｅｎｄｅｎｈａｌｌ’ｓ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ウェルナー症候群、妖精症、脂肪萎縮性糖尿病、および他の脂肪組織萎縮などのインスリン抵抗性糖尿病の全ての形態を言う。本明細書に開示された具体的な高血糖障害は、特に、Ｉ型およびＩＩ型糖尿病である。「糖尿病」自体は、インスリンの不十分な産生または利用に関係する炭水化物代謝の進行性疾患を言い、高血糖および糖尿を特徴とする。
本明細書に用いられる用語の「高頻度可変領域」とは、抗原結合を担っている抗体のアミノ酸残基を言う。高頻度可変領域は、配列アラインメントによって確定された「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」のアミノ酸残基、例えば、軽鎖可変領域の残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）、および８９〜９７（Ｌ３）ならびに重鎖可変領域における３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）および９５〜１０２（Ｈ３）；Ｋａｂａｔら、１９９１年、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、メリーラｍｍド州を参照、および／または構造的に確定された「高頻度可変ループ」（ＨＶＬ）の残基、例えば、軽鎖可変ドメインにおける残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）および９１〜９６（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメインにおける２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）および９６〜１０１（Ｈ３）；ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋｌ、１９８７年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７頁を参照、を含む。「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、本明細書で確定された高頻度可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
免疫疾患ならびに炎症性疾患としては：慢性関節リウマチ、骨関節炎、若年性慢性関節炎、脊椎関節症、全身性硬化症（強皮症）、特発性炎症性筋障害（皮膚筋炎）、全身性血管炎、サルコイドーシス、自己免疫溶血性貧血（免疫汎血球減少症、ＰＮＨ）、自己免疫血小板減少症（特発性血小板減少性紫斑病、免疫媒介血小板減少症）、甲状腺炎（グレーブ病、橋本甲状腺炎、若年性リンパ球甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎）、自己免疫炎症性疾患（例えば、アレルギー性脳脊髄炎、多発性硬化症、インスリン依存性真性糖尿病、自己免疫ブドウ膜網膜炎、甲状腺機能亢進症、自己免疫甲状腺疾患、悪性貧血、自己移植片拒絶、真性糖尿病、ならびに免疫媒介腎疾患（糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎）、多発性硬化症、特発性脱髄性多発神経障害またはギラン−バレ症候群などの中枢および末梢神経系の脱髄性疾患、ならびに慢性炎症性脱髄性多発神経障害；感染性肝炎（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ型肝炎ウィルスおよび他の非肝向性ウィルス）などの肝胆道疾患、自己免疫活動性慢性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、肉芽腫性肝炎、および硬化性胆管炎、グルテン性腸疾患、およびウィップル病；水疱性皮膚疾患、多形紅斑および接触皮膚炎、乾癬などの自己免疫または免疫媒介皮膚疾患；喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、春季結膜炎、湿疹、食物過敏症および蕁麻疹などのアレルギー性疾患；好酸性肺炎、特発性肺線維症、および過敏性間質性肺炎などの肺の免疫疾患；移植片拒絶および移植片対宿主疾患などの移植関連疾患が挙げられる。
本明細書に用いられる用語の「免疫アドヘシン」とは、異種「アドヘシン」タンパク質（例えば、受容体、リガンド、または酵素）の「結合ドメイン」と免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能とを組み合わせている抗体様分子を言う。構造的に、免疫アドヘシンは、抗原認識以外の所望の結合特異性および抗体（すなわち「異種」）の結合部位（抗原結合部位）を有するアドヘシンアミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合体を含む。免疫アドヘシンにおける免疫グロブリン定常ドメイン配列は、γ１、γ２、またはγ４重鎖に由来することが好ましい。これらの領域を含む免疫アドヘシンは、タンパク質Ａクロマトグラフィーによって精製できるからである。例えば、Ｌｉｎｄｍａｒｋら、１９８３年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３頁を参照されたい。
「単離」抗体は、その天然環境の成分から、同定され、分離され、および／または回収された抗体である。その天然環境の混入成分は、該抗体に関する診断的または治療的使用を妨害すると考えられる物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質溶質を含み得る。いくつかの実施形態において、該抗体は、（１）ローリー法によって測定して、抗体の９５重量％超に、最も好ましくは、９９重量％超に、（２）スピニングカップシークエネーターの使用により、Ｎ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得る上で十分な程度に、または（３）クーマシーブルーまたは好ましくは、銀染色を用いて、還元または非還元条件下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均一性に、精製される。単離抗体には、該抗体の天然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイチュー抗体が含まれる。しかし、通常、単離抗体は、少なくとも１つの精製段階によって調製される。
「単離」核酸分子は、該抗体核酸の天然源に通常結合している少なくとも１つの混入核酸分子から、同定され、分離されている核酸分子である。単離核酸は、天然に見られる形態または設定以外においてある。したがって、単離核酸は、天然細胞に存在する核酸分子から区別される。しかし、単離核酸分子には、例えば、核酸分子が天然細胞の染色体位置とは異なる染色体位置にある抗体を、通常、発現する細胞内に含有される核酸分子が含まれる。
用語の「哺乳動物」としては、ヒト、ウシ、ウマ、イヌ、およびネコなどの、哺乳動物として分類されている任意の動物が挙げられる。本発明の一実施形態において、哺乳動物はヒトである。
本明細書に用いられる用語の「モノクローナル抗体」とは、天然に生じる可能性のある、微量に存在し得る突然変異を除いて実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体、すなわち、同一な集団を含む個々の抗体を言う。モノクローナル抗体は、高特異性であり、単一の抗原性部位に特異的である。また、典型的には、種々の決定基（エピトープ）に特異的な種々の抗体を含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に特異的である。修飾因子「モノクローナル」は、該抗体の特徴が、実質的に均一な抗体集団から得られており、何らかの特定の方法による抗体の作製が必要とは考えられていないことを示している。例えば、本発明により使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら、１９７５年、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製できるか、または組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照）によって作製できる。また、「モノクローナル抗体」は、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、１９９１年、Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８頁およびＭａｒｋｓら、１９９１年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７頁に記載された方法を用いて、ファージ抗体ライブラリーから単離できる。
本明細書におけるモノクローナル抗体には、具体的に、重鎖および／または軽鎖の一部が、ある特定の種に由来するか、または特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一であるか、もしくは相同であり、一方、該鎖の残部が、他の種に由来するか、または他の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一であるか、もしくは相同である「キメラ」抗体、ならびに、所望の生物活性を示す限り、このような抗体の断片が含まれる（米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、１９８４年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１−６８５５頁）。
本明細書で用いられる核酸は、他の核酸配列と機能的な関係に置かれている場合、「作動可能に結合されている」。例えば、シグナルペプチドまたは分泌リーダーに関するＤＮＡが、抗体の分泌に関与する前タンパク質として発現される場合、抗体のＤＮＡに作動可能に結合されているか；プロモーターまたはエンハンサーが、該配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に結合されているか；またはリボソーム結合部位が、翻訳を促進するために置かれている場合、それは、コード配列に作動可能に結合されている。一般に、「作動可能に結合されている」という意味は、結合されているＤＮＡが近接しており、分泌リーダーの場合は、近接しており、かつリーディング段階にあるということである。しかし、エンハンサーは、近接している必要がないと考えられる。結合は、都合のよい制限部位における結合によって達成される。このような部位が存在しない場合は、従来の方法にしたがって、合成オリゴヌクレオチドのアダプターまたはリンカーが用いられる。
本明細書の目的に関して、「薬学的組成物」は、哺乳動物、特にヒトへの投与に適合させていて、好適なものである。したがって該組成物は、哺乳動物における疾患または障害を治療するために使用することができる。さらに、その治療的使用を妨害する可能性のある混入物が、それから分離したことになるように、該組成物中の該タンパク質は、１つまたは複数の精製工程または単離工程に供された。一般に、薬学的組成物は、治療的タンパク質および薬学的に許容できるキャリアまたは希釈剤を含む。該組成物は、通常、滅菌してあり、凍結乾燥状態であり得る。薬学的処方物は、下記により詳細に記載されている。
本明細書において交換可能に用いられる「ポリヌクレオチド」または「核酸」とは、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを言い、ＤＮＡおよびＲＮＡが含まれる。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドまたは塩基、および／またはそれらの類縁体、または、ＤＮＡポリメラーゼもしくはＲＮＡポリメラーゼにより、または合成反応により、ポリマーに組み込むことができる任意の基質であり得る。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびそれらの類縁体などの修飾ヌクレオチドを含み得る。ヌクレオチド構造に対する修飾が存在する場合、それが行われるのは、ポリマー組み立ての前でも後でもよい。ヌクレオチドの配列には、非ヌクレオチド成分による割り込みがあり得る。ポリヌクレオチドは、合成後に、標識との結合などによってさらに修飾できる。他のタイプの修飾としては、例えば、「キャップ」、類縁体による天然ヌクレオチドの１つまたは複数の置換、例えば、非電荷結合によるもの（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメートなど）、および電荷結合によるもの（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）、例えば、タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、トキシン、抗体、シグナルペプチド、プライＬリジンなど）などのペンダント部分を含有するもの、割り込み記号を有するもの（例えば、アクリジン、ソラレンなど）、キレーターを含有するもの（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化的金属など）、アルキレーターを含有するもの、修飾結合を有するもの（例えば、アルファアノマー核酸など）などのヌクレオチド間修飾、ならびにポリヌクレオチドの未修飾形態が挙げられる。通常、糖に存在するヒドロキシル基のいずれかが、例えば、ホスホネート基、ホスフェート基によって置換できるか、標準的保護基によって保護できるか、もしくは活性化して、さらなるヌクレオチドへのさらなる結合を調製できるか、または、固体または半固体の支持体に結合できる。５’端および３’端ＯＨは、リン酸化できるか、１から２０の炭素原子のアミンまたは有機キャッピング基部分によって置換できる。他のヒドロキシルもまた、標準的な保護基へと誘導体化できる。ポリヌクレオチドはまた、例えば、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−アリル、２’−フルオロまたは２’−アジドリボース、炭素環式糖類縁体、アルファアノマー糖、アラビノース、キシロースまたはリキソースなどのエピマー糖、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類縁体、およびメチルリボシドなどのアベイシックヌクレオシド類縁体など、当業界で一パン的に知られているリボースまたはデオキシリボース糖の類縁体も含有できる。１つまたは複数のホスホジエステル結合を、代替の結合基によって置換できる。これらの代替結合基としては、限定はしないが、各ＲまたはＲ’が独立してＨまたは置換または非置換アルキル（１〜２０Ｃ）であるＰ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）Ｒ’、ＣＯまたはＣＨ２（「ホルムアセタール」）によって置換されている実施形態が挙げられる。ポリヌクレオチド中の全ての結合が同一である必要はない。前述の事項は、ＲＮＡおよびＤＮＡを含む、本明細書に挙げられた全てのポリヌクレオチドに当てはまる。
本明細書に用いられる「オリゴヌクレオチド」とは、一般的に、短い、一般に一本鎖、一般に語でポリヌクレオチドであり、これらは一般に、約２００ヌクレオチド長未満であるが、必ずしもそうであるとは限らない。用語の「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」は互いに排他的ではない。ポリヌクレオチドに関する前述の事項は、オリゴヌクレオチドにも等しく、完全に当てはめることができる。
「分泌シグナル配列」または「シグナル配列」とは、細胞膜、通常は、原核生物の内膜または内膜および外膜を通して、新たに合成された対象タンパク質を方向づけるために使用できる短いシグナルペプチドをコードする核酸配列を言う。したがって、免疫グロブリンの軽鎖または重鎖ポリペプチドなどの対象タンパク質は、原核細胞宿主細胞の細胞膜周辺内に、または培養培地中に分泌される。分泌シグナル配列によってコードされるシグナルペプチドは、宿主細胞にとって内因性であってもよいし、発現されるポリペプチドに固有のシグナルペプチドを含めて、外因性であってもよい。分泌シグナル配列は、典型的には、発現されるポリペプチドのアミノ末端に存在し、典型的には、生合成と、細胞質からの該ポリペプチド分泌との間に、酵素的に除去される。したがって、シグナルペプチドは、成熟タンパク質産物内には、通常存在しない。
用語の「受容体結合ドメイン」は、受容体に対する、細胞接着分子などの任意の天然リガンド、または対応する天然リガンドの少なくとも質的受容体結合能力を保持している天然リガンドの任意の領域または誘導体を称するために用いられる。この定義は、とりわけ、前述の受容体に対するリガンドの結合配列を特に含む。
本明細書に用いられる「治療的抗体」は、ある疾患または障害に罹っているか、または罹り易くなっている哺乳動物における該疾患または障害の治療に有効な抗体である。代表的な治療的抗体としては、本発明の５Ａ６抗ＦｃγＲＩＩＢ抗体および本発明の二重特異性抗ＦｃγＲＩＩＢ／抗ＦｃεＲＩ抗体、ならびに、ｒｈｕＭＡｂ ４Ｄ５（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））（Ｃａｒｔｅｒら、１９９２年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：４２８５−４２８９頁、米国特許第５，７２５，８５６号９；米国特許第５，７３６，１３７号におけるキメラ抗ＣＤ２０「Ｃ２Ｂ８」（ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標））、米国特許第５，７２１，１０８Ｂ１号における２Ｈ７抗体のキメラ改変体またはヒト化改変体またはトシツモマブ（ＢＥＸＸＡＲ（登録商標））；抗ＩＬ−８（Ｓｔ Ｊｏｈｎら、１９９３年、Ｃｈｅｓｔ １０３：９３２頁、および国際公開第９５／２３８６５号）；ヒト化抗ＶＥＧＦ抗体ｈｕＡ４．６．１ ＡＶＡＳＴＩＮ（商標）（Ｋｉｍら、１９９２年、Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ７：５３−６４頁、１９９８年１０月１５日発行の国際公開第９６／３００４６号、および第９８／４５３３１号）などのヒト化および／または親和性成熟抗ＶＥＧＦ抗体などの抗ＶＥＧＦ抗体；抗ＰＳＣＡ抗体（国際公開第０１／４０３０９号）；Ｓ２Ｃ６およびそのヒト化改変体（国際公開第００／７５３４８号）などの抗ＣＤ４０抗体；抗ＣＤ１１ａ（米国特許第５，６２２，７００号、国際公開第９８／２３７６１号、Ｓｔｅｐｐｅら、１９９１年、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｉｎｔｌ．４：３−７頁、およびＨｏｕｒｍａｎｔら、１９９４年、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｉｏｎ ５８：３７７−３８０頁）；抗ＩｇＥ（Ｐｒｅｓｔａら、１９９３年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３−２６３２頁、および国際公開第９５／１９１８１号）；抗ＣＤ１８（１９９７年４月２２日発行の米国特許第５，６２２，７００号、または１９９７年７月３１日発行の国際公開第９７／２６９１２号）；抗ＩｇＥ（１９９８年２月３日発行の米国特許第５，７１４，３３８号，または１９９２年２月２５日発行の米国特許第５，０９１，３１３号、１９９３年３月４日発行の国際公開第９３／０４１７３号、または１９９８年６月３０日出願の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９８／１３４１０号、米国特許第５，７１４，３３８号）；抗Ａｐｏ−２受容体抗体（１９９８年１１月１９日発行の国際公開第９８／５１７９３号）；ｃＡ２（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標））、ＣＤＰ５７１およびＭＡＫ−１９５などの抗ＴＮＦ−α抗体（１９９７年９月３０日発行の米国特許第５，６７２，３４７号，Ｌｏｒｅｎｚら、１９９６年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６（４）：１６４６−１６５３頁、およびＤｈａｉｎａｕｔら、１９９５年、Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．２３（９）：１４６１−１４６９頁を参照）；抗組織因子（ＴＦ）（１９９４年１１月９日付与の欧州特許第０ ４２０ ９３７ Ｂ１号）；抗ヒトα４〜β７インテグリン（１９９８年２月１９日発行の国際公開第９８／０６２４８号）；抗ＥＧＦＲ（１９９６年１２月１９日発行の国際公開第９６／４０２１０号におけるキメラ化またはヒト化２２５抗体）ＯＫＴ３などの抗ＣＤ３抗体（１９８５年５月７日発行の米国特許第４，５１５，８９３号）；ＣＨＩ−６２１（ＳＩＭＵＬＥＣＴ（登録商標））および（ＺＥＮＡＰＡＸ（登録商標））などの抗ＣＤ２５または抗ｔａｃ抗体（１９９７年１２月２日発行の米国特許第５，６９３，７６２号を参照）；ｃＭ−７４１２抗体などの抗ＣＤ４抗体（Ｃｈｏｙら、１９９６年、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ３９（１）：５２−５６頁）；ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈなどの抗ＣＤ５２抗体（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８年、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３３７頁）；Ｇｒａｚｉａｎｏら、１９９５年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５（１０）：４９９６−５００２頁におけるような、ＦｃγＲＩに特異的なＭ２２抗体などの抗Ｆｃ受容体抗体；ｈＭＮ−１４などの抗癌胎児性抗原（ＣＥＡ）抗体（Ｓｈａｒｋｅｙら、１９９５年、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５（２３ Ｓｕｐｐｌ）：５９３５ｓ−５９４５ｓ）；ｈｕＢｒＥ−３、ｈｕ−Ｍｃ３およびＣＨＬ６などの乳房上皮細胞に特異的な抗体（Ｃｅｒｉａｎｉら、１９９５年、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５（２３）：５８５２ｓ−５８５６ｓ；およびＲｉｃｈｍａｎら、１９９５年、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５（２３ Ｓｕｐｐ）：５９１６ｓ−５９２０ｓ）；Ｃ２４２などの大腸癌細胞に結合する抗体（Ｌｉｔｔｏｎら、１９９６年、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６（１）：１−９頁）；抗ＣＤ３８抗体、例えば、ＡＴ １３／５（Ｅｌｌｉｓら、１９９５年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５（２）：９２５−９３７頁）；Ｈｕ Ｍ１９５などの抗ＣＤ３３抗体（Ｊｕｒｃｉｃら、１９９５年、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５５（２３ Ｓｕｐｐｌ）：５９０８ｓ−５９１０ｓおよびＣＭＡ−６７６またはＣＤＰ７７１；ＬＬ２またはＬｙｍｐｈｏＣｉｄｅなどの抗ＣＤ２２抗体（Ｊｕｗｅｉｄら、１９９５年、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５５（２３ Ｓｕｐｐｌ）：５８９９ｓ−５９０７ｓ；１７−１Ａなどの抗ＥｐＣＡＭ抗体（ＰＡＮＯＲＥＸ（登録商標））；アブシキシマブまたはｃ７Ｅ３ Ｆａｂ（ＲＥＯＰＲＯ（登録商標））などの抗ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体；ＭＥＤＩ−４９３（ＳＹＮＡＧＩＳ（登録商標））などの抗ＲＳＶ抗体；ＰＲＯＴＯＶＩＲ（登録商標）などの抗ＣＭＶ抗体；ＰＲＯ５４２などの抗ＨＩＶ抗体；抗Ｈｅｐ Ｂ抗体ＯＳＴＡＶＩＲ（登録商標）などの抗肝炎抗体；抗ＣＡ １２５抗体ＯｖａＲｅｘ；抗イディオタイプＧＤ３エピトープ抗体ＢＥＣ２；抗αｖβ３抗体ＶＩＴＡＸＩＮ（登録商標）；ｃｈ−Ｇ２５０などの抗ヒト腎臓細胞癌抗体；ＩＮＧ−１；抗ヒト１７−１Ａ抗体（３６２２Ｗ９４）；抗ヒト結腸直腸腫瘍抗体（Ａ３３）；ＧＤ３ガングリオシドに特異的な抗ヒト黒色腫抗体Ｒ２４；抗ヒト扁平上皮細胞癌（ＳＦ−２５）；およびＳｍａｒｔ ＩＤ１０および抗ＨＬＡ ＤＲ抗体Ｏｎｃｏｌｙｍ（Ｌｙｍ−１）などの抗ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）抗体などの抗体が挙げられる。
用語の「治療的有効量」とは、対象または哺乳動物における疾患または障害を「軽減する」または「治療する」上で有効な本発明の組成物の量を言う。一実施形態において、治療すべき免疫疾患がＢ細胞媒介疾患である場合、治療的有効量は、哺乳動物におけるＢ細胞数の減少（Ｂ細胞減損）をもたらす量である。
「治療」とは、対象または哺乳動物における疾患または障害の「治療」にとって、または「治療する」上で有効な本発明の使用を言う。一般に、疾患または障害の治療は、該疾患または障害に関連した１つまたは複数の症状または医療的問題を減少させることを含む。いくつかの実施形態において、本発明の抗体および組成物は、対象または哺乳動物における疾患または障害の発現または再発を防ぐために使用できる。例えば、自己免疫疾患に罹っている対象において、本発明の抗体を、突発を防ぐか、または治療するために使用できる。連続的な治療もしくは投与とは、治療において１日以上の間隔を空けない、少なくとも毎日ベースの治療を言う。間欠的な治療もしくは投与、または間欠的様式における治療または投与とは、連続的ではなく、実際、周期的な治療を言う。本明細書における治療法は、連続的であっても間欠的であってもよい。
本明細書に用いられる「改変体」または「変化した」重鎖とは、ジスルフィド結合能力が減少した、例えば、少なくとも１つのシステイン残基をジスルフィド結合形成不能にさせた重鎖を一般に言う。前記少なくとも１つのシステインは、重鎖のヒンジ領域にあることが好ましい。
本明細書に用いられる用語の「ベクター」は、それが結合した他の核酸分子を輸送することができる核酸分子を称することが意図されている。ベクターの１つのタイプは、追加ＤＮＡのセグメントが結合できる環状の二本鎖ＤＮＡループである「プラスミド」である。ベクターの他のタイプは、ファージベクターである。ベクターの他のタイプは、追加ＤＮＡセグメントがウィルスのゲノムに結合できるウィルスベクターである。一定のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自律複製できる（例えば、細菌の複製起点およびエピソーム哺乳動物ベクターを有する細菌ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞導入時に、宿主細胞のゲノムに組み込むことができ、そのことによって、宿主のゲノムと共に複製される。さらに、一定のベクターは、それらが作動可能に結合した遺伝子の発現を指示することができる。このようなベクターは、本明細書において、「組換え発現ベクター」（または単に、「組換えベクター」）と称される。一般に、組換えＤＮＡ法において利用される発現ベクターは、プラスミドの形態にあることが多い。プラスミドがベクターの最も一般的な使用形態であるため、本明細書において、「プラスミド」と「ベクター」は交換可能に使用できる。
「ヒトＦｃγＲＩＩＢに選択的に結合する」抗体は、他のヒトＦｃγＲ類に対する結合よりも有意に良好な親和性で、ヒトＦｃγＲＩＩＢに結合する。いくつかの実施形態において、ヒトＦｃγＲＩＩＢに選択的に結合する抗体は、ＦｃγＲＩＩＢ１とＦｃγＲＩＩＢ２の双方に結合し、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩおよびＦｃγＲＩＩＩ、ならびにそれらの対立形質改変体に対する結合はほとんど示さないか、または全く示さない。相対的結合性および／または結合親和性は、限定はしないが、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）および蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）などの、当業界に認められた種々の方法で実証できる。一般に、これは、本発明の抗体が、ＥＬＩＳＡで測定した場合、ＦｃγＲＩＩＡに結合するよりも、少なくとも約１ログ高濃度の反応性でＦｃγＲＩＩＢに結合することを意味する。ヒトＦｃγＲＩＩＡよりもヒトＦｃγＲＩＩＢに選択的に結合する抗体は、ヒトＦｃγＲＩＩＡと本質的に交差反応できないことが好ましい。
本明細書に用いられる「ヒトＦｃγＲＩＩＢと本質的に交差反応できない」抗体は、ヒトＦｃγＲＩＩＡに対する結合の程度が、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析または放射免疫沈降アッセイ（ＲＩＡ）によって判定した時、ヒトＦｃγＲＩＩＢ結合のレベルの１０％未満、あるいはヒトＦｃγＲＩＩＢに対する結合に比較して、ヒトＦｃγＲＩＩＡに対して、８％未満、あるいは６％未満、あるいは４％未満、あるいは２％未満、あるいは１％未満の結合性である抗体である。
本明細書に用いられる「ヒトＦｃγＲＩＩＢに対するＦｃ領域の結合に拮抗する」抗体は、ヒトＦｃγＲＩＩＢに対するＦｃ領域（例えば、ＩｇＧなどの抗体のＦｃ領域、または免疫アドヘシン、または他のＦｃ含有構築体）の結合を阻害または妨害する。このような拮抗活性は、例えばＥＬＩＳＡによって判定できる。
ＩＩ．本発明を実施する様式
Ａ．抗ＦｃγＲＩＩＢ抗体の作製
（ｉ）ＦｃγＲＩＩＢ抗原
任意に他の分子に結合させた可溶性ヒトＦｃγＲＩＩＢまたはその断片を、抗体作製のための免疫原として使用できる。免疫原の例としては、キャリアタンパク質またはＧＳＴまたはＨｉｓ６などの親和性タグを有するＦｃγＲＩＩＢ１またはＦｃγＲＩＩＢ２の細胞外ドメインを含む融合タンパク質が挙げられる。あるいは、またはそれに追加して、ヒトＦｃγＲＩＩＢを発現する細胞を免疫原として使用できる。このような細胞は、天然源から誘導できるか、またはヒトＦｃγＲＩＩＢを発現させるために組換え法によって形質転換させた細胞であり得る。抗体の調製に有用なヒトＦｃγＲＩＩＢの他の形態は当業者に明らかであろう。
（ｉｉ）ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、関連抗原およびアジュバントの複数回皮下（ｓｃ）または腹腔内（ｉｐ）注射により、動物内で増加させることが好ましい。二機能性試剤または誘導体化試剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介した結合）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を介して）、グルタールアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、またはＲとＲ１が異なるアルキル基であるＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲを用いて、免疫化される種における免疫原性のタンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、または大豆トリプシン阻害剤に、関連抗原を結合させることが有用であり得る。
例えば、１００μｇまたは５μｇのタンパク質または複合体（それぞれウサギまたはマウスに）と、３容量のフロインドアジュバントとを組み合わせ、その溶液を複数部位に皮内注射することによって、抗原、免疫複合体、または誘導体に対して、動物を免疫化する。およそ１ヵ月後、フロインド完全アジュバント中、元の量の１／５から１／１０のペプチドまたは複合体を複数部位に皮下注射することによって、該動物に増強を行う。７日から１４日後、該動物から採血し、血清を抗体滴定に関してアッセイする。滴定プラトーまで、動物に増強を行う。動物は、同じ抗原の複合体によって増強することが好ましいが、異なるタンパク質と結合させ、および／または異なる交差結合剤によっても増強が行われる。複合体はまた、タンパク質融合体として、組換え細胞培養においても作製できる。また、免疫応答を高めるために、ミョウバンなどの凝集剤が好適に使用される。
（ｉｉｉ）モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら、１９７５年、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５頁に最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製できるか、または組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号参照）によって作製できる。
ハイブリドーマ法においては、マウス、またはハムスターもしくはマカクザルなどの他の適切な宿主動物を、本明細書に上記されたとおり免疫化し、免疫化に用いられたタンパク質に特異的に結合する抗体を産生するか、または産生する能力のあるリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球をインビトロで免疫化できる。次いで、ポリエチレングリコールなどの好適な融合剤を用いて、リンパ球を骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ、１９８６年、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、５９−１０３頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ））。
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親骨髄細胞の増殖または生存を阻害する１つまたは複数の物質を好ましくは含有する好適な培養培地中に播種し増殖させる。例えば、親骨髄細胞が酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠失している場合、ハイブリドーマ用の培養培地は、典型的に、ＨＧＰＲＴ欠失細胞の増殖を防ぐ物質である、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン（ＨＡＴ培地）を含む。
