JPH02268696A - 抗ＨＩＶ―２モノクローナル抗体およびそれを用いた抗ＨＩＶ―２ｇｐ４１抗体の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の病因で
あるＩ−１１Ｖ　（ヒト免疫不全ウィルス）に対する暴
露の検出に関する。さらに詳しくは、本発明は、マウス
モノクローナル抗体Ｈ３７ｃ９７、トＩＩｆ−２ｇｐ４
１内のそのエピトープに関し、これらは、ｌ目Ｖ−１ウ
イルスに暴露した患者から１−１１　Ｖ　−２ウイルス
に暴露した患者を識別するのに用いるためのイムノアッ
セイの基礎を提供する。

（従来の技術および発明が解決しようとする課題）幾つ
かの）Ｉ　Ｉ　Ｖ単離物についでプロウィルスゲノムの
ヌクレオヂド配列が決定されている。それらＨＩ　Ｖ　
１１ｉｌ物としテハ、ＨＩ　Ｖ　−１株であルＩ−１’
１’　Ｌ　Ｖ　−Ｊ１７　［ラットナ−（ＲａＬｎｅｒ
）ら、Ｎ　ａｔｕｒｃ（１９８５）３１３：２７７］：
ΔＩ″ＬＶ　−２［ザンヂエスベスカドール（Ｓ　ａｎ
ｃｈｅｚ　−Ｐ　ｅｓｃａｄｏｒ）ら、５ｃｉｅｎｃｅ
（１９８５）２２７　：４８４　］；ＬＡＶ［ウェイン
ーホブソン（Ｗ　ａ　ｉ　ｎ−１−１ｏｂｓｏｎ）ら、
Ｃｃｌ［ＩＱ　８５）４０：９１およびＣＤＣ−／１５
１［デザイ（Ｄｅｓａｉ）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａ
ｃａｄ、Ｓｃｉ、［ＪＳ　Ａ（１９８６）８３　：８３
８０］が挙げられる。）ｉｒＶ−２ＲＯＤ単離物のヌク
レオヂド配列は、ガイアダー（Ｇｕｙａｄｅｒ）らによ
って報告されている［Ｎ　ａｔｕｒｅ（１９８７）３　
２６　二６６２］。　ＨＩＶ−２１１Ｈｚ　単ｍ物は、
ツァガリ−（Ｚ　ａｇｕｒｙ）らによって報告されてい
る［ＰＮＡＳ（１９８８）８５：５９４１〜５９４５］
。さらに別のＩ−１Ｔ　Ｖ配列がマイヤーズ（Ｍｅｙｅ
ｒｓ）らにより見出されている［ヒニーマン・レトロバ
イラスイズ・アンド・Ａ　Ｉ　Ｄ　Ｓ　（１−１ｕａ＋
ａｎ　ＲｅＬｒｏｖｉｒｕｓｃｓ　ａｎｄ　Ａ　Ｉ　Ｄ
　Ｓ　）　ｌ　９８８、ア・コンビレーンヨン・アンド
・アナリシス・才ブ・ニュークレイツク・アシッド・ア
ンド・アミノ・アシブド−ンークエンシイズ（Ａ　　Ｃ
ｏｌｌ１ｐｉｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ａｎａｌｙｓｉｓ
　ｏｒ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　ａｎｄ　Ａｍ１ｎ
ｏ　Ａｃ１ｄ　５ｃｑｕｅｎｃｅｓ）（ロスアラモス・
ナショナル・ラボラトリ−（Ｌｏｓ　ΔＩａＩ１１ｏｓ
　Ｎａｔｉｏｎａｌ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ロス
アラモス、ＮＭ）］。

１−１１　Ｖ−１感染の検出のために重要な血清学的標
的の一つに、膜透過性タンパク質（ＴＭＰ）であるｇｐ
４１がある。このタンパク質に対する抗体は血清変換に
際して最初に出現するものの一つであり、抗ｇｐ’ｌ　
＋抗体がＡＩＤＳの無症候および他の臨床段階において
ほぼ全般的に存在することがら明示されるように、ｇｐ
４１に対する免疫応答は該疾但の進行を通じて比較的強
く保持されているものと思われる。該タンパク質に対す
る抗体応答の大部分は、よく特徴付けられた免疫優性（
ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ）領域に向けられており
［ヂャング（Ｃｈａｎｇ）ら、ｒ３ｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ（１９８５）３　：９０５〜９０９］、アミノ
酸５７８〜６１３として大まかに定められている（番号
付けはｌ−（Ｘ　Ｆ３２単離物についでマイヤーズらに
よる）。重要な免疫原配列を形成するものとして免疫優
性領域内の特定の小さな配列が同定されてきている。そ
のような配列の例としては、ＲＩ　ＬＡＶＥＩＩＹＬＫ
ＤＱＱＬＬＧＩＷＧＣ８（ベブヂドの免疫原性を保持す
るのＪＣａｒｇ　−１、ｉｌｅ　−２およびＩｙｓ−Ｉ
Ｑがそれぞれ重要な役割を担っている）［ワンプ（Ｗ　
ａｎｇ）ら、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ（１９８６）８３
　：６１５９〜６１６３］、Ｉ、ＧＬＷＧＣＳＧＫＬ　
Ｉ　ｃＣべ’ｊヂドの免疫原性を保持するのに両ｃｙｓ
残基が重要な役割を担っていると思われる）［ダナン（
Ｇ　ｎａｎｎ）ら、Ｊ　、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９８７
）６１　：２６３９〜２６４１］および５ＧＫＬ　Ｉ　
ＣＴＴＡＶＰＷＮＡＳ（天然ウィルスでは隠されている
か疾但の進行の間はｉ１Ｎされ免疫原性となるエピトー
プからなる）［ナーバネン（Ｎ　ａｒｖａｎｅｎ）ら、
Ａ　ＩＤ５（＋　９８８）２：１１９〜１２３］が挙げ
られる。配列ＧＩＷＧＣＳＧＫＬ　Ｔ　Ｃをマツピング
するヒトモノクローナル抗体が産生されており、この配
列が免疫原としての中心的な役割を担っていることがさ
らに支持された［バナボー（ｇ　ａｎａｐｏｕｒ）ら、
Ｊ　、　Ｉ　ｍｍｕｎｏｌ、（１９８７）１３９：４０
２７〜４０３３コ。

ｇｐ４１の他の領域は、免疫応答を引き起こす上で役割
を担っているとしても二次的な役割しか担っていないと
思われ［グナンら、Ｊ　、　Ｉ　ｎｒｅｃｔ、Ｄ　１ｓ
ｃａｓａｓ（１９８７）Ｉ　５６：２６１〜２６７：お
よびウインドホイザー（Ｗ　ｉｎｄｈｅｕｇｅｒ）およ
びウッド（Ｗｏ。

ｄ）、Ｇｅｎｅ（１９８８）６４：１０７〜！　１９］
、診断上有用なものとしては同定されていない。

ＬＩ　Ｉ　Ｖ　−２の免疫優性エピトープ（本明細書で
は、以下、ｒＨＩ　Ｖ　−２ｇｐ４　Ｎという）に関シ
テははるかに知られておらず、この分野の研究は、１−
１１　Ｖ−１に対する暴露から１−１　［Ｖ　−２に対
する暴露を識別するための血清学的標的として該タンパ
ク質の免疫優性領域を使用することに主として向けられ
ている。ダナンら［５ｃｉｅｎｃｅ（１９８７）２３７
：１３４６〜１３４９コは、ＨＩ　Ｖ　−２に対する抗
体を検出しこれをＩ−（ＩＶ−１に対する抗体から識別
するために、合成ペプチドＮ５ＷＧＣＡＦＲＱＶＣ中＋
ＣＨ［Ｖ−２ｒｔＯＤ免疫侵免疫酸性領域を用いた。加
えて、コツト（Ｃｏｔ）ら［ＡＩＤＳ　　Ｒｅ５ｅａｒ
ｃｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　ＦＺｅｔｒｏｖｉｒｕＳｅ
ｓ（１９８８）４　：２３９〜２４１］もまた、ＨｒＶ
−１ｇｐ４１に対するヒト抗体からＨＩＶ−２ｇｐ４１
に対するヒト抗体を識別するために免疫優性領域ペプチ
ドを用いた。用いたｌ−１１Ｖ　−２ベブヂドは、配列
Ｉ？ＶＴＡ　ＩＥＫＹＴ、ＱＤＱＡＲＬＮＳＷＧＣＡＦ
ＲＱＶＣであった。両研究において、利用した領域は第
二のシスティン残基で終わっていた。

