KR20010075418A

KR20010075418A - 유방 특이적으로 분비되는 유방암 단백질인 마마글로빈

Info

Publication number: KR20010075418A
Application number: KR1020017003944A
Authority: KR
Inventors: 마크 에이. 와트슨; 티모씨 피. 플레밍
Original assignee: 추후제출; 워싱톤 유니버시티
Priority date: 1998-09-29
Filing date: 1999-09-29
Publication date: 2001-08-09
Also published as: HUP0104408A2; IL142079A0; CA2343980A1; TR200101702T2; WO2000018783A9; NO20011394D0; US6566072B1; BR9914161A; CN1328567A; JP2002525098A; CA2343980C; EP1117673A1; CZ20011025A3; MXPA01003240A; HUP0104408A3; WO2000018783A1; PL347021A1; NO20011394L; WO2000018783B1; EP1117673A4

Abstract

본 발명에서는 분리, 정제된 DNA서열과 암호화된 유방 특이적으로 분비되는 단백질인 마마글로빈을 개시하고 있다. 또한 본 발명은 유방암 세포에 의한 마마글로빈의 과발현 및 분비를 기초로 하여 유방암을 감지해내는 방법을 개시하고 있다. 본 발명의 방법으로 마마글로빈 또는 마마글로빈을 암호화하는 mRNA의 존재를 감지하고/또는 그 존재량을 측정할 수 있다. 마마글로빈을 발현하는 종양을 가진 유방암 환자를 치료하기 위하여 면역요법을 기초로 한 방법들을 개시하고 있다. 상기 방법들은 체액 및/또는 세포를 매개로 한 종양에 대한 면역반응을 유도하는 마마글로빈 항체를 사용하는 것을 포함한다.

Description

유방 특이적으로 분비되는 유방암 단백질인 마마글로빈{MAMMAGLOBIN, A SECRETED MAMMARY-SPECIFIC BREAST CANCER PROTEIN}

관련출원

본 출원은 1996년 3월 31일자로 출원된 PCT/US96/08235의 부분 계속출원(continuation-in-part)인 1997년 9월 18일자로 출원된 미국 특허출원 제08/933,149호의 부분 계속출원 및 1995년 3월 31일자로 출원된 미국 특허출원 제 08/455,896호로서, 현재는 미국 특허 제5,668,267호의 부분 계속출원이다.

[정부허가 참조]

본 발명은 공중 보건 서비스 허가 CA 76227, CA 76223-01 및 CA68485 하의 미국 정부 지원으로 이루어졌다. 미국 정부는 본 출원에 대하여 어떤 권리를 가진다.

(1) 본 발명의 분야

본 발명은 일반적으로는 유방암 병원론(pathogenesis) 분야에 관한 것이며, 보다 상세하게는 유방암을 감지하고 치료하기 위한 용도로 사용되는 cDNA 서열 및 암호화된 유방 특이적(mammary-specific) 단백질에 관한 것이다.

(2) 관련기술의 설명

유방암은 가장 흔하면서도 치명적인 암중의 하나이다.

조기 진단 및 치료로써, 상기 질병에 대한 발병률 및 사망률을 감소시킬 수 있으나, 유선조영술을 사용한 명확한 추정치는 단지 25% 정도인 것으로 평가되고 있다(Hall 등,N Engl J Med 327:319~328, 1992). 따라서, 암이 유선조영술로써 감지가 가능하게 되는 시기보다 더 조기에 암을 감지할 수 있는 수단이 요구되며, 유전적 또는 생화학적 마커(marker)가 유선조영술의 추정치를 보완 및 향상시켜주는 수단으로서 사용될 수 있을 것이다(Hayes,Hematol Oncol Clin N Am 8:485, 1994).

유방암이 진전되면서 수많은 유전적 변화들이 수반된다(Porter-Jordan,Hematol Oncol Clin N Am 8:73, 1994 참조). 이러한 변화들은 전반적인 염색체 변형 및 유전적 마커들의 손실을 포함한다(Devilee 등,Biochim Biophys Acta 1198:113, 1994; Callahan 등,J Cell Biochem Suppl 17:167, 1993). 유방종양의 진행은 또한 성장인자와 이들의 수용체들(Zajchowski 등,Cancer Res 48:7041, 1988), 구조 단백질(Trask 등,Pro Natl Acad Sci 87:2319, 1990), 이차 메신저(messenger) 단백질(Ohuchi 등,Cancer Res 26:2511, 1986) 및 전사 인자들(Harris,Adv Caner Res 59:69;1992)을 암호화하는 이미 동정되어진 유전자들의 발현에 질적 및 양적인 변화를 일으키는 것으로 알려졌다. 이러한 유전자 변화들이 환자의 생검(biopsy) 검체내에 존재하는 유방암종의 발병요인에 정확히 어떠한 역할을 하는지는 잘 밝혀지지 않았으나, 유전자 발현에 있어서의 이러한 변화들은 잠재적으로 유방암 마커 개발의 토대를 형성할 수 있다.

유방암의 조기 감지를 위한 유방암에 대한 유전적 또는 생화학적 마커를 제공할 뿐만 아니라, 예후의 평가, 치료법의 선발 및 평가를 위한 수단 및 치료를 표적화하는(targeting) 수단을 제공할 수 있는 종양 마커가 존재한다면 바람직할 것이다. 수많은 조직 마커들이 동정되어왔으나, 진단 또는 일반 개체군의 선별에 매우 적합한 정도로 충분히 민감하거나 종양 특이적인 것들은 없었다(Id.). 따라서, 환자에서 유방암의 출현 및 병으로의 진전을 특이적으로 또한 선택적으로 동정해내는데 사용될 수 있고, 종양 특이적 면역치료에 사용될 수 있는 유전자와 이 유전자가 발현한 단백질과 같은 유방암 마커가 여전히 요구되고 있다.

유방암종으로부터 차별적으로 발현된 서열 태그(tag)들을 분리하기 위하여, 변형된 디퍼렌셜 디스플레이 폴리머라아제 연쇄반응 기술(differential display polymerase chain reaction)을 사용하여, 몇 개의 서열 단편들을 분리하여, 종양성 유방 상피조직에 특이적으로 발현시키고 이를 정상 조직의 대조구들과 비교하였다(Watson 및 Fleming,Cancer Res 54:4598~4602,1994, 본 명세서에 참고문헌으로 포함됨). 이들 서열태그들 중 DEST002로서 동정된 하나의 서열태그를 발견하므로써, 신규의 완전한 길이의 cDNA 및 여기서 마마글로빈(mammaglobin)으로 언급한 이의 암호화된 단백질을 발견, 분리하게 되었다. 상기 cDNA와 단백질 모두 신규한 것이다.

발명의 요약

즉, 본 발명은 유방암에서 그 발현이 증가되는 신규한 유전자의 동정 및 이들 유전자들의 mRNA로부터 cDNA를 분리해내는 것에 관한 것이다. 결과적으로, 본 출원인들은 신규한 cDNA 및 이의 암호화된 유방 특이적 분비단백질을 발견해내는데성공하였다. 상기 cDNA는 정제 및 분리된 형태이며, 서열번호 15로 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 암호화된 단백질인 마마글로빈은 정제 및 분리된 형태이며, 서열번호 2로 나타낸 아미노산 서열을 갖는다.

미국 특허 제5,668,267호에 기재된 소규모(small scale) 연구에서, 마마글로빈 mRNA는 I기의 일차 유방암 종양의 27%에서 과발현되었다. 본 출원은 마마글로빈 단백질이 조사된 종양의 약 80%에서 감지되는 복수 등급의 일차 유방암 및 조직형에 대한 많은 검사(survey) 결과에 대하여 기술한다. 이들 데이터는 마마글로빈 유전자의 조절이상(dysregulation)이 유방암의 조기에 그리고 빈번하게 일어난다는 것을 암시한다. 따라서, 마마글로빈과 이의 cDNA의 발견은 인간과 다른 포유류들에서의 유방의 종양성(neoplastic) 질병의 감지 및 치료를 위한 신규한 방법 및 조성물들을 개발할 수 있는 토대를 제공하는 것이다.

따라서, 본 발명은 검체내에서의 유방 종양세포들(neoplasia cells)의 존재를 감지해내는 신규한 방법들에 관한 것이다. 본 발명의 한 구체예에서, 폴리뉴클레오티드 탐침(probe)이 검체내의 마마글로빈 mRNA의 존재를 감지해내는데 사용된다. 상기 방법은 다음 단계들을 포함한다: (a) 서열번호 15 또는 그들의 대립형질적 변형체(allelic variant)를 포함하는 마마글로빈 mRNA에 특정적으로 혼성화되는 폴리뉴클레오티드 탐침을 검체내의 mRNA와 접촉시키는 단계 및 (b) 탐침과 검체 mRNA 간의 혼성화 복합체를 감지하는(detecting) 단계.

본 발명의 또다른 측면은 혼성화에 의해 검체내의 유방 종양세포들의 존재를 감지해내는(detecting) 키트(kit)를 제공하는 것이다. 이 키트는 용기내에 포장된서열번호 15 또는 그들의 대립형질적 변형체를 포함하는 마마글로빈 mRNA에 특정적으로 혼성화되는 폴리뉴클레오티드 탐침을 포함한다.

본 발명의 또다른 구체예에서, 검체에서의 마마글로빈의 발현은 검체에서 마마글로빈 mRAN로부터 역전사된 cDNA의 존재를 감지하므로써 결정된다. 상기 방법은 다음 단계들을 포함한다: (a) 환자로부터 얻은 검체내에서의 역전사 방법을 사용하여 mRNA로부터 마마글로빈을 암호화하는 cDNA를 생성시키고, (b) 마마글로빈을 암호화하는 cDNA내에 위치하거나 근접해(flank) 있는 올리고머들을 포함한, 폴리머라아제 연쇄반응에 사용되는, 두개의 프라이머(primer)들을 제공하고, (c) 상기 폴리머라아제 연쇄반응에 의해 마마글로빈을 암호화하는 cDNA를 증폭하는 단계. 바람직하기로는, 상기 두 개의 프라이머들은 서열번호 4와 서열번호 16을 암호화하는 뉴클레오티드 서열들을 갖는다.

본 발명의 또다른 구체예에서는 폴리머라아제 연쇄반응에 의해 검체내의 유방 종양세포들의 존재를 감지해내는 키트를 제공한다. 상기 키트는 용기내에 포장된 마마글로빈을 암호화하는 cDNA내에 위치하거나 근접해 있는 올리고머들을 포함한 폴리머라아제 연쇄반응에 사용되는 두개의 프라이머들을 포함한다. 바람직하기로는, 상기 두 개의 프라이머들은 서열번호 4와 서열번호 16을 포함하는 뉴클레오티드 서열들을 갖는다.

또 다른 구체예에서 본 발명은 마마글로빈 단백질에 대한 특이적인 항체들을 검체에 사용하여 종양세포에 의해 발현된 마마글로빈 단백질의 존재를 감지한다. 상기 특이적인 항체들은 폴리클로날 또는 모노클로날 항체들일 수 있다.

본 발명은 또한 항체-매개된 그리고/또는 세포-매개된 즉, 활성화된 T 세포들을 통해, 마마글로빈 발현 종양에 대한 면역반응을 유도할 수 있는 마마글로빈 항원들을 사용하여 유방 종양성 질환을 치료하는데 사용되는 신규한 조성물 및 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 조성물의 한 구체예는 마마글로빈 특이적인 B 세포들을 활성화시킬 수 있는 마마글로빈 B 세포 항원을 포함한다. 상기 B 세포 항원은 마마글로빈 특이적인 B 세포 에피토프(epitope)와 T 보조(helper) 세포들에 의해 인식되는 T_H에피토프 또는 결정인자(determinant)를 포함한다.

또 다른 구체예에서, 마마글로빈 항원은 MHC 클래스 I 분자에 대한 T_c세포 에피토프와 결합부위 또는 아그리토프(agretope)를 포함하는 마마글로빈 특이적인 세포독성인(cytotoxic) T 림프구에 의해 인식되는 마마글로빈 T_c세포 항원이다.

다른 구체예에서 본 발명에 따른 조성물은 B 세포 항원 및 T_c세포 항원들을 포함한다.

마마글로빈을 발현하는 종양이 있는 환자에 대한 치료방법들은 환자로부터 분리해낸 마마글로빈 특이적 림프구들의 마마글로빈 항원을 이용한 생체외 자극에 이어, 환자에게 상기 활성화된 림프구들을 투여하는 것을 포함하며, 마마글로빈 항원을 포함한 백신을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 항마마글로빈 면역반응의 생체내 자극을 포함하는 양자 면역요법(adoptive immunotherapy)을 포함한다.

본 발명에 의해 이룰 수 있는 몇몇 장점들 중에서, 유방 암세포들에 대한 마커로서 제공될 수 있는 뉴클레오티드 서열 및 암호화된 아미노산 서열의 제공; 유방 종양세포들의 존재의 조기 감지방법의 제공; 유선조영술을 보완하여 그 추정치를 높일 수 있는 유방암 감지수단의 제공; 예후평가를 제공할 수 있는 방법; 치료의 표적화를 가능하게 하는 마커들의 제공 및; 종양에 대한 세포성 면역과 체액성 면역을 자극하는 조성물들의 제공은 주목될 수 있는 것들이다.

도면의 간단한 설명

도 1은 cDNA 말단의 신속 증폭(RACE) 폴리머라아제 연쇄반응(PCR) 기술 및 pGEM7Z와 pCEV27 벡터내로의 연속된 서브클론화(subcloning)를 포함한, 완전한 길이의 마마글로빈 cDNA를 분리하기 위해 사용된 방법을 예시한 것이다.

도 2는 인간 cDNA 서열(서열번호 1)(위에 번호붙인 뉴클레오티드들) 및 암호화된 유방 특이적 단백질인 마마글로빈의 아미노산 서열(서열번호 2)(아래에 번호붙인 아미노산들), RACE PCR 방법에 의해 분리된 403bp 단편(서열번호 5)을 표시한 고형 바(solid bar)와 206bp DEST002 서열(서열번호 6)을 표시한 열린 바(open bar)를 예시한 것이다;

도 3은 유방 특이적 단백질인 마마글로빈(hMAM)의 아미노산 서열(서열번호 2)과 쥐의 전립선 스테로이드 결합 단백질 서브유니트 C3(rPSC3)(서열번호 7) 및 인간의 클라라 세포(clara cell) 10kD 단백질(hCC10)(서열번호 8)을 비교 예시한 것으로, 볼드체와 이중선으로써 각 종류를 나타내고 단일선으로 구조적으로 유사한 아미노산들을 표시하였다;

도 4에서 (도 4A)는 유방 특이적 단백질인 마마글로빈(hMAM)을 암호화하는상기 인간 cDNA 서열의 유방 종양, 정상 유방 및 다른 성인 조직들로부터 얻은 조직에 의해 발현되는 mRNA로의 혼성화의 노던 블롯(Northern blot) 분석을 예시한 것이며, (도 4B)는 유방 종양, 정상 유방 및 다른 성인 조직들로부터 얻은 조직들의 RT/PCR 증폭된 검체들의 분석결과이다;

도 5는 시험관 내에서의 토끼의 망상적혈구(reticulocyte) 용해질 분석시스템내에서의 유방 특이적 cDNA 서열의 번역을 예시한 것이다;

도 6은 다른 8명의 환자들중 세명으로부터 얻은 종양에서(볼드체로 나타냄), 또한 보다 낮은 수준으로 정상 유방조직(이탤릭체로 나타냄)에서의, 종양 2410내의 mRNA를 감지하는 마마글로빈을 암호화하는 cDNA와의 노던 블롯 혼성화를 예시하고 있으며, 종양조직 및 환자의 정상 조직에서의 마마글로빈 mRNA 발현의 두 경우(오른쪽 네줄)를 비교하고 있다;

도 7은 각각 세포매질과 세포 용해질 내에 존재하는 마마글로빈 단백질의 전구체 및 분비형들을 감지하는 면역 펩타이드의 부재(-) 및 존재(+)하에서, MDA-MB-415 유방 종양 세포들로부터 얻은 조절 배지(S)와 세포 용해질(C)에 대하여 마마글로빈 C-말단(서열번호 14)에 대한 폴리클로날 항체를 사용하여 수행한 웨스턴 블롯 분석을 각각 예시하고 있다;

도 8은 글리코실화(glycosylation)를 저해하는 투니카마이신(tunicamycin)의 부재(-) 및 존재(+)하에서, 성장된 MDA-MB-415 유방 종양 세포들로부터 얻은 조절 배지(S)와 세포 용해질(C)에 대하여 항마마글로빈 폴리클로날 항체를 사용하여 수행한 웨스턴 블롯 분석을 예시하고 있으며, 이는 N-말단에 연결된 글리코실화가 억제된 세포들의 용해질 또는 배지내에는 마마글로빈 단백질이 감지될 정도로 충분하지 못함을 나타낸다;

도 9는 인간의 유방 종양 세포로부터의 세포 용해질들의 웨스턴 블롯 분석을 예시하고 있으며, 이는 효소연결된 화학발광물질(chemiluminescence)에 의해 가시화되는 항마마글로빈 폴리클로날 항체와 염소의 항토끼 항체를 사용하여 전구체 마마글로빈 단백질이 감지되는 것을 나타낸다;

도 10은 임신중 및 분만 후의 인간의 유방으로부터 얻은 분비액에 대하여 항마마글로빈 폴리클로날 항체를 사용하여 수행한 웨스턴 블롯 분석을 예시하고 있으며, 이는 증식화(proliferating)되는 마마글로빈 선(gland)에서의 분비된 마마글로빈 단백질의 감지를 나타낸다;

도 11A는 환자로부터 얻은 유방암 세포의 파라핀 고정된 단면을 항 마마글로빈 폴리클로날 항체 및 양고추냉이(horseradish) 페록시다제로 태그된 염소 항토끼 항체와, 기질로서 DAB를 사용하여 면역조직화학적으로(immunohistochemically) 염색한 칼러 표본을 예시하고 있으며, 마마글로빈 단백질을 발현하는 세포들이 갈색으로 염색된 것을 보여주고 있다.

