JP2882654B2 - Ｈｉｖ‐３レトロウイルスおよびそれの利用 - Google Patents

Ｈｉｖ‐３レトロウイルスおよびそれの利用

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Description

【発明の詳細な説明】 実質的な発展は、後天性免疫不全症候群またはAIDSを
理解することにおいて行われている。主な病因となる物
質は、T4ヘルパー／インデューサーリンパ球に対し向性
を有する非形質転換レトロウイルスであることが証明さ
れており（1,2）、そして世界中の何百万もの人々が既
に感染していると見積もられている。このウイルスでの
感染は、少なくとも症例の相当な割合において、T4リン
パ球集団の進行性低下を導き、それに付随して、この病
気の特徴である日和見感染に対する感受性の増加をもた
らす。
疫学的研究は、AIDSの症例の大部分の原因である病因
物質でありそして現在最も広まっているHIVであるヒト
免疫不全ウイルス１型（HIV−１）が、おそらく中央ア
フリカに起源を有するであろうことを指摘している
（３）。このウイルスの発見は、別の型のヒオ免疫不全
ウイルスの存在を必ずしも暗示するわではなかった。そ
れにもかかわらず、ヒト免疫不全に関連するレトロウイ
ルスの第二にグループ、即ちヒト免疫不全ウイルス２型
（HIV−２）が西アフリカにおいて同定された（4,5）。
HIV−２はEP−Ａ−0 239 425において開示されている。
HIV−１はWO86/12383において開示されている。他の類
似しているが同一ではないレトロウイルスは、アフリカ
ミドリザル（6,7）およびマカク（8,9）のようなシミア
ン起源（シミアン免疫不全ウイルス、SIV）から単離さ
れている。シミアン単離物はHIV−１よりもHIV−２と遺
伝学上密接に関連するが、それにもかかわらず異なる種
類のものであることが示されている（10）。
比較を複雑にするヒト免疫不全ウイルスの１つの特徴
は、それらの遺伝的変異性であり、遺伝的変異は自発的
に且つ高頻度を起こる。様々なHIV−１単離物の比較に
より、ゲノムの或る領域は非常に可変性であり、また或
る領域は適度に良く保存されていることが示された（11
−16）。HIV−２についても同様な多型性が観察されて
いる（17）。最大の遺伝的安定性を有する領域は、おそ
らく構造的または酵素的に不可欠であるウイルスタンパ
ク質の領域をコードしている領域であろう。総体的に最
大の遺伝的安定性を有するウイルス遺伝子はgagおよびp
ol遺伝子であり、一方env遺伝子の或る領域並びに調節
タンパク質をコードする遺伝子、例えばart，tat，sor
および３′orfは、高度の可変性を示す。gagおよびpol
遺伝子産物の主な構造的特徴は、特定のウイルス型の変
異体の全てが明らかに分けもっているだけでなく、少な
くともある程度は、異なるウイルス型間でも保存されて
いる。HIV−１に対して生産された抗血清は、HIV−１の
gagおよびpol遺伝子産物よりも低い親和性であるにもか
かわらず、HIV−２の対応する遺伝子産物と交差反応す
る。しかしながら、証明可能な免疫学的交差反応にもか
かわらず、核酸レベルではほとんど配列相同性がなく、
そしてごく低い緊縮性条件下を除いてこれらの２つのウ
イルス間の有意なハイブリダイゼーションは全く検出で
きない（17）。
SIVagm〔STLV−IIIagm、ヒトリンパ向性ウイルス４型
と殆どまたは完全に同一（15）〕とHIV−２との間で高
度の関連性が証明され得る。免疫学的交差反応はgagお
よびpol遺伝子産物だけに限定されず、env遺伝子産物に
も及ぶ。それにもかかわらず、SIVagmとHIV−２のゲノ
ム分析は、それらが遺伝学的に区別できることを示した
（19）。HIV−２に特異的なDNAプローブは、SIVagm配列
とハイウリダイズできるけれども、HIV−２と優勢的に
ハイブリダイズする（18）。
本発明者らは、カメルーン人女性および彼女の夫から
のヒト免疫不全ウイルスの単離および特徴づけを報告す
る。このウイルスは、地理的には、HIV−２が土地特有
である西アフリカとHIV−１が特有である東−中央アフ
リカとの間に位置するアフリカ地域起源である。この単
離物は、HIV−２よりもHIV−１と遺伝学上密接に関連す
ることが免疫学的に示されるが、gagおよびpol遺伝子産
物の化学的開裂により得られた部分開裂生成物の分析
は、この単離物がHIV−１でもHIV−２でもないことを証
明する。この新規単離物は、HIV−１とHIV−２との間の
進化的結合体（evolutionary link）を意味し得る。こ
の新規ウイルスを以後HIV−３と称することにする。
従って、本発明は、V88060301のもとにEuropean Coll
ection of Animal Cell Culture（ECACC）に寄託された
レトロウイルスの本質的な形態学的および免疫学的性質
を有する、HIV−３レトロウイルスまたはこのウイルス
の変異体に関する。
ウイルスの単離は、汎化したリンパ節疾患を有するHI
V−血清陽性の男性の配偶者である無症候のカメルーン
人女性の血液から行われた。この女性の血清は、エンザ
イムリンクドイムノソルベントアッセイ（EIA,Organon
Teknika）において中程度に陽性であり（O.D./カットオ
フの比が4.5）、そしてHIV−１についての免疫蛍光抗体
アッセイにおいては低い力価（1/40）を有したが、HIV
−１ウエスタンブロットアッセイにおいてp33,p53/55お
よびp64の位置に明確なバンドを有しそしてp24の位置に
ごく弱いバイドを有するという不明瞭な結果を与えた。
この女性のリンパ球と健康な未感染の提供者のPHA刺激
リンパ球とを、20mM HEPES（ヒドロキシエチルピペラジ
ンエタンスルホネート）で緩衝化されそして15％ウシ胎
児血清、5g/mlヒドロコルチゾン、75U/mlインターロイ
キン−２（IL−２）および2g/mlポリブレンが補足され
たRPMI 1640から成る培地中で同時培養することによ
り、ウイルスが単離された。
52日間培養した後、合胞体の存在により、および実験
対照の抗−HIV抗血清を培養物からのアセトン固定化細
胞と共にインキュベートした時に観察される陽性の免疫
蛍光を基にして判断すると、培養物中にウイルスが検出
された。培養上清中の逆転写酵素の存在も検出された
（104cpm/ml、27×バックグラウンド）。無細胞の培養
上清を用いて、新鮮なリンパ球上で該ウイルスを継代培
養した。15日後、CPEが再び観察され、そして上清中に
逆転写酵素が検出された。該ウイルスを、健康な血液提
供者からのPHA−刺激されたリンパ球中で更に増殖さ
せ、そして白血病起源の連続細胞系に転移させた。ウイ
ルス含有上清を、HIV−１を含むことが知られている培
養上清と平行して、下記に詳細に記載される示差的抗原
捕捉においてテストした。この比較結果は、新規単離物
がHIV−１でないことを示した。
次に新規ウイルスをそれのタンパク質抗原および核酸
について特徴づけた。該ウイルスを増殖させるために使
用する細胞系は、場合に応じて、CEM,HUT,Molt−４もし
くはMT4タイプの細胞系、または細胞表面上にT4レセプ
ターを有する他の不死化された細胞系のいずれかである
ことができる。
HIV−３の連続増殖に好ましい細胞系はMolt−４であ
る。HIV−３で感染されたMolt−４細胞は、1988年６月
３日にV88060301号のもとにECACCに寄託された。慢性的
に感染された細胞系の確立は、例えば、次のようにして
行うことができる。
Molt−４細胞（106/ml）、好ましくはMolt−４クロー
ン８細胞（N.山本、山口県、日本から入手）を、20mM H
EPESで緩衝化されておりそして10％ウシ胎児血清を含有
するRPMI 1640培地中で、感染ヒトリンパ球（106/ml）
と共に同時培養する。１〜２週間以内に、培養物におい
て細胞毒性効果が観察され、次いで細胞死が観察され
る。培養中の細胞の一部分は感染から生き残り、そして
ウイルスを連続的に生産する。培養を続けると、それら
の細胞数が増加し、そして継代培養できる。それらの細
胞の上清は、ウイルスの入手源として使用することがで
きる。
更に、本発明は、下記に記載される形態学的および免
疫学的性質を有する精製されたレトロウイルスに関す
る。多くの場合、HIV−３の独特な性質は、他のヒト免
疫不全ウイルスHIV−１およびHIV−２に関する同じタイ
プの性質との比較により、最も正しく評価され得る。
図面の簡単な説明 第１図〜第16図において、名称HIV−３（ANT 70）お
よびHIV−３（ANT 70 NA）は、カメルーン人女性と彼女
のパートナーから単離された新規HIV−３ウイルスの２
つの株に相当し、HIV−３（ANT 70）はECACC V88060301
のもとに寄託されている。
第１図は、ウイルスタンパク質の開裂マップを調製す
るための手順を示す。
第２図は、ウイルス含有培養上清に関する示差的抗原
捕捉を示す。
示差的抗原捕捉は下記に記載のようにして行われる。
実線は広域スペクトル抗−HIV−1 IgGを使って得られた
結果を示し、一方点線はHIV−１にかなり特異的であるI
gGを使って得られた結果を示す。パネルＡ−Ｆに示され
る力価曲線はHIV−１に特有である。パネルＦはHIV−３
（ANT 70）含有上清を使って得られた結果を示す。
第３図は、HIV−１およびHIV−３（ANT 70 NA）上清
における示差的抗原捕捉を示す。実線は広域スペクトル
抗−HIV IgGでコーティングされたプレートにおいて得
られた結果を表わし、一方点線はHIV−１以外のHIV型と
ほとんど交差反応性を示さないIgGでコーティングされ
たプレートにおいて得られた結果を表わす。
第４図は、HIV−１およびHIV−２ウエスタンブロット
ストリップ上での抗−HIV血清の反応性を示す。
HIV−１およびHIV−２ウエスタンブロットストリップ
上での３種の異なる血清の反応性を示す。血清:1.抗−H
IV−1;2.抗−HIV−３（ANT 70）;3.抗−HIV−２（単離
物53）。指示した分子量は製造業者（Dupont Biotech）
により与えられたものである。
第５図は、幾つかのHIV−１単離物、HIV−2rodおよび
HIV−３（ANT 70）のgagおよびpolタンパク質の比較に
関する。
タンパク質を電気泳動により分離しそして後記のよう
にしてブロットした。ブロットを広域スペクトル抗−HI
V抗血清と共にインキュベートし次いで（抗−ヒトIgG）
／アルカリホスファターゼラベル化接合体と共にインキ
ュベートし、タンパク質を可視化した。A.HIV−2rod、
B.HIV−１実験単離物、C.HIV−３（ANT 70 NA）、D.HIV
−１実験単離物、E.HIV−１（SF4）。
第６図は、HIV−３（ANT 70）およびHIV−３（ANT 70
NA）タンパク質の比較を示す。
タンパク質を電気泳動により分離し、そして後記のよ
うにしてブロットした。ブロットをBSR抗血清に続いて
（アルカリホスファターゼ）／抗−ヒトIgG接合体と共
にインキュベートし、タンパク質を可視化した。レーン
1:HIV−３（ANT 70 NA）、レーン2:HIV−３（ANT 7
0）、レーン3:HIV−１（SF4）。レーン１と２の間の明
らかな強度の差は、負荷した試料の量の差によるもので
ある。
第７図は、ウイルス抗原を捕捉する種々のヒト抗−HI
V−１血清の能力に関する。
多数のヒト血清を1:1000希釈し、そしてミクロウェル
プレート上に直接コーティングした。HIV−１（SF4）,H
IV−３（ANT 70）,HIV−2rodまたはHIV−２（単離物5
3）を含有する洗剤処理された培養上清をインキュベー
トし、そして広域スペクトル（抗−HIV IgG）／西洋ワ
サビペルオキシダーゼ接合体を使って、結合した抗原を
検出した。血清１−７はアフリカ人のものであり、血清
８−11はヨーロッパ人のものであった。非−HIV−１抗
原を捕捉するアフリカ人血清の能力がより大きいのは、
一部分は、それらの抗−p24力価がより大きいことによ
り説明できる（データは示されていない）。
第８図は、HIV単離物の結合におけるコーティングIgG
の希釈度の効果を示す。
1:1000の希釈度で始まる４つの異なる血清の連続倍々
希釈液を作製し、これを使ってミクロウェルプレートを
コーティングした。HIV−１（SF4）,HIV−３（ANT 7
0）,HIV−2rodおよびHIV−２（単離物53）の洗剤処理さ
れた上清を、1:1000の希釈率でパネルＢに示される抗血
清でコーティングされたプレート上でのものとほぼ等し
い光学濃度を与えるように希釈した。結合した抗原を、
広域スペクトル（抗−HIV IgG）／西洋ワサビペルオキ
シダーゼ接合体を使って検出した。
第９図は、ヒオポリクローナル抗体およびマウス抗−
HIV−１モノクローナル抗体を使ったウイルス単離物の
抗原捕捉を示す。
明細書中に記載されるようにしてウェルをコーティン
グし、インキュベートした。使用したIgGは次のもので
ある： 1.ヒトポリクローナル抗−HIV IgG;2.MAb CLB 59;3.MAb
CLB 21;4.MAb CLB 64;5.MAb CLB 14;6.MAb CLB 16;7.M
Ab CLB 47;8.MAb CLB 13.6（抗−p18）;9.MAb CLB 19.
