JP2958346B2 - 抗ＨＩＶ―２モノクローナル抗体およびそれを用いた抗ＨＩＶ―２ｇｐ４１抗体の検出方法 - Google Patents

抗ＨＩＶ―２モノクローナル抗体およびそれを用いた抗ＨＩＶ―２ｇｐ４１抗体の検出方法

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Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、後天性免疫不全症候群（AIDS）の病因であ
るHIV（ヒト免疫不全ウイルス）に対する暴露の検出に
関する。さらに詳しくは、本発明は、マウスモノクロー
ナル抗体H37c97、HIV−2 gp41内のそのエピトープに関
し、これらは、HIV−１ウイルスに暴露した患者からHIV
−２ウイルスに暴露した患者を識別するのに用いるため
のイムノアッセイの基礎を提供する。
（従来の技術および発明が解決しようとする課題） 幾つかのHIV単離物についてプロウイルスゲノムのヌ
クレオチド配列が決定されている。それらHIV単離物と
しては、HIV−１株であるHTLN−III［ラットナー（Ratn
er）ら、Nature（1985）313:277］;ARV−２［サンチェ
ス−ペスカドール（Sanchez−Pescador）ら、Science
（1985）227:484］;LAV［ウエイン−ホブソン（Wain−H
obson）ら、Cell（1985）40:9］；およびCDC−451［デ
サイ（Desai）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1986）83:
8380］が挙げられる。HIV−2 ROD単離物のヌクレオチド
配列は、ガイアダー（Guyader）らによって報告されて
いる［Nature（1987）326:662］。HIV−2 NIHZ単離物
は、ツァガリー（Zagury）らによって報告されている
［PNAS（1988）85:5941〜5945］。さらに別のHIV配列が
マイヤーズ（Meyers）らにより見出されている［ヒュー
マン・レトロバイラスイズ・アンド・AIDS（Human Retr
oviruses and AIDS）1988、ア・コンピレーション・ア
ンド・アナリシス・オブ・ニュークレイック・アシッド
・アンド・アミノ・アシッド・シークエンシイズ（A Co
mpilation and Analysis of Nucleic Acid and Amino A
cid Sequences）（ロスアラモス・ナショナル・ラボラ
トリー（Los Alamos National Laboratory）、ロスアラ
モス、NM）］。
HIV−１感染の検出のために重要な血清学的標的の一
つに、膜透過性タンパク質（TMP）であるgr41がある。
このタンパク質に対する抗体は血清変換に際して最初に
出現するものの一つであり、抗gr41抗体がAIDSの無症候
および他の臨床段階においてほぼ全般的に存在すること
から明示されるように、gr41に対する免疫応答は該疾患
の進行を通じて比較的強く保持されているものと思われ
る。該タンパク質に対する抗体応答の大部分は、よく特
徴付けられた免疫優性（immunodominant）領域に向けら
れており［チャング（Chang）ら、Bio/Technology（198
5）3:905〜909］、アミノ酸578〜613として大まかに定
められている（番号付けはHXB2単離物についてマイヤー
ズらによる）。重要な免疫原配列を形成するものとして
免疫優性領域内の特定の小さな配列が同定されてきてい
る。そのような配列の例としては、RILAVERYLKDQQLLGIW
GCS（ペプチドの免疫原性を保持するのにarg−１、ile
−２およびlys−10がそれぞれ重要な役割を担ってい
る）［ワング（Wang）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA（19
86）83:6159〜6163］、LGLWGCSGKLIC（ペプチドの免疫
原性を保持するのに両cys残基が重要な役割を担ってい
ると思われる）［グナン（Gnann）ら、J.Virology（198
7）61:2639〜2641］およびSGKLICTTAVPWNAS（天然ウイ
ルスでは隠されているが疾患の進行の間は暴露され免疫
原性となるエピトープからなる）［ナーバネン（Narvan
en）ら、AIDS（1988）2:119〜123］が挙げられる。配列
GIWGCSGKLICをマッピングするヒトモノクローナル抗体
が産生されており、この配列が免疫原としての中心的な
役割を担っていることがさらに支持された［バナポー
（Banapour）ら、J.Immunol.（1987）139:4027〜403
3］。
gp41の他の領域は、免疫応答を引き起こす上で役割を
担っているとしても二次的な役割しか担っていないと思
われ［グナンら、J.Infect.Diseases（1987）156:261〜
267;およびウインドホイザー（Windheuser）およびウッ
ド（Wood）、Gene（1988）64:107〜119］、診断上有用
なものとしては同定されていない。
HIV−２の免疫優性エピトープ（本明細書では、以
下、「HIV−2 gp41」という）に関してははるかに知ら
れておらず、この分野の研究は、HIV−１に対する暴露
からHIV−２に対する暴露を識別するための血清学的標
的として該タンパク質の免疫優性領域を使用することに
主として向けられている。グナンら［Science（1987）2
37:1346〜1349］は、HIV−２に対する抗体を検出しこれ
をHIV−１に対する抗体から識別するために、合成ペプ
チドNSWGCAFRQVC中にHIV−2 ROD免疫優性領域の一部を
用いた。加えて、コット（Cot）ら［AIDS Research and
Human Retroviruses（1988）4:239〜241］もまた、HIV
−1 gp41に対するヒト抗体からHIV−2 gp41に対するヒ
ト抗体を識別するために免疫優性領域ペプチドを用い
た。用いたHIV−２ペプチドは、配列RVTAIEKYLQDQARLNS
WGCAFRQVCであった。両研究において、利用した領域は
第二のシステイン残基で終わっていた。両研究において
も、また他のいかなる報告にも、HIV−２配列HTTVPWが