両研究においても、また他のいかなる報告にも、ｔ−ｉ
　ｉ　ｖ　−２配列ＨＴ　Ｔ　Ｖ　Ｐ　Ｗが血清学的標
的として、またはモノクローナル抗体の抗原として診断
的価値を存することは示されていない。

（課題を解決するための手段） 本発明の目的は、アミノ酸配列ＨＴＴＶＰＷを実質的に
有するＨＩＶ−２ｇｐ４１上のエピトープに対する特異
性を特徴とするモノクローナル抗体： 上記モノクローナル抗体を産生ずる咄乳動物抗体産生細
胞抹； マウス由来ハイブリドーマ細胞株ＡＴＣＣＩ（Ｂ１００
１２゜ ハイブリドーマ細胞株ＡＴＣＣＪ、ＩＢ　Ｉ　００１２
により産生されたモノクローナル抗体：但者のＨ［Ｖ　
−１に対する暴露からＩ−Ｉ　Ｉ　Ｖ　−２に対する暴
露を識別する方法であって、 （ｉ）該患者からの生物学的試料を、実質的にＨｒＶ−
２のアミノ酸５７８からアミノ＃６０３の領域からなる
アミノ酸配列に結合した、アミノ酸配列ＨＴＴＶＰＷを
実質的に有するエピトープを含む抗原、および該エピト
ープに特異的な抗体と接触させて抗原抗体複合体を生成
させ、ついで（ｉ　ｉ）生成した該複合体のｍを測定し
てｌ−目Ｖ−２に対するｎ露を決定する ことを特徴とする方法；および 生物学的試料中のｉ−１１Ｖ−２ｇｐ’ｌ　Ｉに対する
抗体の存在または爪を検出する方法であって、（ｉ）該
試料を、実質的に１−１１　Ｖ　−２のアミノ酸５７８
からアミノ酸６０３の領域からなるアミノ酸配列に結合
した、アミノ酸配列ＨＴ　Ｔ　Ｖ　Ｐ　Ｗを実質的に有
するエピトープを含む抗原、および該エピトープに特異
的な流体と接触させて抗原抗体複合体を生成させ、つい
で （ｉ　ｉ）生成した該複合体のｍを測定して試料中のＨ
ＩＶ−２ｇｐ４１に対する抗体の存在または爪を決定す
る ことを特徴とする方法を提供することにある。

本発明は、まず、アミノ酸配列）ＩＴＴＶＰＷを実質的
に存するＨ　Ｉ　Ｖ−２ｇｐ４１上のエピトープに対す
る特異性を特徴とするモノクローナル抗体を提供する。

本発明はまた、該モノクローナル抗体を産生ずるハイブ
リドーマ細胞株を６提供する。好ましいｊ３様において
、マウス由来ハイブリドーマ細胞株ＡＴＣＣＩ（Ｉ３１
００１２はモノクローナル抗体１−［３７ｃ９４を産生
ずる。

本発明はまた、患者のＩ−ｆ　Ｉ　Ｖ　−１に対する暴
ハから■１１　Ｖ−２に対する暴露を識別する方法をも
提供する。該方法は、該患者からの生物学的試料を、実
質的にＨＩ　Ｖ−２のアミノ酸５７８からアミノ酸６０
３の領域からなるアミノ酸配列に結合した、アミノ酸配
列）Ｉ　Ｔ　Ｔ　Ｖ　Ｐ　Ｗを実質的に１４するエピト
−プを含む抗原、および該エピトープに特異的な抗体と
接触さＵて抗原抗体複合体を生成さＵ、ついで、生成し
た該複合体の舟を測定してＩ−１ｒ　Ｖ　−２に対する
暴露を決定する、ことを特徴とする。

他の態様において、本発明のモノクローナル抗体は、生
物学的試料中の抗ト冊Ｖ−２抗体を検出するためのプロ
ーブとして用いることができる。

以下、本発明をさらに詳しく説明する。

本発明は、アミノ酸配列［Ｉ　Ｔ　Ｔ　Ｖ　Ｐ　Ｗを実
質的に有するｌ−１１Ｖ−２ｇｐ４１上のエピト−プに
対する特異性を特徴とするモノクローナル抗体を１是供
する。ここで、「実質的」なる語は、保存されたまたは
保存されないアミノ酸変化を含みながら、なお該モノク
ローナル抗体により認識されるあらゆる関連配列を包含
することを意味する。

他の態様において、本発明は、本発明のモノクローナル
抗体を産生ずるハイブリドーマ細胞株を提供する。好ま
しい態様において、マウス由来ハイブリドーマ細胞株Δ
ＴＣＣｔｌＢＩ００１２はモノクローナル抗体Ｈ３７ｃ
９４を産生ずる。

本発明はまた、患者のＩ−Ｉ　Ｉ　Ｖ　−１に対する暴
露からＩ−Ｉ　Ｔ　Ｖ　−２に対する暴露を識別する方
法をも提供する。該方法は、該４ｗ者からの生物学的試
料を、実質的にＨＩＶ−２のアミノ酸５７８からアミノ
酸６０３の領域からなるアミノ酸配列に結合した、アミ
ノ酸配列１１ＴＴＶ））Ｗを実質的に有するエピトープ
を含む抗原、および該エピトープに特異的な抗体と接触
させて抗原抗体複合体を生成させ、ついで、生成した該
複合体の量を測定して！−Ｎ　Ｉ　Ｖ　−２に対する暴
露を決定する、ことを特徴とする。

上記方法に用いる抗原には、不活化全ウィルス、または
部分的に精製した天然の、合成の、もしくは組換えによ
り製造したＨＩＶ−２ｇｐ４１が含まれる。該エピトー
プに結合した該アミノ酸において用いた「実質的」なる
語は、保存されたまたは保γｆされないアミノ酸変化お
よびアミノ酸の付加もしくは欠失を含みながら、なお！
−１１Ｖ−２ｇｐ４１ヒト成体を認識するあらゆる配列
を包含することを意味する。

好ま１．い態様において、本発明の方法は、アミノ酸）
ＩＴＴＶＰＷを実質的に有するエピトープに特異的な抗
体としてｌ−１３７ｃ９４を用いる。このモノクローナ
ル抗体１−１３７ｃ９４は、該抗原に対する結合に関し
、試料中に含まれる抗１−１１　Ｖ　−２ｇｐ４１抗体
と競合する。

本発明の他の態様において、モノクローナル抗体Ｈ３７
ｃ９４は、生物学的試料中の抗ＨＩ　Ｖ２　ｇｐ４１抗
体を検出するためのプローブとして用いることができる
。好ましいｊ７３槌では、試験試料を標識Ｈ３７ｅ９４
と混合１−１ついで固体支持体に固定した組換えＩ−ｒ
　Ｉ　Ｖ−２ｇｐ４１を加える。

結合した標識［−１３７ｃ９４が存在しないと吸光度は
減少し、試験試料中に抗ＨＩＶ−２ｇｐ４１坑体が存在
したことを示ず。ｔｌ、３７ｃ９４をヒト抗ＩＩ　Ｉ　
Ｖ　−２抗体と競合さＵ゛る他のアッセイのり様は、当
業者には知られている。

本発明の方法により容易に試験できる生物学的試料とし
ては、全面、面清、商事、脳を髄液およびリンパ球など
のヒトおよび動物体液または細胞培養上清などが挙げら
れる。

本発明のイムノアッセイに用いる固体支持体としては、
反応トレイのウェル、試験管、ポリスチレンビーズ、ス
トリップ、膜、微細粒子、および当業者に知られた他の
固体マトリックスなどが挙げられる。

検出可能なシグナルを生成することのできるあらゆる標
識または酵素増幅ンステムを本発明のイムノアッセイに
用いることができる。代表的な標識としては、酵素標識
、放射性同位体標識、蛍光標識および化学発光標識が挙
げられる。または特異的結合成分のペアを用いることも
でき、その際、一方の成分を本発明アッセイの抗体に結
合させ、もう一方の成分を検出可能な標識に結合させる
。

