JPH03500483A - Ｈｉｖ抗原に特異な単クローン性抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ６、前記肺細胞がマウス骨髄腫細胞と融合された請求の範囲第３項記載の細胞系 統。

７、　メリーランド州ロックヴイルにあるアメリカン　タイプカルチャー　コレ クションに寄託されＡ、　Ｔ、　Ｃ，Ｃ，番号ＨＢ　９５８５を与えられた雑種 細胞系統サンプル。

８、　アメリカン　タイプ　カルチャー　コレクション、メリーランド州ロック ヴイルに寄託されＡ、　Ｔ、　Ｃ，Ｃ，番号ＨＢ　９５８５を与えられたハイブ リドーマサンプルから産生された単クローン性抗体。

９、Ａ、多重ウィルス分離物から調製され、マウスに注入された抗原とマウス骨 髄腫細胞系統との融合のため収穫されたマウス牌細胞； Ｂ、融合細胞をスクリーニングしてｐ５５、ｐ２４及び若干の分解コア抗原を含 む旧■コア抗原群上のＫＣ−５７抗原に特異的に結合する単クローン性抗体を分 離すること：及びＣ，ＫＣ−５７抗原の免疫グロブリンアイソタイプがマウスＩ ｇＧ１であることを特徴とするハイブリドーマ技術により産生された細胞系統に 由来する単クローン性抗体。

１０、旧■コア抗原群のＫＣ−５７抗原と結合し、旧■エンベロープ抗原とは本 質的に結合しない単クローン性抗体。

Ｉｌ、前記コア抗原が９５５及びｐ２４抗原を含む請求の範囲第１０項記載の単 クローン性抗体。

１２、前記コア抗原がｐ３９及びｐ３３抗原を含む請求の範囲第１１項記載の単 クローン性抗体。

明　細　書 ＨＩＶ抗原に特異な単クローン性抗体 技術分野 この発明は、一般にハイブリドーマ技術により産生される単クローン性抗体に関 し、特に種々の異なる地理的場所からのヒト免疫不全ウィルス（旧■）分離物の ｇａｇ暗号タンパク質群のエピトープを認識する独特の単クローン性抗体を産生 ずる細胞系統に関する。

背景技術 ＨＴＬＶ　ＩＩＩ、すなわちヒトＴ細胞性白血病ウィルス凹型は、現在通例ヒト 免疫不全ウィルス（「旧ＶＪ）と呼ばれ、ヒト免疫不全症候群すなわちエイズに 対する作固体（ｃａｕｓａｔｉｖｅ　ａｇｅｎｔ）であると認識されている。米 国その他の諸国において流行病の割合に迫りつつあると考えられるエイズの慢性 的性質を反映してヒト末梢血液中のウィルス性抗原及びこのような抗原に対する 抗体を信頼性をもって一貫して検出する診断的イムノアッセイを発展させる研究 と努力が広範囲に見られる。このようなイムノアッセイを発展させるためには、 はとんど単クローン性抗体技術に依存している。

ＨＩＶは、ウィルスのレトロウィルス群に属する。レトロウィルスは、正の鎖の ＲＮＡと、リバーストランスクリプターゼと呼ばれる、ウィルスＲＮＡをＤＮＡ に転化するのに用いられる特殊な酵素とをウィルスのコア内に有する。これは、 ＤＮＡがＲＮＡに転化される細胞の転写の古典的過程の逆反応である。

ＨＩＶがＴ４リンパ球に結合すること、またその理由がＴ４リンパ球の表面上の Ｔ４タンパク質がＨＩＶのレセプターすなわち結合部位として役立つためである ことが知られている（ダルグレイシュ・エイ・ジー（Ｄａｌｇｌｅｉｓｈ　ＡＧ ）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　３１２ニア６３〜７６７頁（１９８５年） ）。また、旧■は、単球、組織マクロファージ並びに脳、を髄及び末梢神経内の 細胞のような他の細胞に結合してこれらを攻撃することもできる。旧Ｖの生活環 は、ウィルスが、例えば性行動又は輸血により宿主患者に入り、次いで単球及び リンパ球上のレセプターに結合することを要する。ウィルスは細胞を貫入して、 そのウィルスＲＮＡコアを露出するようにそのエンベロープ、すなわちタンパク 質被覆を脱ぎ捨てる。リバーストランスクリプターゼは、ウィルスＲＮＡコアを ＤＮＡに転化し、これが宿主細胞ゲノムに組込まれる。新しいウィルス粒子があ る量まで産生されると宿主細胞の膜を破って新しいウィルス粒子がヒトの血液系 中に放出される。

