JP2000204100A

JP2000204100A - Ｆｉｖ抗体の検出方法及びｆｉｖ結合ポリペプチド

Info

Publication number: JP2000204100A
Application number: JP11342237A
Authority: JP
Inventors: Philip R Andersen Anderson; フィリップアールアンダースンアンダーソン; Thomas P O'connor; トーマスピーオコーナー; Quentin J Tonelli; クエンチンジェイトネリ
Original assignee: Idexx Laboratories Inc
Current assignee: Idexx Laboratories Inc
Priority date: 1989-05-08
Filing date: 1999-12-01
Publication date: 2000-07-25
Also published as: EP1475442A2; EP0471752A4; EP0471752A1; EP1475442A3; EP0860504A1; WO1990013573A1; JP3058685B2; JPH04507094A; CA2016183A1

Abstract

(57)【要約】【課題】ネコにおけるＦＩＶ感染を検出するための方
法、それに用いることができるポリペプチドを提供す
る。【解決手段】ネコにおけるＦＩＶ感染の検出は、ネコ
の血清中などのＦＩＶに対する特異的抗体を検出するこ
とにより行う。先ず、ＦＩＶにおける抗原性を有するペ
プチドを準備し、これをネコ血清などと接触させ、この
接触による免疫複合体の形成に基づき抗体の存在、ＦＩ
Ｖ感染を検出することができる。また、ＦＩＶのペプチ
ドとしては、ウイルスエンベローブ蛋白質中の糖蛋白
質、例えば、ｇｐ４０などを用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ネコに感染性を有
するＦＩＶをその抗体の検出することにより、ネコにお
けるＦＩＶ感染を検出することに関する。また、本発明
は、このＦＩＶ検出等に使用し得るＦＩＶ結合ポリペプ
チドに関する。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】本出願
は、オコーナー他の１９８９年申請、米国特許出願第３
４８，７８４号、名称「ネコのＴ細胞リンパ系の活性に
影響を与えるレンチウィルス」の一部継続出願であり、
この第３４８，７８４号は、オコーナー他の１９８９年
１月５日申請、米国特許出願第２９３，９０６号（発明
の名称「ネコのＴ−リンパ球の活性に影響を与えるレン
チウィルスに対するモノクローナル抗体」）の一部継続
出願である。また、この第２９３，９０６号は、オコー
ナー他の１９８８年１２月５日申請、米国特許出願第２
７９，９８９号（名称「ネコのＴリンパ球の活性に影響
を与えるレンチウィルスに対するモノクローナル抗
体」）の一部継続出願であり、これらの出願のすべてが
図面を含めここに引用され組み込まれている。

【０００３】この発明は、ネコＴ細胞リンパ系の活性に
影響を与えるレンチウィルス（ＦＩＶ）からのポリペプ
チドの精製に関する。

【０００４】ＦＩＶはもともとエイズに似た症候群を示
すネコから分離されたレトロウィルスである（ペダーソ
ン他、「Ｓｃｉｅｎｃｅ２３５巻７９０，１９８
７）。このウィルスは、ヒトのエイズの原因物であるヒ
ト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）と同じグループに属す
る。ペダーソン他は、０．１ＭＮａＣｌ及び１ｍＭ
ＥＤＴＡを含むｐＨ７．４のトリス塩基中のショ糖（密
度）勾配上の遠心分離によって精製されたウィルスを用
いて免疫蛍光試験により、また、ウェスタンブロットに
よってＦＩＶに対する抗体の検出を記載している。ここ
では、いくつかの蛋白質のバンドが検出され、抗原性の
比較は行われていないけれども、これらのバンドの位置
は、ＨＩＶの主要なコア蛋白質ｐ２４、ｇａｇ前駆
蛋白質ｐ５５、及びエンドヌクレアーゼ蛋白質ｐ３２に
一応対応していると述べられた。

【０００５】ヘダーソン他は、１９８７年８月２６日付
で申請された米国特許出願「ネコＴリンパ細胞の活性に
影響を与えるレンチウィルス」（これは、本出願の先行
技術とは認められない）において、ペダーソンによる上
述の結果について記載し、ＦＩＶに感染された細胞の溶
解産物のウェスタンブロッティングによって、主要な蛋
白質のバンドが、ほぼ２２〜２６ｋＤ、通常約２４ｋ
Ｄ；５０〜６０ｋＤ、通常約５５ｋＤ；及び２８〜３６
ｋＤ、通常約３２ｋＤに現れると述べている。

【０００６】

【課題を解決するための手段】第一の観点において、本
発明は、ＦＩＶの抗原性ポリペプチドの抗原決定基をも
つ精製されたポリペプチドを特徴とする。このポリペプ
チドは、グリコシル化されていることもあり、あるいは
されていないこともある。抗原性ポリペプチドとは、ネ
コにおいて抗体反応を起すことが可能なポリペプチドを
意味する。このポリペプチドは、少なくとも５つのアミ
ノ酸からなるポリペプチド断片でも良く、またＦＩＶ粒
子中に自然に発生するポリペプチドであっても良い。上
記断片は、自然発生ポリペプチドから、例えば酵素消化
によって得てもよく、または、所望のポリペプチドをコ
ードする遺伝子の分離あるいは合成と所望の発現系中、
例えば、細菌や酵母や哺乳動物発現における上記ポリペ
プチドの発現によって生成しても良い。

【０００７】ここで、抗原決定基とは、抗原性ポリペプ
チドの単一の抗原性部位を意味する。このような抗原決
定基は、特に、ＦＩＶの抗原性ポリペプチドに対するモ
ノクロナール抗体によって特異的に認識される。

【０００８】また、精製されたとは、上記ポリペプチド
が共に自然発生する他の細胞構成物、例えばＦＩＶポリ
ペプチドから分離されていることを意味する。好ましく
は、上記ポリペプチドは、これに対するモノクローナル
抗体を調製するために使用することができる程度に充分
純粋であることが望ましく、さらに好ましくは、このポ
リペプチドのアミノ酸配列が標準的な手法で決定できる
程度に充分純粋であることが望ましい。一般的に、精製
されたポリペプチドは、モノクローナル抗体の調製に適
切であり、あるいはネコの血清中の自然発生抗体の検出
に適切であるという点で、生物学的に活性である。

【０００９】好適な実施態様によれば、精製されたポリ
ペプチドは、ＦＩＶのｇａｇまたはｅｎｖポリペプチド
から得られた少なくとも２０個のアミノ酸残基からなる
ポリペプチド断片に対し、少なくとも７５％のアミノ酸
相同性を有し、最も好ましくは、ｇａｇまたはｅｎｖポ
リペプチド全体に対し少なくとも７５％の相同性を有す
るアミノ酸配列を含み、さらに好ましくは、精製された
ｇａｇまたはｅｎｖの全アミノ酸配列であることある。
ｇａｇ及びｅｎｖポリペプチドの例には、ｐ１０、ｐ１
５、ｐ２６、ｇｐ４０、ｇｐ１００、ｇｐ１３０が含ま
れる。

【００１０】もう一つの観点において、本発明は、サン
プル中のＦＩＶに対する抗体の検出方法を特徴とし、上
述の精製されたポリペプチドを提供する各工程及び、こ
のポリペプチドをサンプル中の抗体と精製されたポリペ
プチドの間で抗体／ポリペプチド複合体の形成が可能と
なるような適切な条件下で接触させて、このような複合
体の形成を検出する過程を含む。この抗体／ポリペプチ
ド複合体の存在は、サンプル中にＦＩＶの抗体が存在す
ることを示唆する。

