JPH02119791A - ヒトレトロウィルスｈｉｖ―２の外被糖タンパク質の前駆抗原及びそれと免疫学的同族性をもつ抗原、ならびにこれらの抗原の調製方法及び診断への応用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は、ヒトレトロウィルスＨＩＶ−２の外被糖タン
パク質の前駆抗原ならびにかかるレトロウィルスＨ１■
−２の外被糖タンパク質の前駆物質である上述の抗原を
認識する特異的単クローン抗体と免疫学的に交雑する抗
原に関する。

さらに限定的に言うと、本発明は、ヒトレトロウィルス
ＨＩＶ−２による感染の生体内での推移の成る段階の時
点でのみ存在する抗原に関する。

これらの抗原は、このレトロウィルスの外被糖タンパク
質の形成及び成熟プロセスの特徴であり、従って、感染
の伝播に端を発するレトロウィルスＨＩＶ−２の発達及
び増殖に関与するものである。

本発明は同様に、これらの抗原を認識する抗体ならびに
これらの抗体を含む免疫原性化合物にも関する。

その上、本発明は前記抗原の調製方法ならびにヒトレト
ロウィルスＨＩＶ−２感染の診断のためのその利用にも
関する。

〈従来の技術〉 リンパ節疾患症候群（英語略号はＳＬＡである）の進行
の原因であるか又はこれらの症候群の進行に寄与する或
いは又後天性免疫不全症候群（ＳＩＤＡ、エイズ）の進
行の原因である病因学的作用因子が、分離され識別され
、特徴づけされてきた。

成る種の条件の下で人間において場合によってエイズに
移行するＳ　Ｌ　Ａを誘発する可能性のある複数のヒ［
−しトロウィルスを、ＨＩ　Ｖ　（ＨｕｍａｎＩｍｍｕ
ｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　Ｖｉｒｕｓヒト免疫不全症
ウィルスの英語名の略）という名称で呼んできた。

このようにＬＡＶ−］つまりＨＩ　Ｖ−１と呼称された
最初のウィルスが分離され、英国特許出願明細書簡Ｇ１
３．８３／２４８００号ならびに１９８４年９月１４日
付のヨーロッパ特許出願明細書簡ＥＰ、８４／４０１．
８３４号内に記述されている。このウィルスは又、Ｆ、
　ＢａｒｒｅＳｉｎｏｕｓｓｉ他によりｒｓｃｉｅｎｃ
ｅｊ　（２２０ｎ°４５９９．２０．ｐｐ８６８−８７
１）内に記述されている。

ＬＡＶ　　ＥＬＩ及びＬＡＶ　　ＭＡＬと呼称されたこ
のＨＩＶ−１ウイルスの派生型も又分離され、特徴づけ
され、ヨーロッパ特許出願明細書簡４８／４０１．８３
４号中に記述されている。

この全く異なるクラスに属しこれまでのものとの免疫学
的類似性が少ないレトロウィルスの分離及び特徴づ（づ
については、第２３９．４２５号として公開されたヨー
ロッパ特許出願明細書簡８７／４００，１５１．４号中
に記述されていた。ＨＩＶ−２という呼称の下にまとめ
られたこれらのしトロウィルスは、リンパ節疾患又はエ
イズの症状を示す複数のアフリカ人患者において分離さ
れた。

これらのレトロウィルスＨＩＶ−１の研究、そのヌクレ
オヂド配列の分離及び分析ならびにその抗原タンパク質
の特徴づけにより、構造面及び機能面の両面におしづる
これらの類似性或いは又逆にその特異性レベルで、得ら
れたさまざまな株の間の比較を行なうことができた。

これらのレトロウィルスＨＩ入ｒ−１及びＨＩ　Ｖ２は
同様に原シミアン（ザルの）レトロウィル］　２ ス（ＳＩＶ又はＳ　Ｔ　Ｌ　Ｖ　−Ｉｌｌという略号で
呼称されている）との比較においても研究され、この研
究によりレトロウィルスＨＩＶ−２及びその派生型のタ
ンパク質及び糖タンパク質とレトロウィルスＳＩＶのタ
ンパク質及び糖タンパク質の間の成る種の類似性を示す
ことができた。

これらのウィルスの各々の外被タンパク質（エンベロー
プ）のレベルで類似性が特にきわ立っている。実際、レ
トロウィルスＨＩＶ−２の外被タンパク質に対する抗体
とレトロウィルスＳＩＶの外被糖タンパク質の間の免疫
学的交差反応を実証することができたが、この免疫学的
交差反応は、レトロウィルスＳＩＶとレトロウィルスＨ
ＩＶ−１の間にも、又レトロウィルスＨＩＶ−１とＨＩ
Ｖ−２の間にも起こらない。

レトロウィルスＨＩ　Ｖ　−２のゲノムのｅｎｖ。

ｇｅｎｅ　（ウィルス粒子膜構造タンパク質遺伝子）に
よりコード付けされたこのしトロウィルスの外被糖タン
パク質に関する結果は、前述のヨーロッパ特許出願明細
書簡８７／４００，１５１．４号中に記されている。

このＥＰ特許出願明細書において、この糖タンパク質は
、約１４０．０ＯＯｄというその分子量を示すようｇｐ
１４０という略号で呼称されていた。ただし、分子量の
計算は±１０％の誤差で評価されたことが明記されてい
た。先行するフランス特許出願明細書（第２．５９６．
０６３号として公開された第８６１０３８８１号）にお
いては、ｇｐ１６０　（分子量１６０Ｋｄ±１０％）と
呼称されたｇｌ）ｌ　４０の前駆物質も同様に記述され
ていた。

〈課題を解決するための手段〉 レトロウィルスＨＩＶ−２の外被タンパク質に関するさ
らに詳しい調査が行なわれ、この調査により、当該発明
者は、これまでに与えられた分子量の別の測定方法を実
現し従って上述の分子量の間隔に基づいて結果を精密な
ものにすることができるようになった。外部外被糖タン
パク質は（本発明の作業条件の下で）ＨＩＶ−２のウィ
ルス粒子内て約１２５０００ｄの分子量を呈している（
これはｇｐｌ、２５という名で呼ばれる）。これと同じ
作業条件の下で、フランス特許出願明細書第８６１０３
８８１内ですてに立証済でありｇｐ　１６０と呼称され
ている前駆物質の分子量は、最近得られた結果に従うと
、約１４００００ｄである。従って、本特許出願明細書
中、これをｒｇｌ）１４０Ｊという名て呼ぶことにする
。

本発明の枠内で、当該発明者は、糖タンパク質ｇｐ１２
５及び糖タンパク質ｇｐ３６を含む、成熟した形の外被
糖タンパク質が得られることになる複数の発達段階が存
在することを立証した。

従って、当該発明者は、ヒトレトロウィルスＨＩ　Ｖ　
−２による感染の後に病原性障害が進行する場合に現わ
れるウィルスの複製サイクルの推移におけるさまざまな
段階を識別した。この点に関して当該発明者は、レトロ
ウィルスＨＩＶ−２に感染した細胞内特にヒトリンパ球
Ｔ４内て進行する複数の段階の重要性を強調した。

これと並行して、当該発明者は、レトロウィルスＨＩ　
Ｖ−１及びＨＩＶ−２のウィルスサイクルについて同様
な研究を行なった。これらの研究により、レトロウィル
スＨＩＶ−２及びＳＩＶに共通であり、しかも逆にＨＩ
Ｖ−１のウィルス複製サイクルの際には見かけ」二存在
しないきわめて特異的な特性を発見した。

従って、本発明はヒトレトロウィルスＨＩＶ２に特異的
に起因すると言える感染を検出するための新しい手段を
提供する。

最近得られた結果を考慮すると、レトロウィルスＨＩ　
Ｖ　−２及びＳＩＶ特有のウィルスサイクルは、その全
体のみが最終的な形でのレトロウィルス８丁Ｖ−２のエ
ンベローブ内に存在する外部糖タンパク質の形成に導い
てくれるような１つの複雑な連鎖反応プロセスとして現
われる。このプロセスの際に、さまざまな抗原性前駆物
質を認識し、分離し、識別することができた。これらは
全て特に、前述のヨーロッパ特許出願明細書中に紀され
ているレトロウィルスＩ（Ｉ　Ｖ　−２のｅｎｖｇｅｎ
ｅによりコード付けされた外被糖タンパク質のペプチド
構造を一基礎とする構造上の類似性を有する。

従って本発明は、ヒトレトロウィルスＨＩＶ２の外部外
被タンパク質或いは前記ｇｐ１２５と免疫学的交差反応
を呈する糖タンパク質のペプチド構造を共有し、偶発的
なオリゴ糖鎖の存在及び／又は組成のレベルでは異なっ
ている、ＨＩＶ−２の外部外被糖タンパク質ｇｐ１２５
の形成及び成熟サイクルのさまざまな段階に際してヒト
レトロウィルスＨＩＶ−２による感染の後に生成される
タンパク質又は糖タンパク質に関するものである。

本発明に基づくタンパク質及び糖タンパク質に特異的な
特徴は、ヒトレトロウィルスＨＩＶ−２の成熟した外部
外被タンパク質の形成及び成熟に不可欠な各々の段階の
際に獲得されるものである。

ウィルスサイクルを研究することにより、当該発明者は
、ヒトレトロウィルスＨＩＶ−２の成熟した外被糖タン
パク質の形成の特定の段階に介入することができるとい
うことを示唆し、こうしてウィルスサイクルの正常な推
移を中断し成る種の条件の下で人間に対して感染力のあ
る病原性のしトロウィルスの伝播に対し補正するだめの
手段を提供した。

上述の事実に基づき、本発明は、以下のことを特徴とす
る、抗原性タンパク質ｇｐ３００に関する 一約３００Ｋｄの分子量（ＰＭ） 特にＳＬＡ又は（エイズ）を誘発する可能性のあるヒト
レトロウィルスＨＩＶ−２のゲノムのウィルス粒子膜構
造タンパク質遺伝子（ｅｎｖ、ｇｅｎｅ）によりコード
付けされた外被糖タンパク質ｇｐ１２５又はががるレト
ロウィルスＨＩＶ−２のタンパク質ｇｐ３００に対する
抗体と免疫学的に交差反応するレトロウィルスのタンパ
ク質の前駆外被糖タンパク質ｇｐ１４０の２つの単位の
会合。

前駆物質ｇ　ｐ　］−４０は同様にＨＩＶ−２（７）ｇ
ｐ３６の前駆物質であることがわかる。当該発明者はｇ
ｐ１４０の２つの単位の前述の会合がそのべプチド構造
に固有の特性であることを確認した。

抗原性タンパク質ｇｐ３００はさらに以下の特性によっ
て特徴づけられる 特にヒトリンパ球Ｔ４又はこれらのリンパ球から誘導さ
れた永久系統においてＨＩＶ−２族のレトロウィルスに
感染した患者の生物学標本の細胞中に存在していること その当量点（ｐＩ）は、［６，８−７，８］の間隔にあ
るｐ　Ｈについて得られること それが、窒素に結合されたオリゴ糖鎖によってグリコシ
ル化されていること それが、イオン性洗剤、特にＳＤ３　１％、非イオン性
洗剤、特にＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１０［１２％、尿４Ｍ、
強塩及び還元剤の中で安定していること それが、試験管内で、Ｔ）Ｈ４〜５で約１４０Ｋｄの分
子量の２つの糖タンパク質に自然発生的に解離すること 電気泳動ゲル−ヒての分離及び純化の後、それが、酢酸
緩衝液の中で試験管内で、６以下のｐ　Ｈ値について約
１４０Ｋｄの分子量の２つの糖タンパク質に解離するこ
と ヒトレトロウィルスＨＩＶ−２に感染した患者の血清か
ら得られた特異的抗体が存在する中でのイムノアフィニ
ティカラム上での純化の後、３００Ｋｄの分子量に相当
する電気泳動帯を、６Ｍの尿素の存在する中でポリアク
リルアミドゲル５Ｄ３７．５％上で呈すること。

当該発明者は、ｇｐ３００から成るタイマー（二量体）
の形成が、ウィルスサイクルの過渡的でおそらくはレト
ロウィルスＨＩＶ−２の外被糖タンパク質の成熟に必要
な１つの段階であることに気づいた。実際、上述の抗原
性タンパク質ｇｐ３００は、それが、１８時間３５Ｓ−
メチオニン（２００ＬＬｃｉ／ｍｆ４　ｘ　１０　’細
胞／ｍｆｆ）を用いたｔ票識付けの後のレトロウィルス
ＨＩＶ−２に感染した細胞の特異的培地内に存在するウ
ィルス粒子から成る生物学的媒質の電気泳動分析ならび
に、感染細胞及びその相応する培地を含む得られた抽出
物の純化によっては見かけ玉検出されないものの、同じ
条件の下で上述の感染細胞内では検出されることを、特
徴としている。

