JPH03112485A - Ｈｌａ―ｃ遺伝子およびｄｎａプローブ並びに形質転換細胞 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はＨＬＡ−Ｃ遺伝子およびＤＮＡプローブ並びに
形質転換細胞に関し、特にはＨＬＡ（ｈｕｍａｎ　１ｅ
ｕｋｏｃｙＬｏ　ａｎｔｉｇｅｎ）　　Ｃ抗原のアロタ
イプをコードするＤＮＡおよびＤＮＡタイピングで患者
のクラス！遺伝子そのものを取り出して同定する際に使
用されるＤＮＡプローブ並びに本発明のＤＮＡを真核細
胞に導入することによりその細胞表面上にＨＬＡ−Ｃ抗
原のアロタイプを発現した形質転換細胞に関する。ＨＬ
Ａ−Ｃ抗原のアロタイプを発現した細胞は免疫原として
動物に投与することが可能であるためＨＬＡ−Ｃ抗原の
アロタイプに特異性を有するモノクローナル抗体の開発
に有用である。さらに、ヒトの真核細胞へ本発明の遺伝
子を導入しＨＬＡ−Ｃ抗原のアロタイプを発現した細胞
は抗血清の特異性判定に使用されるパネル細胞（ｐａｎ
ｅＩ　ｃｅｌｌ）として有用である。

〔従来の技術〕

ＨＬＡ抗原はヒトの臓器移植の際、移植片の定着の可否
を決定する抗原として移植免疫に重要な役割を果たして
いる。この中でクラスＩ抗原は、細胞性免疫において細
胞傷害性Ｔ細胞による抗原認識に関与すると共に、尋常
性乾石（ＣＷ６）、天泡疹（ＡＩＯ）、口座ヘルペス（
Ａ２９）。

ベーチェッ１−（Ｂ５７）などの疾患との有意な相関が
明らかにされている。　　（Ｏｚａｗａ、Ａ、、０ｈｋ
ｉｄｏ。

Ｍ、、Ｔｓｕｊｉ、　Ｋ、Ｊ、Ａｎ＋、Ａｃａｄ、Ｄｅ
ｒｍａｔｏｌ、土、　２０５．１９８１　）ＨＬＡ抗原
は拒絶現象や移植免疫に深（関連することから主要組織
適合抗原とも呼ばれ、それをコードする遺伝子群は主要
組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）と呼ばれる。

ＨＬＡはヒトのＭＨＣであり、ＨＬＡクラスＩ抗原は細
胞膜上に存在する膜タンパク質であって、Ａ、Ｂ、Ｃの
３つの遺伝子座に支配されている。クラス■抗原は分子
ｆｆ１４４ｋａの糖タンパク（α鎖）が分子量１２ｋｄ
のタンパク質（Ｂ２−ミクログロブリン）と非共有結合
によって会合した構造を持ち、α鎖は細胞外に位置する
Ｎ末端側に、α１．α２．α３の３個のドメインがあり
、次いで細胞内に埋め込まれた領域（Ｌｒａｎｓｍｅｍ
ｂｒａｎｅ　Ｒｅｇｉｏｎ）　、細胞内に位置する領域
（ｃｙｔｏｐｌａｓｅ＋ｉｃ　ｄｏｍｅｉｎ）が並んで
いる。Ｂ２−ミクログロブリンは１つのドメインからな
り、α鎖に結合している。

ＨＬＡ遺伝子領域はヒト第６染色体短腕上に２．５セン
チモルガン（ｃＭ）の距離に亘って存在し、セントロメ
アーの側からクラス１１６Ｗ域（１，ＯｃＭ）、クラス
ＩＩＩ　９Ｍ域（ＤＲ−Ｂ間＝０．７ｃＭ）、クラスＩ
領域（０，８ｃ　Ｍ　）の順に並んでいる。

（Ｊｏｒｄａｎ、Ｂ、Ｒ，ｅｔ　ａｌ、Ｉａ＋ｍｕｎｏ
１．Ｒｅｖ、、８４．７３＋１９８５）ＨＬ　Ａクラス
■抗原を検査する方法は、血清学的方法および組み換え
ＤＮＡ技術によるＨ　Ｌ　Ａ　−Ｄ　Ｎ　Ａ　　ｔｙｐ
ｉｎｇがある。

血清学的方法としては、補体依存性細胞障害性試験（Ｔ
ｅｒａｓａｋｉ、Ｐ、１．　ａｎｄ　ＭｃＣｌｅｌｌａ
ｎｄ、Ｊ、Ｄ。

Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）　、　２０４．ｐｐ９
９Ｂ−１０００，１９６４）が標準的な手法である。こ
の方法はアロ抗血清を用い、家兎の血清を補体としてリ
ンパ球細胞毒（ｌｙ＊ｐｏｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　
）によりＨＬＡをタイプする方法であるが、抗血清が多
産妊婦のアロ血清であること、および、抗血清は交差反
応性（ｃｒｏｓｓ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）を示しＨＬ　Ａ
クラス■アロタイプに単一特異的に反応するものが得難
いこと、さらに、抗血清はヒトから入手するため再現性
ある血清の安定供給は不可能であること、発現量の少な
いアロ抗原に対する抗血清は得られないことからアロ血
清に替わるモノクローナル抗体の開発が望まれている。

１９８４年の国際組織適合性ワークシジップで、およそ
１５０種のモノクローナル抗体が提出されている。（Ｆ
ａｕｃｈｅｔ、Ｒ，、Ｂｏｎｄｅｒ、Ｊ、Ｇ、、にｅｎ
ｎｅｄｙ、Ｌ、Ｊ、ｅｔ　ａｌ＋：　ＨＬ　Ａ−Ａ、　
　Ｂ、　　Ｃｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　　ａｎｔｉｂｏｄ
ｉｅｓ、　　Ｈｉｓｔ。

ｃｏ＋５ｐａｔｉｂｌｌｉｔｙ　Ｔｅｓｔｉｎｇ　１９
８４　（Ａｌｂｅｒｔ、Ｅ、Ｄ、−。

Ｂａｕｒ、　Ｍ、Ｐ、、Ｍａｙｒ、Ｗ、Ｒ，ｅｄ、）、
　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ。

Ｂｅｒｌｉｎ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｎｅｉ＜　Ｙｏ
ｒｋ、Ｔｏｋｙｏ：　２１１＋１９８４）抗ＨＬ　Ａモ
ノクローナル抗体の作成は、一般にヒトのリンパ球をマ
ウスに免疫して得られた肺細胞とマウス骨髄腫細胞を融
合させる方法を用いることができる。（Ｏｆ、　Ｖ、Ｔ
、　、　Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇ、　Ｌ、Ａ、　：１ｏ＋
ｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ｈｙ
ｂｒｉｄ　ｃｅｌｌ　１ｉｎｅｓ。

