ES2656359T3

ES2656359T3 - Anticuerpos anti-NKG2A y usos de los mismos

Info

Publication number: ES2656359T3
Application number: ES11186901.2T
Authority: ES
Inventors: Pieter Spee; Søren Berg PADKJÆR
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 2006-06-30
Filing date: 2007-06-28
Publication date: 2018-02-26
Anticipated expiration: 2027-06-28
Also published as: RU2499001C2; EP2426150B1; CN101484471A; IL195658B; IL195658A0; NO20090462L; CA2655623A1; RU2008149918A; US20120237510A1; AU2007276294B2; EP2038306B1; EP2426150A1; US9683041B2; US20190248896A1; ZA200810311B; BRPI0712953B8; WO2008009545A1; US8901283B2; TWI537285B; EP2038306A1

Abstract

Un anticuerpo humanizado que se une específicamente a NKG2A, que comprende una CDR-H1 correspondiente a los residuos 31-35 de SEQ ID NO: 5 y una CDR-H3 correspondiente a los residuos 95-102 de SEQ ID NO: 5, donde la CDR-H2 comprende los residuos 50-59 de SEQ ID NO: 5, donde al menos los 6 residuos de aminoácido Cterminales de la CDR-H2 son idénticos a los del dominio variable pesado (VH) de la secuencia aceptora humana, donde la región de entramado aceptora humana del dominio VH tiene una identidad de secuencia del 70% o más con SEQ ID NO: 5 y está exenta de cualesquiera retromutaciones y donde dicho anticuerpo comprende una CDR-L1 correspondiente a los residuos 24-34 de SEQ ID NO: 4, una CDR-L2 correspondiente a los residuos 50-56 de SEQ ID NO: 4 y una CDR-L3 correspondiente a los residuos 89-97 de SEQ ID NO: 4, donde las posiciones de los aminoácidos son según Kabat.

Description

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Normalmente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácido introducidos en el mismo procedentes de una fuente que no es humana. Estos residuos de aminoácido no humanos a menudo se denominan residuos de “importación”, que normalmente se toman de un dominio variable de “importación”. La humanización puede realizarse esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores (Jones et al, Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)), sustituyendo secuencias de región hipervariable por las secuencias correspondientes de un anticuerpo “aceptor” humano. Por consiguiente, tales anticuerpos “humanizados” son anticuerpos quiméricos (patente estadounidense n.º 4.816.567) en los que se ha sustituido sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados normalmente son anticuerpos humanos en los que se sustituyen algunos residuos de región hipervariable y posiblemente algunos residuos de FR por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedores.

Otro método para obtener anticuerpos humanizados se describe en publicación de solicitud de patente estadounidense 2003/0017534, en el que se producen anticuerpos humanizados y preparaciones de anticuerpos a partir de animales no humanos transgénicos. Los animales no humanos se modifican por ingeniería genética para que contengan uno o más loci de inmunoglobulina humanizada que pueden someterse a transposición génica y conversión génica en los animales no humanos transgénicos para producir inmunoglobulinas humanizadas diversificadas.

La elección de los dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, que van a usarse en la obtención de los anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad. Según el método denominado de “ajuste óptimo”, se examina la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor frente a una biblioteca de secuencias de dominio variable humanas conocidas o una biblioteca de secuencias de línea germinal humanas. La secuencia humana que está más próxima a la del roedor puede aceptarse entonces como la región de entramado humana para el anticuerpo humanizado (Sims et al., J. Immunol. 1993;151:2296 y siguientes.; Chothia et al, Chothia y Lesk, J. Mol. Biol 1987;196:901-917). Otro método usa una región de entramado particular derivada de la secuencia consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras o pesadas. Puede usarse la misma región de entramado para varios anticuerpos humanizados diferentes (Carter et al., PNAS USA, 1992;89:4285 y siguientes.; Presta et al., J Immunol 1993; 151:2623 y siguientes.). Otros métodos diseñados para reducir la inmunogenicidad de la molécula de anticuerpo en un paciente humano incluyen anticuerpos remodelados en su superficie (véanse, por ejemplo, la patente estadounidense 6.797.492 y las publicaciones de solicitud de patente estadounidense 20020034765 y 20040253645) y anticuerpos que se han modificado por el análisis y retirada del epítopo de células T modificado (véanse, por ejemplo, las publicaciones de solicitud de patente estadounidense 20030153043 y U.S. Patente No. 5,712,120).

