DK175668B1 - Precursor for kappeglycolproteiner fra HIV-2-retrovirus og beslægtede antigener - Google Patents

Description

i DK 175668 B1

Den foreliggende opfindelse angår precursorantigener for kappeglycoproteiner fra et humant HIV-2-retrovirus samt antigener, der krydsreagerer immunologisk med specifikke monoklonale antistoffer, som genkender ovenstående precursorantigener for kappeglycoproteiner fra HIV-2-retrovirus.

5

Opfindelsen angår mere specifikt antigener, der kun er til stede under visse faser af udviklingen in vivo af en infektion, der skyldes et humant HIV-2-retrovirus. Disse antigener er karakteristiske ved dannelses- og modningsprocessen af dette retro-virus' kappeglycoprotein, og de er derfor impliceret i udviklingen og proliferationen 10 af Ηΐν-2-retrovirus og deltager i infektionens spredning.

Opfindelsen angår også antistoffer, som genkender antigenerne, samt immunogene præparater, der indeholder antistofferne.

15 Opfindelsen angår desuden fremstilling af de ovenfor nævnte antigener samt deres anvendelse til diagnose af en infektion med et humant HIV-2-retrovirus.

Ætiologiske agentier, der er ansvarlige for udvikling af lymfadenopatisyndromer (hvis engelske forkortelse er SLA), eller som ledsager udviklingen af disse syndro-20 mér eller er ansvarlige for udvikling af erhvervet immundefektsyndromer (AIDS), er blevet isoleret, identificeret og karakteriseret.

Flere humane retrovira, som under visse betingelser kan fremkalde et SLA, der eventuelt afløses af AIDS, hos mennesker, betegnes HIV (engelsk forkortelse af 25 Human Immunodeficiency Virus).

Et første virus, der betegnes LAV-1 eller HIV-1, er således blevet isoleret og beskrevet i GB 83/24.800, der svarer til ansøgning EP 84/401.834 af 14. september 1984, offentliggørelsesnr. 0 138 667. Dette virus er også beskrevet af F. Barre i 30 Sinoussi et al. i Science 220, nr. 45-99, 20, s. 868-871.

Varianter af dette HIV-l-virus med betegnelsen LAV ELI og LAV MAL er også isoleret, karakteriseret og beskrevet i EP 84/401.834.

i i

I DK 175668 B1 I

I I

I Isolering og karakterisering af retrovira, som tilhører en bestemt klasse og kun har I

I et begrænset immunologisk slægtskab med de foregående, er beskrevet i EP I

I 87/400.151.4, offentliggørelsesnr. 239.425. Disse retrovira, som er grupperet un-

I der betegnelsen HIV-2, er isoleret hos flere afrikanske patienter med symptomer I

I 5 på lymfadenopati eller AIDS. I

I Undersøgelse af disse HIV-retrovira, isolering og analyse af deres nukleotidsekven- I

I ser samt karakterisering af deres antigenproteiner har gjort det muligt at foretage

I sammenligningsforsøg mellem de forskellige stammer, der er isoleret, med henblik I

I 10 på deres slægtskab eller modsat deres specificitet, både i strukturel og funktionel I

I henseende. I

I Disse HIV-1- og HIV-2-retrovira er også blevet undersøgt i sammenligning med et

I retrovirus af abeoprindelse (betegnet med forkortelsen SIV eller STLV-III), og den- H

I 15 ne undersøgelse har vist et vist slægtskab mellem proteinerne og glycoproteinerne I

I fra HIV-2-retrovirus og varianter deraf og proteinerne og glycoproteinerne fra SIV- I

I retrovirus. Der bemærkes især et slægtskab med hensyn til kappeproteinet på I

I hvert af disse vira. Der er nemlig påvist immunologiske krydsreaktioner mellem I

kappeglycoproteinet på SIV-retrovirus og antistoffer rettet mod kappeglycoprote- I

I 20 inet på HIV-2-retrovirus, mens denne immunologiske krydsreaktion ikke finder sted I

I mellem SIV-retrovirus og HIV-1-retrovirus og ej heller mellem HIV-1- og HIV-2- I

H retrovirus. I

I Resultater angående kappeglycoproteinet fra HIV-2-retrovirus, der indkodes af I

25 env-genet fra dette retrovirus' genom, er anført i den ovenfor nævnte EP I

I J 87/400.151,4, offentliggørelsesnr. 0 239 425. I denne EP-ansøgning blev dette |

I glycoprotein betegnet med forkortelsen gpl40 under henvisning til dets molekyl- - I

vægt på ca. 140.000 dalton. Det blev imidlertid præciseret, at udregningen af mo- I

I lekylvægten blev foretaget med ± 10%. I en tidligere fransk patentansøgning (nr. | I

I 30 86/03881, offentliggørelsesnr. 2.596.063) var der ligeledes blevet beskrevet en precursor for gpl40 med betegnelsen gpl60 (molekylvægt: 160 kd ± 10%).

Der er udført mere grundige undersøgelser af kappeglycoproteinet fra HIV-2-retro- I

virus, og disse har gjort det muligt for nærværende opfindere at foretage andre I

35 målinger af de molekylvægte, der hidtil har været anført, og dermed forfine resul- I

3 DK 175668 B1 taterne ud fra de ovenfor beskrevne molekylvægtintervaller. Det eksterne kap-peglycoprotein har i HIV-2-viruspartikler - under arbejdsbetingelserne ifølge den foreliggende opfindelse · en molekylvægt på ca. 125.000 dalton (det betegnes gpl25). Under de samme arbejdsbetingelser har den precursor, som allerede er 5 påvist og betegnes gpl60 i FR 86/03881, ifølge de seneste resultater en molekylvægt på ca. 140.000 dalton. Den betegnes derfor "gpl40" i den foreliggende ansøgning.

Ifølge den foreliggende opfindelse har opfinderne påvist eksistensen af flere udvik-10 lingsfaser, som fører til opnåelse af kappeglycoproteiner i moden form, idet disse modne kappeglycoproteiner omfatter et gpl25-glycoprotein og et gp36-glycopro-tein. Nærværende opfindere har således identificeret forskellige stadier i forløbet af den virale replikationscyklus, som forekommer, når patogene forstyrrelser udvikler sig som følge af en infektion med et humant HIV-2-retrovirus. Opfinderne har i 15 denne forbindelse understreget vigtigheden af flere trin, som finder sted i de celler, der er inficeret med HIV-2-retrovirus, især i de humane T4-lymfocytter.

Parallelt hermed har de udført lignende forsøg méd de virale cykler for HIV-1-re-trovirus og SIV-retrovirus. Disse forsøg har vist meget specifikke fælles egenska-20 ber hos HIV-2-retrovirus og SIV-retrovirus, hvilke egenskaber derimod tilsyneladende ikke findes under HIV-l's virale replikationscyklus.

Opfindelsen tilvejebringer således hidtil ukendte metoder til detektion af en infektion, som specifikt kan tilskrives et humant HIV-2-retrovirus.

25

Under hensyntagen til de sidstnævnte resultater ser den virale cyklus, som er særegen for HIV-2-retrovirus og SIV-retrovirus, ud til at være en kompleks kædereaktionsproces, som i sig selv kan føre til dannelse af det eksterne glycoprotein, som findes i kappen på ΗIV-2-retrovirus i sin endelige form. Under denne proces har 30 man kunnet genkende, isolere og identificere forskellige antigenprecursorer. Alle har især et strukturelt slægtskab bygget på peptidskelettet af det kappeglycopro-tein, som indkodes af env-genet fra HIV-2-retrovirus, hvilket gen er beskrevet i ovennævnte EP-patentansøgning.

I DK 175668 B1 I

I

i Den foreliggende opfindelse angår således proteiner eller glycoproteiner, som pro- I

I duceres som følge af en infektion med et humant HIV-2-retrovirus under de for- I

skellige trin af cyklen med dannelse og modning af det eksterne kappeglycoprotein I

gpl25 fra HIV-2, hvilke proteiner som fælles træk har peptidskelettet af det eks- I

5 terne kappeglycoprotein fra humant HIV-2-retrovirus, eller et glycoprotein, som I

udviser en immunologisk krydsreaktion med ovennævnte gpi25 og er forskelligt, I

hvad angår tilstedeværelsen og/eller sammensætningen af de eventuelle oligosac- I

charidkæder. I

10 De specifikke træk ved proteinerne og glycoproteinerne ifølge opfindelsen opnås I

ved hvert'trin, der er uundværligt for dannelsen og modningen af det modne ydre I

H kappeglycoprotein fra humant HIV-2-retrovirus. I

I Ved hjælp af undersøgelsen af viruscyklen har opfinderne foreslået muligheden af I

I 15 at gribe ind under de særlige trin med dannelse af de modne kappeglycoproteiner I

fra humant HIV-2-retrovirus, hvilket således tilvejebringer midler til at afbryde vi- I

ruscyklens normale forløb og afbøde propagationen af retroviruset, som er infekti- I

I øst for mennesker og under visse betingelser patogent. I

I 20 I overensstemmelse med ovenstående angår opfindelsen et retroviralt antigengly- I

I coprotein, som er kendetegnet ved, at det drejer sig om: I

I - enten et glycoprotein benævnt gp300 med en molekylvægt på ca. 300 kd be- I

I stående af forbindelsen mellem to enheder af et precursorglycoprotein gpl40, I

I 25 især for kappeglycoproteinet gpl25, der indkodes af env-genet fra genomet af i I

I et humant HIV-2-retrovirus, der kan fremkalde SLA eller AIDS, 1 I

I - eller dimeren af precurseren for kappeglycoproteinet af en retrovirus, som I

I krydsreagerer immunologisk med antistoffer rettet mod gp300-glycoproteinet. I

I 30 Det skal bemærkes, at gpl40-precursoren også er precursoren for gp36 fra hu- I

I mant retrovirus af typen HIV-2. Opfinderne har konstateret, at den ovenfor nævnte I

I forbindelse mellem de to en-heder af gpl40 er en iboende egenskab hos deres I

I peptidskelet. I

I 35 Antigenproteinet gp300 er endvidere ejendommeligt ved følgende egenskaber: ; I

I I

5 DK 175668 B1 det findes i cellerne i en biologisk prøve fra en patient, der er inficeret med et retrovirus af HIV-2-familien, især i de humane T4-lymfocytter eller i permanente cellelinjer afledt af disse T4-lymfocytter, dets isoelektriske punkt (pi) opnås ved en pH-værdr i området [6,8 - 7,8], 5 - det glycosyleres af oligo'Saccharidkæder forbundet til nitrogen, det er stabilt i ioniske detergenter, især 1% SDS, i ikke-ioniske detergenter, især 2% Triton® X-100, i 4M urinstof, i kraftige salte og i reduktionsmidler, det spaltes spontant in vitro til to glycoproteiner med en molekylvægt på ca.