7;10.MAb CLB 13.4（抗体−p18）。
第10図は、種々のHIV型に対するヒト抗−HIV抗血清の
反応性の比較である。
HIV−４（SF4）,HIV−３（ANT 70）,HIV−2rodおよび
HIV−２（単離物53）の溶解物をSDS−ポリアクリルアミ
ドゲル上での電気泳動により分離し、ニトロセルロース
上にブロットし、そして高力価の抗−HIV−１抗血清
（パネルＡ）、低力価の抗−HIV−１抗血清（パネル
Ｂ）、HIV−３（ANT 70）が単離された女性の血清（パ
ネルＣ）、HIV−３（ANT 70 NA）が単離された夫の血清
（パネルＤ）およびHIV−２（単離物53）が単離された
人の抗−HIV−２抗血清（パネルＥ）と共にインキュベ
ートした。
第11図は、エンザイムイムノアッセイによる抗−HIV
血清の力価測定を示す。
ミクロウェルプレートをHIV−１（SF4）,HIV−３（AN
T 70）およびHIV−２（単離物53）の溶解物でコーティ
ングした。HIV−１感染したヨーロッパ人の血清（左の
パネル）およびHIV−２（単離物53）に対する抗血清
（右のパネル）を、３種類のコーティングされたプレー
ト上で1:100の希釈度で始まる倍々希釈液で力価測定し
た。
第12図は、ウイルスのgagおよびpol遺伝子産物におけ
るメチオニンとトリプトファン残基の位置を示す。
p17 gagタンパク質についてのアミノ酸位置は、コー
ド配列中の最初のメチオニンから出発して与えられてい
る。p24 gagタンパク質についてのアミノ酸位置は、p17
/p24タンパク質開裂部位から出発して与えられている。
polタンパク質の位置は、HIV−１配列中の556位と557位
における高度に保存されたトリプトファン対により整列
した後に示されている。保存されたプロテアーゼ配列、
プロテアーゼ／逆転写酵素開裂部位および逆転写酵素／
エンドヌクレアーゼ開裂部位の位置が示されている。こ
の場合、p24およびp17という用語は、遺伝学的意味でそ
れぞれ最大のウイルスコアタンパク質および二番目に大
きいウイルスコアタンパク質について呼称される。“HI
V−２（LAV−２）”という用語は、HIV−2rodと同義で
ある。
第13図は、HIV−１（SF4）〔図中ではHIV−１〕、HIV
−３（ANT 70）〔図中では単離物70）、HIV−2rod〔図
中ではHIV−２（LAV−２）〕およびHIV−２（単離物5
3）〔図中では単離物53〕のgagおよびpol遺伝子産物の
部分開裂生成物の比較である。p24およびp17という用語
は、遺伝学的意味で、それぞれ最大のウイルスコアタン
パク質および二番目に大きいウイルスコアタンパク質を
指すために使われる。
第14図は、ウイルスRNAとcDNAプローブとのハイブリ
ダイゼーションを示す。
材料および方法において記載のようにして、HIV−１
（SF4）,HIV−2rodおよびHIV−３（ANT 70）からのウイ
ルスRNAをメンブランフィルター上にスポットした。非
緊縮（Ａ）または緊縮（Ｂ）条件下で該フィルターをハ
イブリダイズせしめ、そしてオートラジオフィーを行っ
た。
1.形態 HIV−３感染されたMT4細胞の電子顕微鏡検査は、約20
〜40nmの直径を有しそして薄い切片においてHIV−１コ
アの幾分円筒形の外観に比較するとわずかに円錐形であ
るように見える内側の細長いコアを取囲む外側のエンベ
ロープから成り、そして約120nmの直径を有する細胞外
ウイルス粒子の存在を示した。HIV−３はHIV−１やHIV
−２と形態的に非常に類似しているが、他のヒトレトロ
ウイルス、例えばHTLV−ＩやHTLV−IIとは容易に識別さ
れる。
2.タンパク質および糖タンパク質抗原 HIV−３感染されたMolt−４細胞の培養上清中に存在
するウイルスを、ポリエチレングリコール（平均分子量
6000）での沈降に続く遠心により濃縮した。生じたペレ
ットとリン酸塩緩衝化塩溶液中に再懸濁し、20％ショ糖
クッション上に重層させ、そして100,000gにて1.5時間
ペレット化させた。次にペレット化したウイルスを、２
％２−メルカプトエタノール、１％ドデシル硫酸ナトリ
ウムおよび10％グリセロールを含む62.5mMトリス（pH6.
7）中に溶解し、そして主要ウイルス抗原を変性条件下
でのポリアクリルアミドゲル（12.5％）上での電気泳動
により分離した。分子量を評価する基準を提供するため
に同じゲルに分子量マーカーを加えた。分離した後、タ
ンパク質を電気泳動的にニトロセルロース紙に移し（ウ
エスタンブロット）、次いでこれをHIVで感染された人
の抗血清と共にインキュベートした。最初の実験では、
HIV−１で感染された人から誘導されそしてHIV−2 gag
およびpol−由来のタンパク質と交差反応することが前
もって示されている高力価の抗血清を使った。このよう
にして、HIV−3 gagおよびpol遺伝子産物の分子量をHIV
−１およびHIV−２のものと比較することができた。HIV
−３タンパク質について観察された見かけの分子量は、
HIV−１とHIV−２の両者について観察されたものに近似
している。それでも、HIV−３とHIV−１およびHIV−２
との間に小さいが再現可能な分子量の差があることも明
らかである。
タンパク質ブロットは、HIV−３がHIV−１やHIV−２
と同様に３種類のコアタンパク質を有することを示し
た。HIV−３の場合は、これらの３つのタンパク質がそ
れぞれ約12,000,16,500および25,000の分子量を有する
ことがわかった。慣例により、タンパク質はしばしば、
タンパク質については“p"または糖タンパク質について
は“gp"の後に、1,000倍した時にポリペプチドのおよそ
の分子量を示す数を付けて呼称される。HIV−３の３つ
の主要なコアタンパク質を、以後それぞれp12,p16およ
びp25と称することにする。
測定された分子量は、真の値の10％以内で正しいと思
われる。それにもかかわらず、使用する電気泳動装置の
構成および緩衝液成分の入手源は研究室ごとに色々に異
なるので、タンパク室の分子量の値について多くの混乱
が生じる。従って、HIV−１またはHIV−２のものに関し
てHIV−３の抗原タンパク質の見かけの分子量を比較す
る時は、全試料を同一のゲル上において電気泳動にかけ
ることが必要である。そのようなゲルは、例えば、第５
図に見つけることができる。特に、主要コアタンパク質
の場合には、３種のHIVの相同タンパク質の分子量値が
非常に近似しているが、HIV−１由来のタンパク質が最
も小さい。HIV−２の主要コアタンパク質は、以前報告
されているようにHIV−１のものより幾らか大きい。HIV
−３由来の相同タンパク質は、HIV−２の主要コアタン
パク質よりわずかに大きい。これらのタンパク質の計算
平均分子量を第１表に示す。
同様に、ほとんどのHIV−１株においては18,000の分
子量を有する第二のコアタンパク質に関しても、３種の
HIV間に分子量の差が明らかである。しかしながら、こ
のタンパク質の分子量における株間の差は、HIV−１の
場合において実証されており、このタンパク質の分子量
は幾つかの単離物では17,000であろう。HIV−２由来の
相同タンパク質は約16,000の分子量を有する一方、HIV
−３タンパク質は、中間の約16,500の分子量を有する。
HIV−１およびHIV−２との類推により、HIV−３もウ
イルスによりコードされる２つの形の逆転写酵素を有す
る。これらの２つの種は、HIV−１およびHIV−２の対応
する種とはわずかに異なる分子量を有し、そしてHIV−
３に特徴的である。それらの分子量も第１表に要約され
ている。
HIV−３は、31,000の見かけ分子量を有するエンドヌ
クレアーゼでありそしてHIV−１またはHIV−２由来の相
同タンパク質とは分子量の点で異なる、追加のpol遺伝
子由来のポリペプチドを有する。
HIV−３タンパク質を含むタンパク質ブロットを、こ
のウイルスで感染された個体から得られた血清と共にイ
ンキュベートすると、２つの追加のタンパク質が認めら
れ得る。これらのタンパク質はenv遺伝子由来であり、
そしてウイルスエンベロープ糖タンパク質である。膜透
過タンパク質である小さい方のタンパク質は、40,000〜
45,000の間の見かけ分子量を有する幅広いバンドとして
移動する。このタンパク質は、該タンパク質が見かけ分
子量およびポリアクリルアミドゲル上での移動度につい
て幾らかの本質的な不均一性を示すことを理解しなが
ら、gp41と以後称することにする。外膜タンパク質であ
る大きい方のタンパク質も同様に、ポリアクリルアミド
ゲル上で幾らか拡散し、そして約120,000の分子量を有
する。このタンパク質を以後gp120と称することにす
る。ポリアクリルアミドゲル上でのこれら２つの種の見
かけ上不均一な移動は、ポリペプチド鎖における不均一
性のためではなく、むしろ翻訳後グリコシル化における
不均一性のためであることに注目すべきである。特に、
gp120は高度にグリコシル化され、そして観察される見
かけ分子量は、ウイルスを生産せしめるのに使われる細
胞系によりある程度影響される。
ウエスタンブロットに加えて、ウイルスタンパク質抗
原は、放射線免疫沈降アッセイ（RIPA）によっても可視
化され得る。
このためには、HIV−３感染した細胞を、システイン
とメチオニンがなく且つ透析済のウシ胎児血清が補足さ
れたRPMI 1640倍地中で35S−システインと35S−メチオ
ニン（200Ci/ml）の存在下で培養することにより生体内
で代謝的に放射能ラベル化することができる。16時間
後、20％ショ糖クッション上で、100,000gにて1.5時間
遠心することによりラベル化されたウイルスを培養上清
から収得する。得られたペレット化したウイルスを、RI
PA緩衝液（20mMトリエタノールアミン、pH8.0、0.5M Na
Cl、0.5％ Nonidet P40、0.1％デオキシコール酸ナトリ
ウム、および1mMフェニルメチルスルホニルフルオリ
ド）中に再懸濁する。
あるいは、当業者にとってよく知られている技術によ
りクロラミンＴを使ってウイルスを125Iでラベル化する
こともできる。この場合、20％ショ糖クッションを通し
てウイルスをペレット化し、リン酸塩緩衝化塩溶液中に
ウイルスを再懸濁し、そして20〜50％のショ糖勾配上で
の60,000gで12時間の超遠心によりウイルスをバンド状
にすることにより、感染細胞の上清からウイルスを精製
する。バンド状になったウイルスは、逆転写酵素アッセ
イかまたは抗原捕捉アッセイのいずれかにより、分画さ
れた勾配中の位置を突きとめられ得る。ウイルスを含有
する画分をプールし、そしてTriton X−100を0.5％の濃
度に添加る。次いでTriton X−100で溶解されたウイル
スをヨウ素化することができる。
免疫沈降については、RIPA緩衝液中の100,000−200,0
00cpmのラベル化ウイルスタンパク質を、５μｌの試験
血清と共に200μｌの容量において４℃にて16時間反応
させる。次いで生じた免疫複合体をプロテインＡ−セフ
ァロール（ファルマシア社）に結合させ、充分に洗浄
し、そして結合したタンパク質を、１％ SDSを含む電気
泳動試料緩衝液で溶出させる。次に電気泳動に続くオー
トラジオグラフィーにより抗原を分析する。
HIV−３のタンパク質抗原は、異なるが関連する２つ
のアプローチを使って、HIV−１およびHIV−２のものに
関して特徴づけることができる。一方では、HIV−１やH
IV−２で感染された人からの血清と交差反応するそれら
の能力に基づいて該抗原を特徴づけることができる。他
方では、HIV−３抗原に応答して産生される抗体を含有
する、HIV−３感染された人の抗血清を使って、HIV−１
およびHIV−２タンパク質との交差反応性をテストする
ことができる。HIV−３とHIV−１およびHIV−２との間
の抗原の関連性は、下記に示される実施例中で説明され
る。
それらの実験結果は、ウイルスのコアタンパク質およ
びpol遺伝子産物についてのみ交差反応性が観察される
ので、HIV−３はHIV−２と遠縁にしか関連しないことを
示す。抗−HIV−２抗血清をHIV−３タンパク質と共にイ
ンキュベートした時にも、抗−HIV−３抗血清をHIV−２
タンパク質と共にインキュベートした時にも、env遺伝
子産物の交差反応性は全く観察されなかった。
これに対して、抗−HIV−３抗血清はHIV−１のgagお
よびpol遺伝子産物と交差反応するだけでなく、たとえ
低親和性でもgp41およびgp120 env遺伝子産物とも幾ら
か交差反応するので、HIV−３はより密接にHIV−１と関
連する。抗−HIV−１抗血清も同様に、HIV−１のタンパ
ク質に対するものよりも低い親和性であるがHIV−３の
抗原タンパク質の全ての交差反応する。
下記の実施例において、１）HIV−１について観察さ
れるものとは異なる抗−HIV−１抗血清との反応性パタ
ーン、２）HIV−１のp24およびp17コアタンパク質に対
して生起したマウスのモノクローナル抗体により認識さ
れる能力のかなりの低下、および３）HIV−３感染した
個体からの抗血清による、HIV−１タンパク質を上回るH
