TWI645857B - 反應ｂ７-ｈ３之抗體、其免疫活性片段及使用 - Google Patents

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黃菱
Ling Huang
保羅 摩爾
Paul A. Moore
弗朗辛 陳
Francinz Z. Chen
萊斯利 強生
Leslie S. Johnson
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Abstract

本發明涉及對哺乳動物B7-H3受體且更具體而言對人B7-H3受體具有免疫反應性的抗體及其片段，並涉及它們的用途，特別是在癌症和炎症的治療中的用途。本發明因此具體地涉及人源化B7-H3反應性抗體及其免疫反應性片段，該抗體及其免疫反應性片段能夠介導、且更佳地增強免疫系統針對與多種人癌症相關的癌細胞的活化。

Description

反應B7-H3之抗體、其免疫活性片段及使用
本申請是申請日為2011年3月4日，申請號為100107346，發明名稱為“反應B7-H3之抗體、其免疫活性片段及使用”的申請的分案申請。
相關申請案的交叉引用
本申請案要求美國專利申請案序號第61/310,692號(2010年3月4日申請；申請中)；第61/310,695號(2010年3月4日申請；申請中)；第61/311,057號(2010年3月5日申請；申請中)的優先權，每個申請案藉由引用整體併入本文。
序列表的引用
本申請案根據37 C.F.R.1.821及其下列內容包括一份或多份序列表，它們以紙類媒體和計算機可讀媒體揭露，並且紙類揭露內容和計算機可讀揭露內容藉由引用整體併入本文。
本發明涉及對哺乳動物B7-H3受體且更具體而言對人的B7-H3受體具有免疫反應性的抗體及其片段，並涉及它們的用途，特別是在癌症和炎症的治療中的用途。本發明因此特別地涉及人源化B7-H3反應性抗 體及其免疫反應性片段，該抗體及其免疫反應性片段能夠介導、且更佳地增強免疫系統針對與多種人癌症相關的癌細胞的活化。
腫瘤的生長和轉移在很大程度上取決於其逃避宿主免疫監視和戰勝宿主防禦的能力。大多數腫瘤表現可在不同程度上被宿主免疫系統識別的抗原，但在許多情況下，由於效應T細胞的低效活化，引發了不足的免疫反應(Khawli,L.A.等人(2008)“Cytokine,Chemokine,and Co-Stimulatory Fusion Proteins for the Immunotherapy of Solid Tumors(用於實體瘤的免疫治療的細胞介素、趨化因子和共刺激融合蛋白)，”Exper.Pharmacol.181：291-328)。
CD4+ T淋巴細胞是大多數哺乳動物免疫反應和自體免疫反應的必不可少的組織者(Dong,C.等人(2003)“Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules(新穎的共刺激分子的免疫調節)，”Immunolog.Res.28(1)：39-48)。已發現CD4+輔助性T細胞的活化經由抗原呈現細胞與原始CD4+ T淋巴細胞之間的共刺激相互作用而被介導。需要兩種相互作用(Viglietta,V.等人.(2007)“Modulating Co-Stimulation(調控共刺激)，”Neurotherapeutics 4：666-675；Korman,A.J.等人(2007)“Checkpoint Blockade in Cancer Immunotherapy(癌症免疫治療中的檢查點阻斷)，”Adv.Immunol.90：297-339)。在第一種相互作用中，抗原呈現細胞必須展示與細胞的主要組織相容性複合體結合的相關標靶抗原以便它能夠結合原始CD4+ T淋巴細胞的T細胞受體(“TCR”)。在第二種相互作用中，抗原呈現細胞的配體必須結合CD4+ T淋巴細胞的CD28受體(Dong,C.等人(2003) “Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules(新穎共刺激分子的免疫調節)，”Immunolog.Res.28(1)：39-48；Lindley,P.S.等人(2009)“The Clinical Utility Of Inhibiting CD28-Mediated Costimulation(抑制CD28介導的共刺激的臨床應用)，”Immunol.Rev.229：307-321)。然後經歷兩種刺激信號的CD4+輔助性T細胞能夠反應於細胞介素(諸如白細胞介素-2和白細胞介素-12)而發育成Th1細胞。這些細胞產生干擾素-γ(IFN-γ)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，干擾素-γ和腫瘤壞死因子-α介導針對表現標靶抗原的標靶細胞的發炎反應。還發生B細胞的活化和增殖，導致對標靶抗原特異的抗體產生(Bernard,A.等人(2005)“T and B Cell Cooperation：A Dance of Life and Death(T細胞和B細胞合作：生死之舞)，”Transplantation 79：S8-S11)。在TCR銜接過程中不存在兩種共刺激信號的情況下，T細胞進入功能無反應狀態，稱為品系無反應性(Khawli,L.A.等人(2008)“Cytokine,Chemokine,and Co-Stimulatory Fusion Proteins for the Immunotherapy of Solid Tumors(用於實體瘤的免疫治療的細胞介素、趨化因子和共刺激融合蛋白)，”Exper.Pharmacol.181：291-328)。在病理狀態下，Th1細胞是多種器官特異性自體免疫疾病諸如I型糖尿病、類風濕性關節炎和多發性硬化症的關鍵參與者(Dong,C.等人(2003)“Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules(新穎共刺激分子的免疫調節)，”Immunolog.Res.28(1)：39-48)。
I.B7超級科和B7-H3
對CD28受體的配體的研究造成了稱為B7超級科的一組相關分子的表徵(Coyle,A.J.等人(2001)“The Expanding B7 Superfamily：Increasing Complexity In Costimulatory Signals Regulating T Cell Function(擴 展的B7超級科：調節T細胞功能的共刺激信號的日益增加的複雜性)，”Nature Immunol.2(3)：203-209；Sharpe,A.H.等人(2002)“The B7-CD28 Superfamily(B7-CD28超級科)，”Nature Rev.Immunol.2：116-126；Greenwald,R.J.等人(2005)“The B7 Family Revisited(再訪B7科)，”Ann.Rev.Immunol.23：515-548；Collins,M.等人(2005)“The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands(免疫調節配體的B7科)，”Genome Biol.6：223.1-223.7；Loke,P.等人(2004)“Emerging Mechanisms Of Immune Regulation：The Extended B7 Family And Regulatory T Cells(免疫調節的新興機制：擴展的B7科和調節T細胞).”Arthritis Res.Ther.6：208-214；Korman,A.J.等人(2007)“Checkpoint Blockade in Cancer Immunotherapy(癌症免疫治療中的檢查點阻斷)，”Adv.Immunol.90：297-339；Flies,D.B.等人(2007)“The New B7s：Playing a Pivotal Role in Tumor Immunity(新B7：在腫瘤免疫中起樞紐作用)，”J.Immunother.30(3)：251-260；Agarwal,A.等人(2008)“The Role Of Positive Costimulatory Molecules In Transplantation And Tolerance(正向共刺激分子在移植和耐受中的作用)，”Curr.Opin.Organ Transplant.13：366-372；Lenschow,D.J.等人(1996)“CD28/B7 System of T Cell Costimulation(T細胞共刺激的CD28/B7系統)，”Ann.Rev.Immunol.14：233-258；Wang,S.等人(2004)“Co-Signaling Molecules Of The B7-CD28 Family In Positive And Negative Regulation Of T Lymphocyte Responses(T淋巴細胞反應的正向調節和負向調節中的B7-CD28科的共信號傳導分子)，”Microbes Infect.6：759-766)。目前存在七個該科的已知成員：B7.1(CD80)、B7.2(CD86)、可誘導的共刺激物配體(ICOS-L)、程序性死亡配體-1(PD-L1)、程序性死亡配體-2(PD-L2)、 B7-H3和B7-H4(Collins,M.等人(2005)“The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands(免疫調節配體的B7科)，”Genome Biol.6：223.1-223.7)。
B7科成員是具有免疫球蛋白V樣區域和免疫球蛋白C樣區域(例如IgV-IgC)的免疫球蛋白超級科成員(Sharpe,A.H.等人(2002)“The B7-CD28 Superfamily(B7-CD28超級科)，”Nature Rev.Immunol.2：116-126)。B7科成員的IgV和IgC區域各自由單個外顯子編碼，另外的外顯子編碼前導序列、跨膜區域和細胞質區域。細胞質區域很短，長度範圍在19到62個胺基酸殘基，並且可由多個外顯子編碼(Collins,M.等人(2005)“The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands(免疫調節配體的B7科)，”Genome Biol.6：223.1-223.7)。B7-H3的獨特之處在於主要的人形式包含兩個細胞外串聯IgV-IgC區域(即IgV-IgC-IgV-IgC)(Collins,M.等人(2005)“The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands(免疫調節配體的B7科)，”Genome Biol.6：223.1-223.7)。據預測B7科的成員在細胞表面形成背對背非共價同源二聚體，並且已發現這些二聚體與B7-1(CD80)和B7-2(CD86)有關。
B7-1(CD80)和B7-2(CD86)表現出具有對刺激性CD28受體和抑制性CTLA-4(CD152)受體的雙重特異性(Sharpe,A.H.等人(2002)“The B7-CD28 Superfamily(B7-CD28超級科)，”Nature Rev.Immunol.2：116-126)。
儘管最初認為只包含2個Ig區域(IgV-IgC)(Chapoval,A.等人(2001)“B7-H3：A Costimulatory Molecule For T Cell Activation and IFN-γ Production(B7-H3：用於T細胞活化和IFN-γ產生的共刺激分子)，”Nature Immunol.2：269-274；Sun,M.等人(2002)“Characterization of Mouse and Human B7-H3 Genes(小鼠和人B7-H3基因的表徵)，”J.Immunol.168：6294-6297)，已鑑定四個免疫球蛋白胞外區域的變體(“4Ig-B7-H3”)，並發現它是該蛋白更常見的人形式(Sharpe,A.H.等人(2002)“The B7-CD28 Superfamily(B7-CD28超級科)，”Nature Rev.Immunol.2：116-126)。在這兩種形式之間沒有觀察到功能差異，因為天然鼠形式(2Ig)和人4Ig形式表現出相似的功能(Hofmeyer,K.等人(2008)“The Contrasting Role Of B7-H3(B7-H3的截然相反的作用)，”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)105(30)：10277-10278)。4Ig-B7-H3分子抑制自然殺手細胞介導的癌細胞裂解(Castriconi,R.等人“Identification Of 4Ig-B7-H3 As A Neuroblastoma-Associated Molecule That Exerts A Protective Role From An NK Cell-Mediated Lysis(4Ig-B7-H3被鑑定為發揮防止NK細胞介導的裂解作用的神經胚細胞瘤相關分子)，”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)101(34)：12640-12645)。已發現人B7-H3(2Ig形式)藉由結合活化的T細胞上推測的受體來促進T細胞活化和IFN-γ產生(Chapoval,A.等人(2001)“B7-H3：A Costimulatory Molecule For T Cell Activation and IFN-γ Production(B7-H3：用於T細胞活化和IFN-γ產生的共刺激分子)，”Nature Immunol.2：269-274；Xu,H.等人(2009)“MicroRNA miR-29 Modulates Expression of Immunoinhibitory Molecule B7-H3：Potential Implications for Immune Based Therapy of Human Solid Tumors(微小RNA miR-29調節免疫抑制分子B7-H3的表現：對人實體瘤基於免疫的療法的潛在意義)，”Cancer Res. 69(15)：5275-6281)。當表現在腫瘤細胞上時，B7-H4和B7-H1都是有力的免疫功能抑制劑(Flies,D.B.等人(2007)“The New B7s：Playing a Pivotal Role in Tumor Immunity(新B7：在腫瘤免疫中起樞紐作用)，”J.Immunother.30(3)：251-260)。
B7-H3的作用方式複雜，因為該蛋白介導T細胞共刺激和共抑制(Hofmeyer,K.等人(2008)“The Contrasting Role Of B7-H3(B7-H3的截然相反的作用)，”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)105(30)：10277-10278；Martin-Orozco,N.等人(2007)“Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity(抑制性共刺激和抗腫瘤免疫)，”Semin.Cancer Biol.17(4)：288-298；Subudhi,S.K.等人(2005)“The Balance Of Immune Responses：Costimulation Verse Coinhibition(免疫反應的平衡：共刺激對共抑制)，”J.Mol.Med.83：193-202)。B7-H3結合(TREM)樣轉錄物2(TLT-2)並且共刺激T細胞活化，但是也結合目前未鑑定的受體來介導T細胞的共抑制。此外，藉由與未知受體相互作用，B7-H3是自然殺手細胞和成骨細胞的抑制劑(Hofmeyer,K.等人(2008)“The Contrasting Role Of B7-H3(B7-H3的截然相反的作用)，”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)105(30)：10277-10278)。這種抑制可經由與主要的信號傳導途徑的成員相互作用來運行，T細胞受體(TCR)經由該信號傳導途徑調節基因轉錄(例如，NFTA、NF-κB或AP-1因子)。
B7-H3共刺激CD4+ T細胞和CD8+ T細胞的增殖。B7-H3還刺激IFN-γ產生和CD8+的裂解活性(Chapoval,A.等人(2001)“B7-H3：A Costimulatory Molecule For T Cell Activation and IFN-γ Production(B7-H3： 用於T細胞活化和IFN-γ產生的共刺激分子)，”Nature Immunol.2：269-274；Sharpe,A.H.等人(2002)“The B7-CD28 Superfamily(B7-CD28超級科)，”Nature Rev.Immunol.2：116-126)。然而，該蛋白還可能經由NFAT(活化的T細胞的核因子)、NF-κB(核因子κB)和AP-1(活化蛋白-1)因子起作用來抑制T細胞活化(Yi.K.H.等人(2009)“Fine Tuning The Immune Response Through B7-H3 And B7-H4(細由B7-H3和B7-H4細調免疫反應)，”Immunol.Rev.229：145-151)。還認為B7-H3在體內抑制Th1、Th2或Th17(Prasad,D.V.等人(2004)“Murine B7-H3 Is A Negative Regulator Of T Cells(鼠B7-H3是T細胞的負向調節物)，”J.Immunol.173：2500-2506；Fukushima,A.等人(2007)“B7-H3 Regulates The Development Of Experimental Allergic Conjunctivitis In Mice(B7-H3調節小鼠中實驗性過敏性結膜炎的發展)，”Immunol.Lett.113：52-57；Yi.K.H.等人(2009)“Fine Tuning The Immune Response Through B7-H3 And B7-H4(經由B7-H3和B7-H4細調免疫反應)，”Immunol.Rev.229：145-151)。幾項獨立研究已顯示人惡性腫瘤細胞表現出B7-H3蛋白表現的顯著提高並且這種提高的表現與提高的疾病嚴重度有關(Zang,X.等人(2007)“The B7 Family And Cancer Therapy：Costimulation And Coinhibition(B7科和癌症治療：共刺激和共抑制)，”Clin.Cancer Res.13：5271-5279)，暗示腫瘤利用B7-H3作為免疫脫逃途徑(Hofmeyer,K.等人(2008)“The Contrasting Role Of B7-H3(B7-H3的截然相反的作用)，”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)105(30)：10277-10278)。
阻斷B7分子結合T細胞受體(例如CD28)的能力的分子抑制免疫系統並且已被提出作為自體免疫疾病的治療法(Linsley,P.S.等人 (2009)“The Clinical Utility Of Inhibiting CD28-Mediated Co-Stimulation(抑制CD28-介導的共刺激的臨床應用)，”Immunolog.Rev.229：307-321)。用抗4Ig-B7-H3抗體處理的表現4Ig-B7-H3的神經胚瘤細胞對NK細胞更敏感。然而，不清楚是否這種活性能僅歸因於針對4Ig-B7-H3形式的抗體，因為所有報道的針對4Ig-B7-H3產生的抗體也結合B7H3的二Ig樣形式(Steinberger,P.等人(2004)“Molecular Characterization of Human 4Ig-B7-H3,a Member of the B7 Family with Four Ig-Like Domains(具有四個Ig樣區域的B7科成員人4Ig-B7-H3的分子表徵)，”J.Immunol.172(4)：2352-2359和Castriconi等人(2004)“Identification Of 4Ig-B7-H3 As A Neuroblastoma-Associated Molecule That Exerts A Protective Role From An NK Cell-Mediated Lysis(4Ig-B7-H3被鑑定為發揮防止NK細胞介導的裂解作用的神經胚細胞瘤相關分子)，”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)101(34)：12640-12645)。
B7-H3在靜止性B細胞或T細胞、單核細胞或樹突狀細胞上不表現，但在樹突狀細胞上被IFN-γ誘導並且在單核細胞上被GM-CSF誘導(Sharpe,A.H.等人(2002)“The B7-CD28 Superfamily(B7-CD28超級科)，”Nature Rev.Immunol.2：116-126)。結合B7-H3的受體沒有被完全表徵。早期工作暗示在活化後，這樣一種受體需要在T細胞上被快速且瞬時地上調(Loke,P.等人(2004)“Emerging Mechanisms Of Immune Regulation：The Extended B7 Family And Regulatory T Cells(免疫調節的新興機制：擴展的B7科和調節T細胞).”Arthritis Res.Ther.6：208-214)。最近，在髓樣細胞上表現的(TREM)樣轉錄物2(TLT-2或TREML-2)受體(King,R.G.等人(2006)“Trem-Like Transcript 2 Is Expressed On Cells Of The Myeloid/Granuloid And B Lymphoid Lineage And Is Up-Regulated In Response To Inflammation(Trem樣轉錄物2表現於髓樣/粒樣細胞和B淋巴系細胞上並且反應於炎症被上調)，”J.Immunol.176：6012-6021；Klesney-Tait,J.等人(2006)“The TREM Receptor Family And Signal Integration(TREM受體家族和信號整合)，”Nat.Immunol.7：1266-1273；Yi.K.H.等人(2009)“Fine Tuning The Immune Response Through B7-H3 And B7-H4(藉由B7-H3和B7-H4細調免疫反應)，”Immunol.Rev.229：145-151)已顯示能夠結合B7-H3並且能夠由此共刺激特別是CD8+ T細胞的活化(Zang,X.等人(2003)“B7x：A Widely Expressed B7 Family Member That Inhibits T Cell Activation(B7x：抑制T細胞活化的廣泛表現的B7科成員)，”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)100：10388-10392；Hashiguchi,M.等人(2008)“Triggering Receptor Expressed On Myeloid Cell-Like Transcript 2(TLT-2)Is A Counter-Receptor For B7-H3 And Enhances T Cell Responses(髓樣細胞表現的觸發受體樣轉錄物2(TLT-2)是B7-H3的反受體並且增強T細胞反應)，”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)105(30)：10495-10500；Hofmeyer,K.等人(2008)“The Contrasting Role Of B7-H3(B7-H3的截然相反的作用)，”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)105(30)：10277-10278)。
除了在神經胚細胞瘤細胞上的表現，人B7-H3也已知在多種其他癌細胞(例如，胃癌、卵巢癌和非小細胞肺癌)上表現。B7-H3蛋白表現已經由免疫組織學法在腫瘤細胞系中被檢測到(Chapoval,A.等人(2001)“B7-H3：A Costimulatory Molecule For T Cell Activation and IFN-γ Production(B7-H3：用於T細胞活化和IFN-γ產生的共刺激分子)，”Nature Immunol.2：269-274；Saatian,B.等人(2004)“Expression Of Genes For B7-H3 And Other T Cell Ligands By Nasal Epithelial Cells During Differentiation And Activation(鼻上皮細胞在分化和活化過程中表現B7-H3和其他T細胞配體的基因)，”Amer.J.Physiol.Lung Cell.Mol.Physiol.287：L217-L225；Castriconi等人(2004)“Identification Of 4Ig-B7-H3 As A Neuroblastoma-Associated Molecule That Exerts A Protective Role From An NK Cell-Mediated Lysis(4Ig-B7-H3被鑑定為發揮防止NK細胞介導的裂解作用的神經胚細胞瘤相關分子)，”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)101(34)：12640-12645)；Sun,M.等人(2002)“Characterization of Mouse and Human B7-H3 Genes(小鼠和人B7-H3基因的表徵)，”J.Immunol.168：6294-6297)。已在心臟、腎、睾丸、肺、肝、胰腺、前列腺、結腸和成骨細胞中發現mRNA表現(Collins,M.等人(2005)“The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands(免疫調節配體的B7科)，”Genome Biol.6：223.1-223.7)。在蛋白等級上，在人的肝、肺、膀胱、睾丸、前列腺、乳房、胎盤和淋巴樣器官中發現B7-H3(Hofmeyer,K.等人(2008)“The Contrasting Role Of B7-H3(B7-H3的截然相反的作用)，”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)105(30)：10277-10278)。
II.治療性抗體
除了在診斷中的已知用途外，抗體還顯示可用作治療劑。例如，免疫治療或抗體出於治療目的的用途近年來已用於治療癌症。被動免疫治療涉及在癌症治療中使用單株抗體(見例如，DEVITA,HELLMAN,AND ROSENBERG'S CANCER：PRINCIPLES & PRACTICE OF ONCOLOGY(Devita，Hellman和Rosenberg氏癌症：腫瘤學原理與實踐)，第八版(2008),DeVita,V.等人編，Lippincott Williams & Wilkins,Philadelphia,PA，第537-547頁，2979-2990)。這些抗體可藉由直接抑制腫瘤細胞的生長或存活和藉由其募集身體免疫系統的自然細胞殺傷活性的能力而具有內在的治療生物學活性。這些劑可單獨施用或與放射劑或化學治療劑結合使用。被批准分別用於治療非霍奇金氏淋巴瘤和乳腺癌的利妥昔單抗(Rituximab)和曲妥珠單抗(Trastuzumab)是這些治療劑的例子。可選地，抗體可用於製備抗體接合物，在抗體接合物中抗體與毒劑相連並藉由與腫瘤特異性結合將該毒劑導向腫瘤。吉姆單抗奧佐米星是批准的用於治療白血病的抗體接合物的例子。
已揭露結合癌細胞並且具有用於診斷和治療的潛在用途的單株抗體(見例如，除了其他之外還揭露了一些分子量的標靶蛋白的以下專利申請案：美國專利第6,054,561號(200kD c-erbB-2(Her2)和40-200KD大小的其他未知抗原)和美國專利第5,656,444號(50KD和55KD的癌胚抗原)。在臨床試驗中及/或批准用於治療實體瘤的抗體的例子包括：曲妥珠單抗(抗原：180kD，HER2/neu)、依決洛單抗(抗原：40-50kD，Ep-CAM)、抗人乳脂肪球(HMFG1)(抗原&gt；200kD，HMW粘蛋白)、西妥昔單抗(抗原：150kD和170kD，EGF受體)、阿倫單抗(抗原：21-28kD，CD52)和利妥昔單抗(抗原：35kD，CD20)。
用於治療乳腺癌的曲妥珠單抗的抗原標靶(Her-2受體)和在臨床試驗中用於治療幾種癌症的西妥昔單抗的抗原標靶(EGF受體)以某種可檢測等級存在於大量正常成人組織上，包括皮膚、結腸、肺、卵巢、 肝和胰腺。使用這些治療劑的安全限度可能由這些部位的抗原表現程度、或抗體接觸或活性的差異提供。
另一種類型的免疫治療是主動免疫治療或者接種疫苗，用特定癌症上存在的抗原或指導該抗原表現的DNA建構體進行，然後該抗原在個體中激發免疫反應，即誘導個體主動產生針對其本身癌症的抗體。主動免疫的使用不如被動免疫治療或免疫毒素普遍。
已提出幾種疾病(包括癌症)進展模型。理論的範圍從由單個感染/轉化事件引起到最終導致個體具有完全致病能力或惡性能力的不斷增加的“疾病樣”或“癌症樣”組織類型的演化。一些人主張對於癌症而言，例如，單個突變事件足以引起惡性腫瘤，而其他人主張隨後的變化也是必要的。另一些人提出，增加的突變負荷和腫瘤分級(tumor grade)對於瘤形成經過在細胞等級上的連續的突變-選擇事件而開始和進展都是必要的。一些癌症標靶僅見於腫瘤組織中，而其他癌症標靶存在於正常組織中並且在腫瘤組織中被上調及/或過表現。在這些情況下，一些研究者提出過表現與惡性腫瘤的獲得有關，而其他研究者提出過表現只是趨於沿日益增加的疾病狀態路徑的標誌。
在一些情況下，癌症標靶諸如腫瘤中表現或過表現的癌蛋白顯示在胚胎和胎兒的發育過程中存在並且用作生長和分化的調節劑。一些研究者發現這些癌蛋白在胚胎和胎兒發育過程中的表現似乎限於特定的組織並且還限於特定的發育階段。相比之下，這些癌蛋白在成人中的表現顯示與在腫瘤生長中的過表現及/或腫瘤阻抑蛋白的失效有關。
理想的診斷性及/或治療性抗體將對大量癌症存在但任何正 常組織上不存在或僅以低等級存在的抗原具有特異性。能夠結合與癌症特異性相關的抗原的新穎抗體的發現、表徵和分離在許多方面將是有用的。首先，抗體將具有針對這些癌細胞的生物學活性並且能夠募集免疫系統的反應，從而治療疾病。抗體可作為單獨的治療劑施用或與目前的治療聯合施用或用於製備與毒劑相連的免疫接合物。當單獨施用時具有相同特異性但具有低生物學活性或不具有生物學活性的抗體也可能是有用的，原因是抗體可用於與放射性同位素、毒素或化學治療劑或包含化學治療劑的脂質體一起製備免疫接合物，其中接合形式憑藉抗體將毒素導向包含抗原的細胞而具有生物學活性。
如以上所討論的，已描述了特異性結合B7-H3的抗體和其他分子(見，美國專利第7,527,969號；第7,368,554號；第7,358,354號；和第7,279,567號；美國專利申請案公開第US 20090087416號；第US 20090022747號；第US 20090018315號；第US2008116219號；第US20080081346號；第US 20050202536號；第US20030103963號；第US20020168762號；PCT公開第WO 2008/116219號；第WO 2006/016276號；第WO 2004/093894號；WO 04/001381號；第WO 2002/32375號；第WO 2002/10187號和第WO 2001/094413號；EP 1292619B；Modak,S.等人(1999年3月)“Disialoganglioside GD2 And Antigen 8H9：Potential Targets For Antibody-Based Immunotherapy Against Desmoplastic Small Round Cell Tumor (DSRCT)And Rhabdomyosarcoma(RMS)(二唾液酸神經節苷酯GD2和抗原8H9：針對促纖維增生性小圓細胞瘤(DSRCT)和橫紋肌肉瘤(RMS)的基於抗體的免疫治療的潛在標靶)，”美國癌症研究協會年會會議記錄，卷 40：474(美國癌症研究協會年會第90次年會；Philadelphia,Pennsylvania,US；1999年4月10日-14日；Modak,S.等人(2000年3月)“Radioimmunotargeting To Human Rhabdomyosarcoma Using Monoclonal Antibody 8H9(使用單株抗體8H9針對人橫紋肌肉瘤放射免疫靶向)，”Proc.Am.Assoc.Cancer Res.41：724；Modak,S.等人(2001)“Monoclonal Antibody 8H9 Targets A Novel Cell Surface Antigen Expressed By A Wide Spectrum Of Human Solid Tumors(單株抗體8H9靶向廣泛的人實體瘤所表現的新穎細胞表面抗原)，”Cancer Res.61(10)：4048-4054；Steinberger,P.等人(2004)“Molecular Characterization of Human 4Ig-B7-H3,a Member of the B7 Family with Four Ig-Like Domains(具有四個Ig樣區域的B7科成員人4Ig-B7-H3的分子表徵)，”J.Immunol.172(4)：2352-2359；Xu,H.等人(2009)“MicroRNA miR-29 Modulates Expression of Immunoinhibitory Molecule B7-H3：Potential Implications for Immune Based Therapy of Human Solid Tumors(微小RNA miR-29調節免疫抑制分子B7-H3的表現：對人實體瘤基於免疫的療法的潛在意義)，”Cancer Res.69(15)：5275-6281)。
儘管如此，理想的診斷性及/或治療性抗體的一個令人期望的方面將是能夠介導且特別是能夠增強免疫系統針對與多種癌症相關的癌細胞(尤其是人癌細胞)的活化的新穎抗體的發現和表徵。這些組合物還可用於藥物發現(例如小分子)和用於進一步表徵細胞的調節、生長和分化。
因此，儘管有在前的所有進展，對於能夠結合癌細胞和能夠促進或介導針對癌細胞的免疫反應的改進組合物仍存在需要。這些組合物 可用於診斷和治療這些癌症。基於本文揭示的發現，對特異性識別細胞表面上的雙重標靶並能夠藉此調節的新穎組合物還存在需要，該調節是藉由降低或增強B7-H3介導T細胞活化的能力或藉由識別並殺傷表現B7-H3的癌細胞。本發明的一個目的是鑑定這些組合物。本發明的另一個目的是提供在B7-H3表現測定中使用的新穎組合物。
如以下詳述的，本發明涉及能夠影響T細胞活化的新穎抗體，具體包括包含B7-H3 T細胞活化的調節劑的雙親和力重新靶向試劑(“DARTTM”)，以及結合癌細胞的B7-H3受體並促進或介導這些細胞的死亡的新穎抗體。本發明涉及這些組合物及其在診斷和治療疾病諸如癌症中的用途。
本發明涉及對哺乳動物的B7-H3受體且更具體而言對人的B7-H3受體具有免疫反應性的抗體及其片段，並涉及它們的用途，特別是在癌症和炎症的治療中的用途。本發明因此特別地涉及人源化B7-H3反應性抗體及其免疫反應性片段，該抗體及其免疫反應性片段能夠介導、且更佳地增強免疫系統針對與多種人癌症相關的癌細胞的活化。
詳細地，本發明涉及分離的抗體或其免疫反應性片段，其中該分離的抗體或片段包含特異性結合B7-H3的胞外區域的可變區域，其中該抗體與以下抗體的任何一種競爭結合B7-H3：BRCA69D、BRCA84D或PRCA157。
本發明還涉及上述分離的抗體或其免疫反應性片段，其中該抗體或片段包含可變區域，該可變區域包含：(A)BRCA69D的輕鏈的CDR1(SEQ ID NO：21)、CDR2 (SEQ ID NO：23)和CDR3(SEQ ID NO：25)以及BRCA69D的重鏈的CDR1(SEQ ID NO：29)、CDR2(SEQ ID NO：31)和CDR3(SEQ ID NO：33)；(B)BRCA84D的輕鏈的CDR1(SEQ ID NO：5)、CDR2(SEQ ID NO：7)和CDR3(SEQ ID NO：9)以及BRCA84D的重鏈的CDR1(SEQ ID NO：13)、CDR2(SEQ ID NO：15)和CDR3(SEQ ID NO：17)；或(C)PRCA157的輕鏈的CDR1(SEQ ID NO：37)、CDR2(SEQ ID NO：39)和CDR3(SEQ ID NO：41)以及PRCA157的重鏈的CDR1(SEQ ID NO：45)、CDR2(SEQ ID NO：47)和CDR3(SEQ ID NO：49)。