Además es importante que los anticuerpos se humanicen con retención de alta afinidad por el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para lograr este objetivo, según un método preferido, los anticuerpos humanizados se preparan mediante un procedimiento de análisis de las secuencias parentales y diversos productos humanizados conceptuales usando modelos tridimensionales de las secuencias parentales y humanizadas. Se dispone comúnmente de modelos de inmunoglobulina tridimensionales y los expertos en la técnica están familiarizados con ellos. Se dispone de programas informáticos que ilustran y muestran estructuras conformacionales tridimensionales probables de secuencias de inmunoglobulina candidatas seleccionadas. La inspección de estas presentaciones permite el análisis del papel probable de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de los residuos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse a su antígeno. De esta forma, pueden seleccionarse residuos de FR y combinarse con secuencias del receptor y de importación de modo que se logren las características deseadas del anticuerpo, tales como afinidad aumentada por el(los) antígeno(s) diana. En general, los residuos de la región hipervariable están implicados directa y lo más sustancialmente en influir en la unión a antígeno.

El ejemplo 1 a continuación describe el diseño de anticuerpos humanizados anti-NKG2A a modo de ejemplo que se unen a NKG2A, y el análisis se ilustra, al menos en parte, en la figura 1. Tal como se muestra en la figura 1, en un anticuerpo humZ270 de la invención, la parte C-terminal de CDR-H2 (correspondiente a los residuos de Kabat 6165) es idéntica a la parte correspondiente de la secuencia aceptora humana. Además, tal como se describe en la leyenda de la figura, una secuencia de humZ270VL (SEQ ID NO: 4) puede comprender opcionalmente mutaciones en uno o ambos residuos de FR indicados, L46 e I48, y una secuencia de humZ270VH (SEQ ID NO: 5) puede comprender opcionalmente mutaciones en uno o más de los residuos de FR indicados, V5, M69, T71, T73 y T75, numerándose los aminoácidos según Kabat. La tabla 1 describe variantes de humZ270VL y humZ270VH a modo de ejemplo que comprenden retromutaciones de humano a murino a modo de ejemplo en las secuencias de FR de humZ270VH y humZ270VL, así como combinaciones a modo de ejemplo de mutaciones de FR. En la tabla 1 y en otro lugar en el presente documento, las posiciones de aminoácido se designan según Kabat, en las que los aminoácidos V5, M69, T71, T73 y T75 en el dominio de humZ270VH corresponden a los aminoácidos V5, M70, T72, T74 y T76 en SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, u otras secuencias de humZ270VH a modo de ejemplo descritas en el presente documento.

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Tabla 1

Variantes de humZ270VL y humZ270VH que comprenden retromutaciones de FR a modo de ejemplo en secuencias humZ270VL (SEQ ID NO: 4 ó 6) y/o humZ270VH (SEQ ID NO: 5, 7 u 8) nativas o consenso

Variantes de humZ270VL: Variantes de humZ270VH

Ninguna
Ninguna

L46F: V5Q

I48V: M69L

L46F y I48V: T71V T73K T75S V5Q y M69L V5Q y T71V V5Q y T73K V5Q y T75S M69L y T71V M69L y T73K M69L y T75S T71V y T73K T71V y T75S T73K y T75S V5Q, T73K y T75S V5Q, T71V y T75S V5Q, T71V y T73K V5Q, M69L y T75S

V5Q, M69L y T73K V5Q, M69L y T71V T71V, T73K y T75S M69L, T73K y T75S M69L, T71V y T75S, M69L, T71V y T73K, V5Q, M69L, T71V y T73K, V5Q, M69L, T71V y T75S, V5Q, M69L, T73K y T75S, V5Q, T71V, T73K y T75S, M69L, T71V, T73K y T75S, V5Q, M69L, T71V, T73K y T75S

Por consiguiente, la presente invención proporciona versiones humanizadas de un anticuerpo anti-NKG2A producido

5 por el hibridoma de Z270, así como versiones humanizadas de anticuerpos no humanos que comparten características biológicas y/o identidad de secuencia sustancial con Z270. En otra realización, el anticuerpo monoclonal o un fragmento o derivado del mismo puede unirse a un NKG2A de primate no humano.