도 11B는 환자로부터 얻은 유방암 세포의 파라핀 고정된 단면을 항 마마글로빈 폴리클로날 항체 및 양고추냉이 페록시다제로 태그된 염소 항토끼 항체와, 기질로서 DAB를 사용하여 면역조직화학적으로 염색된 흑백 표본을 나타낸 것으로, 여기에는 마마글로빈 단백질을 발현하는 세포들이 갈색으로 염색된 부분을 표시하고 있다.

도 12는 인 시튜(in situ) 상태의 순수 관 종양(ductal carcinoma)(DCIS)(도 12A, 12B), 잘 분화된 관 종양(도 12C, 12D) 및 마마글로빈 항혈청(도 12A, 12C, 12E) 또는 전 면역 항혈청(pre-immune antiserum)(도 12B, 12D, 12F)으로 면역조직화학적으로 염색된 잘 분화되지 않은 관 종양(도 12E, 12F)의 동일한 표본으로부터 얻어진 조직 절편의 마마글로빈 면역반응성을 표시하고 있다.

도 13은 일차 유방암(레인 1∼20, 27), 머리 및 목의 피부(squamous) 세포암(레인 21, 23, 24), 내막암(endometrial cancer)(레인 22), 결장의 아데노카시노마(레인 25), 방광암(billiary carcinoma)(레인 26) 및 폐의 아데노카시노마(레인 28)로부터의 조직학적으로 확인된 전이를 포함하는 림프절과, 음성 표준으로서 공지의 어떠한 종양성도 보이지 않고 있는 환자로부터 얻은 림프절 생검체(레인 29∼33)와, 양성 표준으로서, 정상 유방 조직으로부터 얻은 표본(레인 34) 유래의 RNA로서, 마마글로빈 cDNA(위 판넬) 또는 케라틴 cDNA(아래 판넬)와 혼성화된 RNA의 노던블롯(northern blot)의 사진을 나타낸다.

도 14는 말초 간세포 집합(peripheral stem cell collections)으로부터 얻어진 전이성 유방암(CA) 또는 정상 공여자(NL)를 가진 환자로부터 유래한 RNA의 RT-PCR 산물의 서던 블롯 사진을 나타낸다.

바람직한 구체예의 설명

본 발명의 한 측면은 서열번호 2(도 2)로서 동정된 유방 특이적 분비단백질인 마마글로빈을 암호화하는 서열번호 1로서 동정된 cDNA의 동정 및 서열화에 기초한 것이다. 아래에서 설명되는 바와 같이, PCR 기술을 사용하여 mRNA로부터 출발하여 이를 역전사, 증폭한 후 발현벡터내로 서브클론시켜 완전한 길이의 마마글로빈 cDNA를 분리하였다. 또한, 상기 cDNA에 의해 암호화된 단백질인 마마글로빈을 동정 및 특성화하였다.

무명의 서열 태그를 DEST002로 명명하고 이를 사용하여, 이제까지는 미지였으나 본 발명에서 마마글로빈으로서 동정된 이에 상응하는 유전자 생성물이 유방암 종양세포주 MDA-MB-415에 특히 풍부하다는 것이 증명되었다. 완전한 길이의 마마글로빈 cDNA를 분리하기 위하여, mRNA를 이 세포주로부터 역전사하고, RACE PCR 기술을 사용하여 클론하였다(Edward 등,Nucleic Acids Research 19:5227~32, 1991). 이 기술은 단일가닥 올리고데옥시리보뉴클레오티드를 단일가닥 cDNA의 3'말단에 결찰하는 방법에 기초하고 있다. 이 방법에 의한 마마글로빈 cDNA의 분리를 도 1에 도식적으로 나타내었다.

본 발명자들의 초기 연구(Watson and Fleming, 상기 논문 참조)에서, 상응하는 DEST서열(DEST002, 서열번호 6)(도 2)로부터 미리 얻은 서열정보와 이 기술에 의해 분리된 403bp 단편(서열번호 5)(도 2)으로부터 얻은 서열정보로부터 완전한 길이의 503 염기쌍(bp) cDNA 서열(서열번호 1)을 유추해내었다. 503bp cDNA 내에는 93개 아미노산(서열번호 2)(도 2)의 폴리펩타이드를 암호화하고, 분자질량이 10.5kD인 것으로 예측되는 279bp의 오픈 리딩 프레임(open reading frame)이 존재한다. 이같은 오픈 리딩 프레임의 최초 메티오닌은 거의 완전한 코작(Kozak) 공통서열내에 존재한다(Kozak,Cell 22:7~8, 1980). 이 서열의 60bp 상류는 다른 프레임 내(in-frame) 메티오닌들이나 번역 정지서열들을 포함하지 않는다. 상기 cDNA의번역되지 않은 3' 서열은 163bp로 구성되며, 폴리아데닐화 신호, AATAAA, 원래의 DEST002 서열의 프라이밍(priming) 위치의 12bp 상류를 포함한다. 이러한 데이타는 완전한 길이의 마마글로빈 cDNA가 분리되었음을 나타내는 것이다. 암호화된 폴리펩타이드의 최초 19개 잔기들이 소수성 펩타이드 신호 서열인 것으로 예측되고, 잔기 53~55 및 68~70이 공통된 N-연결된 글리코실화 위치이며, 이는 마마글로빈이 분비된 글리코 단백질이라는 것을 나타낸다.

BLAST 연산을 사용하여 Genbank에서 마마글로빈 cDNA 서열과 유사한 DNA 서열에 대해 검사하므로써(Benson 등,Nucl Acid Res 21: 2963~2965, 1993; Altschul 등,J Mol Biol 215: 403~410, 1990), 명백한 DNA 서열 동종성을 가지는 것은 발견하지 못하였다. 따라서, 마마글로빈 cDNA는 이제까지는 알려지지 않았던, 신규한 DNA 서열인 것으로 믿어진다.

마마글로빈과 관련된 서열들에 대한 다른 폴리펩타이드들을 조사하므로써, 마마글로빈과 다른 폴리펩타이드들 간의 아미노산 서열 동종성이 있음을 알아내었다. 마마글로빈은 쥐(rat)의 전립선 스테로이드 결합 단백질(프로스타테인; prostatein) 서브유니트 C3(rPSC3)(도 3)(서열번호 7)과 42%의 아미노산 동일성(58%는 보존성 치환을 포함)을 나타내었다. 쥐의 전립선 스테로이드 결합 단백질은 두개의 다른 이량성(dimeric) 서브유니트 C3/C1와 C3/C2로 이루어진 사량체 단백질로 구성된 쥐 복부(ventral) 전립선에서의 주요 분비 단백질이다(Parker 등,Ann N Y Acad. Sci 438: 115~124; Parker등,J Steroid Biochem 20:67~71, 1984). 상기 C1, C2 및 C3 유전자들은 모두 약 6 kD의 분비 단백질을 암호화하고, 유전자복제로부터 생성되는 것으로 추정되나, C1과 C2 유전자들은 서로 동종성이 강한 반면, C3 유전자와는 별로 유사하지 않다. 따라서, 마마글로빈은 C1 또는 C2 단백질과는 서열 동종성을 나타내지 않는다.

위에서 설명한 바와 같이, 전립선 스테로이드 결합 단백질(프로스타테인)은 쥐 복부 전립선에서의 주요 분비 단백질이며, 이의 발현은 안드로겐(androgenic) 스테로이드에 의해 조절된다(Parker 등,Ann N Y Acad Sci 438:115~24, 1984; Parker 등,J Steroid Biochem, 20: 60~71, 1984). 다른 단백질로, 인간의 에스트라무스틴(estramustin) 결합 단백질(hEMBP)은 인간의 전립선, 인간의 유방암 및 인간의 악성 흑색종(melanoma)에서 발현되는 것으로 보고되었다(Bjork 등,Cancer Res. 42:1935~1942, 1982; Bjork 등,Anticancer Res 11: 1173~82, 1991). 인간의 에스트라무스틴 결합 단백질은 쥐의 스테로이드 결합 단백질인 프로스타테인과 동일할 것으로 가정되어온 쥐의 에스트라무스틴 결합 단백질과 면역화학적으로 유사하였다. 상기에서 설명한 바와 같이, 마마글로빈의 아미노산 서열은 프로스타테인의 C3 서브유니트와 42%의 아미노산 동일성을 나타내었고, 보존성 치환을 포함하여 58%의 동종성을 나타내었다. 따라서, 마마글로빈은 어떤면에서는 hEMBP과 관련된 것일 수 있다. 그러나, 프로스타테인과 hEMBP은 모두 전립선 내에서 감지되지만, 마마글로빈 mRNA는 이 조직내에서는 전혀 존재하지 않는다. 따라서, 마마글로빈은 hEMBP와 동일한 단백질도 아니고 이의 서브유니트도 아니며, 또한 상기 hEMBP 서열은 아직 결정되지 않아서 마마글로빈이 hEMBP의 일부 단편 또는 서브유니트와 어떠한 유사성이라도 있는지는 알려지지 않았다.

최근의 연구들은 SV40 T 항원에 융합된 rPSC3 프로모터가 형질전환 마우스들에서 전립선 및 유방 암종을 생성하는 것을 설명하고 있으나(Maroulakou 등,Proc Nat Acad Sci U.S. 91:11236~11240, 1994; Sandmoller 등,Oncogene 9:2805~2815, 1994), 이 단백질의 진정한 생물학적 기능은 알려지지 않았다. 또한, 쥐 전립선 스테로이드 결합단백질과 인간 EMBP의 관계에 대한 가설에도 불구하고, rPSC3에 상응하는 인간 폴리펩타이드 또는 인간 유전자는 동정된 바가 없다. 따라서, 마마글로빈과 마마글로빈을 암호화하는 cDNA는 이제까지는 알려지지 않았던 신규한 서열을 나타내는 것이다.

매뉴얼 정렬(manual alignment)을 사용하여, 마마글로빈과 rPSC3 단백질 서열 모두에 대해 보다 낮은 BLAST 값을 가진 다른 서열들을 이용한 인간 클라라 세포 10kD 단백질(hCC10)(서열번호 8)(Peri 등,J Clin Invest 92: 2099~2109, 1993)(도 3) 및 토끼와 마우스의 우테로글로빈 단백질들(Miele 등,Endocrine Rev 8:474~90, 1987; Cato와 Beato,Anticancer Res 5:65~72, 1985; Miele 등,J Endocrinol Invest 17:679~692, 1994)과의 다른 동종성도 동정하였다. 이들 동종성은 종에 따라 다르지만 동일성 26% 또는 보존성 치환을 포함하여 40%였다. 특히, 우테로글로빈 서브유니트들간의 디설파이드 결합을 형성시키는 역할을 하는 것으로 알려진 Cys-3과 Cys-69를 포함하여, 많은 아미노산들이 모든 단백질들 중에서 완전하게 보존되었다(아래참조). 이러한 동종성은 마마글로빈이 상피세포들에 의해 분비되는 단백질 소그룹의 새로운 구성원임을 제시하는 것이다(Miele 등, 1994, 상기 논문참조).

hCC10 유전자는 토끼와 마우스의 우테로글로빈 유전자들에 대한 인간의 상동유전자(homologue)이다(Peri 등,J Clin Invest 92:2099~2109, 1993). 우테로글로빈은 원래 토끼의 자궁내 분비 단백질로서 특성화되었으나, 폐, 유방 및 전립선을 포함한 다른 상피기관들에서도 발견되어 왔다. 쥐의 프로스타테인과는 달리, 우테로글로빈은 보존된 잔기들 Cys-2와 Cys-69에 있는 두개의 디설파이드 결합에 의해 짝을 이룬 호모다이머성(homodimeric) 단백질이다(Miele 등, 1994, 상기 논문참조). 우테로글로빈 유전자의 전사는 스테로이드 호르몬에 의해 조절되지만, 황체호르몬(progesterone) 또는 다른 스테로이드 호르몬에 결합하는 단백질 자체의 능력은 아직 논의되고 있으며, 이 단백질의 진정한 생물학적 기능은 알려지지 않았다(Miele 등, 1994, 상기 논문참조).

마마글로빈의 발현은 유방선에 제한된다. 이는 rPSC3가 쥐의 복부 전립선내에서 발현되고(Parker 등,Ann N Y Acad Sci 438:115~1124, 1984), 폐, 자궁, 전립선 및 유방을 포함하여 다수의 조직들 내에서 hCC10/우테로글로빈의 발현이 관찰되는 것과는 대조적이다(Miele 등, 1987, 상기 논문참조; Cato와 Beato, 상기 논문참조; Miele 등, 1994, 상기 논문참조). 마마글로빈과 이들 단백질들 사이의 서열 동종성으로 인하여, 조직 특이적 발현의 패턴을 결정했다.

500bp 마마글로빈 mRNA는 종양표본 2410(이 조직으로부터 최초의 서열태그를 분리하였음)에서 쉽게 감지되었으며, 정상적인 인간 유방조직 내에서는 상당히 적은 양으로 감지되었다(도 4A). 마마글로빈 mRNA는 불사화된 유방 상피세포주 B5-589에서는 감지되지 않았다. 또한, 마마글로빈의 발현은 인간의 자궁과 폐, 즉 우테로글로빈이 발현되는 두 위치에서는 검출되지 않았다.

RT/PCR을 사용한 증폭으로 종양 2410과 정상 유방조직 모두에서 마마글로빈 mRNA가 검출되었으나, 정상적으로 rPSC3과 우테로글로빈을 발현하는 조직들(폐, 자궁, 전립선)과, 호르몬에 감응성인 스테로이드 분비성 조직들(난소, 정소, 태반) 및 다른 분비성 상피기관(결장)을 포함한 15개의 다른 조직들에서는 검출되지 않았다. 따라서, 마마글로빈 mRNA의 발현은 비교적 유방조직에 특이적인 것이다.

마마글로빈 발현의 유방 특이적인 성질을 분명하게 입증하기 위하여, 전장 마마글로빈 cDNA가 아래의 실시예 2A에 기술된 바와 같은 성인 및 인간 태아 조직의 혼합 집합(pooled populations)으로부터 polyA를 사용하여 선발된 mRNA의 보다 광범위하고 정량적인 판넬에서 마마글로빈 mRNA용 탐침으로 사용된다. 마마글로빈 mRNA 발현은 침샘과 같은 다른 아주 밀접하게 관련된 아포크린샘에는 전혀 없는 것으로, 말초(peripheral) 백혈구, 림프절 및 골수에서도 또한 감지되지 않는 것이다. 유샘(mammary gland)을 제외하고, 마마글로빈 mRNA는 검사된 다른 43 개의 성인 조직 또는 7 개의 태아 조직에서는 감지되지 않았다. 이는 마마글로빈 유전자 발현은 유방암에 대한 아주 특이적인 표지(marker)가 될 수 있다는 것을 확인해주는 것이다.