このことから当該発明者は、ｇｐ３００を、最終的外被
タンパク質の特異的な過渡的前駆物質としてみなすに至
った。タンパク質ｇｐ３００の獲得において結果として
得られるしｌ−ロウィルスＨＩＶ−２のウィルスサイク
ルのこの特性は、窒素上で結合されたオリゴ糖のグリコ
シル化（糖鎖形成）鎖を含む糖タンパク質の形成の一般
的メカニズムについて既得の知識に比べて、独創的かつ
きき慣れないものである。

一方、当該発明者はきわめて興味深いことに、レトロウ
ィルスＳＩＶｍａｃＯ外被糖タンパク質の形成及び成熟
が、ＨＩＶ−２について明確に特徴づけされたｇｐ３０
０のクイズの糖タンパク質の獲得に導くダイマー化段階
を介入させていることに気づいた。これとは反対に、ヒ
トレトロウィルスＨＩＶ−１のウィルスサイクルを並行
して観察したところ、ｇｐ３００に類似する糖タンパク
質の形成において結果として得られるダイマー化の段階
は全くみられなかった。

これらの結果は、全＜驚＜べきことに、レトロウィルス
ＨＩＶ−２のエンベロープの糖タンパク質の前駆物質ｇ
ｐ１４０からのグブレット（つまリダイマー）の形成が
しｌ−ロウィルスＨＩ　Ｖ　−２及ＵＳ　Ｉ　Ｖの１旦
ヱ、ｇｅｎｅの要理の特異的特性であることを示してい
る。

この事実は、成る種の条件において、ＳＬＡ又はエイズ
を誘発することのできるレトロウィルスＨＩＶ−２によ
る感染の選択的診断のための手段の研究及び開発におい
て、利用することのできるものである。これらの適切な
診断手段については、後で言及することにする。

本発明は又、グリコシル化されていない形をしているこ
とならびにその分子量が約２００Ｋｄであることを特徴
とする、ペプチド構造のレベルでｇｐ３ｏｏのものと同
じ特徴を呈するタンパク質にも関する。

以下に示す例において再び言及するこのタンパり質ｐ２
００は、エンド−〇−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ
Ｈ（ｒｅｎｄｏ−ＨＪとも呼ばれる）での消化実験の際
に立証された。ｇｐ３００のグリコシル化されていない
形を表わすこのタンパク質は、ｇｐ３００の最終的コン
フォメーションにとっては重要であるものの関心の対象
であるエピトープへのアクセス可能性にとっては邪魔な
オリゴ糖鎖の存在のためにｇｐ３００内ではほとんど抗
原性がないということがわかる、ｇｐ３００及びｐ２０
０に共通のエピトープが場合によって存在することから
、特に興味深いものでありうる。

ウィルスサイクルの研究中、もう１つの糖タンパク質が
検出された。すなわち、純化された糖タンパク質ｇｐ１
５０である。これは、グルコンダーゼの抑制因子特にカ
スクノスパルミンが存在する中ての短時間にわたる付加
された放射性トレーサによるこれらの細胞の標識イ」け
、次に洗浄によるこの放射性トレーサの除去及び、前記
標識側けの後に形成されたタンパク質及び糖りンバク質
内においてこのトレーサを見つけることができるように
する段階である異なる時間的間隔で採取された標本につ
いての放射能の測定段階に先立つ放射性のない分子によ
る置換の後、試験管内で検出されること（ＨＩＶ−２型
のヒトレトロウィルスに感染した患者の細胞内において
のみ）を特徴とする。ｇｐ１５０の観察は、ｇｐ３ｏｏ
の検出に必要な時間に等しい又はそれに近い時間の後に
行なわれる。

糖タンパク質ｇｐ１５０はさらに次のことを特徴とする 約１５０Ｋｄの分子量 ヒトレトロウィルスＨＩ　Ｖ　−２或いは又かかるレト
ロウィルスＨＩ　Ｖ　−２に感染した患者の血清の抗体
特にｇｐ１２５に対する抗体により認識される外部外被
糖タンパク質をもつレトロウィルスのゲノムのｅｎｖ、
ｇｅｎｅによりコード付けされた外被糖タンパク質ｇｐ
１２５の前駆物質のペプチド構造 オリゴ糖鎖上の末端グルコース残基。

前述のタンパク質及び糖タンパク質好ましくはｇｐ３０
０は、ＨＩＶ−２型のヒトレトロウィルスに感染した患
者の生物学的標本の細胞内の抗体の存在の診断のための
抗原性化合物に使用すると有利であることがわかった。

なおこれらの化合物は、前述の抗原性タンパク質又は糖
タンパク質を含むことをその特徴としている。

これらの化合物は、レトロウィルスＨＩＶ−２に感染し
た患者の血清の抗体と抗原抗体タイプの免疫学的複合体
を形成させることができるという点で、きわめて有利で
ある。従って、これらの化合物及び／又はそれに含まれ
ている抗原は、ＨＩ　Ｖ　−２型のレトロウィルスによ
る感染の特異的診断を行なうために利用すると有利であ
る。

さらに、本発明は、前述のｇｐ３００を認識すること及
び成熟した外被糖タンパク質ｇｐ１２５及び成熟したｇ
ｐ３６を認識しないことを特徴とする単クローン抗体に
も関する。

その他の単クローン抗体は、それが上述のｇｐ３００に
おいて抗体に対して露出されアクセス可能であるような
エピトープを認識すること（ただしこのエピトープは、
その天然のコンフオメションにおける成熟したｇｐ１２
５及びｇｐ３６内では、露出されていないか又はマスキ
ングされている）を特徴とする。

このような単クローン抗体は、特にレトロウィルスＨ丁
Ｖ　−２のその受容体上への固定特にこのウィルスを有
するヒトリンパ球の受容体Ｔ４への固定を妨げることに
より、中和性をもつものでもありうる。

本発明の枠内に入る有利な、その他の単クロン抗体は、
上述のｐ２００を認識し、成熟したタンパク質ｇｐ１２
５及びｇｐ３６を認識しない。

その他の単クローン抗体は、ｐ２００内においてエピト
ープを認識すること（ただしこのエピトープは、その天
然のコンフＡメーションにて得られるようなｇｐ３００
及び／又はｇｐ１２５及びｇｐ３６上では露出されてい
ないか又はマスキングされている）を特徴とする特 上述の単クローン抗体は、免疫原性及び中和性をもぢ、
レトロウィルスＨＩＶ−２の増殖を中断することができ
る。

本発明の実施の枠内で、上述の抗体の生産には槽数の方
法が適する。例えば、動物特にマウスのような語歯目に
おける腹水での培養を用いることができる。又不動化さ
れた又はカプセル封しされた或いは又懸濁状態の細胞培
養から抗体を生成することもてきる。特に予めしトロウ
ィルスＨＩＶ−２を接種してｊ５いた動物のリンパ球の
融合から得られるハイブリドーマ（雑種細胞）の技術を
用いる。この場合、感染した動物のリンパ球が採取され
、選択されたｍｙｃｌ、ｏｍａｔｅｕｓｅ　（骨髄腫細
胞ｍｙｅｌｏｍａｔｅｕｓｅ）細胞と融合させられて、
次に上述の抗原性タンパク質及び糖タンパク質に対する
装置的抗体を生成するその能力について選択される雑種
を形成する。

これらの生成された単クローン抗体は、例えばそれらが
免疫学的複合体を共に形成するタンパク質及び／又は糖
タンパク質を不活性化するため、或いは又ＨＩＶ−２の
エンベロープの最終的糖タンパク質の形成の正常な推移
を妨げるその能力を生かして、用いられることになる。

さらに、本発明に基づくタンパク質及び糖タンパク質の
ペプチド構造の類似性から、これらの糖タンパク質に対
して特にｇｐ３ｏｏ、ｐ２００に対して形成された単ク
ローン抗体は、ｇｐ１２５に対して効果があることにな
る可能性がある。

これらの抗体のその他の応用分野としては生物学的調製
物内のウィルス抗原の検出或いは又アフィニティ力ラム
などでのタンパク質及び／又は糖タンパク質の純化があ
る。

−Ｎ９に、本発明は、唯；−ヒトレトロウィルスＨＩＶ
−２から得られる場合の前述のもののような糖タンパク
質及びタンパク質に限定されるわけてはない。これは反
対に、上述のタンパク質及び糖タンパク質と共通の抗原
性、免疫特性ひいては免疫原性を有するタンパク質及び
糖タンパク質をも包括している。なおこの場合、これら
のタンパク質及び糖タンパク質は、例えばレトロウィル
スＨＩＶ−２の特徴である相応するタンパク質に対する
特異性抗体による認識されるその能力などによって定義
づけされうる。

このことは、当該発明者によるそのウィルスサイクル研
究によりヒト−１〜ロウイルスＨＩ　Ｖ−２の前述のタ
ンパク質及び糖タンパク質と共通の特性が実証された、
レトロウィルスＳＩＶｍａｃの外部外被糖タンパク質の
その他の前駆物質及び糖タンパク質ｇｐ３００にあては
まる。

本発明は又、ワクチンの調製に適した薬学的に受入可能
な賦形剤と結びつけて上述のもののような糖タンパク質
ｇｐ３００を含む免疫原性化合物にも関する。

こうして形成された免疫原性化合物は、１キログラムあ
たり１０μｇから１００μｇの分量で投与することがで
きるように抗原性タンパク質及び／又は糖タンパク質が
調合されている。

本発明は更に、以下の段階な特徴とする抗原性タンパク
質ｇｐ３００の調製方法にも関するヒトレトロウィルス
ＨＩＶ−２に感染した細胞の溶解及び上澄みと細胞抽出
物の分離段階イムノアフィニティクロマトグラフイのカ
ラム上での細胞抽出物及び／又は上澄みの保温段階。こ
のカラム上には、ヒトレトロウィルスＨＩＶ−２に感染
した患者の血清から得られるもののような純化された抗
体を含む免疫吸着剤が沈着させられている。なおこれら
の抗体は、緩衝液の存在する中で、免疫学的抗原抗体複
合体形成に充分な長さの時間、適合された支持体上に固
定されている。

保留されなかった分子を除去するための、緩衝液でのカ
ラムの洗浄段階 一電気泳動及び電気溶離による保留されたタンパク質の
分離段階： 求められている抗原性タンパク質の回収段階。

感染した細胞は、し）・ロウィルスＨＴＶ−２に感染し
た患者において採取され得たはずである。

又、これらの感染細胞は、ＨＩ　Ｖ　−２に感染した細
胞の培養から試験管内でも得られたはずてある。かかる
細胞培養は、ＣＥＭ系統について行なわれつる。

この糖タンパク質の調製のためのもう１つの方法は、前
述のものと頓似した形で得られるが、この場合、電気溶
離の段階は、以下の段階で置換えられる 上述のイムノアフィニティーカラム上に固定されたタン
パク質の溶離、 分離用支持体上に固定された形でｇｐ３００に対する単
クローン抗体を含む、クロマトグラフィのカラム上てこ
うして溶離された生成物の純化。

本発明の特定の一実施態様においては、感染細胞の溶解
は、洗剤溶液の中で行なわれ、免疫吸着剤の中に含まれ
ている抗体は、アガロース珠玉に固定され、連結用（ａ
ｃｃｒｏｃｈａｇｅ）緩衝液の存在下で作業が進められ
る。

本発明の目的は又、以下のことを特徴とする、ヒトレト
ロウィルスＨＩＶ−２による感染の有無を確認する目的
で患者の生物学標本の細胞内の抗体の存在を診断する方
法にもある。

抗原抗体タイプの免疫学的複合物の形成を可能にするよ
うな条件の下での、この生物学的標本と上述の抗原又は
本発明に基づく抗原性化合物の接触。

形成された抗原抗体複合物の検出。

診断が行なわれる生物学的標本は、レトロウィルスＨＩ
Ｖ−２に感染した細胞を含んでいる可能性があるかぎり
、生物学的流体特に血清、生物学的組織抽出物であって
もよい。

かかる方法は、当該発明者が感染の原因であるし１〜ロ
ウイルスのウィルス複製サイクルの早期段階におけるｇ
ｐ３００の出現を実証したことから、それがヒトレトロ
ウィルスＨＩＶ−２又はそれに類するレトロウィルスに
よる感染の早期検出を可能にするかぎりにおいて、特に
有利に利用することができる。