140 kd ved pH 4-5, 10 * efter isolering og oprensning på elektroforesegel spaltes det i en acetatbuffer in vitro til to glycoproteiner med en molekylvægt på ca. 140 kd ved pH-værdier, der er lig med eller mindre end 6, efter oprensning på en HIV-2-serum-Sepharose®immunaffinitetssøjle i nær- j værelse af specifikke antistoffer, der er vundet ud fra serum fra en patient, j 15 som er inficeret med humant HIV-2-retrovirus, giver det et elektroforese- bånd på en 7,5%'s SDS-polyacrylamidgel i nærværelse af 6M urinstof sva- i rende til en molekylvægt på 300 kd. j i Nærværende opfindere har bemærket, at dannelsen af den dimer, som består af 20 gp300, er et kortvarigt trin i viruscyklen, som sandsynligvis er nødvendigt for modningen af kappeglycoproteinerne fra HIV-2-retrovirus. Ovennævnte antigenprotein gp300 er nemlig ejendommeligt ved, at det tilsyneladende ikke fremkaldes ved elektroforeseanalyse af et biologisk medium, som består af viruspartikler, der er til stede i det specifikke dyrkningsmedium af celler, som er inficeret med humant 25 HIV-2-retrovirus, efter mærkning med 1 2 3 4 5 6S-methionin (200 pCi/ml; 4 x 106 cel- · ler/ml) i 18 timer og oprensning af de vundne ekstrakter, som indeholder de inficerede celler og deres tilsvarende dyrkningsmedium, hvorimod det fremkaldes under samme betingelser i ovennævnte inficerede celler.

Dette har ført til den betragtning, at gp300 er en foreløbig precursor, som er speci 2 fik for de endelige kappeglycoproteiner. Denne egenskab hos viruscyklen af hu 3 mant HIV-2-retrovirus, der medfører opnåelse af et gp300-protein, er original og 4 usædvanlig i forhold til det kendskab, der er opnået om de generelle mekanismer i 5 for dannelse af glycoproteiner, som indeholder oligosaccharid-glycosyleringskæder, 6 der er bundet til nitrogen.

I DK 175668 Bl I

I i

Desuden har nærværende opfindere på interessant måde bemærket, at der ved I

dannelsen og modningen af kappeglycoproteiner af SIVmac'retrovirus også fore- I

kommer et dimerisationstrin, som fører til dannelse af et glycoprotein af gp300-ty- I

pen, som er særlig karakteristisk for humant HIV-2-retrovirus. I modsætning hertil I

5 har parallel iagttagelse af viruscyklen af det humane HIV-l-retrovirus ikke gjort det I

muligt at konstatere noget dimerisationstrin, som fører til dannelse af et glycopro- I

H tein, som er beslægtet med gp300. I

Disse resultater antyder overraskende, at dannelse af en dublet (eller dimer) ud fra I

10 gpl40-precursoren for kappeglycoproteinet af humant HIV-2-retrovirus er en I

egenskab, der er specifik for ekspressionen af env-genet fra humant HIV-2-retro- I

virus og SIV-retrovirus. I

H Denne konstatering kan udnyttes ved undersøgelse og udvikling af midler til selek- I

I 15 tiv diagnose af en infektion, som skyldes et humant HIV-2-retrovirus, der kan I

I fremprovo-kere SLA eller AIDS under visse betingelser. Disse hensigtsmæssige I

H diagnostiske midler vil blive beskrevet nærmere i det følgende. I

Opfindelsen angår også et protein, som har identiske træk med gp300, hvad angår I

I 20 peptidskelettet, hvilket protein er ejendommeligt ved, at det er i ikke-glycosyleret I

I form, og at dets molekylvægt er ca. 200 kd. I

Dette protein, p200, som vil blive beskrevet nærmere i eksemplerne nedenfor, er I

I blevet påvist under et spaltningsforsøg med endo-β-Ν- acetylglucosaminidase H (i I

25 det følgende betegnet "endo-H"). Dette protein, som udgør den ikke-glycosylerede I

form af gp300, kan have særlig interesse på grund af den eventuelle forekomst af I

I en fælles epitop for gp300 og p200, som kan vise sig at have ringe antigenicitet i I

I gp300 på grund af tilstedeværelsen af oligosaccharidkæder, som har betydning for I

I den endelige konformation af gp300, men som alligevel hæmmer tilgængeligheden I

I 30 af en interessant epitop. I

I Under undersøgelsen af viruscyklen blev der detekteret et andet glycoprotein; der I

I er tale om et oprenset gpl50-glycoprotein, som er ejendommeligt ved, at det de- I

I tekteres in vitro (kun i celler fra en patient inficeret med et humant retrovirus af I

I 35 HIV-2-typen) efter mærkning af cellerne med et radioaktivt sporstof, som tilsættes I

DK 175668 B1 7 i et kort tidsrum, i nærværelse af en inhibitor af glucosidaseenzymer, især castano-spermin, efterfulgt af fjernelse af det radioaktive sporstof ved vask og erstatning med ikke-radioaktive molekyler forud for et trin med bestemmelse af radioaktiviteten af prøver, der er taget med forskellige tidsintervaller, hvilket trin gør det mu-5 ligt at detektere sporstoffet i de proteiner og gfycoproteiner, der dannes efter mærkningen. Observationen af gpl50 foretages efter et tidsrum, der er lig med eller tæt ved det tidsrum, som er nødvendigt for detektionen af gp300.

Glycoproteinet gpl50 er også ejendommeligt ved følgende træk: 10 en molekylvægt på ca. 150 kd, peptidskelettet af precursoren for kappeglycoproteinet gpl25, der indkodes af env-genet fra genomet af et humant HIV-2-retrovirus eller et retrovirus, hvis ydre kappeglycoprotein genkendes af antistoffer fra et serum fra en pa-15 tient, der er inficeret med det humane HIV-2-retrovirus, især antistoffer rettet mod gpl25, terminale glucoserester på en oligosaccharidkæde.

De ovenfor beskrevne proteiner og glycoproteiner og fortrinsvis gp300 har vist sig 20 nyttige til anvendelse i antigenpræparater til diagnose af tilstedeværelsen af antistoffer i celler i en biologisk prøve fra en patient, der er inficeret med et humant retrovirus af HIV-2-typen, idet disse præparater er ejendommelige ved, at de omfatter et antigenprotein eller -glycoprotein som defineret ovenfor.

25 Disse præparater er særlig interessante i det omfang, de muliggør dannelse af immunologiske komplekser af antigen-antistoftypen med antistoffer fra serummet fra en patient, der er inficeret med et humant HIV-2-retrovirus. Som følge heraf anvendes disse præparater og/eller de antigener, som de indeholder, med fordel til udførelse af specifik diagnose af en infektion, som skyldes et humant retrovirus af 30 HIV-2-typen.

Opfindelsen angår også monoklonale antistoffer, der er ejendommelige ved, at de genkender det ovenfor definerede gp300, og at de ikke genkender det modne kappeglycoprotein gpl25 og det modne gp36.

35

I DK 175668 B1 I

I 8 I

H Andre monoklonale antistoffer er ejendommelige ved, at de genkender en epitop, I

H som i ovennævnte gp300 er blotlagt og tilgængelig for antistoffet, idet denne epi- I

top imidlertid enten ikke er blotlagt eller er maskeret i de modne gpl25 og gp36 i I

H deres naturlige konformation. I

I 5 I

Sådanne monoklonale antistoffer kan også være neutraliserende, idet de især for- I

hindrer binding af humant HIV-2-retrovirus til dets receptor, især til T4-receptoren I

på de humane lymfocytter, som omfatter den. I

10 Andre interessante monoklonale antistoffer ifølge den foreliggende opfindelse gen- I

kender det ovenfor definerede p200 og genkender ikke de modne glycoproteiner I

gpl25 og gp36. I

Andre monoklonale antistoffer er ejendommelige ved, at de genkender en epitop i I

I 15 p200, idet denne epitop imidlertid enten ikke er blotlagt eller er maskeret på gpl25 I

og gp36 og/eller på gp300, således som de fås i deres naturlige konformationer. I

I Ovennævnte monoklonale antistoffer kan have immunogene og neutraliserende I

I egenskaber og afbryde proliferationen af humant HIV-2-retrovirus. I

20 I Flere fremgangsmåder til fremstilling af disse antistoffer kan anvendes til udøvelse af den foreliggende opfindelse. Fx kan der anvendes kulturer i ascites hos dyr, især I hos gnavere såsom mus. Antistofferne kan også produceres ud fra cellekulturer, I der enten er immobiliserede eller indkapslede eller er i suspension. Der anvendes I 25 især teknikken med hybridomer, der er vundet ved fusion af lymfocytter fra et dyr, som i forvejen er inokuleret med humant HIV-2-retrovirus. Derefter udtages lymfo- cytter fra det inficerede dyr, og disse fusioneres med udvalgte myelomceller til I dannelse af hybrider, som derpå selekteres for deres evne til at producere speci- I fikke antistoffer rettet mod de ovenfor beskrevne antigenproteiner og -glycopro- I 30 teiner.

I Disse producerede monoklonale antistoffer anvendes fx til inaktivering af de protei- I ner og/eller glycoproteiner, hvormed de danner et immunologisk kompleks, eller på I grund af deres evne til at forhindre det normale forløb under dannelsen af endelige I 35 glycoproteiner i kappen på et humant HIV-2-retrovirus. Under hensyntagen til

DK 175668 B1 I

slægtskabet mellem peptidskelettet af proteinerne og glycoproteinerne ifølge op- I

findelsen kan de monoklonale antistoffer, som er dannet mod disse glycoproteiner, I

især mod gp300 og p200, desuden vise sig at være effektive mod gpl25. I

5 En anden eventuel anvendelse af disse antistoffer er fx til detektion af virusanti- I

gener i biologiske præparater eller til oprensning af proteiner og/elier glycoprotei- I

ner, fx på en affinitetssøjle. I

Generelt er opfindelsen ikke begrænset til glycoproteiner og proteiner som beskre- I

10 vet ovenfor, når de fås ud fra det humane HIV-2-retrovirus. Opfindelsen omfatter I

derimod også proteiner og glycoproteiner, der har antigene, immunologiske og I

også immunogene egenskaber til fælles med de ovenfor beskrevne proteiner og I

glycoproteiner, idet disse proteiner og glycoproteiner da fx kan defineres ved deres I

evne til at blive genkendt af antistoffer, der specifikt er rettet mod de tilsvarende I

15 proteiner, som er karakteristiske for et humant HJV-2-retrovirus. I

Dette gælder fx glycoproteinerne gp300 og andre precursorer for det ydre kappe- I

glycoprotein af et SIVmac-retrovirus, hvis viruscyklus, der er undersøgt af nærvæ- I

rende opfindere, har vist egenskaber, der er fælles med de ovenfor nævnte pro-20 teiner og glycoproteiner af humant HIV-2-retrovirus.

Opfindelsen angår også et immunogent præparat, som indeholder et gp300-glyco-protein som defineret ovenfor sammen med en farmaceutisk acceptabel bærer, der I er egnet til fremstilling af vacciner.

Et således udformet immunogent præparat indeholder antigenproteiner og/eller -glycoproteiner i en sådan mængde, at der kan administreres en dosis på ΙΟΙ 00 pg/kg.

30 Opfindelsen angår også en fremgangsmåde til fremstilling af gp300-antigenglyco- j proteinet, hvilken fremgangsmåde omfatter følgende trin: lysering af celler, der er inficeret med et humant HIV-2-retrovirus, og separation af supernatanten og celleekstrakten, i I DK 175668 B1 - inkubation af celleekstrakten og/eller supernatanten på en immunaffinitets-søjle, på hvilken der er anbragt en immunadsorbent omfattende oprensede antistoffer, der er vundet fra serummet fra en patient, som er inficeret med humant HIV-2-retrovirus, og hvilke antistoffer er fikseret på et passende 5 underlag, i nærværelse af en buffer og i et tilstrækkelig langt tidsrum til at opnå dannelse af et immunologisk antigen-antistofkompleks, - vask af søjlen med en buffer for at fjerne de ikke-tilbageholdte molekyler, - opløsning af de eluerede proteiner, fx tilbageholdte ved elektroforese og H elektroeluering, H 10 - isolering af de ønskede antigenproteiner.

