JPH03506042A

JPH03506042A - Ｈｉｖ―２型ヒトレトロウイルスのトランスメンブランエンベロープ糖タンパク質の抗原、及び、該抗原に免疫類似性を有する抗原

Info

Publication number: JPH03506042A
Application number: JP2507726A
Authority: JP
Inventors: オバネスイアン，アラ; レ，マリ―アンヌ; ローラン，アンヌ; クルユス，ベルナー; モンタニエ，ルユク
Original assignee: アンステイテユ・パストウール
Priority date: 1989-05-12
Filing date: 1990-05-11
Publication date: 1991-12-26
Anticipated expiration: 2019-06-07
Also published as: JP2005170949A; JP3833681B2; WO1990013314A3; JP2008156350A; EP0424519A1; JP2006213702A; EP0424519B1; JP2003146999A; JP4174591B2; DK0424519T3; JP4423374B2; DE69026569T2; ATE136789T1; OA09634A; SG48125A1; DE69026569D1; CA2032505A1; ES2085908T3; CA2032505C; JP3534746B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】旧Ｖ−２型ヒ１−レトロウィルスのト・ランスメンプランエンベロープ糖タンパク質の抗原、及び、該抗原に免疫類似性を有する抗原本発明は、１ｔｊＶ−２型ヒトレトロウイルスのトランスメンブランエンベロープ糖タンパク質の抗原、及び、該抗原に免疫類似性＜ｐａｒｅｎｔｅ　ｉＩｕｎｏｌｏｇｉｑｕｅ）を有する抗原、特にヒトレトロウィルス旧Ｖ−２の感染のｉｎ　ｖｉｖｏ経過のいくつかの時期に限って存在する抗原に係る。これらの抗原は、該し１−ロウイルスのトランスメンブランエンベロープ糖タンパク質の形成及び成熟プロセスに特徴的であり、従ってレトロウィルスＩＩＩＶ−２の発生及び増殖に関与し、感染の伝播に関与する。

本発明はまた、これらの抗原を認識する抗体、及び、該抗体を含有する免疫原性組成物に係る。

本発明は更に、上記抗原の製造、及び、ヒトレトロウィルス旧Ｌ２の感染を診断するための該抗原の使用に係る。

リンパ節障害症候群（Ｓ＋、＾）を発症させる主因もしくは一因どなる病因物質または後天性免疫不全症候群（＾１Ｄｓ）を発症させる主因となる病因物質は単離され、同定され、特性決定も行なわれた。

ある種の条件下でヒトＳＬ＾を発症させ場合によってはＡＩＤＳを併発させ得るいくつかのヒト１／トロウイルスはＨＩＶ（Ｈｕｍａｎ　Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆ　１ｃｉｅｎｃｙ　Ｖｉｒｕｓ）と命名されている。

最初に単離されたウィルスは［、＾ＬＸまたはＩＩＩＶ−］と命名され、英国特許出願８３／２４，８００及び欧州特許出願８４／４０１．８３４＜１４１０９／８４）などに記載されている。このウィルスはまたＦ、　Ｂａｒｒｅ　５ｉｎｏｕｓｓｉ他によって記載されている（１）。

Ｉ、＾ＶＥＬＩ及び１．＾ＶＭ＾１．ど命名されたウィルスＨＩＶ−１の変種も単離されて特性決定された。これは欧州特許出願８４／４０１　。

８３４に記載されている。

上記ウィルスとの免疫類似性が小さい別のクラスに所属するレトロウィルスの単離及び特性決定は、欧州特許出願８７／４００．］、５１．４（欧州特許第２３９　、４２５号）に記載されている。ＨＩシー２という名称で分類されな該し）・ロウイルスは、リンパ節障害またはＡＩＤＳの症状を示すアフリカ人患者から単離された。

このようなＩＩＩＶレトロウィルスの研究２その単離及びそれらのヌクレオチド配列の分析、それらの抗原性タンパク質の特性決定などに基づいて、得られた種々の菌株間の構造的及び機能的な類似性または逆に特異性の比較研究が可能である。

また、レトロウィルス）ＩＩＶ−１及び旧Ｖ−２を、サル由来のレトロウィルス（ＳＩＶまたは５ＴＬＶ−Ｉ［［）と比較研究することもできる。この研究の結果、レトロウィルス旧Ｖ−２及びその変種とレトロウィルスＳ［Ｖどの間にタンパク質及び糖タンパク質のある程度の類似性があることが判明した。

各ウィルスのエンベロープタンパク質の処で類似性が特に顕著である。実際、レトロウィルスＳＩＶのエンベロー１糖タンパク質とｌ／　トロウィルスＨＩＶ− ２のエンベロープ糖タンパク質に対する抗体との間では交差免疫反応が観察されるが、レトロウィルスＳＩＶとレトロウィルスＩＩＩＶ−１との間、及びＩ／トロウィルス旧ｖ−１と旧シー２との間ではこのような交差免疫反応が生じない。

前出の欧州特許出願８７／４００，１５１．４は、レトロウィルスのゲノムのｅｎｖ遺伝子によってコードされるレトロウィルスＨ＋Ｖ−２のエンベロープ糖タンパク質に関して得られた結果を示している。該欧州特許出願は、分子量約１４０．０ＯＯｄを有することに基づいてこの糖タンパク質をｇｐ１４０と命名した。

分子量の計算には±１０％の誤差が見込まれていることは理解されよう。また、前出のフランス特許出願（出願第８６７０３８８１号、公告第２，５９６，０６３号）は、ｇｐ１８０（分子量１６０にｄ±１０％）と命名した。ｐ１４０の前駆物質を記載している。

発明者等は、レトロウィルス）ＩＩＶ−２のエンベロープ糖タンパク質に関する研究を更に進展させ、上記の分子量の範囲に基づいて、これまで与えられていた分子量とは別の測定値を得ることに成功し、より精密な結果を得ることに成功した。本発明の処理条件下では、ＨＩＶ−２のウィルス粒子の外層エンベロープ糖タンパク質は分子量約１２５，０ＯＯｄを有Ｉ７ていたくこの糖タンパク質をｇｐ１２５と命名した）。同じ処理条件を用いた最新の結果によれば、フランス特許量［１１８６１０３８８１で既に証明されｇｐ１６０と命名されていた前駆物質は分子量約１４０，０ＯＯｄであった。従って本発明ではこれを’８１）１４０」と命名する。

外層エンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２５とトランスメンブランエンベロープ糖タンパク質１？Ｉ）３６とを含む成熟形エンベロープ糖タンパク質が得られるまでに複数の増殖段階が存在することはこれまでに既に判明していた。即ち、ヒトレトロウィルスＩＩＩＶ−２に感染した後で病原体性疾患が進行する際にウィルス複製サイクルが出現しこのサイクルの経過中に複数の段階が存在することが確認されていた。

）１１２の外層エンベロープ糖タンパク質の前駆物質ｇｐ３００の存在及び特性決定に関する最初の結果が得られた。この糖タンパク質は参考文献（２９）に言己載されている。説明の便宜上、以後の記載ではこの糖タンパク質をｇｐ３００と呼ぶ。

発明者等は、ＩＩＩＶ−２のウィルスサイクルに関与する新しい糖タンパク質を発見しその特性を決定した。

発明者等は同時に、レトロウィルス旧Ｖ−１及びＳＩＶのウィルスサイクルに対しても同様の研究を行なった。これらの研究で、レトロウィルスＨＩＬ２及びＳＩＶに共通で逆にＩＩＩＶ−１のウィルス複製サイクルには明らかに存在しない極めて特異的な新しい特性が判明した。

従って本発明は、ヒト１／トロウイルスＨＩＶ−２または近縁ウィルスの感染を検出しヒトレトロウィルス）ＩＩＶ−２型のレトロウィルスの属性を決定するための新しい手段に係る。

得られた結果から判断すると、レトロウィルスＩＩＴＶ−２及びＳＩＶに特有のウィルスサイクルは、複合連鎖反応プロセスとして出現し、これらのプロセス全体によって最終形態のレトロウィルスＨＩＶ−２のエンベロープ糖タンパク質が形成される。このプロセスにおいて新しい抗原性タンパク質または糖タンパク質を認識し単離し同定した。

従って本発明は、ヒトレトロウィルスＩＩＩＶ−２に感染した後に産生され、トランスメンプラン糖タンパク１ＧＰ３６と共通のペプチド骨格を有しウィルスサイクルの進展中に２つのトランスメンブラン糖タンパク質ビρ３６に解１１１１ｔ　１．、、得る抗原性糖タンパク質に係る。

二量体の形態のかかる糖タンパク質は、最適の形態及びコンホーメーションに対応し、細胞膜とウィルス膜とを融合させ得る。

従って本発明は、以下の特性を有すること、即ち、−分子量約８０ｋＤａを有する、一糖タンパク質８ｐ３００に対するポリクローナル抗体によって認識される、一ヒトのＳＬＡまたはＡＩＤＳを発症させ得るＩＩＩＶ−２型ヒトレトロウイルスのゲノムによってコードされたトランスメンブランエンベロープ糖タンパク質８ｐ３６の２つの完全体を二量体の形態に会合させて含む、または、 −８ｐ８０に対する抗体と共に抗原−抗体型の免疫複合体を形成し得る同程度の分子量のすべての糖タンパク質を含む、ことを特徴とする抗原性糖タンパク質、、８０に係る。

前述の糖タンパク質８ｐ３００は参考文献（１３）に記載された糖タンパク質であり、分子量約３００ｋＤａを有し、特にＳＬＡまたは＾ＩＤｓを発症させ得るヒトレトロウィルスＩＩＩＶ−２のゲノムの１１遺伝子によってコードされたエンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２５の前駆物質ｇｐ１．４０が２つ会合１７で形成されたものである。

発明者等はこのタンパク質を単離し特性決定した後で、ＨｌＶ−２の抗原に対して陽性の患者の血清が細胞抽出物またはウィルス抽出物中の糖タンパク質ｉｌ＋）８０を認識することを知見した。８ｐ８０は、感染性て゛ありまた病原性にもなるウィルス粒子の形成段階の１つで必要なトランスメンプラン糖タンパク質の成熟産物である。従って発明者等は、ＩＩＩＶ−２型粒子が形成される正常ウィルスサイクルを、特に、ｐＳＯの形成または解離の処で遮断することによって感染の伝播を妨害し得ると判断した。かかる感染遮断は、糖タンパク質Ｆｉｐ８０の成熟を阻害し得るキャスタノスベルミン（ｃａｓｔａｎｏ−８ｐｅｒｍｉｎｅ）の使用によって強化された。