好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞によって抗体の安定な高レベル産生を支持し、ＨＡＴ培地などの培地に感受性であるものである。これらの中でも好ましい骨髄腫細胞株は、ｔｈｅ Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ、サンジエゴ、カリフォルニア州、ＵＳＡから入手できるＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍に由来するもの、およびＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ロックビル、メリーランド州、ＵＳＡから入手できるＳＰ−２またはＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞などのマウス骨髄腫系である。ヒトモノクローナル抗体産生のために、ヒト骨髄腫およびマウス−ヒト異種骨髄腫細胞株もまた記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ、１９８４年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３３：３００１頁；Ｂｒｏｄｅｕｒら、１９８７年、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、５１−６３頁（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ社、ニュウヨーク））。
ハイブリドーマ細胞が増殖している培養培地を、該抗原に特異的なモノクローナル抗体の産生に関してアッセイする。ハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降によって、または放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）もしくは酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などのインビトロ結合アッセイによって判定する。
所望の特異性、親和性、および／または活性の抗体を産生するハイブリドーマを確認したら、希釈法を制限することによってクローンをサブクローン化でき、標準的方法によって増殖させる（Ｇｏｄｉｎｇ、上記）。この目的に好適な細胞培地としては、例えば、Ｄ−ＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。また、ハイブリドーマ細胞は動物における腹水腫瘍として、インビボで増殖できる。
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えば、タンパク質Ａ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製法によって、培養培地、腹水、または血清から好適に分離される。
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常法を用いて（例えば、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いて）、容易に単離され、配列決定される。ハイブリドーマ細胞はこのようなＤＮＡの好ましい供給源として働く。ＤＮＡを単離したら、発現ベクター内に入れることができ、次いでこれを、他の場合には免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞などの宿主細胞内にトランスフェクトする。抗体の組換え製造は、下記でより詳細に記載する。
さらなる実施形態において、抗体または抗体断片は、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、１９９０年、Ｎａｔｕｒｅ、３４８：５５２−５５４頁に記載されている方法を用いて作出された抗体ファージライブラリーから単離できる。Ｃｌａｃｋｓｏｎら、１９９１年、Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４−６２８頁、およびＭａｒｋｓら、１９９１年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７頁は、ファージライブラリーを用いて、それぞれマウスおよびヒトの抗体の単離を記載している。引き続く刊行物では、鎖シャッフリングによる高親和性（ｎＭ範囲）ヒト抗体の作製（Ｍａｒｋｓら、１９９２年、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９−７８３頁）、ならびに極めて大規模なファージライブラリーを構築する戦略として、組み合わせ感染およびインビボ組換え（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、１９９３年、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ。Ｒｅｓ．２１：２２６５−２２６６頁）が記載されている。したがってこれらの方法を、モノクローナル抗体の単離に関する従来のモノクローナル抗体ハイブリドーマ法の代わりに実施できる。
またＤＮＡは、例えば、ヒト重鎖および軽鎖定常ドメインに関するコード配列を、相同なマウス配列の代わりに置換することによって（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８４年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１頁）、または免疫グロブリン配列を、非免疫グロブリン材料（例えば蛋白質ドメイン）に関するコード配列の全部または一部と共有結合させることによって改変することもできる。
典型的に、このような非免疫グロブリン材料を、抗体の定常ドメインの代わりに置換するか、または抗体の抗原結合部位の可変ドメインの代わりに置換して、ある抗原に対して特異性を有するある抗原結合部位および異なる抗原に対して特異性を有する他の抗原結合部位を含むキメラ二価抗体が創製される。
（ｉｖ）ヒト化抗体およびヒト抗体
ヒト化抗体は、非ヒトである出所源からの１つまたは複数のアミノ酸残基を有する。非ヒトアミノ酸残基は、しばしば「インポート」残基と称され、典型的には、「インポート」可変ドメインから取られる。ヒト化は一般に、齧歯類の１つまたは複数のＣＤＲ配列を、ヒト抗体の対応する配列の代わりに置換することにより、一般に、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者の方法（Ｊｏｎｅｓら、１９８６年、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５頁；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８年、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２７頁；Ｖｒｈｏｅｙｅｎら、１９８８年、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６頁）にしたがって、実施できる。したがって、このような「ヒト化」抗体は、実質的に完全ヒト可変ドメイン未満が、非ヒト種の対応する配列によって置換されているキメラ抗体である（米国特許第４，８１６，５６７号）。実際、ヒト化抗体は、典型的に、いくつかのＣＤＲ残基、および可能性として、いくつかのＦＲ残基が、非ヒト、例えば、齧歯類抗体における類似部位の残基によって置換されているヒト抗体である。
ヒト化抗体の作製に使用される軽重双方のヒト可変ドメインの選択は、抗原性を減少させる上で極めて重要である。いわゆる「最良適合」法により、齧歯類抗体可変ドメインの配列を、公知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーンする。次いで、齧歯類の配列に最も近いヒト配列が、ヒト化抗体のためのヒトフレームワーク（ＦＲ）として受け入れられる（Ｓｉｍｓら、１９８７年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６頁；Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８７年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１頁）。他の方法では、軽鎖または重鎖の特定の亜群の全てのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワークが用いられる。いくつかの異なるヒト化抗体に、同じフレームワークを使用できる（Ｃａｒｔｅｒら、１９９２年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：４２８５頁；Ｐｒｅｓｔａら、１９９３年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３頁）。
さらに、抗体が、抗原に対する高親和性および他の有利な生物学的性質を保持したままヒト化されることが重要である。この目標を達成するために、好ましい方法にしたがって、親配列およびヒト化配列の三次元モデルを用い、親配列および種々の構想的ヒト化産物を分析する方法によって、ヒト化抗体が調製される。三次元免疫グロブリンモデルは、一般に入手可能であり、当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推定三次元立体配置構造を描き、表示するコンピュータプログラムが入手できる。これらの表示を検査することにより、候補免疫グロブリン配列の機能における該残基の可能性のある役割の分析、すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。この方法において、標的抗原に対する親和性増加などの所望の抗体特性が達成されるように、レシピエントおよびインポート配列のＦＲ残基を選択し、組み合わせることができる。一般に、ＣＤＲ残基が、直接的におよび最も実質的に、抗原結合性に対する影響に関与している。
あるいは、免疫化されると、内因性免疫グロブリン産生の不在下で、ヒト抗体の完全レパートリーを産生することができる遺伝子組換え動物（例えば、マウス）を作製することが現在可能である。例えば、キメラマウスおよび生殖細胞株変異マウスにおける抗体重鎖結合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合欠失が、内因性抗体産生の完全阻害をもたらすことが記載されている。このような生殖細胞株変異マウスにおけるヒト生殖細胞株免疫グロブリン遺伝子アレイの転移により、抗原誘発時に、ヒト抗体の産生がもたらされる。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、１９９３年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：２５５１頁；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、１９９３年、Ｎａｔｕｒｅ、３６２：２５５−２５８頁；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎら、１９９３年、Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏ．７：３３頁；およびＤｕｃｈｏｓａｌら、１９９２年、Ｎａｔｕｒｅ ３５５：２５８頁を参照されたい。ヒト抗体はまた、ファージ表示ライブラリーに由来し得る（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、１９９１年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７７：３８１頁；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９１年、２２２：５８１−５９７頁Ｖａｕｇｈａｎら、１９９６年、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ １４：３０９頁を参照されたい。
（ｖ）多重特異性抗体
多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して抗原特異性を有する。このような分子は、通常、２つの抗原に結合するだけだが（すなわち、二重特異性抗体、ＢｓＡｂｓ）、本明細書に用いられる場合、三重特異性抗体などのさらなる特異性を有する抗体が、この語句に包含される。ＢｓＡｂｓの例としては、ＦｃγＲＩＩＢに特異的な１つの抗原結合部位および、例えば：Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、ＣＤ７９αおよび／またはＣＤ７９β、腫瘍細胞上に発現した抗原、ＩｇＥ受容体（ＦｃεＲ）、肥満細胞および／または好塩基球上などのＩｇＥＲに結合したＩｇＥ、ＮＫおよび単球ならびにマクロファージ上などのＩｇＧ受容体ＲＩ（ＦｃγＲＩ）およびＲＩＩＩ（ＦｃγＲＩＩＩ）、受容体チロシンキナーゼｃ−キットに特異的な他の抗原結合部位を有するものが挙げられる。いくつかの実施形態において、ＢｓＡｂｓは、ＦｃγＲＩＩＢに対する第１の結合特異性、および細胞質ＩＴＡＭモチーフを有する活性化受容体に対する第の結合特異性を含む。ＩＴＡＭモチーフ構造は、９〜１１のアミノ酸スペーサーによって分離した２つのチロシンを有する。一般的なコンセンサス配列は、ＹｘｘＬ／Ｉ（ｘ）６〜８ＹｘｘＬである（Ｉｓａｋｏｖ、Ｎ．、１９９７年、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．６１：６−１６頁）。代表的な活性化受容体としては、ＦｃεＲＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、およびＦｃγＲＩＩＣが挙げられる。他の活性化受容体としては、例えば、ＣＤ３、ＣＤ２、ＣＤ１０、ＣＤ１６１、ＤＡＰ−１２、ＫＡＲ、ＫＡＲＡＰ、ＦｃεＲＩＩ、Ｔｒｅｍ−１、Ｔｒｅｍ−２、ＣＤ２８、ｐ４４、ｐ４６、Ｂ細胞受容体、ＬＭＰ２Ａ、ＳＴＡＭ、ＳＴＡＭ−２、ＧＰＶＩ、およびＣＤ４０が挙げられる（例えば、Ａｚｚｏｎｉら、１９９８年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：３４９３頁；Ｋｉｔａら、１９９９年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：６９０１頁；Ｍｅｒｃｈａｎｔら、２０００年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．７４：９１１５頁；Ｐａｎｄｅｙら、２０００年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：３８６３３頁；Ｚｈｅｎｇら、２００１年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：１２９９９頁；Ｐｒｏｐｓｔら、２０００年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：２２１４頁を参照）。
一実施形態において、ＢｓＡｂは、ＦｃγＲＩＩＢに対する第１の結合特異性およびＦｃεＲＩに対する第２の結合特異性を含む。二重特異性抗体は、完全長抗体または抗体断片として調製できる（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）。二重特異性抗体は、ホール内ノブ抗体またはヒンジレス抗体として調製できる。二重特異性抗体は、Ｓｅｇａｌら、２００１年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８：１−６頁に概説されている。
二重特異性抗体を作製する方法は当業界に知られている。完全長二重特異性抗体の従来の作製法は、２つの免疫グロブリン重鎖軽鎖対の同時発現に基づいており、これら２つの鎖は、このような特異性を有している（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎら、１９８３年、Ｎａｔｕｒｅ ３０５：５３７−５３９頁）。免疫グロブリン重鎖および軽鎖のランダムな組み合わせのため、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０の異なる抗体分子の混合物を生じる可能性があり、これらのうち、１つだけが正しい二重特異性の構造を有する。通常、アフィニティークロマトグラフィー処置によって行われる正しい分子の精製は、かなり厄介であり、産物の収量は低い。同様な方法は、国際公開第９３／０８８２９号、およびＴｒａｕｎｎｅｃｋｅｒら、１９９１年、ＥＭＢＯ Ｊ．１０：３６５５−３６５９頁に開示されている。
異なる方法により、所望の結合特異性（抗体−抗原結合部位）を有する抗体可変ドメインを、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合する。この融合は、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとの融合であり得る。融合体の少なくとも１つに存在する軽鎖結合に必要な部位を含有する第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合体および所望の場合は、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡを別個の発現ベクターに挿入し、好適な宿主生物内に同時トランスフェクトする。これによって、構築に用いられた３種の抗体鎖の不等比率が最適収量を与える場合、実施形態における３種の抗体断片の相互比率の調整には大きな柔軟性が与えられる。しかし、等しい比率にある少なくとも２種の抗体鎖の発現が高収量をもたらす場合、またはこれらの比率が特に重要ではない場合、ある発現ベクターにおける２種または３種全ての抗体鎖がコード配列を挿入することは可能である。
この方法の他の実施形態において、二重特異性抗体は、一方のアームにおける第１の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖、および他方のアームにおけるハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第２の結合特異性を提供する）からなる。二重特異性分子の片方の部分にのみ免疫グロブリン軽鎖が存在することで、容易な分離方法が提供されるため、この非対称構造により、所望の二重特異性化合物を、不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することが促進される。この方法は、国際公開第９４／０４６９０号に開示されている。二重特異性抗体の作出のさらなる詳細に関しては、例えば、Ｓｕｒｅｓｈら、１９８６年、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １２１：２１０頁を参照されたい。
国際公開第９６／２７０１１号に記載された他の方法によると、抗体分子対間の界面を、組換え細胞培養物から回収されるヘテロ二量体のパーセンテージを最大化するために操作することができる。好ましい界面は、抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法において、第１の抗体分子の界面からの１つまたは複数の小さなアミノ酸側鎖が、より大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）によって置換される。大きなアミノ酸側鎖を、より小さなもの（例えば、アラニンまたはトレオニン）で置換することにより、大きな側鎖と同じか、または類似のサイズの代償的な「空洞」が、第２の抗体分子の界面に生み出される。これによって、ホモ二量体などの不要な最終産物よりもヘテロ二量体の収量を増加させる機構が提供される。
二重特異性抗体としては、交差結合または「ヘテロ複合体」が挙げられる。例えば、ヘテロ複合体における抗体の一方をアビジンに、他方をビオチンに結合することができる。このような抗体は、例えば、不要な細胞細胞に免疫系を標的化するために（米国特許第４，６７６，９８０号）、およびＨＩＶ感染の治療のために（国際公開第９１／００３６０号、国際公開第９２／２００３７３号、および欧州特許第４，６７６，９８０号）提案されている。ヘテロ複合体は、任意の簡便な架橋法を用いて作製できる。好適な交差結合剤は当業界に十分知られており、例えば、米国特許第４，６７６，９８０号に、多数の交差結合法と共に開示されている。
２超の結合価を有する抗体もまた考慮されている。例えば、Ｔｕｔｔら、１９９１年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０に従って、三重特異性抗体を調製することができる。
（ｖｉ）改変ヒンジ領域を有する抗体
本発明の抗体は、例えば、２００３年１０月３０日出願の出願第１０／６９７，９９５号に記載されているような改変重鎖もまた含み得る。改変重鎖を含む抗体は、システイン残基がジスルフィド結合を形成できないような、少なくとも１つのジスルフィド形成システイン残基の変化を含む。一態様において、前記システインは、重鎖のヒンジ領域のものである（したがって、このようなヒンジ領域は、本明細書において、「改変ヒンジ領域」と称され、さらに、「ヒンジなし」と称される）。
いくつかの態様において、このような免疫グロブリンは、分子間で（２本の重鎖間でのように）または分子内で（ポリペプチド単鎖内の２つのシステイン残基間でのように）、通常はジスルフィド結合を形成することができる重鎖システイン残基の完全レパートリーを欠いている。一般に、および好ましくは、変化させるシステイン残基（すなわち、ジスルフィド結合形成不能にされる）によって形成されたジスルフィド結合は、抗体内に存在していない場合、免疫グロブリンの通常の物理化学的および／または生物学的特徴の実質的な損失をもたらさないものである。ジスルフィド結合形成不能にされるシステイン残基は、重鎖ヒンジ領域のシステインであることが好ましいが、必ずしもそうである必要はない。
改変重鎖または改変ヒンジ領域を有する抗体は、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または２つと１１との間の重鎖間ジスルフィド結合が除かれている抗体を、宿主細胞内に発現させ、宿主細胞から前記抗体を回収することによって、一般に作製される。前記抗体は、ジスルフィド結合能力の減少した改変重鎖を含む抗体をコードするポリヌクレオチドから発現させることができ、引き続き、該ポリヌクレオチドを含む宿主細胞から前記抗体を回収する。好ましくは、前記重鎖は、免疫グロブリン重鎖の改変ヒンジ領域を含んでなり、前記改変ヒンジ領域の少なくとも１つのシステインはジスルフィド結合形成不能になっている。
免疫グロブリン重鎖の任意のシステインが、本明細書に記載されたヒンジシステインと同様にジスルフィド結合形成不能にできることは、このような変化が免疫グロブリンの生物学的機能を実質的に減少させないという条件で、さらに予想される。例えば、ＩｇＭおよびＩｇＥはヒンジ領域を欠いているが、各々が余分の重鎖ドメインを含有し；本発明の方法において、重鎖および／または重鎖を含む抗体の生物学的機能を実質的に減少させない限り、該重鎖システインの少なくとも１つ（いくつかの実施形態においては全て）を、ジスルフィド結合形成不能にすることができる。
例えば、Ｋａｂａｔ、１９９１年、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、上記に記載されているような重鎖ヒンジシステインは当業界に十分に知られている。当業界で知られているように、ヒンジシステインの数は、免疫グロブリンのクラスおよびサブクラスに依って変わる。例えば、Ｊａｎｅｗａｙ、１９９９年、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ、第４版、（Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、ニューヨーク）を参照されたい。例えば、ヒトＩｇＧＩ類においては、２つのヒンジ領域が２つのプロリンによって分離しており、これらは通常、分子間ジスルフィド結合において、隣接した重鎖の相手側と対になっている。他の例としては、４つのヒンジシステインを含有するヒトＩｇＧ２、１１のヒンジシステインを含有するＩｇＧ３、および２つのヒンジシステインを含有するＩｇＧ４が挙げられる。
したがって、本発明の方法は、改変ヒンジ領域の少なくとも１つのシステインがジスルフィド結合形成不能になっている改変ヒンジ領域を含む免疫グロブリン重鎖を宿主細胞内に発現させること、該重鎖を軽鎖と複合体化させて、生物学的に活性な抗体を形成すること、および宿主細胞から抗体を回収することを含む。
代替の実施形態は、少なくとも２つ、３つ、または４つのシステインがジスルフィド結合形成不能になっているもの；約２つから約１１のシステインが不能になっているもの；および改変ヒンジ領域の全てのシステインが不能になっているものを含む。
本発明の方法によって作製された本発明の抗体を構成する軽鎖および重鎖は、単一のポリヌクレオチドによって、または別々のポリヌクレオチドによってコードされ得る。
通常、ジスルフィド結合形成に関与するシステインは、当業界に公知の種々の方法のうちのいずれか、または本明細書に記載された基準を考慮して、当業者に明らかであると考えられる方法によって、ジスルフィド結合形成不能にすることができる。例えば、ヒンジシステインを、ジスルフィド結合のできないセリンなどの他のアミノ酸によって置換することができる。改変するヒンジ領域をコードする核酸配列の部位特異的変異誘発などの標準的な分子生物学的方法によってアミノ酸置換を達成することができる。好適な方法としては、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版に記載されたものが挙げられる。改変ヒンジ領域を有する免疫グロブリンを作出するたの方法としては、ヒンジ領域をコードするオリゴヌクレオチドの合成が挙げられ、置換されるシステインのコドンが、置換アミノ酸のコドンと置き換わる。次いで、このオリゴヌクレオチドを、適宜、可変領域およびＦｃ配列などの他の適切な抗体配列を含むベクター主鎖内に結合することができる。
他の実施形態において、ヒンジシステインを欠失できる。アミノ酸欠失は、改変するヒンジ領域をコードする核酸配列の部位特異的変異誘発などの標準的な分子生物学的方法によって達成できる。好適な方法としては、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記に記載されたものが挙げられる。改変ヒンジ領域を有する免疫グロブリンを作出する他の方法としては、改変するシステインのコドンが欠失しているヒンジ領域をコードする配列を含むオリゴヌクレオチドの合成が挙げられる。次いで、このオリゴヌクレオチドを、適宜、可変領域およびＦｃ配列などの他の適切な抗体配列を含むベクター主鎖内に結合することができる。
（ｖｉｉ）「キャビティー内突起」戦略を用いて形成される二重特異性抗体
いくつかの実施形態において、本発明の二重特異性抗体は、ヘテロオリゴマー化のために、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの間の界面を操作するのに役立つ「キャビティー内突起」戦略を用いて形成され、これは「ホール内ノブ」とも称される。好ましい界面は、抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。Ｆｃ配列のＣＨ３ドメインにおける「ホール内ノブ」変異は、ホモ二量体の形成を大幅に減少させるという報告がある（例えば、Ｍｅｒｃｈａｎｔら、１９９８年、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６：６７７−６８１頁を参照）。「突起」は、第１のポリペプチド界面の小さなアミノ酸側鎖をより大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）によって置換することにより構築される。その突起と同じか、または同様なサイズの補償的「キャビティー」は、第２のポリペプチドの界面に、大きなアミノ酸側鎖をより小さな側鎖によって置換することにより任意に創製される。第１または第２のポリペプチドの界面いずれかに、好適に配置され、大きさを定めた突起またはキャビティーが存在する場合、隣接する界面に、それぞれ対応するキャビティーまたは突起を操作するだけでよい。該突起およびキャビティーは、ポリペプチドをコードする核酸の変化などの合成的手段により、またはペプチド合成により作製することができる。ホール内ノブのさらなる説明に関しては、米国特許第５，７３１，１６８号、第５，８０７，７０６号、第５，８２１，３３３号を参照されたい。
いくつかの実施形態において、「ホール内ノブ」法は、ヘテロ二量体化を促進して、完全長二重特異性抗ＦｃγＲＩＩＢおよび抗「活性化受容体」（例えばＩｇＥＲ）抗体を作出するために用いられる。一実施形態において、「ノブ」変異（Ｔ３６６Ｗ）をＦｃ領域に導入することにより、抗ＦｃγＲＩＩＢ成分（例えばｐ５Ａ６．１１ノブ）のための、また、「ホール」変異（Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ）を導入することにより、抗ＩｇＥＲ成分のための構築体が調製された。他の実施形態において、本明細書に開示された方法、またはＭｅｒｃｈａｎｔら、（１９８８）、上記、または米国特許第５，７３１，１６８号；第５，８０７，７０６号；第５，８２１，３３３号に開示された方法などにより、「ホール」変異をそのＦｃ領域に導入することによって、抗ＦｃγＲＩＩＢ成分（例えばｐ５Ａ６．１１ホール）のための、また、「ノブ」変異をそのＦｃ領域に導入することによって、抗ＩｇＥＲ成分（例えばｐ２２Ｅ７．１１ノブ）のための構築体が調製される。
「キャビティー内突起」法を用いてヘテロ多量体を調製する一般的方法は、１種または数種の宿主細胞に、突起をコードするように元のポリヌクレオチドから変化させた、第１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、およびキャビティーをコードするように元のポリヌクレオチドから変化させた、第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを発現させることを含む。該ポリペプチドは、共通の宿主細胞に発現させて、宿主細胞培養物からヘテロ多量体を回収するか、別々の宿主細胞に発現させて、回収し、精製した後、ヘテロ多量体を形成するかのいずれかである。いくつかの実施形態において、形成されたヘテロ多量体は、多量体抗体、例えば二重特異性抗体である。
いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、ホール内ノブ法と改変ヒンジ領域構築体とを組み合わせて、ヒンジなし二重特異性抗体が作製される。
Ｂ．ベクター、宿主細胞および組換え法
また本発明は、本明細書に開示された抗体をコードする単離ポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含むベクターおよび宿主細胞、ならびに該抗体を作製するための組換え法を提供する。
該抗体の組換え作製のために、該抗体をコードするポリヌクレオチドを単離し、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）のため、または発現のために、複製可能なベクターに挿入する。該抗体をコードするＤＮＡは、従来の方法を用いて、例えば、該抗体をコードする遺伝子に特異的に結合することのできるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより、容易に単離され、配列決定される。多くのベクターが入手可能である。ベクターの構成要素としては、限定はしないが、一般に、以下の１つまたは複数が挙げられる：シグナル配列、複製起点、１つまたは複数のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、および転写終結配列。
（ｉ）シグナル配列要素
本発明の抗体は、直接的にのみならず、異種抗体との融合抗体としても組換え作製できる。一実施形態において、異種抗体は、シグナル配列、または成熟タンパク質または抗体のＮ末端に特定の開裂部位を有する他の抗体である。選択されることが好ましい異種シグナル配列は、宿主細胞によって認識され、処理される（すなわち、シグナルペプチダーゼにより開裂される）ものである。天然抗体のシグナル配列を認識、処理しない原核生物宿主細胞に関しては、そのシグナル配列を、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐ、または熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択された原核生物シグナル配列によって置換する。酵母分泌のためには、天然シグナル配列を、例えば、酵母インベルターゼ、α因子リーダー（サッカロミセスおよびＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓのα因子リーダーを含む）、または酸ホスファターゼリーダー、カンジダアルビカンスグルコアミラーゼリーダー、または国際公開第９０／１３６４６号に記載されたシグナルによって置換できる。哺乳動物細胞の発現には、哺乳動物シグナル配列ならびにウィルス分泌リーダー、例えば、単純疱疹ｇＤシグナルが入手できる。このような前駆体領域のＤＮＡを、リーディングフレーム内で、該抗体をコードするＤＮＡに結合する。
他の実施形態において、抗体の産生は、宿主細胞の細胞質内で生じ得、したがって、各シストロン内に分泌シグナル配列の存在を必要としない。これに考慮して、免疫グロブリンの軽鎖および重鎖は、細胞質内で、発現し、折りたたまれ、組み立てられて、機能的免疫グロブリンが形成される。一定の宿主株（例えば、大腸菌ｔｒｘＢ株）は、ジスルフィド結合形成に有利な細胞質条件を提供し、それによって、発現されたタンパク質サブユニットの適切な折りたたみと組み立てが可能となる（ＰｒｏｂａおよびＰｌｕｋｔｈｕｎ、１９９５年、Ｇｅｎｅ １５９：２０３）。
（ｉｉ）複製起点成分
発現ベクターとクローニングベクターの双方が、１種または複数種の宿主細胞内でベクターが複製することを可能にする核酸配列を含有する。一般にクローニングベクターにおいて、この配列は、ベクターが宿主の染色体ＤＮＡと独立して複製することを可能にする配列であり、複製起点または自己複製配列を含む。このような配列は、種々の細菌、酵母、およびウィルスに関して、十分に知られている。プラスミドｐＢＲ３２２の複製起点は、多くのグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド源は、酵母に好適であり、種々のウィルス源（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウィルス、ＶＳＶ、またはＢＰＶ）は、哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般的に、複製起点成分は、哺乳動物の発現ベクターにとって必要ではない（ＳＶ４０源は、初期プロモーターを含有するという理由だけで、典型的に使用できる）。
（ｉｉｉ）選択遺伝子成分
