JP2003146999A - Ｈｉｖ−２型ヒトレトロウイルスのトランスメンブランエンベロープ糖タンパク質の抗原、及び、該抗原に免疫類似性を有する抗原 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】ＨＩＶ−２型ヒトレトロウイルスのトランスメ
ンブランエンベロープ糖タンパク質の抗原由来の及び該
抗原に免疫類似性を有するポリクロナール及びモノクロ
ナール、これを産生するハイブリドーマに係わる。 【解決手段】特にヒトレトロウイルスＨＩＶ−２の感染
のある時期に限って存在する抗原由来の抗体に係り、生
体内におけるかかる抗原の形成または解離を遮断するこ
とによってＨＩＶ−２の感染を抑制することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ＨＩＶ−２型ヒト
レトロウイルスのトランスメンブランエンベロープ糖タ
ンパク質の抗原、及び、該抗原に免疫類似性（ｐａｒｅ
ｎｔｅ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｑｕｅ）を有する抗原、
特にヒトレトロウイルスＨＩＶ−２の感染のｉｎ ｖｉ
ｖｏ経過のいくつかの時期に限って存在する抗原に係
る。これらの抗原は、該レトロウイルスのトランスメン
ブランエンベロープ糖タンパク質の形成及び成熟プロセ
スに特徴的であり、従ってレトロウイルスＨＩＶ−２の
発生及び増殖に関与し、感染の伝播に関与する。

【０００２】本発明はまた、これらの抗原を認識する抗
体、及び、該抗体を含有する免疫原性組成物に係る。

【０００３】本発明は更に、上記抗原の製造、及び、ヒ
トレトロウイルスＨＩＶ−２の感染を診断するための該
抗原の使用に係る。

【０００４】

【従来の技術】リンパ節障害症候群（ＳＬＡ）を発症さ
せる主因もしくは一因となる病因物質または後天性免疫
不全症候群（ＡＩＤＳ）を発症させる主因となる病因物
質は単離され、同定され、特性決定も行なわれた。

【０００５】ある種の条件下でヒトＳＬＡを発症させ場
合によってはＡＩＤＳを併発させ得るいくつかのヒトレ
トロウイルスはＨＩＶ（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅ
ｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ）と命名されている。

【０００６】最初に単離されたウイルスはＬＡＶ−１ま
たはＨＩＶ−１と命名され、英国特許出願８３／２４，
８００及び欧州特許出願８４／４０１，８３４（１４／
０９／８４）などに記載されている。このウイルスはま
たＦ．Ｂａｒｒｅ Ｓｉｎｏｕｓｓｉ他によって記載さ
れている（１）。

【０００７】ＬＡＶ ＥＬＩ及びＬＡＶ ＭＡＬと命名
されたウイルスＨＩＶ−１の変種も単離されて特性決定
された。これは欧州特許出願８４／４０１，８３４に記
載されている。

【０００８】上記ウイルスとの免疫類似性が小さい別の
クラスに所属するレトロウイルスの単離及び特性決定
は、欧州特許出願８７／４００，１５１．４（欧州特許
第２３９，４２５号）に記載されている。ＨＩＶ−２と
いう名称で分類された該レトロウイルスは、リンパ節障
害またはＡＩＤＳの症状を示すアフリカ人患者から単離
された。

【０００９】このようなＨＩＶレトロウイルスの研究、
その単離及びそれらのヌクレオチド配列の分析、それら
の抗原性タンパク質の特性決定などに基づいて、得られ
た種々の菌株間の構造的及び機能的な類似性または逆に
特異性の比較研究が可能である。

【００１０】また、レトロウイルスＨＩＶ−１及びＨＩ
Ｖ−２を、サル由来のレトロウイルス（ＳＩＶまたはＳ
ＴＬＶ−III）と比較研究することもできる。この研究
の結果、レトロウイルスＨＩＶ−２及びその変種とレト
ロウイルスＳＩＶとの間にタンパク質及び糖タンパク質
のある程度の類似性があることが判明した。

【００１１】各ウイルスのエンベロープタンパク質の処
で類似性が特に顕著である。実際、レトロウイルスＳＩ
Ｖのエンベロープ糖タンパク質とレトロウイルスＨＩＶ
−２のエンベロープ糖タンパク質に対する抗体との間で
は交差免疫反応が観察されるが、レトロウイルスＳＩＶ
とレトロウイルスＨＩＶ−１との間、及びレトロウイル
スＨＩＶ−１とＨＩＶ−２との間ではこのような交差免
疫反応が生じない。

【００１２】前出の欧州特許出願８７／４００，１５
１．４は、レトロウイルスのゲノムのｅｎｖ遺伝子によ
ってコードされるレトロウイルスＨＩＶ−２のエンベロ
ープ糖タンパク質に関して得られた結果を示している。
該欧州特許出願は、分子量約１４０，０００ｄを有する
ことに基づいてこの糖タンパク質をｇｐ１４０と命名し
た。分子量の計算には±１０％の誤差が見込まれている
ことは理解されよう。また、前出のフランス特許出願
（出願第８６／０３８８１号、公告第２，５９６，０６
３号）は、ｇｐ１６０（分子量１６０Ｋｄ±１０％）と
命名したｇｐ１４０の前駆物質を記載している。

【００１３】発明者等は、レトロウイルスＨＩＶ−２の
エンベロープ糖タンパク質に関する研究を更に進展さ
せ、上記の分子量の範囲に基づいて、これまで与えられ
ていた分子量とは別の測定値を得ることに成功し、より
精密な結果を得ることに成功した。本発明の処理条件下
では、ＨＩＶ−２のウイルス粒子の外層エンベロープ糖
タンパク質は分子量約１２５，０００ｄを有していた
（この糖タンパク質をｇｐ１２５と命名した）。同じ処
理条件を用いた最新の結果によれば、フランス特許出願
８６／０３８８１で既に証明されｇｐ１６０と命名され
ていた前駆物質は分子量約１４０，０００ｄであった。
従って本発明ではこれを「ｇｐ１４０」と命名する。

【００１４】外層エンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２５
とトランスメンブランエンベロープ糖タンパク質ｇｐ３
６とを含む成熟形エンベロープ糖タンパク質が得られる
までに複数の増殖段階が存在することはこれまでに既に
判明していた。即ち、ヒトレトロウイルスＨＩＶ−２に
感染した後で病原体性疾患が進行する際にウイルス複製
サイクルが出現しこのサイクルの経過中に複数の段階が
存在することが確認されていた。

【００１５】

【課題を解決するための手段】ＨＩＶ−２の外層エンベ
ロープ糖タンパク質の前駆物質ｇｐ３００の存在及び特
性決定に関する最初の結果が得られた。この糖タンパク
質は参考文献（２９）に記載されている。説明の便宜
上、以後の記載ではこの糖タンパク質をｇｐ３００と呼
ぶ。発明者等は、ＨＩＶ−２のウイルスサイクルに関与
する新しい糖タンパク質を発見しその特性を決定した。

【００１６】発明者等は同時に、レトロウイルスＨＩＶ
−１及びＳＩＶのウイルスサイクルに対しても同様の研
究を行なった。これらの研究で、レトロウイルスＨＩＶ
−２及びＳＩＶに共通で逆にＨＩＶ−１のウイルス複製
サイクルには明らかに存在しない極めて特異的な新しい
特性が判明した。

【００１７】従って本発明は、ヒトレトロウイルスＨＩ
Ｖ−２または近縁ウイルスの感染を検出しヒトレトロウ
イルスＨＩＶ−２型のレトロウイルスの属性を決定する
ための新しい手段に係る。

【００１８】得られた結果から判断すると、レトロウイ
ルスＨＩＶ−２及びＳＩＶに特有のウイルスサイクル
は、複合連鎖反応プロセスとして出現し、これらのプロ
セス全体によって最終形態のレトロウイルスＨＩＶ−２
のエンベロープ糖タンパク質が形成される。このプロセ
スにおいて新しい抗原性タンパク質または糖タンパク質
を認識し単離し同定した。

【００１９】従って本発明は、ヒトレトロウイルスＨＩ
Ｖ−２に感染した後に産生され、トランスメンブラン糖
タンパク質ＧＰ３６と共通のペプチド骨格を有しウイル
スサイクルの進展中に２つのトランスメンブラン糖タン
パク質ｇｐ３６に解離し得る抗原性糖タンパク質に係
る。

【００２０】二量体の形態のかかる糖タンパク質は、最
適の形態及びコンホーメーションに対応し、細胞膜とウ
イルス膜とを融合させ得る。

【００２１】従って本発明は、以下の特性を有するこ
と、即ち、 −分子量約８０ｋＤａを有する、 −糖タンパク質ｇｐ３００に対するポリクローナル抗体
によって認識される、 −ヒトのＳＬＡまたはＡＩＤＳを発症させ得るＨＩＶ−
２型ヒトレトロウイルスのゲノムによってコードされた
トランスメンブランエンベロープ糖タンパク質ｇｐ３６
の２つの完全体を二量体の形態に会合させて含む、また
は、 −ｇｐ８０に対する抗体と共に抗原−抗体型の免疫複合
体を形成し得る同程度の分子量のすべての糖タンパク質
を含む、ことを特徴とする抗原性糖タンパク質ｇｐ８０
に係る。

【００２２】前述の糖タンパク質ｇｐ３００は参考文献
（１３）に記載された糖タンパク質であり、分子量約３
００ｋＤａを有し、特にＳＬＡまたはＡＩＤＳを発症さ
せ得るヒトレトロウイルスＨＩＶ−２のゲノムのｅｎｖ
遺伝子によってコードされたエンベロープ糖タンパク質
ｇｐ１２５の前駆物質ｇｐ１４０が２つ会合して形成さ
れたものである。

【００２３】発明者等はこのタンパク質を単離し特性決
定した後で、ＨＩＶ−２の抗原に対して陽性の患者の血
清が細胞抽出物またはウイルス抽出物中の糖タンパク質
ｇｐ８０を認識することを知見した。ｇｐ８０は、感染
性でありまた病原性にもなるウイルス粒子の形成段階の
１つで必要なトランスメンブラン糖タンパク質の成熟産
物である。従って発明者等は、ＨＩＶ−２型粒子が形成
される正常ウイルスサイクルを、特にｇｐ８０の形成ま
たは解離の処で遮断することによって感染の伝播を妨害
し得ると判断した。かかる感染遮断は、糖タンパク質ｇ
ｐ８０の成熟を阻害し得るキャスタノスペルミン（ｃａ
ｓｔａｎｏ−ｓｐｅｒｍｉｎｅ）の使用によって強化さ
れた。

