KR960016304B1 - Hiv 항원에 특이적인 단일 클론 항체 - Google Patents
Hiv 항원에 특이적인 단일 클론 항체 Download PDFInfo
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Abstract
요약 없음.
Description
현재 인간 면역 결핍 비루스("HIV")로 통상 명명되는 HTLV Ⅲ 또는 인간 T-세포 백혈병 비루스 타입 Ⅲ가 인간 면역 결핍 증후군 또는 AIDS에 대한 원인제라고 인지되어 있다. 미합중국 및 다른 나라들에서 점차 만연되고 있는 전염병으로 여겨지는 AIDS의 만성적인 성질로 인하여, 인간 말초 혈액내의 비루스성 항원 및 그러한 항원에 대한 항체를 확실하며 일관되게 검출하는 진단 면역 분석을 개발하기 위한 연구 및 노력이 집중되고 있다. 실질적인 측정에 있어서, 단일 클론 항체 기법이 그러한 면역 분석 개발에 도움이 되어 왔다.
HIV는 비루스중 테트로비루스(retrovirus)군에 속한다. 레트로비루스는 양성-가닥 RNA 및 그의 핵에 비루스성 RNA를 DNA로 전환하는데 사용되는 리버스 트랜스크립타제(reverse transcriptase)라고 불리우는 특정 효소를 지니고 있다. 이 효소는 DNA가 RNA로 전환되는 세포성 전사의 고전적인 과정을 역으로 바꾼다.
T4 임파구 표면상의 T4 단백질이 HIV에 대한 수용기 또는 결합 부위로서 작용하므로 HIV가 T4임파구에 결합한다는 것이 알려져 있다[Dalgleish AG et al., Nature 312 : 763~767(1985)]. HIV는 또한 단구, 조직 대식세포 및 뇌, 척수와 말초신경 내의 세포 같은 다른 세포에도 결합하여 공격할수도 있다. HIV의 생활사는 비루스가 성적 활동이나 수혈등을 통해 숙주인 환자 안으로 들어가서 단구 및 임파구 상의 수용기에 결합하는 것으로 시작한다. 비루스는 세포를 침투하며 그의 외막 또는 단백질막을 벗어서 그의 비루스성 RNA 핵을 노출시킨다. 리버스 트랜스 크립타제가 비루스성 RNA 핵을 숙주 세포 게놈내로 통합되는 DNA로 전환시킨다. 숙주 세포막이 파열되어 인간 혈액계내에 새로운 비루스성 입자를 방출할때까지 새로운 비루스성 입자가 대량으로 생산된다.
HIV는 봉입막 또는 외막을 형성하는 단백질 분자 및 비루스성 RNA 항원을 싸고 있는 핵으로 구성되어 있다. 막상에서 및 핵 물질내에서 발현되는 항원이 있다 ; 핵은 비루스를 구성하는 단백질의 주 부분을 지니고 있다. 세포 주로부터 단일 클론 항체를 생산하는 일반적인 기법이 널리 사용되며 이론적으로 이해되고 있는 반면, 특정 항체를 생산하고자 하는데 있어서 부닥치는 어려움과 변화성 또한 잘 인지되어 있다. 특정 단일 클론 항체 개발 및 생산으로의 각 연구에 있어서 그 성공적 수행에 장애가 발생한다. 임의의 특정 프로젝트에 성공하느냐 못하느냐는 세포 융합 및 적당한 하이브리도마를 분리하는데 관련된 항원의 성질 및 그를 수행하는 기법에 상당히 관계된다. 이러한 장애는 세포주의 생산으로 그에 관련된 HIV 비루스에 특이적인 단일 클론 항체가 생산되는 경우 특히 분명하다. 수많은 항원 결정소(antigenic determinants)를 지닌 외막 및 수많은 항원 부위를 발현하는 핵 단백질로 구성되어 있는 HIV로 면역된 새앙쥐의 비장세포와 골수종 세포를 통상적으로 융합하면 수많은 하이브리도마가 생기며 그후 특정 항체에 대한 선별은 엄청나게 번거로운 일이 될 것이다.
HIV 분리물의 비루스성 단백질을 인지하는 단일 클론 항체는 "Ferns et al., J. Gen. Virol., 68 ; 1543~1551(1987-영국)"에서 연구되었다. HIV의 gag 단백질에 대해서 단일 클론 항체가 생겨났다. 웨스턴 블로트(Weatern blot)에 의해 단일 클론 항체의 특징을 알아내어 단일 클론 항체에 의해 인지된 HIV gag 단백질이 55000 달톤 분자량(p55), 24000 달톤 분자량(p24), 18000 달톤 분자량(p18)의 단백질인 핵 항원임을 확인하였다.
