JPH04507094A - ネコｔ細胞リンパトロピック レンチウィルスのポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ネコＴ細胞リンパトロピック　レンチウィルスのポリペプチド発明の背景 本出願は、オコーナー他米国特許出願３４８，７８４　（１９８９年出願１名称 「ネコＴ細胞リンパトロピック　レンチウィルス」）の一部継続出願であり、こ の米国特許出願３４８，７８４は、オコーナー他の米国特許出願２９３，９０６ （１９８９年１月５日出願１発明の名称「ネコ−ニーリンパトロピック　レンチ イルスに対するモノクローナル抗体」）の一部継続出願である。また、この米国 特許出願２９３，９０６は、オコーナー他の米国特許出願２７９，９８９　（１ ９８８年１２８５日出願１名称「ネコＴ細胞リンパトロピック　１ノンチウイル スに対するモノクロ−±ル抗体」）の一部継続出願である。そして、これらの出 願の図面を含む全てのものがここに統合されている。

この発明は、ネコＴ細胞リンパトロピック（リンパを変化させる傾向のある）レ ンチウィルス（以下ＦＩＶと言う）からのポリペプチドの精製に関する。

ＦＩＶはもともとエイズに似た症候群を示すネコから分離されたベトロウィルス である（ペダーソン他ｒ２３５Ｓｃｉｅｎｃｅ　７９０．１９８７）ｏ：のウィ ルスは、人のエイズの原因物である人免疫不全ウィルス（ＨＩ　Ｖ）と同じグル ープに属する。ベダーソン他は、免疫不全試験（アッセイ）によるＦＩＶに対す る抗体の検出について記載している。また、０．１Ｍ　ＮａＣ１及び１ｒｎＭ　 ＥＤＴＡを含むｐＨ７，４のトリス（Ｔｒｔｓ）ベース中のサッカロース勾配（ Ｓｕｃｒｏｓｅ　ｇｒａｄｉｅｎｔｓ）上の遠心分離によって精製されたウィル スを用いるウェスタンブロッティングによってもＦＩＶに対する抗体を検出でき たとしている。ここでは、いくつかの蛋白質のバンド（高分子の層）が検出され たが、抗原性比較は行われていない。これらのバンドの位置は、主要なコア蛋白 （ｍａｊｏｒ　ｃｏｒｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ）に対応しているようであると言って いる。ここで、主要なコアプロティンとは、ｐ２４　ｇａｇ　前駆蛋白、ｐ５５ ゜及びエンドヌクレアーゼ蛋白、ｐ３２．　これらはＨＩＶについてのものであ る。

ヘダーソン他は、１．９８７年８月２６日付でなされた米国特許出願「ネコＴリ ンパトロピック　レンチウィルス」　（これは、本出願の先行ウィルスとはなら ない）において上述の結果について記載している。また、ＦＩＶに感染された細 胞の溶解産物のウェスタンブロッティングによって得られたメジャープロティン バンドは、はぼ２２〜２６ｋＤ、通常約２４ｋＤ　；　５０〜６０ｋＤ、通常約 ５５ｋＤ：及び２８〜３６ｋＤＳ４常約３２ｋＤてあったといっている。

発明の概要 まず、本発明は、ＦＩＶの抗原性ポリペプチドのエピトープ（抗原決定器、複雑 な抗原分子の構造を形成している各々の基本構成因子）をもつ精製されたポリペ プチドを特徴とする。このポリペプチドは、グリコシルキ転移していてもしてい なくても良い。抗原性ポリペプチドは、ネコにおいて抗体反応を起すことが可能 なポリペプチドを意味する。このポリペプチドは、少なくとも５アミノ酸のポリ ペプチドフラグメント（断片）でも良く、またＦＩＶ粒子（パーティクル）中に 自然に発生する（ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）ポリペプチドであっても良い。フラグメ ントは、自然発生のポリペプチドから得ることもできる。例えば、自然発生ポリ ペプチドを酵素消化したりしても良い。また、分離によって精製したり、所望の ポリペプチドに遺伝子エンコードする合成や、所望の発現システム中におけるポ リペプチドの発現や、によっても良い。この発現システムは、例えば、細菌や酵 母（イースト）や哺乳動物発現システムである。

ここで、エピトープは、抗原性ポリペプチドの単一の抗原性部位を意味する。

このようなエピトープは、特に、ＦＩＶの抗原性ポリペプチドに対するモノクロ ナール（ｍｏｎｏｃ　１ｏｎａ　１）抗体によって認識することができる。

また、精製とは、例えば自然発生ＦＩＶポリペプチドと混在する他の細胞構成物 からこのポリペプチドを分離することを意味する。

好ましくは、ポリペプチドは、これに対するモノクローナル抗体を調製するため に使用することができる程度に充分純粋であることが望まれる。さらに、ポリペ プチドのアミノ酸シーケンスが標準的な手法で決定できる程度に充分純粋である ことが望ましい。一般的に、精製されたポリペプチドは、生物学的に活性である 。すなわちこれにより、モノクローナル抗体の調製に好適であり、ネコのリンパ 液Ｃｓｅ口」ｍ）中の自然発生抗体の検出に好適である。

好適な実施例によれば、精製されたポリペプチドは、ＦＩＶ　ｇａｇ−または見 ｎｖポリペプチドから得られた少なくとも２０アミノ酸のポリペプチドフラグメ ントに対し、少なくとも７５％アミノ酸について相同性を有する。さらに好まし くは、精製されたポリペプチドは、全てのｇａｇまたはｅｎｖポリペプチドに対 し少なくとも７５％の相同性を有するアミノ酸シーケンスを含む。さらに、精製 ２６、ｇｐ４０．ｇｐｌｏｏ、ｇｐ１３０が含まれる。

次に、本発明は、サンプル中のＦＩＶに対する抗体の検出方法であって、上述の 精製されたポリペプチドを提供する工程を含み、このポリペプチドを次のような ことが起るような条件で接触させる。すなわち、サンプル中の抗体と精製された ポリペプチドの間で抗体／ポリペプチド複合体を形成し、そしてこのような複合 体の形成を検出する。この抗体／ポリペプチド複合体の存在は、サンプル中にＦ ＩＶの抗体が存在することを示す。

第３として、この発明は、ＦＩＶパーティクル中に自然発生する５０ヌクレオチ ドシーケンスとの間で少なくとも９０％の相同性を持つ５０ヌクレオチドンーケ ンスを有する調製された核酸を特徴とする。ここで、精製は、ポリペプチドや他 の核酸など自然発生する全ての物質から目的とする核酸が実質的に分離されるこ とを意味する。好適には、核酸は上述のような物質から完全に分離され、純粋な 核酸の溶液となるかあるいは自然発生ではない次のような細胞中に保持される。

すなわち、バクテリヤ細胞や他のウィルス性のパーティクルや非ネコ真核細胞な どに保持される。９０％相同性とは、５０ヌクレオチドの内少なくとも４５が目 的とするヌクレオチドシーケンスに一致することを意味する。

好適な実施例によれば、目的とする核酸は、抗原性のポリペプチドのエピトープ 、すなわちＦＩＶのｇａｇまたはｅ・ｎｖポリペプチドのエピトープを含むポリ ペプチドをエンコードする。さらに好ましくは、核酸は、発現ベクターによって 運ばれて、細菌類や真菌類や他の真核細胞、例えば哺乳類の細胞などで発現する ことができる。

本発明に関連して、精製されたポリペプチドは、１０またはそれ以上の次のよう なン〜ケンスから隣接する（ｃｏｎｔ　ｉｇｕｏｕｓ）アミノ酸を含む。このシ ーケンスは、アミノ酸を表す標準的な表記により、次のように表される。

（１）　ｌ／−Ｑ−！１ｉ−Ｒ−Ｇ−３−Ｇ−Ｆ−Ｖ−Ｃ−Ｆ−Ｎ−Ｃ−に−に −Ｐ−Ｇ−Ｈ−Ｌ−Ａ−Ｒ−Ｑ−３−Ｈｏ　ｒ（２）　Ｆ−１−Ｑ−Ｔ−Ｖ−Ｎ −Ｇ−Ｖ−Ｐ−Ｑ−Ｙ−Ｖ−Ａ−Ｌ−Ｄ−Ｐ−に−Ｍ−Ｖ−８ｏ　ｒ（３）　５ −Ｖ−Ｑ−８−Ｒ−Ｇ−Ｑ−Ｇ−Ｐ−Ｖ−Ａ−Ｐ−Ｎ　。

