JPH0242987A - ハイブリツド遺伝子 - Google Patents

ハイブリツド遺伝子

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JPH0242987A
JPH0242987A JP14822889A JP14822889A JPH0242987A JP H0242987 A JPH0242987 A JP H0242987A JP 14822889 A JP14822889 A JP 14822889A JP 14822889 A JP14822889 A JP 14822889A JP H0242987 A JPH0242987 A JP H0242987A
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JP
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htlv
hiv
envelope protein
gene
hybrid
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JP14822889A
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Mathew Longiaru
マチュー　ロンギアル
Bradley John Scherer
ブラッドリィ　ジョン　スケラー
Robert William Terry
ロバート　ウイリアム　テリー
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
F Hoffmann La Roche AG
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
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Publication date
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/735—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a domain for self-assembly, e.g. a viral coat protein (includes phage display)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/14011—Deltaretrovirus, e.g. bovine leukeamia virus
    • C12N2740/14022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16211—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV gagpol
    • C12N2740/16222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ＨＩＶ−１エンベロープ遺伝子の部分および
ｌ−Ｉ　Ｔ　Ｌ　Ｖ　−Ｉエンベロープ遺伝子の部分を
含有するハイブリッド遺伝子に関する。本発明はまた、
相当する遺伝子生成物、この遺伝子生成物をコードする
組換えベクター、これらの組換えベクターを含有する単
細庵宿主、組換えベクターを含有する単細胞宿主を用い
て上記遺伝子生成物をｙＪ造する方法、ならびに、哺乳
動物体液中のＨＩＶ−１、）−ＩＴＬＶ−ＩおよびＨＴ
　Ｉ−Ｖ−Ｉに対する抗体の存在を検出する方法に関す
る。
発明の背景 ヒト忰ンバ球好性つィルス■型（ＨＴＬＶｌ）は、成人
１−　、Ｉｌｌ南白血病／リンパ１ｍ＜Ａ’ｒＬ）の原
因として同定されたＣ型ＲＮ　Ａウィルスである。ｌ−
Ｉ　Ｔ　Ｌ　Ｖ　−ＩはＡＴＬ患者から単離されクロー
ン化された最初のレトロウィルスであって、熱帯性痙性
麻痺やＨＴ　Ｌ　Ｖ　−Ｉ関連ミニＯパシーのような神
経学的疾患に結びつけられてもきた。世界のある地域で
はＨＴＬＶ−Ｉ感染症が風土病であるらしい。たとえば
日本の南部のある地域住民での１」丁ＬＶ−Ｉ血清陽性
率は３５％の高さにも達することが知られている。米国
におけるＨ　’ｒ　ＬＶ−Ｔの感染頻麿はまだきわめて
低いが、ＨＴＬＶ−Ｉ単独または他のヒトレトロウィル
スとの複合感染は、経静脈的薬物乱用が日常的常習行為
になっている都心部住民の間では拡大しつつある問題で
ある。Ｔｌ１ｌ胞へアリ−セル白血病患者から誘導され
、ト＋ＴＬＶ−ＩＩと命名されている他の単離ウィルス
は）−Ｉ　Ｔ　Ｌ　Ｖ　−Ｉと密接な関係がある。
１−Ｉ　Ｔ　Ｌ　Ｖ　−Ｉゲノムの完全なヌクレオチド
配列が決定され゛て以来、相当するタンパク質の製造が
行われ、さらにこれらのタンパク質に対する抗体の検出
も可能になった。ウェスタンプロットや放射免疫沈降（
ＲＩＰ）のような技術がＨＴ’　Ｌ　Ｖ　−１コアおよ
びエンベロープタンパク質に対するヒト抗体の測定に適
用されるようになって以来、ＨｒＬＶ−Ｉ感染がある地
域ではほぼ風上病であることも明らかにされた。ＨＴＬ
Ｖ−Ｈに関連する疾患、ヘアリーセル白血病の患者から
の抗体がＨ’ｌ’　Ｌ　Ｖ　−Ｉエンベロープのｐ２１
１ｉ域に相当するポリペプチドに強力に反応することも
明らかにされ、これはトＩＴＬＶ−Ｉとｌ−Ｉ　Ｔ　Ｌ
　Ｖ　−ＩＩの間の高度なホモＯジーを示している。
しかしながら、ＡＩＤＳの流行に研究者や臨床家の興味
が向けられてしまったために、ヒト病原としてのＨＴＬ
Ｖ−Ｉの重要性はあまり認識されていない。ＡＩＤＳは
Ｎ［Ｖ−ルトロウイルスの感染によるものである。ｌ−
Ｉ　Ｉ　Ｖ　−１もＨＴＬＶ−■も様々な経路で、たと
えば注射針の汚染、輸血、性交渉および母体から産児へ
の垂直感染によって伝達される。両１クイルスともヒト
疾患に関連するので、アメリカの地域住民に対しては８
丁１〜Ｖ−ＩおよびＨＩ　Ｖ　−１に対する抗体の断面
スクリーニングが始まっている。
現在、ＨＴ　Ｌ　Ｖ　−ＩおよびＨＩＶ−１に対する抗
体には別個のスクリーニング試験があり、いずれもウィ
ルスでトランスフオームされたにトＴ細胞系から得られ
る破壊ウィルス粒子を使用する。
ウィルス抗原を半精製し、それをヒト抗体が存在す札ば
ウィルス抗原に容易に結合するように固相上に被覆する
。現在用いられているＨＴＬＶ−Ｉ７ツセイには固有の
難点がある。ＨＴ　Ｌ　Ｖ　−Ｉレトロウィルスは細胞
膜から出芽するので、ウィルスエンベロープ中にはヒト
細胞膜決定基が存在する。内因性自己免疫抗体のこれら
の決定基との交差反応性がかなりの数の偽陽性を招くこ
とになる。
偽陽性値も、免疫反応性ウィルスエンベロープタンパク
質がスクリーニングアッセイに使用される前のウィルス
の精製時に破壊されることが多いため、しばしば経験さ
れる。現在用いられている１−１１Ｖ−１スクリーニン
グアツセイにおいても、同じ問題が固有である。
組換えトＩ　Ｔ　Ｌ　Ｖ　−ｉおよびＨＩ　Ｖ　−１遺
伝子生成物の細菌または酵母系の発現については報告が
あり、特責的遺伝子に相当するペプチドが単離されてい
る。これらの組換え技術によって製造されたべ１チド抗
原は、ＨＴＬＶ−１およびＩ−１１Ｖ　−１に対し血清
陽性であることがわかつτいる患者からのヒト血清と交
差反応性を示す。組換え技術によって発現されたタンパ
ク質抗原を使用する別個の抗体スクリーニングアッセイ
が、ト１丁ＬＶ−１およびＨＩＶ−１の両名について最
近開発されている。
尺１とた煎 本発明は、ＨＩ　Ｖ−１に対する抗体によって認識され
るＩＩＩＶ−１エンベロープタンパク質の少なくとも１
個のエピトープを含有するポリペプチドをコードする第
一のＤＮＡ配列とｌ−Ｉ　Ｔ　Ｌ　Ｖ　−１に対する抗
体によってｖｔ識されるト１ｌ−ＬＶ−ｉエンベロープ
タンパク質の少なくとも１個のエピトープを含有するポ
リペプチドをコードする第二のＤＮＡ配列からなるハイ
ブリッド遺伝子を提供する。このハイブリッド遺伝子は