たとえば、ビオヂン／標識抗ビオチン系のようなハブテ
ン／標識抗ハブテン系を用いることができる。加えて、
該抗体に対する標識特異的結合タンパク質を用いること
もでき、該タンパク質は、標識した第二の抗体または標
識したプロティンＡであってよい。」二記モノク【１−
ナル抗体がマウス（１＝山来するときは、該モノクロー
ナル抗体に特異的な標識ｂ″Ｃマウス免疫免疫グツ−１
プリンいることができる。本明細書に記載のモノクロー
ナル抗体を検１１するために、標識した抗イデイオタイ
プ抗体を用いることらできる。

加えて、本発明のアッセイ試薬は、キットを調製するの
に理想的に適している。その、Ｌうなキットは、密な区
域内に収容するために区画化されたギヤリヤ手段、およ
びバイアル、びん、試験管などの１または２以上のコン
テナー手段からなる。

各コンテナー手段は、本発明のイムノアッセイに用いる
別々の要素の一つを含んでいる。

細胞株Ｈ３７ｃ９４を、１９８９年１月３１［］に受託
番号１−１１１１００１２にてアメリカン・タイプ・カ
ルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　’ｒｙｐ
ｅＣｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｃｃｔｉｏｎＸ［７Ｚｌク
ビル、メリーランド）に寄託した。

以下に述べる方法および実施例は、本発明のモノクロー
ナル抗体Ｈ３７ｃ９４の調製および特徴付１ｙ、並びに
小者のＩＩＪＶ−１への暴露から１４　ＴＶ−２への暴
〃を識別するノコめのその臨床学的ａ用性を、詳述する
ものである。

ｎえ Ａ、合成ペプチドの合成 バラリー（Ｂ　ａｒａｒｙ）およびメリフィールド（Ｍ
ａｒｒｉｆｉｅｌｄ）により記載された一般的な方法Ｅ
グロス＆マイネホーフｙ　　（Ｇ　ｒｏｓｓ＆　Ｍｅｉ
ｎｅｈｏｆｅｒ）編、Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、　Ｖ
ｏｌ、２（アカデミツクプレス、ニューヨーク、１９８
０）］に従い、■目Ｖ−２エンベロープタンパク質の配
列６０４〜６３６に対応するペプチドを樹脂支持体上で
段階固相合成法（カルボキシ末々１′μ残ＪＩ（から合
成１１１１姶）により組み立てた。ＢＯＣ−Ｌ−Δ５ｎ
−ＯＣＨ，−Ｐａｍ樹脂をアプライド・バイオシステム
ズ・シンセサイザー（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔ
ｃｍｓ　５ｙｎｔｈｃｓｉｚｃｒ）、モデル４３０Δの
反応容器に移した。アルギニン、アスパラギンおよびグ
ルタミン付加の場合にニーニッヒ（Ｋｏｎｉｇ）および
ガイガー（Ｇ　ｅｉｇｅｒ）により記載されたＤＣＣ／
ｌ−１０＋３Ｔプロトコール［Ｃｈｅｍ、　＋３　ｅｒ
。

（１９７０）ｌ　０３ニア８８〜７９８］を用いた他は
、既存の対称無水物法（ｐｒｅｒｏｒｍｃｄ　ｓｙｍｍ
ｅｔｒｉｃ　ａｎｈｙｄｒｉｄｅ　ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
）により保護アミノ酸を樹脂支持体に段階的に二重結合
さＵ゛た。ずべてのα−アミノ末端残基はｔ−ブヂルオ
ギンカルポニル（１−ＢＯＣ）結合により保護し、種々
のアミノ酸残基の側鎖は下記基により保護した：Ｔｈｒ
（Ｂｚｌ）、Ｔｌ１ｓ（Ｔｏｓ）、Ｃｙｓ（４ＭｅＩ３
ｚｌ）、Ａ　ｒｇ（Ｔ　ｏｓ）、５ｅｒ（ｎｚｌ）、Ａ
ｓｐ（Ｏｌｌｚｌ）、Ｔｙｒ（２−Ｂｒ−Ｚ）、Ｌｙｓ
（２−Ｃ１−Ｚ）、Ｇ　Ｉｕ（ＯＢ　ｚｌ）、アミノ酸
のトリプト７７ンおよびメヂオニンは、側鎖保護基を用
いることなく使用した。トリプトファン導入後、その後
のすべてのＮα−保護（Ｂ　ＯＣ）基を除去するため、
インドールを１％（Ｗ／Ｖ）の濃度にてトリフルオロ酢
酸に加えた。メヂオニン導入後、エタンジオールもまた
０、２５％（ｖ／Ｖ）の濃度にてトリフルオロ酢酸に加
えた。

保護ペプチド−樹脂（３０Ｑｚｇ）を塩化メチレン（Ｃ
ｔｌｙＣＬ）中で５分間膨潤させた。、Ｎα−ＢＯＣ保
護基の除去は、インドールおよびエタンジオールを含有
する６０％トリフル才［１酢酸（ＴＥＡ／Ｃ１，ＣＩ、
）を用い、ＣＩＩｔＣｌ、で洗浄！７．１０％Ｎ、Ｎ−
ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥΔ／　ＣＨｔ　Ｃ
Ｉ　ｚ）で中和し、最後にＣＩ−１１ＣＩ　、で洗浄す
ることにより行った。この樹脂を真空乾燥させた。こう
して得られたペプチド−樹脂を無水フッ化水素酸（＋−
ｒＦ、　　Ｉ　０１１２）で処理し、これに０℃にてｐ
−クレゾール（１ｘＱ）およびジメヂルスルフィド（ｌ
　ｘＱ）を６０分間かけて加えた。Ｉ−Ｉ　Ｆを０℃に
て真空留去した。開裂した遊離のペプチドおよび樹脂を
ジエヂルエーテルのアリコート（１５ｇ０で３回洗浄し
た。ついで、このペプチドを４０％酢酸水溶液のアリコ
ート（１０１ので６回抽出した。

水性抽出物を集めて凍結乾燥して苓口製のペプチドを得
、情製に付した。

この粗製のペプチドを、分析カラム［Ｖｙｄａｃ−２１
４−ＴＰ５４、ビダック・セパレーション・グループ（
Ｖｙｄａｃ　５ｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ｇｒｏｕｐ）、ヘ
スペリア、カリフォルニア］においてはｌ　ｚ（１／分
の流速、セミプレバラティブカラｊｂ（Ｖｙｄａｃ−２
１４−ＴＰ　ｌ　０２２］、：おいてはｌ２Ｉａ／分の
流速にて、溶媒系として０．１％ＴＦΔ／水（Ａ）およ
び１００％アセトニトリル（Ｂ）の勾配を用いたＣ。

カラム上の逆相ＨＩ）　Ｌ　Ｃにより精製した。上記勾
配は、３０％Ｂで開始した。３分後、２０分の間にこの
勾配を４０％Ｂまで一次的に増加させ、ついで１分で３
０％Ｂに戻した。

ペプチドの存在は、２２５ｎａ＋および２８０止にてモ
ニターした。ペプチドの組成は、６Ｎ塩酸１０．３％フ
ェノール中、１５０℃にて２時間真空下に加水分解し、
引き続きベックマン６３００アミノ酸分析機で分析する
ことにより確認した。

Ｈ［Ｖ−２エンベロープの配列５７７〜６０７に対応す
るペプチドを上記のようにして組み立てた。トリプトフ
ァン導入後、その後のすべてのＮα−保護基（Ｌ−ＢＯ
Ｃ）を除去するため、インドールを１１／村の濃度にて
トリフルオロ酢酸に加えた。３２０ｉ９の保護ペプチド
−樹脂を８　、５３１１２の無水フッ化水素酸（ＩＩＦ
）で処理し、これにｐ−クレゾール（０，５Ｎ１２）、
ｐ−ヂオクレゾール（０，５ｇ）およびジメヂルスルフ
ィド（０，５ｆｆ□を加えた。