出願人は、ＦＩＶ抗体を検出するのに適したポリペプチドを提供し、これによっ てＦＩＶへの感染を正確に検出することを可能とした。さらに、ネコのＦＩＶに よる病気を防ぐためのワクチンの製造に有用なポリペプチドを提供した。

この発明の他の特徴や有用性は、実施例の記載及びクレームより明らかとなる。

好適な実施例の説明 最初に図面について簡単に説明する。

図面 図１は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）及びＣｏｍｍａｓｓｉｅ 　Ｂｌｕｅ　Ｒ２５０（レーンＡ）の染色によって確認された（ｉｄｅｎｔｉｆ ｉｅｄ）ＦＩＶの主要なウィルスアソシエイティッド蛋白の写真であり、分子量 のスタンダードは、レーンＢに示しである。

図２は、ＦＩＶ抗体についてのＥＬ　Ｉ　ＳＡ試験によって陽性と確認されたネ コからのリンパ液（ｓｅｒｕｍ）中で発見されたＦＩＶ抗体のウェスタンイムノ プロット（ｗｅｓｔｅｒｎ　ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ）分析の写真である。

図３は、ＨＰＬＣ精製中におけるＦＩＶポリペプチドの溶出をグラフ的に表現し たものである。

図４は、電気泳動及び銀による染色後のＳＤＳポリアクリルアミドゲルの写真で あり、種々のＦＩＶポリペプチドの純度を示している。

図５は、クローンされたＦｉＶ核酸の色々な部位における核酸シーケンスやこれ に対応するアミノ酸シーケンスを示す。

抗原性ＦＩＶポリペプチド この発明において有用なＦＩＶポリペプチド抗原の一般的な説明は上述した。

この発明において有用なポリペプチドは、下記のようにして分離されたウィルス から精製することができる。また、精製されたポリペプチドは、酵素処理や他の 標準的な方法によって分離された。さらに、このポリペプチドは、標準的なイン ・ヴイトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）発現システムによって合成することができる。こ の発現システムにおいては、ＦＩＶポリペプチドのためのＤＮＡエンコードはク ローンされ、バクテリヤ、酵母、または哺乳類細胞発現システム中に発現される 。

このようなりＮＡは、下記のようにして分離及び発現させることができる。この ポリペプチドは、標準的な化学的方法によっても合成することができ、例えば種 々のＦＩＶポリペプチドのポリペプチドセグメントは下記のようにして合成する ことができる。この例において、ＦＩＶポリペプチドは、ＦＩＶ感染細胞から直 接得られ、ＦＩＶビールスパーティクル中に自然発生したポリペプチドの形をと った。本発明は、この例に限定されるものではなく、この発明のポリペプチドを 得るための当業者が認識できる種々の代替方法を含む。このポリペプチドの分子 量について、３０ｋＤポリペプチドは、ｐ３０を意味し、この重量のグリコプロ ティンは、ｇｐ３０である。

培養に用いられるマスターシードウィルスは、＄２４２７から分ＭされたＦＩＶ によって感染された連続ネコ細胞ラインの中から得られた。ここで、＃２４２７ ＦＩＶは、ＣＲＦＫ−Ｆ　ｊＶまたはＰｅｔａｌｕｍａ　５ｔｒａｆｎであり、 カリフォルニヤ　ディビスのカリフォルニヤ大学のＤｒ、　ネイルスフエダーソ ンによるものである。親細胞ラインは、ＦＩＶによって持続的に感染されたクラ ンデルネコ腎臓細胞である。この細胞ラインは、１９８８年７月１３日付でアメ リカンタイプカルチャーコレクシぢンに寄託されており、その寄託ナンバーはＣ ＲＬ９７６１である。出願人及びその指定代理人は、このパテントの権利期間が 終了する前に、この培養が絶えた場合には、これをもう一度提供することを確認 する。これは、培養についての最終的な要求の５年後または３０年後以上であっ ても責任を持つ。また、このような特許の発行の供託場所について知らせること についても責任を持ち、このような時に、寄託は最終的に公共に利用可能となる 。

これまでの期間は、寄託は、３７ＣＦＲ１〜１４条及び３５ＵＳＣ１１２条の指 定によりコミッショナーオブパテンツにおいて寄託が利用可能である。

他のウィルス培養は、フエルダーソン他ディファレンス、上述またはハーバ−他 、Ｌ２２ザヘトティリーナーリー　レコード８４．１９８８に記載されたように して得ることができる。ウィルス精製細胞培養の種ストックは、培養における少 なくとも１９のポスト感染パッセージが続くマスターシード細胞培養の凍結によ って得られる。さらに追加のウィルス精製培養の種ストックは、ＦＩＶマスター シードウィルスを持つ連続ネコ細胞培養の感染またはもともとのＦＩＶ感染マス ターシード細胞培養からのハイレベルＦＩＶ精製者のシングルセルマイクロウェ ルクローニングによって得られる。増殖（繁殖）のため、マスターシードウィル ス感染ネコ細胞培養は、細胞組織培養フラスコ中に接種された。細胞の融合した 単層の成長に続き、組織培養流体は２〜５日のインターバルで採取された。

シードウィルスの働きは、ＦＩＶに永久的に感染されたマスターシード細胞ライ ンによる増殖によって生起される。主材料は、組織培養フラスコに添加された。

この接種材料は、ルルベコモディファイドイーグルミディアム内にあり、これは ２ｍＭＬ−グルタミン及び４．５ｇ／ｌグルコース（ＤＭＥ）を含み、このＤＭ Ｅは１００ユニツト／ｍｌペニシリン及びストレプトマイシン及び２ｍＭ　グル タミンを含む。接種材料は、組織培養フラスコに添加され、培養され、そして処 理ずみの組織培養流体は、細胞が集落（ｃｏｎｆ　１ｕｅｎｃｅ）に育ったとき に採取された。細胞は、培養容器からトリプシン／ＥＤＴＡと共に分けられ、１ ：５〜１：２５（典型的には１：８）の倍率で稀釈された。好ましくは、フラス コは３６℃〜３８℃で最高７日（３〜７日間）恒温に維持され、その後流体及び 細胞が採取された。採取された流体（細胞物質も含む）は、ハイスピード遠心機 （Ｓｏ　ｒｖａ　Ｉ　ＲＣ−５ＢまたはＢｅｃｋｍａｎ　Ｊ２−２１）によって 上澄液及び細胞ベレット物に分離された。得られたセルベレットは捨てられ、上 澄培養液はワーキングウィルスを得るために用いられた。分離（浄化）された上 澄は、ＮａＣｌ中において０．５Ｍ、ポリエチレングリコール（ＰＥ０　８００ ０．　シグマ）中において４％〜１０％（通常７％）とされた。続いて、２℃〜 ７℃でオーバーナイトで培養された後、１３００ＸＧ　（重力加速度）、３０分 の遠心処理によりビールスはペレット化されそしてバッファ中に再度分散された 。ここでバッファは、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ７，６３００ｍＭ　ＮａＣ１， １ｍＭＥＤＴＡで２℃〜７℃である。オード−ナイト培養の後、ビールスは１３ ００ｘＧ１１５分で遠心分離され、ペレットは捨てられそして上澄は、１０ｍＭ Ｔｒｔｓ　３００ｍＭ　ＮａＣｌ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ　ａｔ　ｐＨ７，６中にお ける５０％／８０％不連続グリセロールステップ傾斜状の遠心処理された。この 遠心処理は、１０００００ｘＧ、４℃で３時間行われた。そして、５０％〜８０ ％インターフェースのＦＩＶウィルス性バンドが採取された。このバンドは１０ ｍＭＴｒｉｓ、０．３Ｍ　ＮａＣｌ及び１ｍＭ　ＥＤＴＡ中に分散混合され、バ ッファ中にに３で稀釈され、１０００００ｘＧ、１時間の遠心処理で再度ペレッ ト化された。こうして得られたペレットは、精製されたウィルスであり、上記バ ッファ中にもう一度分散混合されて、−７０℃で貯蔵される。こうして得られた ウィルスは、ＦＩＶ宿主細胞（ホストセル）蛋白から実質的に解放されており、 少なくとも５％のｐ２６（デンジトメトリックスキャン　オブ　コマジー　ブル ー　２５０染色　ＳＤＳ／ＰＡＧＥにより全淡白として計測されたメジャー　ヌ クレオカプシド　蛋白）からなっている。このような精製されたウィルスは、他 の方法によっても得ることができる。しかしながら、出願人は、調製されたウィ ルス中に存在する高分子汚染物質が、傾斜遠心処理を高塩分で使用することによ り除去されることを発見した。ここで、高塩分とは、生理学的な塩濃度より大き なものを言う。

