JP2014058566A - 抗FcγRIIBレセプター抗体およびその使用 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明はまた、FcガンマRIIBに選択的に結合する抗体および活性化受容体に特異的に結合する第2の抗体を含む単離二重機能性抗体を提供する。抗腫瘍抗体と一緒の投与ならびに免疫応答を阻害する方法およびヒスタミン放出を抑制する方法を含む治療的使用を含むそれらの抗体に関する種々の使用法もまた記載する。
【選択図】なし
Description
本発明は、ヒトFcγRIIAよりもヒトFcγRIIBに優先的に結合する抗体、ならびにそれらの抗体に関する使用法に関する。
抗体は、抗原に結合し、抗原がその内在性標的(例えば、受容体またはリガンド)に結合することを防ぐことにより、または抗原除去に導くエフェクター応答を誘導することにより、抗原を中和する。身体にとって異物である抗原を効率的に除去し、および/または破壊するために、抗体は、その抗原に対する高親和性と効率的なエフェクター機能の双方を示す必要がある。多特異性を有する抗体(例えば二重特異性抗体など)は、複数の抗原の補完的または相乗的応答の媒介にとって有用である。
本発明は、ヒトFcγRIIBに選択的に結合する抗原結合ポリペプチドまたは抗体を提供する。本発明の抗原結合ポリペプチドまたは抗体は、ヒトFcγRIIBに、他のヒトFcγR類に結合するよりも有意に良好な親和性で結合し、いくつかの実施形態においては、ヒトFcγRIIAと本質的に交差反応できない。
例えば、本発明は以下を提供する:
(項目1)
配列番号1、2、3、4、5、および6よりなる群から選択される少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つのCDRを含む単離された抗原結合ポリペプチドまたは抗体であって、該抗体はFcγRIIB受容体に選択的に結合する、単離された抗原結合ポリペプチドまたは抗体。
(項目2)
前記抗原結合ポリペプチドまたは抗体の重鎖CDRが、配列番号1および/または配列番号2および/または配列番号3を含む、項目1に記載の単離された抗原結合ポリペプチドまたは抗体。
(項目3)
前記抗原結合ポリペプチドまたは抗体の軽鎖CDRが、配列番号4および/または配列番号5および/または配列番号6を含む、項目1に記載の単離された抗原結合ポリペプチドまたは抗体。
(項目4)
前記抗原結合ポリペプチドまたは抗体が、配列番号7のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、項目1に記載の単離された抗原結合ポリペプチドまたは抗体。
(項目5)
前記抗原結合ポリペプチドまたは抗体が、配列番号8のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む、項目1に記載の単離された抗原結合ポリペプチドまたは抗体。
(項目6)
前記抗原結合ポリペプチドまたは抗体が、配列番号7および8のアミノ酸配列を含む、項目1に記載の単離された抗原結合ポリペプチドまたは抗体。
(項目7)
前記抗原結合ポリペプチドまたは抗体が、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはそれらの断片である、項目1に記載の抗原結合ポリペプチドまたは抗体。
(項目8)
前記抗原結合ポリペプチドまたは抗体が、FcγRIIBに対する抗体Fc領域の結合に拮抗する、項目1に記載の抗原結合ポリペプチドまたは抗体。
(項目9)
ATCC登録番号PTA−4614を有するハイブリドーマ細胞株から作製された抗体の結合特性を有する、項目1に記載の抗原結合ポリペプチドまたは抗体。
(項目10)
ATCC登録番号PTA−4614を有するハイブリドーマ細胞株から作製された抗体の結合特性を有する、単離された抗原結合ポリペプチドまたは抗体。
(項目11)
ATCC登録番号PTA−4614を有するハイブリドーマ細胞株から作製された、単離抗体またはその抗原結合ポリペプチド断片。
(項目12)
FcγRIIBを項目1に記載の抗原結合ポリペプチドまたは抗体に結合する工程を包含する、FcγRIIB活性をダウンレギュレートする方法。
(項目13)
FcγRIIA活性をダウンレギュレートすることなく、FcγRIIB活性がダウンレギュレートされる、項目12に記載の方法。
(項目14)
a)治療的抗原結合ポリペプチド、抗体、または化学療法剤を投与する工程;および
b)項目1に記載の抗原結合ポリペプチドまたは抗体を投与する工程
を包含する、哺乳動物における疾患または障害の処置方法。
(項目15)
項目1に記載の抗原結合ポリペプチドまたは抗体の投与を包含する、哺乳動物における疾患または障害の処置方法。
(項目16)
a)項目1に記載の第1の抗原結合ポリペプチドまたは抗体;および
b)活性化受容体に特異的に結合する第2の抗原結合ポリペプチドまたは抗体を含む、単離二重特異性抗体。
(項目17)
前記第2の抗原結合ポリペプチドまたは抗体がFcεRIに結合する、項目16に記載の単離二重特異性抗体。
(項目18)
前記第2の抗原結合ポリペプチドまたは抗体が、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはそれらの断片である、項目16に記載の単離二重特異性抗体。
(項目19)
前記第1の抗原結合ポリペプチドまたは抗体の重鎖CDR1、2、および3が、それぞれ、配列番号1、2、および3を含む、項目16に記載の単離二重特異性抗体。
(項目20)
前記第1の抗原結合ポリペプチドまたは抗体の軽鎖CDR1、2、および3が、それぞれ、配列番号4、5、および6を含む、項目16に記載の単離二重特異性抗体。
(項目21)
前記第1の抗原結合ポリペプチドまたは抗体が、配列番号7のアミノ酸配列を含む可変ドメイン重鎖を含む、項目16に記載の単離二重特異性抗体。
(項目22)
前記第1の抗原結合ポリペプチドまたは抗体が、配列番号8のアミノ酸配列を含む可変ドメイン軽鎖を含む、項目16に記載の単離二重特異性抗体。
(項目23)
前記第1の抗原結合ポリペプチドまたは抗体が、ATCC登録番号PTA−4614を有するハイブリドーマ細胞株から作製された抗体の結合特性を有する項目16に記載の単離二重特異性抗体。
(項目24)
項目16のいずれかの抗体の投与を包含する、哺乳動物における疾患または障害の処置方法。
(項目25)
a)FcγRIIBに選択的に結合する、ATCC登録番号PTA−4614を有するハイブリドーマ細胞株から作製された第1の抗原結合ポリペプチドもしくは抗体またはその断片、または前記第1の抗体から誘導されたキメラ抗体もしくはヒト化抗体、またはその断片;および
b)活性化受容体に特異的に結合する第2の抗原結合ポリペプチドまたは抗体を含む単離二重特異性抗体。
(項目26)
前記第2の抗原結合ポリペプチドまたは抗体が、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはそれらの断片である、項目25に記載の単離二重特異性抗体。
(項目27)
前記第1の抗原結合ポリペプチドもしくは抗体、またはその断片が、ATCC登録番号PTA−4614を有するハイブリドーマ細胞株から作製された抗体の重鎖CDRまたは軽鎖CDRを含む、項目25に記載の単離二重特異性抗体。
(項目28)
前記第1の抗原結合ポリペプチドもしくは抗体、またはその断片が、ATCC寄託番号PTA−4614のハイブリドーマ細胞株から作製された抗体の重鎖CDRおよび軽鎖CDRを含む、項目25に記載の単離二重特異性抗体。
(項目29)
前記第1の抗体もしくはその断片、または第2の抗体もしくはその断片が、Fab、Fab’、Fab2、Fab’2、Fd、Fd’、scFv、scFv2、dAbよりなる群から選択される抗体断片である、項目25に記載の単離二重特異性抗体。
(項目30)
前記活性化受容体がIgE受容体である、項目16に記載の二重特異性抗体。
(項目31)
前記IgE受容体がFcεRIである、項目16に記載の二重特異性抗体。
(項目32)
前記第1の抗体が前記第2の抗体に共有結合している、項目16に記載の二重特異性抗体。
(項目33)
前記第1および第2の抗原結合ポリペプチドまたは抗体が、少なくとも5つのアミノ酸を含むリンカーによって共有結合している、項目16に記載の二重特異性抗体。
(項目34)
前記二重特異性抗体が、重鎖間ジスルフィド結合のできない改変重鎖ヒンジ領域を含む、項目16に記載の二重特異性抗体。
(項目35)
前記第1の抗原結合ポリペプチドまたは抗体が、ヒトFcγRIIBに結合し、ヒトFcγRIIAには、ほとんどまたは全く結合を示さない、項目16に記載の二重特異性抗体。
(項目36)
前記活性化受容体がIgE受容体である、項目25に記載の二重特異性抗体。
(項目37)
前記活性化受容体がFcεRIである、項目25に記載の二重特異性抗体。
(項目38)
前記第1の抗体が前記第2の抗体に共有結合している、項目25に記載の二重特異性抗体。
(項目39)
前記第1および第2の抗原結合ポリペプチドまたは抗体が、少なくとも5つのアミノ酸を含むリンカーによって共有結合している、項目25に記載の二重特異性抗体。
(項目40)
前記二重特異性抗体が、重鎖間ジスルフィド結合のできない改変重鎖ヒンジ領域を含む、項目25に記載の二重特異性抗体。
(項目41)
前記第1の抗原結合ポリペプチドまたは抗体が、ヒトFcγRIIBに結合し、ヒトFcγRIIAには、ほとんどまたは全く結合を示さない、項目25に記載の二重特異性抗体。
(項目42)
項目16に記載の二重特異性抗体を投与する工程を包含する、哺乳動物における免疫応答を阻害する方法。
(項目43)
項目16に記載の二重特異性抗体を投与する工程を包含する、哺乳動物における免疫応答に関連するヒスタミン放出を抑える方法。
(項目44)
前記ヒスタミン放出が、アレルギー、喘息、または炎症に関連する、項目43に記載の方法。