IV−３タンパク質（エンベロープタンパク質を含む）の
優勢的認識；に基づき、HIV−３はHIV−１とは実質上抗
原的に異なることが証明される。
ヒト免疫不全ウイルスの遺伝的可変性にもかかわら
ず、例えば特定の株から誘導されたHIV−１タンパク質
に基づく試験は、他のHIV−１変異体に応答して生起し
た抗体を検出するのに十分に機能するであろう。これは
特に、モノクローナル抗体がHIV−1,HIV−２およびHIV
−３単離物由来の抗原と反応する能力について試験した
実施例においても認識され得る。この場合、モノクロー
ナル抗体はHIV−1 IIIB株からのコアタンパク質に対し
て生起されたが、HIV−1 SF4株由来のタンパク質に対し
ても強く反応する。それに対して、それらの同じモノク
ローナル抗体はHIV−３のコアタンパク質とはごく弱く
しかまたは全く反応しない。このことは、HIV−１とHIV
−３との間の抗原の相違が非常に大きいので、HIV−１
タンパク質を使用する免疫学的アッセイがHIV−３で感
染された個体の血清を試験するのに適当でないだろうと
いうことを示唆している。
最後に、下記に与えられる実施例において、最も高度
に保存されたgagおよびpol遺伝子産物中のメチオニンと
トリプトファン残基の数および／または位置の相違が示
されている。
3.HIV−３核酸 A.HIV−３ウイルスRNA “ドットブロット”技術に従ってHybond−Ｈ（Amersh
am）フィルター上に移した時のHIV−３のRNAは、緊縮条
件下でHIV−1 DNAとハイブリダイズしなかった。
“緊縮条件”または“非緊縮条件”とは、実際のハイ
ブリダイゼーションおよび／またはその後の洗浄段階が
実施されるもとでの条件を意味する。ドットブロットハ
イブリダイゼーションは、HIV−1 SF4株、HIV−2rodお
よびHIV−3 ANT 70株からのウイルスRNAの希釈液をHybo
nd−Ｈフィルター上にスポットすることにより行った。
各ウイルスの希釈液シリーズは、培養上清5,2.5,1.25
および0.62ml相等物からペレット化されたウイルスRNA
に対応した。このRNAを２分間のUV照射によりフィルタ
ーに固定し、そして該フィルターを32P−ラベル化DNAプ
ローブと接触させることによりハイブリダイゼーション
を行った。選択されたプローブは、ヌクレオチド487−4
652（SacI−EcoRI）に及ぶHIV−１配列に由来し、ベク
ターpUC 13中でサブクローニングされた５′−LTR（lon
g terminal repeat）の一部分、完全なgag領域および大
部分のpol遺伝子を含む。32P−ラベル化プローブと該フ
ィルターとのハイブリダイゼーションは、３×SSC、0.5
％粉乳、１％SDS、１％硫酸デキストラン、50％ホルム
アミド（容量／容量）中で緊縮条件下で42℃にて18時間
行われた（１×SSCは0.15M MaCl、0.015Mクエン酸ナト
リウムに相当する）。その後の洗浄段階は、0.1×SSCお
よび0.1％SDS中で緊縮条件下で65℃にて行われた（２〜
30分間洗浄する）。次いで該フィルターを乾燥し、そし
て映像強化膜を使って−70℃にてオートラジオグラフィ
ーを行った。オートラジオグラフィー後、HIV−１ウイ
ルスRNAに相当するスポットだけが見えた。HIV−２また
は２種のHIV−３株のいずれかとのハイブリダイゼーシ
ョンは全く観察されなかった。従って、HIV−３はHIV−
１とはただ遠く離れてのみ関連すると思われる。
B.HIV−３由来のcDNAおよびcDNAのサブクローン HIV−３配列に相当するcDNAを合成しそしてクローニ
ングした条件を下記に記載する。１の培養液からHIV
−３（ANT 70株）をポリエチレングリコール6000で沈澱
させ、リン酸塩緩衝化塩溶液中に再懸濁し、そして20％
ショ糖クッションを通してペレット化した。得られたウ
イルスペレットを20mMジチオトレイトールおよび0.5％
Nonidet P−40中の6M塩酸グアニジンに溶解した。２モ
ルの濃度までCsClを添加し、崩壊されたウイルスを含む
溶液を、0.1M EDTAを含有する5.7M CsClのクッション1.
2ml上に重層させた。Beckman SW28ローター中15℃にて2
5,000rpmで20時間遠心することによりウイルスRNAをペ
レット化した。ペレット化されたRNAを再溶解し、フェ
ノールで抽出し、そしてエタノールと2M LiClで沈澱さ
せた。
上記のようにして調製されたウイルスRNAの1/5を、第
一cDNA鎖の合成を開始するために働くオリゴ（dT）プラ
イマーを使ったcDNAの合成の第一段階を指図するのに使
った。
Amersham社により供給される市販のキットをHIV−3 c
DNAの調製に使い、そして外因的に添加された逆転写酵
素を使って第一鎖を合成した。
第二鎖の合成は、RNA/DNAハイブリッドのRNA鎖を消化
した除去するためRNase Hの存在下においてE.コリDNAポ
リメラーゼＩを使って行われた。
第二鎖の合成は、cDNAをラベル化するために32PdCTP
の存在下で行われた。得られたcDNAをT4 DNAポリメラー
ゼで処理し、平滑末端を作り、cDNAをメチル化して潜在
的な内部EcoRI開裂部位を保護し、次いで同様にAmersha
m社により供給されたEcoRIリンカーと結合させた。次に
EcoRI制限部位を開裂せしめ、そしてcDNAを1.2％アガロ
ースゲル上でサイズ分離した。500〜2000塩基対のcDNA
長さに相当するゲル部分を切り取り、cDNAを溶出せし
め、そしてEcoRIで開裂されそして脱リン酸化されてい
るpUC 13ベクター中でクローニングした。次にこのDNA
を使ってE.コリMC 1016（ラムダ）のコンピテント細胞
を形質転換させた。得られたコロニーをポール膜（Pall
Biodyne）に移し、1.5M NaCl,0.5M NaOHで溶解および
変性させ、そして3M NaOAc（pH5.5）で中和した。HIV−
３の挿入断片を含有するコロニーを、５×SSC、５×Den
hardts溶液、0.2％ SDS、250mg/ml変性サケ精子DNAを含
有する緩衝液中で穏和な緊縮条件下で、前記のHIV−１
のSacI−EcoRI断片を含有する32Pでラベル化されたプラ
スミドを使って、65℃にて一晩スクリーニングした。ハ
イブリダイゼーション後、フィルターを次の順で洗浄し
た。
1.2×SSC,0.1％ SDS中室温で１時間。
2.0.1×SSC,0.1％ SDS中室温で30分間。
3.2×SSC,0.1％ SDS中42℃で20分間。
4.0.1×SSC,0.1％ SDS中42℃で20分間。
フィルターのオートラジオグラフィー後、幾つかの弱
陽性コロニーを同定し、次いでこれらを分析用に増殖さ
せた。陽性シグナルは、HIV−１のgagまたはpol領域と
の弱い相同性によるか、またはLTRのＲ領域との幾らか
の配列相同性によるかどちらかであろうと予想された。
C.HIV−3 cDNA中に含まれる配列 906塩基対の長さであることがわかりそしてiso 70−1
1と称される最大挿入断片を有するクローンを配列分析
のために選択した。該挿入断片を種々の制限酵素で消化
し、そして得られた断片をpUC 13ベクター中でサブクロ
ーニングすることにより、該挿入断片の多数のサブクロ
ーンを調製した。配列決定は、Sanger（Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 74:5463−5467,1977）により記載されたジデ
オキシ法に従って、17マーのM13プライマーを使用するB
oehringer社から購入したキットを使って行われた。cDN
Aクローンiso 70−11の配列分析は、該挿入断片が３′
末端にポリ（Ａ）鎖を有するウイルスゲノムの３′末端
に相当することを示した。
HIV−３レトロウイルスは、U3領域とＲ領域から成る
３′LTRを含む。HIV−１の３′LTR領域と同様に、クロ
ーンiso 70−11はＲ領域の３′末端から約23ヌクレオチ
ドに位置するAATAAポリアデニル化シグナルを含む。HIV
−３配列の分析は、HIV−１の対応する３′LTR配列と約
70％の相同性があることおよびHIV−２の対応する配列
と55％未満の相同性があることを示した。
逆に、HIV−3 RNAとの交差ハイブリダイゼーションを
検出するためにラベル化プローブとしてHIV−１のgag−
pol配列を使ったハイブリダイゼーションは、該ハイブ
リダイゼーションを緊縮条件下で行った時、検出可能な
ハイブリダイゼーションが全く起こらなかったことを示
した。これはまた、両ウイルスが遠く離れてのみ関連す
ること、そしてgagおよびpol遺伝子を含んで成るゲノム
領域中に核酸レベルにおいてHIV−１とHIV−３との間に
相違があり得ることを指摘している。しかしながら、こ
の同じラベル化プローブはHIV−1 SF4株由来のRNAとハ
イブリダイズした。
加えて、本発明は、少なくとも１つの抗原、特にHIV
−３レトロウイルスのタンパク質または糖タンパク質を
含んで成る組成物に関する。そのような組成物は、抗体
を検出する方法において、およびそのような方法を実施
するためのキットにおいて使用され得る。
HIV−３ウイルスは、HIV−３と接触した人々において
抗体を検出するための抗原の入手源として有用であるこ
とが証明された。それ自体、該ウイルスは既に記載され
た方法により増殖および濃縮され、そして該ウイルスを
適当な洗剤で処理することにより溶解物が調製され得
る。全ウイルス溶解物を調製するのに好ましい洗剤は、
0.5％の濃度で使用されるTriton X−100である。別の好
ましい洗剤は、0.5％の濃度で使用されるNonidet P−40
（NP−40）である。
あるいは、ウイルスの溶解物からウイルスタンパク質
が精製され得る。これらのタンパク質を精製するための
好ましい方法はアフィニティークロマトグラフィーであ
る。例えば、ウイルス抗原は分取用ポリアクリルアミド
ゲル上で分離され、そして精製された形で個々の抗原が
溶出され得る。さらにそれらを使って、例えばウサギに
おいて、個々のウイルスタンパク質に特異的な抗血清を
生起させることができる。免疫ウサギ血清から誘導され
たIgG画分は、CNBr−活性化セファロース4B（Pharmaci
a）のような固相に連結され、ウイルス溶解物から個々
のウイルス抗原を選択的に取り出すために使用できる。
次いで低pH緩衝液を使ってアフィニティー担体からそれ
らのタンパク質を溶出させ、そして例としてMontelaro
ら、J.of Virology（1982）42:1029−1030により与えら
れるような標準的クロマトグラフィー技術を使って更に
精製することができる。
本発明は、一般的にHIV−３感染の診断のためまたは
予後上価値を有する試験のために利用できるいずれかの
組成物に関する。それらの診断方法には、HIV−３の少
なくとも１つの抗原に対して向けられた、血清または他
の体液中の抗体の検出が含まれる。
好ましい組成物はウイルス溶解物または精製された抗
原であって、ウイルスコアタンパク質p12,p16およびp25
のうちの少なくとも１つ、またはエンベロープタンパク
質gp41もしくは120、またはpol遺伝子由来のタンパク
質、例えばp31を含む。特に好ましい組成物は、例とし
て、次のタンパク質を同時に含むものである。
−p25およっびgp120 −p25およびgp45 −p25,p41およびgp120 −p12,p16およびp25 −p25,p31およびgp120 しかしながら、上記の組成物は、単に例として役立つ
だけの意味を持ち、そして本発明は上記タンパク質また
は糖タンパク質のうちの１つもしくは複数を含有する溶
解物またはタンパク質調製物全てに関することを理解す
べきである。
本発明はまた、HIV−３ウイルス溶解物が、同様に調
製されたHIV−１および／またはHIV−２由来のタンパク
質との組合せにおいて、検出しようとするウイルスの絶
対的同一性を顧慮せずにヒト免疫不全ウイルスでの感染
または接触の一般的診断に使用される、いずれの組成物
にも関する。例えば、そういった組成物はHIV−1,HIV−
２およびHIV−３の溶解物の混合物から成ることができ
るし、または次のものから成ることもできる。
−HIV−1,HIV−２およびHIV−３のコアタンパク質、
特にHIV−3 p25タンパク質と相同な各ウイルス型の主要
コアタンパク質。
−HIV−1,HIV−２およびHIV−３のエンベロープ糖タ
ンパク質、特にHIV−3 gp120と相同な各ウイルス型の外
層膜エンベロープ糖タンパク質。
−HIV−1,HIV−２およびHIV−３のコアタンパク質と
一緒のHIV−1,HIV−２およびHIV−３のエンベロープ糖
タンパク質、特に各ウイルス型の主要コアタンパク質と
一緒のHIV−3 gp120と相同な各ウイルス型の主要外層膜
エンベロープ糖タンパク質。
−HIV−1,HIV−２およびHIV−３のコアタンパク質と
エンベロープタンパク質との組合せ、特にそれぞれHIV
−3 p25およびgp120タンパク質に相同であるもの、並び