【００１１】第３の観点において、この発明は、ＦＩＶ
粒子中に自然発生する５０個のヌクレオチドからなる配
列との間で少なくとも９０％の相同性を持つ５０個のヌ
クレオチドからなる配列を含む精製された核酸を特徴と
する。ここで、精製されたとは、この核酸が、例えば、
ポリペプチドや他の核酸など自然に発生する全ての成分
から実質的に分離されていることを意味する。好適に
は、この核酸は上述のような成分から完全に分離され、
純粋な核酸の溶液であるか、あるいはそれが自然には発
生しない次のような細胞中、例えば、バクテリヤ細胞や
他のウィルスの粒子やネコではない真核細胞などに保持
されることが望ましい。９０％相同性とは、この核酸が
５０個のヌクレオチドの内少なくとも４５個と一致する
ことを意味する。

【００１２】好適な実施態様において、この核酸は、Ｆ
ＩＶの抗原性のポリペプチドの抗原決定基、例えばＦＩ
Ｖのｇａｇまたはｅｎｖポリペプチドの抗原決定基を含
むポリペプチドをコードする。最も好ましいのは、該核
酸は、発現ベクターによって運ばれて、細菌や真菌やあ
るいは他の真核細胞、例えば哺乳類の細胞内で発現する
ことができる。

【００１３】関連した観点において、本発明は次のよう
な配列（アミノ酸を表す標準的な文字記号を用いて表し
た）からの１０個あるいはそれ以上の隣接するアミノ酸
を含む精製されたポリペプチドを特徴とする。

【００１４】V-Q-S-R-G-S-G-P-V-C-F-N-C-K-K-P-G-H-L-
A-R-Q-S-H あるいはP-I-Q-T-V-N-G-V-P-Q-Y-V-A-L-D-P-
K-M-V-S またはS-V-Q-S-R-G-Q-G-P-V-A-F-N ．出願人は、ＦＩＶ抗体の特異的な検出に適したポリペプ
チドを提供し、これによってＦＩＶの感染を正確に検出
することを可能とした。出願人は、さらに、ネコのＦＩ
Ｖによっておこる病気を防ぐためのワクチンの製造に有
用なポリペプチドを提供した。

【００１５】この発明の他の特徴や有用性は、後述する
実施形態の記載及び前述の特許請求の範囲より明らかと
なろう。

【００１６】

【発明の実施の形態】以下、本発明の好適な実施形態を
図面を用いて説明する。

【００１７】抗原性ＦＩＶポリペプチドこの発明において有用なＦＩＶポリペプチド抗原の一般
的な説明を上に述べた。この発明において有用なポリペ
プチドは、下記のようにして分離されたウィルスから、
及び酵素処理や他の標準的な方法によって分離された精
製ポリペプチドの断片から精製され得る。さらに、この
ポリペプチドは、ＦＩＶポリペプチドをコードするＤＮ
Ａがクローン化され、バクテリア、酵母、または哺乳類
細胞内で発現される標準的なインビトロの発現系によっ
て合成することができる。このようなＤＮＡは、下記の
ようにして分離及び発現させることができる。このポリ
ペプチドは、標準的な化学的方法によっても合成するこ
とができ、例えば下記の種々のＦＩＶポリペプチドのポ
リペプチド断片は合成することができる。以下の例にお
いて、ＦＩＶポリペプチドは、ＦＩＶ感染細胞から直接
得られ、ＦＩＶウィルス粒子中に自然発生したポリペプ
チドの形状をとっていた。この例は本発明に限定される
ものではなく、当業者はこの発明のポリペプチドを得る
ための種々の代替方法を容認するであろう。このポリペ
プチドは分子量に従って引用され、３０ｋＤポリペプチ
ドはｐ３０と、この重量の糖蛋白質はｇｐ３０と呼ばれ
る。

【００１８】親種ウィルスを生成する培養は、ＦＩＶ分
離株＃２４２７（ＣＲＦＫ−ＦＩＶまたはＰｅｔａｌｕ
ｍａ株）によって感染された連続培養のネコ細胞系の形
で、Ｄｒ．ネイルスフェダーソン（カリフォルニアデ
ィビスのカリフォルニア大学）から入手した。親細胞ラ
インは、ＦＩＶによって持続的に感染されたクランデル
ネコ腎臓細胞である。この細胞系は、１９８８年７月１
３日付でアメリカンタイプカルチャーコレクションに寄
託されており、その寄託ナンバーはＣＲＬ９７６１とい
う番号が割り当てられている。出願人及びその指定代理
人は、この文書に基づいて発行される特許の権利期間が
終了する前に、この培養が死絶した場合には、培養につ
いての最終要求の５年後、または３０年間、いずれか長
い方の期間、これをもう一度提供する責任と、また、寄
託は最終的に公共に利用可能となる時期に、このような
特許の発行の供託場所について知らせることについても
責任を認める。その時期まで、寄託は、３７ＣＦＲ１〜
１４条及び３５ＵＳＣ１１２条の条件下に特許局長に対
して入手可能である。

【００１９】他のウィルス培養は、ペダーソン他の上述
の参考文献またはハーバー他によるＶｅｔｅｒｉｎａｒ
ｙＲｅｃｏｒｄ１２２巻８４，１９８８に記載さ
れたようにして得ることができる。ウィルスを生成する
細胞培養の種ストックは、感染後少なくとも１９回の継
代培養後の親種となる細胞培養の凍結によって得られ
る。さらに追加のウィルス生成培養の種ストックは、Ｆ
ＩＶの親種ウィルスによる連続ネコ細胞培養の感染、ま
たはもとのＦＩＶ感染親種細胞培養からの高度のＦＩＶ
生成細胞の単一細胞マイクロウェルクローニングによっ
て得られた。増殖のため、親種ウィルス感染ネコ細胞培
養は、組織細胞培養フラスコ中に接種された。細胞が集
密的に単層に成長した後、組織培養液は２〜５日の間隔
で採取された。