５ｅｌｅｃｔｅｄ　ａ＋ｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕ
ｎｏｌｏｇｙ、　３５１＋１９８１）しかしながら、現
在まででモノクローナル抗体のうちでＨＬＡタイピング
に適した抗体−たとえばＨＬＡ−Ｂ抗原のアロタイプに
対するモノクローナル抗体を例にとると、８ｗ４，８ｗ
６゜Ｂ７．Ｂ８．Ｂ１３．Ｂ２７に単一特異的に結合す
るモノクローナル抗体しか得られていない状況にあり、
他の多数のアロタイプに単一特異性を存するモノクロー
ナル抗体の開発が期待されている。また、現在まだ反応
性を有するモノクローナル抗体すら得られていないアロ
抗原が多数存在している。このようなアロ抗原について
は他のアロ抗原と交差反応性を存するモノクローナル抗
体も有効である。最近さらに抗ＨＬ　Ａモノクローナル
抗体作製方法の改善が成された。

この方法は、ヒトのＴリンパ球優位の末梢リンパ球を免
疫原として用いた抗体産生法では、ヒト由来の抗原が多
数存在するために目的とするＨＬＡアロタイプの抗原以
外の多数の抗原部位に対し反応性を示すモノクローナル
抗体が得られる点を改善したものであり、免疫動物由来
の真核細胞にヒ）ＨＬＡ抗原遺伝子クローンを導入して
形質転換した細胞を免疫動物に投与することで形質転換
細胞上に発現したヒ）　ＨＬ　Ａ抗原に対するモノクロ
ーナル抗体を効率良く産生ずる肺細胞を得る方法である
。（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａ　１ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｔ
ｏ　ＨＬ　Ａ　−Ｄ　Ｐ　−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｍ
ｏｕｓｅ　　Ｌ　　ｃｅｌｌ：　　Ｐｒｏｃ、　　Ｎａ
ｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、、　　ＵＳＡ、８３゜ｐｐ　
３４１７−３４２１．１９８６　）ＨＬＡクラス！抗原
アロタイプに特異性を有する抗血清、モノクローナル抗
体が得られていないものについてはＤＮＡタイピングが
有力な検査方法である。尋常性乾宿はＨＬ　Ａクラス■
抗原である０ｗ６．０ｗ７に非常に高い相関を示す疾患
として知られている。（Ｏｚａｗａ　ｅｔ　ａｌ、：Ｓ
ｏｍｅ　　ｒｅｃｅｎｔ　　ａｄｖａｎｃｅｓ　　ｉｎ
　　　ＨＬ　　Ａ　　ａｎｄ　　５ｋｉｎｄｉｓｅａｓ
ｅｓ、Ｊ、Ａｍ、Ａｃａｄ、Ｄｅｒｍａｔｏｌ、　　　
４，２０５＋１９８１）そこでＯｚａｗａらはＣ抗原遺
伝子クローンｐ４２（Ｓｏｄｏｙｅｒ＋Ｒ，ｅｔ　ａｌ
、、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕ
ｅｎｃｅ　ｏｆ　ａ　ｇｅｎｅ　ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ａ
　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｈｕｍａｎ　ｃｌａｓｓ　Ｉ　
ｈｉｓｔｏ　ｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ　ａｎｔｉｇ
ｅｎ（ＨＬＡ−Ｃｗ３　）　、　ＥＭＢＯＪ、、３　：
８７９，１９８４）のＰｖ１ｊｌｌフラグメントをプロ
ーブとして０ｗ６゜０ｗ７を有する尋常性乾官２１名と
健常人１６名についてＤＮＡタイピングを実施した。　
（Ｏｚａｗａ。

Ａ、ｅｔ　ａｌ　　：　Ｄ　Ｎ　Ａ　　ｔ”ｙｐｉｎｇ
　ｉｎ　ｐｓｏｒｉａｓｉｓＶｕｌｇａｒｉｓ、　Ｉｎ
：Ｐｒｏｃｅｅｄ＋ｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　　３　ｒｄ　
Ａｓ１ａＯｃｅａｎｉａ　Ｈ４ｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂ
ｉｌｉｔｙ　Ｗｏｒｋｓｈｏｐ　ａｎｄＣｏｎｆｅｒｅ
ｎｃｅ＋　ｉｎ　ｐｒｅｓｓ）　その結果、シグナル配
列、α１ドメインα２ドメインの一部に相当するＰｖｕ
　Ｉｆ　　　１．７ｋｂフラグメントをプローブとした
ときに患者に特異的なバンドを検出した。

〔発明が解決しようとする課題〕

従来の技術においては、単離され塩基配列の特定された
ＨＬＡ遺伝子が数多く得られていないため、ＨＬＡ抗原
アロタイプの解析、ＤＮＡタイピングの適用に制限を受
けていた。また、抗ＨＬＡモノクローナル抗体を作成す
るための良い免疫原が少なかった。

