KR20090029231A

KR20090029231A - 항―ｎｋｇ2ａ 항체 및 이들의 용도

Info

Publication number: KR20090029231A
Application number: KR1020087031966A
Authority: KR
Inventors: 피에테르 요하네스 루이스 스피; 쇠렌 베르그 패드크재르
Original assignee: 노보 노르디스크 에이/에스
Priority date: 2006-06-30
Filing date: 2007-06-28
Publication date: 2009-03-20
Also published as: RU2499001C2; EP2426150B1; CN101484471A; IL195658B; IL195658A0; NO20090462L; CA2655623A1; RU2008149918A; US20120237510A1; AU2007276294B2; EP2038306B1; EP2426150A1; US9683041B2; US20190248896A1; ZA200810311B; BRPI0712953B8; WO2008009545A1; US8901283B2; TWI537285B; EP2038306A1

Abstract

본원은 인간 치료법에 적합한 인체적응형 버전의 뮤린 항-NKG2A 항체 Z270를 포함하는 항-NKG2A 항체, 및 유관 방법 및 생산 물질 및 이러한 항체의 사용에 관한 것이다. 프레임워크 영역(FR) 내의 선택적 아미노산 역치환을 위한 예시적인 상보성-결정 영역(CDR) 서열 및 부위 및/또는 이러한 항체의 CDR을 또한 개시하였다.

항-NKG2A 항체, Z270, 인체적응형.

Description

항―ＮＫＧ2Ａ 항체 및 이들의 용도{ANTI―NKG2A ANTIBODIES AND USES THEREOF}

본 발명은 항-NKG2A 항체에 관한 것이며, 특히 인체적응형 버전의 뮤린 항-NKG2A 항체 Z270 및, 이러한 항체의 생산 및 사용 방법에 관한 것이다.

CD94/NKG2A는 CD94/NKG2A-리간드 HLA-E를 발현하는 세포의 사멸을 제한하는, NK, NKT 및 T 세포의 서브세트에서 발견되는 세포독성 억제 수용체이다(예컨대, WO99/28748 참조). CD94/NKG2A를 억제하는 항체는 종양 세포에 대한 종양-특이적 림프구의 세포용해 활성을 증가시킬 수 있다. 따라서, CD94/NKG2A-발현 세포의 사멸 없이 암 환자 내에서 CD94/NKG2A를 억제하는 치료적 항체는 종양-성장을 조절할 수 있다. 이와 함께, 특정 림프종 예컨대, NK-림프종은 CD94/NKG2A 발현에 의하여 특성화된다. 이러한 환자에서, CD94/NKG2A-발현 세포를 표적화하고 사멸시키는 치료적 항체는 종양 세포를 박멸할 수 있다. 항-NKG2A 항체는 자가면역 또는 염증 질환의 치료에 사용되도록 제안되어 왔다(예컨대, US20030095965A1, WO2006070286).

CD94/NKG2A에 대한 다양한 항체가 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, Sivori et al.(Eur J Immunol 1996;26:2487-92)는 뮤린 항-NKG2A 항체 Z270에 대하여 언급하고; Carretero et al. (Eur J Immunol 1997;27:563-7)는 뮤린 항- NKG2A 항체 Z199에 대하여 설명하며(Beckman Coulter, Inc.를 통하여 구득가능, 제품번호 IM2750, USA); Vance et al. (J Exp Med 1999;190: 1801-12)는 뮤린 항-NKG2-항체 20D5에 대하여 언급하고 있으며(BD Biosciences Pharmingen를 통하여 구득가능, 카탈로그 번호 550518, USA); 및 미국 특허 출원 제20030095965호는 뮤린 항체 3S9를 설명하며, 이들은 NKG2A, NKG2C 및 NKG2E에 결합한다고 알려져 있다.

현재 사용가능한 항-CD94/NKG2A 항체는 비-인간 기원의 것이며, 이는 이들의 면역원성에 기인하여 인간의 치료적 응용에 가장 부적합하도록 한다. 단순한 인체적응화 방법 예컨대, 예컨대, CDR-이식이 가능하나, 기능적 특성을 충분히 보유하거나 또는 향상시키면서도 면역원성을 최소화하는 최적의 인체적응형 변이를 획득하기 위하여 개체화된 인체적응화 방법이 일반적으로 필요하다. 따라서, 인간 환자의 치료용으로 적합한 항-CD94/NKG2A 항체의 수요가 있다.

본 발명은 항-NKG2A 항체와, 이러한 항체를 포함하는 조성물, 및 이러한 항체의 생산 및 사용 방법을 제공한다. 일 실시상태에서, 항체는 인체적응형 버전의 뮤린 항-NKG2A 항체 Z270이며, 본원에서 "humZ270"로 표기한다. 다른 실시상태에서, 항체는 Z270의 것과 실질적으로 일치하는 가변 중쇄(VH) 및/또는 가변 경쇄(VL) 도메인을 보유하는 인체적응형 버전의 항-NKG2A 항체이다.

프레임워크 영역(FR) 내의 아미노산 치환을 위하거나 및/또는 이러한 항체의 예시적인 상보성-결정 영역(CDR) 잔기 및/또는 부위는 향상된 특성 예컨대, 예컨대, 낮은 면역원성, 향상된 항원-결합 또는 다른 기능성 특성, 및/또는 향상된 물리화학적 특성 예컨대, 예컨대, 보다 나은 안정성을 지닌 항체를 생산하기 위하여 제공된다. 일 특징으로서, 본 발명은 최소한 Kabat CDR의 부분이 인간 수용체 서열 내의 대응 부분과 일치하는 인체적응형 항체를 제공한다. 일 실시상태에서, 인간 수용체 프레임워크 서열은 어떠한 아미노산 치환 또는 역돌연변이도 포함하지 않는다. 다른 실시상태에서, 인간 프레임워크 서열은 최소한 하나의 아미노산 치환을 포함한다. 이러한 예시적인 아미노산 치환의 Kabat 부분은 VH 도메인의 프레임워크 영역 내의 5, 66, 67, 69, 71, 73, 및 75, VL 도메인의 프레임워크 영역 내의 46 및 48, 및 CDR-H2 내의 60, 63, 64, 및 65를 포함한다.

다른 특징으로서, 본 발명은 이러한 항체 및 담체를 포함하는 약학적 조성물, 및 세포독성 또는 검출가능한 약제에 접합된 이러한 항체를 포함하는 면역접합체를 제공한다.

다른 특징으로서, 본 발명은 이러한 항체를 암호화하는 핵산과 벡터, 및 이러한 핵산 및/또는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 제공한다. 또한 이러한 숙주 세포를 배양하여 핵산을 생산함으로써 항-NKG2A 항체를 생산하는 재조합 방법을 제공한다.

다른 특징으로서, 본 발명은 이러한 항-NKG2A 항체 및 사용자가 환자 내의 암 또는 바이러스 질환 등의 질병을 치료하도록 지시하는 설명서를 포함하는 용기를 포함하는 제조 물품을 제공한다. 선택적으로, 이 물품은 다른 약제를 함유하는 다른 용기를 포함할 수 있으며, 여기서 설명서는 사용자가 이 약제와 조합하여 항체로 질병을 치료하도록 한다.

본 발명은 또한 환자 내의 암, 바이러스 질환, 염증 질환 또는 자가면역 질환 등의 질병을 치료하기 위하여 이러한 항-NKG2A 항체를 사용하는 방법을 제공하며, 선택적으로 다른 항암제, 항바이러스제, 또는 항염증제와 조합하여 사용하는 방법을 제공한다.

도 1은 선택된 균주 V- 및 J-세그먼트를 지닌 Z270VL 및 Z270VH 및 Kabat 스킴에 따라 계수된 아미노산 잔기를 지닌 예시적인 humZ270VL1(SEQ ID NO:4) 및 humZ270VH1(SEQ ID NO:5) 서열의 정렬을 나타낸다(Kabat et al, 1991, sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.). 마스크 잔기는 Kabat 스킴 내에서 음영으로 처리하였으며; CDR 잔기는 Kabat 스킴 내에서 볼드체로 나타내었다; 마우스/균주 차이는 VKI_O2/JK4(SEQ ID NO:9) 및 VH1_18/JH6(SEQ ID NO:10) 서열 내에서 음영으로 처리하였으며; 및 잠재적인 역돌연변이 잔기는 humZ270VH/VL 서열 내에서 음영으로 처리하였다. VL 내의 확인된 잠재적인 역돌연변이는 L46F 및 I48V 였다. 중쇄 내에서 확인된 잠재적인 역돌연변이는 V5Q, M69L, T71V, T73K, 및 T75S 였다. 또한 결과 humZ270VL 컨센서스("humZ270VL1 cons;" SEQ ID NO:6) 및 humZ270VH1 ("humZ270VH1 cons;" SEQ ID NO:7) 컨센서스 서열을 나타내었다. humZ270VL1 cons에서, 위치 46의 아미노산은 L 또는 F, 및 위치 48의 아미노산은 I 또는 V이다. humZ270VH1 cons에서, 위치 5의 아미노산은 V 또는 Q; 위치 69의 아미노산은 M 또는 L; 위치 71의 아미노산은 T 또는 V; 위치 73의 아미노산은 T 또는 K; 및/또는 위치 75의 아미노산은 T 또는 S이다. 대안적인 humZ270VH1, humZ270VH1cons2(SEQ ID NO:8)에서, 위치 5의 아미노산은 V 또는 Q; 위치 60의 아미노산은 S 또는 A; 위치 63의 아미노산은 L 또는 F; 위치 64의 아미노산은 Q 또는 K; 위치 65의 아미노산은 G 또는 D; 위치 66의 아미노산은 R 또는 K; 위치 67의 아미노산은 V 또는 A; 위치 69의 아미노산은 M 또는 L; 위치 71의 아미노산은 T 또는 V; 위치 73의 아미노산은 T 또는 K; 및/또는 위치 75의 아미노산은 T 또는 S이다.

도 2는 Kabat 정의에 따르는 예시적인 humZ270 항체의 CDR을 나타낸다. 뮤린 Z270 CDR과 비교한 차이는 볼드체로 나타내었다.

도 3A-H는 실시예에 언급된 플라스미드를 나타낸다. (A) TA 클로닝을 위한 pMD19-T 벡터 맵. (B) 임시 발현을 위한 pJSV002 클로닝 벡터 맵. (C) 경쇄는 뮤린 kappa 불변 영역을 지닌 pJSV002 내로 삽입되었다. (D) 뮤린 IgG1 불변 영역을 포함하는 pJSV002-mIgG1 변이체. (E) Z270 중쇄 가변 영역 및 IgG1 중쇄 불변 영역을 포함하는 pJSV002-mIgG1 Z270 H1. (F) 경쇄 가변 영역 및 인간 kappa 사슬 불변 영역을 포함하는 pJSV002-hKappa Z270 L11. (G) pJSV002-IgG4-S241P. (H) pJSV002-IgG4-S241P Z270H1.

도 4는 각각 Z270, (A) 내지 (J), SEQ ID NO:14-23으로부터 유도되거나 또는 이에 기초한 다른 서열을 나타낸다. 자세한 사항은 실시예 2-5를 참조.

도 5는 인체적응형 Z270 중쇄의 발현을 위한 벡터의 예시적인 설계를 나타낸다.

도 6은 인체적응형 Z270 경쇄의 발현을 위한 벡터의 예시적인 설계를 나타낸 다.

도 7은 HEK293 세포 내의 인체적응형 Z270 항체의 임시 발현 절차의 예시적인 개요를 나타낸다.

도 8은 항원에 대한 humZ270의 결합 친화도를 측정하기 위한 예시적인 Biacore 분석을 나타낸다.

도 9는 키메라 Z270(A) 및 humZ270VL1/VH1(B)의 친화도 결정을 나타낸다.

도 10은 경쇄 또는 중쇄 내에 다른 역돌연변이를 지닌 humZ270VL1/VH1의 친화도 결정을 나타낸다. 키메라 Z270를 비교를 위하여 사용하였다.

도 11은 역돌연변이없는(humZ270H3) 또는 역돌연변이를 지닌(humZ270VH4) VH1_18/JH6 중쇄 수용체 프레임워크 내로 뮤린 Z270 Kabat CDRs H1-H3의 표준 CDR-이식에 관한 전략을 나타낸다.

도 12는 모두 CDR-H2의 부분적인 인간 부분을 지닌, 다른 인간 수용체 서열 내의 humZ270VH 구조체들 간의 정렬을 나타낸다.

도 13은 모두 hZ270VL1/VH1의 KD로 표준화된, humZ270 변이체 VL1/VH1 및 VH3-VH8의 Biacore 친화도 평가의 결과를 나타낸다.

도 14는 Z270 VL 및 VH 세그먼트 내에서 결정적인 파라토프 잔기를 확인하기 위한 알라닌-스캔 돌연변이생성을 위하여 선택된 잔기를 나타낸다.

도 15는 키메라 Z270의 결합으로 표준화된 Z270VH 알라닌 돌연변이체의 Biacore 친화도 평가의 결과를 나타낸다.

도 16은 키메라 Z270의 결합으로 표준화된 Z270VL 알라닌 돌연변이체의 Biacore 친화도 평가의 결과를 나타낸다.

도 17은 흐름세포분석기를 사용한, CD94/NKG2A 또는 CD94/NKG2C를 안정적으로 과다-발현하는 Ba/F3 세포의 다양한 재조합 Z270 변이체의 결합을 나타낸다.

도 18은 CD94/NKG2A+ NKL 세포에 의한 ⁵¹Cr-표지 LCL 721.221-Cw3 세포의 사멸을 유도하기 위한 재조합 Z270, 키메라 Z270, humZ270VL1/VH1, 및 Z199의 능력을 평가하는 분석의 결과를 나타내며, humZ270VL1/VH1가 효과적으로 사멸을 유도하였다.

도 19는 농도 의존 방식(다이아몬드)에서 humZ270VL1/VH1가 Ba/F3-CD94/NKG2A 세포에 효과적으로 결합하는 것을 나타낸다. 그러나, 세포를 HLA-E 4량체로 사전배양하는 경우, humZ270VL1/VH1가 Ba/F3-CD94/NKG2A 세포와 결합하는 것이 차단되었다(사각형).

도 20은 VH 내에 V5Q 돌연변이를 지닌 humZ270VL1/VH1 및 humZ270 변이체의 서로 다른 두 제품이 CD94/NKG2C-발현 세포가 아닌 CD94/NKG2A-발현 세포에 결합한다는 것을 나타내며, V5Q-변이체가 약간 효율적이다.

정의

본원에 사용된 용어 "항체"는 최광의로 사용되며, 특히 전장 단클론성 항체, 다클론성 항체, 다특이적 항체(예컨대, 2특이적 항체), 및 소망하는 생물학적 활성을 나타내는 항체 절편을 포함한다. 항체 생산에 관한 다양한 기법은, 예컨대, 문헌 Harlow, et al., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.,(1988)에 제공되어 있다.

"항체 절편"은 전장 항체의 부분을 포함하며, 바람직하게는 항원-결합 또는 이들의 가변 영역을 포함한다. 항체 절편의 예는 Fab, Fab', F(ab)₂, F(ab')₂, F(ab)₃, Fv(일반적으로 항체 단일 암의 VL 및 VH 도메인), 단일-사슬 Fv(scFv), dsFv, Fd 절편(일반적으로 VH 및 CH1 도메인), 및 dAb(일반적으로 VH 도메인) 절편; VH, VL, VhH, 및 V-NAR 도메인; 미니바디, 다이어바디, 트라이어바디, 테트라바디, 및 카파 바디(예컨대, 문헌 Ill et al., Protein Eng 1997;10: 949-57); 카멜 IgG; IgNAR; 및 항체 절편, 및 하나 이상의 분리된 CDR 또는 기능성 파라토프로 부터 형성된 다특이적 항체 절편을 포함하며, 분리된 CDR 또는 항원-결합 잔기 또는 폴리펩타이드는 함께 결합 또는 링크되어 기능성 항체 절편을 형성하게 된다. 다양한 유형의 항체 절편은, 예컨대, 문헌 Holliger and Hudson, Nat Biotechnol 2005;23, 1 126-1 136; WO 2005040219, 및 미국 특허출원 20050238646 및 20020161201에 설명 및 검토되어 있다.

본원에 사용된 용어 "항체 유도체"는 전장 항체 또는 바람직하게는 최소한 항원-결합 또는 이들의 가변 영역을 포함하는 항체의 절편을 포함하며, 여기서 하나 이상의 아미노산은 예컨대, 항체와 제2 분자의 결합을 위하여 예컨대, 알킬화, PEG화, 아실화, 에스테르 형성 또는 아미드 형성 등에 의하여 화학적으로 변형된다. 여기에는 PEG화 항체, 시스테인-PEG화 항체, 및 이들의 변이체를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

"면역접합체"는 제2 약제, 예컨대 세포독성제, 검출가능한 약제 등에 결합하거나 또는 링크된 항체 유도체를 포함한다.

"인체적응형" 항체는 비-인간 면역글로블린으로부터 유도된 최소 서열을 함유하는 인간/비-인간 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인체적응형 항체는 인간 면역글로블린(수용자 항체) 이며, 여기서, 수용자의 고가변 영역의 잔기는 예컨대 바람직한 특이성, 친화도, 및 용량을 지닌 마우스, 레트, 레빗, 또는 비인간 영장류 등의 비인간 종(공여자 항체)의 고가변 영역의 잔기에 의하여 치환된다. 일 실시 상태로서, 인간 면역글로블린의 프레임워크 영역(FR) 잔기는 대응하는 비인간 잔기에 의하여 치환된다. 또한, 인체적응형 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체 내에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 더욱 향상시키기 위하여 수행된다. 일반적으로, 인체적응형 항체는 실질적으로 모든 최소한 하나의, 및 일반적으로 두개의, 가변 도메인을 포함하게 되며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 고가변 루프는 비인간 면역글로블린의 것에 대응하며, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 잔기는 인간 면역글로블린 서열의 것이다. 인체적응형 항체는 선택적으로 최소한 면역글로블린 불변 영역(Fc)의 일부를 포함할 수 있으며, 일반적으로 인간 면역글로블린의 것을 포함하게 된다. 상세한 연구를 위하여, 예컨대, 문헌 Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992), WO 92/02190, 미국 특허 출원 20060073137, 및 미국 특허 6,750,325, 6,632,927, 6,639,055, 6,548,640, 6,407,213, 6,180,370, 6,054,297, 5,929,212, 5,895,205, 5,886,152, 5,877,293, 5,869,619, 5,821,337, 5,821,123, 5,770,196, 5,777,085, 5,766,886, 5,714,350, 5,693,762, 5,693,761, 5,530,101, 5,585,089, 및 5,225,539를 참조한다.

본원에 사용된 용어 "고가변 영역"은 항원-결합을 책임지는 항체의 아미노산 잔기를 의미한다. 고가변 영역은 일반적으로 "상보성-결정 영역" 또는 "CDR"(경쇄 가변 도메인 내의 잔기 24-34(L1), 50-56(L2) 및 89-97(L3) 및 중쇄 가변 도메인 내의 31-35(H1), 50-65(H2) 및 95-102(H3); Kabat et al. 1991, supra)의 아미노산 잔기 및/또는 "고가변 루프"(경쇄 가변 도메인 내의 잔기 26-32(L1), 50-52(L2) 및 91-96(L3) 및 중쇄 가변 도메인 내의 26-32(H1), 53-55(H2) 및 96-101(H3); Chothia and Lesk, J. Mol. Biol 1987;196:901-917)의 이러한 잔기를 포함한다. 일반적으로, 이 영역 내의 아미노산 잔기의 계수는 문헌 Kabat et al., 전게서에서 설명된 방법에 의하여 수행되었다. 예컨대 "Kabat 위치", " Kabat 계수를 사용", "Kabat에 의한 가변 도메인 잔기의 계수" 및 "Kabat에 의하여"라는 어구는 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인의 이 계수 시스템을 의미한다. Kabat 계수 시스템을 사용하면, 펩타이드의 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 CDR의 감축시키거나 또는 그 안의 삽입에 대응하는 더 적은 또는 추가의 아미노산을 함유할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 가변 도메인은 CDR H2의 잔기 52 뒤에 단일 아미노산 삽입(Kabat에 따른 잔기 52a) 및 중쇄 FR 잔기 82 뒤에 삽입된 잔기(예컨대, Kabat에 따른 잔기 82a, 82b, 및 82c, 등)를 포함할 수 있다. 잔기의 Kabat 계수는 "표준" Kabat 계수 서열과 함께 항체의 서열의 상동인 영역에서의 정렬에 의하여 주어진 항체를 결정할 수 있다. 달리 적시하거나 문맥에 반하지 않는 한, 본원의 VL 또는 VH 서열 내의 모든 아미노산 잔기의 위치는 Kabat에 따른다. "프레임워크 영역" 또는 "FR" 잔기는 본원에 정의된 CDR이 아닌 이러한 VH 또는 VL 잔기이다.

폴리펩타이드의 "변이체"는 일반적으로 천연 또는 "모" 폴리펩타이드인 참조 폴리펩타이드와 실질적으로 일치하는 아미노산 서열을 보유하는 폴리펩타이드를 의미한다. 폴리펩타이드 변이체는 천연 아미노산 서열 내의 특정 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 및/또는 삽입을 보유할 수 있다. "보존적" 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 물리화학적 특성을 지닌 측쇄를 지닌 아미노산 잔기로 치환된 것이다. 유사한 측쇄를 지닌 아미노산 잔기의 족은 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 염기성 측쇄(예컨대, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예컨대, 아스파르트산, 글루탐산), 비전하 극성 측쇄(예컨대, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 타이로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄(예컨대, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-가지형 측쇄(예컨대, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예컨대, 타이로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 지닌 아미노산을 포함한다.

문맥상 두 아미노산이 "실질적으로 일치하는" 이라는 표현은 예컨대 디폴트 갭 중량을 사용하는 프로그램 GAP 또는 BEST-FIT에 의한 최적 정렬일 경우, 서열이 최소한 약 50, 최소한 약 60, 최소한 약 70, 최소한 약 80, 최소한 약 90, 최소한 약 95, 최소한 약 98, 또는 최소한 약 99% 서열 일치를 공유한다는 것을 의미한다. 일 실시상태에서, 일치하지 않는 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환에 의하여 달라 진다. 서열 일치성은 일반적으로 서열 분석 소프트웨어를 사용하여 측정될 수 있다. 단백질 분석 소프트웨어는 다양한 치환, 결실 및 보존적 아미노산 치환을 포함하는 다른 변형에 의한 유사성의 측정을 사용하여 유사한 서열을 부합시킨다. 예를 들어, 구득가능한 GCG 소프트웨어는 프로그램 예컨대 "Gap" 및 "BestFit"을 포함하며, 이들은 밀접 유관된 폴리펩타이드, 예컨대 유기체의 다른 종의 상동 폴리펩타이드 사이 또는 야생형 단백질 및 이들의 뮤테인 사이의 서열 상동성 또는 서열 일치성을 결정하기 위한 디폴트 변수를 사용할 수 있다. 예컨대, GCG 버전 6.1. 폴리펩타이드 서열은 디폴트 또는 추천 변수를 적용하는 FASTA 또는 ClustalW를 사용하여 비교될 수 있다. GCG 버전 6.1.의 프로그램인, FASTA(예컨대, FASTA2 및 FASTA3)는 조회 및 검색 서열 사이의 최상의 오버랩의 영역의 정렬 및 퍼센트 서열 일치성을 제공한다(Pearson, Methods Enzymol. 1990; 183:63-98; Pearson, Methods Mol. Biol. 2000; 132: 185-219). 다양한 유기체의 다수의 서열을 함유하는 데이터베이스와 서열을 비교하는 경우 등의 또 다른 바람직한 알고리즘은 컴퓨터 프로그램 BLAST, 특히, 디폴트 변수를 사용하는 blastp이다. 예컨대, Altschul et al., J. Mol. Biol. 1990;215:403-410; Altschul et al., Nuclic Acids Res. 1997;25:3389-402 (1997)를 참조한다; 각각은 참조자료로서 본원에 포함되어 있다. 실질적으로 일치하는 두 아미노산 서열 내의 "대응하는" 아미노산 위치는 일반적으로 디폴트 변수를 사용하는 본원에 언급된 모든 단백질 분석 소프트웨어에 의하여 정렬된 것이다.

참고 항체(예컨대, Z270)의 "생물학적 특성"을 지닌 항체는 동일한 항원(예 컨대 NKG2A)에 결합하는 다른 항체와 구별되는 항체의 하나 이상의 생물학적 특성을 구비하는 것이다. 예를 들어, Z270의 생물학적 특성을 지닌 항체는 NKG2A의 활성화를 차단하거나, 및/또는 NKG2A의 세포외 도메인의 결합에서 Z270와 경쟁할 수 있다.

NKG2A(OMIM 161555, 이의 전체 내용은 본원에 참고자료로서 포함되어 있다)는 전사체의 NKG2 군의 구성원이다(Houchins, et al. (1991) J. Exp. Med. 173:1017-1020). NKG2A는 다소의 차등 스플라이싱을 나타내는 25 kb에 이르는 7개의 엑손에 의하여 암호화된다. NKG2A는 NK 세포, α/β T 세포, γ/δ T 세포, 및 NKT 세포의 서브세트의 표면상에서 발견되는 억제 수용체이다. 억제 KIR 수용체와 같이, 이의 세포질 도메인 내에 ITIM을 포함한다. 본원에서 사용되는, "NKG2A"는 NKG2A 유전자 또는 암호화된 단백질의 모든 변이체, 유도체, 또는 아이소타입을 의미한다. 또한 하나 이상의 생물학적 특성 또는 전장 NKG2A 야생형의 기능을 공유하며, 최소한 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 일치성을 공유하는 모든 핵산 또는 단백질 서열을 포함한다. 인간 NKG2A는 다음의 서열의, 잔기 1-70를 포함하는 세포질 도메인, 잔기 71-93를 포함하는 막관통 영역, 및 잔기 94-233를 포함하는 세포외 영역을 지닌 3개의 도메인 내의 233개의 아미노산을 포함한다:

MDNQGVIYSDLNLPPNPKRQQRKPKGNKSSILATEQEI

TYAELNLQKASQDFQGNDKTYHCKDLPSAPEKLIVGILGIICLILMASVVTIV

VIPSTLIQRHNNSSLNTRTQKARHCGHCPEEWITYSNSCYYIGKERRTWEES

LLACTSKNSSLLSIDNEEEMKFLSIISPSSWIGVFRNSSHHPWVTMNGLAFK

HEIKDSDNAELNCAVLQVN RLKSAQCGSSIIYHCKHKL (SEQ ID NO:11)

NKG2C(OMIM 602891, 이의 전체 내용은 본원에 참고자료로서 포함되어 있다) 및 NKG2E (OMIM 602892, 이의 전체 내용은 본원에 참고자료로서 포함되어 있다)는 전사체의 NKG2군의 두개의 다른 구성원이다(Gilenke, et al. (1998) Immunogenetics 48:163-173). NKG2C 및 NKG2E는 NK 세포의 표면상의 수용체를 활성화시킨다.

HLA-E(OMIM 143010, 이의 전체 내용은 본원에 참고자료로서 포함되어 있다)는 세포 표면 상에서 발현되며, 다른 MHC 클래스 I 분자의 신호 서열로부터 유도되는 펩타이드의 결합에 의하여 조절되는 비전통적인 MHC 분자이다. HLA-E는 CD94/NKG2A, CD94/NKG2B, 및 CD94/NKG2C에 특이적으로 결합하는 자연 살상(NK) 세포 및 일부 T 세포에 결합한다(예컨대, Braud et al. (1998) Nature 391 :795-799, 이의 전체 내용은 본원에 참고자료로서 포함되어 있다). HLA-E의 표면 발현은 CD94/NKG2A+ NK, T, 또는 NKT 세포 클론에 의한 용해로부터 표적 세포를 보호하기에 충분하다. 본원에 사용되는, "HLA-E"는 HLA-E 유전자 또는 암호화된 단백질의 모든 변이체, 유도체, 또는 아이소타입을 의미한다. 또한 야생형, 전장 HLA-E의 하나 이상의 생물학적 특성 또는 기능을 공유하며, 및 최소한 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 일치성을 공유하는 모든 핵산 또는 단백질 서열을 포함한다.

핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계에 놓이는 경우 "작동가능하게 링크"된 다. 예를 들어, 사전서열 또는 분비 리더를 위한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 관여하는 사전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드를 위한 DNA에 작동가능하게 링크되며; 프로모터 또는 인헨서는 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 암호화 서열에 작동가능하게 링크되고; 또는 리보솜-결합 부위는 이들이 위치되어 번역을 촉진하는 경우 암호화 서열에 작동가능하게 링크된다. 일반적으로, "작동가능하게 링크"된다는 것은 링크된 DNA 서열이 인접하며, 분비 리더의 경우, 인접하고 리딩기에 있다는 것을 의미한다. 그러나, 인헨서는 인접해서는 안된다. 링크는 편리한 제한 부위에서의 결찰에 의하여 수행된다. 이러한 부위가 존재하지 않는다면, 종래의 방식에 따라 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터 또는 링커를 사용한다.

"분리된" 분자는 조성물 내의 우세한 종인 분자이며, 여기서, 이들은 이들이 보유한 분자의 클래스에 대하여 발견된다(즉, 이들은 조성물 내의 분자 유형의 최소한 약 50%를 차지하며, 일반적으로 조성물 내에서 최소한 약 70%, 최소한 약 80%, 최소한 약 85%, 최소한 약 90%, 최소한 약 95%, 또는 그 이상의 분자의 종, 예컨대 펩타이드를 차지하게 된다). 일반적으로, 항체 분자의 조성물은 조성물 내의 존재하는 모든 펩타이드 종이라는 의미에서 또는 제안된 사용이라는 의미에서 최소한 실질적으로 활성 펩타이드 종의 98%, 98%, 또는 99%의 항체 분자에 대한 상동성을 나타낸다.