【００２０】作業用の種ウィルスは、ＦＩＶに永久的に
感染された親種細胞系による増殖にによって生成され
た。接種材料は、組織培養フラスコ中の１００ユニット
／ｍｌのペニシリン及びストレプトマイシン、並びに、
２ｍＭのグルタミンを含み、２ｍＭのＬ−グルタミン及
び４．５ｇ／ｌグルコース（ＤＭＥ）を包含するダルベ
ツコの修正イーグル培地内に添加された。接種材料は、
組織培養フラスコに添加され、培養され、そして使用ず
みの組織培養液は、細胞が集密状態に生育した時点で採
取された。細胞は、培養容器からトリプシン／ＥＤＴＡ
によって分離され、１：５〜１：２５（典型的には１：
８）の倍率で培地によって稀釈された。典型的には、フ
ラスコは３６℃〜３８℃で最高７日間（３〜７日間）イ
ンキュベートされ、その後培養液及び細胞が採取され
た。細胞物質を含む採取された液体は、高速遠心機（Ｓ
ｏｒｖａｌＲＣ−５ＢまたはＢｅｃｋｍａｎＪ２−
２１）によって遠心され、上清及び細胞ペレットに分離
された。得られた細胞ペレットは排棄され、上澄培養液
は作業用ウィルスを調製するために用いられた。浄化さ
れた上清は、ＮａＣｌの濃度０．５Ｍ、ポリエチレング
リコール（ＰＥＧ８０００，シグマ）の濃度４％〜１
０％（通常７％）に調製された。２℃〜７℃で一晩培養
された後、ウィルスはペレット化され（１３００×Ｇ
（重力加速度）、３０分）、緩衝液（１０ｍＭＴｒｉ
ｓ，ｐＨ７．６３００ｍＭＮａＣｌ，１ｍＭＥＤ
ＴＡで２℃〜７℃）中に再度懸濁された。一晩培養の
後、ウィルスは１３００×Ｇで１５分間遠心分離され、
ペレットは捨てられ、そして上清は、１０ｍＭＴｒｉ
ｓ３００ｍＭＮａＣｌ，１ｍＭＥＤＴＡ, ｐＨ
７．６中における５０％／８０％の不連続グリセロール
段階勾配で遠心された。この遠心処理は、１０００００
×ｇ、４℃で３時間行われ、５０％−８０％の界面にく
るＦＩＶウィルスのバンドが採取された。このバンドは
１０ｍＭＴｒｉｓ，０．３ＭＮａＣｌ及び１ｍＭ
ＥＤＴＡ中に懸濁され、上記緩衝液で１：３に稀釈さ
れ、１０００００×ｇ、１時間の遠心処理で再度ペレッ
ト化された。こうして得られたペレットは、精製された
ウィルスであり、上記緩衝液中にもう一度懸濁して、−
７０℃で貯蔵された。こうして得られたウィルスは、Ｆ
ＩＶ宿主細胞の蛋白質を実質的に含まず、少なくとも５
％のｐ２６（コマシーブルー２５０で染色されたＳ
ＤＳ／ＰＡＧＥのデンシトメトリックスキャンにより総
蛋白質として測定された場合の主要ヌクレオカプシド
蛋白質）からなっている。

【００２１】このような精製されたウィルスは、他の方
法によっても得ることができる。しかしながら、出願人
は、調製されたウィルス中に存在する高分子汚染物質
が、勾配遠心処理に高濃度の塩を使用することにより除
去されることを発見した（ここで、高濃度の塩とは、生
理学的な塩濃度より高い範囲のものを言う）。

【００２２】図１に示すように、精製されたＦＩＶに関
連しているポリペプチドは、ＳＤＳ／ＰＡＧＥによって
分析され、非細胞を培養した後の培地から同一の方法で
分離されたポリペプチドと同一の手法で比較された。コ
マシーブルー染色ゲルの分析によって、それぞれｐ１
０、ｐ１５、ｐ２６と名づけられている分子量１０ｋ
Ｄ、１５ｋＤ及び２６ｋＤの３つの主要なポリペプチド
が見つかった。

【００２３】ＦＩＶポリペプチドに対するポリクローナ
ル抗体を有するネコを同定するために破砕したＦＩＶを
用いてＥＬＩＳＡテストを行い、ＥＬＩＳＡテストによ
って陽性と判定されたネコの血清にウェスタンブロット
分析を行ったところ、それぞのネコは、用いられた条件
下において、分子量１０、１５、２６、４０及び６５ｋ
Ｄの１つまたはそれ以上のポリペプチドと反応する抗体
を有していた。

【００２４】図２に示すように、トービン他のＰｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃｉＵＳＡ７６
巻, ４３５０，１９７９に記載されている標準ウェスタ
ンイムノブロットが行われた。略述すると、ＦＩＶはＳ
ＤＳで破砕され、蛋白質はニトロセルロースのシートに
移し替えられた。ニトロセルロースのシートは、３０％
子牛血清、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び０．
０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含んでいるＤｕｌｂｅｃｃｏの
燐酸緩衝食塩水でブロックされた。このシートは、０．
５ｃｍ巾の細片にカットされ、１：１００にうすめられ
たブロッキング緩衝液中の血清サンプルと共に、２０〜
２２℃で２時間インキュベートされた。この細片は、洗
浄緩衝液（Ｄｕｌｂｅｃｃｏの燐酸緩衝液中に０．０５
％Ｔｗｅｅｎを含むもの）によって繰り返し洗浄され、
次いで、第２の抗体（ネコのＩｇの重鎮と軽鎮に対して
特異的な）とホースラディッシ・ペルオキシターゼ複合
体（Ｋｉｒｋｇｕａｒｄ及びＰｅｒｒｙＬａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓＩｎｃ．Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，
ＭＤから入手）とインキュベートされた。１時間の培養
の後、細片は、洗浄緩衝液によって繰り返し洗浄され、
沈着性基質４−クロロナフトールと共に１０分間培養さ
れた。この細片を部分的に乾燥し、結果を即座に判断し
た。レーンＡ〜Ｇのそれぞれの血清は、ＦＩＶに感染し
ている種々のネコから得られた。優勢な交差反応性はｐ
２６及びｐ１５に検出され、また、ｐ１０についてはよ
り低い程度の交差反応性が検出される。他の蛋白質３
２、４０、４７及び６５ｋＤ分子量のものも検出されて
いる。

【００２５】ある種のウィルス性ポリペプチド、例えば
ｇａｇ（例えばｐ２６）抗原性ポリペプチドは、精製さ
れたウィルスの調製物中に豊富に見られ、ウィルスエン
ベローブポリペプチド（例えばｇｐ１３０）のような他
のポリペプチドは、ウィルスの精製の際に失われる傾向
にあって、ｇａｇ抗原に比べウェスタンブロッド分析の
ために電気的転送の効率が良くない。従って、ウィルス
エンベローブ（ｅｎｖ）及びｇａｇ前駆体ポリペプチド
のより容易な検出のために、ＦＩＶ細胞抽出物は、³⁵Ｓ
−メチオニン及びシステティンによって標識され、免疫
沈降（ＲＩＰＡ）によって試験された。ＦＩＶに感染さ
れた細胞の集密培養を、メチオニン及びシステティンを
含まないＤｕｌｂｅｃｃｏの修正イーグル培地中で３０
分間インキュベートした。この細胞培養を、１ｍｌ当り
１００マイクロキューリーの³⁵Ｓ−メチオニン及び³⁵Ｓ
−システティン（比活性１２００キューリー／ｍＭ，ニ
ューイングランドニュークレアコーポレーション，ボス
トン，ＭＡ）を含む同じ培地８ｍｌ中で４時間インキュ
ベートした。この放射活性を持つ組織養溶液を除去し、
細胞は、１００ｍＭのＮａＣｌ，１％のＴｒｉｔｏｎ−
Ｘ１００，０．５％のデオキシコール酸ナトリウム，
０．１％のＳＤＳ，０．１ｍＭフェニルメチルサルホニ
ルフロライド、及び１ｍｌあたり１００カリクレン非活
性化因子単位のアプロテインを（シグマケミカルカンパ
ニィー，セントルイス，ＭＯ）に含むｐＨ７．５の１０
ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液５ｍｌ中で溶解した。使用前
に、細胞溶解物は、１００, ０００×ｇ３０分の遠心処
理によって澄明化され、そのペレットは廃棄された。標
識された細胞溶解物の一部（０．１ｍｌ）と、テストさ
れる血清５μｌを、マイクロ遠心チューブの中で混合
し、３７℃で１時間、その後４℃で一晩インキュベート
した。翌日、１００ｍＭＮａＣｌ，１％Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ−１００及び０．１％ＳＤＳを含むｐＨ７．５の１
０ｍＭ燐酸緩衝液中のプロテインＡセファロースＣ
Ｌ−４Ｂビーズ（ファルマシア，ビスカットウェイ，
ＮＪ）の５％浮遊懸濁液０．２ｍｌを、各チューブに添
加し、３０分間４℃で混合し、プロテインＡセファ
ロースビーズに結合した抗体／抗原複合物は、遠心処
理（２分、２００００×ｇ）によって収集され、溶解用
の緩衝液中において３度洗浄された。最終的なペレット
を、再び２５μｌのＳＤＳ／ＰＡＧＥ装填バッファー
（緩衝液）中に浮遊させ、３分間１００℃に加熱した。
セファロースビーズは、遠心処理によって除去され、上
清は、ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）に
かけられた。ゲルはエンライトニング^TM（ニューイング
ランドニュークレアコーポレーション，ボストン，ＭＡ
の米国における登録商標）を用いて蛍光光度法のために
処理されて、コダックＸＲ−５フィルムに−７０℃にお
いて露出された。実験的に感染されたネコからの血清
は、ポリペプチド１５、２２、３６、４０、４７、１１
０及び１３０ｋＤを認識する。定量的及び定性的に幾分
の差があったものの、全てのネコがｐ２２，ｇｐ４０，
ｇｐ４７及びｇｐ１３０に対し反応を呈示するように見
える。

