JP2710972B2 - Ｈｉｖ抗原に特異な単クローン性抗体 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 この発明は、一般にハイブリドーマ技術により産生さ
れる単クローン性抗体に関し、特に種々の異なる地理的
場所からのヒト免疫不全ウイルス（HIV）分離物のgag暗
号タンパク質群のエピトープを認識する独特の単クロー
ン性抗体を産性する細胞系統に関する。

背景技術 HTLV III、すなわちヒトＴ細胞性白血病ウイルスIII
型は、現在通例ヒト免疫不全ウイルス（「HIV」）と呼
ばれ、ヒト免疫不全症候群すなわちエイズに対する作因
体（causative agent）であると認識されている。米国
その他の諸国において流行病の割合に迫りつつあると考
えられるエイズの慢性的性質を反映してヒト末梢血液中
のウイルス性抗原及びこのような抗原に対する抗体を信
頼性をもって一貫して検出する診断的イムノアッセイを
発展させる研究と努力が広範囲に見られる。このような
イムノアッセイを発展させるためには、ほとんど単クロ
ーン性抗体技術に依存している。

HIVは、ウイルスのレトロウイルス群に属する。レト
ロウイルスは、正の鎖のRNAと、リバーストランスクリ
プターゼと呼ばれる、ウイルスRNAをDNAに転化するのに
用いられる特殊な酵素とをウイルスのコア内に有する。
これは、DNAがRNAに転化される細胞の転写の古典的過程
の逆反応である。

HIVがT4リンパ球に結合すること、またその理由がT4
リンパ球の表面上のT4タンパク質がHIVのレセプターす
なわち結合部位として役立つためであることが知られて
いる（ダルグレイシユ・エイ・ジー（Dalgleish AG）
ら、ネィチャー（Nature）312:763〜767頁（1985
年））。また、HIVは、単球、組織マクロファージ並び
に脳、脊髄及び末梢神経内の細胞のような他の細胞に結
合してこれらを攻撃することもできる。HIVの生活環
は、ウイルスが、例えば性行動又は輸血により宿主患者
に入り、次いで単球及びリンパ球上のレセプターに結合
することを要する。ウイルスは細胞を貫入して、そのウ
イルスRNAコアを露出するようにそのエンベロープ、す
なわちタンパク質被覆を脱ぎ捨てる。リバーストランス
クリプターゼは、ウイルスRNAコアをDNAに転化し、これ
が宿主細胞ゲノムに組込まれる。新しいウイルス粒子が
ある量まで産生されると宿主細胞の膜を破って新しいウ
イルス粒子がヒトの血液系中に放出される。

HIVは、包膜すなわちエンベロープを形成するタンパ
ク質分子とウイルスRNA抗原を覆うコアから成る。膜上
及びコア物質中に発現された抗原がある；コアは、ウイ
ルスに含まれるタンパク質の大部分を有する。単クロー
ン生抗体を細胞系統から産生する一般技術は広く用いら
れ、理論的に理解されているが、特定の抗体を産生する
試みで出会う複雑さと変化は、よく認識されている。特
定単クローン性抗体の発生及び産生の各研究は、成功し
て達成するためのそれに特有の障碍がある。特定の研究
課題の成否は、関係する抗原の性質と細胞融合を行うの
に用いる技術と適当なハイブリドーマの分離に大いに関
係する。これらの障碍は、HIVウイルスに特異な単クロ
ーン性抗体を産生する細胞系統の産生が関係する場合、
特に明らかである。HIVは、無数の抗原決定基を有する
エンベロープ膜と無数の抗原部位を発現するコアタンパ
ク質とからなるので、骨髄腫細胞と免疫化マウスの脾細
胞の通常の融合が天文学的数のハイブリドーマを発生さ
せ、その後の特定抗体のスクリーニングが途方もなく複
雑な仕事であることが容易に分かるであろう。