図１に示すように、精製されたＦＩＶと結合（ａｓｓｏｃｆａｔｅｄ）している ポリペプチドは、ＳＤＳ／ＰＡＧＥによって分析され、同一の手法で感染されて いないセルの処理済みの培養ミディアムから独自の方法で分離されたポリペプチ ドと比較された。コマジ−ブルー染色ゲル（Ｃｏｍｍａｓｓ　ｉｅ　Ｂｌｕｅｓ ｔａｉｎｅｄ　ＧＥＬＳ）の分析によれば、３つの主要なポリペプチド、すなわ ち分子量１０ｋＤ、１５ｋＤ及び２６ｋＤ、それぞれｐｌｏ、ｐ１５、ｐ２６と 名づけられているポリペプチドが見つかった。

ＦＩＶポリペプチドに対するポリクローナル抗体を有する同一のネコに対し粉砕 したＦＩＶを用いたＦＬ　ＩＳＡテストを行い、ＥＬＩＳＡテストによって陽性 と判定されたネコリンパ液（ｓ　ｅ　ｒ　ａ）にウェスタンプロット分析を行っ た時には、それぞのネコは、その条件下において、分子量１０．１５．２６．４ ０及び６５ｋＤの／またはそれ以上のポリペプチドと反応する抗体を有していた 。

図２に示すように、トービン他の７６Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃ　ｉ　ＵＳＡ４３５０，１９７９に記載されているスタンダードウェスタン イムノプロットが行われた。ＦＩＶは、ＳＤＳ及び蛋白と共に粉砕され、ニトロ セルロースのシートに移し替えられた。ニトロセルロースのシートは、３０％子 牛リンパ液、１％牛リンパ液アルブミン（ＢＳＡ）及びＤｕｌｂｅｃｃｏの燐酸 バッファ塩中の０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含んでいる。このシートは、０．５ ｃｍの細片にカットされ、１　：　１００でうすめられたブロッキングバッファ 中のリンパ液サンプルと共に、２０〜２２℃で２時間で培養された。この細片は 、洗浄バッファによって繰り返し洗浄された。この洗浄バッファは、Ｄｕｌｂｅ ｃｃ。

ノ燐酸バッファ塩中の０，０５％Ｔｗｅｅｎである。そして、第２の抗体と共に 培養された。この第２の抗体は、ネコのＩｇのヘビーチェーンとライトチェーン を特定するものである。またこれはホースラディッシ・バーオキシターゼ（ＣＯ ｎｊｕｇａｔｅ）であり、これはＫｉｒｋｇｕａｒｄ及びＰｅｒｒｙ　Ｌａｂ。

ｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ、　Ｇａｔｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤによって得られ る。１時間の培養の後、細片は、洗浄バッファによって繰り返し洗浄された。そ して、凝集物質４−クロロナフトールと共に１０分間培養された。この細片は、 部分的には死んでおり、結果は即座に判断された。レーンＡ−Ｇのそれぞれのリ ンパ液は、ＦＴＶに感染している種々のネコから得られた。優勢なりロスリアク ティビティはｐ２６及びｐ１５に検出され、ｐｌｏについてはより少なかった。

他の蛋白３０．４０．４７及び６５ｋＤ分子量のものも検出された。

ある種のウィルス性ポリペプチド、例えばｇａｇ　（すなわちｐ２６）抗原ポリ ペプチドは、精製されたウィルスの調製物中に豊富に見られる。ウィルスエンベ ローブポリペプチド（例えばｇｐ１３０）のような他のポリペプチドは、ウィル スの精製の際に失われる傾向にある。そして、ｌ１主抗原に比ベラニスタンプロ ッド分析のために電気的移動の効率が良くない。従って、ウィルスエンベロープ （ｅｎｖ）及びｇａｇ先行ポリペプチドのより速かな検出のために、ＦＩＶ細胞 抽出物は、３５Ｓ−メチオニン及びシステニンによって標識（ラベル）され、イ グノブレシキテーション（ＲＩ　ＰＡ）によって試験される。ＦＩＶに感染され た細胞の融合（ｃｏｎｆ　１ｕｅｎｔ）培養は、メチオニン及びシステニンーフ リーのＤｕｌｂｅｃｃｏ”ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ″ｓ　ｍｅｄｉｕ ｍ中における３０分の培養によって行われる。この細胞培養は、同し媒体（ｍｅ ｄｉｕｍ）Ｓｒｎｌ中における４時間の培養に供される。ここで、この媒体は、 １ｒｎ１当り１００μキユーリーの３５８−メチオニン及び３５Ｓ−システニン （非活動度１２００キユーリー／ｍＭ、ニューイングランドニュークリアコーポ レーション、ボストン、ＭＡ）　、このように放射線標１されたラジオアクティ ブ組織養溶液は、除去されて、細胞は、ｐＨ７，５の１０ｍＭ燐酸ナトリウムバ ッファ５ｍｌ中に溶解される。このバッファは、ｐＨ７，５で１００ｍＭのＮａ Ｃ１，１％のＴ「１ｔｏｎ−Ｘ　１００，０．５％のソジュームデオキシコレイ ト、０．１％のＳＤＳ、０．　１．ｍＭフェニルメチルサルホニルフロライド、 及び１００カリクレインのアブロチインのアクティベータユニットを１ｍｌあた り（１００Ｋａ　ｌ　ｌ　１ｋｒｎ　１ｎａｃｔＲｖａｔｏｒ　ｕｎｉｔｓ　ｏ ｆ　ａｐｒｏｔｅｎｉｎ　ｐｅｒ　ｍｌ）（シグマケミカルカンパニイー、セン トルイス、ＭＯ）に含んでいる。そして、使用前に、細胞溶解産物は、１０００ ００ＸＧ３０分の遠心処理によって正常化され、そのベレットが廃棄される。標 識された細胞溶解産物（０゜１ｍ１）の一部と、テストされるリンパ液５μｍは 、マイクロ遠心チューブの中で混合され、３７℃で１時間培養され、その後４℃ でオーバーナイトされる。次の日、１００ｍＭ　ＮａＣ１，１％Ｔｒｉｔｏｎ　 Ｘ−１００及び０．　１％ＳＤＳを含むｐＨ７，５の１０ｍＭ燐酸バッファ中に プロティン　Ａ　セパローゼ（Ｓｅｐｈａ　ｒｏｓ　ｅ）ＣＬ−４Ｂ　ビーズ（ ファーマシも　ビスカットウェイ。

ＮＪ）の５％浮遊懸濁液０．２ｍｌが、各チューブに添加され３０分間４℃で混 合された。プロティン　Ａ　セパローゼ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）　ビーズに結合 された抗体／抗原複合物は、遠心処理（２分、２００００ＸＧ）によって収集さ れ、溶解用のバッファ中において３度洗浄された。最終的なベレットは、再び２ ５μＩのＳＤＳ／ＰＡＧＥローディングバッファ中に浮遊させられ、３分間１０ ０℃に加熱された。５ｅｐｈａｒｏｓｅビーズは、遠心処理によって除去され、 ＰＡＧＥ　Ｇｅ１ｓに適用された上澄は、エンライトニングＴＭにニューイング ランドニュークリアコーポレーション、ボストン、ＭＡの米国における登録商標 ）を用いたフロログラフィーによりて処理され、コダックＸＲ−５フィルムに一 ７０℃において露光される。実験的に感染されたネコからのリンパ液は、ポリペ プチド１５．２２．３６．４０．４７．１１．０及び１３０ｋＤを認識する。し かしながら、全てのネコがｐ２２．ｇｐ４ｏ、ｇｐ４７及びｇｐ　１３０に対し 反応を有するように見えるという定量的及び定性的な相違か存在する。（ｍｏｕ ｎｔａ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｔｏ　ｐ２２・＝）主要な内部構成蛋白ｐ２６に関 連するＲＩＰＡ−ＰＡＧＥ分析によってどのポリペプチドか特定されるかという ことを決定するために、ＲＩ　ＰＡ−ＰＡＧＥ分析は、ウェスタンブロッキング によって決定されるｐ２６と反応するモノクローナル抗体を用いて行われた。こ のモノクローナルは、蛋白ｐ４７、ｐ３６、ｐ２２及びｐ１５をイムノプレシー ト（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔｅｄ）とする。