【００２６】ＲＩＰＡ−ＰＡＧＥ分析によって同定され
たポリペプチドのうち、どれが主要な内部構成蛋白質ｐ
２６に関連するかを決定するために、ＲＩＰＡ−ＰＡＧ
Ｅ分析は、ウェスタンブロットによって決定されるｐ２
６と反応するモノクローナル抗体を用いて行われた。こ
のモノクローナル（抗体）は、蛋白質ｐ４７、ｐ３６、
ｐ２２及びｐ１５を免疫沈降した。ＦＩＶのｐ２６モノ
クローナル抗体によって検出されない高分子量ポリペプ
チド（１３０ｋＤ）は、ＲＩＰＡ−ＰＡＧＡによって確
認された。分子量１００ｋＤの蛋白質もまた、何匹かの
感染したネコから得られた血清抗体を利用して検出する
ことが可能であった。

【００２７】他の例によれば、ＦＩＶの抗原性糖ペプチ
ドは、以下のようにして得ることができる。活発に成長
するＣＲＦＫＦＴＬＶ感染細胞は、ローラーボトルか
らかき取られ、燐酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）によって緩和
に洗浄され、ペレット化された。細胞ペレットは、緩衝
液１ｍｌに対し０．１ｍｌの細胞ペレットの比でｐＨ
７．２の、１０Ｍｍ燐酸ナトリウム中に静かに再懸濁さ
れた。この懸濁液は、氷上または冷蔵庫に５〜１０分間
インキュベートされ、３０秒間激しく旋回攪拌されてか
ら、１ＭのＰＭＳＦを含む４倍容量のＰＳＢが添加され
た。この混合物は、（ＰＴＡ２０ジェネレータを持つ）
ブリンクマンホモジェナイザーＰＴ１０／３５により９
０〜１２０秒間激しくホモジナイズされた。

【００２８】その結果得られたホモジエネートは、５０
００×ｇ、２０分間の遠心処理により澄明化された。上
清は捨てられ、細胞膜ペレットは、ＰＢＳ＋０．２％−
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００に緩衝液２．５ｍｌ：０．１
ｍｌ元の細胞ペレットの比で再度懸濁された。この混合
物は、再び、ＰＴＡ２０ジェネレータを持つブリンクマ
ンホモジナイザーＰＴ１０／３５により９０〜１２０秒
間激しくホモジナイズされた。得られたホモジエネート
は、１０００００×ｇ、１時間で澄明化され、上清を注
ぎ出して除去した後、ファルマシアレンチルレクチ
ンセファロース４Ｂ上に、樹脂６ｍｌに対し元の細
胞ペレット５ｍｌの比で一晩２０〜２３℃でバッチ結合
された。

【００２９】このレンチルレクチン懸濁液は、カラムに
注がれ、樹脂は収集され、１５カラム容量のＰＢＳ＋
０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００によって洗浄され
た。糖蛋白質は、樹脂を５〜１０カラム容量のＰＢＳ＋
０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００＋２００ｍＭメチル
α−Ｄマンノピラノシドで処理することによって樹
脂から溶出されて、１カラム容量／チューブの画分が採
取された。

【００３０】糖蛋白質の分離は、９％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
電気泳動により確認され、ＲＩＰＡデータと連繋して³⁵
Ｓ−放射線標識細胞調製物を用いチェックされた。

【００３１】宿主細胞の糖蛋白質からのウィルスの糖蛋
白質のさらなる精製は、ＨＰＬＣやアフィニティークロ
マトグラフィーのためのポリクローナルまたはモノクロ
ーナル抗体の利用を含む。

【００３２】例１：ｇａｇポリペプチドの精製分離されたウィルス（２５０〜５００μｌ）は、２容量
の６Ｍグアニジン塩酸、ｐＨ３（２０％トリフルオロ酢
酸水溶液で調製された）と混合された。この混合物は、
旋回混合され、３７℃〜４０℃の水槽で２０〜２５分間
インキュベートされた。インキュベートされた溶液は、
予め湿らせた（１００μｌの６Ｍグアニジン塩酸、ｐＨ
３で）０．４５ミクロゲルアクアディスクフィルター
（Ｎｏ．４１８４）によって瀘過され、フィルターは、
１００μｌの６Ｍグアジニン塩酸ｐＨ３によって洗浄さ
れた。瀘過されたサンプルは、精製のためにＨＰＬＣカ
ラムにかけられた。

【００３３】このＨＰＬＣ系は、３つの１１０Ｖのポン
プを持つベックマンＨＰＬＣ、４２１コントローラ、１
６６可変波長検出器、４２７インテクレータ、ダイナミ
ックミキサを持つ２１０Ａインジェクタ、及び１０００
μｌサンプルから構成された。カラムは、変形流入口接
続管（ウォータースマイクロボンド−Ａ−パックフェ
ナイル１０ＭＵ８ｍｍ×１０ｃｍカートリッ
ジＮｏ．８５７２２及びガードパックリゾルブＣＮ
カートリッジＮｏ．８５８２６）を有するＲＣＭ−１０
０カラムホルダー中に保持されたウォータースラジア
ルコンプレッションカートリッジである。この系
は、２つのレバーを押して、圧力が中間黄色ゾーンにあ
るようにセットされた。

【００３４】精製は、０．１％トリフルオロ酢酸（ｖ／
ｖ溶媒Ａ）から０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセト
ニトロール（ｖ／ｖ溶媒Ｂ）の多段階密度勾配によっ
た。

【００３５】画分を集めて、サバントスピードバッ
ク（ｓａｖａｎｔｓｐｅｅｄｖａｃ）により濃縮さ
れ、最終容量が５０〜１００μｌとなるまで溶媒が除去
された。濃縮された画分は、２００〜３００μｌｐＨ
７．２の５０ｍＭまたは１００ｍＭの燐酸ナトリウム緩
衝液の添加によって中和とされた。緩衝された画分のｐ
Ｈは、ｐＨ試験紙によってチェックされ、もし、ｐＨが
まだ６以下であったならば、一規定ＮａＯＨを添加し、
ｐＨを６．５〜７．５の範囲に合わせた。中和された画
分は、使用するまで−２０℃で冷凍された。