El anticuerpo humanizado en el presente documento comprende residuos de CDR o de región hipervariable no 10 humanos incorporados en los dominios VH y VL humanos.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión a antígeno procedentes de las CDR del anticuerpo murino Z270 en una región de entramado aceptora humana, en el que al menos los 6 residuos de aminoácido C-terminales de la CDR-H2 son iguales que los de la secuencia aceptora

15 humana. Tales anticuerpos humanizados pueden ser más eficaces que el anticuerpo murino Z270 original o una versión quimérica del mismo, por ejemplo, en potenciar la actividad citotóxica de un linfocito citotóxico que expresa CD94/NKG2A, tal como, por ejemplo, una célula NK, una célula NKT, una célula T / y/o una célula T /, o de una población de linfocitos citotóxicos que expresan CD94/NKG2A.

20 Los anticuerpos típicos de la invención comprenden residuos de unión a antígeno correspondientes a, o partes de las CDR-H2 y CDR-H3 de Z270 que comprenden, residuos D52, D54, R94, F99, T(100C) y W(100F) de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 5, que se ha mostrado en los ejemplos que son críticos para la unión a antígeno. Opcionalmente, los anticuerpos también comprenden los residuos de VH N35, Y53, E56, D98, V(100A) y L(100D).

25 En otro aspecto, un anticuerpo humanizado comprende una secuencia de CDR-H1 correspondiente a los residuos 31-35 de SEQ ID NO: 5 y una secuencia de CDR-H3 correspondiente a los residuos 95-102 de SEQ ID NO: 5, en el que la secuencia de CDR-H2 comprende los residuos 50-59 de SEQ ID NO: 5. En tales anticuerpos humanizados, la región VH puede tener, por ejemplo una identidad de secuencia del 50% o más con SEQ ID NO: 5, tal como una identidad de secuencia de al menos el 60%, al menos el 70%, o al menos el 75%. Dominios VH humanizados a

30 modo de ejemplo que tienen tales secuencias se describen en los ejemplos y a continuación.

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En una realización, en tales anticuerpos humanizados, el aminoácido en la posición 5 de la región VH puede ser V o Q; el aminoácido en la posición 69 de la región VH puede ser M o L; el aminoácido en la posición 71 de la región VH puede ser T o V; el aminoácido en la posición 73 de la región VH puede ser T o K; y/o el aminoácido en la posición 75 de la región VH puede ser T o S. En realizaciones separadas, la región VH comprende residuos de V5 o Q5, M69

o L69, T71 o V71, T73, o K71 y/o T75 o S75. En otra realización, el aminoácido en la posición 69 es L. En otra realización adicional o alternativa, el aminoácido en la posición 71 es V.

En una realización, en tales anticuerpos humanizados, la secuencia aceptora humana del dominio VH está exenta de cualesquiera retromutaciones.

El anticuerpo humanizado puede comprender una región de entramado aceptora humana de VH procedente de una secuencia aceptora humana seleccionada de, por ejemplo, VH1_18, VH5_a, VH5_51, VH1_f, y VH1_46 y el segmento J es JH6, tal como, por ejemplo, VH1_18, VH5_a, VH5_51, o VH1_f, u otras secuencias de región de entramado de VH de línea germinal humana conocidas en la técnica. En una realización, el segmento VH es VH1_18. En una realización particular, la región VH comprende la secuencia de SEQ ID NO: 8. En otra realización particular, la región VH comprende la secuencia de SEQ ID NO: 7. Por ejemplo, la región VH puede comprender la secuencia de SEQ ID NO: 5.

La secuencia aceptora humana de región VL puede ser, por ejemplo, VKI_O2/JK4. En una realización particular, la región VL comprende la SEQ ID NO: 4.

En un aspecto, un anticuerpo humanizado de la invención comprende una CDR-H2 que comprende una parte murina que consiste en los residuos 50-59 de SEQ ID NO: 2 unidos a una CDR-H3 que consiste en los residuos 95102 de SEQ ID NO: 2 a través de secuencias de FR adecuadas.