이러한 연구내용을 기초로 하여 보았을 때, 마마글로빈은 비교적 유방 특이적인 단백질이다. 유방 암종에서 과발현되는 것으로 알려진 두개의 다른 유전자들로는 erb-B와 cyclin D가 있다(Jardines 등,Pathobiology 61:268~282.1994; Keyomars와 Pardee,Proc Nat Acad Sci, U.S. 90:1112~1116, 1993). erb-B 또는cyclin D의 과발현과는 달리, 마마글로빈의 과발현은 일반적으로 성장성이나 분열속도의 증가보다는 유방 상피세포에 보다 특이적인 변화를 유발하는 것 같다. 이와 같이, 마마글로빈 유전자 조절이상이 나타나는 것은 종양의 치료 취약성 또는 임상과정에 보다 특이적인 의미를 가질 수 있다.

미국 특허 제5,668,267호에서 보고된 바와 같이, 마마글로빈 mRNA의 과발현은 다른 조직형의 15개 I기 일차 유방암 중 4개(27%)에서 뿐만 아니라 2410 종양 표본에서의 노던 블롯 혼성화에 의하여 감지되었다. 이러한 백분율은 erb-B 증폭 및 p53 돌연변이(Slamon 등,Sci244:707∼712, 1989; Thor 등,J Nat′l Cancer Inst84:845∼855, 1992)와 같은 다른 유전적 변화가 만연하는 것에 비교되는 것이다. 더욱이, 여기서는 1기 종양에 대한 분석으로 제한된 것이기 때문에, 마마글로빈의 과발현은 이 종양 서브그룹(subgroup)에서 보고된 어떠한 다른 유전적 변이 보다 더 실제적으로 만연해 있을 수 있다(Alllerd 등, J Nat′l Cancer Inst 85:200∼206, 1993). 이러한 데이터는 마마글로빈의 과발현은 단일 종양 표본에 독특한 것은 아니고, 사실 일차 유방암 중에서는 상대적으로 빈번한 것이다. 더욱이, 조사된 모든 종양이 1단계라는 사실은 이 이상조절(dysregulation)은 유방 종양(neoplasia)의 진행 중 상대적으로 조기에 일어난다는 것을 암시한다.

단일단계 RT/PCR 분석에 의해 수행할 수 있는 수준의 감도로는 정상적인 림프절 또는 말초림프구에서의 마마글로빈의 발현은 감지되지 않았다. 그러나, 아래에 보고한 바와 같이, 마마글로빈 mRNA는 전이성 유방암을 가진 환자로부터 유래한 림프절의 40% 이상 및 말초 혈액 간세포 집합(PBSCs)의 60%에서 감지되었다. 다른상피 특이적 유전자들의 경우에 제시되어온 바와 같이, 이러한 결과는 말초 임파절및 혈액 간세포에서의 마마글로빈 전사체의 분석이 미지의 유방암 전이를 감지하는데 유용할 것이라는 것을 나타내는 것이다(Schoenfeld 등,Cancer Res. 54:2986~2990, 1994).

마마글로빈 cDNA가 번역가능한 단백질을 암호화하는 것을 설명하기 위하여, 상기 cDNA 클론을 시험관내 번역 분석에서 사용하였다. 도 5는 마마글로빈 cDNA로 프로그램된 토끼의 망상적혈구 용해질로부터의 단백질 생성물을 보여주는 것이다. 마마글로빈 cDNA를 사용하여 약 6kD 단백질을 생성시켰다. 겉보기 분자량은 오픈리딩 프레임의 개념적 번역으로부터 예측하였던 것보다는 더 작았으나, 이러한 결과는 토끼 및 인간의 우테로글로빈 번역 생성물에서 일반적으로 관찰된다.

유방암에서의 마마글로빈 단백질 발현의 우세(prevalence)를 조사하기 위하여, C-말단 마마글로빈 단백질 서열에 해당하는 펩티드에 대한 토끼 폴리클로날 항-마마글로빈 항체가 생성되었고, 복수 등급(multiple grades)의 100개의 일차 유방암 및 면역조직화학적 분석에 의하여 마마글로빈 단백질 발현에 적합한 조직형을 조사하기 위하여 사용되었다. 아래 표1에 요약된 바와 같이, 이들 종양의 80% 이상이 마마글로빈 단백질에 대하여 강하게 면역학적 양성(immunopositive)을 나타내었고 염색은 종양 등급에 무관하였다. 이 결과는 임상 검체에서의 마마글로빈 단백질의 감지는 일차 유방암에 대한 민감하고 특이적인 표지로서 사용될 수 있다는 것을 나타낸다.

본 발명자들은 마마글로빈이 분비된 단백질이라고 믿으며, 따라서 이 단백질의 존재는 이 유전자 생성물을 과발현하는 종양을 가진 환자들의 혈청내에서 감지될 수 있을 것으로 예측된다. 이와같이, 마마글로빈은 전립선 특이적 항원(PSA)으로서 임상적으로 유용할 수 있으며, 유방암 환자들에 처리하기 위한 다른 고형종양 마커로서도 유용할 수 있다(진단병리학에서 종양마커,Clin Lab Med 10:1~250, 1990).

유방암 마커로서의 마마글로빈의 동정은 본 발명의 다른 측면에 대한 토대를 제공하며, 이는 환자에서 유방암의 존재를 감지하는 방법을 포함한다.

유방종양 질환의 감지 측면에서 사용된 용어 "감지(detection)"는 환자에서 유방암 존재의 결정, 다른 질병과 유방암의 구별, 질병의 가능한 결과 측면에서 예후의 평가 및 회복에 대한 전망, 질병상태 또는 질병의 재발에 대한 모니터링, 환자를 위한 바람직한 치료섭생의 결정과 항암 치료를 표적화하는 것을 포함하는 의미에서 사용되었다.

하나의 유방암 감지방법은 폴리뉴클레오티드를 유방 종양세포들로부터의 mRNA에 혼성화하는 것을 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드에는 서열번호 15의 상보체(complement) 또는 서열번호 15의 상보체의 유도체가 포함된다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 폴리뉴클레오티드에는 DNA 및/또는 RNA가 포함되며, 따라서 DNA 서열로서 서열목록에 언급된 뉴클레오티드 서열에는 또한 티민 잔기가 우라실로 치환된 동일한 RNA 서열이 포함된다. 뉴클레오티드 서열의 유도체는, 그것이 유도된 서열이 유방암 유래의 마마글로빈 mRNA에 특이적으로 혼성화되도록 하는 동일한 엄격한 조건하에서 유방암 세포로부터 유래한 마마글로빈 mRNA에 특이적으로 혼성화시키기 위하여 유도된 서열에 대하여 충분한 서열 동일성을 가진다. 상기 유도된 뉴클레오티드 서열은 반드시 물리적으로 상기 뉴클레오티드 서열로부터 유도될 필요는 없으나, 예를 들면, 화학적 합성 또는 DNA 복제 또는 역전사 또는 전사를 포함하는 어떠한 방법에 따라 생성될 수 있다. 바람직한 유도체 뉴클레오티드 서열에는 서열번호 15의 상보체의 단편 및 서열번호 15에 개시된 마마글로빈 코딩 서열의 대립형질적 변형체의 상보체와 동일한 서열이 포함된다.

유방암 감지 시스템에서 mRNA를 암호화하는 마마글로빈의 존재를 감지하기 위하여, 환자로부터 시료를 얻는다. 시료는 조직 생검 시료 또는 혈액, 혈장, 혈청 등의 시료일 수 있다. 시료안에 포함된 핵산을 추출하기 위해 시료를 처리할 수 있다. 시료로부터 얻어진 핵산은 겔 전기영동법 또는 다른 크기 선별분리기술로 처리된다.

감지는 상기 핵산 및 검체 중의 상기 mRNA를 혼성화 복식체(hybridization duplex)를 형성시키기 위한 상기 폴리뉴클레오티드 탐침(probe)과 접촉시키는 것과 관련된다. 용어 "프로우브(probe)"는 목표(target) 영역내의 서열에 대해 상보적인 프로우브 서열로 인하여, 목표서열과 함께 혼성구조체를 형성하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 구조체를 뜻한다.

결과적으로 생성된 복식체의 감지는 어떤 주지의 방법에 의하여 수행될 수 있다. 선택적으로, 상기 프로우브는 표지되지 않을 수도 있지만, 직접 또는 간접적으로, 표지된 리간드와의 특이적인 결합에 의해 감지될 수 있다. 프로우브와 리간드를 표지하는 방법 및 적합한 표지들은 당 기술분야에서 잘 알려져 있으며 예로서, 공지된 방법들(예, 닉(nick) 번역 또는 키나아제 처리), 비오틴, 형광성 작용기, 화학발광성 작용기(예, 디옥세탄(dioxetanes), 특히 트리거된(triggered) 디옥세탄), 효소, 항체 등에 의하여 도입되어질 수 있는 방사성 표지를 포함한다.

마마글로빈 cDNA를 프로우브로서 사용하는 경우, 잘못된 양성반응을 방지하기 위하여 매우 엄격한 조건들이 사용될 수 있다. 마마글로빈 코딩 서열의 상보체로부터 유도된 서열을 포함하는 프로우브의 경우에는 덜 엄격한 조건이 사용될 수 있다. 혼성화의 엄격한 정도는 혼성 및 세척단계 동안의 온도, 이온강도, 시간 및 포름아미드의 농도를 포함한 많은 요인들에 의해 결정되어진다. 이러한 요인들은 예로서, Sambrook 등에 개략적으로 설명되어 있다(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 판, 1989).

시료에서 마마글로빈 mRNA의 감지감도를 높이기 위하여, 마마글로빈을 암호화하는 mRNA로부터 전사되는 cDNA를 증폭하는데 역전사/중합연쇄반응(RT/PCR) 기술이 사용될 수 있다. 상기 RT/PCR 방법은 당 기술분야에서 잘 알려져 있다(예, Watson and Fleming, 상기 논문 참조). 증폭 프라이머로서 유용한 올리고뉴클레오티드에서는 서열번호 3 및 서열번호 4가 포함된다. 바람직하기로는, 상기 마마글로빈 포워드 증폭 프라이머는 5′-AGCACTGCTACGCAGGCTCT-3′(서열번호 16)로 구성되고, 상기 마마글로빈 러버스 증폭 프라이머는 5′-ATAAGAAAGAGAAGGTGTGG-3′(서열번호 4)로 구성된다.

다른 방법으로는, 역전사된 cDNA 내의 마마글로빈 목표 서열은 갭 LCR(G-LCR) 및 다른 변형 방법을 포함한 리가제 연쇄 반응(ligase chain reaction) 방법또는 자가 유지 서열 복제(self-sustained sequence replication)(3SR) 및 그 다양한 변형들과 같은 다른 주지의 방법을 사용하여 증폭되거나 감지될 수 있다. 더욱이, 상기 마마글로빈 mRNA는 비대칭 갭 LCR(AG-LCR)에 의해 직접적으로 감지될 수 있다. 예를 들면, Molecular Biology and Biotechnology, R.A. Myers, ed., pp.463∼466, VCH 출판사, 1995의 Leckie 등의 " Infectious Disease Testing by Ligase Chain Reaction" 참조.

본 발명의 또다른 구체예에 있어서, 마마글로빈 cDNA 서열 또는 이의 유도체는 유방암 환자로부터의 표본내에 있는 마마글로빈 유전자의 어떤 변화(즉, 유전자 재배열, 유전자 증폭 또는 유전자 결실)를 특징화하기 위하여 사용될 수 있다. 이는 온전한 mRNA를 포함하지 않은 환자의 표본 또는 시료들도 유전자 구조에서의 변화에 대해 시험될 수 있는 방법을 제공한다.

본 기술의 제 1의 적용에 있어서, 마마글로빈 cDNA 서열 또는 이의 유도체는 환자의 종양, 정상조직, 또는 림프구로부터 분리되어진 환자의 게놈의 DNA에 혼성화되고, 하나 또는 그 이상의 제한 엔도뉴클라아제로 소화되어진다. 당 기술분야에서 잘 알려진, 서던 블롯 방법을 사용하여 환자 또는 환자의 유방암 종양이 결실, 재배열 또는 증폭된 마마글로빈 유전자를 가지는지의 여부를 확인할 수 있다. 이러한 변화들의 감지는 예후의 예측 및 환자의 관리에 유용한 중요한 정보를 제공할 수 있다.

본 기술의 제 2의 적용에 있어서, 마마글로빈 cDNA 서열 또는 이의 유도체를 기초로 한 하나 또는 그 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍들이 환자의 시료로부터 얻은 마마글로빈 유전자의 절편을 증폭하기 위하여 폴리머라아제 연쇄반응에 사용될 수 있다. 결과의 PCR 생성물들을 분석하므로써 마마글로빈 유전자의 특정한 절편이 결실되었거나 재배열되었는지의 여부를 알아낸다. 이러한 정보는 예후 및 환자의 관리에 유용한 정보이다.

유방암을 감지하는 또다른 방법은 환자로부터 얻은 시료에서 마마글로빈 폴리펩타이드의 전구체 및/또는 분비형의 존재를 감지하는 것을 포함한다. 당 기술분야에서 알려진 단백질을 감지해내는 어떤 방법도 사용될 수 있다. 이러한 방법은 이에 제한되지는 않지만, 면역확산, 면역전기영동, 면역화학적 방법, 결합(binder) 리간드 분석, 면역조직화학적 기술, 응집(agglutination) 및 보체 분석을 포함한다(예로서,Basic and Clinical Immunology,Sites and Terr, eds., Appleton & Lange, Norwalk, Conn. pp 217~262, 1991). 항체들을 마마글로빈의 한 에피토프 또는 복수의 에피토프와 반응시키고, 표지된 마마글로빈 폴리펩타이드 또는 이의 유도체로 경쟁적으로 치환시키는 것을 포함하는 결합 리간드 면역분석방법들이 바람직하다.

여기에서 사용된 용어 "마마글로빈 폴리펩타이드"는 글리코실화되지 않은 전구체형 및 글리코실화된 전구체 형들 및 글리코실화된 분비형, 이들의 유도체들 및 단편들을 포함하는 자연적으로 발생되는 마마글로빈을 의미한다. 상기 자연적으로 발생된다는 의미는 자연적인 공급원, 예로서 정상의 유기체들 및/또는 병든 유기체들로부터 분리되어지며, 인간에 의해 의도적으로 변형되지 않은 폴리펩타이드를 의미한다. 본 명세서에서 정의된 자연적으로 발생되는 마마글로빈 폴리펩타이드에는서열번호 2를 포함하는 전구체 형태 및 서열번호 17(서열번호 2의 아미노산 20∼93)을 포함하는 분비된 형태가 포함된다. 서열번호 2의 대립형질적 변형체들은 또한 자연적으로 발생되는 마마글로빈 폴리펩타이드의 범위 내에 포함된다는 것을 의도한 것이다.

마마글로빈 폴리펩타이드의 유도체는 자연적으로 발생되는 마마글로빈의 일부와 실질적인 동일성을 갖는 최소 10개 아미노산의 절편을 포함하는 폴리펩타이드를 의미하고자 하는 것이다. 실질적인 동일성을 갖는 절편은 바람직하게는 적어도 약 20개의 아미노산, 보다 바람직하기로는 적어도 약 50개의 아미노산, 그리고 가장 바람직하기로는 적어도 75개의 아미노산을 가지는 것이다. 두 폴리펩타이드가 간격 벌칙(gap penalties)과 다른 인자들에 대한 디볼트 세팅(default settings)을 사용한 BLAST와 같은 서열배열 프로그램들에 의한 최적배열인 경우 실질적인 동일성을 가지며, 이들은 적어도 80%의 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 90%의 서열 동일성, 더 바람직하게는 적어도 95% 서열 동일성, 가장 바람직하기로는 99%의 서열 동일성을 가지는 것이다. 바람직하게는, 동일하지 않은 잔기 위치들은 보존적 아미노산 치환들에 의해 구별된다.