【００３６】図３に上述のＨＰＬＣカラムからのプリン
トアウトを示す。

【００３７】溶媒Ａの１００％からスタートし、流速は
１ｍｌ／分であった。１５分後、溶媒は、２６％溶媒Ｂ
を含むものに変更され、１０分後３１％溶媒Ｂ、１２分
後３７．５％溶媒Ｂ、５分後４０％溶媒Ｂ、６分後４３
％溶媒Ｂ、８分後４５％溶媒Ｂ、１５分後６０％、そし
て２０分後１００％溶媒Ｂに変更された。ｐ１０、ｐ１
５、ｐ２６に対応するピークは、図３に示されている。
これらのピークを含む画分が収集された。

【００３８】図４に示すように、ｐ１０、ｐ１５及びｐ
２６に対応する画分は、１５％ビス−アクリルアミドを
含むＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで７０Ｖにおい
て泳動された。このゲルは、ＢｉｏｒａｄＳｉｌｖｅ
ｒＳｔａｉｎｉｎｇＫｉｔ１６１−０４４３を用
いて銀で染色された。ｐ１５、ｐ１０及びｐ２６に対応
する分離された画分は、ＦＩＶポリペプチドの本質的に
均等な溶液であった。

【００３９】分離されたＦＩＶポリペプチドはアミノ酸
配列のための標準的な手法によって分析され、その結果
を次に示す（ここにおいて、「？」は、実際のアミノ酸
が明確でないこと、またはこれについての情報が得られ
なかったことを示す）。

【００４０】ｐ２６番号 1-2-3-4-5-6-7-8-9-10-11-12-13-14-15-16-17-18-19-20 アミノ酸 P-I-Q-T-V-N-G-V-P-Q-Y-V-A-L-D-P-K-M-V-S p10 番号 1-2-3-4-5-6-7-8-9-10-11-12-13-14-15-16-17-18-19- アミノ酸 V-Q-S-R-G-S-G-P-V-C-F-N-C-K-K-P-G-H-L- 番号 20-21-22-23-24 アミノ酸 A-R-Q-S-H p15 番号 0-1-2-3-4-5-6-7-8-9-10-11-12-13 アミノ酸 S-V-Q-S-R-G-Q-G-P-V-A-F-N-? 精製されたポリペプチドがこの発明において有用である
か否か、すなわちこのポリペプチドが抗原性であるか否
かを決定するためには、どのような標準的な手法をも利
用することができる。例えば、ポリペプチドが交差反応
性であるか否かを決定するためにネコの血清からのポリ
クローナル抗体を用いてＥＬＩＳＡテストを行うことが
できる。また、ポリペプチドは、アジュバントと共に、
または伴わずに動物、例えばマウスに注射して、それに
対する抗体が形成されるか否かを見ることができる。こ
れらポリペプチドは、ネコにおけるＦＩＶが原因である
病気の防止とＦＩＶの感染を防止するためのワクチンの
製造に有用である。これらのワクチンは、標準の方法で
製造される。好適には、ｇａｇまたはｅｎｖポリペプチ
ドは、標準的な接種培地で提供され、これが静脈内、動
脈内、またはその他の方法によってネコに、１〜１００
μｇ／ｋｇ−動物の用量で、３〜４週の間隔で注射さ
れ、ＦＩＶに対する免疫が生成されるまで続けられる。

【００４１】ＦＩＶモノクローナル抗体ＦＩＶポリペプチドの抗体は、上述の如く精製されたポ
リペプチドの確認に役立ち、ポリペプチドの精製の有用
な助けとなる。またこの抗体は、いかなるポリペプチド
であれ、その抗原性の決定のためにも役立つ。有用な抗
体の調製の一例は以下の通りである。このような抗体
は、個々のまたは少数のＦＩＶポリペプチドの検出及び
精製を可能とするモノクローナル抗体である。

【００４２】Ｂａｌｂ／ＣＪ（ＪａｃｋｓｏｎＬａｂ
ｓ）マウスを、（上述のようにして調製された）Ｄｉｆ
ｃｏＢａｃｔｏアジュバントと１：１で混合されたＦ
ＩＶウィルスをマウス１匹あたり５０μｇの初期注射に
よって免疫した。なお、２週間後、それぞれのマウスに
アジュバントを伴わずに１００μｇのＦＩＶウィルスが
静注された。この促進剤注射の３日後、マウス骨髄腫細
胞ラインＦＯまたはｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３との細
胞融合が行われた。中間対激期の骨髄腫系は、細胞融合
の日に採取され、生存力がチェックされた。細胞は、３
００×ｇ８分間の遠心処理によって生長用培地から分離
され、血清を含まないＤＭＥ中に再度懸濁された。

【００４３】細胞融合のために、ＦＩＶを接種されたマ
ウスは、首の脱臼によって殺されて、脾臓が無菌的に取
出された。脾臓は、リンパ液を含んでいないＤＭＥ中で
３度洗浄され、２０ｍｌの完全培地（ＤＭＥは、２０％
の仔牛血清、１ｍｌ当り１００単位のペニシリン及びス
トレプトマイシン及び、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム
を含む）を入れた無菌ペトリ皿に入れられた。細胞を遊
離するために、脾臓は２３ゲージの注射針を用いて灌流
された。

【００４４】細胞は、５０ｍｌの円錐型遠心管内に置か
れ、３００×ｇ８分間でペレット化された。ペレット
は、０．１７Ｍの塩化アンモニウム５ｍｌ中に再度懸濁
され、氷上に８分間置かれた。これに５ｍｌのウシ胎児
血清（２０％）を添加し、細胞は、３００×ｇで８分間
の遠心処理によりもう一度ペレット化された。１０ｍｌ
のＤＭＥ中に再度懸濁された後、細胞はカウントされ、
脾臓及び骨髄腫細胞は、３：１の比率で混合された。細
胞混合物は、２００×ｇ１０分間の遠心処理によりペレ
ット化され、上澄は傾けて除かれ、ペレットは５分間放
置された。そして、１分間にわたって１ｍｌの５０％Ｐ
ＥＧ（ＰＥＧ１５００が１：１の割合でＨｅｐｅｓ、ｐ
Ｈ８．１と混合されたもの）が３７℃で添加された。３
７℃で１分間インキュベートした後、もう一度、１ｍｌ
の血清を含まないＤＭＥが１分間にわたって添加され
た。最後に、１０ｍｌのＤＭＥが、２分間にわたって添
加され、細胞は、２００×ｇ８分間でペレット化され、
ペレットは０．０１６ｍＭチミジン、０．１ｍＭヒ
ポキサンテン、０．５μｍｏｌのアミノプテリン及び１
０％ハイブリドーマクローニング因子（１×ＨＡＴ）を
含む完全培地中に再度懸濁された。この細胞は、９６−
ウェル−プレート中に置かれた。