Tal como se describe en el presente documento, en una realización, el anticuerpo humanizado no comprende sustitución de FR en el dominio VH. En otra realización, el anticuerpo humanizado comprende una sustitución de FR en el dominio VH en una o más posiciones seleccionadas de 5, 69, 71, 73 y 75, utilizando el sistema de numeración de dominios variables según Kabat. En otra realización, el anticuerpo humanizado comprende sustituciones de FR en el dominio VH en dos o más de posiciones 5, 69, 71, 73 y 75; y en otras realizaciones, en tres, cuatro, o en todas estas posiciones. En realizaciones separadas e independientes, el anticuerpo humanizado comprende una sustitución de FR en el dominio VH en una posición seleccionada de 5, 69, 71, 73 y 75. En otras realizaciones separadas e independientes, el anticuerpo humanizado comprende sustituciones de FR en el dominio VH en las posiciones 5 y 69, o5 y71, o5 y 73, o 5 y 75, o69 y71, 69 y 73, o 69 y 75, o 71 y 73, o71 y 75, o73 y75, o 5, 69 y 71, o 5, 69 y 73, o 5, 69 y 75, o 69, 71 y 73, o 69, 71 y 75, o71, 73, y 75, o 5, 69, 71, y 73, o 5, 69, 71, y 75, o 5, 71, 73, y 75, o 69, 71, 73, y 75, o 5, 69, 71, 73, y 75. Menos en lugar de más sustituciones de región de entramado pueden minimizar la inmunogenicidad, pero la eficacia de unión puede ser una consideración importante para algunas aplicaciones. Por tanto, las sustituciones preferidas son retromutaciones, es decir, mutaciones que sustituyen un aminoácido en una posición determinada en la FR humana por el aminoácido en la posición correspondiente en una FR donadora no humana. Por tanto, en realizaciones separadas e independientes, la sustitución de aminoácido en el dominio VH en la posición 5 es V5Q, la sustitución de aminoácido en la posición 69 es M69L, la sustitución de aminoácido en la posición 71 es T71V, la sustitución de aminoácido en la posición 73 es T73K y la sustitución de aminoácido en la posición 75 es T75S. En una realización particular, el anticuerpo humanizado comprende una V en la posición 71 y/o una L en la posición 69.

El anticuerpo humanizado en el presente documento también comprende residuos de región hipervariable no humanos incorporados en un dominio VL humano. En una realización, el anticuerpo humanizado no comprende sustitución de FR en el dominio VL. En otra realización, el anticuerpo humanizado comprende una sustitución de Fr en el dominio VL en una de las posiciones 46 y 48, utilizando el sistema de numeración de dominios variables según Kabat. En otra realización, el anticuerpo humanizado comprende sustituciones de FR en el dominio VL de las posiciones tanto 46 como 48. Las sustituciones preferidas son retromutaciones, es decir, mutaciones que sustituyen un aminoácido en una posición determinada en la FR humana por el aminoácido en la posición correspondiente en una FR donadora no humana. Por tanto, en realizaciones separadas e independientes, la sustitución de aminoácido en el dominio VL en la posición 46 es L46F y la sustitución de aminoácido en el dominio VL en la posición 48 es I48V.

Un anticuerpo humanizado a modo de ejemplo comprende un dominio VH que comprende una secuencia de CDR-H1 correspondiente a los residuos 31-35 de las SEQ ID NOS: 5 o 7, una secuencia de CDR-H2 correspondiente a los residuos 50-66 de las SEQ ID NOS: 5 o 7, y una secuencia de CDR-H3 correspondiente a los residuos 95-102 de las SEQ ID NOS: 5 o 7. El anticuerpo humanizado puede comprender además un aminoácido en la posición 5 de Kabat 5 que es V o Q, un aminoácido en la posición de Kabat 69 que es M o L, un aminoácido en la posición de Kabat 71 que es T o V, un aminoácido en la posición de Kabat 73 que es T o K, y/o un aminoácido en la posición de Kabat 75 que es T o S, en el dominio VH. En una realización, el dominio VH comprende una sustitución de región de entramado en al menos una posición de Kabat seleccionada del grupo que consiste en 5, 69, 71, 73 y 75, por ejemplo, correspondiente a cualquiera de las sustituciones de FR de VH, o combinaciones de las mismas,

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(g) secuencias de entramado aceptoras humanas;

donde los residuos 60-65 en la CDR-H2 son de la secuencia aceptora humana de VH, y

donde el anticuerpo humanizado es más eficaz que un anticuerpo que comprende una secuencia ligera variable (VL) correspondiente a SEQ ID NO: 1 y una secuencia VH correspondiente a SEQ ID NO: 2 para potenciar la actividad citotóxica de una célula NK que expresa CD94/NKG2A.