本發明還涉及上述分離的抗體或其免疫反應性片段中的任何一種，其中該抗體結合癌細胞表面上內源性表現的B7-H3。
本發明還涉及上述分離的抗體或其免疫反應性片段中的任何一種，其中該抗體結合B7-H3，該抗體在結合癌細胞表面上表現的B7-H3時被內化。
本發明還涉及上述分離的抗體或其免疫反應性片段中的任何一種，它們是人源化單株抗體。
本發明還涉及上述分離的抗體或其免疫反應性片段中的任何一種，其中該抗體是包含人IgG1 Fc區變體的修飾的抗體，其中該人IgG1 Fc區變異型較之母體抗體Fc區包含至少一種胺基酸修飾，該胺基酸修飾包括改變Fc區變異型結合FcγR的親和力(affinity)或親合力(avidity)的胺基酸修飾以使得修飾的抗體表現出較之母體抗體增強的效應子功能。
本發明還涉及上述分離的抗體或其免疫反應性片段中的任何一種，其中Fc區修飾包括：(A)選自以下組成的組的至少一種取代：(1)F243L；(5)Y300L； (2)D270E；(6)V305I；(3)R292P；(7)A330V；和(4)S298N；(8)P396L；(B)至少一種兩個胺基酸殘基的取代，該取代選自由以下組成的組：(1)F243L和P396L；(2)F243L和R292P；和(3)R292P和V305I；(C)至少一種三個胺基酸殘基的取代，該取代選自由以下組成的組：(1)F243L、R292P和Y300L；(2)F243L、R292P和V305I；(3)F243L、R292P和P396L；和(4)R292P、V305I和P396L；(D)至少一種四個胺基酸殘基的取代，該取代選自由以下組成的組：(1)F243L、R292P、Y300L和P396L；和(2)F243L、R292P、V305I和P396L；(E)至少五個胺基酸殘基的取代：F243L、R292P、Y300L、V305I和P396L。
本發明還涉及上述抗體，其中該抗體包含以下的取代：(A)F243L、R292P、和Y300L；(B)L235V、F243L、R292P、Y300L和P396L；或(C)F243L、R292P、Y300L、V305I和P396L。
本發明還涉及上述抗體，其中該抗體包含：(A)包含BRCA84D的輕鏈的CDR1(SEQ ID NO：5)、CDR2(SEQ ID NO：7)和CDR3(SEQ ID NO：9)以及BRCA84D的重鏈的CDR1(SEQ ID NO：13)、CDR2(SEQ ID NO：15)和CDR3(SEQ ID NO：17)的可變區域；和(B)包含以下取代的Fc區修飾：L235V、F243L、R292P、Y300L和P396L。
本發明還涉及上述抗體，其中該抗體是嵌合抗體或人源化抗體。
本發明還涉及上述分離的抗體或其免疫反應性片段，其中該抗體包含：(A)具有hBRCA84D-2 VL的胺基酸序列(SEQ ID NO：89)的可變輕鏈；(B)具有hBRCA84D-2 VH的胺基酸序列(SEQ ID NO：99)的可變重鏈；和(C)包括以下取代的Fc區：L235V、F243L、R292P、Y300L和P396L。
本發明還涉及分泌特異性結合B7-H3的胞外區域的單株抗體的融合瘤，其中該抗體與以下抗體的任何一種競爭結合B7-H3：BRCA69D、BRCA84D或PRCA157。
本發明還涉及編碼上述分離的抗體或免疫反應性片段中的任何一種的核酸分子。
本發明還涉及雙親和力重新靶向試劑(DARTTM)，該試劑包含： (A)多肽鏈I，該多肽鏈I包含對於結合B7-H3特異的免疫球蛋白VL表位結合區域和對於結合除B7-H3以外的分子特異的VH表位結合區域；和(B)多肽鏈II，該多肽鏈II包含對於結合B7-H3特異的免疫球蛋白VH表位結合區域和對於結合除B7-H3以外的分子特異的VL表位結合區域；其中該多肽鏈I和多肽鏈II締合在一起形成能夠結合B7-H3和除B7-H3以外的分子的功能性表位結合區域。
本發明還涉及上述雙親和力重新靶向試劑(DARTTM)，其中可被DARTTM結合的除B7-H3以外的分子是半抗原，並且特別地其中該半抗原是異硫氰酸螢光素。
本發明還涉及上述雙親和力重新靶向試劑(DARTTM)，其中可被DARTTM結合的除B7-H3以外的分子是T細胞受體或NKG2D受體。
本發明還涉及上述雙親和力重新靶向試劑(DARTTM)，其中可被DARTTM結合的除B7-H3以外的分子是腫瘤相關抗原，並且特別地，其中該腫瘤相關抗原選自由以下組成的群組：A33；ADAM-9；ALCAM；BAGE；β-連環蛋白；CA125；羧肽酶M；CD103；CD19；CD20；CD22；CD23；CD25；CD27；CD28；CD36；CD40/CD154；CD45；CD46；CD5；CD56；CD79a/CD79b；CDK4；CEA；CTLA4；細胞角蛋白8；EGF-R；EphA2；ErbB1；ErbB3；ErbB4；GAGE-1；GAGE-2；GD2/GD3/GM2；gp100；HER-2/neu；人乳頭狀瘤病毒-E6；人乳頭狀瘤病毒-E7；整合素α-V-β-6；JAM-3；KID3；KID31；KSA(17-1A)；LUCA-2；MAGE-1；MAGE-3；MART；MUC-1；MUM-1；N-乙醯胺基葡糖轉移酶；抑瘤素M；p15；PIPA；PSA；PSMA；ROR1；sTn；TNF-ß受體；TNF-α受體；TNF-γ受體；運鐵蛋 白受體；和VEGF受體。
本發明還涉及編碼上述雙親和力重新靶向試劑(DARTTM)中的任何一種的多肽鏈的核酸分子。
本發明還涉及藥物組合物，該藥物組合物包含：(i)治療有效量的上述分離的抗體或免疫反應性片段或雙親和力重新靶向試劑(DARTTM)中的任何一種和(ii)藥學上可接受的載體。
本發明還涉及上述藥物組合物，其中該抗體是包含以下的人源化抗體：(A)包含BRCA84D的輕鏈的CDR1(SEQ ID NO：5)、CDR2(SEQ ID NO：7)和CDR3(SEQ ID NO：9)以及BRCA84D的重鏈的CDR1(SEQ ID NO：13)、CDR2(SEQ ID NO：15)和CDR3(SEQ ID NO：17)的可變區域；和(B)包含以下取代的Fc區修飾：L235V、F243L、R292P、Y300L和P396L。
本發明還涉及上述藥物組合物，其中該抗體是包含以下的人源化抗體：(A)具有hBRCA84D-2 VL的胺基酸序列(SEQ ID NO：89)的可變輕鏈；(B)具有hBRCA84D-2 VH的胺基酸序列(SEQ ID NO：99)的可變重鏈；和(C)具有以下取代的Fc區：L235V、F243L、R292P、Y300L和P396L。
本發明還涉及上述藥物組合物中的任何一種，該藥物組合物還包含一種或多種另外的抗癌劑，並且特別地，其中該另外的抗癌劑是化 學治療劑、放射治療劑、激素治療劑或免疫治療劑。該另外的抗癌劑可以是選自由以下組成的群組的毒素：紫杉烷、類美登素、阿瑞斯他丁、卡奇黴素、蒽環類、CC-1065類似物、多西他賽、組織蛋白酶、蓖麻毒蛋白、白樹毒素、假單胞菌(Pseudomonas)外毒素、白喉毒素、RNA酶以及毒性放射性同位素。
本發明還涉及上述抗體或免疫反應性片段或雙親和力重新靶向試劑(DARTTM)中的任何一種在癌症診斷中的用途，其中該分離的抗體、免疫反應性片段或DARTTM被可檢測地標記。
本發明還涉及特徵是癌症以存在選自以下組成的組的癌細胞為特徵的上述用途：腎上腺腫瘤、AIDS-相關癌症、軟組織腺泡狀肉瘤、星形細胞瘤、膀胱癌、骨癌、腦脊髓癌、轉移性腦瘤、乳腺癌、頸動脈體瘤、子宮頸癌、軟骨肉瘤、脊索瘤、腎嫌色細胞癌、透明細胞癌、結腸癌、結腸直腸癌、皮膚良性纖維組織細胞瘤、促纖維增生性小圓細胞瘤、室管膜瘤、伊文氏腫瘤、骨外粘液樣軟骨肉瘤、不完全性骨纖維生成、骨纖維性結構不良、膽囊或膽管癌、胃癌、妊娠性滋養細胞疾病、生殖細胞瘤、頭頸癌、肝細胞癌、胰島細胞瘤、卡波西氏肉瘤、腎癌、白血病、脂瘤/良性脂肪瘤、脂肉瘤/惡性脂肪瘤、肝癌、淋巴瘤、肺癌、神經管胚細胞瘤、黑色素瘤、腦膜瘤、多發性內分泌腫瘤、多發性骨髓瘤、骨髓增生異常症候群、神經胚細胞瘤、神經內分泌腫瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳頭狀甲狀腺癌、甲狀旁腺腫瘤、兒科癌症、周圍神經鞘瘤、嗜鉻細胞瘤、垂體瘤、前列腺癌、後葡萄膜黑色素瘤、罕見血液疾病、腎轉移癌、橫紋肌樣瘤、橫紋肌肉瘤(rhabdomysarcoma)、肉瘤、皮膚癌、軟組織肉瘤、鱗狀細胞癌、胃癌、滑膜肉瘤、睾丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲狀腺轉移癌和子宮癌的細胞。
本發明還涉及上述抗體或免疫反應性片段或雙親和力重新靶向試劑(DARTTM)中的任何一種在用於治療或預防患者癌症的藥劑的製備中的用途。本發明還涉及特徵是癌症以存在選自以下組成的組的癌細胞為特徵的這些用途：腎上腺腫瘤、AIDS-相關癌症、軟組織腺泡狀肉瘤、星形細胞瘤、膀胱癌、骨癌、腦脊髓癌、轉移性腦瘤、乳腺癌、頸動脈體瘤、子宮頸癌、軟骨肉瘤、脊索瘤、腎嫌色細胞癌、透明細胞癌、結腸癌、結腸直腸癌、皮膚良性纖維組織細胞瘤、促纖維增生性小圓細胞瘤、室管膜瘤、伊文氏腫瘤、骨外粘液樣軟骨肉瘤、不完全性骨纖維生成、骨纖維性結構不良、膽囊或膽管癌、胃癌、妊娠性滋養細胞疾病、生殖細胞瘤、頭頸癌、肝細胞癌、胰島細胞瘤、卡波西氏肉瘤、腎癌、白血病、脂瘤/良性脂肪瘤、脂肉瘤/惡性脂肪瘤、肝癌、淋巴瘤、肺癌、神經管胚細胞瘤、黑色素瘤、腦膜瘤、多發性內分泌腫瘤、多發性骨髓瘤、骨髓增生異常症候群、神經胚細胞瘤、神經內分泌腫瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳頭狀甲狀腺癌、甲狀旁腺腫瘤、兒科癌症、周圍神經鞘瘤、嗜鉻細胞瘤、垂體瘤、前列腺癌、後葡萄膜黑色素瘤、罕見血液疾病、腎轉移癌、橫紋肌樣瘤、橫紋肌肉瘤、肉瘤、皮膚癌、軟組織肉瘤、鱗狀細胞癌、胃癌、滑膜肉瘤、睾丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲狀腺轉移癌和子宮癌的細胞。
本發明還涉及具有如下特徵的上述用途：上述用途還包括施用選自以下組成的群組的一種或多種另外的癌症治療：化學治療、免疫治療、放射治療、激素治療和手術。
SEQ ID No：3‧‧‧可變輕鏈的胺基酸序列
SEQ ID No：68‧‧‧可變輕鏈
SEQ ID No：11/SEQ ID No：80‧‧‧可變重鏈的胺基酸序列
BRCA84D/BRCA69D/PRCA157‧‧‧融合瘤
BRCA68D/GB8/TES7/BLA8/BRCA165/LUCA50/PRCA123/SG24/TDH5/OVCA21/OVCA22/PA20/SG27/STO9‧‧‧抗體
CSC‧‧‧前列腺
hBRCA84D‧‧‧治療潛力的抗體
Elisa‧‧‧酵素連結免疫吸附分析法
IgG‧‧‧免疫球蛋白C樣區域
HT-1197‧‧‧膀胱癌細胞
A498‧‧‧腎癌細胞
SK-MES-1‧‧‧肺癌細胞
LNCaP‧‧‧前列腺癌細胞
UACC-62‧‧‧黑色素瘤細胞
Mab1‧‧‧抗B7-H3抗體
第1A-1B圖顯示了使用正常胰腺、肝、肺和結腸組織樣本用0.625μg/ml和0.078μg/ml的BRCA84D(第1A圖)以及使用正常心臟、腎和腎上 腺組織用0.625μg/ml的BRCA84D(第1B圖)進行的IHC研究結果。
第2圖顯示使用癌性胰腺、乳腺、結腸和肺組織樣本用0.625μg/ml和0.078μg/ml的BRCA84D進行的IHC研究結果。
第3A-3D圖顯示由本發明的抗體介導的劑量相依重導向殺傷。第3A-3B圖顯示針對B7-H3的反應性單株抗體(效應子：標靶比率為20：1)對A498腎癌細胞的劑量相依重導向殺傷(用靜止性PBMC，18小時(LDH))(第3A圖：BRCA68D、BRCA69D、PRCA157、GB8、TCR-4420；第3B圖：OVCA22、BRCA84D、TDH6、TES7、TCR-4420)。第3C-3D圖顯示針對B7-H3的反應性單株抗體(效應子：標靶比率為30：1)對A549肺癌細胞的劑量相依重導向殺傷(用靜止性PBMC，18小時(LDH))(第3C圖：BRCA84D、OVCA22、PRCA157、TES7；第3D圖：TDH6、BRCA68D、BRCA69D)。
第4A-4B圖顯示抗B7-H3抗體結合可溶性B7H3-2Ig(第4A圖)和可溶性B7H3-4Ig B7-H3(第4B圖)的能力(抗體濃度是100nM)。圖例：(A)BLA8；(B)BRCA165；(C)BRCA68D；(D)BRCA69D；(E)BRCA84D；(F)GB8；(G)LUCA1；(H)LUCA50；(I)OVCA21；(J)OVCA22；(K)PA20；(L)PRCA123；(M)SG24；(N)SG27；(O)STO9；(P)TDH4(184-192)；(Q)TDH4；(R)TDH5；(S)TES7。圖例的垂直位置與對應曲線的位置相關。
第5A-5S圖展示溶液中的抗原與捕獲的單株抗體之間的結合親和力(實線；B7-H3(4Ig)100nM；虛線；B7-H3,100nM)。
第6A-6I圖顯示固定至B7-H3-2Ig(灰色虛線)或B7-H3-4Ig(黑色實線) 的B7-H3抗體的BIACORETM分析結果。抗體從0.063μM被滴定到1μM。時間按秒計。
第7圖提供了抗體PRCA157、BRCA69D、BLA8、PA20、BRCA84D、GB8和SG27的BIACORETM比較分析。
第8圖提供了展示抗體BRCA68D、BRCA69D和PRCA157不與BRCA84D競爭結合人B7-H3的BIACORETM分析。
第9A-9B圖顯示對本發明的抗B7-H3抗體在結合癌細胞時被內化的能力的研究結果(第9A圖，前列腺CSC細胞；第9B圖，Hs700t胰腺細胞)。
第10A-10F圖顯示本發明的抗B7-H3抗體彼此交叉阻斷從而展現重疊表位或不同表位的能力。利用了十倍過量的競爭抗體。
第11A-11B圖顯示BRCA84D的可變輕鏈(第11A圖)或可變重鏈(第11B圖)與其人源化衍生物hBRCA84D的胺基酸殘基的比對。
第12圖顯示hBRCA84D輕鏈衍生物BRCA84D-3VL、BRCA84D-4VL和BRCA84D-5VL對於人B7-H3的相對結合親和力。
第13圖顯示hBRCA84D重鏈衍生物BRCA84D-2VH、BRCA84D-3VH和BRCA84D-4VH對於人B7-H3的相對結合親和力。
第14圖顯示以下抗體的相對結合親和力：(1)包含hBRCA84D-2VL和hBRCA84D-2VH的抗體(試驗1和試驗2)，(2)嵌合BRCA84D，(3)包含hBRCA84D-5VL和嵌合BRCA84D-HC的抗體，以及(4)包含hBRCA84D-5VL和hBRCA84D-2VH的抗體。
第15圖顯示Fc修飾的人源化抗B7-H3抗體在鼠異種移植模型系統中抑制HT-1197膀胱癌細胞的體內腫瘤生長的能力。在植入癌細胞後7天、 14天、21天和28天，向小鼠施用(以1μg/kg、10μg/kg或20μg/kg的劑量)Fc修飾的hBRCA84D-2抗體(包含Fc修飾L235V、F243L、R292P、Y300L和P396L)。
第16圖顯示Fc修飾的人源化抗B7-H3抗體在鼠異種移植模型系統中抑制A498腎癌細胞的體內腫瘤生長的能力。在植入癌細胞後7天、14天、21天和28天，向小鼠施用(以1μg/kg、10μg/kg或20μg/kg的劑量)Fc修飾的hBRCA84D-2抗體(包含Fc修飾L235V、F243L、R292P、Y300L和P396L)。
第17A-17D圖展示hBRCA84D-2/抗TCR DARTTM(“T-DARTTM”)介導SK-MES-1肺癌細胞、A498腎癌細胞、LNCaP前列腺癌細胞和UACC-62黑色素瘤細胞的重導向殺傷的能力。
第18A-18C圖顯示雄性無腫瘤雄性mCD16-/-、hCD16A_FOXN1小鼠的血清中的抗B7-H3 Mab1的藥物代謝動力學衰減(第18A-18B圖)。第18C圖顯示使用2室模型以5mg/kg劑量的參數在0.1、0.5、1、5和10mg/kg產生的預測的藥物代謝動力學曲線。
第19圖顯示HT-1197膀胱癌系對HER2和PRCA135的相對表現。
第20圖顯示抗B7-H3抗體hBRCA84D變體對HT-1197細胞的結合親和力。
第21A-21C圖顯示HT-1197的鼠異種移植分析的結果。8隻雌性小鼠的各組接受媒介物或10 mg/kg IgG對照，或1、5或15mg/kg劑量的西妥昔單抗或0.1、0.5、1、5或10mg/kg劑量的抗B7-H3抗體Mab1(Q7D×5)。每3-4天進行腫瘤測量。第21A圖顯示抗B7-H3抗體Mab1阻止或 抑制鼠異種移植模型中的腫瘤形成的能力。相較於IgG對照的比較：Mab1(1mg/kg和5mg/kg)相較於IgG對照***從第51天；Mab1(10mg/kg)相較於IgG對照**從第48天。第21B圖顯示西妥昔單抗阻止或抑制鼠異種移植模型中的腫瘤形成的能力。西妥昔單抗(7mg/kg)相較於IgG對照**從第51天；西妥昔單抗(15mg/kg)相較於IgG對照***從第58天。第21C圖比較了在測試的最大劑量獲得的結果。
第22A-22B圖顯示HT-1376膀胱癌系對HER2和PMSA的相對表現。
第23圖顯示HT-1376的鼠異種移植分析的結果。各組小鼠接受媒介物或1.0mg/kg的抗B7-H3抗體Mab1(Q7D×4)。
第24圖顯示AGS的鼠異種移植分析的結果。各組小鼠接受媒介物或0.5、1、5或10mg/kg劑量的10mg/kg抗B7-H3抗體Mab1(Q7D x5)。
第25圖顯示A549肺癌細胞在與hBRCA84D、chBRCA84D和hBRCA84(Fc Var1)變體抗B7-H3抗體一起培養時的體外細胞毒性測定結果(E：T比=25：1；效應子=人PBMC；LDH測定讀數)。
第26圖顯示A549的鼠異種移植分析的結果。各組小鼠接受媒介物或1.0mg/kg的抗B7-H3抗體Mab1(Q7D×4)。
第27圖顯示CaLu3的鼠異種移植分析的結果。各組小鼠接受媒介物或0.5、1或5mg/kg(Q7D×5)抗B7-H3抗體Mab1或IgG對照(10mg/ml)。
第28A-28C圖顯示了LOX-IMVI黑色素瘤癌細胞的鼠異種移植分析的結果。8隻雌性小鼠的各組接受媒介物或5mg/kg IgG對照，或5、10或20mg/kg劑量的多西他賽或0.5、1、5或10mg/kg劑量的抗B7-H3抗體Mab1。第28A圖顯示抗B7-H3抗體Mab1阻止或抑制鼠異種移植模型中 的腫瘤形成的能力。第28B圖顯示多西他賽阻止或抑制鼠異種移植模型中的腫瘤形成的能力。圖28C比較了在測試的最大劑量獲得的結果。
第29圖顯示UACC-62黑色素瘤癌細胞的鼠異種移植分析的結果。各組小鼠接受媒介物或5mg/kg IgG對照，0.5、1、5或10mg/kg劑量的抗B7-H3抗體Mab1。
第30A-30C圖顯示了2rv前列腺癌細胞的鼠異種移植分析的結果。8隻雌性小鼠的各組接受媒介物或10mg/kg IgG對照，或1、7或15mg/kg劑量的曲妥珠單抗或0.5、1、5或10mg/kg劑量的抗B7-H3抗體Mab1。
第30A圖顯示抗B7-H3抗體Mab1阻止或抑制鼠異種移植模型中的腫瘤形成的能力。第30B圖顯示曲妥珠單抗阻止或抑制鼠異種移植模型中的腫瘤形成的能力。第30C圖比較了在測試的最大劑量獲得的結果。
第31圖顯示A498腎癌細胞在與hBRCA84D、chBRCA84D和hBRCA84(Fc Var1)變體抗B7-H3抗體一起培養時的體外細胞毒性測定結果(E：T比=25：1；效應子=人PBMC；LDH測定讀數)。
第32圖顯示A498腎癌細胞的鼠異種移植分析的結果。各組小鼠接受媒介物或10mg/kg IgG對照，或0.1、0.5、1、5或10mg/kg劑量的抗B7-H3抗體Mab1。向對照組小鼠施用劑量為1、7或15mg/kg的西妥昔單抗(抗EGRF抗體)。
第33A-33B圖顯示與西妥昔單抗相比786-0腎癌細胞的鼠異種移植分析的結果。各組小鼠接受媒介物或10mg/kg IgG對照，或0.1、0.5、1、5或10mg/kg劑量的抗B7-H3抗體Mab1。向對照組小鼠施用劑量為1、7或15mg/kg的西妥昔單抗(抗EGRF抗體)。
第34圖顯示與紫杉醇相比786-0腎癌細胞的鼠異種移植分析的結果。各組小鼠接受媒介物或5mg/kg IgG對照，或0.1、0.5、1、5或10mg/kg劑量的抗B7-H3抗體Mab1。向八隻這樣的小鼠的對照組施用2.5mg/kg劑量的紫杉醇。
本發明涉及對哺乳動物的B7-H3受體且更具體而言對人的B7-H3受體具有免疫反應性的抗體及其片段，並涉及它們的用途，特別是在癌症和炎症的治療中的用途。本發明因此特別地涉及人源化B7-H3反應性抗體及其免疫反應性片段，該抗體及其免疫反應性片段能夠介導、且更佳地增強免疫系統針對與多種人癌症相關的癌細胞的活化。
I.一般技術
除非另外指明，否則本發明的實施將利用分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學和免疫學的常規技術，這些技術都在本領域的技能之內。這些技術在文獻中得到完全地解釋，諸如，MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL(分子選殖：實驗室指南)，第三版(Sambrook等人編，2001)Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY；OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS：METHODS AND APPLICATIONS(Methods in Molecular Biology)(寡核苷酸合成：方法和應用)(分子生物學方法)，Herdewijn,P.，編，Humana Press,Totowa,NJ；OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS(寡核苷酸合成)(Gait,M.J.，編，1984)；METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY(分子生物學方法)，Humana Press,Totowa,NJ；CELL BIOLOGY：A LABORATORY NOTEBOOK(細胞生物學： 實驗室筆記)(Cellis,J.E.，編，1998)Academic Press,New York,NY；ANIMAL CELL CULTURE(動物細胞培養)(Freshney,R.I.，編，1987)；INTRODUCTION TO CELL AND TISSUE CULTURE(細胞培養和組織培養介紹)(Mather,J.P.和Roberts,P.E.，編，1998)Plenum Press,New York,NY；CELL AND TISSUE CULTURE：LABORATORY PROCEDURES(細胞培養和組織培養：實驗室步驟)(Doyle,A.等人，編，1993-8)John Wiley and Sons,Hoboken,NJ；METHODS IN ENZYMOLOGY(酶學方法)(Academic Press,Inc.)New York,NY；WEIR’S HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY(威爾實驗免疫學手冊)(Herzenberg,L.A.等人編1997)Wiley-Blackwell Publishers,New York,NY；GENE TRANSFER VECTORS FOR MAMMALIAN CELLS(哺乳動物細胞的基因轉移載體)(Miller,J.M.等人編，1987)Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY；CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(現代分子生物學實驗技術)(Ausubel,F.M.等人，編，1987)Greene Pub.Associates,New York,NY；PCR：THE POLYMERASE CHAIN REACTION(PCR：聚合酶連鎖反應)，(Mullis,K.等人，編，1994)Birkhäuser,Boston MA；CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY(現代免疫學實驗技術)(Coligan,J.E.等人，編，1991)John Wiley and Sons,Hoboken,NJ；SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(精編分子生物學實驗指南)(John Wiley and Sons,1999)Hoboken,NJ；IMMUNOBIOLOGY 7(免疫生物學7)(Janeway,C.A.等人2007)Garland Science,London,UK；Antibodies(抗體)(P.Finch,1997)Stride Publications,Devoran,UK；ANTIBODIES：A PRACTICAL APPROACH (抗體：實用方法)(D.Catty.，編，1989)Oxford University Press,USA,New York NY)；MONOCLONAL ANTIBODIES：A PRACTICAL APPROACH(單株抗體：實用方法)(Shepherd,P.等人編，2000)Oxford University Press,USA,New York NY；USING ANTIBODIES：A LABORATORY MANUAL(使用抗體：實驗室指南)(Harlow,E.等人編，1998)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；THE ANTIBODIES(抗體)(Zanetti,M.等人編1995)Harwood Academic Publishers,London,UK)；和DEVITA,HELLMAN,AND ROSENBERG'S CANCER：PRINCIPLES & PRACTICE OF ONCOLOGY(Devita，Hellman和Rosenberg氏癌症：腫瘤學原理與實踐)，第八版，DeVita,V.等人編2008,Lippincott Williams & Wilkins,Philadelphia,PA。
II.定義
如本文所用，術語“B7-H3”是指人B7蛋白科的成員，為具有Ig樣區域的I型膜蛋白，也稱為CD276。術語“2Ig-B7-H3”表示只包含兩個Ig樣區域的B7-H3形式；術語“4Ig-B7-H3”表示包含四個Ig樣區域的B7-H3形式(見，Sun,M.等人(2002)“Characterization of Mouse and Human B7-H3 Genes(小鼠和人B7-H3基因的表徵)，”J.Immunol.168：6294-6297；Steinberger等人(2004),“Molecular Characterization Of Human 4Ig-B7-H3,A Member Of The B7 Family With Four Ig-Like Domains(具有四個Ig樣區域的B7科成員人4Ig-B7-H3的分子表徵)，”J.Immunol.2004,172(4)：2352-2359和Castriconi等人(2004)“Identification Of 4Ig-B7-H3 As A Neuroblastoma-Associated Molecule That Exerts A Protective Role From An NK Cell-Mediated Lysis (4Ig-B7-H3被鑑定為發揮防止NK細胞介導的裂解作用的神經胚細胞瘤相關分子)，”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)101(34)：12640-12645)。抗原“TES7”(WO 2008/066691)是共有4Ig-B7-H3的特徵的抗原。因此，特異性結合TES7的抗體與4Ig-B7-H3結合。TES7抗原可具有多於一個不同的表位，並且表位可以是線性的。已知幾種抗B7-H3抗體結合非線性表位，包括一些只存在於4Ig-B7-H3同種型上的表位。目前認為和正常組織對應物相比，TES7可被過表現在某些癌細胞中。
激動劑、拮抗劑和其他B7-H3功能調節劑被明確地包括在本發明的範圍內。這些激動劑、拮抗劑和調節劑是包含B7-H3的一個或多個抗原決定基位點、或包含這些位點的一個或多個片段、這些位點的變體或這些位點的模擬肽的多肽。這些激動性、拮抗性和B7-H3調節性化合物以線性或環狀形式提供，並任選地包含至少一個自然界不常見的胺基酸殘基或至少一個醯胺同電子排列體。這些化合物可以是醣化的。
更具體而言，如本文所用的術語“B7-H3調節劑”被定義為如下任何化合物：(1)能夠破壞或阻斷人B7-H3與其天然配體或抗B7-H3抗體之間的相互作用；(2)能夠結合人B7-H3及其天然配體或抗B7-H3抗體；(3)包含可用於產生能夠結合人B7-H3及其天然配體或抗B7-H3抗體的抗體的抗原位點；(4)包含可用於篩選能夠結合人B7-H3及其天然配體或抗B7-H3抗體的抗體的抗原位點；(5)包含可用於產生能夠破壞或阻斷人B7-H3與其天然配體或抗B7-H3抗體之間的相互作用的抗體的抗原位點；(6)包含可用於篩選能夠破壞或阻斷人B7-H3與其天然配體或抗B7-H3抗體之間的相互作用的抗體的抗原位點。B7-H3調節劑可以是“B7-H3激動劑”或“B7-H3拮抗劑”，這分 別取決於其活性是增強T細胞活化還是抑制T細胞活化。
B7-H3激動劑、拮抗劑和調節劑包括B7-H3變體，B7-H3肽拮抗劑，模擬肽和小分子，抗B7-H3抗體和免疫球蛋白變體，包括胺基酸取代、缺失和添加的變體在內的人B7-H3的胺基酸變體，或它們的任何組合，以及嵌合免疫球蛋白。本發明的B7-H3激動劑、拮抗劑和調節劑基於對參加人B7-H3與其天然配體或抗B7-H3抗體的結合的B7-H3區域的鑑定。因此，本發明提供了具有複製或模擬人B7-H3的一個或多個抗B7-H3結合區域的分子結構的B7-H3激動劑、拮抗劑和調節劑。
如本文所用，術語“B7-H3變體”表示人B7-H3的任何胺基酸變體，包括胺基酸的取代、缺失和添加變體，或它們的任何組合。該定義涵蓋了嵌合分子，諸如人B7-H3/非人嵌合體和其他雜合分子。本定義中還包括包含該分子的變體區或雜合區的B7-H3變體分子的任何片段。
如本文所用，“抗體”是如下免疫球蛋白分子：能夠藉由位於免疫球蛋白分子的可變區中的至少一個抗原識別位點特異性結合標靶諸如糖、多核苷酸、脂質、多肽等。如本文所用，該術語不僅涵蓋了完整的多株抗體或單株抗體，還涵蓋其片段(諸如Fab、Fab'、F(ab')2Fv)，單鏈(ScFv)，其突變體，天然存在的變體，包含具有所需特異性的抗原識別位點的抗體部分的融合蛋白，人源化抗體，嵌合抗體，“BiTE®”，“DARTTM”分子和包含所需特異性的抗原識別位點的免疫球蛋白分子的任何其他改變的構型。
術語“BiTE”(雙特異性T細胞銜接物)是指具有兩個抗原結合區域的單多肽鏈分子，這兩個抗原結合區域之一結合T細胞抗原而另一個結合標靶表面上存在的抗原(WO 05/061547；Baeuerle,P等人(2008) “BiTE®：A New Class Of Antibodies That Recruit T Cells(BiTE®：募集T細胞的一類新抗體)，”Drugs of the Future 33：137-147；Bargou，等人2008)“Tumor Regression in Cancer Patients by Very Low Doses of a T Cell-Engaging Antibody(由極低劑量的T細胞連接抗體引起的癌症患者腫瘤消退)，”Science 321：974-977)。
術語“DARTTM”(雙親和力重新靶向試劑)是指包含相締合(尤其是經由共價相互作用)以形成至少兩個表位結合位點的至少兩條多肽鏈的免疫球蛋白分子，該表位結合位點識別相同或不同的表位。DARTTM的每一條多肽鏈包含免疫球蛋白輕鏈可變區和免疫球蛋白重鏈可變區，但是這些區域不相互作用形成表位結合位點。反之，DARTTM多肽鏈之一(例如，第一條)的免疫球蛋白重鏈可變區與不同(例如，第二條)DARTTM多肽鏈的免疫球蛋白輕鏈可變區相互作用形成表位結合位點。類似地，DARTTM多肽鏈之一(例如，第一條)的免疫球蛋白輕鏈可變區與不同(例如，第二條)DARTTM多肽鏈的免疫球蛋白重鏈可變區相互作用形成表位結合位點。DARTTM可以是單特異性的、雙特異性的、三特異性的等等，因此能夠同時結合一個、兩個、三個或更多個不同表位(可以是同一抗原或不同抗原的表位)。DARTTM可以另外是單價的、二價的、三價的、四價的、五價的、六價的等等，因此能夠同時結合一個、兩個、三個、四個、五個、六個或更多個分子。DARTTM的這兩個屬性(即特異性程度和效價)可以被合併以例如產生四價(即能夠結合四組表位)的雙特異性抗體(即能夠結合兩個表位)等等。在PCT公開WO 2006/113665、WO 2008/157379和WO 2010/080538中揭露了DARTTM分子。
術語“單株抗體”是指如下均質的抗體群：其中該單株抗體由參與抗原的選擇性結合的胺基酸(天然存在的和非天然存在的)組成。單株抗體為高特異性的，其針對單個抗原位點。術語“單株抗體””不僅涵蓋完整單株抗體和全長單株抗體，還涵蓋其片段(諸如Fab、Fab'、F(ab')2Fv)，其單鏈(ScFv)，突變體，包含抗體部分的融合蛋白，人源化單株抗體，嵌合單株抗體，以及包含所需特異性和結合抗原能力的抗原識別位點的免疫球蛋白分子的任何其他改變的構型。這並非意在就抗體的來源或製備抗體的方式(例如，藉由融合瘤，噬菌體選擇，重組表現，轉基因動物等等)進行限制。該術語包括在“抗體”的定義之下的完整免疫球蛋白及上述片段等等。
術語“人源化抗體”是指一般使用重組技術製備、具有源自非人物種的免疫球蛋白的抗原結合位點並且該分子剩餘的免疫球蛋白結構是基於人免疫球蛋白的結構及/或序列的嵌合分子。抗原結合位點可包含融合到恆定區域上的完整可變區域或僅包含移植到可變區域的適當構架區上的互補決定區(CDR)。抗原結合位點可以是野生型或者被一種或多種胺基酸取代修飾。這消除了作為人個體中的免疫原的恆定區，但對外來可變區免疫反應的可能性仍然存在(LoBuglio,A.F.等人(1989)“Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man：Kinetics And Immune Response(人中的小鼠/人嵌合單株抗體：動力學和免疫反應)，”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)86：4220-4224)。另一種方法不僅聚焦於提供人源的恆定區，而且也修飾可變區以將它們重塑為盡可能接近人形式。已知重鏈和輕鏈的可變區包含對所討論的抗原作不同反應並確定結合能力的三個互補決定區 (CDR)，在互補決定區側翼是在給定物種中相對保守並且推測提供CDR的支架的四個構架區(FR)。當針對特定抗原製備非人抗體時，可藉由在待修飾的人抗體中存在的FR上移植源自非人抗體的CDR對可變區進行“重塑”或“人源化”。這種方法應用於多種抗體已被以下文獻報道：Sato,K.等人(1993)Cancer Res 53：851-856.Riechmann,L.等人(1988)“Reshaping Human Antibodies for Therapy(重塑人抗體用於治療)，”Nature 332：323-327；Verhoeyen,M.等人(1988)“Reshaping Human Antibodies：Grafting An Antilysozyme Activity(重塑人抗體：移植抗溶菌酶活性)，”Science 239：1534-1536；Kettleborough,C.A.等人(1991)“Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR-Grafting：The Importance Of Framework Residues On Loop Conformation(藉由CDR移植使小鼠單株抗體人源化：環構形上的構架殘基的重要性)，”Protein Engineering 4：773-3783；Maeda,H.等人(1991)“Construction Of Reshaped Human Antibodies With HIV-Neutralizing Activity(具有HIV中和活性的重塑人抗體的建構)，”Human Antibodies Hybridoma 2：124-134；Gorman,S.D.等人(1991)“Reshaping A Therapeutic CD4 Antibody(重塑治療性CD4抗體)，”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)88：4181-4185；Tempest,P.R.等人(1991)“Reshaping A Human Monoclonal Antibody To Inhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection in vivo(重塑人單株抗體以抑制體內人呼吸道合胞病毒感染)，”Bio/Technology 9：266-271；Co,M.S.等人(1991)“Humanized Antibodies For Antiviral Therapy(用於抗病毒治療的人源化抗體)，”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)88：2869-2873；Carter,P.等人(1992)“Humanization Of An Anti-p185her2 Antibody For Human Cancer Therapy(用於人癌症治療的抗p185her2抗體的人源化)，”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)89：4285-4289；和Co,M.S.等人(1992)“Chimeric And Humanized Antibodies With Specificity For The CD33 Antigen(具有對CD33抗原的特異性的嵌合且人源化的抗體)，”J.Immunol.148：1149-1154。在一些實施方案中，人源化抗體保留所有CDR序列(例如，包含來自小鼠抗體的所有六個CDR的人源化小鼠抗體)。在其他實施方案中，人源化抗體具有一個或多個就初始抗體而言被改變的CDR(一個、兩個、三個、四個、五個、六個)，它們也稱為“源自”初始抗體的一個或多個CDR的一個或多個CDR。