본 발명의 견지에서, "치료" 또는 "치료하는"이라는 의미는 달리 적시하지 않는다면 질병 또는 질환의 하나 이상의 증상 또는 임상적 유관 징후를 예방, 완화, 관리, 치유 또는 감소시키는 것을 의미한다. 예를 들어, 질병 또는 질환의 하 나 이상의 증상 또는 임상적 유관 징후가 확인되지 않은 환자의 "치료"는 예방 또는 예방적 요법이며, 반면에 질병 또는 질환의 하나 이상의 증상 또는 임상적 유관 징후가 확인된 환자의 "치료"는 일반적으로 예방 또는 예방적 요법을 구성하지 않는다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 NKG2A에 결합하는 항체에 관한 것이다. 일 특징으로서, 항체는 인간 NKG2C 또는 NKG2E에는 결합하지 않으면서 NKG2A에는 특이적으로 결합하는 뮤린 단클론성 항체인 항체 Z270의 인체적응형 버전이다. Z270는 인간 CD94/NKG2A의 기능을 차단할 수 있으며, 농도-의존성 방식으로 CD94/NKG2A-제한 림프구에 의한 세포 살상을 특이적으로 유도한다.

본 발명은, 예컨대, 최소한 VH CDR 예컨대 CDR-H2의 부분이 대응하는 인간 VH 수용체 서열의 부분과 일치하는 humZ270 변이체를 제공하며, 따라서 인체적응형 항체의 면역원성을 감소시킨다. 놀랍게도, 이러한 인체적응형 변이체는 뮤린 또는 키메라 형태의 Z270 보다 CD94/NKG2A-발현 세포독성 림프구의 세포독성을 증가시키는데 더욱 효과적이다. 다른 특징으로서, 본 발명은 뮤린 항체 Z270 내의 것에 대응하는 특정 항원-결합 잔기, 및 인간 프레임워크 서열을 포함하는 CDR을 구비하는 항체를 제공한다. 다음의 장과 실시예에서 이러한 특징들을 상세하게 설명할 것이다.

인체적응형 항-NKG2A 항체

비인간 항체의 인체적응 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 일반적으 로, 인체적응화 절차에서, 뮤린 항체의 상호작용-영역을 암호화하는 뉴클레오타이드는 인간 IgG를 암호화하는 cDNA-벡터로 클론될 수 있으며, 이로써 뮤린 CDR이 정착된 인간 IgG 골격으로 구성되는 키메라 항체가 생성될 수 있다. 이러한 키메라 항체는 원 뮤린 항체에 비하여 낮은 친화도, 낮은 안정성, 또는 다른 바람직스럽지 못한 특성을 나타낼 수 있으며, 면역원성이 될 수 있다. 따라서, 키메라 Ab 내의 개별 아미노산은 인간 치료에 응용되는 양질의 기능성 mAb를 얻기 위해 최적화할 필요가 있다.

일반적으로, 인체적응형 항체는 비인간 기원으로부터 이들로 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 보유한다. 이러한 비인간 아미노산 잔기는 "도입" 잔기로 표시하며, 일반적으로 "도입" 가변 도메인으로부터 취한다. 인체적응화는 Winter와 공동연구자들의 방법을 따라 인간 "수용체" 항체의 대응하는 서열을 위한 고가변 영역 서열을 치환함으로써 수행될 수 있다(Jones et al, Nature, 321 : 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)). 따라서, 이러한 "인체적응형" 항체는 키메라 항체이며(U.S. Pat. No. 4,816,567), 여기서, 실질적으로 적은 무손상 인간 가변 도메인이 비인간 종의 대응하는 서열에 의하여 치환되었다. 실제로, 인체적응형 항체는 일부 고가변 영역 잔기 및 가능한 일부 FR 잔기가 설치류 항체 내의 유사 부위의 잔기에 의하여 치환된 일반적으로 인간 항체이다.

인체적응형 항체를 제조하는 다른 방법은 미국 특허출원 2003/0017534에 설명되어 있으며, 여기서, 인체적응형 항체 및 항체 제품은 유전자삽입 비인간 동물 로부터 생산되었다. 비인간 동물은 분화된 인체적응형 면역글로블린을 생산하기 위하여 유전자삽입 비인간 동물 내에서 유전자 재배치 및 유전자 전환을 할 수 있는 하나 이상의 인체적응형 면역글로블린유전좌(loci)를 포함하도록 유전자 조작될 수 있다.

인체적응형 항체를 제조하기 위하여 사용되는 인간 가변 도메인, 경쇄 및 중쇄 모두의 선택은 항원성 감소에 매우 중요하다. 소위 "best-fit" 법에 따라서, 설치류 항체의 가변 도메인의 서열은 공지의 인간 가변-도메인 서열의 라이브러리 또는 인간 균주 서열의 라이브러리에 대하여 선별하였다. 설치류의 것과 밀접한 인간 서열은 인체적응형 항체를 위한 인간 프레임워크 영역으로서 허용된다(Sims et al., J. Immunol. 1993;151:2296 et seq.; Chothia et al, Chothia and Lesk, J. Mol. Biol 1987;196:901-917). 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 아그룹의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유도된 특정 프레임워크 영역을 사용한다. 동일한 프레임워크는 몇종의 다른 인체적응형 항체를 사용할 수 있다 (Carter et al., PNAS USA, 1992;89:4285 et seq.; Presta et al., J Immunol 1993;151:2623 et seq.). 인간 환자 내에서 항체 분자의 면역원성을 감소하도록 설계된 다른 방법은 베니어드 항체(예컨대, 미국 특허 제6,797,492호 및 미국 특허출원 20020034765 및 20040253645) 및 T-세포 에피토프 분석 및 제거에 의하여 변형된 항체(예컨대, 미국 특허출원 제 20030153043호 및 미국 특허 제5,712,120호)를 포함한다.

항체는 항원에 대한 높은 친화도 및 다른 바람직한 생물학적 특성을 보유한 인체적응형이 되는 것이 보다 중요하다. 이러한 목적을 달성하기 위해, 바람직한 방법에 따라, 인체적응형 항체는 모 서열 및 인체적응형 서열의 3차원 모델을 사용하는, 모 서열 및 다양한 개념적 인체적응형 산물의 분석 프로세스에 의하여 제조된다. 3차원 면역글로블린 모델이 일반적으로 사용가능하며, 당해 기술 분야의 숙련자에게 숙지되어있다. 컴퓨터 프로그램은 선택된 후보의 면역글로블린 서열의 가능한 3차원 배치구조를 도시 및 현시하기 위하여 사용될 수 있다. 이러한 현시의 조사는 후보 면역글로블린 서열의 기능에 있어서의 잔기의 유사한 역할의 분석, 즉, 후보 면역글로블린이 이의 항원에 결합하는 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석을 허용한다. 이 방법에 있어서, FR 잔기가 수용자로부터 선택 및 결합 될 수 있으며, 서열을 도입하여, 소망하는 항체 특성, 예컨대 표적항원(들)에 대한 증가된 친화도가 달성된다. 일반적으로, 고가변 영역 잔기는 직접적이며, 가장 실질적으로 항원 결합에 영향을 미친다.

하기의 실시예 1은 NKG2A에 결합하는 인체적응형 항-NKG2A 항체의 설계를 설명하며, 분석은, 최소한 부분적으로, 도 1에 설명되어 있다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 humZ270 항체에서, CDR-H2의 C-말단부(Kabat 잔기 61-65에 대응하는)는 인간 수용체 서열의 대응하는 부분과 일치한다. 추가적으로, 도면의 제호에서 설명된 바와 같이, humZ270VL 서열(SEQ ID NO:4)은 선택적으로 적시된 FR 잔기 L46 및 I48 중의 하나 또는 양자 내에 돌연변이를 포함할 수 있으며, humZ270VH 서열(SEQ ID NO:5)는 선택적으로 하나 이상의 적시된 FR 잔기 V5, M69, T71, T73 및 T75 내에 돌연변이를 포함할 수 있으며, Kabat에 따라 계수된 아미노산을 지닌다. 표 1은 humZ270VH 및 humZ270VL FR 서열 내의 예시적인 인간-대-뮤린 역돌연변이 및 예시적인 FR 돌연변이의 조합을 포함하는 예시적인 humZ270VL 및 humZ270VH 변이체를 설명한다. 표 1 및 본원에서, 아미노산 위치는 Kabat에 따라 지정되었으며, 여기서, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 내의 아미노산 V5, M70, T72, T74, 및 T76에 대응하는 humZ270VH 도메인 내의 아미노산 V5, M69, T71, T73, 및 T75, 또는 다른 예시적인 humZ270VH 서열을 설명하였다.

천연 또는 컨센서스 humZ270VL(SEQ ID NO:4 또는 6) 및/또는 humZ270VH(SEQ ID NO:5, 7, 또는 8) 서열 내의 예시적인 FR 역돌연변이를 포함하는 humZ270VL 및 humZ270VH 변이체
humZ270VL 변이체	humZ270VH 변이체
무 L46F I48V L46V L46F 및 I48V	무 V5Q M69L T71V T73K T75S V5Q 및 M69L V5Q 및 T71V V5Q 및 T73K V5Q 및 T75S M69L 및 T71V M69L 및 T73K M69L 및 T75S T71V 및 T73K T71V 및 T75S T73K 및 T75S V5Q, T73K 및 T75S V5Q, T71V 및 T75S V5Q, T71V 및 T73K V5Q, M69L 및 T75S V5Q, M69L 및 T73K V5Q, M69L 및 T71V T71V T73K 및 T75S M69L, T73K 및 T75S M69L, T71V 및 T75S M69L, T71V 및 T73K V5Q, M69L, T71V 및 T73K, V5Q, M69L, T71V 및 T75S, V5Q, M69L, T73K 및 T75S, V5Q, T71V, T73K 및 T75S, M69L, T71V, T73K 및 T75S, V5Q, M69L, T71 V, T73K 및 T75S

따라서, 본 발명은 Z270 하이브리도마에 의하여 생산되는 항-NKG2A 항체의 인체적응형 버전 및 Z270와 생물학적 특성 및/또는 실질적인 서열 일치성을 공유하는 비인간 항체의 인체적응형 버전을 제공한다. 다른 실시상태에서, 단클론성 항체 또는 절편 또는 이들의 유도체는 비인간 영장류 NKG2A에 결합이 가능하다.

본원의 인체적응형 항체는 인간 VH 및 VL 도메인 내로 통합된 비인간 고가변 영역 또는 CDR 잔기를 포함한다.

일 특징으로서, 본 발명은 인간 수용체 프레임워크 내의 뮤린 항체 Z270의 CDR의 항원-결합 잔기를 포함하는 인체적응형 항체를 제공하며, 여기서, 최소한 6개의 CDR-H2의 C-말단 아미노산 잔기가 인간 수용체 서열 내의 것과 동일하다. 이러한 인체적응형 항체는 예컨대, CD94/NKG2A-발현 세포독성 림프구, 예컨대, 예컨대, NK-세포, NKT-세포, α/β T-세포, 및/또는 γ/δ T-세포의 세포독성 활성, 또는 CD94/NKG2A-발현 세포독성 림프구의 집단의 세포독성 활성을 증진시키는데 있어서 원 뮤린 Z270 항체 또는 이들의 키메라 버전보다 더욱 효과적일 수 있다.

본 발명의 전형적인 항체는 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:5의 잔기 D52, D54, R94, F99, T(100C), 및 W(100F)에 대응하는 항원-결합 잔기 또는 이들을 포함하는 Z270 CDR-H2 및 CDR-H3의 일부를 포함하며, 항원-결합에 결정적인 실시예에 나타내었다. 선택적으로, 항체는 또한 VH 잔기 N35, Y53, E56, D98, V(100A), 및 L(100D)를 포함한다.

또 다른 특징으로서, 인체적응형 항체는 SEQ ID NO:5의 잔기 31-35에 대응하는 CDR-H1 서열 및 SEQ ID NO:5의 잔기 95-102에 대응하는 CDR-H3 서열을 포함하고, 여기서, CDR-H2 서열은 SEQ ID NO:5의 잔기 50-59를 포함한다. 이러한 인체적응형 항체 내에서, VH 영역은 예를 들어, SEQ ID NO:5와 50% 또는 그 이상의 서열 일치성, 예컨대 최소한 60%, 최소한 70%, 또는 최소한 75% 서열 일치성을 보유한다. 이러한 서열을 보유한 예시적인 인체적응형 VH 도메인을 실시예 및 이하에서 설명한다.

일 실시상태에서, 이러한 인체적응형 항체에서, VH 영역의 위치 5의 아미노산은 V 또는 Q가 될 수 있으며; VH 영역의 위치 69의 아미노산은 M 또는 L; VH 영역의 위치 71의 아미노산은 T 또는 V; VH 영역의 위치 73의 아미노산은 T 또는 K; 및/또는 VH 영역의 위치 75의 아미노산은 T 또는 S가 될 수 있다. 별개의 다른 실시 상태에서, VH 영역은 V5 또는 Q5, M69 또는 L69, T71 또는 V71, T73, 또는 K71, 및/또는 T75 또는 S75 잔기를 포함한다. 다른 실시상태에서, 위치 69의 아미노산은 L이다. 다른 부가적이고 대안적인 실시 상태에서, 위치 71의 아미노산은 V이다.

인체적응형 항체는, 예컨대, VH1_18, VH5_a, VH5_51, VH1_f, 및 VH1_46로부터 선택된 인간 수용체 서열의 VH 인간 수용체 프레임워크을 포함하며, 및 J-세그먼트는 JH6, 예컨대, 예컨대, VH1_18, VH5_a, VH5_51, 또는 VH1_f, 또는 공지된 다른 인간 균주 VH 프레임워크 서열이다. 일 실시상태에서, VH 세그먼트는 VH1_18이다. 특정 실시 상태에서, VH 영역은 SEQ ID NO:8의 서열을 포함한다. 또 다른 특정 실시 상태에서, VH 영역은 SEQ ID NO:7의 서열을 포함한다. 예를 들어, VH 영역은 SEQ ID NO:5의 서열을 포함한다.

VL 영역 인간 수용체 서열은, 예컨대, VKI_O2/JK4 일 수 있다. 특정 실시 상태에서, VL 영역은 SEQ ID NO:4를 포함한다.

일 특징으로서, 본 발명의 인체적응형 항체는 적합한 FR 서열을 통한 SEQ ID NO:2의 잔기 95-102로 구성된 CDR-H3에 링크된 SEQ ID NO:2의 잔기 50-59로 구성된 뮤린 부분을 포함하는 CDR-H2를 포함한다.

본원에서 설명한 바와 같이, 일 실시상태에서, 인체적응형 항체는 VH 도메인 내에 FR 치환을 포함하지 않는다. 다른 실시상태에서, 인체적응형 항체는 Kabat에 따른 가변 도메인 계수 시스템을 사용하여, 5, 69, 71, 73 및 75에서 선택된 하나 이상의 위치에서 VH 도메인 FR 치환을 포함한다. 다른 실시상태에서, 인체적응형 항체는 2 이상의 위치 5, 69, 71, 73 및 75에서 VH 도메인 FR 치환을 포함하며; 다른 실시 상태에서, 이러한 위치의 3, 4 또는 모든 위치에서 포함된다. 별개의 독립적인 실시 상태에서, 인체적응형 항체는 5, 69, 71, 73 및 75에서 선택된 위치에서 하나의 VH 도메인 FR 치환을 포함한다. 별도의 독립적인 실시 상태에서, 인체적응형 항체는 위치 5 및 69, 또는 5 및 71, 또는 5 및 73, 또는 5 및 75, 또는 69 및 71, 69 및 73, 또는 69 및 75, 또는 71 및 73, 또는 71 및 75, 또는 73 및 75, 또는 5, 69 및 71, 또는 5, 69 및 73, 또는 5, 69 및 75, 또는 69, 71 및 73, 또는 69, 71 및 75, 또는 71, 73, 및 75, 또는 5, 69, 71, 및 73, 또는 5, 69, 71, 및 75, 또는 5, 71, 73, 및 75, 또는 69, 71, 73, 및 75, 또는 5, 69, 71, 73, 및 75에서 VH 도메인 FR 치환을 포함한다. 프레임워크 치환보다 적은 것으로 면역원성을 최소화힐 수 있으나, 결합 효능은 일부 응용례에서 중요한 고려사항이 될 수 있다. 그러므로, 바람직한 치환은 역돌연변이, 즉, 인간 FR 내의 특정 위치의 아미노산을 비인간 공여자 FR 내에 대응하는 위치의 아미노산으로 치환하는 돌연변이이다. 그러므로, 별개의 독립적인 실시 상태에서, 위치 5의 VH 도메인 아미노산 치환은 V5Q, 위치 69의 아미노산 치환은 M69L, 위치 71의 아미노산 치환은 T71V, 위치 73의 아미노산 치환은 T73K이고, 및 위치 75의 아미노산 치환은 T75S이다. 특정 실시 상태에서, 인체적응형 항체는 위치 71에 V 및/또는 위치 69에 L을 포함한다.

본원의 인체적응형 항체는 인간 VL 도메인 내로 포함되는 비인간 고가변 영역 잔기를 포함할 수 있다. 일 실시상태에서, 인체적응형 항체는 VL 도메인 내에 FR 치환을 포함하지 않는다. 다른 실시상태에서, 인체적응형 항체는 Kabat에 따른 가변 도메인 계수 시스템을 사용하는, 위치 46 및 48 중의 하나의 VL 도메인 FR 치환을 포함한다. 다른 실시상태에서, 인체적응형 항체는 위치 46 및 48 모두에서 VL 도메인 FR 치환을 포함한다. 바람직한 치환은 역돌연변이, 즉, 인간 FR 내의 특정 위치의 아미노산을 비인간 공여자 FR 내에 대응하는 위치의 아미노산으로 치환하는 돌연변이이다. 그러므로, 별개의 독립적인 실시 상태에서, 위치 46의 VL 도메인 아미노산 치환은 L46F이며, 위치 48의 VL 도메인 아미노산 치환은 I48V이다.

예시적인 인체적응형 항체는 SEQ ID NO:5 또는 7의 잔기 31-35에 대응하는 CDR-H1 서열, SEQ ID NO:5 또는 7의 잔기 50-66에 대응하는 CDR-H2 서열, 및 SEQ ID NO:5 또는 7의 잔기 95-102에 대응하는 CDR-H3 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함한다. 인체적응형 항체는 VH 도메인 내에서 V 또는 Q인 Kabat 위치 5의 아미노산, M 또는 L인 Kabat 위치 69의 아미노산, T 또는 V의 Kabat 위치 71의 아미노산, T 또는 K인 Kabat 위치 73의 아미노산, 및/또는 T 또는 S인 Kabat 위치 75의 아미노산을 추가로 포함할 수 있다. 일 실시상태에서, VH 도메인은 5, 69, 71, 73, 및 75, 예컨대, VH FR 치환, 또는 이들의 조합에 대응하는 것으로부터 선택된 최소한 하나의 Kabat 위치 내의 프레임워크 영역 치환을 포함하며, 이를 표 1에 열거하였다. 일 실시상태에서, VH 도메인은 SEQ ID NO:7의 서열을 포함한다. 다른 실시상태에서, VH 도메인은 SEQ ID NO:5의 서열을 포함한다.

예시적인 인체적응형 항체는 대안적으로 SEQ ID NO:4의 잔기 24-34에 대응하는 CDR-L1 서열, SEQ ID NO:4의 잔기 50-56에 대응하는 CDR-L2 서열, 및 SEQ ID NO:4의 잔기 89-97에 대응하는 CDR-L3 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함할 수 있다. 인체적응형 항체는 L 또는 F인 Kabat 위치 46의 아미노산 및/또는 I 또는 V인 Kabat 위치 48의 아미노산을 추가로 포함할 수 있다. 일 실시상태에서, VL 도메인은 예컨대, 모든 VL FR 치환 또는 이들의 조합에 대응하는 46 및 48로부터 선택된 최소한 하나의 Kabat 위치 내의 프레임워크 영역 치환을 포함하며, 표 1에 열거하였다. 일 실시상태에서, VL 도메인은 SEQ ID NO:4의 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 실시 상태에서, VL 도메인은 SEQ ID NO:6의 서열을 포함한다.

또 다른 특징으로서, 본 발명은 선택적으로 Kabat 위치 5, 69, 71, 73, 및/또는 75에서 하나 이상의 FR 치환된 SEQ ID NO:5의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 항체인 인간 NKG2A에 결합하는 인체적응형 항체를 제공한다. 선택적인 FR 치환은, 예컨대, V5Q, M69L, T71V, T73K, 및/또는 T75S, 및 이들의 조합으로 부터 선택될 수 있다. 이러한 인체적응형 항체는 대안적으로, 선택적으로 Kabat 위치 46 및/또는 48에서 하나 이상의 FR 치환을 지닌 SEQ ID NO:4의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 선택적인 FR 치환은, 예컨대, L46F 및/또는 I48V로부터 선택될 수 있다.

선택적으로, 일 특징으로서, VH 도메인은 하나 이상의 CDR 잔기의 아미노산 변형, 예컨대 항체의 친화도를 필수적으로 유지시키거나 또는 향상시키는 변형을 포함한다. 예를 들어, 항체 변이체는 상기 VH CDR 서열 내의 1, 2, 3, 또는 1에서 7 개의 아미노산 치환을 보유할 수 있다.

일 특징으로서, 비인간 공여자 VH CDR 내의 대응하는 위치의 아미노산과 다른 인체적응형 항체 VH CDR 내의 아미노산은 인체적응형 항체의 결합 특성 및/또는 안정성을 향상시키도록 치환될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 이러한 아미노산은 비인간 공여자 VH CDR 내의 대응하는 위치(들)의 아미노산으로 치환될 수 있다. 일 실시상태에서, 변이체 항체는 (SEQ ID NO:5 또는 7 내에서 위치 61, 64, 65, 및 66에 대응하는) Kabat에 따른 60, 63, 64, 및 65에서 선택된 하나 이상의 위치에서 CDRH2 치환을 포함한다. 별개의 독립적인 실시 상태에서, 항체 변이체는 60, 63, 64, 및 65에서 선택된 일 위치의 CDRH2 아미노산 치환을 포함한다. 별도의 독립적인 실시 상태에서, 항체 변이체는 위치 60 및 63, 또는 60 및 64, 또는 60 및 65, 또는 63 및 64, 또는 63 및 65, 또는 64 및 65, 또는 60, 63, 및 64, 또는 60, 63, 및 65, 또는 60, 64, 및 65, 또는 63, 64, 및 65, 또는 60, 63, 64, 및 65의 CDRH2 아미노산 치환을 포함한다. 바람직한 치환은 역돌연변이, 즉, 인체적응형 CDR 내의 특정 위치의 아미노산이 비인간 공여자 CDR 내의 대응하는 위치의 아미노산으로 치환된 돌연변이이다. 그러므로, 별개의 독립적인 실시 상태에서, 위치 60의 CDRH2 아미노산 치환은 A60S, 위치 63의 아미노산 치환은 L63F, 위치 64의 아미노산 치환은 Q64K, 및 위치 65의 아미노산 치환은 G65D이다. 항체 변이체가 하나 이상의 CDRH2 아미노산 치환 A60S, L63F, Q64K, 및 G65D를 포함하는 경우, 항체 변이체는, 선택적으로 하나 이상의 전술한 VH FR 치환과 결합된, Kabat에 따른 위치 66 및 67에서의 VH FR 아미노산 치환을 포함한다. 바람직하게는, 아미노산 치환은 R66K 및 V67A이다. 예를 들어, 일 실시상태에서, 항체 변이체는 선택적으로 추가적인 아미노산 변형과 결합된 A60S, L63F, Q64K, G65D, R66K 및 V67A "역돌연변이"를 지닌, SEQ ID NO:5의 잔기 31-35에 대응하는 CDR-H1 서열, SEQ ID NO:5의 잔기 50-66에 대응하는 CDR-H2 서열, 및 SEQ ID NO:5의 잔기 95-102에 대응하는 CDR-H3 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함한다.

또 다른 특징으로서, 본 발명은 인간 VH 도메인, SEQ ID NO:8의 잔기 31-35에 대응하는 CDR-H1 서열, SEQ ID NO:8의 잔기 50-66에 대응하는 CDR-H2 서열, 및 SEQ ID NO:8의 잔기 95-102에 대응한는 CDR-H3 서열을 포함하는 VH 도메인 내로 함입된 비인간 CDR 잔기를 포함하는 VH 도메인을 포함하는 항체인 인간 NKG2A에 결합하는 인체적응형 항체를 제공하며, 여기서, Kabat 위치 63, 64, 65, 66, 및 67의 아미노산은 각각 F, K, D, K, A 이다. 일 실시상태에서, VH 도메인은 SEQ ID NO:8의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시상태에서, Kabat 위치 60의 잔기는 A이다. 다른 실시상태에서, Kabat 위치 60는 잔기는 S이며, 인체적응형 항체는 CDR-H2의 C-말단부에 인접한 두 아미노산 내의 FR 역돌연변이를 지닌 Z270의 CDR-H1, -H2, 및 H3 서열을 포함한다. 이 절 내의 인체적응형 항체는 다른 잔기, 예컨대, 본원의 Kabat 위치 5, 69, 71, 73, 및/또는 75 내의 FR 역돌연변이를 추가로 포함할 수 있다.

또 다른 특징으로서, 본 발명은 인체적응형 항체를 제공하며, 여기서 VH 영역 내의 Kabat CDR은 모두 뮤린 Z270VH(SEQ ID NO:2)에서 유도되었으며, S60A, F63L, K64Q, 및/또는 D65G 돌연변이를 추가로 포함한다. 일 실시상태에서, 인체적응형 항체는 돌연변이 S60A, F63L, K64Q, 및/또는 D65G 모두를 포함한다.

인체적응형 항체는 또한 본원의 VH 도메인 CDR에 첨가하여 SEQ ID NO:6의 잔기 24-34에 대응하는 CDR-L1 서열, SEQ ID NO:6의 잔기 50-56에 대응하는 CDR-L2 서열, 및 SEQ ID NO:6의 잔기 89-97에 대응하는 CDR-L3 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함할 수 있다. 일 실시상태에서, 인체적응형 항체의 VL 도메인은 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시상태에서, 인체적응형 항체의 VL 도메인은 SEQ ID NO:4의 아미노산 서열을 포함한다. 선택적으로, 이러한 인체적응형 항체는 하나 이상의 VL CDR 잔기의 아미노산 변형, 예컨대, 항체의 친화도를 필수적으로 유지 또는 향상시키는 변형을 포함한다. 예를 들어, 항체 변이체는 상기 VL CDR 서열 내에서 1, 2, 3 또는 1 내지 약 7 까지의 아미노산 치환을 보유할 수 있다.

본 출원은 또한 항원에 대한 인체적응형 항체의 친화도를 향상시키는 추가적인 CDR 또는 FR 돌연변이를 포함하는, 항-NKG2A에 결합하는 친화도-성숙 항체를 고려하였다. 이러한 친화도-성숙 항체의 제조 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 모 항체는 인체적응형 항체, 예컨대, SEQ ID NO:4 및 5의 VL/VH 서열을 포함하는 것(선택적으로 본원에 설명된 하나 이상의 CDRH2 및/또는 FR 치환을 지닌), 또는 각각 SEQ ID NO:6 및 7의 컨센서스 VL/VH 서열을 포함하는 것일 수 있다. 친화도-성숙 항체는 바람직하게는 뮤린 Z270의 것과 비교할 정도로 또는 그보다 우월한 친화도, 예컨대 하기할 결합 분석법을 사용하여 측정한 바로, 예컨대 최소한 약 1, 약 2 또는 약 4배 내지 약 100배 또는 약 1000배 향상된 친화도를 가지고 NKG2A에 결합한다.

또 다른 특징으로서, 본 발명은 Z270, humZ270, humZ270cons, 및/또는 humZ270cons2(각각 SEQ ID NOS:2, 5, 7, 및 8)의 VH 도메인과 최소한 약 50%, 최소한 약 70%, 최소한 약 80% 서열 일치성 (예컨대, 최소한 약 85%, 90%, 95%, 97%, 또는 그 이상의 일치성)을 지닌 VH 도메인을 포함하는 인체적응형 항체를 제공한다. 또 다른 특징으로서, 본 발명은 인간 VH 도메인 내로 포함되는 비인간 CDR 잔기를 포함하는 VH 도메인을 포함하는 NKG2A에 결합하는 인체적응형 항체를 제공하며, 여기서, VH 도메인은 humZ270VH1(SEQ ID NO:5)에 최소한 약 50% 일치한다. 일 실시상태에서, VH 도메인은 SEQ ID NO:5에 최소한 90% 일치한다. 예를 들어, 인체적응형 항체는 SEQ ID NO:5의 잔기 31-35에 대응하는 CDR-H1 서열, SEQ ID NO:5의 잔기 50-66에 대응하는 CDR-H2 서열, 및 SEQ ID NO:5의 잔기 95-102에 대응하는 CDR-H3 서열을 포함할 수 있다. 인체적응형 항체는 대안적으로 VH 도메인 내의 Kabat 위치 5에 V 또는 Q, Kabat 위치 69에 M 또는 L, Kabat 위치 71에 T 또는 V, Kabat 위치 73에 T 또는 K, 및 Kabat 위치 75에 T 또는 S를 포함한다.