発現ベクターおよびクローニングベクターは、選択性マーカーとも称される選択遺伝子を含有し得る。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗体または他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、またはテトラサイクリンに対する耐性を与える、（ｂ）栄養要求欠失を補足する、または（ｃ）複合培地から入手できない重要な栄養素を供給する、タンパク質をコードする。例えば、桿菌では、Ｄアラニンラセマーゼをコードする遺伝子である。
選択方式の一例では、宿主細胞の増殖を阻害する薬剤が利用される。異種遺伝子によって首尾よく形質転換されている細胞は、薬物耐性を与えて選択処置に生き残るタンパク質を産生する。このような優占的選択の例では、薬物のネオマイシン、ミコフェノール酸およびヒグロマイシンが用いられる。
哺乳動物細胞にとって好適な選択性マーカーの例は、ＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネイン−Ｉおよび−ＩＩ、好ましくは霊長類のメタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼなどの、抗体核酸を有する能力のある細胞の同定を可能にするものである。
例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子によって形質転換した細胞は、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニストであるメトトレキサート（Ｍｔｘ）を含有する培養培地で、全ての形質転換体を培養することによって、先ず同定される。野生型のＤＨＦＲが用いられる場合の適切な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性の欠失したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株である。
あるいは、抗体、野生型ＤＨＦＲタンパク質、およびアミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）などの他の選択性マーカーをコードするＤＮＡ配列によって形質転換されたか、または同時形質転換された宿主細胞（特に、内因性ＤＨＦＲを含有する野生型宿主）が、アミノグリコシド系抗生物質、例えば、カナマイシン、ネオマイシン、またはＧ４１８などの選択性マーカーに関する選択物質を含有する培地中での細胞増殖によって選択できる。米国特許第４，９６５，１９９号参照されたい。
酵母に用いられる好適な選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら、１９７９年、Ｎａｔｕｒｅ ２８２：３９頁）。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファン中で増殖する能力を欠く酵母の欠損株、例えばＡＴＣＣ番号４４０７６またはＰＥＰ４−１に関する選択マーカーを提供する。Ｊｏｎｅｓ、１９７７年、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ８５：１２頁。次いで、酵母宿主細胞ゲノムにおけるｔｒｐ１障害の存在により、トリプトファン不在下での増殖により形質転換を検出するために効果的な環境が提供される。同様に、Ｌｅｕ２欠失酵母株（例えば、ＡＴＣＣ番号２０，６２２または３８，６２６を有する株）は、Ｌｅｕ２遺伝子を担持する公知のプラスミドによって補足される。
また、１．６μｍの環状プラスミドｐＫＤ１由来のベクターを、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ酵母の形質転換に使用できる。あるいは、組換えウシキモシンの大規模製造に関する発現系が、Ｋ．ｌａｃｔｉｓに関して報告されている。Ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ、１９９０年、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：１３５頁を参照されたい。Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓの産業用株による成熟組換えヒト血清アルブミンの分泌に関する安定な多コピー発現ベクターもまた開示されちる。Ｆｌｅｅｒら、１９９１年、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：９６８−９７５頁を参照されたい。
（ｉｖ）プロモーター成分
発現ベクターおよびクローニングベクターは、宿主生物によって認識され、抗体核酸に作動可能に結合したプロモーターを、通常は含有する。原核生物宿主と共に使用する上で好適なプロモーターとしては、ｐｈｏＡプロモーター、βラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、およびｔａｃプロモーターなどのハイブリッドプロモーターが挙げられる。しかし、他の公知の細菌プロモーターも好適である。細菌系に使用されるプロモーターは、該抗体をコードするＤＮＡに作動可能に結合したシネ−ダルガルノ（Ｓ．Ｄ．）配列もまた含有する。
真核生物に関するプロモーター配列が知られている。実際、真核生物の全ての遺伝子が、転写が開始される部位からおよそ２５から３０塩基上流に位置するＡＴの多い領域を有している。多くの遺伝子の転写開始から、７０から８０塩基上流に見られる他の配列は、ＣＮＣＡＡＴ領域であり、ここでＮは任意のヌクレオチドである。多くの真核生物遺伝子の３’端には、コード配列の３’端にポリＡ尾部を付加するシグナルであり得るＡＡＴＡＡＡがある。これらの配列は全て、真核生物発現ベクター内に好適に挿入される。
酵母宿主と共に用いる好適なプロモート配列の例としては、３−ホスホグリセラートキナーゼ、またはエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベ−トデカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルベートキナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼなどの他の解糖酵素に関するプロモーターが挙げられる。
増殖条件によって制御される転写というさらなる利点を有する誘導性プロモーターである他の酵母プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ならびにマルトースおよびガラクトース利用を担っている酵素に関するプロモーター領域である。酵母の発現に用いられる公的なベクターおよびプロモーターは、欧州特許第７３，６５７号にさらに記載されている。酵母エンハンサーもまた、酵母プロモーターと共に有利に用いられる。
哺乳動物宿主細胞において、ベクターからの抗体転写は、ポリオーマウィルス、鶏痘ウィルス、アデノウィルス（アデノウィルス２など）、ウシパピローマウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス、最も好ましくは、シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）などのウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種哺乳動物プロモーター、例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーターにより、このようなプロモーターが、宿主細胞株に適合性であるという条件で、制御される。
ＳＶ４０ウィルスの初期および後期プロモーターは、ＳＶ４０ウィルスの複製起点もまた含有するＳＶ４０制限断片として簡便に得られる。ヒトサイトメガウィルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩＥ制限断片として簡便に得られる。ウシパピローマウィルスをベクターとして用いて哺乳動物宿主にＤＮＡを発現する系は、米国特許第４，４１９，４４６号に開示されている。この系の修飾は、米国特許第４，６０１，９７８号に記載されている。単純疱疹ウィルスのチミジンキナーゼプロモーターの制御下でのマウス細胞におけるヒトβ−インターフェロンｃＤＮＡの発現については、Ｒｅｙｅｓら、１９８２年、Ｎａｔｕｒｅ ２９７：５９８−６０１頁もまた参照されたい。あるいは、ラウス肉腫ウィルスの長末端反復がプロモーターとして使用できる。
（ｖ）エンハンサー要素成分
高級真核生物による、本発明の抗体をコードするＤＮＡの転写は、該ベクター内にエンハンサー配列を挿入することによって増加させることが多い。哺乳動物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−胎児タンパク質、およびインスリン）の多数のエンハンサー配列が、現在知られている。しかし、典型的には、真核生物細胞ウィルスのエンハンサーが用いられる。例としては、複製起点（ｂｐ１００〜２７０）の後期側のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウィルスの初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウィルスエンハンサーが挙げられる。真核生物プロモーターの活性化に関するエンハンス要素については、Ｙａｎｉｖ、１９８２年、Ｎａｔｕｒｅ ２９７：１７−１８頁もまた参照されたい。エンハンサーは、抗体コード配列に対して、５’位または３’位でベクター内にスプライスされ得るが、プロモーターの５’位に位置することが好ましい。
（ｖｉ）転写終結成分
真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、または他の多細胞生物の有核細胞）に用いられる発現ベクターは、転写の終結およびｍＲＮＡの安定化に必要な配列もまた含有する。このような配列は一般に、真核生物またはウィルスＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’、および時には３’未翻訳領域から入手できる。これらの領域は、抗体をコードするｍＲＮＡの未翻訳部分におけるポリアデニル化断片として転写されたヌクレオチドセグメントを含有する。有用な転写終結成分の一つは、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。国際公開第９４／１１０２６号およびそれに開示されている発現ベクターを参照されたい。
（ｖｉｉ）翻訳強度の調節
分泌され、適切に組み立てられた完全長抗体の収量を最大化するために、本発明の免疫グロブリンを、発現される軽鎖と重鎖の量比が調節できる発現系から発現させることもできる。このような調節は、軽鎖と重鎖の翻訳強度を同時に調節することによって達成される。
翻訳強度を調節する１つの方法は、Ｓｉｍｍｏｎｓら、米国特許第５，８４０，５２３号およびＳｉｍｍｏｎｓら、２００２年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２６３：１３−１４７頁に開示されている。それは、シストロン内の翻訳開始領域（ＴＩＲ）の改変体を利用する。所与のＴＩＲに関する一連のアミノ酸配列または核酸配列の改変体が、翻訳強度の範囲で創製され、そのことによって、特定の鎖の所望の発現レベルにこの因子を調節する簡便な手段が提供される。ＴＩＲ改変体は、アミノ酸配列を変化させ得るコドン変化をもたらす従来の変異誘発法によって作出できるが、ヌクレオチド配列のサイレント変化が好ましい。ＴＩＲの変化としては、例えば、シグナリング配列における変化と共に、シネ−ダルガルノ配列の数または間隔の変化を挙げることができる。変異シグナル配列を作出する１つの好ましい方法は、シグナル配列のアミノ酸配列を変化させない（すなわち、変化がサイレントである）、コード配列の始めにおける「コドンバンク」の作出である。これは、各コドンの第３のヌクレオチド位置を変化させることによって達成でき、；さらに、ロイシン、セリン、およびアルギニンなどのいくつかのアミノ酸は、バンク作製に複雑さを付加し得る複数の１位および２位を有する。変異誘発のこの方法は、Ｙａｎｓｕｒａら、１９９２年、ＭＥＴＨＯＤＳ：Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ４：１５１−１５８頁に、詳述されている。
内部の各シストロンに関してあるＴＩＲ強度範囲を有する一組のベクターが作出されることが好ましい。この限定された組により、各鎖の発現レベルならびに種々のＴＩＲ強度の組み合わせにおける完全長産物の収量の比較が提供される。ＴＩＲ強度は、Ｓｉｍｍｏｎｓら、米国特許第５，８４０，５２３号およびＳｉｍｍｏｎｓら、２００２年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２６３：１３３−１４７頁に詳細に記載されているレポーター遺伝子の発現レベルの定量化によって判定することができる。本発明の目的に関して、ベクター内のＴＩＲの特定の対に関する翻訳強度の組み合わせは、（Ｎ−軽、Ｍ−重）によって表されここで、Ｎは、軽鎖の相対的ＴＩＲ強度であり、Ｍは、重鎖の相対的ＴＩＲ強度である。例えば、（３−軽、７−重）は、ベクターが、軽鎖発現に関しては約３の相対的ＴＩＲ強度、重鎖発現に関しては約７の相対的ＴＩＲ強度を提供することを意味する。翻訳強度の比較に基づき、本発明の発現ベクター構築体に組み合わせるべき所望の個々のＴＩＲが選択される。
（ｖｉｉ）宿主細胞の選択および形質転換
本明細書のベクターにおけるＤＮＡのクローニングまたは発現に好適な宿主細胞は、上記の原核生物、酵母、または高級真核生物の細胞である。この目的のための好適な原核生物としては、グラム陰性またはグラム陽性細菌などの古細菌および真性細菌、例えば、エシェリキア属、例えば、大腸菌、エンテロバクター属、エルウィニア属、クレブシェラ属、プロテウス属、サルモネラ属、例えば、サルモネラ菌、セラチア属、例えば、霊菌、志賀菌属、ならびに枯草菌およびリケニホルミス菌などの桿菌（例えば、１９８９年４月１２日発行のＤＤ ２６６，７１０に開示されたリケニホルミス菌４１Ｐ）、緑膿菌などのシュードモナス属、およびストレプトマイセス属が挙げられる。好ましい大腸菌クローニング宿主の１つは、大腸菌２９４（ＡＴＣＣ２７，３２５）であるが、大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）および大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）も好適である。これらの例は、限定ではなくて例示的なものである。また、宿主細胞が最少量のタンパク質分解酵素を分泌することが好ましく、追加のプロテアーゼ阻害剤が細胞培養物中に組み込まれることが望ましい場合がある。また、原核生物宿主細胞は、チオレドキシン経路および／またはグルタチオン経路における変異を含み得る。
原核生物に加えて、糸状菌、真菌または酵母などの真核微生物は、抗体をコードするベクターにとって好適なクローニング宿主または発現宿主である。低級真核生物宿主微生物の中では、酵母、または一般的なパン酵母が最も一般的に用いられる。しかし、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ；例えば、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ（ＡＴＣＣ １２，４２４）、Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（ＡＴＣＣ １６，０４５）、Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ（ＡＴＣＣ ２４，１７８）、Ｋ．ｗａｌｔｉｉ（ＡＴＣＣ ５６，５００）、Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ（ＡＴＣＣ ３６，９０６）、Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、およびＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ（欧州特許第４０２，２２６号）などのＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ宿主；Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（欧州特許第１８３，０７０号）；カンジダ属；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｉａ（欧州特許第２４４，２３４号）；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ；Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓなどのＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ；および例えば、アカパンカビ属、アオカビ属、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍなどの糸状菌およびＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓおよびＡ．ｎｉｇｅｒなどのアスペルギルス属宿主などの他の多数の属、種および株が一般的に入手でき、本明細書において有用である。
グリコシル化抗体の発現に好適な宿主細胞は、多細胞生物に由来する。無脊椎生物細胞の例としては、植物細胞および昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウィルス株および改変体ならびに対応する、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（毛虫）、ネッタイシマカ（蚊）、セスジヤブカ（蚊）、キイロショウジョウバエ（ショウジョウバエ）、およびカイコガなどの宿主の許容的昆虫宿主細胞が確認されている。トランスフェクション用に、例えば、オートグラファカリフォルニア核多汗症ウィルスのＬ−１改変体およびカイコガ核多汗症ウィルスのＢｍ５株などの種々のウィルス株が公共的に入手でき、このようなウィルスは、本発明により、本明細書におけるウィルスとして、特に、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために使用できる。綿、トウモロコシ、ジャガイモ、大豆、ツクバネアサガオ、トマト、およびタバコの植物細胞培養物もまた宿主として利用できる。
脊椎動物宿主細胞は広く用いられており、培養液中での脊椎動物細胞の増殖（組織培養）はルーチン法となっている。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胎児腎臓系（２９３細胞または懸濁培養にて増殖用にサブクローン化した２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））、ハムスター仔腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂら、１９８０年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６頁）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ、１９８０年、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１頁）；サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、１９８２年、Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８頁）；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；ＮＳＯ（例えば、ＲＣＢ０２１３、１９９２年、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６９）およびＳＰ２／０細胞（例えば、ＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５８１）などのマウス骨髄腫細胞；ＹＢ２／０細胞（例えば、ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６６２）などのラット骨髄腫細胞；およびヒト肝癌系（Ｈｅｐ Ｇ２）である。ＣＨＯ細胞は、本発明の実施に好ましい細胞株であり、ＣＨＯ−Ｋ１、ＤＵＫ−Ｂ１１、ＣＨＯ−ＤＰ１２、ＣＨＯ−ＤＧ４４（ＳｏｍａｔｉｃＣｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １２：５５５（１９８６））、およびＬｅｃ１３は代表的な宿主細胞株である。ＣＨＯ−Ｋ１、ＤＵＫ−Ｂ１１、ＤＧ４４またはＣＨＯ−ＤＰ１２宿主細胞の場合、これらは、そこで発現されたタンパク質をフコシル化する能力を欠失するように変化させることができる。
本発明はハイブリドーマ細胞にも適用できる。用語の「ハイブリドーマ」は、免疫源の不死細胞株と抗体産生細胞との融合によって作製されたハイブリッド細胞株を言う。この用語は、ヒト細胞とマウス骨髄腫細胞株との融合、引き続いて、プラズマ細胞との融合の結果である、一般にトリオーマ細胞株として知られている異種ハイブリッド骨髄腫融合体の後代を包含する。さらに、該用語は、例えば、抗体を産生するクアドローマなどの任意の不死化ハイブリッド細胞株を含むことが意図されている（例えば、Ｍｉｌｓｔｅｉｎら、１９８３年、Ｎａｔｕｒｅ ５３７：３０５３頁を参照）。ハイブリッド細胞株は、ヒトやマウスなど、任意の種のものであり得る。
最も好ましい一実施形態において、哺乳動物細胞は、対象となっている抗体をコードする外来性単離核酸によって形質転換された非ハイブリドーマ哺乳動物細胞である。「外来性核酸」または「異種核酸」は、該細胞にとって外来であるか、または該細胞と同種ではあるが、宿主細胞核酸内で該核酸が通常では見られない位置にある核酸配列を意味する。
（ｖｉｉｉ）宿主細胞の培養
宿主細胞は、抗体産生のために、上記の発現ベクターまたはクローニングベクターによって形質転換し、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、または所望の配列をコードする遺伝子の増幅のために、適宜修飾した従来の栄養培地中で培養する。
本発明の抗体の産生に用いられる宿主細胞は、種々の培地中で培養できる。ハムのＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最少必須培地（ＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、およびダルベッコー修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）などの市販の培地が宿主細胞の培養に好適である。また、Ｈａｍら、１９７９年、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４頁、Ｂａｒｎｅｓら、１９８０年、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５頁、米国特許第４，７６７，７０４号；第４，６５７，８６６号；第４，９２７，７６２号；第４，５６０，６５５号；または第５，１２２，４６９号；国際公開第９０／０３４３０号；国際公開第８７／００１９５号；または米国特許Ｒｅ第３０，９８５号に記載された培地のいずれかを、宿主細胞の培養培地として使用できる。これらの培地にはいずれも、必要な場合は、ホルモンおよび／または他の成長因子（インスリン、トランスフェリン、または上皮成長因子など）、塩類（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸など）、緩衝剤（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシンおよびチミジンなど）、抗生物質（ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（商標）剤など）、微量元素（マイクロモル範囲で最終濃度に通常存在する無機化合物として規定された）、およびグルコースまたは等価エネルギー源を添加できる。任意の他の必要添加物を、当業者に公知であると思われる適切な濃度において含めることもできる。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現用に選択された宿主細胞で先に用いられたものであり、当業者には明らかであろう。
培養培地は全て、以下のカテゴリーの１つまたは複数のうちの少なくとも１つの成分を典型的に提供する：
１）通常はグルコースなどの炭水化物の形態におけるエネルギー源；
２）全必須アミノ酸、通常は２０のアミノ酸の基本セットプラスシスチン；
３）ビタミン類および／または低濃度で必要とされる他の有機化合物；
４）遊離脂肪酸；および
５）微量元素、ここで微量元素は、通常マイクロモル範囲の極めて低濃度で典型的に必要とされる無機化合物または天然元素として定義される。
培養培地は、無血清であることが好ましく、例えば、約５％未満、好ましくは、１％未満、より好ましくは、０％から０．１％の血清および他の動物由来タンパク質である。しかし、それらは所望ならば使用できる。本発明の好ましい一実施形態において、細胞培養培地は過剰のアミノ酸を含む。過剰に提供されるアミノ酸は、例えば、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、およびＶａｌから選択できる。Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、およびＴｒｐが過剰に提供されることが好ましい。例えば、欧州特許第３０７，２４７号または米国特許第６，１８０，４０１号に指定された範囲の１倍または２倍で、アミノ酸、ビタミン類、微量元素および他の培地成分を使用できる。これら２つの文書は、参照として本明細書に組み込まれている。
所望のタンパク質を発現し、特定の位置に所望の炭水化物を付加することのできる哺乳動物細胞の培養のために、培養される宿主細胞に特に注意を払って、多数の培養条件が使用できる。哺乳動物細胞のための好適な培養条件は、当業界に十分に知られている（Ｗ．Ｌｏｕｉｓ Ｃｌｅｖｅｌａｎｄら、１９８３年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ５６：２２１−２３４頁）か、または当業者により容易に決定でき（例えば、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ 第２版、Ｒｉｃｋｗｏｏｄ，Ｄ．およびＨａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク（１９９２）を参照）、選択された具体的な宿主細胞によって変わる。
（ｉｘ）抗体の精製
組換え法を用いる場合、抗体は、細胞内に、もしくは細胞周辺腔に産生できるか、または直接、培地に分泌され得る。第１段階として、抗体が細胞内に産生される場合、宿主細胞または溶解断片の破片は、例えば、遠心分離または限外ろ過によって除去される。Ｃａｒｔｅｒら、１９９２年、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３−１６７頁は、大腸菌の細胞周辺腔に分泌される抗体を単離する方法を記載している。手短に述べると、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、およびフェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）の存在下、細胞ペーストを約３０分にわたって解かす。細胞破片は遠心分離によって除去する。抗体が培地に分泌される場合、このような発現系の上澄み液は、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外ろ過ユニットを用いて、一般的には先ず濃縮される。タンパク質分解を阻害するために、ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を、前述のいずれかの段階に含めることができ、また、外来性汚染物の増殖を防ぐために、抗生物質を含めることができる。
細胞から調製された抗体組成物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、およびアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製することができるが、アフィニティークロマトグラフィーが好ましい精製法である。親和性リガンドとしてのタンパク質Ａの好適性は、種および抗体内に存在する免疫グロブリンＦｃ領域のイソタイプに依存する。タンパク質Ａは、ヒトγ１、γ２、またはγ４重鎖に基づく抗体の精製に用いることができる（Ｌｉｎｄｍａｒｋら、１９８３年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３頁）。タンパク質Ｇは、全てのマウスイソタイプおよびヒトγ３に対して推薦されている（Ｇｕｓｓら、１９８６年、ＥＭＢＯ Ｊ．５：１５６７１５７５）。親和性リガンドが結合する基質は、多くの場合アガロースであるが、他の基質も利用できる。制御ポアガラスまたはポリ（スチレンジビニル）べんゼンなどの機械的に安定な基質によって、アガロースで達成できるよりも、速い流速および短い処理時間が可能になる。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、精製には、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、フィリップスバーグ、ニュージャージー州）が有用である。イオン交換カラム上での分画エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上クロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）クロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換樹脂上クロマトグラフィー（ポリアスパラギン酸カラムなど）、等電点クロマトグラフィー、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および硫酸アンモニウム沈殿などの、タンパク質精製のための他の方法もまた、回収する抗体に依って利用できる。
一実施形態において、糖タンパク質は、調製物からフコース含有糖タンパク質を除去するために、レクチン基質上への吸着を用いて精製でき、それによって、フコースのない糖タンパク質を高濃度化できる。
（ｘ）抗体活性アッセイ
本発明の免疫グロブリンは、当業界に公知の種々のアッセイによって、それらの物理的／化学的性質および生物学的機能に関して特性化できる。本発明の一態様において、免疫原に対する本発明の抗体の選択性を他の結合標的に対するものと比較することは重要である。特に、選択的にＦｃγＲＩＩＢに結合する抗体は、他のＦｃγＲ類、特にＦｃγＲＩＩＡと結合しないか、または低い結合親和性を示すことが好ましい。
本発明の一定の実施形態において、本明細書で産生される免疫グロブリンは、それらの生物学的活性に関して分析される。いくつかの実施形態において、本発明の免疫グロブリンは、それらの抗原結合活性に関して試験される。当業界に公知であり、本明細書に使用できる抗原結合アッセイとしては、限定はしないが、ウェスタンブロット、放射免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫沈降アッセイ、蛍光免疫アッセイ、およびタンパク質Ａ免疫アッセイなどの方法を用いた任意の直接的または競合的結合アッセイが挙げられる。例示的抗原結合アッセイは、下記の実施例の節に提供されている。
精製免疫グロブリンは、限定はしないが、Ｎ末端配列決定、アミノ酸分析、非変性ゲルろ過高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、質量分析法、イオン交換クロマトグラフィー、およびパパイン消化などの一連のアッセイによってさらに特性化できる。タンパク質定量化の方法は当業界に十分知られている。例えば、発現したタンパク質のサンプルを、それらの量的強度に関して、クーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で比較できる。あるいは、対象となっている特異的バンド（例えば完全長バンド）を、例えば、ウェスタンブロットゲル分析および／またはＡＭＥ５−ＲＰアッセイによって検出できる。
Ｃ．薬学的処方物
該抗体の治療的処方物は、所望の純度を有する抗体を、任意の生理学的に許容できるキャリア、賦形剤または安定化剤と混合することによって（Ｒｅｍｉｎｇｓｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ 第１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０））、凍結乾燥処方物または水溶液の形態で調製できる。許容できるキャリア、賦形剤、または安定剤は、用いられる投与量および濃度においてレシピエントに対して非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸およびメチオニンなどの抗酸化剤；保存剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）抗体；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストリンなどの単糖、二糖、および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート化剤；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えばＺｎ−タンパク質錯体）；および／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン界面活性剤が挙げられる。
また、本明細書における処方物は、治療される具体的な徴候に関して、必要ならば、１つ超の活性化合物、好ましくは、互いに有害作用を及ぼさない相補的活性を有するものを含有できる。例えば、該処方物は、他の抗体または化学療法剤をさらに含み得る。このような分子は、意図される目的に有効な量で組み合わされて好適に存在する。
また、該活性成分は、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、ミクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）において、またはマクロエマルジョンにおいて、例えば、コアセルベーション法によって、または界面ポリマー化によって調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルならびにポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセルに閉じ込めることもできる。このような方法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ 第６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０）に開示されている。