血清学的標的として、またはモノクローナル抗体の抗原
として診断的価値を有することは示されていない。
（課題を解決するための手段） 本発明の目的は、アミノ酸配列HTTVPWを実質的に有す
るHIV−2 gp41上のエピトープに対する特異性を特徴と
するモノクローナル抗体； 上記モノクローナル抗体を産生する哺乳動物抗体産生
細胞株； マウス由来ハイブリドーマ細胞株ATCC HB10012; ハイブリドーマ細胞株ATCC HB10012により産生された
モノクローナル抗体； 患者のHIV−１に対する暴露からHIV−２に対する暴露
を識別する方法であって、 （ｉ）該患者からの生物学的試料を、実質的にHIV−２
のアミノ酸578からアミノ酸603の領域からなるアミノ酸
配列に結合した、アミノ酸配列HTTVPWを実質的に有する
エピトープを含む抗原、および該エピトープに特異的な
抗体と接触させて抗原抗体複合体を生成させ、ついで （ii）生成した該複合体の量を測定してHIV−２に対す
る暴露を決定する ことを特徴とする方法；および 生物学的試料中のHIV−2 gp41に対する抗体の存在ま
たは量を検出する方法であって、 （ｉ）該試料を、実質的にHIV−２のアミノ酸578からア
ミノ酸603の領域からなるアミノ酸配列に結合した、ア
ミノ酸配列HTTVPWを実質的に有するエピトープを含む抗
原、および該エピトープに特異的な抗体と接触させて抗
原抗体複合体を生成させ、ついで （ii）生成した該複合体の量を測定して試料中のHIV−2
gp41に対する抗体の存在または量を決定する ことを特徴とする方法を提供することにある。
本発明は、まず、アミノ酸配列HTTVPWを実質的に有す
るHIV−2 gp41上のエピトープに対する特異的を特徴と
するモノクローナル抗体を提供する。本発明はまた、該
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を
も提供する。好ましい態様において、マウス由来ハイブ
リドーマ細胞株ATCC HB10012はモノクローナル抗体H37c
94を産生する。
本発明はまた、患者のHIV−１に対する暴露からHIV−
２に対する暴露を識別する方法をも提供する。該方法
は、該患者からの生物学的試料を、実質的にHIV−２の
アミノ酸578からアミノ酸603の領域からなるアミノ酸配
列に結合した、アミノ酸配列HTTVPWを実質的に有するエ
ピトープを含む抗原、および該エピトープに特異的な抗
体と接触させて抗原抗体複合体を生成させ、ついで、生
成した該複合体の量を測定してHIV−２に対する暴露を
決定する、ことを特徴とする。
他の態様において、本発明のモノクローナル抗体は、
生物学的試料中の抗HIV−２抗体を検出するためのプロ
ーブとして用いることができる。
以下、本発明をさらに詳しく説明する。
本発明は、アミノ酸配列HTTVPWを実質的に有するHIV
−2 gp41上のエピトープに対する特異性を特徴とするモ
ノクローナル抗体を提供する。ここで、「実質的」なる
後は、保存されたまたは保存されないアミノ酸変化を含
みながら、なお該モノクローナル抗体により認識される
あらゆる関連配列を包含することを意味する。
他の態様において、本発明は、本発明のモノクローナ
ル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を提供する。好
ましい態様において、マウス由来ハイブリドーマ細胞株
ATCC HB10012はモノクローナル抗体H37c94を産生する。
本発明はまた、患者のHIV−１に対する暴露からHIV−
２に対する暴露を識別する方法をも提供する。該方法
は、該患者からの生物学的試料を、実質的にHIV−２の
アミノ酸578からアミノ酸603の領域からなるアミノ酸配
列に結合した、アミノ酸配列HTTVPWを実質的に有するエ
ピトープを含む抗原、および該エピトープに特異的な抗
体と接触させて抗原抗体複合体を生成させ、ついで、生
成した該複合体の量を測定してHIV−２に対する暴露を
決定する、ことを特徴とする。
上記方法に用いる抗原には、不活化全ウイルス、また
は部分的に精製した天然の、合成の、もしくは組換えに
より製造したHIV−2 gp41が含まれる。該エピトープに
結合した該アミノ酸において用いた［実質的」なる語
は、保存されたまたは保存されないアミノ酸変化および
アミノ酸の付加もしくは欠失を含みながら、なおHIV−2
gp41ヒト抗体を認識するあらゆる配列を包含すること
を意味する。
好ましい態様において、本発明の方法は、アミノ酸配
列HTTVPWを実質的に有するエピトープに特異的な抗体と
してH37c94を用いる。このモノクローナル抗体H37c94
は、該抗原に対する結合に関し、試料中に含まれる抗HI
V−2 gp41抗体と競合する。
本発明の他の態様において、モノクローナル抗体H37c
94は、生物学的試料中の抗HIV−2 gp41抗体を検出する
ためのプローブとして用いることができる。好ましい態
様では、試験試料を標識H37c94と混合し、ついで固体支
持体に固定した組換えHIV−2 gp41を加える。結合した
標識H37c94が存在しないと吸光度は減少し、試験試料中
に抗HIV−2 gp41抗体が存在したことを示す。H37c94を
ヒト抗HIV−２抗体と競合させる他のアッセイの態様
は、当業者には知られている。
本発明の方法により容易に試験できる生物学的試料と
しては、全血、血清、血漿、脳脊髄液およびリンパ球な
どのヒトおよび動物体液または細胞培養上清などが挙げ
られる。
本発明のイムノアッセイに用いる固体支持体として
は、反応トレイのウエル、試験管、ポリスチレンビー
ズ、ストリップ、膜、微細粒子、および当業者に知られ
た他の固体マトリックスなどが挙げられる。
検出可能なシグナルを生成することのできるあらゆる
標識または酵素増幅システムを本発明のイムノアッセイ
に用いることができる。代表的な標識としては、酵素標
識、放射性同位体標識、蛍光標識および化学発光標識が
挙げられる。または特異的結合成分のペアを用いること
もでき、その際、一方の成分を本発明アッセイの抗体に
結合させ、もう一方の成分を検出可能な標識に結合させ
る。たとえば、ビオチン／標識抗ビオチン系のようなハ
プテン／標識抗ハプテン系を用いることができる。加え
て、該抗体に対する標識特異的結合タンパク質を用いる