如本文所用，抗體或多肽被稱為“特異性”結合另一個分子(即表位)的區域，條件是較之可選的表位，該抗體或多肽更頻繁地、更迅速地、以更大的持續時間及/或以更大的親和力與該表位反應或締合。例如，特異性結合B7-H3表位的抗體是以比它結合其他B7-H3表位或非B7-H3表位更大的親和力、親合力、更迅速地及/或以更大的持續時間結合這種B7-H3表位的抗體。藉由閱讀該定義還應理解，例如，特異性結合第一標靶的抗體(或部分或表位)可以特異性或較佳地結合或者可以不特異性或較佳地結合第二標靶。這樣，“特異的結合”不必要求(儘管它可以包括)排他結合。一般來說，但不一定，提及結合表示“特異的”結合。
如本文所用，提及表位存在或“保留免疫活性”的術語“免疫活性”是指抗體(例如抗B7-H3抗體)在不同條件下結合表位的能力，例如在該表位經歷還原和變性條件後。
不同的生物學功能與抗B7-H3抗體相關，包括但不限於以下 一種或多種：特異性結合B7-H3的能力(特別是在癌細胞表面上表現的B7-H3分子，該癌細胞包括但不限於腎癌細胞、前列腺癌細胞或肺癌細胞)；競爭性抑制已知的抗B7-H3抗體與B7-H3優先結合的能力，包括與原始抗體優先結合的同一B7-H3表位優先結合的能力；在體外或體內結合暴露於活細胞表面上的B7-H3部分的能力；結合暴露於活癌細胞表面上的B7-H3部分的能力，該癌細胞包括但不限於前列腺癌細胞、肺癌細胞或腎癌細胞；遞送化學治療劑到表面上表現B7-H3的癌細胞(諸如腎癌細胞、前列腺癌細胞或肺癌細胞)的能力；及/或遞送治療劑或可檢測標記到表面上表現B7-H3的癌細胞中的能力。如本文所討論的，本發明的多肽(包括抗體)具有這些特徵中的任何一種或多種。
“抗B7-H3等同的抗體”或“抗B7-H3等同的多肽”是指具有與抗B7-H3抗體相關的一種或多種生物學功能諸如例如結合特異性的抗體或多肽。
如本文所用，術語“劑”是指生物學、藥學或化學化合物。非限制性例子包括簡單或複雜的有機或無機分子，肽、蛋白質、寡核苷酸、抗體、抗體衍生物、抗體片段、維生素衍生物、碳水化合物、毒素或化學治療化合物。可以合成多種化合物，例如，小分子和寡聚體(例如，寡肽和寡核苷酸)，以及基於多種核心結構的合成有機化合物。此外，多種自然來源可以提供用於篩選的化合物，諸如植物或動物萃取物以及類似物質。
在本發明的方法中採用的劑可被隨機選擇或者理性地選擇或設計。如本文所用，當選擇一種劑而沒有預先考慮或瞭解參與該分子與其天然結合配偶體或已知抗體的締合的特定胺基酸或其他化學部分時，稱 該劑被隨機選擇。隨機選擇的劑的例子是藉由化學文庫或肽組合文庫的使用和篩選而鑑定的劑。
如本文所用，當選擇一種劑是以非隨機為基礎考慮標靶位點的序列及/或與該劑的作用有關的標靶位點構形時，稱該劑被理性地選擇或設計。就抗B7-H3劑而言，目前認為在B7-H3上存在可針對它們產生抗體的至少三個表位，因此存在阻斷B7-H3/抗B7-H3相互作用的劑的至少三個作用位點。本發明還涵蓋在B7-H3與其天然結合配偶體之間的相互作用位點起作用的劑，但其他配體及其活性B7-H3相互作用位點也被涵蓋在本發明的範圍之內，不論是目前已知的或以後鑑定的。藉由利用組成受體/配體複合物及/或B7-H3/抗B7-H3抗體複合物的接觸位點的肽序列，可理性地選擇或理性地設計劑。例如，理性選擇的肽劑可以是如下肽：其胺基酸序列與B7-H3在天然環境中暴露於活細胞表面上時出現的表位相同。這樣一種劑將如所期望那樣藉由結合抗B7-H3抗體或天然配體來減少或阻斷抗B7-H3抗體與B7-H3的締合或B7-H3與其天然配體的締合。
如本文所用，關於抗體的術語“標記的”旨在涵蓋藉由將可檢測物質諸如放射性劑或螢光團(例如藻紅蛋白(PE)或異硫氰酸螢光素(也稱為螢光素異硫氰酸酯或FITC))與抗體相偶聯(即物理連接)將抗體直接標記，以及藉由可檢出物質的反應性將對探針或抗體間接標記。
如本文所用，關於抗體的術語“締合”包括劑(例如化學治療劑)與該抗體的共價和非共價的附著或結合。抗體可藉由直接結合或借助附著到共同平臺的間接結合而與劑(例如，化學治療劑)締合，這樣使得該抗體指導該劑定位於該抗體結合的癌細胞，並且其中該抗體和劑在生理 學條件下基本不解離，以使得該劑不靶向於該抗體結合的相同癌細胞或者使得該劑的效價不減少。
術語“生物樣品”涵蓋從個體獲得的各種樣品類型並且可以在診斷測定或監測測定中使用。該定義涵蓋唾液、血液和生物起源的其他液體樣品，實體組織樣品諸如活組織檢查樣本或由其衍生的組織培養物或細胞，及其子代，例如獲自從懷疑患有癌症的個體收集的組織樣品的細胞，在較佳的實施方案中為獲自卵巢組織、肺組織、前列腺組織、胰腺組織、結腸組織和乳腺組織的細胞。該定義還包括在獲取後以任何方式操作的樣品，例如藉由用試劑處理、溶解或富集某些成分諸如蛋白或多核苷酸，或者出於制切片目的包埋在半固體基質或固體基質中。術語“生物樣品”涵蓋臨床樣品並且還包括培養中的細胞、細胞上清液、細胞裂解物、血清、血漿、生物流體和組織樣品。
術語“宿主細胞”包括可以為或者已經為用於加入多核苷酸插入物的載體的接受者。宿主細胞包括單個宿主細胞的子代，並且由於天然的、意外的或故意的突變，該子代可不必與原始母體細胞完全相同(在形態學上或在整套基因組DNA上)。宿主細胞包括在體內用本發明的多核苷酸轉染的細胞。
如本文所用，術語“延遲轉移的形成”表示推遲、妨礙、減慢、延緩、穩定及/或擱置轉移的形成。取決於癌症病史及/或所治療的個體，這種延遲可以具有不同的時間長度。如對本領域中具有通常知識者明顯的，足夠的延遲或有意義的延遲可實際上涵蓋預防，因為個體不形成轉移。
如本文所用，在一個實施方案中藥物組合物的“有效量”是足 以實現有益的或期望的效果的量，該有益的或期望的效果包括但不限於如下臨床效果：諸如腫瘤(在癌症上下文中，例如乳腺癌或前列腺癌)的大小縮小，癌細胞生長的延緩，延遲轉移的形成，減少由疾病產生的症狀，提高遭受疾病的患者的生命品質，減少治療疾病所需的其他藥劑的劑量，諸如憑藉靶向及/或內化來增強另一種藥劑的作用，延遲疾病的進展，及/或延長個體的存活。有效量可以一次施用或多次施用。出於本發明的目的，藥物、化合物或藥物組合物的有效量是足以減少癌細胞的增殖(或破壞癌細胞)和足以直接或間接減少及/或延遲癌細胞轉移的形成或生長的量。在一些實施方案中，藥物、化合物或藥物組合物的有效量可以或者可以不與另一種藥物、化合物或藥物組合物一起達成。因此，可以在施用一種或多種化學治療劑的背景下考慮“有效量”，並且如果與一種或多種其他的劑一起可達成令人期望的效果，可以考慮以有效量給予單一的劑。當個體需要改變時，每種成分的有效量的最佳範圍的確定是在本領域的技能之內。典型的劑量包括0.1到100mg/kg體重。較佳的劑量包括1到100mg/kg體重。最佳的劑量包括10到100mg/kg體重。
如本文所用，當核酸分子、劑、抗體、組合物或細胞等等與天然存在於其原始來源中的污染的核酸分子、抗體、劑、組合物或細胞等等基本上分離時，稱該核酸分子或劑、抗體、組合物或細胞等等是“分離的”。
術語“個體”是指脊椎動物，較佳為哺乳動物。哺乳動物包括但不限於人、家畜、運動動物、寵物、靈長類動物、小鼠和大鼠。在最佳的實施方案中，術語個體表示人。
術語“多肽”、“寡肽”、“肽”和“蛋白”在本文可互換使用，是 指任何長度的胺基酸的聚合物。該聚合物可以是線性的或分支的，它可以包含修飾的胺基酸，並且它可以被非胺基酸中斷。這些術語還涵蓋已天然地或藉由介入修飾的胺基酸聚合物；例如，二硫鍵形成、醣化、脂化、乙醯化、磷酸化或任何其他的操作或修飾，諸如與標記成分結合。該定義中還包括例如，包含胺基酸(包括，例如，非天然胺基酸等等)的一種或多種類似物以及本領域已知的其他修飾的多肽。應理解，因為本發明的多肽是以抗體為基礎，所述這些多肽能夠作為單鏈或締合鏈而存在。
在本發明的範圍內還涵蓋本文所述的B7-H3激動劑、拮抗劑和調節劑(包括抗B7-H3抗體)的模擬肽。這些模擬肽包括如下肽：其中至少一個胺基酸殘基被自然界不常見的胺基酸殘基諸如該胺基酸的D異構物或該胺基酸的N-烷基化種類取代。在其他實施方案中，藉由用醯胺同電子排列體取代B7-H3肽激動劑、拮抗劑或調節劑中的至少一個醯胺鍵(-C(=O)-NH-)建構模擬肽。適合的醯胺同電子排列體包括-CH2-NH-、-CH2-S-、-CH2-S(O)-、-CH2-S(O)2-、-CH2-CH2-、-CH=CH-(E型或Z型)、-C(=O)-CH2-、-CH(CN)-NH-、-C(OH)-CH2-以及-O-C(=O)-NH-。為醯胺同電子排列體取代的適合候選物的B7-H3肽激動劑、拮抗劑或調節劑中的醯胺鍵包括B7-H3肽激動劑、拮抗劑或調節劑治療的預定受治療者的內源性酯酶或蛋白酶可水解的鍵。
如本文所用，術語“基本上純的”是指至少50%純(即不含污染物)、更佳至少90%純、更佳至少95%純、更佳至少98%純、更佳至少99%純並且最佳大於99%純的材料。
如本文所用，術語“毒素”是指在細胞內引起不利反應的任何 物質。例如，針對癌細胞的毒素將對該癌細胞具有不利作用，有時為有害作用。毒素的例子包括但不限於：紫杉烷、類美登素(maytansinoid)、阿瑞斯他丁(例如單甲基阿瑞斯他丁(MMAE)、單甲基阿瑞斯他丁F(MMAF)、阿瑞斯他丁E(AE)等等)(諸如那些在美國專利第5,208,020號；第5,416,064號；第6,333,410號；第6,340,701號；第6,372,738號；第6,436,931號；第6,441,163號；第6,596,757號；第7,276,497號；第7,585,857號；或第7,851,432號中揭露的)、卡奇黴素、蒽環類抗生素(例如阿黴素)、CC-1065類似物、多西他賽；組織蛋白酶B或E；蓖麻毒蛋白、白樹毒素、假單胞菌外毒素、白喉毒素和RNA酶；放射標記的抗體(例如，tiuxetan接合的抗體或用毒性放射性同位素(例如90Y、131I、177Lu、186Re、188Re、211At、212Bi、213Bi、225Ac等等)標記的抗體。
如本文所用，術語“治療”或“治療了”表示用於獲得有益或期望的效果的方法，該有益或期望的效果包括並較佳為有益或期望的臨床效果。這些有益或期望的臨床效果包括但不限於以下一種或多種：減少癌細胞或其他病態細胞的增殖(或破壞)，減少癌症中發現的癌細胞的轉移，腫瘤的大小縮小，減少由疾病產生的症狀，提高遭受疾病的患者的生命品質，減少治療疾病所需的其他藥劑的劑量，延遲疾病的進展及/或延長個體的存活。
如本文所述，術語癌症旨在涵蓋以存在選自以下組成的組的癌細胞為特徵的癌症：腎上腺腫瘤、AIDS-相關癌症、軟組織腺泡狀肉瘤、星形細胞瘤、膀胱癌(鱗狀細胞癌和移行細胞癌)、骨癌(釉質瘤、動脈瘤樣骨囊腫、骨軟骨瘤、骨肉瘤)、腦脊髓癌、轉移性腦瘤、乳腺癌、頸動脈 體瘤、子宮頸癌、軟骨肉瘤、脊索瘤、腎嫌色細胞癌、透明細胞癌、結腸癌、結腸直腸癌、皮膚良性纖維組織細胞瘤、促纖維增生性小圓細胞瘤、室管膜瘤、伊文氏腫瘤、骨外粘液樣軟骨肉瘤、不完全性骨纖維生成、骨纖維性結構不良、膽囊或膽管癌、胃癌、妊娠性滋養細胞疾病、生殖細胞瘤、頭頸癌、肝細胞癌、胰島細胞瘤、卡波西氏肉瘤、腎癌(腎胚細胞瘤、乳頭狀腎細胞癌)、白血病、脂瘤/良性脂肪瘤、脂肉瘤/惡性脂肪瘤、肝癌(肝母細胞瘤、肝細胞癌)、淋巴瘤、肺癌、神經管胚細胞瘤、黑色素瘤、腦膜瘤、多發性內分泌腫瘤、多發性骨髓瘤、骨髓增生異常症候群、神經胚細胞瘤、神經內分泌腫瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳頭狀甲狀腺癌、甲狀旁腺腫瘤、兒科癌症、周圍神經鞘瘤、嗜鉻細胞瘤、垂體瘤、前列腺癌、後葡萄膜黑色素瘤、罕見血液疾病、腎轉移癌、橫紋肌樣瘤、橫紋肌肉瘤、肉瘤、皮膚癌、軟組織肉瘤、鱗狀細胞癌、胃癌、滑膜肉瘤、睾丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲狀腺轉移癌和子宮癌(子宮頸癌、子宮內膜癌和平滑肌瘤)的細胞。
III.製備抗體和多肽的方法
製備單株抗體的方法是本領域已知的。可以利用的一種方法是Kohler,G.等人(1975)“Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody Of Predefined Specificity(分泌具有預先確定的特異性的抗體的融合細胞的連續培養)，”Nature 256：495-497的方法或其變更。通常，單株抗體在非人物種諸如小鼠中形成。一般而言，使用小鼠或大鼠進行免疫，但是也可以使用其他動物。藉由用致免疫量的包含人B7-H3的細胞、細胞萃取物或蛋白質製備物免疫小鼠來生產抗體。免疫原可以是但不限於原代細胞、 培養的細胞系、癌細胞、核酸或組織。在一個實施方案中，使用人肺癌細胞。可將用於免疫的細胞例如人睾丸癌或胰腺癌細胞或胃細胞在用作免疫原之前培養一段時間(例如至少24小時)。細胞(例如，人睾丸癌、胃癌或胰腺癌細胞)獨自或與非變性佐劑諸如Ribi一起用作免疫原。一般而言，細胞當用作免疫原時應該保持完整並且較佳為有活力。相較於破裂細胞，完整細胞使抗原更好地被免疫動物檢測。變性佐劑或嚴酷佐劑例如弗氏佐劑的使用可能使細胞破裂並因此是不受鼓勵的。免疫原可以以定期間隔諸如每兩週一次或每週一次被多次施用，或者可以以在動物中保持生活力的方式施用(例如在組織重組體中)。
在一個實施方案中，藉由使用過表現B7-H3作免疫原的宿主細胞獲得結合B7-H3的單株抗體。舉例來說，這些細胞包括而不限於人肺癌細胞和人結腸癌細胞。
為了監測抗體反應，可以從動物中獲得小生物樣品(例如血液)並測試其針對免疫原的抗體力價。可以將脾及/或幾個大淋巴結移除並離解成單細胞。若期望，可以藉由塗敷細胞懸浮液至用抗原塗布的孔盤或孔來篩選脾細胞(在除去非特異性粘附的細胞後)。表現對抗原特異的膜結合免疫球蛋白的B細胞將與孔盤結合，並且不隨剩餘懸浮液一起被沖掉。然後可以將得到的B細胞或所有離解的脾細胞與骨髓瘤細胞(例如，X63-Ag8.653和那些來自SaIk Institute，Cell Distribution Center，San Diego，CA的細胞)相融合。可使用聚乙二醇(PEG)將脾細胞或淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合以形成融合瘤。然後將融合瘤培養在選擇性培養基(例如，次黃嘌呤、胺基蝶呤、胸腺嘧啶核苷培養基，另外稱為“HAT培養基”)中。然後藉 由有限稀釋將得到的融合瘤鋪孔盤，並使用例如FACS(螢光活化細胞分選術)或免疫組織化學(IHC)篩選來分析特異性結合免疫原的抗體的產生。然後在體外(例如，在組織培養瓶或中空纖維反應器中)或在體內(例如，作為小鼠中的腹水)培養選擇的分泌單株抗體的融合瘤。
作為細胞融合技術的另一種替代方案，EB病毒(EBV)不朽化B細胞可用於產生本發明的單株抗體。若期望，可以擴增並次選殖這些融合瘤，並且藉由常規測定程序(例如，FACS、IHC、放射性免疫測定、酶免疫測定、螢光免疫測定等等)測定上清液的抗免疫原活性。
在另一種替代方案中，可以對抗B7-H3單株抗體和任何其他等同的抗體定序，並藉由本領域任何已知手段(例如，人源化、使用轉基因小鼠產生全人抗體、噬菌體展示技術等等)重組地產生。在一個實施方案中，對抗B7-H3單株抗體定序，然後將多核苷酸序列選殖到載體中用於表現或增殖。可以將編碼感興趣的抗體的序列保持在宿主細胞中的載體中，然後可以擴增該宿主細胞並冷凍以供將來使用。
可以將抗B7-H3單株抗體和任何其他等同抗體的多核苷酸序列用於基因操作以產生“人源化”抗體、改善抗體的親和力或其他特徵。抗體人源化的一般原理包括保留抗體的抗原結合部分的基本序列，同時用人抗體序列交換出該抗體的非人剩餘部分。存在四個一般步驟使單株抗體人源化。這些步驟是：(1)確定起始抗體輕鏈和重鏈可變區域的核苷酸和預測的胺基酸序列；(2)設計人源化抗體，即決定在人源化過程中使用哪種抗體構架區；(3)實際的人源化方法/技術；以及(4)人源化抗體的轉染和表現。見，例如，美國專利第4,816,567號；第5,807,715號；第5,866,692號；以及第 6,331,415號。
已描述了許多包含源自非人免疫球蛋白的抗原結合位點的“人源化”抗體分子，包括具有與人恆定區域相融合的齧齒類V區或修飾的齧齒類V區以及它們相關的互補決定區(CDR)的嵌合抗體(見，例如，Winter等人(1991)“Man-made Anditbodies(人造抗體)，”Nature 349：293-299；Lobuglio等人(1989)“Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man：Kinetics And Immune Response(人中的小鼠/人嵌合單株抗體：動力學和免疫反應)，”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)86：4220-4224(1989),Shaw等人(1987)“Characterization Of A Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody(17-1A)To A Colon Cancer Tumor-Associated Antigen(針對結腸癌腫瘤相關抗原的小鼠/人嵌合單株抗體(17-1A)的表徵)，”J.Immunol.138：4534-4538，以及Brown等人(1987)“Tumor-Specific Genetically Engineered Murine/Human Chimeric Monoclonal Antibody(腫瘤特異性基因工程鼠/人嵌合單株抗體)，”Cancer Res.47：3577-3583)。其他參考文獻描述了在與適當的人抗體恆定區域融合之前移植到人支持構架區(FR)中的齧齒類CDR(見，例如，Riechmann,L.等人(1988)“Reshaping Human Antibodies for Therapy(重塑人抗體用於治療)，”Nature 332：323-327；Verhoeyen,M.等人(1988)“Reshaping Human Antibodies：Grafting An Antilysozyme Activity(重塑人抗體：移植抗溶菌酶活性)，”Science 239：1534-1536；以及Jones等人(1986)“Replacing The Complementarity-Determining Regions In A Human Antibody With Those From A Mouse(用小鼠互補決定區取代人抗體中的互補決定區)，”Nature 321：522-525)。另一篇參考文獻描述了由重組鑲飾的齧齒類構架區支 持的齧齒類CDR。見，例如，歐洲專利公開第519,596號。這些“人源化”分子被設計成使不想要的針對齧齒類抗人抗體分子的免疫反應最小化，該免疫反應限制了這些部分在人接受者中的治療應用的持續時間和功效。以下參考文獻揭露了還可以利用的使抗體人源化的其他方法：Daugherty等人(1991)“Polymerase Chain Reaction Facilitates The Cloning,CDR-Grafting,And Rapid Expression Of A Murine Monoclonal Antibody Directed Against The CD18 Component Of Leukocyte Integrins(聚合酶連鎖反應促進針對白細胞整合素的CD18成分的鼠單株抗體的選殖、CDR移植以及快速表現)，”Nucl.Acids Res.19：2471-2476以及在美國專利第6,180,377號；第6,054,297號；第5,997,867號；以及第5,866,692號。
本發明還涵蓋了本發明的抗體諸如mu-抗B7-H3的單鏈可變區片段(“scFv”)。藉由使用短連接肽連接輕鏈及/或重鏈可變區，製備了單鏈可變區片段。Bird等人(1988)(“Single-Chain Antigen-Binding Proteins(單鏈抗原結合蛋白)，”Science 242：423-426)描述了在一個可變區的羧基端與另一個可變區的胺基端之間橋連大概3.5nm的連接肽的例子。已設計並使用了其他序列的連接子(Bird等人(1988)“Single-Chain Antigen-Binding Proteins(單鏈抗原結合蛋白)，”Science 242：423-426)。進而可以修飾連接子用於另外的功能，諸如藥物的連接或連接到固體支持體。單鏈變體可以藉由重組或合成而產生。對於scFv的合成產生而言，可以使用自動化合成儀。對於scFv的重組產生，可以將包含編碼scFv的多核苷酸的適合質體引入適合的真核或原核宿主細胞中，該真核宿主細胞諸如酵母、植物、昆蟲或哺乳動物細胞，該原核宿主細胞諸如大腸桿菌(E.coli)。可藉由常規操作諸 如多核苷酸的連接來製備編碼感興趣的scFv的多核苷酸。得到的scFv可使用本領域已知的標準蛋白質純化技術分離。
本發明包括針對與B7-H3及其激動劑、拮抗劑和調節劑結合的抗體和多肽的修飾，該抗體和多肽包括不顯著影響其特性的功能上等同的抗體和多肽以及具有增強或減少的活性的變體。多肽的修飾是本領域中的常規實踐並且不需要在本文中詳細描述。修飾的多肽的例子包括具有不顯著有害地改變功能活性的胺基酸殘基的保守取代、胺基酸的一種或多種缺失或添加或使用化學類似物的多肽。可以用另一種胺基酸殘基保守取代的胺基酸殘基包括但不限於：甘胺酸/丙胺酸；纈胺酸/異亮胺酸/亮胺酸；天冬醯胺/麩醯胺；天冬胺酸/麩胺酸；絲胺酸/蘇胺酸；賴胺酸/精胺酸；以及苯丙胺酸/酪胺酸。這些多肽還包括醣化和非醣化的多肽以及具有其他翻譯後修飾的多肽，諸如，例如，不同糖的醣化，乙醯化和磷酸化。較佳地，胺基酸取代是保守的，即取代的胺基酸將擁有與原始胺基酸相似的化學特性。這些保守取代是本領域已知的，並且在以上提供了例子。胺基酸修飾的範圍可以是從改變或修飾一個或多個胺基酸到諸如可變區的區域的完全重新設計。可變區中的變化能夠改變結合親和力及/或特異性。其他修飾方法包括使用本領域已知的偶聯技術，包括但不限於酶手段、氧化取代和螯合作用。修飾可用於例如，免疫測定的標記的連接，諸如用於放射性免疫測定的放射性部分的連接。使用本領域已建立的程序製備修飾的多肽並且可使用本領域已知的標準測定篩選它們。
本發明還涵蓋了包含來自本發明的多肽和抗體的一個或多個片段或區域的融合蛋白。在一個實施方案中，提供了包含可變輕鏈區的 至少10個連續胺基酸和可變重鏈區的至少10個胺基酸的融合多肽。在另一個實施方案中，融合多肽包含異源免疫球蛋白恆定區。在另一個實施方案中，融合多肽包含由公開寄存的融合瘤產生的抗體的輕鏈可變區和重鏈可變區。出於本發明的目的，抗體融合蛋白包含特異性結合B7-H3的一個或多個多肽區域和在天然分子中不與其相連的另一種胺基酸序列，例如來自另一區域的異源序列或同源序列。
抗B7-H3多肽及其他B7-H3激動劑、拮抗劑和調節劑可以藉由本領域已知的方法產生，例如藉由合成或重組。一種產生B7-H3肽激動劑、拮抗劑和調節劑的方法包括多肽的化學合成，接著在適合於獲得天然構形(即正確的二硫鍵連接)的氧化條件下處理。這還可以使用本領域中具有通常知識者已知的方法完成(見，例如Kelley,R.F.等人(1990)在：GENETIC ENGINEERING PRINCIPLES AND METHODS(基因工程原理和方法)，Setlow,J.K.編，Plenum Press,N.Y.，卷12，第1-19頁；Stewart,J.M等人(1984)SOLID PHASE PEPTIDE SYNTHESIS(固相肽合成)，Pierce Chemical Co.,Rockford,IL；還見美國專利第4,105,603號；第3,972,859號；第3,842,067號；和第3,862,925號)。
本發明的多肽可以使用固相肽合成便利地製備(Merrifield,B.(1986)“Solid Phase Synthesis(固相合成)，”Science 232(4748)：341-347；Houghten,R.A.(1985)“General Method For The Rapid Solid-Phase Synthesis Of Large Numbers Of Peptides:Specificity Of Antigen-Antibody Interaction At The Level Of Individual Amino Acids(快速固相合成大量肽的一般方法：在個體胺基酸等級抗原-抗體相互作用的特異性)，”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.) 82(15)：5131-5135；Ganesan,A.(2006)“Solid-Phase Synthesis In The Twenty-First Century(二十一世紀的固相合成)，”Mini Rev.Med.Chem.6(1)：3-10)。
在仍另一個替代方案中，全人抗體可以藉由使用已被工程化來表現特異性人免疫球蛋白的商購小鼠獲得。被設計為產生更令人期望的(例如全人抗體)或更強健的免疫反應的轉基因動物也可以用於產生人源化抗體或人抗體。這種技術的例子是XENOMOUSETM(Abgenix,Inc.,Fremont,CA)和HUMAB-MOUSE®以及TC MOUSETM(都來自Medarex,Inc.,Princeton,NJ)。
在一個替代方案中，可以使用本領域已知的任何方法藉由重組方式製備並表現抗體。抗體可以用如下方式重組地製備：首先分離由宿主動物製備的抗體，獲得基因序列並使用該基因序列在宿主細胞(例如CHO細胞)中重組地表現抗體。可利用的另一種方法是在植物(例如煙草)或轉基因乳中表現抗體序列。已揭露了用於在植物或乳中重組地表現抗體的適合方法(見，例如，Peeters等人(2001)“Production Of Antibodies And Antibody Fragments In Plants(抗體和抗體片段在植物中的產生)，”Vaccine 19：2756；Lonberg,N.等人(1995)“Human Antibodies From Transgenic Mice(來自轉基因小鼠的人抗體)，”Int.Rev.Immunol 13：65-93；以及Pollock等人(1999)“Transgenic Milk As A Method For The Production Of Recombinant Antibodies(作為生產重組抗體方法的轉基因乳)，”J.Immunol Methods 231：147-157)。用於製備抗體衍生物例如人源化抗體、單鏈抗體等等的適合方法是本領域已知的。在另一個替代方案中，抗體可藉由噬菌體展示技術 重組地製備(見，例如，美國專利第5,565,332號；第5,580,717號；第5,733,743號；第6,265,150號；以及Winter,G.等人(1994)“Making Antibodies By Phage Display Technology(藉由噬菌體展示技術製備抗體)，”Annu.Rev.Immunol.12.433-455)。
感興趣的抗體或蛋白可以進行本領域中具有通常知識者已知的埃德曼降解法定序。由質譜或埃德曼降解產生的肽資訊可用於設計用來選殖感興趣的蛋白的探針或引子。
選殖感興趣的蛋白的另一種替代方法是使用純化的B7-H3或其部分“淘選”表現感興趣的抗體或蛋白的細胞。B7-H3以“2Ig”形式和“4Ig”形式存在。人B7-H3的“2Ig”形式的胺基酸序列是(SEQ ID NO：1)：
編碼人B7-H3的“2Ig”形式的cDNA序列是(SEQ ID NO：2)：
人B7-H3的“2Ig”形式的胺基酸序列(SEQ ID NO：1)(下麵以粗體和下劃線顯示)完全包括在人B7-H3的“4Ig”形式(SEQ ID NO：76)內：
編碼人B7-H3的“4Ig”形式的cDNA序列是(SEQ ID NO：77)；編碼B&-H3的“2Ig”形式的殘基以粗體和下劃線顯示：
“淘選”程序可用如下方式進行：從表現B7-H3的組織或細胞中獲得cDNA文庫，在第二種細胞類型中過表現該cDNA，並篩選該第二種細胞類型的轉染細胞與B7-H3的特異性結合。本領域中可見對藉由“淘選”選殖編碼細胞表面蛋白的哺乳動物基因中使用的方法的詳細描述(見，例如，Aruffo,A.等人(1987)“Molecular Cloning Of A CD28 cDNA By A High-Efficiency COS Cell Expression System(藉由高效率COS細胞表現系統對CD28 cDNA的分子選殖)，”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)84：8573-8577和Stephan,J.等人(1999)“Selective Cloning Of Cell Surface Proteins Involved In Organ Development：Epithelial Glycoprotein Is Involved In Normal Epithelial Differentiation(參與器官發育的細胞表面蛋白的選擇性選殖：上皮醣蛋白參與正常上皮分化)，”Endocrinol.140：5841-5854)。
編碼抗B7-H3抗體及其他B7-H3肽激動劑、拮抗劑和調節劑的cDNA可以根據本領域的標準方法藉由將來自特定細胞類型的mRNA反轉錄而獲得。確切地說，mRNA可使用多種裂解酶或化學溶液根據Sambrook等人，同上所述程序分離或藉由商購核酸結合樹脂遵照由製造商(例如，Qiagen,Invitrogen,Promega)提供的附屬說明書萃取。然後將合成的cDNA引入表現載體中以在第二種類型的細胞中生產感興趣的抗體或蛋白。據暗示表現載體必須是作為離合染色小體或作為染色體DNA的整合部分而在宿 主細胞中可複製。適合的表現載體包括但不限於質體，包括腺病毒、腺伴隨病毒、逆轉錄病毒在內的病毒載體，以及黏粒。
可以藉由大量適合的手段中的任何一種將包含感興趣的多核苷酸的載體引入宿主細胞中，該手段包括：電穿孔、利用氯化鈣、氯化銣、磷酸鈣、DEAE-葡聚糖或其他物質的轉染；微粒轟擊；脂質轉染；以及感染(例如，其中載體為感染劑諸如牛痘苗病毒)。引入的載體或多核苷酸的選擇將通常取決於宿主細胞的特徵。
為了分離編碼感興趣的抗體、多肽或蛋白的基因的目的，可使用能夠過表現異源DNA的任何宿主細胞。適合的哺乳動物宿主細胞的非限制性例子包括但不限於COS、HeLa和CHO細胞。較佳地，宿主細胞以比宿主細胞中對應的感興趣的內源性抗體或蛋白(若存在的話)的cDNA高大約5倍、更佳地高10倍、甚至更佳地高20倍的等級表現cDNA。藉由免疫測定或FACS對宿主細胞與B7-H3的特異性結合進行篩選。可以鑑定過表現感興趣的抗體或蛋白的細胞。
現在可用於產生突變體B7-H3肽激動劑、拮抗劑和調節劑的多種技術也是可用的，該突變體B7-H3肽激動劑、拮抗劑和調節劑較之母體B7-H3肽激動劑、拮抗劑或調節劑分子編碼所得蛋白的胺基酸序列的添加、缺失或改變。
本發明包括包含本發明的抗體的胺基酸序列的多肽。本發明的多肽可以藉由本領域已知的程序來製備。這些多肽可以藉由對抗體的蛋白水解或其他降解法、藉由上述重組方法(即，單個多肽或融合多肽)或藉由化學合成來產生。藉由化學合成便利地製備這些抗體的多肽尤其是多 達大約50個胺基酸的較短多肽。化學合成的方法是本領域已知的並且是可商購的。例如，抗B7-H3多肽可藉由自動化多肽合成儀利用固相方法來產生。
IV.用於篩選多肽和單株抗體的方法
幾種方法可用於篩選結合B7-H3的多肽和單株抗體。應理解“結合”是指生物學或免疫學相關的特異性結合，而不是指在例如免疫球蛋白以非常高的濃度使用時針對非特異性標靶可發生的非特異性結合。在一個實施方案中，使用標準篩選技術篩選單株抗體與B7-H3的結合。以這種方式，獲得了抗B7-H3單株抗體。本發明的較佳的融合瘤是那些生產抗體BRCA69D、BRCA84D或PRCA157的融合瘤。
可以鑑定與B7-H3結合的其他單株抗體。為此目的，篩選單株抗體與癌組織結合但不與非癌細胞結合的差別能力。在一個實施方案中，選擇如下單株抗體：與B7-H3結合並且也與人癌細胞或組織交叉反應，但不與正常細胞或組織在相同程度上交叉反應。可用於篩選的一種方法是免疫組織化學(IHC)。標準免疫組織化學技術是本領域的一般技能技術人員已知的。見，例如，ANIMAL CELLCULTURE METHODS(動物細胞培養方法)(J.P.Mather和D.Barnes，編，Academic Press,NY，卷57,18和19章，第314-350頁，1998)。生物樣品(例如組織)可以從活組織檢查、屍體解剖或屍體剖檢獲得。為了查明是否B7-H3只存在於癌細胞上，可用抗B7-H3抗體檢測來自患有癌症的個體的組織上B7-H3的存在，而用來自遭受癌症的個體的其他非癌組織或來自沒有癌症的個體的組織作為對照。將組織包埋在防止在冷凍期間損壞的固體或半固體物質(例如，瓊脂糖凝膠或OCT)中，然後制切片用於染色。不同器官和不同等級的癌症可用於篩選單株抗體。 可用於篩選目的的組織的例子包括但不限於：卵巢、乳腺、肺、前列腺、結腸、腎、皮膚、甲狀腺、腦、心臟、肝、胃、神經、血管、骨、上消化道和胰腺。可用於篩選目的的不同癌症類型的例子包括但不限於：癌、腺癌、肉瘤、腺肉瘤、淋巴瘤和白血病。
在仍另一個替代方案中，諸如以下的癌細胞系及其對應組織的正常細胞可用於篩選對癌組織特異的單株抗體：HMEC(BioWhittaker CC-2251)、HUVEC(原代內皮細胞)、BT-474(ATCC# HTB-20)、MCF7(ATCC# HTB22)、MDA-MB-175-VII(ATCC# HB-25)、MDA-MB-361(ATCC# HB-27)、SKBR3(ATCC# HTB-30)、A549(ATCC# CCL-185)、Calu-3(ATCC# HTB-55)、SKMES-I(ATCC# HTB-58)、ES-2(ATCC# CRL-1978)、SKOV3(ATCC# HTB-77)、Panc-1(ATCC# CRL-1469)、AsPC-I(ATCC# CRL-1682)、HPAF-II(ATCC# CRL-1997)、Hs700T(ATCC# HTB-174)、Colo205(ATCC# CCL-222)、HT-29(ATCC# HTB-38)、SW480(ATCC# CCL-228)、SW948(ATCC# CCL-237)、293(ATCC # CRL-1573)、786-O(ATCC# CRL-1932)、A498(ATCC# HTB-44)、Caki-2(ATCC# HTB-47)、COS-7(ATCC# CRL-1651)、RL-65(ATCC # CRL-10345)、SV-T2(ATCC# CCL-163.1)、22RV1(ATCC# CRL-2505)、DU145(ATCC# HTB-81)、LNCaP(ATCC# CRL-1740)、PC-3(ATCC# CRL-1435)、HT29(ATCC# HTB-38)、Hs746T(ATCC# HTB-135)、NCI-N87(ATCC# CRL-5822)。源自包括但不限於以下的不同器官的正常組織的原代或低傳代細胞培養物可用作陰性對照：腎、卵巢、乳腺、肺、前列腺、結腸、腎、皮膚、甲狀腺、主動脈平滑肌和內皮細胞。癌細胞或非癌細胞能夠在玻璃載玻片或蓋玻片或在塑料 表面上生長，或者在如WO 01/43869中所述的CellArrayTM裝置中製備，並且如以上對於組織而言使用IHC篩選其對抗體的結合。可選地，可使用非蛋白質水解手段將細胞從生長表面上移除並將其離心旋轉成塊狀沉澱(pellet)，然後將其包埋並作為組織處理用於上述IHC分析。可以將細胞接種到免疫缺陷動物中，允許腫瘤生長，然後可收穫這種腫瘤並將其用作IHC分析的組織來源。在另一個替代方案中，可藉由如下方式篩選單細胞：與一抗、連接至螢光分子的第二“報告”抗體一起溫育，然後使用螢光活化細胞分選(FACS)機分析。
可以利用幾種不同的檢測系統中的任何檢測系統來檢測抗體與組織切片的結合。通常，免疫組織化學包括一抗與組織的結合，然後產生具有針對一抗種類的免疫反應性的二抗並將此二抗與可檢測標記(例如，辣根過氧化酶HRP或二胺基聯苯胺DAB)接合。可以使用的一個替代方法是多株鏡像互補抗體或polyMICATM(多株鏡像互補抗體；The Binding Site Limited,Birmingham,UK；Mangham,D.C.等人(1999)“A Novel Immunohistochemical Detection System Using Mirror Image Complementary Antibodies(MICA)(使用鏡像互補抗體(MICA)的新穎免疫組織化學檢測系統)，”Histopathology 35(2)：129-33)。PoIyMICATM技術可用於測試一抗(例如抗B7-H3抗體)與正常組織和癌組織的結合。幾類polyMICATM檢測套組是可商購的：產品編號HK004.D是使用DAB發色團的polyMICATM檢測套組；產品編號HK004.A是使用AEC發色團的polyMICATM檢測套組。可選地，可以用可檢測標記直接標記一抗。