、相当するハイブリッドタンパク質の製造に、他の目的
の０ＮＡＩＩＱとして、また他の関連する目的のために
有用である。
これらの遺伝子には２つの好ましい態様がある。
第一の態様は、第一のＤＮＡ配列がＨＩ　Ｖ　−１（Ｉ
＋１４１　トランスメンブランタンパク質の免疫決定基
領域、好ましくはＨＩＶ−１エンベロープタンパク質の
ほぼアミノＭ５６０〜６２０（番号は第５図による）を
含有するポリペプチドをコードし、第二の配列が１−Ｉ
ＴＬＶ−ＩエンベＯ−ブタンバク質のほぼアミノ酸３０
６〜４４０を含有するポリペプチドをコードする遺伝子
である。
第二の好ましい態様は、第一のＤＮＡ配列がＨＩＶ−１
（１１）　４１　トランスメンブランタンパク質の免疫
決定基領域、好ましくはｌ−１１Ｖ　−１エンベロープ
タンパク質のほぼアミノ酸５６０〜６２０を含有するポ
リペプチドをコードし、第二の配列がトＩＴＬＶ−Ｉエ
ンベロープタンパク質のほぼアミノ酸２０１〜３０８を
含有するポリペプチドをコードする遺伝子である。
本発明はまた、１１ＩＶ−１に対する抗体によって認識
されるＨＩＶ−１エンベロープタンパク質の少なくとも
１個のエピトープを含有する第一のアミノ酸配列と）−
１’ｒ　Ｌ　Ｖ　−Ｉに対り゛る抗体によって認識され
るＨＴＬＶ−Ｉエンベロープタンパク質の少なくとも１
個のエピトープを含有する第二のアミノ酸配列からなる
相当するハイブリッドクンバク質を提供する。本発明の
ハイブリッドタンパク質は、ＨＴＬＶ−１，ｌ−Ｊよｆ
ｆＨＩＶ−ＩＩエンベロープタンパク質対する抗体の存
在を検出するための抗原として、免疫原として、ならび
に他の治療的および診断的目的に有用である。
このポリペプチドには２種の好ましい態様がある。第一
の態様は第一のアミノ酸配列が）ｌ　Ｉ　Ｖｌ　ｇｐ４
１トランスメンブランタンパク質の免疫決定基領域、好
ましくはｌｌ　Ｉ　Ｖ　−１エンベロープタンパク質の
ほぼアミノＭ５６０へ−６２０（アミノ酸の番号は第５
図による）を含有し、第二のアミノ酸配列がＨＴＬＶ−
Ｉエンベロープタンパク質のほぼアミノ酸３０６〜４４
０を含有するポリペプチドである。
第二の態様は第一・のアミノ酸配列がＨＩＶ−１ｇｌ）
４１トランスメンブランタンパク質の免疫決定基領域、
好ましくはＨＩＶ−１エンベロープタンパク質のほぼア
ミノＩｌ！ｔ５６０〜６２０を含有し、第二のアミノ酸
配列がトＩＴＬＶ−１エンベロープタンパク質のほぼア
ミノ１２０１〜３０８を含有するポリペプチドである。
本発明はまた、本発明のハイブリッド遺伝子から構成さ
れる組換えベクター、とくに単Ｉｌｌ胞宿主中で複製可
能なプラスミドである組換えベクターを包合する。
本発明はまた、本発明の組換えベクターをもつ単細胞宿
主、ならびに本発明の組換えベクターを含有する単細胞
宿主を生育に適当な条件下に培養して相当するハイブリ
ッドタンパク質を産生させる本発明のハイブリッドタン
パク質の製造方法を包含する。
本発明はまた、哺乳動物体液中のＨＴＬＶ−Ｉエンベロ
ープタンパク質、ＨＴ　Ｌ　Ｖ　−ＩＩエンベロープタ
ンパク質および／またはＨＩＶ−１エンベロープタンパ
ク質に対する抗体を検出するにあたり、抗体を含有する
試験サンプルをＩＩＩＶ−１１ンベ０−ブタンバク質の
少なくとも１個のＪピ１−一ブおよびｌ−Ｉ　Ｔ　Ｌ　
Ｖ　−Ｉエンベロープタンパク質の少なくとも１個のエ
ピトープを含有するハイブリッドクンバク質と接触させ
てタンパク質−抗体複合体を形成させ、その複合体を検
出してナツブル中の抗体の存在を明らかにする検出方法
を提供する。この場合の方法は、イムノアッセイ、たと
えばウェスタンブロッティング、−重抗原ザンドイツチ
法、ラジオイムノアッセイまたは、とくに酵素イムノア
ッセイであることが好ましい。
本発明はまた、哺乳動物体液中のＨＩＶ−１、および／
またｉ；ｔｌｌＴＬＶ−Ｉらｕ　＜　ハｌ−Ｉ　Ｔ　Ｌ
　Ｖ　−■に封する抗体の検出に有用な詮所用試験キッ
トを包含する。
ＨＴＬＶ−ＩおよびＨＩＶ−１はいずれもきわめて重要
なヒト病原であり、したがってＨＴＬＶ■およびＨＩ　
Ｖ　−１の両者に対する抗体を測定する甲−のスクリー
ニング試験はきわめて望ましい。
Ｕと凡」 第１図は、プラスミド）ＩＩＶ−１ｐＥＮＶ（６０）−
ＨＴＬＶ−１，−ＥＮＶ−１および１−ＮＶ−２ｐＥＮ
Ｖ（６０）　　−ＦＩＴＬＶ−ＩＩ：ＮＶ−１および−
ＥＮＶ−２の構築を例示する。ザブクローニングに用い
たＨＴＬＶ−Ｉゲノムおよびエンベロープ遺伝子の制限
酵素フラグメントを示づ（詳細は例１および例２参照）
。
）−１１Ｖ−１ｐＥＮＶ（８０）のクローニングおよび
発現はＣｅｒｔａら（ＥＭＢＯＪ、５：３０５１〜３０
５６．１９８６）によって記載されている。
第２図ニブラスミドＨＩＶ−１ｐＥＮＶ　（６０）−Ｈ
Ｔ　Ｌ　Ｖ　−Ｉ　−Ｅ　Ｎ　Ｖ　−１の１−（Ｉ　Ｖ
　−１−ＨＴ　Ｌ　Ｖ　−ｉ翻訳生成物はその完全ＤＮ
Ａおよびアミノ酸配列の直前に発現する（アミノ酸の一
文字コード名はベクター関連残塁であり、エンベロープ
遺伝子に特異的な残基ではない）。
第３図ニアラスミドＨＩＶ−１ｐＥＮＶ（６０）−ＨＴ
ＬＶ−Ｉ−ＥＮＶ−２のｌ−１１Ｖ−１−ＨＴ　Ｌ　Ｖ
　−Ｉ翻訳生成物はその完全ＤＮＡおよびアミノ酸配列
の直前に発現する（アミノ酸の一文字コード名はベクタ
ー関連残樋であり、エンベロープ遺伝子に特異的な残基
ではない）。
第４図は、ＨＩＶ−１Ｄ［ＥＮＶ　（６０）Ｈ１’　Ｌ
　Ｖ　−Ｉ　−Ｅ　Ｎ　Ｖ　　１　Ｕ　ヨ（ｊ　−Ｅ　
Ｎ　Ｖ　−２８合タンパク質の発現および誘導生成物の
５ＤＳＰ　Ａ　Ｇ　Ｅ上での分割を例示する。サンプル
は例５に記載したようにして製造し、ゲル中クーマツシ
ーブルー染色で可視化した。レーンの内容は次のとおり
である：ｐＤＭ１．１およびＨＩＶ−１ｐＥＮＶ　（６
０）−Ｈ１’ＬＶ−Ｉ−ＥＮＶ−１含有大腸菌Ｗ３１１
０細胞非誘導くレーン１）、４時間ｍｓ（レーン２）お
よび５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ　−２００精製（レーン３
）、ｐＤＭＩ、１およびｌ−１［Ｖｌ　　ｐＥＮＶ（６
０）−１−１１’ＬＶ−Ｉ−ＥＮＶ２含有大腸菌Ｊｅ５
５０６細胞非誘導（レーン４）、４時間誘導（レーン５
）および５ｅｐｈａｃｒｙｌＳ−２００精製（レーン６
）。Ｍは分子量標準を示す。
第５図はＨＩＶ−１エンベロープタンパク質のアミノ酸
配列を示す。
詳細な説明 以下のＤＮＡ配列を有するハイブリッド遺伝子が好まし
い。
開始配列 ＡＴＣＭ；Ａ　ＧＧＡ　ＴＣＣＧＡＡ　ＧＣＴ　ＣＡＡ
　ＣＡＧ　ＣＡＴ　ＣＴＧ　ＣＴＧ　ＣＡＡ　ＣＴＣＡ
ＣＴＧＴＴＴＧＧ　ＧＧＴ　ＡＴＣＡＡＡ　ＣＡＧ　Ｃ
ＴＣＣＡＧ　ＧＣＴ　ＣＧＡ　ＡＴＴ　ＣＴＣＧＣＴ　
にＴＴ　ＧＡＡ　Ｃ０ＴＴＡＣＣＴＣＡＡＡ　ＣＡＴ　
ＣＡＡ　ＣＡＧ　ＣＴＣＣＴＧ　ＧＧＴ　ＡＴＣＴＧＧ
　ＧＧＣＴＧＣＡＧＴ　ＧＧＴＡＡＡ　　ＣＴＣＡＴＣ
ＴＧＣＡＣＴ　　ＡＣＴ　ＧＣＴ　ＣＴＴ　ＣＣ”ｌ’
　　ＴＧＧ　　ＡＡＴ　ＧＣ’ｒ　ＴＣＴ　　ＴＣＧ　
ＴＣＴＡＡＴ　ＡＡＧ　ＣＴＴ　ＧＧＡ　ＴＣＣＣＧＣ
ＴＣＣＣＧＣＣＧＡ　ＧＣＧ　ＧＴＡ　ＣＣＧ　ＣＴＣ
ＧＣＧ　にＴＣＴＧＧ　　ＣＴＴ　ＣＴＣＴＣＣＧＣＣ
ＣＴＧ　ＧＣＣＡＴＧ　ＧＧＡＧＣＣＣＧＡ　ＧＴＧ　
ＧＣＴ　ＧＧＣＣＧＧＡＴＴ　ＡＣＣＧＧＣＴＣＣＡＴ
ＣＴＣＣＣＴＣＧＣＣＴＣＡ　ＧＧＡ　ＡＡＧ　ＡＧＣ
ＣＴＣＣＴＡ　ＣＡＴＧＡＧ　ＧＴＧ　ＣＡＣＡＡＡ　
ＣＡＴ　ＡＴＴ　ＴＣＣＣＡＧ　ＴＴＡ　ＡＣＴ　ＣＡ
Ａ　ＧＣＡ　ＡＴＡ　ＣＴＣＡＡＡＡＪＬＣＣＡＣＡＡ
Ａ　ＡＡＴ　ＣＴＡ　ＣＴＣＡＡＡ　ＡＴＴ　ＧＣＧ　
ＣＡＧ　ＴＡＴ　ＧＣＴ　ＧＣＣＣＡＧ　ＡＡＣＡＧＡ
　　ＣＧＡ　ＧＧＣＣＴＴ　ＣＡＴ　　ＣＴＣＣＴＣＴ
ＴＣＴＧＣＧＡＧ　　ＣＡＡ　ＧＧＡ　ＧＧＡ　　ＴＴ
Ａ　ＴＧＣＡＡＡ　ＧＣＡ　ＴＴＡ　ＣＡＡ　　ＧＡＡ
　ＣＡＧ　　ＴにＣＣＧＴ　ＴＴＴ　　ＣＣＧ　　ＡＡ
Ｔ　ＡＴＴ　ＡＣＣＡＡＴ　ＴＣＣＣＡＴ　ＧＴＣＣＣ
Ａ　ＡＴＡ　ＣＴＡ　ＣＡＡ　ＧＡＡ　ＡＧＡ　ＣＣＣ
ＣＣＣＣＴＴ　ＧＡＧ　ＡＡＴ　ＣＧｋ　ＧτＣＣＴＧ
　　ＡＣＴ　　ＧＧＣＴＣＯＧＧＣＣＴＴ　　ＡＡＣＴ