前述の診断方法を利用するため、当該発明者は、次のも
のを含むことを特徴とする、ヒトレトロウィルスＨＩＶ
−２に感染している可能性のある患当の生物学的標本の
細胞内の抗体を検出するための用具又はキットを考案し
た： 前述の少なくとも１つの抗原性タンパク質及び／又は糖
タンパク質、又は これらの構成成分から作られた化合物又はこれらの異な
る構成成分の混合物、そして テストすべき生物学標本中に場合によって存在する抗体
と上述の抗原の間での免疫学的複合物の形成反応を可能
にする手段、特に必要とあらば、単数又は複数の保温用
緩衝液 一陰性対照の標本 形成された抗原抗体複合物の検出のための手段 こうして感染性レトロウィルスＨＩＶ−２の形成のさま
ざまな段階ならびに感染の進行におけるこれらの段階の
うちのいくつかの重要性を見極めた上で、当該発明者は
、グルコシグーゼエ及び／又はＴＩの少なくとも１つの
抑制因子特にカスタノスパルミン又はデオキシシリマイ
シン又はこれらの抑制因子の混合物を、生理学的に受入
れることのできる賦形剤と結びつけて、ウィルスザイク
ルの際に糖タンパク質ｇｐ１５０のオリゴ糖鎖の末端グ
ルコース残渣の除去を阻止するのに充分な分量で含んで
いることを特徴とする薬学的化合物の作製を提案した。

本発明のその他の特徴は、以下の実施例及び図面を参照
することにより明らかになるものと思われる 〈実施例〉 第］Ａ図及び第２Ａ図から成る第１図は、ＨＩＶ−２の
外被糖タンパク質を表わしている。

ＨＩＶ−１又はＨｒＶ−２に感染した細胞ＣＥＭを１８
時間３５Ｓ−メヂオニン（２００ＩＬＣｉ／艷、４ＸＩ
Ｃ１’細胞／艷）を用いて標準付けした。感染した細胞
（ＣＥＬＬ）の抽出物及びその相応する培地（ＳＮ）を
特異的イムノアフィニティカラム上［ＨＩＶ−１タンパ
ク質に特異的な血清−セファロースＨＩＶ−１カラム（
Ｋｒｕｓｔ他、１．９８８年）及びＨＩＶ−２タンパク
質に特異的な血清−セファロースＨ工Ｖ　−２カラム（
「実験手順参り刊」上で純化した６尿素６Ｍを含むポリ
アクリルアミド−３ＤＳ　（７，５％）のゲル電気泳動
により、純化されたタンパク質を分析した。

ゲルのフルオログラフは、第１Ａ図に示されている。Ｈ
ＩＶ−１及びｌ（Ｉ　Ｖ　−２のタンパク質のサイズは
、ラインの左右に示されている。ｐ６Ｂ及びｐ５５は、
それぞれ逆トララスクリブターゼ（転写酵素）及びｇａ
ｇ　（ウィルス内部構造タンパク質遺伝子）の前駆物質
である。ｇｐ１６０及びｇｐ１２０は、それぞれＨＩＶ
−１のエンベロープの前駆糖タンパク質とその開割生成
物である。

ｇｐ３００、ｇｐ１４０及びｇｐ１２５は、糖タンパク
質の前駆物質及びＨＩＶ−２の外被タンパク質の開割生
成物である。

球Ｔを１８時間３Ｈ−グルコサミン（２００ｔｉ、Ｇ〕
／ｍｌ！　：　４　ｘ　１０６細胞／ｍｌ）で標識付け
した。

血清−セファロースＨＩＶ−２カラム上で、感染した細
胞の抽出物（ラインＣ）及びウィルスを含む培質（ライ
ン■）を純化させ、７５％ゲル上で細胞ＣＥ　ＩＶＴ内
で合成されたＨＩＶ−２の糖タンパク質の電気泳動によ
り、標識づけされたタンパク質を分析した。最も左にあ
るラインにおいて、１２５％のアクリルアミドのゲル電
気泳動け、ｇｐ３６の存在を示している。この図のこの
部分はｇｐ３Ｂを立証するため過剰露出しなければなら
なかった。このため、ｇｐ１４０／１２５は厚い帯の形
で分離されている。

ＨＩＶ−２に感染した細胞ＣＥＭ（ＣＥＬＬ）から純化
された糖タンパク質ｇｐ３００、ｇｐ１４０及びｇ　ｐ
　］、　２５を３５３−メチオニンで標識付けした。糖
タンパク質ならびにウィルスを含む培地を分析した（Ｓ
Ｎは培地で得られた結果を表わしている）・調製条件は
、二次元ゲル電気泳動については第１Ａ図のものとほぼ
同しであるげ実験手順」参照のこと）。等電点電気泳動
（第１次元）のｐＨ勾配は、与えられたものと一致して
いる。第２次元では、タンパク質を、尿素６Ｍを含むポ
リアクリルアミド−３ＤＳ　（７，５％）ゲル」二で分
離した。ゲルのフルオログラフは第２図に表わされてい
る。

ａ）−）ＩＩＶ−２に感染しａｓＳ−メチオニンで標識
付けされた細胞ＣＥＭの抽出物を、血清−セファロース
Ｉ−Ｉ　Ｉ　Ｖ−２カラム上で純化した。

この標本を次に２つの等しいアリコート部分に分けた・
すなわちそのうちの１つは、連結用緩衝液内で保温しく
ライン１）、もう一方のものは、ｐＨ４，０の酢酸ナト
リウム３０ｍＭ、ＰＭＳＦ　　０．２ｍｖｌ、アプロチ
ニン　１００単位／ｄ及びβ−メルカプトエタノールを
含む緩衝液内で保温した（ライン２）。３７°Ｃて一時
間放置した後、酸性媒質を中和し、電気泳動により２つ
の標本を分析した。

ｂ）−”ｓ−メチオニンで標識付けされ、純化され、凍
結乾燥されたｇｐ３００を、上述のごとく、ｐ　Ｈ４の
酢酸ナトリウム（１０Ｑｐ１）の緩衝液中て懸濁さぜた
（ライン２）。３７°Ｃで３０分間保温が行なわれた後
、２Ｍの尿素を含む電気泳動緩衝液を２度にわたりイ」
加した。ライン１の結果は、電気泳動緩衝液中に直接懸
濁させられた凍結乾燥されたｇｐ３００に相当する。

ｃ）　　１５３−メチオニンで標識づけされ、純化され
、凍結乾燥されたｇｐ３００を、３０ｍＭのＴｒｉｓ−
Ｈ（１２，０，２ｍＭのＰＭＳＦ及び１００単位／ｍｌ
のアプロチニンを含む溶液中で懸濁させ、ＨＣｌ２でｐ
Ｈ７，５，７，０６５及び６０（図に示されている通り
）に緩衝さぜた。３７°Ｃで６０分放置した後、電気泳
動緩衝液を２度にわたり加え、標本を電気泳動て分析し
た。

これらのゲルのフルオログラフはａ、ｂ及びＣに示され
ている。セクションＣにおいては、ｇｐ３００の特徴的
な帯は、ｇｐ１４０では解離されている。この解離は、
このフルオログラフの比重走査器を作製することにより
数量化されうる。

これらの反応は全て、２度にわたる電気泳動緩衝液の付
加により停止された。第１図について記されているよう
に、電気泳動が行なわれた。異なるゲルのフルオログラ
フが示されている。右側の矢印ｐ９０及びｐ８０は、消
化生成物の位置を示す。ｅ　ｎ　ｄ　ｏ　−Ｈ消化の条
件についてはＴａｒｅｎｔｉｎｏ他（１９７４年）によ
り記述されている。

純化された凍結乾燥された糖タンパク質ｇｐ３００、ｇ
ｐ１４０／ｇｐ１２５及びｇｐ１２５（「実験手順参照
」）を、ｐＨ５，５のクエン酸ナトノウム１５０ｍＭ、
０．１％のＳＤＳ（ｗ／ｓ）、０．５ｍＭのＰＭＳＦを
含む緩衝液中に懸濁させ、その後９０℃で２分間加熱し
た。これらの標本のアリコート部分を、ｅｎｄｏ−Ｈ無
しくラインｌ）又はＥｎｄｏ−ＨＯ，４ミリ単位（ライ
ン２）、２（ライン３）及び１０（ライン４）ミリ単位
有りで保温した（３０°Ｃ２時間）。

住旦 ＨＩＶ−２ｉ、ｍ感染シタ細胞を１８時間、１４’−マ
ンノース（２５μＣｉ／ｍｌ；　４ｘ　１０６細胞／ｒ
ｎｆり又は３Ｈ−フコース（２００ｕｃｉ／ｍＮ　：　
４　Ｘ１０６細胞／１ｆｆ）を用いて標識付けした。感
染した細胞の抽出物（ラインＣ）及びウィルスを含む培
地（ライン■）を、血清−セファロースＨＩ　Ｖ２カラ
ム上で純化させた。次に標識付けされた。

糖タンパク質を、ポリアクリルアミドのゲル電気泳動に
より分析した。フルオログラフは、第５図３つ に示されている。

成）の抑制 チュニカマイシンの存在しない状態で（ラインＣ）又は
チュニカマイシンが存在する状態で（２１Ｊｇ　／　ｍ
ｌ　）　　（ラインＴＭ）、ＨＩＶ−２に感染した細胞
を３４３−メチオニン（３５Ｓ−ｍｅｔという題の枠：
２００１ｔＣｉ／ｍｆｆ：４Ｘ１０６細胞／、ｉ’）又
は３Ｈ−グルコサミン（３Ｈ−ＧＬｃＮＡｃという題の
枠＋　１００１ｔＣｉ／ｍｆｆ：４Ｘ１０６細胞／　ｍ
ｌ　）を用いて１６時間標識付けした。チュニカマイシ
ンで処理された細胞をまず最初に抗生物質（２μｇ　／
　ｍｌ　）で２時間保；品しく３７°Ｃ）、その後３５
８メチオニン又は３Ｈ−グルコサミンで標識づけした。

感染した細胞（ＣＥＬＬ）とウィルスを含む培地（ＳＮ
）の抽出物を、血清−セファロースＨＩ　Ｖ　−２カラ
ム上で純化し、７５％のポリアクリルアミドのゲル電気
泳動により分析した。これらのゲルのフルオログラフが
示されている。工ンベロープのグリコシル化されていな
い前駆物質（ｐ９０／８０）の位置及びグリコシル化さ
れていないタイマー（２００Ｋｄ）の位置は、右側の小
さな矢印により示されている。タンパク質（９０／８０
Ｋｄ及び２００　Ｋｄ）は、　３Ｈ−グルコサミンを内
含していない（枠３Ｈ−ＧＬｃＮＡｃＣＥ　Ｌ　Ｌライ
ンＴＭ）。

果 ＨＩＶ−２に感染した細胞ＣＥＭをオリゴ糖切断抑制因
子無しくラインＴ）又はオリゴ糖切断抑制因子すなわち
１ｍＭのブロモコンデユリトール（ｂｒｏｍｏｃｏｎｄ
ｕｒｉｔｏｌｌ　（ラインＢｒｏ）：１ｍＭのカスタノ
スバルミン（ｃａｓｔａｎｏｓｐｅｒｍｉｎｅ）　（ラ
インＣａ５ｔ）；１０μｇ／ｍｌのスウェインソニン（
ｓｗａｉｎｓｏｎｉｎｓ）　（ラインＳＷ）；３ｍＭの
デオキシノジリマイシン（ｄｅｏｘｙｎｏｊｉｒｉｍｙ
ｃｉｎｅ）　（ラインｄＮＭ）そして１ｍＭのデオキシ
マンノジリマイシン（ｄｅｏｘｙｍａｎｎｎｏｊｉｒｉ
ｍａｙｃｊｎｅｌ　（ラインｄＭＭ）の存在する中で、
３Ｓ３−メチオニン（２００μＣｉ／に４Ｘ１０６４×
１０６細胞／用いて標識付けした（１６時間、３７°Ｃ
）。

感染した細胞（Ｓ　Ｅ　ｉ−Ｌという題の枠）とウィル
ス粒子を含む培地（ＳＮの枠）の抽出物を、血清−セフ
ァロースＨＩＶ−２カラム上で純化し、感染細胞中のウ
ィルス糖タンパク質ｇｐ１２５、ｇｐ１４０、ｇｐ３０
０及び培地中のｇｐ、１２５を識別した。ポリアクリル
アミドゲル７．５％上で電気泳動により全ての標本を分
析した。さまざまな抑制因子て処理された細胞によるｇ
ｐ１２５の生成の抑制がウィルス糖タンパク質に特異的
なものであることを示すため、培地をテストしたところ
、ＨＩ　Ｖ　−２に対する血清陽性の血清を介入させる
イムノプレシピテーションテスト（Ｃ１ａｖｅｌ他、１
９８６ａ、１９８７）により核のタンパク質ｐ２６の存
在が検出された。このｐ２６をポリアクリルアミド（１
２，５％）のゲル電気泳動により分析した。図は、各ゲ
ルの唯一つの部分のみを示すフルオログラフである。