HIV分離物のウイルスタンパク質を認識する単クロー
ン性抗体がフェルンス（Ferns）らにより研究された
（T.Gen.Virol.,68:1543〜1551頁（1987年 英国）。該
単クローン性抗体は、HIVのgagタンパク質に対して挙げ
られた。一群の単クローン性抗体が、ウェスタンブロッ
ト法により該単クローン性抗体により認識されるHIVgag
タンパク質を55000ダルトン分子量（p55）、24000ダル
トン分子量（p24）、18000ダルトン分子量（p18）のタ
ンパク質（すべてコア抗原）として確定することを認識
された。

HIVの全ゲノムは、セルキ（Serki）らの研究（Proc.N
atl.Acad.Sci.,80:3618〜3622頁（1983年））で配列が
決定された。この研究は、HIVエンベロープ遺伝子の種
々のグリコシル化タンパク質と、コアタンパグ質がグリ
コシル化タンパク質でないことを示した。上記フェルン
スらの研究は、HIVエンベロープ遺伝子のグリコシル化
タンパク質が160000ダルトンの分子量を示すgp160、120
000ダルトン分子量を示すgp120及び41000ダルトンの分
子量を示すgp41として同定されることを示す。

単クローン性抗体を利用して人がエイズ病をもってい
るか免疫学的にウイルスにさらされたかを決定するのに
現在商業的に利用しうる診断試験は、成功には遠かっ
た。この病気の診断は、病気の症状が発現する前に長い
潜伏期間が必要であるという事実により複雑になる。病
気の高い感染性とその治療も現在では科学的能力内にな
いという事実も、成功する診断試験を発展させうるよう
に生きているウイルスとヒト免疫系へのその不利な影響
を調べる困難さを増加する。

この発明の目的は、コア内の選択的主タンパク質に結
合する新規単クローン性抗体を産生するハイブリドーマ
すなわち雑種細胞系統を提供することである。この単ク
ローン性抗体は、若干のHIVコア抗原の共通エピトープ
を一貫して信頼性をもって認識するので、前記抗体は、
ヒト生理血清試料中のHIVウイルス抗原を大きな精度を
もって追跡するイムノアッセイに用いることができる。
この単クローン性抗体は、HIVエンベロープ抗原と結合
しない。

発明の開示 HIVコア抗原p55、gag遺伝子に対して暗号化された前
駆体タンパク質、コアタンパク質p24並びに部分分解生
成物p39及びp33に結合しうる単クローン性抗体を産性し
うる、ハイブリドーマ技術により発生された細胞系統。
この発明を具体化する単クローン性抗体は、p18コアタ
ンパク質又はいかなるHIVエンベロープ抗原とも結合し
ない。この単クローン性抗体は、p55、p24、p39及びp33
抗原上の共通エピトープ（ここでは「KC−57」抗原とし
て同定される）を認識する。

この発明の細胞系統は、BALB/cマウスを免疫原の選択
群を用いる一連の多重注入によって免疫化した独特の免
疫化記録（protocol）と、収穫したネズミの脾細胞と融
合させるための従来の骨髄腫細胞系統とにより発生され
た。

寄託供述 この発明に係るKC−57単クローン性抗体を産生する細
胞系統は、アメリカン タイプ カルチャー コレクシ
ョン、アメリカ合衆国メリーランド州20852ロックヴィ
ルに1987年11月６日この特許出願の出願と同時に寄託さ
れた。細胞系統にA.T.C.C.No.HB9585が与えられた。

発明を実施する最良の形態 物質と方法 ウイルス分離物 マウスの免疫化のための抗原は、リンパ腺症ウイルス
（LAV）感染細胞系統から調製した。全ウイルスを培養
液上清からサイズ排除クロマトグラフィーにより分離し
た。ウイルス抽出物も、培養液上清からトライトン（Tr
iton）Ｘ−100によるLAVの溶菌と次いでレンズ豆レクチ
ンアフィニティーカラム上の吸収により調製した。メチ
ル−アルファ，−Ｄマンノピラノシドにより溶離された
抗原は、ウェスタンブロット分析により若干のコア抗原
（p55、p24）が存在する、主としてウイルスエンベロー
プ（gp160/120）であることが示された。