本発明はこのような事情に着目してなされたもので、新
規なＨＬＡ−Ｃ，！ｉ伝子およびＤＮＡプローブ並びに
形質転換細胞を捷供することを目的とする。

〔課題を解決するための手段及び作用〕発明者はＨＬ　
Ａに関する研究を続けた結果、ＨＬＡ−Ｃ遺伝子の単離
に成功し、本発明を完成させた。

１つはＨＬＡ−Ｃｂ−１遺伝子であり下記の塩基配列で
表わされるエクソンを有する。

ＡＴＧＣＧＧＧＴＣＡＴＧＧＣＧＣＣＣＣＧＡＡＣＣＣ
ＴＣ八ＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＣＧＧＧＡＧＣＣＣＴ
ＧＧＣへＣＴＧＡＣＣＧＡＧＡＣＣＴＧＧＧＣＣＴＧＣ
ＴＣＣＣＡＣＴＣＣＡＴＧＡＧＧＴＡＴＴＴＣＴＣＣＡ
ＣＡＴＣＣＧＴＧＴＣＣＣＧＧＣＣＣＧＧＣＣＧＣＧＧ
ＧＧＡＧＣＣＣＣＧＣＴＴＣＡＴＣＧＣＡＧＴＧＧＧＣ
ＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＡＣＡＣＧＣＡＧＴＴＣＧＴＧＣ
ＧＧＴＴＣＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＣＣＧＣＧＡＧＴＣＣ
ＧＡＧＡＧＧＧＧＡＧＣＣＧＣＧＧＧＣＧＣＣＧＴＧＧ
ＧＴＧＧＡＧＣＡＧＧＡＧＧＧＧＣＣＧＧＡＧＴＡＴＴ
ＧＧＧＡＣＣＧＧＧＡＧＡＣＡＣＡＧＡＡＧＴＡＣＡＡ
ＧＣＧＣＣＡＧＧＣＡＣＡＧＡＣＴＧＡＣＣＧＡＧＴＧ
ＡＧＣＣＴＧＣＧＧＡＡＣＣＴＧＣＧＣＧＧＣＴＡＣＴ
ＡＣＡＡＣＣＡＧＡＧＣＧＡＧＧＣＣＧＧＧＴＣＴＣＡ
ＣＡＣＣＣＴＣＣＡＧＴＧＧＡＴＧＴＴＴＧＧＣＴＧＣ
ＧＡＣＣＴＧＧＧＧＣＣＣＧＡＣＧＧＧＣＧＣＣＴＣＣ
ＴＣＣＧＣＧＧＧＴＡＴＧＡＣＣＡＧＴＣＣＧＣＣＴＡ
ＣＧＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＴＴＡＣＡＴＣＧＣＣＣＴＧ
ＡＡＣＧＡＧＧＡＴＣＴＧＣＧＣＴＣＣＴＧＧＡＣＣＧ
ＣＣＧＣＧＧＡＣＡＣＧＧＣＧＧＣＴＣＡＧＡＴＣＡＣ
ＣＣＡＧＣＧＣＡＡＧＴＧＧＧＡＧＧＣＧＧＣＣＣＧ　
ＴＧ　Ａ　Ｇ　ＧＣＧ　ＧＡＧ　ＣＡ　Ｇ　ＣＧ　ＧＡ
　Ｇ　Ａ　Ｇ　ＣＣＴ　Ａ　ＣＣＴＧ　Ｇ　Ａ　Ｇ　Ｇ
　Ｇ　ＣＡ　ＣＧＴＧＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＣＴＣＣＧ
ＣＡＧＡＴＡＣＣＴＧＧＡＧＡＡＣＧＧＧ＾八ＧＧＡＧ
ＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＧＣＧＣＧＧＡＡＣＡＣＣＣＡＡ
ＡＧＡＣＡＣＡＣへＴＧＡＣＣＣＡＣＣＡＴＣＣＣＧＴ
ＣＴＣＴＧＡＣＣＡＴＧＡＧＧＣＣＡＣＣＣＴＧＡＧＧ
ＴＧＣＴＧＧＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＴＧ
ＣＧＧＡＧＡＴＣＡＣＡＣＴＧＡＣＣＴＧＧＣＡＧＴＧ
ＧＧＡＴＧＧＧＧＡＧＧＡＣＣＡＡＡＣＴＣＡＧＧＡＣ
ＡＣＣＧＡＧＣＴＴＧＴＧＧＡＧＡＣＣＡＧＧＣＣＡＧ
ＣＡＧＧＡＧＡＴＧＧＡＡＣＣＴＴＣＣＡＧＡＡＧＴＧ
ＧＧＣＡＧＣＴＧＴＧＡＴＧＧＴＧＣＣＴＴＣＴＧＧＡ
ＧＡＡＧＡＧＣＡＧＡＧ＾ＴＡＣＡＣＧＴＧＣＣＡＴＧ
ＴＧＣＡＧＣＡＣＧＡＧＧＧＧＣＴＧＣＣＧＧＡＧＣＣ
ＣＣＴＣＡＣＣＣＴＧＡＧＡＴＧＧＧＡＧＣＣＧＴＣＴ
ＴＣＣＣＡＧＣＣＣＡＣＣＡＴＣＣＣＣＡＴＣＧＴＧＧ
ＧＣＡＴＣＧＴＴＧＣＴＧＧＣＣＴＧＧＣＴＧＴＣＣＴ
ＧＧＣＴＧＴＣＣＴＡＧＣＴＧＴＣＣＴＡＧＧＡＧＣＴ
ＧＴＧＧＴＧＧＣＴＧＴＴＧＴＧＡＴＧＴＧＴＡＧＧＡ
ＧＧＡＡＧＡＧＣＴＣＡＧＧＴＧＧＡＡＡＡＧＧＡＧＧ
ＧＡＧＣＴＧＣＴＣＴＣ＾ＧＧＣＴＧＣＧＴＣＣＡＧＣ
ＡＡＣＡＧＴＧＣＣＣＡＧＧＧＣＴＣＴＧＡＴＧＡＧＴ
ＣＴＣＴＣＡＴＣＧＣＴＴＧＴＡＡＡＧＣＣＴＧＡ上記
塩基配列およびこの明細書の特許請求の範囲８発明の詳
細な説明に記載した塩基配列では、Ａはアデニン、Ｃは
シトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミンを示す。