또 다른 특징으로서, 본 발명은 대안적으로 Z270, humZ270, 및/또는 humZ270 cons(각각 SEQ ID NOS: 1, 4, 및 6)의 VL 도메인과 최소한 약 50%, 최소한 약 70%, 또는 최소한 약 80% 서열 일치성(예컨대, 최소한 약 85%, 90%, 95%, 97%, 또는 그 이상의 일치성)을 보유한 VL 도메인을 포함하는 항체 분자를 제공한다. 또 다른 특징으로서, 본 발명은 인간 VL 도메인 내에 포함되는 비인간 CDR 잔기를 포함하는 VL 영역을 포함하는 NKG2A에 결합하는 인체적응형 항체를 제공하며, 여기서, VL 도메인은 SEQ ID NO:4에 최소한 50% 일치한다. 일 실시상태에서, VL 영역은 SEQ ID NO:4에 최소한 90% 일치한다. 예를 들어, 인체적응형 항체는 SEQ ID NO:4의 잔기 24-34에 대응하는 CDR-L1 서열, SEQ ID NO:4의 잔기 50-56에 대응하는 CDR-L2 서열, 및 SEQ ID NO:4의 잔기 89-97에 대응하는 CDR-L3 서열을 포함할 수 있다. 인체적응형 항체는 대안적으로 VL 도메인 내의 Kabat 위치 46에 L 또는 F 및/또는 Kabat 위치 48에 I 또는 V를 포함한다. 또 다른 특징으로서, 본 발명은 NKG2A에 특이적으로 결합하며, (a) Z270 VL(SEQ ID NO:1), humZ270 VL(SEQ ID NO:4), 또는 humZ270 VL cons(SEQ ID NO:6)의 CDR-L1, CDR-L2, 및/또는 CDR-L3 서열이나, 또는 (b) Z270 VH(SEQ ID NO:2), humZ270(SEQ ID NO:5), humZ270 cons(SEQ ID NO:7), 또는 humZ270 cons2(SEQ ID NO:8)의 CDR-H1, CDR-H2, 및/또는 CDR-H3 서열을 포함하는 분리된 인체적응형 항체를 제공한다. 또 다른 특징으로서, 본 발명은 최소한 Z270, humZ270, 또는 humZ270 cons의 VH CDR의 완전한 세트를 포함하는 항체 분자를 제공하며, 여기서 6개의 C-말단 아미노산이 인간 수용체 서열의 것과 일치한다. 일 특징으로서, 본 발명은 Z270, humZ270, 또는 humZ270 cons의 CDR-H1, CDR-H2(또는 이들의 N-말단부), 및 CDR-H3 및 최소한 Z270, humZ270, 또는 humZ270 cons의 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3 일부를 포함하는 항체 분자를 제공한다. 더 상세한 특징으로서, 본 발명은 항체 분자를 제공하며, 여기서, 항체 분자는 Z270, humZ270, 또는 humZ270 cons의 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3를 포함하며, 여기서, 적합한 FR 서열을 통하여 CDR-L1은 CDR-L2에 링크되고, CDR-L2는 CDR-L3에 링크되며, CDR-H1는 CDR-H2에 링크되고, 및 CDR-H2는 CDR-H3에 링크된다.

일 특징으로서, 본 발명은 humZ270, humZ270 cons, 또는 humZ270 cons2의 VH 및/또는 VL 도메인 모두를 필수적으로 포함하는 항체 분자를 제공한다.

본 발명에 따른 인체적응형 항-NKG2A 항체는 본원의 humZ270VH를 포함하는 모든 전장 또는 부분 중쇄(HC)를 포함하며 및/또는 humZ270VH를 포함하는 모든 전장 또는 부분 HC는 본원의 모든 humZ270VL와 결합할 수 있으며, 및 결과 항체 또는 절편은 항원 결합, CD94/NKG2A-발현 세포상의 기능성 효과, 및/또는 면역원성에 대하여 시험되었다.

다양한 형태의 인체적응형 항체가 고려되었다. 예를 들어, 인체적응형 항체는 항체 절편, 예컨대 Fab 또는 본원에 설명된 다른 유형의 절편이 될 수 있다. 대안적으로, 인체적응형 항체는 전장 또는 무손상 항체, 예컨대 전장 또는 무손상 IgG1 또는 IgG4 항체가 될 수 있다. 일 실시상태에서, 인체적응형 항체는 전장 IgG4 항체 또는 이들의 절편이다.

일 특징으로서, 본 발명은 다음의 특징이 있는 인체적응형 항체를 제공한다: a) NKG2A에 특이적으로 결합하며; b) Fc 수용체에는 특이적으로 결합하지 않으며; 및 c) 인간 NK 세포 상의 NKG2A에 결합되고, 상기 표적 세포가 상기 NK 세포와 접촉하게 되는 경우 상기 NK 세포가 표적 세포 표면 상의 HLA-E를 함유하는 표적 인간 세포를 용해시키도록 한다. 일 실시상태에서, 인체적응형 항체는 Fc 수용체, 또는 인간 IgG4 불변 영역에 결합하는 것을 차단하도록 변형된 마우스 또는 인간 IgG1 불변 영역을 포함한다. 이러한 항체, 및 Fc 수용체에 결합하지 않는 항체 절편은 특히 항체 의존성 세포 세포독성에 의하여 매개되는 경우 NK 세포 자체를 고갈시키지 않고, NK 세포(예컨대 암, 감염성 질환)를 활성화시키기를 소망하는 응용에 사용되며, "비-고갈" 항체로 불리운다.

또 다른 특징으로서, 인체적응형 항체는 Fc 수용체에 결합하는 마우스 또는 인간 IgG1 불변 영역을 포함하거나, 또는 인간 IgG1, 2, 3 또는 4 불변 영역은 Fc 수용체에 결합하거나 또는 Fc 수용체, 또는 인간 IgG4 불변 영역에 결합을 증가시키도록 변형되었다. 다른 실시상태에서, 단클론성 항체 또는 이들의 절편은 항체에 결합되는 세포에 독성인 모이어티에 결합된다. 이러한 항체는 NK 세포를 고갈시키고자 하는 응용례에 특히 유용하며, 특정 응용례 예컨대 NK-LDGL (과립성 림프구의 NK-형 림프구증식성 질환; 대안적으로, NK-LGL)에 유용하고, 이를 "고갈" 항체라 한다.

인체적응형 항체의 재조합 생산에 있어서, 인체적응형 VH 및 VL 영역, 또는 이들의 변이체 버전은 표준 재조합법에 따라 인간 항체의 전장 또는 절단된 불변 영역을 암호화하는 발현 벡터 내로 클론될 수 있다(예컨대, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989). 결과는 대상 인체적응형 항체 분자를 발현하고 분비하는 전달감염된 세포주이며, 이들은 선택된 VH 및 VL 영역 및 불변 영역을 포함한다. 인간 항체의 불변 영역을 암호화하는 cDNA 서열이 공지되어 있다. 예시적인 cDNA 서열은, 예컨대, GenBank 등을 통하여 입수할 수 있으며, 이들 각각은 일체성을 지니고 참고자료로서 본원에 포함되어 있고, 다음과 같다:

인간 IgG1 불변 중쇄 영역: GenBank accession No.: J00228;

인간 IgG2 불변 중쇄 영역: GenBank accession No.: J00230;

인간 IgG3 불변 중쇄 영역: GenBank accession No.: X04646;

인간 IgG4 불변 중쇄 영역: GenBank accession No.: K01316; 및

인간 kappa 경쇄 불변 영역: GenBank accession No.: J00241.

소망한다면, 인체적응형 항체의 클래스는 공지된 방법에 의하여 "스위치"될 수 있다. 예를 들어, 원래 IgM 분자로서 생산된 항체는 IgG 항체로 클래스 스위치될 수 있다. 클래스 스위칭 기법은 하나의 IgG 서브클래스를 다른 것으로 전환하기 위하여 사용될 수 있으며, 예컨대, IgG1에서 IgG2로 전환에 사용될 수 있다. 그러므로, 본 발명 항체의 효과기 기능은 다양한 치료적 용도를 위하여, 예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE, 또는 IgM 항체로의 아이소타입 스위칭에 의하여 변화될 수 있다.

불변 영역은 당해 기술 분야에 공지된 방법에 따라 변형될 수 있다. 예를 들어, IgG4 불변 영역 내에서, 잔기 S241은 프롤린(P) 잔기로 돌연변이화되어 힌지 부분에서 이황화 브릿지 형성을 완결시킬 수 있다(예컨대, Angal et al., Mol Immunol. 1993;30:105-8).

항체 절편

본 발명의 인체적응형 항체는 항체 절편으로 제조될 수 있거나, 또는 항체 절편은 인체적응형 전장 항체로부터 제조될 수 있다. 인체적응형 항체의 항체 절편의 생산을 위하여 다양한 기법이 발전되어 왔다. 전통적으로, 이러한 절편은 전장 항체의 단백질 분해 소화를 통하여 유도된다(예컨대, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biopysical Methods, 24:107-117 (1992); 및 Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). 그러나, 이러한 절편은 현재 재조합 숙주 세포에 의하여 직접적으로 생산될 수 있다. 대안적으로, Fab'-SH 절편은 E. 콜리에서 직접적으로 회수될 수도 있으며, 화학적으로 커플링되어 F(ab')2 절편을 형성하게 된다(Carter et al., Bio/Technology, 10:163-167 (1992)). 다른 방법에 의하여, F(ab')2 절편은 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 분리될 수 있다. 항체 절편의 생산을 위한 다른 기법은 당해 기술 분야의 숙련자에게 자명하다. 다른 실시 상태에서, 항체 선택은 단일-사슬 Fv 절편(scFv)이다. WO 1993/16185; U.S. Pat. No. 5,571,894; 및 U.S. Pat. No. 5,587,458를 참조한다. 항체 절편은 "선형 항체"가 될 수 있으며, 예컨대, U.S. Pat. No. 5,641,870에 설명되어 있다. 이러한 선형 항체 절편은 일특이적 또는 이특이적이 될 수 있다.

이특이적 항체는 최소한 두개의 다른 에피토프에 대한 결합 특이성을 지닌 항체이다. 이특이적 항체의 제조 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 전장 이특이적 항체의 전통적인 생산은 일반적으로 두 사슬이 다른 특이성을 지닌 두 면역글로블린 중쇄-경쇄짝의 동시발현에 기초한다(Millstein et al., Nature, 305: 537-539 (1983)). 본 발명에 의한 이특이적 항체에서, 최소한 하나의 결합 에피토프는 NKG2A 단백질 상에 존재한다. 항-NKG2A-결합 "암"은 백혈구, 예컨대 T-세포 수용체 분자 (예컨대 CD2 또는 CD3), 또는 IgG의 Fc 수용체(Fc감마-R), 예컨대 Fc-감마-RI(CD64), Fc-감마-RII(CD32) 및 Fc-감마-RIII (CD16) 상에서 촉발 분자에 결합하는 "암"에 결합하여, 세포성 방어 기작을 NKG2A-발현 세포에 집중하도록 한다. 이특이적 항체는 세포독성제가 NKG2A를 발현하는 세포를 국소화하는데 사용될 수 있다. 이러한 항체는 NKG2A-결합 암 및 세포독성제(예컨대 사포린, 항-인터페론-알파, 빈카 알카로이드, 리신 A 체인, 메토트렉세이트, 또는 방사성 동위원소 헵텐)에 결합하는 암을 보유한다. 이특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 절편 (예컨대 F(ab')2 이특이적 항체)로서 제조될 수 있다. 2가 이상의 항체가 고려되었다. 예를 들어, 3특이적 항체를 제조할 수 있다. Tutt et al., J. Immunol, 147: 60 (1991).

본 발명의 전형적인 항체, 항체 절편 및 다특이적 항체는 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:5의 잔기 D52, D54, R94, F99, T(100C), 및 W(100F)를 포함하는 CDR-H2 및 CDR-H3의 일부를 포함하며, 이들은 항원-결합에 결정적인 것으로 나타났다(실시예 참조). 선택적으로, 인체적응형 항체 절편 및 다특이적 항체는 또한 Z270 중쇄 잔기 N35, Y53, E56, D98, V(100A), 및 L(100D)를 포함한다. 일 특징으로서, 본 발명의 인체적응형 항체 절편 또는 다특이적 항체는 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:5의 CDR-H2의 잔기 50-59 및 CDR-H3의 잔기 95-102를 포함한다. 일 실시상태에서, 인체적응형 항체 절편 또는 다특이적 항체는 1, 2, 또는 모든 Z270 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3를 포함하지 않는다. 부가적인 또는 대안적인 실시 상태에서, 항체 절편 또는 다특이적 항체가 Z270 CDR-H1을 포함하지 않는다.

항체 유도체

본 발명의 범위 내의 항체 유도체는 제2 약제와 접합 또는 공유 결합된 인체적응형 항체를 포함한다.

예를 들어, 일 특징으로서, 본 발명은 세포독성제에 접합하거나 또는 공유 결합하는 인체적응형 항체를 포함하는 면역접합체를 제공한다. 본원에 사용되는 용어 "세포독성제"는 이들의 세포 표면상의 NKG2A 수용체를 함유하는 세포를 살상할 수 있는 분자이다. 세포독성 또는 세포억제 효과를 지닌 모든 유형의 모이어티는 존재하는 항체에 접합되어 본 발명의 세포독성 접합체를 형성할 수 있으며, 치료적 방사성동위원소, 독성 단백질, 독성 소분자, 예컨대 약물, 독소, 면역조절제, 호르몬, 호르몬 길항제, 효소, 올리고뉴클레오타이드, 효소 억제제, 치료적 핵종, 혈관형성 억제제, 화학치료제, 빈카 알카로이드, 안트라사이클린, 이피도필로톡신, 탁산, 항대사체, 알킬화제, 항생제, COX-2 억제제, SN-38, 항유사분열제, 항혈관형성제 및 세포사멸제, 특히 독소루비신, 메토트렉세이트, 택솔, CPT-11, 캄프토데칸, 질소 머스타드, 겜시타빈, 알킬 설포네이트, 니트로소우레아, 트리아진, 엽산 유사체, 피리미딘 유사체, 퓨린 유사체, 백금 배위결합 복합체, 슈도모나스 엑소톡신, 리신, 애브린, 5-플루오로우리딘, 리보뉴클레아제(RNase), DNase I, 스트렙토코코스 엔테로톡신-A, 억새풀 항바이러스 단백질, 겔로닌, 디프테린 톡신, 슈도모나스 엑소톡신과 슈도모나스 엔도톡신 및 기타(예컨대, Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Ed. (Mack Publishing Co. 1995); Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics (McGraw Hill, 2001); Pastan et al. (1986) Cell 47:641 ; Goldenberg (1994) Cancer Journal for Clinicians 44:43; U.S. Pat. No. 6,077,499; 이들 전부는 본원에 참고자료로서 포함되어 있다)를 포함하는 특이적 NK 수용체 발현 세포를 억제하거나 또는 살상할 수 있다. 톡신은 동물, 식물, 진균, 또는 미생물 기원일 수 있으며, 또는 화학적 합성에 의하여 생성할 수도 있다는 사실을 인식하여야 한다.

다른 실시상태에서, 항체는 방사성 동위원소, 예컨대 검출에 적합한 치료적 핵종 또는 핵종으로 유도될 수 있다. 적합한 다수의 방사성 동위원소가 사용될 수 있으며, I-131, 인듐-111, 루테튬-171, 비스무스-212, 비스무스-213, 아스타틴-211, 구리-62, 구리-64, 구리-67, 이테륨-90, 요오드-125, 요오드-131, 인-32, 인-33, 스칸듐-47, 은-111, 갈륨-67, 프라세오디뮴-142, 사마리움-153, 테르비움-161, 디스프로슘-166, 홀뮴-166, 레늄-186, 레늄-188, 레늄-189, 납-212, 라듐-223, 악티늄-225, 철-59, 셀레늄-75, 비소-77, 스트론튬-89, 몰리브덴-99, 로듐-105, 팔라듐-109, 프라세오디뮴-143, 프로메티움-149, 에르비움-169, 이리듐-194, 금-198, 금-199, 및 납-211를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 일반적으로, 핵종은 바람직하게는 베타 방출이 100-2,500 keV이고, 알파 방출이 4,000-6,000keV인 오제 에미터로 20 내지 6,000 keV, 바람직하게는 60 내지 200 keV 범위의 붕괴 에너지를 보유한다. 또한 알파 입자의 생성과 함께 실질적으로 붕괴되는 핵종이 바람직하다.

다른 실시 상태에서, 제2 약제는 검출가능한 모이어티이며, 정량적으로 또는 정성적으로 관찰되거나 또는 측정되는 모든 분자이다. 본 발명의 접합된 항체로 유용한 검출가능한 마커의 예는 방사성동위원소, 형관 안료, 또는 상보적 결합 짝의 구성원, 예컨대: 및 항원/항체(NKG2A에 대한 항체), 렉틴/탄수화물; 아비딘/바이오틴; 수용체/리간드; 또는 분자적으로 임프린트된 고분자/프린트 분자 시스템 중의 하나의 구성원 등이다. 제2 약제는 또한 대안적으로 고분자일 수 있으며, 예를 들면 인체적응형 항체의 순환 반감기를 증가시키기 위함이다. 예시적인 고분자 및 이러한 고분자를 펩타이드에 부착하는 방법은, 예컨대, U.S. Pat. Nos. 4,766,106; 4,179,337; 4,495,285; 및 4,609,546에 설명되어 있다. 추가적인 예시의 고분자는 폴리옥시에틸화 폴리올 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 모이어티를 포함한다(예컨대, 전장 항체 또는 항체 절편이 약 1,000 및 약 40,000, 예컨대 약 2000 및 약 20,000, 예컨대, 약 3,000-12,000 사이의 분자량을 지닌 하나 이상의 PEG 분자에 접합할 수 있다).

세포독성제 또는 다른 화합물은 가능한 많은 방법에 의하여 항체에 직접적으로 또는 간접적으로 링크될 수 있다. 예를 들어, 약제는 교결합제 예컨대, N-석시닐 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP), 또는 항체의 Fc 영역 내의 탄수화물 모이어티를 사용하여, 이황화 결합 형성을 통하여 환원된 항체 성분의 힌지 영역에 부착될 수 있다 (예컨대, Yu et al. (1994) Int. J. Cancer 56: 244; Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking (CRC Press 1991); Upeslacis et al., "Modification of Antibodies by Chemical Methods," in monoclonal antibodies: principles and applications, Birch et al. (eds.), pages 187-230 (Wiley-Liss, Inc. 1995); Price, "Production and Characterization of Synthesis Peptide-Derived Antibodies," in monoclonal antibodies: Production, engineering and clinical application, Ritter et al. (eds.), pages 60-84 (Cambridge University Press 1995), Cattel et al. (1989) Chemistry today 7:51-58, Delprino et al. (1993) J. Pharm. Sci 82:699-704; Arpicco et al. (1997) Bioconjugate Chemistry 8:3; Reisfeld et al. (1989) Antihody, Immunicon. Radiopharrn. 2:217).

대안적으로, 항-NKG2A 항체 및 제2(세포독성 또는 기타) 폴리펩타이드제를 포함하는 융합 단백질은 예컨대, 재조합 기법 또는 펩타이드 합성에 의하여 제조될 수 있다.

결합 분석법

본 발명은 인간 NKG2A, 특히 Z270 하이브리도마에 의하여 생산된 인체적응형 버전의 항-NKG2A 항체에 결합하는 항체를 제공한다.

모든 다양한 분석법을 사용하여 항체와 인간 NKG2A의 결합을 사정할 수 있다. 그 중에서도 ELISA, 방사성면역분석, 웨스턴 블로팅, BIACORE, 및 기타 경쟁 분석법을 기반으로 한 프로토콜이 적합하며, 이들은 당해 기술 분야에 공지되어 있다.

예를 들어, 시험 항체가 표적 단백질 또는 에피토프(예컨대, NKG2A 또는 이들의 부분)의 존재하에 배양되며, 미결합 항체는 세정되고, 항체의 존재가 예컨대 방사성표지, 물리적 방법 예컨대 질량 스펙트럼분석 또는 흐름세포분석(예컨대 FACScan)을 사용하여 검출되는 직접 또는 간접 형광 표지를 사용하여 평가되는 단순 결합 분석을 사용할 수 있다. 이러한 방법은 당해 기술 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있다. 어떠한 결합량이 대조구에서 나타낸 양보다 상회한다면, 비특이적 항체는 항체가 특이적으로 표적에 결합한다는 것을 나타낸다.

이러한 분석에서, 시험 항체와 표적 세포 또는 인간 NKG2A와 결합하는 능력을 (음성) 대조구 단백질, 예컨대 구조적으로 무관한 항원, 또는 비-Ig 펩타이드 또는 단백질에 대하여 발생하는 항체와 동일한 표적에 결합하는 능력과 비교할 수 있다. 적합한 분석법을 사용하는 경우, 대조구 단백질에 비하여 25%, 50%, 100%, 200%, 1000%, 또는 그 이상의 친화도를 지닌 표적 세포 또는 NKG2A에 결합하는 항체 또는 절편은 표적과 "특이적으로 결합" 또는 "특이적으로 상호작용"한다고 하며, 하기의 치료 방법에 사용하기 바람직하다. 시험 항체가 NKG2A, 예컨대 Z270, 또는 이들의 유도체에 대한 (양성) 대조구 항체와의 결합에 영향을 미치는 능력을 평가할 수 있다.

인체적응형 항-NKG2A 항체는 인간 NKG2C에 결합하거나 하지 않을 수 있으며, 인간 NKG2E에 결합하거나 하지 않을 수 있거나, 또는 어떠한 인간 NKG2C 및 E에 결합하거나 하지 않을 수 있다. 특정 실시 상태에서, 단클론성 항체 또는 절편은 수용체 NKG2C 또는 NKG2E를 특이적으로 활성화하는 다른 인간 NKG2 수용체에 결합하지 않는다. 본 발명 항체의 NKG2C- 및 NKG2E-결합 특성은 단순히 대상 분자를 NKG2A로 교환하는 전술한 유사한 분석법으로 평가될 수 있다.

일 특징으로서, 본 발명은 Z270와 생물학적 특성 및/또는 실질적인 서열 일치성을 공유하는 인체적응형 버전의 비인간 항체를 제공한다. 하나의 예시적인 생물학적 특성은 Z270 에피토프, 즉, Z270 항체가 결합하는 NKG2A의 세포외 도메인의 영역에 결합한다. Z270 에피토프에 결합하는 항체를 선별하기 위하여, 통상의 교차-차단 분석, 예컨대 문헌 Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)을 수행할 수 있다.

예시적인 교차-차단 또는 경쟁 분석법에서, Z270 (대조구) 항체 및 시험 항체를 혼합하고 (또는 사전흡수), NKG2A를 함유한 시료에 도포하였다. 특정 실시 상태에서, NKG2A-함유 시료에 가하기 전에 일정 시간 동안 다양한 양의 시험 항체 (예컨대, 1:10 또는 1:100)와 함께 대조구 항체를 사전혼합한다. 다른 실시 상태에서, 대조구 및 다양한 양의 시험 항체는 항원/표적 시료에 노출시 단순 혼합될 수 있다. 유리 항체 (예컨대, 분리 또는 수세 기법을 사용하여 미결합 항체를 제거) 및 시험 항체의 대조구 항체(예컨대, 종- 또는 아이소타입-특이적 2차 항체를 사용하고, 검출가능한 표지를 지닌 특이적으로 표지화한 대조구 항체, 또는 물리적 방법 예컨대 질량 스펙트럼분석을 사용하여 다른 화합물을 구별)의 결합을 구별할 수 있는한, 대조구 항체와 항원에 대한 결합을 감소시키는지 여부를 결정할 수 있으며, 이는 시험 항체가 실질적으로 동일한 에피토프를 대조구로서 인식한다는 것을 나타낸다. 이 분석법에서, 완전 무관 항체의 존재하에 (표지된) 대조구 항체의 결합은 대조구의 높은 값이다. 대조구 낮은 값은 표지된(양성) 대조구 항체 (Z270)를 미표지 대조구 항체와 함께 배양함으로써 획득하며, 여기서 경쟁이 발생할 수 있으며 표지된 항체의 결합이 감소된다.

시험 분석법에서, 시험 항체의 존재하에 표지된 항체 반응성의 현저한 감소는 동일한 에피토프를 인식하는 시험 항체의 지표, 즉, 표지된 대조구 항체와 "교차-반응" 하는 것이다. 표지된 대조구와 항원/표적의 결합이 최소한 50% 이상, 바람직하게는 70% 감소하며, 대조구:시험 항체 또는 화합물의 비율이 약 1:10 및 약 1:100인 모든 시험 항체 또는 화합물이 대조구로서 실질적으로 동일한 에피토프 또는 결정기에 결합하는 항체 또는 화합물로 고려된다. 바람직하게는, 이러한 시험 항체 또는 화합물은 대조구와 항원/표적의 결합을 최소한 90% 감소시킨다. 그럼에도, 본 발명에서는 대조구 항체 또는 화합물의 결합을 측정가능한 정도로 감소시키는 모든 화합물 또는 항체를 사용할 수 있다.

유사한 교차-차단 분석법은 (인체적응형)항체가 Z270를 적합한 형태의 HLA-E로 교환함으로써 인간 NKG2A, HLA-E의 천연 리간드와 NKG2A의 결합에 영향을 미치는지 여부를 평가하는데 사용할 수 있다. 예를 들어, 인체적응형 항-NKG2A 항체 제조물이 CD94/NKG2A와 HLA-E의 상호작용을 감소 또는 차단하느지 여부를 결정하기 위하여, 다음의 시험을 수행할 수 있다: CD94/NKG2A, 예컨대 Ba/F3-CD94/NKG2A, NKL 또는 NK92를 발현하는 세포주를 시험 항-NKG2A 항체의 농도를 증가시키면서 얼음상에서 30 분간 배양한다. 그 다음, 세포를 PE-표지화 HLA-E 4량체로 얼음상에서 30 분간 배양하고 다시 세척하였으며, HLA-E 4량체 결합을 표준 방법에 따라 흐름세포분석기(FACScalibur, Beckton Dickinson)로 분석하였다. 시험 항체의 부재하에, HLA-E 4량체는 세포에 결합하였다. HLA-E와 CD94/NKG2A-결합을 차단하는 항체 제조물의 존재하에, HLA-E 4량체와 세포의 결합이 감소했으며, 이러한 mAb는 "차단 항체"로 지정된다.

본 발명의 일 특징으로서, 예컨대, NKG2A-발현 세포를 살상하기를 소망하지 않는 경우, 본원의 인체적응형 항체는 바람직하게는 Fc 수용체와 실질적인 특이적 결합을 나타내지 않는다. 이러한 항체는 Fc 수용체에 결합하지 않는다고 알려진 다양한 중쇄의 불변 영역을 포함할 수 있다. 이러한 일 실시예는 IgG4 불변 영역이다. 대안적으로, 불변 영역, 예컨대 Fab 또는 F(ab')2 절편을 포함하지 않는 항체 절편은 Fc 수용체 결합을 회피하기 위하여 사용될 수 있다. Fc 수용체 결합은 예를 들어 BIACORE 분석법 내에서 Fc 수용체 단백질과 항체의 결합을 시험하는 것을 포함하는 당해 기술 분야에 공지된 방법에 따라 평가될 수 있다. 또한, Fc 부분이 Fc 수용체와의 결합을 최소화 또는 제거하도록 변형된 모든 다른 항체 유형이 사용될 수 있다 (예컨대, WO03101485, 이 내용은 참고자료로서 본원에 포함되어 있다). 분석 예컨대, 예컨대, Fc 수용체 결합을 평가하기 위한 세포 기반 분석은 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 예컨대, WO03101485에 설명되어 있다.

세포독성 분석법

항-NKG2A 항체가 HLA-E와 CD94/NKG2A의 상호작용을 감소 또는 차단시키는 경우, 이는 CD94/NKG2A-제한 림프구의 세포독성을 증가시킬 수 있다. 이는 하기하는 일반적인 세포독성 분석법에 의하여 평가될 수 있다.

CD94/NKG2A-매개 신호화를 감소시키는 능력은 예컨대, CD94/NKG2A를 발현하는 NKL 세포, 및 HLA-E를 발현하는 표적 세포를 사용하는 표준 4-시간 시험관 내 세포독성 분석에서 시험될 수 있다. 이러한 NKL 세포는 HLA-E를 발현하는 표적을 효과적으로 살상하지 않으며, 이는 CD94/NKG2A는 림프구-매개 세포용해를 예방하는 억제 신호화의 개시 및 전파를 유도하는 HLA-E를 인식하기 때문이다. 이러한 시험관 내 세포독성 분석은 공지된 표준 방법에 의하여 수행될 수 있으며, 예를 들어, Coligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc, and Wiley Interscience, N. Y., (1992, 1993)에 설명되어 있다. 표적 세포는 NKL 세포의 첨가 전에 ⁵¹Cr로 표지화되어 있고, 그 다음 살상은 살상의 결과로서 세포에서 배지로 ⁵¹Cr 방출의 비율로 평가된다. CD94/NKG2A를 HLA-E와 결합으로부터 차단하는 항체의 첨가는 CD94/NKG2A를 통한 억제 신호화의 개시 및 전파를 예방하게 된다. 따라서, 이러한 약제의 첨가는 표적 세포의 림프구-매개 살상을 증가시키게 된다. 따라서 이 단계는, 예컨대, 리간드 결합을 차단함으로써 CD94/NKG2A-유도 음성 신호화를 예방하는 약제을 확인한다. 특히 ⁵¹Cr-방출 세포독성 분석에서, CD94/NKG2A-발현 NKL 효과기-세포는 HLA-E-음성 LCL 721.221 표적 세포를 사멸시킬 수 있으나, HLA-E-발현 LCL 721.221-Cw3 대조구 세포는 덜하게 된다. 이와 대조적으로, CD94/NKG2A가 부재한 YTS 효과기-세포는 두 세포주를 효과적으로 사멸시킨다. 그러므로, NKL 효과기 세포는 HLA-E⁺ LCL 721.221-Cw3 세포를 효과적으로 살상하지 못하며, 이는 CD94/NKG2A와 HLA-E-유도 억제 신호화에 기인한다. NKL 세포가 이러한 ⁵¹Cr-방출 세포독성 분석에서 본 발명에 따른 차단 항-CD94/NKG2A 항체와 함께 사전 배양되는 경우, 항체-농도-의존성 방식에서 HLA-E-발현 LCL 721.221-Cw3 세포가 더 효과적으로 사멸된다.

본 발명의 항체의 활성의 억제 또는 강화는 다양한 다른 방법으로 평가할 수 있으며, 예컨대, 세포내 유리 칼슘의 효과에 대하여, 예컨대, Sivori et al., J. Exp. Med. 1997;186:1129-1136를 참조하며, 이 내용은 참고자료로서 본원에 포함되어 있다. NK, T, 또는 NKT 세포 활성은 세포 기반 세포독성 분석, 예컨대, 크롬 방출 또는 항체가 표적 세포 예컨대 P815, K562 세포, 또는 적절한 종양 세포를 사멸시키기 위하여 NK 세포를 작극하는 능력을 평가하기 위한 다른 변수를 측정하므로써 평가할 수 있으며, 이는 문헌 Sivori et al., J. Exp. Med. 1997;186:1129-1136; Vitale et al., J. Exp. Med. 1998; 187:2065-2072; Pessino et al. J. Exp. Med. 1998; 188:953-960; Neri et al. Clin. Diag. Lab. Immun. 2001 ;8:1 131-1135; Pende et al. J. Exp. Med. 1999; 190: 1505-1516에 설명되어 있으며, 이 전체 내용은 참고자료로서 본원에 포함되어 있다.