この粗製のペプチドを、２８％■３の勾配から始め、３
分後に２３分間かけて４５％Ｂまで一次的に増加させて
精製した。ついで、１分間かけて２８％Ｂまで戻した。

Ｂ、免疫 ５匹のＢａ１ｂ？ウスをｔｌ　Ｉ　Ｖ−２ｇｐ４１ペプ
チド６０４〜６３６で免疫した。５００朽のｐ６０４〜
６３６を、解毒した内毒素（５００μ？）およびトレハ
ロースダイマイコレート（５００１ｔ９）全含有するＲ
ＩＢＩアジュバント［ＲＩ　ｒ３　［イムノケム・リザ
ーヂ（ＲＩＢＩ　　Ｉ＋ｍｕｎｏｃｈｅｉ、Ｒｅ５ｅａ
ｒｃｈ　　ｉｎｃ、）］（製造業者により記載されたよ
うにしてクロロホルム／メタノール中で再溶解させたし
の）と混合した。スクアレン（２０μｍ２）を加え、こ
の混合物をホモジナイズし、ついで０．２％ツイーン２
０を含有する水を最終容量１．２ｚＱまで加えノこ。

１回目に各マウスに０　、　Ｉ　ｘＱを皮下で、Ｏ、Ｉ
　ｘＱ。

を腹腔内で投与し、ｐ６０４〜６３６を合計で約１００
μ？投与するようにした。８週間後、上記のようにして
２５（Ｊ１１９のｐ６０４〜６３６を２５０μ９のＲ１
８１アノユバントと混合することにより調製したｐ６０
４〜６３６（５０ｇｇ）を各マウスに投与して２回目の
免疫を行った。３回目、４回目および５回目の免疫に関
しては、それぞれ最初の免疫から２０週、２３逓および
２９週後に、Ｒ［ＢＩアジュバント中の約３４μ？、２
５μ２および２５μ９のｐ６０４〜６３６で腹腔内およ
び皮下投与によりマウスを免疫した。４回目の免疫の５
日後にマウスを出血させた。免疫マウスの免疫応答は、
下記で述べる酵素結合イムノアッセイにより、坑ＨＩ　
Ｖ　−２抗体についで血ｔ１１７をアッセイすることに
より評価した。４遇間後、１匹の特定（７）マウスを滅
菌水（１５０ｆｉ）中（７）ｐ６０４〜６３６　（Ｉ　
ｘｇ／ｘＱ、　　ｌ　ＯＯμＱ）を尾静脈に注射して免
疫した。３日後、このマウスを融合のため屠殺した。

Ｃ，マイクロタイタープレートの調製 １．０μ９／１１（ｌのｐ５７７〜６０７の溶液および
１．０ｇｇ／肩Ｑのｐ６０４〜６３Ｇの溶液を、炭酸水
素塩バッファー（ｐｉ−１９、６）を用いて１ｌｉ１０
した。

ウェル当たり１００μＱのｐ５７７〜６０７溶液かまた
はｐ６０４〜６３６溶液を用い、マイクロタイタープレ
ートを室温にて一部コーティングした。

このプレートを炭酸水素塩バッファーで洗浄し、ついで
室温にてウェル当たり２００μＱの炭酸水素塩バッファ
ー中の１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で３時間かけ
てコーティングした。このプレートを、０．０５％ツイ
ーン２０および０．０１％ドデシル硫酸ナトリウム（Ｓ
ＤＳ）を含有するりン酸緩衝食塩水（Ｐ［３Ｓ）で３回
洗浄した。

Ｄ　酵素結合イムノアッセイ（Ｅ　ＩΔ）未免疫マウス
および免疫マウスからの血清を、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ
、１０％ウノ胎仔血清（ＦＣＳ）１０％正常ヤギ血清（
ＮＧＳ）および０．５％トリトンＸ−１００を含有する
２０ｍＭリン酸カリウノ、・バッファー（＋１１１−（
７、４）で系列希釈した。この希釈血清を、」二足でジ
１η製しｐ５７７〜６０７かまた１；１ｐ６０４〜６３
６をコーティングしたマイクロタイタープレートのウェ
ルに加えた。この血清を含むプレートを４０℃にて３０
分間、ついで４℃にて一夜インキユベートした。このプ
レートを００５％０５％ライ２０を含ａず７．、＞　Ｐ
　Ｂ　Ｓ　テＩ　Ｏ回洗浄し、ついでＮＧＳ巾でＩ：ｌ
０００に希釈したヤギ抗マウス夏ｇＧ　（１ ＋１．）西洋ワザビベルオギ ノダーゼ（ｔｒＲＰＯ）結合抗体［ジャクノン・ラボラ
トリーズ（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
）］を加えた。

このプレートを４０℃にて１時間インキュベート１７、
上記のようにして１０回洗浄し、０−フエニレンノアミ
ン：　２１−Ｉ　ＣＩ（ＯＰ　Ｄ）発色試薬を加えた。

３０分後にＩＮ）［ｔＳ０４を加えてこの反応を停止さ
せ、４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。吸光度はウ
ェルに結合したマウス抗体の爪に正比例した。これらの
アッセイは、免疫マウスの血清中にＩ−［ＩＶ−２ｐ６
０４〜６３６に対する抗体が存在することを示していた
。ｐ６０４〜６３６で免疫したマウスは、ｐ６０４〜６
３６に対してＩＩＩｏ、ｏ　ｏ　ｏよりも大きな力価を
示した。ｐ６０４〜６３６に特異的な抗血清は、ｐ５７
７〜６０７に対して交差反応性を示さなかった。

Ｅ、細胞融合 屠殺マウスの牌臓（抗１−ｒ　Ｉ　Ｖ　−２抗体産生細
胞を含有）を、ワイヤースクリーンを通して２．ＯｍＭ
　Ｌ〜グルタミンおよび５０μ９ＩＲＱのゲンタマイシ
ンを含有するダルベツコ変性イーグル培地（１）ｕｌｂ
ｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍ
ｅｄｉｕｍ：ＤＭＥＭ）中へどろどろにつぶず（ｍａｓ
ｈｉｎｇ）ことにより単一細胞に破砕した。この単一細
胞懸詞液を０．８３％塩化アンモニウム−１０ｍＭ）リ
ス（トリス［ヒドロキシメチルコアミノメタン）で処理
して赤血球を溶解し、ついでＳ　Ｐ　２１０細胞と１：
１の比で混合した。この混合細胞を遠心分離にかけ、血
清不含培地で１回洗浄し、ついで再び遠心分離にかけた
。融合剤としてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用
い、免疫供与胛臓細胞とミエローマ細胞株Ｓ　Ｐ　２１
０とのハイブリッドを生成させた［コーラ−（Ｇ　、Ｋ
ｏｈｌｅｒ）およびミルシコタイン（Ｃ，Ｍｉｌｓｔｃ
ｉｎ）のＮａｔｕｒｅ（１９７５）２５６：４９４参照
、モノクローナル・ハイブリドーマ・アンチボディーズ
：テクニークス・アンド・アプリケーシコンズ（Ｍｏｎ
ｏｃｌｏｎａｌ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　Ａｎｔｉｂｏｄ
ｉｅｓ：　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ａｎｄＡｐｐｌｉｃ
ａｔｉｏｎｓ）、バレル（Ｊ、Ｇ、ｒｔ。

Ｈｕｒｒｅｌ　ｌ）編、ＣＩ’ｌｔＣブレス、１９８２
中で論証されている］。簡単に説明すると、脾臓細胞と
５Ｐ２１０細胞との融合は、上記ペレットを血清不含Ｄ
ＭＥＭ中の５０％ＰＥＧ（ソグマ、ＭＷ１０ｏｏ）に２
分間さらすことにより行った。このＰＥＧに血清不含Ｄ
ＭＥＭ（１ｊＩ（りを加え、１分間待ち、ついでさらに
２０籾の血清不含ＤＭＥＭを５分間かけてゆっくり加え
ることにより希釈した。