보존적 아미노산 치환은 유사한 측쇄를 가지는 잔기들의 교환 가능성을 의미한다. 예로서, 지방족 측쇄들을 갖는 아미노산 그룹은 글리신, 알라닌, 발린, 로이신, 이소로이신이며; 지방족-히드록실 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 세린과 트레오닌; 아미드를 포함하는 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 아스파라긴과 글루타민; 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 페닐알라닌, 티로신과 트립토판; 황을 포함하는측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 시스테인과 메티오닌이다. 바람직한 보존적 아미노산 치환 그룹들은: 발린-로이신-이소로이신, 페닐알라닌-티로신, 리신-아르기닌, 알라닌-발린 및 아스파라긴-글루타민이다.

마마글로빈 폴리펩타이드 유도체는 바람직하게는 자연적으로 발생되는 마마글로빈 또는 이의 단편들에 특이적인 모노클로날 또는 폴리클로날의 항마마글로빈 항체와 교차 반응(cross-react)할 것이다.

여기서 사용된 용어 "단편(fragment)"과 "펩타이드"는 완전한 길이의 마마글로빈 cDNA(예, 서열번호 1)로부터 유도된 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 가지는 마마글로빈 폴리펩타이드를 의미하지만, 아미노 말단 및/또는 카르복시 말단 결실이 있는 것이다. 통상적으로, 마마글로빈 단편들 또는 펩타이드들은 적어도 3개의 아미노산 길이를 갖는다. 바람직하게는, 마마글로빈 단편 또는 펩타이드는 길이가 적어도 6개 아미노산 잔기이며, 보다 바람직하기로는 약 12개 아미노산 잔기, 보다 더 바람직하기로는 25개 아미노산 잔기, 그리고 가장 바람직하기로는 50개 또는 그 이상의 아미노산 잔기이다.

다양한 경쟁적 및 비경쟁적 단백질 결합 면역 분석방법들이 당 기술분야에 잘 알려져 있다. 이러한 분석에 사용되어지는 항체들은 예로서, 응집 시험에서 사용되어지는 것과 같이 표지되지 않거나 또는 여러 분석방법들에 광범위하게 사용되기 위하여 표지되어질 수 있다. 사용될 수 있는 표지들은 방사성 핵종(radionuclides), 효소, 형광제(fluorescers), 화학발광제, 효소 기질 또는 보조 인자, 효소 억제제, 입자, 염료 및 방사면역측정법(RIA), 예로서 효소 결합항체법(ELISA)와 같은 효소면역측정법, 형광면역측정법 등에 사용되는 것들을 포함한다.

B 세포 에피토프를 포함하는 마마글로빈 폴리펩타이드에 대한 폴리클로날 또는 모노클로날 항체들은 면역분석방법에 사용하기 위하여 당 기술분야에서 알려진 많은 방법들에 의해 제조될 수 있다. 여기서 사용된 용어 "B 세포 에피토프"는 마마글로빈 폴리펩타이드의 항원성 결정인자를 의미한다. B 세포 에피토프는 에피토프에 특이적인 공간 구조의 3개의 아미노산들을 포함한다. 일반적으로, B 세포 에피토프는 이러한 아미노산들을 적어도 5개 포함한다. 아미노산들의 공간구조를 결정하는 방법들은 당 기술분야에 잘 알려져 있으며, 예로서, X선 결정학 및 이차원적 핵자기 공명을 포함한다.

한 단백질에 대한 항체들을 제조하는 한 방법은 그 단백질 전부 또는 일부의 아미노산 서열을 선별, 제조하여 그 서열을 화학적으로 합성한후 적합한 동물, 일반적으로 토끼나 마우스에 주입하는 것이다.

마마글로빈 폴리펩타이드의 제조방법은 이에 제한되지는 않지만 화학적 합성, 재조합 DNA 기술 또는 생물학적 시료들로부터의 분리를 포함한다. 에피토프를 포함하는 펩타이드의 화학적 합성은 예로서, 고전적인 메리펠드(Merrifeld) 고체 펩타이드 합성방법(Merrifeld,J Am Chem Soc 85:2149, 1963) 또는 신속 자동화된 다중 펩타이드 합성 시스템에서의 FMOC 방법(DuPont Company, Wilmington, DE)(Caprino and Han,J Org Chem 37:3404, 1972)에 의해 수행될 수 있다.

폴리클로날 항체들은 항원을 슬와근(popliteal) 림프절에 주입하여 토끼에면역을 형성시키고, 항원을 2주후 복강내(intraperitoneal) 주입하여 연이은 급속한 상승상태(boost)를 만드므로써 제조할 수 있다. 상기 동물들에서 피를 뽑아 일반적으로 ELISA 방법에 의해 순수한 마마글로빈 단백질에 대해 혈청을 분석한다.

모노클로날 항체들은 골수종(myeloma) 또는 림프종(lymphoma) 세포들과 같은 종양세포들을 연속적으로 복제하여 면역형성된 마우스들로부터 얻은 비세포(splenocytes)들을 융합하므로써 밀스테인(Milstein)과 코흘러(Kohler)의 방법을 따라 제조될 수 있다(Milstein and KohlerNature 256:495~497, 1975; Gulfre and Milstein,Methods in Enzymology: Immunochemical Techniques73:1~46, Langone and Banatis eds., Academic Press, 1981). 이렇게 생성된 하이브리도마(hybridoma) 세포들을 제한희석법(limiting dilution)에 의해 클론시키고 상등액은 ELISA나 RIA 방법으로써 항체생성에 대해 분석한다.

상기와 같이 제조된 마마글로빈에 대한 폴리클로날 또는 모노클로날 항체들은 마마글로빈을 발현하는 세포들로부터 얻은 마마글로빈의 전구체 또는 분비형들을 분리, 정제하는데 사용될 수 있다. 예로서, 아래 나타낸 바와 같이, 마마글로빈 cDNA로부터 예측되는 16개의 C-말단 아미노산들(Glu-Val-Phe-Met-Gln-Leu-Ile-Tyr-Asp-Ser-Ser-Leu-Cys-Asp-Leu-Phe, 서열번호 14)에 대해 생성된 폴리클로날 항체는 시험관내 번역 시스템에서 합성된 마마글로빈 뿐만 아니라 마마글로빈의 전구체와 분비형들에도 결합한다. 항마마글로빈 항체를 사용한 마마글로빈의 분리는 당 기술분야에서 잘 알려진 방법들, 예로서 친화성 크로마토그래피를 사용하여 수행될 수 있다.

종양세포에 의해 발현된 표적항원들을 인식하고 특이적으로 결합하는 항체들의 독특한 능력은 암치료에 있어 새로운 접근방법을 제공하는 것이다(LoBuglio and Saleh,Am J Med Sci 304:214~224, 1992; Bagshawe,Adv Pharmacol 24:99~121, 1993). 따라서, 본 발명의 또다른 측면은 유방암 세포들에 의해 과발현되는 것으로 밝혀진 마마글로빈에 대한 항체들을 사용하는 것에 기초하여 동물에서의 유방암 발생예방 및 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

마마글로빈에 특이적인 폴리클로날 또는 모노클로날 항체들은 당 기술분야에서 알려진 어떤 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 예로서, 쥐 또는 인간의 모노클로날 항체들은 하이브리도마 기술에 의해 제조될 수 있다. 선택적으로, 마마글로빈 또는 면역학적으로 활성인 이의 유도체나 단편, 또는 항유전형(anti-idiotype) 항체 또는 이의 단편이 마마글로빈을 발현하는 세포들의 인식이 가능한 항체들의 B세포 생성을 제거하기 위해 동물에 투입될 수 있다.

그리하여 제조된 항체들 또는 이들의 단편들을 방사성 핵종, 독소, 또는 세포독성 약물과 같은 하나 또는 그 이상의 종양세포 붕괴(oncolytic)물질들로 표지하고, 유방암이 있는 것으로 의심되는 환자에게 투여한다. 유방암 세포에 의해 과발현되는 마마글로빈에 표지된 항체가 결합되면 유방암 세포는 사멸될 것이다.

당 기술분야에서 알려진 다양한 종양세포 붕괴물질들중 어떤 것도 이러한 표지된 항체들을 제조하는데 사용될 수 있다. 예로서, 식물과 미생물의 독소를 항체에 결합시키므로써 면역독소를 제조할 수 있다. 이러한 독소들은 예로서, 리신(ricin), 디프테리아 독소 및 슈도모나스(Pseudomonas) 균체외 독소(exotoxin)A를 포함한다. 또한 화학적 치료물질들을 항체에 결합시키므로써 약물-항체 결합체들을 제조할 수 있다. 이러한 용도에 적합한 화학적 치료물질들은 예로서, 토목시펜(tomoxifen), 독소루비신(doxorubicin), 메토트렉세이트(methotrexate), 클로람부실(chlorambucil), 빈카(Vinca) 알칼로이드류 및 마이토마이신(mitomycin)을 포함한다. 또한, 방사성 면역 결합체(radioimmunoconjugate)들은 방사성 핵종을 항체에 안정되게 연결시키므로써 제조될 수 있다. 방사성 면역 결합체들을 제조하는데 적합한 방사성 핵종들은 예로서,¹³¹I,¹⁸⁸Re,¹⁸⁶Re,⁶⁷Cu,⁹⁰Y와⁴⁷Sc와 같은 β-방사체들;²¹¹At,²¹²Bi와²¹²Pb와 같은 α-방사체들;¹²⁵I와⁷⁷Br과 같은 오거(auger) 전자 방사체들; 및¹⁰B와 같은 분열가능한 핵종들을 포함한다.

상당한 비율의 유방종양들이 마마글로빈 단백질을 발현한다는 발견은 본 발명의 또다른 측면으로, 이는 마마글로빈 항원들로 마마글로빈 특이적인 B 및/또는 T 세포 림프구들(T_c)을 활성화시키는 것을 포함한다. 따라서, 본 발명은 마마글로빈 B 세포 항원과 T_c세포 항원들; 마마글로빈을 발현하는 종양들에 대한 항체 매개된 및/또는 세포 매개된 면역반응을 유도하기 위해서 적어도 하나의 B 세포 마마글로빈 항원 및/또는 적어도 하나의 T_c세포 마마글로빈 항원을 포함하는 백신들, 그리고 마마글로빈을 발현하는 종양을 지닌 유방암 환자를 치료하는 방법들을 제공한다. 본 발명에 따른 한 방법은 환자에게 활성화된 마마글로빈 특이적인 림프구들을 투여하는 것을 포함한다. 또다른 방법은 환자에게 마마글로빈 특이적인 백신을 투여하는 것을 포함한다.

여기에서 사용된 "마마글로빈 항원"이라는 용어는 마마글로빈 특이적인 B 세포 또는 T_c세포에 의해 인식되는 B 세포 또는 T_c세포 에피토프를 포함하는 자연적으로 발생되는 마마글로빈 폴리펩타이드 및 이들의 유도체들과 단편들을 포함한다.

마마글로빈 B 세포 항원은 마마글로빈 특이적인 B 세포 에피토프와 T_H세포 에피토프를 포함한다. 상기 용어 "B 세포 에피토프"는 B 세포상에 있는 항마마글로빈 면역글로불린 수용체들에 의해 인식되고, 동물에 투여되었을 경우 T_H세포들로부터 적절한 도움을 받아 항체 생성을 유도해 낼 수 있는 어떤 항원, 합텐(hapten), 에피토프 또는 항원성 결정인자를 의미하는 것이다. B 세포 에피토프는 적어도 4개 아미노산의 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 상기 B 세포 에피토프는 적어도 6~25개의 아미노산 길이를 가지며, 보다 바람직하게는 약 15~22개의 아미노산 길이를 가진다. B 세포 에피토프의 아미노산 서열구성은 자연적으로 발생되는 마마글로빈의 단편에 존재하는 연속된 아미노산 서열과 동일하거나 실질적으로 동일할 수 있다. 선택적으로, B 세포 에피토프의 아미노산 서열구성은 마마글로빈의 결집된 국소해부적 결정인자를 나타내는 불연속적인 아미노산 서열과 동일하거나 실질적으로 동일하다.

상기 용어 "T_H세포 에피토프"는 MHC 클래스 Ⅱ 분자들과 결합되므로써 T 보조세포들에 의해 인식되는 어떤 항원성 결정인자를 의미한다. T 보조세포들의 활성화는 휴지상태(resting)의 마마글로빈 특이적인 B 세포들의 보다 높은 친화력의IgG-분비 세포들로의 분화(differentiation), 즉 이차 항체 응답반응을 유도한다. T 세포의 보조로 보다 높은 역가를 지닌 특이적인 항체생성 B 세포들을 제조하기 위하여 B 및 T_H세포 결정인자들을 포함한 면역유전성(immunogenic) 펩타이드들의 제조 및 이용은 당 기술 분야에서 잘 알려져 있으며, 예로서 Cheronis 등, 미국특허 제 5,573,916, Denton 등,Cancer Letters 70:143~150(1993), Borras-Cuesta 등,Eur. J. Immunol. 17, 1213~1215(1987), 및 Good 등,Science235:1059~1062(1987)이 있다. 상기 T_H세포 에피토프는 마마글로빈 또는 이형의 단백질로부터의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예로서, Denton 등은 공지된 보조 T 세포 결정인자인 인플루엔자 헤마글루티닌 A/X-31의 서열 111~120에 연결되는 MUC-1 뮤신의 중심에 있는 B 세포 결정인자 영역을 포함하는 합성 펩타이드로 면역된 쥐들에서, 분비 상피에서 발현되고 유방 및 다른 암종과 관련된 복합 글리코단백질인 뮤신(mucins)에 대한 항체 응답반응의 유도를 설명하였다. T_H세포 에피토프는 약 6~약 20개의 아미노산 잔기들, 바람직하게는 약 8~18 아미노산 잔기들, 보다 더 바람직하게는 9~15 잔기들로 이루어진 아미노산 서열을 포함한다.

마마글로빈 T_c세포 항원은 T_c세포 에피토프와 MHC 클래스 I 아그리토프(agretope)를 포함한다. 상기 용어 "T_c세포 에피토프"는 항원이 존재하는 세포의 표면에 있는 MHC 클래스 I 분자에 의해 제공되는 마마글로빈 특이적인 T_c세포들에 의해 인식되는 어떤 항원, 에피토프 또는 항원성 결정인자를 의미한다.상기 용어 "MHC 클래스 I 아그리토프"는 항원이 존재하는 세포(APC)상에서 MHC 클래스 I 분자에 의해 마마글로빈 항원이 마마글로빈 특이적인 Tc 세포에 제공되어지도록 하는, MHC 클래스 I 분자에 의해 인식되는 어떤 아미노산 서열을 의미한다. 상기 T_c세포 에피토프와 MHC 클래스 I 아그리토프는 자연적으로 발생되는 마마글로빈 단편의 아미노산 서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 약 6~약 11개 아미노산들의 아미노산 서열내에 포함된다. 바람직하게는 상기 서열은 8 또는 9 아미노산 길이를 갖는다.

단백질 항원에 대한 B 와 T_c세포 에피토프들의 동정방법들은 당 기술분야에 잘 알려져 있다. 예로서, 분비된 마마글로빈을 연결하는 중복(overlapping) 합성 펩타이드들에 응답하는 분리된 마마글로빈 특이적인 B 세포들 또는 마마글로빈 특이적인 T_c세포들의 능력은 표준 면역생물학 기술을 사용하므로써 결정될 수 있다. 항원성 물질로 동정되는 이들 펩타이드들은 마마글로빈 특이적인 B 또는 T 세포들을 자극하는 능력을 최대화하기 위하여 그 후 어떤 시기에 하나 또는 몇몇 아미노산들로 변형될 수 있다.

B 세포 에피토프들 또한 C 말단이 폴리에틸렌 멀티핀(multipin) 지지체에 결합된 임의의 펩타이드들의 선별을 포함하는 상업적으로 구입가능한 예로서, 캠브리지 리서치 바이오케미칼(Cambridge Research Biochemicals)의 에피토프 맵핑(mapping) 키트를 사용하여 지도화할 수 있다.