在IHC篩選中選擇適當抗體的第一步是小鼠中產生的一抗 (例如抗B7-H3抗體)與一種或多種免疫原(例如，細胞或組織樣品)的結合。在一個實施方案中，組織樣品是來自不同器官的冷凍組織的切片。細胞或組織樣品可以是癌性或非癌性的。
冷凍組織可以被製備、固定或不固定下制切片並藉由熟悉本領域中具有通常知識者已知的許多方法中的任何一種進行IHC(見，例如，Stephan等人(1999)“Distribution And Function Of The Adhesion Molecule BEN During Rat Development(大鼠發育過程中粘附分子BEN的分佈和功能)，”Dev.Biol.212：264-277以及Stephan等人(1999)“Selective Cloning Of Cell Surface Proteins Involved In Organ Development：Epithelial Glycoprotein Is Involved In Normal Epithelial Differentiation(參與器官發育的細胞表面蛋白的選擇性選殖：上皮醣蛋白參與正常上皮分化)，”Endocrinology 140：5841-5854)。
V.表徵抗B7-H3抗體的方法
可使用幾種方法中的任何一種來表徵抗B7-H3抗體。一種方法是鑑定它結合的表位。表位定位可從幾種來源商購，例如，Pepscan Systems(Lelystad，The Netherlands)。表位定位可用於確定抗B7-H3抗體結合的序列。表位可是線性表位，即包含在單一段胺基酸序列，或者是由可不必被包含在單一段序列中的胺基酸的三維相互作用所形成的構形表位。
可以分離或合成(例如重組方式)具有不同長度(例如，較佳至少4-6個胺基酸長)的肽並將其用於與抗B7-H3抗體的結合測定。抗B7-H3抗體結合的表位可以在系統篩選中藉由如下方式確定：使用源自細胞外序列的重疊肽並藉由抗B7-H3抗體來確定結合。
還有另一種可用於表徵抗B7-H3抗體的方法是使用競爭測定法，該方法用已知結合相同抗原即B7-H3的其他抗體來確定是否抗B7-H3 抗體與其他抗體結合相同的表位。B7-H3的可商購抗體的例子是可用的並且可使用本文教導的結合測定法來鑑定。競爭測定法是本領域中具有通常知識者已知的，並且這些程序和說明資料被進一步詳述在實施例中。抗B7-H3抗體還可以藉由它們所結合的組織、癌症類型或腫瘤類型來表徵。
表徵抗B7-H3抗體的另一種方法是藉由它所結合的抗原。在西方轉漬法中與來自多種人癌症的細胞裂解物一起使用抗B7-H3抗體。如本領域中具有通常知識者已知的，西方轉漬法可包括在變性凝膠和非變性凝膠上電泳細胞裂解物及/或細胞溶解物，將蛋白轉移至硝酸纖維素紙，然後用抗體(例如抗B7-H3抗體)探測該轉漬，看哪些蛋白被該抗體結合。B7-H3與不同組織的多種人癌症相關，該組織包括但不限於結腸、乳腺、卵巢、胰腺和肺。
VI.使用抗B7-H3抗體和B7-H3調節劑診斷癌症的方法
出於診斷目的，藉由本文揭露的方法製備的針對B7-H3的單株抗體可用於鑑定多種組織中癌細胞的存在或不存在，該組織包括但不限於：卵巢、乳腺、肺、前列腺、結腸、腎、胰腺、皮膚、甲狀腺、腦、心臟、肝、胃、神經、血管、骨和上消化道。藉由本文揭露的方法製備的針對B7-H3的單株抗體還可以用於鑑定從實體瘤中釋放後在血液中循環的癌細胞的存在或不存在，或其等級。這種循環抗原可以是完整的B7-H3抗原或保留了根據本文教導的方法得到檢測的能力的B7-H3片段。這種檢測可以藉由FACS分析使用本領域常用的標準方法進行。
這些用途可包括在B7-H3與特異性結合B7-H3的抗體之間形成複合物。這些抗體的例子包括但不限於那些藉由融合瘤BRCA84D、 BRCA69D和PRCA157產生的抗B7-H3單株抗體。這種複合物的形成可以在體外或體內。不受理論束縛，單株抗體抗B7-H3可以經由B7-H3的胞外區域結合B7-H3，然後可以被內化。
在本發明的診斷方法的較佳實施方案中，抗體帶有可檢測標記。可以使用的標記的例子包括放射性劑或螢光團，諸如藻紅蛋白或異硫氰酸螢光素(也稱為螢光素異硫氰酸酯或FITC)。
如同為了診斷和治療目的商業使用的其他已知抗體一樣，本發明的標靶抗原廣泛表現在正常組織中。它也在一些腫瘤中被上調。因此，用於診斷或治療劑的本發明的抗體的具體劑量和遞送途徑將根據目前的具體腫瘤或疾病狀態、以及要治療的具體個體定製。
使用這些抗體來診斷的一種方法是藉由如下方式的體內腫瘤成像：將該抗體連接至放射性劑或不透射線的劑，將該抗體施用至個體並且使用x射線或其他成像機以使該標記抗體在表現該抗原的癌細胞表面的定位顯像。該抗體以在生理條件下促進結合的濃度施用。
用於檢測B7-H3的體外技術在本領域為常規的技術並且包括酵素連結免疫吸附分析法(ELISA)、免疫沉澱、免疫螢光、酵素免疫分析法(EIA)、放射性免疫分析法(RIA)和西方轉漬分析。
在本發明的各方面中，腫瘤或贅瘤的放射性成像方法或測量放射性標記抗體治療方法的功效的方法包括遵照本發明的實踐向個體施用放射標記的腫瘤特異性抗體的步驟。放射性標記抗體可以是包含放射性標記的單株抗體或多株抗體，該放射性標記較佳地選自由以下組成的群組：鍀-99m、銦-111、碘-131、錸-186、錸-188、釤-153、鑥-177、銅-64、鈧-47、 釔-90。用治療性放射性核素諸如碘-131、錸-188、鈥-166、釤-153和鈧-47標記的單株抗體是特別佳的，該治療性放射性核素不損害抗體的免疫反應性並且在體內不被分解。本領域中具有通常知識者將理解，其他放射性同位素是已知的並且可能適合於具體應用。可使用單光子放射電腦斷層掃描(SPECT)、正電子放射斷層掃描(PET)、電腦斷層掃描(CT)或核磁共振成像(MRI)進行放射性成像。還考慮允許對藉由放射性免疫顯像定位的轉移位置的更大解剖學確定的相關成像。
換言之，藉由本領域已知的方法將癌細胞移除並且製備組織用於免疫組織化學(例如，包埋在冷凍化合物中，冷凍並且在固定或不固定下切片；用或不用多種抗原修復進行固定和石蠟包埋，以及複染)。單株抗體也可以用於鑑定不同發育階段的癌細胞。這些抗體還可以用於確定哪些個體的腫瘤在其表面上以預定等級表現抗原並且因此是使用針對該抗原的抗體的免疫治療的候選者。這些抗體可識別表現B7-H3的原發癌和轉移癌。如本文所用，檢測可包括定性檢測及/或定量檢測並且可以包括將所測量的等級與正常細胞進行比較，在癌細胞中B7-H3的表現等級升高。
本發明還提供了使用結合B7-H3的任何抗體輔助診斷個體中以表現B7-H3的癌細胞為特徵的癌症的方法，以及可用於確定B7-H3表現等級的任何其他方法。如本文所用，用於“輔助診斷”的方法表示這些方法幫助作出有關癌症的分類或性質的臨床決定，並且對於明確的診斷而言可能是或可能不是結論性的。因此，癌症的輔助診斷的方法可包括在來自個體的生物樣品中檢測B7-H3等級及/或在該樣品中確定B7-H3表現等級的步驟。也可以使用識別抗原或其部分的抗體來創建診斷性免疫測定法用於檢 測體液中從癌症活細胞或瀕死癌症細胞中釋放或分泌的抗原，該體液包括但不限於血液、唾液、尿、肺液或腹水液。
並非在感興趣的特定腫瘤中的所有細胞都將表現B7-H3，並且其他組織中的癌細胞可以表現B7-H3，因此應該篩選個體中在癌細胞上存在或不存在B7-H3以確定該個體中免疫治療的有用性。藉由本文揭露的方法製備的抗B7-H3抗體可用於確定是否可以認為被診斷患有癌症的個體是使用針對B7-H3的抗體的免疫治療的候選者。在一個實施方案中，可使用針對B7-H3的抗體測試癌腫瘤或活組織檢查樣品的B7-H3表現。具有表現B7-H3的癌細胞的個體是使用針對B7-H3的抗體的免疫治療的適合候選者。用抗B7-H3抗體染色也可以用於區別癌組織與正常組織。
出於診斷目的使用抗B7-H3抗體的方法可用於任何形式的抗癌治療例如化學治療或放射治療之前和之後，以確定哪些腫瘤最可能反應於給定的治療、患有癌症的個體的預後、腫瘤亞型或轉移性疾病的起源、以及疾病的進展或對治療的反應。
本發明的組合物也適合於使用應用於其他病態(非癌性)細胞的以上總體描述的方法來診斷不是癌症的疾病狀態。適合用於本發明的方法中的疾病狀態包括但不限於：與個體中的發炎反應或自體免疫反應有關的疾病或失調。上述方法可用於調節個體中的發炎反應或自體免疫反應。可使用本發明的組合物和方法進行診斷及/或治療的由炎症和自體免疫失調產生的疾病和病症包括例如但不限於：多發性硬化症、腦膜炎、腦炎、中風、其他腦創傷、包括潰瘍性結腸炎和克羅恩病在內的炎性腸病、重症肌無力、狼瘡、風濕性關節炎、哮喘、急性幼發型糖尿病、AIDS癡呆、動 脈硬化、腎炎、視網膜炎、異位性皮膚炎、牛皮鮮、心肌缺血以及急性白細胞介導的肺損傷。
本發明的抗體和其他治療劑的診斷及/或治療用途的其他適應症還包括施用至處於器官排斥或移植排斥風險下的個體。近年來在用於移植組織和器官諸如皮膚、腎、肝、心臟、肺、胰腺和骨髓的手術技術的效力上存在相當大的改善。或許主要的突出問題是缺乏用於在接受者中誘導針對移植的同種異體移植物或器官的免疫耐受的令人滿意的劑。當同種異體細胞或器官被移植到宿主(即供者和受者是來自同一物種的不同個體)中時，宿主免疫系統可能發動針對移植物中的外來抗原的免疫反應(宿主抗移植物病)，導致所移植的組織的破壞。
在本申請案中任何地方描述的抗B7-H3抗體的用途也涵蓋本文所述的其他B7-H3激動劑、拮抗劑和調節劑的用途。在這些實施方案中，在所述步驟中用B7-H3激動劑、拮抗劑或其他非抗體調節劑代替B7-H3抗體，並且作出普通執業者範圍內的變更以使該方法適合於取代的B7-H3調節性組合物。
藉由本文揭露的方法製備的針對B7-H3的單株抗體可用於鑑定各種組織中存在或不存在人癌症幹細胞。已假設癌症幹細胞(CSC)在腫瘤的生長和轉移中起作用(Ghotra,V.P.等人(2009)“The Cancer Stem Cell Microenvironment And Anti-Cancer Therapy(癌症幹細胞微環境和抗癌治療)，”Int.J.Radiat.Biol.85(11)：955-962；Gupta,P.B.等人(2009)“Cancer Stem Cells：Mirage Or Reality？(癌症幹細胞：是幻景還是現實？)”Nat.Med.15(9)：1010-1012；Lawson,J.C.等人(2009)“Cancer Stem Cells In Breast Cancer And Metastasis(在乳腺癌和轉移中的癌症幹細胞)，”Breast Cancer Res.Treat.118(2)：241-254；Hermann,P.C.等人(2009)“Pancreatic Cancer Stem Cells--Insights And Perspectives(胰腺癌幹細胞-見解和觀點)，”Expert Opin.Biol.Ther.9(10)：1271-1278；Schatton,T.等人(2009)“Identification And Targeting Of Cancer Stem Cells(癌症幹細胞的鑑定和靶向)，”Bioessays 31(10)：1038-1049；Mittal,S.等人(2009)“Cancer Stem Cells：The Other Face Of Janus(癌症幹細胞：雙面神的另一面)，”Amer.J.Med.Sci.338(2)：107-112；Alison,M.R.等人(2009)“Stem Cells And Lung Cancer：Future Therapeutic Targets？(幹細胞和肺癌：未來治療標靶？)”Expert Opin.Biol.Ther.9(9)：1127-1141；Charafe-Jauffret,E.等人(2009)“Breast Cancer Stem Cells：Tools And Models To Rely On(乳腺癌幹細胞：依賴的工具和模型)，”BMC Cancer 9：202；Scopelliti,A.等人(2009)“Therapeutic Implications Of Cancer Initiating Cells(癌症啟動細胞的治療啟示)，”Expert Opin.Biol.Ther.9(8)：1005-1016；PCT公開WO 2008/091908)。在這個假設下，CSC在每種腫瘤內提供了能夠無限自我更新並能夠發育成複製能力相對受限的更加成熟的腫瘤細胞的不同的細胞小亞群。已假設這些癌症幹細胞可能對化學治療劑、放射條件或其他毒性條件具有更大抵抗力，並因此在臨床治療後繼續存在，隨後長成繼發性腫瘤、轉移或導致復發。已提出CSC能夠由‘正常的’組織幹細胞或由更為分化的組織祖細胞產生。
人癌症幹細胞具有幾種確定的特徵。這些特徵被描述於PCT公開WO 2008/091908中並由此藉由引用併入。針對癌症幹細胞上的細胞表面標靶的單株抗體可用於鑑定在各種組織中存在或不存在癌症幹細胞。藉 由本文揭露的方法製備的針對B7-H3的單株抗體還可以用於鑑定存在或不存在癌症幹細胞，或癌症幹細胞在樣品或組織中的等級或癌症幹細胞在其從實體瘤中釋放後在循環中的等級。這種循環抗原可以是完整的B7-H3抗原或保留了根據本文教導的方法得到檢測的能力的B7-H3片段。這種檢測可以藉由FACS分析使用本領域常用的標準方法進行。在另一個實施方案中，這種檢測可使用本領域常用的標準方法藉由對組織樣品的免疫組織化學分析進行。
這些用途可以包括在B7-H3與特異性結合癌症幹細胞上的B7-H3的抗體之間形成複合物。這些抗體的例子包括但不限於那些藉由融合瘤BRCA84D、BRCA69D和PRCA157產生的抗B7-H3單株抗體。這種複合物的形成可以在體外或體內。列舉抗B7-H3抗體的用途的本申請案中所述的用途還涵蓋用於鑑定和治療癌症幹細胞的用途的本文所述的其他B7-H3激動劑、拮抗劑和調節劑的用途。在這些實施方案中，抗B7-H3抗體和其他B7-H3激動劑、拮抗劑和調節劑用於使用所述的類似方法對癌症幹細胞進行鑑定、診斷或治療性治療，並且作出一般執業者的範圍內的變更以使該方法適合於癌症幹細胞的鑑定/診斷或治療。
VII.本發明的較佳組合物
本發明涵蓋了組合物，包括藥物組合物，該組合物包含抗B7-H3抗體、源自抗B7-H3抗體的多肽、包含編碼抗B7-H3抗體的序列的多核苷酸和如本文所述的其他的劑。如本文所述，組合物還包含結合B7-H3、B7-H3激動劑、拮抗劑、調節劑的一種或多種抗體、多肽及/或蛋白，及/或包含編碼結合B7-H3的一種或多種抗體、多肽和蛋白的序列的一種或多種多 核苷酸。
本發明還提供了任何B7-H3肽的激動劑、拮抗劑或調節劑與支持特定B7-H3肽的激動劑、拮抗劑或調節劑的預定功能的另外的化學結構的接合物。
這些接合物包括與大分子諸如在本文討論的診斷、篩選或純化程序中使用的任何不溶的固體支持體基質共價連接的B7-H3肽激動劑、拮抗劑或調節劑。適合的基質材料包括化學惰性、具有高孔隙率並且具有大量能夠與肽配體形成共價連接的官能團的任何物質。在以下文獻中描述了用於製備基質-配體接合物的基質材料和程序的例子：Dean等人(編)AFFINITY CHROMATOGRAPHY：A PRACTICAL APPROACH(親和層析實用方法)，IRL Press(1985)；Lowe,“An Introduction to Affinity Chromatography(親和層析介紹)”，在Work等人(編)LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY(生物化學和分子生物學實驗室技術)，卷7，第II部分，North-Holland(1979)中；Porath等人，“Biospecific Affinity Chromatography(雙特異性親和層析)”，在Neurath,H.等人(編)，THE PROTEINS(蛋白質)，第三版，卷1，第95-178頁(1975)；以及Schott,H.AFFINITY CHROMATOGRAPHY(親和層析)，Macel Dekker,Inc.NY(1984)。
本文還提供了B7-H3肽激動劑、拮抗劑或調節劑與本文所討論的診斷程序中使用的任何報告部分的接合物。B7-H3肽激動劑、拮抗劑或調節劑，包括抗B7-H3抗體在內的本發明的多肽和蛋白還藉由以下標準中的任何標準(一個或多個)來鑑定和表徵： (a)特異性結合B7-H3(並且尤其是在癌細胞表面上表現的B7-H3分子，該癌細胞包括但不限於腎癌細胞、前列腺癌細胞或肺癌細胞)的能力；(b)競爭性抑制已知的抗B7-H3抗體與B7-H3優先結合的能力，包括與原始抗體較佳結合的相同B7-H3表位優先結合的能力；(c)在體外或體內結合暴露於活細胞的表面上的B7-H3的部分的能力；(d)結合暴露於表現B7-H3的癌症活細胞的表面上的B7-H3的部分的能力；(e)遞送化學治療劑到表面上表現B7-H3的癌細胞(諸如腎癌細胞、前列腺癌細胞或肺癌細胞)的能力；及/或(f)遞送治療劑或可檢測的標記到表面上表現B7-H3的癌細胞(諸如但不限於前列腺癌細胞)中的能力。
本發明的較佳抗體將表現出腫瘤組織較之正常非癌組織的差異IHC染色，而且將能夠在靈長類(並且特別是食蟹猴)模型中測試抗體效價。本發明的較佳抗體將另外表現出令人期望的親和力和抗原特異性的等級。本發明的較佳抗體將另外表現出令人期望的免疫調節活性和細胞內化的等級。
在一些實施方案中，本發明的抗體是由融合瘤BRCA84D、BRCA69D或PRCA157或它們的子代所產生的抗體。本發明還涵蓋如下物質的各種製劑：由這些寄存的融合瘤所產生的抗體及其等同抗體或多肽片段(例如，Fab、Fab'、F(ab')2Fv、Fc等等)、嵌合抗體、單鏈(scFv)、突變 體，包含抗體部分的融合蛋白，人源化抗體，以及包含所需特異性的抗原(B7-H3)識別位點的這些抗體或等同抗體中的任何一種的任何其他修改的構型。本發明還提供了展示抗B7-H3科成員的一種或多種生物學特徵的人抗體。藉由上述五種標準中的任何標準(一種或多種)對抗B7-H3科的等同抗體(包括人源化抗體和人抗體)、多肽片段和包含這些片段中的任何片段的多肽進行鑑定和表徵。在PCT公開WO 2008/066691中提供了抗B7-H3抗體的鼠序列和示例性人源化可變區域序列。這些序列藉由非限制闡述方式提供，並且不同的序列及所提供的序列的片段和變體涵蓋在本發明的範圍之內。
由於與其他抗體相比具有較純淨的正常組織IHC概況、較強的腫瘤/正常IHC差別、中等到強烈的結合(BIACORETM)/IHC)、對食蟹猴的B7-H3的交叉反應性以及對普遍的DARTTM分子(“UDARTTM”)的強效活性，BRCA84D、BRCA69D和PRCA157是本發明的較佳的B7-H3抗體。在特佳的實施方案中，本發明涵蓋了這些較佳抗體的嵌合變體和人源化變體以及擁有如以下所述的修飾的Fc區的這些較佳抗體的天然變體以及嵌合變體和人源化變體。本發明另外涵蓋擁有這些抗體的表位結合區的DARTTM分子，該表位結合區特別是與結合以下的表位結合區一致的表位結合區：T細胞受體、與NKG2D受體或與腫瘤相關抗原或與半抗原諸如螢光素(例如異硫氰酸螢光素(也稱為螢光素異硫氰酸酯或FITC))。
在一些實施方案中，結合B7-H3的本發明的抗體、多肽和蛋白是競爭性抑制本文指明的抗B7-H3抗體與B7-H3的優先結合的抗體、多肽和蛋白。在一些實施方案中，這些抗體、多肽和蛋白優先結合的B7-H3上的 表位與抗體mu-抗B7-H3優先結合的B7-H3上的表位相同。
因此，本發明提供了以下物質中的任何物質(或包含以下物質中的任何物質的組合物，包括藥物組合物)：(a)由具有以上所示的寄存號碼的宿主細胞或其子代所產生的抗體；(b)這種抗體的人源化形式；(c)包含這種抗體的輕鏈及/或重鏈可變區中的一個或多個的抗體；(d)嵌合抗體，該嵌合抗體包含與這種抗體的重鏈和輕鏈的可變區同源或自其衍生的可變區以及與人抗體的重鏈和輕鏈的恆定區同源或自其衍生的恆定區；(e)包含這種抗體的輕鏈及/或重鏈CDR中的一個或多個(至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個)的抗體；(f)包含這種抗體的重鏈及/或輕鏈的抗體；(g)與這種抗體等同的人抗體。該抗體的人源化形式可以具有或者可以不具有與該原始抗體或由具有以上所示的寄存號碼的宿主細胞產生的抗體相同的CDR。CDR區的確定是本領域技能內容易實現的。在一些實施方案中，本發明提供的抗體包含至少一個與由以上所示的寄存融合瘤之一所產生的抗體(或者，在一些實施方案中與這些抗體之一的所有6個CDR基本上同源或源自這些抗體之一)或由具有以上所示的寄存號碼的宿主細胞所產生的抗體的至少一個CDR、至少兩個CDR、至少三個CDR、至少四個CDR、至少五個CDR基本上同源的CDR。其他實施方案包括的抗體具有與如本文所示寄存的融合瘤所產生的抗體的至少兩個、三個、四個、五個或六個CDR基本上同源的至少兩個、三個、四個、五個或六個CDR或源自這種抗體。應理解，出於本發明的目的，一般保留結合特異性及/或總體活性(它可以是以下方面：遞送化學治療劑到癌細胞或者到癌細胞中以減少癌細胞的生長及/或增殖、誘導癌細胞中的凋亡性細胞死亡、延遲轉移的形成，及/或舒減 療法)，但活性程度與由寄存的融合瘤所產生的抗體相比可能不同(可能更大或更小)。本發明還提供了製備這些抗體中的任何抗體的方法。製備抗體的方法是本領域中已知的，並在本文描述。
本發明還提供了包含本發明的抗體的胺基酸序列的多肽。在一些實施方案中，多肽包含該抗體的輕鏈及/或重鏈可變區中的一種或多種。在一些實施方案中，多肽包含該抗體的輕鏈及/或重鏈CDR中的一種或多種。在一些實施方案中，多肽包含該抗體的輕鏈及/或重鏈的三個CDR。在一些實施方案中，多肽包含的抗體的胺基酸序列具有以下任何一種：原始抗體的序列的至少5個連續胺基酸，至少8個連續胺基酸、至少約10個連續胺基酸、至少約15個連續胺基酸、至少約20個連續胺基酸、至少約25個連續胺基酸、至少約30個連續胺基酸，其中這些胺基酸中的至少3個是來自該抗體的可變區。在一個實施方案中，可變區來自原始抗體的輕鏈。在另一個實施方案中，可變區來自該抗體的重鏈。在另一個實施方案中，5個(或更多)連續胺基酸來自該抗體的互補決定區(CDR)。
在本發明的一些實施方案中，將表現B7-H3、B7-H3的部分、抗B7-H3抗體或本發明的其他B7-H3結合多肽的本發明的細胞直接施用至個體以在體內調節B7-H3生物學活性。
本發明較佳的抗B7-H3抗體是BRCA84D、BRCA69D和PRCA157，所有這些抗體是對人B7-H3分子具有反應性的鼠抗體。BRCA84D、BRCA69D和PRCA157的可變輕鏈和可變重鏈的胺基酸序列和編碼多核苷酸序列與每個這樣的鏈對應的CDR1、CDR2和CDR3區域一起顯示於下文。本領域中具有通常知識者將因此能夠建構具有這些CDR的抗體 及其衍生物，該抗體及其衍生物能夠結合被BRCA84D、BRCA69D和PRCA157識別的表位。
A.BRCA84D的序列
(1)BRCA84D輕鏈序列
BRCA84D可變輕鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO：3)：
編碼BRCA84D可變輕鏈的多核苷酸序列(SEQ ID NO：4)：
BRCA84D可變輕鏈CDR1(SEQ ID NO：5)：KASQNVDTNVA
編碼BRCA84D可變輕鏈CDR1的多核苷酸序列(SEQ ID NO：6)：aaggccagtc agaatgtgga tactaatgta gcc
BRCA84D可變輕鏈CDR2(SEQ ID NO：7)：SASYRYS
編碼BRCA84D可變輕鏈CDR2的多核苷酸序列(SEQ ID NO：8)：tcggcatcct accggtacag t
BRCA84D可變輕鏈CDR3(SEQ ID NO：9)：QQYNNYPFT
編碼BRCA84D可變輕鏈CDR3的多核苷酸序列(SEQ ID NO：10)：cagcaatata acaactatcc attcacg
(2)BRCA84D重鏈序列
BRCA84D可變重鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO：11)：
編碼BRCA84D可變重鏈的多核苷酸序列(SEQ ID NO：12)：
BRCA84D可變重鏈CDR1(SEQ ID NO：13)：FGMH
編碼BRCA84D可變重鏈CDR1的多核苷酸序列(SEQ ID NO：14)：tttggaatgcac
BRCA84D可變重鏈CDR2(SEQ ID NO：15)：YISSDSSAIYYADTVK
編碼BRCA84D可變重鏈CDR2的多核苷酸序列(SEQ ID NO：16)：tacattagta gtgacagtag tgccatctac tatgcagaca cagtgaag
BRCA84D可變重鏈CDR3(SEQ ID NO：17)：GRENIYYGSRLDY
編碼BRCA84D可變重鏈CDR3的多核苷酸序列(SEQ ID NO：18)：gggagggaaa acatttacta cggtagtagg cttgactac
B.BRCA69D的序列
(1)BRCA69D輕鏈序列
BRCA69D可變輕鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO：19)：
編碼BRCA69D可變輕鏈的多核苷酸序列(SEQ ID NO：20)：
BRCA69D可變輕鏈CDR1(SEQ ID NO：21)：RASQDISNYLN
編碼BRCA69D可變輕鏈CDR1的多核苷酸序列(SEQ ID NO：22)：agggcaagtc aggacattag taattattta aac
BRCA69D可變輕鏈CDR2(SEQ ID NO：23)：YTSRLHS
編碼BRCA69D可變輕鏈CDR2的多核苷酸序列(SEQ ID NO：24)：tacacatcac gattacactc a
BRCA69D可變輕鏈CDR3(SEQ ID NO：25)：QQGNTLPPT
編碼BRCA69D可變輕鏈CDR3的多核苷酸序列(SEQ ID NO：26)：caacagggta atacgcttcc tccgacg
(2)BRCA69D重鏈序列
BRCA69D可變重鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO：27)：
編碼BRCA69D可變重鏈的多核苷酸序列(SEQ ID NO：28)：
BRCA69D可變重鏈CDR1(SEQ ID NO：29)：SYWMQ
編碼BRCA69D可變重鏈CDR1的多核苷酸序列(SEQ ID NO：30)：agctactgga tgcag
BRCA69D可變重鏈CDR2(SEQ ID NO：31)：TIYPGDGDTRYTQKFKG
編碼BRCA69D可變重鏈CDR2的多核苷酸序列(SEQ ID NO：32)：actatttatc ctggagatgg tgatactagg tacactcag aagttcaagg gc
BRCA69D可變重鏈CDR3(SEQ ID NO：33)：RGIPRLWYFDV
編碼BRCA69D可變重鏈CDR3的多核苷酸序列(SEQ ID NO：34)：agagggattc cacggctttg gtacttcgat gtc
C.PRCA157的序列
(1)PRCA157輕鏈序列
PRCA157可變輕鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO：35)：
編碼PRCA157可變輕鏈的多核苷酸序列(SEQ ID NO：36)：
PRCA157可變輕鏈CDR1(SEQ ID NO：37)：RASESIYSYLA
編碼PRCA157可變輕鏈CDR1的多核苷酸序列(SEQ ID NO：38)：cgagcaagtg agagtattta cagttattta gca
PRCA157可變輕鏈CDR2(SEQ ID NO：39)：NTKTLPE
編碼PRCA157可變輕鏈CDR2的多核苷酸序列(SEQ ID NO：40)：aatacaaaaa ccttaccaga g
PRCA157可變輕鏈CDR3(SEQ ID NO：41)：QHHYGTPPW
編碼PRCA157可變輕鏈CDR3的多核苷酸序列(SEQ ID NO：42)：caacatcatt atggtactcc tccgtgg
(2)PRCA157重鏈序列
PRCA157可變重鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO：43)：
編碼PRCA157可變重鏈的多核苷酸序列(SEQ ID NO：44)：
PRCA157可變重鏈CDR1(SEQ ID NO：45)：SYGMS
編碼PRCA157可變重鏈CDR1的多核苷酸序列(SEQ ID NO：46)：tcctatggca tgtct
PRCA157可變重鏈CDR2(SEQ ID NO：47)：VATINSGGSNTYYPDSLKG
編碼PRCA157可變重鏈CDR2的多核苷酸序列(SEQ ID NO：48)：gtcgcaacca ttaatagtgg tggaagtaac acctactatc cagacagttt gaagggg
PRCA157可變重鏈CDR3(SEQ ID NO：49)：HDGGAMDY
編碼PRCA157可變重鏈CDR3的多核苷酸序列(SEQ ID NO：50)：catgacgggg gagctatgga ctac
D.Fc工程化B7-H3抗體
在傳統免疫功能中，抗體-抗原複合物與免疫系統的細胞的相互作用產生一系列廣泛的反應，範圍從效應子功能諸如抗體相依細胞毒作用、肥大細胞去顆粒作用和吞噬作用到免疫調節信號諸如調控淋巴細胞增殖和抗體分泌。所有這些相互作用藉由抗體的Fc區域或免疫複合物與造血細胞上專門的細胞表面受體的結合啟動。由抗體和免疫複合物觸發的細 胞反應的多樣性是由三種Fc受體的結構異質性產生：FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)。FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32A)和FcγRIII(CD16)是活化(即，免疫系統增強)受體；FcγRIIB(CD32B)是抑制(即，免疫系統減弱)受體。以下顯示了IgG1 Fc區的胺基酸序列(SEQ ID NO：51，根據Kabat等人，SEQUENCE OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST(免疫學關注的蛋白質的序列)，第五版Public Health Service,NIH,MD(1991)編號，該文獻藉由引用明確地併入本文，並且在此後稱為“Kabat EU”)：
SEQ ID NO：51
殘基230-341是Fc CH2區。殘基342-447是Fc CH3區。
本發明提供了包含變體Fc區的特異性結合B7-H3的抗體，該變體Fc區在一個或多個部分中具有一種或多種胺基酸修飾(例如，取代、缺失、插入)，這些修飾提高了該變體Fc區對於FcγR(包括活化性FcγR和抑制性FcγR)的親和力和親合力。在一些實施方案中，該一種或多種胺基酸修飾提高了變體Fc區對於FcγRIIIA及/或FcγRIIA的親和力。在另一個實施方案中，變體Fc區還以比相當的母體抗體(即，除了Fc區中的一種或多種胺基酸修飾之外具有與本發明的抗體相同的胺基酸序列的抗體)的Fc區低的 親和力特異性結合FcγRIIB。在一些實施方案中，相較於母體抗體，這些修飾提高了變體Fc區對於FcγRIIIA及/或FcγRIIA的親和力並且還增強了變體Fc區對於FcγRIIB的親和力。在其他實施方案中，相較於母體抗體的Fc區，該一種或多種胺基酸修飾提高了變體Fc區對於FcγRIIIA及/或FcγRIIA的親和力，但是不改變變體Fc區對於FcγRIIB的親和力。在另一個實施方案中，相較於母體抗體，該一種或多種胺基酸修飾增強了變體Fc區對於FcγRIIIA和FcγRIIA的親和力但是降低了對於FcγRIIB的親和力。當在細胞中不能檢測到母體分子(沒有修飾的Fc區)的結合活性時，提高的親和力及/或親合力在表現低等級FcγR的細胞中產生了可檢測的FcγR結合或FcγR相關活性。在其他實施方案中，修飾的分子在以下列密度表現非FcγR受體標靶抗原的細胞中表現出可檢測的結合：以30,000到20,000個分子/細胞的密度、以20,000到10,000個分子/細胞的密度、以10,000到5,000個分子/細胞的密度、以5,000到1,000個分子/細胞的密度、1,000到200個分子/細胞的密度或以200個分子/細胞或更小(但至少10個、50個、100個或150個分子/細胞)的密度。
在另一個實施方案中，Fc區胺基酸的該一種或多種修飾降低了抗體對於一種或多種FcγR受體的親和力和親合力。在具體的實施方案中，本發明涵蓋了包含變體Fc區的抗體，其中該變體Fc區較之野生型Fc區包含至少一個胺基酸修飾，該變體Fc區只結合一種FcγR，其中該FcγR是FcγRIIIA。在另一個具體的實施方案中，本發明涵蓋了包含變體Fc區的抗體，其中該變體Fc區較之野生型Fc區包含至少一個胺基酸修飾，該變體Fc區只結合一種FcγR，其中該FcγR是FcγRIIA。
較佳地，本發明的分子的結合特性藉由用於確定一種或多種 FcγR介體效應細胞功能的體外功能測定來表徵(見5.2.7節)。本發明的分子例如抗體對於FcγR的親和力和結合特性可以使用本領域已知的用於確定抗體-抗原或Fc-FcγR相互作用(即分別是抗原與抗體的特異性結合或Fc區對FcγR的特異性結合)的體外分析法(基於生物化學或免疫學的分析法)來確定，該體外測定法包括但不限於ELISA分析、表面電漿子共振分析、免疫沉澱分析。在最佳的實施方案中，本發明的分子在體內模型(諸如本文所描述和揭露的)中具有與基於體外的測定中相似的結合特性。然而，本發明不排除在基於體外的測定中不表現期望表型但在體內表現期望表型的本發明的分子。
在一些實施方案中，包含變體Fc區的本發明的分子在Fc區的CH3區域中包含至少一個胺基酸修飾(例如，具有1、2、3、4、5、6、7、8、9個或更多個胺基酸修飾)，Fc區的CH3區域被限定為從胺基酸342延伸至447。在其他實施方案中，包含變體Fc區的本發明的分子在Fc區的CH2區域中包含至少一個胺基酸修飾(例如，具有1、2、3、4、5、6、7、8、9個或更多個胺基酸修飾)，Fc區的CH2區域被限定為從胺基酸231延伸至341。在一些實施方案中，本發明的分子包含至少兩個胺基酸修飾(例如，具有2、3、4、5、6、7、8、9個或更多個胺基酸修飾)，其中至少一個這樣的修飾是在CH3區中並且至少一個這樣的修飾是在CH2區中。本發明還涵蓋鉸合區中的胺基酸修飾。在具體實施方案中，本發明涵蓋Fc區的CH1區域中的胺基酸修飾，Fc區的CH1區域被限定為從胺基酸216延伸至230。
在特佳的實施方案中，本發明涵蓋包含變體Fc區的分子，其中該變體給予或具有提高的ADCC活性及/或提高的與FcγRIIA(CD32A)結 合，如使用本領域中具有通常知識者已知並且在本文舉例說明的方法所測量的。依據本發明的方法使用的ADCC測定可以是NK相依的或巨噬細胞相依的。
在特佳的實施方案中，本發明涵蓋包含變體Fc區的分子，其中該變體給予或具有提高的ADCC活性及/或提高的與FcγRIIIA(CD16A)結合，如使用本領域中具有通常知識者已知並且在本文舉例說明的方法所測量的。依據本發明的方法使用的ADCC測定可以是NK相依的或巨噬細胞相依的。
可以將本發明的Fc變體與其他Fc修飾組合，該其他Fc修飾諸如在以下文獻中揭露的那些Fc修飾：美國專利第7,632,497號；第7,521,542號；第7,425,619號；第7,416,727號；第7,371,826號；第7,355,008號；第7,335,742號；第7,332,581號；第7,183,387號；第7,122,637號；和第6,737,056號；在PCT公開第WO 2008/105886號；第WO 2008/002933號；第WO 2007/021841號；第WO 2007/106707號；第WO 06/088494號；第WO 05/115452號；第WO 05/110474號；第WO 04/1032269號；以及在第WO 04/063351號中；以及在Presta,L.G.等人(2002)“Engineering therapeutic antibodies for improved function(改善功能的工程化治療性抗體)，”Biochem.Soc.Trans.30(4)：487-490；Shields,R.L.等人(2002)“Lack of fucose on human IgG1 N-linked oligosaccharide improves binding to human Fcgamma RIII and antibody-dependent cellular toxicity(在人IgG1 N-連接寡糖上缺乏海藻糖改善了與人Fcγ RIII的結合以及抗體相依細胞毒性作用)，”J.Biol.Chem.26；277(30)：26733-26740和Shields,R.L.等人(2001)“High resolution mapping of the binding site on human IgG1 for Fc gamma RI,Fc gamma RII,Fc gamma RIII,and FcRn and design of IgG1 variants with improved binding to the Fc gamma R(人IgG1上對於FcγRI、FcγRII、FcγRIII和FcRn的結合位點的高分辨率定位和具有對FcγR的改善結合的IgG1變體的設計)，”J.Biol.Chem.276(9)：6591-6604)中。本發明涵蓋將本發明的Fc變體與其他Fc修飾相組合以向修飾的抗體提供加性的、協同的或新穎的特性。較佳地，本發明的Fc變體增強了與其組合的修飾的表型。例如，如果將本發明的Fc變體與已知以比相當的野生型Fc區高的親和力結合FcγRIIIA的突變體相組合，那麼與本發明的突變體的組合導致FcγRIIIA親和力更大倍數的增強。