この細胞を遠心分離により回収した。上清をデカントし
、ＨＡＴ（ヒボキサンチン、アミノプテリンおよびデミ
ノン）添加２０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ（２０ｉ＋ｆ）
で置き換えてハイブリドーマを選択した。この細胞を約
ｌＸｌ０’細胞／ＩＩＱに希釈し、２４マルチウエルプ
レート中にｌ　ｚＱ／ウェルで入れた。非免疫Ｂａ１ｂ
／ｃマウスからの胛臓細胞もまたフィーダー層として加
えた。隔日毎にＩｘＱの培地をＨＡ　Ｔ添加２０％ＦＣ
Ｓを含む新たなりＭＥＭで置き換え、ハイブリッドをさ
らに７〜１４日増殖させた。　ハイブリブトの幾つかは
、５Ｐ２１０細胞に融合した抗ＨＴ　Ｖ　−２抗体産生
絆臓細胞からなっていた。簡単に説明すると、融合剤は
牌臓細胞膜と５Ｐ２１０細胞膜との間の融合を促進し、
両細胞の核を含むヘテロカリオンを生成させる。その結
果、異なる核は融合して同調有糸分裂を行うことのでき
る単一核を生成する。この融合細胞が分裂すると、ハイ
ブリッドは６核の染色体を失うことにより安定する。こ
の融合細胞をウェル当たり１０５〜１０１細胞にて複数
の２４ウエルプレート中に入れる。Ｓ　Ｐ　２１０・詳
臓細胞融合により生成した融合細胞は、Ｉｆ　Ａ　Ｔ培
地中で培養することにより１択的に増’ｈ（１さＵ゛る
。すべての未融合Ｓ　Ｐ　２１０またはＳ　Ｐ　２１０
二Ｓｔ”２１０融合細胞はアミノプテリンにより増殖が
妨げられ、また未融合牌臓細胞または絆臓：牌臓融合細
胞は培養中で死滅する。Ｓ　Ｐ　２１０　：牌臓）１イ
ブリツドのみがＩＩＡＴ選択培地中で増Ｗｆｉ　！１〜
るであろう。

つぎに実施例に基づき本発明をさらに詳しく説明するが
、本発明はこれらに限られるものではない。

実施例１ モノクローナル抗体のスクリーニング、クローニングお
よび特徴付は 上記方法を用い、Ｉ−Ｉ　Ｉ　Ｖ　−２に対する抗体に
ついでハイブリッドをスクリーニングした。１０〜１４
日後、プロトコールにおいて下記のような変化はあった
が上記方法の説明で記載したＥｌΔ法により、ハイブリ
ドーマ細胞培養を含むウェルからの培養液をスクリーニ
ングした。このプレートを培養液とともに４０℃にて３
〜４時間時間インベコベートついで０．０５％ツイーン
２０および０．１％ＳＤＳを含むＰ　１３　Ｓでプレー
トを洗浄した。選択したすべてのハイブリッドはｐ６０
４〜６３６と強く反応したがｐ５７７〜６０７に対して
は陰性であった。

さらに、標的抗原としてＨＩ　Ｖ　−１ｇａｇ／　ｔｌ
　ｌＶ　−２ｇｐ４１　（ｇａｇ−ｐ４１　）融合タン
パク質およびＣＫＳ−ＨＩＶ−２’ｌ’ＭＩ）断片（Ｃ
ＫＳ　　ＴＭＰ　、ＩＩＩ　Ｖ−２ＴＭＰの最初の１０
８アミノ酸を含有）融合タンパク質を用い、ハイブリッ
ドのウェスタンプロットを試験した。これらのタンパク
質は、米国特許出願第２７５３０９号および同第２７６
２６３号各明細書（１９８８年１１１１２３日出願）に
開示されているようにして調製した。

簡単に説明すると、５００μＣのｇａｇ−ｐ４１を５Ｉ
）Ｓおよび２−メルカプトエタノールで９５°Ｃにて処
理し、１０％ポリアクリルアミド−５ＤＳゲル中で電気
泳動にかけた［ラムリ（Ｌａｃ＋＋＋ｍ１ｉ）ら、Ｎａ
ｔｕｒｅ（１９７０）２　２　７：６　８　０−６　８
　５　コ。　同様に、部分精製ＣＫＳ−ＴＭＰＯ’）２
ｚ９／ｚＱ溶液（２５０Ｉｌ１２）をＳＤＳおよび２−
メルカプトエタノールで９５℃にて処理し、１２％ポリ
アクリルアミド−５Ｉ）　Ｓゲル中で電気泳動にか（Ｊ
た。クンバク質を、２５ｎ＋Ｍｌ−リス、１９２ｍＭグ
リシンおよび２．０％メタノールからなる標孕移動バッ
ファー（ｐｌ−４８、３）中、ゲルからニトロセルロー
スに＋００ｎｆｍｐの電気泳動により一夜かけて移すか
、または１　、　Ｏａｍｐにて１〜２時間かけて移した
［タウビン（ＴＯｗｌ）ｉｎ）ら、　　Ｐ　ｒｏｃ、Ｎ
ａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓ　ｃｉ、（Ｉ　　９　７　９　）
７６・４３５０〜４３５４］。」二足組換えタンパク質
を移し、０．１５Ｍ　ＮａＣｌを含有するｌ０ｍＭトリ
フ、（ＰＩ−１８、Ｏ）中の２０％ｒｃｓで＝ト０セ／
ｌｚロースをブロッキングした後、このニトロセルロー
スをストリップにカッティングし、これを用いて抗ＨＩ
Ｖ−２抗体の存在を決定した。

ウェスタンプロット法のため、ニトロセルしノーススト
リップ、選択ハイブリット（０，２ｘのおよびバッフｙ
−（２０ｍＭトリス、ＩｍＭＥＤＴＡ、０．２ＭＮａＣ
１，０，３％ｌ・リドンＸ−１００および２１２／峠Ｂ
ＳＡ、　ｐ１１７，５ＸＩ　、８峠）からなる反応混合
物を４℃にて一夜インキユベートした。

このストリップを緩衝界面活性剤（０，１％ＳＤＳおよ
び０．５％トリトンＸ−１００を含むｌｏｍＭＰＢＳ、
ｐｌ−（７，５，０、５Ｍ　ＮａＣＩおよび０．５％ト
リトンｘ−ｉｏｏを含むＰ［３５と交替で用いる）で洗
浄し、ついでＨＩＩ　Ｉ）　Ｏに結合したヤギ抗マウス
ＩｇＧ抗体を加えた。このストリップを室温にてＩ〜２
時間時間インベコベートついで緩衝界面活性剤で洗浄し
た。最後に、新たに二４製１．たＨ　Ｒｒ’発色試薬（
バイオラド；１２０ｘｇを４０ｚｕ）水冷メタノール中
に溶解し、ついで１２０１１ｊの３０％過酸化水素を含
む２００ｘ（のトリス緩衝食塩水（ｐＨ７，８）中に希
釈したもの）を加えることにより組換えタンパク質に結
合した抗体を視覚化した。このアッセイにより、ｌ（ｌ
　Ｖ　−２タンパク質に特異的な抗体が存在することが
示された。Ｈ３７を含む２つのハイブリッドがｇａｇ−
ｐ４１およびＣＫＳ−ＴＭＰの両方に対しブ【１ツト反
応性を示した。残りのハイブリッドはｇａｇ−ｐ４１に
対してのみ反応性であった。

このハイブリッドを、ゴーディング（、Ｊ、Ｗ、Ｇ。

ｄ　ｉ　ｎｇ）による［モノクローナル・アンヂボディ
ーズ：プリンシプルズ・アンド・ブラクティス（Ｍｏｎ
ｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒ１ｎｃｉ
ｐｌｅｓ　ａｎｄ　ｒ’ｒａｃｔｉｃｅ）（アカデミツ
クプレス、Ｎ、Ｙ、＋　９８３）Ｊ中に略述されている
指針を用いた限界希釈法により展開した。簡単に説明す
ると、このハイブリッドを１細胞／ウエルにて２−９６
マルチウエルプレート中に展開し、約２週間増殖させた
。単一のハイブリッドＨ３７から、細胞増殖およびコロ
ニー生成を含む４６のウェルが同定された。各ウェルか
らの培養液をＥＴＡおよびウェスタンプロットによリス
クリーニングした。これら４６ウエルのうち３つウェル
が抗１目Ｖ−２抗体に関し陽性であると同定された。こ
れら３つのウェルのそれぞれからの細胞を２４マルチウ
エルプレート中に展開し、ついで、さらに２５ｃｘ’フ
ラスコ、ついで７５ｃｚ″フラスコ中に展開した。これ
ら３つの展開したクローンのうちの一つを！（３，７，
ｃ９４と称した。