ｐ２６モノクローナル抗体によって検出されない高分子量ポリペプチド（１３０ ｋＤ）のＦＩＶは、ＲＩＰＡ−ＰＡＧＡによって確認された。分子量１００ｋＤ の蛋白は、いくつかの感染したネコから得られたリンパ液抗体を利用して変質す ることが可能であった。他の例によれば、ＦＩＶの抗原性グリコペプチドは、以 下のようにして得ることができる。活性に成長するＣＲＦＫ　ＦＴＬＶ感染細胞 は、ローラーボトルからスクレイプされ、燐酸バッファされた塩（ＰＢＳ）によ ってゆるやかに洗浄され、ベレット化された。細胞ベレットは、バッファ１ｍｌ に対し０．１ｍｌのセルベレットの比でｐＨ７，２，１０Ｍｍ燐酸ナトリウム中 にゆるやかに再度分散された。この懸濁液は、氷上または冷蔵庫により５〜１０ 分恒温に保たれた。そして、３０秒間強力に旋回攪拌し、４容量のＰＳＢがＩＭ のＰＭＳＦと共に添加された。この混合物は、ブリンクマンホモジナイザ−ＰＴ １０／３５　（ＰＴＡ２０ジェネレータを利用する）により９０〜１２０秒強力 にホモジナイズ（ｈｏｍｏｇｅｎ　ｉ　ｚｅｄ）された。

ホモジナイズされたあとは、５０００ｘＧ、２０秒間の遠心処理により浄化され た。上澄部は捨てられ、細胞メンブレンベレットは再びＰＢＳ＋０．２％−Ｔｒ ｉｔｏｎ　Ｘ−１００、バッフｙ２．５ｍｌ：０．１ｍｌオリジナル細胞ベレッ トの比で再度分散浮遊された。この混合物は、再び、ブリンクマンホモジナイザ −ＰＴＩＯ／３５　（ＰＴＡ２０ジェネレータ）により９０〜１２０秒強力にホ モジナイズされた。得られたホモジナイズ物は、１．０００００ｘＧ、１時間で 浄化され、上澄はデカンチーシランにより除去され、バッチはＰｈａ　ｒｍａｃ 　ｉ　ａＬｅｎｔｉｌ　Ｌｅｃｔｉｎ　５ｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂ上で、樹脂６ ｍｌに対しオリジナル細胞ベレット５ｍｌの比で２０〜２３℃に置いて１日ノく ランド（ｂ　ｏ　ｕ　ｎ　ｄ）された。

このレンチルレクチン（Ｌｅｎｔｉｌ　Ｌｅｃｔｉｎ）懸濁液は、カラムに注が れ、樹脂（Ｒｅｓｉｎ）は収集され、１５カラム容量のＰＢＳ＋０．２％Ｔｒｔ ｔｏｎ　Ｘ−１００によって洗浄された。グリコプロティンは、樹脂を５〜１０ カラム容量のＰＢＳ＋０．２％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００＋２００ｍＭメチルａ 　−Ｄ　マンノピラノサイド（ｍａｎｎｏｐｙｒａｎｏｓ　ｔｄｅ）によって樹 脂から溶出されて、１カラムボリウム／チユーブのフラクションが採取される。

グリコプロティンの分離は、９％５Ｏ３−ＰＡＧＥ電気泳動により確認された。

そして、ＲＩＰＡデータとの結合による３５Ｓ−放射線標識細胞調製物を用いチ ェックされた。

ホストセルグリコプロティンからのウィルスのグリコプロティンのさらなる精製 は、ＨＰＬＣやアフィニティー（ａｆｉｎｉｔｙ）クロマトグラフィーのための ポリクローナルまたはモノクローナル抗体の利用を含む。

例１　：　ｇａｇ　ポリペプチド精製 分離されたウィルス（２５０〜１５００μｌ）は、２容量の６Ｍグアニジン塩酸 、ｐＨ３（水中の２０％トリフルオロアシデイクアイシ・ノド（ａｃｉｄｉｃａ ｃｉｄ）と共に調製された）に混合される。この混合物は、旋回混合され、３７ ℃〜４０℃のウォータバスに２０〜２５分置かれる。このようにして得た溶液は 、ブリウェット（ｐｒｅ−ｗｅｔｔｅｄ）された（１００μｌの６Ｍグアニジン 塩酸、ｐＨ３）Ｏ１４５ミクロゲルアクアディスクイルター（Ｎｏ、４１８４） によって濾過される。そして、フィルターは、１００μ工の６Ｍグアジニン塩酸 ｐＨ３によって調整される。濾過されたサンプルは、精製のためにＩ（ＰＬＣカ ラムにロードされる。

このＰＨＬＣシステムは、ベックマンＨＰＬＣて構成されており、３つの１１０ ｖポンプと、４２１コントローラと、１６６可変波長検出器と、４２フィンチク レータと、ダイナミックミキサを持つ２１０Ａインジエクタと、１０００μｌサ ンプルを有する。カラムは、ノデイファイドインデ・ソトコネクタ（ウォーター ス　マイクロボンド−Ａ−バック　ツェナイル　１０　Ｍｏ　８　ｍｍＸ１０ｃ ｍ　カートリッジＮｏ、８５７２２及びガードパックリゾルブ　ＣＮ　カートリ ッジＮｏ、８５８２６）を有するＲＣＭ−１００カラムホルダー中に保持された ウォータース　ラジアル　コンプレッション　カートリッジである。このシステ ムは、２つのレバーが押し付けられ圧力が中間黄色ゾーンにあるようにセットさ れた。

精製は、０．１％トリフロロアセティツクアシッド（Ｖ　／　Ｖ溶媒Ａ）から０ ゜１％トリフロロアセティックシアッドを含むアセトニドロール（Ｖ　／　Ｖ溶 媒Ｂ）の多段傾斜による。

フラクションは、最終的な容量が５０〜１００μｍとするために溶媒を除去する ことを目的として、サーバント　スピード　バック（ｓａｖａｎｔ　５ｐｅｅｄ 　ｖａｃ）収集され濃縮される。濃縮されたフラクションは、２００〜３００μ １ｐＨ７，２の５０ｍＭまたは１００ｍＭの燐酸ＮａＣ１バッファの添加によっ て中性とされる。バッファされたフラクションのｐＨは、ｐＨ試験紙によってチ ェックされ、ｐＨがまだ６以下であったならば、−規定ＮａＯＨを添加し、ｐＨ を６．５〜７．５の範囲に持ってくる。中性化されたフラクションは、使用する まで一２０℃で冷凍される。

図３にて上述のＨＰＬＣカラムからのプリントカットを示す。

溶媒Ａの１００％からスタートし、流量は１ｍ１７分であった。１５分後、溶媒 は、２６％溶媒Ｂを含むものに変更された。そして、１００分後３１溶媒８１１ ２分後３７．５％溶媒Ｂ、５分後４０％溶媒Ｂ、６分後４３％溶媒Ｂ、８分後４ ５％溶媒Ｂ、１５５分後６０、そして２００分後１０％溶媒Ｂに変更された。