第８図：ＨＩＶ−２の糖タンパク　の　成プロａ）カル
クノスバルミンの無い状態（対照）又はカスタノスペル
ミン１ｍＭが存在する状態（Ｃａｓｔ、）て、ＨＩＶ−
２に感染した細胞Ｃ、Ｅ　Ｍを用いて、短時間にわたる
放射性トレーサによる標識付は及びその後に続くこのト
レサの除去と放射性の無い分子によるその置換の実験［
パルスチエイス（瞬間標識追跡）実験］を行なった。

対照：感染細胞を１時間３７°Ｃてメチオニンの無い媒
質内で保温し、その後、１５分の短い間ａｅＳ−メヂオ
ニン（２００μＣｉ／献、４×１０５細胞／７ｎＩライ
ン１）で標識付けした。

０５時間、１５時間及び３時間（それぞれライン２．３
．４に結果が報告されている）、放射性トレーサを除去
し５ｍＭに低温メチオニンを含む培地で置換した。Ｃａ
５ｔ：ＨＩＶ−２に感染した細胞ＣＥＭをカスタノスペ
ルミンを含むメチオニンの無い媒質内で保温しく３７°
Ｃで一時間）、その後、３５Ｓ−メチオニンを用いて３
０分間急速に標識付けした。次に、上述のように但し０
５時間、１．５時間及び３時間（それぞれライン２．３
及び４）カスタノスペルミンがある状態で、放射性トレ
ーサの除去及び非放射性分子による置換の後、これらの
細胞を追跡した。

ｂ）放射性トレーサによる標識付けならびにモネンシン
の無い状態（対照）又はモネンシンＩＰＭの有る状態で
ＨＩＶ−２に感染した細胞内での上述の条件下でのこの
トレーサの追跡の実験を行なった。モネンシンの有る状
態又は無い状態の感染細胞をメチオニンの無い媒質内で
保温（１時間、３７°Ｃ）し、その後３６Ｓ−メチオニ
ンで短い時間（３０分）標識付けした（ラインｌ）。次
に、０５時間、１５時間及び３時間（それぞれライン２
．３及び４）低温メチオニン５ｍＭを含む媒地内で、標
識付けされた細胞を追跡した。

血清−セファロースＨＩＶ−２カラム上で抽出物を純化
し、標識付けされたタンパク質をポリアクリルアミド（
７５％）のゲル電気泳動により分析した。結果は、フル
オログラフに示されている。ｐ５５は、セクションＡ、
ライン１においてｇａｇ　（ウィルス内部構造タンパク
質遺伝子の前駆物質）を表わしている。

第９図　ＳＩＶの糖タンパク質の前駆物質３５Ｓ−メチ
オニン（２００μＣｉ／μ、４×１０６細胞／ｍｌ）、
３Ｈ−フコース（２００ＨＬＣ１／ｐＪ！　；　４　Ｘ
　ｌ　０６細胞／ｍｌ）及び”Ｃ−マンノース（２５Ｌ
ＬＣｉ／パ：４ｘ１０６細胞／ｍｌ）を用いて、ＳＩＶ
に感染した細胞ＨＵＴ−７８を標識付けした（１６時間
、３７°Ｃ）。感染した細胞（ラインＣ）及びＳＩＶを
含む媒地（ライン■）の抽出物を、血清−セファロース
ＨＩＶ−２カラム上で純化した。ＨＩＶ−２及びＳＩＶ
のタンパク質は免疫学的交差反応を呈するため、ＳＩＶ
のタンパク質のイムノブレシビテーション反応を行なう
ために、ＨＩ　Ｖ　−２に対し陽性の血清を用いた。全
ての標本を、ポリアクリルアミド（７５％）のゲル電気
泳動により分析した（「実験手順」参照）。さまざまな
ゲルのフルオログラフがホされている。ｇｐ３００ｓＩ
Ｖ及びｇｐ１４０ＳＩＶの電気泳動移動度は、ＨＩ　Ｖ
　−２のｇｐ３００及びｇｐ１４０の糖タンパク質のも
のと致する。ｇｐ１３０ｓＩＶは、ＨＩ　Ｖ　−２のｇ
ｐ１２５のものよりもやや高い移動度を有している。３
５Ｓ−メチオニンで４票識づけされたｐ５５はおそら＜
ＳＩＶのｇａｇの前駆物質である。

合成されたグリコシル化された８０Ｋｄのポリペプチド
は、粒状小胞体（ＲＥＲ）のグルコシダーゼにより急速
に脱グリコシル化されるｇｐ１５０という「糖タンパク
質の未成熟の前駆物質」の形成をひきおこす。このとき
環境（特にｐＨ）の変化は、ダイマー化をひきおこし、
ひいては、「ダイマー形態の中間前駆物質」であるｇｐ
３ｏｏを形成させる。ｇｐ３００はゴルジ体内に輸送さ
れる前に、ＲＥＲのマンノシダーゼにより切断される。

ｇｐ３００のその他の切断は、内側ゴルジ体及びトラン
スコルシ体へのフコース及びシアル酸残基の転移の前に
、ゴルジ体のマンノシダーゼにより行なわれる。最後に
、トランスゴルジ網（ＴＧＮ）の区画内を支配する酸性
ｐＨに比例して［成熟前駆物質ＪｐＧ１３５にタイマー
が解離させられる。ｇｐ１３５は、原形質膜内に輸送さ
れ、細胞プロテアーゼにより開割され、ＨＩ　Ｖ２の成
熟した外被糖タンパク質ｇｐ１２５及びｇｐ３６へと導
く。テユニヵマイシン（ＴＭ）は、ドリコール−Ｐ−Ｐ
−グリカン残基の組立てを抑制し、カスタノスバルミン
（Ｃａｓｔ、）及びデオキシノジリマイシン（ｄＮＭ）
はＲＥＲのグルコシダーゼを抑制し、デオキシマンノジ
リマイシン（ｄＭＭ）は、ＲＥＲ及びシスーゴルシ及び
内側ゴルジ内の切断マンノシダーゼを抑制する；モネン
シンはゴルジ体がらの分泌タンパク質及び膜の糖タンパ
ク質の輸送を抑制する。

例 夫狭土朋 ■−杯料 Ａｍｅｒｓｈａｍ社（Ａｍｅｒｓｈａｍ、イギリス）か
ら入手した、Ｌ１３５Ｓ））ヂオ＝ン（比活性。１００
０Ｃｉ／ｍｍｏＪ）　、　Ｌ−［６３−Ｈ）フコース（
比活性４５−７０　Ｃｉ／ｍｍｏＪ）　、　Ｄ−（６−
３Ｈ）グルコサミン（比活性　２０〜４０　Ｃｉ／　ｍ
ｍｏｌ）及びＤ−（Ｕ”Ｃ）マンノース（比活性　２０
０〜３ｏ。

ｍＣｉ　／　ｍｍｏＪ）。

ブロモコンデユリ１〜−ル、カスクノスパルミン、１−
デオキシマンノジリマイシン（ｄＭＭ）１−デオキシノ
ジリマイシン（ｄＮＭ）、スウエインソニン及びチュニ
カマイシンは、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉ
ｍ社（ドイツ連邦共和国、マンハイム）から入手した。

エンドβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＨは、Ｃａ
ｌｂｉｏｃｈｅｍ社（米国、ザンディエゴ）から入手し
た。

アンフォリン（Ａｍｐｈｏｌｉｎｅ）はＰｈａｒｍａｃ
ｉａ　（スウェーデン、Ｕｐｐｓａｌａ）からのもので
ある。

ＩＩ−ウィルス及び細胞 タイプ１のヒト免疫不全症ウィルスのＨＩＶＩＢＲＬ１
分離片［Ｍｏｎｔａｇｎｉ　ｅｒ他により記述されてい
るもの、１９８４年）、タイプ２のヒト免疫不全症ウィ
ルスの１（ＩＶ−２ＲＯ，分離片（Ｃ１ａｖｅｌ他によ
り記述されているもの、１９８６ａ）及び、ザル免疫不
全症ウィルスＳＩＶ□８ｃ１４□（Ｄａｎｉｅｌ他によ
り記述されているもの、１９８５年）を、本研究におい
て用いた。

さまざまな細胞系統及びヒトリンパ球を１０％（ｖ　／
　ｖ　）のウシ胎児血清を含むＲＰＭ１１６４０の懸濁
液媒質（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社、フランス、Ｃｅｒｇｙ
−Ｐｏｎｔｏｉｓｅ）内で培養した。

ＨＩＶに感染した細胞培養物に対し２　ｊＪｇ　／　ｍ
ｌのポリブレン（ｐｏｉｙｂｕｒｅｎｅ）　（Ｓ　Ｉ　
Ｇ　Ｍ　Ａ　）を付加した。クローンの細胞ＣＥＭ１３
は、ヒトリンパ球様細胞の系統ＣＥＭから生まれ（ＣＣ
Ｌ第１１９号としてＡＴＣＣに預託）、高レベルで抗原
Ｔ４を表現する。ＨＩＶ−１，、Ｕ分離片又はＨＩＶ２
　ＲＯＤ分離片での感染から５日後、約８０〜９０％の
細胞がウィルス粒子を生成し、細胞の空胞化及び小サイ
ズのシンシチウム（合胞体）の出現に相当する細胞変性
効果により識別することができる。

細胞系統ＨＵ　Ｔ　−７８は、Ｓ　Ｉ　Ｖｍａｃ１４゜
の複製に対しきわめて許容的な（Ｄａｎｉｅｌ他、］、
　９８５　）陽性ヒトリンパ球Ｔ４のもう１つの細胞系
統である（Ｇａｄｚｄａｒ他、１９８０年）。健康な献
血者の血液の末梢リンパ球を、ウシ胎児血清１０％を補
完したＲＰＭＩ−１６４０培質内で００２％（Ｗ／Ｖ）
のフィトヘムアグルチニン（植物性血球凝集素の分画Ｐ
　（ＤＩＦＣＯ１米国デトロイト）で、３日間刺激した
。次に、Ｔ細胞の成長因子を１０％（ｖ、／ｖ）（ＴＧ
ＧＦ、Ｂｉｎｔｅｓｔ）含むＲＰＭＩ−１６４０培質上
で細胞を培養した。ＨＩＶ−２での感染の後、リンパ球
を、１０％（ｖ／ｖ）のＴＣＧＦ及び２％ｇ／ｍｌのポ
リブレンが存在する中で培養した。

ｌ１ｌ−細胞の代謝性標識イ・け タンパク質の代謝性標識づけのために、感染した細胞を
、■、−メヂ才ニンも血清も含まないものの２００１４
　Ｃｉ／　ＪのＬ　（３５Ｓ）メチオニンで補完された
Ｍ　Ｅ　ＩＶＴ培地（ｋｌｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓ５ｅｎｔ
ｉａ１．　Ｍｅｄｉｕｍ最小必要培地という英語の略）
内で３７°Ｃで１６時間保温した。糖タンパク質の代謝
性標識づけのためには、感染した細胞を、血清もグルコ
ースも含まないものの２００　ＬＬｃｉ／ｍｌのＨ３−
フコース及び２００　（、ＬＣｉ／　ｍｌのＤ−［６−
Ｈｌ−グルコサミン又は２５ｚｉＣｉ／ｍｌの”Ｃ−マ
ンノースで補完されたＭＥＭ培地内で３７°Ｃて１６時
間保温した。

１■−細胞とウィルス抽出物 １０７の細胞に相当する細胞沈渣を次の緩衝液１００μ
の中で再度懸濁させた。ｐＨ７，６のＴｒ　ｉ　５−Ｈ
Ｃ，Ｃ１０ｍＭ、　ＮａＣｊ２　　］　５５ｍＭＥ　Ｄ
　Ｔ　Ａ　　ｌ　ｍＭ、　Ｐ　Ｍ　Ｓ　Ｆ　　０　、　
２　ｍＭ、アプロチニン１００単位／Ｊ　（Ｉｎｉｐｒ
ａ１社、ＣＨＯＡＹ）。

その後、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００を２％（ｖ　／　ｖ
　）含む同じ緩衝液１００１１Ｊ！を加えた。１０分間
１２０００ｇて細胞抽出物を遠心分離し、上澄みを使用
まで８０°Ｃて保存した。ウィルス抽出物の調製のため
には、感染した細胞ＣＥＭの清澄させられた上澄み１ｉ
あたり１０×溶解緩衝液（ｐＨ７，６のＴｒ　ｉ　５−
ＨＣ，Ｃ１００ｍＭ、　ＮａＣｊ２　１．　５Ｍ、　　
Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　　１０ｍＭ、　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１
００１０％（ｖ／ｖ）、アブロヂニン１００単位／ｍｌ
）を１、ＯＯｄ加えた。これらの調製物を以下のように
使用した。