【００２４】本発明の糖タンパク質ｇｐ８０の特徴は、
更に以下の特性を有すること、即ち、 −ＨＩＶ−２型ヒトレトロウイルスに感染した細胞及び
／またはＨＩＶ−２型のビリオン及び／またはウイルス
に会合し得る、 −１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００のような非イオン性
界面活性剤の存在下ではｉｎ ｖｉｔｒｏで解離せず、
弱酸性ｐＨの１％のＳＤＳのようなイオン性界面活性剤
の存在下ではＨＩＶ−２型レトロウイルスのトランスメ
ンブラン糖タンパク質を形成すべくｉｎ ｖｉｔｒｏで
解離する、 −ＨＩＶ−２血清−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅイムノアフィニ
ティカラムで精製でき、（ポリアクリルアミドゲル電気
泳動で分析すると）感染細胞の標識開始の３〜４時間後
に出現する、ことである。

【００２５】また、上記に定義した糖タンパク質ｇｐ８
０に由来し、該糖タンパク質ｇｐ８０の非グリコシル化
ペプチド骨格に対応するタンパク質も本発明の範囲に包
含される。

【００２６】ｇｐ８０のグリコシル化基が除去された上
記タンパク質はｇｐ８０と共通の特性をいくつか有して
おり、これらの特性によって本発明において重要である
と考えられている。

【００２７】サルレトロウイルスＳＩＶとレトロウイル
スＨＩＶ−１とのウイルスサイクルを同時に研究するこ
とによって、ＳＩＶのサイクルが分子量約６５ｋＤａの
糖タンパク質ｇｐ６５の形態の二量体化段階を含み、こ
の二量体化の後で２つのトランスメンブランエンベロー
プ糖タンパク質ｇｐ３２が形成されることが判明した。

【００２８】逆にＨＩＶ−１感染した生物サンプル中で
は、トランスメンブランエンベロープ糖タンパク質のこ
のような二量体化プロセスが観察されなかった。

【００２９】従って、二量体の形態のトランスメンブラ
ンエンベロープ糖タンパク質が得られることは、ＨＩＶ
−２型レトロウイルスによる感染または該レトロウイル
スと免疫学的に近縁のレトロウイルスによる感染に特異
的に関連すると考えられる。従って、この糖タンパク質
は、ＨＩＶ−２レトロウイルスまたは近縁レトロウイル
スによる特異感染の検出に特に適した手段を構成する。

【００３０】本発明はまた、一方でＨＩＶ−２型レトロ
ウイルスに感染した細胞中に存在するｇｐ３００、ｇｐ
１４０、ｇｐ１２５及びｇｐ８０を特異的に認識し、他
方でＨＩＶ−２型レトロウイルスの抽出物中に存在する
ｇｐ１２５、ｇｐ８０及びｇｐ３６を特異的に認識し、
健常細胞またはＨＩＶ−１型レトロウイルス感染細胞中
に存在するタンパク質または糖タンパク質を認識しない
ポリクローナルまたはモノクローナル抗体に係る。

【００３１】また、糖タンパク質ｇｐ８０と特異的に反
応しＨＩＶ−１型レトロウイルス感染細胞のタンパク質
またはＨＩＶ−１のウイルス集塊とは反応しないことを
特徴とするモノクローナル抗体も本発明の範囲に包含さ
れる。

【００３２】本発明の別のモノクローナル抗体の特徴
は、更にＨＩＶ−２の糖タンパク質ｇｐ３００ｇｐ、ｇ
ｐ１４０及びｇｐ３６を認識することである。

【００３３】上記の定義に適う特に有利な第３のモノク
ローナル抗体の特徴は、糖タンパク質ｇｐ８０とペプチ
ドｐ３９′のアミノ酸配列ＶＴＡＩＥＫＹＬＱＤＱＡＲ
ＬＮＳＷＧＣＡＦＲＱＶＣＨとに共通のエピトープを認
識することである。

【００３４】本発明の目的はまた、ｇｐ８０に由来しグ
リコシル基が除去されたタンパク質に対する抗体を提供
することである。

【００３５】上記モノクローナル抗体は、免疫原性及び
中和性を有し、ｇｐ８０の形成プロセスに作用してレト
ロウイルスＨＩＶ−２の増殖を妨害し得る。

【００３６】上記抗体を産生する種々の方法も本発明の
範囲に包含される。例えば、動物、特にマウスのごとき
齧歯類の腹水培養を利用してもよい。また、固定または
被包または懸濁させた細胞培養物から抗体を産生させて
もよい。特に、レトロウイルスＨＩＶ−２を予め接種し
た動物のリンパ球の融合によってハイブリドーマを得る
方法の使用が適当であろう。感染動物のリンパ球を採取
し選択されたミエローマ細胞と融合させてハイブリッド
を形成し、次に前記の抗原性タンパク質または糖タンパ
ク質に対する特異的抗体を産生し得る能力に基づいて選
択する。

【００３７】本発明のモノクローナル抗体の好ましい製
造方法は以下の段階を含む。 −精製した糖タンパク質ｇｐ８０を必要に応じて複数回
腹腔内注射することによってＢＡＬＢ−Ｃ型マウスを免
疫する、 −免疫マウスの細胞特に脾臓細胞をミエローマ細胞例え
ばＮＳ１型細胞とＫｏｈｌｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ
（１０）の方法で融合させる、−所望のモノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマを選択し回収する。

【００３８】所望のモノクローナル抗体を産生するハイ
ブリドーマを選択するためのハイブリドーマのスクリー
ニングはＲＩＰＡテストまたはウェスターン法（ａｎａ
ｌｙｓｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ）で行なう。

【００３９】本発明の実施に特に適したモノクローナル
抗体は、上記の方法のいずれかによって得られる。また
ｇｐ８０または上記の定義に対応する類似のタンパク質
に対するモノクローナル抗体の特性を、モノクローナル
抗体１Ｈ８（Ｍａｂ １Ｈ８）に関して記載された結果
との比較によって試験できる。

【００４０】本発明の目的はまた、上記のモノクローナ
ル抗体を産生するハイブリドーマを提供することであ
る。

【００４１】産生されるこれらのモノクローナル抗体は
例えば、タンパク質及び／または糖タンパク質と共に免
疫複合体を形成してこれらのタンパク質及び／または糖
タンパク質を失活させるために使用される。あるいは、
ＨＩＶ−２の最終エンベロープ糖タンパク質が形成され
るまでのプロセスの正常な進行を阻止するモノクローナ
ル抗体の能力が利用される。

【００４２】これらの抗体はまた、例えば生物製剤中の
ウイルス抗原の検出に使用されてもよく、または例えば
アフィニティカラムでのタンパク質及び／または糖タン
パク質の精製に使用されてもよい。

【００４３】発明者等は、ｇｐ８０の存在を知見しこれ
を単離し特性決定することによって、ＨＩＶ−２型ヒト
レトロウイルス感染の診断手段の開発に成功した。

【００４４】従って本発明は、ＨＩＶ−２型ヒトレトロ
ウイルスの感染を、該レトロウイルス感染後に形成され
る抗体を含む疑いのある生物サンプルからｉｎ ｖｉｔ
ｒｏで特異的に診断し得る抗原性組成物を提供する。本
発明組成物の特徴は、前記に定義した糖タンパク質ｇｐ
８０を少なくとも含むことである。

【００４５】生物サンプルは、生物体液、特に血液もし
くは血清でもよくまたは生物組織抽出物でもよい。本発
明組成物は、このような生物サンプル中の抗体を検出す
るために有効である。

【００４６】従って本発明の目的はまた、ＨＩＶ−２型
レトロウイルスによる特異感染のｉｎ ｖｉｔｒｏ診断
方法を提供することである。本発明方法の特徴は、以下
の段階、即ち、 −ＨＩＶ−２型レトロウイルス感染後に産生する抗体を
含むと予想される生物サンプルと前記に定義した糖タン
パク質ｇｐ８０または前記の抗原性組成物とを抗原−抗
体型の免疫複合体が形成され得る適当な条件下に接触さ
せ、 −場合によっては形成される抗原−抗体複合体を検出す
る段階を含むことである。

【００４７】本発明は更に、少なくとも糖タンパク質ｇ
ｐ８０を、ワクチン成分として許容される医薬ベヒクル
と共に含有する免疫原性組成物に係る。

【００４８】これらの組成物はＨＩＶ−２型レトロウイ
ルスに対するワクチンを製造するために使用され得る。

【００４９】このように調製された免疫原性組成物は、
体重１ｋｇあたり１０〜１００μｇの薬用量で投与され
るように定量されたタンパク質及び／または糖タンパク
質を含有する。

【００５０】本発明はまた、ｇｐ８０の製造方法を提供
する。この方法は以下の段階、即ち、 −ＨＩＶ−２ヒトレトロウイルスに感染した細胞を溶解
し上清と感染細胞とを分離するか、または調製されたウ
イルス集塊を遠心によって溶解し、 −細胞抽出物及び／またはウイルス抽出物を、例えばヒ
トレトロウイルスＨＩＶ−２感染患者の血清即ちＨＩＶ
−２のエンベロープ糖タンパク質と強力に反応する能力
を有する血清から得られた精製抗体を好ましくは適当な
担体に固定させて含む免疫吸着剤を収容したイムノアフ
ァニティカラムで、バッファの存在下に抗原−抗体免疫
複合体が形成される十分な時間インキュベートし、 −カラムをバッファで洗浄して担体に保持されなかった
分子を除去し、 −所望の抗原性タンパク質を回収する段階を含む。

【００５１】第１の実施態様によれば、糖タンパク質を
回収するために、タンパク質を電気泳動及び電気溶出に
よって処理する。

【００５２】感染細胞は、ＨＩＶ−２感染細胞培養物か
ら、特にＨＩＶ−２に感染したＴ４リンパ球の培養物か
らｉｎ ｖｉｔｒｏで得られた。このような細胞培養に
はＣＥＭ細胞系を用いる。

【００５３】別の実施態様によれば、糖タンパク質は以
下の手順、即ち、 −イムノアフィニティカラムに固定されたタンパク質を
溶出させ、 −分離担体に固定されたｇｐ８０認識モノクローナル抗
体を含むカラムクロマトグラフィーで溶出産物を精製す
る手順によって回収する。