De inficerede celler kan tages fra en patient, der er inficeret med et humant HIV-2- H retrO'Virus. De kan også fås in vitro fra en cellekultur, der er inficeret med HIV-2.

Sådanne cellekulturer kan fås fra CEM-celle-linjer.

15

En anden fremgangsmåde til fremstilling af glycoproteinet udføres analogt med

ovenstående fremgangsmåde, idet elektroelueringstrinnet imidlertid erstattes af I

H følgende trin: 20 - eluering af de proteiner, der er fikseret på ovennævnte immunaffinitetssøjle, - oprensning af de således eluerede produkter på en kromatografisøjle, der fikseret på separationsunderlaget indeholder monoklonale antistoffer rettet I mod gp300.

I 25 I en særlig udførelsesform af opfindelsen udføres lyseringen af de inficerede celler i I en detergentopløsning, idet de antistoffer, der er omfattet i immunadsorbenten, fikseres til agarosekugler, og der arbejdes i nærværelse af en koblingsbuffer.

I Opfindelsen angår også en metode til diagnose in vitro af tilstedeværelsen af anti- I 30 stoffer i celler i en biologisk prøve fra en patient med henblik på at bekræfte en eventuel infektion med humant HIV-2-rétrovirus, hvilken metode omfatter følgende trin:

DK 175668 B1 I

den biologiske prøve bringes i kontakt med et.antigen som beskrevet oven- I

for eller med et antigenpræparat ifølge opfindelsen under betingelser, der I

muliggør dannelse af et immunologisk kompleks af antigen-antistoftypen, I

det dannede antigen-antistofkompleks detekteres. Den biologiske prøve, på I

5 hvilken diagnosen udføres, kan være en biologisk væske, især et serum, en biolo- I

gisk vævsekstrakt, når blot den formodes at indeholde celler, der er inficeret med I

humant HIV-2-retrovirus. I

En sådan metode kan have særlig interesse i det omfang, den muliggør en tidlig I

10 detektion af en infektion, som skyldes et humant HIV-2-retrovirus eller et beslæg- I

tet retrovirus, idet nærværende opfindere har påvist forekomsten af gp300 på et I

tidligt stadium under virus-replikationscyklen af det retrovirus, som er ansvarligt for infektionen.

115 Til udøvelse af ovenstående diagnostiske metode har opfinderne fremstillet en indretning eller et kit til detektion af antistoffer i celler i en biologisk prøve fra en patient, som kan være inficeret med et humant HIV-2-retrovirus, hvilket kit omfatter: i det mindste ét antigenprotein og/eller -glycoprotein som beskrevet ovenfor 20 eller ét præparat fremstillet ud fra disse bestanddele eller en blanding af disse forskellige bestanddele og midler, der muliggør en reaktion til dannelse af et immunologisk kompleks mellem ovenstående antigener og d,e antistoffer, der eventuelt findes i den 25 biologiske prøve, som skal testes, om nødvendigt én eller flere inkubations buffere, en negativ kontrolprøve, midler til fremkaldelse af det dannede antigen-antistofkompleks.

30 Efter at have bestemt de forskellige trin med dannelse af det infek-tiøse HIV-2-re-trovirus samt betydningen af forskellige af disse trin for infektionens udvikling har nærværende opfindere udviklet et farmaceutisk præparat, som er ejendommeligt ved, at det omfatter i det mindste én inhibitor af glucpsidaserne I og/eller II, især castanospermin eller deoxyjirimicyn eller en blanding af disse inhibitorer, i en do-35 sis, der er tilstrækkelig til at blokere elimineringen af terminale glucoserester i

I DK 175668 B1 I

I

H oligosaccharidkæderne på gpl50-glycoproteinet under viruscyklen, sammen med I

H en fysiologisk acceptabel excipiens. I

H Opfindelsen vil i det følgende blive nærmere forklaret under henvisning til neden- I

H 5 stående eksempler og tegningen, der viser følgende: I

H Fig. 1, som består af fig. 1A og IB, viser HIV-2-kappeglycoproteiner. I

Fig. 1A: Sammenligning af proteiner med høj molekylvægt fra HIV-1 og I

I 10 H1V-2 I

CEM-celler inficeret med HIV-l eller HIV-2 blev mærket med 35S-methionin I

I (200 pCi/ml; 4 x 106 celler/ml) i 18 timer. Ekstrakter af de inficerede celler (CELL) I

og deres tilsvarende dyrkningsmedium (SN) blev oprenset på specifikke immunaffi- I

15 nitetssøjler: HIV-l-serum-Sepha-rose-søjle, specifik for HIV-l-proteiner (Krust et I

al., 1988); og HIV-2-serum-Sepharose-søjle, specifik for HIV-2-proteiner (se "eks- I

perimentelle procedurer"). De oprensede proteiner blev analyseret ved elektrofo- I

rese på 7,5%'s SDS-polyacrylamidgel indeholdende 6M urinstof. En fluorograf af I

gelen er vist i fig. 1A. Størrelsen af HIV-1- og HIV-2-proteinerne er vist til venstre I

20 og til højre for banerne. p68 og p55 er henholdsvis revers transkriptase og gag- I

H pre-cursoren. gpl60 og gpl20 er henholdsvis precursoren for HIV-l-kappeglyco- I

I proteinet og dets spaltningsprodukt. gp300, gpl40 og gpl25 er precursorerne for I

I glycoproteinet og spaltningsproduktet af HIV-2-kappeproteinet. I

I 25 Fig. IB Identificering af HIV-2-glycoproteiner I

I CEM-celler inficeret med HIV-2 og T-lymfocytter blev mærket med 3H-glucosamin I

I (200 μθ'/ml; 4 x 106 celler/ml) i 18 timer. Ekstrakter af de inficerede celler (bane I

C) og dyrkningsmediet indeholdende viruset (bane V) blev oprenset på HIV-2-se- I

I 30 rum-Sepharose-søjle, og de mærkede proteiner blev analyseret ved elektrofo-rese I

I på 7,5%'s gel af HIV-2-glycoproteinerne, der var syntetiseret i CEM-cellerne. I ba- I

I nen yderst til venstre viser elektroforese på 12,5% acrylamidgel tilstedeværelsen I

I af gp36. Denne del af figuren skulle overeksponeres for at påvise gp36, hvorfor I

I gpl40/125 er opløst i form af et tæt bånd. I

I 35 DK 175668 B1 13

Fig. 2 Analyse ved gelelektroforese i to dimensioner af HIV-2-glycoproteiner

Glycoproteinerne gp300, gpl40 og gpl25, som var oprenset ud fra CEM-celler inficeret med HIV-2 (CELL), blev mærket med 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11S-methionin. Glycoproteinerne samt 5 dyrkningsmediet indeholdende viruset blev analyseret (SN repræsenterer det resultat, der blev opnået med dyrkningsmediet; fremstillingsbetingelserne svarer til fig.

1A for gelelektroforese i to dimensioner (se "eksperimentelle procedurer"). pH-gra-dienten for isoelektrisk fokusering (første dimension) svarer til den angivne. I den anden dimension blev proteinerne opløst på 7,5% SDS-polyacrylamidgel indehol-10 dende 6M urinstof. Fluorografer af gelerne er vist i fig. 2.

Fig. 3: Dissociering af det native (a) og det denaturerede (b og c) gp300- protein 15 (a) Ekstrakter af CEM-celler inficeret med HIV-2 og mærket med 11S-methionin blev oprenset på HIV-2-serum-Sepharose-søjle. Prøven blev derpå opdelt i to lige store dele: den ene blev inkuberet i en koblingsbuffer (bane 1), mens den anden blev inkube-20 ret i en buffer indeholdende 30 mM natriumacetat, pH 4,0, 0,2 mM PMSF, 100 en-heder/ml aprotinin og 5 mM β-mercaptoethanol (bane 2). Efter 1 time ved 37°C blev det sure medium neutraliseret, og de to prøver blev analyseret ved elektrofo-rese.

(b) gp300, der var mærket med 11S-methionin, oprenset og lyofiliseret, blev sus 2 penderet i en natriumacetatbuffer (100 μΙ) ved pH 4 som beskrevet ovenfor (bane 3 2). Der blev udført inkubationer i 30 minutter ved 37°C før tilsætning i to omgange 4 af en elektroforesebuffer indeholdende 2M urinstof. Resultaterne i bane 1 svarer til 5 lyofiliseret gp300 direkte suspenderet i elektroforesebufferen.

6 7 (c) gp300, der var mærket med 11S-methionin, oprenset og lyofiliseret, blev sus 8 penderet i en opløsning indeholdende 30 mM Tris-HCI, 0,2 mM PMSF og 100 en- 9 heder/ml aprotinin og bufret med HCI til pH 7,5; 7,0; 6,5; og 6,0 (som vist i figu 10 ren). Efter 60 minutter ved 37°C tilsattes i to omgange en elektroforesebuffer, og 11 prøverne blev analyseret ved elektroforese.

DK 175668 B1 I

I

Fluorografer af disse geler er vist under (a), (b) og (c). I sektion (c) er det karak- I

teristiske bånd for gp300 dissocieret til gpl40, idet denne dissociering kan kvan- I

tificeres ved udførelse af en densiometrisk scanning af denne fluorograf. I

5 Fig. 4: Spaltning af HIV-2-glycoproteinerne med endo-H I

Glycoproteinerne gp300, gpl40/gp!25 og gpl25, der var oprenset og lyofiliseret I

(se "eksperimentelle procedurer"), blev suspenderet i en buffer indeholdende I

150 mM natriumcitrat, pH 5,5, 0,1% SDS (vægt/volumen), 0,5 mM PMSF, hvor- I

10 efter det hele blev opvarmet i 2 minutter ved 90°C. Alikvoter af disse prøver blev I

inkuberet (2 timer ved 30°C) uden endo-H (bane 1) eller med 0,4 (bane 2), 2 I

(bane 3) og 10 (bane 4) millienheder endo-H. I

H Alle disse reaktioner blev standset ved tilsætning af elektroforesebuffer i to om- I

15 gange. Elektroforesen blev udført som beskrevet under fig. 1. Fluorografer af de I

I forskellige geler er vist. Pilene p90 og p80 til højre viser spaltningsproduktets posi- I

I tion. Betingelserne for endo-H-spaltningen er beskrevet af Tarentino et al., 1974. I

Fig. 5: Isotopisk mærkning af HIV-2-glycoproteinerne med 14C-mannose el- I

I 20 ler 3H-fucose I

HIV-2-inficerede celler blev mærket i 18 timer med 14C-mannose (25 pCi/ml; 4 x I

I 106 celler/ml) eller 3H-fucose (200 μθ/ml; 4 x 106celler/ml). Ekstrakter af de infi- I

I cerede celler (bane C) og af dyrkningsmediet indeholdende viruset (bane V) blev I

I 25 oprenset på HlV-2-serum-Sepharose-søjle. De mærkede glycoproteiner blev der- I

I efter analyseret ved elektroforese på polyacrylamidgel. Fluorografen er vist i I