モノクローナル抗体１（３７ｃ９４のアイソタイプはＩ
ｇＧ２ａであると決定された。Ｅ　Ｉ　Ａアイツタ４１
手順にはヤギ抗マウスＩｇＧ免疫グロブリンをコーティ
ングしたマイクロタイタープレー１・を用い、これを該
クローンの培養液とともにインキュベートすることによ
り分泌マウス杭体を捕捉した。２時間後、このプレート
を洗浄し、ついでウザギ抗マウスアイソタイプをさらに
２時間適用した。このプレートを再び洗浄し、ＨＩＩＰ
　Ｏ結合ヤギ抗つサギＩｇＧを１時間適用した。過剰の
結合体を洗浄により除去し、ついでＯＰＤ基質を加えた
。マウス免疫グロブリンに結合したウザギ抗マウスアイ
ソタイプの川は４９２ｎｒｒｌで測定した吸光度と正比
例した。マウス腹水からのＨ３７ｃ９４抗体を用いてさ
らに特徴付けを行った。

−雇人ｍのＨ３７ｃ９４モノクローナル抗体を得るため
に、Ｈ３７ｃ９４クローンをマウス中で増幅させた。０
　、５　ｘＱのブリスタン（２，６，Ｉ　Ｏ。

１４−テトラメヂルベンタデカン）で前置て腹腔自処理
したＢａ１ｂ／ｃマウスに１〜２ＸＩ０７個のクローン
化１−１３７ｃ９４細胞を接種した（方法は土間バレル
の文献に略述されている）。プリスタン処理によりマウ
スミエローマハイブリッドのマウス腹腔内での増殖が促
進され、生成する腹水は該ハイブリッド細胞により分泌
されたモノクローナル抗体に富んでいる。モノクローナ
ル抗体に富んだ腹水が生成した後、これらマウスを層殺
し、腹腔から採取した腹水を遠心分離により清澄化した
。

以下に記載する特徴付は手順は、プロティンＡセファロ
ース（バレルの土間文献参照）を含む当該技術分野で公
知の精製法を用い、上記１１１１澄腹水または該腹水か
らの精製抗体を用いて行った。

活性および特異性の決定 マウス腹水中のモノクローナル抗体の力価を決定し、ま
た該モノクローナル抗体の特異性を評価するためにアッ
セイを行った。上記手順を用いたＥＴＡにより、腹水中
のモノクローナル抗体を滴定した。上記プレートを腹水
とともに４０℃にて１時間インキュベートした。モノク
ローナル抗体に富んだ腹水は、合成ベブヂドｐ６０４〜
６３６に対してｌ　：５００．０００以上の高い力価を
示した。この腹水はｐ５７７〜６０７に対しては反応性
を示さなかった。

加えて、モノクローナル抗体Ｈ３７ｃ９４の特異性を放
射性免疫沈降アッセイ（ＩＩＩＰＡ）により確認した。

ウィルスタンパク質の免疫沈降アッセイについではすで
に記載されている［デバレ（Ｄｃｖａｒｅ）ら、Ｐｒｏ
ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳ　Ａ（１９８６
）、８３：５７１８〜５７２２］。これらの研究に用い
た細胞株は、非感染１−１９細胞または）ｌ　Ｔ　Ｖ−
２感染［１９細胞であった。細胞を培養液から回収し、
メヂオニンおよびシスティンを欠＜　ＲＰ　Ｍ１１６４
０（ギブコ・ラボラトリーズ）で１回洗浄し、ついで同
じ培地中に１〜２．５Ｘ１０Ｌ′細胞／峠にて懸澗した
。洗浄細胞を６％ＣＯ１下、３７℃にて３０〜４５分間
インキュベートし、ついで各５０〜１００μＣｉの［”
Ｓ］メチオニンおよびビ８ｓｌシスティン（アマ−ジャ
ム）を培地に加えた。

細胞を３７℃にて４〜８時間放射性標識し、遠心分離に
より回収し、ＩｍＭＰＭＳＦ、アブ口ヂニン（バッファ
ー１１１２当たり１００カリクレイン不活化単位）、１
．０％トリトンＸ−１００，０，１％ＳＤＳおよび０．
５％デオキシコール酸ナトリウム（すべての試薬はシグ
マから入手）を含むＰＢＳ　（ｐＨ７、４）中溶解させ
た。この溶解物を１００゜ｏｏｏｘｙにて４０分間遠心
分離にかけることにより清澄化し、−７０℃にて貯蔵し
た。

細胞溶解物の１００μｇアリコートを１０μＣのモノク
ローナル抗体に富んだ腹水または１００μＱの組織培養
液とともに４℃にて３０〜６０分間インキュベートする
ことにより免疫沈降を行った。

抗体−抗原複合体を、ＢＳΔ（１１９／ｚＱ）を含む溶
解バッファー中で前辺て洗浄した２００μＱの前膨潤プ
ロティンΔ−セファロース（ファルマシア、ＩｇＧ結合
能：５０〜２００μｇ／２００μクプロテインΔ）を加
えることにより回収した。この反応混合物を４℃にて１
時間激しく＠盪し、ついで溶解バッファーを用いてこの
プロティンΔ−セファロースを３回洗浄した。ついでプ
ロティンＡ−セファロースを遠心分離により回収し、つ
いで、２−メルカプトエタノールを含有するＳＯＳゲル
試料バッファー中、９５℃にて加熱することにより免疫
複合体を解離させた（ラムリらの土間文献参照）。この
試料を５ＤＳ−１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動
に供した。このゲルをエンハンス（Ｅ　ｎｈａｎｃｅ）
（デュポン）中で３０分間インギュベートし、乾燥し、
免疫沈降放射性標識タンパク質のオートラジオグラフィ
ーのためにＸ線フィルム１こ暴露した。１４１　Ｖ　−
２ｇｐｌ　１内のエピトープに対するＨ３７ｃ９４抗体
の特異性は、Ｈ［Ｖ　−２感染Ｈ９細胞溶解液からの［
３Ｓｓ］メヂオニン／［３１ｉｓ］システィン生合成標
識ウィルス糖タンパク質ｇｐ１６０（未開裂エンベロー
プ前駆体）およびｇｐ４１の免疫沈降により確認された
。その結果、上記モノクローナル抗体により１（Ｉ　Ｖ
　−２感染細胞溶解液からｇｌ）１６０およびｇｐｌ　
１は沈降したがｇｐ１２０は沈降せず、また放射性標識
細胞タンパク質の非特異的免疫沈降は検出されないこと
が示された。それゆえ、このモノクローナル抗体Ｉ４３
７ｅ９４はｉ−Ｔ　ｒ　Ｖ　−２ｇｐｌ　６０／４　Ｉ
に特異的に結合した。バンドパターンは、）ＩＩＶ−２
血清陽性血清での沈降に対応するｇｐ１６０、ｇｐｌ　
１および小バンド（ｇｐｌ　１の可能な断片）の沈降を
示し、他の研究者による他の１−１１　Ｖ　−２経膜タ
ンパク質に関する報告を確認した。Ｈ３７ｃ９４は、Ｈ
Ｉ　Ｖ２血清陽性の患者に見られるのと同じタンｌ＜り
質を認識する。

実施例２ モノクローナル抗体Ｈ３７ｃ９４により認識されるエピ
トープのマツピングおよび特徴付け：ハイブリッドのＥ
ＩＡスクリーニグにより、１■３７ｃ９４はｐ５７７〜
６０７を認識しないことが確立された。さらに、Ｈ３７
ｃ９４腹水は、ウェスタンブロッティングにおいてＣＫ
Ｓ−ＨＩＶ−２ＴＭＰ断片融合タンパク質を認識した。