にHIV−1,HIV−２およびHIV−３のpol遺伝子由来のタン
パク質、特にHIV−３のp31エンドヌクレアーゼタンパク
質に相同な各ウイルス型のタンパク質。
更に、本発明は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
おいて単一バンドを提供する抗原に関し、前記抗原は、
精製されたHIV−３レトロウイルス抗原と共通した、抗
−HIV−３抗体を有する人の血清により認識されるエピ
トープを含んで成る。それらのエピトープに相当するア
ミノ酸配列は、分取用電気泳動またはアフィニティーク
ロマトグラフィーのいずれかにより個々のタンパク質を
単離し、そして完全タンパク質か、またはトリプシンも
しくはキモトリプシン消化により酵素的にまたは下記に
詳細に記載される方法により化学的に製造された断片の
いずれかのアミノ酸配列を決定することにより、容易に
決定され得る。得られたペプチドまたはポリペプチド
は、エドマン分解により連続的に配列決定され得る。従
って、本発明は、ウイルスから直接的に誘導されるか、
あるいは細菌発現ベクター中でまたは哺乳類もしくは昆
虫細胞中に挿入されたDNAの発現のためのウイルス発現
ベクター中でウイルスのcDNA断片をクローニングし、そ
して上記方法により発現されるタンパク質を精製するこ
とにより製造された、いずれかのタンパク質、糖タンパ
ク質またはペプチドに関する。更に、本発明は、メリフ
ィールド合成またはFmoc化学のいずれかにより製造され
た合成ペプチドにも関し、該ペプチドは次いで均質に精
製され得、そして生来のHIV−３抗原と共有するエピト
ープを配列中に含む。
ウイルスタンパク質とエピトープを共有する抗原は、
ウエスタンブロッティングまたは放射性免疫沈降のいず
れかにより、HIV−３で感染された個体の血清中に存在
する抗体との反応により容易に認識することができる。
ニトロセルロースに結合できない小さいペプチドの場合
には、ナイロン膜（Pall BiodyneまたはAmersham）に結
合させそして抗−HIV−３抗血清と該膜とを反応させる
ことにより、それらのペプチドを検出することができ
る。特に、本発明は、HIV−３コアタンパク質p12,p16お
よびp25のいずれかに含まれるかまたはポリペプチド鎖
の一部として該コアタンパク質の組合せに由来するエピ
トープを含有し得るタンパク質中に含まれる、エピトー
プに関する。更に本発明は、２つのHIV−３エンベロー
プ糖タンパク質gp41およびgp120のいずれか一方並びに
ポリペプチド鎖の一部としてHIV−３エンベロープ糖タ
ンパク質の組合せまたはHIV−３エンベロープ糖タンパ
ク質とHIV−３コアタンパク質との組合せに由来するエ
ピトープを含有するいずれかのタンパク質中に含まれる
エピトープに関する。本発明は、HIV−３タンパク質ま
たは糖タンパク質に由来するエピトープと共にHIV−１
および／またはHIV−２のタンパク質もしくは糖タンパ
ク質に由来するエピトープを単一のポリペプチド鎖の中
に組込む組換えDNA法により作製された発現ベクターに
より合成が指図されるようなポリペプチドに関する。そ
のような構成物の調製は、HIV−３並びにHIV−１および
HIV−２のcDNAから関連するコード領域を切り出し、そ
して必要なシグナル配列を有する発現ベクター中に挿入
された時にHIV−3,HIV−１およびHIV−２のエピトープ
を含むハイブリッドタンパク質の合成を指図するコード
配列を形成するように、同位相で該DNAを連結すること
を含んで成る。
更に、本発明は、特にHIV−３レトロウイルスにより
引き起こされる潜在的なまたは現存するARCまたはAIDS
の診断のために、生物学的液体におけるHIV−３レトロ
ウイルスに対する抗体の検出方法に関し、該方法は、診
断しようとする人の体液を、１種もしくは複数のHIV−
３タンパク質または糖タンパク質を含む組成物、該ウイ
ルスの溶解物、またはHIV−３に共通なエピトープを有
する抗原と接触させ、そして抗−HIV−３抗体と使用さ
れる抗原との間で形成される免疫複合体を検出すること
を特徴とする。
好ましい方法は、例えば、免疫蛍光アッセイまたは免
疫酵素アッセイを含む。
典型的には、免疫蛍光アッセイは、例えば、テストし
ようとする人の血清を、HIV−３で感染されそして冷ア
セトンで固定されそして透過性が上げられている細胞と
共にインキュベートすることを含む。形成された免疫複
合体は、ヒト免疫グロブリンと特異的に反応する抗体の
使用を含む、直接法または間接法を使って検出される。
検出は、蛍光標識、例えばフルオレセインまたはローダ
ミンと結合されている抗体を使用することにより達成さ
れる。
免疫酵素アッセイは、例えば次のようにして行うこと
ができる。
−本発明に従って言及される特定の質のHIV−３ウイ
ルス抽出物または組成物を、ミクロタイタープレートの
ウェル中に入れる。
−適当なインキュベーション時間の後、過剰の未結合
物質を洗浄により除去する。
−HIV−３の１種もしくは複数のタンパク質または糖
タンパク質に対して向けられた抗体の存在についてテス
トしようとする血清または他の体液の適当な希釈液を該
ウェルに導入する。
−結合反応が起こるのに必要な時間、ミクロタイター
プレートをインキュベートする。
−該プロートを徹底的に洗浄する。
−無色または殆ど無色の基質を高度に着色した生成物
に変換することができる酵素、限定的ではないが好まし
くは西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファタ
ーゼまたはβ−ガラクトシダーゼでラベル化されてお
り、そしてヒト免疫グロブリンと特異的に結合する抗体
を使って免疫複合体の存在を検出する。あるいは、検出
系として、適当な基質の存在下で光を放射する酵素を使
用することができる。
−形成される生成物の量を視覚的に、分光光度的にま
たは発光測定的に検出し、そして同様に処理された対照
と比較する。
使用することのできる他の検出系は、スタフィロコッ
カス・アウレウス（Staphylococcus aureus）CowanI株
から誘導されるプロテインＡ、Ｃ群のスタフィロコッカ
ス種（26RP66株）からのプロテインＧの使用に基づく
系、またはビオチン−アビジン結合反応を使用する系を
含む。
１種または複数のHIV−３抗原に対して向けられた抗
体の存在の他の免疫酵素学的検出方法は、ウエスタンブ
ロットである。該ウイルス抗原を電気泳動により分離
し、そしてニトロセルロース膜または他の適当な支持体
に移行させる。次いでテストしようとする体液を該膜と
接触させ、そして形成される免疫複合体の存在を既に記
載した方法により検出する。この方法の変形において
は、精製されたウイルス抗原を膜上に線またはスポット
として適用し、そして結合させる。次に、テストしよう
とする体液を膜とを接触させ、そして前記技術を使っ
て、形成される免疫複合体を検出する。
体液中の抗体の存在は、凝集反応により検出すること
もできる。１種または複数のHIV−３溶解物、本発明に
従って言及される抗原または精製抗原を使って、例えば
均一懸濁液を形成するラテックス粒子をコーティングす
る。存在する抗原に対する抗体を含む血清と混合する
と、該ラテックス粒子が凝集反応を引き起こし、そして
大きな凝集体の存在を視覚的に検出することができる。
本発明は、前記のようなラベル化されたHIV−３抽出
物または組成物にも関する。ラベルは、酵素的、化学
的、蛍光的または放射能的などのいずれのタイプのもの
でもあることができる。
更に、本発明は、体液中のHIV−３抗原の存在を検出
する方法に関する。該方法は、例えば次のようにして達
成され得る。
−HIV−３で感染されたヒトまたは前記のHIV−３溶解
物もしくは組成物で感染された動物のいずれかから誘導
された抗血清のIgG画分をミクロタイタープレートのウ
ェルに入れる。
−吸着させるのに適当な時間の後、過剰の未結合物質
を洗い流す。
−検出しようとする抗原を含む体液を該ウェルに入れ
る。
−結合が起こるのに適当な時間、該ミクロタイタープ
レートをインキュベートする。
−次いで適当な緩衝液で該プレートを徹底的に洗浄す
る。
−例えば、検出しようとする抗原に特異的であり、そ
して好ましくは前述の酵素のうちの１つでラベル化され
ている免疫グロブリンを使うことにより、直接または間
接的に、結合抗原の存在を検出する。
−存在する抗原の量を測定するために、適当な基質を
添加しそして反応の程度を対照と比較する。
また、本発明は、体液中の抗−HIV−３抗体の検出用
キットにも関し、該キットは、上記に言及したHIV−３
溶解物または組成物および形成される免疫複合体を検出
するための手段を含んで成る。
免疫酵素学的方法により特定の抗体を検出するために
考案されたキットの場合、そのようなキットは次のもの
を含むであろう。
−好ましくは精製された形であり、そして好ましくは
ミクロタイタープレートのような固体支持体に付着され
ている、前述のタイプのうちの１つの組成物またはHIV
−３溶解物。
−検出しようとする抗体と結合することができる酵素
と免疫グロブリン画分との接合体、または酵素と細菌性
プロテインＡもしくはプロテインＧとの接合体。
−いずれかのヒト免疫不全ウイルスと共有するエピト
ープを全く有さない対照抗原。
−アッセイを行うのに適当な緩衝液。
−適当な酵素基質。
ラベル化された抗原を使用する特定の抗原の検出のた
めのキットは次のものを含むであろう。
−適当にラベル化された前述の抗原または抗原の組合
せ。
−好ましくは不溶性支持体に結合されたプロテインＡ
または抗−ヒト免疫グロブリン、例えばプロテインＡ−
セファロース4B（Pharmacia）または同等の支持体。
−抗−HIV−３抗血清により認識されない対照抗原。
−アッセイを行うのに適当な緩衝液。
−適当であれば、酵素ラベル化された抗原の検出のた
めの基質。
本発明は更に、生物学的液体中のHIV−３抗原の検出
のために開発されたキットに関し、該キットは次のもの
を含んで成る。
−好ましくはミクロタイタープレートのような固体支
持体に結合された、抗−HIV−３免疫グロブリン。
−酵素と接合された抗−HIV−３免疫グロブリン。
−抗−HIV−３免疫グロブリンにより認識されない負
の対照の抗原。
−前述のHIV−３抗原のうちの１つまたは組成物から
なる正の対照の抗原。
−テストを行うのに適当な緩衝液。
−結合酵素の検出のための適当な基質。
更に、本発明は、HIV−３レトロウイルスのエンベロ
ープ糖タンパク質、特にgp41もしくはgp120、または前
記糖タンパク質の一部分と共に、HIV−３に対して有効
なワクチンの作製に適切な医薬上許容される賦形剤を含
有する免疫学的組成物に関する。加えて本発明は、HIV
−３レトロウイルスの主力のタンパク質の全体または部
分を配列中に含有するいずれかのペプチドまたはポリペ
プチド、並びにペプチドの一般的な免疫学的性質に影響
を及ぼさないようなアミノ酸の付加、置換または欠失か
ら生ずるペプチドにも関する。
本発明は更に、HIV−３抗原または上記に定義された
組成物中に含まれるエピトープを認識する能力により特
徴づけられるモノクローナル抗体、および特に、前記抗
原に対して特異的に生起されそして典型的な技術により
生産されるモノクローナル抗体に関する。本発明は、HI
V−３で感染された人から誘導されたＢ細胞を、例えば
エプスタイン−バー（Epstein−Barr）ウイルスを用い
てＢ細胞を形質転換せしめそして形質転換体をサブクロ
ーニングすることによって不死化することにより、製造
されるヒト起源のモノクローナル抗体にも関する。
本発明は同様に、１種または複数のHIV−３抗原を認
識し、そして精製されたHIV−３またはHIV−３抗原もし
くは抗原の組合せで、特にHIV−３のタンパク質または
糖タンパク質で、動物を感染させることにより製造され
るポリクローナル抗血清の製造方法にも関する。
ポリクローナルまたはモノクローナル抗体は、HIV−
３感染力の中和、生物学的液体または感染細胞中のHIV
−３抗原の検出、およびHIV−３タンパク質または糖タ
ンパク質抗原の精製を含む、広範な目的で使用され得
る。
本発明は、更に、HIV−３レトロウイルスのRNAまたは
このウイルスの変異体のRNAから少なくとも部分的に誘
導され、所望によりラベル化された核酸に関する。
本発明は、cDNAもしくはcDNAの一部またはそれらを含
む組換え体の用途にも関する。それらは、HIV−３レト
ロウイルスの完全ゲノムRNAに対応するcDNAの少なくと
も一部分を含むことを特徴とする。それらのcDNAは、生
物学的液体、組織および細胞におけるHIV−３配列の特
異的検出のためのプローブとして使用することができ
る。該プローブは、好ましくは、放射能的または化学的
にラベル化されるか、あるいは該プローブを検出可能に
する酵素、蛍光または化学発光ラベルを使ってラベル化
される。HIV−３の特異的検出またはHIV−３感染の診断
のための好ましいプローブは、HIV−３ゲノムに相補的
なcDNAの全部または部分を含むプローブである。このよ
うな情況において、特に有利なプローブは、特にクロー
ンiso 70−11中に含まれる核酸配列を含み、そしてウイ