インビボ投与に用いられる処方物は滅菌してある必要がある。これは、滅菌ろ過膜によって容易に達成される。
持続放出処方物を調製できる。持続放出処方物の好適な例としては、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透過基質が挙げられ、該基質は、形状化製品、例えば、薄膜、またはマイクロカプセルの形態にある。持続放出基質の例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９）号、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレンビニルアセテート、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよびロイプロライドアセテートからなる注射用ミクロスフェア）などの分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレンビニルアセテートおよび乳酸−グリコール酸などのポリマーは、１００日間にわたって分子放出を可能にするが、一定のヒドロゲルがタンパク質を放出する時間はより短い。カプセル化抗体が体内で長時間残留すると、３７℃で水分に晒される結果、変性または凝集して、生物活性の損失および場合によっては、免疫原性の変化を生じ得る。関与する機構に依って、安定化のための合理的な戦略が考案できる。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド交換による分子間Ｓ−Ｓ結合形成であることが分かれば、スルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分の制御、適切な添加剤の使用、および特定のポリマー基質組成物の開発によって安定化が達成できる。
Ｄ．抗体の非治療的使用法
本発明の抗体はアフィニティー精製剤として使用できる。この方法においては、当業界に周知の方法を用いて、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（商標）樹脂またはろ紙などの固相上に抗体を固定する。固定化した抗体を、精製する抗原を含有するサンプルに接触させ、その後、サンプル中の精製する抗原以外の実質的に全ての物質を除去する好適な溶媒で支持体を洗浄し、これを固定化抗体に結合させる。最後に、抗体から抗原を遊離させるグリシン緩衝液、ｐＨ５．０などの他の好適な溶媒で支持体を洗浄する。
また抗体は、例えば、特定の細胞、組織、または血清中の対象となっている抗原の発現を検出するための診断的アッセイにも有用である。診断適用では、抗体は典型的に、検出可能部分によって標識化される。多数の標識が入手でき、一般に以下のカテゴリーに分類される：
（ａ）３５Ｓ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、および１３１Ｉなどの放射性アイソトープ。抗体は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第１巻および第２巻、Ｃｏｌｉｇｅｎら 編、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ニューヨーク、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｐｕｂｓ（１９９１）に記載された方法を用いて、放射性アイソトープによって標識化でき、放射性は、シンチレーションカウントによって測定できる。
（ｂ）希土キレート類（ユーロピウムキレート類）またはフルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、リサミン、フィコエリスリン、およびテキサスレッドなどの蛍光標識が入手できる。蛍光標識は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、上記に開示された方法を用いて抗体に結合できる。蛍光は蛍光計を用いて定量化できる。
（ｃ）種々の酵素−基質標識が入手でき、米国特許第４，２７５，１４９号は、これらのいくつかのレビューを提供している。酵素は、種々の方法を用いて測定できる色素産生基質の化学変化を一般に触媒する。例えば、酵素は基質における色変化を触媒でき、これは吸光分析で測定できる。あるいは、酵素は、基質の蛍光または化学発光を変化させ得る。蛍光の変化を定量化する方法は、上記に記載されている。化学発光基質は、化学反応によって電子的に興奮し、次いで、測定できる（例えば化学発光計を用いて）光を発し得るか、または蛍光受容体にエネルギーを供与できる。酵素標識の例としては、ルシフェラーゼ類（例えば、ホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ；米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン類、マレートデヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）などのペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカリドオキシダーゼ類（例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、およびグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ）複素環式オキシダーゼ（ウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼなど）、ァクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼなどが挙げられる。抗体に酵素を結合する方法は、Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｆｏｒ ｕｓｅ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍ．（Ｊ．ＬａｎｇｏｎｅおよびＨ．Ｖａｎ Ｖｕｎａｋｉｓ編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、７３：１４７−１６６頁（１９８１）に記載されている。
酵素−基質の組み合わせの例としては、例えば、
１）セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）は、過酸化水素を利用して色素前駆体を酸化する（例えば、オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）または塩酸３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ））；
２）アルカリホスファターゼ（ＡＰ）と、色素産生基質としてのパラニトロフェニルホスフェート；および
３）β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（β−Ｄ−Ｇａｌ）と色素産生基質（例えば、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ）または蛍光原基質の４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ
が挙げられる。
多数の他の酵素−基質の組み合わせが当業者に入手できる。これらの一般的なレビューに関しては、米国特許第４，２７５，１４９号および第４，３１８，９８０号を参照されたい。
時には、標識を間接的に抗体に結合させる。これを達成するための種々の方法を、当業者は認識されるであろう。例えば、抗体をビオチンに結合させ、上記の標識の３つの広範なカテゴリーのいずれかをアビジンに結合できるか、またはその逆ができる。ビオチンは選択的にアビジンに結合し、したがって、標識をこの間接的な方式で抗体に結合できる。あるいは、標識と抗体との間接的結合を達成するために、抗体を小型のハプテン（例えばジゴキシン）に結合させ、上記の種々のタイプの標識のいずれか１つを、抗ハプテン抗体（例えば抗ジゴキシン抗体）に結合させる。このようにして、標識と抗体との間接的結合を達成できる。
本発明の他の実施形態において、抗体は標識化する必要はなく、その存在は、その抗体に結合する標識抗体を用いて検出できる。
本発明の抗体は、競合結合アッセイ、直接的および間接的サンドイッチアッセイ、および免疫沈降アッセイなどの任意の公知のアッセイ法で使用できる。Ｚｏｌａ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１４７−１５８頁（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ社、１９８７年）。
該抗体は、インビボ診断的アッセイにも使用できる。一般に、抗原またはそれを発現する細胞が局在化できるように、該抗体は、免疫シンチオグラフィーを用いて、放射性核種（１１１Ｉｎ、９９Ｔｃ、１４Ｃ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、３Ｈ、３２Ｐまたは３５Ｓなど）によって標識される。
Ｅ．抗体のインビボ使用法
（ｉ）ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）の抑制活性の減少：抗体Ｆｃ結合の妨害
他の実施形態において、治療薬の機能を高めるために、抗ＦｃγＲＩＩＢ抗体が治療薬と同時投与される。例えば、ＦｃγＲＩＩＢに対するＩｇＧ結合を阻害するために、哺乳動物に抗ＦｃγＲＩＩＢを投与し、そのことによって、免疫応答のＦｃγＲＩＩＢ媒介抑制を防ぐ。これにより、ＩｇＧ治療的抗体の細胞障害性が増強される。例えば、治療的抗体が腫瘍抗原に特異的である場合、本発明の抗ＦｃγＲＩＩを、抗腫瘍抗原抗体と同時投与することにより、抗腫瘍抗原抗体の細胞障害性が増強する。
治療的抗体の多くは、上記に記載されているが、それらは、癌などの種々の疾患の治療に開発され、承認されている。例えば、ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）（リツキシマブ）（ＩＤＥＣＰｈａｒｍ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社）は、Ｂ細胞リンパ腫の治療に使用され、ＡＶＡＳＴＩＮ（商標）（ベバシツマブ）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社）は、転移大腸癌の治療に使用され、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）（トラスツマブ）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社）は、転移乳癌の治療に使用されるヒト化抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体である。このような治療のために開発された全てのモノクローナル抗体による癌治療の機構は、完全には理解されていないかも知れないが、少なくともいくつかの場合、抗体療法の有効性の一部は、免疫エフェクター機能の動員が原因であると考えることができる。（Ｈｏｕｇｈｔｏｎら、２０００年、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ６：３７３−３７４頁；Ｃｌｙｎｅｓら、２０００年、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ６：４３３−４４６頁）。ＸＯＬＡＩＲ（登録商標）（オマリツマブ）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社）は、アレルギーの治療に使用される抗ＩｇＥ抗体である。
ＦｃγＲＩＩＢは、リンパ系および骨髄系の細胞に発現するが、ナチュラルキラー細胞には発現せず、抑制受容体である。ＦｃγＲＩＩＢは、活性化されると、例えば、そうでない場合には、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞および肥満細胞を活性化するＦｃγＲＩＩＢシグナル伝達を抑制する。ＦｃγＲＩＩＢの抑制（例えば、ＦｃγＲＩＩＢに対するＦｃ結合の阻害）により、免疫エフェクター機能に及ぼすその抑制作用が減弱化し、そのことによってＭＡｂ療法が補助される。Ｒａｖｅｔｃｈ，ｊ．（国際公開第０１／７９２９９号）は、ＦｃγＲＩＩＢに対するＦｃ領域の親和性減少により、細胞障害性を増強し、そのことによって細胞活性化のＳＨＩＰ媒介抑制を制限する方法を記載している。
一実施形態において、ＦｃγＲＩＩＢに選択的に結合する抗体が、抗腫瘍抗体と共に、このような治療を必要としている哺乳動物に投与される。ＦｃγＲＩＩＡなどの他のＦｃγＲ類による免疫エフェクター応答の活性化が損なわれないように、ＦｃγＲＩＩＢに対する選択性が望まれる。ＦｃγＲＩＩＡとの交差反応ができないことで、ＦｃγＲＩＩＢの抑制機能はより効果的に阻害され、そのことによって、同時治療薬の効果が増強される。
一実施形態において、ＩｇＧ抗体の結合を阻害し、そのことによって、ＦｃγＲＩＩＢの抑制効果を阻害し、例えば、Ｂ細胞増殖を高めるために、本発明の抗ＦｃγＲＩＩＢ抗体を哺乳動物に投与する。
（ｉｉ）ＦｃγＲＩＩＢの抑制活性の増強：活性化受容体との共凝集
インビボで、ＦｃγＲＩＩＢは、非限定例として、Ｂ細胞抗原受容体（ＢＣＲ）、ＩｇＥに対する高親和性受容体（ＩｇＥＲまたはＦｃεＲＩ）、ＦｃγＲＩＩＡ、およびｃ−ｋｉｔ受容体（ＦｃγＲＩＩＩ）などの種々の活性化受容体と共凝集され得る。非限定例としての活性化受容体は、免疫エフェクター応答に関して活性化活性を有する膜貫通タンパク質であり、ＩＴＡＭ活性化モチーフを含む。ＦｃγＲＩＩＢは、ＦｃγＲＩＩＢと活性化受容体との共凝集によって活性化し、活性化受容体を介して伝達されるシグナルを減弱させる。現在までとところ、ＦｃγＲＩＩＢは、自己凝集またはホモ二量体化によってリン酸化されることは示されていない。ＦｃγＲＩＩＢ受容体は、リン酸化ＩＴＡＭ（活性化モチーフ）を発現している他の受容体と実験的にヘテロ二量体化または共凝集（または共結合）しており、タンパク質チロシンキナーゼ類（ＰＴＫ類）との間接的結合によって、ＦｃγＲＩＩＢ ＩＴＡＭがリン酸化され得る。リン酸化ＦｃγＲＩＩＢ ＩＴＡＭは、ホスファターゼＳＨＩＰ（イノシトールホスフェート５’−ホスファターゼ）を含有するＳＨ２ドメインを動員し、ＩＴＡＭが引き金となるカルシウム動員および細胞増殖を抑制する（Ｄａｅｒｏｎら、１９９５年、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３、６３５；Ｍａｌｂｅｃら、１９９８年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９、１６４７頁；Ｏｎｏら、１９９６年、Ｎａｔｕｒｅ、３８３、２３）。正味の効果は、カルシウム流入の阻害および持続的カルシウムシグナル伝達の防止であり、これによって、脱顆粒、食作用、ＡＤＣＣ、およびサイトカイン放出が防止される（Ｒａｖｅｔｃｈら、２０００年、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９０：８４−８９頁）が、いくつかのＦｃγＲＩＩＢ媒介シグナル伝達阻害は、カルシウムと独立でもあり得る。Ｂ細胞における増殖阻害は、ＩＴＩＭ経路にも依存的である。
ＦｃγＲＩＩＢ抑制活性の活性化は、ＦｃγＲＩＩＢに特異的なモノクローナル抗体と結合活性化受容体との間接的交差結合によって達成されている。間接的交差結合剤としては、ビオチン化モノクローナル体、マウスモノクローナルＩｇＧのＦｃ部分に特異的なポリクローナル抗体、および抑制剤と活性化受容体との双方に結合する免疫複合体を形成する多価抗原に対して、アビジンが挙げられる。多くの実験的モデルでは、マウスＢ細胞または肥満細胞およびマウスＦｃγＲＩＩとＦｃγＲＩＩＩ受容体の双方と交差反応するモノクローナル抗体（ラットＧ４．２）の使用が記載されている。
本発明により、モノクローナル抗ヒトＦｃγＲＩＩＢ Ｆａｂおよび活性化受容体に特異的なモノクローナルＦａｂを含む異種二重機能性抗体が、当業界に周知の化学的または遺伝子工学的方法によって調製される。
このような二重機能性抗体に関する治療可能性としては、炎症およびアレルギーに関与するシグナルの減弱が挙げられよう。ＩｇＥおよびアレルゲンによって活性化されると（ＦｃεＲを介して）、肥満細胞および好塩基球は、血管細胞および筋肉細胞に作用して炎症細胞を動員する炎症メディエーターおよびサイトカインを分泌する。次いで炎症細胞は炎症メディエーターを分泌し、長期継続性の炎症をもたらす連続的過程で炎症細胞を動員する。したがって、ＩｇＥ誘導肥満細胞の活性化を制御する手段は、炎症応答の開始を妨害することにより、アレルギー疾患治療への治療方法を提供する。上記のとおり、ＦｃγＲＩＩＢに選択的に結合する抗体またはその断片をさらに含み、また、例えば、ＦｃεＲＩまたはＩｇＥに結合したＦｃεＲに結合する抗体またはその断片を含む二機能性抗体は、ＦｃγＲＩＩＢの抑制活性によりＩｇＥ媒介活性化を減弱させる。
さらなる二重機能性抗体（例えば二重特異性抗体）の例は、ＦｃγＲＩＩＢに選択的に結合する抗体またはその断片と以下に関与する活性化受容体に結合する第２の抗体またはその断片との組み合わせを含む：喘息（モノクローナルヒト抗体およびＦｃεＲＩ、ＩｇＥに結合したＦｃεＲＩ、またはＣＤ２３に特異的なモノクローナルＦａｂ）、慢性関節リウマチおよび全身性紅斑性狼蒼（モノクローナル抗ヒトＦｃγＲＩＩＢ ＦａｂおよびＦｃγＲＩに特異的なモノクローナルＦａｂ）、乾癬（モノクローナル抗ヒトＦｃγＲＩＩＢ ＦａｂおよびＣＤ１１ａに特異的なモノクローナルＦａｂ）、免疫媒介血小板減少症、慢性関節リウマチおよび全身性紅斑性狼蒼（モノクローナル抗ヒトＦｃγＲＩＩＢ ＦａｂおよびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）またはＣＤ４に特異的なモノクローナルＦａｂ）、クローン病および潰瘍性大腸炎（モノクローナル抗ヒトＦｃγＲＩＩＢ Ｆａｂ、およびアルファ４ベータ７インテグリンサブユニット、またはアルファ４インテグリンサブユニットに特異的なモノクローナルＦａｂ、またはこれらのモノクローナル抗体の結合部分）、および肥満細胞、好塩基球、Ｂ細胞、単球、ナチュラルキラー細胞、好中球および樹状細胞が活動的に関係している他の自己免疫疾患。上記の定義の節に、種々の免疫疾患が記載されている。該抗体はまた、疾患に関連する重要な免疫複合体成分が存在する免疫疾患の治療にも使用できる。
いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、活性化受容体によって媒介される炎症前シグナルおよび／またはＢ細胞活性化を抑制する目的で、該抗体により治療されている哺乳動物における抑制性ＦｃγＲＩＩＢ受容体を活性化するために使用される。したがって、該抗体は、上記で特定されたものなどの炎症性障害および／または自己免疫疾患を治療するために使用される。ＦｃγＲＩＩＢ抑制機能の活性化は、ＦｃγＲＩＩＢと直接的に交差結合する本発明の二重特異性抗体および活性化受容体によって、またはＦｃγＲＩＩＢに間接的に交差結合する抗体および活性化受容体によって達成される。
いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、活性化に関連した脱顆粒化を抑制する。活性化に関連した脱顆粒化は、ヒスタミン放出抑制によって測定できる。いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、全ヒスタミンに比較して、少なくともヒスタミン放出を７０％抑制する。さらなる実施形態において、ヒスタミン放出の抑制は、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％であり、各々、７０％から１００％の連続した整数を含み、ヒスタミン放出の１００％減少は、バックグラウンドのヒスタミン放出に等しい。
疾患の予防または治療のための抗体の適切な投与量は、治療する疾患のタイプ、疾患の重症度および経過、該抗体の投与が予防のためかまたは治療のためか、先行療法、患者の臨床暦および抗体への応答性、ならびに主治医の裁量に依存する。抗体は、患者に、１回、または一連の処置にわたって投与される。
疾患のタイプおよび重症度に依って、例えば、１回または複数の別々の投与によっても、連続的注入によっても、約１μｇ／ｋｇから１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ）の抗体が、患者に投与する初回の候補投与量である。典型的な１日の投与量は、上記の因子に依り、約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であり得る。数日間またはそれ以上にわたる反復投与では、病態に依って、疾患症状の所望の抑制が生じるまで治療が持続される。しかし、他の投与法も有用であり得る。この療法の進行は、従来の方法およびアッセイによって容易にモニターされる。
該抗体組成物は、適切な医療行為に矛盾しない様式で処方され、用量化され、投与されることが必要である。この文脈において考慮すべき因子としては、治療する具体的疾患、疾患の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、および医療行為者に公知の他の因子が挙げられる。投与する抗体の「治療的有効量」は、このような考慮事項によって調節され、疾患または障害を予防、寛解、または治療する上で必要な最少量である。該抗体は、問題の障害を予防または治療するために現在使用されている１つまたは複数の薬剤と共に任意に処方されるが、それが必ずしも必要というわけではない。このような他の薬剤の有効量は、処方物に存在する抗体の量、障害または治療のタイプ、および上記で考察した他の因子に依存する。これらは一般に、先に用いられたのと同じ用量ならびに投与経路で、またはこれまで用いられた用量の約１％から９９％で用いられる。
治療的抗体組成物は一般に、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針によって貫通可能な栓を有するバイアル内に入れられる。
本発明はさらに、例えば、癌の治療に有用な材料を含有する製造品およびキットを提供する。該製造品は、ラベルを有する容器を含む。好適な容器としては、例えば、ビン、バイアル、および試験管が挙げられる。該容器は、ガラスまたはプラスチックなどの種々の材料から形成できる。該容器は、本明細書に記載された抗体を含む組成物を保持する。該組成物中の活性剤は特定の抗体である。該容器上のラベルは、該組成物が特定の疾患または障害の治療または予防に使用されることことを示し、また、上記のものなどのインビボに関する指示もまた示し得る。
本発明のキットは、上記の容器および緩衝液を含む第２の容器を含む。それは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、および使用説明書付きの添付文書などの商業的および使用者の立場から望ましい他の材料をさらに含み得る。
例えば、慢性関節リウマチおよび狼蒼などの、炎症細胞（例えば白血球）接着、移動および活性化の関与がある自己免疫疾患の治療のために、本明細書における抗体は、例えば、抗ＬＦＡ−１抗体（抗ＣＤ１１ａ抗体または抗ＣＤ１８抗体）または抗ＩＣＡＭ−１、−２、または−３などの抗ＩＣＡＭ抗体と共に同時投与できる。本明細書における抗体と組み合わせる、慢性関節リウマチ治療のためのさらなる薬剤としては、Ｅｎｂｒｅｌ（商標）、ＤＭＡＲＤＳ、例えば、メトトレキサート、およびＮＳＡＩＤ類（非ステロイド抗炎症薬）が挙げられる。本明細書における抗体以外の１種超のこのような他の抗体もまた使用できる。さらに、インスリンを糖尿病の治療に、抗ＩｇＥを喘息に、抗ＣＤ１１ａを乾癬に、抗アルファ４ベータ７および成長ホルモン（ＧＨ）を炎症性腸疾患に使用できる。
さらに、該処方物は、有効量の血糖降下薬と共に好適に投与される。本明細書の目的に関し、用語の「血糖降下薬」は、グルコース代謝の調節に有用な化合物、好ましくは、経口薬を言う。本明細書において、ヒトへの使用により好ましいものは、インスリン、および膵臓によるインスリンの分泌を生じさせるスルホニル尿素クラスの経口血糖降下薬である。例としては、グリブリド、グリピジド、およびグリクラジドが挙げられる。さらに、ビグアニド類（メトホルミンおよびフェンホルミンなど）およびＲＥＺＵＬＩＮＴＭ（商標）（トログリタゾン）商標インスリン増感剤などのインスリン感受性を高めるか、またはインスリン増感性の薬剤、ならびにＰＰＡＲ−ガンマ核受容体に結合する他の化合物がこの定義内に入り、また好ましい。
血糖降下薬は、非経口、鼻腔内、経口などの任意の好適な方法により、または任意の他の有効な経路により、哺乳動物に投与される。投与は経口経路によることが最も好ましい。例えば、１．２５ｍｇ、２．５ｍｇ、および５ｍｇ錠剤濃度において、Ｕｐｊｏｈｎにより市販されているＭＩＣＲＯＮＡＳＥ（商標）錠（グリブリド）が経口投与に好適である。この療法で設定されるＩＩ型糖尿病に対する通常の維持用量は一般に、１日当たり、約１．２５ｍｇから２０ｍｇの範囲であり、これを、単回投与として、または１日の間に適切であると考えられるような分割で投与できる。医薬品集、２５６３−２５６５頁（１９９５）。処方に入手できるグリブリドベースの錠剤の他の例としては、ＧＬＹＮＡＳＥ（商標）商標薬（Ｕｐｊｏｈｎ）およびＤＩＡＢＥＴＡ（商標）商標薬（Ｈｏｅｃｈｓｔ−Ｒｏｕｓｓｅｌ）が挙げられる。ＧＬＵＣＯＴＲＯＬ（商標）（Ｐｒａｔｔ）は、５ｍｇと１０ｍｇの双方の力価で入手できるグリピジド（１−シクロヘキシル−３−（ｐ−２−（５−メチルピラジンカルボキサミド）エチル）フェニル）スルホニル）尿素）錠の商標であり、食事管理後の血糖降下療法を必要とするＩＩ型糖尿病患者、または他のスルホニル尿素に対する応答がなくなった患者に、やはり処方される。医薬品集、１９０２−１９０３頁（１９９５）。ビグアナイド類（例えば、メトホルミンおよびフェンホルミン）もしくはチアジリジンジオン類（例えばトログリトゾン）、またはインスリン作用に影響を与える他の薬剤などのスルホニル尿素以外の他の血糖降下薬もまた使用できる。チアジリジンジオンがペプチドと共に用いられる場合、それは、現在使用されている濃度と同じ濃度、またはいくらか低い濃度で使用され、ペプチド単独で、またはジオンと共に見られる効果に関して適合させることができる。トログリタゾン（ＲＥＺＵＬＩＮＴＭ（商標））単独で用いられる典型的な用量は、１日当たり、約１００ｍｇ〜１０００ｍｇ、より好ましくは、２００ｍｇ／日〜８００ｍｇ／日であり、この範囲が本明細書において適用できる。例えば、Ｇｈａｚｚｉら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４６：４３３−４３９頁（１９９７）を参照されたい。トログリタゾンよりも強力なインスリン増感剤である他のチアジリジンジオンは、より低用量で使用されると考えられる。
Ｆ．材料の寄託
以下のハイブリドーマ細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ 大通り、マナサス、バージニア州 ２０１１０−２２０９ 米国（ＡＴＣＣ）に寄託されている：
ハイブリドーマ／抗体名 ＡＴＣＣ番号 寄託月日
ＦｃγＲＩＩＢ ５Ａ６．２．１ ＰＴＡ−４６１４ ２００２年８月２８日
この寄託は、特許手続きを目的とする微生物寄託の国際公認についてのブタペスト条約の条項およびそれに従う規定（ブタペスト条約）の下でなされた。これは、寄託日から３０年間、生存可能な培養維持を保証している。細胞株は、ブタペスト条約の条項の下で、ＡＴＣＣにより入手でき、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社およびＡＴＣＣ間の合意に供され、これによって、（ａ）特許出願の係属中、３７ＣＦＲ§１．１４および３５ＵＳＣ§１２２にしたがって、長官により権利が与えられると判定された者に培養物へのアクセスが利用できること、および（ｂ）このように寄託された培養物の公共への利用可能性に対する制限は、特許付与時に取消し不能で除去されることが保証される。
本発明の譲受人は、寄託培養物が好適な条件下で、死滅または損失または破壊された場合は、通告に基づいて、同じ培養物の生存可能な試料と直ちに交換されることに合意している。寄託細胞株の入手可能性は、任意の政府の権限下でその特許法にしたがって付与された権利に違反して本発明を実施する許可として考えられるべきではない。
前述の明細書は、当業者に本発明の実施を可能にさせる上で十分であると考えられる。寄託された実施形態は、本発明の一態様の一つの実例として意図されているため、本発明は寄託培養物によって範囲が限定されるべきではなく、機能的に等価な任意の培養物が本発明の範囲内にある。本明細書における材料の寄託は、本明細書に含まれた説明が、その最良の様式を含めて、本発明の任意の態様の実施を可能にする上で不十分であるとの容認を定めるものではなく、また、請求項の範囲をそれが表示している特定の実例に限定していると解釈すべきでもない。実際、本明細書に示され記載されたものの他に、本発明の種々の修飾が、前述の説明から当業者に明らかになるであろうし、また添付の請求項の範囲に入る。
本発明は、以下の実施例を参照することにより、より十分に理解されるであろう。しかし、それらを、本発明の範囲を限定するものとして解釈すべきではない。本明細書に挙げられた全ての文献および特許引用文は、参照として、特に組み込まれている。
ＩＩＩ．実施例
機能的には反対であるが、ヒトＦｃγＲＩＩＡ（活性化受容体）とヒトＦｃγＲＩＩＢ（抑制性受容体）は、相同性の高いタンパク質であり（相同性領域は、図２Ａの囲み部分である）、ＩｇＧ１における約９つのアミノ酸および３つの結合ドメインに違いがある。市販のモノクローナル抗体は、ヒトＦｃγＲＩＩＡとＦｃγＲＩＩＢの双方に結合する。ＦｃγＲＩＩＢに特異的に結合するモノクローナル抗体が有用であると考えられ、ＩｇＧ結合を阻害するさらなる能力もまた望ましい。
実施例および補助図において、ＦｃγＲＩＩＢは、ヒトＦｃγＲＩＩＢであり、特に記述されない限り、一般にヒトＦｃγＲＩＩＢ１を言う。ＦｃγＲＩＩＢは、交換可能に、ＦｃｇＲＩＩＢ、ＦｃＧＲＩＩｂ、ｈｕＦｃγＲＩＩＢ、ｈｕ ＦｃＧＲＩＩｂ、ｈＦｃγＲＩＩＢ、Ｆｃγ−ＲＩＩｂ、ＦｃγＲ２Ｂ、ＦｃγＲ２ｂ、またはＩｇＧＲと称し得る。特定の対立遺伝子改変体は、数字の１、２、または３を付けて、例えば、ｈｕ ＦｃＧＲＩＩｂ１と称される。ＦｃεＲＩは、ヒトＦｃεＲＩであり、ヒトＦｃεＲＩαと称される。ＦｃεＲＩは、交換可能に、ＦｃｅＲＩ、ＦｃｅＲＩａ、ＦｃＥＲＩ、ＩｇＥＲ、ＩｇＥ−Ｒ、ＦｃεＲＩα、Ｆｃε−ＲＩまたはＦｃεＲＩａと称し得る。
上記タンパク質のいずれかの抗体は、名称によるか、または一般的に、関連タンパク質の前に「抗」を付けて、例えば、抗ＦｃγＲＩＩＢ、抗ＩｇＥＲなどと称される。タンパク質の細胞外ドメインは、タンパク質名にＥＣＤを付けて、例えば、ＦｃγＲＩＩＢ ＥＣＤと称される。対象となっているタンパク質を発現している細胞は、その細胞株のタンパク質名の変型を含むように記述的に命名でき、「細胞」と称される。
（実施例 １．０ 材料および方法）
１．１ 材料
Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ ＳｃｉｅｎｃｅのＧｅｎｅＡｍｐ（商標）、ｐＧＥＸ−４Ｔ２プラスミド、タンパク質Ａカラムおよび試薬、ならびにタンパク質Ｇ ＦｃγＲＩＩＩを用いて逆転写ＰＣＲを実施し、カラムおよび試薬は、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈから入手した。Ｎｉ−ＮＴＡカラムおよび試薬は、Ｑｉａｇｅｎ、バレンシア、カリフォルニア州から入手した。Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−３０コンセントレーターは、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ベッドフォード、マサチューセッツ州から、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルおよびポリビニリデンジフルオリド膜は、ＮＯＶＥＸ、サンジエゴ、カリフォルニア州から入手し、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）は、Ｒｏｃｈｅから入手した。
ヒトＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ；Ｈｉｓ１３１アロタイプ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）、およびＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６Ａ；Ｖａｌ１５８アロタイプ）の細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインをコードするｃＤＮＡ；およびＦｃγＲＩＩＢおよびＦｃγＲＩＩＡのグルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ（ＧＰＩ）イソ体は、Ｄｒ．Ｊ．Ｒａｖｅｔｃｈ（ロックフェラー大学、ニューヨーク）により提供された。ＦｃγＲＩＩＡ−Ａｒｇ１３１アロタイプおよびＦｃγＲＩＩＩＡ−Ｐｈｅ１５８アロタイプは、部位特異的変異誘発（３１）によって作出した。ＦｃγＲＩＩＢ１（配列番号１１）に関する配列情報は、登録番号：ＮＰ ００３９９２で；ＦｃγＲＩＩＢ２（配列番号１０）および登録番号：
ＮＰ ００１００２２７３で；ＦｃγＲＩＩＡ（配列番号９）および登録番号：ＮＰ ０６７６７４で、およびＦｃγＲＩＩＩ（２つのイソ体）は、登録番号：ＮＰ ０００５６０およびＮＰ ０００５６１で入手できる。
抗体ＡＴ１０は、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、カミリロ、カリフォルニア州から入手した。抗体ｍｏｐｃ２１は、ＢＤ Ｐｈａｒｍａｇｅｎから入手した。マウスモノクローナル抗体は、以下の供給源から入手した：Ｍｅｄａｒｅｘ、アナンデール、ニュージャージー州から、３２．２（抗ＦｃγＲＩ）、ＩＶ．３（抗ＦｃγＲＩＩ）、および３Ｇ８（抗ＦｃγＲＩＩＩ）；およびＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、パロアルト、カリフォルニア州から、Ｂ１Ｇ６（抗ｂ２ミクログロブリン）。抗ＧＳＴ抗体は、Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社から、抗ＧＳＴビオチンは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈクローン１５Ｈ４．１．１ＪＷ８．５．１３は、Ｓｅｒｏｔｅｃ社、ラレイ、ノースカロライナ州から入手した。