HIV의 전체 게놈이 "Serki et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 80 : 3618~3622(1983)"의 연구로 서열화되었다. 이 연구는 HIV 외막 유전자중 여러 글리코실화된 단백질을 알려주며 핵 단백질은 글리코실화된 단백질이 아님을 보여준다. 앞의 Ferns 등의 연구는 HIV 외막 유전자의 글리코실화된 단백질이 분자량 160,000달톤을 나타내는 gp160, 분자량 120,000 달톤을 나타내는 gp120 및 분자량 41,000 달톤을 나타내는 gp41로서 판명됨을 보여준다.
요사이 AIDS 질병을 앓고 있는 환자인지 또는 그 비루스에 면역적으로 노출되어 있는 환자인지를 판별 할 수 있도록 하는 단일 클론 항체를 이용한 시판하는 진단 시약은 아직 성공적인 것은 아니다. 질병의 증상이 발현되기전에 장기간에 걸친 잠복기가 필요하다는 사실로 인하여 질병의 진단은 까다로와진다. 질병의 높은 전염성 및 그 치료가 현재 과학적인 능력 밖이라는 사실로 인해서 살아있는 비루스를 연구하는 어려움과 성공적인 진단 시약이 개발될 수 있도록 하는 인간 면역계상의 역효과가 또한 증가한다.
본 발명의 목적은 핵내의 선택적 주 단백질에 결합하는 신규 단일 클론 항체를 생산하는 하이브리도마 또는 하이브리드 세포주를 제공하는 것이다. 이 단일 클론 항체는 특정 HIV 핵 항원의 공통적인 에피토프를 일관되며 확실하게 인지하므로 이 항체를 인간 생리학적 혈청 시료내의 HIV 비루스성 항원을 추적하는 면역분석에 매우 정확하게 사용할 수 있다. 이 단일 클론 항체는 HIV 외막 항원에는 결합하지 않는다.
발명의 상세한 설명
HIV 핵 항원 p55, gag 유전자에 대해 코오딩되는 전구체 단백질, 핵 단백질 p24 및 부분 분해 산물인 p39 와 p33에 결합할 수 있는 단일 클론 항체를 생산할 수 있는 세포주가 하이브리도마 기법에 의해 개발되었다. 본 발명을 구체화하는 단일 클론 항체는 p18 핵 단백질 또는 임의의 HIV 외막 항원에는 결합하지 않는다. 단일 클론 항체는 여기에서 "KC-57"항원이라고 판명된 p55, p24, p39 및 p33 항원상의 공통적인 에피토프를 인지한다.
본 발명의 세포주는 BALB/c 새앙쥐를 수거된 쥐의 비세포(splenocytes)와 융합하기 위한 통상의 골수종 세포주 및 선택한 면역원군을 사용하여 일련의 다중 주입으로 면역시키는 독특한 면역 프로토콜에 의해 개발되었다.
기탁에 관한 진술
본 발명에 따르는 KC-57 단일 클론 항체를 생산하는 세포주는 특허 출원과 동시에 1987년 11월 6일에 메릴랜드 20852, 록빌에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉숀에 기탁되었다. 세포주는 A.T.C.C. 번호 HB9585로 지정되었다.
본 발명을 수행하는 최상의 방법
재료 및 방법
비루스성 분리물
새앙쥐 면역용 항원은 림파데노파티 비루스(LAV) 감염된 세포주로부터 제조된다. 모든 비루스는 입도-배제 크로마토그래피에 의해 배양 상층액으로부터 분리된다. 트리톤 X-100으로 LAV를 용균시키고 렌즈콩렉틴 친화성 컬럼상에 흡착시켜서, 배양 상층액으로부터 비루스성 추출물을 또한 제조한다. 메틸-알파, -D만노피라노사이드에 의해 유리된 항원이 웨스턴 블로트 분석에 의해 핵 항원 일부(p55,p24)가 존재하는 1차 비루스성 외막(gp160/120)이라고 밝혀졌다.
하이브리도마 세포주의 생산
수컷 BALB/c 새앙쥐를 분리된 LAV로 감염된 완전 프로인트 보조액내의 세포주로 복강내 면역시킨다. 그리고나서 불완전 프로인트보조액 현탁액내의 정제된 비루스로 일주일 간격으로 새앙쥐에 세차례 추가 주입한다. 이러한 주입후 gp160/120 비루스성 추출물로 일주일 간격으로 세차례 면역시킨다. gp160/120의 3차 주입후 3일째에, 새앙쥐 한마리의 비장을 제거하여, 세포 현탁액을 만든다. 그후 비장 세포를 폴리에틸렌글리콜 1500내에서, SP2/0-Ag14 새앙쥐 골수종 세포와 융합시킨다. 융합된 세포를 96-웰 조직 배양 평판에 깔고, HAT(히포크산틴-아미놉테린-티미딘) 베지를 사용하여 항체-생산 하이브리도마를 선택한다(Nature 256 : 495~497,1975).