(項目45)
a)FcγRIIBを発現する細胞を、項目16に記載の二重特異性抗体に接触させる工程;および
b)該FcγRIIBおよび活性化受容体を該二重特異性抗体と共凝集させ、それによって、該FcγRIIBを活性化させる工程を包含する、哺乳動物細胞において、FcγRIIBを活性化させる方法。
(項目46)
前記活性化受容体がITAM活性化モチーフを含む、項目45に記載の方法。
(項目47)
前記活性化受容体がFcεRIである項目46に記載の方法。
(項目48)
FcγRIIBおよびFcεRIの共凝集がFcεRIの発現をダウンレギュレートする項目47に記載の方法。
(項目49)
前記細胞がB細胞または肥満細胞である項目48に記載の方法。
(項目50)
前記細胞がヒト細胞である項目48に記載の方法。
(項目51)
FcεRI受容体およびFcγRIIB受容体を含む細胞に、項目16に記載の二重特異性抗体の有効量を投与することにより、細胞内の該FcεRI受容体の発現を阻害する方法。
(項目52)
前記細胞が、該細胞内のFcεRI発現の阻害により軽減される障害にかかっている哺乳動物の細胞である項目45に記載の方法。
(項目53)
前記障害が慢性的障害である項目52に記載の方法。
(項目54)
前記哺乳動物がヒトである項目53に記載の方法。
(項目55)
前記障害が、アテローム硬化症;白血球接着障害;慢性関節リウマチ;全身性エリトマトーデス(SLE);真性糖尿病;多発性硬化症;レーノー症候群;自己免疫甲状腺炎;アレルギー性脳脊髄炎;シェーグレン症候群;および若年性糖尿病である項目53に記載の方法。
(項目56)
前記方法は、FcεRI活性に関連する慢性的障害の処置を増強する、項目45に記載の方法。
(項目57)
c)FcγRIIBを発現する細胞を、項目25に記載の二重特異性抗体に接触させる工程;および
d)該FcγRIIBおよび活性化受容体を該二重特異性抗体と共凝集させ、それによって、該FcγRIIBを活性化させる工程
を包含する、哺乳動物細胞において、FcγRIIBを活性化させる方法。
(項目58)
前記活性化受容体がITAM活性化モチーフを含む、項目57に記載の方法。
(項目59)
前記活性化受容体がFcεRIである項目57に記載の方法。
(項目60)
FcγRIIBおよびFcεRIの共凝集がFcεRIの発現をダウンレギュレートする項目59に記載の方法。
(項目61)
前記細胞がB細胞または肥満細胞である項目57に記載の方法。
(項目62)
前記細胞がヒト細胞である項目61に記載の方法。
(項目63)
FcεRI受容体およびFcγRIIB受容体を含む細胞に、項目25に記載の二重特異性抗体の有効量を投与することにより、細胞内の該FcεRI受容の発現を阻害する方法。
(項目64)
前記細胞が、該細胞内のFcεRI発現の阻害により軽減される障害にかかっている哺乳動物の細胞である項目57に記載の方法。
(項目65)
前記障害が慢性的障害である項目64に記載の方法。
(項目66)
前記哺乳動物がヒトである項目64に記載の方法。
(項目67)
前記障害が、アテローム硬化症;白血球接着障害;慢性関節リウマチ;全身性エリトマトーデス(SLE);真性糖尿病;多発性硬化症;レーノー症候群;自己免疫甲状腺炎;アレルギー性脳脊髄炎;シェーグレン症候群;および若年性糖尿病である項目64に記載の方法。
(項目68)
FcεRI活性に関連する慢性的障害の処置を増強する、項目57に記載の方法。
(項目69)
抗IgE抗体または抗IgE結合ポリペプチドと組み合わせた治療的使用のための、抗FcγRIIB/抗FcεRI二重特異性抗体および薬学的キャリアを含有する組成物。
(項目70)
前記抗FcγRIIB結合領域が、配列番号1、2、3、4、5、および6よりなる群から選択される少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ(for)、5つ、または6つのCDRを含む、項目69に記載の組成物。
(項目71)
抗IgE抗体または抗IgE結合ポリペプチドをさらに含む、項目69に記載の組成物。(項目72)
前記抗IgE抗体がXolair(登録商標)である項目69に記載の組成物。
(項目73)
前記抗IgE抗体がXolair(登録商標)である項目71に記載の組成物。
(項目74)
前記二重特異性抗体が、哺乳動物におけるアレルギー、喘息および/またはまたは炎症の処置のために、抗IgE抗体または抗IgE結合ポリペプチドと組み合わせて投与するためのものであることを示すラベルをさらに含む、項目69に記載の組成物を含むキット。(項目75)
前記哺乳動物がヒトである項目74に記載のキット。
(項目76)
前記二重特異性抗体の投与が、前記抗IgE抗体または抗IgE結合ポリペプチドとは別個である項目75に記載のキット。
(項目77)
前記二重特異性抗体の投与が、前記抗IgE抗体または抗IgE結合ポリペプチドの投与と同時である項目76に記載のキット。
(項目78)
前記抗IgE抗体がXolair(登録商標)である項目74に記載のキット。
(項目79)
前記二重特異性抗体および抗IgE抗体または抗IgE結合ポリペプチドが、哺乳動物におけるアレルギー、喘息および/またはまたは炎症の処置のためのものであることを示すラベルをさらに含む、項目71に記載の組成物を含むキット。
(項目80)前記哺乳動物がヒトである項目79に記載のキット。
(項目81)
前記抗IgE抗体がXolair(登録商標)である項目80に記載のキット。
(項目82)
アレルギー、喘息および炎症よりなる群から選択される障害を経験している哺乳動物に、抗IgE抗体または抗IgE結合ポリペプチドと組み合わせて、抗FcγRIIB/抗FcεRI二重特異性抗体を投与する工程を包含する処置方法。
(項目83)
前記二重特異性抗体および前記抗IgE抗体または抗IgE結合ポリペプチドの投与は別個である項目82に記載の方法。
(項目84)
前記二重特異性抗体および前記抗IgE抗体または抗IgE結合ポリペプチドの投与が同時である項目82に記載の方法。
(項目85)
前記哺乳動物がヒトである項目82に記載の方法。
(項目86)
前記抗IgE抗体または抗IgE結合ポリペプチドがXolair(登録商標)である項目82に記載の方法。
I.定義
アレルギーとは、環境抗原に対する免疫応答が、組織の炎症および器官の機能障害を引き起こす一定の疾患を言う。アレルゲンは、アレルギーを引き起こす何らかの抗原である。したがって、それは、抗原性分子自体、または花粉粒、動物のふけ、昆虫毒、もしくは食品などの抗原分子源のいずれかであり得る。IgEは、アレルギー障害において中心的な役割を演じている。IgE高親和性受容体(FcεRI)は、アレルギー性疾患の症状発現の多くを生み出す炎症伝達物質のさらなる放出を刺激する抗原性標的として働く肥満細胞および好塩基球上に位置している。
United States Copyright Office、ワシントンDC 20559に、利用者文書と共に保管されている。
A.抗FcγRIIB抗体の作製
(i)FcγRIIB抗原
任意に他の分子に結合させた可溶性ヒトFcγRIIBまたはその断片を、抗体作製のための免疫原として使用できる。免疫原の例としては、キャリアタンパク質またはGSTまたはHis6などの親和性タグを有するFcγRIIB1またはFcγRIIB2の細胞外ドメインを含む融合タンパク質が挙げられる。あるいは、またはそれに追加して、ヒトFcγRIIBを発現する細胞を免疫原として使用できる。このような細胞は、天然源から誘導できるか、またはヒトFcγRIIBを発現させるために組換え法によって形質転換させた細胞であり得る。抗体の調製に有用なヒトFcγRIIBの他の形態は当業者に明らかであろう。
ポリクローナル抗体は、関連抗原およびアジュバントの複数回皮下(sc)または腹腔内(ip)注射により、動物内で増加させることが好ましい。二機能性試剤または誘導体化試剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基を介した結合)、N−ヒドロキシスクシンイミド(リジン残基を介して)、グルタールアルデヒド、無水コハク酸、SOCl2、またはRとR1が異なるアルキル基であるR1N=C=NRを用いて、免疫化される種における免疫原性のタンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、または大豆トリプシン阻害剤に、関連抗原を結合させることが有用であり得る。
モノクローナル抗体は、Kohlerら、1975年、Nature、256:495頁に最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製できるか、または組換えDNA法(例えば、米国特許第4,816,567号参照)によって作製できる。
ヒト化抗体は、非ヒトである出所源からの1つまたは複数のアミノ酸残基を有する。非ヒトアミノ酸残基は、しばしば「インポート」残基と称され、典型的には、「インポート」可変ドメインから取られる。ヒト化は一般に、齧歯類の1つまたは複数のCDR配列を、ヒト抗体の対応する配列の代わりに置換することにより、一般に、Winterおよび共同研究者の方法(Jonesら、1986年、Nature 321:522−525頁;Riechmannら、1988年、Nature 332:323−327頁;Vrhoeyenら、1988年、Science 239:1534−1536頁)にしたがって、実施できる。したがって、このような「ヒト化」抗体は、実質的に完全ヒト可変ドメイン未満が、非ヒト種の対応する配列によって置換されているキメラ抗体である(米国特許第4,816,567号)。実際、ヒト化抗体は、典型的に、いくつかのCDR残基、および可能性として、いくつかのFR残基が、非ヒト、例えば、齧歯類抗体における類似部位の残基によって置換されているヒト抗体である。