本発明の糖タンパク質８ｐ８０の特徴は、更に以下の特性を有すること、即ち、１１１Ｖ−２型ヒトレトロウイルスに感染した細胞及び／または１（ＩＶ−２型のピリオン及び／またはウィルスに会合し得る、−１％のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００のような非イオン性界面活性剤の存在下ではｉｎ　ｖｉｔｒｏで解離せず、弱酸性ｐｉｆの１％のＳＯＳのようなイオン性界面活性剤の存在下ではＩＩＩＶ −２型レトロウイルスのトランスメンブラン糖タンパク質を形成すべく道へ旦！で解離する、一１ｔｌＶ−２血清−５ｅｐｈａｒｏｓｅイムノアフイニテイ力ラムで精製でき、（ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析すると）感染細胞の標識開始の３〜４時開後に出現する、ことである。

また、上記に定義した糖タンパク質８ｐ８０に由来ｌ２、該糖タンパク質ｇｐｓｏの非グリコジル化ペプチド骨格に対応するタンパク質も本発明の範囲に包含される。

ｇｐ８０のグリコジル化基が除去された上記タンパク質は１ｌＩｐ８０と共通の特性をいくつか有しており、これらの特性によって本発明において重要であると考えられている。

サルレトロウィルスＳＩＶとレトロウィルスＨＩＶ−１とのウィルスサイクルを同時に研究することによって、　ＳＩＶのサイクルが分子量約６５ｋＤａの糖タンパク質ｇｐ６５の形態の二量体化段階を含み、この二量体化の後で２つのトランスメンブランエンベロープ糖タンパク質８ｐ３２が形成されることが判明した。

逆にＩｌ［Ｖ４感染した生物テンプル中では、１〜ランスメンブランエンベロープ糖タンパク質のこのような二量体化１０セスが観察されなかった。

従って、二量体の形態のトランスメンブランエンベロープ糖タンパク質が得られることは、ＨＩＶ−２型レトロウイルスによる感染または該しＩ・ロウイルスと免疫学的に近縁の１／　トロウィルスによる感染に特異的に関連すると考えられる。従って、この糖タンパク質は、１ＩＩＬ２レトロウイルスまたは近縁レトロウィルスによる特異感染の検出に特に適した手段を構成する。

本発明はまた、一方でＩＩＩＶ−２型レトロウイルスに感染した細胞中に存在する。ｐ３００、ｇｐｌ、４０、ｇｐ１２５及びｇｐ８０を特異的に認識し、他方で１（ＩＶ−２型レトロウイルスの抽出物中に存在するｇｐ１２５１．、ｐａｏ及び８ｐ３６を特異的に認識し、健常細胞またはＨＩＶ−１型レトロウイルス感染細胞中に存在するタンパク質または糖タンパク質を認識しないポリクローナルまたはモノクローナル抗体に係る。

また、糖タンパク質ｇｐ８０と特異的に反応し旧Ｖ−１型レトロウィルス感染細胞のタンパク質または旧Ｖ−１のウイルス集塊とは反応しないことを特徴どするモノクローナル抗体も本発明の範囲に包含される。

本発明の別のモノクローナル抗体の特徴は、更に旧Ｌ２の糖タンパク質ｇｐ３００ｇｐ、、ｐ１．４０及び、ｐ３６を認識することである。

上記の定義に適う特に有利な第３のモノクローナル抗体の特徴は、糖タンパク質８ｐ８０とへブナドｐ３９′のアミノ酸配列Ｖ　Ｔ　Ａ　　Ｉ　　Ｅ　Ｋ　Ｙ　Ｌ　Ｑ　Ｄ　Ｑ　Ａ　ＲＬ　Ｎ　Ｓ　Ｗ　Ｇ　ＣＡ、Ｆ　ＲＱ　Ｖ　ＣＨとに共通のエピトープを認識することである。

本発明の目的はまた、ｇｐｓｏに由来しグリコジル基が除去されたタンパク質に対する抗体を提供することである。

上記モノクローナル抗体は、免疫原性及び中和性を有し、８ｐ８０の形成プロセスに作用してレトロウィルス旧Ｖ−２の増殖を妨害し得る。

上記抗体を産生する種々の方法も本発明の範囲に包含される。例えば、動物、特にマウスのごとき舗歯類の腹水培養を利用してもよい。また、固定または被包または懸濁させた細胞培養物から抗体を産生させてもよい、特に、レトロウィルスｌ１ｌＬ２を予め接種した動物のリンパ球の融合によってハイブリドーマを得る方法の使用が適当であろう。

感染動物のリンパ球を採取し選択されたミエロ・−マ細胞と融合させてハイブリッドを形成し、次に前記の抗原性タンパク質または糖タンパク質に対する特異的抗体を産生し得る能力に基づいて選択する。

本発明のモノクローナル抗体の好ま！７い製造方法は以下の段階を含む。

一精製した糖タンパク質ｇｐｓｏを必要に応じて複数同腹腔内注射することによってＢＡＬＢ−Ｃ型マウスを免疫する、−免疫マウスの細胞特に肺臓細胞をミエローマ細胞例えばＮＳＩ型細胞とＫｏｈｌｅｒ　＆　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１０）の方法で融合させる、−所望のモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマを選択し回収する。

所望のモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマを選択するためのハイブリドーマのスクリーニングはＲＩＰ＾テストまたはウェスターン法（ａｎａｌｙｓｅ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔ）で行なう。

本発明の実施に特に適したモノクローナル抗体は、上記の方法のいずれかによって得られる。またｇｐｓｏまたは上記の定義に対応する類似のタンパク質に対するモノクローナル抗体の特性を、モノクローナル抗体１ｆ１８（Ｍａｂ　ｔＨ８）に関して記載された結果との比較によって試験できる。

本発明の目的はまた、上記のモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマを提供することである。

産生されるこれらのモノクローナル抗体は例えば、タンパク質及び／または糖タンパク質と共に免疫複合体を形成してこれらのタンパク質及び／または糖タンパク質を失活させるために使用される。あるいは、旧Ｖ−２の最終エンベロープ糖タンパク質が形成されるまでのプロセスの正常な進行を阻止するモノクローナル抗体の能力が利用される。

これらの抗体はまた、例えば生物製剤中のウィルス抗原の検出に使用されてもよく、または例えばアフィニティカラムでのタンパク質及び／または糖タンパク質の精製に使用されてもよい。

発明者等は１．ｐ８０の存在を知見しこれを単離し特性決定することによって、Ｈ！Ｖ−２型ヒトレトロウイルス感染の診断手段の開発に成功した。

従って本発明は、ＨＩＶ−２型ヒトレＩ・ロウイルスの感染を、該し１−ロウイルス感染後に形成される抗体を含む疑いのある生物サンプルから１ｎｖｉｔｒｏで特異的に診断し得る抗原性組成物を提供する。本発明組成物の特徴は、前記に定義した糖タンパク質、ｐ８０を少なくども含むことである。

生物サンプルは、生物体液、特に血液もしくは血清でもよくまたは生物組織抽出物でもよい０本発明組成物は、このような生物サンプル中の抗体を検出するために有効である。

従って本発明の目的はまた、旧Ｖ−２型レトロウィルスによる特異感染のｉｎ　ｖｉｔｒｏ診断方法を提供することである。

本発明方法の特徴は、以下の段階　即ち、１１１Ｖ−２型レトロウイルス感染後に産生する抗体を含むと予想される生物サンプルと前記に定義した糖タンパク質ｌｉｌ＋）８０または前記の抗原性組成物とを抗原−抗体型の免疫複合体が形成され得る適当な条件下に接触させ、−場合によっては形成される抗原−抗体複合体を検出する段階を含むことである。

本発明は更に、少なくとも糖タンパク質ｌ１ｌｐ８０を、ワクチン成分として許容される医薬ベヒクルと共に含有する免疫原性組成物に係る。

これらの組成物はＨＩＬＺ型レトフレトロウィルスるワクチンを製造するなめに使用され得る。

このように調製された免疫原性組成物は、体重１に、あたり１０〜１００．ｃｎの薬用量で投与されるように定量されたタンパク質及び／または糖タンパク質を含有する。

本発明はまた。、　ｇｐｓｏの製造方法を提供する。この方法は以下の段ｌ１ｌ −即ち、１１１Ｖ−２ヒトレトロウイルスに感染した細胞を溶解し上清ど感染細胞とを分離するか、または調製されたウィルス集塊を遠心によって溶解し、一細胞抽出物及び／またはウィルス抽出物を、例えばヒトレトロウィルス旧し２感染患者の血清即ち旧Ｖ−２のエンベロープ糖タンパク質ど強力に反応する能力を有する血清から得られた精製抗体を好ましくは適当な担体に固定させてきむ免疫吸着剤を収容したイムノアファニティ力ラムで、バッファの存在下に抗原−抗体免疫複合体が形成される十分な時間インキュベートし、一カラムをバッファで洗浄１．て担体に保持されなかった分子を除去し、一所望の抗原性タンパク質と回収する段階を含む。

第１の実施態様によれば、糖タンパク質を回収する／ごめに、タンパク質を電気泳動及び電気溶出によって処理する。

感染細胞は、）ＩｉＶ−２１！ｉ染細胞培養物から、特に旧Ｖ−２に感染したＴ４リンパ球の培養物からｉｎ　ｖｉｔｒｏで得られた。このような細胞培養にはＣＥＭ細胞系を用いる。

別の実施態様によれば５糖タンパク質は以下の手順、即ち、 −イムノアフィニティ力ラムに固定されたタンパク質を溶出させ、一分離担体に固定されたｇｐ８０認識モノクローナル抗体を含むカラムクロマトグラフィーで溶出産物を精製する手順によって回収する。

本発明方法の１つの実施ｖＡ様によれば、感染細胞を界面活性剤溶液中で溶解させ、免疫吸着剤に含まれた抗体をアガロースビーズに固定し、バッフｙ　（ｔ、ａ＋＊ｐｏｎ　ｄ’ａｃｃｒｏｃｈａｇｅ）の存在下に処理する。

本発明はまた、ヒトレトロウィルスＩＩＩＶ−２に感染した疑いのある患者の血清またはその他の生物サンプル中で抗体を検出するためのキットを提供する。本発明のキットの特徴は、一少なくとも１つの抗原性糖タンパク質ｇｐ８０まノこはタンパク質組成物、または、上記の種々の成分の混合物ど、−被検生物サンプル中に場合によっては存在する抗体と抗原との間の免疫複合体の形成反応を生じさせる手段、特に必要に応じて１種または複数のインキュベーションバッファと、 −１性対照サンプルと、一形成された抗原−抗体複合体のぼ示（ｒｅｖｅｌａｔ、１ｏｎ）手段とを含む。

本発明はまた、好ましくは、放射性標識１、酵素標識、蛍光標識、化学発光標識または発色団によって標識された糖タンパク質ｇｐａｏ及びｇｐ６５に係る。

本発明はまた、ＩＩＩＶ−２ウイルス感染細胞の検出方法を提供する。この方法は、ＨＩＶ−２感染の疑いがある細胞を含む生物サンプルを細胞内タンパク質が露出するように処理し、露出したタンパク質中のＩＩＩＶ−２の糖タンパクｇｐｓｏの存在を検出する。露出した細胞内タンパクの試験には、例えば電気泳動を用いるか、または、１ｌＩＬ２のｇｐ８０と免疫的に反応性の抗体を用いて免疫検定する。かかる抗体の例は前述した。