旧■は、包膜すなわちエンベロープを形成するタンパク質分子とウィルスＲＮＡ 抗原を覆うコアから成る。膜上及びコア物質中に発現された抗原がある；コアは 、ウィルスに含まれるタンパク質の大部分を有する。単クローン性抗体を細胞系 統から産生ずる一般技術は広く用いられ、理論的に理解されているが、特定の抗 体を産生ずる試みで出会う複雑さと変化は、よく認識されている。特定車クロー ン性抗体の発生及び産生の各研究は、成功して達成するためのそれに特有の障碍 がある。特定の研究課題の成否は、関係する抗原の性質と細胞融合を行うのに用 いる技術と適当なハイブリドーマの分離に大いに関係する。これらの障碍は、Ｈ ＩＶウィルスに特異な単クローン性抗体を産生ずる細胞系統の産生が関係する場 合、特に明らかである。旧■は、無数の抗原決定基を有するエンベロープ膜と無 数の抗原部位を発現するコアタンパク質とからなるので、骨髄腫細胞と免疫化マ ウスの牌細胞の通常の融合が天文学的数のハイブリドーマを発生させ、その後の 特定抗体のスクリーニングが途方もなく複雑な仕事であることが容易に分かるで あろう。

ＨＩＶ分離物のウィルスタンパク質を認識する単クローン性抗体がフェルンス（ Ｆｅｒｎｓ）らにより研究された（Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、＋６８　：　 １５４３〜１５５１頁（１９８７年　英国）。該単クローン性抗体は、１（ＩＶ のｇａｇタンパク質に対して挙げられた。一群の単クローン性抗体が、ウェスタ ンプロット法により該単クローン性抗体により認識されるＨＩＶ　ｇａｇタンパ ク質を５５０００ダルトン分子量（ｐ５５）、２４０００ダルトン分子量（ｐ２ ４）　、１８００Ｑダルトン分子量（ｐ１８）のタンパク質（すべてコア抗原） として確定することを認識された。

ＨＩＶの全ゲノムは、セルキ（Ｓｅｒｋｉ）らの研究（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　８０：　３６］８〜３６２２頁（１９８３年））で配 列が決定された。この研究は、旧■エンベロープ遺伝子の種々のグリコジル化タ ンパク質と、コアタンパク質がグリコジル化タンパク質でないことを示した。上 記フェルンスらの研究は、旧Ｖエンベロープ遺伝子のグリコジル化タンパク質が １６００００ダルトンの分子量を示すｇｐ１６０．１２００００ダルトン分子量 を示すｇｐ１２０及び４１０００ダルトンの分子量を示すｇｐ４１として同定さ れることを示す。

単クローン性抗体を利用して人がエイズ病をもっているか免疫学的にウィルスに さらされたかを決定するのに現在商業的に利用しうる診断試験は、成功には遠か った。この病気の診断は、病気の症状が発現する前に長い潜伏期間が必要である という事実により複雑になる。病気の高い感染性とその治療も現在では科学的能 力内にないという事実も、成功する診断試験を発展させつるように生きているウ ィルスとヒト免疫系へのその不利な影響を調べる困難さを増加する。

この発明の目的は、コア内の選択的主タンパク質に結合する新規単クローン性抗 体を産生ずるハイブリドーマすなわち雑種細胞系統を提供することである。この 単クローン性抗体は、若干の旧Ｖコア抗原の共通エピトープを一貫して信頼性を もって認識するので、前記抗体は、ヒト生理血清試料中の旧■ウィルス抗原を大 きな精度をもって追跡するイムノアッセイに用いることができる。この単クロー ン性抗体は、ＨＩＶエンベロープ抗原と結合しない。

発明の開示 ＨＩＶコア抗原ｐ５５、ｇａｇ遺伝子に対して暗号化された前駆体タンパク質、 コアタンパク質ｐ２４並びに部分分解生成物ｐ３９及びｐ３３に結合しうる単ク ローン性抗体を産生しうる、ハイブリドーマ技術により発生された細胞系統。こ の発明を具体化する単クローン性抗体は、ｐ１８コアタンパク質又はいかなる旧 ■エンベロープ抗原とも結合しない。この単クローン性抗体は、ｐ５５、ｐ２４ 、ｐ３９及びｐ３３抗原上の共通エピトープ（ここではｒＫＣ−５７Ｊ抗原とし て同定される）を認識する。