免疫ペプチドのアミノ酸配列は以下の通りである。

ＨＴＴＶｒ’ＷＶＮＤＳＬＡｒ’ＤＷＤＮＭＴＷＱＥＷ
ＥＫＱＶｒｔＹＬＥＡＮ 非交差反応ペプチドｐ５７７〜６０７のアミノ酸配列は
以下の通りである。

ＡｎＶＴＡ　Ｉ　ＥＫＹ　ＬＱＤＱＡＲＬＮＳＷＧ　Ｃ
ＡＦ　ＲＱＶ　ＣＩ−ＩＴＴＶ ＣＫＳ−ＨＩＶ−２ＴＭＰ断片融合タンパク質のアミノ
酸配列は以下の通りである。

ＹＳＳ・・・ＷＤＷＡＲＬＮＳＷＧＣΔＦＲＷＶＣＨＴ
ＴＶＰＷ／５ＴＬＥＤＰＩＩＶ・・・（スラッシュの後
のアミノ酸はクローン中のナンセンスコードを示す） モノクローナル抗体Ｈ３７ｃ９４は、アミノ酸配列１−
Ｉ　Ｔ　Ｔ　Ｖ　Ｐ　Ｗを有するエピトープを認識する
が、このアミノ酸配列は上記免疫ペプチドと上記融合タ
ンパク質の両方に共通している。上記免疫ペプチドと上
記融合タンパク質との間に６個のアミノ酸がオーバーラ
ツプしていることにより、ｌ−ｌ３７ｃ９４が認識する
エピトープが提供される。ｐ５７７〜６０７の配列ＨＴ
　Ｔ　Ｖは、Ｈ３７ｃ９４の認識するエピトープを生成
するには不充分である。

ＨＴＴＶＰＷＶＮＤＳＩ、ＡＰＤＷＤＮＭＴＷＱＩＪＥ
ＫＱＶＲＹＩ、ＥＡＮＹＳＳ・４ＤＷＡＲＩ、Ｎ５ＷＧ
ＣＡＦＲＷＶＣＩＩＴＴＶＩ４／ＳＴＩ、ＥＤＩ’ＲＶ
−・さらに、ｌ（Ｉ　Ｖ−１の対応領域中の配列と比較
したところ、６個のアミノ酸のうち２個が異なることが
わかった。この変化は、Ｈ３７ｃ９４がＩ■ＩＶ−１ｇ
ｐ４１を認識させなくするのに充分である。

ｉ−ｒ　＋　ｖ　−ｉ　　　・・Ｈ’［”　Ｔ　Ｖ　Ｐ
　Ｗ・・ＨＩＶ−２・　　−ＴＴＡＶＰＷ　　・　　一
実施例３ ■（ＩＶ−１およびＩ−１１Ｖ　−２の識別：本発明に
従って、Ｈ３７ｃ９４はＩ（Ｉ　Ｖ　−２血清陽性試料
の検出のための競合プローブとして有用であることが示
された。さらに本発明に従って、Ｈ３７ｃ９４は患者の
ｌ−Ｉ　Ｉ　Ｖ　−１へのａＮからＨＩＶ−２への暴露
を識別するのに利用することができる。というのは、Ｈ
３７ｃ９４はＨＩ　Ｖ　−２ｇＰ’ｌ　ｌに対する抗体
を含有する試料とは競合するが、）［ｒＶ　−１ｇｐ４
１に対する抗体を含有する試料とは競合しないからであ
る。Ｉ−ｆ　Ｉ　Ｖ　−１血清陽性血清は競合イムノア
ッセイにおいてＴ−Ｔ　３７　ｃ９４と容易に競合しな
いが、ＨＩ　Ｖ−２血清陽性血清は競合する。

１−１３７ｃ９４競合アッセイの好ましい態様におイテ
、組換えＣＫＳ−ト［ＩＶ−２ＴＭＰ断片融合タンパク
質を固体支持体上にコーティングし、試験試料およびモ
ノクローナル抗体）［３７ｃ９４とともにインキュベー
トした。試験試料中に存在するｒ−ｒ　ｉ　ｖ　−２ウ
ィルス特異的抗体は、固体支持体上の組換えタンパク質
への結合に対してトｌ３７ｃ９４と競合した。組換えタ
ンパク質に結合したＨ３７ｃ９４の量は、ＨＲＰ　Ｏに
結合したヤギ抗マウス免疫グロブリンを用いることによ
り定量した。

血清試料（１５個のｌ−１１Ｖ−１，＋５（１，！ｊの
１−目Ｖ−２および５個の「両者」）をｌ−１３７ｃ９
４競合アッセイ法により試験した。Ｉ−＋　１　Ｖ　−
１、Ｉ−［Ｉ　Ｖ　−２または「両者Ｊ（ＨＩ　Ｖ　−
１およびＩ−１１Ｖ　−２に対する別々の抗体集団を含
む）という血清の分類は、生合成的に標識したｇｐ１２
０のＩ−ｒ　Ｉ　Ｖ感染細胞溶解液からの沈降（ＲＩＰ
Ａ）、またはウェスタンプロットにより評価されるよう
にウィルスｇｐ＋２０に対する反応性により、ｇｐ１２
０に対する抗体の存在に基づいている。

Ｈ３７ｃ９４競合アッセイにおいて、陽性コントロール
の吸光度と陰性コントロールの吸光度との合計を２で割
った値に等しい吸光度値はカットオフ値と考えた。この
カットオフ値よりも高い吸光度値を示ず試料はＨ３７ｃ
９４とは競合しないしのと考えられ、［非１−（Ｉ　Ｖ
　−２Ｊと分類した。カットオフ値よりも低い吸光度値
を示ず試料は■１３７ｃ９４と競合すると考えられ、ｒ
Ｈｌｌ−２Ｊと分類した。それゆえ、「非ＨＩＶ−２Ｊ
血清の試料／カットオフ吸光度値（Ｓ／Ｃｏ）が１．０
に等しいかまたはそれより大きく、ｒＨＩＶ−２Ｊ血清
のＳ／Ｃｏは１．０未満である。

第１表に示されるように、ｌ−１３７ｃ９４をプローブ
として用いた競合アッセイは、）Ｉ　Ｉ　Ｖ−２血清陽
性試料とＨｆＶ−１血清陽性試料とを識別するために有
効な方法である。ＨＩＶ−２ｇｐ４１に対するｌ−１３
７ｃ９４の特異性は、それが抗Ｉ−［［Ｖｉ抗体とは競
合しないことにより示された。

１５個のすべてのＩ−１１Ｖ−１試料は、Ｈ３７ｃ９４
競合アッセイにおいて「非１−ｒ　Ｉ　Ｖ−２Ｊと同定
された。１５個のト目Ｖ−２試料に関しては、すべて正
しく同定された。両者として分類された試料は競合アッ
セイにおいて検出され、ｒＩ−（Ｉ　Ｖ　−２Ｊと同定
された。

（注）ＮＤ：決定Ｕず ＊　：ウエスタンプロットにより決定したｇｐ１２０と
の反応性 ＊＊：ＨＩＶ−１陽性として知られるラツンコ・プレス
ビテリアン・セント・ルーカス・メディカル・センター
（Ｒｕｓｈ　Ｐｒｅｓｂｙｔｅｒｉａｎ　Ｓｔ、　Ｌｕ
ｋｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ）、シカゴ、
Ｔ　Ｌからの米国血清陽性試料 加えて、」二足Ｈ３７ｃ９４６Ａ合アッセイを用い、正
常集団からの６３個の試料をスクリーニングした。この
アッセイは、平均Ｓ／Ｇｏ値り月、６（ＳＤ＝Ｏ，ｌ　
１４、ＣＶ＝７．２％）を示した。

Ｉ−＋３７ｃ９４競合アッセイをさらによく特徴付ける
ため、第１表からの幾つかの血ｍ試料についで（ａ）組
換え経模タンパク質に対する反応性、（ｂ）ＨＩＶ−１
およびｔ（Ｉ　Ｖ　−２の経膜タンパク質の免疫優性領
域（目）！１）を示す合成ペプチドに対する反応性、お
よび（ｃ）下記に記載するペプチド抑制アッセイにおけ
る反応性を分析した。使用した組換えタンパク質は、Ｈ
Ｉ　Ｖ　−１に関しては１．４１Ｖ−１ｇｐ４１のＢｇ
ｌ　ＩＩ−Ｋｐｎ　Ｉ制限断片、ＨＩＶ　−２１，：関
してはＣＫＳ−ＨＩＶ−２ＴＭＰ断片融合タンパク質で
あった。使用した合成ペプチドは、Ｉ−１１Ｖ　−１＋
、：関してはｐ５８４〜６１１０１Ｔ　Ｌ　Ｖ−ｉｌｌ
　Ｂ　）、ｌ−１１Ｖ−２ＴＩ）Ｉｔに関してはｐ５７
７〜６０７であった。両ＥｌΔアッセイとも、−１−記
方法の欄で説明した■シＩΔ手順と同様の手順を用いて
行った。