I fig. 5. I

Fig. 6: Inhibering af den nitrogenforbundne glycosylering ved hjælp af I

30 tunicamycin i I

Celler, der var inficeret med HIV-2 i fravær af tunicamycin (bane C) eller i nær- I

værelse af tunicamycin (2 pg/ml) (bane TM), blev mærket med 35S-methionin I

(betegnet 35S-met; 200 pCi/ml; 4 x 106 celler/ml) eller med 3H-glucosamin (beteg- I

35 net 3H-GlcNAc; 200 pCi/ml; 4 x 106 celler/ml) i 16 timer. De tunicamycinbehand- : I

i I I

DK 175668 B1 I

lede celler blev først inkuberet (37°C) med antibiotikummet (2 ng/ml) i 2 timer før I

mærkning med 3SS-methionin eller 3H-glucosamin. Ekstrakter af de inficerede celler

(CELL) og af dyrkningsmediet indeholdende viruset (SN) blev oprenset på HIV-2- I

serum-Sepharose-søjle og analyseret ved elektroforese på 7,5% polyacrylamidgel. I

5 Fluorografer af disse geler er vist. Positionerne af den ikke-glycosylerede kappe- I

precursor (p90/80) og den ikke-glycosylerede dimer (200 kd) er vist med små pile I

til højre. Proteinerne 90/80 kd og 200 kd inkorporerer ikke 3H-glucosamin (3H- I

GlcNAc, CELL, bane TM). I

10 Fig. 7: Virkning af oligosaccharid-spaltningsinhibitorer på processen til dan- I

nelse af HIV-2-kappeglycoproteinet HIV-2-inficerede CEM-celler blev mærket (16 timer, 37°C) med 35S-methionin (200 μCi/ml; 4 x 106 celler/ml) i fravær af spaltningsinhibitor (bane T) eller i nær-15 værelse af en oiigosaccharidspaltningsinhibitor: 1 mM bromconduritol (bane Bro); 1 mM castanospermin (bane Cast.); 10 ng/ml swainsonin (bane Sw); 3 mM deoxy-nojirimycin (bane dNM) og 1 mM deoxymannojirimycin (bane dMM). Ekstrakter af de inficerede celler (CELL) og af dyrkningsmediet indeholdende viruspartiklerne (SN) blev oprenset på HIV-2-serum-Sepharose-søjle for at identificere virusglyco-20 proteinerne gpl25, gpl40 og gp300 i de inficerede celler og gpl25 i dyrkningsme-

Idieme. Alle prøverne blev analyseret ved elektroforese på 7,5% polyacrylamidgel.

For at påvise, at inhiberingen af produktionen af gpl25 ved hjælp af de celler, der var behandlet med de forskellige inhibitorer, er specifik for virusglycoproteinet, blev dyrkningsmediet testet, hvilket førte til detektion af tilstedeværelsen af kerne-25 proteinet, p26, ved en immunpræcipitationstest, hvor der anvendtes et serum, der var HIV-2-séropositivt (Clavel et al., 1986a, 1987). p26 blev analyseret ved elektroforese på polyacrylamidgel (12,5%). Figurerne viser fluorografen, hvor der kun er vist en enkelt del af hver gel.

30 Fig. 8: Virkning af castanospermin og monensin på processen til dannelse af HIV-2-glycoproteiner (a) Der blev udført forsøg med mærkning med et radioaktivt sporstof i et kort tidsrum efterfulgt af fjernelse af sporstoffet og erstatning deraf med ikke-radioaktive 35 molekyler ("pulse-chase"-eksperiment). Disse forsøg blev udført på CEM-celler infi- i DK 175668 B1 ceret med HIV-2 i fravær af castanospermin (kontrol) eller i nærværelse af 1 mM H castanospermin (Cast.).

Kontrol: De inficerede celler blev inkuberet i 1 time ved 37°C i et medium uden H 5 methionin før mærkning i et kort tidsrum på 15 minutter med 35S-methionin (200 H μθ/ml; 4 x 105 celler/ml; bane 1). Det radioaktive sporstof blev fjernet og erstat- H tet med dyrkningsmediet indeholdende koldt 5 mM methionin i 0,5, 1,5 og 3 timer H (resultatet er vist henholdsvis i bane 2, 3 og 4). Cast.: De HIV-2-inficerede CEM- H celler blev inkuberet (1 time ved 37°C) i et medium uden methionin, men indehol-

10 dende castanospermin før hurtig mærkning i 30 minutter med 35S-methionin. Disse I

H celler blev derpå fulgt efter fjernelse af det radioaktive sporstof og erstatning med H ikke-radioaktive molekyler som beskrevet ovenfor, men i nærværelse af castano- spermin i 0,5, 1,5 og 3 timer (henholdsvis bane 2, 3 og 4).

15 (b) Der blev udført forsøg med mærkning med et radioaktivt sporstof efterfulgt af sporstoffet under de ovenfor beskrevne betingelser i HIV-2-inficerede celler i fra-

vær af monensin (kontrol) eller i nærværelse af 1 μΜ monensin. Inficerede celler I

med eller uden monensin blev inkuberet (1 time, 37°C) i et medium uden methio- I nin før mærkning i et kort tidsrum (30 minutter) med 35S-methionin (bane 1). De

20 mærkede celler blev derefter fulgt i dyrkningsmediet indeholdende koldt 5 mM

methionin i 0,5, 1,5 og 3 timer (henholdsvis bane 2, 3 og 4).

Ekstrakter blev oprenset på HIV-2-serum-Sepharose-søjle, og de mærkede prote- I iner blev analyseret ved elektroforese på 7,5%'s polyacrylamidgel. Resultaterne er 25 vist i fluorograferne. p55 angiver gag-precursoren i sektion A, bane 1.

I Fig. 9: Precursorer for SIV-olygoproteiner SIV-inficerede HUT-78-celler blev mærket (16 timer, 37°C) med 35S-methionin 30 (200 μϋ'/μΙ; 4 x 106 celler/ml), 3H-fucose (200 μΟ/μΙ; 4 x 106 celler/ml) og “C-mannose (25 μΟ/μΙ; 4 x 106 celler/ml). Ekstrakter af de inficerede celler (bane C) og af dyrkningsmediet indeholdende SIV (bane V) blev oprenset på HIV-2-serum-Sepharose-søjle. Et HlV-2-positivt serum blev anvendt til udførelse af en immun-præcipitationsreaktion af SIV-proteiner, da HIV-2-proteinerne og SIV-proteinerne 35 udviser immunologiske krydsreaktioner. Alle prøverne blev analyseret ved elektro-

DK 175668 B1 I

forese på 7,5% polyacrylamidgel (se "eksperimentelle procedurer"). En fluorograf

af de forskellige geler er vist. Den elektroforetiske mobilitet af gp300S|V og I

gpl40siv svarer til mobiliteten af glycoproteinerne gp300 og gpl40 fra HIV-2. I

gpl30SiVhar en lidt større mobilitet end gpl25 fra HIV-2. p55 mærket med 3SS- I

5 methionin er formodentlig gag-precursoren fra SIV.

Fig. 10: Skematisk fremstilling af trinnene under dannelsen af HIV-2- I

kappeglycoproteinet I

10 Det syntetiserede og glycosylerede polypeptid på 80 kd giver anledning til dannelse I

af en "umoden precursor for glycoproteiner" gpl50, som hurtigt deglycosyleres af I

glucosidaserne i det ru endoplasmatiske retikulum (RER). En ændring af omgivel- I

serne (især af pH) medfører således dimerisation, hvilket giver anledning til dan- I

Inelse af gp300, "intermediær precursor i form af dimer". gp300 spaltes af manno- I

15 sidaserne fra RER, før det transporteres ind i Golgi-apparatet. Andre spaltninger af I

gp300 udføres af mannosidaserne i Golgi-apparatet før overførsel af fucose og sial- I

syrerester til Golgi-medialen og til trans-Golgi. Til sidst nedbrydes dimeren til en I

"moden precursor" gpl35 på grund af den sure pH, som hersker i trans-Golgi-net-værkets (TGN) hulrum. gpl35 transporteres til plasmamembranen og spaltes af 20 celleproteasen, hvilket giver modne HIV-2-kappeglycoproteiner, gpl25 og gp36.

Tunicamycin (TM) inhiberer samling af dolichol-P-P-glycan-rester; castanospermin (Cast.) og deoxynojirimycin (dNM) inhiberer glucosidaserne i RER; deoxymannojiri-mycin (dMM) inhiberer spaltningsmannosidaserne i RER og i cis-Golgi og i Golgi-medial; monensin inhiberer transporten af membranglycoproteinerne og sekre-25 tionsproteinerne fra Golgi-apparatet.

EKSEMPLER

30 EKSPERIMENTELLE PROCEDURER

I. Materialer L-(35S)Methionin (specifik aktivitet: 1000 Ci/mmol), L-(6-3H)fucose (specifik aktivi-35 tet: 45-70 Ci/mmol), D-(6-3H)glucosamin (specifik aktivitet: 20-40 Ci/mmol) og D- I DK 175668 B1

I I

H (U-^Qmannose (specifik aktivitet: 200*300 mCi/mmol) blev leveret af Amersham I

(Amersham, UK). I

H Bromconduritol, castanospermin, 1-deoxymannojirimycin (dMM), 1-deoxynojiri- I

H 5 mycin (dNM), swainsonin og tunicamycin blev leveret af Boehringer-Mannheim I

H (Mannheim, BRD). I

Endo-/f-N-acetylglucosarninidase H blev leveret af Calbiochem (San Diego, USA).

10 Ampholinerne stammer fra Pharmacia (Uppsala, Sverige). I

Η II. Virus og celler

Et HIV-lBRU*isolat fra humant immundefektvirus, type 1 (beskrevet af Montagnier 15 et al., 1984), et HIV-2ROD-isolat fra humant immundefektvirus, type 2 (beskrevet af

Clavel et al., 1986a) og et abe-immundefektvirus, SIVmaCi42 (beskrevet af Daniel I et al., 1985) blev anvendt i denne undersøgelse.

I De forskellige cellelinjer og de humane lymfocytter blev dyrket i et RPMI-1640-sus- I 20 pensionsmedium (GIBCO-BRL, Cergy-Pontoise, Frankrig) indeholdende 10% (vol/vol) føtalt kalveserum; 2 pg/ml polybren (SIG-ΜΑ) blev sat til de HlV-infice* I rede cellekulturer. Celler fra klonen CEM13 stammer fra CEM-cellelinjen af humane lymfoide celler (deponeret i ATCC med nr. CCL119) og udtrykker T4-antigenet på højt niveau. 5 dage efter infektionen med HIV-lemrisolatet eller med HIV-2ROo-25 isolatet producerer ca. 80-90% af cellerne viruspartikler og kan identificeres ved de cytopatogene virkninger, som svarer til vakuolisering af cellerne og fremkomst af syncytier med lille størrelse.

Cellelinjen HUT-78 er en anden cellelinje af positive humane T4-lymfocytter ' 30 (Gadzdar et al., 1980), som i høj grad tillader replikation af SIVmac142 (Daniel et al., 1985). Perifere blodlymfocytter fra sunde bloddonorer blev stimuleret i 3 dage med 0,02% (vægt/volumen) af fraktion P af phytohæmagglutinin (DIFCO, Detroit, USA) i et RPMI-1640-medium tilsat 10% føtalt kalveserum. Cellerne blev derpå dyrket på et RPMI-1640-medium indeholdende 10% (vol/vol) T-cellevækstfaktor 19 DK 175668 B1 (TCGF, Biotest). Efter infektion med HIV-2 blev lymfocytterne dyrket i nærværelse af 10% (vol/vol) TCGF og 2 ng/ml Polybren.