일 실시상태에서, 항체 제조물은 최소한 10%의 CD94/NKG2A-제한 림프구의 세포독성 증가를 유발하며, 바람직하게는 최소한 40% 또는 50%의 NK 세포독성의 증가, 또는 더욱 바람직하게는 최소한 70%의 NK 세포독성의 증가를 유발한다.

세포독성 림프구의 활성은 사이토카인-방출 분석을 사용하여 설명할 수 있으며, 여기서 NK 세포는 NK 세포의 사이토카인 생산(예를 들어 IFN-y 및 TNF-α 생산)을 자극하는 항체와 함께 배양된다. 예시적인 프로토콜에서, PBMC에서 IFN-y 생산은 세포 표면 및 세포질사이 염색 및 배양 4일 후 흐름세포 분석으로 평가되었다. 간단하게 말하면, 브레펠딘 A(Sigma Aldrich)를 배양 최후 4시간 동안 5 μg/ml의 최종 농도에 첨가하였다. 그 다음, 세포를 삼투화(IntraPrep™; Beckman Coulter) 전에 항-CD3 및 항-CD56 mAb로 배양하고, PE-항-IFN-y 또는 PE-IgG1 (Pharmingen)으로 염색하였다. 다클론성 활성화 NK 세포로부터 GM-CSF 및 IFN-y의 생산은 ELISA(GM-CSF: DuoSet Elisa, R&D 시스템, Minneapolis, MN, IFN-: OptEIA set, Pharmingen)를 사용하여 상청으로 측정하였다.

일 특징으로서, 본 발명은 원, 비-인체적응형 항체 및/또는 이들의 키메라 버전보다 CD94/NKG2A-제한 림프구의 세포독성을 증가시키며, CD94/NKG2A-제한 림프구의 세포독성 활성을 더욱 가능하게 하며, 더 효과적이며, 또는 CD94/NKG2A-매개 신호를 감소 또는 억제하는 항체을 제공한다. 이러한 항체는 원래의, 비-인체적응형 항체 또는 이들의 키메라 버전보다 예를 들어, 최소한 2%, 최소한 5%, 최소한 10%, 최소한 15%, 또는 최소한 20% 더 효과적이다.

재조합법

본 발명은 또한 본원의 항-NKG2A 항체를 암호화하는 분리된 핵산, 및 이러한 핵산을 포함하는 벡터 및 숙주 세포를 제공한다. 또한 이러한 핵산 또는 벡터를 포함하는 적합한 숙주 세포를 배양하여 핵산이 발현되고, 인체적응형 항체를 생산하는 재조합 기법을 사용하여 이러한 항-NKG2A 항체를 생산하는 방법을 제공한다. 배양 전에, 숙주 세포는 예를 들어, 가변 중쇄 도메인을 암호화한 핵산을 포함하는 벡터 및 가변 경쇄 도메인을 암호화한 핵산을 포함하는 벡터로 동시-전달감염될 수 있다. 추가적으로, 항체는 공지의 기법을 사용하는 숙주 세포 배양물로부터 회수 및/또는 분리될 수 있다. 유용한 벡터, 숙주 세포, 및 기법은 후술할 것이며 실시예에 설명되어 있다. 추가적으로, 인체적응형 항-NKG2A 항체의 발현 전략은 도 4-6에 개략적으로 나타내었다.

일반적으로, 항체의 재조합 생산을 위하여, 이를 암호화한 핵산은 분리되며, 추가의 클로닝(DNA의 증폭) 또는 발현을 위하여 복제가능 벡터내로 삽입되었으며, 일반적으로 하나 이상의 발현 대조구 성분 작동가능하게 링크된다. 단클론성 항체를 암호화하는 DNA는 쉽게 분리되며, 종래의 절차를 사용하여 서열화된다(예컨대, 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용). 많은 벡터가 공지되어 있으며, 사용이 가능하다. 벡터 성분은 일반적으로, 하나 이상의 다음의 것을 포함하나 이에 한정되지 않는다: 신호 서열, 복제 원점, 하나 이상의 마커 유전자, 인헨서 성분, 프로모터, 및 전사-종결 서열.

신호 서열 성분

본 발명의 항-NKG2A 항체는 직접적으로뿐만 아니라 이종 폴리펩타이드와의 융합 폴리펩타이드로서 재조합적으로 생산될 수 있으며, 이는 바람직하게는 성숙 단백질 또는 폴리펩타이드의 N-말단에 특이적 분열 부위를 보유한 신호 서열 또는 다른 폴리펩타이드이다. 선택된 이종 신호 서열은 바람직하게는 숙주 세포에 의하여 인식되고 가공(즉, 신호 펩티다아제에 의하여 분열)된 것이다. 예컨대, 항-NKG2A 항체 예컨대 인체적응형 Z270 항체의 인체적응형 중쇄 및/또는 경쇄의 발현을 위한 예시적인 신호 서열에 대한 실시예 2를 참조한다.

천연 항-NKG2A 항체 신호 서열을 인식하거나 가공하지 못하는 원핵 숙주 세포에서는, 신호 서열은, 예를 들어, 알카라인 포스파타아제, 페니실리나아제, Ipp, 또는 열 안정성 엔테로톡신 II 리더의 군으로부터 선택된 원핵 신호 서열에 의하여 치환된다. 효모 분비에 있어서, 천연 신호 서열은, 예컨대, 효모 인버타아제 리더, 알파-인자 리더(사카로마이세스 및 클루베로마이세스 알파 인자 리더 포함), 산-포스파타아제 리더, C. 알비칸 글루코아밀라아제 리더, 또는 WO 1990/13646에 설명된 신호에 의하여 치환될 수 있다. 포유류 세포 발현에서, 포유류 신호 서열 및 바이러스 분비 리더, 예를 들어, 헤르페스 심플렉스 gD 신호가 사용가능하다.

이러한 전구체 영역에 대한 DNA는 리딩 프레임 내에서 항-NKG2A 항체를 암호화하는 DNA에 결찰된다.

복제 원점 성분

발현 및 클로닝 벡터 모두는 하나 이상의 선택된 숙주 세포 내에서 벡터가 복제하도록 하는 핵산 서열을 함유한다. 일반적으로, 클로닝 벡터 내에서, 이 서열은 벡터가 숙주 염색체 DNA와 독립적으로 복제하도록 하는 것이며, 복제 원점 또는 자가 복제 서열을 포함한다. 이러한 서열은 다양한 박테리아, 효모, 및 바이러스에 대하여 공지되어 있다. 플라스미드 pBR322의 복제 원점은 대부분의 그람-음성 박테리아에 적합하며, 2μ 플라스미드 원점은 효모에 적합하고, 다양한 바이러스 기원(SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV, EBV, 또는 BPV)은 포유류 세포 내의 클로닝 벡터에 유용하다. 일반적으로, 복제 원점 성분은 포유류 발현 벡터에 불필요하다(SV40 원점이 일반적으로 사용되며, 이는 이들이 초기 프로모터를 함유하기 때문이다).

선택 유전자 성분

발현 및 클로닝 벡터는 선택 유전자를 함유할 수 있으며, 또한 이들을 선택가능 마커라 한다. 일반적인 선택 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예컨대, 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트, 또는 테트라사이클린에 대한 내성을 부여하고, (b) 상보적 자가영양 결핍이거나, 또는 (c) 복합 배지에서 사용할 수 없는 임계적 영양분, 예컨대, 바실리에 대한 D-알라닌 라세마아제를 암호화하는 유전자를 제공하는 단백질을 암호화한다.

선택 스킴의 일 실시예는 숙주 세포의 성장을 정지시키는 약물을 사용한다. 이종 유전자로 성공적으로 형질전환된 그러한 세포는 약물 내성을 부여하는 단백질을 산출하며, 그러므로 선택 요법에서 생존한다. 이러한 우세 선택의 예는 약물 네오마이신, 미코페놀산 및 하이그로마이신을 사용한다.

포유류 세포를 위한 적합한 선택가능 마커의 또다른 예는 항-NKG2A 항체-암호화 핵산, 예컨대 DHFR, 티미딘 키나아제, 메탈로티오네인-I 및 -II, 바람직하게는 영장류 메탈로티오네인 유전자, 아데로신 디아미나아제, 오르니틴 디카르복실라아제, 등을 포획하는 세포 성분을 확인할 수 있는 것이다.

예를 들어, DHFR 선택 유전자로 형질전환된 세포는 우선 DHFR의 경쟁적 길항제인 메토트렉세이트(Mtx)를 함유한 배양 배지 내에서 모든 형질전환체를 배양함으로써 확인된다. DHFR가 사용되는 경우 적합한 숙주 세포는 DHFR 활성이 결핍된 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포주이다. 대안적으로, 항-NKG2A 항체, 야생형 DHFR 단백질, 및 그 밖의 선택가능 마커 예컨대 아미노글리코사이드 3'-아미노트랜스퍼라아제(APH)를 암호화하는 DNA 서열로 형질전환 또는 동시-형질전환되는 숙주 세포(특히 내재 DHFR를 함유하는 야생형 숙주)는 선택가능 마커에 대한 선택 약제, 예컨대 아미노글리코사이드 항생제, 예컨대, 카나마이신, 네오마이신, 또는 G418을 함유하는 배지 내에서 세포 성장을 시켜 선택할 수 있다. U.S. Patent No. 4,965,199를 참조한다.

효모에 사용되는 적합한 선택 유전자는 효모 플라스미드 YRp7 내에 존재하는 trp1 유전자이다(Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979)). trp1 유전자는 트립토판 내에서의 성장능이 결핍된 효모의 돌연변이 균주에 대한 선택 마커를 제공하며, 예를 들어, ATCC No. 44076 또는 PEP4-1 이다. Jones, Genetics, 85:12 (1977). 효모 숙주 세포 게놈 내의 trp1 부위의 존재는 트립토판 부재하의 성장에 의하여 형질전환을 검출하는 효과적인 환경을 제공한다. 이와 유사하게, Leu2-결핍 효모 균주(ATCC 20,622 또는 38,626)는 Leu2 유전자를 함유한 공지의 플라스미드에 의하여 수행된다.

이와 함께, 1.6μm 원형 플라스미드 pKD1에서 유도된 벡터는 클루베로마이세스 효모의 형질전환에 사용될 수 있다. 대안적으로, 재조합 송아지 키모신의 대규모 생산을 위한 발현 시스템은 K. 락티스에 대하여 보고되었다(Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990)). 클루베로마이세스의 산업용 균주에 의한 성숙 재조합 인간 혈청 알부민의 분비를 위한 안정적인 다카피 발현 벡터가 개시되었다. Fleer et al., Bio/Technolog, 9: 968-975 (1991).

프로모터 성분

발현 및 클로닝 벡터는 일반적으로 숙주 유기체에 의하여인식되는 프로모터를 함유하며, 항-NKG2A 항체-암호화 핵산에 작동가능하게 링크된다. 원핵 숙주에 사용되기 적합한 프로모터는 phoA 프로모터, β-락타마아제 및 락토오스 프로모터 시스템, 알카라인 포스파타아제, 트립토판(trp) 프로모터 시스템, 및 하이브리드 프로모터 예컨대 tac 프로모터를 포함한다. 그러나, 다른 공지의 박테리아 프로모터도 적합하다. 박테리아 시스템에 사용되는 프로모터는 항-NKG2A 항체를 암호화하는 DNA에 작동가능하게 링크된 Shine-Dalgarno(S. D.) 서열을 함유할 것이다.

진핵세포에 대한 다양한 프로모터 서열이 공지되었다. 사실상 모든 원핵 유전자는 전사 개시 부위의 상방 약 25 내지 30 염기에 위치한 AT-풍부 영역을 보유한다. 다수의 유전자의 전사 개시 부위의 상방 70 내지 80 염기에서 발견되는 다른 서열은 CNCAAT 영역이며, 여기서 N은 모든 뉴클레오타이드이다. 대부분의 원핵 유전자의 3' 말단은 암호화 서열의 3' 말단에 폴리-A 테일의 첨가를 위한 신호인 AATAAA 서열이다. 이러한 모든 서열은 원핵 발현 벡터 내로 적절히 삽입된다. 효모 숙주에 사용되는 적합한 프로모팅 서열의 적합한 예는 3-포스포글리세레이트 키나아제 또는 다른 해당 효소, 예컨대 에놀라아제, 글리세랄데하이드-3-포스페이트 데하이드로지나아제, 헥소키나아제, 피루베이트 디카르복실라아제, 포스포푸룩토키나아제, 글루코스-6-포스페이트 아이소머라아제, 3-포스포글리세레이트 뮤타아제, 피루베이트 키나아제, 트리오세포스페이트 아이소머라아제, 포스포글루코스 아이소머라아제, 및 글루코키나아제의 프로모터를 포함한다.

다른 효모 프로모터, 성장 조건에 의하여 조절된 전사의 추가적 이점을 지닌 유도가능한 프로모터는 알콜 데하이드로지나아제 2, 이소시토크롬 C, 산 포스파타아제, 질소 대사에 관련된 분해 효소, 메탈로티오네인, 글리세랄데하이드-3-포스페이트 데하이드로지나아제, 및 말토오스 및 갈락토오스 활용에 관한 효소에 대한 프로모터 영역이다. 효모 발현에 적합한 벡터 및 프로모터는 EP73657에 개시되어 있다. 효모 인헨서는 또한 효모 프로모터와 사용되는 것이 바람직하다.

포유류 숙주 세포 내에서 벡터로부터의 항-NKG2A 항체 전사는 조절된다, 예를 들어, 바이러스 예컨대 폴리오마 바이러스, 조류폭스 바이러스, 아데노바이러스 (예컨대 아데노바이러스 2), 보빈 파필로마 바이러스, 조류 사르코마 바이러스, 사이토메갈로바이러스(CMV), 레트로바이러스, 간염-B 바이러스의 게놈으로부터 유도된 프로모터 및 가장 바람직하게는 시미안 바이러스 40 (SV40), 이종 포유류 프로모터, 예컨대, 액틴 프로모터 또는 면역글로블린 프로모터, 및 열-충격 프로모터에 의하며, 제공된 이러한 프로모터는 숙주 세포 시스템과 호환이 가능하다.

SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터는 SV40 바이러스 복제 원점을 함유하는 SV40 제한 절편으로서 획득할 수 있다. 인간 사이토메갈로바이러스의 가장 초기 프로모터는 HindIII E 제한 절편으로서 획득할 수 있다. 벡터로서 보빈 파필로마 바이러스를 사용하는 포유류 숙주 내에서 DNA를 발현하는 시스템은 U.S. Patent No. 4,419,446 내에 개시되어 있다. 이 시스템의 변형은 U.S. Patent No. 4,601,978에 설명되어 있다. 또한 문헌 Reyes et al., Nature, 297:598-601 (1982)는 헤르페스 심플렉스 바이러스로부터 티미딘 키나아제 프로모터의 조절하에 마우스 세포 내의 인간 베타-인터페론 cDNA의 발현에 관하여 참조한다. 대안적으로, 로우스 사르코마 바이러스 장-말단 반복부는 프로모터로서 사용될 수 있다.

인헨서 성분 성분

고등 진핵세포에 의한 본 발명의 항-NKG2A 항체를 암호화하는 DNA의 전사는 종종 인헨서 서열을 벡터 내로 삽입함으로써 증가된다. 많은 인헨서 서열이 현재 포유류 유전자로부터 알려졌다(글로빈, 엘라스타아제, 알부민, α-페토단백질, 및 인슐린). 일반적으로, 그러나, 진핵 세포 바이러스의 인헨서를 사용하게 된다. 예에는 복제 원점의 말기측상의 SV40 인헨서(bp 100-270), 사이토메갈로바이러스 초기-프로모터 인헨서, 복제 원점의 말기측상의 폴리오마 인헨서, 및 아데노바이러스 인헨서를 포함한다. 또한 문헌 Yaniv, Nature, 297: 17-18 (1982)는 원핵 프로모터의 활성화를 위한 성분의 강화에 대하여 참조한다. 인헨서는 항-NKG2A 항체-암호화 서열에 대한 위치 5' 또는 3'에서 백터 내로 스플라이스되나, 바람직하게는 프로모터로부터 5' 부위에 위치한다.

전사 종결 성분

원핵 숙주 세포 (예를 들어, 효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간, 또는 다세포 유기체의 유핵 세포)에 사용되는 발현 벡터는 전사의 종결 및 mRNA 안정화에 필수적인 서열을 함유한다. 이러한 서열은 원핵 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 미번역 영역인 5' 말단, 때로는 3' 말단으로부터 얻을 수 있다. 이러한 영역은 항-NKG2A 항체를 암호화하는 mRNA의 미번역 부분 내의 폴리아데닐화 절편으로서 전사되는 뉴클레오타이드 세그먼트를 함유한다. 하나의 유용한 전사 종결 성분은 보빈 성장 호르몬 폴리아데닐화 영역이다. WO 1994/11026 및 개시된 발현 벡터를 참조한다.

숙주 세포의 선택 및 형질전환

본원의 벡터 내의 DNA를 클로닝 또는 발현하기 위하여 적합한 숙주 세포는 전술한 원핵생물, 효모, 또는 고등 진핵 세포이다. 이러한 목적에 적합한 원핵생물은 유박테리아, 예컨대 그람-음성 또는 그람-양성 유기체, 예를 들어, 엔테로박테리아세아에 예컨대 에셔리시아, 예컨대, E. 콜리, 엔테로박터, 에르위니아, 클레브시엘라, 프로테우스, 살모넬라, 예컨대, 살모넬라 티피뮤리움, 세라시아, 예컨대, 세라시아 마르세스칸스, 및 쉬겔라, 및 바실리 예컨대 B. 서브틸리스 및 B. 리케니포르미스(예컨대 B. 리케니포르미스 41 P, DD 266,710, 12 Apr. 1989), 슈도모나스 예컨대 P. 아에루기노사, 및 스트렙토마이세스를 포함한다. 바람직한 E. 콜리 클로닝 숙주는 E. 콜리 294(ATCC 31,446), 그러나 다른 균주 예컨대 E. 콜리 B, E. 콜리 X1776(ATCC 31,537), 및 E. 콜리 W3110(ATCC 27,325)도 적합하다. 이러한 예는 예시적인 것이며 제한하기 위한 것이 아니다.

원핵생물과 함께, 원핵 마이크로브 예컨대, 필라멘트형 진균 또는 효모는 항-NKG2A 항체-암호화 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로마이세스 세레비시아에, 또는 일반 제빵 효모가 일반적으로 하등 원핵 숙주 미생물유기체에 사용된다. 그러나, 다수의 다른 속, 종, 및 균주도 사용할 수 있고, 본원에 유용하며, 예컨대 스키조사카로마이세스 폼베; 클루베로마이세스 숙주 예컨대, 예컨대, K. 락티스, K. 프라질리스(ATCC 12,424), K. 불가리쿠스(ATCC 16,045), K. 위커라미(ATCC 24,178), K. 왈티(ATCC 56,500), K. 드로소필라룸(ATCC 36,906), K. 더모톨러란스, 및 K. 막시아누스; 여로위아(EP 402,226); 피치아 파스토리스(EP 183,070); 칸디다; 트리코데르마 레에시아(EP 244,234); 뉴로스포라 크라사; 슈완니오마이세스 예컨대 슈완니오마이세스 오씨덴탈리스; 및 필라멘트형 진균 예컨대, 예컨대, 뉴로스포라, 페니실리움, 톨리포클라디움, 및 아스페르길루스 숙주 예컨대 A. 니둘란스 및 A. 니게르.

글리코실화 항-NKG2A 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 다세포성 유기체로부터 유도된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 다수의 바큘로바이러스 균주 및 변이체 및 대응하는 숙주로부터 복제를 허용하는 곤충 숙주 세포 예컨대 스포도프테라 프루기페루다(모충), 아에데스 아에집티(모기), 아에데스 알보픽투스(모기), 드로소필라 멜라노개스터(초파리), 및 봄빅스 모리가 확인되었다. 다양한 전달감염용 바이러스 균주가 사용되며, 예컨대 아우토그라파 칼리포니카 NPV의 L-1 변이체 및 봄빅스 모리 NPV의 Bm-5 균주이고, 이러한 바이러스는 본 발명에 따른 바이러스로서 사용되었으며, 특히 스포도프테라 프루기페루다 세포에 사용된다.

면화, 옥수수, 감자, 대두, 페츄니아, 토마토, 및 담배의 식물 세포 배양물을 숙주로서 사용할 수 있다.

그러나, 척추동물 세포가 가장 관심 대상이며, 배양(조직 배양)시 척추동물 세포의 증식은 기존의 절차가 된다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 예는 SV40에서 형질전환된 원숭이 신장 CV1주(COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장(HEK) 주(현탁 배양에서 성장되기 위하여 서브클론된 293 또는 293 세포, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); 베이비 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL 10); 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DH FR(CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980), DG44 포함(Urlaub et al., Som. Cell and Mol. Gen., 12: 555-566 (1986)) 및 DP12 세포주); 마우스 써토리 세포(TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); 원숭이 신장 세포(CV1 ATCC CCL 70); 아프리칸 그린 원숭이 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부 암종 세포(HELA, ATCC CCL 2); 카닌 신장 세포(MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 레트 간 세포(BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포(W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포(Hep G2, HB 8065); 마우스 유선 종양(MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포(Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간암주(Hep G2)이다.

숙주 세포는 항-NKG2A 항체 생산을 위하여 전술한 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환되며, 프로모터를 유도하고, 형질전환체를 선택하거나, 또는 소망하는 서열을 암호화하는 유전자를 증폭하기 위하여 개질된 종래의 영양 배지 내에서 배양된다.

숙주 세포의 배양

본 발명의 항-NKG2A 항체의 생산에 사용된 숙주 세포는 다양한 배지 내에서 배양될 수 있다. 상업적으로 구득할 수 있는 배지 예컨대 햄 F10(Sigma), 최소 필수 배지((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma), Freestyle™ (Cibco) 및 둘베코 변형 이글 배지((DMEM), Sigma)가 숙주 세포 배양에 적합하다. 이와 함께, 예를 들어, Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979); Barnes et al., Anal. Biochem., 102:255 (1980); U.S. Pat. Nos. 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; 또는 5,122,469; WO 1990/03430; WO 1987/00195; 또는 U.S. Pat. Re. 30,985에 설명된 모든 배지를 숙주 세포용 배양 배지로서 사용될 수 있다. 이러한 모든 배지는 호르몬 및/또는 다른 성장 인자(예컨대 인슐린, 트랜스페린, 또는 표피 성장 인자), 염(예컨대 염화 나트륨, 칼슘, 마그네슘, 및 포스페이트), 완충액(예컨대 HEPES), 뉴클레오타이드(예컨대 아데노신 및 티미딘), 항생제(예컨대 GENTAMYCIN. TM. drug), 미량 성분(최종 농도에 마이크로몰 범위로 존재하는 무기 화합물로 정의), 및 글루코스 또는 동등한 에너지원으로 보충될 수 있다. 다른 필수적인 보충물은 당해 기술 분야의 숙련자에게 공지된 적합한 농도로 포함될 수 있다. 배양 조건, 예컨대 온도, pH, 등은 발현을 위하여 선택된 숙주 세포에 이전에 사용된 것이며, 당해 기술 분야의 숙련자에게 자명한 것이다.

항-NKG2A 항체의 분리

재조합 기법을 사용하는 경우, 항체는 세포 내 또는 원형질막주위 공간 내에서 생산될 수 있으며, 또는 배지 내로 직접적으로 분비될 수 있다. 항체가 세포내에서 생산되는 경우, 제1 단계로서, 입자화 잔해, 숙주 세포이거나 또는 용해된 절편이 예를 들어, 원심분리 또는 초여과에 의하여 제거된다. 문헌 Carter et al., Bio/Technology, 10:163-167 (1992)는 E. 콜리의 원형질막주위 공간으로 분비된 항체를 분리하기 위한 절차를 설명한다. 요약하자면, 세포 페이스트는 나트륨 아세테이트(pH 3.5), EDTA, 및 페닐메틸설포닐플루오라이드 (PMSF)의 존재하에 30분 이상 해동된다. 세포 잔해는 원심분리에 의하여 제거될 수 있다. 항체가 배지 내로 분비되는 경우, 이러한 발현 시스템의 상청은 일반적으로 구득가능한 단백질 농축 필터, 예를 들어, AMICON™ 또는 MILLIPORE PELLICON™ 초여과 유닛을 사용하여 1차 농축된다. 프로테아제 억제제 예컨대 페닐메틸설포닐 플루오라이드(PMSF)는 단백질분해를 억제하는 모든 이전 단계를 포함할 수 있으며, 항생제는 우발적인 오염의 성장을 예방하기 위하여 포함될 수 있다.

세포로부터 제조된 항체 조성물은, 예를 들어, 히드록시아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 및 바람직한 정제 기법을 지닌 친화도 크로마토그래피를 사용하여 정제될 수 있다. 친화도 리간드로서 단백질 A의 적합성은 항체 내에 존재하는 모든 면역글로블린 Fc 도메인의 종 및 아이소타입에 따라 달라진다. 단백질 A는 인간 감마1, 감마, 또는 감마4 중쇄에 기초한 항체를 정제하기 위하여 사용될 수 있다(Lindmark et al., J. Immunol. Meth., 62:1-13 (1983)). 단백질 G가 모든 마우스 아이소타입 및 인간 y3에 대하여 권고되었다(Guss et al., EMBO J., 5:15671575 (1986)). 친화도 리간드가 부착되는 기질은 대부분 아가로스이나, 다른 기질도 사용할 수 있다. 기계적으로 안정적인 매트릭스 예컨대 조절된-공극 글래스 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠은 아가로스로 달성한 것 보다 더 빠른 흐름 속도 및 더 짧은 처리 시간을 가능하게 한다. 항체가 CH3 도메인을 포함하는 경우, BAKERBOND ABX™ 수지 (J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.)가 정제에 사용하는 것이 유용하다. 단백질 정제를 위한 다른 기법, 예컨대 이온 교환 칼럼상의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카상 크로마토그래피, 헤파린 SEPHAROSE™상의 크로마토그래피, 음이온- 또는 양이온-교환 수지 상의 크로마토그래피(예컨대 폴리아스파르트산 컬럼), 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 및 암모늄-설페이트 침전이 회수되는 항체에 따라 사용될 수 있다.

Z270 또는 이의 인체적응형 버전의 예시적인 단백질 A-기반 정제법은 실시예 6에 설명되어 있다.

약학적 제형

일 실시상태에서, 본 발명은 본원의 항체와 하나 이상의 담체를 함께 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

따라서, 본 발명의 목적은 1 mg/ml 내지 500 mg/ml의 농도로 존재하는 이러한 항체를 포함하는 약학적 제형을 제공하는 것이며, 여기서 상기 제형은 pH가 2.0 내지 10.0 이다. 제형은 완충액 시스템, 보존제(들), 등장제(들), 킬레이트제(들), 안정화제 및 계면활성제를 추가로 포함할 수 있다. 일 실시상태에서, 약학적 제형은 수성 제형, 즉, 물을 함유한 제형이다. 이러한 제형은 일반적으로 용액 또는 현탁액이다. 추가적인 실시 상태에서, 약학적 제형은 수성 용액이다. 용어 "수성 제형"은 최소한 50 %w/w의 물을 포함하는 제형으로 정의된다. 이와 같이, 용어 "수성 용액"은 최소한 50 %w/w의 물을 포함하는 용액으로 정의되며, 용어 "수성 현탁액"은 최소한 50 %w/w의 물을 포함하는 현탁액으로 정의된다.

다른 실시상태에서, 약학적 제형은 동결-건조 제형이며, 이에 임상의 또는 환자는 사용 전 용매 및/또는 희석제를 첨가한다.

다른 실시상태에서, 약학적 제형는 사전 용해 없이 즉시 사용하는 건조 제형(예컨대 동결-건조 또는 분무-건조)이다.

추가적인 특징으로서, 약학적 제형은 이러한 항체, 및 완충액의 수성 용액을 포함하며, 여기서 항체는 1 mg/ml 또는 그 이상의 농도로 존재하며, 여기서 상기 제형의 pH는 약 2.0 내지 약 10.0 이다.

또 다른 실시 상태에서, 제형의 pH는 약 2.0 내지 약 10.0, 약 3.0 내지 약 9.0, 약 4.0 내지 약 8.5, 약 5.0 내지 약 8.0, 및 약 5.5 내지 약 7.5로 구성된 리스트로부터 선택된 범위 내에 존재한다.

추가적인 실시 상태에서, 완충액은 나트륨 아세테이트, 나트륨 카보네이트, 시트레이트, 글리실글리신, 히스티딘, 글리신, 라이신, 아르기닌, 나트륨 디하이드로겐 포스페이트, 디나트륨 하이드로겐 포스페이트, 나트륨 포스페이트, 및 트리스(히드록시메틸)-아미노메탄, 바이신, 트리신, 말산, 숙시네이트, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 아스파르트산 또는 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된다. 각각의 이러한 특이적 완충액은 본 발명의 대안적 실시 상태를 구성한다.

추가적인 실시 상태에서, 제형은 약학적으로 허용가능한 보존제를 추가로 포함한다. 보존제는, 예컨대, 페놀, o-크레졸, m-크레졸, p-크레졸, 메틸 p-히드록시벤조에이트, 프로필 p-히드록시벤조에이트, 2-페녹시에탄올, 부틸 p-히드록시벤조에이트, 2-페닐에탄올, 벤질 알콜, 클로로부탄올, 및 티오메로살, 브로노폴, 벤조산, 이미드우레아, 클로로헥시딘, 나트륨 데히드로아세테이트, 클로로크레졸, 에틸 p-히드록시벤조에이트, 벤즈에토늄 클로라이드, 클로르페네신(3p-클로르페녹시프로판-1,2-디올) 또는 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 보존제는, 예컨대, 0.1 mg/ml 내지 20 mg/ml, 0.1 mg/ml 내지 5 mg/ml, 5 mg/ml 내지 10 mg/ml, 또는 10 mg/ml 내지 20 mg/ml의 농도로 존재한다. 각각의 이러한 특이적 보존제는 본 발명의 대안적 실시 상태를 구성한다. 약학적 조성물에 보존제의 사용은 당해 기술 분야의 숙련자에게 공지되어 있다. 편의를 위하여 참고자료로서 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995가 있다.