선택적으로, 예측되는 마마글로빈 아미노산 서열은 MHC 클래스 I 또는 MHC클래스 Ⅱ 분자들의 알려진 결합 모티프(motif)에 일치하는 서열로서 검색될 수 있다. 예를 들어 Hill 등,Nature 360:434(1992), Pamer 등,Nature 360:852(1992) 및 Hammer 등,J. Exp. Med. 176:1007(1992)와 Falk 등, Nature 351:290~296(1991) 참조. 예로서 유방종양 특이적인 CTLs에 의해 인식가능한 항원성 펩타이드들은, Peoples 등,Proc. Natl. Acad. Sci. 92:432~436(1995)에 개시된 바와 같이, HLA-A2-결합 펩타이드들에 대한 마마글로빈 아미노산 서열을 검색하므로써 동정될 수 있다. 환자가 HLA-A2를 발현하는 경우(코카서스인의 약 50%는 HLA-A2를 발현한다)에 항원 제공 분자로서 HLA-A2를 선택하는 것이 적합하다. 예측된 HLA-A2 결합 펩타이드들은 합성될 수 있으며, 합성된 펩타이드들을 항원 제공(presentation)에 결점을 갖는 인간의 T 세포/B 세포 융합 생성물인 T2 세포주상에, T2 세포들의 표면상에 존재하는 HLA-A2 분자들이 외생의 HLA-A2 결합 펩타이드와 효과적으로 결합될 수 있도록 부가하므로써 항원성을 시험할 수 있다(Henderson 등, Science 255:1264~1266(1992)). 그 후 마마글로빈을 발현하는 유방종양으로부터 분리된 종양 침투 림프구들(TILs)로부터 유도된 유방 특이적인 CTLs와 상기 펩타이드가 적재된 T2 세포들을 함께 인큐베이션하는 것을 포함하는 표준 세포독성 시험을 수행한다. 예를 들어, Peoples 등, pp 432~433과 Toso 등,Cancer Research 56:16~20(1996) 참조.

Tc 세포 에피토프들을 포함하는 항원성 마마글로빈 펩타이드들은 종양세포 표면상의 HLA 클래스 I 분자들에 의해 제공되는 내생의 펩타이드를 산 용출하므로써 동정될 수 있다(예로서, Peoples 등, 상기 논문, p.433 참조). 용출된 펩타이드들은 HPLC 분획화를 포함한 당 기술분야에 알려진 여러 기술들을 사용하므로써 분리될 수 있다. 다른 펩타이드 분획들을 T2 세포들 상에 적재시키고, 표준 면역생물학적 기술을 사용하여 CTLs에 의해 인식되는 펩타이드들이 어느 것인지를 결정하기 위하여 상기 적재된 T2 세포들을 유방종양 특이적인 CTLs와 함께 인큐베이션 시킨다.

본 발명에 따른 마마글로빈 항원의 한 용도는 양자 면역요법에 사용되는 것이다. 이 치료는 마마글로빈을 발현하는 종양을 가진 환자로부터 분리된 항마마글로빈 항체를 생성하는 B 세포들 및/또는 마마글로빈 특이적인 세포독성 T 림프구들(CTLs)의 마마글로빈 항원에 의한 생체외 활성화 및 신장(expansion)을 포함한다. 또한 상기 방법은 마마글로빈 B 세포와 T_c세포 항원들을 모두 포함하는 조성물을 사용하여 실시될 수 있다. 상기 활성화된 림프구들을 양자면역 치료를 위하여 환자에게 다시 재도입시킨다.

본 발명에 따른 마마글로빈 항원은 마마글로빈 특이적인 백신의 성분으로서도 유용하다. 상기 백신은 면역유전적 자극가능한 양의 마마글로빈 항원을 포함한다. 여기에서 사용된 면역자극가능한 양이란 수용자 내에서 유방암을 경감시키거나 치료하기 위한 바람직한 면역반응을 자극할 수 있을 정도의 항원의 양을 말하는 것이다. 상기 양은 과도한 실험없이도, 당 기술분야에서 당업자에게 잘 알려진 표준방법들에 의하여 경험적으로 결정될 수 있을 것이다.

본 발명의 항원은 예로서, 항체 매개된 및/또는 세포 매개된 바람직한 형태의 면역반응을 유도하기 위하여 설계된 다양한 백신 제제들 중 어느것에서나 제공될 수 있다. 이러한 제제들은 당 기술분야에서 잘 알려져 있다. 예를 들어, A. Lanzavecchia,Science 260:937~944(1993) 및 Raychandhuri에게 부여된 미국특허 제 5,585,103호 참조. 면역반응들을 자극하기 위해 사용되는 백신 제제들의 예들은 알루미늄염과 같은 약물학적으로 적합한 보조제들; 스쿠알린 또는 스쿠알렌 및 무라밀(muramyl) 디펩타이드의 에멀젼; 리포좀; 안정화 계면활성제, 미셀(micelle)형성제 및 생분해성이며 생물학적으로 적합한(biocompatible) 오일(Raychandhuri, 상기 논문 참조)을 포함하는 조성물들을 포함한다.

마마글로빈 특이적인 백신은 또한 마마글로빈 항원과 함께 포함되어진 운반(carrier) 세포를 포함할 수 있다. 바람직하게는 상기 운반세포는 마크로파아지, 수상(dendritic) 세포들, 또는 활성화된 B 또는 T 림프구들과 같은 동일 생물에서 유래하는(autologous) 전업(professional) 항원 제공 세포들(APC)로부터 제조되어진다. Lanzavecchia, 상기 논문, p. 937 참조. 전업 APCs는 리간드 B7을 발현하며, 이는 T세포에서 CD28 또는 CTLA4에 결합하여 T 세포 무감증(anergy) 또는 불활성화를 방지하는 시그날 2(Signal 2)로 알려진 항원-비특이적 공동자극성 신호를 전달한다. 따라서, 상기 백신은 또한 무감증 유도를 방지하기 위해 인터루킨-2나 다른 공동자극성 신호를 포함할 수 있다(Lanzavecchia, 상기 논문 참조, p938).

또다른 마마글로빈 특이적인 백신 제제는 발현을 위해 마마글로빈 항원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 포함한다. 세포장해성 T 림프구들을 자극하기 위하여 감염성 성분들을 사용하는 것은 당 기술분야에서 알려져있다(Raychaudhuri, 상기 논문 참조). 리스테리아와 BCG와 같은 박테리아 뿐만 아니라, 우두진(vaccinia), 소아마비(polio), 아데노- 및 레트로 바이러스들을 사용하는 키메릭(chimeric) 벡터들도 설명되어 왔다. 예로서, 카나리폭스(canarypox) 바이러스 벡터인 ALVAC는 암호화된 이형의 유전자 생성물에 대하여 강한 세포적 면역반응을 유도한다(Taylor 등,Virology187:321~328(1991)). 또한, MAGE-1 유전자에 의해 암호화된 MZ2-E 인간 흑색종 거부반응 항원을 발현하는 재조합 ALVAC는 MAGE-1 mRNA를 발현하는 유방종양으로부터 유도된 TIL 개체군내에서 시험관내 MAGE-1 CTL 활성을 자극할 수 있다(Toso 등, 상기 논문 참조). Weiner등에게 부여된 미국특허 제 5593972호에 개시된 또다른 방법에서는, 표적화되어질 면역유전성 단백질의 항원을 암호화하는 재조합 발현벡터는 개체의 생체내, 예로서 근육세포에 직접적으로 투입되거나, 생체외에서 세포들 내로의 DNA의 도입을 용이하게 하는 성분과 함께 개체의 세포에 직접 투입된다.

당 기술분야의 당업자는 바람직한 면역반응을 수행하기에 적합한 백신의 제제화 방법을 쉽게 결정할 수 있을 것이다. 예로서, 항마마글로빈 항체들의 생체내 생산을 유도하기 위해, 마마글로빈 특이적인 백신은 B 세포 에피토프와 T_H세포 에피토프를 포함하는 적어도 하나의 마마글로빈 B 세포 항원을 포함한다. 상기 T_H세포 에피토프는 바람직하게는 목적하는 백신 수용자의 적합한 MHC 클래스 Ⅱ 단형타입(haplotype)과 짝지워진다. 선택적으로, 파상풍 톡소이드(toxoid)로부터 얻은 "보편적(universal)" T세포 에피토프와 같은 HLA 타입에 상관없이 인간에 의해 보편적으로 인식되는 것으로 알려진 T_H세포 에피토프가 사용될 수 있다(Panina Bordignon 등,Eur. J. Immunol. 19:2237(1987)). 바람직하게는, 백신은 다른 HLA 타입들의 MHC 클래스 Ⅱ 분자들에 의해 인식되는 T_H세포 에피토프들과 복수의 마마글로빈 B 세포 항원들을 포함한다.

또다른 구체예에서, 마마글로빈 특이적인 백신은 세포매개된 응답반응을 유도하고, 마마글로빈 특이적인 T_c세포들을 활성화할 수 있는 적어도 하나의 마마글로빈 T_c항원을 포함한다. 바람직하게는, 상기 백신은 여러개의 T_c세포 항원들을 포함한다.

마마글로빈 특이적인 백신은 또한 항체 및 세포매개된 응답반응들을 모두 유도하도록 제조되어질 수 있다. 이러한 구체예는 마마글로빈 B 세포 항원들과 T_c세포 항원들을 모두 포함한다.

마마글로빈을 발현하는 종양을 가진 환자는 본 발명에 따른 마마글로빈 특이적인 백신을 면역자극성인 양만큼 투여받는 치료를 받을 수 있다. 백신의 투여는 공지된 기술 또는 표준 기술로써 수행될 수 있다. 이들은 이에 제한되지는 않지만, 정맥내 주사, 복강내 주사, 근육내 주사, 피하주사 또는 유방내 주사를 포함한다.

본 발명의 바람직한 구체예들은 다음의 실시예들에서 설명될 것이다. 본 명세서의 청구범위내에 속하는 다른 구체예들은 여기 개시된 바와 같은 본 발명의 명세서 및 실시를 고려하여 당 기술분야의 당업자들에게는 명백할 것이다. 실시예들과 더불어, 본 명세서는 실시예 이하의 청구항들에 의해서 인지되는 본 발명의 기술사상과 범위를 나타내는 단지 예시적인 목적일 뿐이다.

이하의 실시예에서, 세포주들은 미국 세포표본 보관소(American Type Culture Collection)로부터 얻었으며, 10% 소 태반 혈청으로서 공급되어진 Dulbecco의 최소 필수배지에서 배양되었다. 조직 생검 시료들은 Human Cooperative Tissue Network로부터 얻었다(LiVolsi 등,Cancer 71:1391~1394, 1993).

실시예 1

본 실시예에서는 마마글로빈 cDNA의 분리를 설명한다.

세포주 MDA-MB415로부터의 총 세포질 RNA를 표준 구아니디늄 이소시아네이트 방법을 사용하여 분리하였다(Belyavsky 등, 상기 논문 참조). 이 RNA를 Amplifinder 키트(Clonetech사)를 제조자에 의해 제시된 사용방법에 따라 이용하는 RACE PCR 방법에 사용하였다.

첫번째 cDNA 가닥의 합성은 반응부피 20㎕내에 RNA 1㎍, 특이적 마마글로빈 프라이머 D2R(5'-ATA AGA AAG AGA AGG TGT GG-3')(서열번호 4) 10μM, 5X RT 버퍼(250mM 트리스Cl pH 8.3, 375mM Kcl, 15mM MgCl₂) 4㎕, 100mM DTT 2㎕, 10mM dNTPs 1㎕ 및 Superscript^TMⅡ 역전사제 200유니트(Gibco사/BRL)를 포함하는 표준 반응액에서 수행되어졌다. 반응을 45℃에서 한시간동안 진행시킨 후, 95℃에서 5분간 인큐베이션 하여 종결시켰다. RNA를 65℃에서 30분동안 400μM NaOH로 가수분해하고 400μM 아세트산으로 중화하였다.

상기 반응 혼합물을 3배 부피의 6M NaI와 처리된 유리 비드(bead) 10㎕에 첨가하였다. 비드들을 80% EtOH로 세번 세척하고, 핵산을 45㎕의 물로 비드로부터 용출시켰다. 그 후 핵산이 침전되면 10㎕ 물에 재현탁시켰다. 정제된 첫번째 cDNA 가닥을 T4 RNA 리가제를 사용하여 27℃에서 20시간동안 제조자에 의해 제공된 앵커(anchor) 올리고뉴클레오티드(서열번호 9, 5'-CAC GAA TTC ACT ATC GAT TCT GGA ACC TTC AGA GG-3')에 결찰시켰다. 결찰반응의 십분의 일은 제조자에 의해 제공된 앵커 프라이머(서열번호 10, 5'-CTG GTT CGG CCC ACC TCT GAA GGT TCC AGA ATC GAT AG-3') 1μM, 제조자에 의해 제공된 마마글로빈 특이적인 프라이머 D2Rb(서열번호 11, 5'-AAT CCG TAG TTG GTT TCT CAC C-3') 1μM, dNTPs 200μM, Vent^TMDNA 폴리머라아제 5 유니트 및 1X 폴리머라아제 버퍼(10mM Kcl, 20mM 트리스Cl, 10mM (NH₄)₂SO₄, 2mM MgSO₄, 0.1% 트리톤 X-100)를 포함한 50㎕ 반응액 내에서의 PCR 증폭에 사용하였다. 상기 반응을 94℃에서 2분간, 그 후 94℃에서 45초간, 50℃에서 1분간, 그리고 72℃에서 90초 동안 총 40주기 인큐베이션 처리하였다.

마마글로빈 특이적인 내포된(nested) 두개의 하류 올리고뉴클레오티드들은 D2R(서열번호 4)와 D2Rb(서열번호 11)였다. 상류 마마글로빈 특이적인 조절 올리고뉴클레오티드 D2F(5'-CTT TCT GCA AGA CCT TTG GC-3')(서열번호 12) 또한 제조자 설명에 따라 사용하였다. 모든 PCR 증폭은 Vent DNA 폴리머라아제(New England Biolabs사)로써 수행되었다. 증폭된 RACE 생성물을 EcoRI로 소화시키고 플라스미드 벡터 pGEM7Z(Promega, Madison, WI)의 EcoRI와 SmaI 위치내로 결찰시켰다.

Taq DNA 폴리머라아제 열 순환(cycle) 서열화 키트를 제조자(Promega)에 의해 제시된 사용방법에 따라 사용하여 서열화를 수행하였다. 사용방법을 다음에 간략히 기재하였다.

10pmol의 서열 특이적 올리고뉴클레오티드를 37℃에서 30분간 10㎕의 반응용액내에서 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제를 사용하여 10pmol의³²P-γATP(3,000 Ci/mmol과 10mCi/㎖)로 말단 표지시켰다. 100ng의 플라스미드 주형, 1.5pmol의 표지된 서열 프라이머 및 5 유니트의 서열화 등급의 Taq 폴리머라아제를 포함한 중합반응액을 제조자에 의해 제공된 17㎕ 버퍼에서 제조하였다. 이 반응액을 제조자에 의해 제공된 데옥시뉴클레오티드와 디데옥시-A, C, G 또는 T의 혼합물을 포함한 4개의 반응튜브 세트에 분액하였다. 4개의 튜브 세트를 95℃에서 2분간 인큐베이션시킨 후, 94℃에서 45초, 45℃에서 30초, 72℃에서 1분간, 총 30주기로 인큐베이션 시켰다. 반응이 완료된 후, 3㎕의 80% 포름아미드/브롬페놀 블루 염색제를 각 튜브에 첨가하였다. 시료들을 70℃에서 2분간 가열하고 6% 아크릴아미드/7.5M 우레아 서열화 겔에 적재하고 2~4시간동안 60W의 일정전압으로 가동시켰다. 상기 겔을 건조한 후 Kodak XAR5 엑스레이 필름에 2~24시간동안 노출시켰다.

상기와 같이 제조된 서열은 도 2에 나타낸 바와 같이 고체 바(bar)의 403bp 단편(서열번호 5)이었다. 초기 연구에서 DEST002 태그 서열을 분리하였다(Watson and Fleming, 상기 논문참조). 이 서열은 도 2에 나타낸 바와 같이 열린 바의 서열 206bp 단편(서열번호 6)이었다. 상기 두 서열들로부터 얻은 정보를 결합하여 완전한 길이의 마마글로빈의 503bp cDNA가 추론되어졌다(도 2).

실시예 2

본 실시예에서는 마마글로빈 발현이 유방선 종양세포들에 제한되어 있고, 보다 낮은 수준으로 정상의 유방선 세포들에 제한되어 있다는 것을 설명한다.