【００５４】本発明方法の１つの実施態様によれば、感
染細胞を界面活性剤溶液中で溶解させ、免疫吸着剤に含
まれた抗体をアガロースビーズに固定し、バッファ（ｔ
ａｍｐｏｎ ｄ′ａｃｃｒｏｃｈａｇｅ）の存在下に処
理する。

【００５５】本発明はまた、ヒトレトロウイルスＨＩＶ
−２に感染した疑いのある患者の血清またはその他の生
物サンプル中で抗体を検出するためのキットを提供す
る。本発明のキットの特徴は、 −少なくとも１つの抗原性糖タンパク質ｇｐ８０または
タンパク質組成物、または、上記の種々の成分の混合物
と、 −被検生物サンプル中に場合によっては存在する抗体と
抗原との間の免疫複合体の形成反応を生じさせる手段、
特に必要に応じて１種または複数のインキュベーション
バッファと、 −陰性対照サンプルと、 −形成された抗原−抗体複合体の顕示（ｒｅｖｅｌａｔ
ｉｏｎ）手段とを含む。

【００５６】本発明はまた、好ましくは、放射性標識、
酵素標識、蛍光標識、化学発光標識または発色団によっ
て標識された糖タンパク質ｇｐ８０及びｇｐ６５に係
る。

【００５７】本発明はまた、ＨＩＶ−２ウイルス感染細
胞の検出方法を提供する。この方法は、ＨＩＶ−２感染
の疑いがある細胞を含む生物サンプルを細胞内タンパク
質が露出するように処理し、露出したタンパク質中のＨ
ＩＶ−２の糖タンパクｇｐ８０の存在を検出する。露出
した細胞内タンパクの試験には、例えば電気泳動を用い
るか、または、ＨＩＶ−２のｇｐ８０と免疫的に反応性
の抗体を用いて免疫検定する。かかる抗体の例は前述し
た。

【００５８】１つの実施態様では、抗原ｇｐ８０の存在
を診断するための生物サンプルとして細胞破片を除去し
たサンプルを用いる。

【００５９】本発明はまた、ＨＩＶ−２抗原を含むと予
想される細胞からＨＩＶ−２の特異感染を検出しＨＩＶ
−１の感染と識別する手段を提供する。この方法では、
試験すべき生物サンプルの処理細胞から得られた細胞内
タンパク質を含む生物サンプルとｇｐ８０に対する抗体
とを接触させる。次いで、ＨＩＶ−２感染の存在を検出
するために抗原−抗体型反応の有無を試験する。

【００６０】本発明の別の特徴及び利点を実施例及び図
面に基づいて説明する。

【００６１】図面の簡単な説明 図１ ：ＨＩＶ−１に陽性の１つの血清とＨＩＶ−２に陽
性の３つの血清（Ａ，Ｂ，Ｃ）とを使用しウェスターン
法で分析したＨＩＶ−２感染細胞中の８０ｋＤａの特異
タンパク質の同定。非感染ＣＥＭ細胞（２列目）、ＨＩ
Ｖ−１感染ＣＥＭ細胞（１列目）及びＨＩＶ−２感染Ｃ
ＥＭ細胞（３列目）の（１０^４細胞の産物に対応する）
細胞抽出物をウェスターン法テストの前に７．５％ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動で分析した。オートラジオ
グラムを示す。左側の矢印は、ＨＩＶ−１の細胞外糖タ
ンパク質（ｇｐ１２０）及びｇａｇ前駆物質ｐ５５及び
ｐ４０の位置を示す。図の右側にＨＩＶ−２の特異タン
パク質ｇｐ３００、ｇｐ１４０及びｇｐ８０の位置を示
す。

【００６２】図２：ＨＩＶ−２に関連した糖タンパク質
の合成。ＨＩＶ−２感染細胞を［^３Ｈ］グルコサミン
（２００μＣｉ／ｍｌ；４×１０^６細胞／ｍｌ）で２、
３、４、６及び８時間標識した。種々の時点で抽出物
（１０^７細胞の産物）を感染細胞及び（１００，０００
ｇで培地を遠心して調製した）ウイルス集塊から調製し
た。（２×１０^６細胞に対応する）これらの抽出物のア
リコートをＨＩＶ−２血清−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅで精製
し、標識タンパク質を、（１２．５％）のポリアクリル
アミドゲル電気泳動で分析した。フルオログラムを示
す。左側に種々の分子量のタンパク質マーカー、即ち、
ミオシン：２００，０００、ホスフォリラーゼＢ：９
７，０００、ウシ血清アルブミン：６８，０００、オボ
アルブミン：４３，０００及び炭酸脱水酵素：３０，０
００の位置を示す。

【００６３】図３：ポリクローナル抗体によるｇｐ３０
０のウェスターン法分析。左側に非感染ＣＥＭ細胞
（−）及びＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２感染ＣＥＭ細胞
の抽出物を示す。右側にＨＩＶ−２感染ＣＥＭ細胞の抽
出物、即ち細胞抽出物（Ｃ列）及びウイルス集塊（Ｖ
列）を示す。マウスのポリクローナル抗体（抗ｇｐ３０
０）を用いて精製タンパク質ｇｐ３００をウェスターン
法で分析する前に、ポリアクリルアミドゲル電気泳動
（左側では７．５％のゲル、右側では１２．５％のゲ
ル）でサンプルを分析した。オートラジオグラムを示
す。各サンプルは１０^６細胞の産物に対応する。

【００６４】図４：モノクローナル抗体ｍＡｂ １Ｈ８
を用いたウェスターン法分析。抗体ｍＡｂ １Ｈ８を用
いてウェスターン法でテストする前に、ＨＩＶ−１また
はＨＩＶ−２感染細胞の抽出物（Ｃ列）及びウイルス集
塊の抽出物（Ｖ列）を１２．５％ポリクローナル電気泳
動で分析した。オートラジオグラムを示す。モノクロー
ナル抗体はＨＩＶ−２ ＲＯＤのトランスメンブランエ
ンベロープ糖タンパク質に対する抗体である。

【００６５】図５：抗体ｍＡｂ １Ｈ８とｇｐ８０との
間の結合を遮断するペプチドｐ３９′。抗体１Ｈ８（セ
クションｍＡｂ）または抗ｇｐ３００ポリクローナル抗
体（セクションＳ）を用いたウェスターン法によってＨ
ＩＶ−２のウイルス集塊の抽出物を分析した。１μｇ／
ｍｌのペプチドｐ３９′の非存在（−列）または存在
（＋列）下に各抗体と共にインキュベートした。オート
ラジオグラフィーの結果を示す。

【００６６】図６：ＨＩＶ−２感染細胞中のｇｐ８０の
産生を示すパルスチェイス実験（ラベルによる標識、ラ
ベルの追跡）。ＨＩＶ−２感染ＣＥＭ細胞を［^３５Ｓ］
メチオニン（２００μＣｉ／ｍｌ；４×１０^６細胞／ｍ
ｌ）で３０分間標識した（０列）。５ｍＭの低温メチオ
ニンを含む培地で放射性標識を２〜４時間追跡した（２
列及び４列）。４時間後に培地を１００，０００ｇで遠
心し、集塊を抽出した。抗ｇｐ３００抗体または抗体ｍ
Ａｂ １Ｈ８を使用して全部のサンプルを免疫沈降させ
た。免疫複合体の調製物から標識タンパク質を電気泳動
バッファに溶出させ７．５％ポリアクリルアミドゲル電
気泳動で分析した。フルオログラムを示す。フルオログ
ラムのＣ及びＶは夫々、細胞抽出物及びウイルス抽出物
に対応する。各サンプルは１０^６細胞の産物を示す。

【００６７】図７：（ａ）ｇｐ８０による標識グルコサ
ミン及びフコースの取込み。［^３Ｈ］グルコサミン（２
００μＣｉ／ｍｌ）または［^３Ｈ］フコース（２００μ
Ｃｉ／ｍｌ）で標識したＨＩＶ−２感染ＣＥＭ細胞を、
抗ｇｐ３００ポリクローナル抗体（Ｓ列）またはモノク
ローナル抗体ｍＡｂ １Ｈ８（Ｍ列）を用いた免疫沈降
によって試験した。全部のサンプルを１２．５％ポリア
クリルアミドゲル電気泳動によって分析した。フルオロ
グラムを示す。（ｂ）ｇｐ１２５及びｇｐ８０の産生に
対するキャスタノスペルミンの効果。キャスタノスペル
ミン（１ｍＭ）の非存在下（−列）または存在下（＋
列）にＨＩＶ−２感染細胞を［^３５Ｓ］メチオニン（２
００μＣｉ／ｍｌ；４×１０^６細胞／ｍｌ）で（１６時
間）標識した。ＨＩＶ−２血清−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを
用いたイムノアフィニティカラムでウイルス粒子を含む
培地の抽出物を精製し、精製したタンパク質を１２．５
％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって試験した。
対応するフルオログラムを示す。

【００６８】図８：ｇｐ８０の解離。セクションＣ：［
^３５Ｓ］メチオニンで標識したＨＩＶ−２感染ＣＥＭ細
胞抽出物をモノクローナル抗体ｍＡｂ １Ｈ８を用いた
免疫沈降によって試験した（列１）。この調製細胞抽出
物の別のアリコートをまず１％ＳＤＳの存在下に（９５
℃で５分間）加熱した。次いで、免疫沈降試験の前にＲ
ＩＰＡバッファで１０倍に希釈した（列２）。免疫複合
体の調製物を電気泳動によって分析した。各サンプル
は、１０^６細胞の抽出物に対応する。セクションＶ：［
^３５Ｓ］メチオニンで標識した細胞から得られたＨＩＶ
ウイルスの集塊（各々が１０^７細胞の産物に対応する）
を種々のバッファ、即ち、（１）Ｔｒｉｔｏｎ（１０ｍ
ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．６、１５０ｍＭのＮａ
Ｃｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏ
ｎ Ｘ−１００及び１００単位／ｍｌのアプロチニン）
を含む溶解バッファ；（２）（バッファ（１）のＴｒｉ
ｔｏｎ Ｘ−１００の代わりに１％（ｖ／ｖ）のＳＤＳ
を含み次いでバッファ（１）同様に加熱した）ＳＤＳを
含む溶解バッファ；（３）ＳＤＳを含み次いで９５℃で
５分間加熱した溶解バッファ；（４）バッファ（１）に
０１％（ｖ／ｖ）のＳＤＳと０．２％（ｖ／ｖ）のデオ
キシコレートとを加えて改質した）ＲＩＰＡバッファに
懸濁させた。次いで抗体ｍＡｂ １Ｈ８を用いてこれら
のサンプル全部を免疫沈降させ、１２．５％ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動によって標識タンパク質を分析し
た。フルオログラムを示す。