추가적인 실시 상태에서, 제형은 등장제를 추가로 포함할 수 있다. 등장제는, 예컨대, 염(예컨대 나트륨 클로라이드), 당 또는 당 알콜, 아미노산 (예컨대 L-글리신, L-히스티딘, 아르기닌, 라이신, 이소류신, 아스파르트산, 트립토판, 트레오닌), 알디톨(예컨대 글리세롤(글리세린), 1,2-프로판디올(프로필렌글리콜), 1,3-프로판디올, 1,3-부탄디올) 폴리에틸렌글리콜(예컨대 PEG400), 또는 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된다. 모든 당 예컨대 모노-, 디-, 또는 폴리사카라이드, 또는 수용성 글루칸, 예를 들어 푸룩토오스, 글루코스, 만노스, 소르보스, 자일로스, 말토오스, 락토오스, 슈크로스, 트레할로스, 덱스트란, 풀루란, 덱스트린, 시클로덱스트린, 가용성 전분, 히드록시에틸 전분 및 카르복시메틸셀룰로오스-Na가 사용될 수 있다. 일 실시상태에서, 당 첨가제는 슈크로스이다. 당 알콜은 최소한 하나의 -OH기를 지닌 C4-C8 탄화수소로서 정의되며, 예를 들어, 만니톨, 소르비톨, 이노시톨, 갈락티톨, 둘시톨, 자일리톨, 및 아라비톨을 포함한다. 일 실시상태에서, 당 알콜 첨가제는 만니톨이다. 전술한 당 또는 당 알콜은 개별적으로 또는 조합하여 사용될 수 있다. 액체 제조시 당 또는 당 알콜이 가용성인한 사용량의 제한은 없으나 본 발명의 방법에 사용되는 안정화 효과에 악영향을 주지 않는다. 당 또는 당 알콜 농도는, 예컨대, 약 1 mg/ml 내지 약 150 mg/ml 사이이다. 등장제는, 예컨대, 1 mg/ml 내지 50 mg/ml, 1 mg/ml 내지 7 mg/ml, 8 mg/ml 내지 24 mg/ml, 또는 25 mg/ml 내지 50 mg/ml의 농도로 존재할 수 있다. 각각의 이러한 특이적 등장제는 본 발명의 대안적 실시 상태를 구성한다. 약학적 조성물에 등장제의 사용은 당해 기술 분야의 숙련자에게 공지되어 있다. 편의를 위하여 참고자료로서 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995가 있다.

추가적인 실시 상태에서, 제형은 또한 킬레이트제를 포함한다. 킬레이트제는, 예를 들어, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 시트르산, 및 아스파르트산, 및 이들의 혼합물의 염으로부터 선택된다. 킬레이트제는, 예를 들어, 0.1 mg/ml 내지 5 mg/ml, 0.1 mg/ml 내지 2 mg/ml, 또는 2 mg/ml 내지 5 mg/ml의 농도로 존재할 수 있다. 각각의 이러한 특이적 킬레이트제는 본 발명의 대안적 실시 상태를 구성한다. 약학적 조성물에 보존제의 사용은 당해 기술 분야의 숙련자에게 공지되어 있다. 편의를 위하여 참고자료로서 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995가 있다.

본 발명의 추가적인 실시 상태에서, 제형은 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다. 약학적 조성물에 안정화제의 사용은 당해 기술 분야의 숙련자에게 공지되어 있다. 편의를 위하여 참고자료로서 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995가 있다. 보다 상세히 살펴보면, 본 발명의 조성물은 저장시 액체 약학적 제형 내에서 응집체 형성을 억제할 수 있는 폴리펩타이드를 포함하는 치료적적 활성 성분을 보유한 액체 약학적 조성물을 안정화시킨다. "응집체 형성"은 가용성인 상태로 잔존하는 올리고머, 또는 용액에서 침전된 육안 식별되는 거대 응집체의 형성을 유발하는 폴리펩타이드 분자간의 물리적 상호작용을 의미한다. "저장시"는 제조된 액체 약학적 조성물 또는 제형이 즉시 대상체에 투여되지 않는 것을 의미한다. 그 다음, 제조 후, 저장을 위하여 액체의 형태, 동결된 상태 또는 건조된 상태로 포장되어 후에 대상체 투여에 적합한 액체 형태 또는 다른 형태로 재구성된다. "건조 형태"는 액체 약학적 조성물 또는 제형이 동결 건조(즉, lyophilization; 예를 들어, Williams and Polli (1984) J. Parental Sci. Technol. 38:48-59), 분무 건조 (see Masters (1991) in Spray-Drying Handbook (5th ed; Longman Scientific and Technical, Essez, U.K.), pp. 491-676; Broad head et al. (1992) Drug Devel. Ind. Pharm. 18:1169-1206; 및 Mumenthaler et al. (1994) Pharm. Res. 1 1 :12-20), 또는 천연 건조(Carpenter and Crowe (1988) Cryobiology 25:459-470; and Roser (1991) Biopharm. 4:47-53) 등에 의하여 건조된다는 것을 의미한다. 액체 약학적 조성물의 저장시 폴리펩타이드에 의한 응집체 형성은 상기 폴리펩타이드 생물학적 활성에 부정적 영향을 미치며, 따라서, 약학적 조성물 치료적 효능에 손실을 주게된다. 더욱이, 응집체 형성은 다른 문제점 예컨대 폴리펩타이드-함유 약학적 조성물이 주입 시스템을 사용하여 투여되는 경우 튜빙, 막, 또는 펌프의 차단을 유발할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 조성물의 저장시 폴리펩타이드에 의한 응집체 형성을 감소시키기에 충분한 일정량의 아미노산 염기를 추가적으로 포함할 수 있다. "아미노산 염기"는 주어진 아미노산이 이들의 유리 염기 형태나 또는 이들의 염의 형태로 존재하는 아미노산 또는 아미노산의 조합을 의미한다. 아미노산의 조합이 사용되는 경우, 모든 아미노산이 유리 염기 형태이거나, 염의 형태이거나, 또는 일부는 이들의 유리염기의 형태이고 나머지는 이들의 염의 형태일 수 있다. 일 실시상태에서, 본 발명의 조성물의 제조에 사용되는 아미노산은 대전된 측쇄, 예컨대 아르기닌, 라이신, 아스파르트산, 및 글루탐산을 구비할 수 있다. 특정 아미노산 (예컨대 메티오닌, 히스티딘, 이미다졸, 아르기닌, 라이신, 이소류신, 아스파르트산, 트립토판, 트레오닌 및 이들의 혼합물)의 모든 입체 이성질체(즉, L, D, 또는 이들의 혼합물) 또는 이러한 입체 이성질체의 조합은 특정 아미노산이 이들의 유리 염기 형태 또는 이들의 염의 형태로 존재하는 한 약학적 본 발명의 조성물 내에 존재할 수 있다. 일 실시상태에서 L형-입체 이성질체가 사용된다. 본 발명의 조성물은 또한 이러한 아미노산의 유사체로 제형화된다. "아미노산 유사체"는 본 발명의 액체 약학적 조성물의 저장시 폴리펩타이드에 의한 응집체 형성을 감소시키는 소망하는 효과를 나타내는 자연 발생적 아미노산의 유사체의 유도체를 의미한다. 적합한 아르기닌 유사체는, 예를 들어, 아미노구아니딘, 오르니틴 및 N-모노에틸 L-아르기닌를 포함하며, 적합한 메티오닌 유사체는 에티오닌 및 부티오닌을 포함하고, 및 적합한 시스테인 유사체는 S-메틸-L 시스테인을 포함한다. 다른 아미노산과 같이, 아미노산 유사체는 이들의 유리 염기 형태 또는 이들의 염의 형태로 조성물 내로 함유된다. 본 발명의 추가적인 실시 상태에서, 아미노산 또는 아미노산 유사체는 단백질의 응집을 예방 또는 지연시키기 충분한 농도로 사용된다.

본 발명의 추가적인 실시 상태에서, 치료적 약제로 작용하는 폴리펩타이드가 이러한 산화에 민감한 최소한 하나의 메티오닌 잔기를 포함하는 폴리펩타이드인 경우 메티오닌(또는 다른 유황 아미노산 또는 아미노산 유사체)에 메티오닌 잔기의 산화를 억제하기 위하여 메티오닌 설폭사이드를 첨가할 수 있다. "억제"는 시간이 지남에 따른 메티오닌 산화 종의 최소한의 축적을 의미한다. 메티오닌 산화 억제는 적절한 분자 형태의 폴리펩타이드를 더 많이 보유하게 한다. 메티오닌(L 또는 D) 또는 이들의 조합의 모든 입체 이성질체를 사용할 수 있다. 첨가량은 메티오닌 잔기의 산화를 억제하기에 충분한 양이어서 메티오닌 설폭사이드의 양은 조절 기관에서 허용가능한 것이어야 한다. 일반적으로, 이는 조성물이 단지 약 10% 내지 약 30% 메티오닌 설폭사이드만을 함유한다는 것을 의미한다. 일반적으로, 이는 메티오닌을 첨가하여 첨가된 메티오닌 대 메티오닌 잔기의 비율이 약 1:1 내지 약 1000:1, 예컨대 10:1 내지 약 100:1이 되도록 함으로써 달성할 수 있다.

추가적인 실시 상태에서, 제형은 고 분자량 폴리머 또는 저 분자 화합물의 군으로부터 선택된 안정화제를 추가로 포함한다. 본 발명의 추가적인 실시 상태에서, 안정화제는 폴리에틸렌 글리콜(예컨대 PEG 3350), 폴리비닐 알콜(PVA), 폴리비닐피롤리돈, 카르복시-/히드록시셀룰로오스 또는 이들의 유도체(예컨대 HPC, HPC-SL, HPC-L 및 HPMC), 시클로덱스트린, 황-함유 물질 예컨대 모노티오글리세롤, 티오글리콜산 및 2-메틸티오에탄올, 및 다른 염(예컨대 나트륨 클로라이드)로부터 선택된다. 각각의 이러한 특이적 안정화제는 본 발명의 대안적 실시 상태를 구성한다.

약학적 조성물은 또한 추가적인 안정화제를 포함하며, 이는 본원의 치료적 활성 폴리펩타이드의 안정성을 증진시킨다. 본 발명의 특정 안정화제에는, 메티오닌 산화로부터 폴리펩타이드를 보호하는 메티오닌 및 EDTA, 및 동결건조 또는 기계적 전단력에 관련된 응집으로부터 폴리펩타이드를 보호하는 비이온성 계면활성제를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

추가적인 실시 상태에서, 제형은 계면활성제를 추가적으로 포함한다. 계면활성제는, 예를 들어, 세정제, 에톡시화 피마자유, 폴리글리콜화 글리세라이드, 아세틸화 모노글리세라이드, 소르비탄 지방산 에스테르, 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 블럭 중합체(예컨대, 폴리옥사머 예컨대 Pluronic® F68, poloxamer 188 및 407, Triton X-100), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 및 폴리에틸렌 유도체 예컨대 알킬화 및 알콕시화 유도체 (tweens, 예컨대 Tween-20, Tween-40, Tween-80 및 Brij-35), 모노글리세라이드 또는 에톡시화 이들의 유도체, 디글리세라이드 또는 폴리옥시에틸렌 이들의 유도체, 알콜, 글리세롤, 렉틴 및 포스포리피드(예컨대, 포스파티딜 세린, 포스파티딜 콜린, 포스파티딜 에탄올아민, 포스파티딜 이노시톨, 디포스파티딜 글리세롤 및 스핑고마이엘린), 포스포리피드의 유도체(예컨대, 디팔미토일 포스파티딜산) 및 라이소포스포리피드(예컨대, 에탄올아민, 콜린, 세린 또는 트레오닌의 팔미토일 라이소포스파티딜-L-세린 및 1-아실-sn-글리세로-3-포스페이트 에스테르) 및 라이소포스파티딜 및 포스파티딜콜린의 알킬, 알콕실(알킬 에스테르), 알콕시(알킬 에테르)-유도체, 예컨대 라이소포스파티딜콜린, 디팔미토일포스파티딜콜린, 및 극성 헤드기의 변형체의 라우로일 및 미리스토일 유도체, 예컨대 콜린, 에탄올아민, 포스파티딜산, 세린, 트레오닌, 글리세롤, 이노시톨, 및 양성 대전 DODAC, DOTMA, DCP, BISHOP, 라이소포스파티딜세린 및 라이소포스파티딜트레오닌, 및 글리세로포스포리피드(예컨대, 세파린), 글리세로글리코리피드(예컨대, 갈락토피란소이드), 스핑고글리코리피드(예컨대, 세라미드, 강글리오사이드), 도데실포스포콜린, 헨 에그 라이소레시틴, 후시드산 유도체-(예컨대, 나트륨 타우로-디하이드로후시데이트 등), 장쇄 지방산 및 이들의 염 C6-C12 (예컨대, 올레산 및 카프릴산), 아실카르니틴 및 유도체, 라이신, 아르기닌 또는 히스티딘의 N^α-아실화 유도체, 또는 라이신 또는 아르기닌의 측쇄 아실화 유도체, 라이신, 아르기닌 또는 히스티딘 및 중성 또는 산성 아미노산의 조합을 포함하는 디펩타이드의 N^α-아실화 유도체, 중성 아미노산 및 2개의 대전된 아미노산의 모든 조합을 포함하는 트리펩타이드의 N^α-아실화 유도체, DSS (도큐세이트 나트륨, CAS registry no [577-1 1-7]), 도큐세이트 칼슘, CAS registry no [128-49-4]), 도큐세이트 칼륨, CAS registry no [7491-09-0]), SDS (나트륨 도데실 설페이트 또는 나트륨 라우릴 설페이트), 나트륨 카프릴레이트, 담즙산 또는 이들의 유도체, 담즙산 및 이들의 염 및 글리신 또는 타우린 접합체, 우르소데옥시콜린산, 나트륨 콜레이트, 나트륨 데옥시콜레이트, 나트륨 타우로콜레이트, 나트륨 글리코콜레이트, N-헥사데실-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판설포네이트, 아미노익(알킬-아릴-설포네이트) 1가 계면활성제, 양쪽성 이온 계면활성제 (예컨대 N-알킬-N,N-디메틸암모니오-1-프로판설포네이트, 3-콜아미도-1-프로필디메틸암모니오-1-프로판설포네이트, 양이온성 계면활성제 (4차 암모늄 염기) (예컨대 세틸-트리메틸암모늄 브로마이드, 세틸피리디늄 클로라이드), 비이온성 계면활성제(예컨대, 도데실 β-D-글루코피라노사이드), 산화 프로필렌 및 산화 에틸렌을 에틸렌디아민에 순차적으로 첨가하여 유도된 3 기능성 블럭 공중합체인 폴록사민(예컨대, 테트로닉스)으로부터 선택되거나, 또는 계면활성제는 이미다졸린 유도체, 또는 이들의 혼합물의 군으로부터 선택될 수 있다. 각각의 이러한 특이적 계면활성제는 본 발명의 대안적 실시 상태를 구성한다.

약학적 조성물에 계면활성제의 사용은 당해 기술 분야의 숙련자에게 공지되어 있다. 편의를 위하여 참고자료로서 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995가 있다.

추가적인 실시 상태에서, 제형은 프로테아제 억제제 예컨대 EDTA (에틸렌디아민 테트라아세트산) 및 벤즈아미딘 HCI을 추가로 포함할 수 있으나, 상업적으로 시판되는 프로테아제 억제제를 사용할 수도 있다. 프로테아제 억제제의 사용은 특히 자가분해를 억제하기 위하여 프로테아제의 효소원을 포함하는 약학적 조성물에 유용하다.

다른 성분이 본 발명의 펩타이드 약학적 제형 내에 존재하는 것이 가능하다. 이러한 추가적인 성분은 습윤제, 에멀젼화제, 항산화제, 팽창제, 등장성 조절제, 킬레이트제, 금속 이온, 유성 운반체, 단백질(예컨대, 인간 혈청 알부민, 젤라틴 또는 단백질) 및 양쪽성이온(예컨대, 아미노산 예컨대 베타인, 타우린, 아르기닌, 글리신, 라이신 및 히스티딘)을 포함할 수 있다. 이러한 추가적인 성분은 물론, 본 발명의 약학적 제형의 전체적인 안정성에 역효과를 나타내서는 안된다.

본 발명의 항체를 함유하는 약학적 조성물은 몇몇 부위, 예를 들어, 국소 부위, 예를 들어, 피부 및 점막 부위, 우회 흡수되는 부위, 예를 들어, 동맥, 정맥 심장에 투여, 및 연관 흡수 부위, 예를 들어, 피부, 피하, 근육 또는 복부 투여를 통하여 이러한 치료가 필요한 환자에게 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여는 여러 투여 경로를 통하여 이루어질 수 있으며, 예를 들어, 피하, 근육내, 복막내, 정맥내, 혀, 설하, 볼, 구강내, 경구, 위장관내, 비강, 폐, 예를 들어, 세기관지 및 폐포 또는 이들의 조합을 통한 투여, 표피, 피부, 경피, 질, 직장, 안구, 예를 들어 결막, 요도, 및 비경구에 의하여 치료가 필요한 환자에 투여된다.

본 발명의 조성물은 다수의 투약 형태, 예를 들어, 용액, 현탁액, 에멀젼, 마이크로에멀젼, 다중 에멀젼, 폼, 연고, 페이스트, 고약, 연고, 타블렛, 피복 타블렛, 린스, 캡슐, 예컨대, 경성 젤라틴 캡슐 및 연성 젤라틴 캡슐, 좌약, 직장 캡슐, 액적, 겔, 스프레이, 분말, 에어로졸, 흡입, 안약, 안 연고, 안 린스, 질 좌약, 질링, 질 연고, 주사 용액, 즉석 전환 용액, 예를 들어 즉석 젤화, 즉석 세팅, 즉석 침전, 즉석 결정화, 주입 용액, 및 삽입물에 의하여 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물은 항체의 안정성을 증진시키고, 생체활용성 및 가용성을 증가시키며, 역효과를 감소시키고, 당해 기술 분야의 숙련자에게 공지된 생체리듬치료를 달성하며, 및 환자 만족도를 증가시키거나 또는 이들의 조합을 갈성하기 위하여 공유, 소수 및 정전기적 상호작용, 약물 담체, 약물 전달 시스템 및 진보된 약물 전달 시스템을 통하여 추가적으로 화합되거나 또는 부착될 수 있다. 담체, 약물 전달 시스템 및 진보된 약물 전달 시스템의 예는 고분자, 예를 들어 셀룰로오스 및 유도체, 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트란 및 유도체, 전분 및 유도체, 폴리비닐 알콜), 아크릴레이트 및 메트아크릴레이트 고분자, 폴리락트 및 폴리글리콜산 및 이들의 블럭 공중합체, 폴리에틸렌 글리콜, 담체 단백질, 예를 들어 알부민, 겔, 예를 들어, 열겔화 시스템, 예를 들어 공지된 블럭 공중합 시스템, 미셀, 리포좀, 마이크로스피어, 나노입자, 액체 결정 및 이들의 분산액, L2 상 및 이들의 분산액, 지질-수성 시스템 내에서 상 운동으로 공지된 것, 고분자 미셀, 다중 에멀젼, 자가 에멀젼화, 자가-마이크로에멀젼화, 시클로덱스트린 및 이들의 유도체, 및 덴드리머를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 조성물은 예를 들어 공지된 기구인 복용량 계측 흡입기, 건조 분말 흡입기 및 분무기를 사용하여 항체의 폐 투여용 고체, 반고체, 분말 및 용액의 제형에 유용하다.

본 발명의 조성물은 조절된, 지속성, 연장, 지연, 및 저속 방출 약물 전달 시스템의 제형에 유용하다. 특히, 이에 한정되지는 않으나, 조성물은 공지된 조절 방출 및 지속 방출 시스템(투여 횟수를 수배 감소시키는 두 시스템)의 비경구 제형에 유용하다. 더욱 더 바람직하게는, 조절 방출 및 지속 방출 시스템은 피하 투여된다. 본 발명의 범위의 제한 없이, 유용한 조절 방출 시스템 및 조성물의 예는 수화겔, 유화겔, 액체 결정, 고분자 미셀, 마이크로스피어, 나노입자이다.

본 발명의 조성물에 유용한 조절 방출 시스템의 생산 방법은 결정화, 축합, 동시-결정화, 침전, 동시-침전, 에멀젼화, 분산, 고압 균질화, 캡슐화, 분무 건조, 마이크로캡슐화, 코아세르베이트화, 상 분리, 마이크로스피어, 압출 및 초임계 유체 프로세스를 생산하기 위한 용매 증발이다. 일반적인 참고자료로서 Handbook of Pharmaceutical Controlled Release(Wise, D. L., ed. Marcel Dekker, New York, 2000) 및 Drug and the Pharmaceutical Sciences vol. 99: Protein Formulation and Delivery (MacNally, E. J., ed. Marcel Dekker, New York, 2000)가 있다.

비경구 투여는 주사기, 선택적으로 펜-유사 주사기에 의하여 피하, 근육내, 복막내 또는 정맥내 주입에 의하여 수행될 수 있다. 대안적으로, 비경구 투여는 주입 펌프에 의하여 수행될 수 있다. 추가의 선택은 비강 또는 폐 스프레이의 형태의 항체 화합물의 투여를 위한 용액 또는 현탁액일 수 있는 조성물이다. 추가적인 선택으로서, 본 발명의 항체를 함유하는 약학적 조성물이 또한 경피 투여, 예컨대 바늘없는 주입 또는 패치, 선택적으로 전리 패치, 또는 경점막, 예컨대 볼점막, 투여에 적용될 수 있다.

항체는 폐 약물 전달에 적합한 공지의 모든 기구를 사용하여 용액, 현탁액 또는 건조 분말로서 폐 경로를 통하여 투여될 수 있다. 이러한 것들의 예는, 이에 한정되는 것은 아니나, 폐 약물 전달을 위한 3개의 일반적인 유형의 에어로졸생성을 포함하며, 제트 또는 초음파 분무기, 복용량 측정 흡입기, 또는 건조 분말 흡입기를 포함할 수 있다(Cf. Yu J, Chien YW. Pulmonary drug delivery: Physiologic and mechanistic aspects. Crit Rev Ther Drug Carr Sys 14(4) (1997) 395-453).

표준화된 시험 방법론에 기초하여, 입자의 공기역학적 직경(da)은 단위 밀도의 표준 구형 입자의 기하 등적 직경으로서 정의된다(1g/cm³). 가장 단순화한 경우, 구형 입자에 있어서, da는 다음에 정의된 바와 같이 밀도비의 루트의 함수로서 참조 직경 (d)에 관련되어 있다:

비구형 입자에서는 이러한 관계식이 변형된다(cf. Edwards DA, Ben-Jebria A, Langer R. Recent advances in Pulmonary drug delivery using large, porous inhaled Particles. J Appl Physiol 84(2) (1998) 379-385). 용어 "MMAD" 및 "MMEAD"는 잘 설명되어 있으며, 당해 기술 분야에 공지되어 있다(cf. Edwards DA, Ben-Jebria A, Langer R and represents a measure of the median value of an aerodynamic Particle size distribution. Recent advances in Pulmonary drug delivery using large, porous inhaled particle. J Appl Physiol 84(2) (1998) 379-385). 질량 평균 공기역학적 직경(MMAD) 및 질량 평균 유효 공기역학적 직경(MMEAD)은 호환하여 사용되며, 통계적 변수이고, 실제 모양, 크기, 또는 밀도와 독립적으로 폐에 잠재적으로 보유되는 에어로졸 입자의 크기를 실험적으로 설명한다(cf. Edwards DA, Ben-Jebria A, Langer R. Recent advances in Pulmonary drug delivery using large, porous inhaled particle. J Appl Physiol 84(2) (1998) 379-385). MMAD는 일반적으로 공기중 입자 관성 행동을 측정하는 기구인 충격기로 측정하여 계산된다.

추가적인 실시 상태에서, 제형은 모든 공지의 에어로졸화 기술, 예컨대 분무화에 의하여 에어로졸화되어 10 μm 이하, 더욱 바람직하게는 1-5 μm 사이, 및 가장 바람직하게는 1-3 μm 사이의 에어로졸 입자의 MMAD를 달성할 수 있다. 바람직한 입자 크기는 단백질을 최적으로 흡수하도록 하는 폐 심부에 약물을 전달할 수 있는 가장 효과적인 크기에 기초한다(cf. Edwards DA, Ben-Jebria A, Langer A, Recent advarices in Pulmonary drug delivery using large, porous inhaled particle. J Appl Physiol 84(2) (1998) 379-385).

항체를 포함하는 폐 제형의 폐 심부 부착은 선택적으로 흡입 기법의 변형에 의하여 최적화 될 수 있으며, 예를 들어, 다음에 한정되지 않는다: 저속 흡입 흐름(예컨대, 30 L/min), 호흡 중지 및 활동 시간.

용어 "안정화 제형"은 증가된 물리적 안정성, 증가된 화학적 안정성 또는 증가된 물리적 및 화학적 안정성을 지닌 제형을 의미한다.

본원에 사용되는 용어 단백질 제형의 "물리적 안정성"은 생물학적으로 불활성을 형성하는 단백질의 경향성 및/또는 열-기계적 스트레스 및/또는 계면과 불안정화시키는 표면과의 상호작용, 예컨대 소수성 표면과 계면간의 상호작용에 단백질을 노출시킨 결과로서의 단백질의 불용성 응집을 의미한다. 수성 단백질 제형의 물리적 안정성은 적합한 용기 (예컨대 카트리지 또는 바이알) 내에 충진된 제형을 서로 다른 온도로 다양한 시간 동안 기계적/물리적 스트레스(예컨대 진탕)에 노출 시킨 후 육안 검사 및/또는 혼탁도 측정에 의하여 평가된다. 제형의 육안 검사는 어두운 배경을 지닌 정밀 촛점광으로 수행된다. 제형의 혼탁도는 혼탁도의 육안 등급인 육안 점수, 예를 들어, 0 내지 3 점으로 특성화된다(혼탁도를 나타내지 않는 제형은 육안 점수 0에 해당하며, 및 주간에도 식별가능한 혼탁도를 나타내는 제형은 육안 점수 3에 해당한다). 제형은 주간에도 식별가능한 혼탁도를 나타내는 경우 단백질 응집에 관하여 물리적 불안정으로 분류된다. 대안적으로, 제형의 혼탁도는 당해 기술 분야의 숙련자에게 공지된 단순 혼탁도 측정으로 평가된다. 수성 단백질 제형의 물리적 안정성은 단백질의 3차원 상태의 분광제 또는 프로브를 사용하여 평가될 수도 있다. 프로브는 바람직하게는 단백질의 인공 이형태체에 우선적으로 결합하는 소분자이다. 단백질 구조의 소분자 분광 프로브의 일례는 티오플라빈 T이다. 티오플라빈 T는 아밀로이드 원섬유의 검출에 널리 사용되는 형광 안료이다. 원섬유의 존재, 및 다른 단백질 배치에 있어서, 티오플라빈 T는 원섬유 단백질 형태에 결합되는 경우 약 450 nm에서 신규의 최대 여기 및 약 482 nm에서 증가된 방출을 나타낸다. 미결합 티오플라빈 T는 필수적으로 파장에 비형광이다.

다른 소분자는 단백질 구조가 천연 상태에서 비천연 상태로 변화하는 프로브로서 사용된다. 예를 들어 노출된 단백질의 소수성 패치에 우선적으로 결합하는 "소수성 패치" 프로브이다. 소수성 패치는 일반적으로 이의 천연 상태에서 단백질의 3차원 구조 내에 덮여 있으나, 단백질이 개방되거나 변성되는 경우 노출될 수 있다. 이러한 소분자, 분광 프로브의 예는 방향족, 소수성 안료, 예컨대 안트라센, 아크리딘, 페난트롤린 등이다. 다른 분광 프로브는 금속-아미노산 복합체, 예컨대 소수성 아미노산의 코발트 금속 복합체, 예컨대 페닐알라닌, 류신, 이소류신, 메티오닌, 및 발린, 등 이다.

본원에 사용되는 용어 단백질 제형의 "화학적 안정성"은 천연 단백질 구조에 비하여 생물학적 능력 및/또는 잠재적인 증가된 면역원성 특성을 덜 나타내는 화학적 분해 산물의 형성을 유도하는 단백질 구조 내의 화학적 원자가 변화를 나타낸다. 다양한 화학적 분해 산물은 천연 단백질의 유형 및 특성, 및 단백질이 노출되는 환경에 따라 형성될 수 있다. 화학적 분해의 제거는 완전하게 회피하기는 어려우며, 화학적 분해 산물은 당해 기술 분야의 숙련자에 의하여 저장시 및 사용시 증가가 관찰된다. 대부분의 단백질은 글루타미닐 또는 아스파라기닐 잔기 내의 측쇄 아미드기가 가수분해되어 유리 카르복실산을 형성하는 과정인, 탈아미드화되는 경향이 있다. 다른 분해 경로는 2 이상의 단백질 분자가 공유 결합된 2량체, 올리고머 및 고분자 분해 산물의 형성을 유도하는 트랜스아미드화 및/또는 2황화 상호작용을 통하여 서로 공유 결합되는 고 분자량 변성 산물의 형성에 관련되어 있다(Stability of Protein Pharmaceuticals, Ahem. T.J. & Manning M. C, Plenum Press, New York 1992). 산화 (예를 들어 메티오닌 잔기의 산화)는 화학적 분해의 또다른 변형으로 언급될 수 있다. 단백질 제형의 화학적 안정성은 다른 환경 조건에 다양한 시점에서 노출된 화학적 분해 산물의 양을 측정함으로써 평가될 수 있다(분해 산물의 형성은 예를 들어 온도 증가에 의하여 가속화될 수 있다). 각 개별 분해 산물의 양은 다양한 크로마토그래피 기법을 사용하여 분자 크기 및/또는 전하에 따라 분해 산물을 분리함으로서 측정할 수 있다(예컨대 SEC-HPLC 및/또는 RP-HPLC).