ルスゲノムRNAの５′末端と３′末端の両方および組込
まれるプロウイルスDNAの５′末端と３′末端の両方に
位置するウイルスLTR−Ｒ配列を含むものとして特徴づ
けることができる。
それにもかかわらず、HIV−３感染の診断に利用でき
るプローブが前述のプローブに決して限定されないこ
と、そして本発明が、HIV−３ゲノムまたはそれの天然
に存在する変異体に由来し、そしてウイルスコアタンパ
ク質をコードする配列（gag遺伝子）、２つの形の逆転
写酵素およびエンドヌクレアーゼをコードする配列（po
l遺伝子）、並びに２つのウイルスエンベロープ糖タン
パク質をコードする配列（env遺伝子）を含む、全ての
配列を包含することが理解される。
本発明は、ベクター由来の核酸を含んで成りそして前
記cDNAまたは前記cDNAの部分が挿入される組換え核酸中
に組み込まれている、HIV−３核酸配列にも関する。そ
のような構成物は、診断目的で使用するのに充分な量の
プローブを提供するために、ウイルスcDNAまたはその断
片を天然宿主以外の生物または細胞中で複製するために
使用することができる。
そのような方法で作製されるプローブは、HIV−３の
特異的検出のための診断テストにおいて使用され得、該
診断テストは次のような本質的な段階を含んで成る。
−前述の方法により上記のようにして作製されたプロ
ーブをラベル化する段階。
−一度感染細胞からのDNAまたは感染細胞もしくは生
物学的液体からのウイルスRNAを、好ましくは膜に適用
しそして該プローブに接近しやすくした後、該プローブ
を緊縮ハイブリダイゼーション条件下で前記DNAまたはR
NAと接触させる段階。
−緊縮条件が維持される環境下で該膜を緩衝液で洗浄
する段階。
−該プローブが放射能ラベル化されている場合にはオ
ートラジオグラフィーにより、または該プローブが化学
的にラベル化されている場合には適当な免疫検出技術に
より、ラベル化されたプローブを検出する段階。
本発明は更に、HIV−３レトロウイルスの製造方法に
関し、該方法は、予めHIV−３レトロウイルスの単離物
で感染されているリンパ球または細胞と共に、T4+表現
型を有する白血病細胞起源のヒトリンパ球細胞系または
ヒトT4リンパ球を培養し、そして培地から該レトロウイ
ルスを回収しそして精製することを特徴とする。
本発明は、HIV−３レトロウイルスの抗原の製造方法
にも関し、該方法は、好ましくは洗剤により該レトロウ
イルスを溶解し、そして前記抗原を含有する溶解物を回
収することを特徴とする。
加えて本発明は、上記で定義されたHIV−３タンパク
質または糖タンパク質p12,p16,p25,p31,gp41,gp120もし
くは逆転写酵素のいずれか、またはそれらの部分の製造
方法に関し、該方法は、前記タンパク質または糖タンパ
ク質をコードする核酸を発現ベクター中に挿入し、前記
ベクターを用いて宿主を形質転換せしめ、形質転換され
た宿主を培養し、そして発現されたタンパク質を回収し
そして精製することを特徴とする。この方法は、融合タ
ンパク質の合成を指図してもしなくてもよいベクターを
含み、そして細菌発現ベクター、哺乳類発現ベクター、
例えばワクシニアベクター、および昆虫細胞中でのクロ
ーン化された遺伝子の発現のためのバクロウイルスをベ
ースとしたベクターを含むがこれに限定されない。
実施例 材料および方法 ウイルスおよび細胞培養 a.ウイルス株および細胞系 J.Levy,サンフランシスコ、U.S.A.（20）により最初
に単離された、ARV−４（HIV−1 SF4）で慢性的に感染
されたHUT−78細胞および未感染のHUT−78細胞は、S.Sp
recher,ブリュッセル、ベルギー、により提供された。
L.Montagnier,パリ、から最初に単離されたLAV−2rod、
およびCEM細胞はJ.De Smeyter,ロービン、ベルギーから
得られた。HIV−２単離物である単離物53は本発明者ら
の研究室において単離された（21）。
b.ウイルスの単離 ウイルスの単離は、LevyおよびShimabukuro（22）に
より記載されたものと同様の方法において変更を伴って
行われた。患者および健康な提供者からのリンパ球を、
Lymphoprep（Nyegaard and Co.,オスロ、ノルウェー）
上でヘパリン処理された全血を単離し、そして20mM HEP
ES、15％ウシ胎児血清（Gibco）、5g/mlヒドロコルチゾ
ン（Merck）、75U/ml IL−２および2g/mlポリブレン（A
ldrich）を含むRPMI 1640培地中で培養した。
健康な提供者からのリンパ球を2g/mlのフィトヘマグ
ルチニン（PHA,Wellcome）で使用前の３日間刺激した。
PHAで刺激された新鮮なリンパ球を、３〜４日毎にウイ
ルス単離培養物に添加した。培養物を、細胞変性効果、
広域特異性のポリクローナル対照抗血清（23）を利用し
た免疫蛍光検査法、および細胞上清中の抗原の存在（In
otecto VCA−HIV,Innogenetics）についてモニターし
た。使用する広域特異性の対照（BSR）抗血清は、HIV−
１感染された提供者から誘導され、そして非常に高い力
価（組換えHIV−1 p24タンパク質に基づくエンザイムイ
ムノアッセイにおいて≧1,000,000）を有し、そして他
のHIV型、特にHIV−２のgagおよびpol遺伝子産物と強く
交差反応することが実験的に示された。本質的には（2
4）に記載のようにして逆転写酵素もアッセイされた。
慢性的に感染された永久細胞系を確立するために、ウ
イルスで感染された一次リンパ球を、N.山本、山口県、
日本により提供されたMolt−４クローン８細胞（25）と
共に同時培養し、そして細胞増殖についてモニターし
た。逆転写酵素アッセイおよび抗原捕捉により、ウイル
ス生産をモニターした。
示差的抗原捕捉 HIV−１と他のヒト免疫不全ウイルスとの間に区別を
つけることができることにより、テスト系を開発した。
この系は、１つは特に主要コアタンパク質に対する非常
に高い力価のために広範な抗−HIV特異性を有するもの
であり、もう１つはHIV−１と優勢的に反応する低力価
のものである、２つの異なるポリクローナルIgG調製物
の、培養上清中の洗剤処理ウイルスを捕捉する能力の比
較に基づく、捕捉される抗原の検出は、（広域特異性Ig
G）／西洋ワサビペルオキシダーゼ接合体を使って達成
される。
該テストは、排他的ではないが主として、p24コアタ
ンパク質を検出する。
HIV−１に対するモノクローナル抗体 使用するモノクローナル抗体のパネルは（26）に記載
されている。この抗体は、Triton X−100で破壊されたH
IV−１調製物中の生来のウイルスタンパク質に対して調
製された。
タンパク質分析 a.電気泳動 ウイルスタンパク質のポリアクリルアミド電気泳動
は、本質的にはMaizel（27）により記載されたようにし
て行った。
b.タンパク質ブロッティング Dunn（28）により記載された炭酸塩緩衝液を使ってBi
o−Rad社のトランスブロットセル中400mAで４時間ブロ
ッティングを行うか、またはLKB半乾燥ブロッティング
装置を使って48mM Tris、39mMグリシン、0.0375％ドデ
シル硫酸ナトリウム（SDS）および20％メタノール中で
0.8mA/cm2で１時間ブロッティングを行った。
c.部分分解生成物の生成 第１図に示される技術によりウイルスタンパク質を分
析した。種々の単離物からの対応するタンパク質が類似
した分子量を有するという事実の利点を使った。12.5％
SDS−ポリアクリルアミドゲル上で、ARV−４タンパク質
のマーカーレーンと共にタンパク質を分離し、これを電
気泳動後に切り取り、ブロットし、そして抗−HIV抗血
清と共にインキュベートし、ウイルスタンパク質の位置
を明らかにした。マーカーブロットは、ウイルスタンパ
ク質のゲルのクーマシーブルー染色部分において開裂す
べき適当な位置を決定するために使用した。タンパク質
を含む水平ゲル断片を切り取り、ガラスチューブに移
し、そして化学的開裂にかけた。
1.臭化シアン開裂 ゲル切片を、新しく調製した0.3N HCl中のCNBr（Merc
k社）の40mg/ml溶液10mlと共にヒュームフード中で室温
で３時間インキュベートした。インキュベーション後、
二次元電気泳動用のSDS試験緩衝液中でゲル切片を平衡
化した。
2.BNPS−スカトール（Skatole）開裂 ゲル切片を、70％酢酸、0.1％フェノール含有30％H2O
中の２−（２′−ニトロフェニルスルフェニル）−３−
メチル−３′−ブロモインドリニン（BNPS−スカトー
ル、Pierce）の調製したばかりの飽和溶液10mlと共に、
遮光下で室温にて３時間インキュベートした。インキュ
ベーション後、ゲル切片をSDS−電気泳動用試料緩衝液
中で繰返し洗浄することにより平衡化した。
開裂後、個々のレーンをゲル切片から切り取り、90°
回転し、そして10−20％ SDS−ポリアクリルアミド勾配
ゲルの頂部に置いた。電気泳動の終了と同時に、該ゲル
をニトロセルロース（Schleicher and Schuell）上にブ
ロッティングし、そして1mg/mlカゼイン（Merck）を含
むPBSでブロックした。低分子量を有するペプチドはニ
トロセルロースに効率的に結合しないので、10kDを超え
る分子量を有する開裂生成物のみが検出できる。ブロッ
トを広域スペクトル抗−HIV抗血清に続いて抗−ヒトIg
G:アルカリホスファターゼ接合体（Promega）と共にイ
ンキュベートした。次いで５−ブロモ−４−クロロ−３
−インドリルホスフェートおよびニトロブル−エトラゾ
リウム（Sigma）との反応により、部分的開裂生成物を
可視化した。
ウイルス核酸 a.ウイルスRNAへのハイブリダイゼーション ４℃にて26,500rpmでの1.5時間の遠心により20％ショ
糖クッションを通してペレット化することにより、培養
上清からウイルスを収得し、そして0.5％ドデシル硫酸
ナトリウムを含む10mMトリス（pH7.4）、10mM NaCl、10
mM EDTA中で破壊した。破壊されたウイルスのアリコー
トを、もとの培養上清5,2.5,1.25および0.62mlに相当す
る量でHybond H（Amersham）膜上にスポットした。紫外
線光での２時間の照射により、フィルター上に置かれた
RNAを膜に固定した。次いで該フィルターに結合されたR
NAを32P−dCTPを用いたニックトランスレーションによ
りラベル化されているHIV−1cDNAプローブとハイブリダ
イズせしめた。ハイブリダイゼーションは、緊縮条件下
において３×SSC、0.5％粉乳、１％SDS、10％硫酸デキ
ストランおよび50％ホルムアミド中で42℃にて18時間行
った。ハイブリダイゼーション後、フィルターを緊縮条
件下0.1×SSCおよび0.1％ SDS中で30分間洗浄した。映
像強化膜を用いた−70℃でのオートラジオグラフィーに
よりハイブリダイゼーションを検出した。ハイブリダイ
ゼーションは、HIV−２のenv領域から誘導されたプロー
ブを使って同様に行われた。
また、非緊縮条件下で５×SSC、25％ホルムアミド、
５×Denhardts溶液、10％硫酸デキストランおよび100mg
/ml変性サケ精子DNA中で37℃にて一晩ハイブリダイゼー
ションを行った。フィルターを５×SSC、0.1％ SDS中で
室温にて15分間４回連続して洗浄し、そしてオートラジ
オグラフィーを行った。
b.ANT 70 cDNAの調製 ポリエチレングリコール6000を使って培養上清１か
らウイルスをペレット化し、PBS中に再溶解し、そして2
0％ショ糖クッションを通してペレット化した。得られ
たウイルスのペレットを、20mMジチオトレイトールおよ
び0.5％ NP−40を含む20mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH
6.5）中の6M塩酸グアニジン中で破壊した。固体のCsCl
を２モルの濃度に添加した。破壊されたウイルスを含む
溶液を、0.1M EDTAを含む5.7M CsClのクッション上に重
層して、そしてBeckman SW28ローター中15℃にて25,000
rpmで20分間遠心することによりウイルスRNAをペレット
化した。遠心後、該RNAを再溶解し、フェノールで抽出
し、そしてエタノールと2M LiClで沈澱させた。
調製したウイルスRNAの1/5を、Amersham社により提供
されたキットを使用するcDNAの合成を第一段階を指図す
るのに使った。cDNA合成はオリゴ（dT）を使って開始さ
れた。合成は、該キットにより供給される逆転写酵素を
使って行われた。第二鎖の合成は、RNA/DNAハイブリッ
ドのRNA鎖を消化して除去するためにRNase Hの存在下に
おいてE.コリDNAポリメラーゼＩを使って行われた。第
二鎖の合成は、cDNAをラベル化するために32P−dCTPの
存在下で行われた。得られたcDNAをT4 DNAポリメラーゼ
で処理して平滑末端を作製し、cDNAをメチル化して潜在
的な内部のEcoRI開裂部位を保護し、次いでEcoRIリンカ
ーと連結せしめた。該リンカー中のEcoRI部位を開裂せ