En un ejemplo, la divulgación proporciona un anticuerpo humanizado que se une a NKG2A humano, comprendiendo el anticuerpo un dominio VH que comprende residuos de CDR no humanos y una región de entramado aceptora de VH humana, comprendiendo el dominio VH una CDR-H1 correspondiente a los residuos 31-35 de SEQ ID NO: 5, una CDR-H2 correspondiente a los residuos 50-65 de SEQ ID NO: 5 y una CDR-H3 correspondiente a los residuos 95-102 de SEQ ID NO: 5. En un ejemplo de la divulgación, un dominio VL que comprende residuos de CDR no humanos incorporados a la región de entramado aceptora de VL humana, comprendiendo el dominio VL una CDR-L1 correspondiente a los residuos 24-34 de SEQ ID NO: 4, una CDR-L2 correspondiente a los residuos 50-56 de SEQ ID NO: 4 y una CDR-L3 correspondiente a los residuos 89-97 de SEQ ID NO: 4.

En un ejemplo, la divulgación proporciona un anticuerpo humanizado que se une a NKG2A humano, comprendiendo el anticuerpo un dominio VH que comprende residuos de CDR no humanos incorporados al dominio VH humano, comprendiendo el dominio VH una sustitución en la región de entramado en al menos una posición Kabat en SEQ ID NO: 7 seleccionada del grupo que consiste en 5, 69, 71, 73 y 75. Este anticuerpo humanizado puede comprender una sustitución V5Q, una sustitución M69L, una sustitución T71V, una sustitución T73K o una sustitución T75S.

En otro aspecto particular, la invención proporciona un anticuerpo humanizado que se une a NKG2A humano, comprendiendo el anticuerpo un dominio VH que comprende residuos de CDR no humanos incorporados en un dominio VH humano, comprendiendo el dominio VH una secuencia de CDR-H1 correspondiente a los residuos 31-35 de SEQ ID NO: 8, una secuencia de CDR-H2 correspondiente a los residuos 50-66 de SEQ ID NO: 8, y una secuencia de CDR-H3 correspondiente a los residuos 95-102 de SEQ ID NO: 8, en el que los aminoácidos en las posiciones de Kabat 63, 64, 65, 66, y 67 son F, K, D, K, A, respectivamente. En una realización, el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8. En otra realización, el residuo en la posición de Kabat 60 es A. En otra realización, el residuo en la posición de Kabat 60 es S, y el anticuerpo humanizado comprende las secuencias de CDR-H1, -H2, y H3 de Z270, con retromutaciones de FR en los dos aminoácidos adyacentes al extremo C-terminal de CDR-H2. Los anticuerpos humanizados descritos en esta sección pueden comprender además retromutaciones de FR en otros residuos, por ejemplo, en las posiciones de Kabat 5, 69, 71, 73 y/o 75, tal como se describe en el presente documento.

En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo humanizado en el que las CDR de Kabat en la región VH se derivan todas ellas de Z270VH murino (SEQ ID NO: 2), comprendiendo además mutaciones S60A, F63L, K64Q y/o D65G. En una realización, el anticuerpo humanizado comprende todas las mutaciones S60A, F63L, K64Q y/o D65G.

El anticuerpo humanizado también puede comprender un dominio VL que comprende una secuencia de CDR-L1 correspondiente a los residuos 24-34 de SEQ ID NO: 6, una secuencia de CDR-L2 correspondiente a los residuos 50-56 de SEQ ID NO: 6, y una secuencia de CDR-L3 correspondiente a los residuos 89-97 de SEQ ID NO: 6, por ejemplo, además de las CDR de dominio VH descritas anteriormente. En una realización, el dominio VL del anticuerpo humanizado comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. En otra realización, el dominio VL del anticuerpo humanizado comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4.