5 III. Metabolisk mærkning af cellerne

Til metabolisk mærkning af proteiner blev inficerede celler inkuberet i 16 timer ved 37°C i et MEM-dyrkningsmedium (engelsk forkortelse af Minimum Essential Medium) uden L-methionin eller serum, men tilsat 200 pCi/ml L-(1 2 3 4 5 6S)methionin. Til 10 metabolisk mærkning af glycoproteinerne blev inficerede celler inkuberet i 1.6 timer ved 37°C i et MEM-dyrkningsmedium' uden serum eller glucose, men tilsat 200 pCi/ml 3H-fucose og 200 pCi/ml D-(6-3H)glucosamin eller 25 pCi/ml MC-mannose.

15 IV. Celler og virusekstrakter

Cellebundfald svarende til 107 celler blev resuspenderet i 100 μΙ af følgende buffer: 10 mM Tris-HCI, pH 7,6, 150 mM NaCI, 1 mM EDTA, 0,2 mM PMSF, 100 enheder/ml aprotinin (Iniprol, CHOAY) før tilsætning af 100 μΙ af samme buffer indeholdende 20 2% (vol/vol) Triton® X-100. Celleekstrakter blev centrifugeret ved 12.000 x g i 10 minutter, og supernatanten blev opbevaret ved -80°C indtil brug. For præparaterne af virusekstrakten blev der tilsat 100 μΙ lOx lysebuffer (100 mM Tris-HCI, pH 7,6, 1,5M NaCI, 10 mM EDTA, 10% (vol/vol) Triton® X-100, 100 enheder/ml aprotinin) pr. ml klaret supernatant af inficerede CEM-celler. Disse præ-25 parater blev anvendt som følger.

V. Fremstilling af en immunabsorbent med antistoffer, som findes i j serum fra en patient, der er seropositiv for HIV-2-virus

Immunglobuliner fra et serum fra en HIV-2-seropositiv patient blev præcipiteret 2 med 50% (NH4)2S04, opløst i 20 mM natriumphosphat (pH 8,0) og derpå oprenset 3 på en DEAE-cellulosesøjle (DE 52, Whatman) ved eluering med 20 mM natrium 4 phosphat (pH 8,0). De således oprensede immunglobuliner blev bedømt til at være 5 90% rene. Antistofferne blev derefter koblet til Sepharose® CL 4B aktiveret med 6 CNBr ifølge den teknik, der er beskrevet af Berg (1977). 2 pg IgG blev koblet pr.

I DK 175668 B1 I

I I

ml Sepharose® CL 4B. Denne immunabsorbent betegnes "HIV-2-serum-Sepharo- I

I I

VI. Bindinger af HIV-2-proteiner på en immunaffinitetssøjle I

I 5 I

Celleekstrakter fra HIV-2-producerende CEM-celler blev først fortyndet i 2 volu- I

I mener koblingsbuffer (20 mM Tris-HCI, pH 7,6, 50 mM KCI, 150 mM NaCI, 1 mM . I

I EDTA, 1% (vol/vol) Triton® X-100, 20% (vol/vol) glycerol, 7 mM mercaptoethanol, I

I 0,2 mM PMSF, 100 enheder/ml aprotinin) før inkubation med ét volumen "HIV-2- I

I 10 serum-Sepharose". Supernatanter af celler, som producerede HIV-2-virus, blev I

I behandlet på samme måde som celleekstrakterne bortset fra, at 1/10 af koblings- I

I bufferen koncentreret lOx blev tilsat pr. volumen af supernatanten. Koblingstrinnet I

I blev udført natten over, hvorefter søjlen blev vasket tilstrækkeligt i koblingsbuf- I

I feren. De proteiner, der var bundet til søjlen, blev elueret ved at lade dem koge i I

15 en elektroforesebuffer (125 mM Tris-HCI, pH 6,8, 1% (vægt/volumen) SDS, 2M I

I urinstof, 20% glycerol, 1% β-mercaptoethanol). De eluerede proteiner blev analy- I

seret på 7,5%’s SDS-polyacrylamid-elektroforesegeler indeholdende 6M urinstof og I

I 0,1% bis-acrylamid i stedet for 0,2% (vægt/volumen). I

20 VIL Præparativ elektroforese I

I

De HIV-2-glycoproteiner, der blev elueret fra affinitetssøjlen, blev analyseret ved I

elektroforese på polyacrylamidgel som beskrevet ovenfor, og de regioner af gelen, I

I som indeholdt virusglycoproteinerne, blev skåret ud med reference til positionen af I

I 25 proteinmarkører med i forvejen fastsat molekylvægt (BRL). I

I Glycoproteinerne blev elueret ved inkubation i 16 timer ved 4°C i en elueringsbuffer I

I (0,1M NaHC03, 0,5 mM EDTA, 0,05% (vægt/volumen) SDS, 0,2 mM PMSF). De så- I

I ledes vundne glycoproteinfraktioner blev lyofiliseret og opbevaret i køleskab, indtil I

I 30 de skulle anvendes. I

I VIII. Elektroforese på gel i to dimensioner I

I Der blev udført elektroforese på gel i to dimensioner som beskrevet af O'Farrel I

I 35 (1975) med følgende modifikationer: proteiner, der var mærket med L-(35S)methi- I

21 DK 175668 B1 onin og bundet til en "HIV-2-serum-Sepharose"-søjle, blev elueret ved at lade dem koge i en elektroforesebuffer som beskrevet ovenfor før fortynding i ét volumen buffer indeholdende 9,5M urinstof, 8% (vol/vol) mercaptoethanol, 1,6% (vægt/vo-lumen) ampholiner ved en pH i området 6,5-9, 0,4% (vaegt/volumen) ampholiner 5 ved en pH i området 3-10 og 100 enheder/ml aprotinin.

EKSEMPEL 1

Karakterisering af glycoproteinerne gp300 og gpl40 10

Det opspaltningsskema, der blev opnået ved elektroforetisk analyse på gel i to dimensioner af glycoproteinerne gp300, gpl40 og gpl25, der var mærket med 35S-methionin, viser, at gp300 og gpl40 er beslægtede. Disse to proteiner giver forskellige aflejringer på gelen, men de har et identisk isoelektrisk punkt (pi) for en 15 pH, der går fra 6,8 til 7,8. Disse resultater er vist i fig. 2. Denne lighed mellem proteinerne gpl40 og gp300 tyder på, at gp300 er en dimer form af gpl40.

gpl25 har mindre heterogenitet både i de inficerede celler og i viruspartiklerne og vandrer ved et isoelektrisk punkt ved pH-værdier på mellem 6,2 og 6,5.

20 I de inficerede celler bemærkedes tilstedeværelsen af mindre underenheder af proteinet gpl25 med et isoelektrisk punkt ved pH-værdier mellem 7,2 og 7,3. Denne sidstnævnte kategori af proteiner er ikke til stede i HIV-2-virionen, hvorfor den sandsynligvis udgør et ikke-definitivt dannet glycoprotein.

25

Den sure natur af modent gpl25 kan skyldes sialsyren ved visse carbonhydrat-kæder, der er tilføjet under modningen af kappeglycoproteinet.

Kappeglycoproteinet gp300 er meget stabilt, idet det er modstandsdygtigt over for 30 ioniske detergenter (1% SDS) og ikke-ioniske detergenter (2% Triton X-100®), over for urinstof (2-6M), over for kraftige salte (1M NaCI) og over for reduktionsmidler (1% β-mercaptoethanol). Det har imidlertid kunnet fastslås, at gp300 kan nedbrydes i et medium ved sur pH, idet der dannes to gpl40-glycoproteiner. I disse forsøg blev proteiner, der var bundet til en immunaffinitetssøjle, inkuberet i en 35 acetatbuffer ved pH-værdier på mellem 4 og 7. Disse prøver blev derpå analyseret

DK 175668 B1 I

ved elektroforese på polyacrylamidgel. Fig. 3A, hvor resultaterne er vist, viser, at I

et gp300-bånd omdannes til et bånd, som svarer til gpl40's position, når prøven I

inkuberes ved pH 4. Andre forsøg er foretaget under anvendelse af oprensede præ- I

parater af gp300, der var vundet ud fra præparative elektroforesegeler som be-

5 skrevet ovenfor. Sådanne denaturerede prøver af gp300 blev fuldstændig ned- I

brudt i en acetatbuffer ved pH 6,0. Resultaterne af disse forsøg er vist i fig. 3B. I

Effektiviteten af nedbrydningen af det oprensede gp300-glycoprotein skyldes sand- I

synligvis sænkningen af pH og tilstedeværelsen af SDS-rester i den lyofiliserede I

prøve, idet det native gp300-glycoprotein, der var bundet til en søjle, ikke kunne I

10 nedbrydes i samme buffer ved pH-værdier på over 5. I

I en Tris-HCI-buffer er nedbrydningen mindre effektiv. Ved pH 7,5 bemærkes kun I

en svag nedbrydning af gp300 i form af gpl40, hvilket dog stiger ved sænkning af I

pH-værdieme. I en Tris-buffer ved pH 6,0 var nedbrydningen ca. 80%, hvilket er I

15 vist i fig. 3C. Ved nedbrydning af rent gp300 i en anden acetatbuffer eller Tris-HCI- I

buffer kunne der ikke detekteres andre proteiner end gpl40 (forsøgene blev udført I

på 15% polyacrylamidgel). Disse resultater antyder, at gp300 er en dimer form af I

gpl40, som selv er en precursor for HIV-2-kappeglycoproteinet. Derfor er det

sandsynligt, at to gpl40-molekyler ved dannelsen af kappeglycoproteinet tager del H

20 i en fusionsmekanisme, som er afhængig af pH. H

EKSEMPEL 2 I

Karakterisering af laterale oligosaccharidkæder i HIV-2-glycoproteiner I

25 I

En spaltning med endo-p-N-acetylglucosaminidase H (endo-H) gjorde det muligt i I

HIV-2-glycoproteinerne at påvise tilstedeværelsen af oligosaccharider bundet til I

H

nitrogen (Tarentino et al., 1974). gp300, en blanding af (gpl40, gpl25) og gpl25 I

alene blev oprenset ved affinitetskromatografi og præparativ elektroforese (se I

30 "eksperimentelle procedurer"). De lyofiliserede prøver blev suspenderet i en endo- I

H-spaltningsbuffer, som ikke fremmer nedbrydning af gp300 til gpl40. I

Efter spaltning med endo-H svarer den elektroforetiske mobilitet af gp300 til den I

svagere mobilitet af et protein på 200-250 kd. En lille fraktion af gp300, der var . I

35 nedbrudt til gpl40, blev spaltet og gav et protein på 80 kd. Resultaterne er vist i I

23 DK 175668 B1 fig. 4, sektion gp300. Den prøve, der indeholdt en blanding af gpl40 og gpl25, blev spaltet med endo-H og gav proteiner på 90 og 80 kd, mens gpl25 alene blev omdannet til et protein på 90 kd under denne spaltning, hvilket er vist i sektionerne gpl40/125 og gpl25 i fig. 4. En spaltning af gpl40 og gpl25 med endo-H giver 5 produkter med en molekylvægt på henholdsvis 80 og 90 kd.