しめ、そしてcDNAを1.2％アガロースゲル上でサイズ分
離した。500〜2000塩基対のcDNA長さに相当するゲルの
部分を切り取り、cDNAを溶出させ、そして予めEcoRIで
開裂されそして脱リン酸化されているpUC 13ベクター中
でクローニングした。連結後、該DNAを使ってE.コリMC
1016（ラムダ）のコンピテント細胞を形質転換せしめ
た。生成したコロニーをPall膜フィルター（Pall Biody
ne）に移行せしめ、1.5M NaCl,0.5M NaOHで溶解および
変性せしめ、そして3M NaOAc（pH5.5）で中和した。HIV
−３の挿入断片を含有しているコロニーのスクリーニン
グは、適度な緊縮条件下で５×SSC、５×Denhardts溶
液、0.2％ SDS、250mg/ml変性サケ精子DNA中65℃での一
晩のハイブリダイゼーションにより行った。ハイブリダ
イゼーションはHIV−１のSacI−EcoRI断片を使って行っ
た。ハイブリダイゼーション後、フィルターを次の順序
で洗浄した。
1.2×SSC,0.1％ SDS中室温で１時間。
2.0.1×SSC,0.1％ SDS中室温で30分間。
3.2×SSC,0.1 SDS中42℃で20分間。
4.0.1×SSC,0.1％ SDS中42℃で20分間。
洗浄後、映像強化膜を使って−70℃にて該フィルター
をオートラジオグラフィー処理した。
HIV−１およびHIV−２プローブの非緊縮ハイブリダイ
ゼーションに使われた非緊縮条件下においてもハイブリ
ダイゼーションを行った。
c.cDNAクローンの分析 陽性のハイブリダイゼーションシグナルを与えるコロ
ニーを分析のために増殖させた。プラスミドを単離し、
EcoRIで開裂せしめ、そしてアガロースゲル電気泳動に
かけ、挿入断片の存在を確認しそしてそのサイズを決定
した。分析した96のコロニーのうち17個が挿入断片を含
むことがわかった。更なる分析のために５個のコロニー
を取り、そして約800〜1600塩基対の長さでサイズが異
なっていた。
d.配列決定 ヌクレオチド配列決定は、Sangerのジデオキシヌクレ
オチド法（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74:5463−5467,197
7）に従って、Boehringer社により供給されたキットを
使って行われた。配列決定は17−マーのM13プライマー
を使って行われた。
e.HIV−１およびHIV−２ウイルスRNAへのANT 70 cDNAの
ハイブリダイゼーション 最大の挿入断片（iso 70−11）を含むANT 70 cDNAク
ローンを、ウイルスRNAが置かれているフィルターへの
ハイブリダイゼーションに使用した。
ハイブリダイゼーションは緊縮条件下３×SSC、0.5％
粉乳、１％ SDS、10％硫酸デキストランおよび50％ホル
ムアミド中で42℃にて18時間行った。ハイブリダイゼー
ション後、フィルターを0.1×SSC,0.1％ SDS中で65℃に
て洗浄し（２−30分間洗浄）、その後映像強化膜を用い
て、−70℃にて該フィルターをオートラジオグラフィー
処理した。
結果 ウイルスの単離 HIVの異性間伝染に関する継続研究の一部として、カ
メルーン人女性と彼女の夫の血液からウイルスの単離を
行った。前記のように、単離された２つの株をそれぞれ
HIV−３（ANT 70）（女性）およびHIV−３（ANT 70 N
A）（男性）と命名する。便宜上、短縮された名称ANT 7
0およびANT 70 NAも使用される。この女性は、全身性リ
ンパ節疾患を有するHIV−血清陽性の男性の配偶者であ
る。この女性の血清は、エンザイムリンクドイムノソル
ベントアッセイ（EIA,Organon Teknika）において中程
度に陽性（O.D./カットオフの比が4.5）であり、HIV−
１についての免疫蛍光抗体アッセイにおいては低い力価
（1/40）を有していたが、HIV−１ウエスタンブロット
アッセイにおいてp33,p53/55およびp64の所に明確なバ
ンドを有し、p24,gp41およびgp120の所にごく弱いバン
ドを有するという不明瞭な結果を与えた。この女性は、
上昇した血清IgGおよびIgMレベル並びに0.46のCD4/CD8
比を有していた。この女性のリンパ球と健康な未感染の
提供社からのPHAで刺激されたリンパ球との同時培養に
よりウイルスが単離された。培養52日後、融合細胞の存
在により、および実験対照抗−HIV抗血清を培養液から
のアセトン固定化細胞と共にインキュベートした時に観
察される陽性の免疫蛍光を基にして、培養液中のウイル
スが検出された。培養上清中の逆転写酵素の存在も検出
された（104cpm/ml、27×バックグラウンド）。無細胞
の培養上清を使ってウイルスを新鮮なリンパ球において
継代培養した。15日後、再びCPEが観察されそして上清
中の逆転写酵素が検出された。しかしながら、この単離
物（ANT 70）の洗剤処理された培養上清と別の単離物と
の示差的抗原捕捉による比較は、この単離物が、HIV−
１ではないことを示した。
それらの結果は第２図に例証される。単離物（ANT 7
0）は、別の単離物と異なり、HIV−１特異的IgGにより
ほとんど認識されないが、別の単離物と同様に、広域特
異性IgG（パネルＦ）により容易に認識されたことが低
いO.D.値により明白である。HIV−１特異的MAb（CLB MA
b 14）を使ってHIV−１株であることがその後示された
別の単離物は全て、広域特異性対照IgGでコーティング
されたプレートよりも、特異的IgGでコーティングされ
たプレートにおいて高いO.D.値を与えた。
単離物（ANT 70）で感染された一次リンパ球とMolt−
４クローン８細胞とを同時培養することによる永久細胞
系に該ウイルスを転移させる試みを行った。感染の初期
において、融合細胞形成および細胞死を伴う大規模な細
胞変性効果が観察された。数週間以内に細胞増殖が検出
された。該細胞は、広域スペクトル抗−HIV抗血清を使
ってテストすると陽性の免疫蛍光を与え、培養上清にお
いて抗原および逆転写酵素の存在が容易に検出可能であ
った。
単離物（ANT 70）が単離された女性の夫からも同様に
ウイルスが単離された（ANT 70 NA株）。この男性はリ
ンパ節疾患にかかっており、そしてCDC分類方式に従っ
てクラス３として分類された。この男性も、上昇した血
清IgMおよびIgGレベル並びに0.4のCD4/CD8比を有してい
た。18日目の培養の上清にウイルスが検出された。この
ウイルスを含む洗剤処理された上清を示差的抗原捕捉に
より分析すると、単離物（ANT 70）と同様な形式で反応
することがわかった（第３図）この単離物から誘導され
た抗原の結合は、同様に、広域特異性IgGよりもHIV−１
特異的IgGの方がより少なかった。
単離物（ANT 70 NA）が得られた人の血清を、HIV−１
およびHIV−２ウエスタンブロットストリップ（Biotec
h）と共にインキュベートした。更にHIV−２（単離物5
3）が単離された人の血清とおよびHIV−１で感染された
提供者の血清とストリップをインキュベートした。その
結果は第４図に示される。ANT 70 NAで感染された人の
血清は、エンベロープタンパク質を含む実質上全てのタ
ンパク質と有意な程度に交差反応した。対して、HIV−
２で感染された個体の血清は、gag p24タンパク質、p34
エンドヌクレアーゼおよびp68逆転写酵素とのみ交差反
応した。抗−HIV−１血清はHIV−２のp26 gagタンパク
質のみを認識するが、一方ANT 70 NA保持者の血清はこ
のタンパク質とHIV−２の逆転写酵素を認識する。
ウイルスタンパク質の特徴づけ 培養上清中のウイルスをポリエチレングリコール6000
（Merck）で沈澱させ、そして得られた材料を再び溶解
し、15％ショ糖クッションを通してペレット化した。ペ
レット化されたウイルスをSDS−試料緩衝液中に溶解
し、そしてポリアクリルアミドゲル電気泳動に続きタン
パク質ブロッティングにより分析した。第５図に示され
るようなブロットを広域特異性抗−HIV血清と共にイン
キュベートし、ウイルスタンパク質を明らかにした。
HIV−１ウイルスタンパク質の全てと反応することに
加えて、BSR抗血清はHIV−２のgagおよびpol遺伝子産物
とも交差反応する。この抗血清は、その上ANT 70のgag
およびpol遺伝子産物を明らかに認識する。ANT 70の遺
伝子産物の分子量がHIV−１またはHIV−２のいずれのも
のとも異なることは明らかである。種々のウイルスタン
パク質の分子量は第１表に要約される。HIV−１のp17/p
18タンパク質における変動性は、幾つかの株においてHI
V−1 HXB2配列中の120位と121位との間に存在する６ア
ミノ酸の挿入のためである。ANT 70およびANT 70 NAの
全てのタンパク質の分子量がANT 70のものに等しい。
HIV−1,HIV−２およびANT 70の間の抗原の関連性を更
に研究するために、アフリカ人およびヨーロッパ人に抗
−HIV−１血清のシリーズを、1:1000に希釈しそしてこ
れを使って抗原捕捉のためにミクロタイタープレートを
コーティングした。HIV−1,ANT 70,HIV−２（LAV 2ro
d）およびHIV−２（単離物53）を含有する洗剤処理され
た培養上清を希釈し、そして４種の異なる単離物を捕捉
する各抗血清の能力を分析した。代表的な結果は第７図
に示される。この実験から、HIV−１を捕捉する種々の
血清の能力は、HIV−２またはANT 70のいずれかを捕捉
する能力と全く無関係であることが理解できる。対し
て、LAV−2rod、即ち原型HIV−２株を捕捉するそれらの
血清の能力は、同様にHIV−２株であるが独立した単離
物である単離物53を捕捉する血清の能力と非常に相互関
係がある。これらのデータは、ANT 70がHIV−１でもHIV
−２でもないことを示している。一連の関連抗原の捕捉
実験において、IgGを様々な希釈度でコーティングした
時にHIV−1,ANT 70,HIV−２（LAV−2rod）およびHIV−
２（単離物53）を結合する能力に近づくために、４人の
アフリカ人の抗−HIV−１血清を選択した。第８図のパ
ネルＢにおいて使用したIgGでコーティングされたプレ
ート上で捕捉された時とほぼ同じ光学濃度を与えるよう
に、培養上清を希釈した。４つの血清の希釈液をコーテ
ィングし、そしてウイルス含有上清を添加した。同類の
ウイルスは同様な力価曲線を生ずるという仮定がなされ
た。実際、第５図において、LAV−2rodと単離物53は共
に、コーティングされたIgGと同様に反応した。他方、A
NT 70は、HIV−２単離物のいずれよりも高いIgG希釈度
においてより強いシグナルを与え、そしてANT 70につい
て得られた曲線の形状はHIV−１について得られた曲線
と非常によく近似していた。ただし、光学濃度は一貫し
て低かった。
HIV−１のp24コアタンパク質に対して向けられたマウス
モノクローナル抗体の交差反応性 HIV−１のp24コアタンパク質に対して調整されたマウ
スモノクローナル抗体（MAb）のパネルを、ANT 70およ
びHIV−２単離物と交差反応する能力についてテストし
た。理論上は、該シリーズがHIV−1 p24分子上の異なる
エピトープと反応するモノクローナル抗体を含む限り、
いずれのパネルの抗−HIV−1 p24モノクローナル抗体で
も使用できる。該抗体を含有する腹水を希釈し、そして
これを使ってイクロウェルプレートをコーティングし
た。コーティングされたウェルに洗剤処理されたウイル
スを含有上清を添加した。西洋ワサビペルオキシダーゼ
と接合されたBSR−HIV IgGを使って、結合抗原を検出し
た。結果は第９図に示される。
ポリクローナル広域スペクトルIgGでコーティングさ
れた対照ウェルにおいては、全てのウイルス含有上清が
ミクロタイタープレートリーダーの限界を超える光学濃
度を与えた。しかしながら、種々のモノクローナル抗体
でコーティングされたウェルにおいてテストすると、全
く異なるパターンが現われた。前の研究は、同一エピト
ープを認識することが示されているMAb CLB 59およびCL
B 21を除き、テストされた全てのMAbがp24分子上の異な
るエピトープを認識することを示した。前記２つのMAb
は両方とも予想通りHIV−１と強く反応し、そしてANT 7
0とも測定可能なシグナルを与えるが、２つのHIV−２株
のいずれとも反応しない。他の２つのMAb CLB 64および
CL 14はHIV−１と良好に結合し、そしてANT 70に対して
も２つのHIV−２単離物に対しても弱い親和性を示し
た。特に、MAb CLB 14は全てのHIV−１単離物を良好に
認識することが示された（テストされたものの＞15
0）。従って、このMAbは名残りが他のヒト免疫不全ウイ
ルスにおいても検出され得る非常に高度に保存されたエ
ピトープと結合するに違いない。p24に対する別のMAb
（CLB 16,47および19.7）およびHIV−1 p18タンパク質
に対して生じた別の２つのMAb（CLB 13.4およびCLB 13.