그러므로, 전술한 바와 같이, "안정화 제형"은 증가된 물리적 안정성, 증가된 화학적 안정성 또는 증가된 물리적 및 화학적 안정성을 지닌 제형을 의미한다. 일반적으로, 제형은 유통기한이 만료될 때 까지 사용 및 저장시 안정적이어야 한다(사용 및 저장 상태에 따라).

본 발명의 일 실시상태에서, 항체를 포함하는 약학적 제형은 6 주 이상의 사용 및 3년 이상의 보관에 안정적이다.

본 발명의 다른 실시상태에서, 항체를 포함하는 약학적 제형은 4 주 이상의 사용 및 3년 이상의 보관에 안정적이다.

본 발명의 추가적인 실시 상태에서, 항체를 포함하는 약학적 제형은 4 주 이상의 사용 및 2년 이상의 보관에 안정적이다.

본 발명의 추가적인 실시 상태에서, 항체를 포함하는 약학적 제형은 2 주 이상의 사용 및 2년 이상의 보관에 안정적이다.

적합한 항체 제형은 또한 이미 개발된 다른 치료적 단클론성 항체와 함께 실험하여 결정된다. 수종의 단클론성 항체가 임상적 상태에 따라 효과적이라고 알려져 있으며, 예컨대 Rituxan(Rituximab), Herceptin(Trastuzumab), Xolair(Omalizumab), Bexxar(Tositumomab), Campath(Alemtuzumab), Zevalin, Oncolym 및 이와 유사한 제형은 본 발명의 항체와 함께 사용할 수 있다. 예를 들어, 단클론성 항체는 100 mg (10 ml) 또는 500 mg (50 ml) 1회용 바이알에 10 mg/mL의 농도로 제공될 수 있으며, IV 투여를 위하여 9.0 mg/mL 나트륨 클로라이드, 7.35 mg/mL 나트륨 시트레이트 디하이드레이트, 0.7 mg/mL 폴리소르베이트 80, 및 주사용 무균수로 제형화된다. pH는 6.5로 조절되었다. 다른 실시상태에서, 항체는 pH 약 6.0에서 약 20 mM Na-시트레이트, 약 150 mM NaCl를 포함하는 제형으로 제공된다.

치료적 응용

본원의 항-NKG2A 항체를 사용하여 환자를 치료하는 방법이 또한 제공된다. 일 실시상태에서, 본 발명은 인간 환자에 투여하기 위한 약학적 조성물의 제조시의 본원의 항체의 용도를 제공한다. 일반적으로, 환자는 암, 바이러스 질환, 염증 질환, 또는 자가면역 질환을 겪고 있거나 걸릴 위험이 있다. 대안적으로, 본 발명의 항체는 환자의 골수 이식을 향상시키기 위하여 사용된다.

예를 들어, 일 특징으로서, 본 발명은 이들이 필요한 환자에서 CD94/NKG2A-제한 림프구의 활성을 강화하는 방법을 제공하며, 상기 환자에 인간 또는 인체적응형 항-NKG2A 항체를 투여하는 단계를 포함하고, 이 항체는 CD94/NKG2A 수용체의 HLA-E-매개 활성화를 감소 또는 예방한다. 일 실시상태에서, 증가된 NK, T, 및/또는 NKT 세포 활성이 유리한 질병을 보유한 환자 내에서 이러한 림프구의 활성을 증가시키는 방법에 관한 것이며, 이는 NK, T, 또는 NKT 세포에 의한 용해에 대한 세포 감수성에 관련되거나, 영향을 미치거나 또는 이로인하여 유발되는 것, 또는 불충분한 NK, T, 또는 NKT 세포 활성, 예컨대 암, 감염성 질환 또는 면역 질환에 의하여 유도되거나 또는 특성화된 것이다.

보다 상세히 살펴보면, 본 발명의 방법 및 조성물은 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 암 및 다른 증식성 질환의 치료에 사용된다: 암종, 예컨대 방광암종, 유방암종, 결장암종, 신장암종, 간암종, 폐암종, 난소암종, 고환암종, 췌장암종, 위암종, 자궁경부암종, 갑상선암종 및 편평 세포 암종을 포함하는 피부암종; 림프구 계통의 조혈성 종양, 예컨대 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 급성 림프모구 백혈병, B-세포 림프종, T-세포 림프종, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 모발상 세포 림프종 및 버케트 림프종, 및 다발성 골수종; 골수 계통의 조혈성 종양, 예컨대 급성 및 만성 골수성 백혈병, 전골수구성 백혈병, 및 골수형성이상 증후군; 중간엽 기원 종양, 예컨대 섬유육종 및 횡문근육종; 기타 종양, 예컨대 흑색종, 생식세포종, 기형암종, 신경모세포종 및 신경아교종; 중추 및 말초 신경계 종양, 예컨대 별아교세포종, 신경모세포종, 신경아교종, 및 신경집종; 중간엽 기원 종양, 예컨대 섬유육종, 횡문근육종, 및 골육종; 및 기타 종양, 예컨대 흑색종, 색소성 피부건조증, 각질가시세포종, 생식세포종, 갑상선 소포 암 및 기형암종.

본 발명에 의하여 치료할 수 있는 특정 질환은 림프구 계통의 조혈성 종양, 예를 들어 T-세포 및 B-세포 종양을 포함하며, T-세포 질환 예컨대 T-프로림프성 백혈병(T-PLL), 예컨대 소 세포 및 대뇌모양 세포 유형; 거대 과립 림프구 백혈병(LGL) 바람직하게는 T-세포 유형; 세자리 증후군(SS); 성인 T-세포 백혈병 림프종(ATLL); T-NHL 간비장 림프종; 말초/갑상성 후 T 세포 림프종(다형태 및 면역모세포 서브타입); 혈관 면역모세포 T-세포 림프종; 중심성(비강) T-세포 림프종; 역형성(Ki 1+) 거대 세포 림프종; 장관 T-세포 림프종; T-림프모구; 림프종/백혈병(T-Lbly/T-ALL), 다발성 골수종을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

다른 증식성 질환도 본 발명으로 치료할 수 있으며, 예를 들어 과다형성증, 섬유증(특히 폐, 또한 다른 유형의 섬유증, 예컨대 신장 섬유증), 혈관형성, 건선, 죽상동맥경화증 및 혈관내 평활근 증식, 예컨대 심장동맥성형술 후 협착증 또는 재협착증을 포함한다.

일 특징으로서, 본 발명의 항체는 NK 세포 또는 NK-유사 세포, 즉, 표면 항원 발현의 특징적 조합을 나타내는 거대 과립 림프구의 클론성 확장에 의하여 유도되는 증식성 질환의 클래스로 나타내는 과립성 림프구의 NK-형 림프구증식성 질환;(NK-LGL로 언급) (예컨대, CD3-, CD56+, CD16+, 등; 예컨대, Loughran (1993) Blood 82:1)을 치료하기 위하여 사용된다. 이러한 질환의 세포 증식은 NK-LDGL 백혈병으로 언급되는 질환의 공격적이며, 종종 치명적인 형태의 일부 환자에서 나타나는 경증의 범위인 가변 효과를 보유할 수 있다. 이 클래스의 질환의 증상은 미열, 경미한 호중구감소증, 저혈소판증, 빈혈, 림프구증가증, 비장비대, 간비대증, 림프절병증, 골수 침윤, 등을 포함할 수 있다(예컨대, Zambello et al. (2003) Blood 102:1797; Loughran (1993) Blood 82:1 ; Epling-Burnette et al. (2004) Blood-2003-02-400).

CD94/NKG2A 항체 기반 치료는 감염성 질환을 치료하거나 예방하기 위하여 사용될 수 있으며, 바람직하게는 바이러스, 박테리아, 프로토조아, 사상균 또는 진균에 의한 감염에 의한 모든 감염을 포함한다. 이러한 바이러스 감염성 유기체는, 이에 한정되는 것은 아니나, A형 간염, B형 간염, C형 간염, 인플루엔자, 수두, 아데노바이러스, 헤르페스 심플렉스(herpes simplex) 타입 1(HSV-1), 헤프페스 심플렉스(herpes simplex) 타입 2 (HSV-2), 우역, 리노바이러스, 에코바이러스, 로타바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 파필로마 바이러스, 파필로마 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 에치노바이러스, 아르보바이러스, 훈타바이러스, 콕사키바이러스, 볼거리바이러스, 홍역 바이러스, 루벨라바이러스, 소아미비 바이러스 및 인간 면역결핍 바이러스 타입 1 또는 타입 2(HIV-1, HIV-2). 박테리아는 또 다른 바람직한 클래스의 감염성 유기체로 구성되며, 다음을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다: 스타필로코커스(Staphylococcus); 스트렙토코커스(Streptococcus), 예컨대 S. 피요젠(pyogene); 엔테로코클; 바실러스(Bacillus), 예컨대 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis), 및 락토바실러스(Lactobacillus); 리스테리아(Listeria); 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheriae); 가르드네렐라(Gardnerella) 예컨대 G. 바기날리스(vaginalis); 노카르디아(Nocardia); 스트렙토마이세스(Streptomyces); 더모액티노마이세스 불가리스(Thermoactinomyces vulgaris); 트레포네마(Treponema); 캄플리오박터(Camplyobacter), Pseudomonas(슈도모나스) 예컨대 P. 아에루기노사(aeruginosa); 레지오넬라(Legionella); 네이세리아(Neisseria) 예컨대 N. 고노르로에아에(gonorrhoeae) 및 N. 메닝기티디스(meningitides); 플라보박테리움(Flavobacterium) 예컨대 F. 메닝고셉티쿰(meningosepticum) 및 F. 오도라턴(odoraturn); 브루셀라(Brucella); 보르데텔라(Bordetella) 예컨대 B. 페르튜시스(pertussis) 및 B. 브론치셉티카(bronchiseptica); 에셔리시아(Escherichia) 예컨대 E. 콜리(coli), 클레브시엘라(Klebsiella); 엔테로박터(Enterobacter), 세라시아(Serratia) 예컨대 S. 마르세시엔스(marcescens) 및 S. 리퀴파시엔스(liquefaciens); 에드워드시엘라(Edwardsiella); 프로테우스(Proteus) 예컨대 P. 미라빌리스(mirabilis) 및 P. 불가리스(vulgaris); 스트렙토바실루스(Streptobacillus); 리케티시아세아에(Rickettsiaceae) 예컨대 R. 피케시피(fickettsfi), 클라미디아(Chlamydia) 예컨대 C. 프시타시(psittaci) 및 C. 트라코마티스(trachomatis); 마이코박테리움(Mycobacterium) 예컨대 M. 튜베르쿨로시스(tuberculosis), M. 인트라셀룰라르(intracellular), M. 폴루이투란(folluiturn), M. 라프라에(laprae), M. 아비움(avium), M. 보비스(bovis), M. 아프리카눔(africanum), M. 칸사시(kansasii), 및 M. 레프라에르누리움(lepraernurium); 및 노카르디아(Nocardia)를 포함한다. 프로토조아는 이에 한정되는 것은 아니나, 레이샤마니아(leishmania), 코크지디오아(kokzidioa), 및 트리파노조마(trypanosoma)를 포함한다. 기생충은 이에 한정되는 것은 아니나, 클라마이디아(chlamydia) 및 리케치아(rickettsia)를 포함한다. 감염성 질환의 완전한 내역은 질병 통제 센터(CDC)의 국립 감염성 질환 센터(NCID)의 웹사이트에서 검색할 수 있으며(World-Wide Web (www) address cdc.gov/ncidod/diseases/), 이들은 본원에 참고자료로서 포함되어 있다. 모든 이러한 질환은 본 발명의 억제 항-CD94/NKG2A 항체를 사용하는 치료에 대한 후보이다.

다른 특징으로서, 항-NKG2A 항체는 예컨대, 암성 세포, 예를 들어 NK-림프종에서 CD94/NKG2A 발현에 의하여 특성화된 암을 겪고 있는 환자 내에서 NKG2A-발현 세포를 표적화하거나 살상하기위하여 사용된다. 일 실시상태에서, 인체적응형 항체는 인체적응형 항체 및 세포독성제를 포함하는 면역접합체의 형태로 투여된다.

다른 특징으로서, 항-NKG2A 항체는 자가면역 또는 염증 질환을 치료 또는 예방하기 위하여 사용된다. 본 발명의 방법을 사용하여 치료가능한 예시적인 자가면역 질환은 그 중에서도, 용혈 빈혈, 악성 빈혈, 다중결절 동맥염, 전신성 홍반성 루프스, 와그너씨 육아종증, 자가면역 간염, 베체트씨병, 크론씨병, 원발성 담도 간경화, 공피증, 궤양 대장염, 쇼그렌 증후군, 타입 1 당뇨병, 포도막염, 그레이브씨병, 알츠하이머병, 갑상선엽, 심근염, 류마티스열, 공피증, 강직성 척추염, 류마티스 관절염, 사구체신염, 사르코이드증, 피부근육염, 중증 근무력증, 다발성근육염, 길랑-바레 증후군, 다발성 경화증, 원형탈모증, 천포창/유사천포창, 수포성 유천포창, 하시모토 갑상선염, 건선, 및 백반증을 포함한다.

이러한 방법으로 치료할 수 있는 염증 질환의 예는, 이에 한정되는 것은 아니나, 부신염, 폐포염, 혈관담낭염, 충수염, 귀두염, 눈꺼풀염, 기관지염, 윤활낭염, 심장염, 연조직염, 자궁경부염, 담낭염, 성대염, 와우염, 결장염, 결막염, 방광염, 피부염, 게실염, 뇌염, 심장내막염, 식도염, 이관염, 섬유조직염, 모낭염, 위염, 위창자염, 치은염, 설염, 간비장염, 각막염, 내이염, 후두염, 림프관염, 유방염, 중이염, 수막염, 자궁근염, 점액증, 심근염, 근육염, 고막염, 신장염, 신경염, 고환염, 골연골염, 중이염, 심장막염, 힘줄주위염, 복막염, 인두염, 정맥염, 회색질척수염, 전립선염, 치수염, 망막염, 비염, 자궁관염, 공막염, 맥락막염, 음낭염, 동염, 척추염, 황색지방증, 구내염, 윤활막염, 이관염, 건염, 편도염, 요도염, 및 질염을 포함한다.

수지상 세포를 살상하는 이형반응 NK 세포는 골수 이식시 조혈 세포의 이식을 향상시킨다고 알려져 있다(L. Ruggeri et al., Science, 2002, 295:2097-2 100). 그러므로, 다른 실시상태에서, 본 발명은 환자 내에서 조혈 세포의 이식을 향상시키는 방법을 제공하며, 활성화된 항체를 포함하는 본 발명의 조성물을 상기 환자에 투여하는 단계를 포함한다. 이식의 향상은 이식 대 숙주 질환의 발생률 또는 중증도를 감소시키고, 이식편의 생존을 증가시키거나, 또는 이식에 의하여 치료되는 질병(예컨대, 조혈 암)의 증상을 감경 또는 제거함으로써 입증된다. 이 방법은 바람직하게는 백혈병의 치료에 사용된다.

조합

다수의 치료 약제가 암 치료에 사용된다. 본 발명의 항체 조성물 및 방법은 그러므로 또한 일반적으로 특정 질병, 특히 종양, 암 질병, 또는 환자가 나타내는 다른 질병 또는 질환의 치료에 사용되는 다른 방법과 조합된다. 특정 치료 방법이 그 자체로 환자의 상태에 해롭다고 알려져 있지 않거나, 항-CD94/NKG2A 항체-기반 치료와 현저하게 중화되지 않는한, 본 발명과 이들의 조합이 고려된다.

고형 종양 치료에 있어서, 본 발명은 고전적인 방법, 예컨대 외과수술, 방사선요법, 화학요법, 등과 조합하여 사용된다. 본 발명은 따라서 본 발명의 항-CD94/NKG2A 항체가 수술 또는 방사선 치료와 동시에, 전에 또는 이후에 사용되거나; 또는 다른 항암제와 함께, 이전에 또는 이후에 환자에 투여되는 조합 요법을 제공한다. 본 발명의 조성물 내의 활성 약제와 조합한 외과수술, 방사선요법, 또는 항암제가 암에 이로운 조합 효과를 발휘한다는 것을 확신한다.

예시적인 항암제는 화학치료제, 호르몬제, 항혈관형성제, 항전이제, 항암 항체(예컨대, Rituximab), 억제 KIR-분자, 성장-인자 억제제, 세포자멸-증진 화합물, 사이토카인 및 다른 면역조절제에 대한 항체, 독소 또는 핵종에 접합한 종양-표적제, DNA 복제, 유사분열 및 염색체 분리를 방해하는 화합물, 및 폴리뉴클레오타이드 전구체의 합성 및 충실도를 파괴하는 약제를 포함한다.

자가면역 또는 염증 질환에 있어서, 하나 이상의 유형의 자가면역 또는 염증 질환, 또는 자가면역 또는 염증 질환의 모든 증상 또는 특징에 효과적인 것으로 알려진 모든 다른 화합물은 그중에서도, 면역억제제, 예컨대, 아자티오프린(예컨대, Imuran), 클로람부칠(예컨대, Leukeran), 시클로포스파미드(예컨대, Cytoxan), 시클로스포린(예컨대, Sandimmune, Neoral), 메토트렉세이트(예컨대, Rheumatrex), 코르티코스테로이드, 프레드니손(예컨대, Deltasone, Meticorten), 에타너셉트(예컨대, Enbrel), 인플릭시맙(예컨대, Remicade), TNF, FK-506, 라파마이신, 마이코페놀레이트 모페틸, 레프루노마이드, 항-림프구 글로블린, 데옥시스페르구알린 또는 OKT의 억제제를 포함한다.

면역조절제 화합물의 바람직한예는 사이토카인을 포함한다. 다른예는, 바람직하게는 NK 세포 활성의 활성화 또는 강화, 또는 NK 세포의 증식을 유도 또는 지원에 효과적인 화합물을 포함한다. 본 발명의 약제를 포함하는 조성물의 투여 전, 동시 또는 후에 투여하는 다른 화합물은 인접 화합물(예컨대, 항구토제 및 진통제) 및 항-바이러스제이다.

당해 기술 분야의 숙련자가 이해하고 있는 바와 같이, 항암제의 적합한 투약량은 이미 임상 요법에서 사용되었으며, 여기서, 항암제는 단독으로 투여되거나 또는 다른 약제와 조합하여 투여된다. 투약량의 변화는 치료 상황에 따라 변화할 수 있다. 치료하는 임상의는 개별 대상체에 적합한 투약량을 결정할 수 있다.

생산 용품

본 발명의 다른 실시상태에서, 전술한 질환의 치료에 사용되는 물질을 함유하는 생산 용품을 제공한다. 예를 들어, 생산 용품은 사용자가 유효량의 항체로 포유류 내에서 질환 예컨대 암 또는 바이러스 질환을 치료하도록 하는 지시서와 함께 전술한 항체를 함유한 용기를 포함할 수 있다. 바람직한 실시 상태로서, 포유류는 인간이다. 생산 용품은 일반적으로 용기 및 라벨 또는 용기 상의 또는 이와 결합되는 포장 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는, 예를 들어, 병, 바이알, 주사기, 등을 포함한다. 용기는 다양한 물질 예컨대 유리 또는 플라스틱으로 형성될 수 있다. 용기는 상태를 치료하기에 효과적인 조성물을 보유하며, 무균 접근 포트를 구비할 수 있다(예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘에 의하여 관통가능한 마개를 구비한 정맥내 용액 백 또는 바이알이 될 수 있다). 조성물 내의 최소한 하나의 활성 약제는 본원의 인체적응형 항-NKG2A 항체, 또는 이러한 인체적응형 항체를 포함하는 항체 유도체(예컨대, 면역접합체)이다. 라벨 또는 포장 삽입물은 조성물이, 예컨대 암 또는 바이러스 질환을 치료하기위하여 사용된다는 것을 나타낸다.

더욱이, 생산 용품은 (a) 조성물을 함유하는 제1 용기(여기서, 조성물은 본원의 항체를 포함한다), 및 (b) 조성물을 함유하는 제2 용기(여기서, 조성물은 제1 항체와 다른 치료제를 포함한다)를 포함할 수 있다. 본 발명의 실시 상태의 생산 용품은 제1 및 제2 조성물이 암 또는 바이러스 질환을 치료하기 위하여 조합하여 사용될 수 있다는 것을 나타내는 포장 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 치료제는 전 절레서 언급한 유사 요법이 될 수 있다(예컨대, 화학치료제, 항혈관형성제, 항-호르몬 화합물, 심장보호제, 및/또는 시이토카인을 포함하는 포유류의 면역 기능 조절제). 대안적으로, 또는 추가적으로, 생산 용품은 약학적으로 허용가능한 완충액, 예컨대 주사용 정균수(BWFI), 포스페이트-완충 식염수, 링거 용액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 (또는 제3의) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 또한 사용자 및 상업적 관점에서 바람직한 다른 물질, 예컨대 다른 완충액, 희석제, 여과기, 바늘, 및 주사기를 추가로 포함할 수 있다.

투여

전술한 바와 같이, 수개의 단클론성 항체가 임상적으로 효과가 있다고 알려져 있으며(예컨대, Rituxan (Rituximab) 및 기타), 및 유사한 투여 요법(즉, 투약 및/또는 투여 프로토콜)이 본 발명의 항체에 사용된다. 투여를 위한 계획 및 투약량은 이러한 제품에 대한 공지의 방법에 따라 결정된다, 예를 들어 제조자 메뉴얼이다. 예를 들어, 항체 제조물은 각각 100 mg (10 ml.) 또는 500 mg(50 ml.) 1회용 바이알 내에 10 mg/mL의 농도로 공급될 수 있다. 본 발명의 항체의 예시적인 적합한 투약 범위는 약 10 mg/m²와 500 mg/m² 사이이다. 예컨대, 24 시간, 48 시간 72 시간 또는 1 주 또는 1 개월 동안 세포를 포화시키는 항-NKG2A 항체의 주사량 및 계획은 항체의 친화도 및 이의 약물동태학적 변수를 고려하여 결정할 수 있다. 그러나, 이러한 계획은 예시적인 것이며 및 최적 계획 및 요법 및 항체의 용인성은 임상 시험에서 결정되어야 한다는 것을 이해하여야 한다.

비치료적 응용

본 발명의 항체(예컨대, 인체적응형 항-NKG2A 항체)는 또한 비치료적 응용을 보유한다.

예를 들어, 항체는 친화도-정제제로서 사용될 수 있다.이 프로세스에서, 항체는 당해 기술 분야에 공지된 방법을 사용하여 고체상 예컨대, SEPHADEX™ 수지 또는 여과지 상에 고정된다. 고정된 항체는 정제된 NKG2A 단백질(또는 이들의 절편)을 함유하는 시료와 접촉하고, 따라서 지지체는 고정된 항체에 결합한 NKG2A 단백질을 제외한 모든 물질을 실질적으로 제거하는 적합한 용매로 세척된다. 마지막으로, 지지체는 다른 적합한 용매, 예컨대 항체에서 NKG2A 단백질을 방출하는 글리신 완충액(pH 5.0)로 세척된다.

항-NKG2A 항체는 NKG2A 단백질의 진단적 분석, 예컨대 특이적 세포, 조직, 또는 혈청 내에서 이의 발현을 검출하기위하여 사용된다.

진단적 응용에서, 항체는 일반적으로 검출가능한 모이어티로 표지되었다. 다수의 라벨은 일반적으로 다음의 카테로리로 분류될 수 있다:

(a) 방사성동위원소, 예컨대 ³⁵S, ¹⁴C, ¹²⁵1, ³H, 및 ¹³¹I. 항체는 문헌 Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, Coligen et al., Ed. Wiley-lnterscience, New York, N. Y., Pubs. (1991)에 설명된 기법을 사용하여 방사성동위원소로 표지될 수 있으며, 예를 들어, 방사성활성은 섬광 계수에 의하여 측정할 수 있다.

(b) 형광 표지, 예컨대 희토류 킬레이트(유로피움 킬레이트) 또는 플루오르세인 및 이의 유도체, 로다민 및 이의 유도체, 단실, 리사민, 피코에리스린 및 텍사스 레드를 사용할 수 있다. 형광 표지는 문헌 Current Protocols in Immunology, 전게서에 개시된 기법을 사용하여 항체에 접합할 수 있으며 예를 들어. 플루오르세인은 흐픔측정기를 통하여 정량화될 수 있다.

(c) 다양한 효소-기질 표지가 사용될 수 있으며, U.S. Pat. No. 4,275,149에서 이러한 연구를 제공한다. 효소는 일반적으로 다양한 기법으로 측정할 수 있는 유색 기질의 화학적 변화를 촉매한다. 예를 들어, 효소는 기질의 색 변화를 촉매할 수 있으며, 이는 분광측광흡수적으로 측정할 수 있다. 대안적으로, 효소는 기질의 형광 또는 화학발광을 변화시킬 수 있다. 형광 변화를 정량화하는 기법을 이전에 설명한 바 있다. 화학 발광 기질은 화학적 반응에 의하여 전자적으로 여기되며, 그 다음 측정 가능한 빛을 방출하거나(화학발광측정기를 사용, 예를 들어) 또는 형광 수용체와 에너지를 공유한다. 효소적 표지의 예는 루시페라아제 (예컨대, 반딧불 루시페라아제 및 박테리아 루시페라아제; U.S. Pat. No. 4,737,456), 루시페린, 2,3-디하이드로프탈라진디온, 말레이트 데하이드로지나아제, 우레아제, 퍼옥시다아제 예컨대 홍당무 퍼옥시다아제(HRPO), 알카라인 포스파타아제, 베타-갈락토시다아제, 글루코아밀라아제, 라이소자임, 사카라이드 옥시다아제 (예컨대, 글루코스 옥시다아제, 갈락토오스 옥시다아제, 및 글루코스-6-포스페이트 데하이드로지나아제), 헤테로시클릭 옥시다아제 (예컨대 유리카아제 및 잔틴 옥시다아제), 락토퍼옥시다아제, 마이크로퍼옥시다아제, 등을 포함한다. 효소와 항체의 접합 기법은 문헌 O'Sullivan et al, "Methods for the Preparation of Enzyme-Antibodies Conjugate for use in Enzyme Immunoassay," in Methods in Enzym. (Ed., J. Langone & H. Van Vunakis), Academic Press, New York, 73:147-166 (1981)에 설명되어 있다.

효소-기질 조합의 예는, 예를 들어: (i) 기질로서 하이드로겐 퍼옥시다아제를 지닌 홍당무 퍼옥시다아제(HRPO), 여기서, 하이드로겐 퍼옥시다아제는 안료 전구체를 산화시킨다(예컨대, 오르소페닐렌 디아민(OPD) 또는 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘 하이드로클로라이드 (TMB));

(ii) 유색 기질로서 파라-니트로페닐 포스페이트를 지닌 알카라인 포스파타아제(AP); 및

(iii) 유색 기질(예컨대, p-니트로페닐-베타-D-갈락토시다아제) 또는 형광 기질 4-메틸움벨리페릴-p-베타-갈락토시다아제를 지닌 베타-D-갈락토시다아제 (베타-D-Gal).

다양한 다른 효소-기질 조합을 당해 기술 분야의 숙련자가 사용할 수 있다. 이러한 일반적인 연구는 U.S. Pat. Nos. 4,275,149 및 4,318,980를 참조한다.

때로는, 표지는 항체와 간접적으로 접합된다. 당해 기술 분야의 숙련자는 이를 달성할 다양한 기법을 인식하고 있다. 예를 들어, 항체는 바이오틴과 접합할 수 있으며, 및 전술한 광의의 3종의 카테고리의 라벨이 아비딘과 접합할 수 있으며, 또는 그 역으로도 성립한다. 바이오틴은 선택적으로 아비딘과 결합할 수 있으며, 그러므로, 표지는 항체와 간접적인 방법으로 접합될 수 있다. 대안적으로, 표지와 항체의 간접적 접합을 달성하기 위하여, 항체는 소 헵텐(예컨대, 디곡신)과 접합하며, 다른 일 유형의 전술한 표지는 항-헵텐 항체(예컨대, 항-디곡신 항체)와 접합한다. 그러므로, 표지와 항체의 간접 접합이 달성될 수 있다.

본 발명의 다른 실시상태에서, 항-NKG2A 항체는 표지될 필요 없으며, 이들의 존재를 NKG2A 항체에 결합하는 표지된 제2 항체를 사용하여 검출할 수 있다.

본 발명의 항체를 공지의 분석 방법, 예컨대 경쟁적-결합 분석, 직 간접 샌드위치 분석, 및 면역침전 분석에 사용할 수 있다. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc. 1987).

면역조직화학에 있어서, 종양 시료는 신선한 것 또는 동결된 것이거나 또는 파라핀에 내장된 것이거나, 보존제 예컨대, 포르말린으로 고정된 것일 수 있다, 예를 들어.

항체는 또한 생체 내 진단적 분석에 사용할 수 있다. 일반적으로, 항체는 예컨대, 핵 자기 공명, 또는 공지의 다른 수단에 의하여 검출가능한 핵종 또는 비-방사성 지표로 표지된다. 바람직하게는, 표지는 방사성표지, 예컨대, 예컨대, ¹²⁵I, ¹³¹I, ⁶⁷Cu, ^99mTc, 또는 ¹¹¹In 이다. 표지된 항체는 숙주에, 바람직하게는 혈관을 통하여 투여되며, 숙주 내의 표지된 항체의 존재 및 위치가 분석된다. 이러한 영상화 기법은 신생물의 검출, 병기 판단 및 치료에 사용되기 적합하다. 방사성동위원소는 금속-킬레이팅 화합물 또는 락토퍼옥시다아제, 또는 요오드화의 요오드발생 기법을 포함하는 모든 수단에 의하여 단백질에 접합된다.