ＥＬＩＳＡプレート、例えば、Ｎｕｎｃ（登録商標）ｍａｘｉｓｏｒｂプレートは、（Ｎａｌｇｅ−Ｎｕｎｃ、ネイパービル、イリノイ州）から入手した。組織培養プレートは、例えば、ＬｉｎｂｒｏまたはＦｉｓｈｅｒから入手できる。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ツウィーン２０（登録商標）、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ＥＭＥＭ（イーグル最少必須培地、イオノマイシン、硫酸プロタミンおよびｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロライド（ＯＰＤ）、ヨウ化プロピジウムは、Ｓｉｇｍａ（セントルイス、ミズーリ州）から、ストレプトアビジンおよびカゼインブロッカー（Ｐｒｏｄ＃３７５２８）は、Ｐｉｅｒｃｅ（ロックフォード、イリノイ州）から、セイヨウワサビペルオキシダーゼウサギ抗マウスＩｇＧ抗体結合体、およびヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）２−特異的ＩｇＧのペルオキシダーゼ結合Ｆ（ａｂ’）２断片は、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ウェストグローブ、ペンシルベニア州から入手した。
ペルオキシダーゼ結合タンパク質Ｃは、ＢｉｏＲａｄから、ストレプトアビジン−ＨＲＰは、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ ＭａｎｎｈｅｉｍまたはＺｙｍｅｄから、ＴＭＢ基質（Ｐｒｏｄ＃ＴＭＢＷ−０１００−０１）および停止液（Ｐｒｏｄ＃ＢＳＴＰ−０１００−０１）は、ＢｉｏＦｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから、ヤギ抗マウスＩｇＧ−フルオレセインは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｑｕａｌｅｘ Ｌａｂｓから入手した。ＮＰ−（１１）−ＯＶＡおよびＴＮＰ−（１１）−ＯＶＡは、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ノバド、カリフォルニア州から入手した。ストレプトアビジン−ＰＥおよびラット抗マウスＩｇＧ−ＰＥまたはフルオレセイン結合体は、ＢＤ Ｐｈａｒｍａｇｅｎ、フランクリン、レイクス、ニュージャージー州から入手した。
フローサイトメトリーは、ＦＡＣＳｃａｎ（商標）上で実施するか、またはＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）フローサイトメーターをＢＤ、フランクリンレイクス、ニュージャージー州から入手した。吸光度は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、マウンテンビュー、カリフォルニア州のＶｍａｘプレートリーダーを用いて読み取った。ヒスタミンＥＬＩＳＡは、ＲＤＩ社（ニュージャージー州）により配給された、ＩＢＬ Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｓ（ハンブルク、ドイツ国）から入手のＨｉｓｔａｍｉｎｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔを用いて実施した。
１．２ ＧＳＴ−Ｆｃ受容体融合タンパク質の作製
ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）のｃＤＮＡは、α鎖細胞外ドメインをコードする断片を作出するプライマーを用いて、Ｕ９３７細胞のオリゴ（ｄＴ）−プライムドＲＮＡの逆転写ＰＣＲによって単離した。全ての受容体のコード領域を、前述のｐＲＫ哺乳動物細胞発現ベクター内にサブクローン化した（Ｅａｔｏｎ，Ｄ．ら、１９８６年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５：８３４３−８３４７頁）。全てのＦｃγＲｐＲＫプラスミドに関して、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを、Ｇｌｙ−Ｈｉｓ６タグおよびヒトグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）をコードするＤＮＡで置換した。５’端と３’端に、それぞれＮｈｅＩ制限部位とＸｂａＩ制限部位を有するｐＧＥＸ−４Ｔ２プラスミドから、ＰＣＲによって２３４のアミノ酸ＧＳＴ配列を得た。したがって、発現タンパク質は、以下のアミノ酸位置において、カルボキシル末端でＧｌｙ／Ｈｉｓ６／ＧＳＴに融合したα鎖の細胞外ドメインを含有する：ＦｃγＲＩ、Ｈｉｓ２９２；ＦｃγＲＩＩＡ、Ｍｅｔ２１６；ＦｃγＲＩＩＢ、Ｍｅｔ１９５；ＦｃγＲＩＩＩＡ、Ｇｌｎ１９１（残基数はシグナルペプチドを含む）。
プラスミドは、リン酸カルシウム沈降によってアデノウィルス形質転換ヒト胚体腎臓細胞株２９３にトランスフェクトした（Ｇｏｒｍａｎら、１９９０年、ＤＮＡ ＰｒｏｔｈｙＡ遺伝子．Ｅｎｇ．Ｔｅｃｈ．２：３−１０頁）。１０ｍｇ／リットルの組換えウシインスリン、１ｍｇ／リットルのヒトトランスフェリン、および微量元素を添加した無血清ＰＳＯ４倍地に変換７２時間後、上澄み液を採集した。タンパク質を、ニッケル−ニトリロ三酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ）クロマトグラフィーによって精製し、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−３０コンセントレーターを用いて、緩衝液をリン酸化緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に交換した。タンパク質を４〜２０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分析し、ポリビニリデンジフルオライド膜に移し、それらのアミノ末端を配列決定して適切なシグナル配列開裂を確認した。マウスモノクローナル３２．２（抗ＦｃγＲＩ）、ＩＶ．３（抗ＦｃγＲＩＩ）、３Ｇ８（抗ＦｃγＲＩＩＩ）、およびＢ１Ｇ６（抗ｂ２−ミクログロブリン）を用いて、ＥＬＩＳＡにより受容体のコンホメーションを評価した。アミノ酸組成分析によって誘導した吸光係数を用いて、２８０ｎｍにおける吸光度を測定した。
１．３ ＦｃγＲＩＩＢ抗体の作製
受容体によるＩｇＧ Ｆｃ結合ｗ阻害するヒトＦｃγＲＩＩＢ特異的抗体を、ＦｃγＲＩＩＢ−Ｈｉｓ６−ＧＳＴに対して作出した。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、足裏に２μｇのｈｕＦｃγＲＩＩＢ−Ｈｉｓ６−ＧＳＴにより免疫化した。免疫化マウスの脾臓細胞（Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｄｓ ｉｎ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｍｉｓｈｅｌｌ ＢＢ、Ｓｈｉｉｇｉ ＳＭ編）、３５１−３７２頁、サンフランシスコ：ＦｒｅｅｍａｎにおけるＯｉ ＶＴ、ハーゼンバーグ、ルイジアナ州、１９８１年、Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｈｙｂｒｉｄ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓに記載された細胞）を、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ１骨髄腫細胞に融合し、およそ９００のハイブリドーマを得た。
ＥＬＩＳＡは一般に、以下のとおり実施される：ＰＢＳ、ｐＨ７．４中、およそ１．５ｍｇ／ｍｌで、受容体融合タンパク質をＥＬＩＳＡプレートに塗布し、４℃で１８時間置いた。プレートを、アッセイ緩衝液により、２５℃で１時間ブロックした。スクリーンする抗体の連続３倍希釈液および対照抗体（１０．０〜０．００４５ｍｇ／ｍｌ）をプレートに加え、２時間インキュベートした。アッセイ緩衝液でプレートを洗浄後、ヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）２特異的ＩｇＧのペルオキシダーゼ結合Ｆ（ａｂ’）２断片により、該受容体に結合したＩｇＧを検出した。使用された基質は、ｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロライドであった。Ｖｍａｘプレートリーダーにより、４９０ｎｍにおける吸光度を読み取った。
１．４ ＦｃγＲＩＩＢ特異的抗体に関する一次スクリーン
一次スクリーンにおいて、ハイブリドーマサブクローンから発現させた抗体を含有する上澄み液を、ＦｃγＲＩＩＢ−Ｈｉｓ６−ＧＳＴに対する陽性結合に関してスクリーンした。ＥＬＩＳＡによりＦｃγＲＩＩＢ−Ｈｉｓ６−ＧＳＴに反応性の抗体を、ＦｃγＲＩＩＢ−Ｈｉｓ６−ＧＳＴに対する結合およびＦｃγＲＩＩＡ（Ｒ１３１改変体）−Ｈｉｓ６−ＧＳＴおよびＦｃγＲＩＩＩ（Ｆ１５８改変体）−Ｈｉｓ６−ＧＳＴに対する陰性結合に関して再スクリーンした。
この一次スクリーンから、およそ５０の抗体がさらなる分析のために選択された。
１．５ ＦｃγＲＩＩＢ特異的抗体に関する二次スクリーン
二次スクリーンにおいて、受容体特異性に関して、該抗体をＥＬＩＳＡにより再スクリーンし、グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ（ＧＰＩ）結合ＦｃγＲＩＩＢ、およびＦｃγＲＩＩＡを発現するＣＨＯ細胞株を用いて細胞結合アッセイを行った。ＥＬＩＳＡを実施し、上記に記載し、結果は図４に示した。図４において、棒グラフは、ＧＳＴ−ｈｕＦｃγＲＩＩＡおよびＧＳＴ−ｈｕＦｃγＲＩＩＩ融合タンパク質と比較して、ＧＳＴ−ｈｕＦｃγＲＩＩＢに対する抗体の相対的結合を示している。抗体１Ｄ１、５Ａ６、５Ｈ１１および６Ａ５は、ＧＳＴ−ｈｕＦｃγＲＩＩＡおよびＧＳＴ−ｈｕＦｃγＲＩＩＩ融合タンパク質よりもＧＳＴ−ｈｕＦｃγＲＩＩＢに選択的に結合する。抗体５Ｂ９は、ＧＳＴ−ｈｕＦｃγＲＩＩＩよりもＧＳＴ−ｈｕＦｃγＲＩＩＢとＧＳＴ−ｈｕＦｃγＲＩＩＡの双方に選択的に結合する。
図５は、ＧＰＩ−ｈｕＦｃγＲＩＩＡを発現するＣＨＯ細胞に比較して、ＧＰＩ−ｈｕＦｃγＲＩＩＢを発現するＣＨＯ細胞に対する抗体の免疫蛍光結合による結合特異性を示している。ＣＨＯ細胞の分離アリコートを、ｍＩｇＧ１イソタイプ対照（ｍｏｐｃ２１），または（抗ヒトＦｃγＲＩＩＢ）モノクローナル抗体、１Ｄ１、５Ａ６、５Ｈ１１および６Ａ５のいずれかによって染色した。フルオロセイン結合Ｆ（ａｂ）’２ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆ（ａｂ）’２特異的抗体による第２のインキュベーションによって、結合を間接的に検出した。抗体５Ａ６は、ＧＰＩ−ｈｕＦｃγＲＩＩＡを発現するＣＨＯ細胞に比較して、ＧＰＩ−ｈｕＦｃγＲＩＩＢを発現するＣＨＯ細胞に優先的に結合する。結果は、ＧＳＴ構築体に対する結合と同様である。
さらなるＥＬＩＳＡ結合データを、図６〜９に示す。図６〜９は、ＧＳＴ−ｈｕＦｃγＲＩＩＢ、ＧＳＴ−ｈｕＦｃγＲＩＩＡ（Ｈ１３１）、またはＧＳＴ−ｈｕＦｃγＲＩＩＡ（Ｒ１３１）に対する種々の抗ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）ＭＡｂ類の結合に関する結合親和性曲線を示す。ＡＴ１０は、ＦｃγＲＩＩＡに特異的なｍＩｇＧであり、ｍｏｐｃ２１は、ｍＩｇＧイソタイプ対照である。５Ａ６ｍＩｇＧ１は、図６に示されたＧＳＴ−ｈｕＦｃγＲＩＩＢに対する結合に関して、０．０６ｎＭのＥＣ５０測定値を有する。対照的に、ＧＳＴ−ｈｕＦｃγＲＩＩＡ（Ｈ１３１）に対する結合に関する５Ａ６ｍＩｇＧ１のＥＣ５０は、５０μｇ／ｍｌ超であり（図９）、ＧＳＴ−ｈｕＦｃγＲＩＩＡ（Ｒ１３１）に対する結合に関しては、２．５μｇ／ｍｌである（図８）。
１．６ 抗体の発現および精製
抗体５Ａ６．２．１（本明細書において、５Ａ６．２．１または５Ａ６と交換可能に称される）を腹水に関して選択し、タンパク質Ｇクロマトグラフィー（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて精製した。５Ａ６．２．１をコードするＤＮＡを常法を用いて単離し、配列決定した。重鎖（配列番号７）および軽鎖（配列番号８）のアミノ酸配列およびＣＤＲを図１０に示す。重鎖ＣＤＲは：ＤＡＷＭＤ（配列番号１）、ＥＩＰＳＫＰＮＮＨＡＴＹＹＡＥＳＶＫＧ（配列番号２）、およびＦＤＹ（配列番号３）である。軽鎖ＣＤＲは：ＲＡＳＱＥＩＳＧＹＬＳ（配列番号４）、ＡＡＳＡＬＤＳ（配列番号５）、およびＬＱＹＶＳＹＰＬ（配列番号６）である。
５Ａ６モノクローナル抗体に対する推定上の結合エピトープとしては、アミノ酸残基Ｋ１５８〜Ｖ１６１およびＦ１７４〜Ｎ１８０が挙げられ、ナンバリングは、図２ＡにおけるＦｃγＲＩＩＢ２に示されている（ＦｃγＲＩＩＢ２、配列番号１０）。ＦｃγＲＩＩＢ１およびＦｃγＲＩＩＢ２受容体は、図２Ａおよび２Ｂに残基Ｔ４３〜Ｐ１２３におけるＩｇＧ様ドメイン１として、および残基Ｗ１３２〜Ｐ２１７におけるＩｇＧ様ドメイン３として示された構造ドメインを有する（ＦｃγＲＩＩＢ２により例示）。ＩＴＩＭモチーフは、図２Ａに、ＦｃγＲＩＩＢ２に関して示されており、残基Ｎ２６９〜Ｍ２７７を含む。図２ＡにおいてＦＳＲＬＤＰＴ（配列番号３９）として示されたＦｃγＲＩＩＡのアミノ酸配列Ｆ１６５〜Ｔ１７１は、ＦＳＨＬＤＰＴ（配列番号４０）であり得、それにより、ＦｃγＲＩＩＡとＦｃγＲＩＩＢとの間には、抗体５Ａ６に対するＦｃγＲＩＩＢの推定結合エピトープにおける大きな配列の相違が示されていることが、最近報告されている（図２および登録番号：ＮＰ ０６７６７４、配列番号３０を参照。このアミノ酸配列は、ＦｃγＲＩＩＡのＮ末端位における残基の変化も含む）。
１．７ Ｅ２７：ＩｇＥ複合体との競合
このアッセイは、ＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＢに対するＩｇＧ１の結合を妨害する５Ａ６ＭＡｂの能力をスクリーンする。ＦｃγＲＩＩ類は、単量体ＩｇＧ１に対する親和性が弱く、したがって、ＩｇＧ１結合は、３種のＩｇＥおよび３種の抗ＩｇＥ分子、例えば、ＩｇＥに結合するヒト化ＩｇＧ１抗体であるＥ２７の安定な六量体複合体を用いてアッセイする（Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１−６６０４頁（２００１））。ヒトＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＢに対するＥ２７−ＩｇＥ六量体複合体の結合に競合する抗体の能力を評価することによるＩｇＧ結合中和に関して、５Ａ６ＭＡｂがスクリーンされた。この競合アッセイは以下のとおり実施され、結果は図１１および１２に示されている。
ＰＢＳ、ｐＨ７．４中、１ｍｇ／ｍｌのＦｃγＲＩＩＢおよびＦｃγＲＩＩＡ融合タンパク質を、ＥＬＩＳＡプレートに塗布し、４℃で４８時間置いた。２５℃で１時間、トリス緩衝生理食塩水、０．５％ウシ血清アルブミン、０．０５％ポリソルベート−２０、２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４５（アッセイ緩衝液）でプレートをブロックした。２５℃で１時間、Ｅ２７およびヒト骨髄腫ＩｇＥの等モル量を混合することにより、アッセイ緩衝液中でＥ２７−ＩｇＥ六量体複合体を調製した（Ｎｉｌｓｓｏｎ，Ｋ．，Ｂｅｎｎｉｃｈ，Ｈ．，Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，Ｓ．Ｇ．Ｏ．，およびＰｏｎｔｅｎ，Ｊ．，（１９７０）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：４７７−４８９頁）。Ｅ２７−ＩｇＥ（アッセイ緩衝液中１０．０ｍｇ／ｍｌ）をプレートに加え、２時間インキュベートした。該プレートを洗浄して、非結合Ｅ２７−ＩｇＥを除去した。５Ａ６ＭＡｂ、５Ａ６Ｆ（ａｂ）２、５Ａ６Ｆａｂ、ｍＩｇＧ１（対照）、および５Ｂ９（抗ＦｃγＲＩＩＡ／Ｂ）を、０．０１ｎＭから１００ｎＭの種々の濃度でアッセイ緩衝液中で調製した。個々のウェルに抗体を加え、１時間インキュベートした。アッセイ緩衝液でプレートを洗浄後、競合抗体の存在下、ＦｃγＲＩＩＡまたはＦｃγＲＩＩＢに結合したままのＥ２７−ＩｇＥ六量体複合体の検出を行った。検出は、Ｅ２７のＩｇＧ１部分への、ヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）２特異的ＩｇＧの結合を含んだ。使用された検出可能なペルオキシダーゼ基質は、ｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロライドであった。４９０ｎｍにおける吸光度を、Ｖｍａｘプレートリーダーを用いて読み取った。図１１は、競合的抗体（５Ａ６ＭＡｂ、５Ａ６Ｆ（ａｂ）２、５Ａ６Ｆａｂ、ｍＩｇＧ１、および５Ｂ９）の濃度の増加と共に、ＦｃγＲＩＩＡに対するＥ２７−ＩｇＥ六量体の結合の継続によって示されるように、５Ａ６がｈｕＦｃγＲＩＩＡに対するＥ２７−ＩｇＥ六量体結合を妨害していないことを示している。ＦｃγＲＩＩＡとＦｃγＲＩＩＢの双方に結合することが知られている抗体５Ｂ９（図４および図５を参照）のみが、Ｅ２７−ＩｇＥ六量体結合と競合することができた。図１２は、５Ａ６抗体、ＦａｂまたはＦ（ａｂ）２の増加と共に、Ｅ２７−ＩｇＥ六量体結合の減少によって示されるように、５Ａ６がＦｃγＲＩＩＢに対するＥ２７−ＩｇＥ六量体結合に競合することを示している。予測どおり、対照のＩｇＧ１抗体は競合しなかった。ｈｕＦｃγＲＩＩＢに対する抗体（５Ａ６、５Ａ５、５Ｈ１１．１および５Ａ６ Ｆａｂ’２）、およびＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＡ（Ｒ１３１）、またはＦｃγＲＩＩＡ（Ｈ１３１）に対するＩｇＧ１（Ｅ２７−ＩｇＥ六量体）の結合がさらに、図１３〜図１６に示されている。図１４では、抗体５Ａ６．２．１および６Ａ５の存在下で、ＦｃγＲＩＩＢに対するＩｇＧの結合が阻害されたことが示されているが、図１３では、ＦｃγＲＩＩＡ（Ｒ１３１）に対するＩｇＧの結合、図１５では、ＦｃγＲＩＩＡ（Ｈ１３１）に対するＩｇＧの結合が阻害されないことが示されている。
１．８ 免疫蛍光結合アッセイ
Ｋ５６２赤白血病細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−２４３）に発現させた天然ＦｃγＲＩＩＡ（Ｒ１３１）に対する５Ａ６ＭＡｂの間接的免疫蛍光結合アッセイを図１６に示す。Ｋ５６２細胞の個別のアリコートを、ｍＩｇＧ１イソタイプ対照（ｍｏｐｃ２１）、５Ａ６（抗ヒトＦｃγＲＩＩＢ）モノクローナル抗体またはＭｅｄａｒｅｘ４．３ＭＡｂ（抗ヒトＦｃγＲＩＩＡ／Ｂ）モノクローナル抗体のいずれかによって染色した。フルオレセイン結合Ｆ（ａｂ）’２ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆ（ａｂ）’２特異的抗体と共に、第２のインキュベーションにより間接的に検出し、フローサイトメトリーによって分析した。Ｍｅｄａｒｅｘ４．３ＭＡｂは、図１６に示されるように、ｈｕＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）に結合し、５Ａ６、抗ｈｕＦｃγＲＩＩＢ（抗ＣＤ３２Ｂ）抗体は、ｈｕＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）に結合せず、図４における点線で示されたように、イソタイプ対照、ｍｏｐｃ抗体が、ｈｕＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）にやはり結合しなかったことと両立した。
（実施例２．０ 抗ＦｃγＲＩＩＢ抗体の性質）
２．１ 材料
抗ＦｃεＲＩＭＡｂ、２２Ｅ７ＭＡｂは、受容体に結合したＩｇＥを有する、または有さないＦｃεＲＩに結合する。２２Ｅ７ＭＡｂは、Ｈｏｆｆｍａｎ−ＬａＲｏｃｈｅ細胞株ＩＧＥ４Ｒ：２２Ｅ７．２Ｄ２．１Ｄ１１から精製した（Ｒｉｓｅｋ，Ｆ．，ら、１９９１年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１１２４５−１１２５１頁）。２２Ｅ７ＭＡｂを発現するＨｏｆｆｍａｎ−ＬａＲｏｃｈｅ細胞は、１０×ＦＢＳ、１×Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ、および１×グルタミンと共に、アイエムディーエム中で増殖させた。２２Ｅ７ＭＡｂを、タンパク質Ａおよびタンパク質Ｇクロマトグラフィーを用いて精製した。２２Ｅ７抽出物をプールし、ＦｃεＲＩに対する親和性を検証した。
２．２ ＲＢＬ細胞株
親ラット肥満細胞株ＲＢＬ−２Ｈ３（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−２２５６）由来のＲＢＬ４８細胞株は、高親和性ヒトＩｇＥ受容体（ＦｃεＲＩ）のαサブユニットを発現する（Ｇｉｌｆｉｌｌｉａｎ Ａ．Ｍ．ら、１９９２年、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１４９、２４４５−２４５１頁）。ＲＢＬ４８細胞株を、電気穿孔法により、ヒトＦｃγＲＩＩＢ１の完全長αサブユニットのｃＤＮＡクローンにトランスフェクトし（Ｍｕｔａ Ｔ．ら、１９９４年、Ｎａｔｕｒｅ３６８：７０−７３頁）、これを、プロマイシン選択性発現ベクター内にサブクローン化した（Ｍｏｒｇｅｎｓｔｅｒｎ，Ｊ．Ｐ．ら、１９９０年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １８：３５８７−３５９６頁）。クローンを、１μＭのプロマイシン中で選択し、抗ヒトＦｃγＲＩＩＢモノクローナル抗体、５Ａ６．２．１による免疫蛍光染色により、ＦｃγＲＩＩＢ細胞表面発現に関して分析した。選択されたサブクローンを、ＲＢＬ４８．Ｃ．４と称した。
２．３ ヒスタミン放出
活性化受容体におけるＦｃγＲＩＩＢ交差結合（本明細書において、共架橋、共凝集、または共結合として、交換可能に称される）の効果を、アレルゲン感作ＲＢＬ４８．Ｃ．４細胞からのヒスタミン放出を阻害する該抗体の能力に基づいて定量的に測定した。アッセイ法は下記に記載され、結果はさらに、図１７に示されている。
２μｇ／ｍｌの抗ＦｃεＲＩ ＭＡｂ２２Ｅ７および０．００２μｇ／ｍｌから２μｇ／ｍｌの種々の濃度におけるｍＩｇＧ１イソタイプ対照（ｍｏｐｃ２１）または５Ａ６ ＭＡｂのいずれかを用い、２ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、１．５ｇ／Ｌの炭酸水素ナトリウム、ペニシリン、ストレプトマイシン、１５％のウシ胎仔血清を有するアッセイ緩衝液（ＥＭＥＭ（アールＢＳＳを有するイーグル最少必須培地）中、ＲＢＬ４８．Ｃ．４クローンを９６ウェルの平底マイクロタイタープレートにインキュベートした。細胞をアッセイ緩衝液中、２回洗浄し、Ｆ（ａｂ）’２ ヤギ抗マウスＦｃ特異的交差結合抗体と共に、３７℃で３０分間インキュベートした。上澄み液を採集し、ヒスタミンＥＬＩＳＡキットを用いて、上記で一般的に記載されたとおり、ＥＬＩＳＡによりヒスタミン含量に関してアッセイした。
ヒスタミン放出値は、三通りのウェルからの平均およびＳＥＭとして表し、図５にグラフで示した。ヒスタミン放出の抑制には、交差結合抗体と共に、５Ａ６と２２Ｅ７の双方が必要であった。ヒスタミン放出は、ＦｃγＲＩＩＢに対する５Ａ６の結合およびＦｃεＲＩに対する２２Ｅ７の結合によって抑制され、５Ａ６および２２Ｅ７は、ヤギ抗マウスＦｃ特異的交差結合抗体によっても交差結合されている。ヒスタミン放出抑制には、５Ａ６対２２Ｅ７の１：１の比率が最も効果的であり、１：１０、１：１００、および１：１０００の比率でも抑制が認められた。
（実施例３．０ 二重特異性抗体の作製）
本実施例は、ジスルフィド形成システイン残基を欠く（「ヒンジなし」）可変ヒンジ領域を有する二重特異性抗体の構築および精製を記載する。野生型ヒンジ配列を有する二重特異性抗体の構築もまた記載する；これらの抗体は、種々の種の抗体複合体を得る効率性を評価するために使用できる。
３．１ 発現ベクターの構築
完全長抗体の発現に関するプラスミドは全て、重鎖および軽鎖の転写に関する別個のｐｈｏＡプロモーター（ＡＰ）（Ｋｉｋｕｃｈｉら、１９８１年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９：５６７１−５６７８頁）、それに続く、翻訳開始のためのｔｒｐ シャインダルガーノ配列に依存する別個のシストロン系（Ｓｉｍｍｏｎｓら、２００２年、Ｊ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２６３：１３３−１４７頁；Ｓｉｍｍｏｎｓら、米国特許第５，８４０，５２３号）基づいた（Ｙａｎｏｆｓｋｙら、１９８１年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ９：６６４７−６６６８頁およびＣｈａｎｇら、１９８７年、Ｇｅｎｅ ５５：１８９−１９６頁）。また、重鎖および軽鎖の細胞周辺腔分泌には、熱安定性エンテロトキシンＩＩシグナル配列（ＳＴＩＩ）（Ｐｉｃｋｅｎら、１９８３年、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．４２：２６９−２７５頁およびＬｅｅら、１９８３年、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．４２：２６４−２６８頁）を用いた。双方の鎖の良好な制御は、翻訳開始領域（ＴＩＲ）に沈黙コドン変化（ＳｉｍｍｏｎｓおよびＹａｎｓｕｒａ、１９９６年、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：６２９−６３４頁およびＳｉｍｍｏｎｓら、上記）を含む相対的翻訳強度を測定した前述のＳＴＩＩシグナル配列改変体によって達成された。本発明の目的に関して、ベクター内の特定のＴＩＲ対に関する翻訳強度の組み合わせは、（Ｎ−軽、Ｍ−重）によって表され、Ｎは軽鎖の相対的ＴＩＲ強度、およびＭは重鎖の相対的ＴＩＲ強度である。最後に、λｔ０転写ターミネーター（ＳｃｈｌｏｓｓｔｉｓｓｅｋおよびＧｒｏｓｓｅ、１９９７年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：３１８５頁）を、双方の鎖のコード配列の下流に配置した。プラスミドには全てｐＢＲ３２２ベースのベクター系のフレームワークが用いられた（Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ、１９７８年、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．４３：７７−９０頁）。
二重特異性ポリペプチド鎖の結合を増強させるために、「ノブおよびホール」変異を二量体領域に導入した。当然のことではあるが、どちらかの鎖が「ノブ」変異を含んでなり得、他方の鎖が「ホール」変異を含む。本発明は双方の実施形態を含む。例示的な本実施例では、二重特異性抗体の５Ａ６アームは、「ノブ」変異を含むように構築され、二重特異性抗体の２２Ｅ７アームは、相補的な「ホール」変異を含むように構築される。
（ｉ）プラスミドｐ５Ａ６．１１．ノブ．Ｈｇ−
所望のｐ５Ａ６．１１．ノブ．Ｈｇ−プラスミドを作出するために、２種の中間体プラスミドが必要とされる。５Ａ６（抗ＦｃγＲＩＩＢ）キメラ軽鎖の可変ドメインを先ずｐＶＧ１１．ＶＮＥＲＫノブプラスミドに転移させて、中間体プラスミドｐ５Ａ６．１．Ｌ．ＶＧ．１．Ｈ．ノブを作出する。次いで、５Ａ６キメラ重鎖の可変ドメインをｐ５Ａ６．１．Ｌ．ＶＧ．１．Ｈ．ノブプラスミドに転移させて、中間体プラスミドｐ５Ａ６．１１．ノブプラスミドを作出する。以下に、これらの中間体プラスミドｐ５Ａ６．１．ＬＣ．ＶＧ．１．ＨＣ．ノブおよびｐ５Ａ６．１１．ノブの調製、引き続いて、ｐ５Ａ６．１１．ノブ．Ｈｇ−ｐ５Ａ６．１．Ｌ．ＶＧ．１．Ｈ．ノブの構築を記載する。
このプラスミドは、完全長抗体重鎖−軽鎖（Ｈ／Ｌ）単量体抗体の作出に適合したプラスミドに、５Ａ６抗体のマウス軽可変ドメインを転移するために構築した。このプラスミドの構築は、２つのＤＮＡ断片の結合を含んだ。第１のものは、小さなＥｃｏＲＩ−ＰａｃＩ断片が除去されたｐＶＧ１１．ＶＮＥＲＫノブベクターであった。プラスミドｐＶＧ１１．ＶＮＥＲＫノブは、軽および重可変ドメインが、「ノブ」変異（Ｔ３６６Ｗ）（Ｍｅｒｃｈａｎｔら、１９９８年、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６：６７７−６８１頁）および上記の全ての制御要素を有する抗ＶＥＧＦ抗体（ＶＮＥＲＫ）に変化した、１−軽および１−重の相対的ＴＩＲ強度（Ｓｉｍｍｏｎｓら、２００２年、上記）を有する別個のシストロンベクターの誘導体である。結合の第２の部分は、上記のＥｃｏＲＩ−ＰａｃＩ消化ｐＶＧ１１．ＶＮＥＲＫノブベクターへの、図２５（配列番号３５）で示された配列の結合を含んだ。該配列は、アルカリホスファターゼプロモーター（ｐｈｏＡ）、ＳＴＩＩシグナル配列および５Ａ６抗体．ｐ５Ａ６．１１．ノブの軽鎖全体（可変ドメインおよび定常ドメイン）をコードする。
このプラスミドは、ヒト重鎖フレームワークに、５Ａ６抗体のマウス重可変ドメインを導入して、キメラ完全長重鎖／軽鎖（Ｈ／Ｌ）単量体抗体を作出するために構築された。ｐ５Ａ６．１１．ノブの構築は、２つのＤＮＡ断片の結合を含んだ。第１の断片は、小さなＭｌｕＩ−ＰｓｐＯＭＩ断片が除去された上記のｐ５Ａ６．１．Ｌ．ＶＧ．１．Ｈ．ノブベクターであった。第２の断片は、ＭｌｕＩ−ＰｓｐＯＭＩ消化ｐ５Ａ６．１．Ｌ．ＶＧ．１．Ｈ．ノブベクターへの、図２７に示された配列（配列番号３７）の結合を含んだ。該配列は、ＳＴＩＩシグナル配列の最後の３つのアミノ酸および５Ａ６抗体のマウス重可変ドメインのおよそ１１９のアミノ酸をコードする。
ｐ５Ａ６．１１．ノブ．Ｈｇ−
完全長キメラ５Ａ６ヒンジなしノブ重／軽（Ｈ／Ｌ）鎖単量体抗体を発現させるために、ｐ５Ａ６．１１．ノブ．Ｈｇ−プラスミドを構築した。該プラスミドの構築は、２つのＤＮＡ断片の結合を含む。第１の断片は、小さなＰｓｐＯＭＩ−ＳａｃＩＩ断片が除去された上記のｐ５Ａ６．１１．ノブベクターであった。第２の断片は、２つのヒンジシステインがセリンに変換したヒト重鎖のおよそ１７１のアミノ酸をコードするｐ４Ｄ５．２２．Ｈｇ−からのおよそ５１４の塩基対ＰｓｐＯＭＩ−ＳａｃＩＩ断片であった（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、第１巻、ＮＩＨ、ベセスダ、メリーランド州におけるＣ２２６Ｓ、Ｃ２２９Ｓ、ＥＵ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｃｈｅｍｅ ｏｆ Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら（編集）、１９９１年、６７１頁）。プラスミドｐ４Ｄ５．２２Ｈｇ−は、軽および重可変ドメインが、抗ＨＥＲ２抗体に変化し、２つのヒンジシステインがセリンに変換した（Ｃ２２６Ｓ、Ｃ２２９Ｓ）、２−軽および２−重の相対ＴＩＲ強度（Ｓｉｍｍｏｎｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２６３：１３３−１４７頁（２００２））を有する別個のシストロンベクターの誘導体である。
（ｉｉ） プラスミドｐ５Ａ６．２２．ノブ．Ｈｇ−
所望のｐ５Ａ６．２２．ノブ．Ｈｇ−プラスミドを作製するためには、１種の中間体プラスミドが必要とされた。ｐｈｏＡプロモーターおよびＳＴＩＩシグナル配列（軽鎖の相対ＴＩＲ強度は２）を先ずｐ５Ａ６．１１．ノブ．Ｈｇ−プラスミドに転移させて、中間体プラスミドｐ５Ａ６．２１．ノブ．Ｈｇ−を作出する。以下に、中間体プラスミドｐ５Ａ６．２１．ノブ．Ｈｇ−の調製、引き続いて、ｐ５Ａ６．２２．ノブ．Ｈｇ−の構築を記載する。
ｐ５Ａ６．２１．ノブ．Ｈｇ−
このプラスミドは、軽鎖にＳＴＩＩシグナル配列（相対ＴＩＲ強度は２）を導入するために構築した。ｐ５Ａ６．２１．ノブ．Ｈｇ−の構築は、３つのＤＮＡ断片の結合を含んだ。第１の断片は、小さなＥｃｏＲＩ−ＰａｃＩ断片が除去されたｐ５Ａ６．１１．ノブ．Ｈｇ−ベクターであった。第２の断片は、キメラ５Ａ６抗体の軽鎖をコードするｐ５Ａ６．１１．ノブ．Ｈｇ−プラスミドからのおよそ６５８の塩基対ＮｓｉＩ−ＰａｃＩ断片であった。結合の第３の部分は、以下のプライマーを用いて、ｐ１Ｈ１．２２．Ｈｇ−プラスミドから作出されたおよそ４８９塩基対ＥｃｏＲＩ−ＮｓｉＩ ＰＣＲ断片であった：
５’−ＡＡＡＧＧＧＡＡＡＧＡＡＴＴＣＡＡＣＴＴＣＴＣＣＡＧＡＣＴＴＴＧＧＡＴＡＡＧＧ
（配列番号２７）
５’−ＡＡＡＧＧＧＡＡＡＡＴＧＣＡＴＴＴＧＴＡＧＣＡＡＴＡＧＡＡＡＡＡＡＣＧＡＡ
（配列番号２８）
プラスミドｐ１Ｈ１．２２．Ｈｇ−は、軽および重可変ドメインが、ラット抗組織因子抗体に変化し、２つのヒンジシステインがセリンに変換した（Ｃ２２６Ｓ、Ｃ２２９Ｓ）、２−軽および２−重の相対ＴＩＲ強度（Ｓｉｍｍｏｎｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２６３：１３３−１４７頁（２００２））を有する別個のシストロンベクターの誘導体である。
ｐ５Ａ６．２２．ノブ．Ｈｇ−
このプラスミドは、重鎖に２の相対ＴＩＲ強度を有するＳＴＩＩシグナル配列を導入するために構築された。ｐ５Ａ６．２２．ノブ．の構築は、２つのＤＮＡ断片の結合を含んだ。第１のものは、小さなＰａｃＩ−ＭＩｕＩ断片が除去されたｐ５Ａ６．２１．ノブ．Ｈｇ−ベクターであった。結合の第２の部分は、軽鎖のλｔ０転写ターミネーター、ｐｈｏＡプロモーター、およびＳＴＩＩシグナル配列（重鎖の相対ＴＩＲ強度は２）をコードするｐ１Ｈ１．２２．Ｈｇ− プラスミドからのおよそ５０３の塩基対ＰａｃＩ−ＭＩｕＩ断片であった。
（ｉｉｉ） プラスミドｐ２２Ｅ７．１１．ホール．Ｈｇ−
所望のｐ２２Ｅ７．１１．ホール．Ｈｇ−プラスミドを作製するためには、２種の中間体プラスミドが必要とされた。２２Ｅ７（抗ＦｃεＲＩ）キメラ軽鎖の可変ドメインを先ずｐＶＧＧ１１．ＶＮＥＲＫ．ホールプラスミドに転移させて、中間体プラスミドｐ２２Ｅ７．１．Ｌ．ＶＧ．１．Ｈ．ホールを作出した。次いで、２２Ｅ７キメラ重鎖の可変ドメインを、ｐ２２Ｅ７．１．Ｌ．ＶＧ．１．Ｈ．ホールプラスミドに転移させて、中間体プラスミドｐ２２Ｅ７．１１ホールプラスミドを作出した。以下に、これらのプラスミドｐ２２Ｅ７．１．Ｌ．ＶＧ．１．Ｈ．ホールおよびｐ２２Ｅ７．１１．ホールの調製、引き続いて、ｐ２２Ｅ７．１１．ホールＨｇ−の構築を記載する。
ｐ２２Ｅ７．１．Ｌ．ＶＧ．１．Ｈ．ホール