こともでき、該タンパク質は、標識した第二の抗体また
は標識したプロテインＡであってよい。上記モノクロー
ナル抗体がマウスに由来するときは、該モノクローナル
抗体に特異的な標識抗マウス免疫グロブリンを用いるこ
とができる。本明細書に記載のモノクローナル抗体を検
出するために、標識した抗イディオタイプ抗体を用いる
こともできる。
加えて、本発明のアッセイ試薬は、キットを調製する
のに理想的に適している。そのようなキットは、密に区
域内に収容するために区画化されたキャリヤ手段、およ
びバイアル、びん、試験管などの１または２以上のコン
テナー手段からなる。各コンテナー手段は、本発明のイ
ムノアッセイに用いる別々の要素の一つを含んでいる。
細胞株H37c94を、1989年１月31日に受託番号HB10012
にてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
（American Type Culture Collection）（ロックビル、
メリーランド）に受託した。
以下に述べる方法および実施例は、本発明のモノクロ
ーナル抗体H37c94の調製および特徴付け、並びに患者の
HIV−１への暴露からHIV−２への暴露を識別するための
その臨床学的有用性を詳述するものである。
方法 A.合成ペプチドの合成 バラリー（Barary）およびメリフィールド（Merrifie
ld）により記載された一般的な方法［グロス＆マイネホ
ーファー（Gross ＆ Meinehofer）編、The Peptides、V
ol.2（アカデミックプレス、ニューヨーク、1980）］に
従い、HIV−２エンベロープタンパク質の配列604〜636
に対応するペプチドを樹脂支持体上で段階固相合成法
（カルボキシ末端残基から合成開始）により組み立て
た。BOC−Ｌ−Asn−OCH2−Pam樹脂をアプライド・バイ
オシステムズ・シンセサイザー（Applied Biosystems s
ynthesizer）、モデル430Aの反応容器に移した。アルギ
ニン、アスパラギンおよびグルタミン付加の場合にコー
ニッヒ（Konig）およびガイガー（Geiger）により記載
されたDOC/HOBTプロトコール［Chem.Ber.（1970）103:7
88〜798］を用いた他は、既存の対称無水物法（preform
ed symmetric anhydride chemistry）により保護アミノ
酸を樹脂支持体に段階的に二重結合させた。すべてのα
−アミノ末端残基はｔ−フチルオキシカルボニル（ｔ−
BOC）結合により保護し、種々のアミノ酸残基の側鎖は
下記基により保護した:Thr（Bzl）、His（Tos）、Cys
（4MeBzl）、Arg（Tos）、Ser（Bzl）、Asp（OBzl）、T
yr（２−Br−Ｚ）、Lyr（２−Cl−Ｚ）、Glu（OBzl）。
アミノ酸のトリプトファンおよびメチオニンは、側鎖保
護基を用いることなく使用した。トリプトファン導入
後、その後のすべてのＮα−保護（BOC）基を除去する
ため、インドールを１％（w/v）の濃度にてトリフルオ
ロ酢酸に加えた。メチオニン導入後、エタンジチオール
もまた0.25％（v/v）の濃度にてトリフルオロ酢酸に加
えた。
保護ペプチド−樹脂（300mg）を塩化メチレン（CH2Cl
2）中で５分間膨張させた。Ｎα−BOC保護基の除去は、
インドールおよびエタンジオールを含有する60％トリフ
ルオロ酢酸（TFA/CH2Cl2）を用い、CH2Cl2で洗浄し、10
％N,N−ジイソプロピルエチルアミン（DIEA/CH2Cl2）で
中和し、最後にCH2Cl2で洗浄することにより行った。こ
の樹脂を真空乾燥させた。こうして得られたペプチド−
樹脂を無水フッ化水素酸（HF、10ml）で処理し、これに
０℃にてｐ−クレゾール（1ml）およびジメチルスルフ
ィド（1ml）を60分間かけて加えた。HFを０℃にて真空
留去した。開裂した遊離のペプチドおよび樹脂をジエチ
ルエーテルのアリコート（15ml）で３回洗浄した。つい
で、このペプチドを40％酢酸水溶液のアリコート（10m
l）で６回抽出した。水性抽出物を集めて凍結乾燥して
粗製のペプチドを得、精製に付した。
この粗製のペプチドを、分析カラム［Vydac−214−TP
54、ビダック・セパレーション・グループ（Vydac Sepa
ration Group）、ヘスペリア、カリフォルニア］におい
ては1ml/分の流速、セミプレパラティブカラム（Vydac
−214−TP1022）においては12ml/分の流速にて、溶媒系
として0.1％TFA/水（Ａ）および100％アセトニトリル
（Ｂ）の勾配を用いたC4カラム上の逆相HPLCにより精製
した。上記勾配は、30％Ｂで開始した。３分後、20分の
間にこの勾配を40％Ｂまで一次的に増加させ、ついて１
分で30％Ｂに戻した。
ペプチドの存在は、225nmおよび280nmにてモニターし
た。ペプチドの組成は、6N塩酸/0.3％フェノール中、15
0℃にて２時間真空下に加水分解し、引き続きベックマ
ン6300アミノ酸分析機で分析することにより確認した。
HIV−２エンベロープの配列577〜607に対応するペプ
チドを上記のようにして組み立てた。トリプトファン導
入後、その後のすべてのＮα−保護基（ｔ−BOC）を除
去するため、インドール1mg/mlの濃度にてトリフルオロ
酢酸に加えた。320mgの保護ペプチド−樹脂を8.5mlの無
水フッ化水素酸（HF）で処理し、これにｐ−クレゾール
（0.5ml）、ｐ−チオクレゾール（0.5g）およびジメチ
ルスルフィド（0.5ml）を加えた。この粗製のペプチド
を、28％Ｂの勾配から始め、３分後に23分間かけて45％
Ｂまで一次的に増加させて精製した。ついで、１分間か
けて28％Ｂまで戻した。
B.免疫 ５匹のBalbマウスをHIV−2 gp41ペプチド604〜636で
免疫した。500mgのp604〜636を、解毒した内毒素（500
μｇ）およびトレハロースダイマイコレート（500μ
ｇ）を含有するRIBIアジュバント［RIBIイムノケム・リ
サーチ（RIBI Immunochem.Research Inc.）］（製造業
者により記載されたようにしてクロロホルム／メタノー
ル中で再溶解させたもの）と混合した。スクアレン（20
μ）を加え、この混合物をホモジナイズし、ついで0.