１つの実施態様では、抗原ｇｐ８０の存在を誇断するための生物サンプルと１．て細胞破片を除去ｌ−たサンプルを用いる。

本発明はま／ご、ＩＩＩＶ−２抗原を含むと予想される細胞からＨＩ　Ｖ　−、２の特異感染を検出しＨＩＶ−１の感染と識別する手段を提供する。この方法では、試験すべき生物サンプルの処理細胞から得られた細胞内タンパク質を陰む生物サンプルと５ｐ８０に対する抗体とを接触させる７次いで、ＩＩＩＶ〜２感染の存在を検出するために抗原−抗体型反応の有無を試験する。

本発明の別の特徴及び利点を実施例及び図面に基づいて説明する。

区　（７）’ｆ”Ｕ］Ｙ、旧シー１に陽性の１つの血清と旧Ｖ−２に陽性の３つの血清（Ａ、Ｂ、Ｃ）とを使用しウェスターン法で分析した）ＩＩＶ−２惑染細胞中の８０ｋＤａの特異タンパク質の同定。非感染ＣＥＭ細胞（２列目）、、　ＨＩＶ−１感染ＣＥＮ細胞（１列目）及び旧Ｖ−２感染ＣＥＭ細胞（３列目）の（１０４細胞の産物に対応する）細胞抽出物をウェスタ・−ン法テストの前に７．５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した。オートラジオグラムを示す。左側の矢印は、ＨＩＶ−１の細胞外糖タンパク質＜ｇｐ１２０）及びｇａｇ前駆物質ｐ５５及びｐ４０の位置を示す。図の右側にＨＩＶ−２の特異タンパク質ｇｐ３００、ｇｐ１４０及びｇｐ８０の位置を示す。

細胞をｔ：　”　Ｈ：ｌグルコサミン（２００μＣ１／ｘβ；４Ｘ　１０”細胞／１１）で２．３．４．６及び８時間標識した。種々の時点で抽出物（１０７細胞の産物）を感染細胞及び（１００，０００ｇで培地を遠心して調製した）ウィルス集塊から調製した。（２ｘ１．０’細胞に対応する）これらの抽出物のアリコートをＨＩＶ−２血清−５ｅｐｈａｒｏｓｅで精製し、標識タンパク質を、（１２，５％）のポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した。フルオログラムを示す。左側に種々の分子量のタンパク質マーカー、即ち、ミオシン：２００．０００、ホスフオリラーゼＢ：９７，０００、ウシ血清アルブミン＋６８，０００、オボγルブミン：４３，０００及び炭酸脱水酵素：３０゜０００の位置を示す。

ｌよ：ポリクローナル抗体によるｇｐ３００のウェスターン法分析。左側に非感染ＣＥＭ細胞（−）及びＨＩＶ−１またはＩＩＩＶ−２感染ＣＥＭ細胞の抽出物を示す。右側に旧Ｖ−２感染ＣＥＮ細胞の抽出物、即ち細胞抽出物（０列）及びウィルス集塊（Ｍ列）を示す。マウスのポリクローナル抗体（抗ｇｐ３００）を用いて精製タンパク質ｇｐ３００をウェスタ・−ン法で分析する前に、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（左側では７．５％のゲル、右側ては１２．５％のゲル）でサンプルを分析した。オートラジオダラムを示す。各サンプルは１０＠細胞の産物に対応する。

１１、モノクローナル抗体…＾ｂ　］、Ｈ８を用いたウェスターン法分析。抗体 −＾ｂ１．Ｈ８を用いてウェスターン法でテストする前に、ＨＩＶ−１または旧Ｖ−２感染細胞の抽出物（０列）及びウィルス集塊の抽出物（７列）を１２．５％ポリクローナル電気泳動で分析した。オートラジオダラムを示す。モノクローナル抗体はＩＩＩＶ−２ＲＯＤのトランスメンプランエンベロープ糖タンパク質に対する抗体である。

旺；抗体涜＾ｂ１．）１８と８ｐ８０との間の結合を遮断するペプチドｐ３９’ 　、抗体ＩＨ８（セクション−＾ｂ）または抗ｇｐ３００ポリクローナル抗体（セクションＳ）を用いたウェスターン法によってＨＩＶ−２のウィルス集塊の抽出物を分析した。１μｇ７ｘｉのペプチドｐ３９°の非存在（−列）または存在（−ト列）下に各抗体と共にインキュベートした。オートラジオグラフィーの結果を示す。

［６：ＨＩＶ−２感染細胞中の、、ｐｓｏの産生を示すパルスチェイス実験（ラベルによる標識、ラベルの追跡）。１ｔｌＶ−２感染ＣＥＭ細胞を〔”Ｓ：］メチオニン（ＺｏｏμＣｉ／贋１！；４Ｘ１０’細胞／肩ｌ）で３０分間標識した（０列）、５Ｊの低温メチオニンを含む培地で放射性標識を２〜４時間追跡したく２列及び４列）。４時間後に培地を１００，０００ｇで遠心し、集塊を抽出した。抗ｇｐ３００抗体または抗体ｍＡｂ　１１（８を使用して全部のサンプルを免疫沈降させた。免疫複合体の調製物から標識タンパク質を電気泳動バッファに溶出させ７．５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した２フルオログラムを示す。フルオログラムのＣ及び■は夫々、細胞抽出物及びウィルス抽出物に対応する。各サンプルは１０６細胞の産物を示す。

′ＬＬ：（ａ）ｇｐ８０による標識グルコサミン及びフコースの取込み。

〔３■〕グルコサミン（２００μＣｉ／＋＊１）または〔３Ｈ〕フコース（２００μＣｉ／１１）で標識した旧Ｖ−２！８染ＣＥＭ細胞を、抗ｇｐ３００ポリクローナル抗体〈８列）またはモノクローナル抗体−＾ｂ　１．Ｈ８（Ｍ列）を用いた免疫沈降によって試験した。全部のサンプルを１２．５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した。

フルオログラムを示す。

（ｂ）ａｐ１２５及び８ｐ８０の産生に対するキャスタノスベルミンの効果。キャスタノスベルミン（１ｍＭ）の非存在下（−列）また＋１存在下（十列）ニＨ１Ｖ−２感染細胞’５：　［：”Ｓ：］メ＋　、ｔ　ニン（２００μＣｉ／ｙ１；４ｘ　１０’細胞／、ｗＩりで（１６時間）標識した。ＨＩＶ−２血清−５ｅｐｈａｒｏｓｅを用いたイムノアフイニテイ力ラムでウィルス粒子を含む培地の抽出物を精製［２、精製したタンパク質を１２．５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって試験した。

対応するフルオログラムを示す。

ｌ影：　ｇｐ　８０の解離。セクションＣ・［：”Ｓ）メチオニンで標識した旧し２感染ＣＥＭ細胞抽出物をモノクローナル抗体−＾ｂＩ１１８を用いた免疫沈降によって試験した（列１）。この調製細胞抽出物の別のアリコートをまず１％ＳＯＳの存在下に（９５℃で５分間）加熱した１次いで、免疫沈降試験の前にＲＩＰ＾バッフＴで１０倍に希釈した（列２）。免疫複合体の調製物を電気泳動によって分析した。各サンプルは、１０“細胞の抽出物に対応する。セクションＶ　：Ｉ：”Ｓ：］メチオニンで標識した細胞から得られた旧■ウィルスの集塊（各々が１０７細胞の産物に対応する）を種々のバッファ、即ち、　（１）Ｔｒｉｔｏｎ（１０ｍＨのＴｒｉｓ−ＩＣ＋２．　ｐＨ７，８，１５０＋＊ＭのＮａＣＮ、ｂ＋ＭのＥＤＴ＾、１％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００及び１００単位／ｚｌのアプロチニン）を含む溶解バッファ＋（２）＜バッファ（１）のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００の代わりに１％（Ｖ／Ｖ）のＳＤＳを含み次いでバッファ（１）同様に加熱した）ＳＤＳを含む溶解バッファ；（３）ＳＯＳを含み次いで９５℃で５分間加熱した溶解バッファ：（４）バッファ（１）に０１％（ｖ／ｖ）のＳＤＳと０２％（ｖ／ｖ）のデオキシコレートとを加えて改質した）ＲＩＰ＾バッファに懸濁させた。次いで抗木鴻＾ｂ　１１１８を用いてこれらのサンプル全部を免疫沈降させ、１２．５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって標識タンパク質を分析した。フルオログラムを示す。

区クー：精製５ｐ８０ノｑｐ３６ヘノＷｉ離。ＨＩＶ−２感染ＣＥＭＩ　胞ヲ［：”Ｓ〕メチオニンで（１７時間）標識し、Ｔｒ　ｉ　ｔｏｎを含む溶解バッファにウィルス集塊を懸濁させた。これらのウィルス抽出物（２ｘ１．０７細胞に対応する産物）を抗体−八Ｂ　１１８を用いて免疫沈降させ、分離用ゲル電気泳動によって、ｐ８０を精製した。

精製したｇｐｓｏ調製物の等量ずつのアリ＝ｒ　−１−を凍結乾燥し、１％（Ｖ／ｖ）のＳＤＳと１００単位／ｌ！のアプロチニンと５ｅａのＥＧＴＡ　（カルシウム依存性タンパク質分解を阻止する成分）とを含むｐＨ６，８，５，８及び４，８の］、　ＯＯｍ　Ｍの酢＃塩に再懸濁させた・、濃縮しノご電気泳動バッファで２倍に希釈する前に全部のサンプルを３０℃で６０分間インキュベートした。、　（１２，５％）ポリアクリルアミドゲル電気泳動によってサン°グルを分析した。フルオログラムを示す。

区ｕ；二Ｉ体の形態で存在するＳＩＶのトランスメンブラン糖タンパク質。セクションＣｅ１ｌ（細胞）：ＳＩＶ−ｍａｃに感染し木：ＨＵ丁−７８細胞及ヒＩＩＩＶ−２４，：感染ＩＪ、ＨＣＥＨ細胞をｌ：”Ｈ〕り／Ｌ＝　＝ｙ　サミン（２００μＣｉ／ｌＩｌ！：４Ｘ　１０’細胞／１ｆｆ）テ１５時間漂識した。

（Ｔｒｉｔｏｎを含む溶解バッファ中で調製した）感染細胞の抽出物（列Ｃ）及びウィルス集塊の抽出物（列Ｖ）をａａ　Ａ　ｂ　１．　Ｈ８を用いた免疫沈降によって精製し、標識タンパク質を１２．５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した。：フルオログラムを示す。

１１λ 佳且及ｌユ訴、− 扛１− Ｌ（”Ｓ）メ＋　オニン（比活性＞　］、０００４Ｃｉ／ｍｍｏｌ）、Ｌ（６− ３８）フコース（比活性４５〜７０μＣｉ／Ｉｏｌ）、Ｄ−〔６−１１１〕ゲルコサ・ミン（比活性＋２０−４０μＣｉ／ｍｍｏｌ）は八＋ＩＩｅｒｓｈａｍ（＾Ｉｌｌ　ｅ　ｒ　ｓ　ｈ　ａ　ｒＭ、英ｆ５＞の製品である。キャスタノスベルミン及びツニカマイシンはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ（Ｍａｎｎｈｅｉｍ、西独）の製品である。