Ｏに　ＧＡＧ　　ＣＴＴ　　ＧＧＣＣＴＣＴＣＡ　　Ｃ
ＡＣＴＧＧＧＣＴ　ＣＧＡ　ＣＣＴ　ＧＣＡ　ＧＣＣＡ
ＡＧ　ＣＴＣＡＡＧ　ＣＴＴ　Ｃ１ＧＣＧＡＧ　ＡＴＴ
　ＴＴＣＡＧＧ　　ＡＧＣＴＡＡ終結配列 以下のＤＮＡ配列を有するハイ１リツド遺伝子も好まし
い。
開始配列 ＡＴＯＡＧＡ　ＧＧＡ　ＴＣＣＧＡＡ　ＧＣＴ　ＣＡＡ
　ＣＡＧ　ＣＡＴ　ＣＴＣＣＴＣＣＡＡ　ＣＴＣＡＣＴ
　ＧＴＴＴＧＧ　ＧＧＴ　ＡＴＣＡＡＡ　ＣＡＧ　ＣＴ
ＣＣＡＧ　にＣＴ　ＣＧＡ　ＡＴＴ　ＣＴＣＧＣＴ　に
ＴＴ　ＧＡＡ　Ｃ０ＴＴＡＣＣτＧ　ＡＡＡ　ＣＡＴ　
ＣＡＡ　ＣＡＧ　ＣＴＣＣＴＧ　ＧＣＴ　ＡＴＣＴＧＧ
　ＧＧＣＴＣＣＡＧＴ　ＧＧＴＡＡＡ　ＣＴＣＡＴＣＴ
ＧＣＡＣＴ　ＡＣＴ　ＧＣＴ　ＧＴＴ　ＣＣＴ　ＴＧＧ
　ＡＡＴ　ＧＣＴ　ＴＣＴ　ＴにＧ　ＴＣＴＡＡＴ　Ａ
ＡＧ　ＣＴＴ　ＧＧＡ　ＴＣＣＣＴＣＧＡＧ　ＣＣＣＴ
ＣＴ　ＡＴＡ　ＣＣＡ　ＴＧＧ　Ａ入Ａ　ＴＣＡ　ＡＡ
ＡＣＴＣＣＴＧ　ＡＣＣＣＴＴ　ＣＴＣＣＡＧ　ＴＴＡ
　ＡＣＣＣＴＡ　Ｃ入Ａ　ＡＣＣＡＣＴ　ＡＡＴ　ＴＡ
Ｔ　ＡＣＴＴＧＣＡＴＴ　ＧＴＣＴＣＴ　ＡＴＣＧＡＴ
　ＣにＴ　ＧＣＣＡＧＣＣＴＣＴＣＣＡＣＴ　ＴＣＧ　
ＣＡＣＧＴＣＣＴＡ　ＴＡＣＴＣＴ　ＣＣＣＡＡＣにＴ
ＣＴＣＴ　ＣＴＴ　ＣＣＡ　ＴＣＣＴＣＴ　ＴＣＴ　Ｔ
ＣＴ　ＡＣＣＣＣＣＣＴＣＣＴＴ　ＴＡＣＣＣＡ　ＴＣ
に　ＴＴＡ　ＧＣＧ　ＣＴＴ　ＣＣＡ　ＧＣＣＣＣＣＣ
ＡＣＣＴＧ　ＡＣＧ　ＴＴＡＣＣＡ　ＴＴＴ　ＡＡＣＴ
にＧ　ＡＣＣＣＡＣＴＣＣＴＴＴ　ＧＡＣＣＣＣＣＡＧ
　ＡＴＴ　ＣＡＡ　ＧＣＴ　ＡＴＡＣＴＣＴＣＣＴＣＣ
ＣＣＣＴＧＴ　ＣＡＴ　ＡＡＣＴＣＣＣＴＣＡＴＣＣＴ
ＣＣＣＣＣＣＣＴＴＴ　ＴＣＣＴＴＧ　ＴＣＡ　ＣＣＴ
　ＧＴＴ　ＣＣＣＡＣＣＣＴＡ　ＧＧＡ　ＴＣＣＡＡＧ
　ＣＴＴ　ＧＧＣＧＡＧ　ＡＴＴ　ＴＴＣＡＧ（ｉ　　
ＡＧＣＴ入Ａ。
終結配列 上に示したように、本発明のハイブリッド遺伝子はさら
に「開始」および「終結Ｊ　ＤＮＡ配列を含有してもよ
い。これらの配列は組換えベクターの結果として生じ、
単細胞宿主内でのハイブリッド遺伝子の発現に必須であ
る。開始配列ｔまＡイブリッド遺伝子に作動的に連結さ
れる。すべてが異なるヌクレオチド配列を示す様々な開
始配列が本ハイブリッド遺伝子とともに使用でき、本発
明はこれらの配列のすべてと組合せた）＼イブリッド遺
伝子を包含するものである。本発明の好ましい開始配列
は、ＡＴＧ　　ＡＧＡ　　ＧＧＡ　　ＴＣＣで示される
ヌクレオチド配列を有する。
ハイブリッド遺伝子の終結コドン後に付加的に存在して
もよい［終結Ｊ　ＤＮＡ配列も相当する遺伝子生成物の
発現に用いられる組換えベクターから生じる。終結ＤＮ
Ａ配列は使用した組換えベクターによって変動する。本
発明は各種終結ＤＮＡ配列のすべてを包含することを意
図するものである。
本発明のハイブリッド遺伝子では、２種のＤＮＡ配列が
互いに直接融合されてもよいし、両者が「リンカ−」配
列を介して互いに結合されてもよい。リンカ−配列は、
ＨＩＶ−１工ンベロープ遺伝子配列とＨＴＬＶ−Ｉエン
ベロープ遺伝子配列の間に、ハイブリッドタンパク質の
翻訳時に正しい読み取り枠を維持するように挿入される
。
本発明は、この目的に使用できる様々なリンカ−ＤＮＡ
配列の包含を意図するものである。
本発明の好ましいハイブリッド遺伝子は式％式％ ： 【 末端アミノ酸 および Ｍｅｎ　Ａｚｇ　ＧＬｙ　Ｓｅ【ＧＬｕ　ＡＬａ　Ｇｉ
ｎ　ＧＬｎ　Ｈｉｓ　　Ｔ、ｅｕ　Ｌａｕ　Ｇｉｎ　Ｌ
ｅｕ　Ｔｈｒ　ＶａｌＴｒｐ　Ｇｌｙ　ＩＬｅ　Ｌｙｓ
　Ｇｉｎ　Ｔ、ａｕ　Ｇｉｎ　ＡＬａ　Ａｃｇ　ＩＬｅ
　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｖａｔ　ＧＬｕ　Ａｃｑｒｙｃ　Ｌ
ｅｕ　ｔ、ｙｓ　Ａｓｐ　にｉｎ　Ｇｉｎ　［、ｅｕ　
［、ｅｕ　ＧＬｙ　Ｔｉｅ　Ｔｃｐ　ＧＬｙ　Ｃｙｓ　
Ｓｅｅ　ＧｌｙＬｙｓ　Ｌｅｕ　ｌｉｅ　Ｃｙｓ　Ｔｈ
【Ｔｈｒ　Ａｌａ　ＶａＬ　Ｐｃａ　Ｔｃｐ　Ａｓｎ　
ＡＬａ　Ｓｅｒ　Ｔｒｐ　５ｅｒＡｓｎ　Ｌｙｓ　Ｌｅ
ｕ　ＧＬｙ　Ｓｅｅ　ＶａＬ　ＧＬｕ　Ｐｒｏ　Ｓｅ＋
：　　ＩＬｅ　Ｐｃｏ　Ｔｅｐ　Ｌｙｓ　Ｓｅｅ　Ｌｙ
ｓｔ＋ｅｕ　Ｌｅｕ　Ｔｈ【　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ
　Ｌｅｕ　Ｔｈｚ　Ｌｅｕ　ＧＬｎ　Ｓｅｔ　Ｔｈ【　
Ａｓｎ　Ｔｙｒ　ＴｈｒＣｙｓ　　ＩＬｅ　Ｖａｔ　Ｃ
ｙｓ　　Ｔｉｅ　Ａｓｐ　ＡＣｇ　ＡＬａ　Ｓｅｃ　Ｌ
ｅｕ　Ｓｅｅ　ＴｈｃＴｃｐ　Ｈｉｓ　ＶａｔＬｅｕ　
Ｔｙｒ　　Ｓｅｃ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｖａｔ　　Ｓｅｒ
　ＶａＬ　　Ｐ【ｏ　　Ｓｅｔ　　Ｓｅｃ　Ｓｅｘ　　
Ｓｅ【　Ｔｈｒ　　Ｐｒ。
Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｔｙｅ　Ｐｒｏ　Ｓｅｅ　Ｌｅｕ　Ａ
Ｌａ　Ｌｅｕ　Ｐｚｏ　ｌＬａ　　Ｐｒｏ　Ｈｉｓ　Ｌ
ｅｕ　Ｔｈ【　ＬｅｕＰｅｏ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｔｒｐ
　Ｔｈｒ　Ｈｉｓ　Ｃｙｓ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　
Ｇｉｎ　ＴＬｅ　Ｇｉｎ　Ａｌａ　　ＴｉｅＶａｌ　　
Ｓｅｃ　Ｓｅ【　ＰＣｏ　　Ｃｙｓ　　Ｈｉｓ　　Ａｓ
ｎ　　Ｓｅ【　Ｌｅｕ　　ｔｉｅ　　Ｌ＋ｅｕ　　Ｐｃ
ｏ　　Ｐｒｏ　　Ｐｈｅ　　５ｅｃＬａｕ　５ｅｃＰｅ
ａ　Ｖａｔ　Ｐｃｏ　ＴｈＣＬｅｕ　ＧＬｙ　Ｓｅ【　
Ｌ　ｓ　　Ｌｅｕ　ＧＬ　　ＧＬｕ　　Ｉｌｅ　Ｐｈｅ
ム■Ｌ旦免し 末端アミノ酸 のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。
これらのポリペプチドはさらに、上述の相当する「終結
」または「リンカ−Ｊ　ＤＮＡ配列にょってコードされ
る数個のアミノ酸の配列を含有してもよい。本発明は、
ハイブリッドポリペプチドの機能には影響しないが形質
転換宿主内での発現の結果として生じる「終結１または
［リンカ−［配列によってコードされる各種アミノ酸の
包含を意図するものである。
ハイブリッドタンパク質自体も、置換がハイブリッドタ
ンパク質の生理学的活性を一般的に変化させない限り、
アミノ酸置換を含有してもよい。
その生物学的活性を実質的に変化させないポリペプチド
におけるアミノ酸置換は本技術分野において公知であり
、たとえばｔＬ　Ｎｅｕｒａｔｈ　＆　Ｒ，Ｌ。
ｔｌ　ｉ　ｌ　ｌにより“Ｔｈｅ　Ｐｒ０ｔｅｉｎＳ”
　、八ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ。
Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９７９）に記載されている。最
も頻繁に認められるアミノ酸置換はＡｌａ／Ｓｅｒ　。
Ｖａｌ／Ｉｌｃ　、　　ＡｓＤ／Ｇｌｕ　、　　Ｔｈｒ
／Ｓｅｒ　。
＾Ｉａ／Ｇｌｙ　　、　　　八Ｉａ／Ｔｈｒ　　、　　
　Ｓｅｒ／Ａｓｎ　　。
Ａｌａ／Ｖａｌ　　、　　Ｓｃｒ／ＧＩＶ　　、　　Ｔ
ｙｒ／Ｐｈｅ　　。
Ａｌａ／Ｐｒｏ　　、　　　Ｌｙｓ／Ａｒａ　　、　　
ＡＳＤ／＾ｓｎ　　。
Ｌｅｕ／Ｉｌｅ　　、　　Ｌｅｕ／Ｖａｌ　　、　　Ａ
ｌａ／Ｇｌｕ　　。
Ａｓρ／Ｇｌｙおよびこれらの逆である。
さらに、ＨＴ　Ｌ　Ｖ　−ＩおよびＩ−Ｉ　Ｔ　Ｌ　Ｖ
　−ＩＩウィルスの類似性により、ＩＩＴＬＶ−ＩＩに
対する抗体は本発明のハイブリッドポリペプチドも認識
する。
本発明はまた、哺乳動物体液中のＨＴ　Ｌ　Ｖ　−Ｉｆ
に対する抗体の、本発明による検出を包含することを意
図するものである（ヨーロッパ特許出願公告用１８１，
１０７号参照）。
ハイブリツ゛遺伝　およびその％Ｊ　１本発明のハイブ
リッド遺伝子は、ｌ−Ｉ　Ｔ　Ｌ　Ｖ　−Ｉに対する抗
体を認識するＨ　Ｔ　Ｌ　Ｖ　−Ｉエンベロープタンパ
ク質の少なくとも１個のエピトープを含有するＤＮＡ配
