KR100254811B1 - 인간 면역결핍 바이러스의 덮개 단백질인 p24 에 대한 단일클론항체, 이를 생산하는 융합세포주 및 그의 제조방법 - Google Patents
인간 면역결핍 바이러스의 덮개 단백질인 p24 에 대한 단일클론항체, 이를 생산하는 융합세포주 및 그의 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 인간 면역결핍 바이러스-1 (HIV-1)의 주요한 덮개 (major capsid) 단백질 p24 에 대한 단일클론 항체, 이를 생산하는 융합세포주 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 HIV-1 p24 중에서 항원성이 높은 부위인 p24 의 아미노산 번호 202-221 서열을 특이적으로 인식하는 단일클론 항체에 대한 것으로서, 상기의 단일클론 항체는 혈액 내의 HIV-1 p24 항원을 검색하여 HIV-1 에 의한 면역결핍 질환을 진단하는데 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 인간 면역결핍 바이러스-1 (Human Immunodeficiency Virus-1 ; 이하 "HIV-1" 이라고 약칭함)의 주요한 덮개 (major capsid) 단백질 p24 에 대한 단일클론 항체, 이를 생산하는 융합세포주 및 그의 제조방법 그리고 p24 (202-221) 서열을 포함하는 다가지 항원 펩타이드에 관한 것이다.
보다 상세하게는, 본 발명은 HIV-1 덮개 단백질 p24에서 항원성이 높은 부위인 아미노산 번호 202-221 서열을 인식하는 마우스 단일클론 항체에 관한 것으로, 상기의 단일클론 항체는 혈액 내의 HIV-1 p24 항원을 검색하여 HIV-1 에 의한 면역결핍 질환을 진단하고 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다. 또한 본 발명의 p24 (202-221) 서열을 포함하는 다가지 항원 펩타이드는 HIV의 양성혈청의 항체를 검출하여 후천성 면역결핍증을 진단하는데 이용될 수 있다.
후천성 면역결핍증 (AIDS)은 인간의 면역결핍 바이러스 1 또는 2 형 (HIV-1 or HIV-2)의 감염에 유발되는 질병이다. 인간의 면역결핍 바이러스에 대한 후천성 면역결핍증을 진단하기 위하여서는 효소 면역 측정법 (enzyme-linked immunosorbent assay, 이하 "ELISA" 로 약칭함)으로 HIV 에 대한 항체 또는 항원을 검색하는 방법이 주로 많이 이용되고 있다.
HIV-1 또는 HIV-2 대한 진단으로 사용되는 항원은 HIV-1 의 표면 단백질인 gp41 단백질과 HIV-2 의 표면 단백질인 gp36 단백질이 주로 사용되고 있으며 HIV-1 의 gp41 단백질과 HIV-1 의 gp36 단백질 중에서 항원성이 높은 부분 (immunodominant epitope)의 서열을 합성한 펩타이드를 ELISA 의 코팅 항원으로 이용하여 사용하기도 한다 (Petrov, R. V. et al., Biomed. Sci., 1 : 239-224 ; Khaitov, R. M. et al., Biomed Sci., 1: 553-564).
한편 gp41 단백질과 gp36 단백질의 재조합 단백질 항원은 정제가 어렵고 비용이 많이 소요되는 단점이 있으며, 펩타이드 항원은 비용은 저렴하나 코팅효율과 항원성이 낮으며(Geerling, H.J. et al.,Immunol. Methods, 106 : 239-244, 1988) 짧은 펩타이드 항원은 감도가 떨어지는 단점이 있다.
따라서 코팅효율 및 감도를 높이기 위하여는 크기가 큰 펩타이드 항원이 요구된다.
본 발명자들은 HIV-1 gp41 단백질 중에서 가장 항원성이 높은 부분인 HIV-1 gp41 (584-618)과 HIV-2 gp36 단백질 중에서 가장 항원성이 높은 부분인 HIV-2 gp36 (574-602) 펩타이드를 코팅항원으로 사용하여 HIV-1 및 HIV-2 항체를 진단하는 방법을 개발하여 특허 출원 (출원번호 97-18527)을 하였으며, 또한 HIV-1 gp41 (584-618) 및 HIV-1 gp41 단백질을 특이적으로 인식하는 마우스 단일클론 항체를 제작하여 HIV-1 항체 진단에 응용하여 특허출원 (출원번호 97-32455) 한 바 있다.