ｐｌｏ、ｐ１５、ｐ２’６に対応するピークは、図３において記しである。これ らのピークを含むフラクションが採取された。

図４に示すように、ｐｌｏ、ｐ１５及びｐ２６に対応するフラクションは、５Ｄ Ｓ−ポリアクリルアミド　ゲル（１５％ｂｉｓ−アクリル°７ミドを７０Ｖで含 む）中にあった。このゲルは、Ｂｉｏｒａｄ　５ｉｌｖｅｒ　Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｋｉｔ　１６１−０４４３を用いた銀による染色が行われた。ｐ１５、ｐｌＯ及 びｐ２６に対応して分離されたフラクションは、本質的に、ＦＩＶボリペプチド とＩｌｌ同する（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ）溶液である。

分離されたＦＩＶポリペプチドはアミノ酸シーケンスのための標準的な手法によ って分析され、その結果を次に示す。ここにおいて、？は、実際のアミノ酸中に おいて明確でないことまたはこれについての情報が得られなかったことを示す。

Ｎｔｎｂｅｒ　ｌ−２−３−−５−８−７−８−９−１ｎ−１１−１２−１３− １４−１，５−１６−１７−１８−１９−２０＾１ｎＯ Ａｃｉｄ　Ｐ−トＱ−Ｔ−Ｖ−Ｎ−Ｇ−Ｖ−Ｐ−Ｑ−Ｙ−Ｖ−Ａ−Ｌ−Ｄ−Ｐ− に−Ｍ−Ｖ−３ｐｌ。

Ｎｕ＋ｇｂｅｒ　１−２−３−４−５−６−７−８−９−１０−１１−１２−１ ３−１４−１５−１６−１７−１８−１９−＾ｓｌｎ。

Ａｃｆｄ　Ｖ−Ｑ−８−Ｒ−Ｇ−８−Ｇ−Ｐ−Ｖ−Ｃ−Ｆ−Ｎ−Ｃ−に−に−Ｐ −Ｇ−Ｈ−Ｌ−Ｎｕｍｂｅｒ　２０−２１−２２−２３−２４＾虐ｆｎ。

Ａｃｆｄ　＾−Ｒ−Ｑ−３−Ｈ Ｎｕｍｂｅｒ　Ｃ１−Ｃ１−１−２−３−４−５−８−７−８−９−１０−１１ −１２−１３Ａ。

Ａｃｆｄ　５−Ｖ−Ｑ−８−Ｒ−Ｇ−Ｑ−Ｇ−Ｐ−Ｖ−Ａ−Ｆ−Ｎ−？この発明 における精製されたポリペプチドが有用であるか否か、すなわちこのポリペプチ ドが抗原性であるか否かを決定するためには、どのような標準的な手法をも利用 することができる。例えば、ＥＬＳＡテストを行うことができる。このテストは ポリペプチドがクロス−リアクティブか否かを決定するためにネコリンパ液から のポリクローナル抗体を用いる。また、ポリペプチドは、補助剤と共にまたは補 助剤を伴わず動物に注入することができる。動物としては、例えばマウスがあり 、この注入によって抗体が形成されるか否かを見る。これらポリペプチドは、Ｆ ＩＶが原因となる病気の防止とネコにおけるＦＩＶの感染を防止するためのワク チンの製造のために利用される。これらのワクチンは、通常の方法で養（生産） され、これが静脈、皮下注射またはその他の方法によってネコに注射される。こ のときのレベルは、１〜１００μｇ／に、ｇ−動物であり、そのインターバルは 、３〜４過てあり、ＦＩＶの免疫か形成されるまで続けられる。

ＦＩＶモノクローナル抗体 ＦＩＶポリペプチドの抗体は、上述の精製されたポリペプチドの確認（同定）に 役立ち、ポリペプチドの精製の助けとなる。またこの抗体は、いかなるポリペプ チドの抗原性の決定のためにも役立つ。例えば、次のような有用な抗体の調製で ある。このような抗体は、独立したまたは少数のＦＩＶポリペプチドの検出及び 精製を可能とするモノクローナル抗体である。

Ｂａ１ｂ／ＣＪ（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂｓ）マウスは、上述のようにして調製 されたＦＩＶウィルスの５０Ｍｇの初期の注射によって免疫ができた。なお、こ こで、ＦＩＶウィルス５０μｇ／マウスであり、Ｄｉｆｅｏ　Ｂａｃｔｏ補助剤 が１コ１でミックスされたものである。１２間後、それぞれのマウスに補助剤を 伴わず１００μｇのＦＩＶウィルスが静脈から注射された。この増加された注射 の３日後、融合（ｆｕｓｉｏｎ）が、マウス骨髄腫細胞ラインＦＯまたはｐ３Ｘ ６３−Ａｇ８．６５３に起った。ミツドログフェーズ骨髄腫ラインは、フュージ ョンの日に採取され、生存力がチェックされた。細胞は、３００Ｇ８分間の回転 処理によって成長用媒体から分離され、リンパ液を含まない［）Ｍ）：（ｓｅｒ ｕｍ　ｆｒｅｅ　ＤＭＥ）中に再度浮遊懸濁された。

フュージョンにより、ＦＩＶが接種されたマウスは、首の脱臼によって殺された 。そｌ、て、肺臓が無菌的に除去された。肺臓は、リンパ液を含んでないＤＭＥ （ｓｅｒｕｍ　ｆｒｅｅ　ＤＭＥ）中で３度洗浄され、２０ｍ１の完全媒体（Ｃ ｏｍｐｌｅｔｅ　ｍｅｄｉｕｍ）（ＤＭＥは、２０％ｂｏｖｉｎｅ　ｆｅｔａｌ ｓｅｒｕｍと・　ｉｍｌ当り１００ユニツトのペニシリン及びストレプトマイシ ンと、１ｍＭ　ｓｏｄｉｕｍ　ｐｙｒｕｖａｔｅを含む）を収容した無菌ベトリ 皿に入れられる。細胞をリリースするために、肺臓は２３ゲージのニードルによ ってばらばらにされた。

細胞は、５０ｍ１の円錐遠心チューブ内に置かれ、３００Ｇ８分間でベレット化 された。べ１ノツトは、０．１７Ｍの塩化アンモニウム５ｍｌ中に再度懸濁され 、氷の上に８分間置かれた。５ｍｌの牛胎児リンパ液（２０％）ｂｏｖｉｎｅ　 ｆｅｔ、ａｌ　５ｅｒｕｔｎ）は、添加され、細胞は、３００Ｇで８分間の遠心 処理によりもう一度ベレット化された。１０ｍ１のＤＭＥ中に再度懸濁された後 、セルはカウントされ、肺臓及び骨髄腫細胞は、３：１の比率で混合された。細 胞混合物は、２００ＧｉＯ分間の遠心処理によりベレット化された。上澄はデカ ンテーションされ、ベレットは５分間縦に置かれ水切りされた（ｓｔａｎｄ　ｆ ｏｒ５ｍｉｎ）ｅそして、１分間にわたって］、ｍｍの５０％ＰＥＧ　（ＰＥＧ １５００が１＝１でＰｅｐｅｓ、ｐＨ８，１と混合されたもの）が３７℃で添加 された。

１分後、３７℃に保たれ、ｉｍｌのＤＭＥは次の１分の期間にわたって添加され た。最後に、１．０ｍｌのＤＭＥが、２分間にわたって添加された。細胞は、２ ００Ｇ８分間でベレット化された。そして、ベレットは完全媒体（ｃａｍｐ　ｌ 　ｅ　ｔｅ　ｍｅｄｉｕｍ）中に再度懸濁された。この完全媒体は、０．０１６ ｒｎＭ　チミジンと、０．１ｍＭ　ハイポキサンチン（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎ ｅ）と、０゜５μｍｏ　Ｉ／アミノプテリン（ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎ）及び１ −０％ハイブリドーマ複製因子（ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｆａｃ ｔｏｒ）（１、ｘＨＡＴ）を含む。この細胞は、９６−ｗｅｌｌプレート中にプ レートされた（平板培養）。

３．５．７日後、フュージョンプレート（ｆｕｓｉｏｎ　ｐｌａｔｅｓ）中の半 分の媒体は除去され、新鮮な１　ｘ　ＨＡＴに取り替られた。１１日後、ノ＼イ グリドーマ細胞上澄液は、ＥＬＩＳＡテストによってスクリーンされた。このテ ストにおいて、９（’）−ｗｅ１１プレートは、標準的手法によってＦＩＶウィ ルスによってコート・された。各ウェル（ｗｅｌｌ）の１００μｌの上澄は、ス クリーニングプレート上の対応するウェルに添加され、２０〜２２℃に１時間置 かれた。