もう１つはＨＬＡ−Ｃｂ−２遺伝子であり下記の塩基配
列で表わされるエクソンを有する。

ＡＴＧＣＧＧＧＴＣＡＴＧＧＣＧＣＣＣＣＧＡＡＣＣＣ
ＴＣＡＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＣＧＧＧＡＧＣＣＣＴ
ＧＧＣＣＣＴＧＡＣＣＧＡＧＡＣＣＴＧＧＧＣＣＴＧＣ
ＴＣＣＣ八ＣＴＣＣＡＴＧＡＧＧＴＡＴＴＴＣＴＡＣＡ
ＣＣＧＣＣＧＴＧＴＣＣＣＧＧＣＣＣＧＧＣＣＧＣＧＧ
ＡＧＡＧＣＣＣＣＧＣＴＴＣＡＴＣＧＣＡＧＴＧＧＧＣ
ＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧ＾ＣＡＣＧＣＡＧＴＴＣＧＴＧＣ
ＧＧＴＴＣＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＣＣＧＣＧＡＧＴＣＣ
ＡＡＧＡＧＧＧＧＡＧＣＣＧＣＧＧＧＣＧＣＣＧＴＧＧ
ＧＴＧＧＡＧＣＡＧＧＡＧＧＧＧＣＣＧＧＡＧＴＡＴＴ
ＧＧＧＡＣＣＧＧＧＡＧＡＣＡＣＡＧＡＡＧＴＡＣＡＡ
ＧＣＧＣＣＡＧＧＣＡＣＡＧＧＣＴＧＡＣＣＧＡＧＴＧ
ＡＧＣＣＴＧＣＧＧＡＡＣＣＴＧＣＧＣＧＧＣＴＡＣＴ
ＡＣＡＡＣＣＡＧＡＧＣＧＡＧＧＣＣＧＧＧＴＣＴＣＡ
ＣＡＣＣＣＴＣＣＡＧＡＧＧＡＴＧＴＡＣＧＧＣＴＧＣ
ＧＡＣＣＴＧＧＧＧＣＣＣＧＡＣＧＧＧＣＧＣＣＴＣＣ
ＴＣＣＧＣＧＧＧＴＡＴＧＡＣＣＡＧＴＣＣＧＣＣＴＡ
ＣＧＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＴＴＡＣＡＴＣＧＣＣＣＴＧ
ＡＡＣＧＡＧＧＡＣＣＴＧＣＧＣＴＣＣＴＧＧＡＣＣＧ
ＣＴＧＣＧＧＡＣＡＣＧＧＣＧＧＣＴＣＡＧＡＴＣＡＣ
ＣＣＡＧＣＧＣＡＡＧＴＧＧＧＡＧＧＣＧＧＣＣＣＧＴ
ＧＡＧＧＣＧＧＡＧＣＡＧＴＧＧＡＧＡＧＣＣＴＡＣＣ
ＴＧＧＡＧＧＧＣＡＣＧＴＧＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＣＴ
ＣＣＧＣＡＧＡＴＡＣＣＴＧＧＡＧＡＡＣＧＧＧＡＡＧ
ＧＡＧＡＣＧＣＴＧＣＡＧＣＧＣＧＣＧＧＡＡＣＡＣＣ
ＣＡＡＡＧＡＣＡＣＡＣＧＴＧ八ＣＣＣＡＣＣＡＴＣＣ
ＣＧＴＣＴＣＴＧＡ（：ＣＡＴＧＡＧＧＣＣＡＣＣＣＴ
ＧＡＧＧＴＧＣＴＧＧＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＴＣＴＡＣ
ＣＣＴＧＣＧＧＡＧＡＴＣＡＣＡＣＴＧＡＣＣＴＧＧＣ
ＡＧＣＧＧＧＡＴＧＧＣＧＡＧＧＡＣＣＡＡＡＣＴＣＡ
ＧＧＡＣＡＣＣＧＡＧＣＴＴＧＴＧＧＡＧＡＣＣＡＧＧ
ＣＣＡＧＣＡＧＧＡＧＡＴＧＧＡＡＣＣＴＴＣＣＡＧＡ
ＡＧＴＧＧＧＣＡＧＣＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＣＣＴＴＣ
ＴＧＧＡＧＡＡＧＡＧＣＡＧＡＧＡＴＡＣＡＣＧＴＧＣ
ＣＡＴＧＴＧＣＡＧＣＡＣＧＡＧＧＧＧＣＴＧＣＣＧＧ
ＡＧＣＣＣＣＴＣＡＣＣＣＴＧＡＧＡＴＧＧＧＡＧＣＣ
ＡＴＣＴＴＣＣＣＡＧＣＣＣＡＣＣＡＴＣＣＣＣＡＴＣ
ＧＴＧＧＧＣＡＴＣＧＴＴＧＣＴＧＧＣＣＴＧＧＣＴＧ
ＴＣＣＴＧＧＣＴＧＴＣＣＴＡＧＣＴＧＴＣＣＴＡＧＧ
ＡＧＣＴＧＴＧＡＴＧＧＣＴＧＴＴＧＴＧＡＴＧＴＧＴ
八ＧＧＡＧＧＡＡＧＡＧＣＴＣＡＧＧＴＧＧＡＡＡＡＧ
ＧＡＧＧＧＡＧＣＴＧＣＴＣＴＣＡＧＧＣＴにＣＧＴＣ
ＣＡＧＣＡＡＣＡＧＴＧＣＣＣＡＧＧＧＣＴＣＴＧＡＴ
ＧＡＧＴＣＴＣＴＣＡＴＣＧＣＴＴＧＴＡＡＡＧＣＣＴ
ＧＡこの２つのＨＬＡクラスＩ　ＤＮＡは、その部の配
列にマーカー物質を標識してＤＮＡタイピングに使用さ
れるＤＮＡプローブに応用できる。マーカー物質として
は、ベルオキシターゼ鉄ポルフィリン誘導体、ルシフェ
ラーゼ等の発光物質、蛍光物ｉ、２．３−ブタジオン等
のリン光物質およびｉｔｐ、ｓｓ３等の放射性物質が一
般的に使用される。これらのマーカー物質およびマーカ
ー物質を１本鎖ＤＮＡに標識する方法は公知である。（
Ａｎｎｕａｌ　Ｒｅｖｉｅｗ　Ｂｉｏｐｈｙｓ。

Ｂｉｏｅｎｇ、ｐｐ１７５−１９５．（１９８１）、　
Ｒｉｇｂｙ　ｅｔａｌ、、Ｊ、Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、、１１３，２３７．　（１９７７））この２
つのＨＬＡ−Ｃ遺伝子はＨＬＡ−Ｃｂ−１，Ｃｂ−２を
それぞれコードするので真核細胞に導入することにより
ＨＬＡ−Ｃｂ−１゜Ｃｂ−２抗原をそれぞれ発現する形
質転換細胞を得ることができる。

〔実施例〕

本発明を実施例に基いて説明する。

ＨＬＡ−Ｃ”の 染色体ＤＮＡの分離 ＨＬＡ−Ａ２／Ａ２．Ｂ５１／Ｂ５１．Ｃ−／ＣＤＲ４
／ＤＲ４，ＤＱ３／ＤＱ３．ＤＰ５／ＤＰ５のハブロタ
イブをもち、ＥＢウィルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ
　Ｖｉｒｕｓ）で形質転換したヒトＢｌｌｌ胞株ＬＫＴ
−２（北里大学大谷博士より入手）５Ｘ１０’個を１０
−のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に浮遊させ、１５００
ｒｐｎ＋で遠心した。上清を捨て、再び１０ｄのＰＢＳ
に浮遊させ、１５００ｒｐＬ＠で遠心し、上清を完全に
取り除いた。

次に、ＬＫＴ−２細胞を２ｄのＬＳＴ緩衝液（２０ｍＭ
　　Ｔｒｉｓ溶液ｐ　Ｈ７，４，１０ｍＭ　ＮａＣ１，
３ｍＭＭｇＣｌｚ　）に浮遊させ１５００ｒｐｍで遠心
し上清を取り除いた。４°Ｃに冷却した５％５ｏｃｏｓ
ｅ、　４％ＮＰ　−４０を含むＬＳＴ緩衝液１−を加え
ＬＫＴ−２細胞を浮遊させ５分間放置した。その後１５
００ｒｐｍ＋で遠心し上清を取り除き、冷却した５−の
ＡＣＥＣ１衝液（５０ｍＭ酢酸ナトリウム、　１０ｍＭ
ＥＤＴＡ）を加えて撹拌した。０．５ｄのｌＯ％ＳＤＳ
溶液を加えた後、５−のフェノール溶液を加え４分間振
盪した。その後２００Ｏｒｐｍで１０分間遠心し、上層
を新しい試験管に入れた。この試験管に上層液と等量の
クロロホルム溶液を加え４分間振盪後、２００Ｏｒｐｍ
で１０分間遠心し、上層を新しい試験管に入れた。上層
をとった試験管に２倍量の９９％エタノールをゆっくり
加え混合しヒト染色体ＤＮＡを糸状に分離した。分離し
たヒト染色体ＤＮＡ３０μｇを制限酵素Ｅｃ　ｏＲ１９
０単位（Ｕ）で３７°Ｃ３時間インキエベートした。Ｅ
ｃｏＲＩで切断したヒト染色体ＤＮＡを０．８％アガロ
ースゲルの末端に添加し電気泳動し、６．Ｏｋｂから８
．５ｋｂの範囲にあるＤＮＡ断片をＤＥペーパー分離法
で分離し、ＤＮＡを得た。