HIV의 감염의 진단에는 HIV gp41 에 대한 항체 검출이 HIV 감염 여부를 알려주는 지표 (marker)가 될 수 있으나, HIV-1 의 감염 초기에는 HIV-1 gp41 단백질에 대한 항체의 역가 (titer)가 낮기 때문에 HIV-1 gp41 단백질 및 펩타이드를 코팅항원으로 하는 HIV-1 항체의 진단으로는 HIV-1를 진단할 수 없어 자칫 위음성 (false negative)을 나타낼 수 있다. 또한 HIV 의 감염 초기에는 HIV-1 p24 단백질 항원의 농도가 매우 높은 것으로 알려져 있다. 그러므로 최근에는 HIV의 진단시 p24 항원 검출도 동시에 하도록 권장하고 있다. 따라서 HIV 감염의 HIV-1 양성 혈청내 p24 단백질의 존재는 HIV 감염을 알려주는 지표이다. 또한 HIV-1 p24 는 HIV 의 바이러스 유래의(viral) RNA 와 복제 효소(replecation enzyme) 등을 보호하는 덮게 역할을 하며, 바이러스 입자의 형성에 중요한 역할을 담당한다.
따라서 HIV-1 감염 초기의 환자의 HIV-1 진단을 위하여 p24 단백질 항원을 검출하는 항원 진단법이 주로 사용되고 있으며 이 때 p24 단백질에 대한 단일클론항체를 이용하고 있다. 즉, 자칫 HIV 항체의 진단에 의해 놓칠 수 있는 것을 p24 단백질의 항원 진단에 의하여 HIV 감염을 진단할 수 있다고 여겨지는 것이다.
그러나 p24 단백질은 다른 레테로 바이러스와 교차반응(cross reaction)을 나타내는 경우가 많으므로 HIV-1 p24 항원의 검출시 HIV-1 p24 단백질에 아주 특이적인 단일클론 항체의 개발이 요구된다. 따라서 HIV-1 p24 단백질의 항체에 특이적 반응성을 가진 p24 펩타이드를 동정하고 이에 대한 항체를 만들어 p24 항원 검출에 이용하면 비특이적 반응 (nonspecific reaction)을 매우 낮출 수 있으리라 여겨진다.
펩타이드에 대한 단일클론 항체를 생산하는 과정에서 특정 펩타이드 자체만 면역화시킬 경우에는 분자량이 작아 항체의 생성이 어려우며, 펩타이드를 운반체 단백질 (carrier protein)에 접합 (conjugation) 시킨 것을 면역화 시킬 경우에는 펩타이드 뿐만 아니라 운반체 단백질에 대하여서도 항체가 생성되는 단점이 있다. 반면 면역화에 사용되는 펩타이드를 다가지 항원 펩타이드 형태로 합성하여 분자량을 크게 하여 항원성을 증가시키면 이와 같은 단점을 극복할 수 있다고 보고되어 있다 (Tam, J. P., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 : 5409-5413, 1988, Shin, S. Y., Lee, M. K., Kim, S. Y. and Hahm, K-. S., Mol. Cells 6 : 169-175, 1996).