6）は、ANT 70または２つのHIV−２単離物のいずれも認
識できなかったが、対応するHIV−１抗原を捕捉した。
ウイルスタンパク質とヒト抗−HIV抗血清との反応 HIV−１（ARV−４）,ANT 70およびHIV−２（LAV−2ro
d）からのウイルスタンパク質のタンパク質ブロット
を、洗剤で溶解された抽出物の電気泳動後に調製し、そ
して種々のヒト血清と共にインキュベートした（第10
図）。パネルＡは、広域特異性の実験対照血清と３種の
ウイルス単離物との反応を示す。パネルＢでは、該ブロ
ットを抗−HIV−１抗血清と共にインキュベートし、優
勢的にHIV−１タンパク質を認識することを示す。ANT 7
0が単離された女性の血清（パネルＣ）およびANT 70 NA
が単離された彼女の夫の血清（パネルＤ）を、別のウイ
ルス単離物を認識する能力についてテストした。それら
の血清は両方とも、このウイルスのgp120エンベロープ
タンパク質を含むANT 70を優勢的に認識する。彼女の夫
の血清は、ANT 70が単離された女性の血清よりも高い力
価を有しており、HIV−１のgp41を認識する。それらの
血清は両方とも、HIV−１またはHIV−２単離物よりもAN
T 70に対してより高い親和性を有する。対して、HIV−
２単離物53が単離された人の血清はHIV−２タンパク質
を優勢的に結合し、そしてこのウイルスのHIV−2 gp120
エンベロープタンパク質およびgp41膜透過タンパク質を
認識する（パネルＥ）。それはHIV−１またはANT 70の
糖タンパク質とは反応しない。それらの結果は、ANT 70
がHIV−１ともHIV−２とも異なることを更に指摘する。
コートされたウイルスタンパク質を使った抗−HIV−
１、抗−ANT 70および抗−HIV−２血清の力価測定を使
ったエンザイムリンクドイムノソルベントアッセイは、
HIV−１（ARV−４）,ANT 70およびHIV−２（単離物53）
のウイルス溶解物でコーティングされたミクロタイター
プレート中で行われた。1:100の初期希釈度で始まる各
血清の倍々希釈度を、コーティングされた抗原を結合す
る能力についてテストした。西洋ワサビペルオキシダー
ゼでラベル化されたヤギの抗−ヒトIgG接合体を使っ
て、結合抗体を検出した。それらの結果を第11図に示
す。抗−HIV血清はHIV−１タンパク質を優勢的に認識し
たが、ANT 70タンパク質とも有意な量の交差反応を示し
た。HIV−２タンパク質はわずかに検出された。対し
て、抗−ANT 70血清はANT 70タンパク質を優勢的に認識
し、HIV−１タンパク質に対して交差反応性を示し、そ
して高い光学濃度値が得られたことにより証明されるよ
うに、抗−HIV−１血清よりも抗−ANT 70血清は、HIV−
２でコーティングされたウェルと良好に反応した。抗−
HIV−２血清は非常に低い力価を有するが、それにもか
かわらずHIV−２タンパク質とは最も良く反応した。HIV
−１またはANT 70でコートされたウェルにおいては、全
く検出可能なシグナルが観察されなかった。この場合に
交差反応を検出できないのは、この血清の低い抗−HIV
力価に確実に関連する。
ウイルスタンパク質の部分的化学的開裂生成物の分析 化学的開裂のために使用する２つの試薬、臭化シアン
とBNPS−スカトールは、それぞれメチオニン（29）とト
リプトファン（30）に対する高特異性のために選択され
た。これら２つのアミノ酸は疎水性であり、従ってタン
パク質分子の外面上のエピトープにはおそらくないと思
われる（31）。HIV−１（32−36）,HIV−２（19）,SIVa
gm（10）,SIVmac（９）、ウマ伝染性貧血ウイルス（EIA
V,37）およびVisna（38）のgagおよびpol遺伝子産物の
公表されたアミノ酸配列の調査により、幾つかの異なる
単離物間ではほとんどアミノ酸の相同性がないけれど
も、それらのタンパク質中のメチオニン残基の位置の多
く、およびより大部分はトリプトファン残基の位置が、
著しく保存されていることが明らかになった（第12
図）。更に、それらの残基における種間変異は、少なく
ともHIV−１（36）の場合には、最小であるか又は全く
無く、そしておそらくヒトおよびシミアン免疫不全レト
ロウイルスの全てについて当てはまるであろう。
HIV−1,ANT 70,HIV−２（LAV−2rod）およびHIV−２
（単離物53）のgagおよびpol遺伝子産物の部分消化パタ
ーンを第13図に示す。４つの単離物からのp24タンパク
質のCNBr開裂パターンの調査は、HIV−２（LAV−2rod）
およびHIV−２（単離物53）について生じるパターンが
等しいことを示す。しかしながら、HIV−１およびANT 7
0については異なるパターンが観察される。従って、HIV
−1,ANT 70およびHIV−２の主要コアタンパク質中のメ
チオニン残基の位置には有意な差がある。p17コアタン
パク質の場合には、２つのHIV−２単離物の間に相違が
観察される。HIV−2rodの公表された配列の調査は、こ
のタンパク質のカルボキシル末端から18番目のアミノ酸
にメチオニンが位置することを示す。本発明者らは、こ
のメチオニンが単離物53の対応するタンパク質中に欠け
ているに違いないと推断する。開裂パターンから、ANT
70からのp16タンパク質の一端に近いメチオニン（10−1
5番目のアミノ酸）の存在を推論することも可能であ
る。レトロウイルス逆転写酵素のCNBr開裂は、２つのHI
V−２単離物からのタンパク質が同じであり、一方HIV−
１およびANT 70のタンパク質については異なるパターン
が観察されることを示す。pol遺伝子の３′−部分に由
来するp31エンドヌクレアーゼの場合は、幾つかの小さ
い差は明らかであるけれども、単離物全ての間に類似性
が推定され得る。
４つの単離物からのp24タンパク質のBNPS−スカトー
ル開裂は、著しく類似したパターンを生じた。このタン
パク質中のトリプトファンの位置は、特にヒトおよびシ
ミアン起源のレトロウイルスについて非常に高度に保存
されているので、これは予想されることであることが第
８図から明らかである。本発明者らは、ANT 70のp25タ
ンパク質中のトリプトファン位置もこのパターンに従う
と推断する。しかしながら、パターンの調査により、該
パターンの全体の外観においてでなく、むしろ開裂によ
り生じるものの見かけ分子量において小さい差が観察さ
れ得ることがわかる。特に、各パターンの中央のスポッ
トの見かけ分子量において差が検出され、予想通り、HI
V−２（LAV−2rod）とHIV−２（単離物53）についての
パターンは等しい。しかしながら、ANT 70についてのパ
ターンの中央のスポットは大きい見かけ分子量を有する
一方、HIV−１（ARV−４）についての中央のスポットは
より小さい見かけ分子量を有する。p16に関しては、ANT
70タンパク質中のトリプトファンの位置は、HIV−２タ
ンパク質において見つかるトリプトファンの位置とより
密接に似ていると思われる。HIV−1 p17は、該タンパク
質のアミノ末端から16番目のアミノ酸に位置するトリプ
トファンを有し、そしてBNPS−スカトール開裂後のANT
70およびHIV−２のパターンにおいて認められない追加
のスポットを生ずる。HIV−1 p17配列中の36位のものと
対応するトリプトファンは、全ての単離物において保存
されている。
４つの単離物からの逆転写酵素の開裂により生じるパ
ターンは複雑であるが、２つのHIV−２単離物が等しい
ことは明らかである。ANT 70について得られるパターン
HIV−１について得られるパターンともHIV−２のパター
ンとも対応しない。p31エンドヌクレアーゼの開裂生成
物の見かけ分子量の差も観察されるが、HIV−1,ANT 70
およびHIV−２からの対応するタンパク質から生じるパ
ターンもまた、保存された構造を支持する共通の特徴を
有する。
結果 ウイルス核酸 a.ウイルスRNAへのHIV−１およびHIV−2 cDNAのハイブ
リダイゼーション HIV−２およびANT 70ウイルスからのRNAとHIV−1 cDN
Aとの間の核酸ハイブリダイゼーションは、pUC 13ベク
ター中に挿入されているSacI−Bg1II HIV−１制限断片
を用いてハイブリダイゼーションを用いて行うことによ
り評価された。この断片は、HIV−１のＲ領域を含む
５′LTRの部分、完全なgag遺伝子、およびpol遺伝子の
大部分を含む。緊縮ハイブリダイゼーション条件下で
は、このプローブとHIV−１（SF4）由来のRNAとの間に
おいてのみ、ハイブリダイゼーションが観察された。該
プローブとHIV−２またはANT 70との間には全くハイブ
リダイゼーションが観察されなかった（第14図）。これ
は、HIV−２およびANT 70のgagおよびpol領域がHIV−１
の対応領域と有意に異なることを示す。
使用されるHIV−２プローブは、HIV−２のenv遺伝子
に由来する約1000塩基対の配列を含む。このプローブ
は、緊縮条件下においてHIV−2 RNAとのみハイブリダイ
ズし、そしてHIV−１またはHIV−３とは全くハイブリダ
イズしなかった。
b.ANT 70 cDNAとHIV−１およびHIV−２の配列との間の
相同性 挿入断片のサブクローニングをpUC 13中で行い、そし
てジデオキシヌクレオチド法を使って配列決定した。
ポリＡ尾の存在は、iso 70−11挿入断片がウイルスRN
Aの３′末端に由来することを確証する。ポリＡ尾に隣
接して、ウイルス３′LTRのＲ領域に相当する配列が存
在する。ANT 70 cDNA中に含まれる配列およびそれらに
対応するウイルス配列を下記に示す。
考察 本発明者らは、カメルーン人女性（ANT 70）および彼
女のの配偶者（ANT 70 NA）から新規ヒト免疫不全関連
レトロウイルスを単離した。最初のウイルス単離を行っ
た時点では、この女性はごくわずかに血清陽性であり、
ウエスタンブロットテストにおいて不明瞭な結果を与
え、そして診断上は無症候であった。その時から、この
女性はAIDS関連症候群（ARC）の幾つかの症候を現わし
始めた。対して、本発明者らが最初の単離物と同じ特徴
を有するウイルスを単離することができた彼女の配偶者
は、リンパ節疾患にかかっており、そしてAIDSの別の症
候を発現していた。従って、この新規単離物はヒト免疫
不全ウイルスであるとみなすことができる。この同じウ
イルスが性的相手からも単離できたという事実は、伝染
の様式がヒトレトロウイルスのものと類似していること
を示唆する。
該ウイルスはまず、示差的抗原捕捉アッセイにおける
異なる捕捉能力に基づいて、HIV−１とは異なるものと
して認識された。これは、HIV−１株と非−HIV−１株と
を識別することができる高信頼性のテストであることが
立証されている。この単離物がHIV−１でないことは、
１）ウイルスタンパク質の分子量の相違、２）HIV−１
とは異なる抗−HIV−１抗血清との交差反応性パター
ン、３）HIV−１のp24およびp17コアタンパク質に対し
て生起されたマウスモノクローナル抗体により認識され
る能力が非常に小さいこと、４）ウイルス感染者の血清
により、HIV−１タンパク質よりも優勢的にANT 70が認
識されること、並びに５）最も高度に保存されている４
つのウイルスタンパク質の部分開裂のパターンが、HIV
−１タンパク質を同じ処理にかけた時に得られるパター
ンと一致しないこと、によりタンパク質レベルで確証さ
れる。それにもかかわらず、このウイルスで感染された