2％ツイーン20を含有する水を最終容量1.2mlまで加え
た。
１日目に各マウスに0.1mlを皮下で、0.1mlを腹腔内で
投与し、p604〜636を合計で約100μｇ投与するようにし
た。８週間後、上記のようにして250μｇのp604〜636を
250μｇのRIBIアジュバントと混合することにより調製
したp604〜636（50μｇ）を各マウスに投与して２回目
の免疫を行った。３回目、４回目および５回目の免疫に
関しては、それぞれ最初の免疫から20週、23週および29
週後に、RIBIアジュバント中の約34μｇ、25μｇおよび
25μｇのp604〜636で腹腔内および皮下投与によりマウ
スを免疫した。４回目の免疫の５日後にマウスを出血さ
せた。免疫マウスの免疫応答は、下記で述べる酵素結合
イムノアッセイにより、抗HIV−２抗体について血清を
アッセイすることにより評価した。４週間後、１匹の特
定のマウスを滅菌水（150μ）中のp604〜636（1mg/m
l、100μ）を尾静脈に注射して免疫した。３日後、こ
のマウスを融合のため屠殺した。
C.マイクロタイタープレートの調製 1.0μg/mlのp577〜607の溶液および1.0μg/mlのp604
〜636の溶液を、炭酸水素塩バッファー（pH9.6）を用い
て調製した。ウエル当たり100μのp577〜607溶液かま
たはp604〜636溶液を用い、マイクロタイタープレート
を室温にて一夜コーティングした。このプレートを炭酸
水素塩バッファーで洗浄し、ついで室温にてウエル当た
り200μの炭酸水素塩バッファー中の１％ウシ血清ア
ルブミン（BSA）で３時間かけてコーティングした。こ
のプレートを、0.05％ツイーン20および0.01％ドデシル
硫酸ナトリウム（SDS）を含有するリン酸緩衝食塩水（P
BS）で３回洗浄した。
D.酵素結合イムノアッセイ（EIA） 未免疫マウスおよび免疫マウスからの血清を、0.15M
NaCl、10％ウシ胎仔血清（FCS）、10％正常ヤギ血清（N
GS）および0.5％トリトンＸ−100を含有する20mMリン酸
カリウムバッファー（pH7.4）で系列希釈した。この希
釈血清を、上記で調製しp577〜607かまたはp604〜636を
コーティングしたマイクロタイタープレートのウエルに
加えた。この血清を含むプレートを40℃にて30分間、つ
いで４℃にて一夜インキュエートした。このプレートを
0.0％ツイーン20を含有するPBSで10回洗浄し、ついでNG
S中で1:1000に希釈したヤギ抗マウスIgG（Ｈ＋Ｌ）西洋
ワサビペルオキシダーゼ（HRPO）結合抗体［ジャクソン
・ラボラトリーズ（Jackson Laboratories）］を加え
た。このプレートを40℃にて１時間インキュベートし、
上記のようにして10回洗浄し、ｏ−フェニレンジアミ
ン:2HCl（OPD）発色試薬を加えた。30分後に1N H2SO4を
加えてこの反応を停止させ、492nmにおける吸光度を測
定した。吸光度はウエルに結合したマウス抗体の量に正
比例した。これらのアッセイは、免疫マウスの血清中に
HIV−2 p604〜636に対する抗体が存在することを示して
いた。p604〜636で免疫したマウスは、p604〜636に対し
て1:10,000よりも大きな力価を示した。p604〜636に特
異的な抗血清は、p577〜607に対して交差反応性を示さ
なかった。
E.細胞融合 屠殺マウスの脾臓（抗HIV−２抗体産生細胞を含有）
を、ワイヤースクリーンを通して2.0mM L−グルタミン
および50μg/mlのゲンタマイシンを含有するダルベッコ
変性イーグル培地（Dulbecco's Modified Eagle's Medi
um:DMEM）中へどろどろにつぶす（mashing）ことにより
単一細胞に破砕した。この単一細胞懸濁液を0.83％塩化
アンモニウム−10mMトリス（トリス［ヒドロキシメチ
ル］アミノメタン）で処理して赤血球を溶解し、ついで
SP2/0細胞と1:1の比で混合した。この混合細胞を遠心分
離にかけ、血清不含培地で１回洗浄し、ついで再び遠心
分離にかけた。融合剤としてポリエチレングリコール
（PEG）を用い、免疫供与脾臓細胞とミエローマ細胞株S
P2/0とのハイブリッドを生成させた［コーラー（G.Kohl
er）およびミルシュタイン（C.Milstein）のNature（19
75）256:494参照、モノクローナル・ハイブリドーマ・
アンチボディーズ：テクニークス・アンド・アプリケー
ションズ（Monoclonal Hybridoma Antibodies:Techniqu
es and Applications）、ハレル（J.G.R.Hurrell）編、
CRCプレス、1982中で論評されている］。簡単に説明す
ると、脾臓細胞とSP2/0細胞との融合は、上記ペレット
を血清不含DMEM中の50％PEG（シグマ、MW1000）に２分
間さらすことにより行った。このPEGに血清不含DMEM（1
ml）を加え、１分間待ち、ついでさらに20mlの血清不含
DMEMを５分間かけてゆっくり加えることにより希釈し
た。この細胞を遠心分離により回収した。上清をデカン
トし、HAT（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチ
ミジン）添加20％FCSを含むDMEM（20ml）で置き換えて
ハイブリドーマを選択した。この細胞を約１×106細胞/
mlに希釈し、24マルチウエルプレート中に1ml/ウエルで
入れた。非免疫Balb/cマウスからの脾臓細胞もまたフィ
ーダー層として加えた。隔日毎に1mlの培地をHAT添加20
％FCSを含む新たなDMEMで置き換え、ハイブリッドをさ
らに７〜14日増殖させた。ハイブリッドの幾つかは、SP
2/0細胞に融合した抗HIV−２抗体産生脾臓細胞からなっ
ていた。簡単に説明すると、融合剤は脾臓細胞膜とSP2/
0細胞膜との間の融合を促進し、両細胞の核を含むヘテ
ロカリオンを生成させる。その結果、異なる核は融合し
て同調有糸分裂を行うことのできる単一核を生成する。
この融合細胞が分裂すると、ハイブリッドは各核の染色
体を失うことにより安定する。この融合細胞をウエル当
たり105〜106細胞にて複数の24ウエルプレート中に入れ
る。SP2/0:脾臓細胞融合により生成した融合細胞は、HA
T培地中で培養することにより選択的に増殖される。す
べての未融合SP2/0またはSP2/0:SP2/0融合細胞はアミノ
プテリンにより増殖が妨げられ、また未融合脾臓細胞ま
たは脾臓：脾臓融合細胞は培養中で死滅する。SP2/0:脾
臓ハイブリッドのみがHAT選択培地中で増殖するであろ
う。
つぎに実施例に基づき本発明をさらに詳しく説明する
が、本発明はこれらに限られるものではない。
実施例１ モノクローナル抗体のスクリーニング、クローニングお
よび特徴付け： 上記方法を用い、HIV−２に対する抗体についてハイ
ブリッドをスクリーニングした。10〜14日後、プロトコ
ールにおいて下記のような変化はあったが上記方法の説
明で記載したEIA法により、ハイブリドーマ細胞培養を
含むウエルからの培養液をスクリーニングした。このプ
レートを培養液とともに40℃にて３〜４時間インキュベ
ートし、ついで0.05％ツイーン20および0.1％SDSを含む