이에 본 발명자들은 HIV-1 p24 단백질중 아미노산 번호 202-221서열의 20 개 아미노산으로 이루어진 펩타이드가 항-폴리클론 HIV-1 p24 염소 항체에 대하여 매우 반응성이 높음을 동정하고(Lee, M. K., Shin, S. Y., Kim, S. Y. and Hahm, K-. S. Korean J. BRM 6: 249-258, 1996), 상기의 p24 (202-221)서열을 포함하는 직쇄상 펩타이드를 4 개의 가지로 연결한 MAP (이하 " MAP-7" 이라고 약칭함) 형태로 설계하고 제조하여, 이것을 마우스에 면역화 시켜 기존의 방법으로 융합세포주를 제조한 다음 이로부터 p24 단백질에 높은 특이성을 나타내는 마우스 단일클론 항체를 분리하여 그의 항원 특이성 등을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 인간 면역결핍 바이러스 (HIV-1) 의 p24 단백질에 특이적으로 결합하는 마우스 단일클론 항체, 이를 생산하는 융합세포주 및 그의 제조방법 그리고 p24 (202-221) 서열을 포함하는 다가지 항원 펩타이드을 제공함에 그 목적이 있다.
도 1은 HIV-1 덮개 단백질 p24 중 아미노산 번호 202-221 서열[이하 "p24 (202-221)"로 약칭함]의 다가지 항원 펩타이드 (multiple antigenic peptide, 이하 "MAP"로 약함)를 33% 트리신 젤 전기 영동으로 확인한 것이고,
레인 1 : 분자량 마커 ; 레인 2 : MAP-7
도 2는 HIV-1 덮개 단백질 p24 에 대한 단일클론 항체 및 이를 생산하는 융합세포주의 제조 과정을 도시화한 것이고,
도 3은 본 발명의 융합세포주가 생산하는 단일클론 항체의 면역글로불린 이소타입을 결정한 것이고,
A : 융합세포주 (KI-24)의 배양액을 사용한 경우 ;
B : KI-41 의 배양액을 사용한 경우 ;
C : 키트의 양성 대조 배양액을 사용한 경우 ;
D : 음성 대조군으로 RPMI-1640 배지액을 사용한 경우
도 4는 본 발명의 단일클론 항체가 HIV-1 p24 및 HIV-1 p24 (202-221)를 특이적으로 인식하는 능력을 효소 면역측정법으로 측정하여 나타낸 것이고,
● : HIV-1 gp41 의 아미노산 번호 584-618 서열 [이하 "HIV-1 gp41 (584-618)"으로 약함] MAP 합성 펩타이드를 코팅항원으로 사용한 경우;
■ : HIV-1 p24 (202-221) MAP 합성 펩타이드를 코팅항원으로 사용한 경우;
▲ : HIV-1 p24 단백질을 코팅항원으로 사용한 경우
도 5a 및 도 5b는 본 발명의 단일클론 항체가 HIV-1 p24 (202-221) 및 HIV-1 p24를 특이적으로 인식하는 능력을 효소 면역 측정법으로 측정하여 나타낸 것이고,
● : 상기의 단일클론 항체를 1 차 항체로 사용한 경우 ;
■ : 항-MHC 클래스II 단일클론 항체를 1 차 항체로 사용한 경우
도 6은 본 발명의 단일클론 항체의 항원 특이성을 웨스턴 블럿에 의하여 검증하여 나타낸 것이다.
레인 1: HIV-1 p24 단백질 ; 레인 2 :트립시노겐 ;
A : 본 발명의 단일클론 항체의 배양액과 반응전 ;
B : 본 발명의 단일클론 항체의 배양액과 반응 후
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 HIV-1 p24 단백질 중 서열 1의 아미노산 번호 202-221 서열을 포함하는 서열 2의 다가지 항원 펩타이드 MAP-7을 마우스에 면역시키는 과정으로 융합세포주를 제조하고, 이로부터 상기 서열 1을 특이적으로 인식하는 마우스 단일클론 항체 (수탁번호 : KCTC 0358 BP)를 제공한다.