90:2551頁;Jakobovitsら、1993年、Nature、362:255−258頁;Bruggermanら、1993年、Year in Immuno.7:33頁;およびDuchosalら、1992年、Nature 355:258頁を参照されたい。ヒト抗体はまた、ファージ表示ライブラリーに由来し得る(Hoogenboomら、1991年、J.Mol.Biol.277:381頁;Marksら、J.Mol.Biol.1991年、222:581−597頁Vaughanら、1996年、Nature Biotech 14:309頁を参照されたい。
多重特異性抗体は、少なくとも2つの異なる抗原に対して抗原特異性を有する。このような分子は、通常、2つの抗原に結合するだけだが(すなわち、二重特異性抗体、BsAbs)、本明細書に用いられる場合、三重特異性抗体などのさらなる特異性を有する抗体が、この語句に包含される。BsAbsの例としては、FcγRIIBに特異的な1つの抗原結合部位および、例えば:B細胞受容体(BCR)、CD79αおよび/またはCD79β、腫瘍細胞上に発現した抗原、IgE受容体(FcεR)、肥満細胞および/または好塩基球上などのIgERに結合したIgE、NKおよび単球ならびにマクロファージ上などのIgG受容体RI(FcγRI)およびRIII(FcγRIII)、受容体チロシンキナーゼc−キットに特異的な他の抗原結合部位を有するものが挙げられる。いくつかの実施形態において、BsAbsは、FcγRIIBに対する第1の結合特異性、および細胞質ITAMモチーフを有する活性化受容体に対する第の結合特異性を含む。ITAMモチーフ構造は、9〜11のアミノ酸スペーサーによって分離した2つのチロシンを有する。一般的なコンセンサス配列は、YxxL/I(x)6〜8YxxLである(Isakov、N.、1997年、J.Leukoc.Biol.61:6−16頁)。代表的な活性化受容体としては、FcεRI、FcγRIII、FcγRI、FcγRIIA、およびFcγRIICが挙げられる。他の活性化受容体としては、例えば、CD3、CD2、CD10、CD161、DAP−12、KAR、KARAP、FcεRII、Trem−1、Trem−2、CD28、p44、p46、B細胞受容体、LMP2A、STAM、STAM−2、GPVI、およびCD40が挙げられる(例えば、Azzoniら、1998年、J.Immunol.161:3493頁;Kitaら、1999年、J.Immunol.162:6901頁;Merchantら、2000年、J.Biol.Chem.74:9115頁;Pandeyら、2000年、J.Biol.Chem.275:38633頁;Zhengら、2001年、J.Biol.Chem.276:12999頁;Propstら、2000年、J.Immunol.165:2214頁を参照)。
本発明の抗体は、例えば、2003年10月30日出願の出願第10/697,995号に記載されているような改変重鎖もまた含み得る。改変重鎖を含む抗体は、システイン残基がジスルフィド結合を形成できないような、少なくとも1つのジスルフィド形成システイン残基の変化を含む。一態様において、前記システインは、重鎖のヒンジ領域のものである(したがって、このようなヒンジ領域は、本明細書において、「改変ヒンジ領域」と称され、さらに、「ヒンジなし」と称される)。
いくつかの実施形態において、本発明の二重特異性抗体は、ヘテロオリゴマー化のために、第1のポリペプチドと第2のポリペプチドとの間の界面を操作するのに役立つ「キャビティー内突起」戦略を用いて形成され、これは「ホール内ノブ」とも称される。好ましい界面は、抗体定常ドメインのCH3ドメインの少なくとも一部を含む。Fc配列のCH3ドメインにおける「ホール内ノブ」変異は、ホモ二量体の形成を大幅に減少させるという報告がある(例えば、Merchantら、1998年、Nature Biotechnology 16:677−681頁を参照)。「突起」は、第1のポリペプチド界面の小さなアミノ酸側鎖をより大きな側鎖(例えば、チロシンまたはトリプトファン)によって置換することにより構築される。その突起と同じか、または同様なサイズの補償的「キャビティー」は、第2のポリペプチドの界面に、大きなアミノ酸側鎖をより小さな側鎖によって置換することにより任意に創製される。第1または第2のポリペプチドの界面いずれかに、好適に配置され、大きさを定めた突起またはキャビティーが存在する場合、隣接する界面に、それぞれ対応するキャビティーまたは突起を操作するだけでよい。該突起およびキャビティーは、ポリペプチドをコードする核酸の変化などの合成的手段により、またはペプチド合成により作製することができる。ホール内ノブのさらなる説明に関しては、米国特許第5,731,168号、第5,807,706号、第5,821,333号を参照されたい。
また本発明は、本明細書に開示された抗体をコードする単離ポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含むベクターおよび宿主細胞、ならびに該抗体を作製するための組換え法を提供する。
本発明の抗体は、直接的にのみならず、異種抗体との融合抗体としても組換え作製できる。一実施形態において、異種抗体は、シグナル配列、または成熟タンパク質または抗体のN末端に特定の開裂部位を有する他の抗体である。選択されることが好ましい異種シグナル配列は、宿主細胞によって認識され、処理される(すなわち、シグナルペプチダーゼにより開裂される)ものである。天然抗体のシグナル配列を認識、処理しない原核生物宿主細胞に関しては、そのシグナル配列を、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、lpp、または熱安定性エンテロトキシンIIリーダーの群から選択された原核生物シグナル配列によって置換する。酵母分泌のためには、天然シグナル配列を、例えば、酵母インベルターゼ、α因子リーダー(サッカロミセスおよびKluyveromycesのα因子リーダーを含む)、または酸ホスファターゼリーダー、カンジダアルビカンスグルコアミラーゼリーダー、または国際公開第90/13646号に記載されたシグナルによって置換できる。哺乳動物細胞の発現には、哺乳動物シグナル配列ならびにウィルス分泌リーダー、例えば、単純疱疹gDシグナルが入手できる。このような前駆体領域のDNAを、リーディングフレーム内で、該抗体をコードするDNAに結合する。
発現ベクターとクローニングベクターの双方が、1種または複数種の宿主細胞内でベクターが複製することを可能にする核酸配列を含有する。一般にクローニングベクターにおいて、この配列は、ベクターが宿主の染色体DNAと独立して複製することを可能にする配列であり、複製起点または自己複製配列を含む。このような配列は、種々の細菌、酵母、およびウィルスに関して、十分に知られている。プラスミドpBR322の複製起点は、多くのグラム陰性細菌に好適であり、2μプラスミド源は、酵母に好適であり、種々のウィルス源(SV40、ポリオーマ、アデノウィルス、VSV、またはBPV)は、哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般的に、複製起点成分は、哺乳動物の発現ベクターにとって必要ではない(SV40源は、初期プロモーターを含有するという理由だけで、典型的に使用できる)。
発現ベクターおよびクローニングベクターは、選択性マーカーとも称される選択遺伝子を含有し得る。典型的な選択遺伝子は、(a)抗体または他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、またはテトラサイクリンに対する耐性を与える、(b)栄養要求欠失を補足する、または(c)複合培地から入手できない重要な栄養素を供給する、タンパク質をコードする。例えば、桿菌では、Dアラニンラセマーゼをコードする遺伝子である。
発現ベクターおよびクローニングベクターは、宿主生物によって認識され、抗体核酸に作動可能に結合したプロモーターを、通常は含有する。原核生物宿主と共に使用する上で好適なプロモーターとしては、phoAプロモーター、βラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系、およびtacプロモーターなどのハイブリッドプロモーターが挙げられる。しかし、他の公知の細菌プロモーターも好適である。細菌系に使用されるプロモーターは、該抗体をコードするDNAに作動可能に結合したシネ−ダルガルノ(S.D.)配列もまた含有する。
高級真核生物による、本発明の抗体をコードするDNAの転写は、該ベクター内にエンハンサー配列を挿入することによって増加させることが多い。哺乳動物遺伝子(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−胎児タンパク質、およびインスリン)の多数のエンハンサー配列が、現在知られている。しかし、典型的には、真核生物細胞ウィルスのエンハンサーが用いられる。例としては、複製起点(bp100〜270)の後期側のSV40エンハンサー、サイトメガロウィルスの初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウィルスエンハンサーが挙げられる。真核生物プロモーターの活性化に関するエンハンス要素については、Yaniv、1982年、Nature 297:17−18頁もまた参照されたい。エンハンサーは、抗体コード配列に対して、5’位または3’位でベクター内にスプライスされ得るが、プロモーターの5’位に位置することが好ましい。
真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、または他の多細胞生物の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、転写の終結およびmRNAの安定化に必要な配列もまた含有する。このような配列は一般に、真核生物またはウィルスDNAまたはcDNAの5’、および時には3’未翻訳領域から入手できる。これらの領域は、抗体をコードするmRNAの未翻訳部分におけるポリアデニル化断片として転写されたヌクレオチドセグメントを含有する。有用な転写終結成分の一つは、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。国際公開第94/11026号およびそれに開示されている発現ベクターを参照されたい。