週製 ＨＩＶ−２に対し血清陽性の患者の血清の免疫グロブリ
ンを５０％の（ＮＨ４＋２ＳＯ４で沈殿させ、リン酸ナ
トリウム（ｐＨ８，０）２０ｍＭ中に溶解させ、次に２
０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ８，０）でのン容肖１
こよりセルロースカラムＤＥＡＥ　（ＤＥ　　５２、Ｗ
ｈａｔｍａｎｊ上で純化した。

こうして純化されたこれらの免疫グロブリンは、９０％
純粋と判断された。次に、Ｂｅｒｇにより記述されてい
る（　１．９７７　）技法に従いＣＮＢｒにより活化さ
れた５ＥＰＩＩＡＲＯ３Ｅ■ＣＬ４Ｂ上に、抗体を結合
サセタ。５ＥＰＨＡＲＯ３Ｅ（ｉｌｉ）　ＣＬ４Ｂ　　
Ｉ　Ｊ　＋：　−）　キ２　ミ’）ダラムのＩｇＧを結
合させた。この免疫吸着剤は「血清−セファロースＨＩ
Ｖ−２Ｊと呼ばれる。

Ｖｌ−イムノアフィニティカラム上のＨＩ　Ｖ−２タン
ガノｊ１以逍企 ＨＩ　Ｖ　−２を生成する細胞ＣＥＭの細胞抽出物をま
ず、連結用緩衝液（ｐＨ７，６のＴｒｉｓＨＣｆｆ　　
２０ｍＭ、ＫＣｇ　　５０ｍＭ、ＮａＣｆ２１５０ｍＭ
、　ＥＤＴＡ　　１ｍＭ、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００１％
（ｖ／ｖ）、グリセロール２０％（ｖ／ｖ）、メルカプ
トエタノール７ｍＭ、ＰＭＳＦ　　０．２ｍＭ、アブロ
ヂニン１００単位／ｉ）２体積内で希釈し、その後１体
積の［血清−セファロースＨＩＶ２」と共に保温する。

ＨＩＶ−２ウイルスを生成する細胞の上澄みを、この上
澄み１体積あたり濃縮連結用緩衝液（１０倍）１０分の
１が加えられる点を除いて細胞抽出物の場合と同し要領
て処理した。連結段階を１晩行ない、次に連結用緩衝液
の中てカラムを充分に洗浄した。カラム上に結合された
タンパク質を、電気泳動用緩衝液（ｐ＋ｑ６８のＴｒｉ
ｓ−ＨＣ，１２１２５ｍＭ、ＳＤＳ１％（ｗ／ｖ）、尿
素２Ｍ、クリセロール２０％、β−メルカプトエタノー
ル１％）中で沸とうさせることにより、溶離させた。溶
離されたタンパク質を、０，２％（Ｗ／Ｖ）ではなく０
．１％のビス−アクリルアミドと尿素６Ｍを含む７５％
のＳＤＳ−ポリアクリルアミドの電気泳動用ゲル上で分
析した。

ｖｎ−五東箇ｌｌ詠働 アフィニティ力ラムから？容離されたＨＩＶ−２の糖タ
ンパク質を前述のようにポリアクリルアミドのゲル電気
泳動により分析し、ウィルス糖タンパク質を含むゲルの
領域を、予め設定された分子量のタンパク質標識（ＢＲ
Ｌ）の位置を基準にして切断した。

溶離用緩衝液（Ｍ　ａ　ＨＣＯ２０１Ｍ、ＥＤＴＡ　　
０．５ｍＡ、ＳＤ３　０．０５％（ｗ／ｖ）、ＰＭＳＦ
　　０．２ｍＭ）内で４°Ｃで１６時間の保温により、
糖タンパク質を溶離した。こうして得られた糖タンパク
質の両分を凍結乾燥させ、使用するまで冷蔵庫に保存し
た。

■−二次元ゲル電気泳動 二次元ゲル電気泳動は、以下のような修正を加えた上て
、０°Ｆａｒｒｅｌ　（１９７５）が記述している方法
により行なった　すなわち、［血清−セファロースＨＩ
　Ｖ−２Ｊカラム上に結合されたＬ　（”’Ｓ）−メチ
オニンにより標識づけされたタンパク質を、前述のごと
く電気泳動用緩衝液内で沸とうさせることにより溶離さ
せ、その後で、尿素９．５Ｍ、メルカプトエタノール８
％（ｖ／ｖ）、ｐＨが６５〜９のアンフォリン１６％（
ｗ／ｖ）、ｐＨが３〜１０のアンフォリン０．４％（ｗ
／ｖ）及びアブロヂニン１００単位／ｉを含む緩衝液１
体積中に希釈させた。

Ｓ　３５−メチオニンで標識づけされた、糖タンパり質
ｇｐ３００、ｇｐ１４０及びｇｐ１２５の次元ゲル電気
泳動分析から得られた分解図は、ｇｐ３ｏｏ及びｇｐ　
１４０が類似していることを示している。これら２つの
タンパク質は、ゲル上で全く異なる沈着を示すが、６８
〜７８のｐＨについて同じような等電点（ｐＩ）を有し
ている。これらの結果は、第２図に報告されている。タ
ンパク質ｇｐ１４０とｇｐ３００の間のこの類似性は、
ｇＰ３００がｇｐ１４０のタイマ形で有ることを示唆し
ている。

ｇｐ　ｌ　２５は、感染細胞においてもウィルス粒子に
おいても同様に異質性が低く、６２から６５まてのｐＨ
値で等電点に移動する。

感染した細胞内には、７．２〜７３のｐＨ値に対して等
電点を有するタンパク質ｇｐ１２５の微量小単位が存在
していた。このカテゴリのタンパク質は、ＨＩ　Ｖ　−
２ヴイリオン（ウィルス粒子）には存在せず、このため
これは最終的に構成されたのではない糖タンパク質であ
ると思われる。

成熟したｇｐ１２５の酸性は、外被糖タンパク質の熟成
の際に付加された炭水化物レベルのシアル酸によるもの
と考えられる。

外被糖タンパク質ｇｐ３００は、イオン性洗剤（ＳＤ３
　１％）及び非イオン性洗剤（Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ１００
２％）、尿素（２−６Ｍ）、強塩（Ｎ　ａ　Ｃ（２ＬＭ
）ならびに還元剤（β−メルカプトエタノル　１％）に
対し耐性をもつため、きわめて安定性がある。しかしな
がら、ｇｐ３ｏｏが酸性ｐ　Ｈの媒質内で解離され、２
つの糖タンパク質ｇｐ１４０を形成しつるということを
立証することができた。これらの実験においては、イム
ノアフィニティカラム上に結合されたタンパク質を４〜
７に変化するｐ　Ｉｉ値の酢酸緩衝液内で保温した。次
にこれらの標本を、ポリアクリルアミドのゲル電気泳動
により分析した。結果が報告されている第３Ａ図は、標
本がｐＨ４で保温された場合、ｇｐ１４０の位置に相当
する帯に、ｇｐ３００の帯が変換されることを示してい
る。その他の実験は、前述のように、予備的電気泳動用
ゲルから得られたｇｐｇｏｏの純化された調製物を用い
て実施された。ｇｐｇｏｏの変性されたこのような標本
を、ｐＨ６，０の酢酸緩衝液中で完全に解離させた。こ
れらの試験の結果は、第３Ｂ図に報告されている。純化
された糖タンパク質ｇｐ３００の解離の効率の良さは、
ｐＨの低下及び凍結乾燥された標本中のＳＤＳ残基の存
在によるものと思われる。というのも、カラム上に結合
された未変性糖タンパク質ｇｐ３００は、ｐ、　Ｈ５よ
りも高いｐＨ値では同し緩衝液中でも解離不能であるか
らである。

Ｔｒｊｓ−ＨＣｎ緩衝液中では、解離の効率はさほど良
（ない。ｐＨ７，５では、ｇｐ１４０の形でのｇｐｇｏ
ｏのわずかな解離しか見られないが、それでもこれはｐ
Ｈ値の低下に伴って増大する。ｐＨ６，’０のＴｒｉｓ
緩衝液中では、解離は第３Ｃ図に示されているとおり、
約８０％であった。純粋ｇｐ３００の解離の場合、他の
酢酸又はＴｒｉｓ−Ｈ（１２緩衝液中には、ｇｐ１４０
以下のいかなるタンパク質も検出できなかった（実験は
、１５％のポリアクリルアミドゲル上で行なわれた）。

これらの結果は、ｇｐｇｏｏが、それ自体ＨＩＶ−２の
外被槽タンパク質の前駆物質であるｇｐ１４０のタイマ
ー形であることを示している。従って、外被槽タンパク
質の構成に際しては、ｇｐ１４０の２つの分子がｐＨ依
存の融合メカニズムに参加しているものと思われる。

例２−ＨＩＶ−２の糖タンパク　のオリゴ糖側Δ性道ｊ
せ エンドβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＨ（ｅ　ｎ
　ｄ　ｏ　　Ｈ）での消化により、窒素上に結合された
オリゴ糖の存在なＨＩＶ−２の糖タンパク質について立
証することができた。アフィニティークロマトグラフィ
及び予備的電気泳動により、ｇｐｇｏｏ、　（ｇｐ１４
０、ｇｐ１２５）の混合物及びｇｐ１２５単独、を純化
した（実験手順参叩）。ｇｐ１４０へのｇｐｇｏｏの解
離に有利に作用しない消化緩衝液ｅｎｄｏ　　Ｈ内に、
凍結乾燥された標本を懸濁させた。

ｅｎｄｏ　　Ｈでの消化後、ｇｐ、３００の電気法動移
動度は、２００−２５０Ｋｄのタンパク質のより低い移
動度と一致する。ｇｐ　１４０に解離されたｇｐｇｏｏ
の小画分を消化させると、８０Ｋｄのタンパク質が生成
された。結果は、第４図のセクションｇｐ３００に報告
されている。

ｇｐ、１４０、ｇｐ１２５の混合物を含む標本をｅｎｄ
ｏ　　Ｈで消化さぜると、９０及び８０Ｋｄのタンパク
質が得られた。一方この消化に際し、単独のｇｐ１２５
は９０Ｋｄのタンパク質に変換された。（第４図のセク
ションｇｐ１４０／１２５及びｇｐ１２５参昭）。ｇｐ
１４０及びｇｐ１２５のｅｎｄｏ　　Ｈての消化は、そ
れぞれ８０Ｋｄ及び９０Ｋｄの分子量の生成物を導く。

実際、１４ｃｍマンノース及び３Ｈ−フコースで細胞を
代謝的に標識付けすることにより、ｇｐｇｏｏ、ｇ　ｐ
　１４．０及びｇ　ｐ　］−２５内にマンノスが取り込
まれるのに対し、フコースをとり込むことができるのは
ｇｐｇｏｏとｇｐ１２５だけであったということが示さ
れた（第５図）。フコース残基は通常、小胞体及びゴル
ジ体の凝集酵素の作用の後、グルコシル化ザイクルのさ
らに進んだ段階においてオリゴ糖鎖の上に転移させられ
る。

（Ｋｏｒｎｆｅｌｄ及びＫｏｒｎｆｅｌｄ　、　　１９
８５　；　Ｆｕｈｒｍａｎｎ他、１９８５）。

これらの理由から、ｇ　ｐ　１．４０に比べてｇｐ１２
５の６ｎｄｏ　　Ｈでの消化に対する耐性が低いのは、
マンノースタイプのオリゴ糖のいくつかの側鎖が、外被
槽タンパク質の形質転換に際して複雑なオリゴ糖に変換
するせいであると思われる（Ｋｏｒｎｆｅｌｄ　＆　Ｋ
ｏｒｎｆｅｌｄ　、　１９８５　）　、　ｇ　ｐ１４０
がフコース残基を全く含んでいないという事実は、それ
がｇ’　ｐ　３００及びｇｐ１２５の前駆物質を構成す
るという事実と合致している。