PBSでプレートを洗浄した。選択したすべてのハイブリ
ドーマはp604〜636と強く反応したがp577〜607に対して
は陰性であった。
さらに、標的抗原としてHIV−1 gag/HIV−2 gp41（ga
g−p41）融合タンパク質およびCKS−HIV−2 TMP断片（C
KS−TMP;HIV−2 TMPの最初の108アミノ酸を含有）融合
タンパク質を用い、ハイブリッドのウエスタンブロット
を試験した。これらのタンパク質は、米国特許出願第27
5309号および同第276263号各明細書（1988年11月23日出
願）に開示されているようにして調製した。簡単に説明
すると、500μのgag−p41をSDSおよび２−メルカプト
エタノールで95℃にて処理し、10％ポリアクリルアミド
−SDSゲル中で電気泳動にかけた［ラムリ（Laemmli）
ら、Nature（1970）227:680〜685］。同様に、部分精製
CKS−TMPの2mg/ml溶液（250μ）をSDSおよび２−メル
カプトエタノールで95℃にて処理し、12％ポリアクリル
アミド−SDSゲル中で電気泳動にかけた。タンパク質
を、25mMトリス、192mMグリシンおよび2.0％メタノール
からなる標準移動バッファー（pH8.3）中、ゲルからニ
トロセルロースに100mamPの電気泳動により一夜かけて
移すか、または1.0ampにて１〜２時間かけて移した［タ
ウビン（Towbin）ら、Proc.Natl.Acad.Sci（1979）76:4
350〜4354］。上記組換えタンパク質を移し、0.15M NaC
lを含有する10mMトリス（pH8.0）中の20％FCSでニトロ
セルロースをブロッキングした後、このニトロセルロー
スをストリップにカッティングし、これを用いて抗HIV
−２抗体の存在を決定した。
ウエスタンブロット法のため、ニトロセルローススト
リップ、選択ハイブリッド（02ml）およびバッファー
（20mMトリス、1mM EDTA、0.2M NaCl、0.3％トリトンＸ
−100および2mg/mlBSA、pH7.5）（1.8ml）からなる反応
組成物を４℃にて一夜インキュベートした。このストリ
ップを緩衝界面活性剤（0.1％SDSおよび0.5％トリトン
Ｘ−100を含む10mM PBS、pH7.5、0.5M NaClおよび0.5％
トリトンＸ−100を含むPBSと交替で用いる）で洗浄し、
ついでHRPOに結合したヤギ抗マウスIgG抗体を加えた。
このストリップを室温にて１〜２時間インキュベート
し、ついで緩衝界面活性剤で洗浄した、最後に、新たに
調製したHRP発色試薬（バイオラド;120mgを40mlの氷冷
メタノール中に溶解し、ついで120μの30％過酸化水
素を含む200mlのトリス緩衝食塩水（pH7.8）中に希釈し
たもの）を加えることにより組換えタンパク質に結合し
た抗体を視覚化した。このアッセイにより、HIV−２タ
ンパク質に特異的な抗体が存在することが示された。H3
7を含む２つのハイブリッドがgag−p41およびCKS−TMP
の両方に対しブロット反応性を示した。残りのハイブリ
ッドはgag−p41に対してのみ反応性であった。
このハイブリッドを、ゴーディング（J.W.Goding）に
よる「モノクローナル・アンチボディーズ：プリンシプ
ルズ・アンド・プラクティス（Monoclonal Antibodies:
Principles and Practice）（アカデミックプレス、N.
Y.1983）」中に略述されている指針を用いた限界希釈法
により展開した。簡単に説明すると、このハイブリッド
を１細胞／ウエルにて２−96マルチウエルプレート中に
展開し、約２週間増殖させた。単一のハイブリッドH37
から、細胞増殖およびコロニー生成を含む46のウエルが
同定された。各ウエルからの培養液をEIAおよびウエス
タンブロットによりスクリーニングした。これら46ウエ
ルのうち３つウエルが抗HIV−２抗体に関し陽性である
と同定された。これら３つのウエルのそれぞれからの細
胞を24マルチウエルプレート中に展開し、ついで、さら
に25cm2フラスコ、ついで75cm2フラスコ中に展開した。
これら３つの展開したクローンのうちの一つをH37c94と
称した。
モノクローナル抗体H37c94のアイソタイプはIgG2aで
あると決定された。EIAアイソタイプ手順にはヤギ抗マ
ウスIgG免疫グロブリンをコーティングしたマイクロタ
イタープレートを用い、これを該クローンの培養液とと
もにインキィベートすることにより分泌マウス抗体を捕
捉した。２時間後、このプレートを洗浄し、ついでウサ
ジ抗マウスアイソタイプをさらに２時間適用した。この
プレートを再び洗浄し、HRPO結合ヤギ抗マウスIgGを１
時間適用した。過剰の結合体を洗浄により除去し、つい
でOPD基質を加えた。マウス免疫グロブリンに結合した
ウサジ抗マウスアイソタイプの量は492nmで測定した吸
光度と正比例した。マウス腹水からのH37c94抗体を用い
てさらに特徴付けを行った。
一層大量のH37c94モノクローナル抗体を得るために、
H37c94クローンをマウス中で増幅させた。0.5mlのプリ
スタン（2,6,10,14−テトラメチルペンタデカン）で前
以て腹腔内処理したBalb/cマウスに１〜２×107個のク
ローン化H37c94細胞を接種した（方法は上掲ハレルの文
献に略述されている）。プリスタン処理によりマウスミ
エローマハイブリッドのマウス腹腔内での増殖が促進さ
れ、生成する腹水は該ハイブリッド細胞により分泌され
たモノクローナル抗体に富んでいる。モノクローナル抗
体に富んだ腹水が生成した後、これらマウスを屠殺し、
腹腔から採取した腹水を遠心分離により清澄化した。以
下に記載する特徴付け手順は、プロテインＡ−セファロ
ース（ハレルの上掲文献参照）を含む当該技術分野で公
知の精製法を用い、上記清澄腹水または該腹水からの精
製抗体を用いて行った。
活性および特異性の決定 マウス腹水中のモノクローナル抗体の力価を決定し、
また該モノクローナル抗体の特異性を評価するためにア
ッセイを行った。上記手順を用いたEIAにより、腹水中
のモノクローナル抗体を滴定した。上記プレートを腹水
とともに40℃にて１時間インキュベートした。モノクロ
ーナル抗体に富んだ腹水は、合成ペプチドp604〜636に
対して1:500,000以上の高い力価を示した。この腹水はp
577〜607に対しては反応性を示さなかった。
加えて、モノクローナル抗体H37c94の特異性を放射性
免疫沈降アッセイ（RIPA）により確認した。ウイルスタ
ンパク質の免疫沈降アッセイについてはすでに記載され
ている［デバレ（Devare）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA
（1986）、83:5718〜5722］。これらの研究に用いた細
胞株は、非感染H9細胞またはHIV−２感染H9細胞であっ
た。細胞を培養液から回収し、メチオニンおよびシステ
インを欠くRPMI1640（ギブコ・ラボラトリーズ）で１回
洗浄し、ついで同じ培地中に１〜2.5×106細胞/mlにて
懸濁した。洗浄細胞を６％CO2下、37℃にて30〜45分間
インキュベートし、ついで各50〜100μCiの［35S］メチ
オニンおよび［35S］システイン（アマーシャム）を培
