JPH04505621A

JPH04505621A - Ｔリンパ球向性レトロウイルス単クローン抗体

Info

Publication number: JPH04505621A
Application number: JP2508986A
Authority: JP
Inventors: バツトマン，ブライアン・テイー; ベネツタ，トーマス・エム
Original assignee: アクゾ・エヌ・ヴエー
Priority date: 1989-05-15
Filing date: 1990-05-14
Publication date: 1992-10-01
Also published as: FI915333A0; CA2032509A1; AU642886B2; KR920701243A; AU5835590A; WO1990014358A1; KR0168447B1; ZA903492B; EP0472659A4; EP0472659A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】Ｔリンパ球内性しトロウィルス単りローン抗体産業上の利用分野本発明は、単クローン抗体、その単クローン抗体のエピトープを包含するペプチド、及びＴリンパ球向性レトロウィルス、特にＨＩＶ−１、ＨＩ　Ｖ−２、及びｓｒｖの検出のために上記の単クローン及び上記のペプチドを用いる検定に関する。

発明の背景Ｔリンパ球向性レトロウィルス族としては、レンチウィルスの中でもとりわけ、サルレトロウィルスＳＩＶ、並びにヒトレトロウィルスＨＩＶ−１（ＡＩＤＳの有望な病因）及びＨＩＶ−２が挙げられる。ＨＩＶ−１及びＨＩ　Ｖ−２は、進化的に関連があるけれども、核酸配列分析から、ＨＩＶ−２はＨＩＶ−１よりもＳＩＶとより密接に関連することが明らかにされている。Ｇｕｙａｄｅｒ等（１９８７）は、彼らが比較したＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２単離体間に４２％のみの全ゲノム配列一致を認めただけであった。ｉｎ　ｖｉｔｒｏ細胞変性及びＣＤ４向性（Ｃ１ａｖｅｌ　ｅｔ　ａｌ、、１９８６）のようなＨＩｖ−１関連の微細構造的及び生物学的特性にもがかわらず、ＨＩＶ−２感染患者は、ＡＩＤＳ１純粋に神経学的な疾患、又は無症候性感染の特徴を表わす疾患を示し得る（Ｋｕｈｎｅｌｅｔ　ａｌ、、１９８８）。

ＨＩＶ−１及びＨＩＶ〜２ゲノムは、逆転写酵素を含めたひとつまたはそれ以上の酵素をコードする配列、ウィルス構造蛋白質をコードするｇａｇ及びｅｎｖ領域、ＬＴＲ及びその他のＯＲＦ及び調節成分を包含する典型的レトロウィルス構成を有する。ＨＩＶ−１のｇａｇ領域は、ｐ５５として公知の前駆体ペプチドをコードする。ｐ５５は、プロセッシングされて蛋白質の中でもとりわけｐ２４として公知の主要なコアまたはキャプシド蛋白質を生じる。ＨＩｖ−２では、類似のｇａｇ前駆体はより大きく、ｐ５７として公知であって、主要コア蛋白質はｐ２６として公知である。ＨＩＶ−１及びＨＩ　Ｖ−２（７）ｇ　ａ　ｇ蛋白質の高度の保存が予期されるけれども、Ｇｕｙａｄｅｒ等（１９８７）は、ＨＩｖ− １及びＨＩ　Ｖ　２　ｇ　ａ　ｇ　蛋白質問’）アミノ酸の５８％の一致を見いだしただけであった。ＨＩＶ−１の遠縁の単離体の間でさえ、ｇａｇ蛋白質の９０％以上の一致が認められる。この及びその他のデータは、ｆ（ＩＶ−１及びＨＩＶ−２は多少関連があるけれども、にもかかわらずそれらは異なるレトロウィルス種であるという仮説を支持する。

ＨＩＶ−１、及びおそらくはＨＩＶ−２もヒトの免疫系にこのような影響を及ぼすため、ＨＩＶの存在を検出するための高感度で迅速な診断的検定が、集団スクリーニング、血液バンクの品質管理、診断、ワクチン及び治療法を獲得する目標を確実にするためにそれらのウィルスについての我々の理解の増進などに利用できることが望ましく、実際に肝要である。容易で便利なために、検定はＥＬ　Ｉ　ＳＡ法のような免疫学ベースのものであり、そして再現性、特異性、及び一貫性のためには、試薬は単クローン抗体であって抗原特性ペプチドを明示することが好ましい。ｐ２４抗原血症はＨＩＶ感染の初期徴候であり（Ｋｅｓｓｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、１９８７；Ｗａｌｌ　ｅｔ　ａｌ、、１９８７）　、ＡＩＤＳ続発病の臨床的進行は抗ｐ２４の減少に関連し、一方ＡＩＤＳ患者は高レベルの抗ｅｎｖ価で死亡し得るという観察（Ｃｏａｔｅｓ　ｅｔ　ａｌ、、１９８７）のために、検定はｐ２４／ｐ２６のようなｇａｇ生成物を検出するよう仕向けられるのが有利である。