列を、ｌ−１１Ｖ　−１に対する抗体を認識するＨＩＶ
−１エンベロープタンパク質の少なくとも１［＆Ｉのエ
ピトープを含有するＤＮＡ配列に融合することによって
作成される。
１−１１’　Ｌ　Ｖ　−ＩおよびＨＩＶ−１エンベロー
プ遺伝子フラグメントは、様々なソースから得ることが
できる。
１−ＩＴＬＶ−Ｉエンベロープ遺伝子は６１．０００ダ
ルトンの糖タンパク′ｉ（すｐ６１　）’を］−ドし、
これは４６．０ＯＯＨ，１４，の外部糖タンパク質（ｇ
ｐ４６）と２１．０００Ｍ、誓、のトランスメン１ラン
タンバク質（（１１）２１　）とに切断される。
ハイブリッド遺伝子の製造に使用できるＨ　Ｔ　Ｌ　Ｖ
　−Ｉエンベロープ遺伝子フラグメントは多くのソース
から得ることができる。たとえば、本発明においては、
ｐｔ１２Ｅｘと命名されたプラスミドをＨＴ　Ｌ　Ｖ　
−Ｉエンベロープ遺伝子ＤＮＡのソースとして使用した
。このプラスミドは最初、１８１　１０７号に記載され
ているように、ＨＴ　Ｌ　Ｖ　−ＩのＥｎｖ、　Ｄ　Ｘ
およびＬ　’Ｔ’　Ｒを含有するλＣＲ１と命名されて
いるプラスミドからサブクローニングされた。
ＨＴＬＶ−Ｉエンベロープタンパク質の（ＩＮ６のＣ末
端領域の部分をコードするプラスミドｐＫＳ３００、お
よびＨ−ｒＬＶ−ＩＩンベｏ−７タン法を用いて上述の
プラスミドＤＨ２ＥＸから容易に誘導される。これらの
プラスミドはコーロツバ特許出願公告第１８１　１０７
号の主題である。
１１’ｒＬＶ−Ｉエンベロープ遺伝子フラグメントの他
の可能性あるフラグメントとしては、本技術分野で公知
の方法に従って化学合成された遺伝子配列が包含される
（　ｃｅｒｔａら：ＥＭＢＯＪ、５：３．０５１〜３０
５６．１９８６）。
トＩＴＬＶ−Ｉエンベロープ遺伝子フラグメントは、Ｙ
ｏｓｈｉｄａら（ＰＮＡＳ、７９：２０３１〜２０３５
．１９８２）およびＰｏ１ｅｓｚら（ＰＮＡＳ。
Ｌユニ７４１５〜７４１９．１９８０）によって報告さ
れているように、ＨＴＬＶ−Ｉビリオンによりウィルス
でトランスフオームされたヒト丁細胞系からも得ること
ができる。ＤＮＡフラグメントはついで本技術分野にお
いて公知の方法により単離し、ＣＤＮＡライブラリーを
構築し、ＣＤＮＡライブラリーを調査することによって
所望のエンベロープ遺伝子フラグメントを得ることがで
きる。
１１Ｖ−１エンベロープ遺伝子は、（ｌＤ１２０とｇＤ
４１に処理を受ける分子１ｆｉ１６０．０００　（ｇｐ
１６０）のグリコジル化タンパク質（ｇｐ）をコードす
る。融合遺伝子の作成に使用できるＩＩＩＶ−１エンベ
ロープ遺伝子フラグメントは広い範囲から入手″（・き
る。所望の）Ｉ　Ｉ　Ｖ−１工ンベロープ遺伝子配列は
公知の方法に従って化学的に合成することもできるし、
またこのＤ　Ｎ　Ａ配列はウィルスでトランスフオーム
した細胞系から産生されるｍＲＮＡに相補性のＤＮＡを
調製することによって重鎖できる。ＨＩＶ−１ウイルス
はＨ−９細胞系（ＰＣＴ出願公告ＷＯ３５１０４８９７
号）を用いて培養が可能であり、これは）−１１Ｖ−１
エンベロープＤＮＡフラグメントの一ソースとすること
ができる。ＨＩＶ−１の全ゲノム分子は５Ｃｈｕｐｂａ
Ｃｈら：５ｃｉｅｎｃｅ　、　　２２４　：　５０３〜
５０５　（１９８４）に報告されているようにクローン
化された。このゲノムの完全ヌクレオチド配列はＲａｔ
ｎｅｒら：Ｎａｔｕｒｅ、　　３１３　：　２７７〜２
８４　　（１９８５）に報告されているように決定され
た。本発明のハイブリッドの構築に用いられる特定のＨ
Ｉ　Ｖ　−１エンベロープ遺伝子フラグメントはｃｃｒ
ｔａら：ＥＭＢＯＪ、、５：３０５１〜３０５６　（１
９８６）に記載されているようにして得られた。
本発明のハイブリッド遺伝子を構築するためには、ＤＮ
Ａ配列を特定の部位で切断する制限エンドヌクレアーゼ
を用いてトＩＴＬＶ−Ｉエンベロープ遺伝子およびＨＩ
　Ｖ　−１エンベロープ遺伝子の所望の部分を切り取る
ことが必要である。例１および２にはこの方法を用いて
ハイブリッド遺伝子を構築する手段を例示する。
合成ハイブリッド遺伝子も製造できる。オリゴヌクレオ
チドフラグメントを合成し、これらを適切に組立てると
ハイブリッドタンパク質をコードするハイブリッド遺伝
子が形成される。フラグメントは予め定められた段階で
ハイブリダイズし、リゲートして合成遺伝子を構築でき
る。合成遺伝子には適当なυ１限酵索部位を付与するこ
とができ、合成遺伝子の発現を最大にするように特別に
設計されたベクター中にクローン化することができる。
所望のハイブリッドタンパク質をコードする上記ハイブ
リッド遺伝子を構築するためには、いくつかの基準が遵
守されなければならない。第一に、細胞とくに大腸菌に
受は入れられるまたは好んで用いられるトリヌクレオチ
ドコドンを使用しなければならない。第二に、プラスミ
ドまたはファージ起源のベクターの挿入が１４能なよう
に分子の読み取り起点に制限酵素認識部位をもつことが
望ましい。さらに、制限部位は、十分に理解されたクロ
ーニングおよび発現ベクターたとえばｐｏｓ−族のプラ
スミドの使用が可能なように選択されねばならない。第
三に、遺伝子の部分をきわめて容易に変換および修飾し
またその部分の発現を可能にするため、一連の制限エン
ドヌクレアーゼ認識部位が導入されなければならない。
第四に、遺伝子の組立てを容易にするため、合成は不必
要に複雑であってはならないし、不適当な交差ハイブリ
ダイゼーシヨンは最小にしなければならない。
本発明のハイブリッド遺伝子はそれ自体公知の方法で、
プラスミドまたはファージ起源の任意の慣用のベクター
に導入１゛ることができる。プラスミドまたはファージ
起源の便利な発現ベクターについては、たとえば実験便
覧、“ＨＯｌｅＣｔｌｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ　”　、　
　Ｈａｎｉａｔｉｓら著、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒａｎｇ　Ｈ
ａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　、　１９８２に記載
されている。
えベクターおよび　質転　　主 ハイブリッド遺伝子が構築されたならば、それらはそれ
自体公知の任意の方法によって便利なベクター、シラス
ミドまたはファージ中に導入することができる。プラス
ミドまたはファージ起源の便利な組換えベクターは、た
とえば実験便覧、“Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ”、　ＨａｎｉａｔｉＳら著、Ｃｏ１ｄＳｐｒｉｎｏ
　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　１９８２に
記載されている。
これらの構築体に有用なプラスミドを含有する大腸菌株
はたとえば、プラスミドＤＤＳ５／ＲＢＳＩＩ、３△＋
５ＡとｐＤＭＩ、１を含む大腸菌Ｍ１５　（ＤＳＭ３５
１７）　、プラスミドｐＤＳ６／ＲＢＳＩＩ、３　Ａ　
＋　５　ＡとｐＤＭＩ、１を含む大腸菌Ｍ１５　（ＤＳ
Ｍ３５１８）またはプラスミドｐＡ−ＥＮＶ−２０を含
む大腸菌ＴＢＩ（０８Ｍ３５１６）がある。これらの株
は、請求によりａ６ｔｔｉｎｇｃｎのドイツ微生物寄託
機関（ＤＳＭ）から、づべて自由に入手できる。
前述のように、ハイブリッド遺伝子は、組換えベクター
の適当な部位に挿入された場合、それら自体の構造遺伝
子の部分ではないＤＮＡ配列に融合することができる。
しかしながら、挿入された遺伝子配列は、形質転換宿主
中でハイブリッドタンパク質またはアミノ酸芦換によっ
て得られる類縁体を産生ずることのみが要求される。
本発明のハイブリッドタンパク質をコードするＤＮＡ配
列の発現方法は、たとえば前出のＨａｎｉａｔｉＳらに
よりよく知られている。これらの方法は、発現調節ＤＮ
Ａ配列と作動的連結した上記ＤＮＡ配列を有ケる組換え
ベクターによる適当な宿主の形質転換、生育に適当な条
件上での形質転換宿主の培養、および培養液からの所望
のハイブリッドタンパク質の抽出、単離を包含する。本