총 세포질 RNA 시료들을 표준 구아니디늄 이소시아네이트 방법을 사용하여 분리하고 RNA 효소(RNase)가 포함되지 않은 DNA 효소(DNase)로 처리하였다. RT/PCR 분석을 위해 1㎍의 표시된(indicated) 총 RNA를 제조자 설명서에 따라 올리고 dT₂₁(서열번호 13)과 Superscript Ⅱ 역전사효소(Gibco/BRL)를 사용하여 역전사하였다.

200ng의 올리고 dT21(서열번호 13)과 1㎍의 총 RNA를 10㎕ 부피로 65℃에서 5분간 인큐베이션 시켰다. 시료를 얼음으로 냉각시키고, 여기에 4㎕의 5X RT 버퍼(250mM 트리스Cl pH 8.3, 375mM Kcl, 15mM MgCl₂), 2㎕의 100mM DTT, 1㎕의 10mM dNTPs와 200유니트의 Superscript^TMⅡ 역전사효소(Gibco/BRL)를 첨가하였다. 상기 반응을 45℃에서 1시간동안 진행시키고 95℃에서 5분간 인큐베이션시켜 종료시켰다.

각 RT반응액의 십분의 일을 마마글로빈 특이적인 프라이머 D2R(5'-ATA AGA AAG AGA AGG TGT GG-3')(서열번호 4)과 d2102(5'-CAG CGG CTT CCT TGA TCC TTG-3')(서열번호 3)를 사용하여 40회의 94℃ ×30초/55℃ ×1분/72℃ ×1분의 표준반응 조건으로 PCR 분석하였다.

노던 분석을 위해, 20㎍의 총 RNA를 완전한 길이의 마마글로빈 cDNA 프로우브를 사용하여 상기 설명한 바와 같이(Watson and Fleming, 상기 논문참조) 분석하였다. 각 RNA 시료의 보존성 및 균등한 적재(loading)는 에티디움 브로마이드 염색으로써 평가하였다.

도 4A에 나타낸 바와 같이, 500bp 마마글로빈 메세지는 종양 표본 2410(원래의 DEST를 분리해낸 조직)에서 쉽게 감지되며, 정상적인 인간 유방조직에서는 훨씬 낮은 수준으로 감지되었으나, 불사화된 유방 상피세포주 B5-589, 또는 인간의 폐, 태반, 자궁 및 난소에서는 감지되지 않았다(도 4A). RT/PCR 분석을 사용한 증폭후에도, 조사된 15개 조직에서는 마마글로빈 발현이 감지되지 않았다(도 4B). 이들 반응에서 글리세르알데히드 3-포스페이트 탈수소효소(GAPDH) 메세지(도 4B)와 EGF 수용체 메세지(데이타는 나타내지 않았음)의 감지는, 발현의 부재가 분해된 RNA 또는 다른 사소한 이유들로 인한 것이 아니라는 것을 설명해 준다. 따라서 마마글로빈 mRNA의 발현은 유방조직에 대하여 비교적 특이적이다.

실시예2A

본 실시예에서는 정상 조직에서의 마마글로빈 발현의 유방 특이성을 확인한다.

실시예2에 사용된 마마글로빈 cDNA 탐침은 정상인 조직의 혼합된 집합(pooled populations)으로부터 파생된 노말라이즈되고(normalized), poly-A 부유된 RNA의 상업적으로 제조된 도트 블롯(dot blot)에 혼성화되었다(Master Bot^TM, Clonetech, Palo Alto, CA). 상기 도트 블롯에는 다음의 인간 조직에서 유래한 RNA가 포함된다; 전체 뇌, 편도선(amygdala), 코데이트 핵(caudate nucleus), 대뇌, 대뇌 피질, 전두엽, 해마상 융기(hippocamus), 연수, 후두엽(occipital lobe), 경막(putamen), 서브스탠셔 니그라(substantia nigra), 측두엽, 시상(thalamus), 뉴클리어스 어큠버스(nucleus accumbeus), 척추(spinal cord), 심장, 대동맥, 골격근, 결장, 방광(bladder), 자궁, 전립선, 정소, 난소, 이자, 뇌하수체, 아드레날 샘(adrenal gland), 티로이드 샘(thyroid gland), 침샘, 유샘, 신장, 간장, 소장, 지라, 흉선, 말초 백혈구, 림프절, 골수, 맹장, 폐, 기관, 태반, 태아 뇌, 태아 심장, 태아 신장, 태아 간장, 태아 이자, 태아 흉선 및 태아 폐.

상기 마마글로빈 cDNA 탐침은 공급자의 프로토콜에 따라³²P-α-dCTP(10mCi/ml;>3000 Ci/mmol) 및Rediprime표지 키트(Amersham, Arlington Heights, IL)로 방사성 표지되었다. 상기 도트 블롯은Rapid-Hyb혼성화 버퍼(Amersham, Arlington Heights, IL)를 사용하여 60℃에서 16시간 동안 마마글로빈 cDNA 탐침의 1×10⁶CPM/ml와 혼성화되었다. 그리고 나서 필터들은 2xSSC/0.1% SDS에서 15분 동안 실온에서 두 번 세척되었고, 0.2xSSC/0.1% SDS에서 한 시간 동안 60℃에서 다시 두 번 세척되었다. 세척된 필터들은 인(phosphor) 증진 스크린을 가진 XAR5 필름(Eastman-Kodak, Rochester, NY.)에 72시간 동안 노출되었다.

마마글로빈 mRNA는 유선에서 유래한 RNA에서만 감지되었다(데이터는 나타내지 않음). 정상적인 침샘 침 전립선에서의 감지가능한 마마글로빈 mRNA가 없다는 것은 마마글로빈 발현은 유방-특이적 표지로서 사용되어 왔던 GCDP15의 아포크린세포 특이성과는 반대로 아포크린 표현형과 결합되어 있지 않다는 것을 나타낸다. Wick 등의Hum Pathol20:281∼287, 1989: Raab 등의Am J Clin Pathol100:27∼35, 1993 참조. 이러한 결과들은 유방암에 대한 아주 특이적인 표지로서 마마글로빈 유전자 발현을 이용하는 것에 대한 잠재적인 잇점을 제시하는 것이다.

실시예 3

본 실시예에서는 마마글로빈 cDNA가, 적절히 예측된 분자질량의 단백질 생성물을 제조하는 번역가능한 뉴클레오티드 서열을 암호화하는 것을 설명한다. 제조자 설명서에 따라 T7 RNA 폴리머라아제를 갖는 TNT^TM토끼 망상적혈구 번역키트(Promega) 및³⁵S-메티오닌(>1000Ci/mmol; 10mCi/ml, Amersham)을 사용하여 시험관내 번역을 수행하였다.

25㎕의 TNT^TM토끼 망상적혈구 용해질에 제조자에 의해 제공된 반응 버퍼 2㎕, T7 RNA 폴리머라아제, 메티오닌이 빠진 20μM의 아미노산 혼합물, 40μCi³⁵S-메티오닌(1,000 Ci/mmol 및 10mCi/㎖), 40유니트의 리보뉴클레아제 억제제, 1㎍의 마마글로빈/pGEM7 플라스미드 및 충분한 양의 DEPC 처리된 물을 첨가하여, 최종 반응부피가 50㎕가 되도록하였다. 이 반응액을 30℃에서 60분동안 인큐베이션시켰다. 이 반응용액 5㎕를 20㎕의 SDS 겔 버퍼에 첨가하여 2분간 끓이고, 17.5% SDS-폴리아크릴아미드 겔에 적재하였다.

마마글로빈 cDNA로 프로그램된 토끼 망상적혈구 용해질은 6kD의 단백질을 생성하였으나, cDNA 없이 프로그램된 것은 어떤 단백질도 생성하지 못하였다.

실시예 4

본 실시예에서는 일차(원발성) 유방암종에서 마마글로빈의 과발현이 많이 일어나는 것을 설명한다.

유방암종에서의 마마글로빈 과잉발현의 빈도를 결정하기 위하여, 마마글로빈 cDNA 프로우브를 사용하여 노던 블롯 혼성화로 조직학적 유형을 달리하는 I기의 일차 유방암종 15개의 패널을 실험하였다. 또한 환자에 매치된 정상의 유방조직 시료들을 두 환자들로부터 얻은 조직들과 비교하였다(도 6). 500bp의 마마글로빈 mRNA가 정상의 유방조직과 종양 2410, 그리고 다른 3개의 종양들에서 감지되었으며, 시험했을때 이들중 2개는 환자에 매치된 정상조직에서 발현되지 않거나 적게 발현되었다(BO15 v. BO16; BO22 v. BO23)(도 6). 결과적으로, 시험된 종양 15개 중 4개(27%)는 마마글로빈 mRNA을 과발현하였다.

이러한 데이타는 마마글로빈의 과발현이 단일한 종양 표본에 대해 특이적인 것은 아니며, 실제로 일차 유방 종양에서 비교적 빈번하다는 것을 나타낸다. 또한, 시험된 모든 종양들이 I기라는 사실은 이러한 조절이상이 유방암종의 진행에서 비교적 초기에 일어난다는 것을 암시한다.

실시예 5

본 실시예에서는 항마마글로빈 폴리클로날 항체를 사용하여 마마글로빈 단백질을 감지하는 것을 설명한다.

마마글로빈 cDNA로부터 예측된 16개의 C-말단 아미노산들(Glu-Val-Phe-Met-Gln-Leu-Ile-Tyr-Asp-Ser-Ser-Leu-Cys-Asp-Leu-Phe, 서열번호 14)에 상응하는 펩타이드를 키홀 림펫 헤모시아닌(Keyhole Lymphet Hemocyanin)에 커플링시키고, Freund 보조제와 함께 토끼에게 주사하여 항마마글로빈 폴리클로날 항체를 제조하였다. 접종된 토끼들을 3주간격으로 재접종하여 체내 농도를 높이고(boost), 피를 뽑아, 혈청이 없는 조절 배지내에서 유방암 종양세포주 MDA-MB-415와 MCF-7의 배양액으로부터 마마글로빈을 감지하는 능력을 혈청에 대해 분석하였다. 마마글로빈 메세지를 과발현하는 세포주로서 MDA-MB-415가 초기에 동정되었고, 검출가능한 마마글로빈 mRNA를 전혀 생성하지 않은 세포주로서 MCF-7이 초기에 동정되었다.

조절 배지를 24시간 배양하고 이를 채취하여 감소 조건하에서(즉, 디설파이드 결합들의 수를 감소시키기 위하여 시료를 디티오트레이톨(DTT)과 2-머캡토에탄올(BME)을 포함한 버퍼내에서 가열하였다) 12% SDS 아크릴아미드 겔에 녹이고, Nytran 필터상에서 블로팅시킨 후, 이 분석에서의 주 항체로서 상기 언급된 C-말단 펩타이드에 대한 항체를 사용하여 표준 웨스턴 블롯방법으로 분석하였다. 일차 항체결합 후, 상기 블롯을 세척하고 이차 항체(염소 항토끼)를 첨가하였다. 마마글로빈-항체 복합체를 효소결합된 화학발광제(ECL 웨스턴 블로팅 검출 시약, Amersham, Arlington Heights, IL)로써 가시화하였다.

항마마글로빈 폴리클로날 항체는 MDA-MB-415 세포 배양액의 조절 배지에서 약 21kD의 겉보기 분자량을 가진 밴드(band)를 검출해내었다(데이타는 개시하지 않았음). MCF-7 세포 배양액의 조절 배지에서는 어떤 밴드도 검출되지 않았다(데이타는 개시하지 않았음). 따라서, mRNA 데이타와 일치하게 MDA-MB-415 세포들은 마마글로빈 단백질을 분비하지만 MCF-7 세포들은 마마글로빈 단백질을 분비하지 않는다.

MDA-MB-415 배양 배지내로 분비된 마마글로빈의 겉보기 분자량은 서열번호 2의 예측된 아미노산 서열로부터 계산된 분자량 10.5kDa 보다 더 컸다. 거의 모든 분비된 단백질들이 글리코실화 되었기 때문에, 분비된 마마글로빈의 어떤 전구체 형들이 감지될 수 있는지의 여부를 알아보기 위하여 항마마글로빈 폴리클로날 항체로 MDA-MB-415 세포들의 시토졸(cytosol)을 분석하였다.

MDA-MG-415 세포들을 혈청이 없는 배지에서 24시간동안 배양하고, 배지 배양액을 모아서 원심분리기로 탈수한 후, 결과의 상등액을 모았다. 덩어리진 세포들을 포스페이트 완충된 식염수(PBS)로 세척하고 1X Laemmli 시료 버퍼(2% SDS, 10% 글리세롤, 100mM DTT, 60mM 트리스, pH 6.8, 0.001% 브로모페놀 블루)로써 용해하였다. 용해 혼합물을 5분동안 끓인 후 5분간 10,000g으로 원심분리 탈수시켜서 세포 파편들을 펠렛화하였다. 세포 용해질을 새 튜브로 옮기고 아래 설명한 바와 같이 웨스턴 블롯분석에 사용하였다.

상기 배양 상등액과 세포 용해질을 감소 조건(즉, DTT와 BME를 포함한 버퍼내에서 시료를 끓였다)하에서 12% SDS 아크릴아미드 겔에서 전개시키고 표준기술을 사용하여 PVDF 막 위에 블로팅하였다. 상기 블롯을 항체를 생성하는데 사용되는 경쟁적 펩타이드의 존재하와 부재하에서 C-말단 펩타이드에 대한 폴리클로날 항체로 탐지하였다.

마마글로빈-항체 복합체의 시각화는 상기 설명된 바와 같이 수행하였다. 도7에서 알 수 있는 바와 같이, 경쟁적 펩타이드의 부재하에서(-) 조절 배지(S)는 분비된 마마글로빈 단백질의 표현형인 21kD 밴드를 나타내었다. 세포 용해질(C)은 약 14kD에서 현저한 밴드 및 약 21kD에서 하나의 밴드를 포함하여, 몇개의 보다 높은 분자량 밴드를 나타내었다. 웨스턴 블롯이 경쟁적 펩타이드 존재하에서(+) 수행될 때, 마마글로빈의 분비형 및 세포내 존재형은 가시화되지 않았으며, 이는 이들 단백질이 그에 대한 항체가 합성된 펩타이드를 포함한다는 것을 나타낸다.

세포 용해질내에서는 단지 14kD 밴드가 검출되었으며, 이는 마마글로빈의 전구체 또는 처리되지 않은 형태를 나타내는 것이다. 마마글로빈에 대한 예측된 아미노산 서열은 서열번호 2의 53~55 잔기 및 68~70 잔기에 위치한 공통된 N-글리코실화 위치, Asn-X-Thr를 가졌으며, 관찰된 분비된 21kD 형은 단백질의 어느정도 글리코실화된 형태를 나타낸다.

이 가설은 MDA-MB-415 세포들을 진핵세포 단백질들의 N-연결된 글리코실화를 억제하는 약물인 투니카마이신(tunicamycin)의 존재 및 부재하에서 배양하므로써 테스트하였다. 투니카마이신 1ug/㎖을 두개의 동일한 배양액에 첨가하고, 두 배양액을 하룻밤동안 인큐베이션 처리하였다. 처리된 배양액 및 대조 배양액으로부터 배지 배양액과 세포 용해질을 제조하고 상기 언급한 바와 같이 웨스턴 블롯으로 분석하였다.

도 8에 나타낸 바와 같이, 투니카마이신으로 처리된(+) 배양액(S)로부터의 배지는 분비된 마마글로빈이 검출가능한 정도가 아니었으며, 이는 분비된 마마글로빈이 글리코실화된 것이라는 것을 의미한다. 놀랍게도, 마마글로빈의 세포 시토졸형태(14kD) 또한 투니카마이신으로 처리된 MDA-MB-415 세포들의 용해질에서 검출되지 않았다(가장 오른쪽 줄). 투니카마이신에 의한 초기 글리코실화의 저해는 마마글로빈 전구체 형을 불안정화시키고 변형시킨다는 가설로써, 투니카마이신으로 처리된 세포들의 시토졸내에서의 검출가능한 14kD 단백질의 부족함을 설명할 수 있다.