ペプチド抑制アッセイ法 １−１１　Ｖ−１１Ｄ　ＲかまたハＨＩ　Ｖ−２１Ｄｌ
ｌの合成ペプチドを８８％ギ酸中に可溶化し、０５ＭＮ
ａＣｌおよび０．００２２％トリ）・ンＸ−１００を含
むＯ，１Ｍトリスバッファー中に５ｆｌｙ／ｘＱに希釈
し、ｐ　＋−１を８．５に調節した。このペプチドをポ
リスチレンビーズとともに３７℃にて２時間インキュベ
ートした。このビーズをＩ）　Ｂ　Ｓ中の０．１％トリ
トン（ｐ＋−１７、４）で４０℃にて１時間洗浄した。

このビーズをＰ　Ｂ　Ｓで洗浄し、Ｐ　１３　Ｓ中の５
％ＢｓΔを４０°Ｃにて１時間コーティングし、Ｐ　Ｕ
　Ｓで洗浄し、ＰＢＳ中の５％ショ糖で室温にて２０〜
３０分間コーティングした。

−ｒｙｓＶ−２”＋７々、目　ヘフ壬Ｋ　Ｊｎｌ　１ｉ
１１７−＋　セＩ　ノｂｇ度を最適化するために血清を
滴定した。適当な希釈液（１０μｍ２）を、Ｉ−［Ｉ　
Ｖ　−１かまたはｌ−［Ｉ　Ｖ　−２１ＤＲ’＜プチド
（１０ｕ　ｇ／ｘＱヘブチドを１００μＣ１または１０
０１１／峠ペプチドを１００μＱ）、および０．０９Ｍ
　ＮａＣ１，０，２％トリトンＸ−１００，２０％ＮＧ
Ｓおよび１０％ＦＯＳを含有”４゛る１１ｍＭリン酸ナ
トリウムバッファー（３００μｍ２）と混合した。４０
°Ｃにて１時間後、ビーズに結合したペプチドを加え、
この混合物を４０℃にて２時間インキコベートした。ビ
ーズはまた単独で血清ととらにインキュベートし、コン
トロールとした。これらビーズを蒸留水で洗浄１２、」
―記血清に富んだバッファー中で希釈したヤギ抗ヒト１
　ｇＧ　（Ｈ−＋−Ｌ）　−ＨＲＰ　Ｏと反応させ、発
色させた。

これら分析の結果を第２表にまとめである。両方のＥＩ
Ａアッセイとも、非希釈試料の５ｌＣＯ値として終点希
釈の逆数を括弧内に入れて結果を示した。終点希釈とは
、血清が陽性結果を示す最大希釈として定義される。さ
らに第１図に示すように、ベブヂド抑制アッセイにおｌ
ｊる反応性に従って血清をｔｌ　Ｉ　Ｖ　−１、Ｉ−（
Ｉ　Ｖ　−２、ＨＩ　Ｖ　−１と反応性のｌ−１１Ｖ−
２（２ＸＩ）または両者として分類した。ＩＩ　Ｉ　Ｖ
−２抗体陽性であるがｌ−ｒ　Ｉ　ＶＩＤＲペプチドを
も弱く認識した血ｔ１ｇは２ＸＩと分類した。

ベブヂド抑制アッセイに括づく試料の分類は、Ｒ１１）
Ａデータ、および第１表に示したＩ−１３７ｃ９・１競
合アッセイ結果と対応するものであった。

加えて、直接Ｅ　Ｉ　Ａアッセイにおいて、抗原標的と
して組換え経膜タンパク質またはより短いＩＤ［２ベブ
ヂドのいずれを用いたかにかがイつらず、２×１と分類
された試料は！−１１Ｖ　−１および［１１Ｖ−２標的
の両方と反応した。２ＸＩ試料は、＋（３７ｃ９４ＱＡ
合アッセイにおいてｌ−１３７ｃ９４と明らかに競合し
た。これらの■Σ［Ａデータは、組換えｐ４１タンパク
質または免疫優性萌域を含むベブヂドが、Ｉ−１１Ｖ　
−１からＩＩ　Ｉ　Ｖ　−２を必ずしも識別することが
できるものではないことを明確に示している。これとは
対照的に、ｌ−１３７ｃ９４競合７ツセイは１４１　Ｖ
−１から１−１１　Ｖ　−２を識別し、Ｉ−（Ｉ　Ｖ　
−１と交差反応性のＨＩ　Ｖ　−２試料および両者感染
試料中で■目Ｖ−２を検出することができる。それゆえ
、Ｈ３７ｃ９４競合アッセイは、組換えタンパク質また
は合成ベブヂドに比べて識別試薬として優れたものであ
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は、夏ＨＶ−１血清、ＨＩ　Ｖ　−２血清、両者
゛、およびＨＩＶ−１と交差反応性のＨＩ　Ｖ　−２血
清（２ＸＩ）における、固体支持体上のＬＩ　Ｉ　Ｖ−
Ｉ　　ＩＤＲおよび固体支持体上の夏１１Ｖ−２１ＤＩ
との競合ペプチド不在、ＨＪＶ−１１ＤＲペブヂドおよ
びＨｒ　Ｖ　−２［Ｄ　ｒ（ペプチドの反応性を吸光度
（４９２ｎｍ）で示すグラフである。 特許出願人　アボット・ラボラトリーズ化　理　人　弁
理士　青　山　　葆ほか１名吸光！ｆ（４９２ｎｍ） 吸光＋、ｔ（、ｉ　９２　ｎｍ）

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. （１）アミノ酸配列ＨＴＴＶＰＷを実質的に有するＨＩ
   Ｖ−２ｇｐ４１上のエピトープに対する特異性を特徴と
   するモノクローナル抗体。
2. （２）請求項（１）に記載のモノクローナル抗体を産生
   する哺乳動物抗体産生細胞株。
3. （３）ミエローマ細胞株ＳＰ２／０に融合させたマウス
   脾臓細胞の細胞ハイブリッドからなるハイブリドーマで
   ある請求項（２）に記載の細胞株。
4. （４）マウス由来ハイブリドーマ細胞株ＡＴＣＣＨＢ１
   ００１２。
5. （５）ハイブリドーマ細胞株ＡＴＣＣ　ＨＢ１００１２
   により産生されたモノクローナル抗体。
6. （６）患者のＨＩＶ−１に対する暴露からＨＩＶ−２に
   対する暴露を識別する方法であって、 該患者からの生物学的試料を、実質的にＨＩＶ−２のア
   ミノ酸５７８からアミノ酸６０３の領域からなるアミノ
   酸配列に結合した、アミノ酸配列ＨＴＴＶＰＷを実質的
   に有するエピトープを含む抗原、および該エピトープに
   特異的な抗体と接触させて抗原抗体複合体を生成させ、
   ついで 生成した該複合体の量を測定してＨＩＶ−２に対する暴
   露を決定する ことを特徴とする方法。
7. （７）該生物学的試料と該抗原および該抗体との接触を
   、該抗原を固体支持体に固定し、ついで該試料を該固体
   支持体に固定した該抗原、および該抗体と接触させるこ
   とにより行う請求項（６）に記載の方法。
8. （８）抗体がモノクローナル抗体である請求項（６）に
   記載の方法。
9. （９）モノクローナル抗体が請求項（１）から（５）の
   いずれかに記載のモノクローナル抗体である請求項（８
   ）に記載の方法。
10. （１０）モノクローナル抗体を検出可能な標識で標識し
    てある請求項（９）に記載の方法。
11. （１１）標識が、放射性同位体、酵素、蛍光化合物、化
    学発光化合物および特異的結合成分のペアよりなる群か
    ら選ばれたものである請求項（１０）に記載の方法。
12. （１２）生物学的試料中のＨＩＶ−２ｇｐ４１に対する
    抗体の存在または量を検出する方法であって、該試料を
    、実質的にＨＩＶ−２のアミノ酸５７８からアミノ酸６
    ０３の領域からなるアミノ酸配列に結合した、アミノ酸
    配列ＨＴＴＶＰＷを実質的に有するエピトープを含む抗
    原、および該エピトープに特異的な抗体と接触させて抗
    原抗体複合体を生成させ、ついで 生成した該複合体の量を測定して試料中のＨＩＶ−２ｇ
    ｐ４１に対する抗体の存在または量を決定する ことを特徴とする方法。