Ｗｅｉｓｓ等（１９８８）は、放射免疫沈降検定、及びＥＬＩＳＡ法においてＨＩＶ−２ｇｐ１３０に特異的な抗体を含有するヒト血清資料を確認した。それらの抗体は、ｖｓｖ偽型中型中和検定びＣ８１６６シンシチウム形成検定の中和において、低レベルのＨＩＶ−１交叉反応性を示した。

Ｍｉｎａｓｓｉａｎ等は、ＨＩＶ−２に対して生じたＲＩＣ７と確認された単クローン抗体を記載している。抗キャプシド抗体（ｐ２６）ｔ”あるＲＩＣ７は試験した３つｃ７）ＨＩ　Ｖ　−２単離体とだけでなく、試験した５つのＨＩｖ− １単離体及び７つのＳＩＶ単離体と反応した。イムノプロットにおいては、ＲＩＣ７は、ＨＩ　Ｖ−２＋７）５５ＫＤ及び２６ＫＤ蛋白質、ＨｒＶ−１（７）２４ＫＤ及び５５ＫＤ蛋白質、及び２８ＫＤ（７）ＳＩＶ蛋白質と結合した。

Ｎｉｅｄｒｉｇ等は、ＨＩＶ−１に対する２９の単クローン抗体のパネルを開発した。一つの抗体はｐ１７及びその前駆体に対するものであり、一方残りのものはｐ２４と反応し、それらのいくつかはｐ５５とも反応した。ｐ１７抗体は、ＨＩＶ−１特異性であることが判明した。２８個の抗ｐ２４抗体のうち、２０個はイムノプロットにおいてＨＩＶ−２の対応するキャブシト蛋白質（ｐ　２６）と反応し、そのうち５つは対応するＳＩＶ蛋白質ｐ２８をも認識した。Ｎｉｅｄｒｆｇ等は、抗体価、抗原捕獲検定における抗体の効力、あるいはどの抗体がｐ２６、ｐ５５、又はその両方と結合することについては言及していない。さらに、数個の抗体は、ＨＩＭ−２標本において未知の機能を有する２２ＫＤ蛋白質と反応した。

血清、血液、血液製品、又はその他の身体組織の試料中のＨＩＶ−１の検出のために、多数の診断キット及び検定が開発されてきた。その検定には、ウェスターンプロット、酵素結合免疫吸収検定（ＥＬＩＳＡ）、又は間接的免疫蛍光検定といったような技法が用いられ、全ウィルス又は精製ウィルス抗原に対する抗体が使用される（例えば、Ｇａ１ｌｏ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｕ、Ｓ、Ｐａｔｅｎｔ　Ｎｏ、４，５２０．１１３；Ｓａｒｎｇａｄｈａｒａｎ　ｅｔ　ａｌ、、（１９８４）；及びＲｏｂｅｒｔ−Ｇｕｒｏｆｆ　ｅｔ　ａｌ、（１９８２）を参照）。

本発明の要約本発明は、単クローン抗体、それらの抗体を産生ずる細胞株、それらの抗体のエピトープを包含するペプチド、及びＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２遺伝子生成物並びにＳＩＶ遺伝子生成物の検出のためのそれらの抗体及びペプチドの使用に関する。特に、本抗体はｐ　２４　／　ｐ　２６キヤプシド蛋白質と反応する。ＨＩＶ −１／ＨＩＶ−２保存エピトープを包含するノナペプチドが開示され、ＨＩＶ− １及びＨＩＶ−２を同時に検出し得る３つの単クローン抗体の組み合わせを用いる捕獲（ｃ　ａ　ｐ　ｔ　ｕ　ｒ　ｅ）ＥＬ　Ｉ　ＳＡが開示される。