마마글로빈의 C-말단 펩타이드에 대한 폴리클로날 항체 또한 초기 인간 유방암 표본으로부터의 세포 용해질내에 있는 마마글로빈의 14kDa 전구체를 감지하였다. 도 9에서 볼 수 있는 바와 같이, 마마글로빈의 전구체 형태는 종양표본 BO23내에 존재하지만, 동일한 환자로부터의 정상 유방조직 시료(BO22)에서는 검출되지 않았다. 흥미롭게도, 마마글로빈 전사체(즉, 087R, 014, 75A 및 2410)를 발현하는 어떤 종양 시료들은 웨스턴 블롯 분석으로 분석했을 때 마마글로빈 단백질을 검출가능한 농도로 포함하지 않았다. 이들 데이타에 맞는 한 가설은 마마글로빈 발현은 전사 및 번역수준에 따라서 별도로 조절되어진다는 것과 이러한 별도의 조절은 종양의 발전단계를 결정한다는 것이다.

또한 항마마글로빈 폴리클로날 항체는 증식된 유방선으로부터의 유방 분비액 내에서 분비된 마마글로빈을 찾아내는데 사용되었다. 초유(Colostrum) 또는 성숙유 액(시료 500 ul)을 임신한 여성으로부터 임신기간중 첫번째 세달과 그 후 세달이 지난후 다시 세달동안, 분만시에, 그리고 분만후 3, 14, 21일에 손으로 짜서 모았다. 시료들을 2X 램리(laemmli) 시료 버퍼(4% SDS, 20% 글리세롤, 200mM DTT, 120mM 트리스, pH 6.8, 0.002% 브로모페놀 블루)를 동량사용하여 희석하였다. 희석된 시료들을 5분간 끓이고, 4℃에서 5분간 10,000g으로 원심탈수시켜 세포파편들을 펠렛화하였다. 상기와 같이 웨스턴 블롯 분석하기 전에 변성된 시료들을 새 튜브로 옮기고 -20℃에서 보관하였다.

도 10에 나타낸 바와 같이, 상기 항체는 유방 상피세포들이 높은 증식이 일어나는 기간인 임신중에 채취한 유방 분비물에 존재하는 21kD의 분비된 마마글로빈을 감지하였다. 그러나, 유방 상피 분화단계인 수유기에는, 분만후 3일까지 마마글로빈 농도가 현저히 감소되고 분만후 14일 이후에는 마마글로빈이 더이상 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 분비되는 마마글로빈은 유방 상피세포들의 증식과 관련이 있다는 것을 의미하며, 인간의 유방암에서 분비된 마마글로빈의 감지와 일치한다.

마마글로빈 펩타이드에 대한 항체와의 반응성은 유방 종양세포에 대하여 유방암 환자의 표본의 파라핀 고정 단편을 면역조직화학적으로 염색하므로써 나타내어졌다(도 11). 면역조직화학적 염색은 일차 항체로서 마마글로빈 펩타이드에 대한 항체를 사용하여 수행하고, 양고추냉이 페록시다아제로 태그된 염소 항토끼 항체와 기질로서 3, 3' 디아미노벤젠 테트라하이드로클로라이드(DAB)를 사용하여 마마글로빈-항체 복합체를 검출하였다. 마마글로빈 단백질을 발현하는 세포들은 갈색으로 염색되었다.

이러한 결과들로부터, 마마글로빈 단백질은 전구체 단백질로부터 합성되고, N-연결된 글리코실화와 같은 번역후 변형들로 인해 분비 전에 겉보기 분자량이 증가되며; 마마글로빈의 전구체 형들의 안정성은 N-연결된 글리코실화에 따라 달라지며: 유방 종양세포들이 증식되므로써 마마글로빈 단백질이 분비되는 것으로 믿어진다.

실시예6

본 실시예에서는 실시예 5에 기술된 항-마마글로빈 토끼 폴리클로날 항체를 사용한 면역조직화학적 분석에 의한 일차 유방암에 있어서의 마마글로빈 단백질의 감지를 설명하고 있다.

100개의 수집된(archived) 유방암 표본이 반더빌트 대학 병리과(Vanderbilt University Department of Pathology) 및 워싱톤 대학 암센터 종양 기탁소(Washington University Cancer Center Tumor Repository)로부터 임의로 선택되었다. 포르말린 고정되고, 파라핀이 채워진 조직을 5㎛로 잘라내고, 차지된(charged) 슬라이드 위에 올려놓고 건조시켰다.

면역조직화학적 분석을 위하여, 슬라이드는 등급이 메겨진 에탄올 및 증류수 용액 내에서 파라핀제거되고 탈수된다. 조직절편은 실온에서 1시간 동안 3% 우혈청 알부민(BSA)/인산완충 식염수(PBS) 중의 1:100으로 희석된 정상 염소 혈청(goat serum)(Vector Laboratories, Burlingame, CA) 및 그 후 1:1000으로 희석된 항-마마글로빈 토끼 폴리클로날 항체와 전배양시켰다(preincubated). PBS로 여러번 헹군(rinse) 후, 절편들은 PBS 중의 정상 염소 혈청(1:1000), 3% BSA, 및 6㎍/ml의 바이오틴 결합된 염소 항-토끼 IgG(Vector Laboratories, Burlingame, CA) 용액 중에서 1시간 동안 배양되었다. 2차 항체 용액은 PBS로 4번 헹궈졌고, 조직은 그런 후 역시 3% BSA/PBS 용액 중에서 1:1000으로 희석된 스트렙타비딘-퍼옥시다제와 함께 배양되었다(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). 30분 배양 후, 슬라이드를 다시 4번 PBS로 헹궜고 3분 동안 1mg/ml의 3,3′-디아미노벤지딘 테트라클로라이드(Dako, Carpinteria, CA) 및 0.02% 하이드로젠 퍼옥사이드(hydrogen peroxide)를 포함하는 크로마젠 용액(chromagen solution)에 노출시켰다. 슬라이드를 탈이온수(deionized water)에서 잠시 헹구고, 헤리스 헤모톡시린(Harris' hemotoxylin)으로 반대염색하고(counterstained), 커버스립 하에 올려놓았다.

음성 표준으로서, 조직 절편은 1:500으로 희석된 전면역 토끼 혈청(pre-immune rabbit serum)이 항-마마글로빈 항혈청 대신 치환된 것을 제외하고는 동일하게 처리되었다. 다른 방법으로, 펩티드 경쟁 실험을 위하여, 마마글로빈 항혈청을 실온에서 1시간 동안 3% BSA/PBS 중의 100㎍/ml의 농도로 16 잔기 마마글로빈 펩타이드와 먼저 배양시킨 후, 조직 절편에 적용하였다.

면역양성성(immunopositivity)은 0: 염색되지 않음, 1: 종양 세포의 50% 미만에서 약하고 간헐적인 염색, 2: 종양 세포의 50% 이상에서 약하게 염색, 3: 종양세포의 50% 미만에서 강한 확산성(diffuse) 세포질 염색으로서 점수화되었다. 3 또는 4로서 점수매겨진 절편만이 마마글로빈 "양성"으로서 간주되었다. 점수화 결과는 아래의 표1에 나타내었으며, 3개의 종양 유형에 대한 대표적 염색 양상은 도 12에 나타내었다.

표1. 인간 유방암의 마마글로빈 면역반응성 염색

¹엽상(lobular) 및 인 시튜 상태의 관 카시노마(ductal carcinoma in situ)(DCIS)를 제외한 모든 표본은 침투성 관암(ductal cancers)이다.

²유방암 조직절편의 항-마마글로빈 항체에 대한 면역 양성 염색의 정도는 0: 염색되지 않음, 1: 종양 세포의 <50%에서 약한 염색, 2: 종양 세포의 >50%에서 약한 염색, 3: 종양 세포의 <50%에서 강한 세포질성 염색, 4: 종양 세포의 >50%에서 강한 세포질성 염색으로 수치화하였다. 설명상 마마글로빈 "양성" 종양은 3 또는 4로 매겨진 종양들이다.

대체적으로, 조사된 관 카시노마(ductal carcinoma) 중 80%가 마마글로빈 단백질에 대한 강하고 전면적(global) 또는 집중적(focal) 세포 염색을 나타내었다. 흥미롭게도, 염색은 잘 분화된(78%), 중간정도 분화된(67%), 그리고 거의 분화되지않은(63%) 종양(표1, 도12) 간에 동일한 빈도였다. 강한 염색은 순수한 인 시튜 상태의 관 카시노마(ductal carcinoma in situ)(DCIS) 3/3 경우에서 또한 관찰되었다(도 12A). 마마글로빈의 세포성 염색 양상은 비록 일부 세포는 또한 핵 근처에 편재된 염색을 나타내지만, 확산성(diffuse) 및 세포질성이 우세하다. 정상적인 유방 조직에서, 마마글로빈 염색은 작은 관(ducts) 및 엽(lobules) 내의 희귀 표피세포 내에서만 관찰되었다.

그러나, 다른 분비성 단백질에서 관찰된 바와 같이, 마마글로빈의 증가된 발현은 아포크린 메타플레지아(metaplasia)의 특성과 일치하였다. 메타플라스틱 아포크린 표피를 가진 양성 유방조직에서, 마마글로빈 면역 반응성은 포피 내 및 아포크린 낭액 내에서 모두 존재한다. 양성 염색의 이러한 양상의 특이성은 경쟁하는 C말단 펩티드와 전배양된 전면역 토끼 혈청(도 12B, 12D, 12F) 또는 항-마마글로빈 항혈청(데이터는 나타내지 않음)과 배양된 동일한 표본으로부터 유래한 신호의 부재에 의하여 기록화되었다(documented).

그러나, 마마글로빈 발현은 정상 전립선 및 침샘과 같은 다른 아포크린 샘에서는 탐지되지 않았다. 더욱이, 아포크린 및 비아포크린 특성 모두를 가진 유방암 세포는 대략 동일한 빈도 및 강도로 마마글로빈을 발현시킨다. 또한 마마글로빈 발현과 종양 등급간에는 외견상 어떠한 상관관계도 없다. 그러므로, 마마글로빈 발현은 독특한 유방암 표현형이며 분자 수순에서 유방암을 심층 정의하기 위하여 확립된 다른 표지들(markers)과 연관짓는 경우 유용할 수 있다.

실시예5 및 6에 기재된 결과는 마마글로빈 단백질의 탐지는 유방암 경과 시간(relapse)을 검사하는 경우, 침입하는 종양 세포에 대하여 자가(autologous) 골수/간세포 이식을 모니터하는 경우 및 항체 매개 복합체를 통한 치료적 개입(intervention)을 위하여 유방암 세포를 목표로 삼는(targeting) 경우에 있어서 유방암 표지로서 마마글로빈 단백질을 사용하는 암진단에 적용될 것이라는 것을 나타내고 있다. 정제 및 분리된 마마글로빈 폴리펩타이드가 유방암에 대한 항체 생성 및 다른 종양 특이적 면역치료 체제를 개발하는 데에 있어서 유용하다.

실시예7

본 실시예는 림프절에 있어서 마마글로빈 mRNA의 감지에 대한 것이다.

많은 백분율의 일차 유방암에서의 마마글로빈의 발현 및 림프성 조직에서의 그 발현의 부재는 림프절 내에서 전이성 유방암 세포를 감지하기 위한 민감하고 특이적인 표지일 수 있다는 것을 암시하였다. 이 아이디어를 시험하기 위하여, 조직학적으로 문서화된 유방 전이암 또는 다른 비유방 전이성 암을 포함하는 림프절에서 마마글로빈 mRNA 발현을 조사하였다. 마마글로빈의 발현은 또한 마마글로빈 신호를 각 림프절 검체에 존재하는 악성(malignant) 표피 세포의 전체 수에 노말라이즈(normalize)하기 위하여 표피 세포 특이적 표지인 케라틴 19의 발현과 비교하였다.

전이 흔적을 포함하는 익명의 림프절 표본은 협동적 인간 조직 네트워크(Cooperative Human Tissue Network)(LiVolsi 등,Cancer71: 1891∼1894, 1993) 및 위싱톤 대학 암센터 종양 기탁소로부터 얻었다. 조직 표본은 1ml 시약 당 조직 100mg의 농도로된 트린졸 시약(Trizol reagent)(Life Technologies,Rockville, MD) 중에서 분쇄하고 균질화하였다. RNA 분리는 제조자의 프로토콜에 정확하게 권해진 바 대로 행하였으며, 그 결과 얻어진 RNA는 RNA가 없는 물에 2㎍/㎕의 농도로 재현탁시켰다. 20㎍의 각 RNA는 포름알데히드 아가로즈 겔 전기영동을 행하고 10XSSC 및 표준 방법론을 사용하여 Nytran Plus 막(Schleicher & Schull, Keene, NH)으로 전이시켰다.

마마글로빈 혼성화 탐침을 만들기 위하여, 실시예2에 사용된 마마글로빈 cDNA를³²P-dCTP(10mCi/ml; > 3000 Ci/mmol) 및Rediprime표지 키트(Amersham, Arlington Heights, IL)의 공급자의 프로토콜에 따라서 방사성 표지하였다.

케라틴 19 혼성화 탐침은 다음과 같이 만들어졌다. 포워드(5′-CGCGGATCCAGGATTGTCCTGCAGAT-3′)(서열번호: 18) 및 리버스(5′-CCGGAATTCCCATCCCTCTACCCAGA-3′)(서열번호:19) 케라틴 19 특이적 올리고뉴클레오티드 서열이 뉴클레오티드 477로부터 뉴클레오티드 1298까지의 코딩 영역(Stasiak, P.C. 및 Lane, E.B.,Nucleic Acid Res15:10058, 1987)을 포함하는 k19 cDNA 단편을 생성시키기 위하여 정상인의 유방 cDNA의 표준 PCR 증폭 반응에 사용되었다. 이 단편은 EcoRI 및 BamHI 말단을 생성시키기 위하여 소화되었고, pGEM3Z 벡터(Promega, Madison, WI)의 해당 부위에 클론되었고 동일성을 확인하기 위하여 서열분석되었다. 상기 클론된 821bp k19 cDNA 단편은 위에서 기술한 바 대로 방사성 표지되었다.

노던 블롯 필터는 먼저Rapid-Hyb혼성화버퍼(Amersham, ArlingtonHeights, IL)를 사용하여 60℃에서 16 시간 동안 1x10⁶CPM/ml의 마마글로빈 혼성화 버퍼와 혼성화되었다. 그 후 필터는 2X SSC/0.1% SDS 중에서 실온에서 15분 동안 2회 세척되었고, 0.2X SSC/0.1% SDS 중에서 60℃에서 1시간 동안 다시 2회 세척되었다. 세척된 필터는 72시간 동안 인광물질 증진 스크린을 가진 XAR5 필름(Eastman-Kodak, Rochester, NY)에 노출되었다. 상기 필터는 몇 반감기 동안 붕괴되도록 한 다음 상기 필터의 전처리 없이 1x10⁶CPM/ml의 케라틴 19 혼성화 탐침과 재혼성화되었다. 마마글로빈 및 케라틴 19 cDNA의 동일 숫자(equal counts) 및 비활성이 사용되었고 각 혼성화는 동등한 조건하의 필름에 노출되었다.

이 조사의 결과는 도 13에 나타내었다. 조직학적으로 문서화된 전이성 유방암(레인 1∼20, 27)을 포함하는 21개의 림프절 중에서, 마마글로빈 발현은 9개의 경우(43%)(레인 1,2,7,9,11,12,17,18 및 27)에서 감지할 수 있었다. 그러나, 21개 중 6개의 경우 있어서, 마마글로빈도 케라틴 19 mRNA도 감지할 수 없었다(레인 3, 5, 6, 10, 13, 14, 16, 19 및 20)는 것은 이들 경우로부터 유래한 림프절 검체는 본 방법에 의하여 검출되기에는 너무 적은 종양 세포가 포함되었다는 것을 암시한다. 이들 6개의 경우가 제외되었을 때, 60%(9/15)의 경우에서 감지가능한 mRNA를 포함하였다. 적어도 한 경우에 있어서, 마마글로빈 발현은 케라틴 19 발현(레인 27) 없이 감지되었으며, 이는 마마글로빈은 종양의 서브세트 중에서 더욱 민감한 표지일 수 있다는 것을 암시한다. 더욱이, 케라틴 19는 예를 들면, 후두 및 방광 종양 관련성이 있는 림프절(레인 21∼26)과 같은 많은 비유방성 전이암에서 전재적으로(ubiquitously) 발현되고, 반면에 마마글로빈 발현은 비유방성 전이성 흔적(레인 22) 중 단지 한 경우에서만 감지되었다. 이 경우는 출처가 알려지지 않은 거의 분화되지 않은 아데노카시노마(adenocarcinoma)를 포함하는 서혜 림프절(inguinal lymph node)이었다. 이전의 내막암의 이력이 문서화되었기 때문에, 이 흔적은 상기 질병의 전이성 재발(metastatic recurrence)로 간주되었다. 본 연구자들은 최근 여러 일차 내막암(데이터는 나타내지 않음)에서 발현된 마마글로빈을 감지하였으며, 이는 마마글로빈은 정상 내막 조직에서는 발현되지 않는 반면, 유방암 뿐만 아니라 내막 서브세트에서 발현된다는 아이디어를 확인하는 것이다. 전이성 질병이 없는 모든 림프절의 경우(레인 29∼33)에 있어서, 케라틴 19 및 마마글로빈 발현 모두 감지되지 않았다. 예측한 바 대로 마마글로빈 mRNA는 정상 유방 조직(레인 34)으로부터 분리된 RNA에서 감지되었다.