【００６９】図９：精製ｇｐ８０のｇｐ３６への解離。
ＨＩＶ−２感染ＣＥＭ細胞を［^３５Ｓ］メチオニンで
（１７時間）標識し、Ｔｒｉｔｏｎを含む溶解バッファ
にウイルス集塊を懸濁させた。これらのウイルス抽出物
（２×１０^７細胞に対応する産物）を抗体ｍＡＢ １Ｈ
８を用いて免疫沈降させ、分離用ゲル電気泳動によって
ｇｐ８０を精製した。精製したｇｐ８０調製物の等量ず
つのアリコートを凍結乾燥し、１％（ｖ／ｖ）のＳＤＳ
と１００単位／ｍｌのアプロチニンと５ｍＭのＥＧＴＡ
（カルシウム依存性タンパク質分解を阻止する成分）と
を含むｐＨ６．８、５．８及び４．８の１００ｍＭの酢
酸塩に再懸濁させた。濃縮した電気泳動バッファで２倍
に希釈する前に全部のサンプルを３０℃で６０分間イン
キユベートした。（１２．５％）ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動によってサンプルを分析した。フルオログラ
ムを示す。

【００７０】図１０：二量体の形態で存在するＳＩＶの
トランスメンブラン糖タンパク質。セクションＣｅｌｌ
（細胞）：ＳＩＶ−ｍａｃに感染したＨＵＴ−７８細胞
及びＨＩＶ−２に感染したＣＥＭ細胞を［^３Ｈ］グルコ
サミン（２００μＣｉ／ｍｌ：４×１０^６細胞／ｍｌ）
で１５時間標識した。（Ｔｒｉｔｏｎを含む溶解バッフ
ァ中で調製した）感染細胞の抽出物（列Ｃ）及びウイル
ス集塊の抽出物（列Ｖ）をｍＡｂ １Ｈ８を用いた免疫
沈降によって精製し、標識タンパク質を１２．５％ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動によって分析した。フルオ
ログラムを示す。

【００７１】実施例 材料及び方法 材料 Ｌ−［^３５Ｓ］メチオニン（比活性＞１０００μＣｉ／
ｍｍｏｌ）、Ｌ−［６−^３Ｈ］フコース（比活性：４５
〜７０μＣｉ／ｍｍｏｌ）、Ｄ−［６−^３Ｈ］グルコサ
ミン（比活性：２０〜４０μＣｉ／ｍｍｏｌ）はＡｍｅ
ｒｓｈａｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、英国）の製品である。
キャスタノスペルミン及びツニカマイシンはＢｏｅｈｒ
ｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ（Ｍａｎｎｈｅｉｍ、西
独）の製品である。ポリ（Ａ）．ポリ（Ｕ）はパリのＩ
ｎｓｔｉｔｕｔ Ｃｕｒｉｅから入手し、Ｈｏｖａｎｅ
ｓｓｉａｎ他の方法（１９８２，Ｊｏｕｒｎａｌ Ｉｎ
ｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈｖｏｌ．２−ｐ．
２０９〜２１６）に従って調製した。

【００７２】ウイルス及び細胞 これらの実施例では、１型のヒト免疫不全ウイルスの単
離物ＨＩＶ−１ ＢＲＵ（１２）及び２型のヒト免疫不
全ウイルスの単離物ＨＩＶ−２ ＲＯＤ（４，５）、及
び、サルの免疫不全ウイルスＳＩＶ ｍａｃ１４２
（６）を使用した。

【００７３】１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清を含むＲ
ＰＭＩ−１６４０懸濁培地（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ、Ｃｅ
ｒｇｙ−Ｐｏｎｔｏｉｓｅ、フランス）で種々の細胞系
及びヒトリンパ球を培養し、ＨＩＶ感染細胞を培養する
ために２μｇ／ｍｌのポリブレン（Ｓｉｇｍａ）を添加
した。クローンＣＥＭ細胞１３はヒトリンパ球ＣＥＭ細
胞系（ＡＴＣＣ−ＣＣＬ１１９）に由来し、Ｔ４抗原を
高レベルで発現する。ＨＩＶ−１ ＢＲＵまたはＨＩＶ
−２ ＲＯＤの単離物で感染させた５日後に約８０〜９
０％の細胞がウイルス粒子を産生する。これは細胞の液
胞形成に対応する細胞障害作用及びシンシチウムによっ
て確認された。ＨＵＴ−７８細胞系は、ＳＩＶ ｍａｃ
１４２の複製（Ｄａｎｉｅｌ他，１９８５）を十分に許
容するＴ４レセプター（Ｇａｚｄａｌ他，１９８０）に
対して陽性の別のヒトリンパ球細胞系である。健康な供
血者の末梢血液のリンパ球を、１０％のウシ胎児血清を
補充したＲＰＭＩ−１６４０培地中で０．２％（ｗ／
ｖ）のフィトヘマグルチニン分画Ｐ（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅ
ｔｒｏｉｔ，米国）と共に３日間刺激した。１０％（ｖ
／ｖ）のＴ細胞増殖因子（ＴＣＧＦ，Ｂｉｏｔｅｓｔ）
を含むＲＰＭＩ−１６４０培地中で細胞を培養した。Ｈ
ＩＶ−２に感染させたリンパ球を、１０％（ｖ／ｖ）の
ＴＣＧＦ及び２μｇ／ｍｌのポリブレンの存在下に培養
した。

【００７４】細胞の代謝標識 タンパク質の代謝標識のためには、Ｌ−メチオニン及び
血清を除去し２００μＣｉ／ｍｌの［^３５Ｓ］メチオニ
ンを補充したＭＥＭ培地（Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎ
ｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ；最小必須培地）中で、感染細
胞を３７℃で１６時間インキュベートした。糖タンパク
質の代謝標識のためには、血清及びグルコースを除去し
２００μＣｉ／ｍｌの^３Ｈ−フコースまたは２００μＣ
ｉ／ｍｌの^３Ｈ−グルコサミンを補充したＭＥＭ培地で
感染細胞を３７℃で１６時間インキュベートした。

【００７５】細胞及びウイルスの抽出物 １０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．６と１５０ｍＭ
のＮａＣｌと１ｍＭのＥＤＴＡと０．２ｍＭのＰＭＳＦ
と１００単位／ｍｌのアプロチニン（Ｉｎｉｐｒｏｌ，
Ｃｈｏａｙ）とを含む１００μｌのバッファに１０^７細
胞に対応する細胞集塊を再懸濁させ、次いで２％（ｖ／
ｖ）のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む１００μｌの同
じバッファを添加した。

【００７６】細胞抽出物を１２，０００ｇで１０分間遠
心し、使用するまで上清を−８０℃で保管した。ウイル
ス抽出物を調製するためには、上記同様に処理した感染
ＣＥＭ細胞の透明上清１ｍｌあたり１００μｌの割合で
１０倍の溶解バッファ（１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ，ｐＨ７．６、１．５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤ
ＴＡ、１０％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、
１００単位／ｍｌのアプロチニン）を添加した。ウイル
ス集塊から抽出物を調製するためには、感染細胞の培地
をまず１２，０００ｇで１０分間遠心し、次いで１０
０，０００ｇで１５分間高速遠心した（Ｂｅｃｋｍａｎ
のＴＬ１００遠心機）。次にウイルス集塊（１０^７細胞
から得られた産物）を２００μｌの溶解バッファ中で可
溶化した。

【００７７】ＨＩＶ−２に血清陽性の患者から得られた
抗体を用いた免疫吸着剤の調製 ＨＩＶ−２に血清陽性の患者の血清の免疫グロブリン
を、２０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）に溶解
した５０％の（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４で沈降させ、次いで、
ＤＥＡＥセルロースカラム（ＤＥ５２、Ｗｈａｔｍａ
ｎ）で２０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）で溶
出させることによって精製した。このようにして精製さ
れた免疫グロブリンは純度９０％であると考えてよい。
次いでＢｅｒｇによって記載された方法（２）に従って
ＣＮＢｒで活性化したＳｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ ４Ｂ
カラムに抗体を結合させた。Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ
４Ｂ１ｍｌあたり２ｍｇのＩｇＧが結合した。以後の
記載ではこの免疫吸着剤を「ＨＩＶ−２血清−Ｓｅｐｈ
ａｒｏｓｅ」と呼ぶ。

【００７８】イムノアフィニティカラムにおけるＨＩＶ
−２のタンパク質の調製 まず、ＨＩＶ−２を産生するＣＥＭ細胞の細胞抽出物を
２倍容の結合バッファ（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，
ｐＨ７．６、５０ｍＭのＫＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣ
ｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、２０％（ｖ／ｖ）のグリセロー
ル、７ｍＭのβメルカプトエタノール、０．２ｍＭのＰ
ＭＳＦ、１００単位／ｍｌのアプロチニン）に希釈し、
等容のＨＩＶ−２血清−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅとインキュ
ベートした。細胞外ウイルスを１０倍に濃縮した１／１
０容の結合バッファでＨＩＶ−２産生細胞の上清と同様
に処理した。結合処理を１晩継続し、カラムを結合バッ
ファで十分に洗浄した。電気泳動バッファ（１２５ｍＭ
のＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８、１％（ｗ／ｖ）のＳ
ＤＳ、２Ｍの尿素、２０％のグリセロール、０．５％の
βメルカプトエタノール）中で沸騰処理することによっ
てカラムに結合したタンパク質を溶出させた。溶出した
タンパク質を、６Ｍの尿素と０．２％（ｗ／ｖ）でなく
０．１％（ｗ／ｖ）のビスアクリルアミドとを含む７．
５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって回
収した。

【００７９】分離用電気泳動 アフィニティカラムから溶出したＨＩＶ−２の糖タンパ
ク質（ｇｐ３００及びｇｐ８０）を前記同様にポリアク
リルアミドゲル電気泳動にかけて回収し、ウイルス糖タ
ンパク質を含むゲルの領域を所定分子量のタンパク質マ
ーカー（ＢＲＬ）の位置に基づいて切断した。