技術分野の熟練者には、これらの公知方法から、本発明
の範囲より逸脱することなく特定の遺伝子の発現に最も
有効な方法を選択することが可能である。
本発明に使用する特定の宿主の選択は、本技術分野でよ
く知られている多数の因子に依存する。
これらの因子には、たとえば、選択された発現ベクター
との適合性、ハイブリッドプラスミドがコードするタン
パク質の毒性、所望のタンパク質の回収の容易さ、発現
特性、生物学的安全性および経済性が包含される。これ
らの−船釣指針の範囲内で有用なＩｌＩ菌宿主の例とし
ては、グラム陰性およびグラム陽性菌、とくに大腸菌株
を挙げることができる。本発明の最も好ましい宿主細胞
は、大腸菌Ｍ　１５　（Ｖｉｌｌａｒｅｊｏら：Ｊ、　
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　、　１２０　：　４６６〜４７
４．１９７４１．：ＤＺ２９１として報告されている）
および大腸菌Ｊｅ５５０６（ｌｌｉｒｏｔａら：ＰＮＡ
Ｓ、７４：１４１７〜１４２０．１９７７に報告されて
いる）である。しかしながら、他の大腸菌株、たとえば
大腸菌２９４（ＡＴＣＣ１４ｏ、３１４４６）、大１１
１ＡｉｌＲＲ１（ＡＴＣＣＮｏ、３１３４３）Ｊ３よび
大Ｉｌｌ菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣＮｏ、２７３２５）も
同様に使用できる。
大腸内で産生きれた本発明のハイブリッドタンパク°ｄ
は、大部分細菌の不溶性凝集体に局限され、これがこれ
らのタンパク質の回収を著しく容易にする。本発明のハ
イブリッドタンパク質を単離するためには、細菌細胞を
破壊または溶解し、不溶性のタンパク質を遠心分離によ
って回収する。ついで、沈殿を緩衝液、界面活性剤およ
び塩溶液で順次洗浄し、続いてｆｉ準的なタンパク質精
製技術を用いてほぼ精製することができる。
ポリアクリルアミド電気泳動分析用に採取するサンプル
のような少量の物質については、細胞をたとえばドデシ
ル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）のような界面活性剤で処理
して破壊する。大部分のタンパク質は超音波処理または
他の機械的破壊手段たとえばフレンチプレスによって回
収できる。好ましくは、細胞を化学的および酵素的手段
、たとえばＥＤＴＡもしくはＦＥ　Ｇ　ＴΔおよびリゾ
チームによって溶解する。
不溶性のタンパク質沈殿は３段階の別工程で洗ひするの
が好ましいが、これらの工程の一部の合体、再配列また
は省略が可能なことを予測できる。
沈殿を洗浄する第一工程は緩衝溶液、好ましくは１０ｍ
ＨＴｒｙｓ、　Ｄ１１８　、０で行われる。第二工程で
は、沈殿を界面活性剤、好ましくは１．Ｏ％Ｔｒｉｔｏ
ｎ　　Ｘ　−１００で洗浄する。第三工程の最終洗浄は
塩溶液、好ましくは７Ｍグアニジン塩塩基塩行う。
最終洗浄溶液から生じたハイブリッドタンパク質沈殿は
ついで慣用のタンパク′員精製技術によってさらに精製
できる。たとえばゲル濾過、クロマトグラフィー、調製
用平床等電点電気泳動、ゲル電気泳動、高速液体りＯマ
ドグラフィー（以下１−ＩＰＬｃという。イオン交換、
ゲル濾過および逆相クロマトグラフィーを含む）、およ
び、たとえば染料結合担体上または上記ハイブリッドタ
ンパク質に対するモノクローナル抗体を結合させた５ｅ
ｐｈａｒｏｓｅ上でのアフィニティークロマトグラフィ
ーを挙げることができるが、これらに限定されるもので
はない。ハイブリッドタンパク質沈殿はさらに、５ｕｐ
ｅｒｏｓｅ　１２または５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ　−２
００ゲルを用いて、サイズ排除クロマトグラフィーによ
って精製するのが好ましい。
本発明の方法は、合理的な順序で（１）　　ハイブリッ
ド遺伝子配列をコードする遺伝子の調製、（Ｊこれらの
遺伝子の適当なりローニングベクターへの挿入による上
記ハイブリッド遺伝子配列を含有する組換えベクターの
製造、（３）　　適合性のある宿主生物への組換えクロ
ーニングベクターの移入、（４）　　挿入された遺伝子
配列を発現できるこのような修飾宿主の選択および生育
、（５）　　遺伝子生成物の同定および精製、＋６１Ｈ
ＩＶ−１もしくは１」１“ＬＶ−Ｉまたは関連ウィルス
に対す・る抗体を検出するための遺伝子生成物の使用を
包含する多数の工程を伴うものである。
本発明のハイブリッドタンパク質は慣用的な公知方法に
よって製造できる。新規なハイブリッドタンパク質を製
造できる過程は３つの群に分類できる。すなわち、（１
）　　化学合成、好ましくは固相合成、（２）　　化学
合成によって製造される融合遺伝子の［Ｊ、その宿主へ
の挿入およびハイブリッドタンパク質の宿主による発現
、および　（３）　　相当するハイブリッド遺伝子は上
述のプラスミドまたはクローンのようなソースから得ら
れ、宿主へ挿入され、タンパク質が宿主によって発現さ
れる。
本発明のハイブリッドタンパク質はＨｅｒｒｉｆ’１ｅ
ｌｄの一般的固相法（Ｊ、＾ｒｅ、　Ｃｈｅ＋＋、　Ｓ
ｏｃ、　、　８５　：　２１４９．１９６３）を用いて
合成できる。
ハイブリッドタンパク質はまた、ハイブリッド遺伝子配
列を適当な組換えベクター中に挿入し、宿主を形質転換
する組換え法によっても製造できる。ついで形質転換体
を適当な培養条件下に生育させ、相当するハイブリッド
タンパク質を生成させる。以下の例３に、本発明の組換
えタンパク質の発現を例示する。これはＨａｎｉａｔｉ
ｓら（前出）によって−膜内に記載されているものであ
る。
本発明のハイブリッドタンパク質は、哺乳動物体液たと
えば血清、涙液、精液、膣分泌物および唾液中のＨＩＶ
−１エンベロープタンパク質およびＨＴＬＶ−Ｉまたは
関連ウィルス（たとえばＨ’ｒ　Ｌ　Ｖ　−ＩＩ　）エ
ンベロープタンパク質両者に対する抗体の存在を検出す
るために使用できる。本発明は、ＨＩＶ−１、）ＩＴＬ
Ｖ−Ｉまたは関連ウィルスの存在ついて哺乳動物体液を
試験する診断方法、およびこの方法に使用できる試験キ
ットを包含する。
ＨＩＶ−１，１−ＩＴＬＶ−１または関連ウィルス（た
とえばｌ−Ｉ　Ｔ　Ｌ　Ｖ　−１［）に対する抗体を検
出できる方法のひとつには、いわゆる「ウエスタンブロ
ツテインク」分析（Ｔｏｂｉｎら：ＰＮＡＳ、７６：４
３５０〜４３５４．１９７９）。この技術によれば、本
発明のハイブリッドタンパク質は５ＤＳ−ポリアクリル
アミドゲルから電気泳動的にニトロセルロース濾紙上に
移相される。ついでニトロセルロース濾紙を試験サンプ
ルで処理する。洗浄後、ニトロセルロース濾紙をベルオ
キシダーぜで標識した抗−ヒトＩａＧで処理する。次に
ペルオキシダーゼを適当な基質たとえばＯ−フェニレン
ジアミンによって測定する。放射性または蛍光標識も使
用できる。
１−１１Ｖ−１まタハ）ｌ　Ｔ　Ｌ　Ｖ　−Ｉもしくは
Ｈ’ｒ　Ｌ　Ｖ　−Ｉｆに対する抗体を本発明のハイブ
リッドタンパク質を使用して測定するためのもつと便利
な技術は、酵素連結イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩ
ＳＡ）である。このアッセイは、（ω　本発明のハイブ
リッドポリペプチドの固体支持体上への固定化、 υ　工程（２）の固定化ポリペプチドと試験サンプルの
接触による固定化タンパク質−抗体複合体の形成、 （ロ）　工程（へ）の複合体から非結合物質の洗浄除去
、および に）　ヒト抗体の選択的検出が可能な標識試薬たとえば
標識５ｔａｐｈｙ＋ｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓプロ
ティンＡまたは抗ヒトＩＱＧの添加によるト記複合体の
検出、 からなり、サンプル中のＨＩＶ−１エンベロープタンパ
ク質またはＨ’ｌ−Ｌ　Ｖ　−Ｉエンベロープタンパク
質に対する抗体の存在を明らかにすることができる。
適当な固体支持体は、試験容器（ガラスまたは人工材料
の試験管、タイタープレートまたはキューペット）の内
壁、ならびに固体物体（ガラスまたは人工材料のロッド
、末端肥厚部を有するロッド、末端突出部または層状部