図面の簡単な説明図１は、捕獲ＥＬ　Ｉ　ＳＡにおける培養上澄の反応性を示すグラフである。詳細な説明は表１に示しである。

図２は、抗ＨＩＶ抗体の特異性を測定するイムノプロットニトロセルロースストリップの写真である。

図３では、蛋白質入精製抗体をイムノプロットにおける分離ＨＩＶ−２蛋白質に対するプローブとして用いた。レーン１及び２は陽性対照であり、レーン３は陰性対照である。

図４は、エピトープをマツピングするために用いたいくつかの組み換え体ｐ２４ペプチドの図である。

図５は、種々の単クローン抗体が結合するｐ２４の４つの領域の図である。

図６は、種々の単クローン体とプロット化ｇａｇ及びｇａｇ断片が反応するウェスターンプロットの写真である。各写真のレーン１は全ウィルス溶解物質を含有する。各写真のレーン５は陰性対照ｐ２４−プラスミドであり、各写真のレーン６は非ＨＩＶ感染ＭＯＬＴ溶解物質を含有する別の陰性対照である。

図７は、７−Ｄ４のエピトープを測定するために抗原として連続的重複ノナペプチドを用いるＥＬ　Ｉ　ＳＡ法の結果を示すグラフである。

図８は、ＥＬ　Ｉ　ＳＡ法において抗原として連続的重複ノナペプチドを用いるエピトープマツピングを示す図である。

図９は、７−Ｄ４エピトープを包含する領域の組成である。

図１０は、固相上で２つの抗ｐ２４抗体、６−ＣＩＯ及び５−Ｂ４と、抗原としてＨｒＶ−１感染ＭＯＬＴ３溶解物質を用いる捕獲ＥＬ　Ｉ　ＳＡ法の感度のグラフである。ＨＲＰ結合ヒト抗ＨＬＶがレポーターであった。

図１１は、ＨＩＶ−２のｐ２６を検出するために固相上で７−Ｄ４と共に又は伴わずに６−ＣＩＯ及び５−Ｂ４を用いる捕獲ＥＬ　Ｉ　ＳＡ法の感度のグラフである。

図１２は、６−ＣＩＯ１５−Ｂ４、及び７−Ｄ４を用いる捕獲ＥＬ　ｒ　ＳＡ法におけるｆ（ＩＶ−１及び）ＩｆＶ−２１，：関すル用量反応曲線である。

図１３は、３抗体捕獲ＥＬＩＳＡ法と逆転写酵素検定との間のＨｒＶ−１用量反応曲線の比較である。

本発明の詳細な説明本発明は、単クローン抗体及びその産生、イムノアッセイ、並びにオリゴペプチドに関する。使用した方法は当業界で公知であって、本明細書中では簡単に考察するだけである。本発明を実行するのに適した方法は、Ｍｅｔｈ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１２１．　（１９８６）及びその他の利用可能な参考文献に見出される。

単クローン抗体の調製単クローン抗体は、確立された手法（Ｋｏｈ　ｌ　ｅ　ｒ＆Ｍｉ　１ｓｔｅｉｎ、１９７５）にしたがって産生じた。手短に言えば、雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを完全フロインドアジュバント（５０％）中に乳化したＨＩＶ−１感染ＭＯＩ、Ｔ３細胞の溶解物質を繰り返し腹腔内投与して免疫化した。感作膵臓細胞を、ＰＥＧ　１５００を用いてＰ３Ｘ６３〜Ａｇ８．６５３骨髄腫と融合した。

ヘテロカリオンをＨＡＴ培地中で選択し、クローン化し、捕獲ＥＬ　Ｉ　ＳＡ法で）ＩＩＶ抗原に対する反応性に関してスクリーニングした。多クローン性ヒト抗ＨＩＶのＩｇＧ分画を微小滴定型の穴の上に被せた。ＨＩＶ−１（ＭＯＬＴ３細胞中で産生）及び培養上澄をその穴に同時に添加した。結合ネズミ抗体を、酵素標識化抗マウスＩｇ抗体を用いて検出した。スクリーニングを表わすデータを図１に示す。試料番号の指定対象を、表１融合体Ｆ８６のＥＬＩ　ＳＡスクリーニング１１　’　１Ｏ−Ｃ１２１６７−ＥＩＯ２０９−Ｄ５２１　Ｆ８６　流出物１掌　屠殺時に採取した血清零＊　正常マウス血清ウェスターンプロット抗ＨＩＶ候補クローンをさらにウェスターンプロット（Ｔ。

ｗｂｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、１９７９）で試験した。ＨＩＶ感染ＭＯＬＴ３細胞の溶解物質を、変性条件下で１２％アクリルアミドゲルを通して分離した。蛋白質をニトロセルロースに移し、個々のストリップをブロックして培養上澄と反応させた。結合抗体は、酵素標識化ヤギ抗マウスＩｇ抗体を用いて検出した。

ｐ２４と特異的に反応する抗体を選択した（図２）。ストリ、ツブの指定対象物を表２に示す。

表　２抗ｐ２４ｍＡｂｓのウェスターンプロット分析ストリップ番号　指定対象物１　陽性対照６　陽性対照９　６−Ｃ１０１０６−Ｅｌｌｌｌ　陽性対照１５　陽性対照１９　陽性対照２４　陽性対照次に、イムノプロットにおけるＨ　Ｉ　Ｖ−２の９２６に対する交叉反応性に関して、・抗ｐ２４抗体を試験した。ＨＩ　Ｖ−２溶解物質を分離し、ブロッティングして、抗ｐ２４抗体と反応させた。２つの抗体、７−Ｄ４及び５−Ｄ９は、ｐ２６と強く反応した（図３）。ストリップの指定対象物を表３に示す。

表　３抗ｐ２４ｍＡｂｓのＨＩＶ−２のｐ２６との交差反応性ストリップ　ｍＡｂＩＨｕ−抗旧Ｖ−１１ｇＧ２　”　Ｏ３Ｓ　３９−８−３３　ＭＯＰＣ２１（ＩｇＧ１）部　１３７−０４！ミ関連実験において、７−Ｄ４は、ＳＩＶＭＡＣの溶解物質中の分子量約２７，０００の蛋白質を認識した。

エピトープマツピング７−Ｄ４のｐ２４エピトープを包含するアミノ酸を以下の方法でマツピングした。ｇａｇ領域及びｇａｇの一部を発現ベクター中でサブクローン化した。手短に言えば、λＨＡＴバクテリオファージ（ｃＤＮＡライブラリーＨＩＶ−ＩＲＦ、クローンＨＡＴ３　（Ｓｔａｒｃｉｃｈ　ｅｔ　ａｌ、、（１９８６）））のウィルスＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化して、ｐＢＲ３２２由来プラスミドｐＭＬＢ１１１３に結紮することにより、ＥｃｏＲＩ／５ｓｔＩ　ｇａｇ／ｐａｌ　ＯＲＦを含有するクローン２９と確認されるプラスミドを生成した。クローン２９を５ｓｔＩで消化して本質的でないベクター配列を除去し、再結紮してプラスミドｇａｇ／ｐｏｔ　１．２を生じた。この後者プラスミドを音波破砕し、プラント末端化して、ＥｃｏＲＩリンカ−と結紮した。次に、その混合物をＥｃｏＲＩで消化し、λ０ＲＦ８に結紮して（Ｍｅｉｓｓｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、１９８７））パッケージした。λ０ＲＦ８発現ライブラリーを大腸菌Ｅ。

ｃｏｌｔ中に作り、ヒト抗ＨＩＶ多クローン抗体及びマウス抗ｐ２４　（ＨＩＶ −１）単クローン抗体でスクリーニングした。

陽性反応物を選択し、増殖させて、ウェスターンプロット、イムノアッセイ、及びヌクレオチドシーケンシングによって発現したペプチドを特徴づけた。組換えｐ２４２４ペプチドｇ８、ｇａｇ１２６、ｇａｇ１０７、及びｇａｇ１４１をＥ、ｃｏｌｉ中で発現させた。別に、クローン２９を鋳型として用い、発表済の配列の５゛及び３゛末端に対応するオリゴヌクレオチドをポリメラーゼ鎖反応に用いてｇａｇ蛋白質ｐ２４の完全配列を生成した。５°末端はＥｃｏＲＩ部位を含有し、３°末端はＢａｍＨＩ部位を含有した。反応生成物質をＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消化し、次いでｐＭＬＢ１１１３に結紮した。組換えＩ）２４蛋白質、ｇａｇ２４．５をＥ、ｃｏｌｉ中で発現させた。組換えｐ２４ペプチドの特徴表示を図４に示す。

種々の組換えｐ２４ペプチドを、ＥＬｒＳＡ法及びウェスターンプロットにおいて抗原として用いて、指定の単クローン抗体が指定のペプチドと結合したか否かを調べた。任意の単クローン抗体のｐ２４ペプチドのパネルとの反応性パターンにより、表４、並びに図５及び６に示すように、認識されたエピトープを４つの領域のうちの１つに限定できた。