또한 본 발명은 HIV-1 p24 단백질 중에서 가장 항원성이 높은 부분인 서열 1의 HIV-1 p24 (202-221) 펩타이드를 포함하는 HIV-1항체 결합용 다가지 항원 펩타이드를 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 인간 면역결핍 바이러스(HIV-1)의 p24 단백질을 특이적으로 인식하는 단일클론 항체를 생산하는 융합세포주를 제조하기 위하여, 우선 HIV-1 p24 단백질 중 아미노산 번호 202-221 서열의 20 개 아미노산으로 이루어진 서열 1의 p24 (202-221)를 포함하는 직쇄상 펩타이드를 4 개의 가지로 포함하는 서열 2의 MAP-7 합성 펩타이드를 설계하여 제조한다. 상기 MAP-7 합성 펩타이드를 이용하여 마우스를 면역화 시키고 이로부터 추출한 비장 세포와 마이엘로마 세포 P2X63Ag8.653를 기존의 방법으로 융합시킨 후, MAP-7 합성 펩타이드 및 HIV-1 p24 단백질 및 HIV-1 p24 (202-221)에 특이성을 보이는 세포 클론을 효소 면역 측정법으로 선별한다.
상기의 과정으로 선별된 본 발명의 마우스 융합세포주를 "KI-24" 로 명명하고 이를 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에 1997년 8월 4일에 기탁하였다 (수탁번호 : KCTC 0358BP).
본 발명은 상기 마우스 융합세포주가 생산하는 단일클론 항체의 이소타입이 IgG1 (light chain :κ)임을 이소 타입 키트를 이용하여 결정하였다 (도 3 참고).
본 발명은 MAP-7 합성 펩타이드에 대한 상기 단일클론 항체가 HIV-1 p24 (202-221) 및 p24 단백질을 선별적으로 인식하는 항원 특이성이 있는가를 확인하기 위하여, MAP-7 합성 펩타이드, p24 단백질 및 음성 대조군인 HIV-1 gp41 (584-618) MAP 합성 펩타이드와 상기 단일클론 항체와의 반응성을 효소 면역 측정법으로 조사하였으며, 또한 MAP-7 합성 펩타이드 및 p24 단백질의 항체의 특이성을 확인하기 위하여 상기 단일클론 항체 및 항체의 음성 대조군인 MHC ClassII 에 대한 단일클론 항체 (L243) 와 MAP-7 합성 펩타이드 및 p24 단백질의 반응성을 조사하였다.
그 결과, 상기 단일클론 항체는 HIV-1 p24 (202-221) 및 합성 펩타이드 및p24 단백질에 대하여 선별적으로 높은 항원 인식 능력을 나타냄을 확인하였고 (도 4 참조), MAP-7 합성 펩타이드 및 p24 단백질과 특이적인 효소면역반응을 수행함을 확인하였다(도 5a 및 도 5b 참조),
또한 본 발명은 상기 단일클론 항체가 자연 상태로 존재하는 HIV-1 p24 단백질도 선별적으로 인식하는 항원 특이성이 있는가를 확인하기 위하여, HIV-1 p24 (202-221) 펩타이드 부위를 포함하는 HIV-1 p24 단백질을 이용한 웨스턴 블럿을 수행하였다.
그 결과, 본 발명의 단일클론 항체는 음성 대조 단백질로 사용한 트립시노겐 (trypsinogen)과는 전혀 반응하지 않는 반면 HIV-1 p24 (202-221) 펩타이드를 포함하는 HIV-1 p24 단백질과는 특이적으로 반응함을 확인하였다 (도 6 참조). 따라서 본 발명의 단일클론 항체는 자연 상태로 존재하는 HIV-1 p24 단백질을 특이적으로 인식하는 단일클론 항체로도 사용될 수 있다.
본 발명의 마우스 융합세포주가 생산하는 단일클론 항체는 사람의 혈액내에 존재하는 HIV-1 의 p24 단백질 항원과 플레이트에 코팅한 p24 펩타이드를 경쟁적으로 반응시키면 HIV 환자 혈청내의 p24 항원의 농도를 결정할 수 있을 뿐만 아니라 HIV 진단에 이용될 수 있다.
따라서 본 발명의 단일클론 항체는 HIV-1 p24 단백질 항원 진단 키트를 개발하는데 이용될 수 있다.
또한 본 발명은 HIV-1 p24 단백질 중에서 가장 항원성이 높은 부분인 서열 1의 HIV-1 p24 (202-221) 펩타이드를 포함하는 HIV-1항체 결합용 다가지 항원 펩타이드를 제공한다.