この発明の細胞系統は、ＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫原の選択群を用いる一連の多 重注入によって免疫化した独特の免疫化記録（ｐｒｏｔｏｃｏｌ）と、収穫した ネズミの肺細胞と融合させるための従来の骨髄腫細胞系統とにより発生された。

寄託供述 この発明に係るＫＣ−５７単クロ一ン性抗体を産生ずる細胞系統は、アメリカン 　タイプ　カルチャー　コレクション、アメリカ合衆国メリーランド州２０８５ ２０ックヴイルに１９８７年１１月６日この特許出願の出願と同時に寄託された 。細胞系統にＡ、　Ｔ。

Ｃ，ＣＮｏ、　ＨＢ９５８５が与えられた。

発明を実施する最良の形態 物質と方法 プ乙火丞立■惣 マウスの免疫化のための抗原は、リンパ腺症ウィルス（ＬＡＶ）感染細胞系統か ら調製した。全ウィルスを培養液上清からサイズ排除クロマトグラフィーにより 分離した。ウィルス抽出物も、培養液上清からトライトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ− １００によるＬＡＶの溶菌と次いでレンズ豆レクチンアフィニティーカラム上の 吸収により調製した。メチル−アルファ、−Ｄマンノピラノシドにより溶離され た抗原は、ウェスタンプロット分析により若干のコア抗原（ｐ５５　、ｐ２４） が存在する、主としてウィルスエンベロープ（ｇｐ　１６０／１２０）であるこ とが示された。

ハイブリドーマ細胞系統の産生 雄性のＢＡＬＢ／ｃマウスを、完全フロインドアジュバント中の分離ＬＡＹ感染 細胞系統で腹腔内で免疫化した。次いで、マウスは、不完全フロインドアジュバ ントの懸濁液中の精製ウィルスの更に３回の注入を腹腔内に受け、各注入は１週 間間隔で行った。

これらの注入に続いてｇｐ１６０／１２０ウィルス抽出物の１週間間隔であけた ３回の免疫化を行った。ｇｐ１６０／１２０の第３回注入後３日後、１匹のマウ スの肺臓を取り出し細胞懸濁液をつくった。

次いでこの肺細胞をポリエチレングリコール１５００中５Ｐ２１０−　Ａｇ１４ マウス骨髄腫細胞と融合させた。融合細胞を９６穴組織培養プレートにブレーテ ィングし抗体産生ハイブリドーマをＨＡＴ　（ヒポキサンチン−アミノプテリン −チミジン）培地で選択した（ネイチャー２５６　：　４９５〜４９７頁、１９ ７５年）。

コロニーのスクリーニング ＨＩ■コア抗原に対する抗体を産生ずるコロニーは、捕捉（ｃａｐｔｕｒｅ）　 ＢＬＩＳＡ法により同定された。旧■コア抗原を認識するヒト抗体は、９６穴ポ リスチレンアツセイプレート上に吸収された。非特異性結合部位をウシ血清アル ブミンでブロッキングした後、デタージェント分裂ＬＡＶをアッセイプレートで インキュベートした。次いで、プレートを洗浄し、各個々のハイブリドーマコロ ニーからの条件付き（ｃｏｎｄ　ｉｔ　１ｏｎｅｄ　）培地をアッセイ穴に加え た。インギュベイショ゛ン後、プレートを洗浄し、ペルオキシダーゼ複合ヤギ抗 マウスＩｇＧ＋ＩｇＡ　＋１ｇＭを加えてインキュベートした。穴を次に洗浄し 、基質テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を添加した。反応をＨｚＳＯ＊で停止 し、吸光度を４５０１ｍで測定した。ＫＣ−５７を含む陽性コロニーは、陰性中 央（ｃｅｎｔｒａｌ）吸光度の少なくとも３倍の吸光度を有するとして同定され た。

陽性コロニーを広げ、軟寒天中クローン化し、次いでこれを抗体含有腹水症液を 産生ずるためプリスタンブライミングした（ｐｒｉｓｔａｎｅ−ｐｒｉｍｅｄ） 　ＢＡＬＢ／ｃ　？ウスに注入した。