【００８０】糖タンパク質ｇｐ３００を、溶出バッファ
（０．１ＭのＮａＨＣＯ_３、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、
０．０５％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ、０．２ｍＭのＰＭＳ
Ｆ）中に４℃で１６時間インキュベーションすることに
よって溶出させた。このようにして得られた糖タンパク
質の分画を凍結乾燥し、使用するまで冷蔵庫に保存し
た。ｇｐ８０は４ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．
６、２ｍＭの酢酸ナトリウム及び２ｍＭのＥＤＴＡを含
むバッファ中で電気溶出（ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔｉｏ
ｎ）した。

【００８１】ｇｐ３００に対するマウスのポリクローナ
ル抗体の調製 ＨＩＶ−２血清−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いたイムノア
フィニティクロマトグラフィー及び分離用電気泳動（１
３）を順次行なうことによって感染ＣＥＭ細胞（３×１
０８細胞）の抽出物からＨＩＶ−２のエンベロープ糖タ
ンパク質ｇｐ３００を精製した。ｇｐ３００の精製調製
物を０．５Ｍの尿素と１ｍｇ／ｍｌのマウス血清タンパ
ク質とを含む１０ｍｌの１５０ｍＭのＮａＣｌに溶解
し、１５０ｍＭのＮａＣｌと０．５Ｍの尿素とを含む溶
液と接触させて２４時間透析した。次いで透析産物を遠
心し、２ｍｌのアリコートを−８０℃で保存した。（８
週齢）の５匹のマウスに３５０μｌのｇｐ３００調製物
（約１μｇのｇｐ３００含有）を腹腔内注射によって１
２日おきに５回投与した。各免疫中にポリ（Ａ）．ポリ
（Ｕ）アジュバント（２００μｇ；１５０ｍＭのＮａＣ
ｌ中に１ｍｇ／ｍｌ）を静注によって投与した（１
７）。最終注射の５日後にマウスに１０６サルコーマ１
８０／ＴＧ細胞の懸濁液を腹腔内に注射して超免疫腹水
を調製した（８）。注射の８日後にマウスを殺し、腹水
を収集した。腹水の細胞を遠心（２００ｇ、５分間）に
よって除去し、腹腔液を収集した。

【００８２】モノクローナル抗体ｍＡｂ １Ｈ８の調製 ＨＩＶ−２ビリオンをＣＥＭ細胞中で培養し、ショ糖濃
度勾配でバンドを形成させることよって濃縮培養上清か
ら精製した。精製ウイルスを、０．５％のＴｒｉｔｏｎ
−１００、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉ
ｓ，ｐＨ８．０、０．１％のアプロチニン（Ｓｉｇｍ
ａ）で可溶化し、超遠心によって清澄化した。次いでウ
イルス抽出物をＬｅｎ−ｔｉｌ−Ｌｅｃｔｉｎ Ｓｅｐ
ｈａｒｏｓｅ４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）アフィニティ
カラムに通し、カラムを洗浄し、付着した糖タンパク質
を０．５Ｍのメチル−α−Ｄ−マンノピラノシド（Ｓｉ
ｇｍａ）によって溶出させ、リン酸緩衝生理的塩類溶液
（ＰＢＳ）と接触させて１晩透析した。

【００８３】Ｌｅｎｔｉｌ−Ｌｅｃｔｉｎ Ｓｅｐｈａ
ｒｏｓｅ ４Ｂ（５０〜１００μｌ）に再付着した２〜
５μｇの精製糖タンパク質を含む０．３ｍｌの腹腔内注
射によってＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫した。４〜６週毎
に同じ免疫原をマウスに２４時間ブースター投与した。
これらのマウスを追跡し、その抗体産生を、［^３５Ｓ］
メチオニンで標識したＨＩＶ−２ビリオンの抽出物のＲ
ＩＰＡテストによって定性的に検出し、可溶化ビリオン
のＥＩＡテストによって定量的に検出した（Ｇｅｎｅｔ
ｉｃ Ｓｙｓｔｅｍ）。

【００８４】最終注射の３日後にＫｏｈｌｅｒ ＆ Ｍ
ｉｌｓｔｅｉｎの方法（１０）で脾臓細胞をミエローマ
ＮＳ１細胞と融合させた。Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｙｓｔｅ
ｍの可溶化ビリオンのＥＩＡテストを使用して抗ＨＩＶ
−２抗体を分泌するハイブリドーマの存在を検出するた
めに、９６ウェルの融合プレートをスクリーニングし
た。クローンハイブリドーマを増殖及び安定させる方法
と腹水の産生方法は既に記載されている（７）。次い
で、ハイブリドーマの培養上清をＲＩＰＡ分析及びウェ
スターン法によってスクリーニングした。糖タンパク質
と反応するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）１Ｈ８の特性
は、合成ペプチドに基づくＥＩＡテスト（１６）におい
て、対応するＨＩＶ−２のトランスメンブラン糖タンパ
ク質のアミノ酸配列５７９〜６０４によって決定され
る。アミノ酸配列５７９〜６０４は、配列決定済みのす
べてのＨＩＶ−２及びＳＩＶの単離物中に十分に維持さ
れており、モノクローナル抗体１Ｈ８は、試験されたこ
のようなＨＩＶ−２及びＳＩＶ単離物のすべてと交差反
応を生じた。使用した合成ペプチドｐ３９′は、ＨＩＶ
−２ ＲＯＤのエンベロープのヌクレオチド配列の推定
アミノ酸配列５７９〜６０４に従って合成されたもので
ある。合成ペプチドｐ３９′のアミノ酸配列は以下の通
りである。 ＶＴＡＩＥＫＹＬＱＤＱＡＲＬＮＳＷＧＣＡＦＲＱＶＣ
Ｈ

【００８５】放射性免疫沈降検定（ＲＩＰＡ） （２０μｌの）細胞またはウイルスの抽出物（１０^６の
感染細胞に対応する産物）をまず倍容のＲＩＰＡバッフ
ァ（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．６、１５０
ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＴｒｉｔｏ
ｎ Ｘ−１００（ｖ／ｖ）、０．２％（ｗｔ／ｖ）のナ
トリウムデオキシコレート、０．１％（ｗｔ／ｖ）のＳ
ＤＳ、７ｍＭの２β−メルカプトエタノール、０．２ｍ
ＭのＰＭＳＦ、１００μ／ｍｌのアプロチニン（Ｉｎｉ
ｐｒｏｌ，Ｃｈｏａｙ）及び２０％（ｖ／ｖ）のグリセ
ロール）に希釈した。次に希釈抽出物を、（２５μｌ
の）ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体と共
に（４℃で４５分間）インキュベートした。次いでプロ
テインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを添加し、サンプルを４
℃で３時間インキュベートした。次にこれらのサンプル
をＲＩＰＡバッファで洗浄した。免疫沈降によって回収
したタンパク質を、電気泳動バッファ（１２５ｍＭのＴ
ｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８、１％（ｗｔ／ｖ）のＳＤ
Ｓ、２０％（ｖ／ｖ）のグリセロール、０．５％のβ−
メルカプトエタノール）中で（９５℃で５分間）加熱し
て溶出させた。溶出したタンパク質を０．２％（ｗｔ／
ｖ）でなく０．１％（ｗｔ／ｖ）のビス−アクリルアミ
ドを含む７．５％または１２．５％のＳＤＳポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動で回収した。

【００８６】電気泳動後のイムノブロット分析：ウェス
ターン法 タンパク質をポリアクリルアミドゲル電気泳動によって
分析し、次いで（３）に記載のごとき電極バッファ（２
０ｍＭのＴｒｉｓ塩基、１５０ｍＭのグリシン、２０％
（ｖ／ｖ）のメタノール）中で０．４５μｍのニトロセ
ルロースシート（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕ
ｌｌ，Ｄａｓｓｅｌ，西独）に電気泳動転移させた。電
気泳動斑を、ＰＢＳに乳濁させた５％（ｗ／ｖ）の粉末
ミルクで飽和した。次いで１０％のＦＣＳを含むＰＢＳ
中のＨＩＶ−１陽性血清もしくはＨＩＶ−２陽性血清
（希釈度１：１００）またはマウスのポリクローナル抗
体もしくはモノクローナル抗体（希釈度１：２００）と
共に密封バッグ中で（４℃で１晩）インキュベートし
た。次いで、シートをＰＢＳ、５％のＮｏｎｉｄｅｔＰ
−４０を含むＰＢＳで洗浄し、（５％の）乳濁ミルクを
含むＰＢＳで再度飽和させた。洗浄したシートを、ＨＩ
Ｖ−１血清またはＨＩＶ−２血清中のヒトポリクローナ
ル抗体を顕示させるＩ１２５で標識したプロテインＡ製
剤（Ａｍｅｒｓｈａｍ，＞３０ｍＣｉ／ｍｇ）、また
は、Ｉ１２５で標識した抗マウスヤギ免疫グロブリン製
剤（Ａｍｅｒｃｈａｍ；２〜１０μＣｉ／μｇ）と共に
密封バッグにいれて（室温で２時間）インキュベートし
た。シートをバッグから取り出して再度洗浄し、乾燥し
て２４〜４８時間オートラジオグラフ（Ｋｏｄａｋ Ｒ
ＰＲｏｙａｌ，Ｘ−Ｒａｙ Ｆｉｌｍｓ）にかけた。

【００８７】結果 ＨＩＶ−２感染細胞及びビリオンにおける８０ｋＤａの
糖タンパク質の検出 ＨＩＶ−２の糖タンパク質の前駆物質は１４０ｋＤａの
タンパク質（ｇｐ１４０）であり、これは、成熟産物、
即ち細胞外糖タンパク質（ｇｐ１２５）及びトランスメ
ンブラン糖タンパク質（ｇｐ３６）に変態するときに相
同な二量体を形成する必要があることは既に判明してい
た（１３）。本発明では更に、トランスメンブラン糖タ
ンパク質がポリアクリルアミドゲル上の８０ｋＤａのタ
ンパク質に対応する位置に電気泳動移動度を有するホモ
二量体（ｈｏｍｏｄｉｍｅｒｅ）の形態で存在すること
を証明した（図１から図６）。このタンパク質はグリコ
シル化されており、便宜上これをｇｐ８０と呼ぶ。