本發明涵蓋了包含變體Fc區的特異性結合B7-H3的抗體，其中該變體Fc區與野生型Fc區相比包含至少一種胺基酸修飾(例如，具有1、2、3、4、5、6、7、8、9個或更多個胺基酸修飾)，這樣使得該抗體分子與包含野生型Fc區的分子相比具有增強的效應子功能，只要該變體Fc區沒有或者不全是在以下任何一個或多個位置上的取代：243、255、256、258、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、300、301、303、305、307、309、312、320、322、326、329、330、332、331、333、334、335、337、338、339、340、359、360、373、376、416、419、430、434、435、437、438、439。在具體的實施方案中，本發明涵蓋了包含變體Fc區的這些抗體，其中該變體Fc區與野生型Fc區相比包含至少一種胺基酸修飾(例如，具有1、2、3、4、5、6、7、8、9個或更多個胺基酸修飾)，這樣使得該抗體分子以與包含野生型Fc區的分子相比改變的親和力結合FcγR，只要該變體Fc區沒有或者 不全是在以下任何一個或多個位置上的取代：位置243、255、258、267、269、270、276、278、280、283、285、289、292、293、294、295、296、300、303、305、307、309、320、322、329、332、331、337、338、340、373、376、416、419、434、435、437、438、439，並且在位置256、290、298、312、326、333、334、359、360或430的任何位置沒有丙胺酸；在268位置沒有天冬醯胺；在272位置沒有麩醯胺；在286位置沒有麩醯胺、絲胺酸或天冬胺酸；在290位置沒有絲胺酸；在301位置沒有甲硫胺酸；在320位置沒有甲硫胺酸、麩醯胺、麩胺酸或精胺酸；在322位置沒有麩胺酸；在326位置沒有天冬醯胺、絲胺酸、麩胺酸或天冬胺酸；在330位置沒有賴胺酸；在334位置沒有麩醯胺；在334位置沒有麩胺酸；在334位置沒有甲硫胺酸；在334位置沒有組胺酸；在334位置沒有纈胺酸；在334位置沒有亮胺酸；在335位置沒有麩醯胺；在335位置沒有賴胺酸；或者在339位置沒有蘇胺酸。
本發明還涵蓋了包含變體Fc區的特異性結合B7-H3的抗體，其中該變體Fc區包括含有變體Fc區的這些抗體，其中該變體Fc區沒有或者不全是在以下任何一個或多個位置上的取代：位置268、269、270、272、276、278、283、285、286、289、292、293、301、303、305、307、309、320、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、416、419、430、434、435、437、438或439，並且在280位置沒有組胺酸、麩醯胺或酪胺酸；在290位置沒有絲胺酸、甘胺酸、蘇胺酸或酪胺酸，在294位置沒有天冬醯胺，在295位置沒有賴胺酸；在296位置沒有脯胺酸；在298位置沒有脯胺酸、天冬醯胺、天冬胺酸或纈胺酸；或者在300位置沒有亮胺酸或異亮胺酸。在另一個實施方案中，本發明涵蓋了包含變體Fc區的這些抗體，其 中該變體Fc區與野生型Fc區相比包含至少一種胺基酸修飾，這樣使得該分子以與包含野生型Fc區的分子相比減少的親和力結合FcγR，只要該變體Fc區沒有或者不全是在以下任何一個或多個位置上的取代：位置243、252、254、265、268、269、270、278、289、292、293、294、295、296、298、300、301、303、322、324、327、329、333、335、338、340、373、376、382、388、389、414、416、419、434、435、437、438或439。又在另一個實施方案中，本發明涵蓋了包含變體Fc區的這些抗體，其中該變體Fc區與野生型Fc區相比包含至少一種胺基酸修飾，這樣使得該分子以與包含野生型Fc區的分子相比增強的親和力結合FcγR，只要該變體Fc區沒有或者不全是在以下任何一個或多個位置上的取代：位置280、283、285、286、290、294、295、298、300、301、305、307、309、312、315、331、333、334、337、340、360、378、398或430。
本發明還涵蓋了包含變體Fc區的特異性結合B7-H3的抗體，其中該變體Fc區沒有或者不全是在以下任何一個或多個位置上的取代：位置330、243、247、298、241、240、244、263、262、235、269或328，並且在243位置沒有亮胺酸，在298位置沒有天冬醯胺，在241位置沒有亮胺酸，並且在240位置沒有異亮胺酸或丙胺酸，在244位置沒有組胺酸，在330位置沒有纈胺酸，或者在328位置沒有異亮胺酸。
本發明特別涵蓋包含變體Fc區的特異性結合B7-H3的抗體，該變體Fc區具有增強的效應子功能及/或改變的對於活化性受體及/或抑制性受體的親和力，其中該變體Fc區包含：(a)以下取代中的任何1個、2個、3個、4個、5個或6個：S239D、S298A、A330L、I332E、E333A或K334A； 或者(b)以下任何取代組合：(1)S298A、E333A和K334A；(2)S239D和I332E；或者(3)S239D、A330L和I332E。
本發明特別涵蓋包含變體Fc區的特異性結合B7-H3的抗體，該變體Fc區具有增強的效應子功能及/或改變的對於活化性受體及/或抑制性受體的親和力，其中該變體Fc區包含如下取代：(1)在288位置用天冬醯胺取代，在330位置用絲胺酸取代並且在396位用亮胺酸取代；(2)在334位置用麩胺酸取代，在359位置用天冬醯胺取代並且在366位置用絲胺酸取代；(3)在316位置用天冬胺酸取代，在378位置用纈胺酸取代並且在399位置用麩胺酸取代；(4)在247位置用亮胺酸取代，並且在421位置用賴胺酸取代；(5)在392位置用蘇胺酸取代，並且在396位置用亮胺酸取代；(6)在221位置用麩胺酸取代，在270位置用麩胺酸取代，在308位置用丙胺酸取代，在311位置用組胺酸取代，在396位置用亮胺酸取代，並且在402位置用天冬胺酸取代；(7)在419位置用組胺酸取代，並且在396位置用亮胺酸取代；(8)在240位置用丙胺酸取代，並且在396位置用亮胺酸取代； (9)在410位置用組胺酸取代，並且在396位置用亮胺酸取代；(10)在243位置用亮胺酸取代，在305位置用異亮胺酸取代，在378位置用天冬胺酸取代，在404位置用絲胺酸取代，並且在396位置用亮胺酸取代；(11)在255位置用異亮胺酸取代，並且在396位置用亮胺酸取代；(12)在370位置用麩胺酸取代並且在396位置用亮胺酸取代；(13)在270位置用麩胺酸取代；或者(14)上述(1)-(12)取代的任何組合。
在具體的實施方案中，本發明涵蓋了包含變體Fc區的特異性結合B7-H3的抗體，該變體Fc區包含如下取代：F243L、R292P和Y300L。在又一個具體的實施方案中，本發明涵蓋了包含變體Fc區的特異性結合B7-H3的抗體，該變體Fc區包含如下取代：L235V、F243L、R292P、Y300L和P396L。在又一個具體的實施方案中，本發明涵蓋了包含變體Fc區的特異性結合B7-H3的抗體，該變體Fc區包含取代F243L、R292P、Y300L、V305I和P396L。
在又一個具體的實施方案中，本發明涵蓋了包含變體Fc區的特異性結合B7-H3的抗體，該變體Fc區包含如下取代：在396位置用亮胺酸取代，在270位置用麩胺酸取代並且在243位置用亮胺酸取代。在另一個具體的實施方案中，該分子還包含諸如本文所揭露的一種或多種胺基酸修飾。
本發明特別涵蓋包含變體Fc區的特異性結合B7-H3的抗體，該變體Fc區具有增強的效應子功能及/或改變的對於活化性受體及/或抑制性受體的親和力，該變體Fc區在以下位置中的一個或多個具有胺基酸修飾：119、125、132、133、141、142、147、149、162、166、185、192、202、205、210、214、215、216、217、218、219、221、222、223、224、225、227、229、231、232、233、235、240、241、242、243、244、246、247、248、250、251、252、253、254、255、256、258、261、262、263、268、269、270、272、274、275、276、279、280、281、282、284、287、288、289、290、291、292、293、295、298、301、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、315、316、317、318、319、320、323、326、327、328、330、333、334、335、337、339、340、343、344、345、347、348、352、353、354、355、358、359、360、361、362、365、366、367、369、370、371、372、375、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、404、406、407、408、409、410、411、412、414、415、416、417、419、420、421、422、423、424、427、428、431、433、435、436、438、440、441、442、443、446或447。較佳地這些突變產生了如下分子：已被給予效應細胞介導的功能並且任選地具有改變的對於FcγR的親和力，如使用本文所揭露並舉例說明的且是本領域中具有通常知識者已知的方法確定的。
本發明特別涵蓋特異性結合B7-H3、包含變體Fc區、具有改變的效應子功能及/或改變的對於活化性受體及/或抑制性受體的親和力的 抗體，該抗體具有：(I)在以下一個或多個位置上的胺基酸修飾：235、240、241、243、244、247、262、263、269、298、328或330，以及更佳地一個或多個以下修飾：V240A、V240I、F241L、F243L、P244H、S298N、L328I、A330V；其中這些抗體與具有缺乏這種修飾的野生型Fc區的抗體相比表現出改變的效應子功能；(II)在以下一個或多個位置上的胺基酸修飾：268、269、270、272、276、278、283、285、286、289、292、293、301、303、305、307、309、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、416、419、430、434、435、437、438或439，以及更佳地一個或多個以下修飾：D280H、D280Q、D280Y、K290G、K290S、K290T、K290Y、E294N、Q295K、Y296P、S298D、S298N、S298P、S298V、Y300I、Y300L；其中這些抗體與具有缺乏這種修飾的野生型Fc區的抗體相比表現出改變的效應子功能；(III)在以下一個或多個位置上的胺基酸修飾：255、256、258、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、300、301、303、305、307、309、312、320、322、326、329、330、332、331、333、334、335、337、338、339、340、359、360、373、376、416、419、430、434、435、437、438、439，以及更佳地一個或多個以下修飾：T256A、H268N、E272Q、N286D、N286Q、N286S、K290A、K290S、S298A、R301M、D312A、K320E、K320M、K320Q、K320R、K322E、K326A、K326D、K326E、K326N、K326S、A330K、A339T、E333A、K334A、K334E、K334H、K334L、K334M、K334Q、K334V、 T335K、T335Q、T359A、K360A、E430A；其中這些抗體與具有缺乏這種修飾的野生型Fc區的抗體相比表現出改變的效應子功能；(IV)在以下一個或多個位置上的胺基酸修飾：252、254、265、268、269、270、278、289、292、293、294、295、296、298、300、301、303、322、324、327、329、333、335、338、340、373、376、382、388、389、414、416、419、434、435、437、438或439；其中這些抗體與具有缺乏這種修飾的野生型Fc區的抗體相比表現出降低的效應子功能；(V)在以下一個或多個位置上的胺基酸修飾：280、283、285、286、290、294、295、298、300、301、305、307、309、312、315、331、333、334、337、340、360、378、398或430；其中這些抗體與具有缺乏這種修飾的野生型Fc區的抗體相比表現出增強的效應子功能；或者(VI)在以下一個或多個位置上的胺基酸修飾：R255A、T256A、E258A、S267A、H268A、H268N、E272A、E272Q、N276A、D280A、E283A、H285A、N286A、N286D、N286Q、N286S、K290A、K290S、R301M、K320E、K320M、K320Q、K320R、K322E、K326A、K326D、K326E、K326S、A330K、P331A、T335Q、S337A、E430A；其中這些抗體與具有缺乏這種修飾的野生型Fc區的抗體相比表現出增強的效應子功能。
在其他實施方案中，本發明涵蓋了本領域已知的任何Fc變體的使用，諸如在以下文獻中揭露的那些：Jefferis,B.J.等人(2002)“Interaction Sites On Human IgG-Fc For FcgammaR：Current Models(人IgG-Fc上的FcγR相互作用位點：目前模型)，”Immunol.Lett.82：57-65；Presta, L.G.等人(2002)“Engineering Therapeutic Antibodies For Improved Function(改善功能的工程化治療性抗體)，”Biochem.Soc.Trans.30：487-90；Idusogie,E.E.等人(2001)“Engineered Antibodies With Increased Activity To Recruit Complement(具有提高的募集補體活性的工程化抗體)，”J.Immunol.166：2571-75；Shields,R.L.等人(2001)“High Resolution Mapping Of The Binding Site On Human IgG1 For Fc Gamma RI,Fc Gamma RII,Fc Gamma RIII,and FcRn and Design Of IgG1 Variants With Improved Binding To The Fc gamma R(人IgG1上對於FcγRI、FcγRII、FcγRIII和FcRn的結合位點的高分辨率定位和具有對FcγR的改善結合的IgG1變體的設計)，”J.Biol.Chem.276：6591-6604；Idusogie,E.E.等人(2000)“Mapping Of The C1q Binding Site On Rituxan,A Chimeric Antibody With A Human IgG Fc(具有人IgG Fc的嵌合抗體Rituxan上的C1q結合位點的定位)，”J.Immunol.164：4178-84；Reddy,M.P.等人(2000)“Elimination Of Fc Receptor-Dependent Effector Functions Of A Modified IgG4 Monoclonal Antibody To Human CD4(針對人CD4的修飾的IgG4單株抗體的Fc受體相依效應子功能的消除)，”J.Immunol.164：1925-1933；Xu,D.等人(2000)“In Vitro Characterization of Five Humanized OKT3 Effector Function Variant Antibodies(五種人源化OKT3效應子功能變體抗體的體外表徵)，”Cell.Immunol.200：16-26；Armour,K.L.等人(1999)“Recombinant human IgG Molecules Lacking Fcgamma Receptor I Binding and Monocyte Triggering Activities(缺乏Fcγ受體I結合活性和單核細胞觸發活性的重組人IgG分子)，”Eur.J.Immunol.29：2613-24；Jefferis,R.等人(1996)“Modulation Of Fc(Gamma)R and Human Complement Activation By IgG3-Core Oligosaccharide Interactions(藉由IgG3-核心寡糖相互作用調節Fc(γ)R和人補體的活化)，”Immunol.Lett.54：101-04；Lund,J.等人(1996)“Multiple Interactions Of IgG With Its Core Oligosaccharide Can Modulate Recognition By Complement and Human Fc Gamma Receptor I and Influence The Synthesis Of Its Oligosaccharide Chains(IgG與其核心寡糖的多種相互作用能夠調節補體和人Fcγ受體I對其的識別並影響其寡糖鏈的合成)，”J.Immunol.157：4963-4969；Hutchins等人(1995)“Improved Biodistribution,Tumor Targeting,and Reduced Immunogenicity In Mice With A Gamma 4 Variant Of Campath-1H(坎帕斯-1H的γ4變體改善了在小鼠中的生物分佈、腫瘤靶向和減少了免疫原性)，”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)92：11980-84；Jefferis,R.等人(1995)“Recognition Sites On Human IgG For Fc Gamma Receptors：The Role Of Glycosylation(人IgG上的Fcγ受體識別位點：醣化的作用)，”Immunol.Lett.44：111-17；Lund,J.等人(1995)“Oligosaccharide-Protein Interactions In IgG Can Modulate Recognition By Fc Gamma Receptors(IgG中的寡糖-蛋白相互作用能夠調節Fcγ受體對其的識別)，”FASEB J.9：115-19；Alegre,M.L.等人(1994)“A Non-Activating "Humanized" Anti-CD3 Monoclonal Antibody Retains Immunosuppressive Properties In Vivo(非活化的“人源化”抗CD3單株抗體保留了體內免疫抑制特性)，”Transplantation 57：1537-1543；Lund等人(1992)“Multiple Binding Sites On The CH2 Domain Of IgG For Mouse Fc Gamma R11(IgG的CH2區域上針對小鼠FcγR11的多個結合位點)，”Mol.Immunol.29：53-59；Lund等人(1991)“Human Fc Gamma RI and Fc Gamma RII Interact With Distinct But Overlapping Sites On Human IgG(人FcγRI和FcγRII與人IgG上不同但重疊的位點相互作用)，”J.Immunol.147：2657-2662；Duncan,A.R.等人(1988)“Localization Of The Binding Site For The Human High-Affinity Fc Receptor On IgG(IgG上人高親和力Fc受體的結合位點的定位)，”Nature 332：563-564；美國專利第5,624,821號；第5,885,573號；第6,194,551號；第7,276,586號；和第7,317,091號；以及PCT公開WO 00/42072和PCT WO 99/58572。
本發明涵蓋了包含變體Fc區的分子，該變體Fc區由以下表1的表格中列出的任何突變組成或包含它們。
在具體的實施方案中，這些抗B7-H3抗體的變體Fc區具有：(1)在247位置的亮胺酸，在421位置的賴胺酸和在270位置的麩胺酸；(2)在392位置的蘇胺酸，在396位置的亮胺酸，在270位置的麩胺酸和在243位置的亮胺酸(3)在419位置的組胺酸，在396位置的亮胺酸和在270位置的麩胺酸；(4)在419位置的組胺酸，在396位置的亮胺酸，在270位置的麩胺酸和在243位置的亮胺酸；(5)在240位置的丙胺酸，在396位置的亮胺酸和在270位置的麩胺酸；(6)在255位置的賴胺酸和在396位置的亮胺酸； (7)在255位置的賴胺酸，在396位置的亮胺酸和在270位置的麩胺酸；(8)在255位置的賴胺酸，在396位置的亮胺酸，在270位置的麩胺酸和在300位置的賴胺酸；(9)在255位置的賴胺酸，在396位置的亮胺酸，在270位置的麩胺酸和在292位置的甘胺酸；(10)在255位置的賴胺酸，在396位置的亮胺酸，在270位置的麩胺酸和在243位置的亮胺酸；(11)在370位置的麩胺酸，在396位置的亮胺酸和在270位置的麩胺酸；(12)在270位置的麩胺酸，在316位置的天冬胺酸和在416位置的甘胺酸；(13)在243位置的亮胺酸，在292位置的脯胺酸，在305位置的異亮胺酸和在396位置的亮胺酸；(14)在243位置的亮胺酸，在270位置的麩胺酸，在392位置的天冬醯胺和在396位置的亮胺酸；(15)在243位置的亮胺酸，在255位置的亮胺酸，在270位置的麩胺酸和在396位置的亮胺酸；(16)在297位置的麩醯胺；或者(17)上述(1)-(16)取代的任何組合。
在一些實施方案中，本發明的分子還包含一個或多個醣化位 點，以便一個或多個碳水化合物部分被共價連接至該分子。較佳地，具有一個或多個醣化位點及/或Fc區中的一種或多種修飾的本發明的分子與母體抗體相比給予或具有增強的抗體介導的效應子功能，例如增強的ADCC活性。在一些實施方案中，本發明還包括如下分子：包含直接或間接已知與抗體的碳水化合物部分相互作用的胺基酸的一種或多種修飾，該胺基酸包括但不限於在位置241、243、244、245、245、249、256、258、260、262、264、265、296、299和301的胺基酸。直接或間接與抗體的碳水化合物部分相互作用的胺基酸是本領域已知的，見例如，Jefferis等人，1995 Immunology Letters,44：111-7，藉由引用將其整體併入本文。
在另一個實施方案中，本發明涵蓋如下分子：藉由引入一個或多個醣化位點到該分子的一個或多個位點中，較佳沒有改變這些分子的功能性，例如對標靶抗原或FcγR的結合活性。可以將醣化位點引入到本發明的分子的可變區及/或恆定區中。如本文所用，“醣化位點”包括寡糖(即包含連接在一起的兩個或更多個單糖的碳水化合物)將特異性和共價地連接的抗體中的任何特定胺基酸序列。通常寡糖側鏈借助N-連接或O-連接與抗體的骨架相連。N-連接的醣化是指寡糖部分與天冬醯胺殘基的側鏈相連。O-連接的醣化是指寡糖部分與羥基胺基酸例如絲胺酸、蘇胺酸相連。本發明的分子可包含一個或多個醣化位點，包括N-連接的和O-連接的醣化位點。可依據本發明使用本領域已知的N-連接或O-連接的醣化的任何醣化位點。可依據本發明的方法使用的示例性N-連接的醣化位點是胺基酸序列：Asn-X-Thr/Ser，其中X可以是任何胺基酸並且Thr/Ser表示蘇胺酸或絲胺酸。可以使用本發明所屬領域已知的方法將這樣的位點引入本發明的分子 中(見例如，IN VITRO MUTAGENESIS,RECOMBINANT DNA：A SHORT COURSE(體外誘變，重組的DNA：短期課程)，J.D.Watson，等人W.H.Freeman and Company,New York,1983，第8章，第106-116頁，藉由引用將其整體併入本文)。用於將醣化位點引入本發明的分子中的示例性方法可以包括：修飾或突變該分子的胺基酸序列以便獲得期望的Asn-X-Thr/Ser序列。
在一些實施方案中，本發明涵蓋了藉由添加或缺失醣化位點來改變本發明的分子的碳水化合物含量的方法。用於改變抗體的碳水化合物含量的方法是本領域已知的並且涵蓋在本發明之內，見，例如，美國專利第6,218,149號；EP 0 359 096 B1；美國公開第US 2002/0028486號；WO 03/035835；美國公開第2003/0115614號；美國專利第6,218,149號；美國專利第6,472,511號；藉由引用將所有這些文獻整體併入本文。在其他實施方案中，本發明涵蓋了藉由缺失本發明的分子的一個或多個內源性碳水化合物部分來改變該分子的碳水化合物含量的方法。在具體的實施方案中，本發明涵蓋了藉由改變與297相鄰的位置來移動抗體的Fc區的醣化位點。在一個具體的實施方案中，本發明涵蓋修飾296位置以便296位置而不是297位置被醣化。
效應子功能也可以藉由如下技術改變：諸如藉由將一個或多個半胱胺酸殘基到Fc區中，由此允許在該區域中發生鏈間二硫鍵形成，導致可能具有改善的內化能力及/或提高的補體介導的細胞殺傷作用和ADCC的同源二聚體抗體的產生(Caron,P.C.等人(1992)“Engineered Humanized Dimeric Forms Of IgG Are More Effective Antibodies(工程化人源化二聚體形式的IgG是更有效的抗體)，”J.Exp.Med.176：1191-1195；Shopes,B.(1992)“A Genetically Engineered Human IgG Mutant With Enhanced Cytolytic Activity(具有增強的細胞裂解活性的基因工程化人IgG突變體)，”J.Immunol.148(9)：2918-2922)。具有增強的抗腫瘤活性的同源二聚體抗體也可以使用在Wolff,E.A.et al.(1993)“Monoclonal Antibody Homodimers：Enhanced Antitumor Activity In Nude Mice(單株抗體同源二聚體：在裸鼠中增強的抗腫瘤活性)，”Cancer Research 53：2560-2565中描述的異雙功能交聯劑來製備。可選地，可以改造出具有雙重Fc區並可以由此具有增強的補體裂解能力和ADCC能力的抗體(Stevenson,G.T.等人(1989)“A Chimeric Antibody With Dual Fc Regions(bisFabFc)Prepared By Manipulations At The IgG Hinge(藉由在IgG鉸合處操作而製備的具有雙重Fc區(雙FabFc)的嵌合抗體)，”Anti-Cancer Drug Design 3：219-230)。
E.B7-H3 DART TM (雙親和力重新靶向試劑)
如以上所討論的，本發明另外涵蓋包含至少兩條多肽鏈的“DARTTM”(雙親和力重新靶向試劑)分子，這兩條多肽鏈形成至少兩個表位結合位點，該表位結合位點中的至少一個特異性結合B7-H3。
在較佳的實施方案中，DARTTM的第一條多肽鏈包含：(i)包含對表位(1)特異的第一免疫球蛋白的輕鏈可變區域(VL1)的結合區的區域(A)；(ii)包含對表位(2)特異的第二免疫球蛋白的重鏈可變區域(VH2)的結合區的區域(B)；以及(iii)區域(C)。
這種DARTTM的第二多肽鏈包含： (i)包含對表位(2)特異的第二免疫球蛋白的輕鏈可變區域(VL2)的結合區的區域(D)；(ii)包含對表位(1)特異的第一免疫球蛋白的重鏈可變區域(VH1)的結合區的區域(E)；以及(iii)區域(F)。
DARTTM區域(A)和(B)彼此不締合形成表位結合位點。類似地，DARTTM區域(D)和(E)彼此不締合形成表位結合位點。相反，DARTTM區域(A)和(E)締合形成結合表位(1)的結合位點；該DARTTM區域(B)和(D)締合形成結合該表位(2)的結合位點。區域(C)和(F)共價締合在一起。
DARTTM分子的每條多肽鏈包含VL區域和VH區域，這兩個區域被共價相連以便限制其自組裝。兩條多肽鏈的相互作用將產生兩個VL-VH配對，從而形成兩個表位結合位點，即二價分子。VH或VL區域不限定在多肽鏈內的任何位置，即不限制於胺基(N)端或羧基(C)端，且這兩個區域彼此的相對位置也不受限制，即VL區域可位於VH區域的N端，並且反之亦然。唯一的限制是有可用的互補多肽鏈，以便形成功能性DARTTM。在VL區域和VH區域源自同一抗體時，這兩條互補多肽鏈可以相同。例如，在結合區域源自對表位A特異的抗體(即，該結合區域是由VLA-VHA相互作用而形成)時，每條多肽將包含VHA和VLA。抗體的兩條多肽鏈的同源二聚作用將導致形成兩個VLA-VHA結合位點，從而產生二價單特異性抗體。在VL區域和VH區域源自對不同的抗原特異的抗體時，功能性雙特異性DARTTM的形成需要兩條不同的多肽鏈的相互作用，即形成異源二聚體。例如，對於雙特異性DARTTM來說，一條多肽鏈將包含VLA和VHB；該鏈的同 源二聚作用將導致兩個VLA-VHB結合位點的形成，VLA-VHB結合位點不能結合或具有不可預測的結合。相比之下，在兩條有差別的多肽鏈例如在重組表現系統中自由相互作用時，一條鏈包含VLA和VHB，而另一條包含VLB和VHA，將形成兩個有差別的結合位點：VLA-VHA和VLB-VHB。對於所有的DARTTM多肽鏈對來說，兩條鏈可能的錯誤對齊或錯誤結合是可能發生的，即VL-VL區域或VH-VH區域的相互作用；然而使用本領域已知的或者在本文舉例說明的任何基於親和力的方法例如親和層析法，容易基於適當地二聚化的結合位點的免疫特異性對功能性雙抗體進行純化。
DARTTM多肽鏈中的一條或多條可以任選地包含Fc區域區域或其部分(例如，CH2區域或CH3區域)。Fc區域或其部分可能源自任何免疫球蛋白同種型或同種異型，包括但不限於IgA、IgD、IgG、IgE和IgM。在較佳的實施方案中，Fc區域(或其部分)源自IgG。在具體實施方案中，IgG同種型是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其同種異型。在一個實施方案中，雙抗體分子包含Fc區域，該Fc區域包含獨立地選自任意免疫球蛋白同種型的CH2區域和CH3區域(即，Fc區域包含源自IgG的CH2區域和源自IgE的CH3區域，或者源自IgG1的CH2區域和源自IgG2的CH3區域等等)。可以將Fc區域在相對於構成本發明的雙抗體分子的多肽鏈的其他區域或部分的任何位置(例如，Fc區域或其部分可以位於該鏈的多肽的VL區域和VH區域二者的c端；可以位於VL區域和VH區域二者的n端；或者可以位於一個區域的N端，並且位於另一個區域的c端(即，在多肽鏈的兩個區域之間))加工到該多肽鏈中。
在DARTTM分子的多肽鏈中的Fc區域優先二聚化，導致表現 出免疫球蛋白樣特性例如Fc-FcγR相互作用的DARTTM分子的形成。構成雙抗體的Fc可能是例如由兩條多肽鏈組成的二聚體，每條鏈包含VH區域、VL區域和Fc區域。該多肽鏈的二聚作用產生了包含Fc區域的二價DARTTM，儘管結構與未修飾的二價抗體的結構不同。這些DARTTM分子較之野生型免疫球蛋白將表現出改變的表型，例如改變的血清半衰期、結合特性等等。在其他實施方案中，包含Fc區域的DARTTM分子可以是四聚體。這些四聚體包含兩條‘較重的’多肽鏈，即包含VL、VH和Fc區域的多肽鏈，以及兩條‘較輕的’多肽鏈，即包含VL和VH的多肽鏈。較輕的鏈和較重的鏈相互作用形成單體，並且該單體藉由其未配對的Fc區域相互作用形成Ig樣分子。這種Ig樣DARTTM是四價的並且可以是單特異性的、雙特異性的或四特異性的。
如上文所述的四特異性雙抗體分子的形成需要四條不同的多肽鏈的相互作用。由於潛在的鏈錯配的許多變體，這種相互作用難以在單細胞重組生產系統中有效實現。一個降低錯配概率的解決辦法是將“旋鈕入洞(knobs-into-holes)”型突變加工在期望的多肽鏈對中。這些突變有利於異源二聚作用而不是同源二聚作用。例如，就Fc-Fc相互作用而言，可以將胺基酸取代(較佳用包含形成‘旋鈕’的大側基的胺基酸例如色胺酸取代)引入CH2或CH3區域中，以使得位阻影響將阻止與類似突變的區域相互作用並將強迫該突變的區域與其中已加工了互補性突變或適應性突變的區域配對，該互補性突變或適應性突變即‘洞’(例如用甘胺酸取代)。可以將這些突變組加工在構成雙抗體分子的任何多肽對中，並且進一步加工在該對的多肽鏈的任何部分中。將蛋白質加工成有利於異源二聚作用而不是同源二聚作用的方法是本領域已知的，特別是就免疫球蛋白樣分子而言，並且被 涵蓋在本文中(見，例如，Ridgway等人(1996)“'Knobs-Into-Holes' Engineering Of Antibody CH3 Domains For Heavy Chain Heterodimerization(重鏈異源二聚作用的抗體CH3區域的‘旋鈕入洞’工程化)，”Protein Engr.9：617-621,Atwell等人(1997)“Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library(來自使用噬菌體展示文庫重塑同源二聚體的區域界面的穩定異源二聚體)，”J.Mol.Biol.270：26-35，和Xie等人(2005)“A New Format Of Bispecific Antibody：Highly Efficient Heterodimerization,Expression And Tumor Cell Lysis(雙特異性抗體的新樣式：高效的異源二聚作用、表現和腫瘤細胞裂解)，”J.Immunol.Methods 296：95-101；它們中的每一篇均藉由引用整體併入本文)。
本發明還涵蓋了包含變體Fc區域或變體鉸合-Fc區域(或其部分)的雙抗體分子，該變體Fc區域較之相當的野生型Fc區域或鉸合-Fc區域(或其部分)包含至少一種胺基酸修飾(例如，取代、插入、缺失)。包含變體Fc區域或鉸合-Fc區域(或其部分)的分子(例如抗體)與包含野生型Fc區域或鉸合-Fc區域或其部分的分子相比通常具有改變的表型。可將變體表型表示為改變的血清半衰期、改變的穩定性，改變的對細胞酶的感受性或者如在NK相依性測定或巨噬細胞相依性測定中所測定的改變的效應子功能。以上揭露了被鑑定為改變的效應子功能的Fc區域修飾。
本發明還涵蓋包含鉸合區域的分子。鉸合區域源自任何免疫球蛋白同種型或同種異型，包括IgA、IgD、IgG、IgE和IgM。在較佳的實施方案中，鉸合區域源自IgG，其中該IgG同種型是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或它們的同種異型。可以將鉸合區域與Fc區域一起加工在構成雙抗體分子 的多肽鏈中，以使得該雙抗體分子包含鉸合-Fc區域。在某些實施方案中，鉸合區域和Fc區域獨立地選自本領域已知或本文舉例說明的任何免疫球蛋白同種型。在其他實施方案中，鉸合區域和Fc區域被該多肽鏈的至少一個其他區域例如VL區域分隔。可以將鉸合區域或任選地鉸合-Fc區域加工在本發明多肽鏈中相對於該多肽鏈的其他區域或部分的任何位置。在某些實施方案中，本發明的多肽鏈包含鉸合區域，該鉸合區域在該多肽鏈的C端，其中該多肽鏈不包含Fc區域。又在其他實施方案中，本發明的多肽鏈包含鉸合-Fc區域，該鉸合-Fc區域在該多肽鏈的C端。在其他實施方案中，本發明的多肽鏈包含鉸合-Fc區域，該鉸合-Fc區域在該多肽鏈的N端。