上述した操作をＨＬ　Ａ　−Ａｌｌ／　Ａ２４．　　Ｂ
　ｗ５２／Ｂｗ５２．Ｃｗ７／Ｃｗ−、ＤＲ２／ＤＲｗ
８゜１、ＤＱＩ／ＤＱ−のハブロタイブをもったヒト正
常人末梢血リンパ球（ＰＢＬ）に対し行なった結果ＰＢ
Ｌ細胞からもＤＮＡを得た。

ゲノムＤＮＡライブラリーの作成 分離したヒトＤＮＡ０．４μｇに対してλフアージＤＮ
ＡのＥｃｏＲＩ消化物（λ０ＮＧＣ）２μｇを加え、Ｔ
、リガーゼを加えて、４°Ｃ１８時間インキュベートし
て結合させた。このサンプルをパンケージング　キット
　（Ｇｆｇａｐａｃｋｇｏｌｄ：Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ
社製）を使ってｉｎ　ｖｉＬｒｏでパッケージングした
。パッケージングがうまくいっているか確認するためパ
ッケージングしたファージサンプルの力価を以下の手順
で調べた。

（サンプルの力価の測定） Ｌ　Ｅ　３９２Ｅ、　ｃｏｌｉを少量とり、４０−のＬ
Ｂ培地（ＮａＣ１５ｇ、イーストイクストラクト５ｇ。

トリプトン１０ｇを１４！ＬＯにとかしたもの。）を入
れである５０−の遠心管に入れ３７°Ｃ−晩振盪培養し
た。培養したバクテリア培地１ｄを遠心管に加え、さら
に３−のＬＢ培地と８０ｄのＩＭＭｇＳＯａを加えた。

こうして得たバクテリア培地０．２ｄとパッケージング
サンプルの希釈系列２μｌ（原液、　１０倍希釈液、　
　ｉｏｏ倍希釈液、　１０００倍希釈液）を６ｄの試験
管に加え３７°Ｃ１５分間インキュベートした。４５°
Ｃ保温の２．５艷の０．７％軟寒天を各試験管に加えて
′混ぜた後、直径９０鴫の１．５％寒天皿の上に重層す
る。３７°Ｃ８時間培養しプラーク数をカウントした。

ＨＬＡクラス■ゲノムＤＮＡのクローニング９０ｍの皿
に約４０００個のプラークができるようにライブラリー
の原液を３Ｍ培地（ＮａＣ１１５，８ｇ、Ｍｇ５０．７
Ｈア０２ｇ、５０献　ＩＭＴｒｉｓＣｌ　　ｐ　Ｈ７，
５，５ｔｄ　　２％ｇｅｌａｔｉｎを１１Ｈ，Ｏにとか
したもの、）で希釈した。−次スクリーニングは上記の
サンプルの力価の測定と同様の手順で操作し９０Ｍ皿に
ファージプラークを形成した。ニトロセルロースｐ　（
ＧｅｌｍａｎＳｃｉｅｎｃｅ社製）を軟寒天層上に載せ
５分間放置した０次に、ニトロセルロース膜をｄｅｎａ
　ｔｕｒｅ溶液（０，１ＭＮａＯＨ，１，５ＭＮａｃｌ
）を含むクロマトグラフィー用紙に、ファージがついて
いる面を上にして載せ５分間放置した。次に、２倍のＳ
ＳＣ溶液を含むクロマトグラフィー用紙にニトロセルロ
ース膜を載せ５分間放置した後、ニトロセルロース膜を
室温で乾燥させた。

最後に、８０°Ｃの真空乾燥機の中で１２０分間放置し
プロッティングを完了した。

ハイブリダイゼーションで使用するＨＬＡＢ　７　ｃ　
ＤＮＡプローブを以下のように調製した。

ＨＬ　Ａ　−Ｂ　７　ｃ　Ｄ　ＮＡ１３４０ｂｐ　Ｃ０
ｒｒ　Ｈ，Ｔ、ｅｔａｌ　；　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ、１８．５７１１．１９７９　）がＰｓｔｌｓｉｔｅ
でＰＢＲ３２８に入っているプラスミドｐＩ）ｐｏｏｌ
　　（ＤｒＪｅｉｓｍａｎ、Ｖａｌｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓ
ｉｔｙより入手）をＰｓｔｌで切断し、アガロースゲル
で電気泳動し、ＤＥペーパー法で１３４０ｂ、のＨＬＡ
−Ｂ７ｃＤＮＡを分離した。分離したＨＬＡ−Ｂ７ｃＤ
ＮＡ２００ｎｇをニックトランスレーション法により”
Ｐ−ｄＣＴＰで標識した。標識したｃＤＮＡと未結合の
”Ｐ−ｄＣＴＰを分離するためセファデックスＧ５０カ
ラムに流し放射能活性のある第１ピークを集めた。

以下の手順でＨＬＡクラス！遺伝子をクローニングした
。

ファージライブラリーをプロッティングしたニトロセル
ロース膜をハイブリダイゼーションバックに入れた。プ
レハイブリダイゼーション溶液（５０倍のＤｅｎｈａｒ
ｄｔ’ｓ　５ｏｌｕｔｉｏｎ　０．８ｍｆ、１０ｄＦｏ
ｒｍａｓ＋ｉｄｅ、　　０．２ｄ　　１０％　Ｓ　　Ｄ
　　Ｓ　、０．５−の　４　■／ｄサケ精子ＤＮＡ、　
６．６ａｔｅ　２０倍ＳＳＣ，１，９Ｗ１）（＊Ｏ）を
加えバックを密封し４２°Ｃ２時間インキュベートした
。２Ｘ１０’フｃｐｓのＨＬＡ−Ｂ７ｃＤＮＡプローブ
と４　ｍｇ／ｄサケ精子ＤＮＡ０１５ｄをガラス試験管
に入れ１００°Ｃの水浴で１０分間加熱した後、氷の中
で急冷した。このガラス試験管に０．８ｄの５０倍Ｄｅ
ｎｈａｒｄｔ’　５ｏｌｕｔｉｏｎ。

１０ｄ　ｆｏｒａ＋ａｍｉｄｅ、０．２１Ｒ１１０％Ｓ
　Ｄ　Ｓ、６．６ｄ　２０倍ＳＳＣ溶液、２−の５０％
Ｄｅｘｔｒａｎ　５ｕｌｆａｔｅの混合液を加えてハイ
ブリダイゼーション溶液とした。ハイブリダイゼーショ
ンバックからプレハイブリダイゼーション溶液を捨て、
ハイブリダイゼーション溶液を加えてバックを密封し４
２°Ｃ１８時間インキエベートした。バンクからニトロ
セルロース膜を取り出し、２倍のＳＳＣ，０，１％ＳＤ
Ｓからなる洗浄溶液で３７°Ｃ３０分間×２回、さらに
５２°Ｃ３０分間×２回洗った後ニトロセルロース膜を
乾燥させた。乾燥したニトロセルロース膜を−ｈａｔｓ
ａｎ　　３　Ｍ　Ｍ濾紙上に固定しＸ線フィルムのカセ
ットに入れＸ線フィルムに３−１８時間露光した後、フ
ィルムを感光させた。黒いドツトとして現れたポジティ
ブプラークをｌｉｉ！認した後９０ｍ皿からポジティブ
プラークをピペットで取り１ｄＳＭ緩衝液の入っている
１、５ｄ遠心管に入れ３７°Ｃ１時間インキエベートし
た。次に、クロロホルムを数滴加えて１５０００ｒｐ＋
ａで数秒遠心した後、上清を２次スクリーニングのファ
ージとした。