실시예8

본 실시예는 순환하는 유방암 세포에 대한 표지로서 말초혈액간세포(PBSC) 집합에서의 마마글로빈 mRNA의 감지에 관한 것이다.

∼1x10⁶말초 백혈구의 분액(aliquot)을 전이성 유방암에 대하여 고 투여(high dose) 화학요법 및 자가 간세포 이식을 받은 15 환자의 백혈구 추출 생산물(leukopheresis products)로부터 얻었다. 양성 표준으로서, 10¹마마글로빈-발현 MDA-MB 175 인간 유방암 세포(Wastson 등,Cancer Res56: 860∼865, 1996)를 1:10⁵유방암 세포 희석이 되도록 10⁶인간 OM431 멜라노마 세포(melanoma cell)와혼합하였다. OM431 세포의 순수 집합은 음성 표준으로서 사용되었다. 냉동된 세포 분액은 1ml 트리졸 시약(Life Technologies, Rockville, MD) 내에 즉시 분해시키고(lysed), 전체 RNA를 공급자의 프로토콜에 따라 준비하였다. RNA 순도(integrity) 및 농도는 아가로즈 겔 전기영동으로 검사하였다.

전체 RNA 중 약 1 마이크로그램을 T_11-17프라이머 및 공급자의 프로토콜에 따른 Superscript II 증폭 시스템(Life Technologies, Rockville, MD)을 사용하여 첫 번째 가닥 cDNA로 전화시켰다. RNase H로 처리 및 불활성화시킨 후, 검체를 뉴클리아제(nuclease) 없는-물로 2배 희석시키고 -20℃에 저장하였다. 합성된 cDNA의 순도를 검사하기 위하여, 10%의 cDNA를 최종 농도로 1X Taq DNA 폴리머라제 버퍼, 1.5mM MgCl₂, 200μM dNTPs, 0.6μM 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로제나제(Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase)(GAPDH) 포워드 증폭 프라이머(5′-CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA-3′)(서열번호: 20), 0.6㎛ GAPDH 리버스 증폭 프라이머(5′-TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCACC-3′)(서열번호:21) 및 2.5 유니트의 Taq 폴리머라제(Life Technologies, Rockville, MD)를 포함하는 50㎕ PCR 반응을 시켰다. 반응물을 94℃에서 1분 동안 가열하고 그 후 94℃에서 30초 동안 30회 반응시키고, 58℃에서 60초 및 72℃에서 45초 동안 반응시켰다. PCR 산물은 2% 아가로즈 겔에서 단일하고 균일하게 강한 599nt 단편이 분석되었으며, 이는 각 cDNA 합성 반응은 성공적이었다는 것을 나타낸다.

cDNA 반응의 또다른 10%는 최종 농도로 1X Taq DNA 폴리머라제 버퍼, 1.5mMMgCl₂, 200μM dNTPs, 0.6μM 마마글로빈 포워드 증폭 프라이머(5′-AGCACTGCTACGCAGGCTCT-3′)(서열번호:16), 0.6㎛ 마마글로빈 리버스 증폭 프라이머(5′-ATAAGAAAGAGAAGGTGTGG-3′)(서열번호:4) 및 2.5 유니트의 Taq 폴리머라제(Life Technologies, Rockville, MD)를 포함하는 두 번째 50㎕ PCR 반응을 시켰다. 반응물을 94℃에서 1분 동안 가열하고 그 후 94℃에서 30초 동안 45회 반응시키고, 58℃에서 60초 및 72℃에서 30초 동안 반응시켰다. 증폭 산물은 또다른 실험실 위치로 옮겨, 2% 아가로즈 겔 상에서 전기영동하였고, 0.2㎛ Nytran Plus 막 및 중성 전이 방법에 관한 공급자의 프로토콜(Schleicher & Schuell, Keene, NH)을 사용하여 서던 블롯을 행하였다. 그 결과 얻은 필터는 1x10⁶CPM/1ml 마마글로빈 cDNA 탐침과 혼성화하였고, 위에서 설명한 바 대로 세척하였다.

본 검사의 결과는 도 14에 나타내었다. 15개의 유방암 경우(CA) 중에서, 9개(60%)가 PBSCs로부터 감지가능한 마마글로빈 mRNA를 보였으며, 이는 수집된 산물들은 오염된 유방암 세포를 포함하고 있다는 것을 암시한다. 나머지 6개의 경우에 있어서, 일차 종양들은 마마글로빈 발현에 대하여 조사되지 않았기 때문에, 상기 PBSCs에 대한 신호의 부재가 종양 세포의 진정한 부재를 의미하는 마마글로빈-발현 종양 세포의 부재를 나타내는 것인지 검사 비민감성(assay insensitivity)을 나타내는 것인지는 알 수 없었다. 건강한 공여자(NL)로부터 유래한 집합에서는 어떠한 경우도 마마글로빈 mRNA가 감지되지 않았다. 1:10⁵유방암을 포함하는 2배수 양성 표준(+)으로부터 얻은 강한 혼성화 신호에 근거하여, 현 검사 형식(format)에대한 감지 한계는 아마도 1:10⁶세포 훨씬 이하일 것으로 판단된다. 본 검사의 감지 빈도 및 높은 특이성은 대규모의 예측적인(prospective) 연구에서 미지의 순환성 종양세포의 예후적(prognostic) 중요성을 연구하는데 유용한 도구일 수 있다는 것을 의미한다. 예를 들면, 마마글로빈 발현은 사이토카인 프라임(cytokine priming)(Passos-Coelho 등,J.Clin. Oncol. 14:2569-2575, 1996) 또는 종양세포 퍼지(purging) 프로토콜(Passos-Coelho 등,Cancer Res. 54:2366∼2371, 1994) 후 말초 간세포 산물의 종양 오염을 평가하는 데 유용할 수 있다.

상기와 같은 관점에서, 본 발명의 여러가지 잇점이 달성될 수 있고 다른 이로운 결과들이 얻어질 수 있다는 것을 보였다.

본 발명의 범위를 벗어나지 않고 상기한 방법 및 조성물에 대하여 다양한 변화가 이루어질 수 있기 때문에, 상기 상세한 설명 및 첨부 도면에 포함된 모든 사항은 예시적인 것이며 제한적인 의미로 해석되어서는 안된다.

특허 및 특허 출원을 포함한 본 명세서에 언급된 모든 참조 문헌은 참고문헌으로 본 명세서에 포함되어진다. 본 명세서에 포함한 참조문헌 중의 논의는 단순히 그 저자들의 주장을 요약하고자 한 것이지 어떤 참조문헌이 선행기술이라는 것을 인정하는 것은 아니다. 출원인은 참조된 문헌의 정확성 및 관련성에 대하여 반박할 수 있는 권리를 유보하고 있다.

Claims

환자로부터 유래한 검체 내에서 마마글로빈 폴리펩타이드를 암호화하는 mRNA의 존재를 감지하는 단계를 포함하고, 상기 mRNA는 서열번호 15 또는 서열번호 15의 상보체와 특이적으로 혼성화하며, 정상인에 대한 농도보다 높은 상기 mRNA의 증가된 농도가 유방암 세포의 존재를 나타내는 것을 특징으로 하는 환자 내의 유방암 세포의 존재를 감지하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 감지하는 단계는 다음의 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 환자 내의 유방암 세포의 존재를 감지하는 방법:

(a) 서열번호 15와 특이적으로 혼성화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계,

(b) 상기 폴리뉴클레오티드가 유방 종양성 세포(neoplasia cells)로부터 유래한 mRNA와 특이적으로 혼성화될 수 있도록 하는 조건하에서, 상기 폴리뉴클레오티드와 검체를 배양시키는 단계,

(c) 폴리뉴클레오티드-mRNA 혼성화 복합체의 존재를 감지하는 단계.
제 2항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 15의 상보체 또는 그들의 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 환자 내의 유방암 세포의 존재를 감지하는 방법.
제 3항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되는 마마글로빈 폴리펩타이드를 암호화하는 cDNA인 것을 특징으로 하는 환자 내의 유방암 세포의 존재를 감지하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 검체는 림프절 조직을 포함하는 것을 특징으로 하는 환자 내의 유방암 세포의 존재를 감지하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 감지하는 단계는 다음 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 환자 내의 유방암 세포의 존재를 감지하는 방법:

(a) 역전사 방법을 사용하여 mRNA로부터 마마글로빈 폴리펩타이드를 암호화하는 cDNA를 제조하는 단계,

(b) PCR 방법에 의하여 증폭되어야 할 cDNA의 영역을 정의하기 위하여 cDNA에 특이적으로 혼성화되는 두 개의 올리고뉴클레오티드를 제공하는 단계, 여기서, 하나의 올리고뉴클레오티드는 아주 엄격한 조건하에서 서열번호 1에 혼성화되고, 다른 하나의 올리고뉴클레오티드는 아주 엄격한 조건하에서 서열번호 1의 상보체에 혼성화된다,

(c) 프라이머로서 상기 두 개의 올리고뉴클레오티드를 사용하는 PCR 방법에 의하여 cDNA 영역을 증폭하는 단계,

(d) 증폭된 cDNA 영역의 존재를 감지하는 단계.
제 6항에 있어서, 상기 두 개의 올리고뉴클레오티드 중 하나는 서열번호 4를 포함하고, 다른 하나의 올리고뉴클레오티드는 서열번호 16을 포함하는 것을 특징으로 하는 환자 내의 유방암 세포의 존재를 감지하는 방법.
제 6항에 있어서, 상기 검체는 말초 백혈구(peripheral leukocytes)를 포함하는 것을 특징으로 하는 환자 내의 유방암 세포의 존재를 감지하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 감지하는 단계는 다음의 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 환자 내의 유방암 세포의 존재를 감지하는 방법:

(a) 비대칭 갭 리가제 연쇄반응(asymmetric gap ligase chain reaction)에 의하여 마마글로빈을 암호화하는 mRNA 내의 목표 영역을 증폭시키는 단계, 및

(b) 상기 증폭된 목표 영역의 존재를 감지하는 단계.
용기 내에 포함되는 PCR 방법용 프라이머로서 두 개의 올리고뉴클레오티드를 포함하여 이루어지고, 상기 올리고뉴클레오티드는 증폭되어야 할 영역을 정의하기 위하여 서열번호 2를 암호화하는 cDNA에 특이적으로 혼성화되는 것을 특징으로 하는 검체 내의 유방 종양성 세포의 존재 감지용 키트.
제 10항에 있어서, 상기 두 개의 올리고뉴클레오티드 중 하나는 서열번호 4를 포함하고, 다른 하나의 올리고뉴클레오티드는 서열번호 6을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 검체 내의 유방 종양성 세포의 존재 감지용 키트.
환자로부터 유래한 검체 내의 마마글로빈 폴리펩타이드의 존재를 감지하는 단계를 포함하며, 정상인에 대한 농도보다 높은 상기 마마글로빈 폴리펩타이드의 증가된 농도가 유방암의 존재를 나타내는 것을 특징으로 하는 환자 내의 유방암의 존재를 감지하는 방법.
제 12항에 있어서, 상기 감지하는 단계는 마마글로빈 폴리펩타이드와 정제된 항체를 반응시키는 단계 및 상기 마마글로빈 폴리펩타이드와 상기 항체의 결합을 감지하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 항체는 서열번호 17의 적어도 5개의 아미노산을 포함하여 이루어지는 마마글로빈 에피토프(epitope)에 특이적인 것을 특징으로 하는 환자 내의 유방암의 존재를 감지하는 방법.
제 13항에 있어서, 상기 마마글로빈 폴리펩타이드는 서열번호 17을 포함하는 것을 특징으로 하는 환자 내의 유방암의 존재를 감지하는 방법.
제 14항에 있어서, 상기 정제된 항체는 폴리클로날 항체이고, 상기 마마글로빈 에피토프는 서열번호 14를 포함하는 것을 특징으로 하는 환자 내의 유방암의 존재를 감지하는 방법.
제 14항에 있어서, 상기 정제된 항체는 모노클로날 항체이고, 상기 마마글로빈 에피토프는 서열번호 14를 포함하는 것을 특징으로 하는 환자 내의 유방암의 존재를 감지하는 방법.
제 13항에 있어서, 상기 검체는 유방 종양 조직을 포함하는 것임을 특징으로 하는 환자 내의 유방암의 존재를 감지하는 방법.
용기 내에 포함된 정제된 항체를 포함하고, 상기 항체는 서열번호 2의 적어도 5개의 아미노산을 포함하여 이루어진 마마글로빈 에피토프에 특이적이고, 상기 항체는 서열번호 17 또는 그의 대립형질적 변형체를 포함하는 마마글로빈 폴리펩타이드와 반응하는 것을 특징으로 하는 검체 내의 유방암 세포의 존재 감지용 키트.
제 18항에 있어서, 상기 마마글로빈 에피토프는 서열번호 14를 포함하는 것을 특징으로 하는 검체 내의 유방암 세포의 존재 감지용 키트.
환자로부터 유래한 내막조직(endometrial tissue)의 검체 내에서의 마마글로빈 발현을 감지하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 환자 내의 내막암(endometrial cancer)의 존재를 감지하는 방법.
환자로부터 유래한 내막조직 또는 결합된 림프조직의 검체 내의 마마글로빈 폴리펩타이드를 암호화하는 mRNA의 존재를 감지하는 단계를 포함하고, 정상인으로부터 유래한 내막조직에 대한 농도보다 높은 상기 mRNA의 증가된 농도가 내막암 세포의 존재를 나타내는 것을 특징으로 하는 환자 내의 내막암 세포의 존재를 감지하는 방법.
환자로부터 유래한 검체 내의 마마글로빈 폴리펩타이드를 암호화하는 mRNA의 존재를 감지하는 단계를 포함하고, 정상인에 대한 농도보다 높은 상기 mRNA의 증가된 농도가 내막암 세포의 존재를 나타내는 것을 특징으로 하는 내막암을 가진 또는 가졌었던 것으로 알려진 환자 내의 내막암 세포의 존재를 감지하는 방법.
환자로부터 유래한 내막조직 또는 결합된 림프조직의 검체 내의 마마글로빈 폴리펩타이드의 존재를 감지하는 단계를 포함하고, 정상인에 대한 농도보다 높은 상기 마마글로빈 폴리펩타이드의 증가된 농도가 내막암의 존재를 나타내는 것을 특징으로 하는 환자 내의 내막암의 존재를 감지하는 방법.
환자로부터 유래한 검체 내의 마마글로빈 폴리펩타이드의 존재를 감지하는 단계를 포함하고, 정상인에 대한 농도보다 높은 상기 마마글로빈 폴리펩타이드의 증가된 농도가 내막암의 존재를 나타내는 것을 특징으로 하는 내막암을 가진 또는 가졌었던 것으로 알려진 환자 내의 내막암의 존재를 감지하는 방법.
환자로부터 유래한 검체내의 마마글로빈 폴리펩타이드를 암호화하는 mRNA의 존재를 감지하는 단계를 포함하고, 정상인에 대한 농도보다 높은 상기 mRNA의 증가된 농도가 유방암 세포의 존재를 나타내며, 유방암을 가진 환자들로부터 유래한 검체의 적어도 43%에서 상기 증가된 농도의 mRNA의 존재를 감지할 수 있는 것을 특징으로 하는 환자 내의 유방암 세포의 존재를 감지하는 방법.
제25항에 있어서, 유방암을 가진 환자들로부터 유래한 검체의 적어도 60%에서 증가된 농도의 상기 mRNA의 존재를 감지할 수 있는 것을 특징으로 하는 환자 내의 유방암 세포의 존재를 감지하는 방법.