Ved metabolisk mærkning af cellerne med HC-mannose og 3H-fucose blev det påvist, at mannose var inkorporeret i gp300, gpl40 og gpl25, hvorimod kun gp300 og gpl25 var i stand til at inkorporere fucose (fig. 5). Fucoseresterne overføres 10 normalt til oligosaccharidkæder på et fremskredet stadium af glycosyleringscyklen efter virkningen af kohæsionsenzymerne i det endoplasmatiske retikulum og Golgi-apparatet (Kornfeld og Kornfeld, 1985; Fuhrmann et al., 1985).

Af disse grunde kan man formode, at gpl25's svage modstandsdygtighed over for 15 spaltning med endo-H i forhold til gpl40 efter al sandsynlighed skyldes omdannelse af visse laterale oligosaccharidkæder af mannosetypen til komplekse oligosac-charider ved omdannelsen af kappeglycoproteinet (Kornfeld og Kornfeld, 1985).

Den omstændighed, at gpl40 ikke indeholder fucoserester, stemmer overens med, at det udgør en precursor for gp300 og gpl25.

20 EKSEMPEL 3

Virkning af tunicamycin, en glycosyleringsinhibitor, på dannelsen af HIV-2-glycoproteiner 25

Alle de glycoproteiner, der bærer oligosaccharider bundet til nitrogen, modtager deres oligosaccharidkæde Glc3Man9-GlcNAc2-pp-dolichol på grund af en reaktion, der udføres af proteinet oligosaccharidyl-transferase, som katalyserer blokoverførslen af oligosaccharidkæder til asparaginrester (se Kornfeld og Kornfeld, 1985).

30 Tunicamycin blokerer en sådan nitrogenforbundet glycosylering ved at inhibere produktionen af N-acetylglucosamin-pyrophosphoryldolichol, som er det første trin i samlingen af oligosaccharider, der er forbundet af lipiderne (Li et al., 1978; Heifetz et al., 1979). I nærværelse af 2 pg/ml tunicamycin blokeres hele den nitrogenforbundne glycosylering af HIV-2-kappeglycoproteinerne i de inficerede celler. Dette 35 resultat kan påvises ved manglende inkorporering af 3H-glucosamin i virus-glyco-

I DK 175668 B1 I

Η

I 24 I

proteinerne gp300, gpl40 og gpl25 (fig. 6). Under disse forsøgsbetingelser blev I

syntesen af proteinet imidlertid ikke påvirket i de inficerede celler, som var be- I

handlet med tunicamycin. Sådanne kulturer, der var mærket med 35S-methionin- I

isotoper, indeholder to større proteiner med en skønnet vægt pi 200 og 80-90 kd, I

5 som vandrer i store bånd (fig. 6). Disse proteiners molekylvægt falder sammen I

med produkterne fra spaltningen med endo-H af gp300, gpl40 og gpl25 (fig. 4), I

hvilket antyder, at proteinerne med en molekylvægt på 200 kd og 80-90 kd svarer I

til ikke-glycosylerede former af HIV-2-kappeglycopro-teinerne. I

10 Molekylvægten af proteinet på 80-90 kd svarer til den forventede molekylvægt af I

den ikke-glycosylerede HIV-2-kappeprecursor, beregnet ud fra dens nukleotid- I

sekvens (Guyader et al., 1987). Glycoproteinet på 200 kd er formodentlig den I

dimere form af den ikke-glycosylerede kappeprecursor. Disse resultater bekræfter, I

at HIV-2-kappeproteinerne indeholder polysaccharidkæder forbundet til nitrogen. I

I 15 Foruden inhiberingen af glycosyleringen inhiberer en behandling med tunicamycin I

dannelse og eksport af kappeglycoproteinet, eftersom proteinet på 80-90 kd ikke I

I er påvist i det ekstracellulære miljø, hvilket er vist i fig. 6, bane SN. I

I Resultaterne af disse forsøg gør det muligt at antage, at glycosaccharidkæderne af I

20 HIV-2-kappeproteinerne sandsynligvis er impliceret i den cellulære transport gen- I

nem Golgi-apparatet. Fraværet af ikke-glycosylerede former af kappeproteinet i det I

ekstracellulære miljø af celler, der er behandlet med tunicamycin, kan eventuelt I

I skyldes den hurtige nedbrydning. Flere rapporter har antydet, at den ikke-glycosy- I

I lerede form af et protein generelt er mere følsom over for proteasers virkning end I

I 25 den glycosylerede form (Olden et al., 1978; Schwartz et al., 1976). I overensstem- I

I 1 melse med disse resultater repræsenterer de proteiner med lille molekylvægt, der I

I findes i celler, som er mærket med 35S-methionin og dyrket i tunicamycin, formo- I

I dentlig produkter fra en delvis nedbrydning af det ikke-glycosylerede kappeprotein I

I (fig. 6). I

I 30 1

35 I

25 DK 175668 B1 EKSEMPEL 4

Virkninger af oligosaccharid-kohæsionsinhibitorer på syntesen og transformationen af HIV-2-glycoproteiner 5

Oligosaccharider bundet til asparagin (GIC3Man9GlcNAc2) fra glycoproteiner undergår omfattende modifikationer eller en transformation som følge af deres binding til proteinerne (se Kornfeld og Kornfeld, 1985). Elimineringsreaktioner af glucose- og mannoseenderne ved hjælp af enzymerne finder sted i lumen på det ru endoplas-10 matiske retikulum (RER) og i Golgi-apparatet ved indvirkning af specifikke manno-sidaser og glucosidaser.

Man kan gribe ind i transformationen af oligosaccharidkæderne i glycoproteiner ved at anvende specifikke inhibitorer af glucosidaser og mannosidaser (beskrevet af 15 Schwarz og Datema, 1984; Fuhrmann et al., 1985). I disse forsøg er der anvendt forskellige forbindelsesinhibitorer for at undersøge lokaliseringen af precursorer for HIV-2-glycoproteinet og også for at undersøge glycosyleringens rolle i transformationen af kappeprecursoren. De anvendte inhibitorer er følgende: casta nosperm in, et plantealkaloid, som inhiberer glucosidase I (Saul et al., 1983); deoxynojirimycin 20 (dNM), en glucoseanalog, som inhiberer glucosidaserne I og II og sørger for eliminering af glucoseenderne (Lemansky et al., 1984); deoxymannojirimycin (dMM), en mannoseanalog, som inhiberer de reaktioner, der katalyseres af mannosidase (Fuhrmann et al., 1984); bromconduritol (6-brom-3,4,5-trihy-droxycyclohex-l-en), som inhiberer glucosidase II (Datema et al., 1982); swainsonin, et indolizidin-25 alkaloid, som inhiberer mannosidase II fra Golgi-apparatet (Tulsiani et al., 1982).

HIV-2-inficerede celler, der var mærket med 35S-methionin-isotoper i fravær eller nærværelse af forskellige forbindelsesinhibitorer og intracellulære og ekstracellu-lære proteiner, blev oprenset ved affinitetskromatografi (fig. 7). Det blev bekræf-30 tet, at de inficerede celler indeholder gp300, gpl40 og gpl25, mens kun gpl25 observeres i det ekstracellulære miljø (resultaterne er vist i fig. 7, sektionerne "celler" og SN, bane T). I de celler, der var behandlet med castanospermin eller dNM, blev der observeret et normalt gp300-niveau, fravær af gpl25 og en lille mængde af et protein på 150 kd, som formodentlig svarer til den glycosylerede 35 form af gpl40. I sådanne celler var transformationen af kappeglycoproteinet der-

I DK 175668 B1 I

I I

I med blokeret, fordi der ikke detekteres noget gpl25 i det ekstracellulære miljø pi I

I trods af produktionen af p26, der er et kemeprotein fra HIV-2 (fig. 7, banerne I

I Cast, og dNM). I

5 Disse resultater viser, at fjernelse af terminale glucoserester fra oligosaccharid- I

kæder i precursoren for kappeglycoproteinet er nødvendig for dens transformation I

I og spaltning med cellulær protease. Bromconduritol, som virker pi glucosidase II, I

H , inhiberede også 70-90% af den normale produktion af gpl25, men mængderne af I

I gpl40 og gp300 forblev normale (fig. 7, bane Bro.). I modsætning til castanosper- I

I 10 min og dNM (som inhiberer fjernelsen af den terminale glucoserest) blokerer be- I

handling med bromconduritol (som inhiberer fjernelsen af de to interne glucose- I

I rester) ikke fuldstændig transformationen af HIV-2-kappeglycoproteinet. Faktisk I

I kan der detekteres en lille mængde gpl25 i de intracellulære og ekstracellulære I

I miljøer. Dette sidste resultat tyder på, at et ringe niveau af mannoseeliminering I

I 15 kan forekomme uden fjernelse af de to interne glucoserester. I

Inhibitorer af mannosidase, swainsonin og dMM, har ikke medført synlige modifika- I

I tioner af den intracellulære mængde af gp300, gpl40 eller gpl25, men det ekstra- I

I cellulære niveau af gp!25 var 50% mindre end den tilsvarende form i kontrolceller I

I 20 (fig. 7, bane Sw og dMM). Selv om oligosaccharidkaeden kun har undergået en de- I

glycosylering, spaltes precursoren for glycoproteinet således pi grund af proteo- I

lytiske enzymer, hvilket giver et protein, der ligner gpl25, men indeholder mere I

mannose, hvilket formodentlig påvirker den cellulære transport af gpl25. Molekyl- I

vægten af det ekstracellulære glycoprotein, der produceres i nærværelse af dMM, I

25 er en smule højere end molekylvægten af det protein, der produceres i fravær af I

inhibitoren. Dette skyldes sandsynligvis en højere koncentration af mannoserester i I

det ekstracellulære protein, der syntetiseres af de dMM-behandlede celler (fig. 7, I

sektion SN). I 1

35 I

Af ovenstående kan udledes, at virkningerne af enzymelimineringsinhibitorer på I

transformationen af HIV-2-kappeglycoproteinet er specifikke, eftersom syntesen og I

produktionen af p26 fra HIV-2 overhovedet ikke påvirkes (fig. 7, sektion SN). I

27 DK 175668 B1 EKSEMPEL 5

Virkning af castanospermin og monensin på transformationen af HIV-2-glycopro-teiner 5

For at undersøge den intracellulære transformation af HIV-2-glycoproteiner blev der udført forsøg under anvendelse af sporstoffer (pulse-chase). HIV-2-inficerede celler blev hurtigt mærket med radioaktivt 35S-methionin i 15 minutter efterfulgt af inkorporering af sporstoffet (chase) i 0,5, 1,5 og 3 timer (fig. 8, kontrol). gpl40 er 10 det første protein, der detekteres 15 minutter efter mærkningen. Under den efterfølgende inkorporering af det radioaktive sporstof kan gp300 detekteres efter 1/2 time, mens gpl25 først detekteres efter 1,5-3 timer. Den omstændighed, at gp300 observeres efter syntesen af gpl40, og at gpl25 først detekteres efter dannelse af gp300 (fig. 8A, bane 1-4), tyder på, at dimerisationen er et mellemliggende stadi-15 um, der er nødvendigt for transformationen af oligosaccharidet til et glycoprotein, der er blevet modent, gpl25. Denne antydning bekræftes ved anvendelse af castanospermin, som inhiberer undertrykkelsen af den eksterne glucoserest og polysac-charidkæderne. Efter 30 minutters mærkning (pulse) i nærværelse af castanospermin detekteres der et protein på 150 kd med gp300 (fig. 8, Cas., bane 1). Prote-20 inet på 150 kd kan svare til gpl40; den svage stigning i den første precursors molekylvægt tilskrives tilstedeværelsen af glucoserester i oligosaccharidkæderne. Således udgør gpl40, der er syntetiseret i HIV-2-inficerede celler, precursoren for glycoproteinet uden glucoserester. I overensstemmelse med dette resultat udgør proteinet på 150 kd (gpl50) det første HIV-2-kappeglycoprotein, som endnu ikke 25 er blevet modent. Fjernelse af glucoserester i kontrolcellerne svarer til en hurtig transformation, som finder sted under eller umiddelbart efter den cotranslationelle translokation af glycoproteinprecursorerne i det endoplasmatiske retikulum (Lemansky et al., 1984). Efter 30 minutters mærkning (pulse) og 3 timers efterfølgende inkorporering af sporstoffet (chase) i nærværelse af castanospermin 30 reduceres niveauet af gpl50 gradvist, mens mængden af gp300 vokser (fig. 8,

Cast., bane 1-4). Under disse forsøgsbetingelser spaltes precursoren ikke til dannelse af gpl25.