사용의 편리함을 위하여, 본 발명의 항체는 키트, 즉, 진단적 분석을 수행하기 위한 지시서와 함께 설정된 양의 시약의 포장된 조합물로 제공된다. 항체가 효소로 표지된 경우, 키트는 효소에 의하여 획득한 기질 및 보조인자를 포함하게된다(예컨대, 검출가능한 발색단 또는 형광단을 제공하는 기질 전구체). 이와 함께, 다른 첨가제 예컨대 안정화제, 완충액(예컨대, 블럭 완충액 또는 용해 완충액) 등을 포함할 수 있다. 다양한 시약의 상대량은 분석의 감도를 실질적으로 최적화하는 시약의 농도에 따라 크게 달라질 수 있다. 특히, 약제는 건조 분말, 일반적으로 용해되어 적절한 농도로 제공되는 부형제를 포함하는 동결건조형으로 제공된다.

기탁

Z270 하이브리도마를 2005년 12월 22일자로 콜렉션 내셔날레 드 컬쳐 드 마이크로오르가니즘스, 파스퇴르 연구소(25, Rue du Docteur Roux, F-75725 Paris, France)에 승인 번호 1-3549로 기탁하였다.

본 발명의 추가적인 상세는 다음의 비제한적인 실시예에 의하여 설명된다.

실시예 1 - 모 humZ270VL 및 humZ270VH 서열의 선택

이 실시예는 모 humZ270VL 및 humZ270VH 서열의 선택 및 선택적인 변이체 h270VL 및 humZ270VH 서열의 역돌연변이를 설명한다. 실시예 2에 설명한 바와 같이, Z270 하이브리도마를 클론하였으며, 및 대응하는 항체로부터의 Z270 VH 및 VL 사슬 서열은 다음과 같이 결정되었다:

Z270VL:

DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYLAWYQQKQGKSPQFLVYNAKTLAEGVPSRF

SGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCQHHYGTPRTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:1),

Kabat 위치 108에 선택적 아르기닌(R) 잔기를 보유.

Z270VH:

QVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTSYWMNWVKQRPEQGLQWIGRIDPYDSETH

YSQKFKDKAILTVDKSSSTAYM RLSSLTSEDSAVYYCARGGYDFDVGTLYWFFDVWGAGTT

VTVS (SEQ ID NO:2), 선택적 C-말단 세린(S) 잔기를 보유.

제2 경쇄, Z270VL-NB를 또한 확인하였다. 그러나, 이는 일반적인 골수종 경쇄였다.

Z270VL-NB:

NIVMTQSPKSMSMSVGERVTLTCKASENWTYVSWYQQKPEQSPKLLIYGASNRY

TGVPDRFTGSGSATDFTLTISSVQAEDLADYHCGQGYSYPYTFGGGTKLEIKRA (SEQ ID NO:3),

Kabat 위치 108에 선택적 아르기닌(R) 잔기를 보유하며, Kabat 위치 109에 선택적 알라닌(A) 잔기를 보유.

뮤린 Z270 서열의 분석에서, Kabats 정의에 따른 CDR이 다음과 같이 결정되었다:

CDR-L1: RASENIYSYLA (SEQ ID NO:1의 잔기 24-34)

CDR-L2: NAKTLAE (SEQ ID NO:1의 잔기 50-56)

CDR-L3: QHHYGTPRT (SEQ ID NO:1의 잔기 89-97)

CDR-H1: SYWMN (SEQ ID NO:2의 잔기 31-35)

CDR-H2: RIDPYDSETHYSQKFKD (SEQ ID NO:2의 잔기 50-66)

CDR-H3: GGYDFDVGTLYWFFDV (SEQ ID NO:2의 잔기 95-102).

3D 단백질 구조 모델은 단백질 데이터베이스 은행(PDB)의 구조적 주형을 사 용하여 MOE(molecular Operating Environment; www.chemcomp.com)을 사용하여 구축되었다: 1OPG 및 1XF4. PDB는 문헌 Berman et al. (Nucl Acids Res 2000;28:235-242)에서 설명하였으며, 웹사이트 www.rcsb.org/pdb에서 사용가능하다. PDB 데이터베이스 내의 201 항체-항원 복합체의 통계학적 분석에 기초하여, 파라토프 내에서 가장 가능성 있는 잔기가 다음과 같이 결정되었다:

Z270VL: SEQ ID NO:1의 잔기 24-34, 49-56, 89-97

Z270VH: SEQ ID NO:2의 잔기 23-35, 49-58, 93-102.

MOE를 사용하여, 파라토프와 잔기의 상호작용(소수성, 하이드로겐 결합, 또는 전하)을 확인하였으며, 결합된 세트의 잔기 (파라토프 + 상호작용 잔기)를 Z270의 마스크로 취하였다.

균주 V 데이터베이스(V-base; vbase.mrccpe.cam.ac.uk/)를

다음의 잠재적인 프레임워크 주형으로 회귀한 Z270VL 및 Z270VH로 검색하였다(E-값은 괄호):

중쇄: VH1_46(2e-036), VH1_f(2e-035), VH1_02(3e-035), VH1_18(4e-035), VH1_03(6e-035); 및

경쇄: VKI_O2(1e-039), VKI_O12(1e-039), VKI_L12(9e-038), VKI_L8(9e-038), VKI_A20(9e-038).

균주 데이터베이스를 다음의 잠재적인 프레임워크 주형으로 회귀한 마스크로 검색하였다(E-값은 괄호):

중쇄: VH5_a(4e-013), VH5_51(3e-011) VH1_f(1e-010), VH1_18(2e-010), VH1_46(4e-010): 및

경쇄: VKI_L9(2e-012), VKI_O2(3e-012), VKI_O12(3e-012), VKI_L24(2e-011), VKI_A20(2e-011)

정렬 및 히트를 수검한 후, VH1_18 및 VKI_O2를 인간 스케폴드로서 선택하였다. JH6 및 JK4를 균주 J-세그먼트로서 선택하였다. 인체적응화는 현재 다음의 규칙으로 설계하였다:

● 마스크 외부의 잔기는 인간의 것으로 택한다.

● 마스크 내부 및 Kabat CDR 내부의 잔기는 뮤린의 것으로 택한다.

● 마우스/균주 컨센서스를 지닌 마스크 내부 및 Kabat CDR 외부의 잔기는 컨센서스 서열로 택한다.

● 마우스/균주 차이를 지닌 마스크 내부 및 Kabat CDR 외부의 잔기는 잠재적인 역돌연변이를 가한다.

분석은 Z270VL 및 Z270VH에 대하여 도 1에 나타내었으며, 마스크 잔기는 Kabat 스킴 내에서 음영으로 처리하였다; CDR 잔기는 Kabat 스킴 내에서 볼드체로 나타내었으며; 및 마우스/균주 차이는 VKI_O2/JK4 및 VH1_18/JH6 서열 내에서 음영으로 처리하였다. Z270VL 및 humZ270VL1, 및 humZ270VL1 cons는 선택적으로 Kabat 위치 108에서의 아르기닌(R) 잔기를 포함한다.

결과 서열, humZ270VL1 및 humZ270VH1는 인간으로서 잠재적인 역돌연변이 잔기를 지니는 것으로 제공된다.

Kabat 정의에 따른 인체적응형 Z270 항체의 CDR은 도 2에 나타내었다. humZ270 CDR에서는, 단지 CDR-H2 서열만이 4 위치가 다른 대응하는 뮤린 CDR의 것과 차이가 있었다. 그러나, 효과에 있어서는, 이는 더 많은 인간 분자 및 더 적은 면역원성의 위험을 제공하면서, Kabat CDR-H2 잔기 60-65가 인간 수용체 서열과 일치한다는 것을 의미한다. 도 2에서, 차이는 볼드체로 나타내었다.

실시예 2 - Z270 IgG1 VH 및 VL 영역의 클로닝

이 실시예는 뮤린 Z270 VH 및 VL 영역의 클로닝 및 서열화를 설명한다.

총 RNA 추출물에 대한 Z270 하이브리도마 세포 배양. Z270 하이브리도마를 RPMI 1640(Hyclone Cat# SH30011.04)와 10% FCS(Biochrom CaWSOH 5) 내에서 배양하였다. 5 x 10⁶ 내지 1 x 10⁷ 세포를 총 RNA 추출물로부터 수확하였다.

항체 생산의 Z270 하이브리도마 세포 배양. 1주 간의 배치 배양 전략을 Z270 mAb의 생산에 도입하였다. 배양 배지는 10% FCS를 함유한 RPMI 1640이었다. 상청을 매 7일마다 수확하였다. CL-1000 플라스크(INTEGRA Biosciences, Item No. 90005, Lot No. 08541150)의 배양 격실 내의 개시 세포 밀도는 2 x 10⁶ 세포/ml였다. 배양시, 세포 밀도 및 생활성을 정기적으로 확인하였다. CL-1000 플라스크 내에서 배양 3일 후, 밀도는 1 x 10⁷ 이상이었으며, 생활성은 약 85% 였다. 이후 4일간, 세포 밀도는 1.5-2.5 x 10⁷ 세포/ml 사이였으며, 생활성은 60-70%로 점차 감소되었다. 7일차에 상청을 수거하였으며 및 환원 SDS-PAGE를 사용하여 정량화 대조구와 함께 항체 농도를 측정하였다(A-TNP 20050118 2mg/ml).

Z270 총 RNA 추출. 이는 TRIZOL 시약(Invitrogen, Cat. No. 15596-026)을 제조자 지시에 따라 사용하여 수행하였다.

5'-RACE(cDNA 말단의 급속 증폭). 프로토콜은 SMART™ RACE cDNA 증폭 키트(Clontech, Catalog no. 634914)를 제조자 지시에 따라 사용하였으며, 다음의 설계를 지닌 유전자-특이적 프라이머(GSPs)를 보유한다:

GSP1: IgG1 중쇄 가변 영역의 증폭용

RacePrimerheavy: 5'-GCCAGTGGATAGACAGATGG-3' (SEQ ID NO: 12)

GSP2: IgG1 카파 사슬 가변 영역의 증폭

RacePrimerkappa: 5'-GATGGATACAGTTGGTGCAGC-3' (SEQ ID NO: 13).

제1 가닥 cDNA 합성, RACE, 및 1.5% 아가로스 겔 상의 결과 시료의 분석 후, RACE DNA 밴드를 절제하여, Gel 정제 키트(QIAGEN QIAquick Cat#28706)로 정제한 뒤, TA 클로닝에 의하여 DNA 결찰 키트(Cat#D6022, TAKARA, Ver. 2.0)를 사용하여 pMD-19 내로 클론하였다(도 3A). 양성 클론을 DNA 시퀀싱하였다.

경쇄 및 중쇄의 수개의 클론을 도 4A-D에 나타낸 일치 서열과 함께 서열화하였다(신호 펩타이드 서열을 볼드체로 나타냄):

Z270 VL cDNA: (SEQ ID NO:14)

Z270 VL 단백질 (SEQ ID NO: 15)

Z270 VH cDNA (SEQ ID NO: 16)

Z270 VH 단백질 (SEQ ID NO: 17).

실시예 3 - pJSV002 내로 뮤린 IgG1 경쇄 및 중쇄의 클로닝

항체 친화도를 시험하고, 이를 양성 대조구로 사용하기 위하여, Z270 항체 경쇄 및 중쇄를 뮤린 항체 IgG1으로서 pJSV002에 삽입하였다. pJSV002는 Z270 임시 발현을 위한 HEK293 6E 세포와 조합하여 사용할 수 있는 임시 발현 벡터이다(도 3B).

Z270 VL 및 IgG1 불변 영역은 pJSV002의 EcoRI 및 Nhe I 부위 내로 클론되었다. 결과 플라스미드를 도 3C에 나타내었다. 양 말단에 EcoRI 및 Nhe I가 삽입된 서열 (대문자)을 도 4E에 나타내었다(SEQ ID NO: 18).

H1 가변 영역 및 IgG1 불변 영역을 pJSV002-mIgG1-변이체의 EcoRI 및 Nhe I 부위 내로 클론되었다(도 3D). pJSV002-mIgG1-변이체는 뮤린 IgG1 중쇄 불변 영역을 함유한다(도 3E). 삽입된 서열은 제한 부위 및 하부 문자로 적시된 뮤린 IgG1 불변 영역을 지닌 EcoRI와 Nhe I(gctagc) 부위 사이에 존재하며, 이는 도 4F에 나타내었다(SEQ ID NO: 19).

실시예 4 - 키메라 Z270 항체용 플라스미드 구조체

항체 친화도를 시험하고, 이를 양성 대조구로 사용하기 위하여, 뮤린 Z270 항체 경쇄 및 중쇄를 인간 키메라 항체 IgG4 S241P로서 pJSV002 내로 삽입하였다. 항체는 뮤린 가변 영역 및 중쇄 내에 S241P 돌연변이를 지닌 인간 IgG4 불변 영역을 함유한다.

키메라 Z270 항체(chimZ270)의 발현을 위하여, Z270VL 서열 및 인간 경쇄 (kappa) 불변 영역은 pJSV002의 EcoR I 및 BamH I 부위 내로 삽입된다(도 3F). 도 4G에 나타난 서열을 사용하였으며, 대문자는 제한 부위를 나타낸다(SEQ ID NO:20).

Z270 VH 및 인간 중쇄 불변 영역은 pJSV002-IgG4-S241P의 EcoR I 및 Nhe I 부위 내로 삽입된다(도 3G 및 3H). 도 4H에 나타낸 서열을 사용하였으며, 실제 삽입된 서열은 EcoRI 및 Nhe I(gctagc) 부위 사이였고, 여기서 대문자는 제한 부위를 나타낸다(SEQ ID NO:21).

실시예 5 - 인체적응형 Z270의 발현

실시예 1에 설명된 Z270 인체적응화 전략에 따라, Z270 경쇄 CDR를 VKI_O2/JK4 주형 내로 이식하여 humZ270VL1를 제조하였다. 도 4I에 나타낸 서열은 EcoRI 및 Kasl 부위 사이의 서열의 합성에 의한 것이며, 이를 pJSV002-hKappaC 내에 삽입하였다(pJSV002 내의 인간 Kappa 불변 영역과 함께), 이는 대문자 내의 CDR-암호화 서열 및 볼드체 제한 부위와 함께 삽입하였다(SEQ ID NO:22).

중쇄의 인체적응화를 위하여, Z270 중쇄 CDR(선택적으로 최적화된 CDR-H2과 함께)을 VH1_18/JK6 주형 내로 이식하여 humZ270VH1을 생산하였다. EcoRI 및 Nhe I 부위 사이의 서열이 합성되어, pJSV002-hIgG4 S241P 내로 클론되었으며(pJSV002 내의 인간 IgG4 S241P 불변 영역, 도 3G), CDR-암호화 서열은 대문자로, 제한 부위는 볼드체로 나타내었다(도 4J, SEQ ID NO:23). 돌연변이 구조체도 이와 같이 대응하는 IgG4 S241P 불변 영역 및 인간 Kappa 사슬 불변 영역을 지닌 pJSV002 내로 클론되었으며, 각 humZ270VL 및 humZ270VH 내에 다음 조합의 프레임워크 역돌연변이를 지닌다:

humZ270VL: Wt(즉, 역돌연변이 없음), L46F, I48V, L46F_I48V

humZ270VH: Wt(즉, 역돌연변이 없음), V5Q, M69L, T71V, T73K, T75S,

V5Q_M69L, V5Q_T71V, V5Q_T73K, V5Q_T75S, M69L_T71V, M69L_T73K, M69L_T75S,

T71V_T73K, T71V_T75S, T73K_T75S, V5Q_M69L_T71V_T73K_T75S,

M69L_T71V_T73K_T75S, V5Q_T71V_T73K_T75S, V5Q_M69L_T73K_T75S,

V5Q_M69L_T71V_T75S, V5Q_M69L_T71V_T73K, T71V_T73K_T75S, M69L_T73K_T75S,

M69L_T71V_T75S, M69L_T71V_T73K, V5Q_T73K_T75S, V5Q_T71V_T75S,

V5Q_T71V_T73K, V5Q_M69L_T75S, V5Q_M69L_T73K, V5Q_M69L_T71V.

중쇄(HC)의 예시적인 벡터 설계는 도 5에 나타내었으며, 및 경쇄(LC)의 예시적인 벡터는 도 6에 제공하였다.

플라스미드는 임시 발현을 위하여 293펙틴을 사용하여 HEK293 6E 내로 전달감염된다. 재료: 세포: HEK293 6E (293-6E) 세포는 지수적 성장 상태로 성장하였다(0.8 내지 1.2 x 10⁶ 세포/ml). 배양 배지: FreeStyleTM(Cat. No. 12338-018, Gibco); 25 μg/ml 제네티신 418(Cat. No. 10131-019, Gibco); 0.1 % 플루로닉 F-68(Cat. No. 24040-032, Gibco). 전달감염 배지: Opti-MEM(Cat. No. 51985-026, Gibco); 293펙틴 (Cat. No. 12347019, Invitrogen). 플라스미드 DNA: 정제 플라스미드 DNA(상기 참조).

세포 계수 및 접종. 전달 감염 2일 전, 7.5 x 10⁶ 세포에 필요한 부피를 125ml 플라스크로 이동시켰으며, 신선한 Freestyle 배지를 첨가하여 30 ml가 되도록 하였다(최종 세포 농도는 0.25 x 10⁶ 세포/ml이어야 한다). 2일 후(전달감염일), 세포 밀도는 1 내지 1.2 x 10⁶ 세포/ml이어야 한다. 대안적으로, 전당 감염 1일 전, 1.5 x 10⁷ 세포에 필요한 부피를 125ml 플라스크로 이동시켰으며, 신선한 Freestyle 배지를 첨가하여 30 ml가 되도록 하였다(최종 세포 농도는 0.5 x 10⁶ 세포/ml이어야 한다). 24 시간 후(전달 감염일), 세포 밀도는 0.9 내지 1.2 x 10⁶ 세포/ml이어야 한다.

293펙틴-DNA 복합체 제조. DNA 용액을 준비하기 위하여, 30μg의 DNA를 총 부피 1 ml의 Opti-MEM에서 희석하였다. 293펙틴 용액을 준비하기 위하여, 40μl를 960μl의 Opti-MEM에 희석하였다. 실온에서 배양 5 분 후, 293펙틴 용액 및 DNA 용액을 혼합하였으며, 그 다음 실온에서 25 분간 배양하였다. 그 다음 세포를 2ml의 293펙틴-DNA 혼합물로 전달감염시키고, 및 5% CO2를 함유하는 습식 배양기(오비탈 쉐이커) 내에서 37℃로 4 내지 6일간 배양하였다. 도 7은 HEK293 세포, 예컨대 예컨대, HEK693 6E 세포의 임시 발현의 일반적인 절차를 개괄하였다.

실시예 6 - Z270 하이브리도마 배양물로부터 IgG1의 정제

IgG1 Z270 항체는 시료를 3M NaCl 5OmM Tris (pH 8.5, 유속: 1.0 ml/min) 내에서 평형을 이룬 HiTrap 단백질 A HP(1 ml) 컬럼으로 첨가하고, 25mM 시트르산, 4.5mM 나트륨 시트르산(pH 3.0)을 사용하여 항체를 용출시킴으로써 Z270 하이브리도마 세포 배양 유체로부터 정제되었다.

실시예 7 - 항체 정량화 및 친화도 결정

경쇄 및 상응하는 중쇄 발현 구조체를 함유하는 플라스미드를 짝지어 혼합하였으며, 플라스미드를 전달감염 HEK6E 세포에 사용하였다. 그 다음 배양 배지 상청을 수거하였다. 마우스 IgG1 (또는 IgG4) 항체 정량화를 하기 위하여, ELISA 플레이트를 염소 폴리 항 마우스 IgG1 (또는 IgG4) Fc 특이적 캡춰 항체로 피복하였다. 항체 발현 상청을 도포하고, 그 다음 HRP-Goat 폴리 항 마우스 kappa 또는 Fab 제2 항체를 도포하였다. HRP 기질를 도포하고, OD450에서 전환을 검출하였다.

인체적응형 Z270 항체의 항원-결합을 분석하기 위하여, 다음의 Biacore 분석(도 8)을 사용하였다. 항원-캡춰 항체는 Biacore 칩 상에 고정되었다. 항원 및 배양물 상청을 도포하였다. 온- 및 오프율을 분석하여 친화도를 계산하였다.

실시예 8 - Z270의 키메라, 인체적응형, 및 역돌연변이 변이체의 Biacore 분석

재료 및 방법

VKI_O2/JK4 경쇄 및 VH1_18/JH6 중쇄 수용체 프레임워크 내의 키메라 Z270 및 humZ270를 실시예 4 및 5에 나타낸 방법에 따라 생산하였다. 키메라 Z270, humZ270 및 역돌연변이 변이체의 항원-결합 특성을 Biacore T100(Biacore AB, Uppsala, Sweden)으로 분석하였다. 항원은 단일-사슬 NKG2A-CD94-mFc 구조체의 형태이며, 이들은 센서 CM5 칩 (Biacore AB, Uppsala, Sweden)에 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 하이드로클로라이드(EDC) 및 N-히드록시숙신이미드(NHS)를 사용하는 아민기를 통하여 공유결합으로 고정된다. 고정화 수준은 300 RU로 표적화되었다. Z270 항체 변이체를 흐르는 완충액 HBS-EP(10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.005%(v/v) Tween-20) 내에서 일련의 농도(0.157, 0.313, 0.625, 1.25, 2.5 nM)로 희석하였다. 그 다음 모든 시료를 고정된 항원 상에 2 분간 40 ul/min의 유속으로 주입하였다. 후속적으로, 유동하는 완충액을 3 분간 40 ul/min로 주입하여 항체 용해 분석을 하였다. 각각의 수행을 마친 후, 잔존 항체를 항원으로부터 완전하게 제거하기 위하여 재생 완충액(10 mM NaOH, 500 mM NaCl)을 주입하였다(30 초, 10 ul/min). 데이터를 Biacore T100 평가 소프트웨어로 평가하였다.

결과

humZ270의 친화도는 67 pM로 측정되었다. 이 KD 값은 키메라 Z270의 것(50 pM) 보다 큰 것이다(도 9 및 표 2). VKI_O2/JK4 경쇄 및 VH1_18/JH6 중쇄 수용체 프레임워크 내에서 역 돌연변이를 humZ270에 도입은 실질적으로 이들의 친화도를 향상시키지 않았다(도 10).

키메라 Z270				humZ270
ka (1/Ms)	kd (1/s)	KD (M)	Chi² (RU²)	ka (1/Ms)	Kd (1/s)	KD (M)	Chi²(RU²)
7.970E+6	3.972E-4	4.983E-11	0.0968	7.492E+6	4.982E-4	6.650E-11	0.044

실시예 9 -전장 CDR-H2를 보유한 humZ270의 생성

도 11에 나타낸 대안적 전략에서, 전장 Kabat CDR(전장 CDR-H2를 포함)이 VKI_O2/JK4 경쇄 및 VH1_18/JH6 중쇄 수용체 프레임워크 내에서 humZ270의 친화도를 향상시키는지 여부를 조사하였다. humZ270VH3(SEQ ID NO:24)는 CDR 정의 내의 차이를 직접적으로 따르게 되어, 기본적으로 Kabat CDR-이식 인체적응형 Z270 항체가 된다. humZ270VH4(SEQ ID NO:25)는 K38, Q46, W47, I48, G49, Y59, Q61, K62, K66, 및 A67는 S60, F63, K64, D65 측쇄와 매우 유사하다는 관찰을 따르므로, R38K, E46Q, M48I, R66K, 및 V67A 역돌연변이를 지닌 CDR-이식 인체적응형 Z270 항체가 된다.

실시예 10 - 다른 인간 수용체 프레임워크 내의 humZ270의 생성

인간 중쇄 수용체 프레임워크 서열과 다른 다수의 다른 인체적응형 구조체가 프레임워크 선택을 하기 위하여 생성되었다.

도 12는 제조된 다른 인체적응형 Z270VH 구조체간의 정렬을 나타낸다. humZ270VH5(SEQ ID NO:26)은 VH5_a를 기초로 하며, humZ270VH6(SEQ ID NO:27)는 VH5_51를, humZ270VH7(SEQ ID NO:28)은 VH1_f를, 및 humZ270VH8(SEQ ID NO:29)는 VH1_46을 기초로 하며, 이들 모두는 JH6 J-세그먼트를 보유한다. 모든 인체적응형 구조체의 Kabat CDR-H2의 6 C-말단 아미노산 잔기는 인간 수용체 프레임워크와 일치하였다.

정렬 프로그램 벡터NTI를 사용하여, 다음의 humZ270VH1과 humZ270VH5, -6, -7, 및 -8 사이의 서열 일치성을 획득하였다: 78.2% (VH1 vs. VH5), 79.0% (VH1 vs. VH6), 88.7% (VH1 vs. VH7), 및 96.0% (VH1 vs. VH8)이었다.

실시예 11 - 다른 humZ270 변이체의 Biacore 분석

huZ270 변이체의 친화도는, humZ270VL1 서열을 모두 포함하나 다른 VH 서열 인체적응화 전략을 사용하여 분석되었다.

재료 및 방법

Biacore T100(Biacore AB, Uppsala, Sweden)을 사용하였다. CD94/NKG2A 항원은 단일-사슬 NKG2A-CD94-mFc 구조체의 형태 내에서 사용되었으며, 센서 CM5 칩(Biacore AB, Uppsala, Sweden)에 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카보이미드 하이드로클로라이드(EDC) 및 N-히드록시숙신이미드(NHS)를 사용하는 아민기를 통하여 공유결합으로 고정되었다. 고정화 수준은 300 RU로 표적화되었다. humZ270 항체 변이체는 유동하는 완충액 HBS-EP 내에서 일련의 농도(0.157, 0.313, 0.625, 1.25, 2.5 nM)로 희석되었다. 그 다음 모든 시료를 고정된 항원에 2 분간 40 ul/min의 유속으로 주입하였다. 후속적으로, 유동하는 완충액을 3 분간 40 ul/min으로 주입하여 항체 용해 분석을 하였다. 각각의 수행을 마친 후, 잔존 항체를 항원으로부터 완전하게 제거하기 위하여 재생 완충액(10 mM NaOH, 500 mM NaCl)을 주입하였다(40 초, 10 ul/min). 데이터를 Biacore T100 평가 소프트웨어로 평가하였다. 각 변이체의 KD 값을 humZ270VH1 중쇄를 지닌 huZ270의 값으로 나누어 상대적인 KD 배수 변화를 획득하였다.

결과 및 결론

결과를 도 13에 나타내었으며, 각 변이체의 KD 값를 humZ270VH1 중쇄를 지닌 huZ270의 값으로 일반화하여 KD의 상대적 변화를 획득하였다. 도 13에 나타낸 바와 같이, CDR-이식 변이체(VH3, VH4)와 CDR-H2 세그먼트 내에 소수의 뮤린 잔기를 포함하는 humZ270 변이체(humZ270VL1/VH1) 사이에 현저한 차이는 없었다. 다른 인간 수용체 프레임워크 내의 "인체적응형-CDR-H2" 변이체 사이의 실질적인 차이가 없다. 인간 humZ270 항체는 인간 환자 내에서 면역원성 반응의 위험을 낮추는 이익이 있기 때문에, 인체적응형-CDR-H2 변이체 예컨대 VH1, VH5, VH6, 및 VH7를 치료적 응용에 선택될 수 있으며, 이는 표준 CDR-이식 humZ270 항체에 비하여 상당한 친화도 저하 없이, 숙주 면역 반응의 가능성을 낮추게된다.

실시예 12 - Z270VL 및 VH 내의 결정적인 잔기의 확인

Z270의 파라토프를 확인하기 위하여, 알라닌 스캔 돌연변이생성을 뮤린 항체의 CDR에서 수행하였다. 다음의 아미노산을 알라닌 돌연변이생성을 위하여 선택하였다(도 14):

Z270VL: R24A, S26A, E27A, N28A, Y30A, S31A, N50A, K52A, T53A, E56A, Y92A, T94A

Z270VH: K23A, S25A, T28A, T30A, S31A, N35A, D52A, Y53A, D54A, S55A, E56A, R94A, D98A, F99A, D100A, V(100A)A, T(100C)A, L(100D)A, W(100F)A, D101A.

재료 및 방법

알라닌 돌연변이체의 항원-결합 특성을 Biacore T100(Biacore AB, Uppsala, Sweden)로 분석하였다 사용하였다. sc-NKG2A-CD94-mFc 형태의 항원을 센서 CM5 칩(Biacore AB, Uppsala, Sweden)에 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카보이미드 하이드로클로라이드(EDC) 및 N-히드록시숙신이미드(NHS)를 사용하는 아민기를 통하여 공유결합으로 고정하였다. 고정화 수준은 300 RU로 표적화되었다. 정제 Z270 알라닌 돌연변이체는 유동하는 완충액 HBS-EP 내에서 0.75 nM 또는 1.5 nM로 희석되었다. 그 다음 모든 시료를 고정된 항원에 3 분간 10 ul/min의 유속으로 주입하였다. 후속적으로, 유동하는 완충액을 1 분간 10 ul/min으로 주입하여 항체 용해 분석을 하였다. 각각의 수행을 마친 후, 잔존 항체를 항원으로부터 완전하게 제거하기 위하여 재생 완충액(10 mM NaOH, 500 mM NaCl)을 주입하였다(35 초, 10 ul/min). 데이터를 Biacore T100 평가 소프트웨어로 평가하였다. 각 돌연변이의 상대적 결합은 Biacore에서 획득한 결합 수준(RU)을 chimZ270의 값으로 나누어 계산하였다.

결과 및 결론

도 15에 나타낸 바와 같이, Z270VH 알라닌 돌연변이체 D52A, D54A, F99A, T(100C)A, 및 W(100F)A는 이들의 항원-결합 특성을 완전히 상실하였다. 중쇄 돌연변이 R94는 약 20% 항원-결합능을 보유하였다. 중쇄 돌연변이체 N35A, Y53A, E56A, D98A, V(100A)A, 및 L(100D)A의 상대적인 결합 수준은 40-70% 사이이다(도 1). 따라서, Z270 중쇄 CDR-H2 및 CDR-H3 내의 아미노산 D52, D54, R94, F99, T(100C), 및 W(100F)는 항원을 인식하는 결정적인 잔기이다. 반면에, 중쇄 내의 아미노산 N35, Y53, E56, D98, V(100A), 및 L(100D)는 어느정도 항원-결합에 영향을 미친다. 흥미로운 것은, 모든 Z270 경쇄 알라닌 돌연변이체는 키메라 Z270의 값에 비견할만한 항원-결합 특성을 보유한다(도 16). 따라서, Z270 경쇄 내의 아미노산은 항원 인식에 상당히 기여하지는 못한다.