９０ｍｍ皿に１００−５００個のプラークができるよう
に上清を３Ｍ培地で希釈した後、１次スクリーニングと
同様の方法でニトロセルロース膜にプロッティングし、
ＨＬＡ−Ｂ７ｃＤＮＡプローブを使用しハイブリダイゼ
ーションを行いポジティブプラークを取った。

２次スクリーニングで得たポジティブプラークをピペッ
トで取り１ｄＳＭ培地の入っている１、５−遠心管に入
れ室温１時間インキエベートした後クロロホルムを数滴
加えて１５００ｒｐ＋ＩＩｖｌ１秒間遠心する。遠心後
の上清を３次スクリーニングのファージとし、２次スク
リーニングと同じ方法でスクリーニングを行い、すべて
のプラークがポジティブプラークであることをハイブリ
ダイゼーションによって確認し、クローニングを完了し
た。

ＤＮＡの精製 ３次スクリーニングで得たλファージの力価を上述した
サンプルの力価の測定と同様の手順で行った。３次スク
リーニングで得たファージの力価を上げるため９０■皿
にファージプラークをまき、翌日４ｄＳＭ培地を皿に加
えて１時間インキエベートした０次に上清を１．５ｄ遠
心管に入れ５０μｌのクロロフォルムを加えて１時間混
合した後１５０００ｒｐｍで１分間遠心し、その上清の
ファージの力価をスクリーニングと同じ方法でハイブリ
ダイゼーションを行い測定した。力価は１．０　Ｘ　１
０’であった。

Ｌ　Ｅ　３９２　Ｅ　、ｃｏｌｉ　を０．４％マルトー
スの入ったＮＺＹＤＥ培地３０ｍに加え一晩培養した。

翌日、培養液を４００Ｏｒｐｍで５分間遠心した後、上
清をすて３Ｍ培地５ｄを加えて細菌を浮遊させた。この
際分光光度計で６００ｎｎのＯＤ値を測定シナカラ、Ｃ
ＯＤ値１．０＝　８　ＸＩＯ”個）４　Ｘｌ０Ｉ０個の
Ｅ、ｃｏｌｉを５ｄＳＭ培地に浮遊するようにした。上
で調製したｌＸｌ０”力価のファージと４×１０１０個
のＥ、ｃｏｌｉ　を浮遊させた５ｄＳＭ培地を試験管に
入れ３７’Ｃ２分間インキュベートした。

インキュベートした試験管中の溶液をｌ　ｆｆ１ＮＺＹ
ＤＥ培地に加え３７°Ｃ８時間振盪培養した。さらに、
１０ｓｆクロロフオルムを加え２０分間振盪した後、こ
の培養液をｌｆｆ１の遠心管に入れ３５００ｒｐｍで３
０分間冷却しながら遠心した。次に、上清を新しい遠心
管に入れＤＮａ　ｓ　ｅ、ＲＮａ　ｓｅをそれぞれｌｔ
ｔｇ／ｄに最終濃度がなるように加えて室温３０分イン
キュベートした。この遠心管に３６ｇＮａＣ１と６４　
ｇ　Ｐ　Ｅ　Ｇ６０００　（シグマ社製）を加えて溶解
し４°Ｃ−晩装置した。この遠心管を３５０Ｏｒｐｍで
３０分間遠心し上清を捨てた。６ｄの３Ｍ培地を加えた
後、この遠心管中の溶液を別の５０ｄの遠心管に移し、
６１ｎＩｌクロロフオルムを加えよく混合した。５〇−
遠心管を４００Ｏｒｐｍで遠心した後、上滑を別の新し
い遠心管に移した。

３Ｍ培地を加えて全体を６ｄにし３ｇＣｓＣ１を加えて
よく溶解させた。遠心管を２２０００ｒｐｍ　４時間遠
心してＣｓＣ１比重遠心分離法によりファージ層を分離
した。分離したファージ層をとり、１．５　ｇ／ｄＣｓ
　Ｃ１を含む３Ｍ培地に加えて再び４５０００ｒｐｍ１
８時間遠心しファージ層を分離した。このファージ層の
溶液を透析膜に入れ０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ、　０．０５Ｍ
　ＮａＣ１，０，００１Ｍ　ＭｇＣＩｚ　の溶液で１時
間透析した。透析後のファージ溶液にｌ／１０の量の０
．５Ｍ　ＥＤＴ八、１／２０の量の１０％ＳＤＳ、１／
２０の量の２　ｍｇ　／　ｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　
Ｋを加え室温３０分間インキュベートした。次に、Ｐｈ
ｅｎｏｌ法によってＤＮＡを分離し、Ｔ　Ｅ　Ｉｊｔ街
液（１０Ｉｌ＋Ｍ　ＴｒｉｓＣｌ、Ｉｎ＋Ｍ　ＥＤＴＡ
　ｐ８８．０　）で−晩透析してＤ　Ｎ　Ａを精製した
。

によるＨＬＡクラスＩ−の クローニングしたＨＬＡクラス；ゲノムＤＮＡをｔｋ−
マウスＬ細胞に遺伝子導入しその細胞表面上での発現を
抗！（ＬＡクラスＩ抗体で調べた。

マウスＬ細胞へのＨＬＡクラスＩ遺伝子の導入遺伝子移
入の前日、５Ｘ１０”個のマウスＬ細胞を培養フラスコ
に入れ１０％ＦＣ３を含むＭＥＭ培地中で培養した。

Ｃａ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ沈殿法により沈殿物を以下の
手順で作成した。

（ａ）２０　ｔｔ　ｇ　／　１０．Ｏｕ　ｊ２のＨＬＡ
クラスｌゲノムＤＮＡと、１μｓ／ｌｏｏμｌのチミジ
ンキナーゼ遺伝子と、１００μｊ！　　ＣａＣ１ｔ−２
Ｈ，Ｏ溶液ＰＨ７，０と、７００μｌのＨ，Ｏを濃合し
総量をｌｉｄとした。