ＫＣ−５７の確認 ＫＣ−５７の免疫グロブリンサブクラスは、オークテルロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒ ｌｏｎｙ）の二重拡散法によりネズミのＩｇＧ１であることが決定された。ＫＣ −５７により認識された抗原の分子量を測定するためウェスタンプロット法を行 った。ＬＡＶ感染細胞の溶菌液をこの分析のための抗原源として用いた。抗原に 対する陰性コントロールは、未感染Ｔ細胞の溶菌液であった。コントロール標本 は、ＫＣ−５７との反応性を示さなかった。使用した内部分子量標識は、フィブ リノーゲン（３４００００）、フィブロネクチン（４４００００）、ミオシン（ ２０００００）、β−ガラクトシダーゼ（１１６０００）、ホスホリラーゼＢ　 （９２５００）、ウシアルブミン（６６０００）　、オボアルブミン（４３００ ０）　、カルボニックヒドラーゼ（３００００）　、）リプシンインヒビター（ ２０１００）及びα−ラクトアルブミン（１４０００）であった。ＫＣ−５７を 有するニトロセルロースストリップのインキュベイジョンに続いて１２５　Ｉ− ヤギ抗マウス抗体を単タローン性抗体により認識されるＨＩＶ抗原を検出するの に用いた。旧■関連コア抗原ｐ５５及びｐ２４並びにｐ５５の切断生成物であろ うｐ３９及びｐ３１は、ＫＣ−５７により認識される。ｐ１８との反応性は見ら れず、ＨＩＶエンベロープ抗原との反応性も何ら見られなかった。

ＫＣ−５７により認識されるＨＩＶ関連抗原の細胞表面発現の分析をＥＰＩＣＳ フローサイトメーター分析（クールター・コーポレーション、フロリダ州ハイア リー１製機器）により行った。

ＬＡＶ感染細胞をＫＣ−５７とともにインキュベートした後、ヤギ抗マウスＦＪ ＴＣ複合体とともにインキュベートした。生きている旧■感染細胞の表面上の抗 原決定基に対するＫＣ−５７の反応性は証明されなかった。

細胞質ＨＩＶコア関連抗原の発現がアセトン固定ＬＡＶ感染細胞を用いて行われ た。更に、未感染、ＨＴＬＶ−Ｉ感染及びＨＴＬＶ−１感染リンパ球が同じ仕方 で得られ調製された。ＫＣ−５７とともにインキュベイジョン後、ヤギ抗マウス ＦＩＴＣ複合体を特異的反応性を検出するために用いた。未感染、ＨＴＬＶ−Ｉ 感染、又はＨＴＬＶ−Ｉｆ感染細胞に対して反応性は証明されなかった。ＫＣ− ５７は、固定胴Ｖ感染リンパ球の細胞質中に存在するコア関連抗原と特異的に反 応した。

ＫＣ−５７を捕捉抗体として用いる抗原捕捉ＥＩＡを開発した。

精製ＫＣ−５７を９６穴アツセイプレート上に固相化し、ＢＳＡでブロッキング した。ＨＩＶ抗原源は、ＬＡＶ感染リンパ球からのデタージエント溶菌培養液上 清であった。インキュベイジョンと洗浄後、ビオチン標識化ヒト抗ＨＩＶコア抗 体を添加し、インキュベートし洗浄した。次にストレプタビジン（ｓｔｒｅｐｔ ａｖｉｄｉｎ）ペノ、レオキシダーゼの添加とこれに続くインキュベイジョンで あった。

最終洗浄後、ＴＭＢを添加しインキュベートした。硫酸の添加により反応を停止 した。吸光度を４５０ナノメートルの波長で読んだ。この手法を用いて、組織培 養中に成長した旧■の九つの個々の分離物について陽性の結果が得られた。この 反応性を測定するのに用いた抗原は、デタージエント溶菌培養液上清であった。

未感染細胞からの上清について反応性は見られなかった。

このデータを下記表３に示す。

ＫＣ−５７単クロ一ン性抗体は、前記単クローン性抗体がマイクロタイタープレ ートの穴のような固体表面上に被覆され制御された記録でヒト生理液サンプルと 反応させられる固相イムノアッセイに対して特に有用である。アッセイ方法論は 、ＫＣ−５７単クロ一ン性抗体がサンプル中に見いだされる旧■抗原に結合する ことで検出されるＥＬＩＳＡ型であってもよい。

表３ ＫＣ−５７１（ＩＶ抗原捕捉ＥＬＩＳＡＢＡＧＡＬ　ニューヨーク市　十 １２６５　Ｄ１３　アトランタ　＋ Ｚ　３４　ザイール　＋ ＳＤＲサンフランシスコ　＋ ２１５３　Ｄ１６　ニューヨーク市　士１２１８８６−１　ベセスダ　＋ １２７２　Ｄ２１　シカゴ　＋ 表３は、ＫＣ−５７単クロ一ン性抗体を捕捉相とし、ヒト抗旧Ｖ抗体を検出相と して用いる旧■抗原アッセイが表示した全林が旧■抗原含有量に対して陽性であ ると同定したことを明らかにする。