その後、それぞれのウェルは、蒸留水によって３度洗浄され、１００μｌのホー スラディツシュ過酸化コンジュゲート（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　ｐｅｒｏｘｉ ｄｉｄｅ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）であってボートアンチマウス（ｇｏａｔ　ａｎ ｔｉ−ｍｏｕｓｅ）　ＩｇＧ　（Ｈ＋Ｌ）１．Ａ、Ｍ（１：１５００　ｄｉｌｕ ｔｉｏｎ）が各ウェルに添加された。そして、２０〜２２℃に１時間置かれた。

蒸留水の３回の洗浄の後、基質ＯＰＤ／過酸化水素水か添加され、５〜１５分間 恒温に置くことが続けられた。１．００μｍのストップソリューション（１Ｍ塩 酸）が添加され、４９０ｎｍにおける吸光度か検出された。光学的濃度の読取り 値がコンドロールウエルカ吠きくなった培養体は２ｃｍ２の培養皿へ移され、こ こに１、ｘ　ＨＴ媒体中の正常マウス膵臓細胞が添加された。さらに３日たった 後、この２ｃｍ２の全ての培養体は、抗体のためにもう１度スクリーンされ、こ れらの試験により再び陽性であるものは限定稀釈（ｌｉｍｉｔｉｎｇ　ｄｉｌｕ ｔｉｏｒｂ）によってクローンされる。各２ｃｍ２培養におけるセルは、カウン トされ、ｉｍｌ当りＩ　Ｘ　１０”となるように濃縮して濃度が調製される。細 胞は、完全媒体により稀釈され、ハイブリドーマ細胞の５．１０及び５０セルを １ｒｎｌに含む濃度の正常マウス膵臓細胞がこれに添加される。細胞は９６−ｗ ｅｌ、１プレートにプレートされそれぞれ稀釈される。１０日後、フローリング プレートは、成長のためスクリーンされる。はぼ３７％のウェルは成長を示して いた。正の成長を示したウェルは、抗体のためにスクリーンされ、テストにより 正であったウェルは、２ｃｍ２培地に拡げられ、正常マウス膵臓細胞が供給され た。クローニング手順は、安定した抗体製造ハイブリドーマが得られるまで２回 繰り返された。ここにおいて、細胞培養は、２−”９−７９−７５−１５Ｏ培養 容器に拡げられてここにおいて腹水の生成が始まった。

腹水の生成のため、ｔｒｉｓｔａｎｅ（原始）ｐｒｉｍｅｄ　ＩＲＣＦ）ｓマウ スが用いられた。０．５ｍｌのプリステーン（ｐｒｉｓｔａｎ）は、それぞれの マウスの腹腔（ＩＰ）内に注射され、マウスは、１０〜６０日休まされた。この とき、４．５Ｘ１０６細胞がそれぞれのマウスのＩＰ中に接種され、腹水は７〜 １４日の間形成された。腹水は、腹膜の穴を介しパスツールピペットによって採 取された。

グリコプロティンの抗体も同様に分離及び検出可能である。特に、分子量４０ｋ Ｄ　（ｇｐ４０）及び１３０ｋＤ　（ｇｐｌ、３０）の２つのグリコプロティン に対する抗体はＰＡＧＥ及びＲＩＰＡをそれぞれ用いて検出される。

この発明においてモノクローナルは、ＦＩＶの固定のポリペプチドの精製及び同 定に有用である。ここで、特定のポリペプチドは、ＦＩＶに対【、特異的であり 充分強い相互作用をＦＩＶエビトーク、ＦｒＶ抗原との間にもつものを含み、免 疫試験（イムノアッセイ）、例えばＥＬＩＳＡによるＦＩＶ抗原の検出などにａ 用である。上述のモノクローナル抗体の内どれが有用であるかを決定するために 、１つの主要なテストが利用された。これは、モノクローナル抗体かＦＩＶ抗原 をバインドできるか否かについての決定を必要とし、ＦＩＶに対するポリクロー ナル抗体のコンデュゲート（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）と共に検出される（上述のＥ ＬＩＳＡテスト）。

さらに他のテストは、モノクローナル抗体が１以上のＦＩＶ抗原に対し良好な反 応性を有するか否かを決定するためのウェスタンプロットの実施である。一般的 に、反応性の弱いモノクローナルは、ウェスタンプロット上に弱いバンド（ｆａ ｉｎｔ　ｂａｎｄｓ）を精製し、この発明には適さない。さらに他のテストは、 ラジオイムノブレシピテイシゴン試験（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｒ＋ｏｐｒｅｃ＋ｐ ｉｐａｔｊｏｎ　ａｓｓａｙ）（ＲＩＰＡ）を含む。このＲＩＰＡにおいては、 ＦＩＶウィルスは、３５Ｓ−メチオニンによって標識され、モノクローナル抗体 と反応してイムツブレシピティト中に形成する。そして、イムツブレシピティト は５ＤＳ−ＰＡＧＥ中で働き、標識された蛋白を検出するためにオートラジオグ ラフされる。この分析は、どのモノクローナル抗体が前駆ＦＩＶ抗原ポリペプチ ドであり単なる成熟したポリペプチドでないことを検出することができるものか を決上述の抗原性ポリペプチドはネコによ７て生成される自然発生抗体を検出す るのに利用される。このような検出は、標準的なイムノアッセイ手法により行え る。

例えば、上述したようにＥＬＩＳＡテストなどが用いられる。このようなテスト の一例を下に示す。この例は、本発明を限定するものではなく、当業者が認識で きる他の多くの標準的な手法を用いることができる。

例２−抗体試験 この試験を実施するために必要なものとして、９６ウエルフラツトボトムマイク ロタイターストリツプ（９６ｗｅｌｌ　ｆｌａｔ　ｂｏｔｔｏｍ　ｍ１ｃｒｏｔ ｉｔｅｒ　ａｔｒｉｐｓ）があり、このストリップは適当なテストする抗原（例 えばｐ２６、ｐ１５またはｐｌｏ）を含む溶液によってコートされている。

テストされるウェルは、１００１１１の溶液であって、０．１５ｇｇの抗原をｐ Ｈ７，５の０．２５モル（ｍｏｌ、ａｒ）クエン酸ナトリウム中に含む。ウェル はバラフィルムによってカバー・されており、４℃にオーバーナイト（１晩）置 き、乾燥するまでタップされた（ｔａｐｐｅｄ）。抗体は、その後ｏ、２５モル クエン酸ナトリウム中の２００μｍ１％ＢＳＡの添加によってオーバーコートさ れた。

そして、室温（２０〜２５℃）に１時間置かれ、タッピングによってウェルか乾 燥される。２００μｍの０．２５モルクエン酸ナトリウム中の７．５％サッカロ ース（Ｍ糖）は、その後それぞれのウェルに添加され、室温に３０分置かれた。

この結果のストリップは、すぐに使われまたは減圧条件下室温で６時間乾燥され 、後の使用に供される。

試験は、１００μｍのネコセイラム（リンパ液ンサンプルを添加することＪごよ って行われた。ここで、ネコセイラムサンプル（ｆｅｌｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ　ｓ ａｍｐ　１　ｅ）は、ポジティブコントロール、ネガティブコントロールまたは テストセーラム（ｓｅｒａ）であり、Ｄｕｌｂｅｃｃｏｓ　ＰＢＳ中にｌ：１０ ０で稀釈され、このＰＢＳは、０．１％Ｂｏｖｉｎｅ　（ウシ）　ｓｅｒｕｍ　 アルブミンと、３０％ｃａｌｆ（子ウシ）　ｓｅｒｕｍと、０．０５％Ｔ　ｗ　 ｅ　ｅ　ｎ　−２０（シグマケミカル、セントルイス、ＭＯ）を含み、ウェルに 供される。そして、室温において３０分置かれ、タッピングによりウェルを乾燥 する。ウェルは、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ−ｓ　ＰＢＳ　（０，０５％Ｔｗｅｅｎ−２ ０を含む）によって即座に２度洗浄され、この２度目の洗浄の後タッピングによ ってウェルが乾燥される。