地に加えた。細胞を37℃にて４〜８時間放射性標識し、
遠心分離により回収し、1mM PMSF、アプロチニン（バッ
ファー1ml当たり100カリクレイン不活性単位）、1.0％
トリトンＸ−100、0.1％SDSおよび0.5％デオキシコール
酸ナトリウム（すべての試薬はシグマから入手）を含む
PBS（pH7.4）中溶解させた。この溶解物を100,000×ｇ
にて40分間遠心分離にかけることにより清澄化し、−70
℃にて貯蔵した。
細胞溶解物の100μアリコートを10μのモノクロ
ーナル抗体に富んだ腹水または100μの組織培養液と
ともに４℃にて30〜60分間インキュベートすることによ
り免疫沈降を行った。抗体−抗原複合体を、BSA（1mg/m
l）を含む溶解バッファー中で前以て洗浄した200μの
前膨張プロテインＡ−セファロース（ファルマシア、Ig
G結合能:50〜200μg/200μのプロテインＡ）を加える
ことにより回収した。この反応混合物を４℃にて１時間
激しく振盪し、ついで溶解バッファーを用いてこのプロ
テインＡ−セファロースを３回洗浄した。ついでプロテ
インＡ−セファロースを遠心分離により回収し、つい
で、２−メルカプトエタノールを含有するSDSゲル試料
バッファー中、95℃にて加熱することにより免疫複合体
を解離させた（ラムリらの上掲文献参照）。この試料を
SDS−10％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。
このゲルをエンハンス（Enhance）（デュポン）中で30
分間インキュベートし、乾燥し、免疫沈降放射性標識タ
ンパク質のオートラジオグラフィーのためにＸ線フィル
ムに暴露した。HIV−2 gp41内のエピトープに対するH37
c94抗体の特異性は、HIV−２感染H9細胞溶解液からの［
35S］メチオニン／［35S］システイン生合成標識ウイル
ス糖タンパク質gp160（未開裂エンベロース前駆体）お
よびgp41の免疫沈降により確認された。その結果、上記
モノクローナル抗体によりHIV−２感染細胞溶解液からg
p160およびgp41は沈降したがgp120は沈降せず、また放
射性標識細胞タンパク質の非特異的免疫沈降は検出され
ないことが示された。それゆえ、このモノクローナル抗
体H37c94はHIV−2 gp160/41に特異的に結合した。バン
ドパターンは、HIV−２血清陽性血清での沈降に対応す
るgp160、gp41および小バンド（gp41の可能な断片）の
沈降を示し、他の研究者による他のHIV−２経膜タンパ
ク質に関する報告を確認した。H37c94は、HIV−２血清
陽性の患者に見られるのと洞じタンパク質を認識する。
実施例２ モノクローナル抗体H37c94により認識されるエピトープ
のマッピングおよび特徴付け： ハイブリッドのEIAスクリーニグにより、H37c94はp57
7〜607を認識しないことが確立された。さらに、H37c94
腹水は、ウエスタンブロッティングにおいてCKS−HIV−
2 TMP断片融合タンパク質を認識した。免疫ペプチドの
アミノ酸配列は以下の通りである。
非交差反応ペプチドp577〜607のアミノ酸配列は以下
の通りである。
CKS−HIV−2 TMP断片融合タンパク質のアミノ酸配列
は以下の通りである。
（スラッシュの後のアミノ酸はクローン中のナンセンス
コードを示す） モノクローナル抗体H37c94は、アミノ酸配列HTTVPWを
有するエピトープを認識するが、このアミノ酸配列は上
記免疫ペプチドと上記融合タンパク質の両方に共通して
いる。上記免疫ペプチドと上記融合タンパク質との間に
６個のアミノ酸がオーバーラップしていることにより、
H37c94が認識するエピトープが提供される。p577〜607
の配列HTTVは、H37c94の認識するエピトープを生成する
には不充分である。
さらに、HIV−１の対応領域中の配列と比較したとこ
ろ、６個のアミノ酸のうち２個が異なることがわかっ
た。この変化は、H37c94がHIV−1 gp41を認識させなく
するのに充分である。
実施例３ HIV−１およびHIV−２の識別： 本発明に従って、H37c94はHIV−２血清陽性試料の検
出のための競合プローブとして有用であることが示され
た。さらに本発明に従って、H37c94は患者のHIV−１へ
の暴露からHIV−２への暴露を識別するのに利用するこ
とができる。というのは、H37c94はHIV−2 gp41に対す
る抗体を含有する試料とは競合するが、HIV−1 gp41に
対する抗体を含有する試料とは競合しないからである。
HIV−１血清陽性血清は競合イムノアッセイにおいてH37
c94と容易に競合しないが、HIV−２血清陽性血清は競合
する。
H37c94競合アッセイの好ましい態様において、組換え
CKS−HIV−2 TMP断片融合タンパク質を固体支持体上に
コーティングし、試験試料およびモノクローナル抗体H3
7c94とともにインキュベートした。試験試料中に存在す
るHIV−２ウイルス特異的抗体は、固体支持体上の組換
えタンパク質への結合に対してH37c94と競合した。組換
えタンパク質に結合したH37c94の量は、HRPOに結合した
ヤギ抗マウス免疫グロブリンを用いることにより定量し
た。
血清試料（15個のHIV−１、15個のHIV−２および５個
の「両者」）をH37c94競合アッセイ法により試験した。
HIV−１、HIV−２または「両者」（HIV−１およびHIV−
２に対する別々の抗体集団を含む）という血清の分類
は、生合成的に標識したgp120のHIV感染細胞溶解液から
の沈降（RIPA）、またはウエスタンブロットにより評価
されるようにウイルスgp120に対する反応性により、gp1
20に対する抗体の存在に基づいている。
H37c94競合アッセイにおいて、陽性コントロールの吸
光度と陰性コントロールの吸光度との合計を２で割った
値に等しい吸光度値はカットオフ値と考えた。このカッ
トオフ値よりも高い吸光度値を示す試料はH37c94とは競
合しないものと考えられ、「非HIV−２」と分類した。
カットオフ値よりも低い吸光度値を示す試料はH37c94と
競合すると考えられ、「HIV−２」と分類した。それゆ
え、「非HIV−２」血清の試料／カットオフ吸光度値（S
/CO）が1.0に等しいかまたはそれより大きく、「HIV−
２」血清のS/COは1.0未満である。
第１表に示されるように、H37c94をプローブとして用
いた競合アッセイは、HIV−２血清陽性試料とHIV−１血
清陽性試料とを識別するために有効な方法である。HIV
−2 gp41に対するH37c94の特異性は、それが抗HIV−１
抗体とは競合しないことにより示された。15個のすべて
のHIV−１試料は、H37c94競合アッセイにおいて「非HIV
−２」と同定された。15個のHIV−２試料に関しては、
すべて正しく同定された。両者として分類された試料は
競合アッセイにおいて検出され、「HIV−２」と同定さ
れた。
加えて、上記H37c94競合アッセイを用い、正常集団か
らの63個の試料をスクリーニングした。このアッセイ
は、平均S/CO値が1.6（SD＝0.114、CV＝7.2％）を示し
た。
H37c94競合アッセイをさらによく特徴付けるため、第
１表からの幾つかの血清試料について（ａ）組換え経膜