分泌され、適切に組み立てられた完全長抗体の収量を最大化するために、本発明の免疫グロブリンを、発現される軽鎖と重鎖の量比が調節できる発現系から発現させることもできる。このような調節は、軽鎖と重鎖の翻訳強度を同時に調節することによって達成される。
本明細書のベクターにおけるDNAのクローニングまたは発現に好適な宿主細胞は、上記の原核生物、酵母、または高級真核生物の細胞である。この目的のための好適な原核生物としては、グラム陰性またはグラム陽性細菌などの古細菌および真性細菌、例えば、エシェリキア属、例えば、大腸菌、エンテロバクター属、エルウィニア属、クレブシェラ属、プロテウス属、サルモネラ属、例えば、サルモネラ菌、セラチア属、例えば、霊菌、志賀菌属、ならびに枯草菌およびリケニホルミス菌などの桿菌(例えば、1989年4月12日発行のDD 266,710に開示されたリケニホルミス菌41P)、緑膿菌などのシュードモナス属、およびストレプトマイセス属が挙げられる。好ましい大腸菌クローニング宿主の1つは、大腸菌294(ATCC27,325)であるが、大腸菌B、大腸菌X1776(ATCC31,537)および大腸菌W3110(ATCC27,325)も好適である。これらの例は、限定ではなくて例示的なものである。また、宿主細胞が最少量のタンパク質分解酵素を分泌することが好ましく、追加のプロテアーゼ阻害剤が細胞培養物中に組み込まれることが望ましい場合がある。また、原核生物宿主細胞は、チオレドキシン経路および/またはグルタチオン経路における変異を含み得る。
Genetics 12:555(1986))、およびLec13は代表的な宿主細胞株である。CHO−K1、DUK−B11、DG44またはCHO−DP12宿主細胞の場合、これらは、そこで発現されたタンパク質をフコシル化する能力を欠失するように変化させることができる。
宿主細胞は、抗体産生のために、上記の発現ベクターまたはクローニングベクターによって形質転換し、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、または所望の配列をコードする遺伝子の増幅のために、適宜修飾した従来の栄養培地中で培養する。
1)通常はグルコースなどの炭水化物の形態におけるエネルギー源;
2)全必須アミノ酸、通常は20のアミノ酸の基本セットプラスシスチン;
3)ビタミン類および/または低濃度で必要とされる他の有機化合物;
4)遊離脂肪酸;および
5)微量元素、ここで微量元素は、通常マイクロモル範囲の極めて低濃度で典型的に必要とされる無機化合物または天然元素として定義される。
56:221−234頁)か、または当業者により容易に決定でき(例えば、Animal Cell Culture:A Practical Approach 第2版、Rickwood,D.およびHames,B.D.編、Oxford University Press、ニューヨーク(1992)を参照)、選択された具体的な宿主細胞によって変わる。
組換え法を用いる場合、抗体は、細胞内に、もしくは細胞周辺腔に産生できるか、または直接、培地に分泌され得る。第1段階として、抗体が細胞内に産生される場合、宿主細胞または溶解断片の破片は、例えば、遠心分離または限外ろ過によって除去される。Carterら、1992年、Bio/Technology 10:163−167頁は、大腸菌の細胞周辺腔に分泌される抗体を単離する方法を記載している。手短に述べると、酢酸ナトリウム(pH3.5)、EDTA、およびフェニルメチルスルホニルフルオライド(PMSF)の存在下、細胞ペーストを約30分にわたって解かす。細胞破片は遠心分離によって除去する。抗体が培地に分泌される場合、このような発現系の上澄み液は、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、AmiconまたはMillipore Pellicon限外ろ過ユニットを用いて、一般的には先ず濃縮される。タンパク質分解を阻害するために、PMSFなどのプロテアーゼ阻害剤を、前述のいずれかの段階に含めることができ、また、外来性汚染物の増殖を防ぐために、抗生物質を含めることができる。
本発明の免疫グロブリンは、当業界に公知の種々のアッセイによって、それらの物理的/化学的性質および生物学的機能に関して特性化できる。本発明の一態様において、免疫原に対する本発明の抗体の選択性を他の結合標的に対するものと比較することは重要である。特に、選択的にFcγRIIBに結合する抗体は、他のFcγR類、特にFcγRIIAと結合しないか、または低い結合親和性を示すことが好ましい。
該抗体の治療的処方物は、所望の純度を有する抗体を、任意の生理学的に許容できるキャリア、賦形剤または安定化剤と混合することによって(Remingston’s Pharmaceutical Sciences 第16版、Osol,A.編(1980))、凍結乾燥処方物または水溶液の形態で調製できる。許容できるキャリア、賦形剤、または安定剤は、用いられる投与量および濃度においてレシピエントに対して非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などの緩衝剤;アスコルビン酸およびメチオニンなどの抗酸化剤;保存剤(オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド;フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール;メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3−ペンタノール;およびm−クレゾールなど);低分子量(約10残基未満)抗体;血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質;ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジンなどのアミノ酸;グルコース、マンノース、またはデキストリンなどの単糖、二糖、および他の炭水化物;EDTAなどのキレート化剤;スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖;ナトリウムなどの塩形成対イオン;金属錯体(例えばZn−タンパク質錯体);および/またはTWEEN(商標)、PLURONICS(商標)またはポリエチレングリコール(PEG)などの非イオン界面活性剤が挙げられる。
本発明の抗体はアフィニティー精製剤として使用できる。この方法においては、当業界に周知の方法を用いて、Sephadex(商標)樹脂またはろ紙などの固相上に抗体を固定する。固定化した抗体を、精製する抗原を含有するサンプルに接触させ、その後、サンプル中の精製する抗原以外の実質的に全ての物質を除去する好適な溶媒で支持体を洗浄し、これを固定化抗体に結合させる。最後に、抗体から抗原を遊離させるグリシン緩衝液、pH5.0などの他の好適な溶媒で支持体を洗浄する。
(a)35S、14C、125I、3H、および131Iなどの放射性アイソトープ。抗体は、例えば、Current Protocols in Immunology、第1巻および第2巻、Coligenら 編、Wiley−Interscience、ニューヨーク、New York Pubs(1991)に記載された方法を用いて、放射性アイソトープによって標識化でき、放射性は、シンチレーションカウントによって測定できる。
1)セイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRPO)は、過酸化水素を利用して色素前駆体を酸化する(例えば、オルトフェニレンジアミン(OPD)または塩酸3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(TMB));
2)アルカリホスファターゼ(AP)と、色素産生基質としてのパラニトロフェニルホスフェート;および
3)β−D−ガラクトシダーゼ(β−D−Gal)と色素産生基質(例えば、p−ニトロフェニル−β−D−ガラクトシダーゼ)または蛍光原基質の4−メチルウンベリフェリル−β−D−ガラクトシダーゼ
が挙げられる。
(i)FcγRIIB(CD32B)の抑制活性の減少:抗体Fc結合の妨害
他の実施形態において、治療薬の機能を高めるために、抗FcγRIIB抗体が治療薬と同時投与される。例えば、FcγRIIBに対するIgG結合を阻害するために、哺乳動物に抗FcγRIIBを投与し、そのことによって、免疫応答のFcγRIIB媒介抑制を防ぐ。これにより、IgG治療的抗体の細胞障害性が増強される。例えば、治療的抗体が腫瘍抗原に特異的である場合、本発明の抗FcγRIIを、抗腫瘍抗原抗体と同時投与することにより、抗腫瘍抗原抗体の細胞障害性が増強する。