본 발명의 MAP는 HIV의 양성혈청의 항체를 검출하여 후천성 면역결핍증을 진단하는데 이용될 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.
단 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
〈실시예 1〉 MAP-7 의 제조
HIV-1 p24 단백질 항체에 대하여 반응성이 높은 부위인 서열 1의 HIV-1 p24 (202-221) 20 개 아미노산으로 이루어진 4 개의 펩타이드를 포함하는 서열 2의 MAP-7을 합성하기 위하여, 본 발명자들이 개발한 보트형 반응기 (대한민국 특허공고 제 95-14842 호)에서 Fmoc 보호기를 이용한 메리필드의 고상법으로 합성하였다 (Merrifield. R. B., J. Am. Chem. Soc., 85 : 2149-2154, 1963 ; Merrifield, R. B., Science, 232 : 341-347, 1983) .
먼저 Fmoc-수지를 피페리딘 (piperidine)을 이용해 Fmoc 보호기를 제거하고 DCC (cyclohexylcarbodiimide)-HOBt (1-hydroxybenzotriazole)를 이용하여 Fmoc-라이신 (Fmoc)을 연결시켰다. 이 상태에서 Fmoc 보호기를 피페리딘으로 제거하여 2 개 아미노기를 노출시키고 다시 Fmoc-라이신 (Fmoc)을 연결시킨 다음 이 상태에서 Fmoc 보호기를 피페리딘으로 제거하여 4 개의 아미노기를 노출시켰다. 노출된 4 개의 아미노기에 p24 (202-221) 펩타이드의 아미노산 서열을 카르복실 말단부터 순차적으로 DCC / HOBt 로 연결하여 가지가 4 개 달린 조 (crude) MAP-7을 제조하였다. 상기 과정을 거친 합성 펩타이드들에 3% 트리이소프로필실란(triisopropylsilane) 이 첨가된 시약 K (트리플루오르아세트산 / 티오아니솔 / 페놀 / 에탄디티올 / 물 = 85/5/5/2.5/5, v/v)를 처리하여 본 발명의 MAP-7 합성 펩타이드를 정제하였다. 다음 MAP-7 합성 펩타이드를 역상 C18칼럼을 이용한 HPLC 로 분리, 정제하여 그의 분자량을 트리신-SDS 폴리 아크릴아마이드 젤 전기영동으로 확인하였다 (도 1 참조).
〈실시예 2〉 마우스의 면역화
실시예 1에서 제조한 MAP-7 합성 펩타이드로 마우스를 면역화시키기 위하여, 8 주 된 실험용 BALB/c 마우스 (mouse)를 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 (KRIBB) 실험 동물 사업실에서 분양받았다. 상기 MAP-7 합성 펩타이드 100μg을 완전 프로인트 면역 보조제(complete Freund's adjuvant )와 혼합하여 유상화한 다음 생쥐의 복강에 주사하였다. 다음 동일한 과정을 반복하여 2 주 간격으로 같은 양의 MAP-7 합성 펩타이드를 면역 보조제와 혼합하여 복강에 2 회 주사하였다. 각 주사일로부터 2 주뒤에 마우스의 안 정맥으로부터 50-100μl 의 혈액을 채혈한 다음 MAP-7 합성 펩타이드를 코팅한 웰 플레이트에 항-마우스 IgG 항체를 반응시키는 간접 ELISA를 수행하였다. 그 결과 마우스의 혈청내에 MAP-7 합성 펩타이드에 대한 특이 항체의 역가가 상승하고 있음을 확인하였다.