タンパク質に対する反応性、（ｂ）HIV−１およびHIV−
２の経膜タンパク質の免疫優性領域（IDR）を示す合成
ペプチドに対する反応性、および（ｃ）下記に記載する
ペプチド抑制アッセイにおける反応性を分析した。使用
した組換えタンパク質は、HIV−１に関してはHIV−1 gp
41のBal II−Kpn I制限断片、HIV−２に関してはCKS−H
IV−2 TMP断片融合タンパク質であった。使用した合成
ペプチドは、HIV−１に関してはp584〜611（HTLV−III
B）、HIV−2 IDRに関してはp577〜607であった。両EIA
アッセイとも、上記方法の欄で説明したEIA手順と同等
の手順を用いて行った。
ペプチド抑制アッセイ法 HIV−1 IDRかまたはHIV−2 IDRの合成ペプチドを88％
ギ酸中に可溶化し、0.5M NaClおよび0.0022％トリトン
Ｘ−100を含む0.1Mトリスバッファー中に５μg/mlに希
釈し、pHを8.5に調節した。このペプチドをポリスチレ
ンビーズとともに37℃にて２時間インキュベートした。
このビーズをPBS中の0.1％トリトン（pH7.4）で40℃に
て１時間洗浄した。このビーズをPBSで洗浄し、PBS中の
５％BSAを40℃にて１時間コーティングし、PBSで洗浄
し、PBS中の５％ショ糖で室温にて20〜30分間コーティ
ングした。
このビーズに対し、ペプチド抑制アッセイの感度を最
適化するために血清を適定した。適当な希釈液（10μ
）を、HIV−１かまたはHIV−2 IDRペプチド（10μg/m
lペプチドを100μ、または100μg/mlペプチドを100μ
）、および0.09M NaCl、0.2％トリトンＸ−100、20％
NSGおよび10％FCSを含有する11mMリン酸ナトリウムバッ
ファー（300μ）と混合した。40℃にて１時間後、ビ
ーズに結合したペプチドを加え、この混合物を40℃にて
２時間インキュベートした。ビーズはまた単独で血清と
ともにインキュベートし、コントロールとした。これら
ビーズを蒸留水で洗浄し、上記血清に富んだバッファー
中で希釈したヤギ抗ヒトIgG（Ｈ＋Ｌ）−HRPOと反応さ
せ、発色させた。
これら分析の結果を第２表にまとめてある。両方のEI
Aアッセイとも、非希釈試料のS/CO値として終点希釈の
逆数を括弧内に入れて結果を示した。終点希釈とは、血
清が陽性結果を示す最大希釈として定義される。さらに
第１図に示すように、ペプチド抑制アッセイにおける反
応性に従って血清をHIV−１、HIV−２、HIV−１と反応
性のHIV−２（２×１）または両者として分類した。HIV
−２抗体陽性であるがHIV−1 IDRペプチドをも弱く認識
した血清は２×１と分類した。
ペプチド抑制アッセイに基づく試料の分類は、RIPAデ
ータ、および第１表に示したH37c94競合アッセイ結果と
対応するものであった。加えて、直接EIAアッセイにお
いて、抗原標的として組換え経膜タンパク質またはより
短いIDRペプチドのいずれを用いたかにかかわらず、２
×１と分類された試料はHIV−１およびHIV−２標的の両
方と反応した。２×１試料は、H37c94競合アッセイにお
いてH37c94と明らかに競合した。これらのEIAデータ
は、組換えp41タンパク質または免疫優性領域を含むペ
プチドが、HIV−１からHIV−２を必ずしも識別すること
ができるものではないことを明確に示している。これと
は対照的に、H37c94競合アッセイはHIV−１からHIV−２
を識別し、HIV−１と交差反応性のHIV−２試料および両
者感染試料中でHIV−２を検出することができる。それ
ゆえ、H37c94競合アッセイは、組換えタンパク質または
合成ペプチドに比べて識別試薬として優れたものであ
る。
【図面の簡単な説明】
第１図は、HIV−１血清、HIV−２血清、両者、およびHI
V−１と交差反応性のHIV−２血清（２×１）における、
固体支持体上のHIV−1 IDRおよび固体支持体上のHIV−2
IDRとの競合ペプチド不在、HIV−1 IDRペプチドおよび
HIV−2 IDRペプチドの反応性を吸光度（492nm）で示す
グラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 スシル・ジー・デヴェア アメリカ合衆国イリノイ 60062、ノー スブルック、ファーンスワース・レイン 2492番 (72)発明者 イルズ・イングリッド・イー・トリッビ ー アメリカ合衆国イリノイ 60611、シカ ゴ、イー・デラウェア・ピーエル，アプ ト．5611、175番 (72)発明者 スレッシュ・エム・デサイ アメリカ合衆国イリノイ 60048、リバ ティビル、アミー・レイン 1408番 (72)発明者 ジェームス・エム・キャシー アメリカ合衆国イリノイ 60031、ガー ニー、マックルーア 4567番 (72)発明者 ジル・ジョンソン―パエプク アメリカ合衆国ウィスコンシン 53140、 ケノシャ、シックスティーンス・アベニ ュー 4726番 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12P 2/08 C12N 15/06 - 15/08 C12N 5/12 - 5/28 G01N 33/569 G01N 33/577 ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／Ｇｅｎｂａｕｋ／Ｇ ｅｎｅｓｅｑ／ＰＩＲ／Ｓｗｉｓｓｐｒｏ ｔ

Claims (12)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】アミノ酸配列HTTVPWを実質的に有するHIV
    −2 gp41上のエピトープに対する特異性を特徴とするモ
    ノクローナル抗体。
  2. 【請求項２】請求項（１）に記載のモノクローナル抗体
    を産生する哺乳動物抗体産生細胞株。
  3. 【請求項３】ミエローマ細胞株SP2/0に融合させたマウ
    ス脾臓細胞の細胞ハイブリッドからなるハイブリドーマ
    である請求項（２）に記載の細胞株。
  4. 【請求項４】マウス由来ハイブリドーマ細胞株ATCCHB10
    012。
  5. 【請求項５】ハイブリドーマ細胞株ATCC HB10012により
    産生されたモノクローナル抗体。
  6. 【請求項６】患者のHIV−１に対する暴露からHIV−２に
    対する暴露を識別する方法であって、 該患者からの生物学的試料を、実質的にHIV−２のアミ
    ノ酸578からアミノ酸603の領域からなるアミノ酸配列に
    結合した、アミノ酸配列HTTVPWを実質的に有するエピト
    ープを含む抗原、および該エピトープに特異的な抗体と
    接触させて抗原抗体複合体を生成させ、ついで 生成した該複合体の量を測定してHIV−２に対する暴露
    を決定する ことを特徴とする方法。
  7. 【請求項７】該生物学的試料と該抗原および該抗体との
    接触を、該抗原を固体支持体に固定し、ついで該試料を
    該固定支持体に固定した該抗原、および該抗体と接触さ
    せることにより行う請求項（６）に記載の方法。
  8. 【請求項８】抗体がモノクローナル抗体である請求項
    （６）に記載の方法。