表　４組換えペプチドを用いた抗２４ｍＡｂｓの免疫化学的分析ｇａｇ　ｇａｇ　ｇａｇ　ｇａｇ　ｇａｇ　ｍＡｂ７−Ｆ３　＋　＋　−−Ｂ８−Ｅ７　＋　−−−−Ａ７−Ｄ４はｇａｇ２４．５及びｇａｇ１２６とのみ結合するため、７−Ｄ４エピトープは、アミノ酸残基１４２〜２０９で限定される領域に認められると推論し得た。

７−Ｄ４のエピトープをさらに局限化するために、ｐ２４のＢ領域に関して、合成連続的重複ノナペプチドを作製した。各ノナペプチドは、一連のＥＬ　Ｉ　ＳＡ法における固相抗原として用いて、単クローン体の最大結合親和性を調べた。

反応性の単一ピークは、アミノ酸１４２〜１５８を含有する領域（図８）を包含する直線領域に関して見出された（図７）。

ＨＩＶ−１単離体のｐ２４、ＨＩＶ−２単離体のｐ２６、及びＳ　Ｉ　ＶＭＡＣのｐ２７のアミノ酸配列の比較により、Ｓｅｔ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ｌｙｓから成るｐ２４のエピトープ内のデカペプチド（図９）の保存が明示された。デカペプチドを包含する領域はＨＩＶ−２（７）ｐ２６及びＳ　ＩＶＭＡＣ（７）ｐ２７の７−Ｄ４エピ）−プである、と推定し得る。

限定されたエピトープの価値は、当業者には公知である。その利点の一つは、上記のエピトープ及び同様のエピトープと反応可能な新規の抗体を産生ずる能力である。合成ペプチドをエピトープ配列の後に配置し、修飾しないか又は担体と結合させたものを抗原として用いる。例えば、ペプチドは、ゲルタールアルデヒド、カルボジイミド、又はＮ−マレイミドベンゾイルヒドロスクシンイミドエステルを用いて、ＰＰＤ、破傷風トキソイド、ＫＬＨ，又はＢＳＡに結合し得る。抗原としての合成ペプチドの使用を検討するためには、Ｃ１ｂａ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　１１９（１９８６）　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　５ｏｎｓ、ＮＹ、を参照していただきたい。抗体は、マウス、ヤギ又はその他の実験用動物の場合のようにｉｎ　ｖｉｖｏで、又はｔｈｅ　ＩＶＩＳ　ｏｆ　Ｈａｎａ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ　（Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ）と同様の物質及び方法の系を用いてｉｎ　ｖｉｔｒｏで生成し得る。

別の利点は、大量のエピトープ配列が、合成的に、又は上記のような標準的な組換えＤＮＡ法を用いて生成可能であり、そのペプチドは循環抗体の検出のための、又は阻害型検定における循環抗原の検出のための免疫学を基礎とした検定及びキットにおいて抗原として用い得る。別の利点は、本明細書に開示された検定の改良に関する。調査を拡張しなければ、本明細書に記載のＨＩＶ−１単離体中に確認されたエピトープがその単離体に、そしてさらに本明細書に記載のＨＩ　Ｖ −２及びＳＩＶ単離体に特異的であるか否かは、明らかでない。参照点としてその配列を用いて、エピトープを工作し得る、即ち、さらに多数の種類のＨＩＶ単離体の間での高度の保存を有する関連配列の確認に関しては、又は検定における高度の反応性を有する関連配列を得ることに関して、一つ又はそれ以上のアミノ酸を置換し、あるいはエピトープを誘導する等である。ノナペプチド分析は、ＨＩＶ−２及びＳＩＶ中に保存されるＨＩＶ−１ｇａｇのアミノ酸１４２〜１５８から成る別々の直鎖エピトープを明らかに確認したけれども、本発明は、単クローン抗体、上記の単クローン抗体のエピトープ、並びにＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、及びＳＩＶのｇａｇコード蛋白質を検出し得る上記の抗体及び上記のペプチドを用いる検定に関する、と理解すべきである。