インビボで、FcγRIIBは、非限定例として、B細胞抗原受容体(BCR)、IgEに対する高親和性受容体(IgERまたはFcεRI)、FcγRIIA、およびc−kit受容体(FcγRIII)などの種々の活性化受容体と共凝集され得る。非限定例としての活性化受容体は、免疫エフェクター応答に関して活性化活性を有する膜貫通タンパク質であり、ITAM活性化モチーフを含む。FcγRIIBは、FcγRIIBと活性化受容体との共凝集によって活性化し、活性化受容体を介して伝達されるシグナルを減弱させる。現在までとところ、FcγRIIBは、自己凝集またはホモ二量体化によってリン酸化されることは示されていない。FcγRIIB受容体は、リン酸化ITAM(活性化モチーフ)を発現している他の受容体と実験的にヘテロ二量体化または共凝集(または共結合)しており、タンパク質チロシンキナーゼ類(PTK類)との間接的結合によって、FcγRIIB ITAMがリン酸化され得る。リン酸化FcγRIIB ITAMは、ホスファターゼSHIP(イノシトールホスフェート5’−ホスファターゼ)を含有するSH2ドメインを動員し、ITAMが引き金となるカルシウム動員および細胞増殖を抑制する(Daeronら、1995年、Immunity 3、635;Malbecら、1998年、J.Immunol.169、1647頁;Onoら、1996年、Nature、383、23)。正味の効果は、カルシウム流入の阻害および持続的カルシウムシグナル伝達の防止であり、これによって、脱顆粒、食作用、ADCC、およびサイトカイン放出が防止される(Ravetchら、2000年、Science 290:84−89頁)が、いくつかのFcγRIIB媒介シグナル伝達阻害は、カルシウムと独立でもあり得る。B細胞における増殖阻害は、ITIM経路にも依存的である。
以下のハイブリドーマ細胞株は、American Type Culture Collection、10801 University 大通り、マナサス、バージニア州 20110−2209 米国(ATCC)に寄託されている:
ハイブリドーマ/抗体名 ATCC番号 寄託月日
FcγRIIB 5A6.2.1 PTA−4614 2002年8月28日
この寄託は、特許手続きを目的とする微生物寄託の国際公認についてのブタペスト条約の条項およびそれに従う規定(ブタペスト条約)の下でなされた。これは、寄託日から30年間、生存可能な培養維持を保証している。細胞株は、ブタペスト条約の条項の下で、ATCCにより入手でき、Genentech社およびATCC間の合意に供され、これによって、(a)特許出願の係属中、37CFR§1.14および35USC§122にしたがって、長官により権利が与えられると判定された者に培養物へのアクセスが利用できること、および(b)このように寄託された培養物の公共への利用可能性に対する制限は、特許付与時に取消し不能で除去されることが保証される。
機能的には反対であるが、ヒトFcγRIIA(活性化受容体)とヒトFcγRIIB(抑制性受容体)は、相同性の高いタンパク質であり(相同性領域は、図2Aの囲み部分である)、IgG1における約9つのアミノ酸および3つの結合ドメインに違いがある。市販のモノクローナル抗体は、ヒトFcγRIIAとFcγRIIBの双方に結合する。FcγRIIBに特異的に結合するモノクローナル抗体が有用であると考えられ、IgG結合を阻害するさらなる能力もまた望ましい。
1.1 材料
Perkin Elmer Life ScienceのGeneAmp(商標)、pGEX−4T2プラスミド、タンパク質Aカラムおよび試薬、ならびにタンパク質G FcγRIIIを用いて逆転写PCRを実施し、カラムおよび試薬は、Amersham Pharmacia Biotechから入手した。Ni−NTAカラムおよび試薬は、Qiagen、バレンシア、カリフォルニア州から入手した。Centriprep−30コンセントレーターは、Millipore、ベッドフォード、マサチューセッツ州から、SDS−ポリアクリルアミドゲルおよびポリビニリデンジフルオリド膜は、NOVEX、サンジエゴ、カリフォルニア州から入手し、FuGENE(登録商標)は、Rocheから入手した。
NP 001002273で;FcγRIIA(配列番号9)および登録番号:NP 067674で、およびFcγRIII(2つのイソ体)は、登録番号:NP 000560およびNP 000561で入手できる。
FcγRI(CD64)のcDNAは、α鎖細胞外ドメインをコードする断片を作出するプライマーを用いて、U937細胞のオリゴ(dT)−プライムドRNAの逆転写PCRによって単離した。全ての受容体のコード領域を、前述のpRK哺乳動物細胞発現ベクター内にサブクローン化した(Eaton,D.ら、1986年、Biochemistry 25:8343−8347頁)。全てのFcγRpRKプラスミドに関して、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを、Gly−His6タグおよびヒトグルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)をコードするDNAで置換した。5’端と3’端に、それぞれNheI制限部位とXbaI制限部位を有するpGEX−4T2プラスミドから、PCRによって234のアミノ酸GST配列を得た。したがって、発現タンパク質は、以下のアミノ酸位置において、カルボキシル末端でGly/His6/GSTに融合したα鎖の細胞外ドメインを含有する:FcγRI、His292;FcγRIIA、Met216;FcγRIIB、Met195;FcγRIIIA、Gln191(残基数はシグナルペプチドを含む)。
受容体によるIgG Fc結合w阻害するヒトFcγRIIB特異的抗体を、FcγRIIB−His6−GSTに対して作出した。BALB/cマウスを、足裏に2μgのhuFcγRIIB−His6−GSTにより免疫化した。免疫化マウスの脾臓細胞(Selected Methds in cellular immunology(Mishell BB、Shiigi SM編)、351−372頁、サンフランシスコ:FreemanにおけるOi VT、ハーゼンバーグ、ルイジアナ州、1981年、Immunoglobulin producing hybrid cell linesに記載された細胞)を、P3X63Ag8U1骨髄腫細胞に融合し、およそ900のハイブリドーマを得た。
一次スクリーンにおいて、ハイブリドーマサブクローンから発現させた抗体を含有する上澄み液を、FcγRIIB−His6−GSTに対する陽性結合に関してスクリーンした。ELISAによりFcγRIIB−His6−GSTに反応性の抗体を、FcγRIIB−His6−GSTに対する結合およびFcγRIIA(R131改変体)−His6−GSTおよびFcγRIII(F158改変体)−His6−GSTに対する陰性結合に関して再スクリーンした。
二次スクリーンにおいて、受容体特異性に関して、該抗体をELISAにより再スクリーンし、グルコース−6−ホスフェートイソメラーゼ(GPI)結合FcγRIIB、およびFcγRIIAを発現するCHO細胞株を用いて細胞結合アッセイを行った。ELISAを実施し、上記に記載し、結果は図4に示した。図4において、棒グラフは、GST−huFcγRIIAおよびGST−huFcγRIII融合タンパク質と比較して、GST−huFcγRIIBに対する抗体の相対的結合を示している。抗体1D1、5A6、5H11および6A5は、GST−huFcγRIIAおよびGST−huFcγRIII融合タンパク質よりもGST−huFcγRIIBに選択的に結合する。抗体5B9は、GST−huFcγRIIIよりもGST−huFcγRIIBとGST−huFcγRIIAの双方に選択的に結合する。
抗体5A6.2.1(本明細書において、5A6.2.1または5A6と交換可能に称される)を腹水に関して選択し、タンパク質Gクロマトグラフィー(Amersham Pharmacia Biotech)を用いて精製した。5A6.2.1をコードするDNAを常法を用いて単離し、配列決定した。重鎖(配列番号7)および軽鎖(配列番号8)のアミノ酸配列およびCDRを図10に示す。重鎖CDRは:DAWMD(配列番号1)、EIPSKPNNHATYYAESVKG(配列番号2)、およびFDY(配列番号3)である。軽鎖CDRは:RASQEISGYLS(配列番号4)、AASALDS(配列番号5)、およびLQYVSYPL(配列番号6)である。
このアッセイは、FcγRIIAおよびFcγRIIBに対するIgG1の結合を妨害する5A6MAbの能力をスクリーンする。FcγRII類は、単量体IgG1に対する親和性が弱く、したがって、IgG1結合は、3種のIgEおよび3種の抗IgE分子、例えば、IgEに結合するヒト化IgG1抗体であるE27の安定な六量体複合体を用いてアッセイする(Shields,R.L.ら、J.Biol.Chem.276:6591−6604頁(2001))。ヒトFcγRIIAおよびFcγRIIBに対するE27−IgE六量体複合体の結合に競合する抗体の能力を評価することによるIgG結合中和に関して、5A6MAbがスクリーンされた。この競合アッセイは以下のとおり実施され、結果は図11および12に示されている。
K562赤白血病細胞(ATCC番号CCL−243)に発現させた天然FcγRIIA(R131)に対する5A6MAbの間接的免疫蛍光結合アッセイを図16に示す。K562細胞の個別のアリコートを、mIgG1イソタイプ対照(mopc21)、5A6(抗ヒトFcγRIIB)モノクローナル抗体またはMedarex4.3MAb(抗ヒトFcγRIIA/B)モノクローナル抗体のいずれかによって染色した。フルオレセイン結合F(ab)’2ヤギ抗マウスIgG(F(ab)’2特異的抗体と共に、第2のインキュベーションにより間接的に検出し、フローサイトメトリーによって分析した。Medarex4.3MAbは、図16に示されるように、huFcγRIIA(CD32A)に結合し、5A6、抗huFcγRIIB(抗CD32B)抗体は、huFcγRIIA(CD32A)に結合せず、図4における点線で示されたように、イソタイプ対照、mopc抗体が、huFcγRIIA(CD32A)にやはり結合しなかったことと両立した。
2.1 材料
抗FcεRIMAb、22E7MAbは、受容体に結合したIgEを有する、または有さないFcεRIに結合する。22E7MAbは、Hoffman−LaRoche細胞株IGE4R:22E7.2D2.1D11から精製した(Risek,F.,ら、1991年、J.Biol.Chem.266:11245−11251頁)。22E7MAbを発現するHoffman−LaRoche細胞は、10×FBS、1×Pen−Strep、および1×グルタミンと共に、アイエムディーエム中で増殖させた。22E7MAbを、タンパク質Aおよびタンパク質Gクロマトグラフィーを用いて精製した。22E7抽出物をプールし、FcεRIに対する親和性を検証した。