このプラスミドは、完全長重鎖／軽鎖（Ｈ／Ｌ）単量体抗体の作出に適合したプラスミドに、２２Ｅ７抗体のマウス軽可変ドメインを転移させるために構築した。このプラスミドの構築は、２つのＤＮＡ断片の結合を含んだ。第１の断片は、小さなＥｃｏ−ＲＩ−ＰａｃＩ断片が除去されたｐＶＧＧ１１．ＶＮＥＲＫ．ホールベクターであった。プラスミドｐＶＧＧ１１．ＶＮＥＲＫ．ホールは、軽および重可変ドメインが、「ホール」変異（Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ）（Ｍｅｒｃｈａｎｔら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６：６７７−６８１頁）および上記の全ての制御要素を有する抗ＶＥＧＦ抗体（ＶＮＥＲＫ）に変化した、１−軽および１−重の相対ＴＩＲ強度（Ｓｉｍｍｏｎｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２６３：１３３−１４７頁（２００２））を有する別個のシストロンベクターの誘導体である。結合の第２の部分は、上記のＥｃｏＲＩ−ＰａｃＩ消化ｐＶＧ１１．ＶＮＥＲＫ．ホールベクターへの、図２６（配列番号３６）で示された配列の結合を含んだ。該配列は、アルカリホスファターゼプロモーター（ｐｈｏＡ）、ＳＴＩＩシグナル配列および２２Ｅ７抗体の軽鎖全体（可変ドメインおよび定常ドメイン）をコードする。
ｐ２２Ｅ７．１１．ホール
このプラスミドは、２２Ｅ７抗体のマウス重可変ドメインを、ヒト重鎖フレームワークに導入して、キメラ完全長重鎖／軽鎖Ｈ／Ｌ単量体抗体を作出するために構築した。ｐ２２Ｅ７．１１．ノブの構築は、２つのＤＮＡ断片の結合を含んだ。第１のものは、小さなＭＩｕＩ−ＰｓｐＯＭＩ断片が除去されたｐ２２Ｅ７．１．Ｌ．ＶＧ．１．Ｈ．ホールベクターであった。結合の第２の部分は、ＭＩｕＩ−ＰｓｐＯＭＩ消化ｐ２２Ｅ７．１．Ｌ．ＶＧ．１．Ｈ．ホールベクターへの、図２８（配列番号３８）で示された配列の結合を含んだ。該配列は、ＳＴＩＩシグナル配列の最後の３つのアミノ酸および２２Ｅ７抗体のマウス重可変ドメインのおよそ１２３のアミノ酸をコードする。
ｐ２２Ｅ７．１１．ホール．Ｈｇ−
ｐ２２Ｅ７．１１．ホール．Ｈｇ−プラスミドは、完全長キメラ２２Ｅ７ヒンジなしホール重鎖／軽鎖（Ｈ／Ｌ）単量体抗体を発現させるために構築した。該プラスミドの構築は、２つのＤＮＡ断片の結合を含んだ。第１のものは、小さなＰｓｐＯＭＩ−ＳａｃＩＩ断片が除去されたｐ２２Ｅ７．１１．ホールベクターであった。結合の第２の部分は、２つのヒンジシステインがセリンに変換した（Ｃ２２６Ｓ、Ｃ２２９Ｓ）、ヒト重鎖のおよそ１７１のアミノ酸をコードするｐ４Ｄ５．２２．Ｈｇ−からの５１４の塩基対ＰｓｐＯＭＩ−ＳａｃＩＩ断片であった。
（ｉｖ） プラスミド ｐ２２Ｅ７．２２．ホール．Ｈｇ−
所望のｐ２２Ｅ７．２２．ホール．Ｈｇ− プラスミドを作製するためには、１種の中間体プラスミドが必要とされた。軽鎖のｐｈｏＡプロモーターおよびＳＴＩＩシグナル配列（相対ＴＩＲ強度は２）を先ずｐ２２Ｅ７．１１．ホール．Ｈｇ−プラスミドに転移させて、中間体プラスミドｐ２２Ｅ７．２１．ホール．Ｈｇ−を作出した。以下に、中間体プラスミドｐ２２Ｅ７．２１．ホール．Ｈｇ−の調製、引き続いて、ｐ２２Ｅ７．２２．ホール．Ｈｇ−の構築を記載する。
ｐ２２Ｅ７．２１．ホール．Ｈｇ−
このプラスミドは、軽鎖のＳＴＩＩシグナル配列（相対ＴＩＲ強度は２）を導入するために構築した。ｐ２２Ｅ７．２１．ホール．Ｈｇ−の構築は、３つのＤＮＡ断片の結合を含んだ。第１の断片は、小さいＥｃｏＲＩ−ＰａｃＩ断片が除去されたｐ２２Ｅ７．１１．ホール．Ｈｇ−ベクターであった。第２の断片は、キメラ２２Ｅ７抗体の軽鎖をコードするｐ２２Ｅ７．１１．ホール．Ｈｇ−プラスミドからのおよそ６４７塩基対ＥｃｏＲＩ−ＰａｃＩ断片であった。第３の断片は、アルカリホスファターゼプロモーター（ｐｈｏＡ）およびＳＴＩＩシグナル配列をコードするｐ１Ｈ１．２２．Ｈｇ−プラスミドからのおよそ５００塩基対ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＶ断片であった。
ｐ２２Ｅ７．２２．ホール．Ｈｇ−
このプラスミドは、重鎖のＳＴＩＩシグナル配列（相対ＴＩＲ強度は２）を導入するために構築した。ｐ２２Ｅ７．２２．ホール．Ｈｇ−の構築は、３つのＤＮＡ断片の結合を含んだ。第１の断片は、小さいＥｃｏＲＩ−Ｍ１ｕＩ断片が除去されたｐ２２Ｅ７．２１．ホール．Ｈｇ−であった。第２の断片は、アルカリホスファターゼプロモーター、ＳＴＩＩシグナル配列、およびキメラ２２Ｅ７抗体の軽鎖をコードするｐ２２Ｅ７．２１．ホール．Ｈｇ−プラスミドからのおよそ１１４１塩基対ＥｃｏＲＩ−ＰａｃＩ断片であった。第３の断片は、軽鎖のλｔ０転写ターミネーターおよび重鎖のＳＴＩＩシグナル配列（相対ＴＩＲ強度は２）をコードするｐ１Ｈ１．２２．Ｈｇ−プラスミドからのおよそ５０３塩基対ＰａｃＩ−Ｍ１ｕＩ断片であった。
３．２ 抗体発現．．５Ａ６ノブおよび２２Ｅ７ホール
抗ＦｃγＲＩＩＢ（５Ａ６）／抗ＦｃεＲＩ（２２Ｅ７）抗体の作出におけるヘテロ二量体化を促進するために、「ホール内ノブ」技法を利用して、完全長二重特異性抗体を形成した。Ｆｃ配列のＣＨ３ドメインにおける「ホール内ノブ」変異により、二量体の形成が大いに減少することが報告されている（Ｍｅｒｃｈａｎｔら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６：６７７−６８１頁（１９９８））。「ノブ」変異（Ｔ３６６Ｗ）をＦｃ領域に導入することにより、抗ＦｃγＲＩＩＢ成分のための構築体、および「ホール」変異（Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ）を導入することにより、抗ＦｃεＲＩ成分（ｐ２２Ｅ７．１１．ホール）のための構築体を調製した（Ｍｅｒｃｈａｎｔ、１９９８年、上記）。
ノブ抗ＦｃγＲＩＩＢ単量体抗体産生のために、プラスミドｐ５Ａ６．１１．ノブを、およびホール抗ＦｃεＲＩ単量体抗体のために、ｐ２２Ｅ７．１１．ホールを用いて、抗体の小規模合成を実施した。プラスミドの各々は、軽鎖と重鎖の双方に関して、１の相対ＴＩＲ強度を有した。各構築体の小規模発現には、宿主細胞として、大腸菌株３３Ｄ３（Ｗ３１１０ΔｆｈｕＡ（ΔｔｏｎＡ）ｐｔｒ３ ｌａｃ Ｉｑ ｌａｃＬ８ΔｏｍｐＴΔ（ｎｍｐｃ−ｆｅｐＥ）ｄｅｇＰ４１ ｋａｎＲ）を用いた。形質転換後、カルベニシリン（５０μｇ／ｍＬ）を添加した５ｍＬのＬＢ培地に、選択された形質転換体を播種し、培養ウィール上、３０℃で一晩増殖させた。次いで、各培養物を、Ｃ．Ｒ．Ａ．Ｐ．リン酸制限培地に希釈（１：１００）した（Ｓｉｍｍｏｍｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２６３：１３３−１４７頁（２００２））。次いで、誘導培養物に、カルベニシリンを５０μｇ／ｍＬの濃度で添加し、培養ウィール上、該培養物を３０℃でおよそ２４時間増殖させた。別に記述しない限り、振とうフラスコ誘導は全て、５ｍＬ容量で実施した。
誘導培養物からの非還元細胞全体のライセートは、以下のとおり調製した：（１）１ＯＤ６００ −ｍＬの誘導サンプルを、マイクロチューブで遠心分離した；（２）各ペレットを、９０μＬのＴＥ（１０ｍＭのトリスｐＨ７．６、１ｍＭのＥＤＴＡ）中に再懸濁した；（３）遊離システインを抑え、ジスルフィドシャッフリングを防ぐために、各サンプルに、１０μＬの１００ｍＭヨード酢酸（Ｓｉｇｍａ Ｉ−２５１２）を加えた；（４）２０μＬの１０％ＳＤＳを、各サンプルに加えた。サンプルに渦を巻かせ、約９０℃で３分間加熱し、次いで、再び渦を巻かせた。サンプルが室温まで冷却した後、７５０μＬのアセトンを加えて、タンパク質を沈殿させた。サンプルに渦を巻かせ、約１５分間、室温に置いた。マオクロ遠心分離で５分間の遠心分離後、各サンプルの上澄み液を吸引により除去し、各タンパク質ペレットを、５０μＬのｄＨ２Ｏプラス５０μＬの２×ＮＯＶＥＸ ＳＤＳサンプル緩衝液中に再懸濁した。次いで、サンプルを約９０℃で４分間加熱し、渦を巻かせ、室温まで冷却させた。５分間の最終遠心分離を実施し、上澄み液を清浄な管に移した。
誘導培養物からの還元細胞全体のライセートは、以下のとおり調製した：（１）１ＯＤ６００ −ｍＬの誘導サンプルを、マイクロチューブで遠心分離した；（２）各ペレットを、９０μＬのＴＥ（１０ｍＭのトリスｐＨ７．６、１ｍＭのＥＤＴＡ）中に再懸濁した；（３）ジスルフィド結合を還元させるため、各サンプルに、１０μＬの１Ｍ ジチオスレイトール（Ｓｉｇｍａ Ｄ−５５４５）を加えた；（４）２０μＬの１０％ＳＤＳを、各サンプルに加えた。サンプルに渦を巻かせ、約９０℃で３分間加熱し、次いで、再び渦を巻かせた。サンプルが室温まで冷却した後、７５０μＬのアセトンを加えて、タンパク質を沈殿させた。サンプルに渦を巻かせ、約１５分間、室温に置いた。マオクロ遠心分離で５分間の遠心分離後、各サンプルの上澄み液を吸引により除去し、各タンパク質ペレットを、１０μＬの１Ｍ ジチオスレイトールプラス４０μＬのｄＨ２０プラス５０μＬの２×ＮＯＶＥＸ ＳＤＳサンプル緩衝液中に再懸濁した。次いで、サンプルを約９０℃で４分間加熱し、渦を巻かせ、室温まで冷却させた。５分間の最終遠心分離を実施し、上澄み液を清浄な管に移した。
調製後、各サンプルの５μＬから８μＬを１０ウェル、１．０ｍｍ １２％トリス−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＮＯＶＥＸ）上に乗せ、約１２０ボルトで１．５〜２時間、電気泳動を行った。次いで、生じたゲルを、クーマシーブルーで染色するか、ウェスタンブロット分析に用いた。
ウェスタンブロット分析では、１０ｍＭのＣＡＰＳ緩衝液、ｐＨ１１＋３％メタノール中、ニトロセルロース膜（ＮＯＶＥＸ）上に、該ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを電気ブロットした。１×ＮＥＴ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのトリス ｐＨ７．４、０．０５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００）プラス０．５％ゼラチンの溶液を用い、室温でおよそ３０分〜１時間揺動させて、該膜をブロックした。ブロッキング処置後の抗Ｆａｂウェスタンブロット分析では、１×ＮＥＴ／０．５％ゼラチン／抗Ｆａｂ抗体（ヒトＩｇＧＦａｂに対するペルオキシダーゼ結合ヤギＩｇＧフラクション；ＣＡＰＰＥＬ番号５５２２３）の溶液中に、該膜を置いた。抗Ｆａｂ抗体の希釈は、抗体のロットに依って、１：５０，０００から１：１，０００，０００の範囲であった。あるいは、抗Ｆｃウェスタンブロット分析では、１×ＮＥＴ／０．５％ゼラチン／抗Ｆｃ抗体（ヒトＦｃ断片に対するペルオキシダーゼ結合ヤギＩｇＧフラクション；ＢＥＴＨＹＬ番号Ａ８０−１０４Ｐ−４１）の溶液中に、該膜を置いた。抗Ｆｃ抗体の希釈は、抗体のロットに依って、１：５０，０００から１：２５０，０００の範囲であった。各々の場合において、該膜は、抗体溶液中、揺動させながら室温で一晩置いた。翌朝、該膜を、１×ＮＥＴ／０．５％ゼラチン中、最低３×１０分洗浄し、次いでＴＢＳ（２０ｍＭのトリス ｐＨ７．５、５００ｍＭのＮａＣｌ）中、１×１５分間洗浄した。抗Ｆａｂ抗体および抗Ｆｃ抗体に結合したタンパク質バンドを、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＥＣＬ検出キットを用い、引き続き、Ｘ線フィルムに曝露して可視化した。
ｐ５Ａ６．１１．ノブ（ノブ抗ＦｃγＲＩＩＢ）抗体およびｐ２２Ｅ７．１１．ホール（ホール抗ＦｃεＲＩ）抗体の発現に関する抗Ｆａｂウェスタンブロットの結果を図１８に示す。それらは、レーン１におけるノブ抗ＦｃγＲＩＩＢ抗体、ならびにレーン２におけるホール抗ＦｃεＲＩ抗体に関する完全に折りたたまれ、組み立てられた重軽（ＨＬ）鎖種の発現を明らかにしている。抗Ｆａｂ抗体は、軽鎖の異なる可変ドメインが異なる親和性を有する。非還元サンプルにおいては、各抗体の発現により、重軽鎖種が検出されることになる。特に、ホール抗ＦｃεＲＩ抗体に関して、完全長抗体ホモ二量体種が検出可能であるが、それは、完全に折りたたまれ、組み立てられた抗体種全体のうちの小さい比率にすぎない。抗ＦｃγＲＩＩＢ抗体に関しては「ノブ」変異、および抗ＦｃεＲＩ抗体に関しては「ホール」変異を含む結果、完全長抗体ホモ二量体種の折りたたみおよび組み立てに都合がよくない。還元サンプルでは、ノブ抗ＦｃγＲＩＩＢ抗体およびホール抗ＦｃεＲＩ抗体に関して、軽鎖が検出される。
同様に、抗Ｆｃウェスタンブロットの結果が図１９に示されており、それらは、レーン１におけるノブ抗ＦｃγＲＩＩＢ抗体、ならびにレーン２におけるホール抗ＦｃεＲＩ抗体に関する完全に折りたたまれ、組み立てられた重軽（ＨＬ）鎖種の発現を、やはり明らかにしている。抗Ｆｃ抗体は軽鎖に結合できず、したがって、軽鎖は検出されない。非還元サンプルに関して、各抗体の発現により、重軽鎖種が検出されることになるが、完全長抗体ホモ二量体種は検出されない。還元サンプルに関しては、ノブ抗ＦｃγＲＩＩＢ抗体およびホール抗ＦｃεＲＩ抗体に関して、同様な量の重鎖が検出される。
３．３ ５Ａ６ノブヒンジ改変抗体および２２Ｅ７ホールヒンジ改変抗体
ｐ５Ａ６．１１．ノブ構築体およびｐ２２Ｅ７．１１．ホール構築体の発現から得られた一次抗体種は、完全に折りたたまれ、組み立てられた重軽（ＨＬ）鎖種であった。しかし、二重特異性抗ＦｃγＲＩＩＢ／ＦｃεＲＩ（５Ａ６／２２Ｅ７）抗体に関する、本明細書に記載した調製法を促進するために、２つのヒンジシステインをセリンに置換する（Ｃ２２６Ｓ、Ｃ２２９Ｓ、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．らのＥＵナンバリング方式、上記）ことによって、２つの重鎖のヒンジ配列を修飾した。ヒンジ改変体は、下記で「ヒンジなし」とも称される。
ノブ抗ＦｃγＲＩＩｂ（５Ａ６）抗体およびホール抗ＦｃεＲＩ（２２Ｅ７）抗体に関して、Ｃ２２６Ｓ、Ｃ２２９Ｓ置換を有するヒンジ改変体を含むプラスミド構築体を調製した。各抗体に関して２つのプラスミド構築体を調製した。１つの構築体は、軽鎖と重鎖双方に関して、１の相対ＴＩＲ強度を有し、第２の構築体は、軽鎖と重鎖双方に関して、２の相対ＴＩＲ強度を有した。
次いで、ノブ抗ＦｃγＲＩＩＢ抗体（ｐ５Ａ６．１１．ノブプラスミドから）、ホール抗ＦｃεＲＩ抗体（ｐ２２Ｅ７．１１．ホール）ノブヒンジなし抗ＦｃγＲＩＩｂ抗体（ｐ５Ａ６．１１．ノブ．Ｈｇ−およびｐ５Ａ６．２２．ノブ．Ｈｇ−），およびホールヒンジなし抗ＦｃεＲＩ抗体（ｐ２２Ｅ７．１１．ホール．Ｈｇ−およびｐ２２Ｅ７．２２．ホール．Ｈｇ−）を本明細書の上記に記載されたそれらのそれぞれのプラスミドから発現させた。細胞全体のライセートを調製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロースに移し、上記のヤギ抗ヒトＦａｂ結合抗体およびヤギ抗ヒトＦｃ結合抗体によって検出した。
抗Ｆａｂウェスタンブロットの結果は、図２０に示されており、それらは、レーン２におけるノブヒンジなし抗ＦｃγＲＩＩＢ単量体抗体（相対ＴＩＲ強度−軽鎖で１および重鎖で１）ならびにレーン５におけるホールヒンジなし抗ＦｃεＲＩ単量体抗体（相対ＴＩＲ強度−軽鎖で１および重鎖で１）に関する重−軽（ＨＬ）鎖種の折りたたみおよび組み立てにおけるかなりの改善を示している。また、抗Ｆａｂウェスタンブロットの結果は、軽鎖および重鎖の相対ＴＩＲ強度が１から２に増加すると、単量体ＨＬノブヒンジなし抗ＦｃγＲＩＩＢ抗体（レーン３）および単量体ＨＬホールヒンジなし抗ＦｃεＲＩ抗体（レーン６）に関する重−軽（ＨＬ）鎖種の折りたたみおよび組み立てが増加することを示している。抗Ｆａｂ抗体は、軽鎖の異なる可変ドメインが異なる親和性を有し、一般に重鎖は親和性が低い。非還元サンプルに関して、各抗体の発現により、重軽鎖種が検出されることになるが、完全長抗体種は、ヒンジシステインがセリンに変換する結果、検出されない。２つのヒンジシステインがセリンに変換される場合、またやはり、軽鎖および重鎖の相対ＴＩＲ強度が１から２に増加する場合、ノブヒンジなし抗ＦｃγＲＩＩｂ抗体およびホールヒンジなし抗ＦｃεＲＩ抗体の各々で、重−軽（ＨＬ）鎖種の折りたたみおよび組み立てにかなりの改善がある。還元サンプルでは、種々の抗ＦｃγＲＩＩｂ抗体および抗ＦｃεＲＩ抗体に関して、重鎖ならびに軽鎖が検出される。相対ＴＩＲ強度が１から２に増加すると、重鎖および軽鎖の量の増加が検出される。
同様に、図２１における抗Ｆｃウェスタンブロットの結果は、２つの重鎖（ＨＣ）ヒンジシステインがセリンに変換される場合、またやはり、軽鎖および重鎖の相対ＴＩＲ強度が１から２に増加する場合、ノブヒンジなし抗ＦｃγＲＩＩＢ抗体およびホールヒンジなし抗ＦｃεＲＩ抗体の双方で、重−軽（ＨＬ）鎖単量体種の折りたたみおよび組み立てにかなりの改善があることを示している。抗Ｆｃ抗体は軽鎖に結合できず、したがって、軽鎖は検出されない。還元サンプルに関して、種々の抗ＦｃγＲＩＩｂ抗体および抗ＦｃεＲＩ抗体に関して、重鎖が検出される。相対ＴＩＲ強度が１から２に増加すると、重鎖の量の増加が検出される。
３．４ 二重特異性抗体成分の精製
上記の可変ヒンジ領域を有する抗体の文脈で、精製された機能的二重特異性抗体を得る容易さおよび効率をさらに評価した。
１． 大腸菌ペーストからの抽出
凍結大腸菌ペーストを解凍し、ＨＣｌでｐＨ５に調整した５容量（ｖ／ｗ）の蒸留水に懸濁させ、遠心分離し、上澄み液を捨てた。この不溶性ペレットを、ポリトロン（Ｂｒｉｎｋｍａｎ）を用いて、ｐＨ９で５〜１０容量の緩衝液中に再懸濁し、遠心分離後、上澄み液を保持した。この処理をもう一度繰り返した。
次いで、不溶性ペレットを同じ緩衝液の５〜１０容量に再懸濁し、マイクロフリューダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）により継代分裂させた。遠心分離後、上澄み液を保持した。
該上澄み液を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およびウェスタンブロットにより評価し、単一アーム抗体（すなわち、単一の重鎖プラス軽鎖の分子量に相当するバンド）を含有するものをプールした。
２． タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィー
プールした上澄み液を、ｐＨ８に調整し、ＰｒｏＳｅｐ（商標）−Ａビーズ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を加えた（１０リットル当たりおよそ２５０ｍｌのビーズ）。該混合物を４℃で２４〜７２時間攪拌し、ビーズを沈降させ、上澄み液を流し捨てた。ビーズをクロマトグラフィーカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＸＫ５０（商標）に移し、１０ｍＭのトリス緩衝液ｐＨ７．５で洗浄した。次いでこのカラムを、５０ｍＭのクエン酸、０．１ＭのＮａＣｌ緩衝液中、ｐＨ勾配を用いて溶出させた。出発緩衝液は、ｐＨ６に調整し、勾配は、ｐＨ２の緩衝液を用いて直線希釈によって作成した。
フラクションを、８Ｍ尿素およびトリス塩基の添加により、ｐＨ５、および２Ｍ尿素に調整し、次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価し、プールした。
３． カチオン交換クロマトグラフィー
Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（商標）カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、２Ｍ尿素、２５ｍＭのＭＥＳ ｐＨ５．５により平衡化した。ＰｒｏＳｅｐ（商標）−Ａ溶出液プールを等量の平衡化緩衝液で希釈し、カラムに装填した。平衡化緩衝液、次いで２５ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ５．５で洗浄後、カラムを、２５ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ５．５中、０Ｍ〜１Ｍ ＮａＣｌの直線勾配で展開した。フラクションを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に基づいてプールした。
４． 疎水性相互作用クロマトグラフィー
ＨＩ−Ｐｒｏｐｙｌ（商標）カラム（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ）を、０．５Ｍの硫酸ナトリウム、２５ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ６で平衡化した。Ｓ−Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（商標）溶出物を、０．５Ｍの硫酸ナトリウム、ｐＨ６に調整し、カラムに装填し、このカラムを、２５ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ６中、０．５Ｍ〜０Ｍ 硫酸ナトリウムの勾配により展開した。フラクションを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に基づいてプールした。
５． サイズ排除クロマトグラフィー
ＣｅｎｔｒｉＰｒｅｐ（商標）ＹＭ１０コンセントレーター（Ａｍｉｃｏｎ）を用いて、ＨＩ−Ｐｒｏｐｙｌ（商標）溶出液プールを濃縮し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）ＳＸ２００カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に装填し、０．１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６中、１０ｍＭのコハク酸または１０ｍＭのヒスチジンで平衡化し、２．５ｍｌ／分でカラムを展開した。フラクションを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に基づいてプールした。
３．５ 二重特異性抗体抗体作出のための抗体アニーリング
２つの類似した（同じではない）アニーリング法を下記に記載する。これらは双方とも二重特異性抗体を良好な収量で生じた。下記の抗体および抗体成分の重鎖は、上記の可変ヒンジ領域を含有する。
ヒンジ改変５Ａ６ノブおよびヒンジ改変２２Ｅ７ホールのアニーリング−方法１
２５ｍＭのＭＥＳ ｐＨ５．５、０．５ＭのＮａＣｌ中、精製した５Ａ６ノブおよび２２Ｅ７ホールの重鎖／軽鎖単量体抗体を、それらの濃度に基づき、等モル比で混合した。次いで、この混合物を５０℃で、５分間から１時間加熱した。このアニーリング温度は、これらのＣＨ３改変体に関して、以前記載された融解曲線（Ａｔｗｅｌｌ，Ｓ．ら、１９９７年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７０：２６−３５頁）から誘導した。次いで、アニールした抗体をその二重特異性を判定するための分析に供した。
二重特異性の分析
１）等電点電気泳動
アニールした抗体を、サンプルに等電点電気泳動分析を実施することにより、二重特異性について検証した。５Ａ６ノブ抗体は、７．１３のｐＩを有し、一方、２２Ｅ７ホールは、９．１４のｐＩを有する。５Ａ６ノブ／２２Ｅ７ホール抗体は、８．６７のｐＩを有する。図２２は、クーマシーブルーによる染色後、等電点電気泳動ゲル上の、５Ａ６ノブ、２２Ｅ７ホールおよび二重特異性５Ａ６ノブ／２２Ｅ７ホール（加熱の前および後）抗体の動きを示している。室温での混合時に、いくらかのアニーリングが存在するが、５０℃への加熱は、この方法の達成を促進するようである。５Ａ６ノブと２２Ｅ７ホールの間のｐＩを有する新たなタンパク質バンドの出現は、二重特異性抗体の形成を検証している。
２）アフィニティーカラム分析
５Ａ６ノブ、２２Ｅ７ホールおよび二重特異性５Ａ６ノブ／２２Ｅ７ホール抗体の挙動を、ＦｃγＲＩＩＢアフィニティーカラム上で観察した。製造元の使用説明書に従って、小型カラムにおける固体支持体に、ヒトＦｃγＲＩＩＢ（細胞外ドメイン）−ＧＳＴ融合タンパク質を結合した（Ｐｉｅｒｃｅ、ＵｌｔｒａＬｉｎｋ（商標）Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｋｉｔ＃４６５００）。ＰＢＳ（１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、８ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１．５ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．２）中の５Ａ６ノブ、２２Ｅ７ホールおよび二重特異性５Ａ６ノブ／２２Ｅ７ホール抗体を、３つの別個のＦｃγＲＩＩＢアフィニティーカラムに、各カラムの理論的結合能力のおよそ１０〜２０％で装填した。次いで、カラムを１６カラム容量のＰＢＳで洗浄した。装填および洗浄のカラム流出物を回収し、合わせて、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ（商標）マイクロコンセントレーター（Ａｍｉｃｏｎ）内で、およそ１０倍に濃縮した。次いで、同容量の各濃縮体を２×ＳＤＳサンプル緩衝液で２倍に希釈し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｎｏｖｅｘ Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ）によって分析した。タンパク質バンドを、２０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４ ｐＨ６．５中、電気ブロッティングによってニトロセルロースへ移し、抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂペルオキシダーゼ結合抗体（ＣＡＰＰＥＬＬ番号５５２２３）を用いて探索した。次いで、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐはｒまたはシスチン−ｄ−アラビノフラノシドＢｉｏｔｅｃｈ ＥＣＬ（商標）キットを用い、製造元の使用説明書に従って、抗体バンドを検出した。
この分析の結果を図２３に示す。ＦｃγＲＩＩＢアフィニティーカラムは、５Ａ６ノブ抗体および５Ａ６ノブ／２２Ｅ７ホール二重特異性抗体を保持するはずである。図２３に示されるように、２２Ｅ７ホール抗体は、流出するはずである。５Ａ６ノブ／２２Ｅ７ホール二重特異性レーンに抗体が検出されなかったことにより、二重特異性が示された。
５Ａ６ノブ、２２Ｅ７ホールおよび二重特異性５Ａ６ノブ／２２Ｅ７ホール抗体の挙動は、ＦｃεＲＩアフィニティーカラム上でも観察できる。ＦｃγＲＩＩＢアフィニティーカラムのために、上記のとおり、ＩｇＥ融合アフィニティーカラムを調製し、利用できる。ＦｃεＲＩアフィニティーカラムは、２２Ｅ７ホール抗体および５Ａ６ノブ／２２Ｅ７ホール抗体を保持するはずである。５Ａ６ノブ抗体は流出するはずである。５Ａ６ノブ／２２Ｅ７ホール抗体レーンに抗体が検出されなかったことにより、二重特異性が示された。
ヒンジ改変５Ａ６ノブおよびヒンジ改変２２Ｅ７ホールのアニーリング−方法２
抗体成分（単一アーム５Ａ６ノブおよび２２Ｅ７ホール）を上記のとおり精製した。
わずかに過剰モルの５Ａ６を用いた５０℃でのアニーリングにより、「ヘテロ二量体」が見られた。次いで、カチオン交換カラム上で精製した。
５Ａ６（ノブ）５ｍｇおよび２２Ｅ７（ホール）４．５ｍｇＨ／Ｌ単量体抗体を、２０ｍＭトリス、ｐＨ７．５に調整した全量１０ｍｌの８ｍＭ コハク酸、８０ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液に合わせた。
該混合物を、水浴中、５０℃に１０分間加熱することによって、単量体抗体をアニールし、次いで４℃に冷却して、二重特異性抗体を形成した。
（二重特異性の分析）
１． 等電点電気泳動
等電点電気泳動ゲル（Ｃａｍｂｒｅｘ、ｐＨ７〜１１）上での分析により、アニーリング混合物中、ｐＩ約８．５に、二重特異性抗体に相当する単一バンド（計算ｐＩは８．６７）の形成が示された。図２４を参照されたい。
２． カチオン交換カラム上での精製
５ｍｌのＣＭ−高速カラム（ＨｉＴｒａｐ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、ｐＨ５．５における緩衝液（３０ｍＭのＭＥＳ、２０ｍＭのｈｅｐｅｓ、２０ｍＭのイミダゾール、２０ｍＭのトリス、２５ｍＭのＮａＣｌ）によって平衡化した。アニールしたプールを、等量の平衡化緩衝液で希釈し、ｐＨ５．５に調整し、カラムに装填し、平衡化緩衝液で洗浄した。該カラムを、同じ緩衝液中、ｐＨ５．５からｐＨ９．０の勾配を用い、１ｍｌ／分で３０分かけて展開した。
フラクションをＩＥＦによって分析すると、５Ａ６が、ヘテロ二量体の前に溶出されることが分かった。ヘテロ二量体を含有するプールフラクションの光散乱による分析で、単量体は無いことが分かった。
（実施例４．０ ５Ａ６／２２Ｅ７ホール内ノブ二重特異性抗体の特性化）
本実施例の目的は、５Ａ６または２２Ｅ７単独ではなく、５Ａ６／２２Ｅ７が二重特異性抗体であることの実証である。５Ａ６／２２Ｅ７は、サンドイッチＥｌｉｓａアッセイにおいて、ヒトＦｃγＲＩＩＢ−Ｈｉｓ６−ＧＳＴおよびＦｃεＲＩ−ＥＣＤ−Ｆｃに対して二重の結合特異性を有する。結果を図２９および図３０に示す。５Ａ６（Ａ）および５Ａ６（Ｂ）は、５Ａ６の２種のタンパク質調製物を称する。下記の５Ａ６／２２Ｅ７二重特異性抗体は、野生型ヒンジを有するか、または有さないホール内ノブヘテロ二量体抗体である。二重特異性抗体は、交換可能にＢｓＡｂと称される。
ｈｕＦｃγＲＩＩＢ−Ｈｉｓ６−ＧＳＴおよびｈｕＦｃεＲＩ−ＥＣＤ−Ｆｃ（ＩｇＥ受容体融合体）は、ＥＬＩＳＡによって実証され、結果は図２９に示されている。ＰＢＳ、ｐＨ７．４中、ＦｃγＲＩＩＢ−Ｈｉｓ６−ＧＳＴの１μｇ／ｍｌ溶液の１００μｌにより、ＥＬＩＳＡプレートを、４℃で一晩コーティングした。該プレートを、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中１％カゼインブロッカーでブロックした。該ウェルを、ＰＢＳ／０．０５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）で３回洗浄した。Ｅｌｉｓａ Ｄｉｌｕｅｎｔ緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％ツウィーン２０、０．５％ＢＳＡ、２ｍＭのＥＤＴＡ）中、１０μｇ／ｍｌのＣＤ４−ＩｇＧを調製し、以下の各試験抗体のＦｃ部分に対するＦｃεＲＩ−ＥＣＤ−Ｆｃ：５Ａ６（Ａ）／２２Ｅ７ホール内ノブ、野生型ヒンジ、二重特異性抗体；５Ａ６（Ｂ）／２２Ｅ７ホール内ノブ、野生型ヒンジ、ＢｓＡｂ；５Ａ６／２２Ｅ７ホール内ノブ、ヒンジなしＢｓＡｂ；５Ａ６ ＭＡｂ；および２２Ｅ７ ＭＡｂ。該プレートをＰＢＳ／０．０５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）で３回洗浄後、５Ａ６（Ａ）／２２Ｅ７、５Ａ６ ＭＡｂ、および２２Ｅ７ ＭＡｂの３種の連続希釈液をＥＬＩＳＡ Ｄｉｌｕｅｎｔ緩衝液中で調製し、各希釈液を、１００μｌ／ウェルでウェルに加えた。該プレートを室温で１時間インキュベートした。該プレートを、ＰＢＳ／０．０５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）で３回洗浄後、各ウェルに、１μｇ／ｍｌ ｈｕＦｃεＲＩ−ＥＣＤ−Ｆｃの１００μｌを加え、該プレートを室温で１時間インキュベートした。該プレートを、ＰＢＳ／０．０５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）で３回洗浄後、各ウェルに、１μｇ／ｍｌ ＩｇＥ−ビオチンを加え、室温で１時間インキュベートした。該プレートを、ＰＢＳ／０．０５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）で洗浄し、ＥＬＩＳＡ希釈緩衝液中１：２０００ストレプトアビジン−ＨＲＰの１００μｌ／ウェルと共に、３０分間インキュベートした。ＰＢＳ／０．０５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）で洗浄後、該プレートを、１００μｌのＴＭＢ基質と共に５分間インキュベートした。１００μｌ／ウェルの停止溶液により反応をクウェンチし、該プレートを、９６ウェルプレートデンシトメーター（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）上、６３０ｎｍにおいて読み取った。結果は、５Ａ６／２２Ｅ７二重特異性抗体を含有するウェルにおけるＩｇＥ結合を示している。二重特異性抗体：５Ａ６（Ａ）＋２２Ｅ７ ＢｓＡｂ、５Ａ６（Ｂ）＋２２Ｅ７ ＢｓＡｂ、および５Ａ６＋２２Ｅ７ヒンジなしノブ−ホールＢｓＡｂは、ＦｃγＲＩＩＢ−ＧＳＴおよびＩｇＥ−ビオチンに首尾よく結合した。図２９を参照されたい。
補足的ＥＬＩＳＡ実験を以下のとおり実施し、結果は図３０に示した。ＰＢＳ、ｐＨ７．４中、ＦｃεＲＩ−ＥＣＤ−Ｆｃの１μｇ／ｍｌ溶液の１００μｌにより、ＥＬＩＳＡプレートを、４℃で一晩コーティングした。該プレートを、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中１％カゼインブロッカーでブロックした。該ウェルを、ＰＢＳ／０．０５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）で３回洗浄した。Ｅｌｉｓａ Ｄｉｌｕｅｎｔ緩衝液中、５Ａ６／２２Ｅ７二重特異性抗体、５Ａ６抗体、または２２Ｅ７抗体の連続希釈液を調製し、各希釈液を、１００μｌ／ウェルでウェルに加えた。該プレートを、室温で１時間インキュベートした。該プレートを、ＰＢＳ／０．０５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）で３回洗浄後、試験抗体、ｈｕＦｃεＲＩ−ＥＣＤ−ＦｃのＦｃ部分および第２の抗体（抗ＧＳＴビオチン）に対するＦｃγＲＩＩＢ−Ｈｉｓ６−ＧＳＴ結合を阻害するために、１０μｇ／ｍｌのＣＤ４−ＩｇＧの存在下、ＦｃγＲＩＩＢ−Ｈｉｓ６−ＧＳＴを、１μｇ／ｍｌの１００μｌで各ウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。該プレートを、ＰＢＳ／０．０５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）で３回洗浄後、１μｇ／ｍｌ 抗ＧＳＴ−ビオチンの１００μｌを各ウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。該プレートを、ＰＢＳ／０．０５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）で洗浄し、ＥＬＩＳＡ希釈緩衝液中１：２０００ストレプトアビジン−ＨＲＰの１００μｌ／ウェルと共に、３０分間インキュベートした。ＰＢＳ／０．０５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）で洗浄後、該プレートを、１００μｌのＴＭＢ基質と共に５分間インキュベートした。１００μｌ／ウェルの停止溶液により反応をクウェンチし、該プレートを、６３０ｎｍにおいて読み取った。結果は、５Ａ６／２２Ｅ７二重特異性抗体を含有するウェルにおける抗ＧＳＴビオチン結合を示している。二重特異性抗体：５Ａ６（Ａ）＋２２Ｅ７および５Ａ６（Ｂ）＋２２Ｅ７ヒンジなし二重特異性抗体、および５Ａ６＋２２Ｅ７ノブ−ホール二重特異性抗体は、ｈｕＦｃεＲＩ−ＥＣＤ−ＦｃおよびＦｃγＲＩＩＢ−ＧＳＴに首尾よく結合した。図３０を参照されたい。