ハイブリドーマ細胞系統の産生 雄性のBALB/cマウスを、完全フロイントアジュバント
中の分離LAV感染細胞系統で腹腔内で免疫化した。次い
で、マウスは、不完全フロイントアジュバントの懸濁液
中の精製ウイルスの更に３回の注入を腹腔内に受け、各
注入は１週間間隔で行った。これらの注入に続いてgp16
0/120ウイルス抽出物の１週間間隔であけた３回の免疫
化を行った。gp160/120の第３回注入後３日後、１匹の
マウスの脾臓を取り出し細胞懸濁液をつくった。次いで
この脾細胞をポリエチレングリコール1500中SP2/0−Ag1
4マウス骨髄腫細胞と融合させた。融合細胞を96穴組織
培養プレートにプレーティングし抗体産生ハイブリドー
マをHAT（ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジ
ン）培地で選択した（ネイチャー256:495〜497頁、1975
年）。

コロニーのスクリーニング HIVコア抗原に対する抗体を産生するコロニーは、捕
捉（capture）ELISA法により同定された。HIVコア抗原
を認識する抗体は、96穴ポリスチレンアッセイプレート
上に吸収された。非特異性結合部位をウシ血清アルブミ
ンでブロッキングした後、デタージェント分裂LAVをア
ッセイプレートでインキュベートした。次いで、プレー
トを洗浄し、各個々のハイブリドーマコロニーからの条
件付き（conditioned）培地をアッセイ穴に加えた。イ
ンギュベイション後、プレートを洗浄し、ペルオキシダ
ーゼ複合ヤギ抗ヤウスIgG＋IgA＋IgMを加えてインキュ
ベートした。穴を次に洗浄し、基質テトラメチルベンジ
ジン（TMB）を添加した。反応をH₂SO₄で停止し、吸光度
を450nmで測定した。KC−57を含む陽性コロニーは、陰
性中央（central）吸光度の少なくとも３倍の吸光度を
有するとして同定された。陽性コロニーを広げ、軟寒天
中クローン化し、次いでこれを抗体含有腹水症液を産生
するためプリスタンプライミングした（pristane−prim
ed）BALB/cマウスに注入した。

KC−57の確認 KC−57の免疫グリブリンサブクラスは、オークテルロ
ニー（Ouchterlony）の二重拡散法によりネズミのIgG1
であることが決定された。KC−57により認識された抗原
の分子量を測定するためウェスタンブロット法を行っ
た。LAV感染細胞の溶菌液をこの分析のための抗原源と
して用いた。抗原に対する陰性コントロールは、未感染
Ｔ細胞の溶菌液であった。コントロール標本は、KC−57
との反応性を示さなかった。使用した内部分子量標識
は、フィブリノーゲン（340000）、フィブロネクチン
（440000）、ミオシン（200000）、β−ガラクトシダー
ゼ（116000）、ホスホリラーゼＢ（92500）、ウシアル
ブミン（66000）、オボアルブミン（43000）、カルボニ
ックヒドラーゼ（30000）、トリプシンインヒビター（2
0100）及びα−ラクトアルブミン（14000）であった。K
C−57を有するニトロセルロースストリップのインキュ
ベイションに続いて125I−ヤギ抗マウス抗体を単クロー
ン性抗体により認識されるHIV抗原を検出するのに用い
た。HIV関連コア抗原p55及びp24並びにp55の切断生成物
であろうp39及びp31は、KC−57により認識される。p18
との反応性は見られず、HIVエンベロープ抗原との反応
性も何ら見られなかった。

KC−57により認識されるHIV関連抗原の細胞表面発現
の分析をEPICSフローサイトメーター分析（クールター
・コーポレーション、フロリダ州ハイアリー、製機器）
により行った。LAV感染細胞をKC−57とともにインキュ
ベートした後、ヤギ抗マウスFITC複合体とともにインキ
ュベートした。生きているHIV感染細胞の表面上の抗原
決定基に対するKC−57の反応性は証明されなかった。

細胞質HIVコア関連抗原の発現がアセトン固定LAV感染
細胞を用いて行われた。更に、未感染、HTLV−Ｉ感染及
びHTLV−II感染リンパ球が同じ仕方で得られ調製され
た。KC−57とともにインキュベイション後、ヤギ抗マウ
スFITC複合体を特異的反応性を検出するために用いた。
未感染、HTLV−Ｉ感染、又はHTLV−II感染細胞に対して
反応性は証明されなかった。KC−57は、固定HIV感染リ
ンパ球の細胞質中に存在するコア関連抗原と特異的に反
応した。