ボ１月＾）、ポリ（Ｉｔ）はパリの１ｎｓｔｉｔｕＬ　Ｃｕｒｉｅがら入手し、Ｈｏｖａｎｅｓｓｉａｎ他の方法（１９８２，Ｊｏｕｒｎａｌ　Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈｖｏ１．２−ｐ、２０９〜２１６）に従って調製しな。

ウィルス　び細これらの実施例では、１型のし）−免疫不全ウィルスの単離物ＨＩＶ−Ｉ　ＢＲＵ（１２）及び２型のヒｌ−免疫不全ウィルスの頃１１物＋１ＴＶ−２ＲＯＤ（４，５）、及び、サルノ免疫不全つィルスＳＩＶ情１１ｃ１４２（６）を使用した。

１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ−１６４０懸濁培地（ＧｉＢＣＯ−ＢＲＬ、Ｃｅｒｇｙ−ＰｏｎＬｏｉｓｅ、フランス）で種々の細胞系及びヒトリンパ球を培養し、１．［Ｉν感染細胞を培養するなめに２Ｍｇｈｌのポリブレ・ン（ＳｉＢＩｌｌａ）を添加した。クローンＣＥＭ細胞１３はヒトリンパ球ＣＥＭ細胞系（＾Ｔ文Ｃ−ＣＣＬ１１９）に由来し、Ｔ４抗原を高ｌノベルで発現する。　ｌｌ［Ｖ−１８１（ＵまたはＨＩＶ−２ＲＯＩＩ〕単離物で感染させた５日後に約８０−９０％の細胞がウィルス粒子を産生ずる。これは細胞の液胞形成に対応する細胞障害作朋及びシンシチウムによって確認された。Ｉ（ＵＴ− ７８細胞系は、ＳｉＶ　１ｅａ（！１＋、の複製（Ｄａｎｉｅｌ他、　１９８５）を十分に許容するＴ４１／セプター（Ｇａｚｄａｌ他、　１９８０）に対して陽性の別のヒトリンパ球細胞系である。健康な供血者の末梢血液のリンパ球を、１０％のウシ胎児血清を補充したＲＰ旧−１６４０培地中で０．２％（ｗ／ｖ）のフィトヘマグルチニン分画Ｐ　（Ｄｉｆｃｏ、Ｄｅｔ、ｒｏｉｔ、。

米Ｅｌ）と共に３日間刺激Ｉ７た。１０％（ｖ／ν）のＴ細胞増殖因子（ＴＣＣ：Ｆ、　Ｂｉｏｔｅｓｔ、）を含むＲＰ旧−１６４０培地中で細胞を培養した。

ＨＩＶ−２に感染させたリンパ球を、１０％（ｖ／ｖ）のＴ　Ｃ：　Ｇ　Ｆ及び２μｙ／１のポリブレンの存在下に培養した。

扛１１０（正ＪＬｉタンパク質の代謝標識のためには、Ｌ−メチオニン及び血清を除去し２００μＣｉ　／　ｘ　Ｒの［：”ＳＪ）メチオニンを補充しｙＳＭＥＭ培地（Ｍｉｎｉｍａｌ　Ｅｓ５ｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ；ｆｉ小心・須培地）中で、感染細胞を３７℃で１６時間インキ５Ｌべ一１＝　Ｌ　ｌご。糖タンパク質の代謝標識のためには、血清及びグルコースを除去し２００μＣｉ／１１１のａＨ−フコ・− スまたは２００μＣ：／ａｉの１１１−グルコサミンを補充したＭＥＮ培地て感染細胞を３７°Ｃ’？：’１６時閏インキュベ−１・した。

紐ＪｔＬＭｔＪεグΔ」ヨ列な猜韮−割１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＺ、　　ｐＨ７，６と１５０ｍｆ１７）ＮａＣｐど１．ｍ１ｂ７）ＥＧＴＡど０．２ｅａのＰＭＳＦと１．００単位／ｗｌのアプロチニン（丁ｎ１ｐｒｏｌ　、　Ｃｂｏａｙ）とを含む１００μ！のバッファに１０７１１ｉｌｌ胞に対応する細胞集塊を再懸濁させ、次いで２％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ４００を含む１００７１１の同じバッファを添加した。

細胞抽出物を１２，０００ｇで１０分間遠心し、使用するまで上清を一８０℃で保管した。ウィルス抽出物を調製するためには、上記同様に処理した感染ＣＥＭ細胞の透明上清１１１１あたり１、ＯＯμ？７）割合テ１０倍の溶解バッフ　７　（１００Ｊｃ７）Ｔｒｉｓ−ｔｉｃ／、　ｐＨ７，６，１，５ＭのＮａＣｔ、ｌ０ＲＩＮのＥＧＴＡ、１０％（Ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ１００．１００単位／Ｉ１１のアプロチニン）を添加した。ウィルス集塊がら抽出物を調製するためには、感染細胞の培地をまず１２．０００ｙテ１０分間遠心し、次イテ１．ＯＯ，０００ｇテ１５分閲高遼遠心した（ＢｅｅｋｍａｎのＴｔ、１００遠心機）、次にウィルス集塊（１ｏ７細胞から得られ／、：産物）を２００μｌの溶解バッファ中で可溶化しな。

１（Ｉｖ−２にｔＩＬ肌者；’！Ｉ’　ら１瓜１犬　　　　　’鷺を涜Ｊ１創ｌプ１−ＩＬＨＩＶ−ｇに血清陽性の患者の血清の免疫グロブリンを、２０ｍＭのリン酸すトリウム（ｐ１１８．ｏ）に溶解した５０％ノ（Ｎ）ｌ、）２ＳＱ、テ沈降させ、次いで、ＤＥＡＥセルロースカラム（ＤＥ５２、ＷｈａＬｍａｎ）で２０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐ）１８．０）で溶出さ仕ることによって精製した。このようにして精製された免疫グロブリンは純度９０％であると考えてよい０次いでＢｅｒｇによって記載された方法（２）に従ってＣＮＢｒで活性化した５ｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ　４Ｂカラムに抗体を結合させた。５ｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｃｌ、４Ｂ　１１ｅあたり２％ｇのＩＨＧが結合し５た。以後の記載ではこの免疫吸着剤をｒｌｌｌＶ−２血清−３ｅｐｈａｒｏｑｅ　」ど呼ぶ。

（Ａノアフィニヱ土Ｅかにお十ぐＵｖ−２のタンパク１へまず、ＨＩＶｌ−２を産生ずるＣＥＭ細胞の細胞抽出物を２倍容の結ｅｒハ・ｙ　７７　（２０ｍＭ（７）Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２．　ｐＨ７，６，５０ｄノＫＣ１，１５０ｍＭのＮａＣ１，１＋＊ＮのＥＤＴ＾、２０％（Ｖ／Ｖ）のグリセロール、７ｍＭのβメルカプｌ＝エタノール、０．２ＪのＰＭＳＦ、１００単位／ｗｅのアプロチニン）に希釈し、等容のＨＩＶ−２血清−５ｅｐｈａｒｏｓｅとインキュベートｊ、た。

細胞外ウィルスを１０倍に濃縮ｌ−た１、／１０容の結合バッファでＨＩＶ−２産生細胞の上清と同様に処理ｊ７た。結合処理を１晩継続Ｉ７、カラムを結合バッファで十分に洗浄した。電気泳動バッフｒ　（１２５ｍＭのＴｒｉｓ−ｔｌｃＩ２．　ｐＨ６，８，１％（１１／％ｌ＞のＳＯ５，２Ｈの尿素、２０％のグリセロール、０．５％のβメルカプトエタノール）中で沸騰処理することによってカラムに結合したタンパク質を溶出させた。溶出したタンパク質を、６Ｈの尿素と０．２％（Ｗ／Ｖ）でなく０．１％（ｗ／Ｖ）のビスγクリルアミドとを含む７５％ＳＯＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって回収した。

立１」じＬ１泳ｌ− アフィニティ力ラムから溶出した１（ＩＶ−２の糖タンパク質（、ｐ３００及びｇｐ８０）を前記同様にポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけて回収し、ウィルス糖タンパク質を含むゲルの領域を所定分子量のタンパク質マーカー（ＢＲＬ）の位置に基づいて切断した。

糖タンパク質、ｐ３００を、溶出バッファ（０，１ＨのＮａ）ｌｃＯ３，０，５ｎｔ１７）ＥＤＴΔ、０．０５％（１／ｖ）のＳＯ３，０，２ｎＨのＰＭＳＦ）中に４℃で１６時間インキュベーションすることによって溶出させた。

このようにして得られた糖タンパク質の分画を凍結乾燥し、使用するまで冷蔵庫に保存した。８ｐ８０は４ｎＨのＴｒｉｓ−１（ＣＩ。

ｐＨ７，６，２＋ｎＭの酢酸ナトリウム及び２ｎＨのＥＤＴΔを含むバッファ中で電気溶出（ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔｉｏｎ）　した。

江史μζ生１土１ウスのボυじケローナル弘ｊ４１［１ＨＩＶ−２血清−５ｅｐｈａｒｏｑｅを用いたイムノアフィニティクロマトグラフィー及び分離用電気泳動（１３〉を順次行なうことによって感染ＣＥＭ細胞（３ｘｌＯＩ＋細胞）の抽出物から）ＩＩＶ−２のエンベロープ糖タンパク質８ｐ３００を精製１．た。ｇｐ３００の精製調製物を０．５Ｍの尿素と１Ｂｇ／ｗｅのマウス血清タンパク質とを含む１０１１の］、　５０１６ＭのＮａＣｌ！に溶解し、１５０ｍＭのＮａＣ／と０．５Ｍの尿素どを含む溶液と接触させて２４時間透析した。次いで透析産物を遠心し、、　２ｚｌのアリコー１−を一８０℃で保存した。（８週齢）の５匹のマウスに３５０μｇのｇｐ３００調製物（約１μｇのｇｐ３００含有）を腹腔内注射によって１２日おきに５回投与した。各免疫中にポリく＾）ポリ（Ｕ）アジュバント（２００μｇ、１．５０…ＨのＮａ（Ｖ中に１．１ｇ／ｚ／）を静注によって投与した（１７）。最終注射の５日後にマウスに１０６サルコーマ１８０／ＴＧ細胞の懸濁液を腹腔内に注射Ｉ７て超免疫腹水を調製した（８）。