콜로니의 선별
HIV 핵 항원에 대한 항체를 생산하는 콜로니를 포획 ELISA에 의해 판별한다. HIV 핵 항원을 인지하는 인간 항체가 96-웰 폴리스티렌 분석 평판상에 흡착된다. 비-특이적 결합 부위를 소 혈청 알부민으로 차단한 후, 세제로 파괴된 LAV를 분석 평판을 사용하여 배양한다. 그리고나서 평판을 세척하고 각각의 하이브리도마 콜로니로부터 조절된 배지를 분석 웰에 첨가한다. 배양후, 평판을 세척하고, 퍼옥시다제-결합된 염소 항-새앙쥐 IgG+IgA+IgM을 첨가하고 배양한다. 다음, 웰을 세척하고, 기질인 테트라메틸벤지딘(TMB)을 첨가한다. H2SO4로 반응을 중지시키고, 450nm에서 흡광도를 측정한다. KC-57을 포함하는 양성 콜로니가 음성 기본 흡광도 보다 3배 이상 더 높은 흡광도를 지니는 것으로 판명되었다. 양성 콜로니를 넓게펴서 연질 한천에서 클로닝한 후, 항체를 함유한 복수액(as tes fluid)을 생산하기 위하여, 프리스탄으로 표지된(pristane-primed) BALB/c 새앙쥐내로 주입시킨다.
KC-57의 특성 분석
KC-57의 면역 글로불린 서브클라스가 오텔로니(Ouchterlony) 이중 확산법에 쥐의 IgG1으로 판명되었다. 웨스턴 블로팅을 수행하여 KC-57에 의해 인지되는 항원의 분자량을 결정하였다. LAV로 감염된 세포의 용해질을 이 분자량 분석을 위한 항원의 원으로 사용하였다. 항원에 대한 음성 대조는 비감염된 T세포의 용해질이다. 대조 표본은 KC-57과 아무런 반응성도 나타내지 않았다. 사용된 내부의 분자량 마아커는 피브리노겐(340,000), 피브로넥틴(440,000), 미오신(200,000), 베타-갈락토시다제(116,000), 포스포릴라제 B(92,500), 소 알부민(66,000), 난 알부민(43,000), 탄산 히드라제(30,000), 트립신 저해제(20,100) 및 알파락트알부민(14,000)이다. KC-57을 지닌 니트로셀룰로오스 띠를 항온 처리한 후, 125 요오드-염 항-새앙쥐 항체를 사용하여 단일 클론 항체에 의해 인지되는 HIV 항원을 검출한다. HIV 결합된 핵 항원 p55 및 p24, 그리고 p55의 분해 산물인 p39 및 p31이 KC-57에 의해 인지된다. p18과의 반응성은 전혀 나타나지 않으며 HIV 외막 항원과도 전혀 반응하지 않았다.
KC-57에 의해 인지되는 HIV 결합된 항원의 세포 표면 발현 분석은 플로리다, 하이아리에 소재하는 쿠울터 코오포레이숀사 제품인 EPICS 유동 세포 측정기 분석으로 수행한다. LAV로 감염된 세포를 KC-57과 함께 배양한 다음 염소 항-새앙쥐 FITC 배합체와 함께 배양한다. KC-57은 살아있는 HIV로 감염된 세포 표면상의 항원 결정소와 아무런 반응도 나타내지 않았다.
세포질성 HIV 핵 결합된 항원의 발현은 아세톤으로 고정된 LAV로 감염된 세포를 사용하여 수행한다. 또한, 비감염된, HTLV-Ⅰ 감염된 및 HTLV-Ⅱ 감염된 임파구가 동일한 방법으로 수득되며 제조된다. KC-57과 함께 배양한 다음, 염소 항-새앙쥐 FITC 배합체를 사용하여 특이적 반응성을 탐지한다. 비감염된, HTLV-Ⅰ 감염된, 또는 HTLV-Ⅱ 감염된 세포에 대하여 아무런 반응성도 나타내지 않았다. 핵 결합된 항원과 특이적으로 반응하는 KC-57은 고정된 HIV로 감염된 임파구의 세포질 내에 존재한다.