KC−57を捕捉抗体として用いる抗原捕捉EIAを開発し
た。精製KC−57を96穴アッセイプレート上に固相化し、
BSAでブロッキングした。HIV抗原源は、LAV感染リンパ
球からのデタージェント溶菌培養液上清であった。イン
キュベイションと洗浄後、ビチオン標識化ヒトHIVコア
抗体を添加し、インキュベートし洗浄した。次にストレ
プタビジン（streptavidin）ペルオキシダーゼの添加と
これに続くインキュベイションであった。最終洗浄後、
TMBを添加しインキュベートした。硫酸の添加により反
応を停止した。吸光度を450ナノメートルの波長で読ん
だ。この手法を用いて、組織培養中に成長したHIVの九
つの個々の分離物について陽性の結果が得られた。この
反応性を測定するのに用いた抗原は、デタージエント溶
菌培養液上清であった。未感染細胞からの上清について
反応性は見られなかった。このデータを下記表３に示
す。

KC−57単クローン性抗体は、前記単クローン性抗体が
マイクロタイタープレートの穴のような固体表面上に被
覆され制御された記録でヒト生理液サンプルと反応させ
られる固相イムノアッセイに対して特に有用である。ア
ッセイ方法論は、KC−57単クローン性抗体がサンプル中
に見いだされるHIV抗原に結合することで検出されるELI
SA型であってもよい。

表 ３ KC−57HIV抗原捕捉ELISA HIV分離物 分離された地域 結果 LAV フランス ＋ BAGAL ニューヨーク市 ＋ 1265 D13 アトランタ ＋ Z 34 ザイール ＋ SDR サンフランシスコ ＋ 2153 D16 ニューヨーク市 ＋ 121886−１ ベセスダ ＋ 1272 D21 シカゴ ＋ 表３は、KC−57単クローン性抗体を捕捉相とし、ヒト
抗HIV抗体を検出相として用いるHIV抗原アッセイが表示
した全株がHIV抗原含有量に対して陽性であると同定し
たことを明らかにする。

表 ４ KC−57単クローン性抗体の特異性 病 原 体 ＃試験 ＃陽性 EBV ２ ０ HTLV Ｉ ２ ０ HTLV II ２ ０ HSV Ｉ ２ ０ HSV II ２ ０ CMV ２ ０ クラミジア ２ ０ 上記表は、前記HIV抗原アッセイで行った場合の他の
病原体に対するKC−57抗体の反応性を示す。これらの病
原体のいずれとも反応性は、見られなかった。

表４は、前記HIV抗原アッセイにおいてKC−57単クロ
ーン性抗体を捕捉抗体として用いた場合の該抗体の他の
病原体に対する反応性を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 サリバアン キャロル アメリカ合衆国フロリダ州 33161 マ イアミ エヌ イー フィフス アベニ ュー 10811 (72)発明者 トウドター ガリー ピー アメリカ合衆国フロリダ州 33025 ミ ラマル サイプレス サークル ノース 9210

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】HIVp55,p24,p33およびp39コア抗原上の共
   通のエピトープに特異的に結合する単クローン性抗体を
   産生する、アメリカン タイプ カルチャー コレクシ
   ョン、メリーランド州ロックヴィルに寄託されA.T.C.C.
   番号HB9585を与えられたハイブリドーマ細胞系統。
2. 【請求項２】アメリカン タイプ カルチャー コレク
   ション、メリーランド州ロックヴィルに寄託されA.T.C.
   C.番号HB9585を与えられたハイブリドーマ細胞系統サン
   プルから産生され、かつKC−57とて同定されたHIVp55,p
   24,p33およびp39コア抗原の抗原決定基に特異的に結合
   する単クローン性抗体。
3. 【請求項３】KC−57として同定されたHIVp55,p24,p33お
   よびp39コア抗原の抗原決定基に特異的に結合し、HIVコ
   ア抗原p18およびHIVエンベロープ抗原に関して結合特異
   性を有しない単クローン性抗体。