捕獲ＥＬＩＳＡ検定どの単クローン体がＥＬ　Ｉ　ＳＡにおいて有用であるかを調べるために、各々を、サンドイッチ検定における捕獲又はＨＲＰ結合抗体として用いた。手短に言えば、単クローン抗体で穴を被い、１０μｌの分裂緩衝液を添加した。１００μ ｌの容量の洗剤緩衝液中に懸濁した抗原試料又は対照を次に添加し、３７℃で９０分インキュベートした。洗浄後、穴に抗ＨＩＶ試薬を抱合した酵素（ホースラディシュペルオキシダーゼー抱合ヒト抗ＨＩＶＩｇＧ、アフィニティ精製、１００μｌ）を添加し、３７℃で３０分インキュベートすることによって、結合抗原を検出した。数回洗浄後、１００μｌの基質溶液を穴に添加し、室温で３０分間インキュベートした。１，００μｍの停止試薬を添加し、エアブランクを用いて４５０ｎｍでの吸光度を読み取った。代表的データを表５に示す。

表　５ｍＡｂｓのチェックカーボード分析捕獲抗体　５Ｂ４　５Ｄ９　５Ｅ２　６Ｃ１０６Ｅ１１　７Ｅ１Ｇ　９Ｂ７　Ｈ αＨＩＹ５Ｂ４　０，１２　０．２６　０．２９　０．８２　Ｑ、１３　１．０３　Ｇ、１７　２．６７５Ｄ９　０．７３　Ｇ、１３　０．４３　０，６２　０．３７　０．３８　０．１２　＞３．０５Ｅ２　０．５８　０，４７　０．１４　Ｇ、６１　０．２３　０．８０　Ｇ、１１　２．５１６Ｃ１００，８１０，３８０，４４０，２００，１７０，７０Ｇ、１３　＞３．０６ＥＩｌ　Ｏ，０９０，２１０，２＋　０．１４　０．１６　０．２７　０．０９　Ｇ、４１７Ｅ１０　０．８４　０．４３　０．４９　［１，８４０，１８０，１１１０，１３＞３．０９Ｂ７　０．１４　０．１１　Ｑ、ＩＱ　Ｏ，１７０，１３０，１７０，１３０，２８３４Ａ　０．４９　０．１２　０，０８　０．９６　０．２ｇ　１．８１　０．２２　＞３．０精製ｍＡｂを、１０μｇ／ｍｌで一晩被覆した。１０ μｇ／ｍｌで用いたＨＲＰ−ｍＡｂをインキュベーション開始時に添加した（３７℃で９０分）。

ＨＲＰ−ヒトー抗ＨｒＶを６０分後に加えた。

吸光度は、ＮＨ３における１０．　０ｎｇ／ｍｌ　旧Ｙ−Ｉ　ＭＯＬＴ　３に関して示された。

ＮＨ８に関する吸光度は０．１２±０．０３であった。

抗体５−Ｂ４．６−ＣＩＯｌ及び７−ＥＩＯは、捕獲及び抱合抗体として最良に作用した。最大シグナルは、抱合体としてＨＲＰ−ヒト抗ＨＩｖに関して得られた。

単クローン体の種々の組換えを、ＥＬＩＳＡにおける捕獲抗体として用いた。５ −Ｂ４及び６−ＣＩＯの組合せは、］）２４の検出に際して最大の感受性を示した（図１０）。ＨＩＶ−２の９２６を検出するために、７−Ｄ４を捕獲抗体として用いた（図１１）。最大感受性及び耐久性は、３つの抗体、５−Ｂ４．６−ＣＩＯｌ及び７−Ｄ４を捕獲抗体として組み合わせた場合に生じることが判明した。それらの条件下では、ｐ２６は、ｐ２４同様、５−Ｂ４及び６−ＣＩＯのみを捕獲抗体として用いた場合に解釈が困難なある種の境界線的臨床試料から検出可能であった。これら３つの抗体を用いる捕獲ＥＬ　Ｉ　ＳＡ法の感受性は、ＨＩＶ−１ｐ２４抗原の１０ｐｇ／ｍｌ　（ｌｐｇ／穴未満）より低く、そしてＨＩＶ−２ｐ２６抗原の０．５ｎｇ／ｍｌより低い（ｌｌＵ１２）範囲でもある。臨床試料中にＨＩＶ抗体が存在したにもかかわらず、感受性が認められる。３つの抗体、５−Ｂ４．６−ＣＩＯｌ及び７−Ｄ４を用いる捕獲ＥＬＩＳＡをさらに、全ウィルスの検出のための逆転写酵素検定と比較した。ＥＬ　Ｉ　ＳＡは、逆転写酵素検定の２５．０００倍の感受性を示した（図１３）。