En anden karakterisering af HIV-2-kappeglycoproteinet blev udført ved forsøg, der 35 angik inkorporering af radioaktivt sporstof (pulse-chase) under anvendelse af mo- Η

DK 175668 B1 I

I I

nensin, en kationisk ionophor, som inhiberer transport af proteiner fra Golgi-appa- I

ratet hen til plasmamembranen eller i visse tilfælde blokerer transport af proteiner I

ved cisternerne i det mediale Golgi-apparat (Tartakoff og Vassali, 1977; Johnson I

I og Schlesinger, 1980; Strous og Lodish, 1980; Griffiths et al., 1983). HIV-2-infice- I

5 rede celler bide i fravær og i nærværelse af monensin blev mærket med et radio- I

aktivt sporstof (pulse) i 30 minutter, hvorefter inkorporeringen af sporstoffet blev I

fulgt (chase) i 0,5, 1,5 og 3 timer (fig. 8B). I nærværelse af monensin syntetisere- I

I de de HIV-2-inficerede celler gpl40 i et normalt niveau samt den dimere form I

deraf. Derimod kunne der ikke detekteres spor af gpl25 i celler behandlet med I

I 10 monensin. Efter 1,5-3 timers følgning af inkorporeringen af sporstoffet (chase) har I

de celler, der er behandlet med monensin, akkumuleret et protein på 135 kd I

(gpl35), som formodentlig er et nedbrydningsprodukt fra precursoren for dimeren. I

gpl35's lidt mindre molekylvægt end gpl40 skyldes fjernelse af visse mannoseres- I

ter ved indvirkning af mannosidaserne fra RER og Golgi-apparatet. Dette gpl35 I

15 kan derefter transporteres til plasmamembranen og spaltes af den cellulære prote- I

ase. Inhibering af transporten af proteiner ved hjælp af monensin blokerer gpl35- I

glycoproteinet i "trans"-delen af Golgi-apparatet (trans-Golgi). Der detekteres intet I

I modent kappeglycoprotéin i de celler, der er behandlet med monensin, hverken I

I intracellulært eller ekstracellulært, hvorimod kerneproteinet ("core") p26 synte- I

I 20 tiseres og udskilles. I

I EKSEMPEL 6 I

I Dimerisation af precursoren for glycoproteiner i celler inficeret med SIVmac I

25 I

I Nukleotidsekvensen af HIV-2-kappeglycoproteinet viser en betydelig homologi I

I (75% identiske aminosyrer) med sekvensen af SIV (Guyader et al., 1987; Chakra- I

barti et al., 1987; Franchini et al., 1987). Derfor blev der udført undersøgelser for I

I i at bestemme, om dimerisationen af kappeglycoproteinerne ligeledes kan detekte- I

I I 30 res i celler inficeret med SIV. SIV-proteiner blev oprenset på immunaffinitetssøjle I

I indeholdende specifikke antistoffer rettet mod HIV-2-proteinerne i det omfang, I

I hvor proteinerne gag, pol og env fra HIV-2 og SIV udviser antigene krydsreaktio- I

ner. Fig. 9 viser, at celler inficeret med SIV syntetiserer tre proteiner med en høj I

I molekylvægt, som er analoge med dem, der syntetiseres i celler inficeret med HIV- I

I -Il 29 DK 175668 B1 2: gp300, gpl40 og gpl30. Beviset for, at de glycoproteiner, der findes i SIV-inficerede celler, er glycoproteiner, blev tilvejebragt ved isotypisk mærkning med I4C-mannose og 3H-fucose. Disse tre proteiner inkorporerede mannose, men kun gp300/SIV og gpl30/SIV inkorporerede fucose. gp300/SIV og gpl40/SIV er intra-5 cellulære proteiner, mens gpl30/SIV er et ekstracellulært glycoprotein. Det faktum, at gp300/SIV og gpl30/SIV er i stand til at inkorporere fucose, viser, at disse proteiner er transformationsprodukter af gpl40/SIV.

Disse resultater viser, at dannelse i dublet (dimer) af precursoren for kappegly-10 coproteinet er en specifik egenskab ved ekspressionen af genet for HIV-2- og SIV-kappen. Det kan omvendt hævdes, at HIV-l-kappeglycoproteinet ikke undergår dimerisation under dets transformation. Celler, der er inficeret med HIV-1 i nærværelse af castanospermin eller dNM, akkumulerer ikke kappe-dimer, som det er tilfældet med HIV-2 eller SIV.

15

DISKUSSION

Som eksemplerne viser, er det lykkedes opfinderne at bestemme processen til dannelse af HIV-2-kappeglycoproteinet, og de har påvist en original mekanisme i 20 syntesen af glycoproteinerne, der omfatter oligosaccharidkæder bundet til nitrogen. HIV-2-kappeglycoproteinerne, dvs. det ekstracellulære gpl25-glycoprotein og det transmembrane gp36-glycoprotein, stammer fra et fælles precursorglycoprote-in (Guyader et al., 1987). Et uventet element, som er beskrevet ifølge opfindelsen, er, at precursoren for glycoproteinet for at blive transporteret og transformeret i 25 Golgi-apparatet forudsætter dannelse af en homolog dimer. Mekanismen for dimerisation af kappeglycoproteinet er endnu ikke fuldstændig klarlagt. Den omstændighed, at den dimer, der er oprenset ifølge opfindelsen, kan nedbrydes ved en sur pH (pH 6,0), tyder på, at dimerisationen kan være pH-afhængig. 1 2 3 4 5 6

Opfinderne har påvist, at de oligosaccharidkæder, der findes i den naturlige precur 2 sor for glycoproteinet, ikke er essentielle for dannelsen af dimeren. Dette er påvist 3 ved to forsøg: (1) spaltning med endo-H fører til en modifikation af dimerens elek 4 troforetiske mobilitet uden nedbrydning af denne; (2) i nærværelse af tunicamycin 5 syntetiserer HIV-2-inficerede celler en ikké-glycosyleret kappeprecursor 6 (80-90 kd), der er i stand til at danne en dimer (200 kd). Disse resultater under-

I DK 175668 B1 I

I I

H bygger den kendsgerning, at dannelse af en dimer er en iboende egenskab hos I

kappeprecursorens polypeptidskelet. I

H Forsøg med mærkning i et kort tidsrum (på engelsk "pulse") med et radioaktivt I

5 sporstof, efterfulgt af et trin med fjernelse af dette sporstof ved udvaskning og I

erstatning af det med ikke-radioaktive molekyler, efterfulgt af lokalisering af I

radioaktiviteten (pi engelsk "chase") ud fra prøver, der er taget med forskellige I

tidsintervaller, med eller uden castanospermin (fig. 8) viser, at dimerisationen af I

precursoren for glycoproteinet normalt indtræder umiddelbart efter undertrykkel- I

10 sen af glucoseresterne. Da glucosidaserne er forbundet med membranerne i det I

endoplasmatiske retikulum, kan det formodes, at dimerisationen griber ind i RER. I I

nærværelse af castanospermin akkumuleres dimeren i RER og transformeres ikke. I

H Nar glucoseresterne imidlertid undertrykkes, forhindrer inhibering af mannosida- I

serne i RER ikke transformationen af de dimeriserede glycoproteiner tværs gennem I

15 Golgi-apparatet (fig. 7). Dette tillader opstilling af den hypotese, at glucoseresterne I

i oligosaccharidkæderne på den dimeriserede precursor forhindrer dens udstødelse I

I fra RER. I overensstemmelse hermed kan der fremsættes den hypotese, at spalt- I

ning af glucoseresterne er nødvendig for at opnå en effektiv transport fra RER hen I

I mod Golgi, idet dette eventuelt skyldes, at de deglycosylerede oligosaccharider I

20 udgør en del af stedet for genkendelse af en receptor for transporten (Lodish og I

I , Kong, 1984; Lemansky et al., 1984). Det er også muligt, at undertrykkelsen af I

glucose er vigtig, for at den dimeriserede precursor antager en korrekt funktionel I

I konfiguration (Schlesinger et al., 1984). Denne funktionelle konfiguration ville I

fremme virkningen af spaltningsmannosidaserne. I

I 25

I I lyset af disse resultater har opfinderne foreslået et skema, der viser transforma- I

I . tionen af HIV-2-kappeglycoproteinerne (fig. 10). Den formodede størrelse af poly- I

I peptidskelettet af precursoren for kappeglycoproteinet er ca. 80 kd (fig. 4 og 6).

I Oligosaccharidkæden overføres fra dolichol-P-P hen mod en kappe-precursor 30 (80 kd), formodentlig på aminosyrerester af asparagintypen, der fungerer som I acceptorer (Kornfeld og Kornfeld, 1985). Tunicamycin inhiberer samlingen af I dolichol-P-P og glycan, og derfor glycosyleres proteinet på 80 kd ikke. Tilføjelse af oligosaccharidkæder til proteinet på 80 kd fører til opnåelse af den første precursor I for kappeglycoproteinet, gpl50. Denne precursor kan eksistere, som den er, eller i I 35 modsat ikke eksistere i de inficerede celler, for tilføjelse af polysaccharidkæder og 31 DK 175668 B1 spaltning af glucoseresterne sker formodentlig under translationen af precursoren.

Hvad der end er tilfældet, deglycosyleres gpl50 hurtigt og danner gpl40. På dette stadium styrer en forskel i miljøet, måske på pH-niveau, dannelsen af dimeren ved fusion af to gpl40-molekyler. Det resulterende gp300 kan derefter spaltes med en 5 mannosidase fra RER og transporteres hen mod Golgi-apparatet. I nærværelse af castanospermin eller dNM dimeriseres gpl50 og akkumuleres i RER. Denne dimer transformeres ikke, fordi den er glycosyleret. Så længe dimeren findes i deglycosy-leret form, kan den imidlertid transporteres ind i Golgi; inhibering af mannosidase fra RER med dMM blokerer ikke opnåelsen af den dimeriserede precursor.