親ラット肥満細胞株RBL−2H3(ATCC番号CRL−2256)由来のRBL48細胞株は、高親和性ヒトIgE受容体(FcεRI)のαサブユニットを発現する(Gilfillian A.M.ら、1992年、Immunology、149、2445−2451頁)。RBL48細胞株を、電気穿孔法により、ヒトFcγRIIB1の完全長αサブユニットのcDNAクローンにトランスフェクトし(Muta T.ら、1994年、Nature368:70−73頁)、これを、プロマイシン選択性発現ベクター内にサブクローン化した(Morgenstern,J.P.ら、1990年、Nucleic Acid Research 18:3587−3596頁)。クローンを、1μMのプロマイシン中で選択し、抗ヒトFcγRIIBモノクローナル抗体、5A6.2.1による免疫蛍光染色により、FcγRIIB細胞表面発現に関して分析した。選択されたサブクローンを、RBL48.C.4と称した。
活性化受容体におけるFcγRIIB交差結合(本明細書において、共架橋、共凝集、または共結合として、交換可能に称される)の効果を、アレルゲン感作RBL48.C.4細胞からのヒスタミン放出を阻害する該抗体の能力に基づいて定量的に測定した。アッセイ法は下記に記載され、結果はさらに、図17に示されている。
本実施例は、ジスルフィド形成システイン残基を欠く(「ヒンジなし」)可変ヒンジ領域を有する二重特異性抗体の構築および精製を記載する。野生型ヒンジ配列を有する二重特異性抗体の構築もまた記載する;これらの抗体は、種々の種の抗体複合体を得る効率性を評価するために使用できる。
完全長抗体の発現に関するプラスミドは全て、重鎖および軽鎖の転写に関する別個のphoAプロモーター(AP)(Kikuchiら、1981年、Nucleic Acids Res.9:5671−5678頁)、それに続く、翻訳開始のためのtrp シャインダルガーノ配列に依存する別個のシストロン系(Simmonsら、2002年、J,Immunol.Methods 263:133−147頁;Simmonsら、米国特許第5,840,523号)基づいた(Yanofskyら、1981年、Nucleic Acids Res 9:6647−6668頁およびChangら、1987年、Gene 55:189−196頁)。また、重鎖および軽鎖の細胞周辺腔分泌には、熱安定性エンテロトキシンIIシグナル配列(STII)(Pickenら、1983年、Infect.Immun.42:269−275頁およびLeeら、1983年、Infect.Immun.42:264−268頁)を用いた。双方の鎖の良好な制御は、翻訳開始領域(TIR)に沈黙コドン変化(SimmonsおよびYansura、1996年、Nature Biotechnol.14:629−634頁およびSimmonsら、上記)を含む相対的翻訳強度を測定した前述のSTIIシグナル配列改変体によって達成された。本発明の目的に関して、ベクター内の特定のTIR対に関する翻訳強度の組み合わせは、(N−軽、M−重)によって表され、Nは軽鎖の相対的TIR強度、およびMは重鎖の相対的TIR強度である。最後に、λt0転写ターミネーター(SchlosstissekおよびGrosse、1997年、Nucleic Acids Res.15:3185頁)を、双方の鎖のコード配列の下流に配置した。プラスミドには全てpBR322ベースのベクター系のフレームワークが用いられた(Sutcliffe、1978年、Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.43:77−90頁)。
(i)プラスミドp5A6.11.ノブ.Hg−
所望のp5A6.11.ノブ.Hg−プラスミドを作出するために、2種の中間体プラスミドが必要とされる。5A6(抗FcγRIIB)キメラ軽鎖の可変ドメインを先ずpVG11.VNERKノブプラスミドに転移させて、中間体プラスミドp5A6.1.L.VG.1.H.ノブを作出する。次いで、5A6キメラ重鎖の可変ドメインをp5A6.1.L.VG.1.H.ノブプラスミドに転移させて、中間体プラスミドp5A6.11.ノブプラスミドを作出する。以下に、これらの中間体プラスミドp5A6.1.LC.VG.1.HC.ノブおよびp5A6.11.ノブの調製、引き続いて、p5A6.11.ノブ.Hg−p5A6.1.L.VG.1.H.ノブの構築を記載する。
完全長キメラ5A6ヒンジなしノブ重/軽(H/L)鎖単量体抗体を発現させるために、p5A6.11.ノブ.Hg−プラスミドを構築した。該プラスミドの構築は、2つのDNA断片の結合を含む。第1の断片は、小さなPspOMI−SacII断片が除去された上記のp5A6.11.ノブベクターであった。第2の断片は、2つのヒンジシステインがセリンに変換したヒト重鎖のおよそ171のアミノ酸をコードするp4D5.22.Hg−からのおよそ514の塩基対PspOMI−SacII断片であった(Sequences of proteins of Immunological interest、第5版、第1巻、NIH、ベセスダ、メリーランド州におけるC226S、C229S、EU numbering scheme of Kabat,E.A.ら(編集)、1991年、671頁)。プラスミドp4D5.22Hg−は、軽および重可変ドメインが、抗HER2抗体に変化し、2つのヒンジシステインがセリンに変換した(C226S、C229S)、2−軽および2−重の相対TIR強度(Simmonsら、J.Immunol.Methods 263:133−147頁(2002))を有する別個のシストロンベクターの誘導体である。
(ii) プラスミドp5A6.22.ノブ.Hg−
所望のp5A6.22.ノブ.Hg−プラスミドを作製するためには、1種の中間体プラスミドが必要とされた。phoAプロモーターおよびSTIIシグナル配列(軽鎖の相対TIR強度は2)を先ずp5A6.11.ノブ.Hg−プラスミドに転移させて、中間体プラスミドp5A6.21.ノブ.Hg−を作出する。以下に、中間体プラスミドp5A6.21.ノブ.Hg−の調製、引き続いて、p5A6.22.ノブ.Hg−の構築を記載する。
このプラスミドは、軽鎖にSTIIシグナル配列(相対TIR強度は2)を導入するために構築した。p5A6.21.ノブ.Hg−の構築は、3つのDNA断片の結合を含んだ。第1の断片は、小さなEcoRI−PacI断片が除去されたp5A6.11.ノブ.Hg−ベクターであった。第2の断片は、キメラ5A6抗体の軽鎖をコードするp5A6.11.ノブ.Hg−プラスミドからのおよそ658の塩基対NsiI−PacI断片であった。結合の第3の部分は、以下のプライマーを用いて、p1H1.22.Hg−プラスミドから作出されたおよそ489塩基対EcoRI−NsiI PCR断片であった:
5’−AAAGGGAAAGAATTCAACTTCTCCAGACTTTGGATAAGG
(配列番号27)
5’−AAAGGGAAAATGCATTTGTAGCAATAGAAAAAACGAA
(配列番号28)
プラスミドp1H1.22.Hg−は、軽および重可変ドメインが、ラット抗組織因子抗体に変化し、2つのヒンジシステインがセリンに変換した(C226S、C229S)、2−軽および2−重の相対TIR強度(Simmonsら、J.Immunol.Methods 263:133−147頁(2002))を有する別個のシストロンベクターの誘導体である。
このプラスミドは、重鎖に2の相対TIR強度を有するSTIIシグナル配列を導入するために構築された。p5A6.22.ノブ.の構築は、2つのDNA断片の結合を含んだ。第1のものは、小さなPacI−MIuI断片が除去されたp5A6.21.ノブ.Hg−ベクターであった。結合の第2の部分は、軽鎖のλt0転写ターミネーター、phoAプロモーター、およびSTIIシグナル配列(重鎖の相対TIR強度は2)をコードするp1H1.22.Hg− プラスミドからのおよそ503の塩基対PacI−MIuI断片であった。
所望のp22E7.11.ホール.Hg−プラスミドを作製するためには、2種の中間体プラスミドが必要とされた。22E7(抗FcεRI)キメラ軽鎖の可変ドメインを先ずpVGG11.VNERK.ホールプラスミドに転移させて、中間体プラスミドp22E7.1.L.VG.1.H.ホールを作出した。次いで、22E7キメラ重鎖の可変ドメインを、p22E7.1.L.VG.1.H.ホールプラスミドに転移させて、中間体プラスミドp22E7.11ホールプラスミドを作出した。以下に、これらのプラスミドp22E7.1.L.VG.1.H.ホールおよびp22E7.11.ホールの調製、引き続いて、p22E7.11.ホールHg−の構築を記載する。
このプラスミドは、完全長重鎖/軽鎖(H/L)単量体抗体の作出に適合したプラスミドに、22E7抗体のマウス軽可変ドメインを転移させるために構築した。このプラスミドの構築は、2つのDNA断片の結合を含んだ。第1の断片は、小さなEco−RI−PacI断片が除去されたpVGG11.VNERK.ホールベクターであった。プラスミドpVGG11.VNERK.ホールは、軽および重可変ドメインが、「ホール」変異(T366S、L368A、Y407V)(Merchantら、Nature Biotechnology 16:677−681頁)および上記の全ての制御要素を有する抗VEGF抗体(VNERK)に変化した、1−軽および1−重の相対TIR強度(Simmonsら、J.Immunol.Methods 263:133−147頁(2002))を有する別個のシストロンベクターの誘導体である。結合の第2の部分は、上記のEcoRI−PacI消化pVG11.VNERK.ホールベクターへの、図26(配列番号36)で示された配列の結合を含んだ。該配列は、アルカリホスファターゼプロモーター(phoA)、STIIシグナル配列および22E7抗体の軽鎖全体(可変ドメインおよび定常ドメイン)をコードする。