本発明の好ましい態様の詳細を参照することにより、本発明を本特許明細書に開示してきたが、一方、この開示は、当業者が容易に修正し得るよう意図されているので、本発明の精神並びに添付の請求の範囲の範囲内において、意味を限定するものではなく説明のためのものである。

参考文献１、Ｃ１ａｖｅｌ、Ｆ、、ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ　２３３．　３４３　（１９８６）２、Ｃｏａｌｅｓ、　Ａ、、ｅｆ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　３２６．　５４９　（１９８７）３、Ｇｕｙａｄｅ＋、　Ｍ、、　ｅｌ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　３２６．６６２　（１９ｇ？）４、　Ｋｅｓｓｌｅ＋、Ｈ，、ｅｔａｌ、、Ｊ　Ａｍ　Ｍｅｄ　Ａ＋ｓ＋＋ｃ　２５８．　１１９６（＋９８７）５、Ｋａｈｌｅｒ、Ｇ、　＆Ｍｉｌｓｌｓｉｎ、Ｃ，、ＮａｔＤｒｅ　２５６．　４９５　（１９７５）６、Ｋ＋＋ｈｎｅｌ、　Ｈ，、Ｎ　１１．、　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　１１６゜７、Ｍａｒｌｉｎｋ、　Ｒ，、ｅｊ　ａｌ、、＾ＩＤＳ　Ｒｅｓ　Ｈｕｍ　Ｒｅ１ｒｏｖｉｔｕｓｅｓ　４゜８、Ｍｉｎａｓｓｉａｎ、Ａ、、ｅｊ　ｘｌ、、Ｐｒｏｃ　Ｎａｊｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８５゜９、Ｍｅｉｓｓｎｅｒ、Ｐ、Ｓ、ｅｔ　ａｌ、、Ｐ＋ｏｃ　）ｍｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ｌｌ５Ａ　８４゜１０、　Ｎｉｅｄｒｉｇ、　Ｍ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｉ　Ｇｅｎ　Ｖｉ「ａｌ　６９．　２１０９　（１９８８）比ＲｏｂｅＩｔ−Ｇｕ＋ｏｆ！、　Ｒ，Ｃ，ｅｊ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２１５．９７５１２、Ｓｘｒｎｇａｄｈａ＋ａｎ、Ｍ、Ｇ、、ｅｌ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ　２２４．　５０６Ａｂｓ　４５０ｎｍ ’＃Ｑ　ｔＬ−ｑ　Ｊｒｘ、ｉ　埒、Ｔ’　ミ／　ｈ’ｉ−ミーＲＪ　／ｚａ　 −３ｔ　＝Ａｂｓ　４５０ｎｍｎｑｕｘ・フＩＴ々デ十ゝ７、　３；−Ｈ−４−＜キー鉱−騎１〜Ａ社Ｐｉφ「＠８Ａｂｓ　４５０ｎｍＦｉ手「６１００．０．４５０ｎｍＦｉｇｕｒ＠’１１国際調査報告ＰＣＴ／１１５９０１０２８７４ｃｏｎｔｉｎｕｅｄ　ｆ’ｒｃｅ＋　Ｌ　Ｃ１ａｓｓｉｆｉｃａ乞ｉｏｎ　ｏｆ　５ｕｂｊｅｃｔ　ｍａｔｔｅｒ　ｂｌｏｃｋ　３゜ｏｒ　ＨｒＶｌ　ａｎｄ　（Ｐ２４　ｏｒ　Ｐ２６）。