10 I Golgi passerer gp300 gennem de forskellige hulrum, formodentlig ved vesikulær transport (Griffiths og Simons, 1986). Under denne transport spaltes oligosaccha-ridkæden med mannosidaserne fra Golgi før tilføjelse af andre sukkere såsom fucose og sialsyre. Påvisning af inkorporeringen af fucose blev opnået ved isotypisk 15 mærkning af gp300 med 3H-fucose. Påvisning af inkorporeringen af sialsyre blev opnået indirekte ved spaltning af gp300 med neuramidase, et enzym, som er i stand til at hydrolysere N-acetylneuraminsyrer, som er terminale i forskellige gly-coproteiner (Peyrieras et al., 1983). gp300 fra HIV-2 kan spaltes med neuramidase, hvilket den betydelige formindskelse af dimerens elektroforetiske mobilitet 20 viser. Resultaterne stemmer overens med den iagttagelse, at precursoren bevarer sin dimeriserede form under hele sin transport og transformation i Golgi, cis-, medial- og trans-cisterner, før den transporteres ind i trans-Golgi-netværket (TGN; !

Griffiths og Simons, 1986), hvor den nedbrydes ved en sænkning af pH-værdien i dette hulrum. Den nedbrudte dimer fører til glycoproteiner (gpl35) med en mole-25 kylvægt, der er lidt mindre end molekylvægten af precursoren for det først detekterede glycoprotein (gpl50-140). gpl35 kan eventuelt transporteres hen mod plasmamembranen og således spaltes med den cellulære protease, før dette fører til modne HIV-2-kappeglycoproteiner, gpl25 og gp36. Monensin inhiberer formodentlig transporten fra Golgi hen mod plasmamembranen; derfor akkumuleres i 30 gpl35 i Golgi.

Det er kendt, at Golgi-apparatet er involveret i mekanismen med sortering af udskilte proteiner og proteiner fra plasmamembranen. Denne mekanisme finder tilsyneladende sted i det terminale hulrum i Golgi, der betegnes TGN (Griffiths og 35 Simons, 1986). Dette hulrum svarer til ”trans"-siden af stakke i Golgi, som under-

Claims (19)

1. 20 I
2. 1. Retroviralt antigenglycoprotein, I I kendetegnet ved, at det drejer sig om: I I - enten et glycoprotein benævnt gp300 med en molekylvægt på ca. 300 kd I I 25 bestående af forbindelsen mellem to enheder af et precursorglycoprotein I I gpl40, især for kappeglycoproteinet gpl25, der indkodes af env-genet fra I I genomet af et humant HIV-2-retrovirus, der kan fremkalde SLA eller AIDS, I I - eller dimeren af precurseren for kappeglycoproteinet af en retrovirus, som I I krydsreagerer immunologisk med antistoffer rettet mod gp300-glycoproteinet. I
3. 30 I 2. gp300-antigenglycoprotein ifølge krav 1, I I kendetegnet ved, at det har følgende egenskaber: I DK 175668 B1 33 det findes i cellerne i en biologisk prøve fra en patient, der er inficeret med et humant retrovirus af HIV-2-familien, især i de humane T4-lymfocytter eller i permanente cellelinjer afledt af disse T4-lymfocytter, dets isoelektriske punkt (pi) opnås ved en pH-værdi i området [6,8 - 7,8), 5. det glycosyleres af oligosaccharidkæder forbundet til nitrogen, det er stabilt i ioniske detergenter, især 1% SDS, i ikke-ioniske detergenter, især 2% Triton® X-100, i 4M urinstof, i kraftige salte og i reduktionsmidler, det spaltes spontant in vitro til to glycoproteiner med en molekylvægt på ca. 140 kd ved pH 4-5, 10. efter isolering og oprensning på elektroforesegel spaltes det i en acetatbuffer in vitro til to glycoproteiner med en molekylvægt på ca. 140 kd ved pH-værdier, der er lig med eller mindre end 6, det udviser et elektroforesebånd på en 7,5%’s SDS-polyacrylamidgel i nærværelse af 6M urinstof svarende til en molekylvægt på 300 kd efter 15 oprensning på en immunaffinitetssøjle af typen HIV-2-serum-Sepharose®, der indeholder specifikke antistoffer, der er vundet ud fra serum fra en patient, som er inficeret med humant HIV-2-retrovirus.
4. 3. Antigenglycoprotein ifølge krav 1 eller 2, 20 kendetegnet ved, at det ikke fremkaldes ved elektroforetisk analysering af et biologisk medium, der udgøres af viruspartikler, som findes i det specifikke dyrkningsmedium for celler inficeret med humant HIV-2-retrovirus, efter mærkning med 35S-methio-nin (200 pCi/ml, 4 x 101 2 celler/mi) i 18 timer og oprensning af de vundne ekstrakter, som indeholder de inficerede celler og deres tilsvarende 25 dyrkningsmedium, hvorimod det fremkaldes under samme betingelser i de inficerede celler.
5. 4. Protein p200 afledt af glycoproteinet ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3, kendetegnet ved, at det har et ikke-glycosyleret skelet, som er identisk med 30 skelettet af glycoproteinet, og at det har en molekylvægt på ca. 200 kd og er forskelligt fra glycoproteinet som følge af fraværet af glycosyleringsgrupper. Oprenset glycoprotein gpl50, der kan detekteres in vitro i celler fra en patient inficeret med humant HIV-2-retrovirus, 2 35 kendetegnet ved: I : DK 175668 B1 I I I en molekylvægt på ca. 150 kd, I H - peptidskelettet af precursoren for kappeglycoproteinet gpl25, der indkodes I H af env-genet fra genomet af et humant HlV-2-retrovirus eller et retrovirus, I H · 5 hvis ydre kappeglycoprotein genkendes af antistoffer fra et serum fra en I patient, der er inficeret med det humane HIV-2-retrovirus, især antistoffer I rettet mod gpl25, I - terminale glucoserester på en oligosaccharidkæde. I
6. 6. Antigenpræparat til diagnose af tilstedeværelsen af antistoffer i celler fra en bio- I : logisk prøve fra en patient, som er inficeret med et humant retrovirus af HIV-2- I typen, I kendetegnet ved, at det omfatter et antigenprotein eller -glycoprotein ifølge I et hvilket som helst af kravene 1-5. I I 15 I
7. 7. Monoklonalt antistof, I I kendetegnet ved, at det genkender glycoproteinet ifølge et hvilket som helst I af kravene 1-3, og at det ikke genkender de modne kappeglycoproteiner gpl25 og I I ; gp36. I II20. I
8. 8. Monoklonalt antistof, I I kendetegnet ved, at det genkender en epitop, som i glycoproteinet ifølge et I hvilket som helst af kravene 1-3 er blotlagt og tilgængeligt for antistoffet, idet den- I ne epi-top imidlertid enten ikke er blotlagt eller er maskeret på de modne gpl25 I 25 og gp36 i deres naturlige konformation. I
9. 9. Antistof ifølge krav 8, I I kendetegnet ved, at det desuden er neutraliserende, idet det især forhind- I I rer binding af humant HIV-2-retrovirus til dets receptor, især T4-receptoren på de I 30 humane lymfocytter, som omfatter den. I
10. 10. Monoklonalt antistof, I I kendetegnet ved, at det genkender p200 ifølge krav 4, og at det ikke gen- I I kender de modne glycoproteiner gpl25 og gp36. I I 35 I DK 175668 B1 35
11. 11. Monoklonalt antistof, kendetegnet ved, at det genkender en epitop på p200 ifølge krav 4, hvilken epitop imidlertid enten ikke er blotlagt eller er maskeret på gpl25 og gp36 og/eller på gp300, således som de er opnået i deres naturlige konformationer. 5
12. 12. Monoklonalt antistof ifølge krav 11, kendetegnet ved, at det er neutraliserende, idet det især forhindrer binding af humant HIV-2-retrovirus til dets receptor, især T4-receptoren på humane lymfocytter. 10
13. 13. Immunogent præparat, der indeholder et glycoprotein ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3 eller p200 ifølge krav 4 sammen med en farmaceutisk acceptabel bærer, der er egnet til fremstilling af vacciner. 15
14. 14. Immunogent præparat ifølge krav 11, kendetegnet ved, at det indeholder antigenproteiner og -glycoproteiner ifølge et hvilket som helst af kravene 1-4 i en sådan mængde, at dette muliggør administration af en dosis på 10-100 pg/kg. 20
15. 15. Fremgangsmåde til fremstilling af antigenglycoproteinet ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3, kendetegnet ved, at den omfatter følgende trin: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 i - lysering af celler, der er inficeret med et humant HIV-2-retrovirus, og 2 separation af supernatanten og celleekstrakten, 3 inkubation af celleekstrakten og/eller supernatanten på en immunaffinitets 4 søjle, på hvilken der er anbragt en immunadsorbent omfattende oprensede 5 antistoffer, der er vundet fra serummet fra en patient, som er inficeret med 6 humant HIV-2-retrovirus, og hvilke antistoffer med fordel er fikseret på et 7 passende underlag, i nærværelse af en buffer og i et tilstrækkelig langt 8 tidsrum til at opnå dannelse af et immunologisk antigen-antistofkompleks, 9 vask af søjlen med en buffer for at fjerne de molekyler, der ikke er tilbage 10 holdt på underlaget, 11 - opløsning af de eluerede glycoproteiner, I DK 175668 B1 I I isolering af de ønskede antigenproteiner. I
16. 16. Fremgangsmåde ifølge krav 15 til fremstilling af et glycoprotein ifølge et hvilket I H som helst af kravene 1-3, I H 5 kendetegnet ved, at opløsningen af glycoproteinerne sker ved elektroforese I H og ved elektroeluering af de proteiner, der er tilbageholdt på søjlen. I
17. 17. Fremgangsmåde ifølge krav 15 til fremstilling af et glycoprotein ifølge et hvilket I H som helst af kravene 1-3, I H kendetegnet ved, at opløsningen af glycoproteinerne opnås ved I 10. eluering af de proteiner, der er fikseret på immunaffinitetssøjlen, I H - oprensning af de således eluerede produkter på en kromatografisøjle, der I fikseret til separationsunderlaget indeholder monoklonale antistoffer, som I genkender gp300. I
18. 18. Metode til diagnose in vitro af tilstedeværelsen af antistoffer i celler i en bio- I H logisk prøve fra en patient med henblik på at verificere en eventuel infektion med I humant HIV-2-retrovirus, I H kendetegnet ved, at I 20. den biologiske prøve bringes i kontakt med et antigen ifølge et hvilket som helst af kravene 1-5 eller et antigenpræparat ifølge krav 6 under betingel- . ser, der muliggør dannelse af et immunologisk kompleks af antigen- I antistoftypen, - det dannede antigen-antistofkompleks detekteres. I 25
19. 19. Indretning eller kit til detektion af antistoffer i celler i en biologisk prøve fra en i patient, som kan være inficeret med et humant HIV-2-retrovirus, i I kendetegnet ved, at det omfatter: 30. i det mindste ét antigenprotein og/eller -glycoprotein ifølge et hvilket som I helst af kravene 1-5, I - eller et præparat ifølge krav 6, - eller en blanding af disse forskellige bestanddele og , I - midler, der muliggør en reaktion til dannelse af et immunologisk kompleks I 35 mellem ovenstående antigener og de antistoffer, der eventuelt findes i den 37 DK 175668 B1 biologiske prøve, som skal testes, om nødvendigt én eller flere inkubationsbuffere, en negativ kontrolprøve, midler til fremkaldelse af det dannede antigen-antistofkompleks. 5 i