注射の８日後にマウスを殺し、腹水を収集！７た。腹水の細胞を遠心（Ｚｏｏ、、５分間）によって除去し、腹腔液を収集した。

モノクローナル　　輪＾ｂ　ＩＨ８の・１＋！１Ｖ−２ピリオンをＯＥＭ細胞中で培養し、ショ糖濃度勾配でバンドを形成させることよって濃縮培養上清から精製した。

精製ウィルスを、０．５％のＴｒｉｔｏｎ−１００，１５０ｍＭのＮａＣｌ２．５０輸８のＴｒｉｓ、　ｐＨ１８，ｏ、０．１％のアプロチニン（Ｓｉｇｍａ＞で可溶化し、超遠心によって清澄化した。次いでウィルス抽出物をＬｅｎ−ｔｉｌ−Ｌｅｅｔｉｎ　５ｅｐｈａｒｏｑｅ　４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）アフイニテイ力ラムに通１７、カラムを洗浄し、付着した糖タンパク質を０．５Ｍのメチル−α−Ｄ−マンノピラノシド（Ｓｉｇｍａ＞によって溶出させ、リン酸緩衝生理的塩類溶液（ＰＢＳ）と接触させて１晩透析したや１、ｅｎｔ、１ｌ−Ｌｅｃｔｉｎ　５ｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂ（５０〜１００ｕ＆）に再付着した２〜５μｇの精製糖タンパク質を含む０３１の腹腔内注射によってＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスを免疫した。４〜６週毎に同じ免疫原をマウスに２４時間ブースター投与した。これらのマウスを追跡し、その抗体産生を、（’ＳＳ：ｌメチオニンで標識した）ＩＩＶ−２ビリオンの抽出物のＲＩＰ＾テストによって定性的に検出し、可溶化ピリオンのＥｌ＾テストによって定量的に検出１．た（Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｓｙｓｔｅｍ）。

最終注射の３日後にＫｏｈｌｅｒ　ｌ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎの方法（１０）で牌臓細胞をミエローマＮＳＩ細胞と融合させた。Ｇｅｎｅｊｉｃ　５ｙｓｔｅ＠の可溶化ピリオンのＥＩＡテストを使用して抗＋１１Ｖ−２抗体を分泌するハイブリドーマの存在を検出するために、９６ウエルの融合プレートをスクリーニングした。クローンハイブリドーマを増殖及び安定させる方法と腹水の産生方法は既に記載されている（７）９次いで、ハイブリドーマの培養上清をＲＩＰ八分へ及びウェスターン法によってスクリーニングした。糖タンパク質と反応するモノクローナル抗体（ｍＡｂ＞１１１８の特性は、合成へ１千ドに基づ＜Ｅｌ＾テスト（１６）において、対応するＨＩＶ−２のトランスメンブラン糖タンパク質のアミノ酸配列５７９〜６０４によって決定される。アミノ酸配列５７９〜６０４は、配列決定済みのすべてのＨＩＶ−２及びＳＩＶの単離物中に十分に維持されており、モノクローナル抗体１１１８は、試験されたこのようなＨＩＬ２及びＳＩＶ単１物のすべてと交差反応を生じた。使用した合成ペプチドｐ３９′は、ＩＩＩＶ−２ＲＯＤのエンベロープのヌクＩ／オチド配列の推定アミノ酸配列５７９〜６０４に従って合成されたものである。合成ペプチドｐ３９′のアミノ酸配列は以下の通りである。

ＶＴＡＴ　ＥＫＹＬＱＤＱＡＲＬＮＳＷＧＣＡＦＲＱＶＣ）（嵐■」Ｊｌ【１鷹ｍ旦辻況− （２０μｐの）細胞またはウィルスの抽出物（１０６の感染細胞に対応する産物）をまず倍容のＲＩＰ＾バッファ（１０ＶｍＨのＴｒｉｓ−ＨＣｌ２゜ＤＨ７，６，１５０ｄのＮａＣ＆、ｌｄのＥＤＴΔ、１％のＴｒｉｌｏｎ　Ｘ−１００（ｖ／Ｖ）、０．２％（ｗｔ／ｖ）のす１−リウムデオキシコレート、０．１％（ｗｔ／ｖ）のＳＯＳ、７−の２β−メルカフ゛ｌ・エタノール、０．２１１ＮのＰＭＳＦ、１００μ／ｚｆｆｉのアプロチニンＮｎ１ｐｒｏｌ、　Ｃｂｏａｙ）及び２０％（ｖ／ｖ）のグリセロール）に希釈した０次に希釈抽出物を、（２５ μ！の）ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体と共に（４°Ｃで４５５分間インキュベート・シた。次いでプロティンＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを添加し、サンプルを４℃で３時間インキュベートした。次にこれらのサンプルをＲＩＰ＾バッファで洗浄した。免疫沈降によって回収したタンパク質を、電気泳動バッフｙ（１，２５ｍＭのｒｒｉｓ−ＭＣＩ！、　ｐｆ１６．８．　１％（ｗｔ／ｖ）のＳＯＳ、２０％（Ｖ／ｖ）のグリセロール、０，５％のβ−メルカプｌ〜エタノ・−ル）中で（９５℃で５分間）加熱して溶出させた。溶出したタンパク質を０．２％（ｔｗｔ／ｖ）でなく０．１％（胃ｔ／ｖ）のビス−アクリルアミドを含む７．５％または１２．５％のＳＯＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で回収した。

゛　　　のイムノプロット　　：ウェスターンｌタンパク質をポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析し、次いで（３）に記載のごとき電極バッファ（２０ｍＭのＴｒｉｓ塩基、１５０ｄのグリシン、２０％（、／Ｖ）のメタノール）中で０．４５μｍのニトロセルロースシート（Ｓｃｈｉｅｉｃｈｅｒ＆　５ｃｈｕｔｌ。

Ｄａｓｓｅｌ　、西独）に電気泳動転移させた。電気泳動斑を、ＰＢＳに乳濁させた５％（ｗ／ｖ）の粉末ミルクで飽和した２次いで１０％のＦＣＳを含むＰＢＳ中の旧Ｖｌ陽性血清もしくはＩＩＩＶ−２陽性血清（希釈度１：１００）またはマウスのポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体（希釈度１：２００）と共に密封バッグ中で（４℃で１晩）インキュベートした０次いで、シ・−トをＰＢＳ、５％のＮｏｎ１ｄｅｔ、　Ｐ−４０を含むＰＢＳで洗浄し、（５％の〉乳濁ミルクを含むＰＢＳで再度飽和させた。洗浄したシートを、２ＨＩＶ−１血清または１（ＩＬ２血清中のヒＩ〜ポリクローナル抗体を顕示させる１１２５で標識したプロティンＡ製剤（＾ｎｅｒｓｈ＋ｉｍ。

＞３０＋＊Ｃｉ＃ｙ）、または、１１２″で標識した抗マウスヤギ免疫グロブリン製剤＜Ａｍｅｒｃｈａｍ　；２〜１０μＣｉ／μｇ）と共に密封バッグにいれて（室温で２暗闇）インキュベートした。シートをバッグから取り出して再度洗浄し、乾燥して２４〜４８時間オートラジオグラフ（Ｋｏｄａｋ　ＲＰ　Ｒｏｙａｌ、　Ｘ−Ｒａｙ　Ｆｉｌｍｓ）にがけた。

［ｔμｍ鉦」ｌ＾込旦ニオ！（並−去−Ｖ蚊Ｉ鼾ｌ［釘乙バＪ］１【）１１Ｖ−２の糖タンパク質の前駆物質は１４０ｋＤａのタンパク質（ｇｐ１４０）であり、これは、成熟産物、即ち細胞外筒タンパク質（ｇｐ１２５）及びトランスメンブラン糖タンパク質（ｇｐ３６）に変態するどきに相同な二量体を形成する必要があることは既に判明していた＜１３）　、本発明では更に、トランスメンブラン糖タンパク質がポリアクリルアミドゲル上の８０ｋＤａのタンパク質に対応する位置に電気泳動移動度を有するホモ二量体（ｈｏａｎｏｄｉｍｅｒｅ）の形態で存在することを証明した（図１から図６）。このタンパク質はグリコジル化されており、便宜上これを、ｐ８０と呼ぶ。

Ｈ［ＬＩ　ＢＲＵまたはＨＩＶ−２ＲＯＤに感染したＯＥＭ細胞または非感染のＣＥＭ細胞の粗抽出物を、ＡＩＤＳ罹患患者から採取１．な］つのＨＩＶ−１陽性血清サンプル及び３つのＨ［Ｖ−２陽性血清サンプルを用い、電気泳動転移後にイムノプロットテスト（ウェスターン法〉で分析した（図１）。ＨＩＬ２特異血清はエンベ０−７前ＮＡ物１ｉ　（ｓｐ１４０及ヒｇｐ３００）　ヲｉＫｍ　Ｌ、更ニ、８０ｋＤａの糖タンパク質（ｇｐｓｏ）を強力に認識した。これらの血清は、１１１Ｖ−１特異血清によって検出可能なＩＩＩＶ−１タンパク質、即ち１１１’ｔｌ−１のエンベロープ糖タンパク質の前駆物質ｇｐｉ２０及びｇａ８タンパク質の前駆物質（ＨＩＶ−１ではｐ　５５及びｐ４０）を認識しないので、）ＩＩＶ−２のタンパク質特異的であった。Ｉ！ＩＬ２の感染・と８ｐ８０との関連性は、ＨＩＶ−１血清によってｇｐｓｏが認識されないどいつ結果、１ｉＩＶ−１感染細胞中でも認識されないという結果がいくつも得られたことによって証明される。

感染培地の遠心（ｔｏｏ、０００ｙで３０分間）によって調製されたウィルス集塊をウェスターン法で分析すると５．ｐ８０がまた、ＨｆＶ−２粒子中で細胞外糖タンパク質ｇｐ１２５と同時に検出され得ることが判明した。

壮Ｌ４速細　　のｐ８０の今ＩＬ予備実験は、すべてのＩＩＶ−２陽性匍清が、ｇｐｓｏ並びにエンベロープの８ μｇ前駆物質ｇｐＸ４０及びＥｐ３００、並びに細胞外糖タンパク質ｇｐ１２５を免疫沈降させ得ることを証明ｊ７た。

特性決定によってｇ　ｌ）８０のき成を確認するために、エンベロープタンパク質と強力に反応するＨＩＶ−２陽性血清を使用；７た。この血清から精製１．た抗体を、エンベロープ糖タンパク質精製用のイムノアフィニティ力ラムとして使用されるＣＮＢｒによって活性化した５ｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ＩＩＩＶ−２血清−８ｅ−ｐｈａｒｏｓｅ）に結合させた。旧Ｖ−２感染細胞を（）［１）グルコナミンで標識し、種々の時点（２，３，４，６及び８時間後）に感染細胞抽出物及びウィルス集塊抽出物を調製した。全部のサンプルをＨＩＶ−２血清−３ｅｐｂａｒｏｓｅで精製し、標識タンパク質をポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析したく図２）。２時間後に、感染細胞中の検出可能な標識タンパク質はｇｐ１４０及びｇｐ３００だけであった。　ｇｐｉ、２５及び８ｐ８０は標識開始の３または４時間後に検出可能になり、また、培地から調製されたウィルス集塊中でも検出可能になった。標識開始の６から８時間後にはｇｐ１２５及びｇ、８０がはっきりと検出された。これらの結果は、ｇｐｓｏがウィルス粒子と関連性を有すること、及びｇｐｓｏが未成熟な前駆物質の成熟産物であることを示唆する。