DARTTM的多肽鏈的每個區域即VL、VH和Fc區域可被肽連接子分隔。肽連接子長度可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8或9個胺基酸。在某些實施方案中，胺基酸連接子序列是由核酸序列ggaggcggat ccggaggcggaggc(SEQ ID NO：53)編碼的GGGSGGGG(SEQ ID NO：52)。可以將DARTTM分子的多肽鏈加工成包含至少一個半胱胺酸殘基，該半胱胺酸殘基將與DARTTM的另一條多肽鏈上的對應半胱胺酸殘基相互作用以形成鏈間二硫鍵。這些鏈間二硫鍵起穩定DARTTM分子的作用，由此改善重組系統中的表現和回收，產生穩定且一致的製劑，並改善分離的及/或純化的產物的體內穩定性。可以將半胱胺酸殘基作為單個胺基酸或作為較大胺基酸序列例如鉸合區域的一部分在多肽鏈的任何部分中引入。在具體的實施方案中，可將半胱胺酸殘基加工成在多肽鏈的C端出現。在一些實施方案中，可將半胱胺酸殘基在胺基酸序列LGGC內引入多肽鏈中。在具體的實施方案中，構成本發明的DARTTM分子的多肽鏈的C端包含胺基酸序列LGGC(SEQ ID NO：54)。在另一個實施方案中，將半胱胺酸殘基在構成鉸合區的胺基酸序列例如EPKSCDKTHTCPP(SEQ ID NO：55)或ESKYGPPCPS(SEQ ID NO：56)內引入多肽中。在具體的實施方案中，本發明的DARTTM分子的多肽鏈的C端包含IgG鉸合區域的胺基酸序列，例如SEQ ID NO：55或SEQ ID NO：56。在另一個實施方案中，本發明的DARTTM分子的多肽鏈的C端包含可由核苷酸序列gttgagccca aatcttgt(SEQ ID NO：58)編碼的胺基酸序列VEPKSC(SEQ ID NO：57)。在其他實施方案中，將半胱胺酸殘基在可由核苷酸序列ctgggaggct gcttcaacag gggagagtg(SEQ ID NO：60)編碼的胺基酸序列LGGCFNRGEC(SEQ ID NO：59)內引入多肽鏈中。在具體的實施方案中，構成本發明的DARTTM的多肽鏈的C端包含胺基酸序列LGGCFNRGEC(SEQ ID NO：59)。又在其他實施方案中，將半胱胺酸殘基在可由核苷酸序列ttcaacaggg gagagtgt(SEQ ID NO：62)編碼的胺基酸序列FNRGEC(SEQ ID NO：61)內引入多肽鏈中。在具體的實施方案中，構成本發明的DARTTM的多肽鏈的C端包含胺基酸序列FNRGEC(SEQ ID NO：61)。
在某些實施方案中，雙抗體分子包含至少兩條多肽鏈，其中每一條多肽鏈都包含胺基酸序列LGGC(SEQ ID NO：54)並且藉由LCCG(SEQ ID NO：54)序列中的半胱胺酸殘基之間的二硫鍵共價連接。在另一個具體的實施方案中，雙抗體分子包含至少兩條多肽鏈，其中一條多肽鏈包含序列FNRGEC(SEQ ID NO：61)，而另一條包含鉸合區域(包含至少一個半胱胺酸殘基)，其中該至少兩條多肽鏈藉由FNRGEC(SEQ ID NO：61)中的半胱胺酸殘基與鉸合區域中的半胱胺酸殘基之間的二硫鍵共價連接。在具體的方面，負責位於鉸合區域中的二硫鍵的半胱胺酸殘基是Cys-128(根 據Kabat EU編號；位於未修飾的完整IgG重鏈的鉸合區域中)，並且在SEQ ID NO：23中的對應半胱胺酸殘基是Cys-214(根據Kabat EU編號；位於未修飾的完整IgG輕鏈的C端)(Elkabetz等人(2005)“Cysteines In CH1 Underlie Retention Of Unassembled Ig Heavy Chains(CH1中的半胱胺酸是保留未裝配的Ig重鏈的基礎)，”J.Biol.Chem.280：14402-14412)。又在其他實施方案中，將至少一個半胱胺酸殘基加工成在胺基酸鏈的N端出現。仍在其他實施方案中，將至少一個半胱胺酸殘基加工成在雙抗體分子的多肽鏈的連接子部分中出現。在另外的實施方案中，將VH區域或VL區域加工成包含較之母體VH區域或VL區域的至少一種胺基酸修飾，使得該胺基酸修飾包括用半胱胺酸取代母體胺基酸。
仍在該實施方案中的另一方面，第一多肽鏈的區域(C)包含胺基酸序列VEPKSC(SEQ ID NO：57)，該胺基酸序列源自人IgG的鉸合區域並且可由核苷酸序列gttgagccca aatcttgt(SEQ ID NO：58)編碼。在該實施方案中的另一方面，第二多肽鏈的區域(F)包含胺基酸序列VEPKSC(SEQ ID NO：57)。在該實施方案的某些方面，第一多肽鏈的區域(C)包含人κ輕鏈的C端6個胺基酸FNRGEC(SEQ ID NO：61)；並且第二多肽鏈的區域(F)包含胺基酸序列VEPKSC(SEQ ID NO：57)或鉸合區域。在該實施方案的其他方面，第二多肽鏈的區域(F)包含人κ輕鏈的C端6個胺基酸FNRGEC(SEQ ID NO：61)；並且第一多肽鏈的區域(C)包含胺基酸序列VEPKSC(SEQ ID NO：57)或鉸合區域。
鑒於前述內容將被理解的，雙特異性DARTTM的個體多肽可形成兩種同源二聚體和一種異源二聚體。在本發明的一個實施方案中，可 以將帶電的多肽添加至一條DARTTM多肽或更佳兩條DARTTM多肽的C端。藉由將雙特異性DARTTM的個體多肽選擇為帶相反電荷的帶電多肽，包含這種帶電多肽有利於形成異源二聚體並減少同源二聚體的形成。較佳地，帶正電荷的多肽將包含相當大的精胺酸、麩醯胺、組胺酸及/或賴胺酸(或這些胺基酸的混合物)含量，而帶負電荷的多肽將包含相當大的天冬胺酸或麩胺酸(或這些胺基酸的混合物)含量。包含相當大的賴胺酸含量的帶正電荷的多肽和包含相當大的麩胺酸含量的帶負電荷的多肽是特佳的。為了使這些帶相反電荷的多肽之間的靜電引力最小，較佳利用能夠自發採取螺旋構形的多肽。
因此，在較佳的實施方案中，帶正電荷的“E-捲曲”將附於用來形成雙特異性DARTTM的多肽之一，而帶負電荷的“K-捲曲”將附於另一條DARTTM多肽。特佳的E-捲曲將具有序列：(EVAALEK)4[即(SEQ ID NO：63)EVAALEKEVAALEKEVAALEKEVAALEK]。特佳的K-捲曲將具有序列：(KVAALKE)4[即(SEQ ID NO：64)KVAALKEKVAALKEKVAALKEKVAALKE]。
擁有這種E-捲曲的較佳的DARTTM多肽將具有通用序列：[VL區域]-[GGGSGGGG]-[VH區域]-[(EVAALEK)4]-GGGNS，其中VL是DARTTM的可變輕鏈Ig區域，GGGSGGGG是SEQ ID NO：52，VH是DARTTM的可變重鏈Ig區域，(EVAALEK)4是SEQ ID NO：63，並且GGGNS是SEQ ID NO：65。擁有這種K-捲曲的較佳的DARTTM多肽將具有通用序列：[VL區域]-[GGGSGGGG]-[VH區域]-[(KVAALKE)4]-GGGNS，其中VL是DARTTM的可變輕鏈Ig區域，GGGSGGGG是SEQ ID NO：52，VH是 DARTTM的可變重鏈Ig區域，(KVAALKE)4是SEQ ID NO：64，並且GGGNS是SEQ ID NO：65。
在另外的實施方案中，可將Fc區連接至E-捲曲DARTTM或K-捲曲DARTTM的E捲曲及/或K捲曲。此外，在包含Fc的DARTTM的Fc區與DARTTM VH區域之間的分隔在如下情況下是令人期望的：其中這些區域的較少的分隔安排導致在這些區域與其結合配體之間的相互作用減少或者另外妨礙DARTTM組裝。儘管可利用任何胺基酸序列的分隔物，較佳利用形成α螺旋捲曲的分隔物，以使Fc區域最大限度地遠離可變區域而延伸和突出。因為帶相反電荷的上述捲曲多肽另外起促進異源二聚體形成的作用，所以這些分子是特佳的分隔物。這些包含捲曲的Fc-DARTTM分子提供了與Fc-DARTTM類似的益處，包括改善的血清半衰期和效應子功能募集。上述E-捲曲和K-捲曲多肽對於此目的是特佳的。因此，在較佳的實施方案中，E-捲曲的包含Fc的DARTTM將具有通用序列：以D234(Kabat編號)為起始的[VL區域]-[GGGSGGGG]-[VH區域]-[(EVAALEK)4]-GGG-Fc區域，其中VL是DARTTM的可變輕鏈Ig區域，GGGSGGGG是SEQ ID NO：52，VH是DARTTM的可變重鏈Ig區域，並且(EVAALEK)4是SEQ ID NO：63。類似地，在較佳的實施方案中，K-捲曲的包含Fc的DARTTM將具有通用序列：以D234(Kabat編號)為起始的[VL區域]-[GGGSGGGG]-[VH區域]-[(KVAALEK)4]-GGG-Fc區域，其中VL是DARTTM的可變輕鏈Ig區域，GGGSGGGG是SEQ ID NO：51，VH是DARTTM的可變重鏈Ig區域，並且(KVAALEK)4是SEQ ID NO：64。
如以上所指出的，包含捲曲的DARTTM分子或包含捲曲、包 含Fc的DARTTM分子可只包含單個這種捲曲分隔物，或者它可以包含多於一個這種分隔物(例如，較佳為帶相反電荷的兩個分隔物，其中一個與DARTTM多肽的每個VH區域相連)。藉由將Fc區與這種分隔物分子相連，增強了藉由鏈交換製備Fc-DARTTM分子的二價、四價等型式的能力。因此，取決於Fc區域與DARTTM VH區域中的一個或兩個相連，能夠產生形成單體和二聚體的Fc-DARTTM分子。
1.B7-H3 DART TM 分子的多能性
本發明的雙特異性DARTTM可同時結合兩個分離且不同的表位。在某些實施方案中，這些表位來自於同一抗原。在其他實施方案中，這些表位來自於不同抗原。在較佳的實施方案中，至少一個表位結合位點對免疫效應細胞上表現的決定基(例如，CD3、CD16、CD32、CD64、T細胞受體等等)具有特異性，該決定基表現在T淋巴細胞、自然殺手(NK)細胞或其他單核細胞上。在一個實施方案中，DARTTM分子結合效應細胞決定基並且還活化該效應細胞。在這點上，本發明的DARTTM分子可表現出Ig樣功能性而不依賴於是否它們還包含Fc區域(例如，如在本領域已知或本文舉例說明的任何效應子功能測定(例如，ADCC測定)中所測定的)。在某些實施方案中，本發明的雙特異性DARTTM分子結合腫瘤細胞上的癌抗原和效應細胞決定基，同時活化該細胞。在替代實施方案中，本發明的雙特異性DARTTM分子或DARTTM分子可藉由同時結合並因此連接同一細胞上如上文所述(見背景部分)的活化性受體和抑制性受體(例如，結合CD32A和CD32B、BCR和CD32B、或IgERI和CD32B)來抑制標靶細胞諸如效應細胞的活化。在該實施方案的另一方面，雙特異性DARTTM可藉由同時結合病 毒上的兩種中和表位(例如，RSV表位；WNV表位諸如E16和E53)表現出抗病毒特性。
2.多能性B7-H3 DART TM 分子
在一個實施方案中，可以將本發明的雙特異性DARTTM分子建構成包含特異性結合B7-H3的一個表位結合區域和特異性結合半抗原例如異硫氰酸螢光素(也稱為螢光素異硫氰酸酯或FITC)的第二表位結合區域。這種DARTTM用作能夠共連接B7-H3和與螢光素接合的結合配偶體相互作用的分子的通用銜接子(“UDARTTM”)。例如，DARTTM的FITC反應臂可用於結合FITC標記的抗體，該FITC標記的抗體與參與細胞間簇集、細胞間募集、無細胞的募集、多個標靶等等的非B7-H3標靶結合。抗螢光素Mab的嵌合的小鼠Fv/人Fc型式4420可用作FITC特異性CDR區域的來源(Gruber,M.等人(1994)“Efficient Tumor Cell Lysis Mediated By A Bispecific Single Chain Antibody Expressed In Escherichia coli(由大腸桿菌中表現的雙特異性單鏈抗體介導的有效的腫瘤細胞裂解)，”J.Immunol.152(11)：5368-5374)。
3.細胞標靶特異性B7-H3 DART TM 分子
本發明的雙特異性DARTTM分子提供了靶向特定的細胞類型的獨特機會。例如，雙特異性DARTTM或DARTTM分子可被加工成包含識別標靶細胞或標靶組織類型獨特的一組抗原的表位結合位點的組合。另外，在個體抗原中的一個或兩個分別在其他組織及/或細胞類型中很常見的情況下，低親和力結合區域可用於建構DARTTM或DARTTM分子。這種低親和力結合區域將不能以用於治療目的的足夠親合力結合個體表位或抗原。然而，在兩個表位或抗原都存在於單個標靶細胞或標靶組織上的情況下， DARTTM或DARTTM分子對於該細胞或組織的親合力較之只表現這些抗原之一的細胞或組織將提高，使得該細胞或組織能夠有效地被本發明靶向。較之單特異性DARTTM或只具有對該抗原之一的特異性的抗體，這種雙特異性分子能夠表現出增強的對表現兩個標靶抗原的細胞上的一個或兩個標靶抗原的結合。
例如，可將本發明的B7-H3特異性DARTTM建構成包含如下區域：該區域是自然殺手細胞2D群(NKG2D)受體的結合配體。NKG2D受體表現在所有的人(或其他哺乳動物)自然殺手細胞上(Bauer,S.等人(1999)“Activation Of NK Cells And T Cells By NKG2D,A Receptor For Stress-Inducible MICA(應激誘導型MICA的受體NKG2D對NK細胞和T細胞的活化)，”Science 285(5428)：727-729；Jamieson,A.M.等人(2002)“The Role Of The NKG2D Immunoreceptor In Immune Cell Activation And Natural Killing(在免疫細胞活化和自然殺傷中的免疫受體)，”Immunity 17(1)：19-29)以及表現在所有CD8+ T細胞(Groh,V.等人(2001)“Costimulation Of CD8αβ T Cells By NKG2D Via Engagement By MIC Induced On Virus-Infected Cells(NKG2D借助病毒感染細胞上誘導的MIC連接對CD8αβ T細胞的共刺激)，”Nat.Immunol.2(3)：255-260；Jamieson,A.M.等人(2002)“The Role Of The NKG2D Immunoreceptor In Immune Cell Activation And Natural Killing(NKG2D免疫受體在免疫細胞活化和自然殺傷中的作用)，”Immunity 17(1)：19-29)上。這些結合配體且特別是那些正常細胞上不表現的結合配體包括視黃酸早期誘導基因-1(RAE-1)的產物組織相容性60(H60)分子和鼠UL 16-結合蛋白樣轉錄物1(MULT1)(Raulet D.H.(2003)“Roles Of The NKG2D Immunoreceptor And Its Ligands(NKG2D免疫受體及其配體的作用)，”Nature Rev.Immunol.3：781-790；Coudert,J.D.等人(2005)“Altered NKG2D Function In NK Cells Induced By Chronic Exposure To Altered NKG2D Ligand-Expressing Tumor Cells(藉由長期暴露於改變的表現NKG2D配體的腫瘤細胞誘導的NK細胞中改變的NKG2D功能)，”Blood 106：1711-1717)。與人NKG2D反應的另外的配體包括多態性MHC I類鏈相關分子MICA和MICB(Diefenbach,A.等人(1999)“Natural Killer Cells：Stress Out,Turn On,Tune In(自然殺手細胞：應激釋放，打開，調入)，”Curr.Biol.9(22)：R851-R8533；Bauer,S.等人(1999)“Activation Of NK Cells And T Cells By NKG2D,A Receptor For Stress-Inducible MICA(應激誘導型MICA的受體NKG2D對NK細胞和T細胞的活化)，”Science 285(5428)：727-729；Stephens,H.A.(2001)“MICA And MICB Genes：Can The Enigma Of Their Polymorphism Be Resolved？(MICA和MICB基因：它們的多態性之謎能被解開嗎？)”Trends Immunol.22：378-385)。MICA的序列是SEQ ID NO：66：
MICB的序列是SEQ ID NO：67：
可選地，可將本發明的DARTTM分子建構成包含如下區域：該區域是T細胞受體(“TCR”)或CD3(T細胞共受體)的結合配體。TCR被CD4+或CD8+ T細胞天然表現，並且允許這些細胞識別被抗原呈現細胞的I類或II類MHC蛋白結合並呈現的抗原肽。pMHC(肽-MHC)複合物被TCR的識別啟動細胞免疫反應的擴散，導致細胞介素的產生和抗原呈現細胞的裂解(見，例如Armstrong,K.M.等人(2008)“Conformational Changes And Flexibility In T-Cell Receptor Recognition Of Peptide-MHC Complexes(T細胞受體識別肽-MHC複合物中的構形改變和可變性)，”Biochem.J.415(Pt 2)：183-196；Willemsen,R.(2008)“Selection Of Human Antibody Fragments Directed Against Tumor T-Cell Epitopes For Adoptive T-Cell Therapy(選擇針對腫瘤T細胞表位的人抗體片段用於接受性T細胞治療)，”Cytometry A.73(11)：1093-1099；Beier,K.C.等人(2007)“Master Switches Of T-Cell Activation And Differentiation(T細胞活化和分化的主開關)，”Eur.Respir.J.29：804-812；Mallone,R.等人(2005)“Targeting T Lymphocytes For Immune Monitoring And Intervention In Autoimmune Diabetes(靶向用於自體免疫性糖尿病的免疫監測和干預的T淋巴細胞)，”Am.J.Ther.12(6)：534-550)。CD3是結合TCR的受體(Thomas,S.等人(2010)“Molecular Immunology Lessons From Therapeutic T-Cell Receptor Gene Transfer(治療性T細胞受體基因轉移的分子免疫學教訓)，”Immunology 129(2)：170-177；Guy,C.S.等人(2009)“Organization Of Proximal Signal Initiation At The TCR：CD3 Complex(TCR：CD3複合物近端信號啟動的組織)，”Immunol.Rev.232(1)：7-21；St. Clair,E.W.(Epub 2009年10月12日)“Novel Targeted Therapies For Autoimmunity(用於自體免疫的新穎靶向治療)，”Curr.Opin.Immunol.21(6)：648-657；Baeuerle,P.A.等人(Epub 2009年6月9日)“Bispecific T-Cell Engaging Antibodies For Cancer Therapy(用於癌症治療的雙特異性T細胞銜接抗體)，”Cancer Res.69(12)：4941-4944；Smith-Garvin,J.E.等人(2009)“T Cell Activation(T細胞活化)，”Annu.Rev.Immunol.27：591-619；Renders,L.等人(2003)“Engineered CD3 Antibodies For Immunosuppression(用於免疫抑制的工程化CD3抗體)，”Clin.Exp.Immunol.133(3)：307-309)。
藉由將這些DARTTM分子建構成另外包含能夠結合例如標靶細胞表面上存在的受體的至少一個表位結合區域，這些DARTTM分子將因此能夠結合這些標靶細胞並由此促使這些標靶細胞展示自然殺手細胞2D群(NKG2D)受體或TCR的結合配體(不論哪個存在於標靶細胞結合的DARTTM上)(見例如，Germain,C.等人(2008)“Redirecting NK Cells Mediated Tumor Cell Lysis By A New Recombinant Bifunctional Protein(新的重組雙功能蛋白使NK細胞介導的腫瘤細胞裂解重導向)，”Prot.Engineer.Design Selection 21(11)：665-672)。這些DARTTM可用於使任何期望的標靶細胞轉向進入是NK細胞介導的細胞裂解或T細胞介導的細胞毒性作用的標靶的細胞中。在一個實施方案中，能夠結合存在於標靶細胞表面上的受體的DARTTM的表位結合區域是結合腫瘤相關抗原以使這些腫瘤細胞轉向進入NK細胞介導的細胞裂解或T細胞介導的細胞毒性作用的基質的表位。特別感興趣的是如下腫瘤相關抗原：乳腺癌抗原、卵巢癌抗原、前列腺癌抗原、子宮頸癌抗原、胰腺癌抗原、肺癌抗原、膀胱癌抗原、結腸癌抗原、睾丸 癌抗原、惡性膠質瘤癌抗原、B細胞惡性腫瘤相關抗原、多發性骨髓瘤相關抗原、非霍奇金氏淋巴瘤相關抗原或慢性淋巴細胞白血病相關抗原。
用於這些用途的適合的腫瘤相關抗原包括A33(結腸直腸癌抗原；Almqvist,Y. 2006,Nucl Med Biol.Nov；33(8)：991-998)；B1(Egloff,A.M.等人2006,Cancer Res.66(1)：6-9)；BAGE(Bodey,B.2002 Expert Opin Biol Ther.2(6)：577-84)；β-連環蛋白(Prange W.等人2003 J Pathol.201(2)：250-9)；CA125(Bast,R.C.Jr.等人2005 Int J Gynecol Cancer 15 Suppl 3：274-81)；CD5(Calin,G.A.等人2006 Semin Oncol.33(2)：167-73；CD19(Troussard,X.等人1998 Hematol Cell Ther.40(4)：139-48)；CD20(Thomas,D.A.等人2006 Hematol Oncol Clin North Am.20(5)：1125-36)；CD22(Kreitman,R.J.2006 AAPS J.18；8(3)：E532-51)；CD23(Rosati,S.等人2005 Curr Top Microbiol Immunol.5；294：91-107)；CD25(Troussard,X.等人1998 Hematol Cell Ther.40(4)：139-48)；CD27(Bataille,R.2006 Haematologica 91(9)：1234-40)；CD28(Bataille,R.2006 Haematologica 91(9)：1234-40)；CD36(Ge,Y.2005 Lab Hematol.11(1)：31-7)；CD40/CD154(Messmer,D.等人2005 Ann N Y Acad Sci.1062：51-60)；CD45(Jurcic,J.G.2005 Curr.Oncol Rep.7(5)：339-46)；CD56(Bataille,R.2006 Haematologica 91(9)：1234-40)；CD79a/CD79b(Troussard,X.等人1998 Hematol Cell Ther.40(4)：139-48；Chu,P.G.等人2001 Appl Immunohistochem Mol Morphol.9(2)：97-106)；CD103(Troussard,X.等人1998 Hematol Cell Ther.40(4)：139-48)；CDK4(Lee,Y.M.等人2006 Cell Cycle 5(18)：2110-4)；CEA(癌胚抗原；Mathelin,C.2006 Gynecol Obstet Fertil.34(7-8)：638-46；Tellez-Avila,F.I.等人2005 Rev Invest Clin. 57(6)：814-9)；CTLA4(Peggs,K.S.等人2006 Curr Opin Immunol.18(2)：206-13)；EGF-R(表皮生長因子受體；Adenis,A.等人2003 Bull Cancer.90 Spec No：S228-32)；Erb(ErbB1；ErbB3；ErbB4；Zhou,H.等人2002 Oncogene 21(57)：8732-40；Rimon,E.等人2004 Int J Oncol.24(5)：1325-38)；GAGE(GAGE-1；GAGE-2；Akcakanat,A.等人2006 Int J Cancer.118(1)：123-8)；GD2/GD3/GM2(Livingston,P.O.等人2005 Cancer Immunol Immunother.54(10)：1018-25)；gp100(Lotem,M.等人2006 J Immunother.29(6)：616-27)；HER-2/neu(Kumar,Pal S等人2006 Semin Oncol.33(4)：386-91)；人乳頭狀瘤病毒-E6/人乳頭狀瘤病毒-E7(DiMaio,D.等人2006 Adv Virus Res.66：125-59；KSA(17-1A)(Ragupathi,G.2005 Cancer Treat Res.123：157-80)；MAGE(MAGE-1；MAGE-3；(Bodey,B.2002 Expert Opin Biol Ther.2(6)：577-84)；MART(Kounalakis,N.等人2005 Curr Oncol Rep.7(5)：377-82；MUC-1(Mathelin,C.2006 Gynecol Obstet Fertil.34(7-8)：638-46)；MUM-1(Castelli,C.等人2000 J Cell Physiol.182(3)：323-31)；N-乙醯胺基葡萄糖轉移酶(Dennis,J.W.1999 Biochim Biophys Acta.6；1473(1)：21-34)；p15(Gil,J.等人2006 Nat Rev Mol Cell Biol.7(9)：667-77)；PSA(前列腺特異抗原；Cracco,C.M.等人2005 Minerva Urol Nefrol.57(4)：301-11)；PSMA(Ragupathi,G.2005 Cancer Treat Res.123：157-80)；sTn(Holmberg,L.A.2001 Expert Opin Biol Ther.1(5)：881-91)；TNF受體(TNF-α受體、TNF-ß受體；或TNF-γ受體；van Horssen,R.等人2006 Oncologist.11(4)：397-408；Gardnerova,M.等人2000 Curr Drug Targets.1(4)：327-64)；或VEGF受體(O’Dwyer.P.J.2006 Oncologist.11(9)：992-8)。
用於這種用途的另外的腫瘤相關抗原(及揭露這些抗原的特異性反應抗體的出版物)包括ADAM-9(美國專利公開第2006/0172350號；PCT公開第WO 06/084075號)；ALCAM(PCT公開第WO 03/093443號)；羧肽酶M(美國專利公開第2006/0166291號)；CD46(美國專利第7,148,038號；PCT公開第WO 03/032814號)；細胞角蛋白8(PCT公開第WO 03/024191號)；蝶素受體(並且特別是EphA2(美國專利第7,569,672號；PCT公開第WO 06/084226號)；整合素α-V-β-6(PCT公開第WO 03/087340號)；JAM-3(PCT公開第WO 06/084078號)；KID3(PCT公開第WO 05/028498號)；KID31(PCT公開第WO 06/076584號)；LUCA-2(美國專利公開第2006/0172349號；PCT公開第WO 06/083852號)；抑瘤素M(抑瘤素受體β)(美國專利第7,572,896號；PCT公開第WO 06/084092號)；PIPA(美國專利第7,405,061號；PCT公開第WO 04/043239號)；ROR1(美國專利第5,843,749號)；以及運鐵蛋白受體(美國專利第7,572,895號；PCT公開第WO 05/121179號)。
同樣感興趣的是對具體感染劑特異的抗原，該感染劑例如：病毒劑，包括但不限於人免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)、流感病毒、人乳頭狀瘤病毒(HPV)、足口病(克沙奇病毒)、狂犬病毒、單純皰疹病毒(HSV)，以及胃腸炎的病原體，包括輪狀病毒、腺病毒、杯狀病毒、星狀病毒和諾沃克病毒；細菌劑，包括但不限於：大腸桿菌(E.coli)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella thyphimurium)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、霍亂弧菌(Vibrio cholerae)、淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)、幽門螺旋菌(Helicobacter pylori)、流感嗜血桿菌(Hemophilus influenzae)、痢疾志賀桿菌(Shigella dysenteriae)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)和肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)，以及真菌劑和寄生蟲諸如梨形鞭毛蟲屬(Giardi)。
在一些實施方案中，將本發明的分子加工成較之模版分子的可比較的部分包含改變的醣化模式或改變的糖形。加工的糖形可用於多種目的，包括但不限於增強效應子功能。加工的糖形可藉由本領域中具有通常知識者已知的任何方法產生，例如藉由使用加工的或變異的表現菌株，藉由與一種或多種酶例如DI N-乙醯胺基葡萄糖轉移酶III(GnTI11)共表現，藉由在多種生物體或來自多種生物體的細胞系中表現本發明的DARTTM，或者藉由在將DARTTM表現並純化後修飾碳水化合物。用於產生加工的糖形的方法是本領域已知的並且包括但不限於在以下文獻中描述的那些方法：Umana等人(1999)“Engineered Glycoforms Of An Antineuroblastoma IgG1 With Optimized Antibody-Dependent Cellular Cytotoxic Activity(具有最佳化的抗體相依細胞毒活性的抗神經胚細胞瘤IgG1的加工的糖形)，”Nat.Biotechnol 17：176-180；Davies等人(2001)“Expression Of GnTIII In A Recombinant Anti-CD20 CHO Production Cell Line：Expression Of Antibodies With Altered Glycoforms Leads To An Increase In Adcc Through Higher Affinity For Fc Gamma RIII(GnTIII在重組的抗CD20 CHO生產細胞系中的表現：具有改變的糖形的抗體的表現經由對FcγRIII的更高的親和力導致提高Adcc)，”Biotechnol Bioeng 74：288-294；Shields等人(2002)“Lack Of Fucose On Human IgG1 N-Linked Oligosaccharide Improves Binding To Human Fcgamma RIII And Antibody-Dependent Cellular Toxicity(人IgG1 N-連接的寡糖上缺乏海藻糖改善了與人FcγRIII的結合和抗體相依細胞毒性作用)，”J Biol Chem 277：26733-26740；Shinkawa等人(2003)“The Absence Of Fucose But Not The Presence Of Galactose Or Bisecting N-Acetylglucosamine Of Human IgG1 Complex-Type Oligosaccharides Shows The Critical Role Of Enhancing Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity(人IgG1複合物型寡糖的不存在海藻糖而不是存在半乳糖或二等分N-乙醯葡糖胺顯示了增強的抗體相依細胞毒作用的關鍵作用)，”J Biol Chem 278：3466-3473)US 6,602,684；USSN 10/277,370；USSN 10/113,929；PCT WO 00/61739A1；PCT WO 01/292246A1；PCT WO 02/311140A1；PCT WO 02/30954A1；PotillegentTM技術(Biowa,Inc.Princeton,NJ)；GlycoMAbTM醣化工程技術(GLYCART biotechnology AG,Zurich,Switzerland)；它們中的每一篇均藉由引用整體併入本文。見，例如，WO 00061739；EA01229125；US 20030115614；Okazaki等人(2004)“Fucose Depletion From Human IgG1 Oligosaccharide Enhances Binding Enthalpy And Association Rate Between IgG1 And FcGammaRIIIA(人IgG1寡糖的海藻糖消除增強了IgG1與FcγRIIIA之間的結合焓和締合速率)，”JMB,336：1239-49，它們中的每一篇均藉由引用整體併入本文。
本發明還涵蓋加入非天然胺基酸來產生本發明的DARTTM。這些方法是本領域中具有通常知識者已知的，諸如那些使用天然生物合成機構允許將非天然胺基酸加入蛋白中的方法，見，例如，Wang等人(2002)“Expanding The Genetic Code(擴展遺傳密碼)，”Chem.Comm.1： 1-11；Wang等人(2001)“Expanding The Genetic Code Of Escherichia coli(擴展大腸桿菌的遺傳密碼)，”Science,292：498-500；van Hest等人(2001)“Protein-Based Materials,Toward A New Level Of Structural Control(基於蛋白的材料：達到結構控制的新等級)，"Chem.Comm.19：1897-1904，它們中的每一篇均藉由引用整體併入本文。替代策略聚焦於負責胺基醯基-tRNA的生物合成的酶，見，例如，Tang等人(2001)“Biosynthesis Of A Highly Stable Coiled-Coil Protein Containing Hexafluoroleucine In An Engineered Bacterial Host(包含六氟亮胺酸的高度穩定的捲曲螺旋蛋白在工程化細菌宿主中的生物合成)，”J.Am.Chem.Soc.123(44)：11089-11090；Kiick等人(2001)“Identification Of An Expanded Set Of Translationally Active Methionine Analogues In Escherichia coli(大腸桿菌中的一組擴展的翻譯活性甲硫胺酸類似物的鑑定)，”FEBS Lett.502(1-2)：25-30；它們中的每一篇均藉由引用整體併入本文。在一些實施方案中，本發明涵蓋了藉由添加或缺失醣化位點來修飾本發明的分子的VL、VH或Fc區域的方法。用於修飾蛋白的碳水化合物的方法是本領域已知的並且涵蓋在本發明之內，見，例如，美國專利第6,218,149號；EP 0 359 096 B1；美國公開第US 2002/0028486號；WO 03/035835；美國公開第2003/0115614號；美國專利第6,218,149號；美國專利第6,472,511號；藉由引用將所有這些文獻整體併入本文。
VIII.出於治療目的使用B7-H3調節劑和抗B7-H3抗體的方法
針對B7-H3的單株抗體可出於治療目的用於患有癌症和其他疾病的個體中。用抗B7-H3抗體治療可涉及如上所述在體外和體內複合物 的形成。在一個實施方案中，單株抗體抗B7-H3可結合並減少癌細胞的增殖。應理解抗體以促進生理(例如體內)條件下的結合的濃度施用。在另一個實施方案中，針對B7-H3的單株抗體可用於針對不同組織諸如結腸、肺、乳腺、前列腺、卵巢、胰腺、腎的癌細胞和其他類型癌症諸如肉瘤的免疫治療。在一個實施方案中，單株抗體抗B7-H3單獨可結合並減少癌細胞中的細胞分裂。在另一個實施方案中，單株抗體抗B7-H3可結合癌細胞並延遲轉移的形成。仍在另一個實施方案中，給予患有癌症的個體抗B7-H3抗體的舒減療法。癌症個體的舒減療法包括治療或減少疾病的不利症狀或由給予疾病的其他治療產生的醫源性症狀，但不直接影響癌症進展。這包括用於減輕疼痛、營養支持、性別問題、心理困擾、抑鬱、疲勞、精神疾病、噁心、嘔吐等等的治療。
在這些情況下，抗B7-H3抗體可以與增強或引導個體本身的免疫反應的劑諸如加強ADCC的劑一起施用。
仍在另一個實施方案中，可將抗B7-H3抗體與放射性分子、毒素(例如，卡奇黴素)、化學治療分子、脂質體或其他包含化學治療化合物的囊泡接合或締合，並且施用於需要這種治療的個體以將這些化合物靶向包含由該抗體識別的抗原的癌細胞並因此消除癌細胞或病態細胞。不受限於任何具體理論，抗B7-H3抗體被表面帶有B7-H3的細胞內化，由此將接合部分遞送至細胞以誘導治療作用。又在另一個實施方案中，在手術除去表現該抗原的癌症時，該抗體可用作輔助治療以便延遲轉移的形成。也可以在手術前在患有表現該抗原的腫瘤的個體中施用該抗體(新輔助治療)以減少腫瘤的大小並因此使能夠手術或簡化手術，在手術過程中不損害組 織及/或減少產生的外貌損傷。
在本發明的實踐中考慮細胞週期給藥。在這些實施方案中，化學治療劑用於使腫瘤或其他標靶病態細胞的細胞週期同步在預定階段。隨後，進行本發明的抗B7-H3抗體(單獨或與另外的治療部分一起)的施用。在替代實施方案中，在施加第二輪治療之前，使用抗B7-H3抗體同步細胞週期並減少細胞分裂；該第二輪可以是施加抗B7-H3抗體及/或另外的治療部分。