（ｂ）Ｈｅ　ｐ　ｅ　ｓ／Ｎａ　Ｃ１溶液と　１００倍
のＮａＨＰＯ，溶液を４９：１で混合し、その溶液を６
−の試験管に入れた。

（ｃ）　（ａ）で作成した溶液を１滴ずつ（ｂ）の試験
管に入れ混合した後２０分間インキュベートしＣａ−Ｄ
ＮＡ沈殿物を作成した。

前日培養したマウスＬ細胞をＣａ非含有ＰＢＳで１回洗
浄した後、Ｃａ−ＤＮＡ沈殿物を加えてフラスコ中で１
５分間インキュベートした。

さらにｌＯ％ウシ胎児血清（Ｆｅ２）を含むＭＥＭ培地
を１〇−加えて３７°Ｃ６時間ＣＯ，インキュベーター
でインキュベートした。次に、ＦＣ３非含有培地を用い
て作成した３４％ＰＥＧ−５％ＤＭＳＯ溶液でフラスコ
中の培地を除いた後、２１ＲＩｌの３４％ＰＥＧ−５％
ＤＭＳＯ溶液を加えて３分間インキュベートした。ＦＣ
３非含有培地で３回洗浄後、ｌＯ％ＦＣＳを含む培地で
２回洗浄した０次に、１０．−の１０％ＦＣ３を含む培
地を加え一晩培養した。翌日、ＨＡＴ培地に変え培養し
た。２〜３日毎にＨＡＴ培地を交替した。

約１４〜２１日でｔｋ遺伝子導入し細胞が増殖しコロニ
ーを形成するのを確認した。各コロニーをクローニング
リングを使って拾った後、各クローンを培養した。

形質転換細胞上に発現したＨ　Ｌ　ＡクラスＩ抗原の確
認 クローン化した各コロニーｌＸｌ０’個をＰＢＳで２回
洗い１００μｌのＰＢＳに浮遊させた後、５０１Ｉｆｆ
ｉずつ複数本の試験管に入れた。各試験管ニ５０μｌの
抗ＨＬＡクラス１モノクローナル抗体Ｗ　６　／３２　
（Ｐａｒｈａｍ　Ｐ　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ。

（１９７９）　、　１２３．　ｐｐ３４２−３４９　）
と、５０μ２の抗ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃモノクローナル抗
体２６４．８８　と、５０μｒの抗ＨＬＡ−ＤＲモノク
ローナル抗体Ｌ２４３　（Ｌａｍｐｓｏｎ　ＬＡｅｔ　
ａｌ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、（１９８０）、１２５゜ｐ
ｐ２９３−２９９）を別々に加え４°Ｃ３０分インキュ
ベートした。各試験管に０．５艷のＰＢＳを加えて１５
００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を取り除いた。

これを３回操り返した。５０倍希釈のＦＩＴＣ抗マウス
Ｉｇ抗体（Ｓｉｌｅｎｕｓ社製）を各試験管に加えて４
°Ｃ３０分インキュベートした。各試験管に０．５ｄ　
Ｐ　Ｂ　Ｓを加え、１５００ｒｐｍで５分間遠心して、
上清を取り除（作業を３回繰り返した。最後に１ｊＲ１
ＰＢｓを各試験管に加えフローサイトメトリーにより解
析した。結果を第１図に示す。

第１図（Ａ）はＬＫＴ−２１１１胞から単離した遺伝子
クローンｃｂ−ｔを導入したマウスＬ細胞を用いた場合
のフローサイトメトリー、第１図（Ｂ）はＰＢＬ細胞か
ら単離した遺伝子クローンＣｂ−２を導入したマウスＬ
１１１胞を用いた場合のフローサイトメトリーである。

図中、横軸は螢光強度を、縦軸は細胞数を表わす。図中
、実線ａは２６４．８８抗体を用いた場合、−点鎖線す
はＷ　６　／３２抗体を用いた場合、鎖線ＣはＬ２４３
抗体を用いた場合のフローサイトメトリーである。

さらに、遺伝子クローンＣｂ−１，Ｃｂ−２をハイグロ
マイシン耐性遺伝子と一緒に、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ抗原を発
現してないＢリンパ芽球細胞Ｈａ＋ｙ２　ＣＩ　Ｒ（Ｊ
、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１６６、ｐｐ２８３−２８８
゜（１９８７））に導入し、ハイグロマインシンＢ培地
を用いて形質転換細胞を得た。この形質転換細胞をさら
に培養し、２６４．８８モノクロ一ナル抗体を加えて３
０分間反応させた後ＰＢＳで３回洗浄した０次に、５０
倍希釈のＦＩＴＣ抗マウスＩｇ抗体を添加し、４’Ｃ３
０分反応させた。ＰＢＳで３回洗浄の後、細胞の螢光強
度をフローサイトメトリーで調べた。結果を第２図に示
す。図中、横軸は螢光強度を、縦軸は細胞数を表わす。

実線ｄは遺伝子クローンＣｂ−１を導入して形質転換し
たＨｎ＋ｙ２ＣＩＲ細胞、−点鎖線ｅは遺伝子クローン
Ｃｂ−２を導入して形質転換したＨｒａｙ２ＣＩＲ細胞
、鎖ｆ％Ｉｆは形質転換していない元のＨｍｙ２ＣＩＲ
細胞を用いた場合のフローサイトメトリーをそれぞれ表
わす。

ＨＬＡ−Ｃ遺伝子のＥｃｏＲ■フラグメントは７．６ｋ
ｂと７．９ｋｂの２つのグループに分けられることがわ
かっている。ＬＫＴ−２細胞は同種のＣブランク遺伝子
を有する細胞であり、この細胞から単離された７、６ｋ
ｂの遺伝子クローンＣｂ−ｔはＣブランク遺伝子である
ことが強く示唆された。また、Ｃｗ　７　／　Ｃ−を有
するＰＢＬ細胞からは７．６ｋｂの遺伝子クローンＬ−
１と、７．９ｋｂの遺伝子クローンＣｂ−２が単離され
た。

Ｃｗ７は？、６ｋｂであることからＬ−１はＣｗ７遺伝
子であり、遺伝子クローンＣｂ−２はＣブランク遺伝子
であることが強く示唆された。

クローンＣｂ−１，Ｃｂ−２のゲノムＤＮＡの全塩基配
列をジデオキシ法により決定した。

結果を第３図に示す。図中、Ｊ（ＬＡ−Ｃｂ−１゜Ｃｂ
−２遺伝子の他に、参考までにＣｗｔ、０ｗ２，１，０
ｗ２，２の塩基配列を並記した。

ＨＬＡ−Ｃｗ　１．０ｗ２．１はＩａｍｕｎｏｇｅｎｅ
ｔｉｃｓ２５、ｐ３１３．１９７５．　ＨＬ　Ａ　−Ｃ
ｗ　２　、２はＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、（ＬＩＳＡ）、　８５．　ｐ４０
０５，１９８８として公知である０図中、Ａはアデニン
、Ｃはシトシン。

Ｇはグアニン、Ｔはチミンを示す。

第４図は第３図に示したＨＬＡ−Ｃｂ−１゜Ｃｂ−２遺
伝子の各エクソン部がコードするペプチドのアミノ酸シ
ークエンスを示す、アミノ酸は１文字略記で表示してあ
り、Ａはアラニン。