を有するロッド）の表面である。ガラスまたは人工材料
のビーズはとくに適当な固相担体である。
有用な標識は、試薬およびその結合パートナ−の結合を
妨害しない任意の検知可能な機能体である。ＥＬｉＳＡ
アッセイおよび他のイムノアッセイに使用できる多数の
標識、たとえば西洋ワサビペルオキシダーゼ、　Ｃおよ
び１２５Ｉのような同位元素、フルオレセインの稀土類
キレートのような蛍光性色素、スピンラベル等が公知で
ある。
本発明の好ましい態様においては、ビーズ上に固定化さ
れた本発明のハイブリッドタンパク質を用い、以下に記
載するような試験キットでＥＬ　［ＳＡ　（Ｅ　ＩＡ）
アッセイを行う。被覆した球体に患者サンプルならびに
陽性および陰性対照を加え、３７℃で３０分間インキュ
ベートさせる。
ビーズを洗って非結合抗体を除去したのち、西）イワナ
ビベルオキシダーゼ（１−Ｉ　ＲＰ　）にカップリング
した抗−ヒトＩＱＧを加える。トＩＲＰ抱合体を３７℃
で１５分間反応させ、つい゛Ｃ球体を洗浄して非結合Ｈ
ＲＰ抱合体を除去する。ＨＲＰの基質、０−フェニレン
ジアミン（ＯＰＤ）を球体に加え、室温で１５分間反応
させる。酵素反応はＨ２ＳＯ４を加えて終結させ、ＨＲ
Ｐによって生成された黄褐色を比色計で読み取る。４９
２　ｎ項における光学密度は、ヒトＩｇＧに結合したＨ
　Ｉ−＜　Ｐ抱合体の存在ひいてはプレート上の抗原に
結合したヒトＩａＧの存在を指示する。
ＩＶ−１エンベロープタンパク貿またはＨＴ　Ｌ　Ｖ　
−Ｉエンベロープタンパク質に対する抗体はまた、本発
明のハイブリッドタンパク質を用い、いわゆる［二重抗
原サンドイツチ法］に従った酵素免疫学的試験でも測定
できる。この方法は、Ｉａｍｕｎｏｌｏａｉｃａｌ　Ｈ
ｅｔｈｏｄｓ　、　２０　：　２５〜３４．１９７８に
２載されたＨａｉｏｌｉｎＩ、　Ｒ，Ｉ　、の研究に塁
づくものである。この方法によれば、試験サンプルを、
ペルオキシダーゼで標識した本発明のハイブリッドタン
パク質が被覆されている固体支持体と接触させる。つい
で免疫学的反応を１工程または２工程で行わせることが
できる。免疫学的反応を２工程で行う場合は、２回のイ
ンキュベーションの間に洗浄工程を設ける。１工程また
は２工程の免疫学的反応ののちに洗浄ＴＲを設ける。つ
いでペルオキシダーゼを単質たとえば０−フにレンジア
ミンで°測定する。
哺乳動物体液中のＨＩＶ−１エンベロープまたはＨＴ　
Ｌ　Ｖ　−Ｉエンベロープタンパク質に対する抗体を検
出する本発明の方法を用いて陽性の結果が得られたなら
ば、ｌ−１１Ｖ　−１エンベロープまたはＨＴ　Ｌ　Ｖ
　−Ｉエンベロープに対する抗体について別個にサンプ
ルの試験を行い、確認することが可能である。
本発明はさらに以下の例によって説明するが、これらは
単に例示の目的で記述されるものであり、本発明を限定
するものではない。
鼓ニ プラスミドｐ）−１２Ｅ　Ｘを）−ＩＴＬＶ−Ｉエンベ
ロープ遺伝子ＤＮＡのソースとして使用した。このプラ
スミドは最初、ＨＴ　Ｌ　Ｖ　−ＩのＥｎＶ、ｐＸおよ
びしＴＲを含むλＣＲ１からサブクローニングされた（
Ｈａｎｚａｒｉら：前出）。プラスミド１）８ＳＥＮＶ
は、発現ベクターｐｌ）８５６／Ｒ１３ＳＩＩの唯一の
３ａｊ！Ｉ部位に７１５ｂｌｌｘｈＯ１制限フラグメン
トを挿入することによって構築されたくヨーロッパ特許
出願公告第２８２０４２号）。挿入されたＤＮＡフラグ
メントは１−Ｉ　Ｔ　Ｌ　Ｖ　−Ｉエンベロープ遺伝子
のアミノ酸２０１〜４４０をコードする。
プラスミドＨＩＶ−１ｐＥＮＶ（６０）−ＨＴＬＶ−ｉ
−ＥＮＶ−１は、ｐＢＳＥＮＶから４１３　ｂｐ　Ｂａ
ｍＨＩ、’Ｈｔ　ｎｄ［ＩＩ１ｌＩＩｌ限フラグメント
を除去し、退行３’−ＯＮ末端をＤＮＡポリメラーゼｆ
のフレノウフラグメントで充填し、適当なサイズの合成
）−１ｉｎｄＩＩＩリンカ−を連結して読み取り枠を維
持しくＮｅｗ　［：ｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　）
、このＨｉ　ｎｄＩＩＩフラグメントを発現ベクターｐ
Ｄｓ５／１（１３ｓｌＩ　　ＥＮＶ　（６０）に挿入す
ることによって構築した。発現ベクターはクローンｐＤ
Ｓ５／ＲＢＳＩＩ　　ＥＮＶ（８０）からＨｉ　ｎｄＩ
Ｉｌ制限フラグメントを除去し、残りのベクターを再び
環化することにより誘導した。結果として、このベクタ
ーはＨＩＶ−１０１）　４１　トランスメンブランタン
パク質の免疫学的優性領域を表す化学的に合成されたＤ
ＮＡフラグメントのＮ末端６０アミノ酸をコードする。
プラスミドＨＩＶ−１ｐＥＮＶ　　　（６０）　　　−
ト１ｒＬＶ−Ｉ−ＥＮＶ−１は、ＨＩ　Ｖ　−１エンベ
ロープ遺伝子の６０アミノ酸（アミノ酸５６０〜６２０
に対応）とＨＴ　Ｌ　Ｖ　−Ｉエンベロープ遺伝子の１
３４７ミノＡ！２（アミノ酸３０６〜４４０）を含有し
、予示される分子ｆｆ１２３．２Ｋｄのハイブリッドタ
ンパク質をコードする。Ｎ末端の付加的な４個のアミノ
酸ならびに融合タンパク質のＣ末端上終結コドンが認め
られる前に発現する付加的な１３個のアミノ酸はベクタ
ー配列に由来する（第２図参照）。
脛ニ プラスミドＨＩＶ−１ｐＥＮＶ（６０）−Ｈ’Ｔ’ＬＶ
−Ｉ　　ＥＮＶ−２は（ｌＤ４６１７）Ｃ−末Ｎ、Ｈ１
’　Ｌ　Ｖ　−Ｉの外部糖タンパク質（アミノ１１１２
２０ントを除去し、使用されたｐＤＳ発現ベクターの読
み取り枠を維持するｌ−１ｉ　ｎ　ｄ　ｉｌｌリンカ−
を付加し、得られたフラグメントをｐＤｓ５／ＲＢＳＩ
ＩＥＮＶ　（６０）のＨｉ　ｎ　ｄ　１部位に挿入スル
コトによって構築された（第１図および第３図）。
例３ 組換えタンパク質の発現 挿入された遺伝子の発現はｃｅｒｔａら（前出）の記載
を一部変更して、活動的に生育している細菌の培ｉ液に
イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（Ｉ　
ＰＴＧ）を添加することにより誘導した。培養体を３７
℃で０Ｄ６００が０．６〜０．７になるまで生育させ、
Ｉ　Ｐ　Ｔ　ＧをＱ、５ｍＮまで添加して誘導し、２〜
４時間インキュベーションしたのち、一部のサンプルを
取り出した。細胞を遠心分離によって集め、相当量の全
細胞溶解液を１２％５ＤＳ−）’ＡＧＥゲル上に適用し
、タンパク質のバンドをクーマツシー・ブリリアント・
ブルー（Ｒ−２５０＞で染色して可視化した（第４図）
。全細胞溶解液サンプルは、遠心分離した培養液１．５
−を２　Ｘ　Ｌａｅｌｌｌｌ　ｉサンプル緩衝液に再懸
濁し、煮沸してＩＩ製した。
胆 組換えタンパク質の精製 組換えタンパク質の精製は、Ｈａｎｎｅらの操作（ＰＮ
ＡＳ、旦：３７６．１９８５）を改良して行った。簡単
に述べれば次のとおりである。
ＩＰＴＧ誘導細胞ペレットをＰＢ　Ｓ　／　５　ｍＨ［
ＤＴＡ／２５％スクロース／１％ＴｒｉｔＯｎ　　Ｘ　
−１００／１ｍＨＤ’ｒＴ、ｐＨ７，５中、ａｕｒａペ
ースト１ｇあたり２ａｄ！の割合で再懸濁した。リゾチ
ームを１１ＩＩ９／−になるように加え、懸濁液の凍結
−解凍を３回くり返した。ＤＮアーゼ１を０．４１１１
！？／ａｄ！になるように加え、氷上で２０分間インキ
コベートし、溶解物を４℃において２５．０００１ｍＨ
ＤＴＶ（２０ａｉりで４回洗浄した。次に、ベレットを
ＰＢＳ／１．７５Ｍグアニジン塩酸塩１５ｍＨＤＴＴＳ
ＤＨ７，５で洗浄し、ベレットを３１ｄの１０ｉ＋Ｈｌ
’ｒｉｓ１５１１８　　ＤＴＴ／７Ｍグアニジン塩ｍ塩
、ｐＨ８，０に可溶化した。不溶物質を遠心分離によっ
て除去した。上清を１０１１１１０１１１ＨＴｒｉ　　
ＤＴＴで１：１５に希釈し、室温で１０分間インキュベ
ートし、４℃において１２．０ＯＯＸ９で１０分間遠心
分離した。ベレットを２０ｍの１０ｎＨＴｒｉｓ１５ｍ
ＨＤｒＴ、ｐ１１３．０で１回洗浄し、１２５ｎＨＴｒ
ｉｓ１５ａ＋ＨＤ１−ｒ／４％５Ｏ８１０，０２％Ｎａ
Ｎ３．１）Ｈ６，８中に室温で一夜を要し徐々に溶解さ
せた。
場合によっては、２５ｎＨＴｒｉｓ／１ｍＭＥＤ丁Ａ／
１００ｍＨＮａＣ１１０，１％５Ｏ８１０，０２％Ｎ　
ａ　Ｎ　３　、ＤＩＩ８　、　ＯＴ７平衡化した５ｅｐ