これらの実験においては〔３Ｈ〕グルコサミンで標識されたｇｐｓｅも検出されたが、細胞内タンパク質として検出されたものではない６図２では２００ｋＤａのタンパク質も出現しているが、これは、別のＩＨＶ−２陽性血清によって免疫沈降しなかったので、細胞性タンパク質であろうと考えられる。

ＨＩＶ−２のエンベロープ糖タンパク質の合成に関する反応理論の結果は、既存の結果と一致する。ＩＩＩＶ−２感染細胞中で、、　ｇｐｌ、４０は標識（パルスラベリング）の１５分後に検出可能な最初のエンベロープ産物である。ｌ・レーサー追跡（チェース）期間中、二量体形のエンベロープ前駆物質（ｇｐ３００）は３０分後に検出されたが、成熟細胞外筒タンパク質（ｇｐ１２５）は１．５〜３時間後にようやく検出可能になった（１３）。

］朋νにケ舌−乙さ」よゴー剪１１１１且す」ロ婬誌ノー且−二九［ｉ制にに女鉦堕久翼粂Ｈ１Ｌ２のエンベロープ糖タンパク質の特性決定のために、精製１７た二量体前駆物質、ｐ３００に対するポリクローナル抗体を調製した。このためにｇｐ３００をまず、旧Ｖ−２血清陽性患者の抗体と共に免疫吸着剤によって部分的に精製し、次いで分離用電気泳動によって精製しｔ二。５μ「のこの精製ｇｐ３００調製物を５匹のマウスに１０日おきに５回復腔内投与することによってマウスを免疫した。（２００μＳの）ポリ（＾）、ポリ（［１）をアジュバントとして使用し、抗原と混合１．て投与した（材料及び方法の項参照）。全部のマウスでｇｐ３００に対する抗体が発生した。これらの抗体は、ｐ３００に対するポリクローナル抗体（抗、ｐ３００抗体）である。図３は、１匹の免疫マウスの抗体を使用したウェスターン法による分析結果を示す。

抗ｇ　ｐ　３００抗体１ｊ：ｇｐ３００ト特ｉ　反応Ｌ　タが、１ｔｌＶ−２感染細胞中に存在するＥ＋９１４０．　Ｂｐ１２５及びｇｐ８０トも反応した。ＨｔＶ−１４，：感染したＣＥＭ細胞または非感染のＣＥＮ細胞中で特異信号は全く観察されなかった。６０ｋＤａのタンパク質が抗８，３００抗体によって標識されることも１７ばしば観察されたが、これは、ウィルス感染に無関係な細胞抽出物（区３．細胞セクションｒｃＥＬｌ、」）中でも観察されいくつかの実験では全く観察されなかったので恐らく非特異的である。これらのポリクローナル抗体はまた、Ｈ１Ｌ２感染細胞の抽出物及びウィルス集塊を使用する同様のウェスターン法テストでも使用された。

抗体は細胞抽出物中のｇｐ　３００−１ｇｐ１４０及びｇｐｓｏ　（図３、セクションＩＩＩＶ−２、列３）を認識した。抗体はまた、ウィルス抽出物中のｇｐ１２５、ｇｐｓｏ及びトランスメンブラン糖タンパク質であろうど推定される３６ｋＤａのタンパク質を認識ｊ７た（図３、セクションＨＩＶ−２、列■）。長時間の接触（ｅｘｐｏｓｉｔ、１ｏｎ）によって、細胞抽出物中の８ｐ３６の位置に対応する信号を検出することが可能であった。また、ウィルス集塊中のｇｐｓｏ及び、ｐ３６のレベルが細胞抽出物中でのレベルに比較してはるかに高かったことにも注目する必要がある。

これらの結果は、エンベロープ糖タンパク質の前駆物質に対するポリクローナル抗体が、ｇｐａｏを認識し、丈な同時にＨＩＶ−２のエンベロープのすべての成分を認識することを示しており、従ってｇｐｓｏは１（ＩＶ−２のエンベロープ糖タンパク質と関係があると考えられる。糖タンパク質、ｐ８０はウィルスと関連があり、成熟産物であろうと推定される。

モノクローナル　　１１ｔ８にξＶ肛ｖ−ｇの１−ラ乙スメクｌｊＺタンパク　　８０の、　引Ｊどのウィルス糖タンパク質を認識できるが含決定するために、モノクローナル抗体ｍＡｂ　１１ｉ８を使用したウェスターン法テストを行なっ）ご。ＨＩＶ−２感染細胞中で、鵡へｂ１．Ｈ８はｇｐａｏ０、ｇ９１４０及びｇｐａｏを認識しタカ、ＨＩＶ−２粒子中テハ主として帥８０を認識し、ｇｐ３６及びｇｐａｏ０もゎずかに認識したく図４）。ウィルス集塊中に少量のｇｐ３ｏｏが存在する理由は恐ら＜　、Ｆｌｐ３００が細胞性タンパク質なので溶解した細胞から混入するなめであろう（１３）、　８ｐ３６に関する信号が弱い理由は恐らく、このタンパク質のレベルが低いためであろう。哨＾ｂＩ１１８は細胞外糖タンパク質、ｐ１２５を認識しなかったく図４）。

また、旧■−１感染細胞の抽出物またはウィルス集塊のいがなるタンパク質も認識しなかった。これらの結果は、）ｌ　Ｉ　Ｖ　−２のエンベロープ前駆物質（ｇｐｌ、４０及びｇ　ＩＶ３００　）及びトランスメンブラン糖タンパク質（ｇｐ３６）に対して抗体１内糺ユ１１８が特異性を有することを示す。…＾ｂ１．ｌＩ８の反応性がＩＩ　Ｉ　Ｖ　−、２のトランスメンブラン糖タンパク質のアミノ酸配列５７９〜，６０４に存在することを合成ペプチドｌ）３９　’を用いて試験した。

彌＾ｂ　ＩＩ８と８ｐ８０との反応特異性を証明するために、ＲＩＶ−２のウィルス鶏塊抽出物を使用してウェスターン法テストを行なった。タンパク質の転移後、ニトロセルロースシートを一へｂ１．Ｈ８抗体またはｇｐａｏ０に対するポリクロ−カル抗体と共に、ペプチド３９′の存在または非存在下にインキュベ− １”　Ｌ　ｆｓ　（図５　＞。＊Ａｂ　ＩＨ８１ｉ　ｇｐａｏと共に強い信号を４えた。

更に、ｇｐ３６に対する信号が観察されたが、この信号は長時間露光後のオートラジオダラムにのみ観察された。抗ｇｐｓ。

Ｏ抗体ハｇｐ１２５、ｇｐＯ及Ｕ　ｇｐ３８　ト反応Ｌ　ｆｚ。６ｏｋＤａノタンハク質によって得られた信号はく図３に示すごとく）特異的でない，ペプチドｐ３９′を添加するどＭ／ｌ　ｂ　Ｉ　Ｈ　８で得られる信号は完全に消滅したが、抗Ｆｌｐ３００抗体で得られる信号は消滅しなかったく図５）。これらの観察から、ｍ　Ａ　ｂ　１．　Ｈ　８の反応性がＨＩＶ−２のトランスメンブラン糖タンパ２質の配列５７９−６０４に対応する２６個のアミノ酸残基に特異的であることが確認された。即ち、ペプチドｐ３９゛の配列に対応する配列がｇｐａｏに存在すると推定される。抗Ｅｐ３００抗体の反応性はペプチドｐ３９′によって変性しなかった。その理由は、これらのポリクローナル抗体がペプチドｐ３９°に対応するエピトープ以外のエピトープと相互作用するからであろう。

帆ｌ祁００ポリクロー世フｌ（、Ｌスル１轡」郵賀」禦１咀映ダｍ丸」ポリクローナル抗体はｇｐ３ｏｏ、ｇｐ１４０、ｇｐ１２５及びｇｐａｏを免疫沈降させ、輸＾ｂ１１１８はｇｐａｏ０．、ｐ１４０及びｇｐｓｏを免疫沈降させた（図６）。２つの細胞性タンパク質（６０及び４５ｋＤａ）も、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の双方を含む免疫複合体調製物と会合１，ていたく図６、０時間及び２時間の列）。タンパク質６０及び４５ｋＤａは、プロティンＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに付着することによって免疫複合体調製物中に存在していた。プロティンＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅは、種々の抗体と共に形成される免疫複合体を回収するために使用されたものである。

１（ＩＶ−２感染細胞を「パルス法」で３０分間標識しマーカーを２及び４時間追跡（チェイスＮ，た。標識細胞の抽出物（０、２及び４時間）及びウィルス集塊を４時間追跡（チェイス）後に回収し、ｇｐａｏ０に対するポリクローナル抗体及び抗体ｍＡｂ　ＩＩ８を用いた免疫沈降アッセイで分析した（図６）。標識（パルス）中はｇｐａｏはポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体によって検出されなかった。２時間追跡（チェイス）後に感染細胞中でｇｐａｏがはっきりと検出された。４時間追跡（チェイス）後に感染性細胞中てｌ””Ｓ：ＩＩメチオニン標識したｇｐｓｏが検出できなくなる。４時間後の産生ウィルス集塊を分析すると、細胞外糖タンパク質ｇｐｉ２５と同様にｇｐｓｏがウィルス粒子に会合していることが判明したく図６）。

ｇｐａｏは旧Ｖ−２のエンベロープの成熟産物であると考えることができる。ｇｐｓｏが）ＩＩＶ−２のトランスメンブラン糖タンパク質の特異モノクローナル抗体によって認識されたことは５このタンパク質が８ｐ３６の二量体形に対応することを示唆する（図８及び図９に示した結果で確認された）。ｇ，８０は感染ＣＥＭ細胞だけがら検出され／Ｓのでな（　、ｌ（ＩＶ−２に感染したＴ４リンパ球からも検出された。

ウェスターン法による分析及び免疫沈降アッセイによって得られた結果を比較すると、）ＩＩＶ−２に陽性のヒト血清、マウスポリクローナル抗体及び抗体−＾ｂ１．Ｈ８が、［１ｐ８０及びｇｐ１２５の天然形よりも変性形を認識し易いことが判明する（図１、図２、図３、図４及び図６）。これらの成熟糖タンパク質の天然形は、種々の抗水によって認識される工とｌ−−ブを隠蔽するようなコンボ・−メーションを有しているのであろうと推定される。