次に、ネコイムノグロブリンに対する抗体を含む１００μｌの溶液を添加する。

これらの抗体はインジケータ酵素（例えばアルカリ性ホスファターゼ）と結合（ ｃｏｊｕｇａ　ｔ　ａｄ）される。そして、ｐＨ７，６の５０％子牛脂児リンパ 液（ｆｅｔａｌ　ｃａｌｆ　ｓｅｒｕｍ）と、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含 む０．０５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ中に溶解される。このウェルは室温、３０分置 かれ、タッピングによって乾燥され、そして０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む Ｄｕｌｂｅｃｃｏ”ｓ　ＰＢＳによって２度洗浄される。

４０％グリセロール及び５０％メタノール中に０．１％の３．　３”、５．　５ −テトラメチルヘンシブ〉を含む溶液が、次のようなものを含む溶液と等量混合 される。すなわち、この溶液は、１１中に２２．８２ｇの２塩基リン酸カリウム と、１９．２ｇのクエン酸と、１．３４ｍ１の３０％過酸化水素水を含む。この 溶液の１．００ｍ１が各ウェルに添加される。そして、室温に１５分間保たれる 。

この恒温１こ保った期間の終了時に、０．２５％のフッ酸を１００μｌを各ウェ ルに添加する。そして、マイクロチタープレートリーダにより６５０ｎｍの波長 の吸光度（ｏｐｔｉｃａｌ　ｄｅｎｓｉｔｙ）を計測する。ｐｌｏＳｐ１５及び ｐ２６に対する免疫性の応答は、次の実験的にＦＩＶに感染されたネコや、ネコ リンパ液（ｆｅｌｉｎｅ　５ｅｒａ）の処理されたＦＩＶに対する抗体の両方を 検出可能であった。

ＦｉＶ核酸 ＦＩＶ核酸は、ＦＩＶポリペプチドの多量の生産に有用である。また、ＦＩＶポ リペプチドのフラグメントの生産についても有用である。また、ｖｉｖｏにおけ る（ｉｎ　ｖｊｖｏ）核酸の相同性の検出についても有効である。なお、これら の場合において、通常の手法が利用される。次に、ＦＩＶウィルスのＤＮＡに対 するクローニングの例について説明する。ここで、特定のＦＩＶストレイン（ｓ 　ｔ　ｒａ　ｉｎ）の選択は、この発明を限定するものではない。当業者は、ク ローンされたシーケンスの使用により均等な（実質的に同等な）核酸が分離でき ることを認識しており、ここにおけるクローンされたシーケンスは特定の寄託に より提供される。また、以下に記載する例と近似する手法によっても均等な核酸 が得られることは当業者が理解できることである。

ＦＩＶスト１ツイン２４２８　（Ｐｅｎｔａｌｕｍａ　ｆｓｏｌａｔｅ）により 生産的に感染されたクランデル腎臓細胞ライン（Ｃｒａｎｇａｌ　ｆｅｒｉｎｅ ｋｉｄｎｅｙ　ｃｅｌｌ）が、統合されていないウィルス性のＤＮＡの基として 使用された。この統合されていないウィルスＤＮＡは、ヒート抽出（Ｈｉｒｔｅ ｘ　ｔ　ｒａｃ　ｔ　１ｏｎ）によって調製された。モしてＣｓＣ１−エチジウ ムブロマイド遠心処理により線形とスーパーコイルのウィルスＤＮＡに分解して 調製される（Ｈｉｒｔ、２６　Ｊ　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、３６５，１９６７；Ｃ ａｎａａｎｉ他、２ｇ２　Ｎａｔｕｒｅ　３７８，１．９７９）。

スーパーコイルウィルスＤＮＡがオーバーラツプするウィルスＤＮＡシーケンス を含むライブラリィ　（ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）を構築するのに用いられる。この ようなライブラリィを構築する手法は、Ｍａ口１ａｔｉｓ他Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ１ｏｎｉｎｇ、Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒ ｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ。

Ｙ及びＧｌｏｖｅｒ、ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｖｏｌ、１．Ａ　Ｐｒａｃｔｉ ｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＤＣ ）に記載された方法と同様であり、当業者に慣用されているものである。

２つの限定エンドヌクレアーゼによってスーパーコイルウィルスＤＮＡが裂開（ これはＤＮＡシーケンス５−ＧＧＣＣ３−を認識する）は、スーパーコイルウィ ルスＤＮＡについてのものであり、シーケンスがオーバーラツプしている２セツ トの平滑末端（ｂｌｕｎｔ−ｅｎｄｅｄ）ＤＮＡ分子を生成する。この平滑束ゲ ンス５−−ＧＡＡＴＣＣ−３”メチル化のアデニン残留物は限定エンドヌクレア ーゼＥｃｏＲＩにより処理されたＤＮＡの裂開を防止するように変更する。メチ ル化されたＤＮＡ分子は、リンカ−（ｌ　１ｎｋｅｒ）ＤＮＡ分子と結合（Ｉｆ して、生成される分子の終端は、組替えＤＮＡファージベクタλＺＡＰ　（米国 登録商標：Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、カリフォルニヤ）におけ るＥｃｏＲＩクローニング部位と適合する（ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）。裂開によ って得られたリンカ−フラグメントは、クイックスピンカラム（Ｂｏｅｈｒｉｎ ｇｅｒ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）ｆ−のサイズ分 離にＡＰベクタ中にＴ４　ＤＮＡ　リガーゼ（ｌｉｇａｓｅ）（Ｎｅｗ　Ｅｎｇ ｌａｎｄ　Ｂｉｏｂａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）を用いて結合（ｌｉｇａｔ ｅｄ）される。結合されたＤＮＡ分子は、ギガパックゴールド（Ｓ　ｔ　ｒａ、 　ｔ　ａｇｅｎｅ。

Ｌａ、Ｊｏｌｌａ、カリフォルニヤ）を用いてファージ中にパッケージされる。

このパッケージング反応からの種々のファージは、ＢＢ４細胞（Ｓｔｒａｔａｇ ｅｎｅ）を感染させることにより及びこれら感染された細胞のプレート溶解産物 を採取することにより増幅され、これによって組替えλＺＡＰクローンのストッ クを得る。

組替えλＺＡＰクローンのインサートＤＮＡはホストセルとしてのＤＮＡの他に ＦＩＶプロウィルスのＤＮＡシーケンスを有するため、即座に検出可能なラベル を持つＦ　ＩＶＤＮＡプローブによりそれぞれのライブラリィをスクリーンする ことが必要である。このようなプローブは、ＦＩＶから分離されたＲＮＡから製 造される。ラジオアクティブな優性（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）ＤＮＡはト ータルのウィルスＲＮＡから合成される。このＲＮＡについては、Ｍａｎｉａｔ ｆｓ他１９８２に記載がある。ここで、記載がないものとしては、ポリＡ−ｃ。

ｎｔａｉｎｔｎｇＲＮＡの選別は、行われず、メチマーキュリツク／Ｘイドロオ キサイドはプロトコルから除かれている点である。

バクテリオファージライブラリィは、１５０ｍｒｎの皿に１００００バクテリオ フアージの密度でプレートされる。これらは、ラジオアクティブ（こラベルされ ｔニブローブとニトロセルロースフィルタ（Ｍａｎｉａｔｉｓ他１９８９．上他 色９８９上にイムノビライズされ（ｔｍｍｏｂ　Ｌ　Ｉ　Ｌ　ｚｅｄ）るファー ジＤＮＡとのハイブリダイズによってスクリーンされる。それぞれのハイブリダ イズ（対合）バクテリオファージプラク（ｐｌａｑｕｅ）は、吊り上げられ、ま た上述と同様にハイブリダイズされる。そして、１つのウェルがλＺＡＰ組替え クローンを含むことになるまで繰り返される。ＸＬ−１−Ｂｌｕｅ細胞（Ｓ　ｔ 　ｒａ　ｔ　ａｇｅｎｅ）は、組替えλＺＡＰファージにより感染される。そし てインサートＤＮＡを含むプラスミドは、下記Ｒ４０８ヘルパーフアージによる スー７く−インフエクンコンにより得られる。ここで、ヘルパーファージの製造 はその製造者の指針（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　カリフォル ニヤ）による゛。この手法は、組替えプラスミド（これは細胞から分離可能であ る）及びａｌｔ−のストランプツト（ｓ　ｔ　ｒａｎｄｅｄ）ファージストック も供給する。ここで、このファージストックは、ＤＮＡシーケンス分析のための 媒体から分離することができる。