窒素に結合されたオリゴ糖の担体である糖タンパク質は
全て、アスパラギン残基上のオリゴ糖鎖のブロック転移
の触媒として作用するタンパク質−オリゴ糖トランスフ
ェラーゼにより実現される反応のおかげて、そのオリゴ
糖鎖ＧρＣ９Ｍａｎ９−ＧｕｃＮＡｃｚ−ｐｐ−Ｄｏｌ
　　１ｃｈｏｌを受りとる（Ｋｏｒｎｆｅｌｄ　＆　Ｋ
ｏｒｎｆｅｌｄの参考文献参照、１９８５年）。ヂュニ
カマイシンは、脂質による結合されたオリゴ糖の組合せ
における第１の段階であるＮ−アセチルグルコサミンビ
ロフオスフォリルドリコールの生成を抑制することによ
り、窒素に結びつけられたかかるグリコシル化を阻止す
る（ｌｊ他、１９７８年：　Ｈｅ１ｆｅｔｚ他、１９７
９年）。２Ｈｇ／ｍｌのヂュニカマイシンの存在する中
で、感染された細胞内のＨＩＶ−２の外被糖タンパク質
の、窒素に結びつけられたグリコシル化は全て阻止され
る。この結果は、ウィルス糖タンパク質ｇｐ３ｏｏ、ｇ
ｐ１４０、ｇｐ１２５内の３Ｈ−グルコサミンの取込み
が無いことによって実証されている（第６図）。これら
の実験条件において、タンパク質合成はそれても、チュ
ニカマイシンにより処理された感染細胞において影響さ
れなかった。３５Ｓ−メチオニンの同位体で標識づけさ
れたこのような培養物は、広い帯状に移動する見かけ分
子量２００及び８〇＝９０Ｋｄの２つの主要なタンパク
質を示す。これらのタンパク質の分子量は、ｇｐ３ｏｏ
、ｇｐ１４０及びｇｐ１２５のｅｎｄｏＨによる消化の
生成物と一致し、２００Ｋｄ、８Ｏ−９０Ｋｄの分子量
のタンパク質が、ＨＩＶ−２の外被糖タンパク質のグリ
コシル化されていない形に相当するということを示唆し
ている。

８Ｏ−９０Ｋｄというこのタンパク質の分子量は、その
核酸配列から見積ったグリコシル化されていないＨＩＶ
−２のエンベロープの前駆物質の予惣分子量に一致する
（Ｇｕｙａｄｅｒ他、１９８７年）。２００Ｋｄの糖タ
ンパク質は、おそらくグリコシル化されていないエンベ
ロープ前駆物質のタイマー形であろう。これらの結果は
、ＨＩＶ−２の外被タンパク質が、窒素に結びつけられ
た多糖鎖を含んでいることを裏づけでいる。グリコシル
化の抑制の他に、チュニカマイシンでの処理は、外被糖
タンパク質の形成及び輸出を抑制する。というのも、８
０Ｋｄ〜９０Ｋｄのタンパク質は、第６図、ラインＳＮ
が示しているように、細胞外媒質内で明らかにされなか
ったからである。

これらの実験の結果により、我々はＨＩＶ−２の外被タ
ンパク質のグリコサツカリド鎮がゴルシ体を通しての細
胞輸送に関与しでいると思われるということを仮恕する
ことができる。チュニカマイシンにより処理された細胞
の細胞外媒質内にグルコシル化されていない形の外被タ
ンパク質が存在しないのは、場合によってはその減成が
急速であるぜいかもしれない。数多くの報告書が、一般
に１つのタンパク質のグリコシル化されていない形は、
そのグリコシル化された形に比べてプロテアーゼの作用
に対しより敏感であるということを示唆している（Ｏ１
ｄｅｎ他、１９７８年：　Ｓｃｈｗａｒｔｚ他、１９７
６年）。これらの結果と一致して、チュニカマイシンの
中で培養された３ｊＳ−メチオニンで標識付けされた細
胞中に存在する低分子量のタンパク質は、おそらくグリ
コシル化されていない外被タンパク質の部分的減成の生
成物を表わすものである（第６図）。

糖タンパク質のアスパラギン（ＧＩ２ｃ３Ｍａｎ９Ｇ℃
０ＮＡＣ２）により結合されたオリゴ糖は、タンパク質
へのイ」着後、広範な変更又は形質転換を受ける（Ｋｏ
ｒｎｆｅｌｄ及びＫｏｒｎｆｅｌｄ　、　　１９８５参
照）。酵素によるグルコース及びマンノース末端基の除
去反応は、粒状小胞体（ＲＥＲ）のルーメン（管腔）内
及びゴルジ体の中で特異的マンノシダーゼ及びグルコシ
ダーゼの作用により起こる。

グルコシダーゼ及びマッシダーゼの特異的抑制因子を用
いることにより、糖タンパク質のオリゴ糖鎖の形質転換
に介入することができる（Ｓｃｈｗａｒｚ及びＤａｔｅ
ｍａ、１９８４、Ｆｕｈｒｍａｎｎ他、１９８５、によ
り報告されている。）これらの実験において、ＨＩＶ−
２の糖タンパク質の前駆物質の局在化を研究し、又エン
ベロープの前駆物質の形質転換におけるグリコシル化の
役目を検討するため、さまざまな接合抑制因子を用いた
。使用した抑制因子は次のようなものである・グルコシ
ダーゼＩを抑制する植物のアルカロイド、カスタノスパ
ルミン（Ｓａｕｌ他、１９８３年）、グルコシダーゼ■
及びＩＩを抑制しグルコース末端基の除去を行なうグル
コースの相似物、デオキシノジリマイシン（ｄ　Ｎ　Ｍ
　）　（ｌｅｍａｎｓｋｙ他、１９８４年）、マンノシ
ダーゼによる触媒反応を抑制するマンノースの相似物、
デオキシマンノジリマイシン（ｄＭＭ）ｆＦｕｈｒｍａ
ｎｎ他、１９８４年）、グルコシダーゼＨを抑制するブ
ロモコンデユリトール（６−ブロモ３．４．５−ｔ−リ
ヒドロキシシクロヘツクス１−エン）　（Ｄａｔｅｍａ
他、１９８２年）、ゴルジ体のマンノシダーゼＩＩを抑
制するインドールイジンアルカロイド、スウェインソニ
ンｆＴｕｌｓｉａｍ他、１９８２年）。

さまざまな接合抑制因子及び細胞内及び細胞外タンパク
質の無い状態又は有る状態で、３５Ｓ−メチオニンの同
位元素により標識づけされたＨ　Ｉ　Ｐ２に感染した細
胞を、アフィニティクロマトグラフィで純化させた（第
７図）。感染した細胞がｇｐ３００、ｇ　ｐ　］、　４
０及びｇｐ１２５を含むのに対し、細胞外媒質内ではｇ
ｐ１２５のみが見られる、ということを確認した。（結
果は、第７図、セクション「細胞」及びＳＮ、ラインＴ
に報告されている。）カスクノスパルミン又はｄＮＭて
処理された細胞においては、通常の割合のｇｐ３００、
ｇｐ１２５の不在そして恐らくはｇｐ１４０のグリコシ
ル化された形に相当する１５０Ｋｄの少量のタンパク質
を認知した。従って、ＨＩＶ−２の核のタンパク質であ
るｐ２６の生成にもかかわらず、細胞外媒質内ではいが
なるｇｐ１２５も検出されないため、かがる細胞におい
て外被糖タンパク質の形質転換は阻止された（第７図、
ラインＣａｓ　ｔ、及びｄＮＭ）。

これらの結果は、外被糖タンパク質の前駆物質のオリゴ
糖鎖のグルコース末端残基の除去が、その形質転換及び
細胞プロテアーゼによる卵割にとって必要であることを
示している。グルコシダーゼＩＩに対して作用するブロ
モコンデユリトルは、ｇｐ１２５の通常の生成をも７０
〜９０％抑制したが、ｇｐ１４０及びｇｐ３００の割合
は通常どおりにとどまっていた（第７図、ラインＢｒｏ
、）。カスタノスパルミン及びｄＮＭ（これらはグルコ
ース末端残基の除去を抑制する）とは逆に、ブロモコン
デユリトールでの処理（これは２つのグルコース内部残
基の除去を抑制する）は、ＨＩ　Ｖ　−２の外被糖タン
パク質の形質転換を完全に阻止しない。実際、細胞内及
び細胞外媒質内には、わずかな割合でｇｐ１２５が検出
できる。この最後の結果は、２つのグルコース内部残基
を除去しなくても低レベルのマンノース除去が起こりつ
るということを示唆している。

マンノシダーゼの抑制因子であるスウェインソニン及び
ｄＭＭは、ｇｐ３００、ｇｐ１４０又はｇ　ｐ　１．２
５の細胞内割合における顕著な変更を生み出さなかった
が、ｇｐ１２５の細胞外レベルは、対照細胞における相
応する形状よりも５０％低いものであった（第７図、ラ
インＳｗ及びｄ　Ｍ　Ｍ　）。従って、オリゴ糖鎖は脱
グルコシル化を一回しか受しづていないのに、糖タンパ
ク質の前駆物質はタンパク質分解酵素のおかげで卵割さ
れ、ｇｐ１２５に類似するもののより多くのマンノース
を含むタンパク質を生成し、このことは恐らく、ｇｐ１
２５の細胞輸送に影響を及ぼしている。ｄＭＭが存在す
る中で生成された細胞外槽タンパク質の分子量は、抑制
因子の無い状態で生成されたタンパク質の分子量よりや
や大きい。これは、ｄＭＭで処理された細胞により合成
された細胞外タンパク質のマンノース残基の濃度がより
大きいぜいであると思われる（第７図、セクションＳＮ
）。

以上のことから、ＨＩＶ−２の外被糖タンパク質の形質
転換に対する除去酵素抑制因子の効果は、ＨＩＶ−２の
ｐ２６の合成及び生成が全く影響を受けていないことか
らみて特異的である、という結論をひき出すことができ
る（第７図、セクションＳＮ）。

ＨＩ　Ｖ　−２の糖タンパク質の細胞内形質転換を検討
する目的で、トレーサを用いた実験（パルス−チエイス
）を実施した。ＨＩ　Ｖ　−２に感染した細胞を、１５
分間放射性３５Ｓ−メチオニンにより急速に標識付けし
、次に、０５時間、１５時間及び３時間トレーサの取込
みを追跡（チエイス）した（第８図、対照）。ｇｐ１４
０は、標識付けから１５分後に最初に検出されたタンパ
ク質である。放射性トレーサの取込みの追跡中、ｇｐ３
００は半時間後に検出てきたが、ｇｐ１２５は１５〜３
時間後にしか検出てきなかった。ｇｐ３００がｇｐ１４
０の合成後に観察されること、そしてｇｐ１２５がｇｐ
３００の形成後にしか検出されないこと（第８図、ライ
ン１〜４）は、ダイマー化が成熟に達した糖タンパク質
ｇｐ１２５へのオリゴ糖の形質転換に必要な１つの中間
段階であることを示唆している。この示唆は、外部グル
コース残基及び多糖鎖の削除を抑制するカスタノスパル
ミンの使用によって裏付けられる。カスタノスバルミン
が存在する中で３０分標識付けしだ後（パルス）、１５
０Ｋｄのタンパク質がｇｐ３ｏｏで検出される（第８図
、Ｃａｓ　　、ライン１）。１５０Ｋｄのタンパク質は
、ｇｐ１４０に相応しうる。第１の前駆物質の分子量が
あまり増加していないのは、オリゴ糖鎖の中にグルコー
ス残基が存在するせいである。従ってＨＩ　Ｖ−２に感
染した細胞内で合成されたｇｐ１４０は、グルコース残
基の無い糖タンパク質の前駆物質を表わしている。この
結果と一致して、１５０Ｋｄ（ｇＰ１５０）のタンパク
質は、まだ成熟に達していないＨＩ　Ｖ　−２の第１の
外被糖タンパク質を表わしている。対照細胞中のグルコ
ース残基の除去は、小胞体内の糖タンパク質の前駆物質
の同時並進転移の間又はその直後に起こる急速な形質転
換に相当する（Ｌｅｍａｎｓｌｙ他、１９８４年）。カ
スタノスパルミンが存在する中での３０分の標識付け（
パルス）と３時間のトレーサ取込み追跡（チエイス）の
後、ｇｐ１５０のレベルは徐々に低下し、一方ｇｐ３０
０の量は増大する（第８図、Ｃａ５ｔ、、ライン１〜４
）。このような実験条件の下で、前駆物質が開割してｇ
ｐ１２５を与えることはなかった。

ＨＩ　Ｖ　−２の外被糖タンパク質のもう１つの特徴づ
けは、ゴルシ体から原形質膜へのタンパク質の輸送′を
抑制し、場合によっては中央ゴルジ体のシスターネレベ
ルへのタンパク質の輸送を阻止するカチオンイオノコア
であるモネンシンを用いることによって、放射性トレー
サの取込みに関する実験（パルスチエイス）の際に行な
われた（Ｔａｒｔａｋｏｆｆ　＆　ＶａｓＳａｌｊ、１
９７７年：　Ｊｏｈｎｓｏｎ　＆Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅ
ｒ　、　１９８０年；　５ｔｒｏｕｓ　＆　Ｌｏｄｉｓ
ｈ　。