Claims

【特許請求の範囲】

１．ＨＩＶ−１のｐ２４及びＨＩＶ−２のｐ２６のエピトープと反応し、上記エピトープがｐ２４のアミノ酸残基１４０〜１６０内に位置する単クローン抗体。
２．上記エピトープがｐ２４のアミノ酸残基１４２〜１５８内に位置する請求項１記載の単クローン抗体。
３．上記エピトープがｐ２４のアミノ酸残基１４４〜１５８内に位置する請求項１記載の単クローン抗体。
４．上記エピトープがアミノ酸配列Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ− Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ｌｙｓを包含する請求項１記載の単クローン抗体。
５．上記エピトープがアミノ酸配列Ｈｉｓ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｘ（ここで、Ｘは生物学的機能が一致する任意のアミノ酸である）を包含する請求項１記載の単クローン抗体。
６．アミノ酸配列Ｈｉｓ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｘ（ここで、Ｘは生物学的機能が一致する任意のアミノ酸である）を包含する抗原と反応する単クローン抗体。
７．アミノ酸配列Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｌａ− Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ｌｙｓを包含する抗原と反応する単クローン抗体。
８．アミノ酸配列Ｈｉｓ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｘ（ここで、Ｘは生物学的機能が一致する任意のアミノ酸である）を包含し、請求項１の単クローン抗体と反応するエピトープ。
９．アミノ酸配列Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｌａ− Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ｌｙｓを包含し、請求項１の単クローン抗体と反応するエピトープ。
１０．アミノ酸配列Ｈｉｓ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｘ（ここで、Ｘは生物学的機能が一致する任意のアミノ酸である）。
１１．アミノ酸配列Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｌａ −Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ。
１２．ＨＩＶ−１の抗原と反応する少なくとも一つの抗体、及び請求項１記載の単クローン抗体を包含するＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２の検出のための診断キット。
１３．上記抗体が単クローン抗体である請求項１２記載の診断キット。
１４．上記抗体のエピトープがアミノ酸配列Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ− Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ｌｙｓを包含する請求項１３記載の診断キット。
１５．ＨＩＶ−１の抗原と反応する２つの単クローン抗体を含有する請求項１４記載の診断キット。
１６．ＨＩＶ−１の抗原と反応する上記単クローン抗体の一つがｐ２４のアミノ酸残基１４２〜２０９内に位置するエピトープと結合し、ＨＩＶ−１の抗原と反応する上記単クローン抗体の二番目のものがｐ２４のアミノ酸残基２６３〜３４４内に位置するエピトープと結合する請求項１５記載の診断キット。
１７．ＨＩＶ−１の抗原と反応する少なくとも一つの抗体、及び請求項６記載の単クローン抗体を包含するＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２の検出のための診断キット。
１８．ＨＩＶ−１の抗原と反応する少なくとも一つの抗体、及び請求項７記載の単クローン抗体を包含するＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２の検出のための診断キット。
１９．試料を、ＨＩＶ−１の抗原と反応する少なくとも一つの抗体、及び請求項１記載の単クローン抗体と接触させ、抗原−抗体複合体の形成を測定することから成る上記試料中のＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２抗原の検出方法。
２０．上記抗体が単クローン抗体である請求項１９記載の方法。
２１．上記エピトープがアミノ酸配列Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ −Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ｌｙｓを包含する請求項２０記載の方法。
２２．ＨＩＶ−１の抗原と反応する２つの単クローン抗体を含有する請求項２１記載の方法。
２３．ＨＩＶ−１の抗原と反応する上記単クローン抗体の一つがｐ２４のアミノ酸残基１４２〜２０９内に位置するエピトープと結合し、ＨＩＶ−１の抗原と反応する上記単クローン抗体の二番目のものがｐ２４のアミノ酸残基２６３〜３４４内に位置するエピトープと結合する請求項２２記載の方法。
２４．試料を、ＨＩＶ−１の抗原と反応する少なくとも一つの抗体、及び請求項６記載の単クローン抗体と接触させ、抗原−抗体複合体の形成を測定することから成る上記試料中のＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２抗原の検出方法。
２５．試料を、ＨＩＶ−１の抗原と反応する少なくとも一つの抗体、及び請求項７記載の単クローン抗体と接触させ、抗原−抗体複合体の形成を測定することから成る上記試料中のＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２抗原の検出方法。
２６．試料を、請求項８記載のエピトープと接触させ、抗原−抗体複合体の形成を測定することから成る上記試料中のＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２抗体の検出方法。
２７．試料を、請求項９記載のエピトープと接触させ、抗原−抗体複合体の形成を測定することから成る上記試料中のＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２抗体の検出方法。
２８．試料を、請求項１０記載のアミノ酸配列と接触させ、抗原−抗体複合体の形成を測定することから成る上記試料中のＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２抗体の検出方法。
２９．試料を、請求項１１記載のアミノ酸配列と接触させ、抗原−抗体複合体の形成を測定することから成る上記試料中のＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２抗体の検出方法。
３０．請求項８記載のエピトープを包含する試料中のＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２抗体の検出用診断キット。
３１．請求項９記載のエピトープを包含する試料中のＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２抗体の検出用診断キット。
３２．請求項１０記載のアミノ酸配列を包含する試料中のＨＩＶ−１及びＨＩＶ −２抗体の検出用診断キット。
３３．請求項１１記載のアミノ酸配列を包含する試料中のＨＩＶ−１及びＨＩＶ −２抗体の検出用診断キット。