両実験に関する曲線のグラフを、図２９および図３０に示す。ＦｃγＲＩＩＢ−ＧＳＴおよびｈｕＦｃεＲＩ−ＥＣＤ−Ｆｃに対する結合成功は、５Ａ６（Ａ）＋２２Ｅ７および５Ａ６（Ｂ）＋２２Ｅ７ヒンジなし二重特異性抗体によってのみ実証された。、図２９および図３０に示された結果に関するＩＣ５０値を表１に提供する。
Figure 2008515780
 （実施例５．０ ５Ａ６／２２Ｅ７ヒンジなし、ホール内ノブ、二重特異性抗体の性質）
５．１ 材料
先の実施例において、ＦｃγＲＩＩＢは、３つのヒトＦｃγＲＩＩＢスプライス改変体の１つであるｈｕＦｃγＲＩＩＢ１であった。残りの実施例において、ＦｃγＲＩＩＢ１およびさらなるスプライス改変体、ＦｃγＲＩＩＢ２が利用され、そのように称されている。
ＪＷ８．５．１３は、ＮＰ（ニトロフェノール、抗原）に特異的なマウス可変領域およびヒトＩｇＥ Ｆｃ領域からなるキメラ抗体である。ＪＷ８．５．１３ＩｇＥの可変領域は、ＮＰに特異的であり、ＴＮＰと交差反応しない。ＪＷ８．５．１３のヒトＩｇＥ部分は、ｈｕＦｃεＲＩに特異的に結合し、ＲＢＬ誘導細胞株における内因性ラットＦｃεＲＩに結合しない。ｈｕＦｃεＲＩに対するＪＷ８．５．１３の結合は、その発現をアップレギュレートし、それを抗原特異的ＩｇＥで満たす。
高親和性ヒトＩｇＥ受容体（ＦｃεＲＩ）のαサブユニットであるＦｃεＲＩαを発現するＲＢＬ−２Ｈ３（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−２２５６）細胞（Ｇｉｌｆｉｌｌａｎら（１９９５）Ｉｎｔ Ａｒｃｈ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０７（１−３）：６６−６８頁）に、ｈｕＦｃγＲＩＩＢ１および／またはｈｕＦｃγＲＩＩＢ２の組み合わせ（すなわち、有無）をトランスフェクトして、ＲＢＬ誘導細胞株を作出した。ＲＢＬ−２Ｈ３細胞株改変体は、ＢＤ−Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手可能なｐＱＣＸＩＲ（Ｒｅｔｒｏ−ＸＱベクター）に類似した、ワシントン大学、ミズーリ州から入手したレトロウィルス発現ベクターを用いて、ＲＢＬ−２Ｈ３細胞への、ヒトＦｃγＲＩＩＢ１またはＦｃγＲＩＩＢ２のレトロウィルスによる形質導入によって作出した。完全長ヒト遺伝子のｃＤＮＡを、単独で、またはＩＲＥＳ（Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｅｎｔｒｙ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）と組み合わせて、レトロウィルスベクターにサブクローン化し、２つの遺伝子の二シストロン同時トランスフェクションおよび同時発現を可能にした。レトロウィルス形質導入法のさらなる説明を下記に提供する。
ＰＧ１３パッケージ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１０６８６）を、１プレート当たり２×１０６細胞で、１０ｃｍの組織培養プレート（ＤＭＥＭ高グルコース、１０％ＦＣＳ、ペニシリン、ストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミン）上に播種し２４時間置いた。ＦｕＧＥＮＥ６を用いて、ｐＭＳＣＶ ＤＮＡ構築体を細胞にトランスフェクトし、３７℃、５％ＣＯ２で２日間培養した。レトロウィルス粒子を含有する細胞培養上澄み液を採取し、０．４ミクロンフィルターを通してろ過した。滅菌硫酸プロタミンを、１０μｇ／ｍｌの最終濃度まで添加し、４ｍｌの上澄み液を用いて、およそ１×１０６ＲＢＬ細胞に、３２℃で９０分間、スピン感染によって感染させ、引き続き、レトロウィルス上澄み液中、３７℃、５％ＣＯ２で３〜４時間、連続培養した。感染ＲＢＬ細胞を回収し、ＲＢＬ培地に移し、選別のために増加させた。トランスフェクト陽性細胞を、２２Ｅ７抗体および／または５Ａ６抗体を用いてＦＡＣＳにより同定し、ヒトＦｃεＲＩＡおよびヒトＦｃγＲＩＩＢをそれぞれ検出した。
得られた細胞株は以下のとおり命名した：ＲＢＬヒトＦｃεＲＩ細胞表面発現ヒトＦｃεＲＩα；ＲＢＬ ｈｕＦｃγＲＩＩＢ細胞表面発現ヒトＦｃγＲＩＩＢ１、ＲＢＬ ｈｕＦｃεＲＩ＋ｈｕＦｃγＲＩＩＢ１細胞表面発現ヒトＦｃεＲＩαおよびヒトＦｃγＲＩＩＢ１；ならびにＲＢＬ ｈｕＦｃεＲＩ＋ｈｕＦｃγＲＩＩＢ２細胞表面発現ヒトＦｃεＲＩαおよびヒトＦｃγＲＩＩＢ２。
２０×モル過剰のＥＺ−ｌｉｎｋ（商標）ＮＨＳ−ＰＥＯ４−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ、ロックフォード、イリノイ州）をＰＢＳ中、二重特異性抗体に結合させることによって、ビオチン化５Ａ６／２２Ｅ７二重特異性抗体（ホール内ノブ、ヒンジなし）を調製した。
バキュロウィルス発現系にサブクローン化することによって、ｈｕＦｃεＲＩα細胞外ドメイン（ｈｕＦｃεＲＩα ＥＣＤ）を作製し、ＣＮＢｒ−セファロース結合カラムおよびセファデックスゲルろ過カラムを用いて精製した。ｈｕＦｃγＲＩＩＢ細胞外ドメイン（ｈｕＦｃγＲＩＩＢ ＥＣＤ）は、Ｃ末端Ｈｉｓ６タグを有するフレームにサブクローン化し、続いて、バキュロウィルス発現系に発現させて作製した。ｈｕＦｃγＲＩＩＢ ＥＣＤは、ＮｉＮＴＡ樹脂によって精製した。
５．２ ヒスタミン放出アッセイ
５Ａ６／２２Ｅ７二重特異性抗体が、細胞表面上のｈｕＦｃγＲＩＩＢ１またはｈｕＦｃγＲＩＩＢ２またはｈｕＦｃεＲＩに架橋する能力を、以下のアッセイによるヒスタミン放出の選択的阻害によって実証した。以下の説明は、さらに図３１〜３３によって裏づけられる。
５％ＣＯ２の加湿インキュベーター内の標準的組織培養フラスコにおいて、２ｍＭのＬ−グルタミン、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、１．５ｇ／Ｌの炭酸水素ナトリウム、ペニシリン、ストレプトマイシン、１５％胎仔ウシ血清を添加したＥＭＥＭ（アールＢＳＳ添加イーグル最少必須培地）中、トランスフェクトしたＲＢＬ４８細胞（上記）を、３７℃で増殖させた。ＰＢＳ／０．０５％トリプシン／０．５３ｍＭ ＥＤＴＡの４ｍＬ溶液に３７℃で２分間曝露することによって細胞を採取した後、遠心分離し（４００×ｇ、１０分）、新鮮ＥＭＥＭに再懸濁させた。懸濁液中の細胞を、血球計数器（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ−Ｊｕｎｇ）でカウントし、密度を、およそ１０５から１０６細胞／ｍｌに調整した。
上記のトランスフェクトしたＲＢＬ細胞、ＲＢＬ ｈｕＦｃεＲＩ、ＲＢＬ ｈｕＦｃεＲＩ＋ｈｕＦｃγＲＩＩＢ１細胞およびＲＢＬ ＲＢＬ ｈｕＦｃεＲＩ＋ｈｕＦｃγＲＩＩＢ２細胞を９６ウェル、平底組織培養プレートに、２００μｌのＥＭＥＭ中、１０５細胞／ウェルで播種した。該細胞を、１ｍｇ／ｍｌのＪＷ８．５．１３（「ＮＰ特異的ヒトＩｇＥ」）と共に、またはそれなしで、２４時間、３７℃でインキュベートした。次いで、該細胞を新鮮培地で３回洗浄し、非結合のＮＰ特異的ヒトＩｇＥを除去した。いくつかの細胞は、抗原による活性化前に、飽和条件下、１〜５μｇ／ｍｌの二重特異性抗体によって処理し、３７℃で１時間インキュベートした。
ニトロフェノール（ＮＰ）結合オバルブミン（ＮＰ（１１）−ＯＶＡ）、ＪＷ８．５．１３に結合する抗原、ＩｇＥ、またはＴＮＰ（１１）−ＯＶＡ、無関連抗原と共に、３７℃で１時間インキュベートした。ＮＰ（１１）−ＯＶＡおよびＴＮＰにより、二重特異性抗体と共に、またはそれなしで、ＲＢＬ ｈｕＦｃεＲＩ、ＲＢＬ ｈｕＦｃεＲＩ＋ｈｕＦｃγＲＩＩＢ１細胞およびＲＢＬ ＲＢＬ ｈｕＦｃεＲＩ＋ｈｕＦｃγＲＩＩＢ２細胞の活性化関連脱顆粒（ヒスタミン放出）を、０．０００１μｇ／ｍｌから１０μｇ／ｍｌの抗原濃度の範囲で試験した。インキュベーション後、細胞上澄み液（細胞培養培地）中のヒスタミン濃度を上記のＥＬＩＳＡにより測定した。また、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００による細胞溶解によるか、またはイオノマイシンを用いた刺激によりヒスタミン放出を引き起こすことによって、活性化と独立した陽性対照として働く、該細胞に関する総ヒスタミン濃度も得た。また、ＲＢＬ細胞によるバックグラウンドヒスタミン放出も得た。ヒスタミン放出濃度は、Ｈｉｓｔａｍｉｎｅ ＥＬＩＳＡキット（ＫＭＩ、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ミネアポリス、ミネソタ州）を用いて定量化した。
ヒスタミン放出アッセイの結果を、図３１〜３３に示す。ヒスタミン放出は、特に阻害されない限り、ｈＩｇＥ（ＪＷ８．５．１３）およびＮＰ（１１）−ＯＶＡ抗原（「ＮＰ」）の存在下で増加することが予想される。図３１は、ＴＮＰまたはＮＰ（１１）−ＯＶＡの種々の濃度でのＲＢＬ ｈｕＦｃεＲＩ細胞におけるヒスタミン放出データを示している。ＲＢＬ ｈｕＦｃεＲＩ細胞において、ヒスタミン放出は、ＮＰおよびｈＩｇＥによって引き起こされる。予想どおり、二重特異性抗体は、ｈｕＦｃγＲＩＩＢの不在下ではヒスタミン放出に影響（すなわち、抑制または阻害）を及ぼさない（図３１、グラフＡの各サンプルの一番右の暗灰色の棒、「ｈＩｇＥ＋ＮＰ＋二重特異性」を参照）。
図３２は、ＲＢＬ ｈｕＦｃεＲＩ＋ｈｕＦｃγＲＩＩＢ１細胞におけるヒスタミン放出データを示しており、図３３は、ＲＢＬ ｈｕＦｃεＲＩ＋ｈｕＦｃγＲＩＩＢ２細胞におけるヒスタミン放出データを示している。ＲＢＬ ｈｕＦｃεＲＩ＋ｈｕＦｃγＲＩＩＢ１細胞ならびにＲＢＬ ｈｕＦｃεＲＩ＋ｈｕＦｃγＲＩＩＢ２細胞において、二重特異性抗体はヒスタミン放出を抑制する（図３２のグラフＡ、および図３３のグラフＡにおける明灰色棒の「＋ｈＩｇＥ＋ＮＰ」を、暗灰色の「＋ｈＩｇＥ＋ＮＰ＋二重特異性」と比較されたい）。
全てのＲＢＬ細胞株におけるヒスタミン放出の活性化は、ヒトＦｃεＲＩに結合したヒトＩｇＥによる用量依存的様式で、抗原特異的である。細胞は、ヒトＩｇＥの不在下では活性化されなかったし、また、非関連抗原（すなわちＴＮＰ）によって引き起こされた場合でも活性化されなかった。５Ａ６／２２Ｅ７二重特異性抗体を加えることにより、ＲＢＬ ｈｕＦｃεＲＩ＋ｈｕＦｃγＲＩＩＢ１細胞ならびにＲＢＬ ｈｕＦｃεＲＩ＋ｈｕＦｃγＲＩＩＢ２細胞において、ヒスタミン放出を抑制する（バックグラウンド濃度に比較して）が、ＲＢＬ ｈｕＦｃεＲＩ細胞においては抑制せず、抑制機能にとってＦｃγＲＩＩＢの存在が必要であることを示している。ｈｕＦｃεＲＩ存在下のＦｃγＲＩＩＢ１およびＦｃγＲＩＩＢ２の双方によっても、同様な結果が見られる。
本発明の二重特異性抗体は、主要なヒト好塩基球における抗ＩｇＥ誘導ヒスタミン放出もまた抑制する。主要好塩基球は、インフォームドコンセントを得た６人の正常なヒト血液ドナーから単離された。好塩基球は、デキストラン沈降プロトコルを用いて、ヒト血液から濃縮化された。簡単に述べると、沈降させるドナー血液の各４０ｍｌを、５０ｍｌの円錐管内で、３７５ｍｇのデキストロース、５．０ｍｌの０．１Ｍ ＥＤＴＡおよび１２．５ｍｌの６％臨床用デキストランと混合する。この混合物を５０ｍｌの円錐管２本に分け、円錐管１本当たり、２０ｍｌの血液を加える。該血液を、６０〜９０分間、沈降させ、その間、血漿層を取り出し、４℃で８分間、１１０×ｇで遠心分離し、ペレット化細胞を保持し、再懸濁させ、ＰＡＧ（デキストロース１ｇ／Ｌ；１×ＰＩＰＥＳ、ｐＨ７．３；０．００３％ヒト血清アルブミン）で洗浄し、ＰＡＧに再懸濁させる。細胞を、デキストラン濃縮調製物として、または引き続いてミルテニー磁気ビーズ分離（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、オーバーン、カリフォルニア州；例えば、Ｋｅｐｌｅｙ，Ｃ．ら、Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０２：３０４−３１５頁（１９９８）を参照）を用いた精製後、３７℃で１時間インキュベートしてから、遠心分離して細胞をペレット化して、抗ＩｇＥ抗体で刺激した。上澄み液を分析用に保持した。好塩基球は、Ｋｅｐｌｅｙ，Ｃ．Ｌ．ら、Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０６（２）：３３７−３４８頁（２０００）に記載されているような標準的方法により単離できる。濃縮された好塩基球は、磁気ビーズ分離（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、オーバーン、カリフォルニア州；Ｋｅｐｌｅｙ，Ｃ．ら、Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０２：３０４−３１５頁（１９９８））により、および／またはフローサイトメトリー選別（Ｋｅｐｌｅｙ，Ｃ．ら（１９９４）、上記）によってさらに精製できる。ヤギ抗ヒトＩｇＥは、Ｃａｌｔａｇ（Ｃａｌｔａｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、バーリンゲーム、カリフォルニア州、米国）から入手した。単離好塩基球、同時発現のｈｕＦｃγＲＩＩＢおよびｈｕＦｃεＲＩを、抗ＩｇＥ（ヤギ抗ヒトＩｇＥ（Ｃａｌｔａｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））と共に、または５Ａ６／２２Ｅ７二重特異性抗体をさらに添加して、３７℃で１時間インキュベートした。ヤギ抗ＩｇＥの１：１００希釈（容量で）液を用いて、試験溶液中、０ｎｇ／ｍｌから２００００ｎｇ／ｍｌの範囲の５Ａ６／２２Ｅ７二重特異性抗体の存在下、好塩基球を刺激した。ヒスタミン放出は、本明細書に上記で開示したとおりにアッセイした。図６２の棒グラフは、抗ヒトＩｇＥの存在下、ヒスタミン放出が誘導されたことを示している。５Ａ６／２２Ｅ７二重特異性抗体の添加により、おおよそ用量依存様式でヒスタミン放出が抑制された。抗体の不在で、または５Ａ６／２２Ｅ７二重特異性抗体単独での存在下で、バックグラウンドヒスタミン放出は制限された。６人の正常なヒト血液ドナーからの好塩基球サンプルの分析に基づくと、５Ａ６／２２Ｅ７二重特異性抗体によるヒスタミン放出の平均抑制は、６７％±９であった。Ｘｏｌａｉｒ（登録商標）患者の好塩基球からの平均ヒスタミン放出は、ＦｃεＲＩ発現のダウンレギュレーションに基づき、９０日後におよそ５０％に抑制されたことが報告されている（ＭａｃＧｌａｓｈａｎ，Ｄ．Ｗ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：１４３８−１４４５頁（１９９７））。これらの結果は、抗ｈｕＦｃγＲＩＩＢ／抗ｈｕＦｃεＲＩ二重特異性抗体は、ＦｃγＲＩＩＢとの交差結合によって、ＦｃεＲＩの活性を抑制することにより、ヒト患者の免疫反応（好塩基球におけるヒスタミン放出など）を速やかに抑制するための治療的分子として有用であることを実証している。また、抗ｈｕＦｃγＲＩＩＢ／抗ｈｕＦｃεＲＩ二重特異性抗体は、抗ＩｇＥ抗体との併用療法にも有用である。併用療法を用いることによって、抗ｈｕＦｃγＲＩＩＢ／抗ｈｕＦｃεＲＩ二重特異性抗体は、ＦｃγＲＩＩＢとの交差結合によって、ヒスタミン放出を速やかに抑制する作用をし、続いて、抗ＩｇＥ抗体（Ｘｏｌａｉｒ（登録商標）抗ＩｇＥ抗体、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社など）によりＦｃεＲＩ発現のダウンレギュレーションが行われる。
５．３ 二重特異性抗体によるｈｕＦｃεＲＩおよびｈｕＦｃγＲＩＩＢの交差結合
本実施例の目的は、５Ａ６／２２Ｅ７二重特異性抗体による、細胞表面上でのヒトＦｃεＲＩとヒトＦｃγＲＩＩＢの交差結合に対するヒスタミン抑制の依存性を示すことである。このアッセイ法は、以下に記載されており、結果は、さらに図３４〜４１に示されている。
ＲＢＬ ｈｕＦｃεＲＩ＋ｈｕＦｃγＲＩＩＢ１細胞ならびにＲＢＬ ｈｕＦｃεＲＩ＋ｈｕＦｃγＲＩＩＢ２細胞を、５μｇ／ｍｌのＮＰ特異的ヒトＩｇＥと共に、３７℃で２４時間、インキュベートし、続いて新鮮培地ＥＭＥＭで３回洗浄して、非結合のＮＰ特異的ヒトＩｇＥを除去した。ＲＢＬ細胞に加える前に、５Ａ６／２２Ｅ７二重特異性抗体を、種々のモル比で、精製ｈｕＦｃεＲＩα ＥＣＤおよびｈｕＦｃγＲＩＩＢ ＥＣＤと共に３０分間、プレインキュベートした。プレインキュベートした５Ａ６／２２Ｅ７二重特異性抗体を、５Ａ６／２２Ｅ７二重特異性抗体の最終濃度、５μｇ／ｍｌで、ＲＢＬ細胞培養培地に加え、３７℃で１時間、さらにインキュベートした。細胞を、ＮＰ結合オバルブミンと共に、３７℃で１時間インキュベーションすることによって活性化した。活性化に関連した脱顆粒を、上記で一般的に記載したＥＬＩＳＡ法を用いて、細胞培養培地へのヒスタミン放出を定量化することによって測定した。本発明の二重特異性抗体によるヒトＦｃεＲＩとヒトＦｃγＲＩＩＢの同時交差結合に対するヒスタミン放出抑制の依存性を、図３４に（ＲＢＬ ｈｕＦｃεＲＩ＋ｈｕＦｃγＲＩＩＢ１細胞に関して）および図３６に（ＲＢＬ ｈｕＦｃεＲＩ＋ｈｕＦｃγＲＩＩＢ２細胞に関して）示してある。
ＲＢＬ誘導細胞に対する二重特異性抗体の結合は、フローサイトメトリーを用いて、ｈｕＦｃεＲＩα ＥＣＤおよびｈｕＦｃγＲＩＩＢ ＥＣＤの存在下でも評価された。細胞および材料は上記のとおりである。該細胞を採取し、１０５〜１０６細胞のアリコートに選別する。該細胞を洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液（２％のＦＣＳを有するＰＢＳ）中に再懸濁させた。２回目の細胞洗浄を行い、１０％のラット血清、２μｇ／ｍｌのヒトＩｇＧおよび１μｇ／ｍｌのビオチン化二重特異性抗体を添加したＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させた。該細胞を、氷上で３０秒間インキュベートし、洗浄し、ストレプトアビジン−ＰＥを有するＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させた。氷上でさらに３０秒間のインキュベーション後、混合物を冷ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、遠心沈殿させ、０．１％ヨウ化プロピジウムを有するＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させた。サンプルをフローサイトメトリーで分析し、結果を相対蛍光単位（ＲＦＵ）として表した。これらの結合試験の結果は、図３５および図３７〜４１に示してあり、ＥＣＤ対二重特異性抗体の比率が示されている。図３５および図３７は、ｈｕＦｃεＲＩ ＥＣＤおよびｈｕＦｃγＲＩＩＢ ＥＣＤの存在下、ＲＢＬ ｈｕＦｃεＲＩ＋ｈｕＦｃγＲＩＩＢ１細胞（図３５）またはＲＢＬ ｈｕＦｃεＲＩ＋ｈｕＦｃγＲＩＩＢ２細胞（図３７）のいずれかに対する５Ａ６／２２Ｅ７二重特異性抗体の結合に関するフローサイトメトリーデータのグラフを含んでいる。予想どおり、高比率のＥＣＤ対二重特異性抗体は、細胞に対する二重特異性抗体の結合を減少させる。明色ピーク（ＥＣＤの存在下、ＢｓＡｂにより結合した細胞）対暗色ピーク（陽性対照−ＥＣＤの不在下、ＢｓＡｂにより結合した細胞）を比較されたい。
図３８〜４１では、ｈｕＦｃεＲＩ ＥＣＤ、ｈｕＦｃγＲＩＩＢ ＥＣＤまたはｈｕＦｃεＲＩ ＥＣＤとｈｕＦｃγＲＩＩＢ ＥＣＤとの双方の存在下、種々のＲＢＬ誘導細胞に対する５Ａ６／２２Ｅ７二重特異性抗体の結合を分析するために、フローサイトメトリーを用いている。図３８〜４１において、黒色ピークは、ＥＣＤの存在下での５Ａ６／２２Ｅ７の細胞表面受容体結合である。明灰色ピーク（ＢｓＡｂによって結合されていない細胞）および暗灰色ピーク（ＥＣＤの不在下、ＢｓＡｂによって結合されている細胞）と比較されたい。予想どおり、ｈｕＦｃγＲＩＩＢ ＥＣＤではなく、ｈｕＦｃεＲＩ ＥＣＤの濃度増加により、ＲＢＬ ｈｕＦｃεＲＩ細胞に対する５Ａ６／２２Ｅ７結合（図３８を参照）が阻害され、双方のＥＣＤの阻害は、ｈｕＦｃεＲＩ ＥＣＤに対して同様な結果となる。ＲＢＬ ｈｕＦｃγＲＩＩＢ細胞に対する５Ａ６／２２Ｅ７結合（図３９ｗ参照）は、ｈｕＦｃεＲＩ ＥＣＤによって影響されず、ｈｕＦｃγＲＩＩＢ ＥＣＤによって阻害される。ＲＢＬ ｈｕＦｃεＲＩ＋ｈｕＦｃγＲＩＩＢ１細胞（図４０）およびＲＢＬ ｈｕＦｃεＲＩ＋ｈｕＦｃγＲＩＩＢ２細胞（図４１）においては、同様な結合結果が見られる。予想どおり、５Ａ６／２２Ｅ７の結合は、ｈｕＦｃεＲＩ ＥＣＤまたはｈｕＦｃγＲＩＩＢ ＥＣＤいずれかの１０：１比によって減少し、双方のＥＣＤの１０：１比（飽和濃度）においてのみ、ＲＢＬ ｈｕＦｃεＲＩ＋ｈｕＦｃγＲＩＩＢ（１または２）細胞に対する５Ａ６／２２Ｅ７の完全阻害がある。
１０倍モル過剰のｈｕＦｃεＲＩαおよびｈｕＦｃγＲＩＩＢ細胞外ドメインと共に、５Ａ６／２２Ｅ７二重特異性抗体のプレインキュベーションの際には、ヒスタミン応答の抑制が見られなかったことから、これらの実験は、ヒスタミン放出の抑制が、細胞表面ＦｃεＲＩとＦｃγＲＩＩＢの同時交差結合に依存していることを実証している。これらの条件下で、細胞表面に対する５Ａ６／２２Ｅ７二重特異性抗体の結合は、フローサイトメトリーによって評価されるとおり、完全に阻害された。低モル比のｈｕＦｃεＲＩ ＥＣＤおよびｈｕＦｃγＲＩＩＢ ＥＣＤ（２：２：１、１：１：１、または０．１：０．１：１のｈｕＦｃεＲＩ：ｈｕＦｃγＲＩＩＢ：二重特異性）でのプレインキュベーションは、ＲＢＬ細胞に対する５Ａ６／２２Ｅ７二重特異性結合の不完全阻害ならびにヒスタミン放出の不完全抑制に至った。したがって、肥満細胞におけるヒスタミン放出の抑制には、細胞表面ＦｃεＲＩαとＦｃγＲＩＩＢの交差結合が必要である。
飽和下濃度での５Ａ６／２２Ｅ７二重特異性抗体による抑制は、所望の抑制を達成するために受容体の完全占拠は必要ないことを示唆している。
５．４ 飽和下濃度における二重特異性抗体による抑制
５Ａ６／２２Ｅ７二重特異性抗体のヒスタミン放出抑制およびＲＢＬ ｈｕＦｃεＲＩ＋ｈｕＦｃγＲＩＩＢ１細胞の結合を、以下の方法により、結合飽和下濃度で測定し、結果を図４２〜４６に示した。
ＲＢＬ ｈｕＦｃεＲＩ＋ｈｕＦｃγＲＩＩＢ１細胞またはＲＢＬ ｈｕＦｃεＲＩ＋ｈｕＦｃγＲＩＩＢ２細胞を、５μｇ／ｍｌのＮＰ特異的ヒトＩｇＥと共に、３７℃で２４時間インキュベートし、続いて新鮮培地で３回洗浄し、非結合のＮＰ特異的ヒトＩｇＥを除去した。抗原による活性化前に、濃度を変化させた５Ａ６／２２Ｅ７二重特異性抗体と共に、細胞を３７℃で１時間、さらにインキュベートした。フローサイトメトリーによる分析またはヒスタミン発現のために、細胞を分けた。
二重特異性抗体結合の程度を、上記のとおり、フローサイトメトリーにより評価した。フローサイトメトリーは、ストレプトアビジン−ＰＥで検出されたビオチン化二重特異性抗体の比較可能な濃度を用いて実施した。
上記のプレインキュベートした細胞を、０．１μｇ／ｍｌまたは１μｇ／ｍｌのＮＰ結合オバルブミンのいずれかと共に、３７℃で１時間インキュベーションすることにより活性化した。活性化に関連した脱顆粒を、上記のとおり、細胞培養培地に放出されたヒスタミン濃度を定量化することによって測定した。
ヒスタミン放出データならびにＲＢＬ ｈｕＦｃεＲＩ＋ｈｕＦｃγＲＩＩＢ１細胞に対する５Ａ６／２２Ｅ７二重特異性抗体結合は、それぞれ、図４２と図４３に示し、ＲＢＬ ｈｕＦｃεＲＩ＋ｈｕＦｃγＲＩＩＢ２細胞に対する５Ａ６／２２Ｅ７二重特異性抗体結合は、それぞれ、図４４と図４５に示している。バックグラウンド濃度に対するヒスタミン放出の抑制は、ＲＢＬ ｈｕＦｃεＲＩ＋ｈｕＦｃγＲＩＩＢ１細胞とＲＢＬ ｈｕＦｃεＲＩ＋ｈｕＦｃγＲＩＩＢ２細胞の双方において、０．００２５μｇ／ｍＬ超の二重特異性抗体濃度において示される。
ＲＢＬ ｈｕＦｃεＲＩ＋ｈｕＦｃγＲＩＩＢ１細胞およびＲＢＬ ｈｕＦｃεＲＩ＋ｈｕＦｃγＲＩＩＢ２細胞に対する二重特異性抗体結合のフローサイトメトリー試験により、結合飽和は、およそ２．５μｇ／ｍｌの二重特異性抗体で達成されることが示された。図４６は、４つのＲＢＬ誘導細胞株、ＲＢＬ ｈｕＦｃεＲＩ細胞、ＲＢＬ ｈｕＦｃγＲＩＩＢ細胞、ＲＢＬ ｈｕＦｃεＲＩ＋ｈｕＦｃγＲＩＩＢ１細胞、およびＲＢＬ ｈｕＦｃεＲＩ＋ｈｕＦｃγＲＩＩＢ２細胞にわたって、０．１μｇ／ｍｌから２．５μｇ／ｍｌの二重特異性抗体のフローサイトメトリーによる滴定を示している。中実ピークは、ビオチン化二重特異性抗体に結合した細胞に対応する。ＲＢＬ誘導細胞株に対する二重特異性抗体結合の滴定により、ＲＢＬ ｈｕＦｃεＲＩ＋ｈｕＦｃγＲＩＩＢ１細胞、ならびにＲＢＬ ｈｕＦｃεＲＩ＋ｈｕＦｃγＲＩＩＢ２細胞に対する二重特異性抗体の結合は、低濃度の二重特異性抗体では低下し、０．００２５μｇ／ｍｌ未満では検出不可能であることが示される。図４２および図４４に示されるように、ＮＰ抗原刺激の異なる２種の濃度を用い、二重特異性抗体のＲＢＬヒスタミン放出抑制は、二重特異性抗体の結合飽和下濃度で維持された。
５．５ ＦｃεＲＩα表面発現レベルに及ぼす二重特異性の効果
肥満細胞および好塩基球上のＦｃεＲＩ発現レベルのダウンレギュレーションは、抗原誘導活性化に対する肥満細胞および好塩基球の感受性を減少させる一つの手段であり、治療薬が喘息またはアレルギーに有益な効果を有し得る一つの機構である。
ＦｃεＲＩの表面発現レベルを調節する二重特異性抗体の能力は、以下の方法を用い、二重特異性抗体の存在下または不在下で、ＩｇＥ誘導ＦｃεＲＩのアップレギュレーションおよびダウンレギュレーション実験を実施することによって評価した。
２μｇ／ｍｌの二重特異性抗体の存在下または不在下、ＲＢＬ ｈｕＦｃｅＲＩ＋ｈｕＦｃγＲＩＩＢ１細胞、およびＲＢＬ ｈｕＦｃｅＲＩ＋ｈｕＦｃγＲＩＩＢ２細胞を、１μｇ／ｍｌのＵ２６６ＩｇＥ（ＡＴＣＣ ＴＩＢ１９６）と共に、１、２、３、または７日間インキュベートした。図４７および図４８は、５Ａ６／２２Ｅ７二重特異性抗体およびＩｇＥの濃度は、検出用ヒトＩｇＧ１およびＩｇＥを用いてＥＬＩＳＡによって検出した際、７日間の時間経過の間に変化しないままだったことを示しており、該試薬が細胞培養培地から減損されなかったことを示している。細胞表面ヒトＦｃεＲＩの総レベルは、全てのＦｃεＲＩ受容体を氷上でＵ２６６ＩｇＥによって飽和させた後、ヒトＩｇＥ（Ｃａｌｔａｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に対する抗体を用いたフローサイトメトリーによって測定した。
ＦｃεＲＩアップレギュレーションに関するフローサイトメトリーデータを、図４９〜５４に示す。図４９および５０に示されるとおり、ＲＢＬ ｈｕＦｃεＲＩ細胞の２つのサンプル、ならびに図５１および５２に示されるとおり、ＲＢＬ ｈｕＦｃεＲＩ＋ｈｕＦｃγＲＩＩＢ１細胞の２つのサンプルにおけるＦｃεＲＩ表面発現レベルのＩｇＥ誘導アップレギュレーションに対し、二重特異性抗体は効果を及ぼさない。しかし、図５３および５４に示されたＲＢＬ ｈｕＦｃεＲＩ＋ｈｕＦｃγＲＩＩＢ２細胞の２つのサンプルにおけるｈｕＦｃｅＲＩおよびｈｕＦｃγＲＩＩＢ２の同時交差結合の際には、二重特異性抗体は、ＦｃεＲＩのアップレギュレーションの程度を低下させた。
また、ＩｇＥ除去後のＦｃεＲＩαのダウンレギュレーションに及ぼす二重特異性抗体の効果も測定し、結果は図５５〜５７に示されている。ＲＢＬ細胞上のＦｃεＲＩαは、１μｇ／ｍｌのＵ２６６ＩｇＥによって７日間アップレギュレートした。次いで。ＩｇＥを細胞培養培地から洗い出し、ＩｇＥ除去後、１、２、３、および７日目に、二重特異性抗体の存在下または不在下で、ＦｃεＲＩαのダウンレギュレーションをフローサイトメトリーによって観察した。図５５および５６に示されるとおり、ＲＢＬ ｈｕＦｃεＲＩ細胞およびＲＢＬ ｈｕＦｃεＲＩ＋ｈｕＦｃγＲＩＩＢ１細胞におけるＦｃεＲＩαのダウンレギュレーションに、二重特異性抗体は効果を及ぼさなかった。しかし、図５７に示されるとおり、ＲＢＬ ｈｕ５Ａ６／２２Ｅ７二重特異性抗体＋ｈｕＦｃγＲＩＩＢ２細胞において、ＦｃεＲＩαのダウンレギュレーションの割合は二重特異性抗体によって増加した。ＲＢＬ ｈｕＦｃεＲＩ＋ｈｕＦｃγＲＩＩＢ２細胞を用いる実験を繰り返した。ただし、ＩｇＥ存在下、０、３または４日目に、５Ａ６／２２Ｅ７二重特異性抗体を加えた（図６３を参照）。結果は、二重特異性抗体が、これらの細胞において、ＦｃεＲＩのＩｇＥ誘導発現を低下させることを示している。また、これらの試験により、ＦｃγＲＩＩＢ１イソ体はｈｕＦｃεＲＩ発現をダウンレギュレートしないことが分かった。
二重特異性抗体は、ＦｃεＲＩとＦｃγＲＩＩＢ２イソ体との同時交差結合の際に、肥満細胞および好塩基球上のＦｃεＲＩの表面発現レベルを低下させ得ることが、これらの試験によって示された。肥満細胞におけるｈｕＦｃεＲＩα、ＦｃγＲＩＩＢ１、ＦｃγＲＩＩＢ２、ｈｕＲＰＬ１９（対照）、およびラットＦｃεＲＩα、ｍＲＮＡ発現；ＲＢＬ ＦｃεＲＩ（ｈｕＦｃＥＲＩａと称される）、ＲＢＬ ｈｕＦｃεＲＩ＋ｈｕＦｃγＲＩＩＢ１細胞（ｈｕＦｃＧＲＩＩｂ１と称される）、およびＲＢＬ ｈｕＦｃεＲＩ＋ｈｕＦｃγＲＩＩＢ２細胞（ｈｕＦｃＧＲＩＩｂ２と称される）；および３人の異なるドナーのヒト好塩基球上のＲＴ−ＰＣＲデータ。３人の異なるヒトドナーの精製末梢血好塩基球から調製したｍＲＮＡに対して、ＦｃγＲＩＩＢ１イソ体およびＦｃγＲＩＩＢ２イソ体のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ同定を実施した。ヒト血液の好塩基球は、磁気ビーズ精製法（ＭＡＣｓヒト好塩基球単離キット、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いて、１００ｍｌの血液から単離した。１０６好塩基球からのｍＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ（商標）ミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析に用いられる以下のプライマー／プローブセットを表２に挙げてある。
Figure 2008515780
 ＲＮＡは、製造元の推奨プロトコルに従って、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００配列検出システムで分析した。図５８〜６１に示されるとおり、ＦｃγＲＩＩＢのＢ１イソ体とＢ２イソ体の双方がヒト好塩基球に発現し、細胞内のＦｃγＲＩＩＢ２と同時架橋する際に、ＦｃεＲＩ表面発現レベルをダウンモジュレートする二重特異性抗体の能力が実証されたことにより、ＦｃεＲＩの抑制および／またはダウンレギュレーションが疾患の軽減を提供するような疾患を経験している患者の治療にとって、本発明の抗ＦｃγＲＩＩＢ−抗ＦｃεＲＩ二重特異性抗体を用いる方法は特に有用になる。
５．６ 二重特異性抗体は、ＲＢＬ細胞株においてサイトカイン放出を抑制する
以下のアッセイによって実証されるとおり、抗ＦｃγＲＩＩＢ−抗ＦｃεＲＩ二重特異性抗体５Ａ６／２２Ｅ７の存在下で、サイトカインＭＣＰ−１（単球走化性タンパク質−１）、ＩＬ−４（インターロイキン４）、およびＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子α）の放出が抑制された。ＲＢＬ細胞に、ｈｕＦｃγＲＩＩＢ２またはｈｕＦｃγＲＩＩＢ１およびｈｕＦｃεＲＩをコードするｃＤＮＡをトランスフェクトし、上記の本実施例５に記載された方法に従って培養した。ヒスタミン放出アッセイに関して本実施例５に記載されたとおり、ニトロフェノール（ＮＰ）結合オバルブミン（ＮＰ（１１）−ＯＶＡ）およびＩｇＥ（抗ＮＰヒトＩｇＥ）に曝露することによって細胞を刺激し、サイトカインを放出させた。５Ａ６／２２Ｅ７二重特異性抗体を、５μｇ／ｍｌの濃度でテキストサンプルに加えた。対象となっているサイトカインに関して、以下のとおり、対象となっているサイトカイン各々の検出および定量化を行った。ＭＣＰ−１およびＩＬ−４は、Ｂｅａｄｌｙｔｅ Ｒａｔ Ｍｕｌｔｉ−ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｂｅａｄｍａｓｔｅｒキット（カタログ４８−２００、Ｕｐｓｔａｔｅ、シャーロッテズビル、バージニア州、米国）を用いて検出した。ラットＴＮＦアルファは、製造元の使用説明書に従い、抗ラットＴＮＦアルファＥＬＩＳＡキットを用いて検出した。アッセイを、製造元の使用説明書に従って実施した。図６４は、ＦｃγＲＩＩＢ２およびＦｃεＲＩをトランスフェクトしたＲＢＬ細胞におけるサイトカイン放出の結果を示しているが、その結果は、ＦｃγＲＩＩＢ１およびＦｃεＲＩをトランスフェクトしたＲＢＬ細胞に関するものと同じであった。ラット肥満細胞のサイトカイン放出は、５Ａ６／２２Ｅ７二重特異性抗体の存在下で抑制されたが、他方、細胞培養中では５時間にわたり、サイトカイン放出は抑制されず、増加した（暗色棒）。
５．７ 二重特異性抗体は、ＲＢＬ細胞株において、アラキドン酸代謝物の合成および放出を抑制する。
アレルゲンの存在は、肥満細胞からのヒスタミンなどのいわゆる「前形成」炎症伝達物質の放出、アラキドン酸の産生およびプロスタグランジンなどのいわゆる「エイコサノイド」伝達物質へのアラキドン酸の変換、およびサイトカイン類およびケモカイン類の産生および放出など、複数の免疫応答を開始させる。前形成伝達物質は、曝露の際に直ちに放出されるが、エイコサノイド伝達物質は、およそ３０分から２時間遅れ、サイトカイン類およびケモカイン類は、およそ５時間から２４時間遅れる。アラキドン酸カスケードと呼ばれる身体の防御機構の１つは、あらたに形成される３種の炎症性伝達物質−プロスタグランジン類、トロンボキサン類およびロイコトリエン類を産生し、これらは集合的に、エイコサノイドとして知られている。アレルゲンへの曝露のこの下流作用を抑制する５Ａ６／２２Ｅ７二重特異性抗体の能力を試験するために、アラキドン酸代謝物の放出をモニターした。ｈｕＦｃγＲＩＩＢ１またはｈｕＦｃγＲＩＩＢ２およびｈｕＦｃεＲＩをコードするｃＤＮＡを、ＲＢＬ細胞にトランスフェクトし、上記の本実施例５に記載されたとおり培養した。ヒスタミン放出アッセイに関して本実施例５に記載されたとおり、ＩｇＥ（抗ＮＰヒトＩｇＥ）と組み合わせて、抗原としてのニトロフェノール（ＮＰ）結合オバルブミン（ＮＰ（１１）−ＯＶＡ）に曝露することによってアラキドン酸カスケードを刺激した。代謝物、ロイコトリエンＣ４（ＬＴＣ４）の定量化を、ＥＩＡキット（カタログ番号２１２０１１）（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、上記）を用い、製造元の使用説明書に従って実施した。代謝物、プロスタグランジンＤ２（ＰＧＤ２）の定量化を、ＭＯＸ ＥＩＡキット（カタログ番号２１２０１１）（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、上記）を用い、製造元の使用説明書に従って実施した。図６５の結果は、ｈｕＦｃγＲＩＩＢ１およびＦｃεＲＩを発現するＲＢＬ細胞において、ＬＴＣ４およびＰＧＤ２の産生によって立証されるように、アラキドン酸代謝物は、ＩｇＥプラス抗原の存在下では時間と共に増加し、非関連抗原（ＴＮＰ（１１）−ＯＶＡ）の存在下では増加しなかったことを示している。５μｇ／ｍｌの５Ａ６／２２Ｅ７二重特異性抗体の存在下で、アラキドン酸代謝は抑制された。ｈｕＦｃγＲＩＩＢ２およびＦｃεＲＩを発現するＲＢＬ細胞を用いても同じ結果が得られた（データは示していない）。これらの結果は、抗ＦｃγＲＩＩＢ−抗ＦｃεＲＩ二重特異性抗体によって、重要な免疫経路が抑制されることを実証している。