〈실시예 3〉 HIV-1 p24 (202-221) 펩타이드를 특이적으로 인식하는 단일클론 항체를 생산하는 마우스 융합세포주의 제조
HIV-1 p24 (202-221) 펩타이드를 특이적으로 인식하는 단일클론 항체를 생산하는 마우스 융합세포주를 제조하기 위하여, 세포 융합 3 일전에 MAP-7 합성 펩타이드 100 μg을 인산 완충 용액 (phosphate buffered saline)에 녹인 다음 생쥐의 꼬리 정맥에 주사하였다 (도 2 참조). 면역원을 주사한 마우스에서 추출한 비장세포와 마이엘로마 세포 P3X63Ag8.653를 융합하고 이를 분리 배지인 HAT 배지로 옮겨 96-웰 플레이트에서 배양하였다. 세포 콜로니가 형성된 다음 각 웰로부터 배양액 50μl를 채취하여 MAP-7 합성 펩타이드를 코팅 항원으로 한 ELISA를 수행하였다. 다음 상기에서 나타난 양성 클론으로부터 단일클론을 분리하기 위하여 제한 희석 (limiting dilution)을 수행하였다.
〈실시예 4〉 융합세포주를 탐색하는 간접 효소 면역 측정법
실시예 3에서 융합한 세포 중에서 MAP-7 합성 펩타이드에 대하여 특이성을 가진 항체를 생산하는 융합세포주를 검색하기 위하여, 간접 효소 면역 측정법을 수행하였다. 구체적으로 MAP 합성 펩타이드 및 음성 대조 펩타이드인 HIV-1 gp41 (584-618)을 포함하는 MAP-1 (Shin, S. Y., Lee, M. K., Hahm, K. S., Biochemistry Molecular Biology International, 1997 : 인쇄중)을 코팅 용액 (0.1 N 탄산암모늄 완충용액, pH 9.5)에 잘 혼합하여 96-웰 엘리자 플레이트에 각 웰당 200 ng 농도로 상기 펩타이드가 포함되도록 1 시간 동안 37℃에서 코팅 처리하였다. 이어서 비특이 반응을 방지하기 위하여 각 웰에 2.7% 카세인을 포함하는 트리스 완충용액을 첨가하여 37℃에서 1 시간 동안 반응시킨 다음 세척액 (0.05% 트윈 20을 포함하는 트리스 완충 용액)으로 3 번 반복하여 세척하였다. 다음 각 융합세포주들의 배양액 100μl 씩 첨가하고 37℃에서 1 시간 동안 더 반응 시킨 다음 세척액으로 반복하여 3번 세척하였다. 다음 마우스 IgG 에 특이한 서양 고추냉이 퍼옥시다제 (horse radish peroxidase) 결합 염소 유래 항체를 가하여 37℃에서 1 시간 동안 반응 시키고 세척액으로 반복하여 3번 세척한 다음 인산염-구연산 완충용액에 0.4 mg/ml 의 o-페닐렌디아민 디하이드로클로라이드 (o-penylenediamine dihydrochloride, OPD) 및 0.4 μl/ ml 과산화수소가 포함된 기질 용액으로 발색 반응 시켜 492 nm에서 흡광도를 측정하였다 (도 4 참조).
상기의 과정에서 선별된 본 발명의 MAP-7 합성 펩타이드에 대한 단일클론 항체를 생산하는 마우스 융합세포주를 "KI-24" 로 명명하고 이를 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에 1997년 8월 4일에 기탁하였다 (수탁번호 : KCTC 0358 BP).
〈실시예 5〉 단일클론 항체의 이소 타입 결정
본 발명의 MAP-7 합성 펩타이드에 대한 단일클론 항체의 이소타입을 결정하기 위하여, 마우스 단일클론 항체 이소타입 키트 (MAb-based mouse Ig isotyping kit, 파민겐사, 미국)를 구입하여 사용하였다. 키트에 준비된 8종류의 이소타입 특이적 쥐 항-마우스 단일클론 항체 (5 배 농축액)를 키트에 준비된 코팅 용액으로 5 배 희석하여 96-웰 엘리자 플레이트에 각 웰당 50μl 씩 가하여 하루 밤 동안 4℃에서 코팅하였다. 이어서 비특이 반응을 방지하기 위하여 각 웰에 1.0 % 소 혈청을 포함하는 인산염 완충용액을 200 μl 첨가하여 실온에서 15 분간 반응시킨 다음 세척액 (0.05% 트윈 20을 포함하는 인산염 완충용액)으로 3 번 반복하여 세척하였다. 다음 본 발명의 융합세포주 (KI-24)의 배양액, 양성 대조군인 KI-41 의 배양액 및 키트의 양성 대조 배양액, 음성 대조군으로 RPMI-1640 배양액을 각 웰에 50μl 씩 첨가하고 실온에서 1 시간 동안 반응시킨 다음 배양액을 제거한 후 키트에 준비된 알칼리 포스파타아제(alkaline phosphatase) 결합 항-마우스 Igs 단일클론 항체의 쥐 유래 폴리클론 항체 (AKP-labeled polyclonal rat anti-mouse Igs Ab) 용액을 50μl 씩 가하여 실온에서 1 시간 동안 반응 시켰다. 세척액으로 반복하여 5 번 세척한 다음 키트에 준비된 기질 용액 (p-NPP 기질 용액)을 50μl 씩 가하여 37℃에서 30 분간 동안 반응시켜 발색 시켰다.