化學治療劑包括放射性分子、也稱為細胞毒素或細胞毒劑的毒素，其包括對癌細胞的生活力有害的任何劑、劑和脂質體或其他包含化學治療化合物的囊泡。適合的化學治療劑的例子包括但不限於：1-去氫睾酮、5-氟尿嘧啶胺烯咪胺、6-巰嘌呤、6-硫鳥嘌呤、放線菌素D、阿黴素、阿地白介素、烷化劑、別嘌醇鈉、六甲蜜胺、胺磷汀、阿那曲唑、安麯黴素(AMC))、抗有絲分裂劑、順式二氯二胺鉑(II)(DDP)順鉑)、二氯二胺基鉑、蒽環、抗生素、抗代謝物、門冬醯胺酶、BCG活疫苗(膀胱內)、倍他米松磷酸鈉和醋酸倍他米松、比卡魯胺、硫酸博來黴素、白消安、亞葉酸鈣(calcium leucouorin)、卡奇黴素、卡培他濱、卡鉑、洛莫司汀(CCNU)、卡莫司汀(BSNU)、苯丁酸氮芥、順鉑、克拉屈濱、秋水仙素、結合型雌激素、環磷醯胺(cyclophosphamide)、Cyclothosphamide、阿糖胞苷、阿糖胞苷、細胞鬆弛素B、環磷醯胺(cytoxan)、達卡巴嗪、更生黴素、更生黴素(從前的放線菌素)、鹽酸柔紅黴素(daunirubicin HCL)、檸檬酸柔紅黴素(daunorucbicin citrate)、地尼白介素白喉毒素連接子(denileukin diftitox)、右雷佐生、二溴甘露醇、二羥蒽二酮(dihydroxyanthracindione)、 多西他賽、甲磺酸多拉司瓊、鹽酸阿黴素、屈大麻酚、大腸桿菌L-門冬醯胺酶、依米丁、阿爾法依伯汀、歐文菌屬L-門冬醯胺酶、酯化的雌激素、雌二醇、雌莫司汀磷酸鈉、溴化乙錠、乙炔基雌二醇、羥乙二磷酸鹽(etidronate)、依託泊苷嗜橙菌因子、磷酸依託泊苷、非格司亭、氮尿苷、氟康唑、磷酸氟達拉濱、氟尿嘧啶、氟他胺、亞葉酸、鹽酸吉西他濱、糖皮質激素、醋酸戈舍瑞林、短桿菌肽D、鹽酸格拉司瓊、羥基脲、鹽酸伊達比星、異環磷醯胺、干擾素α-2b、鹽酸伊立替康、來曲唑、亞葉酸鈣、醋酸亮丙立德、鹽酸左旋咪唑、利多卡因、洛莫司汀、類美登素、鹽酸氮芥、醋酸甲羥孕酮、醋酸甲地孕酮、鹽酸美法侖、巰嘌呤(mercaptipurine)、美司鈉(mesna)、甲胺蝶呤、甲睾酮、光輝黴素、絲裂黴素C、米托坦、米托蒽醌、尼魯米特、醋酸奧曲肽、鹽酸昂丹司瓊、紫杉醇、帕米膦酸二鈉、噴司他丁、鹽酸毛果芸香堿、吡利黴素(plimycin)、聚苯丙生20(與卡莫司汀植入劑)、卟吩姆鈉、普魯卡因、鹽酸丙卡巴肼、普萘洛爾、利妥昔單抗、沙格司亭、鏈唑黴素、它莫西芬、紫杉酚、替尼泊苷、tenoposide、睾內酪、丁卡因、噻替派苯丁酸氮芥(thioepa chlorambucil)、硫鳥嘌呤、噻替派、鹽酸托泊替康、檸檬酸托瑞米芬、曲妥珠單抗、維A酸、戊柔比星、硫酸長春堿、硫酸長春新堿以及酒石酸長春瑞濱。
在較佳的實施方案中，細胞毒素在分裂或快速分裂細胞中特別有效，使得非分裂細胞相對不受毒性效應損害。
本發明的抗體可以被內化在它們所結合的病態細胞或癌細胞中並因此對治療性應用特別有用，例如，將需要被內化的毒素為其不利活性遞送到細胞中。這些毒素的例子包括但不限於肥皂草毒素、卡奇黴素、 阿瑞斯他丁和類美登素。
可將本發明的抗體或多肽與放射性分子、毒素或其他治療劑或與脂質體或其他包含治療劑的囊泡直接或間接地共價或非共價締合(包括接合或連接)。只要抗體能夠結合它的標靶B7-H3，就可將該抗體在沿抗體的任何位置與放射性分子、毒素或化學治療分子相連。
可將毒素或化學治療劑與適合的單株抗體並行施用(在單株抗體施用前、施用後或施用過程中施用)，或者與適合的單株抗體直接或間接(例如，經由連接基團或可選地經由具有適當附著位點的連接分子，諸如在美國專利第5,552,391號中描述的平臺分子)偶聯(例如共價鍵合)。可使用本領域已知的方法將本發明的毒素或化學治療劑與特定的靶向蛋白直接偶聯。例如，當劑與抗體各自擁有能夠彼此進行反應的取代基時，它們之間直接反應是可能的。例如，在一個上的親核基團諸如胺基或巰基基團可能與另一個上的包含羰基的基團諸如酸酐或醯基鹵或者與包含良好脫離基(例如鹵化物)的烷基(alkyl)進行反應。
還可經由微載體將抗體或多肽與化學治療劑相連。術語“微載體”是指在水中不可溶並且具有如下大小的生物可降解或生物不可降解的顆粒：小於約150μm的大小，120μm或100μm大小，更常見小於約50-60μm，較佳小於約10μm、5μm、2.5μm、2μm或1.5μm。微載體包括“奈米載體”，它們是具有小於約1μm、較佳小於約500nm大小的微載體。這些顆粒是本領域已知的。固相微載體可以是從生物相容的天然存在的聚合物、合成的聚合物或合成的共聚物形成的顆粒，它們可以包括或不包括從瓊脂糖或交聯的瓊脂糖以及其他本領域已知的生物可降解材料形成的微載體。 生物可降解固相微載體可以從如下聚合物中形成：該聚合物在哺乳動物生理學條件下是可降解的(例如，聚(乳酸)、聚(乙醇酸)以及它們的共聚物)或易受侵蝕的(例如，聚(原酸酯)，諸如3,9-二亞乙基-2,4,8,10-四氧雜螺[5.5]十一烷(DETOSU)，或聚(酸酐)，諸如癸二酸的聚(酸酐))。微載體也可以為液相(例如，基於油或脂質)，諸如脂質體，沒有抗原的iscom(免疫刺激複合物，它們是膽固醇與磷脂、佐劑活性的皂苷的穩定複合物)，或者見於水包油或油包水乳劑中的小滴或微胞，只要該液相微載體是生物可降解的。生物可降解的液相微載體通常加入生物可降解的油，許多生物可降解的油是本領域已知的，包括角鯊烯和植物油。微載體在形狀上通常為球狀，但是偏離球形的微載體也是可接受的(例如，橢圓體、棒狀等等)。由於微載體的不溶性質(相對於水而言)，微載體可從水或基於水(含水)的溶液中濾過。
本發明的抗體或多肽接合物可包括雙功能連接子，該雙功能連接子包含能夠與毒劑或化學治療劑偶聯的基團和能夠與抗體偶聯的基團。連接子能夠作為間隔抗體與劑以避免妨礙結合能力的間隔物發揮功能。連接子可以是可裂解的或不可裂解的。連接子還用於提高在劑或抗體上的取代基的化學反應性，並因此提高偶聯效率。化學反應性的提高還可以促進劑或劑上的官能團的使用，該劑或劑上的官能團的使用在其他情況下是不可能的。可藉由本領域已知的手段將雙功能連接子與抗體偶聯。例如，可將包含活性酯部分的連接子諸如N-羥基丁二醯亞胺酯用於藉由醯胺連接與抗體中的賴胺酸殘基偶聯。在另一個實施方案中，可將包含親核胺或肼殘基的連接子與藉由抗體碳水化合物殘基的糖酵解氧化所產生的醛基 相偶聯。除了這些直接的偶聯方法以外，可憑藉中間載體諸如胺基葡聚糖將連接子與抗體間接地偶聯。在這些實施方案中，修飾的連接是藉由賴胺酸、碳水化合物或中間載體。在一個實施方案中，連接子與蛋白中的游離硫醇殘基以位點選擇性方式偶聯。適合於與蛋白上的硫醇基選擇性偶聯的部分是本領域已知的。例子包括二硫化物化合物、α-鹵代羰基和α-鹵代羧基化合物以及馬來醯亞胺。當親核胺官能與&#945；-鹵代羰基或羧基存在於相同的分子中時，存在經由該胺的分子內烷化發生環化的可能。防止這種問題的方法是本領域中具有通常知識者已知的，例如藉由製備如下分子：在該分子中胺和&#945；-鹵素官能被非柔性基團諸如芳基或反式烯烴分隔，該非柔性基團使得從立體化學上不利於不期望的環化。見，例如，用於經由二硫化物部分製備類美登素與抗體的接合物的美國專利第6,441,163號。
可用於製備抗體-藥物接合物的可裂解的連接子之一是基於順烏頭酸的酸不穩定連接子，它利用不同的細胞內區室的酸性環境諸如在受體介導的胞飲作用過程中遇到的內體和溶酶體。見，例如，用於製備道諾黴素與大分子載體的接合物的Shen,W.C.等人(1981)(“cis-Aconityl Spacer Between Daunomycin And Macromolecular Carriers：A Model Of pH-Sensitive Linkage Releasing Drug From A Lysosomotropic Conjugate(道諾黴素與大分子載體之間的順烏頭基間隔物：從抗溶酶體接合物中釋放藥物的pH敏感連接的模型)，”Biochem.Biophys.Res.Comtnun.102：1048-1054(1981))；用於製備柔紅黴素與抗黑色素瘤抗體的接合物的Yang等人(1988)(“Pharmacokinetics And Mechanism Of Action Of A Doxorubicin-Monoclonal Antibody 9.2.27 Conjugate Directed To A Human Melanoma Proteoglycan(針對 人黑色素瘤蛋白聚糖的阿黴素-單株抗體9.2.27接合物的藥物代謝動力學和作用機制)，”J.Natl.Canc.Inst.80：1154-1159)；以相似的方式使用酸不穩定的連接子製備柔紅黴素與抗T細胞抗體的接合物的Dillman等人(1988)(“Superiority Of An Acid-Labile Daunorubicin-Monoclonal Antibody Immunoconjugate Compared To Free Drug(酸不穩定的柔紅黴素-單株抗體免疫接合物相較於游離藥物的優越性)，”Cancer Res.48：6097-6102)；以及用於藉由肽間隔物臂連接柔紅黴素與抗體的Trouet等人(1982)“A Covalent Linkage Between Daunorubicin And Proteins That Is Stable In Serum And Reversible By Lysosomal Hydrolases,As Required For A Lysosomotropic Drug-Carrier Conjugate：In Vitro And In Vivo Studies(抗溶酶體藥物-載體接合物所需的在血清中穩定並且溶酶體水解酶可逆的柔紅黴素與蛋白之間的共價連接：體外和體內研究)，”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)79：626-629)。
可藉由本領域已知的任何方法將本發明的抗體(或多肽)與射性分子或毒素接合(連接)。對於放射標記抗體的方法的討論(見，CANCER THERAPY WITH MONOCLONAL ANTIBODIES(單株抗體的癌症治療)，D.M.Goldenberg(編)CRC Press,Boca Raton,1995)。適合的毒素包括：紫杉烷、類美登素、阿瑞斯他丁(例如單甲基阿瑞斯他丁(MMAE)、單甲基阿瑞斯他丁F(MMAF)、阿瑞斯他丁E(AE)等等)(諸如那些在美國專利第5,208,020號；第5,416,064號；第6,333,410號；第6,340,701號；第6,372,738號；第6,436,931號；第6,441,163號；第6,596,757號；第7,276,497號；第7,585,857號；或第7,851,432號中揭露的)、卡奇黴素、蒽環類抗生素(例如阿黴素)、CC-1065類似物、多西他賽；組織蛋白酶B或E；蓖麻毒蛋 白、白樹毒素、假單胞菌外毒素、白喉毒素和RNA酶；tiuxetan或毒性放射性同位素(例如90Y、131I、177Lu、186Re、188Re、211At、212Bi、213Bi、225Ac等等)。
可選地，如在美國專利第4,676,980號中所述，可將抗體與第二抗體接合以形成抗體異接合物(heteroconjugate)。交聯抗體的形成能夠使免疫系統靶向特定類型的細胞，例如表現B7-H3的癌細胞或病態細胞。
本發明還提供了使用與化學治療劑聯合或化學治療劑連接的抗B7-H3抗體或結合B7-H3的其他實施方案來延遲患有癌症(包括但不限於，前列腺癌、肺癌或腎癌)的個體中的轉移形成的方法。在一些實施方案中，抗體是非人抗B7-H3抗體的人源化形式或嵌合形式。
又在另一個實施方案中，在手術除去表現抗原的癌症以便延遲轉移的形成時，抗體可用作佐劑治療。也可以在手術前在患有表現該抗原的腫瘤的個體中施用該抗體或與化學治療劑相締合的抗體(新輔助治療)以減少腫瘤的大小並因此使能夠手術或簡化手術，在手術過程中不損害組織及/或減少產生的外貌損傷。
又在另一個實施方案中，本文所述的B7-H3結合組合物中的任何一種能夠結合表現B7-H3的癌細胞並且誘導針對表現B7-H3的癌細胞的主動免疫反應。在一些情況下，主動免疫反應能夠引起癌細胞死亡(例如，結合癌細胞的抗體誘導程序化細胞死亡)或者抑制癌細胞的生長(例如，阻斷細胞週期進展狀態)。在其他情況下，本文所述的任何一種新穎抗體能夠結合癌細胞並且抗體相依細胞毒作用(ADCC)能夠消除抗B7-H3結合的癌細胞。因此，本發明提供了刺激免疫反應的方法，該方法包括施用 本文所述的任何一種組合物。
在一些情況下，抗體結合還能夠活化細胞免疫反應和體液免疫反應並募集更多的自然殺手細胞或增加的細胞介素(例如，IL-2、IFN-γ、IL-12、TNF-α、TNF-β等等)的產生，該細胞介素進一步活化個體的免疫系統來破壞癌細胞。又在另一個實施方案中，抗B7-H3抗體能夠結合癌細胞並且巨噬細胞或者其他吞噬細胞能夠調理癌細胞。
抗B7-H3抗體或其片段的多種製劑可供施用。在一些實施方案中，抗B7-H3抗體或其片段可以未稀釋而施用。除了藥理活性劑之外，本發明的組合物可包含適合的藥學上可接受的載體，包括賦形劑和助劑，該賦形劑和助劑是本領域已知並且為促進藥理有效物質的施用或促進活性化合物加工成可藥用以遞送到作用位點的製品的相對惰性的物質。例如，賦形劑能夠給予形狀或稠度或者充當稀釋劑。適合的賦形劑包括但不限於穩定劑、濕潤劑和乳化劑、不同滲透性的鹽、囊封劑、緩衝劑和皮膚穿透增強劑。
用於腸胃外施用的適合製劑包括處於水溶形式的活性化合物例如水溶性鹽的水溶液。另外，可以施用活性化合物的懸浮液作為適當的油性注射懸浮液。適合的親脂性溶劑或媒介物包括脂肪油(例如芝麻油)，或合成的脂肪酸酯，例如油酸乙酯或甘油三酯。含水的注射懸浮液可以含有增加該懸浮液粘度的物質，包括例如羧甲基纖維素鈉、山梨醇及/或葡聚糖。任選地，懸浮液也可以含有穩定劑。脂質體也可以用於將遞送到細胞中的劑封入囊內。
可將根據本發明的用於系統施用的藥物製劑配製成腸施 用、腸胃外施用或局部施用。實際上，所有三種類型的製劑可同時用於達成活性成分的系統施用。用於腸胃外和非腸胃外藥物遞送的賦形劑以及製劑敍述在REMINGTON：THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY(雷明頓：制藥科學與實踐)，第21版，Lippincott Williams & Wilkins Publishing(2005)中。適合口服施用的製劑包括硬明膠膠囊或軟明膠膠囊，丸劑、包括膜衣錠劑在內的錠劑、酏劑、懸浮劑、糖漿劑或吸入劑，以及它們的控制釋放形式。一般而言，這些劑被配製成藉由注射(例如，腹膜內、靜脈內、皮下、肌內等等)施用，但也可以使用其他的施用形式(例如，口服，粘膜等等)。因此，抗B7-H3抗體較佳地與藥學上可接受的媒介物諸如鹽水、林格氏溶液、右旋糖溶液等聯合。
具體的給藥方案即劑量、計時和重複將取決於具體的個體和該個體的醫療史。一般而言，施用如下劑量：至少約100μg/kg體重、更佳為至少約250μg/kg體重、甚至更佳為至少約750μg/kg體重、甚至更佳為至少約3mg/kg體重、甚至更佳為至少約5mg/kg體重、甚至更佳為至少約10mg/kg體重。
經驗考慮諸如半衰期一般將有助於劑量的確定。與人免疫系統相容的抗體諸如人源化抗體或全人抗體可用於延長該抗體的半衰期並防止該抗體被宿主的免疫系統攻擊。可以隨療程確定並調整施用頻率，並且它是基於減少癌細胞的數目、保持癌細胞的減少、減少癌細胞的增殖或延遲轉移的形成。可選地，抗B7-H3抗體的持續不斷釋放的製劑可能是合適的。多種用於達成持續釋放的製劑和裝置是本領域已知的。
在一個實施方案中，已給予一次或多次施用的個體中抗 B7-H3抗體的劑量可按經驗確定。給予個體遞增劑量的抗B7-H3抗體。為了評定抗B7-H3抗體的療效，可追蹤具體癌症疾病狀態的標記。這些標記包括：經由觸診和目測觀察直接測量腫瘤大小、藉由x射線或其他成像技術間接測量腫瘤大小；如藉由對腫瘤樣品的直接的腫瘤活組織檢查和顯微鏡檢查所評定的改善；測量間接的腫瘤標記(例如，前列腺癌的PSA)、疼痛或麻痹的減少；改善的語言、視力、呼吸或與腫瘤相關的其他失能；增加的食欲；或藉由接受的測試測量的生活品質的提高和存活的延長。將對本領域中具有通常知識者明顯的是，劑量將隨以下因素而改變：個體、癌症類型、癌症階段(不論是否癌症已開始轉移到個體中的其他位置)、以及使用的歷史治療和並行治療。
其他製劑包括本領域已知的適合的遞送形式，包括但不限於載體，諸如脂質體。見，例如，Mahato等人(1997)“Cationic Lipid-Based Gene Delivery Systems：Pharmaceutical Perspectives(基於陽離子脂質的遞送系統：藥學前景)，”Pharm.Res.14：853-859。脂質體製品包括但不限於細胞轉染劑、多層囊泡和單層囊泡。
在一些實施方案中，可存在多於一種抗體。抗體可以是單株或多株的。這些組合物可含有至少一種、至少兩種、至少三種、至少四種、至少五種不同的對癌、腺癌、肉瘤或腺肉瘤具有反應性的抗體。可將抗B7-H3抗體與一種或多種對器官中的癌、腺癌、肉瘤或腺肉瘤有反應性的抗體相混合，該器官包括但不限於卵巢、乳腺、肺、前列腺、結腸、腎、皮膚、甲狀腺、骨、上消化道和胰腺。在一個實施方案中，使用不同的抗B7-H3抗體的混合物。抗體的混合物(如它們在本領域中通常所表示的那樣)特 別可用於治療較寬範圍的個體群體。
現在已總體上描述了本發明，經由參考以下例子將更容易地理解本發明，以下例子藉由舉例說明的方式提供，並且除非指明，否則不旨在限制本發明。
實施例1
免疫組織相容性研究
由腫瘤細胞/胎兒祖細胞的免疫產生了一組49種單株抗體。評估了抗體的如下方面：其表現出腫瘤組織較之正常非癌組織的差異IHC染色的能力、在抗體療效的靈長類(並且特別是食蟹猴)模型中的使用能力、親和力等級和抗原特異性以及免疫調節活性和細胞內化。最初藉由MS分析及/或與B7-H3-CHO細胞結合鑑定了這些單株抗體中的21種。藉由用B7-H3蛋白的ELISA重新篩選該庫，鑑定剩餘的28種單株抗體。在表2中提供了這組49個成員中的46個的特徵。
IHC染色證實該組包含如下抗體：在許多鑑定的抗體中引起 強腫瘤正常組織結合差別，藉由BIACORETM分析表現出一定範圍的結合特性，對一定範圍的重疊表位和非重疊表位表現出反應性，以及對4Ig B7-H3和2Ig B7-H3表現出一定範圍的特異性。九種最好候選物的特徵示於表3和表4中。
表5提供了這些抗體活性概況的概述。
在表6中顯示的抗體的活性分析揭示它們各自的概況不同並且每種抗體相對於彼此各有優點和缺點(表6)。
因為BRCA84D、BRCA68D、BRCA69D和PRCA157表現出較純淨的正常組織IHC概況、較強的腫瘤/正常IHC差別、中等到強烈的結合(BIACORETM/IHC)、對食蟹猴的B7-H3的交叉反應性以及強效UDARTTM活性，選擇這些抗體種類以進一步開發。這些抗體不同於表現出低親和力(在BIACORETM測定中)和對食蟹猴的B7-H3無交叉反應性的TES7和OVCA2。這些抗體不同於表現出低親和力(在BIACORETM測定中)、較差IHC表現(弱結合)和較低UDARTTM活性的SG27。這些抗體不同於表現出低親和力(在BIACORETM測定中)、較弱的腫瘤/正常IHC差別和較低UDARTTM活性的GB8。
使用Caki-2和Hs700T陽性對照細胞，IHC研究揭示抗體中的每一種較之另一種抗體表現出不同的最適濃度和不同的差別濃度(表7)。
使用表7中所示的最適濃度和差別濃度，確定了B7-H3抗體在人組織中的IHC反應。對腎上腺、肝、胰腺、腎、肺和結腸的這些分析結果顯示在表8A-8B和表9A-9B中(所有的抗體顯示對心臟組織的陰性IHC反應)。
使用癌症樣本進行的IHC研究顯示本發明的B7-H3抗體可用於鑑定和診斷多種組織來源的癌症(表10)。在表10中，數字表示加號數目(1=+，2=++，3=+++)；每個數字是指一份不同的測試樣品。
對於用B7-H3抗體BRCA84D處理的前列腺癌、乳腺癌、結腸癌和肺癌細胞而言，腫瘤樣品染色存在於腫瘤細胞和間質細胞中，包括腫瘤脈管系統。在一些腫瘤樣品中，間質染色比腫瘤細胞強得多。當將BRCA84D單株抗體滴定至較低濃度時，一些實例顯示在腫瘤細胞中染色減少，但是仍保持強間質染色。在用0.625μg/ml的BRCA84D染色時，前列腺癌細胞表現出3/3+的IHC；乳腺癌細胞表現出4/4+的IHC；結腸癌細胞表現出4/4+的IHC並且肺癌細胞表現出4/4+的IHC。在用0.078μg/ml的BRCA84D染色時，前列腺癌細胞表現出3/4+的IHC；乳腺癌細胞表現出5/5+的IHC；結腸癌細胞表現出4/4+的IHC並且肺癌細胞表現出3/4+的IHC。
用B7-H3抗體BRCA68D處理正常肝，並且在肝細胞和竇狀隙襯細胞中看見染色。用B7-H3抗體BRCA68D染色的正常胰腺表現出在膠原纖維和上皮中的多焦點染色。用B7-H3抗體BRCA68D處理的正常腎上腺 細胞表現出在皮質中染色。在用0.156μg/ml的BRCA68D染色時，腎癌細胞和卵巢癌細胞都表現出5/5+的IHC。
對胃癌、腎癌和卵巢癌組織的樣品進行另外的IHC染色分析。這些分析的結果顯示在表12中。在表11中，數字表示加號數目(1=+，2=++，3=+++)；每個數字是指一份不同的測試樣品。
總之，所有測試的單株抗體都顯示在正常的肝、胰腺、結腸和肺中各種程度的染色強度。第1A圖顯示使用正常胰腺、肝、肺和結腸的組織樣本用0.625μg/ml和0.078μg/ml的BRCA84D進行的IHC研究結果。用BRCA84D和TES7進行的肝染色相對受限在竇狀隙襯細胞(纖維原細胞和科弗氏細胞)中。在最適濃度下，OVCA22除了顯示竇狀隙襯細胞染色之外還顯示膜肝細胞染色。然而，在差別濃度下肝細胞中的染色消失。所有其他單株抗體在最適濃度和差別濃度下都顯示在肝細胞中染色，包括膜或細胞質的染色。主要在膠原纖維和小百分比的上皮中觀察到胰腺染色(腺泡細胞或/和間界細胞)。在差別濃度下上皮中的染色減少或消失。結腸染色相對受限在隱窩上皮的頂膜和粘膜的纖維原細胞中。在結腸淋巴結中沒有觀察 到結合。肺顯示用BRCA84D、BRCA68D、BRCA69D和GB8在上皮中非常弱且不規則的染色。然而，在差別濃度下染色消失。用兩種濃度下的TES7、OVCA22和PRCA157在肺中沒有觀察到染色。在最適濃度下，幾乎所有單株抗體觀察到腎上腺皮質染色，BRCA84D除外。用差別濃度的TES7和OVCA22，腎上腺中的染色明顯地減少。用所有單株抗體，心臟和腎未顯示明顯的染色(第1B圖)。鑒於這些特性，認為BRCA84D是最好的單株抗體，然後依次是(2)TES7，(3)OVCA22，(4)組BRCA68D、BRCA69D和PRCA157，以及最後(5)GB8。
在研究中包括的所有單株抗體顯示在最適濃度下在4種癌症類型中染色。在差別濃度下，BRCA84D仍保持在前列腺癌、乳腺癌和結腸癌中的良好染色。TES7在4種研究癌症類型中保持良好染色。剩餘的單株抗體顯示在不同腫瘤類型中的各種染色強度。在腫瘤細胞和間質細胞包括脈管系統中觀察到腫瘤樣品染色。一些腫瘤樣品只在脈管系統中顯示陽性染色，即BRCA84D、BRCA69D、TES7和PRCA157。一些腫瘤顯示比腫瘤細胞染色更強的間質染色。當在這些樣品上將單株抗體滴定至較低濃度時，一些實例顯示在腫瘤細胞中的染色減少或無染色，但是仍保持強間質染色。一般而言，按照在人正常組織中的表現以及在正常組織相對於腫瘤組織中的差別表現，從最好的IHC表現到最差的表現的單株抗體次序如下所示：(1)BRCA84D，(2)TES7，(3)OVCA22，(4)組BRCA68D，BRCA69D和PRCA157，和最後(5)GB8。表12和第2圖顯示了抗體BRCA84D的結果。
實施例2
食蟹猴B7-H3交叉反應性
食蟹猴B7-H3的序列與它的人對應物共有近似90%的同源性，表明食蟹猴是對於人B7-H3相互作用的優異模型。進行研究來評估B7H3候選物BRCA84D、BRCA68D、BRCA69D、TES7、OVCA22和PRCA157與腎上腺、肝、腎、胰腺和肺以及一例足月的食蟹猴胎盤的交叉反應性，以便比較任何交叉反應性與人組織觀察到的染色強度和染色模式。
每種測試的單株抗體的染色濃度是在Caki-2和Hs700T陽性對照細胞中確定的最適濃度(見表8)。選擇商業的山羊抗人B7-H3(與食蟹猴交叉反應)作為對食蟹猴胎盤組織染色的陽性對照抗體。在每次實驗運行中都應用對應的同種型對照。這些研究的結果顯示在表13中。
在食蟹猴胎盤中的BRCA84D(0.625μg/ml)IHC染色的研究表現出在蛻膜細胞中染色，但沒有在絨毛中染色。在食蟹猴的肝和胰腺中沒有觀察到染色，然而，在人的肝中觀察到竇狀隙襯細胞的染色，並且在人胰腺組織中觀察到集中的纖維和上皮染色。
在食蟹猴胎盤中的BRCA68D(0.156μg/ml)IHC染色的研究表現出在蛻膜細胞、間充質細胞(內皮和纖維原細胞)和絨毛中染色。染色存在於肝細胞的膜和肝纖維原細胞的細胞質中以及胰腺纖維和胰腺上皮的細胞質中。因此，人和食蟹猴的肝和胰腺組織表現出相似的BRCA68D染色模式。
總之，BRCA84D、BRCA68D、BRCA69D和PRCA157均在食蟹猴組織中顯示交叉反應性。BRCA84D未在猴的肝和胰腺中顯示染色； 在人的肝和胰腺組織中觀察到這種染色。BRCA68D和BRCA69D在猴組織中顯示相似的染色強度和染色模式。儘管BRCA68D、BRCA69D和PRCA157顯示與人組織可比的染色模式，但在最適條件下的染色強度與人組織不同。TES7和OVCA22於最適條件下在猴組織中不顯示任何染色。
在食蟹猴組織和人組織中的IHC染色的比較結果的概括在表14中提供。
實施例3
B7-H3單株抗體與多種ATCC癌細胞系結合
發現本發明的抗體能夠與在美國模式培養物寄存所(American Type Culture Collection)的寄存物中包含的多種癌細胞系結合。表15和表16概括了結合結果。
實施例4
B7-H3單株抗體重導向殺傷
本發明的抗體結合存在於癌細胞表面上的B7-H3。使用常規 方法，這些抗體可以用如上所述的螢光素進行標記。當將這些標記的分子在UDARTTM分子的存在下溫育時，它們能夠結合這些UDARTTM分子並由此將其限制在表現B7-H3的細胞的表面並引起重導向的殺傷，該UDARTTM分子具有結合T細胞受體的表位結合區域和結合螢光素的表位結合區域(“TCR-UDARTTM”)。
A.A498腎癌細胞的重導向殺傷
為了證明這些重導向殺傷，將螢光素標記的B7-H3抗體與這些TCR-UDARTTM分子一起溫育，並評估這些分子介導A498腎癌細胞的細胞毒性的能力(表17)。在取得的結果的基礎上，斷定最好的候選物是：RECA13、BRCA68D、BRCA69D和TDH6。
將A498腎癌細胞與不同濃度的對B7-H3具有反應性的單株抗體一起溫育以確定由這些抗體所介導的劑量相依重導向殺傷。實驗結果(第3A-3B圖)顯示重導向殺傷是劑量相依的。
B.A549肺癌細胞的重導向殺傷
為進一步證明這種重導向殺傷，將螢光素標記的B7-H3抗體與上述TCR-UDARTTM分子或與具有結合CD16的表位結合區域和結合螢光素的表位結合區域的UDARTTM分子(“CD16-UDARTTM”)一起溫育，並評估這些分子介導A549肺癌細胞的細胞毒性的能力(表18)。實驗結果(第3C-3D圖)顯示重導向殺傷是劑量相依的。在取得的結果的基礎上，斷定最好的候選物是：BLA8、BRCA68D、BRCA69D和BRCA84D。
C.LNcap前列腺癌細胞的重導向殺傷
為進一步證明這種重導向殺傷，將螢光素標記的B7-H3抗體與上述TCR-UDARTTM分子或與具有結合CD16的表位結合區域和結合螢光素的表位結合區域(“CD16-UDARTTM”)的UDARTTM分子一起溫育，並評估這些分子介導LNcap前列腺癌細胞的細胞毒性的能力(表19)。在取得的 結果的基礎上，斷定最好的候選物是：BRCA68D、BRCA69D、BRCA84D和PRCA157。
實施例5
B7-H3單株抗體結合可溶性B7H3-2Ig和可溶性B7H3-4Ig的能力
如以上所討論的，B7-H3以包含4個Ig區域的形式(B7H3-4Ig)和包含2個Ig區域的形式(B7H3-2Ig)存在。測試本發明的抗B7-H3抗體結合可溶性B7H3-2Ig(第4A圖)和可溶性B7H3-4Ig B7-H3(第4B圖)的能力。發現這些抗體表現出寬範圍的結合特徵。發現抗體PRCA123、TDH5、BLA8、BRCA68D和SG24表現出與可溶性B7H3-2Ig的結合最強，而發現抗體TES7、LUCA50、BRCA165、OVCA22、STO9和PA20表現出與可溶性B7H3-2Ig的結合最弱。發現抗體PRCA123、BRCA69A、 BLA8和BRCA68D表現出與可溶性B7H3-4Ig的結合最強，而發現抗體TES7、OVCA21、BRCA165和STO9表現出與可溶性B7H3-4Ig的結合最弱。
實施例6
溶液中的抗原與捕獲的單株抗體的親和力結合
為了證明在溶液中的抗原與捕獲的單株抗體之間的結合親和力，將抗體以100-200RU的等級捕獲在固定的IgG Fc特異性Fab2片段上。在捕獲的抗體上注入濃度為100nM(20μl/min的流速持續120秒)的抗原B7-H3和B7-H3(4Ig)，並測量結合。將結合反應標準化為相同等級的捕獲單株抗體，並減去對m2B6抗體(mIgG1)對照的結合反應作為空白。這種分析的結果(第5A-5S圖；實線；B7-H3(4Ig)100nM；虛線；B7-H3，100nM)證明本發明的抗體表現出與B7-H3(4Ig)強烈結合。
實施例7
BIACORE TM 分析：B7-H3單株抗體向固定的B7-H3滴定
為了證明B7-H3-2Ig和B7-H3-4Ig對本發明的抗體的相對結合親和力，進行BIACORETM分析。允許本發明的B7-H3抗體結合固定的B7-H3-2Ig或B7-H3-4Ig，並評定隨時間過去對結合的滴定(第6A-6I圖)。發現TDH5、PRCA123、BLA8、BRCA69具有對B7-H3-2Ig和B7-H3-4Ig的高親和力。然而，發現它們的表位在B7-H3-4Ig分子中是大部分被阻塞的，只有少數是可用的。發現OVCA22具有對B7-H3-2Ig和B7-H3-4Ig的非常低的親和力，它的表位在兩種分子上同等可用。然而，可能只有B7-H3-4Ig形式提供對抗體二價結合的足夠接近度(低脫落速率)，而B7-H3-2Ig只能以單價形式被結合。發現TDH6幾乎不具有這種形式的親和力，其結合2Ig可能是非特異 性的。發現TES7和PA20是具有低親和力的B7-H4-4Ig特異性抗體。TES7大概具有低結合速率和比PA20高的脫落速率。發現BRCA84D是具有在B7-H3-2Ig和B7-H3-4Ig上的多個結合位點可能性的中間親和力抗體。基於BIACORE TM分析，BRCA84D由於其與眾不同的結合位點而被認為是較佳的抗體。TES7和PA20被認為是特異性結合高密度抗原表面的候選物和高親和力-低特異性抗體(例如，BRCA69D或另一種)之一。
第7圖提供了抗體PRCA157、BRCA69D、BLA8、PA20、BRCA84D、GB8和SG27的BIACORETM比較分析，顯示本發明的抗B7-H3抗體能夠表現出一定範圍的結合特性。
第8圖展示本發明的幾種抗B7-H3抗體的非競爭特異性。在實驗中，將人B7-H3分子在抗體BRCA84D的存在下溫育，並使其經歷BIACORETM分析。在大約3分鐘後將第二種抗B7-H3抗體加至該反應。如果此第二種抗體與BRCA84D競爭，會發現B7-H3位點關閉並且不能結合。這些結果表明抗體BRCA68D、BRCA69D和PRCA157不與BRCA84D競爭結合人B7-H3。
實施例8
抗B7-H3單株抗體在CSC和ATCC細胞系上內化
研究了本發明的抗B7-H3抗體在結合癌細胞時被內化的能力。將前列腺CSC細胞和Hs700t胰腺細胞與抗B7-H3抗體一起溫育。在皂草素毒蛋白-接合物抗小鼠二抗的存在下溫育後確定這些細胞的生活力，該皂草素毒蛋白-接合物抗小鼠二抗如果結合一抗並被內化，將對細胞有毒性。對前列腺CSC細胞(第9A圖)和Hs700t胰腺細胞(第9B圖)的這種研究的結 果展示本發明的抗體被內化到細胞中的能力。
實施例9
藉由ELISA進行的B7-H3單株抗體結合和交叉阻斷分析
為了探明本發明的抗體與被這些抗體識別的表位的交叉反應性，測量了在競爭性B7-H3抗體的存在下發生的結合的程度。這種分析的結果顯示在第10A-10F圖中，並顯示BRCA68D與BRCA69D競爭。還發現TES7和OVCA22彼此競爭，但發現TES7而不是OVCA22還與BRCA68D和BRCA69D競爭。發現GB8與SG27競爭結合B7-H3-2Ig而不是B7-H3-4Ig。數據概述在表20中並顯示B7-H3-4Ig的至少四種不同表位(即，被SG27識別的表位，被GB8識別的表位，被OVCA22和TES7識別的表位，以及被BRCA68D、BRCA69D和TES7識別的表位)和B7-H3-2Ig的至少兩種表位(即，被SG27和GB8識別的表位，以及被BRCA68D和BRCA69D識別的表位)。
本發明的關鍵抗B7-H3抗體的特質顯示在表21中。基於它們表現出的對正常組織和癌組織的差別染色、它們結合B7-H3-4Ig以及 B7-H3-2Ig的能力、藉由上述BIACORETM分析測量的它們的結合親和力和它們結合食蟹猴B7H3的能力，將抗體BRCA68D、BRCA69D、BRCA84D和PRCA157判定為最佳的抗體。
實施例10
人源化抗B7-H3抗體
將單株抗體BRCA84D人源化以產生提供改善的人治療潛力的抗體(在本文一般命名為“hBRCA84D”)。以下提供了得到的人源化抗體(在本文命名為“hBRCA84D-1”)的可變輕鏈和可變重鏈的序列，以及對應 的胺基酸序列和多核苷酸序列：
人源化BRCA84D-1可變輕鏈(SEQ ID NO：68)：
編碼人源化BRCA84D-1可變輕鏈的多核苷酸序列(SEQ ID NO：69)：
人源化BRCA84D-1可變輕鏈CDR1(SEQ ID NO：70)：KASQNVDTNVA
編碼人源化BRCA84D-1可變輕鏈CDR1的多核苷酸序列(SEQ ID NO：71)：aaggccagtc agaatgtgga tactaatgta gcc
人源化BRCA84D-1可變輕鏈CDR2(SEQ ID NO：72)：SASYRYS
編碼人源化BRCA84D-1可變輕鏈CDR2的多核苷酸序列(SEQ ID NO：73)：tcggcatcct accggtacag t
人源化BRCA84D-1可變輕鏈CDR3(SEQ ID NO：74)：QQYNNYPFT
編碼人源化BRCA84D-1可變輕鏈CDR3的多核苷酸序列(SEQ ID NO：75)：cagcaatata acaactatcc attcacg
人源化BRCA84D-1可變重鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO：80)：
編碼人源化BRCA84D-1可變重鏈的多核苷酸序列(SEQ ID NO：81)：
人源化BRCA84D-1可變重鏈CDR1(SEQ ID NO：82)：FGMH
編碼人源化BRCA84D-1可變重鏈CDR1的多核苷酸序列(SEQ ID NO：83)：tttggaatgcac
人源化BRCA84D可變重鏈CDR2(SEQ ID NO：84)：YISSDSSAIYYADTVK
編碼人源化BRCA84D-1可變重鏈CDR2的多核苷酸序列(SEQ ID NO：85)：tacattagta gtgacagtag tgccatctac tatgcagaca cagtgaag
人源化BRCA84D-1可變重鏈CDR3(SEQ ID NO：86)：GRENIYYGSRLDY
編碼人源化BRCA84D-1可變重鏈CDR3的多核苷酸序列(SEQ ID NO：87)：gggagggaaa acatttacta cggtagtagg cttgactac
第11A-11B圖顯示BRCA84D與其人源化衍生物hBRCA84D的可變輕鏈(第11A圖)或可變重鏈(第11B圖)的胺基酸殘基的比對。
為了獲得表現出改善的對人B7-H3的親和力的hBRCA84D種類，對編碼hBRCA84D-1的輕鏈或重鏈的多核苷酸(即，分別是hBRCA84D-1VL或hBRCA84D-1VH)進行誘變，並且對突變的hBRCA84D-1輕鏈衍生物hBRCA84D-2VL、hBRCA84D-3VL、hBRCA84D-4VL、hBRCA84D-5VL和hBRCA84D-6VL以及突變的hBRCA84D-1重鏈衍生物hBRCA84D-2VH、hBRCA84D-3VH和hBRCA84D-4VH進行分離和表徵。這些抗體的可變輕鏈和重鏈的胺基酸序列和核苷酸序列在以下提供：
hBRCA84D-2VL(SEQ ID NO：89)：
編碼hBRCA84D-2VL的多核苷酸(SEQ ID NO：90)：
hBRCA84D-3VL(SEQ ID NO：91)：
編碼hBRCA84D-3VL的多核苷酸(SEQ ID NO：92)：
hBRCA84D-4VL(SEQ ID NO：93)：
編碼hBRCA84D-4VL的多核苷酸(SEQ ID NO：94)：
hBRCA84D-5VL(SEQ ID NO：95)：
編碼hBRCA84D-5VL的多核苷酸(SEQ ID NO：96)：
hBRCA84D-6VL(SEQ ID NO：97)：
編碼hBRCA84D-6VL的多核苷酸(SEQ ID NO：98)：
hBRCA84D-2VH(SEQ ID NO：99)：
編碼hBRCA84D-2VH的多核苷酸(SEQ ID NO：100)：
hBRCA84D-3VH(SEQ ID NO：101)：
編碼hBRCA84D-3VH的多核苷酸(SEQ ID NO：102)：
hBRCA84D-4VH(SEQ ID NO：103)：
編碼hBRCA84D-4VH的多核苷酸(SEQ ID NO：104)：