ｈａｃｒｙｌ　Ｓ　−２００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）
カラム上クロマトグラフィーによってさらに精製を行っ
た。
分画を５ＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、問題のタンパク質を
舎内する分画をプールした。
例５ 臨床サンプルの試験 試験した血清は、正常の血液ドナー、ならびに以前血清
陽性を示したことがあるＡＩＤＳおよびＡＲＣ患者から
得た。ＨＴＬＶ−Ｉ血清陽性ナツブルは日本から人手し
たｌ−１１Ｖ−１およびトドｒ　Ｌ　Ｖ　−ｉに対する
、プールした陽性対照血清はＷｅｓｔｅｒｎ　５ｔａｔ
ｕｓ　Ｐｌａｓｍａから入手した。
ビーズ１１覆操作 人朶： １１０．０５Ｍ炭酸塩−重炭酸塩緩自液、ｐＨ９，５ ２）ポリスチレンビーズ（アルコール洗浄）３）０．０
５Ｍ炭酸塩−億炭酸塩緩衝液、ｐＨ９，５中１％Ｔｗｅ
ｅｎ　２０ ４）　　２５ｎＨＴｒｉｓ、ｉｍ＋　　ＥＤＩ−Ａ、１
００１ＨＮａＣＪ！、０．１％ＳＤＳ、０．０２％Ｎａ
Ｎ３、ｐＨ８，０中）１１Ｖ−１／Ｈ’ｒＬＶ−Ｔ融合
タンパク質 ５）被覆溶液：ｌ−１１Ｖ−Ｉ　　ＨＴＬＶ−１タンパ
ク質を０．０５ＭＦＡ酸塩−重炭酸塩緩衝液ｐＨ９，０
で最終濃度１０μｇ／ｄに希釈する。
プロトコール： （１）　　アルコール洗浄ビーズ５００個（７０ｇ）を
０．０５Ｍ炭！！塩／市炭酸塩緩衝液、ｐＨ１９，５中
１％ｒｗｅｅｎ　２０．１００項に加える。
（２１３７℃で一夜（１８時間）インキュベ−１・、溶
液を吸引し、２００ｄの脱イオン水で５回洗浄、最後の
洗浄液を吸引除去する。
（３）　　湿ったビーズを１０μｇ／ｄのＩ」ＩＶ−１
／）ＩＴ’ＬＶ−Ｉ融合タンパク質を含む被覆溶敬１０
０ｔｅで被覆する。
４　３７℃で２０時間インキュベートする。
５）　被覆溶液を吸引除去する ６）　脱イオン水２００ｄで５回洗浄する。
７　　最後の洗浄液を吸引除去する。
８　　ビーズをタンブラ−中３７℃で３時間乾燥し、２
〜８℃に保存する。
同時抗体スクリーニング 基り： （１）、ＨＩＶ−１／ＨＴＬＶ−Ｉ−ＥＮＶタンパク質
７１ｎＭビーズ：　Ｉ　Ｃ１ｇ／ｄのＨＩ　Ｖ−１ｏＥ
ＮＶ　（６０）−ＨＴＬＶ−Ｉ−ＥＮＶ−１融合タンパ
ク質溶液で被覆したつや消しポリスヂレンビーズ （２）　　サンプル希釈液：０．０２Ｍリン酸緩衝食塩
溶液、ｐＨ７，０中、２０％ウシ新生仔血消、０．５％
丁ｗｅｅｎ２０．０．０１％ヤギＩＱＧ。
０．０１％チメロサール、５　ｍＨＥＤＴ八（３）　　
ｌ−１［Ｖ−１弱陽性対１’（（：　ＨＩＶ　ニ対スル
抗体陽性の熱不活化ヒト血清、０．１％アジド、０．０
１％チメロサール （４）　　ＨＩＶ−１強陽性対照：ｔ−１１Ｖに対する
抗体陽性の熱不活化ヒト血清、０．１％アジド、０．０
１％チメロサール （５）　　ＨＩＶ−１／Ｈ’ＴＬＶ−Ｉ陰性対照二ＨＩ
Ｖ−１およびＨＴＬＶ−Ｉに対する抗体陰性の熱不活化
ヒト血清、０．１％アジド、０．０１％チメロサール （６）　　ＨＴＬＶ−Ｉ陽性対照ニドＩ　Ｔ　Ｌ　Ｖ　
−Ｉに対する抗体陽性の熱不活化ヒトＩＩｎ泗、０．１
％アジド、０．０１％チメロサール （７）　　抱合試薬：２０％処理ウシつ仔血清、０．０
４％４−アミノアンプビリン、１％Ｔｗｅｅｎ２０（ポ
リソルベート２０＞、０．１％　にａｔｈｏｎ（Ｖ／Ｖ
）、含有０．ＩＭＴｒｉｓ酢酸塩、ＤＩ＋７．３中１　
：９００に希釈した（希釈は力価によって異なることが
ある）ペルオキシダーゼ（西洋ワサビ）標識ヤギ抗−ヒ
トＩｑＧ （８）　　基質ａ衝液：Ｏ，ＩＭりｒ−ン酸力ＩＪウム
、０．０２％過酸化水素、０．０１％　ＫａｔｈｏｎＳ
ｐＨｂ、２５ （９）　　ＯＰＤ錠：１０＃　　Ｏ−’フェニＬ／ンシ
７ミン／錠 （１０）停止試薬：脱イオン水中１Ｎ硫酸アッセイ操作 （１）　　標本１０μ！＋サンプル希釈液４００μ！　
（１：４１希釈）を反応チューブに取る。
（２）　　ビーズ１個を加える。
（３）　　Ｒｅ５ａ　　ＣＯＢ　Ａ　Ｓシェーカー／イ
ンキュベーターを用い、３７℃で３０分間インキュベー
トする。
（４）脱イオン水を用いウオッシャ−中でチュ（６）　
　Ｒｃｓａ　　ＣＯＢ　Ａ　Ｓシェーカー／インキュベ
ーターを用い、３７℃で１５分間インキュベートＪる。
（７）　　免疫学的インキュベーションの終了約１０分
館に、ＯＰＤ錠を基Ｖ３緩衝液に溶解して（基質溶液５
Ｉｄにつき１錠加える）、ＯＰＤ基質溶液を調製する。
（８）　　脱イオン水を用いウオッシャ−中でチューブ
を洗浄する。
（９）　　予め合したＯＰＤ／基質２５０μｍを加える
。
（１０）ラックを奈盪する。
（１１）暗所、室温で１５分間インキュベートする。
（１２）各チューブに停止試薬１ｄを加える。
（１３）　　Ｒｅ５ａ　　ＣＯＢ　Ａ　Ｓ比色計により
４９２ｎｍでチューブを読む。
アッセイ結果は第１表および第２表に示す。
第１表 組換え発現トＩＴＬＶ−ＩおよびＨＩＶ−１エンベロー
プタンパク質の免疫反応性 （０，Ｄ、＝４９２＞ サンプル Ｎ。
ＨＩＶ−１ ｐＥＮＶ（８０） ＨＩＶ−１ １）ＥＮＶ（６０）− ＨＴＬＶ−１− ［：ＮＶ−１ １−＋１Ｖ−１陽性 １．１３４ ４．４７１ ４．２２４ ３．９８１ ４．４２２ １　、３０４ ３、１５７ ３．２１１ ３、３９５ ０．１０２ ０、１２０ ０、０７４ ０、０７５ ０．１４３ １．９＆３ １．２８７ ０．６８５ １．８６０ ２．６０４ 陰性 ０゜１７７ ０．１７８ ０、０５１ ０、０６１ ｏ６２ ０．０８２ ０．０５７ ＨＩＶ−＋　　　　ＨＩＶ−１ ｐ［ＮＶ（６０）−ｐＥＮＶ（ＧＯ）−ＨＩＬＶ−１−
ＨｌＬＶ−１− ＥＮＶ−２ｆＮＶ−１＋ｌ：ＮＶ−２ ０．９５９　　　２　Ｉ＋！＋９ ３．１３７　　　４．９１８ ２．９５７　　　４．５Ｂ２ ２．９９８　　　　４．６００ ３．２６３　　　　４．８５８ ０．６９０ １　、３５０ ０．７００ ３．７７２ ３、１３５ ３、６０８ ４、　！＋７７ ０．１３３ ０．１７５ ０．１２０ ０．１６５ ０．０９２ ０、１＆６ ０．２０４ ０．１７２ ０．１３７ ４゜ 以上、本発明を好ましい態様との関連で説明したが、こ
れは促示した特定の形に本発明を限定することを意図す
るものではなく、特許請求の範囲に定義された本発明の
精神および範囲内に包含される変更、隆部および均等態
様を含むことを意図するものである。
図面の簡単な説明 第１図は、プラスミドＨＩ　Ｖ　−１１）　Ｅ　Ｎ　Ｖ
（６０）　−１−Ｉ　Ｔ　Ｌ　Ｖ　−１−ヒＮＶ−１お
よび−に　ＮＶ−２ｐＥＮＶ（６０）−ＨＴＬＶ−ＩＥ
　Ｎ　Ｖ　−１ｔ３よびＥＮＶ−２１／）構築ヲ／Ｒｔ
　ＦＺＪ　テある。
第２図は、ブラスミドトＩＩＶ−１ｐＥＮＶ（６０）−
ＨｒＬＶ−Ｉ−ＥＮＶ−１（７）翻訳生成物およびＤＮ
Ａ配列を示す。
第３図は、７ラスミドＨＩＶ−１ｐＥＮＶ（６０）−Ｈ
ＴＬＶ−Ｉ−ＥＮＶ−２（７）翻訳生成物およびＤＮＡ
配列を示す。
第４図は、ｔｌｌＶ−１ｐＥＮＶ（６０）−Ｈ−ｒ　Ｌ
　Ｖ　−Ｉ　−Ｅ　Ｎ　Ｖ　−１および一ヒＮＶ−１１
合タンパク質の５ＤＳ−ＰＡＧＥ上での分離例を示す。
第５図は、ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質のアミノ
酸配列を丞ず。

Claims (35)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）ＨＩＶ−１に対する抗体によつて認識されるＨＩ
    Ｖ−１エンベロープタンパク質の少なくとも１個のエピ
    トープを含有するポリペプチドをコードする第一のＤＮ
    Ａ配列とＨＴＬＶ− I に対する抗体によつて認識され
    るＨＴＬＶ− I エンベロープタンパク質の少なくとも
    １個のエピトープを含有するポリペプチドをコードする
    第二のＤＮＡ配列からなるハイブリッド遺伝子。
  2. （２）第一のＤＮＡ配列はＨＩＶ−１ｇｐ４１トランス
    メンブランタンパク質の免疫学的優性領域を含有するポ
    リペプチドをコードする特許請求の範囲第１項に記載の
    遺伝子。
  3. （３）ＤＮＡ配列はＨＩＶ−１エンベロープタンパク質