このプラスミドは、22E7抗体のマウス重可変ドメインを、ヒト重鎖フレームワークに導入して、キメラ完全長重鎖/軽鎖H/L単量体抗体を作出するために構築した。p22E7.11.ノブの構築は、2つのDNA断片の結合を含んだ。第1のものは、小さなMIuI−PspOMI断片が除去されたp22E7.1.L.VG.1.H.ホールベクターであった。結合の第2の部分は、MIuI−PspOMI消化p22E7.1.L.VG.1.H.ホールベクターへの、図28(配列番号38)で示された配列の結合を含んだ。該配列は、STIIシグナル配列の最後の3つのアミノ酸および22E7抗体のマウス重可変ドメインのおよそ123のアミノ酸をコードする。
p22E7.11.ホール.Hg−プラスミドは、完全長キメラ22E7ヒンジなしホール重鎖/軽鎖(H/L)単量体抗体を発現させるために構築した。該プラスミドの構築は、2つのDNA断片の結合を含んだ。第1のものは、小さなPspOMI−SacII断片が除去されたp22E7.11.ホールベクターであった。結合の第2の部分は、2つのヒンジシステインがセリンに変換した(C226S、C229S)、ヒト重鎖のおよそ171のアミノ酸をコードするp4D5.22.Hg−からの514の塩基対PspOMI−SacII断片であった。
(iv) プラスミド p22E7.22.ホール.Hg−
所望のp22E7.22.ホール.Hg− プラスミドを作製するためには、1種の中間体プラスミドが必要とされた。軽鎖のphoAプロモーターおよびSTIIシグナル配列(相対TIR強度は2)を先ずp22E7.11.ホール.Hg−プラスミドに転移させて、中間体プラスミドp22E7.21.ホール.Hg−を作出した。以下に、中間体プラスミドp22E7.21.ホール.Hg−の調製、引き続いて、p22E7.22.ホール.Hg−の構築を記載する。
このプラスミドは、軽鎖のSTIIシグナル配列(相対TIR強度は2)を導入するために構築した。p22E7.21.ホール.Hg−の構築は、3つのDNA断片の結合を含んだ。第1の断片は、小さいEcoRI−PacI断片が除去されたp22E7.11.ホール.Hg−ベクターであった。第2の断片は、キメラ22E7抗体の軽鎖をコードするp22E7.11.ホール.Hg−プラスミドからのおよそ647塩基対EcoRI−PacI断片であった。第3の断片は、アルカリホスファターゼプロモーター(phoA)およびSTIIシグナル配列をコードするp1H1.22.Hg−プラスミドからのおよそ500塩基対EcoRI−EcoRV断片であった。
このプラスミドは、重鎖のSTIIシグナル配列(相対TIR強度は2)を導入するために構築した。p22E7.22.ホール.Hg−の構築は、3つのDNA断片の結合を含んだ。第1の断片は、小さいEcoRI−M1uI断片が除去されたp22E7.21.ホール.Hg−であった。第2の断片は、アルカリホスファターゼプロモーター、STIIシグナル配列、およびキメラ22E7抗体の軽鎖をコードするp22E7.21.ホール.Hg−プラスミドからのおよそ1141塩基対EcoRI−PacI断片であった。第3の断片は、軽鎖のλt0転写ターミネーターおよび重鎖のSTIIシグナル配列(相対TIR強度は2)をコードするp1H1.22.Hg−プラスミドからのおよそ503塩基対PacI−M1uI断片であった。
抗FcγRIIB(5A6)/抗FcεRI(22E7)抗体の作出におけるヘテロ二量体化を促進するために、「ホール内ノブ」技法を利用して、完全長二重特異性抗体を形成した。Fc配列のCH3ドメインにおける「ホール内ノブ」変異により、二量体の形成が大いに減少することが報告されている(Merchantら、Nature Biotechnology 16:677−681頁(1998))。「ノブ」変異(T366W)をFc領域に導入することにより、抗FcγRIIB成分のための構築体、および「ホール」変異(T366S、L368A、Y407V)を導入することにより、抗FcεRI成分(p22E7.11.ホール)のための構築体を調製した(Merchant、1998年、上記)。
p5A6.11.ノブ構築体およびp22E7.11.ホール構築体の発現から得られた一次抗体種は、完全に折りたたまれ、組み立てられた重軽(HL)鎖種であった。しかし、二重特異性抗FcγRIIB/FcεRI(5A6/22E7)抗体に関する、本明細書に記載した調製法を促進するために、2つのヒンジシステインをセリンに置換する(C226S、C229S、Kabat,E.A.らのEUナンバリング方式、上記)ことによって、2つの重鎖のヒンジ配列を修飾した。ヒンジ改変体は、下記で「ヒンジなし」とも称される。
上記の可変ヒンジ領域を有する抗体の文脈で、精製された機能的二重特異性抗体を得る容易さおよび効率をさらに評価した。
凍結大腸菌ペーストを解凍し、HClでpH5に調整した5容量(v/w)の蒸留水に懸濁させ、遠心分離し、上澄み液を捨てた。この不溶性ペレットを、ポリトロン(Brinkman)を用いて、pH9で5〜10容量の緩衝液中に再懸濁し、遠心分離後、上澄み液を保持した。この処理をもう一度繰り返した。
プールした上澄み液を、pH8に調整し、ProSep(商標)−Aビーズ(Millipore)を加えた(10リットル当たりおよそ250mlのビーズ)。該混合物を4℃で24〜72時間攪拌し、ビーズを沈降させ、上澄み液を流し捨てた。ビーズをクロマトグラフィーカラム(Amersham Biosciences XK50(商標)に移し、10mMのトリス緩衝液pH7.5で洗浄した。次いでこのカラムを、50mMのクエン酸、0.1MのNaCl緩衝液中、pH勾配を用いて溶出させた。出発緩衝液は、pH6に調整し、勾配は、pH2の緩衝液を用いて直線希釈によって作成した。
S−Sepharose Fast Flow(商標)カラム(Amersham Biosciences)を、2M尿素、25mMのMES pH5.5により平衡化した。ProSep(商標)−A溶出液プールを等量の平衡化緩衝液で希釈し、カラムに装填した。平衡化緩衝液、次いで25mMのMES、pH5.5で洗浄後、カラムを、25mMのMES、pH5.5中、0M〜1M NaClの直線勾配で展開した。フラクションを、SDS−PAGE分析に基づいてプールした。
HI−Propyl(商標)カラム(J.T.Baker)を、0.5Mの硫酸ナトリウム、25mMのMES、pH6で平衡化した。S−Fast Flow(商標)溶出物を、0.5Mの硫酸ナトリウム、pH6に調整し、カラムに装填し、このカラムを、25mMのMES、pH6中、0.5M〜0M 硫酸ナトリウムの勾配により展開した。フラクションを、SDS−PAGE分析に基づいてプールした。
CentriPrep(商標)YM10コンセントレーター(Amicon)を用いて、HI−Propyl(商標)溶出液プールを濃縮し、Superdex(商標)SX200カラム(Amersham Biosciences)に装填し、0.1MのNaCl、pH6中、10mMのコハク酸または10mMのヒスチジンで平衡化し、2.5ml/分でカラムを展開した。フラクションを、SDS−PAGE分析に基づいてプールした。
2つの類似した(同じではない)アニーリング法を下記に記載する。これらは双方とも二重特異性抗体を良好な収量で生じた。下記の抗体および抗体成分の重鎖は、上記の可変ヒンジ領域を含有する。
25mMのMES pH5.5、0.5MのNaCl中、精製した5A6ノブおよび22E7ホールの重鎖/軽鎖単量体抗体を、それらの濃度に基づき、等モル比で混合した。次いで、この混合物を50℃で、5分間から1時間加熱した。このアニーリング温度は、これらのCH3改変体に関して、以前記載された融解曲線(Atwell,S.ら、1997年、J.Mol.Biol.270:26−35頁)から誘導した。次いで、アニールした抗体をその二重特異性を判定するための分析に供した。
1)等電点電気泳動
アニールした抗体を、サンプルに等電点電気泳動分析を実施することにより、二重特異性について検証した。5A6ノブ抗体は、7.13のpIを有し、一方、22E7ホールは、9.14のpIを有する。5A6ノブ/22E7ホール抗体は、8.67のpIを有する。図22は、クーマシーブルーによる染色後、等電点電気泳動ゲル上の、5A6ノブ、22E7ホールおよび二重特異性5A6ノブ/22E7ホール(加熱の前および後)抗体の動きを示している。室温での混合時に、いくらかのアニーリングが存在するが、50℃への加熱は、この方法の達成を促進するようである。5A6ノブと22E7ホールの間のpIを有する新たなタンパク質バンドの出現は、二重特異性抗体の形成を検証している。
5A6ノブ、22E7ホールおよび二重特異性5A6ノブ/22E7ホール抗体の挙動を、FcγRIIBアフィニティーカラム上で観察した。製造元の使用説明書に従って、小型カラムにおける固体支持体に、ヒトFcγRIIB(細胞外ドメイン)−GST融合タンパク質を結合した(Pierce、UltraLink(商標)Immobilization Kit#46500)。PBS(137mMのNaCl、2.7mMのKCl、8mMのNa2HPO4、1.5mMのKH2PO4、pH7.2)中の5A6ノブ、22E7ホールおよび二重特異性5A6ノブ/22E7ホール抗体を、3つの別個のFcγRIIBアフィニティーカラムに、各カラムの理論的結合能力のおよそ10〜20%で装填した。次いで、カラムを16カラム容量のPBSで洗浄した。装填および洗浄のカラム流出物を回収し、合わせて、Centricon(商標)マイクロコンセントレーター(Amicon)内で、およそ10倍に濃縮した。次いで、同容量の各濃縮体を2×SDSサンプル緩衝液で2倍に希釈し、SDS−PAGE(Invitrogen、Novex Tris−Glycine)によって分析した。タンパク質バンドを、20mMのNa2HPO4 pH6.5中、電気ブロッティングによってニトロセルロースへ移し、抗ヒトIgG Fabペルオキシダーゼ結合抗体(CAPPELL番号55223)を用いて探索した。次いで、Amersham Pはrまたはシスチン−d−アラビノフラノシドBiotech ECL(商標)キットを用い、製造元の使用説明書に従って、抗体バンドを検出した。