【００４５】３、５、７日後、細胞融合プレート中の培
地の半分が除去され、新鮮な１ｘＨＡＴ培地で取り替
られた。１１日後、ハイブリドーマ細胞上清は、ＥＬＩ
ＳＡテストによってスクリーンされた。このテストにお
いて、９６−ウェルプレートは、標準的手法によってＦ
ＩＶウィルスによってコートされた。各ウェルの１００
μｌの上清は、スクリーニングプレート上の対応するウ
ェルに添加され、２０〜２２℃に１時間インキュベート
された。インキュベート後、それぞれのウェルは、蒸留
水によって３度洗浄され、ヤギの抗マウスＩｇＧ
（Ｈ＋Ｌ）、Ａ，Ｍ（１：１５００希釈）のホースラ
ディッシュペルオキシダーゼ複合体１００μｌが各ウェ
ルに添加され、２０〜２２℃で１時間インキュベートさ
れた。蒸留水で３回洗浄後、基質ＯＰＤ／過酸化水素水
が添加され、５〜１５分間インキュベートされた。１０
０μｌの停止溶液（１Ｍ塩酸）が添加され、４９０ｎｍ
における吸光度が測定された。光学的濃度の読取り値が
対照のウェルより大きな培養体は２ｃｍ²の培養皿へ移
され、ここに１ｘＨＡＴ培地中の正常マウス脾臓細
胞が添加された。さらに３日後、この２ｃｍ²の全ての
培養体は、抗体に対してもう１度スクリーンされ、これ
らの試験により再び陽性であるものは限定稀釈によって
クローン化された。各２ｃｍ²培養における細胞は、カ
ウントされ、１ｍｌ当り１×１０⁵細胞濃度となるよう
に調整された。細胞は、完全培地により稀釈され、ハイ
ブリドーマ細胞の５．１０及び５０個を１ｍｌに含む濃
度の正常マウス脾臓細胞がこれに添加された。細胞は各
希釈に対する９６−ウェルプレートにプレートされた。
１０日後、クローニングプレートは、細胞生長について
スクリーニングされた。すべてのウェルのほぼ３７％は
生長を示していた。正の生長を示したウェルは、抗体に
ついてスクリーンされ、検査の結果正であったウェル
は、２ｃｍ²培地に拡げられ、正常マウス脾臓細胞が加
えられた。クローニング手順は、安定した抗体生成ハイ
ブリドーマが得られるまで２回繰り返された。ここにお
いて、細胞培養は、２→９→７５→１５０ｃｍ²培養容
器に順次拡大され、この時点で腹水の生成を始めること
ができた。

【００４６】腹水の生成のため、プリスタンで刺激した
ＩＲＣＦｌｓマウスが用いられた。０．５ｍｌのプリス
タンが、それぞれのマウスの腹腔（ＩＰ）内に注射さ
れ、マウスは、１０〜６０日休まされた。この時点で、
４．５×１０⁶細胞がそれぞれのマウスの腹腔中に接種
され、腹水は７〜１４日の間形成された。腹水は、腹膜
の穴を介しパスツールピペットによって採取された。

【００４７】糖蛋白質に対する抗体も同様に分離及び検
出可能である。特に、分子量４０ｋＤ（ｇｐ４０）及び
１３０ｋＤ（ｇｐ１３０）の２つの糖蛋白質に対する抗
体はそれぞれＰＡＧＥ及びＲＩＰＡを用いて検出され
る。

【００４８】ＦＩＶの特異的ポリペプチドの精製及び同
定のために本発明において有用なモノクローナル抗体に
は、ＦＩＶに対し特異的で、充分強い相互作用をＦＩＶ
抗原決定基及びＦＩＶ抗原との間に持ち、免疫試験、例
えばＥＬＩＳＡによるＦＩＶ抗原の検出に有用であるも
のを含む。上述のモノクローナル抗体の内どれが有用で
あるかを決定するために、１つの主要なテストが利用さ
れた。これは、当該モノクローナル抗体がＦＩＶ抗原と
結合し、ＦＩＶに対するポリクローナル抗体の複合体に
よって検出できるか否かの決定が必要である（上述のＥ
ＬＩＳＡテスト）。

【００４９】さらに他のテストは、モノクローナル抗体
が１つあるいはそれ以上のＦＩＶ抗原に対し良好な反応
性を有するか否かを決定するためにウェスタンブロット
を実施することである。一般的に、反応性の弱い、すな
わち、ウェスタンブロット上に弱いバンドを生成するモ
ノクローナル（抗体）は、この発明には適さない。さら
に他のテストは、放射線免疫沈降試験（ＲＩＰＡ）を含
み、ここで³⁵Ｓ−メチオニンによって標識されたＦＩＶ
ウィルスがモノクローナル抗体と反応して免疫沈降物を
形成し、この免疫沈降物はＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけら
れ、標識された蛋白質を検出するためにオートラジオグ
ラフされる。この分析は、どのモノクローナル抗体が前
駆体ＦＩＶ抗原ポリペプチドを検出し、単に成熟したポ
リペプチドのみを検出できるのではないことを決定する
ことができる。

【００５０】抗体検出上述の抗原性ポリペプチドはネコによって生成される自
然発生抗体を検出するのに利用できる。このような検出
は、例えば、上述のようにＥＬＩＳＡテストによる標準
的なイムノアッセイ手法により行える。このようなテス
トの一例を下に示す。この例は、本発明に限定されるも
のではなく、当業者は他の多くの標準的な手法を用い得
ることを認識するであろう。

【００５１】例２：抗体試験この試験を実施するために必要なものとして、適当な検
査抗原（例えばｐ２６、ｐ１５またはｐ１０）を含む溶
液によってコートされた９６ウェルの平底マイクロタイ
ターストリップが含まれる。検査用ウェルは、ｐＨ７．
５の０．２５モルクエン酸ナトリウム中に０．１５μｇ
の抗原を含む溶液１００μｌでコートされた。ウェルは
パラフィルムによってカバーされ、４℃で１晩インキュ
ベートし、液を流し出して乾燥した。抗体は、その後
０．２５モルクエン酸ナトリウム中の１％ＢＳＡ２００
μｌの添加によってさらにコートされ、室温（２０〜２
５℃）で１時間インキュベートされた後、液を流し出し
てウェルを乾燥した。次いで、０．２５モルクエン酸ナ
トリウム中の７．５％ショ糖２００μｌを、それぞれの
ウェルに添加し、室温に３０分間インキュベートした。
この結果得られたストリップは、すぐに使われるかまた
は減圧下室温で６時間乾燥した後、使用された。

【００５２】試験は、（陽性対照、陰性対照または被検
血清）、０．１％ウシ血清アルブミン、３０％仔ウシ血
清、及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（シグマケミカ
ル、セントルイス、ＭＯ）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏのＰ
ＢＳ中に１：１００に稀釈されたネコの血清サンプル１
００μｌをウェルに加え、室温において３０分間インキ
ュベートし、液を流し出してウェルを乾燥することによ
って行われる。ウェルは、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０
を含むＤｕｌｂｅｃｃｏのＰＢＳによって即座に２度洗
浄され、この２度目の洗浄の後、液を流し出してウェル
が乾燥された。

【００５３】次に、ネコの免疫グロブリンに対する抗体
を含む１００μｌの溶液を添加した。これらの抗体はイ
ンジケータ酵素（例えばアルカリ性ホスファターゼ）と
結合され、５０％子牛胎児血清と、０．０５％Ｔｗｅｅ
ｎ−２０を含むｐＨ７．６の０．０５ＭＴｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ中に溶解された。このウェルは室温で３０分間イン
キュベート後、液を流し出して乾燥され、０．０５％Ｔ
ｗｅｅｎ−２０を含むＤｕｌｂｅｃｃｏのＰＢＳによっ
て２度洗浄された。