이상과 같은 방법으로 MAP-7 합성 펩타이드에 대한 본 발명의 단일클론 항체의 이소타입은 IgG1(light chain : κ)임이 밝혀졌다 (도 3 참조).
〈실시예 6〉 면역 효소 측정법에 의한 단일클론 항체의 항원 특이성 조사
MAP-7 합성 펩타이드에 대한 본 발명의 단일클론 항체가 HIV-1 p24 (202-221)를 선별적으로 인식하는 항원 특이성이 있는가를 확인하기 위하여, MAP-7 및 음성 대조군인 HIV-1 gp41 (584-618) MAP 합성 펩타이드 (MAP-1)에 대한 반응성을 조사하였다. MAP-7 및 p24 단백질들을 96-웰 엘리자 플레이트에 각 웰 당 500 ng, 166.6ng, 55.55ng, 18.52ng, 6.17ng, 2.06ng, 0.69ng 양으로 코팅되도록 가하고, 이를 2.7 % 카제인을 포함하는 트리스 완충용액으로 블로킹시킨 다음 상기 융합세포주의 배양액 100μl 씩을 첨가하여 37℃에서 1 시간 동안 반응시키고 실시예 4와 동일한 방법으로 단일클론 항체의 HIV-1 p24 (202-221) MAP 및 p24 단백질에 대한 항원 인지 능력을 측정하였다.
그 결과, 본 발명의 KI-24 융합세포주가 생산하는 단일클론 항체는 음성 대조군인 HIV-1 gp41 (584-618) MAP 합성 펩타이드는 전혀 인식하지 않고 HIV-1 p24 (202-221) MAP 합성 펩타이드 (MAP-7) 및 p24 단백질에 대하여 선별적으로 높은 항원 인식 능력을 나타내었다 (도 4 참조).
또한, 음성 대조군 단일클론 항체로 항-MHC 클래스 II 단일클론 항체 (L243)를 생산하는 융합세포주의 배양액을 사용한 경우 HIV-1 p24 (202-221) MAP 합성 펩타이드 (MAP-7) 및 p24 단백질에 대하여 그 어느쪽도 인식되지 않아 효소 면역 반응이 특이적으로 수행되었음을 증명하였다 (도 5a, 5b 참조).
〈실시예 7〉 웨스턴 블럿에 의한 단일클론 항체의 항원 특이성 조사
본 발명은 융합세포주가 생산하는 단일클론 항체의 항원 특이성이 합성 펩타이드 형태의 항원 뿐만 아니라 자연 상태로 존재하는 HIV-1 p24 단백질을 인식할 수 있음을 검증하기 위하여 웨스턴 블럿을 수행하였다.