］９８０年：　Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ他、１９８３年）。

モネンシンの無い状態及び有る状態でＨＩＶ−２に感染
した細胞を３０分間放射性トレーサで標識づけしくパル
ス）、次に１〜レーサの取込みを０５時間、１５時間及
び３時間（第８Ｂ図）追跡した。モネンシンのある状態
で、ＨＩＶ−２に感染した細胞は、通常レベルのｇｐ１
４０ならびにそのダイマー形を合成した。逆に、モネン
シンにより処理された細胞内ではｇｐ１２５の痕跡は全
く検出てきなかった。トレーサのを込みを１．５〜３時
間追跡した後（チエイス）、モネンシンで処理された細
胞は、おそらくタイマーの前駆物質の解離生成物である
１３５Ｋｄのタンパク質（ｇｐ１３５）を蓄積した。ｇ
ｐ１４０に比べて幾分か低いｇｐ１３５の分子量は、Ｒ
ＥＲ及びゴルジ体のマンノシダーゼの作用によるいくつ
かのマンノース残基の除去によるものである。次にこの
ｇｐ１３５は、原形質膜まで輸送され、細胞プロテアー
ゼにより開割されつる。モネンシンによるタンパク質の
輸送の抑制は、ゴルジ体の「トランス」部分（１−ラン
スゴルジ）内で糖タンパク質ｇｐ１３５を阻止する。モ
ネンシンにより処理された細胞内には、細胞内であろう
と細胞外であろうと成熟した外被糖タンパク質は全く検
出されないのに対し、核（コア）のタンパク質ｐ２６は
合成され排出される。

ＨＩＶ−２の外被糖タンパク質のヌクレオチド配列は、
ＳＩＶのものと著しい相同性を示す（アミノ酸の７５％
が同一）　（Ｇｕｙａｄｅｒ他、１９８７年：　Ｃｈａ
ｋｒａｂａｒｔｉ他、１９８７年：　Ｆｒａｎｃｂｉｎ
ｉ他、１９８７年）。このような理由から、ＳＩＶに感
染した細胞内にも外被糖タンパク質のダイマー化が検出
されうるか否かを見極めるため研究が行なわれた。

ＨＩ　Ｖ−２及びＳＩＶのタンパク質ｇａｇ、ｐｏ、ｃ
及びｅｎｖが抗原性交差反応を呈するかぎりにおいて、
ＨＩＶ−２のタンパク質に対する特異的抗体を含むイム
ノアフィニティカラム上でＳＩＶのタンパク質を純化し
た。第９図は、ＳＩＶに感染した細胞が、ＨＩ　Ｖ　−
２に感染した細胞内で合成されたものと類似する高分子
量の３つのタンパク質（ずなわちｇｐ３ｏｏ、ｇｐ１４
０及びｇｐ１３０）を合成することを示している。ＳＩ
Ｖに感染した細胞内に存在する糖タンパク質が糖タンパ
ク質であるという証拠は、４Ｃ−マンノース及び３Ｈ−
フコースでのアイソタイプ標識付けによって得られた。

これら３つのタンパク質はマンノースを取り込んだが、
フコスを取り込んだのはｇｐ３００／ＳＩＶとｇｐ１３
０／ＳＩＶだけてあった。ｇｐ３００／ＳＩＶとｇｐ１
４０／ＳＩＶは、細胞内タンパク質であるのに対し、ｇ
ｐ１３０／ＳＩＶは、細胞外＋＋ｉタンパク質である。

ｇ　ｐ　３００　／　Ｓ　Ｉ　Ｖ及びｇ　ｐ　１．３０
　／　Ｓ　Ｉ　Ｖはフコースを取り込むことができると
いう事実は、これらのタンパク質がｇｐｌ、４０／ＳＩ
Ｖの形質転換の生成物であるということを示している。

これらの結果は、外被糖タンパク質の前駆物質のタブレ
ット（ダイマー）形成が、ＨＩＶ−２及びＳＩＶのエン
ベロープの遺伝子の表現に特異的な特性であることを示
している。逆に、ＨＩＶｌの外被糖タンパク質がその形
質転換中にタイマー化を受けないと言うこともできる。

カスタノスパルミン又はｄＮＭの存在する中でＨＩＶ−
１に感染した細胞は、ＨＩＶ−２又はＳＩＶがそうであ
るように、エンベロープのタイマーを蓄積しない。

塗副 例が示しているように、当該発明者は、ＨＩＶ２の外被
糖タンパク質の形成プロセスを見極めることができ、窒
素に結合されたオリゴ糖鎖を含む糖タンパク質の合成に
おける独創的なメカニズムを実証した。ＨＩＶ−２の外
被糖タンパク質、つまり細胞外槽タンパク質ｇｐ１２５
及び膜間糖タンパク質ｇｐ３６は、共通の前駆糖タンパ
ク質から生まれる（Ｇｕｙａｄｅｒ他、１９８７年）。

本発明により報告されている予期せぬ要素は、ゴルジ体
内に輸送され形質転換されるために、糖タンパク質の前
駆物質には、相同のダイマーの形成が関与しているとい
うことである。外被糖タンパク質のダイマー化のメカニ
ズムは、まだ完全に明らかになっていない。本発明の枠
内で純化されたダイマーが酸性ｐ　Ｈ（ｐ　Ｈ６、０）
で解離されうるという事実はダイマー化がｐＨにより左
右されうることを示唆している。

当該発明者は、糖タンパク質の天然前駆物質中に存在す
るオリゴ糖鎖が基本的にダイマー形成のためのものでは
ないことを明らかにした。このことは、次の２つの実験
にあたって実証された。すなわち（１）ｅｎｄｏ　　Ｈ
での消化は、タイマを解離させることなく、その電気泳
動移動度を変更するに至る。（２）チュニカマイシンの
存在する中で、ＨＩＶ−２に感染した細胞は、グリコシ
ル化されず（８０−９０Ｋｄ）、ダイマーを形成しつる
（２００Ｋｄ）エンベロープ前駆物質を合成する。これ
らの結果は、ダイマーの形成が、エンベロープの前駆物
質のポリペプチド構造に固有の特性であることを証明し
ている。

カスタノスパルミンが有る状態又は無い状態でさまざま
な時間的間隔で採取された標本に基づき、放射性トレー
サを用いた短時間にわたる標識付け（英語で［パルス（
ｐｕｌｓｅｌ　Ｊ　）そしてその後のこのトレーサの洗
浄による除去と非放射性分子によるその置換の段階の実
験ならびに放射能の局在化の追跡（英語て［チエイス（
ｃｈａｓｅｌ　Ｊ　）　（第８図）は、糖タンパク質の
前駆物質のダイマー化が通常、グルコース樹脂の抑制の
直後に介入することを示している。グルコシダーゼは小
胞体の膜に結びつけられているため、このダイマー化は
ＲＥＲ内にて介入すると仮定することができる。カスタ
ノスパルミンが存在する状態では、タイマーはＲＥ　ｌ
’？の中に蓄積され、形質転換されない。しかしながら
グルコース残基が削除された場合、ＲＥＲのマンノシダ
ーゼの抑制はゴルシ体を通してのタイマー化された糖タ
ンパク質の形質転換を妨げない（第７図）。このことか
ら、ダイマー化された前駆物質のオリゴ糖鎖のグルコー
ス残基がそのＲＥＲからの排出を妨げていると仮定する
ことができる。これと一致して、場合によってはグルコ
シル化されたオリゴ糖が輸送の受容体に対する認識部位
の一部分を形成するという事実を原因として、ＲＥＲか
らゴルジ体への効果的な輸送のためにはグルコース残基
の切断が必要であるという仮定を立てることができる（
Ｌｏｄｉｓｈ　＆　Ｋｏｎｇ、１９８４年、Ｌｅｍａｎ
ｓｋｙ他、１９８４年）、又、グルコースの抑制は、ダ
イマー化された前駆物質が正しい機能的形態をとること
ができるためには重要なことであるということも同様（
こ可能である（Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ他、１９８４年
）。この機能的形態は、切断マンノシダーゼの作用に有
利に働く。

これらの結果を考慮して、当該発明者は、ＨＩ　Ｖ　−
２の外被糖タンパク質の形質転換の概略図を提示した（
第１Ｏ図）。外被糖タンパク質の前駆物質のポリペプチ
ド構造の推定サイズは、約８０Ｋｄである（第４図及び
第６図）。オリゴ糖鎖はドリコールｐ−ｐからエンベロ
ープ前駆物質（８０Ｋｄ）の方へ、おそらくアクセプタ
として機能１−るアスパラギンクイブのアミノ−酸残基
上に転移される（Ｋｏｒｎｆｅｌｄ　＆　Ｋｏｒｎｆｅ
ｌｄ、１９８５年）。チュニカマイシンはドリコール−
ｐ−ｐ及びグリカンの組合せを抑制し、このため８０Ｋ
ｄのタンパク質はグルコシル化されない。８０Ｋｄのタ
ンパク質にオリゴ糖鎖を伺加すると、外被糖タンパク質
（ｇｐ１５０）の第１の前駆物質が得られることになる
。この前駆物質は、この状態のままで存在することもて
きるし、又逆に感染細胞内には存在しない可能性もある
。これは、多糖鎖の付加及びグルコース残基の切断がお
そらく前駆物質の翻訳の間に起こるからである。いずれ
にせよ、ｇｐ１５０は急速に脱グルコシル化され、ｇｐ
１４０に達する。この段階で環境内におそらくはｐＨレ
ベルでの差異は、ｇｐ１４０　２分子の融合によるダイ
マーの形成を導くことになろう。このとき、結果として
得られるｇｐ３００はＲＥＲのマンノシダーゼにより切
断され、ゴルシ体へと輸送されうる。カスタノスパルミ
ン又はｄＮＭが存在する中では、ｇｐ１５０はダイマー
化されＲＥＲ内に蓄積される。このダイマーはグリコシ
ル化されているため、形質転換されない。ただし、この
ダイマーは、脱グリコシル化された形で存在するかぎり
ゴルシ体内へと輸送されうる。

ｄＭＭによるＲＥＲのマンノシダーゼの抑制は、タイマ
ー化された前駆物質の獲得を阻止しない。

ゴルジ体内では、ｇｐ３００は、おそらくは小胞輸送に
より異なる区画を通過するｆＧｒｉｆｆｉｔｈｓ　＆Ｓ
ｉｍｏｎｓ、１９８６年）。この輸送の間、オリゴ糖鎖
は、シアル酸及びフコースといったその他の糖を付加す
る前にゴルジ体のマンノシダーゼにより切断される。フ
コースの取込みは、３Ｈ−フコスてのｇｐ３００のアイ
ソタイプ標識付しりにより実証された。シアル酸の取込
みは、さまざまな糖りンバク質内の末端基であるＮ−ア
セチルノイラミン酸を加水分解することのできる酵素で
あるノイラミダーゼを用いたｇｐ３００の消化により間
接的に実証された（Ｐｅｙｒｉｅｒａｓ他、１９８３年
）。

ＨＩ　Ｖ　−２のｇｐ３００は、タイマーの電気泳動移
動度の多大な減少が示しているように、ノイラミダーゼ
で消化される可能性が高い。結果は、この前駆物質が、
ｐ　Ｈの低下に際して解離される１−ランスーゴルシ体
の網内まで輸送される前に（Ｔ　Ｇ　Ｎ　：　Ｇｒｉｆ
ｆｉｔｈｓ　ｇＩＳｉｍｏｎｓ、１９８６年）、シス、
内側及びトランス・シスターネ（槽）ゴルシ体内でのそ
の輸送及び形質転換全体を通してそのダイマー化された
形を保っているという観察事実と一致している。解離さ
れたダイマーは、最初に検出された糖タンパク質の前駆
物質（ｇｐ１．５Ｏ−１４０）のものに比べやや低い分
子量をもつ糖タンパク質（ｇｐｌ、３５）に導く。ｇｐ
１３５は原形質膜の方に輸送され、こうしてＨＩＶ−２
の外被成熟糖タンパク質ｇｐ１２５及びｇｐ３６に至る
前に細胞プロテアーゼにより開割されることができる。

モネンシンはおそらく、原形質膜へのゴルジ体の輸送を
抑制する。このためｇｐ１３５はゴルジ体内に蓄積され
る。

ゴルジ体が分泌タンパク質及び原形質膜タンパク質のソ
ーティングのメカニズムに関与していることは、既知の
事実である。このメカニズムは、Ｔ　Ｇ　Ｎ　（Ｇｒｉ
ｆｆｉｔｈｓ　＆　Ｓｉｍｏｎｓ、１９８６年）により
指定されたゴルジの末端区画内で起こると思われる。こ
の区画は、時としてゴルジの小胞体のりソソーム（氷解
小体１［ＧＥＲＬ）により指定され、最近ゴルジ体の液
胞後方又はゴルジ錯体の最も内側のシスターネにより指
定されるゴルジの重なりの「トランス」に相当する（Ｎ
ｏｖｉｋｏｆｆ、１９７６年；　５ａｒａｓｔｅ　＆　
Ｋｕｉｓｍａｎｅｎ　１９８４年０ｒｃｉ他、１９８７
年）。きわめて興味深いことに、ＴＧＮのｐＨが検討さ
れ、それが平均して酸性つまり約６であることがわかっ
たｆＡｎｄｅｒｓｏｎ　＆Ｐａｔｈａｋ、　１９８４年
：　Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ　＆　Ｓｊ、ｍｏｎｓ、１９８
６年〕。ＴＧＮ内の酸性ｐ　Ｈは、形成されたダイマー
の解離に関与しうる。