【００８８】ＨＩＶ−１ ＢＲＵまたはＨＩＶ−２ Ｒ
ＯＤに感染したＣＥＭ細胞または非感染のＣＥＭ細胞の
粗抽出物を、ＡＩＤＳ罹患患者から採取した１つのＨＩ
Ｖ−１陽性血清サンプル及び３つのＨＩＶ−２陽性血清
サンプルを用い、電気泳動転移後にイムノブロットテス
ト（ウェスターン法）で分析した（図１）。ＨＩＶ−２
特異血清はエンベロープ前駆物質（ｇｐ１４０及びｇｐ
３００）を認識し、更に、８０ｋＤａの糖タンパク質
（ｇｐ８０）を強力に認識した。これらの血清は、ＨＩ
Ｖ−１特異血清によって検出可能なＨＩＶ−１タンパク
質、即ちＨＩＶ−１のエンベロープ糖タンパク質の前駆
物質ｇｐ１２０及びｇａｇタンパク質の前駆物質（ＨＩ
Ｖ−１ではｐ５５及びｐ４０）を認識しないので、ＨＩ
Ｖ−２のタンパク質特異的であった。ＨＩＶ−２の感染
とｇｐ８０との関連性は、ＨＩＶ−１血清によってｇｐ
８０が認識されないという結果、ＨＩＶ−１感染細胞中
でも認識されないという結果がいくつも得られたことに
よって証明される。

【００８９】感染培地の遠心（１００，０００ｇで３０
分間）によって調製されたウイルス集塊をウェスターン
法で分析すると、ｇｐ８０がまた、ＨＩＶ−２粒子中で
細胞外糖タンパク質ｇｐ１２５と同時に検出され得るこ
とが判明した。

【００９０】ＨＩＶ−２感染細胞中のｇｐ８０の合成 予備実験は、すべてのＨＩＶ−２陽性血清が、ｇｐ８０
並びにエンベロープのｇａｇ前駆物質ｇｐ１４０及びｇ
ｐ３００、並びに細胞外糖タンパク質ｇｐ１２５を免疫
沈降させ得ることを証明した。特性決定によってｇｐ８
０の合成を確認するために、エンベロープタンパク質と
強力に反応するＨＩＶ−２陽性血清を使用した。この血
清から精製した抗体を、エンベロープ糖タンパク質精製
用のイムノアフィニティカラムとして使用されるＣＮＢ
ｒによって活性化したＳｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ＨＩ
Ｖ−２血清−Ｓｅ−ｐｈａｒｏｓｅ）に結合させた。Ｈ
ＩＶ−２感染細胞を［^３Ｈ］グルコサミンで標識し、種
々の時点（２、３、４、６及び８時間後）に感染細胞抽
出物及びウイルス集塊抽出物を調製した。全部のサンプ
ルをＨＩＶ−２血清−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅで精製し、標
識タンパク質をポリアクリルアミドゲル電気泳動によっ
て分析した（図２）。２時間後に、感染細胞中の検出可
能な標識タンパク質はｇｐ１４０及びｇｐ３００だけで
あった。ｇｐ１２５及びｇｐ８０は標識開始の３または
４時間後に検出可能になり、また、培地から調製された
ウイルス集塊中でも検出可能になった。標識開始の６か
ら８時間後にはｇｐ１２５及びｇｐ８０がはっきりと検
出された。これらの結果は、ｇｐ８０がウイルス粒子と
関連性を有すること、及びｇｐ８０が未成熟な前駆物質
の成熟産物であることを示唆する。

【００９１】これらの実験においては［^３Ｈ］グルコサ
ミンで標識されたｇｐ３６も検出されたが、細胞内タン
パク質として検出されたものではない。図２では２００
ｋＤａのタンパク質も出現しているが、これは、別のＨ
ＩＶ−２陽性血清によって免疫沈降しなかったので、細
胞性タンパク質であろうと考えられる。

【００９２】ＨＩＶ−２のエンベロープ糖タンパク質の
合成に関する反応理論の結果は、既存の結果と一致す
る。ＨＩＶ−２感染細胞中で、ｇｐ１４０は標識（パル
スラベリング）の１５分後に検出可能な最初のエンベロ
ープ産物である。トレーサー追跡（チェース）期間中、
二量体形のエンベロープ前駆物質（ｇｐ３００）は３０
分後に検出されたが、成熟細胞外糖タンパク質（ｇｐ１
２５）は１．５〜３時間後にようやく検出可能になった
（１３）。

【００９３】ＨＩＶ−２のエンベロープ前駆物質に対す
るポリクローナル抗体によるｇｐ８０の認識 ＨＩＶ−２のエンベロープ糖タンパク質の特性決定のた
めに、精製した二量体前駆物質ｇｐ３００に対するポリ
クローナル抗体を調製した。このためにｇｐ３００をま
ず、ＨＩＶ−２血清陽性患者の抗体と共に免疫吸着剤に
よって部分的に精製し、次いで分離用電気泳動によって
精製した。５μｇのこの精製ｇｐ３００調製物を５匹の
マウスに１０日おきに５回腹腔内投与することによって
マウスを免疫した。（２００μｇの）ポリ（Ａ）．ポリ
（Ｕ）をアジュバントとして使用し、抗原と混合して投
与した（材料及び方法の項参照）。全部のマウスでｇｐ
３００に対する抗体が発生した。これらの抗体はｇｐ３
００に対するポリクローナル抗体（抗ｇｐ３００抗体）
である。図３は、１匹の免疫マウスの抗体を使用したウ
ェスターン法による分析結果を示す。抗ｇｐ３００抗体
はｇｐ３００と特異反応したが、ＨＩＶ−２感染細胞中
に存在するｇｐ１４０、ｇｐ１２５及びｇｐ８０とも反
応した。ＨＩＶ−１に感染したＣＥＭ細胞または非感染
のＣＥＭ細胞中で特異信号は全く観察されなかった。６
０ｋＤａのタンパク質が抗ｇｐ３００抗体によって標識
されることもしばしば観察されたが、これは、ウイルス
感染に無関係な細胞抽出物（図３；細胞セクション「Ｃ
ＥＬＬ」）中でも観察されいくつかの実験では全く観察
されなかったので恐らく非特異的である。これらのポリ
クローナル抗体はまた、ＨＩＶ−２感染細胞の抽出物及
びウイルス集塊を使用する同様のウェスターン法テスト
でも使用された。抗体は細胞抽出物中のｇｐ３００、ｇ
ｐ１４０及びｇｐ８０（図３、セクションＨＩＶ−２、
列３）を認識した。抗体はまた、ウイルス抽出物中のｇ
ｐ１２５、ｇｐ８０及びトランスメンブラン糖タンパク
質であろうと推定される３６ｋＤａのタンパク質を認識
した（図３、セクションＨＩＶ−２、列Ｖ）。長時間の
接触（ｅｘｐｏｓｉｔｉｏｎ）によって、細胞抽出物中
のｇｐ３６の位置に対応する信号を検出することが可能
であった。また、ウイルス集塊中のｇｐ８０及びｇｐ３
６のレベルが細胞抽出物中でのレベルに比較してはるか
に高かったことにも注目する必要がある。

【００９４】これらの結果は、エンベロープ糖タンパク
質の前駆物質に対するポリクローナル抗体が、ｇｐ８０
を認識し、また同時にＨＩＶ−２のエンベロープのすべ
ての成分を認識することを示しており、従ってｇｐ８０
はＨＩＶ−２のエンベロープ糖タンパク質と関係がある
と考えられる。糖タンパク質ｇｐ８０はウイルスと関連
があり、成熟産物であろうと推定される。

【００９５】モノクローナル抗体１Ｈ８によるＨＩＶ−
２のトランスメンブラン糖タンパク質ｇｐ８０の特異的
認識 どのウイルス糖タンパク質を認識できるかを決定するた
めに、モノクローナル抗体ｍＡｂ １Ｈ８を使用したウ
ェスターン法テストを行なった。ＨＩＶ−２感染細胞中
で、ｍＡｂ １Ｈ８はｇｐ３００、ｇｐ１４０及びｇｐ
８０を認識したが、ＨＩＶ−２粒子中では主としてｇｐ
８０を認識し、ｇｐ３６及びｇｐ３００もわずかに認識
した（図４）。ウイルス集塊中に少量のｇｐ３００が存
在する理由は恐らく、ｇｐ３００が細胞性タンパク質な
ので溶解した細胞から混入するためであろう（１３）。
ｇｐ３６に関する信号が弱い理由は恐らく、このタンパ
ク質のレベルが低いためであろう。ｍＡｂ １Ｈ８は細
胞外糖タンパク質ｇｐ１２５を認識しなかった（図
４）。また、ＨＩＶ−１感染細胞の抽出物またはウイル
ス集塊のいかなるタンパク質も認識しなかった。これら
の結果は、ＨＩＶ−２のエンベロープ前駆物質（ｇｐ１
４０及びｇｐ３００）及びトランスメンブラン糖タンパ
ク質（ｇｐ３６）に対して抗体ｍＡｂ １Ｈ８が特異性
を有することを示す。ｍＡｂ １Ｈ８の反応性がＨＩＶ
−２のトランスメンブラン糖タンパク質のアミノ酸配列
５７９〜６０４に存在することを合成ペプチドｐ３９′
を用いて試験した。

【００９６】ｍＡｂ １Ｈ８とｇｐ８０との反応特異性
を証明するために、ＨＩＶ−２のウイルス集塊抽出物を
使用してウェスターン法テストを行なった。タンパク質
の転移後、ニトロセルロースシートをｍＡｂ １Ｈ８抗
体またはｇｐ３００に対するポリクローナル抗体と共
に、ペプチド３９′の存在または非存在下にインキュベ
ートした（図５）。ｍＡｂ １Ｈ８はｇｐ８０と共に強
い信号を与えた。更に、ｇｐ３６に対する信号が観察さ
れたが、この信号は長時間露光後のオートラジオグラム
にのみ観察された。抗ｇｐ３００抗体はｇｐ１２５、ｇ
ｐ０及びｇｐ３６と反応した。６０ｋＤａのタンパク質
によって得られた信号は（図３に示すごとく）特異的で
ない。ペプチドｐ３９′を添加するとｍＡｂ １Ｈ８で
得られる信号は完全に消滅したが、抗ｇｐ３００抗体で
得られる信号は消滅しなかった（図５）。これらの観察
から、ｍＡｂ １Ｈ８の反応性がＨＩＶ−２のトランス
メンブラン糖タンパク質の配列５７９〜６０４に対応す
る２６個のアミノ酸残基に特異的であることが確認され
た。即ち、ペプチドｐ３９′の配列に対応する配列がｇ
ｐ８０に存在すると推定される。抗ｇｐ３００抗体の反
応性はペプチドｐ３９′によって変性しなかった。その
理由は、これらのポリクローナル抗体がペプチドｐ３
９′に対応するエピトープ以外のエピトープと相互作用
するからであろう。