？彩ぢζえ多Ａ先Ｊ工ま之り隻１旦、二＆Ｑ−取Ｌム［：　’　＋（〕ｌグルコサミンび〔：’　ＩＩ　：ｌフコースで代謝的に標識した）１！Ｖ−２ウイルス感染細胞の抽出物を、抗体随＾ｂ　ＩＩ８及び抗ｇｐ３００ポリクローナル抗体を用いて免疫沈降させた。先の結果（図３−６）と同様に、抗ｇｐ３００抗体は、糖で標識された糖タンパク質、即ちｇ　ｐ　３００　　、、　、　＋　４０．８ｐ＋２５及びＥ　Ｋ１８０を免疫沈降させ、ｍ　Ａ　ｂ　１　ｔｌ　８は、ｇ　ｐ　３００．８　Ｔ１１４０及び［１８０を免疫沈降させた。（’　１１　：ｌグルコサミンはこれらの全部のタンパク質によって取り込まれてい／、二が、Ｃ３）１　）ツー１−スは概してｇｐｌ、２５及び８ｐ８０によ−）て取り込まれていることが判明ｊ、た（図７＾）。

これらの実験で、〔１旧フコースで標識された。ｐ３６は長時間露光後のす・− トラジオダラムにも微弱にしか［察されなかった。Ｅｐ８０はまた１、ｐ３００、ｇｒ＋１．４０及びｇｐｌ、２５と同様に［”　ＩＩ　）マンノースを取り込むことがてきる。８ｐ　８０及びその他の糖タンパク質によるこのような標識糖の取込みは、抗生物質であるツニカマイシン（１５）によって阻害される。ツニカマイシンは窒素に結合したタンパク質のグリコジル化を阻止する。

（ドアセチルグルコサミン、マンノース及びグルコースを含む）アスパラギンに結合した糖タンパク質のオリゴ糖は、天然タンパク質に結合］また後により閣著に成熟する（１１）。オリゴ糖鎖の末端が、フコース残基及びシアル酸の転移前に小胞体及びゴルジ体に結合する。その理由は、フコース残基の取込みがグリコジル化段階よりはるかに後で生じるからである。Ｈｉ　Ｖ〜２感染細胞中では［：　３　ＩＩ　：ｌｌフコースの大部分が、Ｉ（ＩＶ−２のエンベロープの前駆物質の成熟産物に対応するく図６）２つのタンパク質Ｂ　ｐ　１．２５及びｇｐ８０に取り込まれる（図７）。エンベロープの前駆物質の成熟中に８ｐ１２０が産生されノ：：ことを確認するためＣご、　ｆｉｌｖ−２感染細胞をグルコシダーゼインヒビターであるキャスタノスペルミンク１４）の存在下または非存在下にＣ３５Ｓ’ｌメチオニンで標識した。次に、複数のウィルスタンパク質を認識したｌｌ＋Ｖ−２陽性患者の血清を用い、培養上清を免疫沈降によって試験］７た。キャスタノスベルミンの存在下では、８μ８ｏ及びＢｐ　＋、　２５の産生はかなり減少したが、ヌクレオキャプシドの主要（コア）タンパク質＜ｐ２６）は有意な影響を受けながった（図７！Ｊ）。

ＵＵカッ【旺謀さ一ΦＢ８ｐ８０の解離に最適な条件を知る／ごめの実験を行なった。

これらの条件は、極めて生理的塩類溶液に近い培地、酸性ｐＨ，イオン性界面活性剤ＥＩＪＴＡまたはＥＧＴ＾、などに対応した。

文献（１３）に記載された方法を用い、弱酸性バッファ中でのインキ工ベーションによってｇｐ３０Ｑの解鯵試験を行なった。

、二の方法は、６より小さいｐＨ値を有するバッファによるｇｐｓｏの解離には適しているが、糖タンパク質ｇｐｓｏの大部分が分解（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）　Ｉ、た。どの実験においても、非イオン性界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ　Ｌｌｏｏを含む溶菌バッファを使用して感染細胞抽出物またはウィルス集塊を調ｍｌ！！　した。これらの条件ではｇ　１３３００及びｇｐｓｏは解離せず、イオン性界面活性剤Ｓ　Ｄ　Ｓを添加しまた後でも解離しなかった。ＳＯＳの効果、即ち゛「丁・己Ｏ１１の代わりにＳＯ３を使用して抽出物を調製１７た場合についても試験ｌ−な。旧■感染細胞をＣ３５Ｓ’Ｊメチオニンで標識し、１％のＴｒｉｔ、ｏｎ　Ｘ−１００または１％のＳＤＳを含む溶菌バッファで可溶化することによって抽出物を調製した。次に、これらの抽出物を、界面活性剤を含まない溶菌バッファで１０倍に希釈し、精＾ｂ　ｉｏｓを用いて免疫沈降させた６Ｔｒｉｔｏｎによる抽出物から得られた免疫種自体調製物は、［”Ｓ：ｌメチオニンで標識されたバンド、即ち８ｐ３００．ｇｐｌ、４０及びｇｐｓｏに対応するバンドと、ｇｐ３６ｉ、こ対応する弱いバンド（図８、セクションＣの列１）との存在を示Ｌ　ｌ：：　、更に、抽出物をＳＯＳで調製１７たとき、　ｇｐ３００及び８ｐ８０は実質的に検出不能であったが、ｇｐ１４０及び８ｐ３６のｌ／ベルは増加していた（国８、セクションＣ１列２）。従って、イオン性界面活性剤の存在下では二量体形の８．．３００及びｇｐ８０は解離して夫々８ρ１４０及びｇｐ３６になる。　［：’ＳＳ：ｌメチオニンで標識しｌ：精製、ｐ３００は解離によってｇｐ１４０だけを産生じたり１３〉。従って、、３６は、ｐ８０の解離後にのみ存在する。標識されたタンパク質１ｌｌｐ３００及びｆｆｐ８０が解離タンパク質から全く回収されなくなると、　ＳＯ３の存在下ではタンパク質の分解（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）が生じることが観察された（図８、セクションＣ）。２００単位／１１１のアプロチニン及び０．２ｍＨのＰＭＳＦの存在は、ＳＯ３とのインキュベ・−ジョン中のかかる分解（ｄｅ８ｒａｄａｔ、　１ｏｎ）を妨害しなかった。

二量体形のタンパク質がタンパク質分解に抵抗するコンボーメ−ジョンを有するとも考えられる。ｇｐ３００及びｇｎ、８０の解離はタンパク分解部位をアクセス可能にするコンボーメ−ジョン的修飾を生じる。

１１１Ｖ−２のウィルス集塊に対（７て同様の解離実験を行なった、　（”Ｓ）メチオニンで標識したウィルスタンパク質を１％のＴｒｉｔ、ｏｎまたは１％のＳＯＳを含む溶菌バッファまたは０，１％のＳＯＳと１％のデオキシコｌ／　− １−とを含むＲＩＰ＾バッファで可溶化した。１％のＳＯ５を含む溶菌バッファ中の抽出物を更に９５°Ｃに加熱した。次に、全部の抽出物を一＾ｂ　ｉＨｂによって免疫沈降させ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析Ｉ７た（図８、セクションＶ）。

Ｔ’ｒｉＬｏｎによる抽出物から調製した免疫複合体中では　抗体１１１Ｂによって免疫沈降する主要タンパク質はｇｐｓｏ及び８ｐ３６であった。また、ＳＤＳによる抽出物中では１．ｐ８０は検出不能になったが、ｇｐ３６のレベルは閉著に増加１７た。ＳＤＳ抽出物中では標識成分の大部分が消滅したのて、極めて高度な分解が生じたものと推定される。ＲＩＰ＾バッファを用いた結果は更に良好であり、ｇ、＋ＳＯの大部分が解離しラベルの約３０％が８ｐ３６に検出された（図８、セクションＶ）、　ｇｐｓｏが８ｐ３６のみから成ることを証明するために、抗体ｖＡＡｂ　１．Ｈ８による免疫沈降と分離用ゲル電気泳動どによって精製した「１５Ｓ’ｌメチオニン標識ｇｐ８０の解離実験を行なった。凍結乾燥した８ｐ８０の調製物を［）ＩＩ　６　、８．５，８及び４．８のＳ［ｌＳを含む酢酸塩バッファ中に直接懸濁させた。ｐｌ＋４．８においては全部のｇｐｓｏがｇｐ３６に転化したく図９）。

ジ１ｙニ」」ゴ已セヨ（トニ＝」１］本じ彩ヨード≧之−とヨ♂−イｙ丁て□コリン１ｔ１ノー３こＭＪＬ’７と…ｌトランスメンブラン糖タンパク質がＳＩｖサンプル中で二量体形で検出されるか否かを試験した。

ＳＩｖ及びＨＩＶ−２に感染１７た細胞を〔１■〕グルコサミンで標識］７、Ｔｒｉｔｏｎを含む溶菌バッファで抽出物を調製し、次いで抗体…＾ｂ　ＩＩ８で免疫沈降させた。図７に示すように、モノクローナル抗体はＨＩＶ−２感染細胞ノ５ｐ３ｏｏ、ｇ　Ｉ３　＋、　４０　及びｇｐｓｏを沈降させ、ウィルス粒子中てはｇｐｓｏだけが検出された（図１０）。ＳＩＶ感染細胞中ではモノクローナル抗体は３つのグリコジル化タンパク質、即らエンベロープ前駆物質ｇｐ１４０、二量体形前駆物質８ｐ３００及びＩＩ［Ｖ−２の８ｐ　８０に恐らく対応する６５ｋＤａのタンパク質（ｉｉｌｐ６５）を沈降さ堕た。、ｐ８０ど同様に、Ｆｉｐ６５はＳＩＶのウィルス粒子と会合していたく図１０）。

これらの実験ニオイテ、）ＩＩＶ−２ＲＯＤ及びＳ［Ｖ−ｍａｃ））、ランスメンプラン糖タンパク質の単量体形は検出できなかった。

＋＋１Ｖ−２ＲＯＤのアミノ酸配列５７９−６０４はＳｉＶ−ｍａｃのアミノ酸配列５９５〜６２０に対応する（１９．７）。これらの２つの配列は高度な相同性を有し、抗体…＾ｂ　１１１８はｔｌｌＶ−２ＲＯ［］及びＳＩＶ−ｍａｃの双方のエンベロープ糖タンパク質に交差反応する。

従って発明者は分子量約６５ｋＤａのタンパク質が５ＩＶ−ｓａｃウィルスの８ｐ３２の二量体形に対応することを証明した。

１に量体形タンパク質（Ｆｌｐ３００及び５ｐ８０）の解離は弱酸性ｐｉｔで生じ得る。従って、ｇｐ１４０の二量体化はｐ）ｌ依存性であり、前駆物質８ｐ１４０の２分子の融合に有利な小胞体のコンパートメントで生じると推定される。