La presente solicitud también contempla anticuerpos madurados por afinidad que se unen a anticuerpos anti-NKG2A, que contienen mutaciones de CDR o FR adicionales que mejoran la afinidad del anticuerpo humanizado por el antígeno. Se conocen en la técnica métodos para preparar tales anticuerpos madurados por afinidad. El anticuerpo original puede ser un anticuerpo humanizado, por ejemplo, uno que comprende las secuencias de VL/VH de las SEQ ID NOS: 4 y 5 (opcionalmente con una o más de las sustituciones de CDRH2 y/o FR descritas en el presente documento), o uno que comprende las secuencias de VL/VH consenso de las SEQ ID NOS: 6 y 7, respectivamente. El anticuerpo madurado por afinidad se une preferiblemente a NKG2A con una afinidad comparable o superior a la de Z270 murino, por ejemplo una afinidad mejorada de desde al menos aproximadamente una, aproximadamente dos o aproximadamente cuatro veces hasta aproximadamente 100 veces

o aproximadamente 1000 veces, por ejemplo tal como se evalúa usando un ensayo de unión tal como se describe a continuación.

En otro aspecto, la divulgación proporciona anticuerpos humanizados que comprenden un dominio VH que tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 50%, al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 80% (por ejemplo, una identidad de al menos aproximadamente el 85%, 90%, 95%, 97% o más) con el dominio VH de Z270, humZ270, humZ270cons y/o humZ270cons2 (SEQ ID NOS: 2, 5, 7 y 8, respectivamente). En otro aspecto particular, la divulgación proporciona un anticuerpo humanizado que se une a NKG2A, que comprende un dominio VH que comprende residuos de CDR no humanos incorporados en un dominio VH humano, en el que el dominio VH es idéntico en al menos aproximadamente el 50% a humZ270VH1 (SEQ ID NO: 5). En una realización, el dominio VH es idéntico en al menos el 90% a SEQ ID NO: 5. Por ejemplo, el anticuerpo humanizado puede comprender una secuencia de CDR-H1 correspondiente a los residuos 31-35 de SEQ

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(marcado) en presencia de un anticuerpo completamente irrelevante es el valor alto de control. El valor bajo de control se obtiene incubando el anticuerpo control (Z270) marcado (positivo) con anticuerpo control no marcado, donde se produciría competencia y se reduciría la unión del anticuerpo marcado.

En un ensayo de prueba, una reducción significativa en la reactividad del anticuerpo marcado en presencia de un anticuerpo de prueba es indicativa de un anticuerpo de prueba que reconoce el mismo epítopo, es decir, uno que “reacciona de manera cruzada” con el anticuerpo control marcado. Cualquier compuesto o anticuerpo de prueba que reduzca la unión del control marcado al antígeno/diana en al menos el 50% o más preferiblemente el 70%, en cualquier razón de compuesto o anticuerpo de prueba con respecto al control de entre aproximadamente 1:10 y aproximadamente 1:100 se considera que es un compuesto o anticuerpo que se une sustancialmente al mismo epítopo o determinante que el control. Preferiblemente, un compuesto o anticuerpo de prueba de este tipo reducirá la unión del control al antígeno/diana en al menos el 90%. No obstante, en la presente invención puede usarse cualquier compuesto o anticuerpo que reduzca la unión de un compuesto o anticuerpo control en cualquier grado medible.

También pueden usarse ensayos de bloqueo cruzado similares para evaluar si un anticuerpo de prueba (humanizado) afecta a la unión del ligando natural para NKG2A, HLA-E, a NKG2A, intercambiando Z270 por una forma adecuada de HLA-E. Por ejemplo, para determinar si una preparación de anticuerpos humanizados anti-NKG2A reduce o bloquea las interacciones CD94/NKG2A con HLA-E, puede realizarse la siguiente prueba. Se incuba una línea celular que expresa CD94/NKG2A, tal como Ba/F3-CD94/NKG2A, NKL o NK92, durante 30 min en hielo, con concentraciones crecientes de un anticuerpo de prueba anti-NKG2A. Entonces se incuban las células con tetrámeros marcados con PE de HLA-E durante 30 minutos en hielo, se lavan de nuevo y se analiza la unión del tetrámero de HLA-E en un citómetro de flujo (FACScalibur, Beckton Dickinson), mediante métodos convencionales. En ausencia de anticuerpos de prueba, el tetrámero de HLA-E se une a las células. En presencia de una preparación de anticuerpos que bloquea la unión de CD94/NKG2A a HLA-E, hay una unión reducida de tetrámeros de HLA-E a las células, y tales AcM se denominan “anticuerpos bloqueantes”.