【００９７】抗ｇｐ３００ポリクローナル抗体及びｍＡ
ｂ １Ｈ８によるｇｐ８０の免疫沈降 ポリクローナル抗体はｇｐ３００、ｇｐ１４０、ｇｐ１
２５及びｇｐ８０を免疫沈降させ、ｍＡｂ １Ｈ８はｇ
ｐ３００、ｇｐ１４０及びｇｐ８０を免疫沈降させた
（図６）。２つの細胞性タンパク質（６０及び４５ｋＤ
ａ）も、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の
双方を含む免疫複合体調製物と会合していた（図６、０
時間及び２時間の列）。タンパク質６０及び４５ｋＤａ
は、プロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに付着すること
によって免疫複合体調製物中に存在していた。プロテイ
ンＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅは、種々の抗体と共に形成さ
れる免疫複合体を回収するために使用されたものであ
る。

【００９８】ＨＩＶ−２感染細胞を「パルス法」で３０
分間標識しマーカーを２及び４時間追跡（チェイス）し
た。標識細胞の抽出物（０、２及び４時間）及びウイル
ス集塊を４時間追跡（チェイス）後に回収し、ｇｐ３０
０に対するポリクローナル抗体及び抗体ｍＡｂ １Ｈ８
を用いた免疫沈降アッセイで分析した（図６）。標識
（パルス）中はｇｐ８０はポリクローナル抗体及びモノ
クローナル抗体によって検出されなかった。２時間追跡
（チェイス）後に感染細胞中でｇｐ８０がはっきりと検
出された。４時間追跡（チェイス）後に感染性細胞中で
［^３５Ｓ］メチオニン標識したｇｐ８０が検出できなく
なる。４時間後の産生ウイルス集塊を分析すると、細胞
外糖タンパク質ｇｐ１２５と同様にｇｐ８０がウイルス
粒子に会合していることが判明した（図６）。ｇｐ８０
はＨＩＶ−２のエンベロープの成熟産物であると考える
ことができる。ｇｐ８０がＨＩＶ−２のトランスメンブ
ラン糖タンパク質の特異モノクローナル抗体によって認
識されたことは、このタンパク質がｇｐ３６の二量体形
に対応することを示唆する（図８及び図９に示した結果
で確認された）。ｇｐ８０は感染ＣＥＭ細胞だけから検
出されたのでなく、ＨＩＶ−２に感染したＴ４リンパ球
からも検出された。

【００９９】ウェスターン法による分析及び免疫沈降ア
ッセイによって得られた結果を比較すると、ＨＩＶ−２
に陽性のヒト血清、マウスポリクローナル抗体及び抗体
ｍＡｂ １Ｈ８が、ｇｐ８０及びｇｐ１２５の天然形よ
りも変性形を認識し易いことが判明する（図１、図２、
図３、図４及び図６）。これらの成熟糖タンパク質の天
然形は、種々の抗体によって認識されるエピトープを隠
蔽するようなコンホーメーションを有しているのであろ
うと推定される。

【０１００】ｇｐ８０によるグルコサミン及びフコース
の取込み ［^３Ｈ］グルコサミン及び［^３Ｈ］フコースで代謝的に
標識したＨＩＶ−２ウイルス感染細胞の抽出物を、抗体
ｍＡｂ １Ｈ８及び抗ｇｐ３００ポリクローナル抗体を
用いて免疫沈降させた。先の結果（図３〜６）と同様
に、抗ｇｐ３００抗体は、糖で標識された糖タンパク
質、即ちｇｐ３００、ｇｐ１４０、ｇｐ１２５及びｇｐ
８０を免疫沈降させ、ｍＡｂ １Ｈ８は、ｇｐ３００、
ｇｐ１４０及びｇｐ８０を免疫沈降させた。［^３Ｈ］グ
ルコサミンはこれらの全部のタンパク質によって取り込
まれていたが、［^３Ｈ］フコースは概してｇｐ１２５及
びｇｐ８０によって取り込まれていることが判明した
（図７Ａ）。これらの実験で、［ ^３Ｈ］フコースで標識
されたｇｐ３６は長時間露光後のオートラジオグラムに
も微弱にしか観察されなかった。ｇｐ８０はまた、ｇｐ
３００、ｇｐ１４０及びｇｐ１２５と同様に［^３Ｈ］マ
ンノースを取り込むことができる。ｇｐ８０及びその他
の糖タンパク質によるこのような標識糖の取込みは、抗
生物質であるツニカマイシン（１５）によって阻害され
る。ツニカマイシンは窒素に結合したタンパク質のグリ
コシル化を阻止する。

【０１０１】（Ｎ−アセチルグルコサミン、マンノース
及びグルコースを含む）アスパラギンに結合した糖タン
パク質のオリゴ糖は、天然タンパク質に結合した後によ
り顕著に成熟する（１１）。オリゴ糖鎖の末端が、フコ
ース残基及びシアル酸の転移前に小胞体及びゴルジ体に
結合する。その理由は、フコース残基の取込みがグリコ
シル化段階よりはるかに後で生じるからである。ＨＩＶ
−２感染細胞中では［ ^３Ｈ］フコースの大部分が、ＨＩ
Ｖ−２のエンベロープの前駆物質の成熟産物に対応する
（図６）２つのタンパク質ｇｐ１２５及びｇｐ８０に取
り込まれる（図７）。エンベロープの前駆物質の成熟中
にｇｐ１２０が産生されたことを確認するために、ＨＩ
Ｖ−２感染細胞をグルコシダーゼインヒビターであるキ
ャスタノスペルミン（１４）の存在下または非存在下に
［^３５Ｓ］メチオニンで標識した。次に、複数のウイル
スタンパク質を認識したＨＩＶ−２陽性患者の血清を用
い、培養上清を免疫沈降によって試験した。キャスタノ
スペルミンの存在下では、ｇｐ８０及びｇｐ１２５の産
生はかなり減少したが、ヌクレオキャプシドの主要（コ
ア）タンパク質（ｐ２６）は有意な影響を受けなかった
（図７ｂ）。

【０１０２】ｇｐ８０からｇｐ３６への解離 ｇｐ８０の解離に最適な条件を知るための実験を行なっ
た。これらの条件は、極めて生理的塩類溶液に近い培
地、酸性ｐＨ、イオン性界面活性剤ＥＤＴＡまたはＥＧ
ＴＡ、などに対応した。文献（１３）に記載された方法
を用い、弱酸性バッファ中でのインキュベーションによ
ってｇｐ３００の解離試験を行なった。この方法は、６
より小さいｐＨ値を有するバッファによるｇｐ８０の解
離には適しているが、糖タンパク質ｇｐ８０の大部分が
分解（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）した。どの実験におい
ても、非イオン性界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００
を含む溶菌バッファを使用して感染細胞抽出物またはウ
イルス集塊を調製した。これらの条件ではｇｐ３００及
びｇｐ８０は解離せず、イオン性界面活性剤ＳＤＳを添
加した後でも解離しなかった。ＳＤＳの効果、即ちＴｒ
ｉｔｏｎの代わりにＳＤＳを使用して抽出物を調製した
場合についても試験した。ＨＩＶ感染細胞を［ ^３５Ｓ］
メチオニンで標識し、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００
または１％のＳＤＳを含む溶菌バッファで可溶化するこ
とによって抽出物を調製した。次に、これらの抽出物
を、界面活性剤を含まない溶菌バッファで１０倍に希釈
し、ｍＡｂ１Ｈ８を用いて免疫沈降させた。Ｔｒｉｔｏ
ｎによる抽出物から得られた免疫複合体調製物は、［
^３５Ｓ］メチオニンで標識されたバンド、即ちｇｐ３０
０、ｇｐ１４０及びｇｐ８０に対応するバンドと、ｇｐ
３６に対応する弱いバンド（図８、セクションＣの列
１）との存在を示した。更に、抽出物をＳＤＳで調製し
たとき、ｇｐ３００及びｇｐ８０は実質的に検出不能で
あったが、ｇｐ１４０及びｇｐ３６のレベルは増加して
いた（図８、セクションＣ、列２）。従って、イオン性
界面活性剤の存在下では二量体形のｇｐ３００及びｇｐ
８０は解離して夫々ｇｐ１４０及びｇｐ３６になる。［
^３５Ｓ］メチオニンで標識した精製ｇｐ３００は解離に
よってｇｐ１４０だけを産生した（１３）。従ってｇｐ
３６はｇｐ８０の解離後にのみ存在する。標識されたタ
ンパク質ｇｐ３００及びｇｐ８０が解離タンパク質から
全く回収されなくなると、ＳＤＳの存在下ではタンパク
質の分解（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）が生じることが観
察された（図８、セクションＣ）。２００単位／ｍｌの
アプロチニン及び０．２ｍＭのＰＭＳＦの存在は、ＳＤ
Ｓとのインキュベーション中のかかる分解（ｄｅｇｒａ
ｄａｔｉｏｎ）を妨害しなかった。二量体形のタンパク
質がタンパク質分解に抵抗するコンホーメーションを有
するとも考えられる。ｇｐ３００及びｇｐ８０の解離は
タンパク分解部位をアクセス可能にするコンホーメーシ
ョン的修飾を生じる。

【０１０３】ＨＩＶ−２のウイルス集塊に対して同様の
解離実験を行なった。［^３５Ｓ］メチオニンで標識した
ウイルスタンパク質を１％のＴｒｉｔｏｎまたは１％の
ＳＤＳを含む溶菌バッファまたは０．１％のＳＤＳと１
％のデオキシコレートとを含むＲＩＰＡバッファで可溶
化した。１％のＳＤＳを含む溶菌バッファ中の抽出物を
更に９５℃に加熱した。次に、全部の抽出物をｍＡｂ
１Ｈｂによって免疫沈降させ、ポリアクリルアミドゲル
電気泳動によって分析した（図８、セクションＶ）。