抗体成分(単一アーム5A6ノブおよび22E7ホール)を上記のとおり精製した。
1. 等電点電気泳動
等電点電気泳動ゲル(Cambrex、pH7〜11)上での分析により、アニーリング混合物中、pI約8.5に、二重特異性抗体に相当する単一バンド(計算pIは8.67)の形成が示された。図24を参照されたい。
5mlのCM−高速カラム(HiTrap、Amersham Biosciences)を、pH5.5における緩衝液(30mMのMES、20mMのhepes、20mMのイミダゾール、20mMのトリス、25mMのNaCl)によって平衡化した。アニールしたプールを、等量の平衡化緩衝液で希釈し、pH5.5に調整し、カラムに装填し、平衡化緩衝液で洗浄した。該カラムを、同じ緩衝液中、pH5.5からpH9.0の勾配を用い、1ml/分で30分かけて展開した。
本実施例の目的は、5A6または22E7単独ではなく、5A6/22E7が二重特異性抗体であることの実証である。5A6/22E7は、サンドイッチElisaアッセイにおいて、ヒトFcγRIIB−His6−GSTおよびFcεRI−ECD−Fcに対して二重の結合特異性を有する。結果を図29および図30に示す。5A6(A)および5A6(B)は、5A6の2種のタンパク質調製物を称する。下記の5A6/22E7二重特異性抗体は、野生型ヒンジを有するか、または有さないホール内ノブヘテロ二量体抗体である。二重特異性抗体は、交換可能にBsAbと称される。
MAb;および22E7 MAb。該プレートをPBS/0.05%TWEEN(登録商標)で3回洗浄後、5A6(A)/22E7、5A6 MAb、および22E7 MAbの3種の連続希釈液をELISA Diluent緩衝液中で調製し、各希釈液を、100μl/ウェルでウェルに加えた。該プレートを室温で1時間インキュベートした。該プレートを、PBS/0.05%TWEEN(登録商標)で3回洗浄後、各ウェルに、1μg/ml huFcεRI−ECD−Fcの100μlを加え、該プレートを室温で1時間インキュベートした。該プレートを、PBS/0.05%TWEEN(登録商標)で3回洗浄後、各ウェルに、1μg/ml IgE−ビオチンを加え、室温で1時間インキュベートした。該プレートを、PBS/0.05%TWEEN(登録商標)で洗浄し、ELISA希釈緩衝液中1:2000ストレプトアビジン−HRPの100μl/ウェルと共に、30分間インキュベートした。PBS/0.05%TWEEN(登録商標)で洗浄後、該プレートを、100μlのTMB基質と共に5分間インキュベートした。100μl/ウェルの停止溶液により反応をクウェンチし、該プレートを、96ウェルプレートデンシトメーター(Molecular Devices)上、630nmにおいて読み取った。結果は、5A6/22E7二重特異性抗体を含有するウェルにおけるIgE結合を示している。二重特異性抗体:5A6(A)+22E7 BsAb、5A6(B)+22E7 BsAb、および5A6+22E7ヒンジなしノブ−ホールBsAbは、FcγRIIB−GSTおよびIgE−ビオチンに首尾よく結合した。図29を参照されたい。
5.1 材料
先の実施例において、FcγRIIBは、3つのヒトFcγRIIBスプライス改変体の1つであるhuFcγRIIB1であった。残りの実施例において、FcγRIIB1およびさらなるスプライス改変体、FcγRIIB2が利用され、そのように称されている。
ECDは、NiNTA樹脂によって精製した。
5A6/22E7二重特異性抗体が、細胞表面上のhuFcγRIIB1またはhuFcγRIIB2またはhuFcεRIに架橋する能力を、以下のアッセイによるヒスタミン放出の選択的阻害によって実証した。以下の説明は、さらに図31〜33によって裏づけられる。
本実施例の目的は、5A6/22E7二重特異性抗体による、細胞表面上でのヒトFcεRIとヒトFcγRIIBの交差結合に対するヒスタミン抑制の依存性を示すことである。このアッセイ法は、以下に記載されており、結果は、さらに図34〜41に示されている。
ECDの濃度増加により、RBL huFcεRI細胞に対する5A6/22E7結合(図38を参照)が阻害され、双方のECDの阻害は、huFcεRI ECDに対して同様な結果となる。RBL huFcγRIIB細胞に対する5A6/22E7結合(図39w参照)は、huFcεRI ECDによって影響されず、huFcγRIIB ECDによって阻害される。RBL huFcεRI+huFcγRIIB1細胞(図40)およびRBL huFcεRI+huFcγRIIB2細胞(図41)においては、同様な結合結果が見られる。予想どおり、5A6/22E7の結合は、huFcεRI ECDまたはhuFcγRIIB ECDいずれかの10:1比によって減少し、双方のECDの10:1比(飽和濃度)においてのみ、RBL huFcεRI+huFcγRIIB(1または2)細胞に対する5A6/22E7の完全阻害がある。
5A6/22E7二重特異性抗体のヒスタミン放出抑制およびRBL huFcεRI+huFcγRIIB1細胞の結合を、以下の方法により、結合飽和下濃度で測定し、結果を図42〜46に示した。
肥満細胞および好塩基球上のFcεRI発現レベルのダウンレギュレーションは、抗原誘導活性化に対する肥満細胞および好塩基球の感受性を減少させる一つの手段であり、治療薬が喘息またはアレルギーに有益な効果を有し得る一つの機構である。
以下のアッセイによって実証されるとおり、抗FcγRIIB−抗FcεRI二重特異性抗体5A6/22E7の存在下で、サイトカインMCP−1(単球走化性タンパク質−1)、IL−4(インターロイキン4)、およびTNF−α(腫瘍壊死因子α)の放出が抑制された。RBL細胞に、huFcγRIIB2またはhuFcγRIIB1およびhuFcεRIをコードするcDNAをトランスフェクトし、上記の本実施例5に記載された方法に従って培養した。ヒスタミン放出アッセイに関して本実施例5に記載されたとおり、ニトロフェノール(NP)結合オバルブミン(NP(11)−OVA)およびIgE(抗NPヒトIgE)に曝露することによって細胞を刺激し、サイトカインを放出させた。5A6/22E7二重特異性抗体を、5μg/mlの濃度でテキストサンプルに加えた。対象となっているサイトカインに関して、以下のとおり、対象となっているサイトカイン各々の検出および定量化を行った。MCP−1およびIL−4は、Beadlyte Rat Multi−cytokine Beadmasterキット(カタログ48−200、Upstate、シャーロッテズビル、バージニア州、米国)を用いて検出した。ラットTNFアルファは、製造元の使用説明書に従い、抗ラットTNFアルファELISAキットを用いて検出した。アッセイを、製造元の使用説明書に従って実施した。図64は、FcγRIIB2およびFcεRIをトランスフェクトしたRBL細胞におけるサイトカイン放出の結果を示しているが、その結果は、FcγRIIB1およびFcεRIをトランスフェクトしたRBL細胞に関するものと同じであった。ラット肥満細胞のサイトカイン放出は、5A6/22E7二重特異性抗体の存在下で抑制されたが、他方、細胞培養中では5時間にわたり、サイトカイン放出は抑制されず、増加した(暗色棒)。
IgE。5A6/22E7二重特異性抗体がこのような生存を阻害したかどうかを試験するために、以下のアッセイを実施できる。ヒト造血前駆体幹細胞(CD34+)を、Allcells(カタログ番号ABM012、Allcells、LLC、バーケリー、カリフォルニア州、米国)から入手した。IL−3(30ng/mlで)、IL−6(200ng/mlで)および幹細胞因子(SCF、100ng/mlで)を含有するStemPro−34(登録商標)無血清培地(Gibco Cell Culture Systems、Invitrogen、カールスバッド、カリフォルニア州、米国)中で、3人のドナー各々からの細胞を2週間培養した。以下の試験条件下で、肥満細胞の生存を、Annexin/7−AAD(7−アミノアクチオマイシンD)染色(BD/ファーミンゲンフローサイトメトリーキット、Becton Dickenson & Company、フランクリンレイクス、ニュージャージー州、米国)によって評価した:(1)StemPro(登録商標)培地単独、(2)StemPro(登録商標)培地+30ng/mlのIL−3、200ng/mlのIL−6、および100ng/mlのSCF、(3)StemPro(登録商標)培地+5μg/mlのSPE−7(マウスIgE抗DNPモノクローナル抗体(SPE−7、Sigma、セントルイス、ミズーリ州、米国)、(4)StemPro(登録商標)培地+5μg/mlの煮沸、変性SPE−7、および(5)StemPro(登録商標)培地+5μg/mlのSPE−7+5μg/mlの5A6/22E7二重特異性抗体。最初の2週間の培養期間の後の10日間、細胞の生存をモニターした。両段階とも、細胞は37℃、5%CO2に維持した。試験培養開始後、4日から7日の間に時期に、細胞の生存を判定した。3人のドナーの細胞サンプルに関する細胞生存の平均阻害パーセントは、65%±9であった。これらの結果は、抗FcγRIIB−抗FcεRI二重特異性抗体を用いた、FcγRIIB受容体との架橋によるFcεRI受容体活性の抑制は、ヒト骨髄由来肥満細胞のマウスIgE誘導生存を阻害することを示している。
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