１（ＩＶ−２の二量体形エンベロープ前駆物質、ｐ３００の分子量を非変性条件下にポリアクリルアミドゲル電気泳動で算出した（１３）、　０．２％（ｗｔ／ｖ）の代わりに０．１％（ｗｔ／ｖ）のビスアクリルアミドを含む５％のポリアクリルアミドゲル中でこの二量体形前駆物質は２８０ｋＤａのタンパク質に対応する位置に泳動した。天然条件下の二量体の分子量を確認するなめに、５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−３００カラムを用い且つＴｒｉｔ、ｏｎを含む溶菌バッファで調製したｉ’　３　！ｉ　Ｓ　）メチオニン標識１１ＴＶ−２感染細胞抽出物を用いてゲル濾過実験を実施ｌ−な。これらの実験条件でｇｐｓｏ０は集塊タンパク質のピークの後の第２のピークの形態で溶出した。■・ランス、メンプラン糖タンパク質の二量体は、　ｐ　］、　２５のピークの後及びマーカーとして使用したウシ血清アルブミン（６８ｋＤｎ）のピークの前の分子量７５〜８０ｋＤａを有する溶出タンパク質に対応した。これらの観察は、二量体ｇｐ３００及びｇｐｓｏの分子量が天然形及び変性形で同等である５：とを示す。これらの二量体形のｉｎ　ｖｉｔｒｏ解離は、酸性！１１Ｈで生じ、またイオン性界面活性剤ＳＯ３の存在下でも生じた。

Ｔｒ　ｉ　ｔｏｎを含有する溶菌バッフＴによって抽出物を調製すると、二量体形！１ｐ３００及び８ｐ８０はＳ　Ｄ　Ｓによって解離しなかった。

従って非イオン性界面活性剤Ｔｒ　ｉ　ｔｏｎはエンベロープｇｐ３００及び８ｐ８０の天然杉二量体を維持する。

二量体形のエンベロープ前駆物質ｇｐ３００及びトランスメンブラン糖タンパク質はまた、ＳＩＶ感染細胞でも観察されたが旧Ｖ−１感染細胞では観察されなかった。特に、Ｉ１１’／−２の二量体形トランスメンブラン糖タンパク質（ｇｐｓｏ）及びＳＩＶの二量体形）・ランスメンプラン糖タンパク質（ｓｐ６５）は還元剤の存在下に解離しない。従って、トランスメンプランエンベロープ糖タンパク質の二量体化は旧Ｖ−２及びＳＩＶのエンベロープ遺伝子に特異的な特性であると考えられる。この特性は、新しいＨＩＶ単離物を特性決定するときに、検出された単離物と１ＩｉＶ−１型またはＩＩＩＶ−２型との関係を説明するための適当なマーカーとして利用され得る。成熟エンベローブ糖タンパク質を産生ずるべく前駆物質が成熟するためには、エンベロープ前駆物質の二量体化が必須である。：量体形のトランスメンブラン糖タンパク質は、最適なピリオン構造の形成に必須であり、また細胞膜と融合する能力及び感染させる能力にも必須であるが、１−ランスメンブラン二量体のｉｎ　ｖｉｔｒｏ解離は極度の分解を生じさせる。その理由は、この糖タンパク質の二量体形がタンパク質分解に抵抗し得るコンホーメーションを有するためであろう。

実施例で説明した本発明のいくつかの特徴を、ＩＩＩＶ−２の糖タンパク質ｇｐ１．２５及びｇｐｓｏを示す表及びそれらの産生段階を示す図にまとめる。

冒、４；ｔｌｌｌｌｎ、！、Ｉｓ＋−９ρ１４０ＡｂＳｇｐ３００→のｇｐ８０−・　　　　ｇｐｓｏ−・　　−ｇｐ３６−　　”　　　　！ＪＰ３６ →・−ｅ・口＝コｐＨ：　　　６．８　　５．８　　４．８ｇｐ８０→′−◆ 尋　　　１・・　６ｇ９３６区＝コｇｐ３００→曽　　　　　ｇＰ３００．ｗ　　・・ｇｐ１４０→・　　　　ｇｐ１４０→優ｇｐ６５→・　　− 国際調査報告国際調査報告１コｈｍａｎｔｉ１ｍｔｌｈＦｐｍ＋ｒｍ＋１＋ｍｌｌｔｎｅｍｂ４ｎＷｍ１ｎｅ＋ｅ＋ＭｐＨｅｆｆｉ１ｍｓｅｕｎｗｎｕｆｌｌｌｌｄＩqｔｈｅ算１ｎ雫嘩 ″１ｖ−１１τ−・ｎ−トーｗｔｒｎ−ａｉｓ＋＋ａｌ＠６ｆｆｉｒｅｌｈｎｎｓ　ｍｔＭ−ａｒｅ　ｕｕｎ＋劃ｗｄ側ｉｅｍＦｘｏｐｅｍｎ　Ｐｕｅｍ　０ＩＴＷ　ＦＯＰｎｋｅ＋＋　７３１１０１９０Ｔ１１１ＥＷ申Ｎ＋ＰＵｅｌｌｌｌＯｆｆ＋ｅｒｉｌｉｎ６６＊Ｑｌｉｓｂｌ＋ｌＮ１ｈｌ’Ｎｐ＊Ｍ１１’ｌｌｌ寝Ｎ１１ｈｌｌｈ６１２sｈＷｔ１７１ｊｉｌｔｆｉＩＩＩＴｌｌｌｐｕｎ・ｗｍｌ＋ｎシ・ｒｍｍｉ＊ａ

Claims

【特許請求の範囲】

１．以下の特性を有すること、即ち、 −分子量約８０ｋＤａを有する、 −糖タンパク質ｇｐ３００に対するポリクローナル抗体によって認識される、 −ヒトのＳＬＡまたはＡＩＤＳを発症させ得るＨＩＶ−２型ヒトレトロウイルスのゲノムによってコードされたトランスメンブランエンベロープ糖タンパク質ｇｐ３６の２つの完全体を二量体形態に会合させて含む、または、 −前記ｇｐ８０に対する抗体と共に抗原−抗体型の免疫複合体を形成し得る同程度の分子量のすべての糖タンパク質を含む、ことを特徴とする抗原性糖タンパク質ｇｐ８０。
２．以下の特性を有すること、即ち、 −ＨＩＶ−２型ヒトレトロウイルスに感染した細胞及び／またはＨＩＶ−２型のビリオン及び／またはウイルスに会合し得る、−１％のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００のような非イオン性界面活性剤の存在下ではｉｎ　ｖｉｔｒｏで解離せず、弱酸性ｐＨの１％のＳＤＳのようなイオン性界面活性剤の存在下ではＨＩＶ−２型レトロウイルスのトランスメンプラン糖タンパク質ｇｐ３６を形成すべくｉｎｖｉｔｒｏで解離する、ことを特徴とする請求項１に記載の糖タンパク質ｇｐ８０。
３．−一方でＨＩＶ−２型レトロウイルスに感染した細胞中に存在するｇｐ３００、ｇｐ１４０、ｇｐ１２５及び請求項１または２に記載のｇｐ８０を特異的に認識し、他方でＨＩＶ−２型レトロウイルスの抽出物中に存在するｇｐ１２５、請求項１または２に記載のｇｐ８０及びｇｐ３６を特異的に認識し、−健常細胞またはＨＩＶ−１型レトロウイルスに感染した細胞中に存在するタンパク質または糖タンパク質を認識しないことを特徴とするポリクローナル抗体。
４．請求項１または２に記載の糖タンパク質ｇｐ８０と特異的に反応し、ＨＩＶ −１型レトロウイルスに感染した細胞のタンパク質及び糖タンパク質またはＨＩＶ−１のウイルス集塊とは反応しないことを特徴とするモノクローナル抗体。
５．更に、ＨＩＶ−２の糖タンパク質的ｇｐ３００ｇｐ、ｇｐ１４０及びｇｐ３６を認識することを特徴とする請求項４に記載のモノクローナル抗体。
６．請求項４または５に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
７．ＨＩＶ−２型ヒトレトロウイルス感染を、該感染後に形成された抗体を含むと予想される生物サンプルからｉｎ　ｖｉｔｒｏで特異的に診断するための、請求項１または２に記載の糖タンパク質ｇｐ８０を少なくとも１つ含むことを特徴とする抗原性組成物。
８．請求項１または２に記載の糖タンパク質ｇｐ８０の少なくとも１つを、ワクチン成分として許容される医薬担体と共に含有することを特徴とする免疫原性組成物。
９．−ＨＩＶ−２型レトロウイルス感染後に産生する抗体を含むと予想される生物サンプル請求項１まは２に記載の糖タンパク質ｇｐ８０または請求項７に記載の抗原性組成物とを抗原−抗体型の免疫複合体が形成され得る適当な条件下に接触させ、 −場合によっては形成される抗原−抗体複合体を検出する段階を含むことを特徴とするＨＩＶ−２型レトロウイルスに特異的に起因する感染のｉｎ　ｖｉｔｒｏ診断方法。
１０．−ヒトレトロウイルスＨＩＶ−２に感染した細胞を溶解し上清と感染細胞とを分離するか、または遠心によって調製されたウイルス集塊を溶解させ、 −細胞抽出物及び／またはウイルス抽出物を、例えばヒトレトロウイルスＨＩＶ −２感染患者の血清即ちＨＩＶ−２のエンベロープタンパク質と強力に反応する能力を有する血清から得られた精製抗体を好ましくは適当な担体に固定させて含む免疫吸着剤を収容したイムノアファニティカラムで、バッファの存在下に抗原 −抗体免疫複合体が形成される十分な時間インキュベートし、 −カラムをバッファで洗浄して担体に保持されなかった分子を除去し、 −所望の抗原性タンパク質を回収する段階を含むことを特徴とする請求項１または２に記載の抗原性糖タンパク質ｇｐ８０の製造方法。
１１．糖タンパク質の回収を電気泳動及び電気溶出によって行なうことを特徴とする請求項１または２に記載の糖タンパク質を製造するための請求項１０に記載の方法。
１２．糖タンパク質を回収するために、−前記イムノアフィニティカラムに固定されたタンパク質を溶出させ、 −前記の溶出産物を、分離担体に固定されたｇｐ８０認識モノクローナル抗体を含むカラムクロマトグラフィーで精製することを特徴とする請求項１または２に記載の糖タンパク質を製造するための請求項１０に記載の方法。
１３．−請求項１または２に記載のタンパク質及び／または抗原性糖タンパク質少なくとも１つ、または、−請求項７に記載の組成物、または −これらの種々の成分の混合物と、 −被検生物サンプル中に場合によっては存在する抗体と前記抗原との間の免疫複合体の形成反応を生じさせる手段、特に必要に応じて１種または複数のインキュベーションバッファと、 −陰性対照サンプルと、 −形成された抗原−抗体複合体の顕示手段とを含むことを特徴とするヒトレトロウイルスＨＩＶ−２に感染した疑いのある患者の血清またはその他の生物サンプル中の抗体検出用キット。
１４．−細胞内タンパク質が露出するように生物サンプルを処理し、 −例えば電気泳動、または、ｇｐ８０と免疫的に反応性の抗体を用いた免疫検定によって、露出した細胞内タンパク質中のタンパクｇｐ８０存在を検出する段階を含むことを特徴とする生物サンプル中のレトロウイルスＨＩＶ−２感染の検出方法。