【０１０４】Ｔｒｉｔｏｎによる抽出物から調製した免
疫複合体中では、抗体１Ｈ８によって免疫沈降する主要
タンパク質はｇｐ８０及びｇｐ３６であった。また、Ｓ
ＤＳによる抽出物中では、ｇｐ８０は検出不能になった
が、ｇｐ３６のレベルは顕著に増加した。ＳＤＳ抽出物
中では標識成分の大部分が消滅したので、極めて高度な
分解が生じたものと推定される。ＲＩＰＡバッファを用
いた結果は更に良好であり、ｇｐ８０の大部分が解離し
ラベルの約３０％がｇｐ３６に検出された（図８、セク
ションＶ）。ｇｐ８０がｇｐ３６のみから成ることを証
明するために、抗体ｍＡｂ １Ｈ８による免疫沈降と分
離用ゲル電気泳動とによって精製した［ ^３５Ｓ］メチオ
ニン標識ｇｐ８０の解離実験を行なった。凍結乾燥した
ｇｐ８０の調製物をｐＨ６．８、５．８及び４．８のＳ
ＤＳを含む酢酸塩バッファ中に直接懸濁させた。ｐＨ
４．８においては全部のｇｐ８０がｇｐ３６に転化した
（図９）。

【０１０５】ＳＩＶ−ｍａｃ中の二量体形トランスメン
ブラン糖タンパク質の特性決定 トランスメンブラン糖タンパク質がＳＩＶサンプル中で
二量体形で検出されるか否かを試験した。

【０１０６】ＳＩＶ及びＨＩＶ−２に感染した細胞を［
^３Ｈ］グルコサミンで標識し、Ｔｒｉｔｏｎを含む溶菌
バッファで抽出物を調製し、次いで抗体ｍＡｂ １Ｈ８
で免疫沈降させた。図７に示すように、モノクローナル
抗体はＨＩＶ−２感染細胞のｇｐ３００、ｇｐ１４０及
びｇｐ８０を沈降させ、ウイルス粒子中ではｇｐ８０だ
けが検出された（図１０）。ＳＩＶ感染細胞中ではモノ
クローナル抗体は３つのグリコシル化タンパク質、即ち
エンベロープ前駆物質ｇｐ１４０、二量体形前駆物質ｇ
ｐ３００及びＨＩＶ−２のｇｐ８０に恐らく対応する６
５ｋＤａのタンパク質（ｇｐ６５）を沈降させた。ｇｐ
８０と同様に、ｇｐ６５はＳＩＶのウイルス粒子と会合
していた（図１０）。

【０１０７】これらの実験において、ＨＩＶ−２ ＲＯ
Ｄ及びＳＩＶ−ｍａｃのトランスメンブラン糖タンパク
質の単量体形は検出できなかった。ＨＩＶ−２ ＲＯＤ
のアミノ酸配列５７９〜６０４はＳＩＶ−ｍａｃのアミ
ノ酸配列５９５〜６２０に対応する（１９，７）。これ
らの２つの配列は高度な相同性を有し、抗体ｍＡｂ１Ｈ
８はＨＩＶ−２ ＲＯＤ及びＳＩＶ−ｍａｃの双方のエ
ンベロープ糖タンパク質に交差反応する。

【０１０８】従って発明者は分子量約６５ｋＤａのタン
パク質がＳＩＶ−ｍａｃウイルスのｇｐ３２の二量体形
に対応することを証明した。

【０１０９】理論 二量体形タンパク質（ｇｐ３００及びｇｐ８０）の解離
は弱酸性ｐＨで生じ得る。従って、ｇｐ１４０の二量体
化はｐＨ依存性であり、前駆物質ｇｐ１４０の２分子の
融合に有利な小胞体のコンパートメントで生じると推定
される。

【０１１０】ＨＩＶ−２の二量体形エンベロープ前駆物
質ｇｐ３００の分子量を非変性条件下にポリアクリルア
ミドゲル電気泳動で算出した（１３）。０．２％（ｗｔ
／ｖ）の代わりに０．１％（ｗｔ／ｖ）のビスアクリル
アミドを含む５％のポリアクリルアミドゲル中でこの二
量体形前駆物質は２８０ｋＤａのタンパク質に対応する
位置に泳動した。天然条件下の二量体の分子量を確認す
るために、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００カラムを用
い且つＴｒｉｔｏｎを含む溶菌バッファで調製した［
^３５Ｓ］メチオニン標識ＨＩＶ−２感染細胞抽出物を用
いてゲル濾過実験を実施した。これらの実験条件でｇｐ
３００は集塊タンパク質のピークの後の第２のピークの
形態で溶出した。トランスメンブラン糖タンパク質の二
量体はｇｐ１２５のピークの後及びマーカーとして使用
したウシ血清アルブミン（６８ｋＤａ）のピークの前の
分子量７５〜８０ｋＤａを有する溶出タンパク質に対応
した。これらの観察は、二量体ｇｐ３００及びｇｐ８０
の分子量が天然形及び変性形で同等であることを示す。
これらの二量体形のｉｎ ｖｉｔｒｏ解離は、酸性ｐＨ
で生じ、またイオン性界面活性剤ＳＤＳの存在下でも生
じた。Ｔｒｉｔｏｎを含有する溶菌バッファによって抽
出物を調製すると、二量体形ｇｐ３００及びｇｐ８０は
ＳＤＳによって解離しなかった。従って非イオン性界面
活性剤Ｔｒｉｔｏｎはエンベロープｇｐ３００及びｇｐ
８０の天然形二量体を維持する。

【０１１１】二量体形のエンベロープ前駆物質ｇｐ３０
０及びトランスメンブラン糖タンパク質はまた、ＳＩＶ
感染細胞でも観察されたがＨＩＶ−１感染細胞では観察
されなかった。特に、ＨＩＶ−２の二量体形トランスメ
ンブラン糖タンパク質（ｇｐ８０）及びＳＩＶの二量体
形トランスメンブラン糖タンパク質（ｇｐ６５）は還元
剤の存在下に解離しない。従って、トランスメンブラン
エンベロープ糖タンパク質の二量体化はＨＩＶ−２及び
ＳＩＶのエンベロープ遺伝子に特異的な特性であると考
えられる。この特性は、新しいＨＩＶ単離物を特性決定
するときに、検出された単離物とＨＩＶ−１型またはＨ
ＩＶ−２型との関係を説明するための適当なマーカーと
して利用され得る。成熟エンベロープ糖タンパク質を産
生するべく前駆物質が成熟するためには、エンベロープ
前駆物質の二量体化が必須である。二量体形のトランス
メンブラン糖タンパク質は、最適なビリオン構造の形成
に必須であり、また細胞膜と融合する能力及び感染させ
る能力にも必須であるが、トランスメンブラン二量体の
ｉｎ ｖｉｔｒｏ解離は極度の分解を生じさせる。その
理由は、この糖タンパク質の二量体形がタンパク質分解
に抵抗し得るコンホーメーションを有するためであろ
う。

【０１１２】実施例で説明した本発明のいくつかの特徴
を、ＨＩＶ−２の糖タンパク質ｇｐ１２５及びｇｐ８０
を示す表及びそれらの産生段階を示す図にまとめる。

【０１１３】

【表１】

【０１１４】

【表２】

【図面の簡単な説明】

【図１】ＨＩＶ−１に陽性の１つの血清とＨＩＶ−２に
陽性の３つの血清（Ａ，Ｂ，Ｃ）とを使用しウェスター
ン法で分析したＨＩＶ−２感染細胞中の８０ｋＤａの特
異タンパク質の同定。

【図２】ＨＩＶ−２に関連した糖タンパク質の合成。

【図３】ポリクローナル抗体によるｇｐ３００のウェス
ターン法分析。

【図４】モノクローナル抗体ｍＡｂ １Ｈ８を用いたウ
ェスターン法分析。

【図５】抗体ｍＡｂ １Ｈ８とｇｐ８０との間の結合を
遮断するペプチドｐ３９′。

【図６】ＨＩＶ−２感染細胞中のｇｐ８０の産生を示す
パルスチェイス実験（ラベルによる標識、ラベルの追
跡）。

【図７】（ａ）ｇｐ８０による標識グルコサミン及びフ
コースの取込み。及び（ｂ）ｇｐ１２５及びｇｐ８０の
産生に対するキャスタノスペルミンの効果。

【図８】ｇｐ８０の解離。

【図９】精製ｇｐ８０のｇｐ３６への解離。

【図１０】二量体の形態で存在するＳＩＶのトランスメ
ンブラン糖タンパク質。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ａ６１Ｋ 39/21 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (72)発明者 アンヌ・ローラン フランス国、75007・パリ、アベニユ・エ ミル−デシヤネル・９ (72)発明者 ベルナー・クルユス フランス国、75012・パリ、リユ・ドウ・ マダガスカル・７ (72)発明者 ルユク・モンタニエ フランス国、92350・プレスイ−ロバンソ ン、リユ・ドウ・マラブリイ・21 Ｆターム(参考） 4B064 AG27 CA10 CA20 CC24 DA01 DA13 4B065 AA91X AA93Y AB05 BA02 CA25 CA45 CA46 4C085 AA03 AA13 AA14 BA65 CC08 CC32 DD06 DD33 DD43 EE01 GG01 4H045 AA11 AA30 CA02 DA75 DA76 EA31 EA53 FA72

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 −一方でＨＩＶ−２型レトロウイルスに
   感染した細胞中に存在するｇｐ３００、ｇｐ１４０、ｇ
   ｐ１２５及びｇｐ８０を特異的に認識し、他方でＨＩＶ
   −２型レトロウイルスの抽出物中に存在するｇｐ１２
   ５、ｇｐ８０及びｇｐ３６を特異的に認識し、 −健常細胞またはＨＩＶ−１型レトロウイルスに感染し
   た細胞中に存在するタンパク質または糖タンパク質を認
   識しないことを特徴とするポリクローナル抗体。
2. 【請求項２】 糖タンパク質ｇｐ８０と特異的に反応
   し、ＨＩＶ−１型レトロウイルスに感染した細胞のタン
   パク質及び糖タンパク質またはＨＩＶ−１のウイルス集
   塊とは反応しないことを特徴とするモノクローナル抗
   体。
3. 【請求項３】 更に、ＨＩＶ−２の糖タンパク質ｇｐ３
   ００ｇｐ、ｇｐ１４０及びｇｐ３６を認識することを特
   徴とする請求項２に記載のモノクローナル抗体。
4. 【請求項４】 請求項２または３に記載のモノクローナ
   ル抗体を産生するハイブリドーマ。