Ｒはアルギニン、Ｎはアスパラギン、Ｄはアスパラギン
酸、Ｃはシスティン、Ｑはグルタミン。

Ｅはグルタミン酸、Ｇはグリシン、Ｈはヒスチジン、■
はイソロイシン、Ｌはロイシン、にはリジン、Ｍはメチ
オニン、Ｆはフェニルアラニン、Ｐはプロリン、Ｓはセ
リン、Ｔはトレオニン、Ｗはトリプトファン、Ｙはチロ
シン、■はバリンを示す。

図中、参考までにＨＬＡ−Ｃｗｌ、０ｗ２゜１、Ｃｗ３
のアミノ酸配列を並記した。

ＨＬＡ−Ｃｗ　１．Ｃｗ２．１はＩｍｍｕｎｏｇｅｎｅ
ｔｉｃｓ２５、ｐ３１３．１９７５、ＨＬＡ−Ｃｗ２．
２はＰｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８５．１）４０
０５．１９８８、ＨＬＡ−Ｃｗ３はＥ　Ｍ　Ｂ　ＯＪ、
３．ｐ８７９．１９８４として公知である。第３図、第
４図中、ダッシュは一番上の配列と同じ塩基またはアミ
ノ酸であることを示す。

ＤＮＡプローブへの ２種のＣブランク遺伝子ＨＬＡ−Ｃｂ−１゜Ｃｂ−２の
塩基配列が上述した実施例により明らかになったことか
ら、Ｃｂ−１，Ｃｂ−２遺伝子をＤＮＡタイピングによ
って同定することが強く期待される。

Ｃｂ−１の一次構造はＣｗｌときわめて良く似ていて、
５個のアミノ酸しか違いがない。しかも、この５個のア
ミノ酸はすべてβストランドに位置している。抗体の認
識する部位はα、。

α２　ドメインのα−ヘリックスまたは外側のループ構
造の部分であり、したがって、抗体はＣｂ−１抗原を認
識することができないと思われる。したがって、Ｃｂ−
１遺伝子のＤＮＡプローブによる検出は有効な手段であ
る。［）ＮＡプローブに用いるＤＮＡとしては、Ｉ（Ｌ
Ａ−Ｃｂ−ｔでは、Ｃｗｌと違っている５つのアミノ酸
の置換位置の近傍または、そのすべてを含む領域をコー
ドする塩基配列が候補として挙げられ、ＨＬＡ−Ｃｂ−
２では７３番目のＡｌａをコードする塩基配列の近傍が
候補として挙げられる。

塩基配列が決定されたＤＮＡは、ＤＮＡ合成機又はホス
ホトリエステル合成法により合成する。合成したＤＮＡ
にアルカリフォスターゼ（３，１，３，１）　、　　ポ
リヌクレオチドキナーゼ（２，７゜１．７８）とα−３
χＰｄＡＴＰを加えて一本鎖ＤＮＡの５′端にｓｉｐを
標識することにより、ＤＮＡプローブが得られる。

〔発明の効果〕

本発明はＨＬＡ−Ｃアロ抗原の研究、検査。

診断に有用である。

【図面の簡単な説明】

第１図（Ａ）は、遺伝子クローンＣｂ−１形Ｗ　転ｔｕ
ｔマウスＬｌ［ｌ胞へのモノクローナル抗体２６４．８
Ｂ、　Ｗ６／３２．　Ｌ２４３の反応性を示すフローサ
イトメトリー、 第１図（Ｂ）は、遺伝子クローンＣｂ−２形質転換マウ
スＬ細胞へのモノクローナル抗体２６４．８Ｂ、　　Ｗ
　６　／３２．　Ｌ２４３の反応性を示すフローサイト
メトリー、 第２図は遺伝子クローンｃｂ−ｔ、ｃｂ−２を導入した
形質転換Ｈｍｙ２ＣＩＲ細胞へのモノクローナル抗体２
６４．Ｂ８の反応性を示すフローサイ　　ト　メ　　ト
　リ　− 第３図（１）、　　（ＩＩ）、　　（ＩＩＩ）はＨＬＡ
二Ｃｂ−１，Ｃｂ−２遺伝子のエクソン部の塩基配列を
示す図、 第４図（１）、（ＩＩ）はＨＬＡ−Ｃｂ−１゜Ｃｂ−２
遺伝子がコードするペプチドのアミノ酸配列を示す図で
ある。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記の塩基配列で表わされるエクソンを有するＨＬ
   Ａ−Ｃ遺伝子 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 上記式中、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン
   、Ｔはチミンを示す。 ２、下記の塩基配列で表わされるエクソンを有するＨＬ
   Ａ−Ｃ遺伝子 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 上記式中、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｃはグアニン
   、Ｔはチミンを示す。 ３、下記のアミノ酸配列をコードするＨＬＡ−Ｃ遺伝子 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 上記式中、Ａはアラニン、Ｒはアルギニン、Ｎはアスパ
   ラギン、Ｄはアスパラギン酸、Ｃはシステイン、Ｑはグ
   ルタミン、Ｅはグルタミン酸、Ｇはグリシン、Ｈはヒス
   チシン、Ｉはイソロイシン、Ｌはロイシン、Ｋはリジン
   、Ｍはメチオニン、Ｆはフェニルアラニン、Ｐはプロリ
   ン、Ｓはセリン、Ｔはトレオニン、Ｗはトリプトファン
   、Ｙはチロシン、Ｖはバリンを示す。 ４、下記のアミノ酸配列をコードするＨＬＡ−Ｃ遺伝子 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 上記式中、Ａはアラニン、Ｒはアルギニン、Ｎはアスパ
   ラギン、Ｄはアスパラギン酸、Ｃはシステイン、Ｑはグ
   ルタミン、Ｅはグルタミン酸、Ｇはグリシン、Ｈはヒス
   チシン、Ｉはイソロイシン、Ｌはロイシン、Ｋはリジン
   、Ｍはメチオニン、Ｆはフェニルアラニン、Ｐはプロリ
   ン、Ｓはセリン、Ｔはトレオニン、Ｗはトリプトファン
   、Ｙはチロシン、Ｖはバリンを示す。 ５、請求項１記載の塩基配列の一部に一致する塩基配列
   を持つＤＮＡと、ＤＮＡの一部に結合したマーカー物質
   とからなるＤＮＡプローブ。 ６、請求項２記載の塩基配列の一部に一致する塩基配列
   を持つＤＮＡと、ＤＮＡの一部に結合したマーカー物質
   とからなるＤＮＡプローブ。 ７、請求項１記載のＨＬＡ−Ｃ遺伝子を真核細胞に導入
   して得られＨＬＡ−Ｃｂ−１抗原を発現することを特徴
   とする形質転換細胞。 ８、請求項２記載のＨＬＡ−Ｃ遺伝子を真核細胞に導入
   して得られＨＬＡ−Ｃｂ−２抗原を発現することを特徴
   とする形質転換細胞。