以」二に検討されてきた結果は、ＨＩＶ−２の外被糖タ
ンパク質の形成及び形質転換が、複数の段階を含みしか
も特に未成熟の前駆物質ｇ　ｐ　１．５０１４０の合成
、中間グイマー化前駆物質っまりｇｐ３００の合成及び
成熟した前駆物質ｇｐ１３５の合成が関与する１つのプ
ロセス内に入る、という事実を例証している。その類似
性にもかかわらず、し１〜ロウイルスＨＩ　Ｖ−１及び
ＨＩＶ−２は、その外被糖タンパク質の形成に関し異な
るメカニズムをもっており、このことはＨＩＶ−１によ
る感染とＨＩＶ−２による感染を区別するための全く有
利な１つの特徴であると考えられる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＨＩＶ−２の外被糖タンパク質な表わしてい
る。 第１Ａ図は、ＨＩ　Ｖ　−１及びＨＩ　Ｖ　−２の高分
子量のタンパク質を比較する、ゲルのフルオログラフで
ある。 第１Ｂ図は、ＨＩＶ−２の糖タンパク質の識別を表わし
ている。 第２図は、ＨＩ　Ｖ　−２の糖タンパク質の二次元ゲル
電気泳動のフルオログラフである。 第３図は、未変性タンパク質ｇｐ３００　（ａ）と変性
タンパク質ｇｐ３００　（ｂ及びＣ）の解離を示す、ゲ
ルのフルオログラフである。 第４図は、Ｅｎｄｏ−ＨによるＨＩＶ−２の糖タンパク
質の消化を示す、異なるゲルのフルオログラフである。 第５図は、１４ｃｍマンノース又は３Ｈ−フコスを用い
たＨＩＶ−２の糖タンパク質の同位体標識付けを示す、
フルオログラフである。 第６図は、チュニカマイシンによる窒素に結びつけられ
たグリコシル化の抑制を表わす、フルオログラフである
。 第７図は、ＨＩＶ−２に外被糖タンパク質の形成プロセ
スに対するオリゴ糖の切断抑制因子の効果を表わす、各
ゲルの唯一の部分のみを示すフルオログラフである。 第８Ａ及び８Ｂ図は、ＨＩ　Ｖ　−２の糖タンパク質の
形成プロセスに対するカスタノスペルミン及びモネンシ
ンの効果を表わす、フルオログラフである。 第９図は、ＳＩＶの糖タンパク質の前駆物質に関する、
さまざまなゲルのフルオログラフである。 第１０図は、ＨＩＶ−２の外被糖タンパク質の形成段階
の概略的表示である。 Ｎ 派 ９ρ３０〇−曹ｉ 卯３００→鴫 ｇｐ１４０→ ｐＨニ ア・５ ７．０ ６・５ ＠　−３００ −，１４０ 第 第 １４ｃ、−、、、ンノース 　　ｖ ３Ｈ−フコース ど−−−へ一一一） 　　ｖ ９ρト！−や ― 、ｇ：、１；＝− ｇｐ１２５→― 第 図 ＥＬＬ Ｎ １ｐ１２５→−−− ｐ２６−◆ 第 図 ｇｐ３００→ 対照　Ｃａ５ｔ。 ど−一−＾−−−）　　　ど−＋ 一一一一一嘴豐嘲！！甲 第８Ａ図 対照 モネンシン ど−−−＾−−−）ど−−−＾−−−）ｇｐ３００−−
２″嘴冒−ｍ−！ 第８Ｂ図 Ｍｅｔ。 Ｍａｎ・ Ｆｕｃ・ ｄＭＭ ｇｐｌｓ。 ？ Ｐ　　　　ＴＭ ＧＩｃＮＡｃ２Ｍａｎ９Ｇｌｃ３ 第１０図

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. （１）−約３００Ｋｄの分子量（ＰＭ） −特にＳＬＡもしくはＳＩＤＡ（エイズ）を誘発する可
   能性のあるヒトレトロウィルス ＨＩＶ−２のゲノムのウィルス粒子膜構造タンパク質遺
   伝子￥ｅｎｖ￥によりコード付けされた外被糖タンパク
   質ｇｐ１２５又は かかるレトロウィルスＨＩＶ−２のタンパク質ｇｐ３０
   ０に対する抗体と免疫学的に交差反応するレトロウィル
   スのタンパク質の前駆外被糖タンパク質ｇｐ１４０の２
   つの単位の会合 を特徴とする、抗原性タンパク質ｇｐ３００。
2. （２）−特にヒトリンパ球Ｔ４又はこれらのリンパ球か
   ら誘導された永久系統においてＨＩＶ−２族のレトロウ
   ィルスに感染した患者の生物学標本の細胞中に存在して
   いること；−その当電点（ｐＩ）は、［６．８−７．８
   ］の間隔にあるｐＨについて得られること；−それが、
   窒素に結合されたオリゴ糖鎖によってグリコシル化され
   ていること； −それが、イオン性洗剤（界面活性剤）、特にＳＤＳ１
   ％、非イオン性洗剤（界面活性剤）、特にＴｒｉｔｏｎ
   Ｘ−１００２％、尿素４Ｍ、強塩及び還元剤の中で安定
   していること； −それが、試験管内で、ｐＨ４〜５で約１４０Ｋｄの分
   子量の２つの糖タンパク質に自然発生的に解離すること
   ； −電気泳動ゲル上での分離及び純化の後、それが、試験
   管内の酢酸緩衝液中で、６以下のｐＨ値について約１４
   ０Ｋｄの分子量の２つの糖タンパク質に解離すること； −ヒトレトロウィルスＨＩＶ−２に感染した患者の血清
   から得られた特異的抗体を含む血清 −セファロースＨＩＶ−２＾■タイプのイムノアフィニ
   ティカラム上での純化の後、３００Ｋｄの分子量に相応
   する電気泳動帯を、６Ｍの尿素の存在する中でポリアク
   リルアミド−ＳＤＳ（７．５％）ゲル上で呈すること； を特徴とする、抗原性タンパク質ｇｐ３００。
3. （３）１８時間３＾５＾Ｓ−メチオニン（２００μＣｉ
   ／ｍｌ４×１０＾６細胞／ｍｌ）を用いた標識付けの後
   のレトロウィルスＨＩＶ−２に感染した細胞の特異的培
   地内に存在するウィルス粒子から成る生物学的媒質（ｍ
   ｉｌｉｅｕ）の電気泳動分析ならびに、感染細胞及びそ
   の相応する媒地を含む得られた抽出物の純化によっては
   見かけ上検出されないものの、同じ条件の下で上述の感
   染細胞内では検出されることを特徴とする、請求項（１
   ）又は（２）に記載の抗原性タンパク質。
4. （４）約２００Ｋｄの分子量で、グリコシル化基の不在
   により前記ｇｐ３００とは区別される、前記タンパク質
   ｇｐ３００のものと同じグリコシル化されていない構造
   を特徴とする、請求項（１）乃至（３）のいずれかに記
   載のタンパク質ｇｐ３００から誘導されたタンパク質。
5. （５）請求項（１）から（４）のいずれかに記載の抗原
   性糖タンパク質又はタンパク質を含むことを特徴とする
   、ＨＩＶ−２タイプのヒトレトロウィルスに感染した患
   者の生物学標本の細胞中の抗体の存在の診断用の抗原化
   合物。
6. （６）請求項（１）乃至（３）のいずれかの記載のｇｐ
   ３００を認識すること、そして成熟外被タンパク質ｇｐ
   １２５及びｇｐ３６を認識しないことを特徴とする単ク
   ローン抗体。
7. （７）請求項（１）乃至（３）のいずれかに記載のｇｐ
   ３００内において、抗体に対し露出されアクセス可能で
   あるようなエピトープを認識すること［ただしこのエピ
   トープはその自然のコンフォーメーション（立体配座）
   においては成熟ｇｐ１２５及びｇｐ３６内で露出されて
   いないか又はマスキングされている］を特徴とする単ク
   ローン抗体。
8. （８）さらに中和性をもつこと、特にＨＩＶ−２レトロ
   ウィルスを有するヒトリンパ球の受容体Ｔ４といったそ
   の受容体へのこのレトロウィルスの固定を妨げること、
   を特徴とする、請求項（６）又は（７）に記載の抗体。
9. （９）請求項（４）に記載のｐ２００を認識し、成熟糖
   タンパク質ｇｐ１２５及びｇｐ３６を認識しないことを
   特徴とする、単クローン抗体。
10. （１０）請求項（３）に記載のｐ２００に共通のエピト
    ープを認識すること（ただしこのエピトープは、その自
    然のコンフォーメーションにて得られたようなｇｐ３０
    ０及び／又はｇｐ１２５及びｇｐ３６上でマスキングさ
    れているか又は露出されていない）を特徴とする単クロ
    ーン抗体。
11. （１１）中和性をもつこと、特に、その受容体特にヒト
    リンパ球の受容体Ｔ４上へのレトロウィルスＨＩＶ−２
    の固定を妨げることを特徴とする、請求項（１０）に記
    載の単クローン抗体。
12. （１２）ワクチンの調製に適した薬学的に受容できる賦
    形剤と結びつけて、請求項（１）乃至（３）のいずれか
    に記載の糖タンパク質ｇｐ３００又は請求項（４）に記
    載のｐ２００を含む免疫原性化合物。
13. （１３）１キログラムあたり１０μｇ〜１００μｇの分
    量で投与できるように、請求項（１）乃至（４）のいず
    れかに記載の抗原性糖タンパク質及びタンパク質が調合
    されていることを特徴とする、請求項（１１）に記載の
    免疫原性化合物。
14. （１４）以下の段階を特徴とする請求項（１）乃至（３
    ）のいずれかに記載の抗原糖タンパク質の調製方法； −ヒトレトロウィルスＨＩＶ−２に感染した細胞の溶解
    及び上澄みと細胞抽出物の分離段階； −イムノアフィニティクロマトグラフィのカラム上での
    細胞抽出物及び／又は上澄みの保温段階。このカラム上
    には、ヒトレトロウィルスＨＩＶ−２に感染した患者の
    血清から得られるもののような純化された抗体を含む免
    疫吸着剤が沈着させられている。なおこれらの抗体は有
    利なことに、緩衝液の存在する中で、免疫学的抗原抗体
    複合体形成に充分な長さの時間、適合された支持体上に
    固定されている。； −支持体上に保留されなかった分子を除去するための、
    緩衝液でのカラムの洗浄段階； −溶離された糖タンパク質の分離段階； −求められている抗原性タンパク質の回収段階。
15. （１５）糖タンパク質の分離が、カラム上に保留された
    タンパク質の電気泳動及び電気溶離により行なわれるこ
    とを特徴とする、請求項（１）乃至（３）のいずれかに
    記載の糖タンパク質の調製のための請求項（１４）に記
    載の方法。
16. （１６）糖タンパク質の分離が、 −上述のイムノアフィニティーカラム上で固定されたタ
    ンパク質の溶離、 −ｇｐ３００を認識する単クローン抗体を分離用支持体
    上に固定された形で含むクロマトグラフィのカラム上で
    このように溶離された生成物の純化により得られること
    を特徴とする、請求項（１）乃至（３）のいずれかに記
    載の糖タンパク質の調製のための、請求項（１４）に記
    載の方法。
17. （１７）場合によってヒトレトロウィルスＨＩＶ−２に
    感染していることを確認する目的で患者の生物学標本の
    細胞内の抗体の存在を試験管内で診断するための方法に
    おいて、請求項（１）乃至（４）のいずれかに記載の抗
    原又は請求項（５）に記載の抗原化合物とこの生物学的
    標本を、抗原抗体タイプの免疫学的複合物の形成を可能
    にする条件の下で接触させること、そして形成された抗
    原抗体複合物を検出することを特徴とする方法。
18. （１８）ヒトレトロウィルスＨＩＶ−２に感染している
    可能性のある生物学的標本の細胞内の抗体を検出するた
    めの用具又はキットにおいて、この中には、 −請求項（１）乃至（４）のいずれかに記載の少なくと
    も１つの抗原性糖タンパク質又は／及びタンパク質、 −又は請求項（６）に記載の化合物、 −或いは又これらのさまざまな構成成分の混合物、そし
    て −テストすべき生物学標本中に場合によって存在する抗
    体と上述の抗原の間での免疫学的複合物の形成反応を可
    能にする手段、特に必要とあらば、単数又は複数の保温
    用緩衝液；−陰性対照の標本； −形成された抗原抗体複合物の検出のための手段； が含まれていることを特徴とする、用具又はキット。