    のほぼアミノ酸５６０〜６２０をコードする特許請求の
    範囲第２項に記載の遺伝子。
  4. （４）ハイブリッド遺伝子と作動的に連結している開始
    ＤＮＡ配列を含有する特許請求の範囲第３項に記載の遺
    伝子。
  5. （５）開始ＤＮＡ配列はＡＴＧＡＧＡＧＧＡＴＣＣであ
    る特許請求の範囲第４項に記載の遺伝子。
  6. （６）第二のＤＮΛ配列はＨＴＬＶ− I エンベロープ
    タンパク質のほぼアミノ酸３０６〜４４０を含有するポ
    リペプチドをコードし、ヌクレオチド配列は【遺伝子配
    列があります】 である特許請求の範囲第５項に記載の遺伝子。
  7. （７）第二のＤＮＡ配列はＨＴＬＶ− I エンベロープ
    タンパク質のほぼアミノ酸２０１〜３０８を含有するポ
    リペプチドをコードし、ヌクレオチド配列は【遺伝子配
    列があります】 である特許請求の範囲第５項に記載の遺伝子。
  8. （８）ＨＩＶ−１に対する抗体によつて認識されるＨＩ
    Ｖ−１エンベロープタンパク質の少なくとも１個のエピ
    トープを含有する第一のアミノ酸配列とＨＴＬＶ− I
    に対する抗体によつて認識されるＨＴＬＶ− I エンベ
    ロープタンパク質の少なくとも１個のエピトープを含有
    する第二のアミノ酸配列からなるハイブリッドポリペプ
    チド。
  9. （９）第一の配列はＨＩＶ−１ｇｐ４１トランスメンブ
    ランタンパク質の免疫学的優性領域を含有する特許請求
    の範囲第８項に記載のポリペプチド。
  10. （１０）第一の配列はＨＩＶ−１エンベロープタンパク
    質のほぼアミノ酸５６０〜６２０を含有する特許請求の
    範囲第９項に記載のポリペプチド。
  11. （１１）第二のアミノ酸配列はＨＴＬＶ− I エンベロ
    ープタンパク質のほぼアミノ酸２０１〜３０８を含有し
    、アミノ酸配列は 【遺伝子配列があります】 である特許請求の範囲第１０項に記載のポリペプチド。
  12. （１２）第二のアミノ酸配列はＨＴＬＶ− I エンベロ
    ープタンパク質のほぼアミノ酸３０６〜４４０を含有し
    、アミノ酸配列は 【遺伝子配列があります】 である特許請求の範囲１０項に記載のポリペプチド。
  13. （１３）ＨＩＶ−１に対する抗体によつて認識されるＨ
    ＩＶ−１エンベロープタンパク質の少なくとも１個のエ
    ピトープとＨＴＬＶ− I に対する抗体によって認識さ
    れるＨＴＬＶ− I エンベロープタンパク質の少なくと
    も１個のエピトープを含有するハイブリッドポリペプチ
    ドをコードするハイブリッド遺伝子からなる組換えベク
    ター。
  14. （１４）単細胞宿主中で複製可能なプラスミドである特
    許請求の範囲１３項に記載の組換えベクター。
  15. （１５）大腸菌株内で複製可能である特許請求の範囲１
    ４項に記載の組換えベクター。
  16. （１６）ベクターはプラスミドｐＥＮＶ群の一員である
    特許請求の範囲第１５項に記載の組換えベクター。
  17. （１７）プラスミドＨＩＶ−１ｐＥＮＶ（６０）−ＨＴ
    ＬＶ− I −ＥＮＶ−１である特許請求の範囲第１６項
    に記載の組換えベクター。
  18. （１８）プラスミドＨＩＶ−１ｐＥＮＶ（６０）−ＨＴ
    ＬＶ− I −ＥＮＶ−２である特許請求の範囲第１６項
    に記載の組換えベクター。
  19. （１９）ＨＩＶ−１に対する抗体によつて認識されるＨ
    ＩＶ−１エンベロープタンパク質の少なくとも１個のエ
    ピトープとＨＴＬＶ− I に対する抗体によつて認識さ
    れるＨＴＬＶ− I エンベロープタンパク質の少なくと
    も１個のエピトープを含有するハイブリッドポリペプチ
    ドをコードするハイブリッド遺伝子からなる組換えベク
    ターを含む単細胞宿主。
  20. （２０）大腸菌株である特許請求の範囲１９項に記載の
    宿主。
  21. （２１）大腸菌Ｍ１５である特許請求の範囲２０項に記
    載の大腸菌株。
  22. （２２）ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質の少なくと
    も１個のエピトープとＨＴＬＶ− I エンベロープタン
    パク質の少なくとも１個のエピトープを含有するハイブ
    リッドポリペプチドを製造するにあたり、上記ハイブリ
    ッドポリペプチドをコードする遺伝子を含有する組換え
    ベクターを含有する単細胞宿主を上記ポリペプチドが発
    現するのに適当な生育条件下に培養し、上記ポリペプチ
    ドを単離することからなる方法。
  23. （２３）哺乳動物体液中のＨＴＬＶ− I もしくはＨＴ
    ＬＶ−IIエンベロープタンパク質またはＨＩＶ−１エン
    ベロープタンパク質に対する抗体を検出するにあたり、
    試験サンプルをＨＩＶ−１エンベロープタンパク質の少
    なくとも１個のエピトープおよびＨＴＬＶ− I エンベ
    ロープタンパク質の少なくとも１個のエピトープを含有
    するハイブリッドポリペプチドと接触させてタンパク質
    −抗体複合体を形成させ、その複合体を検出する方法。
  24. （２４）複合体はイムノアツセイで測定する特許請求の
    範囲第２３項に記載の方法。
  25. （２５）イムノアツセイはウエスタンブロツテイング、
    二重抗原サンドイツチアツセイ、ラジオイムノアツセイ
    および酵素イムノアツセイからなる群より選ばれる特許
    請求の範囲第２４項に記載の方法。
  26. （２６）ａ）特許請求の範囲第８項から第１２項のハイ
    ブリッドポリペプチドを固体支持体上に固定化し、ｂ）
    哺乳動物体液サンプルを工程（ａ）の固定化ポリペプチ
    ドと接触させてタンパク質−抗体複合体を形成させ、ｃ
    ）非結合物質を工程（ｂ）の複合体から洗い流し、つい
    でｄ）この複合体を、ヒト抗体の選択的検出が可能な標
    識試薬を添加して検出する特許請求の範囲第２５項に記
    載の方法。
  27. （２７）固体支持体はビーズである特許請求の範囲第２
    ６項に記載の方法。
  28. （２８）ヒト抗体の選択的検出が可能な試薬は標識抗−
    ヒトＩｇＧである特許請求の範囲第２７項記載の方法。
  29. （２９）標識は放射標識である特許請求の範囲第２８項
    に記載の方法。
  30. （３０）標識は酵素標識である特許請求の範囲第２９項
    に記載の方法。
  31. （３１）陽性試験結果はＨＴＬＶ− I またはＨＩＶ−
    １エンベロープタンパク質に対する抗体について別個に
    サンプルを試験することによつて確認する特許請求の範
    囲第３０項に記載の方法。
  32. （３２）ＨＴＬＶ− I 、ＨＴＬＶ−IIまたはＨＩＶ−
    １エンベロープタンパク質に対する抗体の存在について
    哺乳動物体液を試験する特許請求の範囲第８項から第１
    ２項までのハイブリッドタンパク質の使用。
  33. （３３）特許請求の範囲第２２項の方法によつて製造さ
    れる特許請求の範囲第８項から第１２項までのいずれか
    に記載のハイブリッドタンパク質。
  34. （３４）ａ）固体支持体上に固定化された特許請求の範
    囲第８項から第１２項までのハイブリッドタンパク質を
    含む容器、ｂ）ヒト抗体の選択的検出が可能な標識試薬
    を含む容器、ｃ）陽性および陰性対照を含む容器、なら
    びにｄ）サンプル希釈液を含む容器からなるヒト体液中
    のＨＴＬＶ− I 、ＨＴＬＶ−IIまたはＨＩＶ−１エン
    ベロープタンパク質に対する抗体の測定に有用な診断用
    キット。
  35. （３５）固体支持体はビーズである特許請求の範囲第３
    ４項に記載の試験キット。
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