HIV-1 p24 (202-221) 펩타이드 부위를 포함하는 HIV-1 p24 단백질 200 ng 및 단백질 음성 대조 항원인 트립시노겐 (trypsinogen) 1 μg을 10% 폴리 아크릴아미아드 젤에 전기 영동 한 후 이를 니트로 셀룰로스 막에 이동시킨 다음, 폰셔스 (ponceau S) 스테이닝 (staining) 에 의하여 니트로 셀루로스 막으로 단백질의 밴드가 이동한 것을 확인 한 후 (도 6a 참조), 2.7% 카제인을 포함하는 트리스 완충용액으로 실온에서 1 시간 동안 담구어 블로킹 시켰다. 이를 다시 세척액 (0.05% 트윈 20을 포함하는 트리스 완충용액)으로 세척한 다음 세포 배양액을 가하여 실온에서 1 시간 동안 반응시키고 다시 세척액으로 씻어 내었다. 그 다음 항-마우스 IgG 퍼옥시다제 결합 염소 유래 항체 (시그마사, 미국)가 1 : 5000 비율로 희석된 0.3% 카제인을 포함한 트리스 완충용액을 가하여 실온에서 30 분 동안 반응 시키고 이를 세척액으로 3 번 반복하여 세척한 다음 4-클로로-1-나프톨 및 과산화수소수를 포함한 트리스 완충용액에 담구어서 발색 반응을 수행하였다. 상기 반응은 니트로셀룰로스 막을 3 차 증류수로 씻어냄으로 종결 시켰다.
그 결과 도 6b 에 나타난 바와 같이, 트립시노겐은 본 발명의 단일클론 항체에 의하여 전혀 인식되지 않는 반면 HIV-1 p24 (202-221) 펩타이드를 포함하는 HIV-1 p24 단백질은 상기 단일클론 항체에 특이적으로 결합하였음을 확인 하였다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 마우스 융합세포주가 생산하는 단일클론 항체는 HIV-1 p24 단백질을 인식하는 높은 특이성을 지닌다. 따라서 상기 단일클론 항체는AIDS 환자의 혈액내에 존재하는 HIV-1 의 p24 단백질 항원의 탐지에 쓰일 수 있다. 즉, AIDS 환자의 혈액내에 존재하는 HIV-1 의 p24 단백질 항원과 플레이트에 코팅한 p24 (202-221) 펩타이드와의 경쟁반응을 시키는 경쟁 효소 면역 측정법 (competitive enzyme-linked immunosorbent assay)를 이용하여 환자 혈청 중 HIV-1 의 p24 단백질 유무와 농도를 간접적으로 측정하고 진단하는데 응용될 수 있다.
또한 상기 단일클론 항체 및 HIV-1 항원 진단 키트를 개발하면 면역결핍 질환 및 특히 HIV 감염 초기의 환자를 효과적으로 진단하는데 유용하게 이용할 수 있다.
그리고 본 발명의 HIV-1 p24 (202-221) 펩타이드를 포함하는 다가지 항원 펩타이드는 HIV의 양성혈청의 항체를 검출하여 후천성 면역결핍증을 진단하는데 이용될 수 있다.
[서 열 목 록]
서열번호 : 1
서열의 길이 : 20
서열의 형 : 아미노산
쇄의 수 : 1본쇄
형태 : 직쇄상
서열의 종류 : 펩타이드
[서 열 목 록]
서열번호 : 2
서열의 길이 : 84
서열의 형 : 아미노산
쇄의 수 : 1본쇄
서열의 종류 : 다가지 펩타이드
Claims (4)
- 인간 면역결핍 바이러스 (HIV-1)의 덮개 단백질 p24의 아미노산 번호 202-221 서열로서 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 특이적으로 인식하는 단일클론 항체.
- 제1항의 단일클론 항체를 생산하는 융합세포주 KI-24 (수탁번호 : KCTC 0385 BP).
- 서열 1의 HIV-1의 p24 단백질의 아미노산 번호 202-221 서열을 4 개의 가지로 포함하는 서열 2의 다가지 항원 펩타이드 MAP-7을 마우스에 면역화 시킨 다음 그 생쥐의 비장 세포를 마이엘로마 세포와 융합하고 이로부터 제1항의 단일클론 항체를 생산하는 융합세포주를 선별하는 제3항의 융합세포주의 제조방법.
- 제1항의 단일클론 항체를 유효성분으로 하는 HIV-1 감염 진단용 키트.
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