  9. 【請求項９】モノクローナル抗体が請求項（１）から
    （５）のいずれかに記載のモノクローナル抗体である請
    求項（８）に記載の方法。
  10. 【請求項１０】モノクローナル抗体を検出可能な標識で
    標識してある請求項（９）に記載の方法。
  11. 【請求項１１】標識が、放射性同位体、酵素、蛍光化合
    物、化学発光化合物および特異的結合成分のペアよりな
    る群から選ばれたものである請求項（10）に記載の方
    法。
  12. 【請求項１２】生物学的試料中のHIV−2 gp41に対する
    抗体の存在または量を検出する方法であって、 該試料を、実質的にHIV−２のアミノ酸578からアミノ酸
    603の領域からなるアミノ酸配列に結合した、アミノ酸
    配列HTTVPWを実質的に有するエピトープを含む抗原、お
    よび該エピトープに特異的な抗体と接触させて抗原抗体
    複合体を生成させ、ついで 生成した該複合体の量を測定して試料中のHIV−2 gp41
    に対する抗体の存在または量を決定する ことを特徴とする方法。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6514691B1 (en) * 1986-01-22 2003-02-04 Institut Pasteur Peptides of human immunodeficiency virus type 2 (HIV-2), antibodies against peptides of HIV-2, and methods and kits for detecting HIV-2
US4839288A (en) * 1986-01-22 1989-06-13 Institut Pasteur Retrovirus capable of causing AIDS, antigens obtained from this retrovirus and corresponding antibodies and their application for diagnostic purposes
EP0438332B1 (fr) * 1990-01-16 1998-04-08 Orgenics Ltd. Peptides dérivant de la glycoprotéine d'enveloppe de virus HIV, leurs applications à la détection d'une infection due à ces virus et à la vaccination contre le SIDA
AU8849391A (en) * 1990-08-16 1992-03-17 Diagnostic Biotechnology, Inc. An augmented western blot format and immunoassay for detection of viral antibodies
US5256561A (en) * 1991-12-20 1993-10-26 Abbott Laboratories Monoclonal antibody to HIV-2 and uses thereof
US6074646A (en) * 1993-10-26 2000-06-13 Board Of Regents, The University Of Texas System Nondenatured HIV envelope antigens for detecting early HIV-specific antibodies
EP0832113B1 (en) * 1995-06-07 2004-05-19 Abbott Laboratories Peptides for hiv-1 detection
DE19622088A1 (de) * 1996-05-31 1997-12-04 Boehringer Mannheim Gmbh Anti-HIV-Antikörper als Kontrollproben
EP0993615A1 (en) * 1998-03-04 2000-04-19 Universal Healthwatch, Inc. Rapid confirmatory test for microbial infections
US6852491B2 (en) * 2001-09-04 2005-02-08 Abbott Laboratories Amplification and detection reagents for HIV-1
AU2003212466A1 (en) * 2002-02-28 2003-09-16 Board Of Regents, The University Of Texas System Method and composition for detecting early hiv antibody
CA2793959C (en) 2010-03-25 2019-06-04 Oregon Health & Science University Cmv glycoproteins and recombinant vectors
HUE037408T2 (hu) 2011-06-10 2018-08-28 Univ Oregon Health & Science CMV glikoproteinek és rekombináns vektorok
AU2012216792A1 (en) 2011-09-12 2013-03-28 International Aids Vaccine Initiative Immunoselection of recombinant vesicular stomatitis virus expressing HIV-1 proteins by broadly neutralizing antibodies
EP2586461A1 (en) 2011-10-27 2013-05-01 Christopher L. Parks Viral particles derived from an enveloped virus
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US20150065381A1 (en) 2013-09-05 2015-03-05 International Aids Vaccine Initiative Methods of identifying novel hiv-1 immunogens
US10058604B2 (en) 2013-10-07 2018-08-28 International Aids Vaccine Initiative Soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1341482C (en) * 1984-10-31 2005-05-10 Paul A. Luciw Process for preparing fragments of aids-associated retroviruses

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