【００５４】４０％グリセロール及び５０％メタノール
中に０．１％の３，３´，５，５´テトラメチルベンジ
ジンを含む溶液が、１ｌ中に２２．８２ｇのリン酸二カ
リウム、１９．２ｇのクエン酸、及び１．３４ｍｌの３
０％過酸化水素水を含む溶液と等量混合された。この溶
液の１００ｍｌが各ウェルに添加され、室温で１５分間
インキュベートされた。このインキュベーション期間の
終了時に、０．２５％のフッ酸の１００μｌを各ウェル
に添加した。そして、マイクロタイタープレートリーダ
により各ウェル内溶液の６５０ｎｍ波長の吸光度を測定
した。ｐ１０、ｐ１５及びｐ２６に対する免疫応答は、
ＦＩＶによるネコの実験的感染後や、あるいはＦＩＶに
対する抗体を持つネコの血清中で検出可能であった。

【００５５】ＦＩＶ核酸ＦＩＶ核酸は、ＦＩＶポリペプチドあるいはその切片の
大量の生産、及び標準の技法を用いたインビボにおける
相同性核酸の検出にも有用である。次に、ＦＩＶウィル
スのＤＮＡに対するクローニングの例について説明す
る。ここで、選択された特異なＦＩＶ株は、この発明に
限定されるものではなく、当業者は、特定の寄託物とし
て提供されるクローン化された配列の使用により、ある
いは、本例に記載されているのと同様の手法によって同
等な核酸が分離できることを認識するであろう。

【００５６】（抗体）生産の目的でＦＩＶの２４２８株
（Ｐｅｎｔａｌｕｍａ分離株）に感染されたクランデル
腎臓細胞系が、組み込まれていないウィルスＤＮＡの原
料として使用された。この組み込まれていないウィルス
ＤＮＡは、ヒート抽出（Ｈｉｒｔｅｘｔｒａｃｔｉｏ
ｎ）及びＣｓＣｌ−エチジウムブロミド遠心処理により
調製され、鎖状でスーパーコイルのウィルスＤＮＡに分
離された（Ｈｉｒｔ，２６ＪＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．
２６巻, ３６５，１９６７；Ｃａｎａａｎｉ他，Ｎａ
ｔｕｒｅ２８２巻, ３７８，１９７９）。

【００５７】このスーパーコイルウィルスＤＮＡがオー
バーラップするウィルスＤＮＡ配列を含むライブラリィ
を構築するのに用いられた。このようなライブラリィを
構築する手法は、Ｍａｎｉａｔｉｓ他の、Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭ
ａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ
Ｌａｂ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．
Ｙ及びＧｌｏｖｅｒ，ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏ
ｌ．１，ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，
ＩＲＬＰｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ）に
記載された方法と同様であり、当業者によく知られてい
るものである。

【００５８】２つの限定エンドヌクレアーゼの一つによ
るスーパーコイルウィルスＤＮＡの開裂によって２つの
ウィルスＤＮＡライブラリィが生成された。スーパーコ
イルウィルスＤＮＡの限定エンドヌクレアーゼＲｓａＩ
による部分的な開裂（これは、ＤＮＡ配列５´ＧＴＡＣ
３´を認識する）、または限定エンドヌクレアーゼＨａ
ｅIII による開裂（これはＤＮＡ配列５´ＧＧＣＣ３´
を認識する）によって、配列がオーバーラップしている
２セットの平滑末端ＤＮＡ分子を生成する。この平滑末
端ＤＮＡ分子は製造元の指針に従ってＥｃｏＲＩメチ
ラーゼによって処理され、ＥｃｏＲＩ認識配列５´−Ｇ
ＡＡＴＣＣ−３´の３´アデニン残基が修飾された。こ
の部位のメチル化は、処理されたＤＮＡの限定エンドヌ
クレアーゼＥｃｏＲＩによる開裂を阻害する。メチル化
されたＤＮＡ分子は、限定エンドヌクレアーゼＥｃｏＲ
Ｉに対する開裂部位を持つリンカーＤＮＡ分子と結合さ
れた。このリンカーを含むＤＮＡ分子は、限定エンドヌ
クレアーゼＥｃｏＲＩにより処理されて、次の分子を生
成するためにその終端が、組替えＤＮＡファージベクタ
λＺＡＰ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，
カリフォルニア）におけるＥｃｏＲＩクローニング部位
と適合する分子を生成した。この開裂によって得られた
リンカーの切片は、クィックスピンカラム（Ｂｏｅｈｒ
ｉｎｇｅｒ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌ
ｉｓ，ＩＮ）上でのサイズ分離によって大きなＤＮＡ分
子から分離された。ＤＮＡ分子は、次いで、ＥｃｏＲＩ
で開裂されたλ ＺＡＰベクター中にＴ４ＤＮＡリ
ガーゼ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｂ
ｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を用いて結合された。結合された
ＤＮＡ分子は、ギガパックゴールド（Ｓｔｒａｔａｇｅ
ｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，カリフォルニア）を用いてフ
ァージ中に詰め込まれた。この詰め込み反応から得られ
た生存力のあるファージは、組替えλＺＡＰクローンの
ストックを得るために、ＢＢ４細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅ
ｎｅ）を感染させ、及びこれら感染された細胞のプレー
ト溶解産物を採取することにより増幅された。

【００５９】組替えλＺＡＰクローンの挿入ＤＮＡは宿
主細胞のＤＮＡ並びにＦＩＶプロウィルスのＤＮＡ配列
を含むため、容易に検出可能な標識を持つＦＩＶＤＮＡ
プローブによりそれぞれのライブラリィをスクリーンす
ることが必要である。このようなプローブは、ＦＩＶか
ら分離されたＲＮＡから製造される。放射活性を持つ相
補的ＤＮＡはウィルスＲＮＡから本質的には上記のＭａ
ｎｉａｔｉｓ他１９８２に記載のようにして合成され
た。ただし、ポリＡを含むＲＮＡの選別は行われず、メ
チマーキュリックハイドロオキサイドはプロトコルから
除かれた。

【００６０】バクテリオファージライブラリィは、１５
０ｍｍの皿１つ当たり１００００個のバクテリオファー
ジの密度でプレートされた。これらは、放射標識された
プローブとニトロセルロースフィルタ（Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ他１９８９，上述と同様）上に固定されたファージＤ
ＮＡとのハイブリッド形成によってスクリーンされた。
それぞれのハイブリッドを形成しているバクテリオファ
ージのプラークを採取し、再プレートして、１つのλＺ
ＡＰ組替えクローンを含む１個のウェルが分離されるま
で上述と同様にハイブリッド形成を行った。次いで、Ｘ
Ｌ−１−Ｂｌｕｅ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を、組
替えλＺＡＰファージに感染させ、挿入ＤＮＡを含むプ
ラスミドは、製造者の指針（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌ
ａＪｏｌｌａ，カリフォルニア）に従い、Ｒ４０８ヘ
ルパーファージによる重感染により得られた。この手法
は、組替えプラスミド（これは細胞から分離可能であ
る）及び一本鎖のＤＮＡ配列分析のために培地から分離
することができるファージストックも供給する。