En algunos aspectos de la invención, por ejemplo, cuando no se desea destruir las células que expresan NKG2A, los anticuerpos humanizados de esta invención preferiblemente no demuestran unión específica sustancial a receptores de Fc. Tales anticuerpos pueden comprender regiones constantes de diversas cadena pesadas que se sabe que no se unen a receptores de Fc. Uno de tales ejemplos es una región constante. Alternativamente, pueden usarse fragmentos de anticuerpo que no comprenden regiones constantes, tales como fragmentos Fab o F(ab’)2, para evitar la unión al receptor de Fc. Puede evaluarse la unión al receptor de Fc según métodos conocidos en la técnica, incluyendo por ejemplo someter a prueba la unión de un anticuerpo a la proteína receptora de Fc en un ensayo BIACORE. Además, puede usarse cualquier otro anticuerpo en el que la parte de Fc se modifica para minimizar o eliminar la unión a los receptores de Fc (véase, por ejemplo, el documento WO03101485). Se conocen bien en la técnica ensayos tales como, por ejemplo, ensayos basados en células, para evaluar la unión al receptor de Fc y se describen, por ejemplo, en el documento WO03101485.

Ensayos de citotoxicidad

Si un anticuerpo anti-NKG2A reduce o bloquea las interacciones CD94/NKG2A con HLA-E, puede aumentar la citotoxicidad de linfocitos restringidos por CD94/NKG2A. Esto puede evaluarse mediante un ensayo de citotoxicidad típico, ejemplos de los cuales se describen a continuación.

Puede someterse a prueba la capacidad de un anticuerpo para reducir la señalización mediada por CD94/NKG2A en un ensayo de citotoxicidad in vitro de 4 horas convencional usando, por ejemplo, células NKL que expresan CD94/NKG2A, y células diana que expresan HLA-E. Tales células NKL no destruyen eficazmente dianas que expresan HLA-E porque CD94/NKG2A reconoce HLA-E, conduciendo a la iniciación y la propagación de señalización inhibidora que impide la citólisis mediada por linfocitos. Un ensayo de citotoxicidad in vitro de este tipo puede llevarse a cabo mediante métodos convencionales que se conocen bien en la técnica, tal como se describe por ejemplo en Coligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. y Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993). Se marcan las células diana con 51Cr antes de la adición de células NKL, y entonces se estima la destrucción como proporcional a la liberación de 51Cr de las células al medio, como resultado de la destrucción. La adición de un anticuerpo que impide que CD94/NKG2A se una a HLA-E da como resultado que se impida la iniciación y la propagación de la señalización inhibidora a través de CD94/NKG2A. Por tanto, la adición de tales agentes da como resultado aumentos en la destrucción mediada por linfocitos de células diana. Esta etapa identifica de ese modo agentes que impiden la señalización negativa inducida por CD94/NKG2A, por ejemplo, bloqueando la unión al ligando. En un ensayo de citotoxicidad por liberación de 51Cr particular, las células efectoras NKL que expresan CD94/NKG2A pueden destruir las células diana LCL 721.221 negativas para HLA-E, pero menos bien que las células control LCL 721.221-Cw3 que expresan HLA-E. En cambio, las células efectoras YTS que carecen de CD94/NKG2A destruyen ambas líneas celulares eficazmente. Por tanto, las células efectoras NKL destruyen menos eficazmente las células LCL 721.221-Cw3 HLA-E+ debido a la señalización inhibidora inducida por HLA-E a través de CD94/NKG2A. Cuando se preincuban células NKL con anticuerpos bloqueantes anti-CD94/NKG2A según la presente invención en un ensayo de citotoxicidad de liberación de 51Cr de este tipo, se destruyen más eficazmente las células LCL 721.221-Cw3 que expresan HLA-E, de manera dependiente de la concentración de anticuerpo.

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Claims

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