表４ ＫＣ−５７単クロ一ン性抗体の特異性 病　原　体　＃試験　＃陽性 ＥＢＶ　２　０ ＨＴＬＶ　Ｉ　２　０ ＨＴＬＶ　Ｉ［２０ Ｈ３Ｖ　Ｉ　２　０ Ｈ３Ｖ　ｎ　２　０ ＣＭＶ　２　０ クラミジア　２０ 上記表は、前記ＨＩＶ抗原アッセイで行った場合の他の病原体に対するＫＣ−５ ７抗体の反応性を示す。これらの病原体のいずれとも反応性は、見られなかった 。

表４は、前記旧Ｖ抗原アッセイにおいてＫＣ−５７単クロ一ン性抗体を捕捉抗体 として用いた場合の該抗体の他の病原体に対する反応性を示す。

ｆＴ　］コ　＋　＋−ｍ　士／ｒ１　公営　Ｈ日・補正書の写しく翻沢幻提出書 （特許法第１８４条の８）平成２年５月２日 特許庁長官　吉　１）　文　毅　殿 １、特許出願の表示 ＰＣＴ／ＵＳ　８８１０１９９７ ２、発明の名称 ＨＩＶ抗原に特異な単クローン性抗体 ３、特許出願人 名称　クールター　コーポレーション 住所　同　所 １９８９年ＩＯ月１０日 ６、添付書類の目録 （１補正書の写しく翻訳力　１通 ｎ／両Ｉ＋−へ１ δ」止し１こ請氷り粍囲 「テ　ゑ　理　香　郁　告 ゛０゛°″Ａｌ　ｌ　Ａ　Ｉ　ａ　”　Ｉ　＋　’　０”　ｈ　′、　ｃ　７／ 　Ｌｓεε１０１９９７カ合衆国フロリダ州　３３１６ｉ　マイアミ　エヌ　イ ー　マイノース　９２１０

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. １．共通エピトープを有するＨＩＶコア抗原群を認識し、かつＨＩＶエンベロー プ抗原を本質的に認識しないＫＣ−５７単クローン性抗体を産生する、ハイプリ ドーマ技術により発生された細胞系統。
2. ２．前記コア抗原がｐ５５、ｐ２４及び更に分解抗原を含む請求の範囲第１項記 載の細胞系統。
3. ３．単クローン性抗体がネズミ脾細胞に由来する請求の範囲第１項記載の細胞系 統。
4. ４．前記脾細胞が一連の異なる免疫原免疫化により発生された請求の範囲第１項 記載の細胞系統。
5. ５．前記免疫原が順に注入された分離ＬＡＶ感染細胞系統、精製ＨＩＶウイルス 及びｇｐ１６０／１２０からなる請求の範囲第４項記載の細胞系統。
6. ６．前記脾細胞がマウス骨髄腫細胞と融合された請求の範囲第３項記載の細胞系 統。
7. ７．メリーランド州ロックヴィルにあるアメリカンタイプカルチャーコレクショ ンに寄託されＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．番号ＨＢ９５８５を与えられた雑種細胞系統サン プル。
8. ８．アメリカンタイプカルチャーコレクション、メリーランド州ロックヴィルに 寄託されＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．番号ＨＢ９５８５を与えられたハイプリドーマサンプ ルから産生された単クローン性抗体。
9. ９．Ａ．多重ウイルス分離物から調製され、マウスに注入された抗原とマウス骨 髄腫細胞系統との融合のため収穫されたマウス脾細胞； Ｂ．融合細胞をスクリーニングしてｐ５５、ｐ２４及び若干の分解コア抗原を含 むＨＩＶコア抗原群上のＫＣ−５７抗原に特異的に結合する単クローン性抗体を 分離すること；及びＣ．ＫＣ−５７抗原の免疫グロブリンアイソタイプがマウス ＩｇＧｌであることを特徴とするハイブリドーマ技術により産生された細胞系統 に由来する単クローン性抗体。
10. １０．ＨＩＶコア抗原群のＫＣ−５７抗原と結合し、ＨＩＶエンベロープ抗原と は本質的に結合しない単クローン性抗体。
11. １１．前記コア抗原がｐ５５及びｐ２４抗原を含む請求の範囲第１０項記載の単 クローン性抗体。
12. １２．前記コア抗原がｐ３９及びｐ３３抗原を含む請求の範囲第１１項記載の単 クローン性抗体。