【００６１】上述の組替えプラスミドは、下記のよう
に、これらのプラスミドを複製するバクテリヤの１晩の
培養からプラスミドＤＮＡ調製することにより、挿入部
について分析された。１晩の培養物１．５ｍｌをマイク
ロ遠心チューブ内に入れ、４０００Ｇで４分間遠心し
た。上澄は除去され、チューブは再度４０００Ｇで４分
間遠心された。上澄はまた除去され、チューブは数秒間
遠心され、残留した液体を注意深くパスツールピペット
で除いた。バクテリアのペレットは、８％のショ糖、５
０ｍｍのＥＤＴＡ、５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００及
び５０ＭＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．０５）を含む
溶液２００μｌ中に再懸濁された。ｐＨ８．０の１０ｍ
ＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ中に１０ｍｇ／ｍｌの濃度のリゾ
チームと、１μＭのＥＤＴＡを含む溶液２０μｌが添加
され、混合されて、この混合物は、４℃に１５分間イン
キュベートされた。このバクテリヤを含む溶液は、９０
秒間沸騰水の槽中に置かれた。この混合物は氷上で冷さ
れ、マイクロフュージ中で氷冷下１１０００×ｇで１０
分間遠心された。ペレットはガラスピペットを用いて注
意深く取出された。氷で冷されたイソプロパノール（２
００μｌ）が添加され、溶液は十分に混合され、−２０
℃に５分間インキュベートされた。冷された溶液は、−
２０℃、１１０００×ｇで１０分間遠心処理され、プラ
スミドＤＮＡをペレット化した。上澄は、注意深く除去
され、ペレット化されたＤＮＡは部分的に空気乾燥され
た。このＤＮＡペレットは、１００μｌの無菌の２回蒸
留水に溶解された。このようにして分離されたプラスミ
ドＤＮＡは、限定エンドヌクレアーゼ開裂及び、０．８
％アガロースゲル中における電気泳動（Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ他１９８２、上述）によって挿入部について分析され
た。

【００６２】標準の２デオキシ配列分析は、組替えＤＮ
Ａを含むクローンについて行われた。一本鎖ファージは
ブルースクリプトプラスミドを含む細胞の増殖に使用さ
れた培地から、Ｍ１３ダイデオキシシーケンシング
マニュアル、ベセスダリサーチラボラトリーズ（Ｇａｉ
ｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，メリーランド）出版物に一般的に
記載されている方法を用いて分離された。いくつかのク
ローンは、この方法により配列決定され分析された。１
０ＣＸ、２ＢＹ、Ｒ５Ｘと呼ばれるクローンについての
配列情報は、それぞれのクローンについての推定的に翻
訳されたアミノ酸配列と並べて、図５、６、７に示され
ている。これらのアミノ酸配列は、次のようなアミノ酸
配列に対し相同性を示す。すなわち、免疫的にＦＩＶに
関連の近いレンチウィルスの１つであるウマの感染性貧
血ウィルスのエンベロープ遺伝子に対するアミノ酸配列
に相同性を示す。

【００６３】２ＢＹＤＮＡ配列から得られた核酸プロ
ーブは、ＦＩＶに感染されている細胞から分離されたＤ
ＮＡとハイブリッドを形成するが、未感染の細胞からの
ＤＮＡとはハイブリッドを形成しない。これらのプロー
ブは、他の株からの他のＦＩＶ遺伝子を分離するために
も利用することができ、また、上述の精製ポリペプチド
を提供するための標準的な手法によって発現することも
できる。

【００６４】寄託ストレイン１０ＣＸ、２Ｂ４及びＲ５Ｘは、ＡＴＣＣに
寄託され、それぞれ、６７９３７、６７９３８及び６７
９３９という番号を割り当てられている。出願人及びそ
の指定代理人は、申請書に基づいて発行される特許の権
利期間が終了する前に、これらの培養がもし、万一死絶
した場合には、最終の要求後５年間または３０年間、い
ずれか長い方の期間、これをもう一度提供する責任のあ
ること、及びこのような特許の発行の供託場所について
知らせる責任のあることを確認するもので、この時期
に、寄託は最終的に公共に利用可能となる。これまでの
期間は、寄託は、３７ＣＦＲ１〜１４条及び３５ＵＳＣ
１１２条の規定により特許庁長官に対して寄託が利用可
能である。

【図面の簡単な説明】

【図１】Ｒ２５０（レーンＡ）において、染色された
ＦＩＶの主要なウィルス関連蛋白質のポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）パターンを示す写真であ
る。

【図２】ＦＩＶ抗体に対するＥＬＩＳＡ試験によって
陽性と確認されたネコの血清中で発見されたＦＩＶ抗体
のウェスタン免疫ブロット分析の結果を示す写真であ
る。

【図３】ＨＰＬＣ精製におけるＦＩＶポリペプチドの
溶出パターンを示すグラフ図である。

【図４】ＳＤＳポリアクリルアミドを用いた電気泳動
後、銀染色を行った結果を示し、種々のＦＩＶポリペプ
チドの純度を示す写真である。

【図５】クローン化されたＦＩＶ核酸の色々な部位に
おける核酸配列及びこれに対応するアミノ酸配列を示す
図である。

【図６】クローン化されたＦＩＶ核酸の色々な部位に
おける核酸配列及びこれに対応するアミノ酸配列を示す
図である。

【図７】クローン化されたＦＩＶ核酸の色々な部位に
おける核酸配列及びこれに対応するアミノ酸配列を示す
図である。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成１１年１２月２８日（１９９９．１２．
２８）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＣ (72)発明者オコーナートーマスピーアメリカ合衆国メイン州 04092 ウェストブルークサミットサークル 52 (72)発明者トネリクエンチンジェイアメリカ合衆国メイン州 04103 ポートランドウェリントンロード 37

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ＦＩＶに対する抗体を検出する方法にお
いて、精製されたＦＩＶポリペプチドを準備する工程と、前記ＦＩＶポリペプチドを試料と接触させる工程と、前記ポリペプチドと前記試料中に含まれる抗体との間で
形成された複合体の存在を検出する工程と、を含み、前記ＦＩＶポリペプチドが、ｇｐ４０、ｇｐ１００また
はｇｐ１３０であることを特徴とするＦＩＶ抗体検出方
法。
【請求項２】ＦＩＶに対する抗体を検出する方法にお
いて、精製されたＦＩＶポリペプチドを準備する工程と、前記精製されたＦＩＶポリペプチドを試料と接触させる
工程と、前記ポリペプチドと前記試料中に含まれる抗体との間で
形成された複合体の存在を検出する工程と、を含み、前記精製されたＦＩＶポリペプチドが、モノクローナル
抗体２Ｆ１１に結合し得るポリペプチドであることを特
徴とするＦＩＶ抗体検出方法。
【請求項３】前記モノクローナル抗体２Ｆ１１に結合
し得るペプチドがｇｐ４０であることを特徴とする請求
項２に記載のＦＩＶ抗体検出方法。
【請求項４】ＦＩＶに対する抗体と結合し得る単離ポ
リペプチドであって、前記ポリペプチドが、ｐ１０、ｐ１５、２６、ｇｐ４
０、ｇｐ１００又はｇｐ１３０のいずれかであることを
特徴とする単離ポリペプチド。
【請求項５】ＦＩＶに対する抗体と結合し得る単離ポ
リペプチドであって、前記ＦＩＶに対する抗体が、モノクローナル抗体２Ｆ１
１であることを特徴とする単離ポリペプチド。
【請求項６】前記単離ペプチドが、ｇｐ４０であるこ
とを特徴とする請求項５に記載の単離ポリペプチド。
【請求項７】請求項１〜３のいずれかに記載の方法に
基づいてＦＩＶ抗体を検出するための検出キットであっ
て、精製されたＦＩＶポリペプチドと、前記精製されたＦＩ
Ｖポリペプチドと試料中の抗体との間で形成される複合
体を検出するための検出試薬とを含むＦＩＶ抗体検出キ
ット。