KC-57을 포획 항체로 사용하는 항원 포획 EIA가 개발되었다. 정제된 KC-57을 96웰 분석 평판상에 고상(固相)화 시키고 BSA로 차단시킨다. HIV 항원의 원은 LAV로 감염된 임파구로부터의 세제로 용균된 배양 상층액이다. 배양 및 세척후, 비오틴으로 표지된 인간 항-HIV 핵 항체를 첨가하고, 배양 및 세척한다. 다음, 스트렙트아비딘 퍼옥시다제를 첨가하여 계속 배양한다. 최종 세척후, TMB를 첨가하고 배양한다. 황산을 첨가하여 반응을 중지시킨다. 450nm의 파장에서 흡광도를 읽는다. 이 과정을 이용하여, 조직 배양에서 생장된 HIV의 9개체 분리물로 양성 결과가 수득되었다. 이러한 반응성을 결정하는데 사용된 항원은 세제로 용균된 배양 상층액이다. 비감염된 세포로부터의 상층액과는 아무런 반응성도 나타나지 않았다. 이 데이타가 하기의 표3에 나타나 있다.
KC-57 단일 클론 항체는 그 단일 클론 항체를 마이크로 타이터 평판의 웰과 같은 고형 표면상에 피복시키고 조절된 프로토콜내에서 인간 생리액 시료와 반응시키는 고상 면역분석(solid phase immunoassay)용으로 특히 사용된다. 분석 방법은 KC-57 단일 클론 항체가 시료내에서 발견된 HIV 항원에 결합되어 있는 상태로 검출되는 ELISA형이다.
[표 3]
표3에 나타나 있듯이, KC-57 단일 클론 항체를 포획상으로 사용하며 인간 항-HIV 항체를 검출상으로 사용하는 HIV 항원 분석에 의하여, 나열된 균주가 모두 HIV 항원 함유에 대해 양성으로 판명되었다.
[표 4]
상기 표는 앞서 기재된 HIV 항원 분석으로 시행된 다른 병원체에 대한 KC-57 항체의 반응성을 나타내고 있다. 이들 병원체중 어느 것과도 반응성이 나타나지 않는다.
상기 표는 상기 HIV 항원 분석에서 포획 항체로 사용된 다른 병원체에 대한 KC-57 단일 클론 항체의 반응성을 나타내고 있다.
본 발명은 일반적으로 하이브리도마 기법에 의해 생산된 단일 클론 항체에 관한 것이며 더욱 특별하게는, 여러 상이한 지리적 위치로부터 분리된 인간 면역 결핍 비루스(HIV) 분리물의 gag-코오팅된 단백질 군의 에피토프(epitope)를 인지하는 독특한 단일 클론 항체를 생산하는 세포주에 관한 것이다.
Claims (11)
- 메릴랜드주 록빌의 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉숀에 기탁, 지정된 A.T.C.C. 번호가 HB 9585인 하이브리도마 세포주로서, KS-57 핵 항원의 에피토프에 특이하게 결합하는 단일 클론 항체를 생산함을 특징으로 하는 하이브리도마 세포주.
- 제1항에 있어서, 핵 항원이 p55, p24 및 추가의 분해된 항원을 포함하는 하이브리도마 세포주.
- 제1항에 있어서, 단일 클론 항체가 쥐의 비세포로부터 유래되는 하이브리도마 세포주.
- 제1항에 있어서, 비세포가 일련의 상이한 임뮤노겐 면역법으로부터 유래되는 하이브리도마 세포주.
- 제4항에 있어서, 임뮤노겐이 분리된 LAV로 감염된 세포주, 정제된 HIV 비루스 및 gp160/120을 차례로 주입시킨 것으로 구성된 하이브리도마 세포주.
- 제3항에 있어서, 비세포가 새앙쥐 골수종 세포와 융합된 하이브리도마 세포주.
- 메릴랜드 록빌에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉숀에 A.T.C.C. 번호 HB9585로 기탁된 하이브리도마 시료로부터 생산된 단일 클론 항체.
- A. 다음 비루스성 분리물로부터 제조된 항원을 새앙쥐에 주사하고, 새앙쥐 비장세포를 수거하여 새앙쥐 골수종 세포주와 융합시키고 ; B. 융합된 세포를 선별하여 p55, p24 및 특정의 분해된 핵 항원을 포함하는 HIV 핵 항원군 상의 KC-57 항원에 특이적으로 결합하는 단일 클론 항체를 분리하고 ; C. KC-57 항원의 면역 글로불린 이소타입(isotype)이 새앙쥐 IgG1인 것을 특징으로 하는 하이브리도마 기법에 의해 생산되는 세포주로부터 유래하는 단일 클론 항체.
- HIV 핵 항원군의 KC-57 항원에 결합하여 HIV 외막 항원에는 본질적으로 결합하지 않는 단일 클론 항체.
- 제9항에 있어서, 핵 항원이 p55 및 p24 항원인 것을 특징으로 하는 단일 클론 항체.
- 제10항에 있어서, 핵 항원이 p39 및 p33 항원인 것을 특징으로 하는 단일 클론 항체.
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