２人の血清はHIV−１のgp41エンベロープタンパク質を
認識する。上記に挙げたのと同じ基準により、ANT 70が
HIV−２でないこともまた明らかである。実際、ANT 70
とHIV−１との間の抗原上の相違は、HIV−２とHIV−１
との間のものよりも小さい。これは特に第８図および第
10図に与えられた結果から明らかである。
ANT 70がHIV−１およびHIV−２とは異なる独特なウイ
ルスであるという更なる強制的証拠は、部分的ペプチド
マップから生ずる。本発明者らは、最も高度に保存され
るウイルスタンパク質において有意な差があることを示
した。比較のために用いた２つおHIV−２単離物は、p17
コアタンパク質のCNBr開裂の場合を除いて、本質的に同
じ開裂パターンを与えた。しかしながら、少なくともHI
V−１株においては、p24タンパク質よりもp17タンパク
質の方が変動性を表わすことに着目すべきである（3
4）。このことがHIV−２についても当てはまるかどうか
は、今までに分析されているものよりも多数の株に関す
る配列決定を待たねばならない。
gp41エンベロープタンパク質にまで及ぶ高度の交差反
応性により証明されるように、ANT 70が抗原的にはHIV
−２よりもHIV−１により密接に関連するという事実を
考慮すれば、ANT 70が単なるHIV−１の遺伝的変異体以
上のものであることを確立することが必須であった。こ
れは、最も少なく遺伝的変異にさらされる多数のウイル
スタンパク質中に最も高度に保存される幾つかのアミノ
酸の位置を調べることにより可能である。開裂パターン
に主要な相違が認められたことは、HIV−1,HIV−２およ
びANT 70が３種の遺伝的に異なるウイルスであることを
指摘する。他方、同じシリーズの実験は、３種のウイル
ス全てが共通の先祖から発生したことを示し得るウイル
ス間の類似性も示した。
ハイブリダイゼーションデータもまた、ANT 70がHIV
−１およびHIV−２のいずれとも根本的に異なるという
概念を支持する。ハイブリダイゼーションが行われる条
件が緊縮である限り、それら３つのウイルス型間に容易
に区別をつけることができる。
cDNA配列の分析は、挿入断片がウイルスゲノムの３′
末端に由来することを示した。それらの配列とHIV−１
およびHIV−２の配列との相同性の分析は、ANT 70が特
にLTR配列（約70％の相同性）において、HIV−１と幾ら
か多く密接に関連することを示した。それにもかかわら
ず、ANT 70が単にHIV−１の遺伝的変異体である可能性
を除外する程大きな相違がある。ANT 70の３′LTRは、
レトロウイルスのLTRに典型的なシグナル配列も含む。
第三の型のヒト免疫不全ウイルスの実在は、即座に疫
学的関係および血液銀行テスト結果をみる必要がある。
既に示したように、このウイルスで感染された人からの
抗体はこのウイルスと優勢的に反応するが、それらの抗
体がHIV−１タンパク質とも交差反応する。HIV−１タン
パク質を基にしたエンザイムイムノアッセイ、免疫蛍光
抗体アッセイおよびウエスタンブロットアッセイにおい
てANT 70 NAの陽性反応を検出することが可能である一
方、陽性シグナルが避けがたい交差反応によるものであ
ったという事実は、そのようなテストの感度がこのウイ
ルスに応答して生産された抗体についてはより小さいで
あろうことを意味する。このことは、エンザイムイムノ
アッセイの結果（第11図）により十分に証明された。更
に、ウエスタンブロットアッセイにおける血清陽性につ
いての１つの基準は、gagおよび／またはpolタンパク質
並びにエンベロープタンパク質の１つの両者に対する検
出可能な抗体の存在である。それぞれANT 70およびANT
70 NAで感染された２個体の場合、HIV−１のp24とエン
ベロープタンパク質の両方に対して交差反応が観察され
たので、それら個体はHIV−１で感染されているが、或
る理由でHIV−１に対する高い力価を発現できないとい
う結論が常に指摘される。従って、このウイルスは現在
理解されているよりもずっと広く普及することが可能で
ある。疫学的見地から、このウイルスを発見し得るアフ
リカの地理的領域の限界を評価するため、およびこのウ
イルスが広まった範囲を評価するため、このウイルスに
特異的な診断テストを開発することが不可欠である。
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フロントページの続き (72)発明者 サマン，エリク ベルギー国，ベー‐2680 サン ニクラ ース，ナクステガランラーン 12 (72)発明者 ファン ヒューベルスワイン，ヒューゴ ー ベルギー国，ベー‐9280 ラールン，コ ルマンシュトラート 62

Claims (14)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】次の核酸配列と70％より高い相同性を示す
    LTR配列を核酸配列の中に含んで成り： 欧州動物細胞培養物寄託機関（European Collection of
    Animal Cell Cultures ;ECACC）に第V88060301号のも
    とに寄託されたHIV−３（ANT 70）レトロウィルスの本
    質的な形態学的および免疫学的性質を有し、ここでこの
    本質的な性質が、 −該ウィルスがT4リンパ球に対し向性を示す； −該ウィルスがそれが感染するリンパ球に対し細胞毒性
    である； −該ウィルスが約120mmの直径を有する； −該ウィルスがマグネシウム依存性逆転写酵素活性を有
    する； −それがT4レセプターを担持している不死化細胞系にお
    いて培養され得る； −該ウィルスの溶解物が、ウエスタンブロット分析並び
    に部分CNBr−解裂のそれぞれによりHTLV−１のp19タン
    パク質並びにHIV−１及びHIV−２のp24タンパク質とは
    免疫学的に異なるp25タンパク質を含む； −該ウィルスの溶解物が、ウエスタンブロット分析によ
    りHTLV−１のgp110タンパク質、HIV−１のgp120タンパ
    ク質及びHIV−２のgp120タンパク質とは免疫学的に異な
    るgp120タンパク質を含む； −該ウィルスの溶解物が、40,000−45,000の分子量を有
    するgp41糖タンパク質を更に含む； −HIV−３のゲノムRNAが、緊縮ハイブリダイゼーション
    条件下においてHIV−１の配列ともHIV−２の配列ともハ
    イブリダイズしない； −該ウィルスの溶解物が部分CNBr−解裂によりHIV−１
    及びHIV−２のp17とは異なるp16タンパク質を含む； −該ウィルスの溶解物がウェスタンブロット分析により
    HIV−１及びHIV−２由来のp12タンパク質とは異なるp12
    タンパク質を含む； −該ウィルスの溶解物が部分CNBr−解裂によりHIV−１
    及びHIV−２由来のp31エンドヌクレアーゼとは異なるp3
    1エンドヌクレアーゼを含む； −該ウィルスの溶解物がウェスタンブロット分析により
    HIV−１及びHIV−２由来のものより低分子量である逆転
    写酵素タンパク質を含む； ことを特徴とする、HIV−３レトロウィルス株。
  2. 【請求項２】該ウィルスRNAが、緊縮条件下において、H
    IV−１のenv遺伝子およびそれに隣接したLTRとハイブリ
    ダイズせず、且つHIV−１ゲノムのpol領域の配列ともハ
    イブリダイズしないことを特徴とする、請求項１記載の
    レトロウィルス株。
  3. 【請求項３】該ウィルスのRNAが、緊縮条件下におい
    て、HIV−１のヌクレオチド配列8352−9538とハイブリ
    ダイズしないことを特徴とする、請求項２記載のHIV−
    ３レトロウィルス株。
  4. 【請求項４】ECACC第V88060301号のもとに寄託された名
    称ANT 70の請求項１又は２記載のHIV−３レトロウィル
    ス株。
  5. 【請求項５】名称ANT 70 NAである前記株が、ECACC第V8
    8060301号のもとに寄託された株ANT 70の単離された女
    性の夫から単離されたものである、請求項１又は２記載
    のHIV−３レトロウィルス株。
  6. 【請求項６】請求項１〜５のいづれか１項記載のHIV−
    ３レトロウィルス株の全抽出物又は溶解物。
  7. 【請求項７】請求項１〜５のいづれか１項記載のHIV−
    ３レトロウィルス株の少なくとも一種の抗原であって、 内部コアタンパク質；及び エンベロープタンパク質； のタンパク質の群より選ばれる、前記抗原。
  8. 【請求項８】前記内部タンパク質が、それぞれ12,000、
    16,000及び26,000のオーダーの見かけ分子量を有するp1
    2、p16又はp26タンパク質であり、そして前記エンベロ
    ープタンパク質が、それぞれ40,000〜45,000及び120,00
    0の見かけ分子量を有するgp41又はgp120タンパク質であ
    る、請求項７記載の抗原。
  9. 【請求項９】請求項１〜５のいづれか１項記載のHIV−
    ３レトロウィルス株の全タンパク質抽出物を調製電気泳
    動又はアフィニティークロマトグラフィーにかけ、周知
    の方法で単離することにより得られる、請求項８におい
    て定義されている精製抗原。
  10. 【請求項１０】生物液体中の請求項１〜５のいづれか１
    項記載のHIV−３レトロウィルス株に対する抗体の検出
    のための方法であって、検査すべきヒトの体液を、請求
    項６において定義されている抽出物もしくは溶解物、又
    は請求項７〜９のいづれかにおいて定義されている抗原
    と接触させ、そして前記抗−HIV−３株の抗体と使用し
    た抗原とで形成された免疫接合体を検出することを特徴
    とする方法。
  11. 【請求項１１】前記生物液体が血清又は骨髄液であり、
    前記方法がHIV−３レトロウィルス株により引き起こさ
    れる潜在的又は現存のARC又はAIDSの検査のためであ
    る、請求項10記載の方法。
  12. 【請求項１２】生物学的液体中のHIV−３レトロウィル
    ス株に対する抗体の検出のためのキットであって、 −請求項６において定義された抽出物もしくは溶解物、
    又は請求項７〜９のいづれかにおいて定義された抗原、
    および −形成される免疫複合体を検出するための手段 を含んで成るキット。
  13. 【請求項１３】請求項１〜５のいづれか１項記載のHIV
    −３レトロウィルス株の製造方法であって、ヒトT4リン
    パ球、またはそれから誘導されたT4表現型を有する永久
    細胞系を、HIV−３レトロウィルスで予め感染されてい
    るリンパ球または細胞系と共に培養し、培地から該レト
    ロウィルスを回収しそして精製することを特徴とする方
    法。
  14. 【請求項１４】請求項１〜５のいづれか１項記載のHIV
    −３株の抗原の検出方法であって、HIV−３株に対して
    生起された免疫グロブリン画分で表面をコートし、分析
    しようとする体液または培養液を該免疫グロブリンと接
    触させ、そして該免疫グロブリンと該抗原との間で形成
    された複合体を検出することを特徴とする方法。
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