５．８ 二重特異性抗体はＩｇＥ誘導肥満細胞の生存を阻害する
ＩｇＥ。５Ａ６／２２Ｅ７二重特異性抗体がこのような生存を阻害したかどうかを試験するために、以下のアッセイを実施できる。ヒト造血前駆体幹細胞（ＣＤ３４＋）を、Ａｌｌｃｅｌｌｓ（カタログ番号ＡＢＭ０１２、Ａｌｌｃｅｌｌｓ、ＬＬＣ、バーケリー、カリフォルニア州、米国）から入手した。ＩＬ−３（３０ｎｇ／ｍｌで）、ＩＬ−６（２００ｎｇ／ｍｌで）および幹細胞因子（ＳＣＦ、１００ｎｇ／ｍｌで）を含有するＳｔｅｍＰｒｏ−３４（登録商標）無血清培地（Ｇｉｂｃｏ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバッド、カリフォルニア州、米国）中で、３人のドナー各々からの細胞を２週間培養した。以下の試験条件下で、肥満細胞の生存を、Ａｎｎｅｘｉｎ／７−ＡＡＤ（７−アミノアクチオマイシンＤ）染色（ＢＤ／ファーミンゲンフローサイトメトリーキット、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ ＆ Ｃｏｍｐａｎｙ、フランクリンレイクス、ニュージャージー州、米国）によって評価した：（１）ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）培地単独、（２）ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）培地＋３０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３、２００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６、および１００ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、（３）ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）培地＋５μｇ／ｍｌのＳＰＥ−７（マウスＩｇＥ抗ＤＮＰモノクローナル抗体（ＳＰＥ−７、Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ州、米国）、（４）ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）培地＋５μｇ／ｍｌの煮沸、変性ＳＰＥ−７、および（５）ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）培地＋５μｇ／ｍｌのＳＰＥ−７＋５μｇ／ｍｌの５Ａ６／２２Ｅ７二重特異性抗体。最初の２週間の培養期間の後の１０日間、細胞の生存をモニターした。両段階とも、細胞は３７℃、５％ＣＯ２に維持した。試験培養開始後、４日から７日の間に時期に、細胞の生存を判定した。３人のドナーの細胞サンプルに関する細胞生存の平均阻害パーセントは、６５％±９であった。これらの結果は、抗ＦｃγＲＩＩＢ−抗ＦｃεＲＩ二重特異性抗体を用いた、ＦｃγＲＩＩＢ受容体との架橋によるＦｃεＲＩ受容体活性の抑制は、ヒト骨髄由来肥満細胞のマウスＩｇＥ誘導生存を阻害することを示している。
上記の明細書、実施例およびデータは、本発明の組成物の製造ならびに使用法についての完全な説明を提供している。本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本発明の多くの実施形態を行い得るため、本発明は、以下の添付の請求項のもとにある。
図１は、天然ＩｇＧの概略図である。ジスルフィド結合は、ＣＨ１ドメインとＣＬドメインとの間、および２つのＣＨ間ドメインの間の太線で表されている。Ｖは可変ドメインであり；Ｃは定常ドメインであり；Ｌは軽鎖を、Ｈは重鎖を表す。 図２Ａは、好ましいヒトＦｃγＲＩＩＡ（配列番号９）；ヒトＦｃγＲＩＩＢ２（配列番号１０）のアミノ酸配列のアラインメントである。 図２Ｂは、ＦｃγＲＩＩＢ１（配列番号１１）のアミノ酸配列を示している。 図３は、天然配列ヒト抗体Ｆｃ領域配列のアラインメントを示している。これらの配列は、天然配列ヒトＩｇＧ１（配列番号３１）、非Ａアロタイプ；天然配列ヒトＩｇＧ２（配列番号３２）；天然配列ヒトＩｇＧ３（配列番号３３）；および天然配列ヒトＩｇＧ４（配列番号３４）である。 図４は、ＧＳＴ−ｈｕＦｃγＲＩＩＡ融合タンパク質およびＧＳＴ−ｈｕＦｃγＲＩＩＩ融合タンパク質に比較して、ＧＳＴ−ｈｕＦｃγＲＩＩＢに対する抗体の相対的結合性を示す棒グラフを提供している。 図５は、ＧＰＩ−ｈｕＦｃγＲＩＩＡを発現するＣＨＯ細胞に比較して、ＧＰＩ−ｈｕＦｃγＲＩＩＢを発現するＣＨＯ細胞に対する、抗体の免疫蛍光結合による結合特異性を示している。 図６〜９は、ＧＳＴ−ｈｕＦｃγＲＩＩＢ、ＧＳＴ−ｈｕＦｃγＲＩＩＡ（Ｈ１３１）、またはＧＳＴ−ｈｕＦｃγＲＩＩＡ（Ｒ１３１）に対する種々の抗ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）の結合に関する結合親和性曲線を示している。 図６〜９は、ＧＳＴ−ｈｕＦｃγＲＩＩＢ、ＧＳＴ−ｈｕＦｃγＲＩＩＡ（Ｈ１３１）、またはＧＳＴ−ｈｕＦｃγＲＩＩＡ（Ｒ１３１）に対する種々の抗ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）の結合に関する結合親和性曲線を示している。 図６〜９は、ＧＳＴ−ｈｕＦｃγＲＩＩＢ、ＧＳＴ−ｈｕＦｃγＲＩＩＡ（Ｈ１３１）、またはＧＳＴ−ｈｕＦｃγＲＩＩＡ（Ｒ１３１）に対する種々の抗ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）の結合に関する結合親和性曲線を示している。 図６〜９は、ＧＳＴ−ｈｕＦｃγＲＩＩＢ、ＧＳＴ−ｈｕＦｃγＲＩＩＡ（Ｈ１３１）、またはＧＳＴ−ｈｕＦｃγＲＩＩＡ（Ｒ１３１）に対する種々の抗ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）の結合に関する結合親和性曲線を示している。 図１０は、モノクローナル抗体５Ａ６．２．１の軽鎖および重鎖のアミノ酸配列を示している。 図１１〜１５は、５Ａ６はｈｕＦｃγＲＩＩＡに対するＥ２７−ＩｇＥ六量体結合を妨害しないが、５Ａ６は、ｈｕＦｃγＲＩＩＡに対するＥ２７−ＩｇＥ六量体結合の結合を妨害することを示している。 図１１〜１５は、５Ａ６はｈｕＦｃγＲＩＩＡに対するＥ２７−ＩｇＥ六量体結合を妨害しないが、５Ａ６は、ｈｕＦｃγＲＩＩＡに対するＥ２７−ＩｇＥ六量体結合の結合を妨害することを示している。 図１１〜１５は、５Ａ６はｈｕＦｃγＲＩＩＡに対するＥ２７−ＩｇＥ六量体結合を妨害しないが、５Ａ６は、ｈｕＦｃγＲＩＩＡに対するＥ２７−ＩｇＥ六量体結合の結合を妨害することを示している。 図１１〜１５は、５Ａ６はｈｕＦｃγＲＩＩＡに対するＥ２７−ＩｇＥ六量体結合を妨害しないが、５Ａ６は、ｈｕＦｃγＲＩＩＡに対するＥ２７−ＩｇＥ六量体結合の結合を妨害することを示している。 図１１〜１５は、５Ａ６はｈｕＦｃγＲＩＩＡに対するＥ２７−ＩｇＥ六量体結合を妨害しないが、５Ａ６は、ｈｕＦｃγＲＩＩＡに対するＥ２７−ＩｇＥ六量体結合の結合を妨害することを示している。 図１６は、Ｋ５６２赤白血病系を発現する天然ＦｃγＲＩＩＡに対する５Ａ６ＭＡｂの間接的免疫蛍光結合分析を示している。 図１７は、ヒスタミン放出の阻害により定量的に測定した、活性化受容体に対するＦｃγＲＩＩＢ交差結合の効果を示している。 図１８は、ｐ５Ａ６．１１．Ｋｎｏｂ（Ｋｎｏｂ抗ＦｃγＲＩＩＢ）および２２Ｅ７．１１．Ｈｏｌｅ（ｈｏｌｅ抗ＦｃεＲＩ）抗体成分発現に関する抗Ｆａｂウェスタンブロットの結果を示している。 図１９は、ｐ５Ａ６．１１．Ｋｎｏｂ（Ｋｎｏｂ抗ＦｃγＲＩＩＢ）および２２Ｅ７．１１．Ｈｏｌｅ（ｈｏｌｅ抗ＦｃεＲＩ）抗体成分発現に関する抗Ｆｃウェスタンブロットの結果を示している。 図２０は、野生型または改変ヒンジ配列を有する抗体成分の発現に関する抗Ｆａｂウェスタンブロットの結果を示している。 図２１は、野生型または改変ヒンジ配列を有する抗体成分の発現に関する抗Ｆｃウェスタンブロットの結果を示している。 図２２は、室温で５Ａ６Ｋｎｏｂと２２Ｅ７Ｈｏｌｅとを混合し、この混合物を５０℃で５分間加熱した、５Ａ６Ｋｎｏｂ、２２Ｅ７Ｈｏｌｅの等電点電気泳動分析を示している。 図２３は、５Ａ６Ｋｎｏｂ／２２Ｅ７Ｈｏｌｅ二重特異性抗体、２２Ｅ７Ｈｏｌｅ抗体、および５Ａ６Ｋｎｏｂ抗体に関するＦｃγＲＩＩＢアフィニティーカラム流動を示している。 図２４は、５Ａ６Ｋｎｏｂ、２２Ｅ７Ｈｏｌｅ、および５０℃に１０分間加熱した５Ａ６Ｋｎｏｂと２２Ｅ７Ｈｏｌｅとの混合物の等電点電気泳動分析を示している。 図２５は、５Ａ６抗体のアルカリホスファターゼプロモーター（ｐｈｏＡ）、ＳＴＩＩシグナル配列および軽鎖全体（可変ドメインおよび定常ドメイン）をコードする核酸配列（配列番号３５）を示している。 図２６は、２２Ｅ７抗体のアルカリホスファターゼプロモーター（ｐｈｏＡ）、ＳＴＩＩシグナル配列および軽鎖全体（可変ドメインおよび定常ドメイン）をコードする核酸配列（配列番号３６）を示している。 図２７は、５Ａ６抗体のＳＴＩＩシグナル配列の最後の３つのアミノ酸およびマウス重鎖可変ドメインのおよそ１１９のアミノ酸をコードする核酸配列（配列番号３７）を示している。 図２８は、２２Ｅ７抗体のＳＴＩＩシグナル配列の最後の３つのアミノ酸およびマウス重鎖可変ドメインのおよそ１２３のアミノ酸をコードする核酸配列（配列番号３８）を示している。 図２９および３０は、５Ａ６／２２Ｅ７ヒンジなし二重特異性抗体の二重結合特異性を示すＥＬＩＳＡ結果を提供している。 図２９および３０は、５Ａ６／２２Ｅ７ヒンジなし二重特異性抗体の二重結合特異性を示すＥＬＩＳＡ結果を提供している。 図３１〜３３は、ｈｕＦｃγＲＩＩＢからｈｕＦｃεＲＩに交差結合する５Ａ６／２２Ｅ７二重特異性抗体の能力を示すヒスタミン放出アッセイＥＬＩＳＡデータを示している。 図３１〜３３は、ｈｕＦｃγＲＩＩＢからｈｕＦｃεＲＩに交差結合する５Ａ６／２２Ｅ７二重特異性抗体の能力を示すヒスタミン放出アッセイＥＬＩＳＡデータを示している。 図３１〜３３は、ｈｕＦｃγＲＩＩＢからｈｕＦｃεＲＩに交差結合する５Ａ６／２２Ｅ７二重特異性抗体の能力を示すヒスタミン放出アッセイＥＬＩＳＡデータを示している。 図３４は、ｈｕＦｃεＲＩ ＥＣＤおよびｈｕＦｃγＲＩＩＢ ＥＣＤとの５Ａ６／２２Ｅ７二重特異性抗体のプレインキュベーションによるＲＢＬ−ｈｕＦｃεＲＩ＋ＦｃγＲＩＩＢ１細胞における抗原誘導ヒスタミン放出の阻害を示すＥＬＩＳＡヒスタミン放出アッセイ結果のグラフである。 図３５は、ｈｕＦｃεＲＩ ＥＣＤおよびｈｕＦｃγＲＩＩＢ ＥＣＤの存在下、ＲＢＬ−ｈｕＦｃεＲＩ＋ＦｃγＲＩＩＢ１細胞に対する５Ａ６／２２Ｅ７二重特異性抗体の結合に関するＦＡＣＳデータのグラフを含む。 図３６は、ｈｕＦｃεＲＩ ＥＣＤおよびｈｕＦｃγＲＩＩＢ ＥＣＤとの５Ａ６／２２Ｅ７二重特異性抗体のプレインキュベーションによるＲＢＬ−ｈｕＦｃεＲＩ＋ＦｃγＲＩＩＢ２細胞における抗原誘導ヒスタミン放出抑制の阻害を示すＥＬＩＳＡヒスタミン放出アッセイ結果のグラフである。 図３７は、ｈｕＦｃεＲＩ ＥＣＤおよびｈｕＦｃγＲＩＩＢ ＥＣＤの存在下、ＲＢＬｈｕＦｃεＲＩ＋ＦｃγＲＩＩＢ２細胞に対する５Ａ６／２２Ｅ７二重特異性抗体の結合に関するＦＡＣＳデータのグラフを含む。 図３８は、ｈｕＦｃεＲＩ ＥＣＤ、ｈｕＦｃγＲＩＩＢ ＥＣＤ、または双方のＥＣＤによる、ＲＢＬ ｈｕＦｃεＲＩ細胞に対する５Ａ６／２２Ｅ７二重特異性抗体結合の阻害を示すＦＡＣＳデータのグラフを含む。 図３９は、ｈｕＦｃεＲＩ ＥＣＤ、ｈｕＦｃγＲＩＩＢ ＥＣＤ、または双方のＥＣＤによる、ＲＢＬ ｈｕＦｃγＲＩＩＢ細胞に対する５Ａ６／２２Ｅ７二重特異性抗体結合の阻害を示すＦＡＣＳデータのグラフを含む。 図４０は、ｈｕＦｃεＲＩ ＥＣＤ、ｈｕＦｃγＲＩＩＢ ＥＣＤ、または双方のＥＣＤによる、ＲＢＬ ｈｕＦｃεＲＩ＋ｈｕＦｃγＲＩＩＢ１細胞に対する５Ａ６／２２Ｅ７二重特異性抗体結合の阻害を示すＦＡＣＳデータのグラフを含む。 図４１は、ｈｕＦｃεＲＩ ＥＣＤ、ｈｕＦｃγＲＩＩＢ ＥＣＤ、または双方のＥＣＤによる、ＲＢＬ ｈｕＦｃεＲＩ＋ｈｕＦｃγＲＩＩＢ２細胞に対する５Ａ６／２２Ｅ７二重特異性抗体結合の阻害を示すＦＡＣＳデータのグラフを含む。 図４２は、飽和下濃度における５Ａ６／２２Ｅ７二重特異性抗体による、ＲＢＬ ｈｕＦｃεＲＩ＋ｈｕＦｃγＲＩＩＢ１細胞における抗原誘導ヒスタミン放出の抑制を示すＥＬＩＳＡヒスタミン放出アッセイ結果のグラフである。 図４３は、ＲＢＬ ｈｕＦｃεＲＩ＋ｈｕＦｃγＲＩＩＢ１細胞に対する５Ａ６／２２Ｅ７二重特異性抗体結合のフローサイトメトリーデータである。 図４４は、飽和下濃度における５Ａ６／２２Ｅ７二重特異性抗体による、ＲＢＬ ｈｕＦｃεＲＩ＋ｈｕＦｃγＲＩＩＢ２細胞における抗原誘導ヒスタミン放出の抑制を示すＥＬＩＳＡヒスタミン放出アッセイ結果のグラフである。 図４５は、ＲＢＬ ｈｕＦｃεＲＩ＋ｈｕＦｃγＲＩＩＢ２細胞に対する５Ａ６／２２Ｅ７二重特異性抗体結合のフローサイトメトリーデータである。 図４６Ａおよび４６Ｂは、ＲＢＬ ｈｕＦｃεＲＩ細胞、ＲＢＬ ＦｃγＲＩＩＢ細胞、ＲＢＬ ｈｕＦｃεＲＩ＋ｈｕＦｃγＲＩＩＢ１細胞、およびＲＢＬ ｈｕＦｃε＋ＦｃγＲＩＩＢ２細胞に対する５Ａ６／２２Ｅ７二重特異性抗体結合の滴定のフローサイトメトリーデータを示している。 図４６Ａおよび４６Ｂは、ＲＢＬ ｈｕＦｃεＲＩ細胞、ＲＢＬ ＦｃγＲＩＩＢ細胞、ＲＢＬ ｈｕＦｃεＲＩ＋ｈｕＦｃγＲＩＩＢ１細胞、およびＲＢＬ ｈｕＦｃε＋ＦｃγＲＩＩＢ２細胞に対する５Ａ６／２２Ｅ７二重特異性抗体結合の滴定のフローサイトメトリーデータを示している。 図４７は、二重特異性抗体の存在下または不在下、ＩｇＥによる処理後７日間の時間経過にわたる、ＲＢＬ ｈｕＦｃεＲＩ細胞、ＲＢＬ ｈｕＦｃεＲＩ＋ｈｕＦｃγＲＩＩＢ１細胞、およびＲＢＬ ｈｕＦｃεＲＩ＋ｈｕＦｃγＲＩＩＢ２細胞の、ＥＬＩＳＡによって検出された細胞培地中の二重特異性抗体レベルのグラフであり、該抗体が減損していなかったことを示している。 図４８は、二重特異性抗体の存在下または不在下、ＩｇＥによる処理後７日間の時間経過にわたる、ＲＢＬ ｈｕＦｃεＲＩ細胞、ＲＢＬ ｈｕＦｃεＲＩ＋ｈｕＦｃγＲＩＩＢ１細胞、およびＲＢＬ ｈｕＦｃεＲＩ＋ｈｕＦｃγＲＩＩＢ２細胞の、ＥＬＩＳＡによって検出された細胞培地中のＩｇＥレベルのグラフであり、該抗体が減損していなかったことを示している。 図４９および５０は、ＲＢＬ ｈｕＦｃεＲＩ細胞におけるＦｃεＲＩ表面発現のＩｇＥに誘導されたアップレギュレーションに関するフローサイトメトリーデータを示している。 図４９および５０は、ＲＢＬ ｈｕＦｃεＲＩ細胞におけるＦｃεＲＩ表面発現のＩｇＥに誘導されたアップレギュレーションに関するフローサイトメトリーデータを示している。 図５１および５２は、ＲＢＬ ｈｕＦｃεＲＩ＋ＦｃγＲＩＩＢ１細胞におけるＦｃεＲＩ表面発現のＩｇＥに誘導されたアップレギュレーションに関するフローサイトメトリーデータを示している。 図５１および５２は、ＲＢＬ ｈｕＦｃεＲＩ＋ＦｃγＲＩＩＢ１細胞におけるＦｃεＲＩ表面発現のＩｇＥに誘導されたアップレギュレーションに関するフローサイトメトリーデータを示している。 図５３および５４は、ＲＢＬ ｈｕＦｃεＲＩ＋ＦｃγＲＩＩＢ２細胞におけるＦｃεＲＩ表面発現のＩｇＥに誘導されたアップレギュレーションに関するフローサイトメトリーデータを示している。 図５３および５４は、ＲＢＬ ｈｕＦｃεＲＩ＋ＦｃγＲＩＩＢ２細胞におけるＦｃεＲＩ表面発現のＩｇＥに誘導されたアップレギュレーションに関するフローサイトメトリーデータを示している。 図５５は、ＩｇＥ除去後のＲＢＬ ＦｃεＲＩ細胞におけるＦｃεＲＩ表面発現のダウンレギュレーションに対する二重特異性抗体の効果を示すフローサイトメトリーデータを示している。 図５６は、ＩｇＥ除去後のＲＢＬ ＦｃεＲＩ＋ＦｃγＲＩＩＢ１細胞におけるＦｃεＲＩ表面発現のダウンレギュレーションに対する二重特異性抗体の効果を示すフローサイトメトリーデータを示している。 図５７は、ＩｇＥ除去後のＲＢＬ ＦｃεＲＩ＋ＦｃγＲＩＩＢ２細胞におけるＦｃεＲＩ表面発現のダウンレギュレーションに対する二重特異性抗体の効果を示すフローサイトメトリーデータを示している。 図５８〜６１は、肥満細胞ＲＢＬのｈｕＦｃεＲＩ（ｈｕＦｃＥＲＩａと称される）、ＲＢＬ ＦｃεＲＩ＋ＦｃγＲＩＩＢ１細胞（ｈｕＦｃＧＲＩＩｂ１と称される）、およびＲＢＬ ｈｕＦｃεＲＩ＋ＦｃγＲＩＩＢ２細胞（ｈｕＦｃＧＲＩＩｂ２と称される）における、ならびに３種の異なるドナーのヒト好塩基球におけるｈｕＦｃεＲＩα、ＦｃγＲＩＩＢ１、ＦｃγＲＩＩＢ２、ｈｕＲＰＬ１９（対照）、およびラットＦｃεＲＩαのｍＲＮＡ発現のＲＴ−ＰＣＲデータを示している。 図５８〜６１は、肥満細胞ＲＢＬのｈｕＦｃεＲＩ（ｈｕＦｃＥＲＩａと称される）、ＲＢＬ ＦｃεＲＩ＋ＦｃγＲＩＩＢ１細胞（ｈｕＦｃＧＲＩＩｂ１と称される）、およびＲＢＬ ｈｕＦｃεＲＩ＋ＦｃγＲＩＩＢ２細胞（ｈｕＦｃＧＲＩＩｂ２と称される）における、ならびに３種の異なるドナーのヒト好塩基球におけるｈｕＦｃεＲＩα、ＦｃγＲＩＩＢ１、ＦｃγＲＩＩＢ２、ｈｕＲＰＬ１９（対照）、およびラットＦｃεＲＩαのｍＲＮＡ発現のＲＴ−ＰＣＲデータを示している。 図５８〜６１は、肥満細胞ＲＢＬのｈｕＦｃεＲＩ（ｈｕＦｃＥＲＩａと称される）、ＲＢＬ ＦｃεＲＩ＋ＦｃγＲＩＩＢ１細胞（ｈｕＦｃＧＲＩＩｂ１と称される）、およびＲＢＬ ｈｕＦｃεＲＩ＋ＦｃγＲＩＩＢ２細胞（ｈｕＦｃＧＲＩＩｂ２と称される）における、ならびに３種の異なるドナーのヒト好塩基球におけるｈｕＦｃεＲＩα、ＦｃγＲＩＩＢ１、ＦｃγＲＩＩＢ２、ｈｕＲＰＬ１９（対照）、およびラットＦｃεＲＩαのｍＲＮＡ発現のＲＴ−ＰＣＲデータを示している。 図５８〜６１は、肥満細胞ＲＢＬのｈｕＦｃεＲＩ（ｈｕＦｃＥＲＩａと称される）、ＲＢＬ ＦｃεＲＩ＋ＦｃγＲＩＩＢ１細胞（ｈｕＦｃＧＲＩＩｂ１と称される）、およびＲＢＬ ｈｕＦｃεＲＩ＋ＦｃγＲＩＩＢ２細胞（ｈｕＦｃＧＲＩＩｂ２と称される）における、ならびに３種の異なるドナーのヒト好塩基球におけるｈｕＦｃεＲＩα、ＦｃγＲＩＩＢ１、ＦｃγＲＩＩＢ２、ｈｕＲＰＬ１９（対照）、およびラットＦｃεＲＩαのｍＲＮＡ発現のＲＴ−ＰＣＲデータを示している。 図６２は、主要なヒト好塩基球における抗ＩｇＥ誘導ヒスタミン放出が、抗ＦｃγＲＩＩＢ−抗ＦｃεＲＩ二重特異性抗体５Ａ６／２２Ｅ７により抑制されたアッセイの結果を示している。 図６３は、抗ＦｃγＲＩＩＢ−抗ＦｃεＲＩ二重特異性抗体５Ａ６／２２Ｅ７が、０日目、３日目および４日目に添加された場合の、ＲＢＬ ＦｃεＲＩ＋ＦｃγＲＩＩＢ２細胞におけるＩｇＥ誘導ＦｃεＲＩ表面発現のダウンレギュレーションに及ぼす二重特異性抗体の効果を示すフローサイトメトリーデータを示している。 図６４は、ＲＢＬ ＦｃεＲＩ＋ＦｃγＲＩＩＢ２細胞におけるＩｇＥ／抗原誘導サイトカイン放出が抗ＦｃγＲＩＩＢ−抗ＦｃεＲＩ二重特異性抗体５Ａ６／２２Ｅ７により抑制されたアッセイの結果を示している。各棒グラフに関し：抗原／ＩｇＥ単独（ＮＰ（１１）−ＯＶＡ＋ＩｇＥ）は暗灰色の棒；抗原／ＩｇＥ＋二重特異性抗体（ＮＰ（１１）−ＯＶＡ＋ＩｇＥ＋ＢｓＡｂ）は明灰色の棒。 図６５は、ＲＢＬ ＦｃεＲＩ＋ＦｃγＲＩＩＢ１細胞におけるＩｇＥ／抗原誘導アラキドン酸カスケード刺激が抗ＦｃγＲＩＩＢ−抗ＦｃεＲＩ二重特異性抗体５Ａ６／２２Ｅ７により抑制されたアッセイの結果を示している。

Claims (86)

  1. 配列番号１、２、３、４、５、および６よりなる群から選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＣＤＲを含む単離された抗原結合ポリペプチドまたは抗体であって、該抗体はＦｃγＲＩＩＢ受容体に選択的に結合する、単離された抗原結合ポリペプチドまたは抗体。
  2. 前記抗原結合ポリペプチドまたは抗体の重鎖ＣＤＲが、配列番号１および／または配列番号２および／または配列番号３を含む、請求項１に記載の単離された抗原結合ポリペプチドまたは抗体。
  3. 前記抗原結合ポリペプチドまたは抗体の軽鎖ＣＤＲが、配列番号４および／または配列番号５および／または配列番号６を含む、請求項１に記載の単離された抗原結合ポリペプチドまたは抗体。
  4. 前記抗原結合ポリペプチドまたは抗体が、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、請求項１に記載の単離された抗原結合ポリペプチドまたは抗体。
  5. 前記抗原結合ポリペプチドまたは抗体が、配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む、請求項１に記載の単離された抗原結合ポリペプチドまたは抗体。
  6. 前記抗原結合ポリペプチドまたは抗体が、配列番号７および８のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離された抗原結合ポリペプチドまたは抗体。
  7. 前記抗原結合ポリペプチドまたは抗体が、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはそれらの断片である、請求項１に記載の抗原結合ポリペプチドまたは抗体。
  8. 前記抗原結合ポリペプチドまたは抗体が、ＦｃγＲＩＩＢに対する抗体Ｆｃ領域の結合に拮抗する、請求項１に記載の抗原結合ポリペプチドまたは抗体。
  9. ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−４６１４を有するハイブリドーマ細胞株から作製された抗体の結合特性を有する、請求項１に記載の抗原結合ポリペプチドまたは抗体。
  10. ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−４６１４を有するハイブリドーマ細胞株から作製された抗体の結合特性を有する、単離された抗原結合ポリペプチドまたは抗体。
  11. ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−４６１４を有するハイブリドーマ細胞株から作製された、単離抗体またはその抗原結合ポリペプチド断片。
  12. ＦｃγＲＩＩＢを請求項１に記載の抗原結合ポリペプチドまたは抗体に結合する工程を包含する、ＦｃγＲＩＩＢ活性をダウンレギュレートする方法。
  13. ＦｃγＲＩＩＡ活性をダウンレギュレートすることなく、ＦｃγＲＩＩＢ活性がダウンレギュレートされる、請求項１２に記載の方法。
  14. ａ）治療的抗原結合ポリペプチド、抗体、または化学療法剤を投与する工程；および
    ｂ）請求項１に記載の抗原結合ポリペプチドまたは抗体を投与する工程
    を包含する、哺乳動物における疾患または障害の処置方法。
  15. 請求項１に記載の抗原結合ポリペプチドまたは抗体の投与を包含する、哺乳動物における疾患または障害の処置方法。
  16. ａ）請求項１に記載の第１の抗原結合ポリペプチドまたは抗体；および
    ｂ）活性化受容体に特異的に結合する第２の抗原結合ポリペプチドまたは抗体
    を含む、単離二重特異性抗体。
  17. 前記第２の抗原結合ポリペプチドまたは抗体がＦｃεＲＩに結合する、請求項１６に記載の単離二重特異性抗体。
  18. 前記第２の抗原結合ポリペプチドまたは抗体が、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはそれらの断片である、請求項１６に記載の単離二重特異性抗体。
  19. 前記第１の抗原結合ポリペプチドまたは抗体の重鎖ＣＤＲ１、２、および３が、それぞれ、配列番号１、２、および３を含む、請求項１６に記載の単離二重特異性抗体。
  20. 前記第１の抗原結合ポリペプチドまたは抗体の軽鎖ＣＤＲ１、２、および３が、それぞれ、配列番号４、５、および６を含む、請求項１６に記載の単離二重特異性抗体。
  21. 前記第１の抗原結合ポリペプチドまたは抗体が、配列番号７のアミノ酸配列を含む可変ドメイン重鎖を含む、請求項１６に記載の単離二重特異性抗体。
  22. 前記第１の抗原結合ポリペプチドまたは抗体が、配列番号８のアミノ酸配列を含む可変ドメイン軽鎖を含む、請求項１６に記載の単離二重特異性抗体。
  23. 前記第１の抗原結合ポリペプチドまたは抗体が、ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−４６１４を有するハイブリドーマ細胞株から作製された抗体の結合特性を有する請求項１６に記載の単離二重特異性抗体。
  24. 請求項１６のいずれかの抗体の投与を包含する、哺乳動物における疾患または障害の処置方法。
  25. ａ）ＦｃγＲＩＩＢに選択的に結合する、ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−４６１４を有するハイブリドーマ細胞株から作製された第１の抗原結合ポリペプチドもしくは抗体またはその断片、または前記第１の抗体から誘導されたキメラ抗体もしくはヒト化抗体、またはその断片；および
    ｂ）活性化受容体に特異的に結合する第２の抗原結合ポリペプチドまたは抗体
    を含む単離二重特異性抗体。
  26. 前記第２の抗原結合ポリペプチドまたは抗体が、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはそれらの断片である、請求項２５に記載の単離二重特異性抗体。
  27. 前記第１の抗原結合ポリペプチドもしくは抗体、またはその断片が、ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−４６１４を有するハイブリドーマ細胞株から作製された抗体の重鎖ＣＤＲまたは軽鎖ＣＤＲを含む、請求項２５に記載の単離二重特異性抗体。
  28. 前記第１の抗原結合ポリペプチドもしくは抗体、またはその断片が、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−４６１４のハイブリドーマ細胞株から作製された抗体の重鎖ＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲを含む、請求項２５に記載の単離二重特異性抗体。
  29. 前記第１の抗体もしくはその断片、または第２の抗体もしくはその断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ２、Ｆａｂ’２、Ｆｄ、Ｆｄ’、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ２、ｄＡｂよりなる群から選択される抗体断片である、請求項２５に記載の単離二重特異性抗体。
  30. 前記活性化受容体がＩｇＥ受容体である、請求項１６に記載の二重特異性抗体。
  31. 前記ＩｇＥ受容体がＦｃεＲＩである、請求項１６に記載の二重特異性抗体。
  32. 前記第１の抗体が前記第２の抗体に共有結合している、請求項１６に記載の二重特異性抗体。
  33. 前記第１および第２の抗原結合ポリペプチドまたは抗体が、少なくとも５つのアミノ酸を含むリンカーによって共有結合している、請求項１６に記載の二重特異性抗体。
  34. 前記二重特異性抗体が、重鎖間ジスルフィド結合のできない改変重鎖ヒンジ領域を含む、請求項１６に記載の二重特異性抗体。
  35. 前記第１の抗原結合ポリペプチドまたは抗体が、ヒトＦｃγＲＩＩＢに結合し、ヒトＦｃγＲＩＩＡには、ほとんどまたは全く結合を示さない、請求項１６に記載の二重特異性抗体。
  36. 前記活性化受容体がＩｇＥ受容体である、請求項２５に記載の二重特異性抗体。
  37. 前記活性化受容体がＦｃεＲＩである、請求項２５に記載の二重特異性抗体。
  38. 前記第１の抗体が前記第２の抗体に共有結合している、請求項２５に記載の二重特異性抗体。
  39. 前記第１および第２の抗原結合ポリペプチドまたは抗体が、少なくとも５つのアミノ酸を含むリンカーによって共有結合している、請求項２５に記載の二重特異性抗体。
  40. 前記二重特異性抗体が、重鎖間ジスルフィド結合のできない改変重鎖ヒンジ領域を含む、請求項２５に記載の二重特異性抗体。
  41. 前記第１の抗原結合ポリペプチドまたは抗体が、ヒトＦｃγＲＩＩＢに結合し、ヒトＦｃγＲＩＩＡには、ほとんどまたは全く結合を示さない、請求項２５に記載の二重特異性抗体。
  42. 請求項１６に記載の二重特異性抗体を投与する工程を包含する、哺乳動物における免疫応答を阻害する方法。
  43. 請求項１６に記載の二重特異性抗体を投与する工程を包含する、哺乳動物における免疫応答に関連するヒスタミン放出を抑える方法。
  44. 前記ヒスタミン放出が、アレルギー、喘息、または炎症に関連する、請求項４３に記載の方法。
  45. ａ）ＦｃγＲＩＩＢを発現する細胞を、請求項１６に記載の二重特異性抗体に接触させる工程；および
    ｂ）該ＦｃγＲＩＩＢおよび活性化受容体を該二重特異性抗体と共凝集させ、それによって、該ＦｃγＲＩＩＢを活性化させる工程
    を包含する、哺乳動物細胞において、ＦｃγＲＩＩＢを活性化させる方法。
  46. 前記活性化受容体がＩＴＡＭ活性化モチーフを含む、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記活性化受容体がＦｃεＲＩである請求項４６に記載の方法。
  48. ＦｃγＲＩＩＢおよびＦｃεＲＩの共凝集がＦｃεＲＩの発現をダウンレギュレートする請求項４７に記載の方法。
  49. 前記細胞がＢ細胞または肥満細胞である請求項４８に記載の方法。
  50. 前記細胞がヒト細胞である請求項４８に記載の方法。
  51. ＦｃεＲＩ受容体およびＦｃγＲＩＩＢ受容体を含む細胞に、請求項１６に記載の二重特異性抗体の有効量を投与することにより、細胞内の該ＦｃεＲＩ受容体の発現を阻害する方法。
  52. 前記細胞が、該細胞内のＦｃεＲＩ発現の阻害により軽減される障害にかかっている哺乳動物の細胞である請求項４５に記載の方法。
  53. 前記障害が慢性的障害である請求項５２に記載の方法。
  54. 前記哺乳動物がヒトである請求項５３に記載の方法。
  55. 前記障害が、アテローム硬化症；白血球接着障害；慢性関節リウマチ；全身性エリトマトーデス（ＳＬＥ）；真性糖尿病；多発性硬化症；レーノー症候群；自己免疫甲状腺炎；アレルギー性脳脊髄炎；シェーグレン症候群；および若年性糖尿病である請求項５３に記載の方法。
  56. 前記方法は、ＦｃεＲＩ活性に関連する慢性的障害の処置を増強する、請求項４５に記載の方法。
  57. ｃ）ＦｃγＲＩＩＢを発現する細胞を、請求項２５に記載の二重特異性抗体に接触させる工程；および
    ｄ）該ＦｃγＲＩＩＢおよび活性化受容体を該二重特異性抗体と共凝集させ、それによって、該ＦｃγＲＩＩＢを活性化させる工程
    を包含する、哺乳動物細胞において、ＦｃγＲＩＩＢを活性化させる方法。
  58. 前記活性化受容体がＩＴＡＭ活性化モチーフを含む、請求項５７に記載の方法。
  59. 前記活性化受容体がＦｃεＲＩである請求項５７に記載の方法。
  60. ＦｃγＲＩＩＢおよびＦｃεＲＩの共凝集がＦｃεＲＩの発現をダウンレギュレートする請求項５９に記載の方法。
  61. 前記細胞がＢ細胞または肥満細胞である請求項５７に記載の方法。
  62. 前記細胞がヒト細胞である請求項６１に記載の方法。
  63. ＦｃεＲＩ受容体およびＦｃγＲＩＩＢ受容体を含む細胞に、請求項２５に記載の二重特異性抗体の有効量を投与することにより、細胞内の該ＦｃεＲＩ受容体の発現を阻害する方法。
  64. 前記細胞が、該細胞内のＦｃεＲＩ発現の阻害により軽減される障害にかかっている哺乳動物の細胞である請求項５７に記載の方法。
  65. 前記障害が慢性的障害である請求項６４に記載の方法。
  66. 前記哺乳動物がヒトである請求項６４に記載の方法。
  67. 前記障害が、アテローム硬化症；白血球接着障害；慢性関節リウマチ；全身性エリトマトーデス（ＳＬＥ）；真性糖尿病；多発性硬化症；レーノー症候群；自己免疫甲状腺炎；アレルギー性脳脊髄炎；シェーグレン症候群；および若年性糖尿病である請求項６４に記載の方法。
  68. ＦｃεＲＩ活性に関連する慢性的障害の処置を増強する、請求項５７に記載の方法。
  69. 抗ＩｇＥ抗体または抗ＩｇＥ結合ポリペプチドと組み合わせた治療的使用のための、抗ＦｃγＲＩＩＢ／抗ＦｃεＲＩ二重特異性抗体および薬学的キャリアを含有する組成物。
  70. 前記抗ＦｃγＲＩＩＢ結合領域が、配列番号１、２、３、４、５、および６よりなる群から選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ（ｆｏｒ）、５つ、または６つのＣＤＲを含む、請求項６９に記載の組成物。
  71. 抗ＩｇＥ抗体または抗ＩｇＥ結合ポリペプチドをさらに含む、請求項６９に記載の組成物。
  72. 前記抗ＩｇＥ抗体がＸｏｌａｉｒ（登録商標）である請求項６９に記載の組成物。
  73. 前記抗ＩｇＥ抗体がＸｏｌａｉｒ（登録商標）である請求項７１に記載の組成物。
  74. 前記二重特異性抗体が、哺乳動物におけるアレルギー、喘息および／またはまたは炎症の処置のために、抗ＩｇＥ抗体または抗ＩｇＥ結合ポリペプチドと組み合わせて投与するためのものであることを示すラベルをさらに含む、請求項６９に記載の組成物を含むキット。
  75. 前記哺乳動物がヒトである請求項７４に記載のキット。
  76. 前記二重特異性抗体の投与が、前記抗ＩｇＥ抗体または抗ＩｇＥ結合ポリペプチドとは別個である請求項７５に記載のキット。
  77. 前記二重特異性抗体の投与が、前記抗ＩｇＥ抗体または抗ＩｇＥ結合ポリペプチドの投与と同時である請求項７６に記載のキット。
  78. 前記抗ＩｇＥ抗体がＸｏｌａｉｒ（登録商標）である請求項７４に記載のキット。
  79. 前記二重特異性抗体および抗ＩｇＥ抗体または抗ＩｇＥ結合ポリペプチドが、哺乳動物におけるアレルギー、喘息および／またはまたは炎症の処置のためのものであることを示すラベルをさらに含む、請求項７１に記載の組成物を含むキット。
  80. 前記哺乳動物がヒトである請求項７９に記載のキット。
  81. 前記抗ＩｇＥ抗体がＸｏｌａｉｒ（登録商標）である請求項８０に記載のキット。
  82. アレルギー、喘息および炎症よりなる群から選択される障害を経験している哺乳動物に、抗ＩｇＥ抗体または抗ＩｇＥ結合ポリペプチドと組み合わせて、抗ＦｃγＲＩＩＢ／抗ＦｃεＲＩ二重特異性抗体を投与する工程を包含する処置方法。
  83. 前記二重特異性抗体および前記抗ＩｇＥ抗体または抗ＩｇＥ結合ポリペプチドの投与は別個である請求項８２に記載の方法。
  84. 前記二重特異性抗体および前記抗ＩｇＥ抗体または抗ＩｇＥ結合ポリペプチドの投与が同時である請求項８２に記載の方法。
  85. 前記哺乳動物がヒトである請求項８２に記載の方法。
  86. 前記抗ＩｇＥ抗体または抗ＩｇＥ結合ポリペプチドがＸｏｌａｉｒ（登録商標）である請求項８２に記載の方法。
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