表22列出了所研究的hBRCA84D可變輕鏈和可變重鏈的突 變；數字是指第11A圖和第11B圖中使用的Kabat編號系統。
hBRCA84D輕鏈衍生物hBRCA84D-3VL、hBRCA84D-4VL和hBRCA84D-5VL對人B7-H3的相對結合親和力是藉由形成包含這些輕鏈可變區和嵌合BRCA84D-1VH重鏈的抗體來確定(第12圖)。發現BRCA84D-5VL(K42Q，L46A)具有所測試的hBRCA84D-VL的最高結合親和力。因此將BRCA84D-5VL用作輕鏈來研究hBRCA84D-1VH、hBRCA84D-2VH、hBRCA84D-3VH和hBRCA84D-4VH的hBRCA84D重鏈對人B7-H3的相對結合親和力(第13圖)。發現hBRCA84D-2VH(A93G)具有所測試的hBRCA84D-VH的最高結合親和力。
嵌合BRCA84D-1的胺基酸序列和編碼多核苷酸序列如下：
chBRCA84D輕鏈(SEQ ID NO：105)：
編碼chBRCA84D輕鏈的多核苷酸(SEQ ID NO：106)：
chBRCA84D重鏈(SEQ ID NO：107)：
chBRCA84D重鏈的多核苷酸(SEQ ID NO：108)：
比較了包含以下部分的抗體的相對結合親和力：(1)hBRCA84D-2VL和hBRCA84D-2VH(兩個試驗)，(2)嵌合BRCA84D，(3)包含hBRCA84D-5VL和嵌合BRCA84D-HC的抗體，以及(4)包含hBRCA84D-5VL和hBRCA84D-2VH的抗體。這些結果顯示在第14圖中。
實施例11
人源化抗B7-H3抗體抑制異種移植物中的腫瘤生長
為了證明人源化抗B7-H3抗體抑制體內腫瘤生長的能力，在鼠異種移植物中研究膀胱癌細胞和A498腎癌細胞的腫瘤生長。將人源化抗體hBRCA84D-2(hBRCA84D-2 VL鏈/hBRCA84D-2 VL鏈)修飾成包含具有取代L235V、F243L、R292P、Y300L和P396L的Fc區。在植入癌細胞後7天、14天、21天和28天，向小鼠施用(以1μg/kg、10μg/kg或20μg/kg的劑量)Fc修飾的hBRCA84D-2抗體。結果顯示在所有劑量施用的Fc修飾的hBRCA84D-2抗體能夠抑制HT-1197膀胱癌細胞(第15圖)和A498腎癌細胞(第16圖)的腫瘤生長。
實施例12
對B7-H3和T細胞受體特異的雙親和力重新靶向試劑 (DART TM )介導強效的重導向T細胞殺傷
製備了對B7-H3和T細胞受體(“TCR”)以及對自然殺手細胞2D群(NKG2D)受體特異的雙親和力重新靶向試劑(DARTTM)。這些DARTTM具有定位T細胞(藉由使這種T細胞結合TCR結合DARTTM的TCR結合部分)或定位NK細胞(藉由使這種NK細胞結合NKG2D結合DARTTM的NKG2D結合部分)於癌細胞部位的能力(藉由使這種癌細胞結合DARTTM的B7-H3結合部分)。然後這種定位的T細胞或NK細胞能夠介導在本文稱為“重導向”殺傷的過程中對癌細胞的殺傷。
建構了具有hBRCA84D-2的抗B7-H3可變區域和抗TCR可變區域的對B7-H3和T細胞受體(“TCR”)特異的雙親和力重新靶向試劑(DARTTM)：
TCR VL×hBRCA84D VH-2-E捲曲DARTTM鏈(SEQ ID NO：109)：
編碼TCR VL×hBRCA84D VH-2-E捲曲DARTTM鏈的多核苷酸(SEQ ID NO：110)：
hBRCA84DVL-2×TCR VH-K捲曲鏈(SEQ ID NO：111)：
編碼hBRCA84DVL-2×TCR VH-K捲曲鏈的多核苷酸(SEQ ID NO：112)：
建構了具有hBRCA84D-2的抗B7-H3可變區域和抗TCR可變區域的對B7-H3和自然殺手細胞2D群(NKG2D)受體特異的雙親和力重新 靶向試劑(DARTTM)：
NKG2D VL×hBRCA84D VH-2-E捲曲DARTTM鏈(SEQ ID NO：113)：
編碼NKG2D VL×hBRCA84D VH-2-E捲曲DARTTM鏈的多核苷酸(SEQ ID NO：114)：
hBRCA84DVL-2×NKG2D VH-K捲曲鏈(SEQ ID NO：115)：
編碼hBRCA84DVL-2×NKG2D VH-K捲曲鏈的多核苷酸(SEQ ID NO：116)：
為了證明DARTTM介導對癌細胞的這種重導向殺傷的能力，將上述hBRCA84D-2/抗TCR DARTTM(“T-DARTTM”)、hBRCA84D-2、hBRCA84D-2(Fc-修飾的：L235V、F243L、R292P、Y300L和P396L)和TCR-DARTTM對照在多種濃度下與標靶癌細胞(SK-MES-1肺癌細胞，A498腎癌細胞，LNCaP前列腺癌細胞，或UACC-62黑色素瘤細胞)和效應子靜止性PBMC(E：T比率=30：1)一起溫育，並確定細胞毒性(LDH測定)。這些研究的結果顯示在第17A-17D圖中並展示了hBRCA84D-2/抗TCR DARTTM(“T-DARTTM”)介導對癌細胞的重導向殺傷的能力。
實施例13
無瘤小鼠中的藥物代謝動力學曲線
將抗B7-H3抗體(Mab1)注射到雄性mCD16-/-、hCD16A_FOXN1小 鼠(5mg/kg；靜脈內)中，並且在(給藥前和)注射後2、15、30min和1、2、4、6小時，以及1、2、3、6、8、14、21和28天測定血清。發現抗體具有10.54天的T½和43.493μg/ml的Cmax。發現抗體濃度隨時間為雙相性的，擬合到二成分模型中(第18A-18B圖)。使用具有5mg/kg劑量的參數的2室模型產生的預測藥物代謝動力學曲線顯示在第18C圖中。
實施例14
抗B7-H3抗體結合HT-1197膀胱癌細胞及防止或抑制鼠異種移植模型中的腫瘤形成的能力
評定了上述抗B7-H3抗體(Mab1)結合表現人B7-H3的膀胱癌細胞系HT-1197的能力。如第19圖所示，這些細胞表現出比HER2更多的PRCA135表現，並因此特別適合於評定本發明的抗體在重介導HT-1197腫瘤上的治療潛力。依據這一結論，發現抗B7-H3抗體hBRCA84D的變體能夠結合HT-1197細胞。第20圖顯示Mab1抗體對HT-1197細胞的結合親和力。
在小鼠(mCD16-/-,hCD16A+_FoxN1)脅腹上經皮下植入8×106個HT-1197細胞。腫瘤細胞在200μl用MATRIGELTM 1：1稀釋的Ham’s F12培養基中被植入。在植入7天內開始用Mab1經由靜脈內Q7D x5使用劑量0.1、0.5、1、5或10mg/kg(每劑量八隻雌性小鼠)處理。向對照組小鼠施用劑量為1、5或15mg/kg(每劑量八隻雌性小鼠)的西妥昔單抗(抗EGRF抗體)。同樣用媒介物或用10mg/kg IgG對照注射八隻雌性小鼠。每3-4天進行腫瘤測量。實驗的結果(第21A圖)顯示Mab1能夠防止或抑制鼠異種移植模型中的膀胱腫瘤形成。第21B圖顯示用西妥昔單抗(centimab)獲得的結果。第21A圖和第21B圖的比較展示了本發明的抗體在防止或抑制鼠異種 移植模型中的膀胱腫瘤形成上比西妥昔單抗更有效。第21C圖比較了在測試的最大劑量獲得的結果。
實施例15
抗B7-H3抗體結合HT-1376膀胱癌細胞及防止或抑制鼠異種移植模型中的腫瘤形成的能力
評定了上述抗B7-H3抗體(Mab1)結合表現人B7-H3的膀胱癌細胞系HT-1376的能力。如第22A-22B圖所示，這些細胞表現出比HER2或PMSA更多的PRCA135表現，並因此特別適合於評定本發明的抗體在重介導HT-1376腫瘤上的治療潛力。依據這一結論，發現抗B7-H3抗體hBRCA84D的變體能夠結合HT-1376細胞。第22A-22B圖顯示Mab1抗體對HT-1376細胞的結合親和力。
在小鼠(mCD16-/-,hCD16A+_FoxN1)脅腹上經皮下植入5×106個HT-1376細胞。腫瘤細胞在200μl用MATRIGELTM 1：1稀釋的Ham’s F12培養基中被植入。在植入7天內開始用Mab1經由靜脈內Q7D x4、劑量為1mg/kg的Q7D x4處理。實驗的結果(第23圖)顯示Mab1能夠防止或抑制鼠異種移植模型中的膀胱腫瘤形成。
實施例16
抗B7-H3抗體結合癌細胞的能力
經由FACS分析評定了抗B7-H3抗體BRCA84D結合以下細胞的能力：SW480和SW620結腸直腸癌細胞；AGS胃癌細胞；M-14和LOX IMVI黑色素瘤細胞；22rv前列腺癌細胞；AsPC-1和BxPc-3胰腺癌細胞；A498和786-0腎癌細胞。發現該抗體能夠結合所有這些細胞。
實施例17
抗B7-H3抗體防止或抑制鼠異種移植模型中的胃腫瘤形成的能力
在小鼠(mCD16-/-,hCD16A+_FoxN1)脅腹上經皮下植入5×106個AGS細胞。腫瘤細胞在200μl用MATRIGELTM 1：1稀釋的Ham’s F12培養基中被植入。在植入7天內開始用Mab1經由靜脈內Q7D x5使用劑量0.5、1、5或10mg/kg處理。實驗的結果(第24圖)顯示Mab1能夠防止或抑制鼠異種移植模型中的胃腫瘤形成。
實施例18
抗B7-H3抗體結合肺癌細胞及防止或抑制鼠異種移植模型中的腫瘤形成的能力
在hBRCA84D、chBRCA84D和hBRCA84(0264Fc)變體的存在下溫育A549肺癌細胞，並確定這些抗體的細胞毒效應。這個實驗的結果顯示在第25圖中，並表明所有這三種抗體均對A549細胞有細胞毒性。
在小鼠(mCD16-/-,hCD16A+_FoxN1)脅腹上經皮下植入8×106個A549細胞。腫瘤細胞在200μl用MATRIGELTM 1：1稀釋的Ham’s F12培養基中被植入。在植入7天內開始用Mab1經由靜脈內Q7D x4使用劑量1mg/kg處理。實驗的結果(第26圖)顯示Mab1能夠防止或抑制鼠異種移植模型中的肺癌腫瘤形成。
對CaLu3肺癌細胞進行FACS分析以確定這些細胞是否結合抗B7-H3抗體。此實驗證實這些細胞表現B7-H3並且結合本發明的抗體。為了確定本發明的抗體是否有效防止或抑制肺癌腫瘤形成，在小鼠(mCD16-/-, hCD16A+_FoxN1)脅腹上經皮下植入5×106個CaLu3細胞。腫瘤細胞在200μl用MATRIGELTM 1：1稀釋的Ham’s F12培養基中被植入。在植入7天內開始用Mab1經由靜脈內Q7D x4使用劑量0.5、1或5mg/kg處理。實驗的結果(第27圖)顯示Mab1能夠防止或抑制鼠異種移植模型中的肺癌腫瘤形成。
實施例19
抗B7-H3抗體防止或抑制鼠異種移植模型中的LOX黑色素瘤腫瘤形成的能力
在小鼠(八隻雌性mCD16-/-,hCD16A+_FoxN1)脅腹經皮下植入LOX-IMVI黑色素瘤癌細胞，然後靜脈內/Q7D x3接種PBS對照、IgG對照(5/mg/kg)、Mab1(0.5、1、5或10mg/kg)，或腹膜內/BIWx2接種多西他賽(5、10或20mg/kg)。腫瘤細胞在200μl用MATRIGELTM 1：1稀釋的Ham’s F12培養基中被植入。在植入的7天內開始用Mab1處理。實驗的結果(第28A-28C圖)顯示Mab1能夠防止或抑制鼠異種移植模型中的黑色素瘤癌腫瘤形成。
實施例20
抗B7-H3抗體防止或抑制鼠異種移植模型中的UACC-62黑色素瘤腫瘤形成的能力
在小鼠(八隻雌性mCD16-/-,hCD16A+_FoxN1)脅腹經皮下植入UACC-62黑色素瘤癌細胞，然後靜脈內/Q7D x5接種PBS對照、IgG對照(5/mg/kg)或Mab1(0.5、1、5或10mg/kg)。腫瘤細胞在200μl用MATRIGELTM 1：1稀釋的Ham’s F12培養基中被植入。在植入的7天內開始用Mab1處理。實驗的結果(第29圖)顯示Mab1能夠防止或抑制鼠異種移植模 型中的黑色素瘤癌腫瘤形成。
實施例21
抗B7-H3抗體防止或抑制鼠異種移植模型中的22rv前列腺腫瘤形成的能力
在小鼠(mCD16-/-,hCD16A+_FoxN1)脅腹上經皮下植入6×106個22rv前列腺癌細胞，然後靜脈內/Q7D x4接種PBS對照、IgG(10mg/kg)、Mab1(0.5、1、5或10mg/kg；Q7D x5)或曲妥珠單抗(1.7或15mg/kg)。腫瘤細胞在200μl用MATRIGELTM 1：1稀釋的Ham’s F12培養基中被植入。在植入的7天內開始用Mab1處理。實驗的結果(第30A-30C圖)顯示Mab1能夠防止或抑制鼠異種移植模型中的前列腺癌腫瘤形成。
實施例22
抗B7-H3抗體結合腎癌細胞及防止或抑制鼠異種移植模型中的腫瘤形成的能力
在hBRCA84D、chBRCA84D和hBRCA84(0264Fc)變體的存在下培養A498腎癌細胞，並確定這些抗體的細胞毒效應。這個實驗的結果顯示在第31圖中，並表明所有這三種抗體均對A498細胞有細胞毒性。
使用生物素醯化的BRCA84D抗體(20μg/ml)、BRCA69D(5μg/ml)和抗Her2抗體(20μg/ml)進行A498異種移植物腫瘤組織的IHC分析。發現BRCA84D抗體結合20-40%的腫瘤組織(弱到中等：+或++)；發現BRCA69D結合80-100%的腫瘤組織(中等到強：++或+++)。發現BRCA84D抗體較弱地結合40%的UMUC-3腫瘤組織(+)；發現BRCA69D中等或強烈結合70%的這種腫瘤組織(++或+++)；發現抗-Her2抗體可變地結合20%的 這種腫瘤組織(+-+++)。作為對照，發現抗Her2抗體結合SKBR-3細胞(+++)並發現BRCA84D和BRCA69D能夠結合Hs 700T細胞(+++)。
在小鼠(mCD16-/-,hCD16A+_FoxN1)脅腹上經皮下植入5×106個A498腎癌細胞。腫瘤細胞在200μl用MATRIGELTM 1：1稀釋的Ham’s F12培養基中被植入。在植入7天內開始用Mab1經由靜脈內Q7D x5使用劑量0.1、0.5、1、5或10mg/kg處理。向對照組小鼠施用劑量為1、7或15mg/kg的西妥昔單抗(抗EGRF抗體)。用媒介物或用10mg/kg IgG對照注射另外的對照小鼠。實驗的結果(第32圖)顯示Mab1能夠防止或抑制鼠異種移植模型中的腎癌腫瘤形成。
在小鼠(mCD16-/-,hCD16A+_FoxN1)脅腹上經皮下可選地植入5×106 786-0腎癌細胞。腫瘤細胞在200μl用MATRIGELTM 1：1稀釋的Ham’s F12培養基中被植入。在植入7天內開始用Mab1經由靜脈內Q7D x5使用劑量0.1、0.5、1、5或10mg/kg處理。向對照組小鼠施用劑量為1、7或15mg/kg的西妥昔單抗(抗EGRF抗體)。用媒介物或用10mg/kg IgG對照注射另外的對照小鼠。實驗的結果(第33A-33B圖)顯示Mab1能夠防止或抑制鼠異種移植模型中的腎癌腫瘤形成。
將Mab1的活性與癌症化學治療中使用的有絲分裂抑制劑紫杉醇的活性進行比較。在每組八隻雌性小鼠(mCD16-/-,hCD16A+_FoxN1)的脅腹上經皮下植入786-0腎癌細胞，然後經靜脈內Q7D、劑量為0.1、0.5、1、5或10mg/kg提供Mab1。在研究第21天、28天和35天向八隻這樣的小鼠的對照組施用2.5mg/kg劑量的紫杉醇。用媒介物或用5mg/kg IgG對照注射另外的對照小鼠(每組七隻雌性)。實驗的結果(第34圖)顯示Mab1能夠防 止或抑制鼠異種移植模型中的腎癌腫瘤形成。
實施例23
食蟹猴毒理學研究
進行食蟹猴毒理學研究以評定單劑量Mab1後的急性毒理學概況、確定Mab1的藥物代謝動力學概況、建立誘導與效應細胞活化有關的細胞介素的時間對劑量的關係、並評定藥物治療對循環的白細胞(例如，NK細胞和T細胞)的等級的作用。
可將這種研究設計成包括四組每組6隻猴(3隻雄性和3隻雌性)，並且從開始的治療到最終的屍體剖檢持續7週。第1組將包括在第1週和第2週只接受媒介物的對照組。第1組的四個成員(兩隻雄性和兩隻雌性)將在第3週被處死。第1組的剩餘成員在第3週將接受另外的媒介物並且在第7週被處死進行屍體剖檢。第2-4組是在第1週接受媒介物並且在第2週接受B7-H3抗體(分別為1、30或100mg/kg)的實驗組。每組的四個成員(兩隻雄性和兩隻雌性)將在第3週被處死。每組的剩餘成員在第3週將接受另外的媒介物並且在第7週被處死進行屍體剖檢。
所有的輸注得到良好耐受，並且沒有觀察到死亡或體重、臨床症狀或血清化學的顯著改變。觀察到循環的NK細胞的劑量相依性減少，但在循環的B細胞和T細胞中沒有觀察到。
此研究對食蟹猴作為相關的毒理學物種提供了驗證。當接觸正常的人組織時，抗體BRCA84D顯示在肝、胰腺、結腸、肺和腎上腺皮質中各種程度的染色強度。肝染色相對限於竇狀隙襯細胞(纖維原細胞和庫弗細胞)。觀察到胰腺染色主要在膠原纖維中和小百分比在上皮中(腺泡細 胞及/或間界細胞)。結腸染色相對受限在隱窩上皮的頂膜和粘膜的纖維原細胞中。肺顯示在上皮中的非常弱且不規則的染色。除肝和胰腺中缺乏染色外，相較於人組織概況，BRCA84D顯示在食蟹猴組織中的良好交叉反應性，以及在食蟹猴垂體細胞中可能的B7-H3表現。
在本說明書中提及的所有出版物和專利均藉由引用整體併入本文，其程度就如同具體和單獨地指出每篇單獨的出版物或專利申請案都藉由引用整體併入本文。儘管已結合本發明的具體實施方案對本發明進行了描述，但應理解，能夠對本發明進行進一步改變並且本申請案旨在涵蓋本發明的任何變化、利用或改編，該變化、利用或改編總體上遵循本發明的原理並且包括與本揭露內容的諸如以下偏離：屬於本發明所屬領域內的已知或常規實踐的偏離以及可應用於上文所述的必要特徵的偏離。
<110> 宏觀基因股份有限公司(MacroGenics,Inc.)
<120> 反應B7-H3之抗體、其免疫活性片段及使用(Antibodies Reactive with B7-H3,Immunologically Active FragmentsThereof and Uses Thereof)
<140> TW 102134185
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<150> US 61/311,057
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<151> 2010-03-04
<150> US 61/310,692
<151> 2010-03-04
<160> 116
<170> PatentIn version 3.5
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<223> 編碼BRCA69D可變重鏈的多核苷酸序列
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<213> Artificial Sequence
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<223> PRCA157可變重鏈的胺基酸序列
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<223> 編碼PRCA157可變重鏈CDR3的多核苷酸序列
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<223> 鉸合區域
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<223> DART的C端胺基酸序列
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<213> Artificial Sequence
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<223> DART包含半胱胺酸的序列
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<213> Artificial Sequence
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<220>
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> 編碼人源化BRCA84D-1可變輕鏈的多核苷酸序列
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人源化BRCA84D-1可變輕鏈CDR1
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Polynucleotide Sequence Encoding Humanized BRCA84D-1 Variable編碼人源化BRCA84D-1可變輕鏈CDR1的多核苷酸序列
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人源化BRCA84D-1可變輕鏈CDR2
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<212> DNA
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<223> 編碼人源化BRCA84D-1可變輕鏈CDR2的多核苷酸序列
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人源化BRCA84D-1可變輕鏈CDR3
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 編碼人源化BRCA84D-1可變輕鏈CDR3的多核苷酸序列
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人源化BRCA84D-1可變重鏈的胺基酸序列
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<223> 人源化BRCA84D可變重鏈CDR2
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<213> Artificial Sequence
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<212> PRT
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 編碼hBRCA84D-6VL的多核苷酸
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<212> PRT
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 編碼hBRCA84D-2VH的多核苷酸
<400> 100
<210> 101
<211> 122
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hBRCA84D-3VH
<400> 101
<210> 102
<211> 366
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 編碼hBRCA84D-3VH的多核苷酸
<400> 102
<210> 103
<211> 122
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hBRCA84D-4VH
<400> 103
<210> 104
<211> 366
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 編碼hBRCA84D-4VH的多核苷酸
<400> 104
<210> 105
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> chBRCA84D Light Chain
<400> 105
<210> 106
<211> 645
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 編碼chBRCA84D輕鏈的多核苷酸
<400> 106
<210> 107
<211> 452
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> chBRCA84D重鏈
<400> 107
<210> 108
<211> 1359
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 編碼chBRCA84D重鏈的多核苷酸
<400> 108
<210> 109
<211> 270
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TCR VL×hBRCA84D VH-2-E捲曲DART鏈
<400> 109
<210> 110
<211> 810
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 編碼TCR VL×hBRCA84D VH-2-E捲曲DART鏈的多核苷酸
<400> 110
<210> 111
<211> 269
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hBRCA84DVL-2×TCR VH-K捲曲鏈
<400> 111
<210> 112
<211> 807
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 編碼hBRCA84DVL-2×TCR VH-K捲曲鏈的多核苷酸
<400> 112
<210> 113
<211> 274
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NKG2D VL×hBRCA84D VH-2-E捲曲DART鏈
<400> 113
<210> 114
<211> 822
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 編碼NKG2D VL×hBRCA84D VH-2-E捲曲DART鏈的多核苷酸
<400> 114
<210> 115
<211> 270
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hBRCA84DVL-2×NKG2D VH-K捲曲鏈
<400> 115
<210> 116
<211> 810
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 編碼hBRCA84DVL-2×NKG2D VH-K捲曲鏈的多核苷酸
<400> 116

Claims (24)

  1. 一種雙親和力重新靶向試劑，該試劑包含：(A)一多肽鏈I，該多肽鏈I包含對於結合B7-H3特異的一免疫球蛋白VL表位結合區域和對於結合除B7-H3以外的一分子特異的一VH表位結合區域；和(B)一多肽鏈II，該多肽鏈II包含對於結合B7-H3特異的一免疫球蛋白VH表位結合區域和對於結合除B7-H3以外的該分子特異的一VL表位結合區域；其中該多肽鏈I和多肽鏈II共價締合在一起，以便該多肽鏈I的免疫球蛋白VL表位結合區域和該多肽鏈II的免疫球蛋白VH表位結合區域形成能夠結合B7-H3功能性表位結合區域，和該多肽鏈I的免疫球蛋白VH表位結合區域和該多肽鏈II的免疫球蛋白VL表位結合區域形成能夠結合除B7-H3以外的該分子的功能性表位結合區域；和其中該多肽鏈I包含BRCA84D的輕鏈的CDR1的胺基酸序列(SEQ ID NO：5)、CDR2的胺基酸序列(SEQ ID NO：7)和CDR3的胺基酸序列(SEQ ID NO：9)，和該多肽鏈II包含BRCA84D的重鏈的CDR1的胺基酸序列(SEQ ID NO：13)、CDR2的胺基酸序列(SEQ ID NO：15)和CDR3的胺基酸序列(SEQ ID NO：17)。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的雙親和力重新靶向試劑，其包含：(A)輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO：89的胺基酸序列；和(B)重鏈可變區，其包含SEQ ID NO：99的胺基酸序列。
  3. 如申請專利範圍第1項所述的雙親和力重新靶向試劑，其中該試劑包含一Fc區域的至少一部份。
  4. 如申請專利範圍第1項所述的雙親和力重新靶向試劑，其中：(A)該多肽鏈I還包含一E-捲曲區域(SEQ ID NO：63)且該多肽鏈II還包含一K-捲曲區域(SEQ ID NO：64)；或(B)該多肽鏈I還包含一K-捲曲區域(SEQ ID NO：64)且該多肽鏈II還包含一E-捲曲區域(SEQ ID NO：63)。
  5. 如申請專利範圍第3項所述的雙親和力重新靶向試劑，其中：(A)該多肽鏈I還包含一E-捲曲區域(SEQ ID NO：63)且該多肽鏈II還包含一K-捲曲區域(SEQ ID NO：64)；或(B)該多肽鏈I還包含一K-捲曲區域(SEQ ID NO：64)且該多肽鏈II還包含一E-捲曲區域(SEQ ID NO：63)。
  6. 如申請專利範圍第1項所述的雙親和力重新靶向試劑，其中可以被該試劑結合的除B7-H3以外的該分子是一種半抗原。
  7. 如申請專利範圍第6項所述的雙親和力重新靶向試劑，其中該半抗原是一異硫氰酸螢光素。
  8. 如申請專利範圍第1項所述的雙親和力重新靶向試劑，其中可以被該試劑結合的除B7-H3以外的該分子是一T細胞受體、T細胞共受體或NKG2D受體。
  9. 如申請專利範圍第5項所述的雙親和力重新靶向試劑，其中可以被該試劑結合的除B7-H3以外的該分子是一T細胞受體、T細胞共受體或NKG2D受體。
  10. 如申請專利範圍第1項所述的雙親和力重新靶向試劑，其中可以被該試劑結合的除B7-H3以外的該分子是一腫瘤相關抗原。
  11. 如申請專利範圍第10項所述的雙親和力重新靶向試劑，其中該腫瘤相關抗原選自由以下組成的群組：A33、ADAM-9、ALCAM、BAGE、β-連環蛋白、CA125、羧肽酶M、CD103、CD19、CD20、CD22、CD23、CD25、CD27、CD28、CD36、CD40/CD154、CD45、CD46、CD5、CD56、CD79a/CD79b、CDK4、CEA、CTLA4、細胞角蛋白8、EGF-R、EphA2、ErbB1、ErbB3、ErbB4、GAGE-1、GAGE-2、GD2/GD3/GM2、gp100、HER-2/neu、人乳頭狀瘤病毒-E6、人乳頭狀瘤病毒-E7、整合素α-V-β-6、JAM-3、KID3、KID31、KSA(17-1A)、LUCA-2、MAGE-1、MAGE-3、MART、MUC-1、MUM-1、N-乙醯胺基葡萄糖轉移酶、抑瘤素M、p15、PIPA、PSA、PSMA、ROR1、sTn、TNF-ß受體、TNF-α受體、TNF-γ受體、運鐵蛋白受體和VEGF受體。
  12. 一種核酸分子，該核酸分子編碼申請專利範圍第1-11項中任一項的雙親和力重新靶向試劑的一多肽鏈。
  13. 一種藥物組合物，該藥物組合物包含(i)治療有效量的申請專利範圍第1-11項中任一項的雙親和力重新靶向試劑以及(ii)一藥學上可接受的載體。
  14. 如申請專利範圍第13項所述的藥物組合物，該藥物組合物更包含一種或多種另外的抗癌劑。
  15. 如申請專利範圍第14項所述的藥物組合物，其中該另外的抗癌劑是一化學治療劑、一放射治療劑、一激素治療劑、一毒素或一免疫治療劑。
  16. 如申請專利範圍第15項所述的藥物組合物，其中該另外的抗癌劑是選自由以下組成的群組：一紫杉烷、一類美登素、一阿瑞斯他丁、一卡奇黴素、一蒽環類、一CC-1065類似物、一多西他賽、一組織蛋白酶、一蓖麻毒蛋白、一白樹毒素、一假單胞菌(Pseudomonas)外毒素、一白喉毒素、一RNA酶以及一毒性放射性同位素。
  17. 如申請專利範圍第1-11項中任一項的雙親和力重新靶向試劑在製備用於診斷癌症的藥劑中的用途，其中該雙親和力重新靶向試劑被可檢測地標記。
  18. 如申請專利範圍第17項所述的用途，該用途的特徵在於該癌症以存在選自由以下組成的群組的一癌細胞為特徵：一腎上腺腫瘤、一AIDS-相關癌症、一軟組織腺泡狀肉瘤、一星形細胞瘤、一膀胱癌、一骨癌、一腦脊髓癌、一轉移性腦瘤、一乳腺癌、一頸動脈體瘤、一子宮頸癌、一軟骨肉瘤、一脊索瘤、一腎嫌色細胞癌、一透明細胞癌、一結腸癌、一結腸直腸癌、一皮膚良性纖維組織細胞瘤、一促纖維增生性小圓細胞瘤、一室管膜瘤、一伊文氏腫瘤、一骨外粘液樣軟骨肉瘤、一不完全性骨纖維生成、一骨纖維性結構不良、一膽囊或膽管癌、一胃癌、一妊娠性滋養細胞疾病、一生殖細胞瘤、一頭頸癌、一肝細胞癌、一胰島細胞瘤、一卡波西氏肉瘤、一腎癌、一白血病、一脂瘤/良性脂肪瘤、一脂肉瘤/惡性脂肪瘤、一肝癌、一淋巴瘤、一肺癌、一神經管胚細胞瘤、一黑色素瘤、一腦膜瘤、一多發性內分泌腫瘤、一多發性骨髓瘤、一骨髓增生異常症候群、一神經胚細胞瘤、一神經內分泌腫瘤、一卵巢癌、一胰腺癌、一乳頭狀甲狀腺癌、一甲狀旁腺腫瘤、一兒科癌症、一周圍神經鞘瘤、一嗜鉻細胞瘤、一垂體瘤、一前列腺癌、一後葡萄膜黑色素瘤、一罕見血液疾病、一腎轉移癌、一橫紋肌樣瘤、一橫紋肌肉瘤、一肉瘤、一皮膚癌、一軟組織肉瘤、一鱗狀細胞癌、一滑膜肉瘤、一睾丸癌、一胸腺癌、一胸腺瘤、一甲狀腺轉移癌和一子宮癌的細胞。
  19. 如申請專利範圍第13-16項中任一項所述的藥物組合物在製備用於診斷癌症的藥劑中的用途，其中該雙親和力重新靶向試劑被可檢測地標記。
  20. 如申請專利範圍第19項所述的用途，該用途的特徵在於該癌症以存在選自由以下組成的群組的一癌細胞為特徵：一腎上腺腫瘤、一AIDS-相關癌症、一軟組織腺泡狀肉瘤、一星形細胞瘤、一膀胱癌、一骨癌、一腦脊髓癌、一轉移性腦瘤、一乳腺癌、一頸動脈體瘤、一子宮頸癌、一軟骨肉瘤、一脊索瘤、一腎嫌色細胞癌、一透明細胞癌、一結腸癌、一結腸直腸癌、一皮膚良性纖維組織細胞瘤、一促纖維增生性小圓細胞瘤、一室管膜瘤、一伊文氏腫瘤、一骨外粘液樣軟骨肉瘤、一不完全性骨纖維生成、一骨纖維性結構不良、一膽囊或膽管癌、一胃癌、一妊娠性滋養細胞疾病、一生殖細胞瘤、一頭頸癌、一肝細胞癌、一胰島細胞瘤、一卡波西氏肉瘤、一腎癌、一白血病、一脂瘤/良性脂肪瘤、一脂肉瘤/惡性脂肪瘤、一肝癌、一淋巴瘤、一肺癌、一神經管胚細胞瘤、一黑色素瘤、一腦膜瘤、一多發性內分泌腫瘤、一多發性骨髓瘤、一骨髓增生異常症候群、一神經胚細胞瘤、一神經內分泌腫瘤、一卵巢癌、一胰腺癌、一乳頭狀甲狀腺癌、一甲狀旁腺腫瘤、一兒科癌症、一周圍神經鞘瘤、一嗜鉻細胞瘤、一垂體瘤、一前列腺癌、一後葡萄膜黑色素瘤、一罕見血液疾病、一腎轉移癌、一橫紋肌樣瘤、一橫紋肌肉瘤、一肉瘤、一皮膚癌、一軟組織肉瘤、一鱗狀細胞癌、一滑膜肉瘤、一睾丸癌、一胸腺癌、一胸腺瘤、一甲狀腺轉移癌和一子宮癌的細胞。
  21. 如申請專利範圍第1-11項中任一項的雙親和力重新靶向試劑在用於治療患者癌症的藥劑的製備中的用途。
  22. 如申請專利範圍第21項所述的用途，該用途的特徵在於該癌症以存在選自由以下組成的群組的一癌細胞為特徵：一腎上腺腫瘤、一AIDS-相關癌症、一軟組織腺泡狀肉瘤、一星形細胞瘤、一膀胱癌、一骨癌、一腦脊髓癌、一轉移性腦瘤、一乳腺癌、一頸動脈體瘤、一子宮頸癌、一軟骨肉瘤、一脊索瘤、一腎嫌色細胞癌、一透明細胞癌、一結腸癌、一結腸直腸癌、一皮膚良性纖維組織細胞瘤、一促纖維增生性小圓細胞瘤、一室管膜瘤、一伊文氏腫瘤、一骨外粘液樣軟骨肉瘤、一不完全性骨纖維生成、一骨纖維性結構不良、一膽囊或膽管癌、一胃癌、一妊娠性滋養細胞疾病、一生殖細胞瘤、一頭頸癌、一肝細胞癌、一胰島細胞瘤、一卡波西氏肉瘤、一腎癌、一白血病、一脂瘤/良性脂肪瘤、一脂肉瘤/惡性脂肪瘤、一肝癌、一淋巴瘤、一肺癌、一神經管胚細胞瘤、一黑色素瘤、一腦膜瘤、一多發性內分泌腫瘤、一多發性骨髓瘤、一骨髓增生異常症候群、一神經胚細胞瘤、一神經內分泌腫瘤、一卵巢癌、一胰腺癌、一乳頭狀甲狀腺癌、一甲狀旁腺腫瘤、一兒科癌症、一周圍神經鞘瘤、一嗜鉻細胞瘤、一垂體瘤、一前列腺癌、一後葡萄膜黑色素瘤、一罕見血液疾病、一腎轉移癌、一橫紋肌樣瘤、一橫紋肌肉瘤、一肉瘤、一皮膚癌、一軟組織肉瘤、一鱗狀細胞癌、一滑膜肉瘤、一睾丸癌、一胸腺癌、一胸腺瘤、一甲狀腺轉移癌和一子宮癌的細胞。
  23. 如申請專利範圍第13-16項中任一項所述的藥物組合物在用於治療患者癌症的藥劑的製備中的用途。
  24. 如申請專利範圍第23項所述的用途，該用途的特徵在於該癌症以存在選自由以下組成的群組的一癌細胞為特徵：一腎上腺腫瘤、一AIDS-相關癌症、一軟組織腺泡狀肉瘤、一星形細胞瘤、一膀胱癌、一骨癌、一腦脊髓癌、一轉移性腦瘤、一乳腺癌、一頸動脈體瘤、一子宮頸癌、一軟骨肉瘤、一脊索瘤、一腎嫌色細胞癌、一透明細胞癌、一結腸癌、一結腸直腸癌、一皮膚良性纖維組織細胞瘤、一促纖維增生性小圓細胞瘤、一室管膜瘤、一伊文氏腫瘤、一骨外粘液樣軟骨肉瘤、一不完全性骨纖維生成、一骨纖維性結構不良、一膽囊或膽管癌、一胃癌、一妊娠性滋養細胞疾病、一生殖細胞瘤、一頭頸癌、一肝細胞癌、一胰島細胞瘤、一卡波西氏肉瘤、一腎癌、一白血病、一脂瘤/良性脂肪瘤、一脂肉瘤/惡性脂肪瘤、一肝癌、一淋巴瘤、一肺癌、一神經管胚細胞瘤、一黑色素瘤、一腦膜瘤、一多發性內分泌腫瘤、一多發性骨髓瘤、一骨髓增生異常症候群、一神經胚細胞瘤、一神經內分泌腫瘤、一卵巢癌、一胰腺癌、一乳頭狀甲狀腺癌、一甲狀旁腺腫瘤、一兒科癌症、一周圍神經鞘瘤、一嗜鉻細胞瘤、一垂體瘤、一前列腺癌、一後葡萄膜黑色素瘤、一罕見血液疾病、一腎轉移癌、一橫紋肌樣瘤、一橫紋肌肉瘤、一肉瘤、一皮膚癌、一軟組織肉瘤、一鱗狀細胞癌、一滑膜肉瘤、一睾丸癌、一胸腺癌、一胸腺瘤、一甲狀腺轉移癌和一子宮癌的細胞。
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