上述の組替えプラスミドは、調製されたプラスミドＤＮＡによるインサートのた めにアナライズ（ａｎａｌｙｚｅｄ）される。このプラスミドＤＮＡは下記のよ うに、バクテリヤの１晩の培Ｊｉ（カルチャ）による細胞分裂によって精製され る。１または１．．５ｍｌの１晩（オーバーナイト）培養されたカルチャーはマ イクロ遠心チューブ内に置かれ、４０００Ｇで４分間回転される。上澄は除去さ れ、チューブはもう一度４０００Ｇで４分間回転される。上澄はまた除去され、 チューブは数分間回転される。そして、残留した液体が注意深くパスツールピペ ットにより除かれる。バクテリヤのベレットは、２００μｍの溶液中にもう一度 分散浮遊される。この溶液は、ｐＩ（８，０５であり、８％のサブ力ロースと、 ５０ｍｍのＥＤＴＡと、５％のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００及び５０ＭＭのＴｒｉ ｓ／ＨＣ１を含んでいる。１０ｍＭのＴｒｔｓ／ＨＣＩ中に１．０ｍｇ／ｍｌの リゾソームを含む２０μｌのイリゾーム溶液と、１μＭのＥＤＴＡが添加され混 合される。

そして、この混合物は、４℃に１５分間置かれる。このバクテリヤを含む溶液は 、９０秒間沸騰水のバス中に置かれる。この混合物は氷上で冷され、マイクロフ ユージ（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）中で冷された条件下において１１．０００Ｇで１ ０分間回転される。ベレットはグラスピペットを用いて注意深く除去される。２ ００μｌの氷で冷されたイソプロパツールが添加され、溶液は完全に混合され、 −２０℃に５分間置かれる。冷された溶液は、−２０℃、１１０００Ｇで１０分 間遠心処理され、プラスミドＤＮＡがベレット化される。上澄は、注意深く除去 され、ベレット化されたＤＮＡは部分的に空気乾燥される。ＤＮＡベレットは、 １００μｍの無菌の２回蒸留水に溶解される。このようにして分離されたプラス ミドＤＮＡは、限定エンコヌクレアーゼ（ｅｎｃｏｎｕｃｌｅａｓｅ）裂開によ るインサートのためにアナライズされる。そして、アガロースゲル（Ｍａｎｉａ ｔｉｓ他１９８２、上述）の０．　８％ゲル中において電気泳動される。

スタンダード２デオキシシーケンスアナリシスは、クローンを含む組替えＤＮＡ について行われる。単一鎖ファージ（ｓｉｎｇｌｅ　５ｔｒａｎｄｅｄ　ｐＨＡ ＧＥ）は細胞増殖に使用される物質から分離される。この増殖される細胞は、次 のマニュアルに記載されている方法を利用するブルースクリプトプラスミドを含 んでいる。すなわち、この方法は、Ｍ１３ダイデオキシ　シーケンシング　マニ ュアル、ベセスダリサーチラボラトリーズ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、メリー ランド）出版に一般的な記載がある。クローンの数（ｎ　ｕｍｂ　ｅ　ｒ）は、 この方法によりシーケンスされアナライズされる。ｌ０ＣＸ、２ＢＹ％Ｒ５Ｘで 規制されるクローンについてのシーケンス情報は、図５ａｑ　５ｂ、５ｃに示さ れている。この図５に示されているのは、それぞれのクローンについての推定的 に翻訳されたアミノ酸シーケンスである。これらのアミノ酸シーケンスは、次の ようなアミノ酸シーケンスに対し相同性を示す。すなわち、免疫的にＦＩＶに近 い再感染貧血ウィルス（ｅｑｕｉｎｅ　１ｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　ａｎｂｍｉａ　 ｖｆｒＵＳ）、レンチウィルスのアミノ酸シーケンスと相同性がある。

２ＢＹ　ＤＮＡシーケンスから得られた核酸プローブは、ＦＩＶに感染されてい る細胞（ｉｎｆｅｃｔｅｄ　ｂｕｔ　ｎｏｔ　ｕｎｉｎｆｅｃｔｅｄ　ｅｅｌＩ ｓ）から分離されたＤＮＡとハイブリッド（対合）する。このプローブは、他の ストレイン（ｓｔｒａｉｎ）からの他のＦＩＶ遺伝子を分離するためにも利用す ることができる。また、上述したポリペプチド精製のための標準的な手法によっ て発現することもできる。

寄託 ストレインｌ０ＣＸ、２Ｂ４及びＲ５Ｘは、ＡＴＣＣに寄託され、この受理ナン バーは、６７９３７．６７９３８及び６７９３９である。出願人及びその指定代 理人は、このパテントの権利期間が終了する前に、この培養が絶えた場合には、 これをもう一度提供することを確認する。これは、培養についての最終的な要求 の５年後または３０年後以上であっても責任を持つ。また、このような特許の発 行の供託場所について知らせることについても責任を持ち、このような時に、寄 託は最終的に公共に利用可能となる。これまでの期間は、寄託は、３７ＣＦＲ１ 〜１４条及び３５ＵＳＣ１１２条の指定によりコミツンヨナーオブバテンツにお いて寄託が利用可能である。

国際調査報告 １＋ｎｏ＋１−４．−＾””’−””ｗ＋Ｔ／ＩＫＯｆｌＺ／’１ｆｆｉｉ’Ｉ Ｑ

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １．精製されたポリペプチドであって、ＦＩＶの抗原性ポリペプチドのエピトー プを含む。
2. ２．請求項１記載の精製されたポリペプチドであって、上記ペプチドは、ＦＩＶ のｇａｇまたはｅｎｖのエピトープを含む。
3. ３．請求項２記載の精製されたポリペプチドであって、上記ポリペプチドは、上 記ｇａｇまたはｅｎｖポリペプチドに対し少なくとも７５％の相同性を有するポ リペプチドを含む。
4. ４．請求項３記載の精製されたポリペプチドであって、上記ポリペプチドは、Ｆ ＩＶのｇａｇまたはｅｎｖポリペプチドを含む。
5. ５．請求項２、３または４記載の精製されたポリペプチドであって、上記ポリペ プチドは、ｐ１０、ｐ１５、またはｐ２６である。
6. ６．請求項２、３または４記載の精製されたポリペプチドであって、上記ポリペ プチドは、ｇｐ４０、ｇｐ１００またはｇｐ１３０である。
7. ７．ＦＩＶに対する抗体の検出方法であって、ＦＩＶの抗原性ポリペプチドのエ ピトープを含むポリペプチドを精製する工程と、上記精製されたポリペプチドと 上記抗体を含むサンプルを接触させる工程と、上記ポリペプチド及び上記抗体か ら形成される複合体の存在を検出する工程と、を含む。
8. ８．精製された核酸であって、ＦＩＶパーティクル中に自然発生する５０ヌクレ オチドシーケンスに対し少なくとも９０％の相同性を有する５０ヌクレオチドシ ーケンスを含む。
9. ９．請求項８記載の核酸であって、上記核酸は、ＦＩＶの抗原性ポリペプチドの エピトープを含むポリペプチドをエンコードする。
10. １０．請求項９記載の核酸であって、上記ポリペプチドは、ＦｌＶのｇａｇまた はｅｎｖポリペプチドのエピトープを含む。
11. １１．請求項８記載の核酸であって、この核酸は発現ベクタ中に存在する。
12. １２．ネコにＦＩＶ起因の病気に対する免疫を精製する方法であって、請求項１ 記載のポリペプチドをネコに接種する工程を含む。
13. １３．精製されたポリペプチドであって、次のシーケンスから得られる１０以上 の連続したアミノ酸を有する。 【配列があります】又は【配列があります】又は【配列があります】発明の詳細 な説明