실시예 13 - HumZ270는CD94/NKG2A를 발현하는 세포에 특이적으로 결합한다

야생형 Z270를 생산하는 HEK293 세포(recZ270) 내에서, 인간 IgG4를 지닌 키메라 Z270(chimZ270) 또는 인체적응형 Z270 (humZ270VL1/VH1)와 CD94/NKG2A 또는 CD94/NKG2C를 안정적으로 과다발현하는 Ba/F3 세포의 결합을 분석함으로써 humZ270와 CD94/NKG2A의 결합 강도 및 특이성을 흐름 세포분석으로 시험하였다. 이 목적을 위하여, Ba/F3-CD94/NKG2A 및 -C 세포를 2% FCS를 함유하는 조직-배양 배지 내에서 다양한 농도의 Z270 변이체를 최소한 30 분간 얼음상에서 배양하였다. 후속적으로 세포를 세척하였으며, 세포를 제2 Ab's에 접합된 APC를 함유한 유사한 배지 내에서 최소한 30 분간 얼음상에서 배양하였다. 얼음-냉동 PBS로 2회 세척 후, mAb's와 세포의 결합을 BD Biosciences FACS 분석을 사용하여 현시하였다.

도 17에 나타낸 바와 같이, 모든 Z270 변이체는 복용량-의존성 방식으로 Ba/F3-CD94/NKG2C 세포가 아닌 Ba/F3-CD94/NKG2A 세포에 결합하였다. 그러므로 모든 변이체는 chimZ270와 같이 유사한 효능을 지닌 NKG2A와 결합하는 humZ270를 지닌 NKG2A에 특이적으로 결합한다, 여기서 recZ270가 약간 더 효과적이다.

실시예 14 - humZ270는 CD94/NKG2A-발현 NKL 세포에 의하여 HLA-E+ 표적 세포의 살상을 유도한다

CD94/NKG2A+ NKL 세포에 의한 recZ270, chimZ270, humZ270VL1/VH1 및 Z199가 ⁵¹Cr-표지 LCL 721.221-Cw3 세포의 살상을 유도하는 능력을 조사하였다. 이 분석에서, ⁵¹Cr-표지 LCL 721.221-Cw3 표적-세포(HLA-E+)를 다양한 농도의 항-NKG2A mAb's의 존재 또는 부재하에 NKL 세포와 함께 5% CO2를 함유한 습식 배양기에서 4 시간 동안 37℃로 배양하였다(E:T 비율 = 6:1). 표적-세포의 살상은 조직-배양 배지 내의 ⁵¹Cr의 양을 측정함으로써 분석되며, 살상시 표적 세포에 의하여 방출된다.

도 18에서, 증가하는 농도의 항-NKG2A 항체는 NKL 세포에 의한 LCL 721.221-Cw3 세포의 살상을 유도한다는 것을 보여준다. Z199, chimZ270 및 recZ270는 모두 동등한 효과를 지니고 있으나, humZ270는 NKL 세포에 의한 LCL 721.221-Cw3 세포의 살상을 더 많이 유도하였다. 그러므로, humZ270는 CD94/NKG2A-발현 세포독성 림프구, 예컨대 NK-세포, NKT-세포, α/β T-세포 및 γ/δ T-세포의 서브세트 상의 CD94/NKG2A의 억제 기능을 효과적으로 차단할 수 있으며, 시험한 다른 재조합 변이체보다 더 효과적이다.

실시예 15 - humZ270는 경쟁적 CD94/NKG2A 길항제이다

humZ270VL1/VH1가 리간드(즉 HLA-E)와 CD94/NKG2A의 결합을 차단하는지 여부를 시험하기 위하여, humZ270가 HLA-E 4량체와 CD94/NKG2A 과다-발현 Ba/F3 세포(Ba/F3-CD94/NKG2A)의 결합을 차단하는지 여부를 분석하였다. 이를 위하여, Ba/F3-CD94/NKG2A를 1) 다양한 농도의 humZ270와 함께 배양하거나 또는 2) 포화 농도의 HLA-E 4량체(4.7 μg/ml)로 먼저 배양하고, 그 다음 다양한 농도의 humZ270으로 배양한다. 모든 배양은 2% FCS를 함유하는 조직-배양 배지의 얼음상에서 수행하였다. 후속적으로, 세포를 마우스 Ab's에 특이적인, APC-접합된 제2 항체와 함께 배양하였으며, BD Biosciences FACS 분석을 사용하여 흐름 세포분석에 의하여 분석하였다.

도 19에 나타난 바와 같이, humZ270는 농도 의존성 방식으로 Ba/F3-CD94/NKG2A 세포에 효과적으로 결합한다(다이아몬드). 그러나, 세포가 HLA-E 4량체와 사전 배양하는 경우, humZ270는 Ba/F3-CD94/NKG2A 세포와의 결합을 차단한다. 그러므로 HumZ270 및 HLA-E는 CD94/NKG2A 상의 오버랩된 에피토프에 결합한다. 따라서, NK-세포독성 분석에서 humZ270의 CD94/NKG2A-억제 효과는 CD94/NKG2A를 통한 세포독성 림프구에 대한 음성 신호를 유도하는 HLA-E의 능력을 차단한 결과인 것 같다. 이와 같이, humZ270는 경쟁적 CD94/NKG2A 길항제로 고려될 수 있다.

실시예 16 - humZ270는 CD94/NKG2A에 특이적으로 결합한다

humZ270VL1/VH1의 특이성 및 효능, 및 가변 경쇄(VL) 또는 가변 중쇄(VH) 영역 내의 역돌연변이를 지닌 다양한 humZ270VL1/VH1 변이체를 흐름 세포 분석으로 CD94/NKG2A와의 결합에 대하여 시험하였다. 이를 위하여, Ba/F3-CD94/NKG2A 세포를 humZ270-L46F(VL), humZ270-I48V(VL), humZ270-L46F/I48V(VL), humZ270-V5Q(VH), humZ270-M69L(VH), humZ270-T71V(VH), humZ270-T73K(VH), humZ270-T75S(VH), humZ270-V5Q/M69L/T71V/T73K/T75S(VH), humZ270-M69L/T71V/T73K/T75S(VH) 또는 역돌연변이가 없는 두개의 다른 배치의 humZ270VL1/VH1 ("DK" 및 "CHN")와 함께 배양하였다. 이러한 목적을 위하여, Ba/F3-CD94/NKG2A 또는 -C 세포를 다양한 농도의 humZ270 변이체로 2% FCS를 함유하는 조직-배양 배지로 최소한 30 분간 얼음상에서 배양하였다. 그 다음 세포를 세척하였으며, 인간 항체에 특이적인 APC 접합 제2 항체를 지닌 유사한 배지 내에서 최소한 30 분간 얼음상에서 배양하였다. 얼음-냉동 PBS로 2회 세척 후, 제2 항체와 세포의 결합을 BD Biosciences FACS 분석을 사용하여 현시하였다.

모든 변이체는 CD94/NKG2A에 특이적으로 결합하였으나, CD94/NKG2C에 결합하지 않았다. 모든 변이체는 약간 효과적이지 못하게 결합하는 V5Q(VL) 돌연변이를 지닌 변이체를 제외하고는 유사한 효능을 지니고 CD94/NKG2A에 결합하였다(도 20 참조).

예시적인 실시 상태

다음은 본 발명의 예시적인 실시 상태를 설명한다.

1. 뮤린 항체 Z270 및 인간 수용체 프레임워크 서열의 상보성-결정 영역(CDRs)의 항원-결합 잔기를 포함하는, NKG2A에 특이적으로 결합하는 항체로서, CDR-H2의 최소한 6개의 C-말단 아미노산 잔기가 가변 중쇄(VH) 인간 수용체 서열 내의 것과 동일한 항체.

2. 실시 상태 1에 있어서, CD94/NKG2A-발현 세포독성 림프구의 세포독성 활성을 강화시키는데 있어서 뮤린 항체 Z270 가변 경쇄(VL) 및 VH 서열을 포함하는 항체 보다 더욱 효과적인 것을 특징으로 하는 항체.

3. 실시 상태 1에 있어서, 세포독성 림프구의 표면상에 발현되는 CD94/NKG2A 수용체의 억제 활성을 중성화하는데 있어서 뮤린 항체 Z270 가변 경쇄(VL) 및 VH 서열을 포함하는 항체보다 더욱 효과적인 것을 특징으로 하는 항체.

4. 실시 상태 1에 있어서, CD94/NKG2A-발현 세포독성 림프구의 세포독성 활성의 CD94/NKG2A-매개 억제를 감소시키는데 있어서 뮤린 항체 Z270 가변 경쇄(VL) 및 VH 서열을 포함하는 항체보다 더욱 효과적인 것을 특징으로 하는 항체.

5. 실시 상태 1에 있어서, CD94/NKG2A-발현 세포독성 림프구에 의하여 Cw3-발현 표적 세포의 사멸을 유도하는데 있어서 뮤린 항체 Z270 가변 경쇄(VL) 및 VH 서열을 포함하는 항체보다 더욱 효과적인 항체.

6. 실시 상태 2-5 중 어느 하나에 있어서, CD94/NKG2A-발현 세포독성 림프구는 NK 세포, NKT 세포, α/β T-세포, 또는 γ/δ T-세포인 것을 특징으로 하는 세포.

7. 실시 상태 6에 있어서, CD94/NKG2A-발현 세포독성 림프구는 NK 세포인 것을 특징으로 하는 항체.

8. 실시 상태 1-7 중 어느 하나에 있어서, 항체 VH 도메인은 뮤린 항체 Z270의 VH CDRs의 잔기 D52, D54, F99, T(100C), 및 W(100F)를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.

9. 실시 상태 8에 있어서, 항체 VH 도메인은 뮤린 항체 Z270의 VH CDRs의 잔기 N35, Y53, E56, D98, V(100A), 및 L(100D)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.

10. 실시 상태 1-9 중 어느 하나에 있어서, SEQ ID NO:5의 잔기 31-35에 대응하는 CDR-H1 및 SEQ ID NO:5의 잔기 95-102에 대응하는 CDR-H3를 포함하며, CDR-H2는 SEQ ID NO:5의 잔기 50-59를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.

11. 실시 상태 1-10 중 어느 하나에 있어서, VH 도메인 인간 수용체 프레임워크는 SEQ ID NO:5와 70% 이상의 서열 일치성을 보유하는 것을 특징으로 하는 항체.

12. 실시 상태 1-11 중 어느 하나에 있어서, VH 인간 수용체 프레임워크의 VH 세그먼트는 VH1_18, VH5_a, VH5_51, VH1_f, 또는 VH1_46이며, J-세그먼트는 JH6인 것을 특징으로 하는 항체.

13. 실시 상태 12에 있어서, VH 세그먼트는 VH1_18, VH5_a, VH5_51, 또는 VH1_f인 것을 특징으로 하는 항체.

14. 실시 상태 13에 있어서, VH 세그먼트는 VH1_18인 것을 특징으로 하는 항체.

15. 실시 상태 1-14 중 어느 하나에 있어서, VH 도메인 인간 수용체 서열은 어떠한 역돌연변이도 부재한 것을 특징으로 하는 항체.

16. 실시 상태 1 내지 14 중 어느 하나에 있어서,

(a) VH 도메인의 위치 5의 아미노산은 V 또는 Q;

(b) VH 도메인의 위치 69의 아미노산은 M 또는 L;

(c) VH 도메인의 위치 71의 아미노산은 T 또는 V;

(d) VH 도메인의 위치 73의 아미노산은 T 또는 K; 또는

(e) VH 도메인의 위치 75의 아미노산은 T 또는 S

인 것을 특징으로 하는 항체.

17. 실시 상태 16에 있어서, 위치 69의 아미노산은 L인 것을 특징으로 하는 항체.

18. 실시 상태 16에 있어서, 위치 71의 아미노산은 V인 것을 특징으로 하는 항체.

19. 실시 상태 1-15 중 어느 하나에 있어서, VH 도메인은 SEQ ID NO:5의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.

20.실시 상태 1-19 중 어느 하나에 있어서, SEQ ID NO:4의 잔기 24-34에 대응하는 CDR-L1, SEQ ID NO:4의 잔기 50-56에 대응하는 CDR-L2, 및 SEQ ID NO:4의 잔기 89-97에 대응하는 CDR-L3를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.

21. 실시 상태 20에 있어서, VL 도메인 인간 수용체 서열은 어떠한 역돌연변이도 부재한 것을 특징으로 하는 항체.

22. 실시 상태 20-21 중 어느 하나에 있어서, VL 도메인 인간 수용체 프레임워크는 VKI_O2/JK4의 것인 것을 특징으로 하는 항체.

23. 실시 상태 20-22 중 어느 하나에 있어서, VL 도메인 인간 수용체 프레임워크는 SEQ ID NO:4를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.

24. NKG2A에 특이적으로 결합하는 인체적응형 항체 또는 항체 절편으로서

(a) SEQ ID NO:4의 잔기 24-34에 대응하는 CDR-L1;

(b) SEQ ID NO:4의 잔기 50-56에 대응하는 CDR-L2;

(c) SEQ ID NO:4의 잔기 89-97에 대응하는 CDR-L3;

(d) SEQ ID NO:5의 잔기 31-35에 대응하는 CDR-H1;

(e) SEQ ID NO:5의 잔기 95-102에 대응하는 CDR-H3 ; 및

(f) SEQ ID NO:5의 잔기 50-59를 포함하는 CDR-H2; 및

(g) 인간 수용체 프레임워크 서열;

을 포함하며, CDR-H2 내의 잔기 60-65는 VH 인간 수용체 서열의 것이며, 및 여기서 인체적응형 항체는 CD94/NKG2A-발현 NK 세포의 세포독성 활성을 강화하는데 있어서 SEQ ID NO:1에 대응하는 가변 경쇄 (VL) 서열 및 SEQ ID NO:2에 대응하는 VH 서열을 포함하는 항체보다 더 효과적인 NKG2A에 특이적으로 결합하는 인체적응형 항체 또는 항체 절편.

25. 인간 NKG2A에 결합하는 인체적응형 항체로서 항체는 비인간 CDR 잔기 및 인간 VH 수용체 프레임워크를 포함하는 VH 도메인을 포함하며, VH 도메인은 SEQ ID NO:5의 잔기 31-35에 대응하는 CDR-H1, SEQ ID NO:5의 잔기 50-65에 대응하는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO:5의 잔기 95-102에 대응하는 CDR-H3를 포함하는 인간 NKG2A에 결합하는 인체적응형 항체.

26. 실시 상태 25에 있어서, 인간 VH 수용체 프레임워크는 어떠한 역돌연변이도 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 인체적응형 항체.

27. 실시 상태 25에 있어서, VH 도메인의 Kabat 위치 5의 아미노산은 V 또는 Q인 것을 특징으로 하는 인체적응형 항체.

28. 실시 상태 25에 있어서, VH 도메인의 Kabat 위치 69의 아미노산은 M 또는 L인 것을 특징으로 하는 인체적응형 항체.

29. 실시 상태 25에 있어서, VH 도메인의 Kabat 위치 71의 아미노산은 T 또는 V인 것을 특징으로 하는 인체적응형 항체.

30. 실시 상태 25에 있어서, VH 도메인의 Kabat 위치 73의 아미노산은 T 또는 K인 것을 특징으로 하는 인체적응형 항체.

31. 실시 상태 25에 있어서, VH 도메인의 Kabat 위치 75의 아미노산은 T 또는 S인 것을 특징으로 하는 인체적응형 항체.

32. 실시 상태 25에 있어서, VH 도메인은 5, 69, 71, 73, 및 75로 구성되는 군으로부터 선택된 최소한 하나의 Kabat 위치 내의 프레임워크 영역 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는 인체적응형 항체.

33. 실시 상태 32에 있어서, VH 도메인은 다음의 선택에 따른 프레임워크 치환을 보유한 SEQ ID NO:5의 아미노산 서열을 포함하는 인체적응형 항체:

(a) 없음

(b) V5Q

(c) M69L

(d) T71V

(e) T73K

(f) T75S

(g) V5Q 및 M69L

(h) V5Q 및 T71V

(i) V5Q 및 T73K

(j) V5Q 및 T75S

(k) M69L 및 T71V

(I) M69L 및 T73K

(m) M69L 및 T75S

(n) T71V 및 T73K

(o) T71V 및 T75S

(p) T73K 및 T75S

(q) V5Q, T73K 및 T75S

(r) V5Q, T71V 및 T75S

(s) V5Q, T71V 및 T73K

(t) V5Q, M69L 및 T75S

(u) V5Q, M69L 및 T73K

(v) V5Q, M69L 및 T71V

(w)T71V, T73K 및 T75S

(x) M69L, T73K 및 T75S

(y) M69L, T71V 및 T75S,

(z) M69L, T71V 및T73K,

(aa) V5Q, M69L, T71V 및 T73K,

(bb) V5Q, M69L, T71V 및 T75S,

(cc) V5Q, M69L, T73K 및 T75S,

(dd) V5Q, T71V, T73K 및 T75S,

(ee) M69L, T71V, T73K 및 T75S, 및

(ff) V5Q, M69L, T71V, T73K 및 T75S.

34. 실시 상태 25-32 중 어느 하나에 있어서, 인간 VL 수용체 프레임워크 내로 포함되는 비인간 CDR 잔기를 포함하는 VL 도메인을 포함하며, VL 도메인은 SEQ ID NO:4의 잔기 24-34에 대응하는 CDR-L1, SEQ ID NO:4의 잔기 50-56에 대응하는 CDR-L2, 및 SEQ ID NO:4의 잔기 89-97에 대응하는 CDR-L3를 포함하는 것을 특징으로 하는 인체적응형 항체.

35. 실시 상태 34에 있어서, 인간 VL 수용체 프레임워크은 어떠한 역돌연변이도 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 인체적응형 항체.

36. 실시 상태 34에 있어서, VL 도메인의 Kabat 위치 46의 아미노산은 L 또는 F인 것을 특징으로 하는 인체적응형 항체.

37. 실시 상태 34에 있어서, VL 도메인의 Kabat 위치48의 아미노산은 I 또는 V인 것을 특징으로 하는 인체적응형 항체.

38. 실시 상태 34에 있어서, VL 도메인은 46 및 48로부터 선택된 최소한 하나의 Kabat 위치 내에 프레임워크 영역 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는 인체적응형 항체.

39. 실시 상태 38에 있어서, VL 도메인은 다음의 선택에 따른 프레임워크 치환을 보유한 SEQ ID NO:4의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 인체적응형 항체:

(a) 없음

(b) L46F

(c) I48V

(d) L46 및 I48V.

40. 인간 NKG2A에 결합하는 인체적응형 항체로서, 항체는 인간 VH 도메인내로 포함된 비인간 CDR 잔기를 포함하는 VH 도메인을 포함하며, VH 도메인은 5, 69, 71, 73, 및 75로 구성되는 군으로부터 선택되는 SEQ ID NO:7 내의 최소한 하나의 Kabat 위치 내의 프레임워크 영역 치환을 포함하는 인간 NKG2A에 결합하는 인체적응형 항체.

41. 실시 상태 40에 있어서, V5Q 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는 인체적응형 항체.

42. 실시 상태 40에 있어서, M69L 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는 인체적응형 항체.

43. 실시 상태 40에 있어서, T71V 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는 인체적응형 항체.

44. 실시 상태 40에 있어서, T73K 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는 인체적응형 항체.

45. 실시 상태 40에 있어서, T75S 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는 인체적응형 항체.

46. 실시 상태 40에 있어서, 인간 VL 도메인 내에 포함되는 비인간 CDR 잔기를 포함하는 VL 도메인을 포함하며, VL 도메인은 46 및 48으로부터 선택된 SEQ ID NO:6 내의 최소한 하나의 Kabat 위치 내의 프레임워크 영역 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는 인체적응형 항체.

47. 실시 상태 40에 있어서, L46F 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는 인체적응형 항체.

48. 실시 상태 40에 있어서, I48V 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는 인체적응형 항체.

49. 실시 상태 40-48 중 어느 하나에 있어서, SEQ ID NO:5의 잔기 31-35에 대응하는 CDR-H1, SEQ ID NO:5의 잔기 50-66에 대응하는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO:5의 잔기 95-102에 대응하는 CDR-H3를 포함하는 것을 특징으로 하는 인체적응형 항체.

50. 실시 상태 40-49 중 어느 하나에 있어서, SEQ ID NO:7의 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 인체적응형 항체.

51. 실시 상태 40-50 중 어느 하나에 있어서, SEQ ID NO:6의 잔기 24-34에 대응하는 CDR-L1, SEQ ID NO:6의 잔기 50-56에 대응하는 CDR-L2, 및 SEQ ID NO:6의 잔기 89-97에 대응하는 CDR-L3를 포함하는 것을 특징으로 하는 인체적응형 항체.

52. 실시 상태 40-52 중 어느 하나에 있어서, SEQ ID NO:6의 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 인체적응형 항체.

53. 인간 NKG2A에 결합하는 인체적응형 항체로서, 항체는 선택적으로 Kabat 위치 5, 69, 71, 73, 및/또는 75에서 하나 이상의 FR 치환을 지닌 SEQ ID NO:5의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 인간 NKG2A에 결합하는 인체적응형 항체.

54. 실시 상태 53에 있어서, 선택적 FR 치환은 V5Q, M69L, T71V, T73K, 및/또는 T75S인 것을 특징으로 하는 인체적응형 항체.

55. 실시 상태 52에 있어서, Kabat 위치 46 및/또는 48에서 선택적으로 하나 이상의 FR 치환을 보유한 SEQ ID NO:4의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 인체적응형 항체.

56. 실시 상태 55에 있어서, 선택적 FR 치환은 L46F 및/또는 I48V인 것을 특징으로 하는 인체적응형 항체.

57. NKG2A에 결합하는 인체적응형 항체로서, 인간 VH 도메인 내로 포함되는 비인간 CDR 잔기를 포함하는 VH 도메인을 포함하며, 여기서 VH 도메인은 SEQ ID NO:5와 최소한 50% 일치하는 NKG2A에 결합하는 인체적응형 항체.

58. 실시 상태 46에 있어서, VH 도메인은 SEQ ID NO:5에 최소한 90% 일치하는 것을 특징으로 하는 인체적응형 항체.

59. 실시 상태 57 내지 58 중 어느 하나에 있어서, SEQ ID NO:5의 잔기 31-35에 대응하는 CDR-H1, SEQ ID NO:5의 잔기 50-66에 대응하는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO:5의 잔기 95-102에 대응하는 CDR-H3를 포함하는 것을 특징으로 하는 인체적응형 항체.

60. 실시 상태 57-59 중 어느 하나에 있어서, VH 도메인 내에서 Kabat 위치 5에 V 또는 Q, Kabat 위치 69에 M 또는 L, Kabat 위치 71에 T 또는 V, Kabat 위치 73에 T 또는 K, 및 Kabat 위치 75에 T 또는 S를 포함하는 것을 특징으로 하는 인체적응형 항체.

61. 실시 상태 57-60 중 어느 하나에 있어서, 인간 VL 도메인 내에 포함되는 비인간 CDR 잔기를 포함하는 VL 도메인을 포함하며, VL 도메인은 SEQ ID NO:4에 최소한 50% 일치하는 것을 특징으로 하는 인체적응형 항체.

62. 실시 상태 57-61 중 어느 하나에 있어서, VL 도메인은 SEQ ID NO:4와 최소한 90% 일치하는 것을 특징으로 하는 인체적응형 항체.

63. 실시 상태 57-62 중 어느 하나에 있어서, SEQ ID NO:4의 잔기 24-34에 대응하는 CDR-L1 서열, SEQ ID NO:4의 잔기 50-56에 대응하는 CDR-L2 서열, 및 an SEQ ID NO:4의 잔기 89-97에 대응하는 CDR-L3 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 인체적응형 항체.

64. 실시 상태 57-63 중 어느 하나에 있어서, Kabat 위치 46에 L 또는 F 및/또는 Kabat 위치 48에 I 또는 V를 포함하는 것을 특징으로 하는 인체적응형 항체.

65. 인간 NKG2A에 결합하는 인체적응형 항체로서, 항체는 인간 VH 도메인 내로 포함되는 비인간 CDR 잔기를 포함하는 VH 도메인을 포함하며, VH 도메인은 SEQ ID NO:8의 잔기 31-35에 대응하는 CDR-H1, SEQ ID NO:8의 잔기 50-66에 대응하는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO:8의 잔기 95-102에 대응하는 CDR-H3를 포함하며, Kabat 위치 63, 64, 65, 66, 및 67의 아미노산은 각각 F, K, D, K, A인 인간 NKG2A에 결합하는 인체적응형 항체.

66. 실시 상태 65에 있어서, Kabat 위치 60의 아미노산은 A인 것을 특징으로 하는 인체적응형 항체.

67. 실시 상태 65 및 66 중 어느 하나에 있어서, VH 도메인은 SEQ ID NO:8의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 인체적응형 항체.

68. 실시 상태 65-67 중 어느 하나에 있어서, SEQ ID NO:6의 잔기 24-34에 대응하는 CDR-L1, SEQ ID NO:6의 잔기 50-56에 대응하는 CDR-L2, 및 SEQ ID NO:6의 잔기 89-97에 대응하는 CDR-L3를 포함하는 VL 도메인을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 인체적응형 항체.

69. 실시 상태 65-68에 있어서, VL 도메인은 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 인체적응형 항체.

70. Z270 하이브리도마에 의하여 생산된 인체적응형 버전의 항-NKG2A 항체.

71. 실시 상태 1-70 중 어느 하나에 있어서, 항체가 다특이적 항체 또는 항체 절편인 것을 특징으로 하는 항체.

72. 실시 상태 71에 있어서, 항체 절편은 Fab, Fab', F(ab)₂, F(ab')₂, F(ab)₃, Fv, 단일-사슬 Fv, dsFv, Fd 절편, dAb 절편, 미니바디, 다이아바디, 트라이어바디, 테트라바디, 카파바디; 카멜 IgG; IgNAR; 및 다특이적 항체 절편으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항체.

73. 실시 상태 72에 있어서, 항체는 이특이적 항체인 것을 특징으로 하는 항체.

74. 실시 상태 1-70 중 어느 하나에 있어서, 항체는 전장 IgG4 항체 또는 이들의 절편인 것을 특징으로 하는 항체.

75. 실시 상태 74에 있어서, 중쇄 불변 도메인은 S241P 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.

76. 전술한 실시 상태 중의 하나의 항체를 암호화하는 분리된 핵산.

77. 실시 상태 76의 핵산을 포함하는 벡터.

78. 실시 상태 76의 벡터를 포함하는 숙주 세포.

79. 실시 상태 78의 숙주 세포를 배양하여 핵산을 발현시키고 항체를 생산하는 단계를 포함하는 항체의 생산 방법.

80. 실시 상태 79에 있어서, 숙주 세포 배양물로부터 항체를 회수하는 단계를 추가로 포함하는 방법.

81. 실시 상태 79에 있어서, 배양 전에, 숙주 세포는 가변 중쇄 도메인을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터와 가변 경쇄 도메인을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터로 동시-전달감염되는 것을 특징으로 하는 방법.

82. 실시 상태 1-75 중의 하나에 따른 항체 및 제2 약제를 포함하는 면역접합체.

83. 실시 상태 82에 있어서, 제2 약제는 세포독성제인 것을 특징으로 하는 면역접합체.

84. 실시 상태 82에 있어서, 제2 약제는 PEG-분자인 것을 특징으로 하는 면역접합체.

85. 실시 상태 1-75 중의 하나의 항체 또는 실시 상태 82-84 중의 하나의 면역접합체, 및 담체를 포함하는 약학적 조성물.

86. 실시 상태 74에 있어서, pH가 약 6.0 내지 약 7.5인, 시트레이트, 포스페이트, 및 이들의 조합으로부터 선택된 완충액을 포함하는 약학적 조성물.

87. 실시 상태 1-75 중의 하나의 항체를 함유하는 용기 및 사용자가 유효량의 상기 항체로 암, 바이러스 질환, 염증 질환, 및 자가면역 질환으로부터 선택된 질환을 치료하도록 하는 지시서를 포함하는 생산 용품.

88. 실시 상태 87에 있어서, 포유류는 인간인 것을 특징으로 하는 용품.

89. 실시 상태 1-75 중 어느 하나에 있어서, 인간 환자 내에서 세포독성 림프구의 표면상에서 발현되는 CD94/NKG2A 수용체의 억제 활성을 중성화하기 위하여 사용하는 것을 특징으로 하는 항체.

90. 실시 상태 1-75 중 어느 하나에 있어서, 인간 환자 내에서 CD94/NKG2A-발현 세포독성 림프구의 세포독성 활성의 CD94/NKG2A-매개 억제를 감소하기 위하여 사용하는 것을 특징으로 하는 항체.

91. 실시 상태 1-75 중 어느 하나에 있어서, 인간 환자 내에서 CD94/NKG2A-발현 세포독성 림프구의 세포독성 활성을 강화하기 위하여 사용하는 것을 특징으로 하는 항체.

92. 실시 상태 1-75 중 어느 하나에 있어서, 인간 환자에 있어서 CD94/NKG2A-발현 세포독성 림프구에 의한 Cw3-발현 표적 세포의 사멸을 유도하기 위하여 사용하는 것을 특징으로 하는 항체.

93. 실시 상태 89-92 중 어느 하나에 있어서, CD94/NKG2A-발현 세포독성 림프구는 NK 세포, NKT 세포, α/β T-세포, 또는 γ/δ T-세포인 것을 특징으로 하는 항체.

94. 실시 상태 85-86 중의 하나의 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 암, 바이러스 질환, 염증 질환, 및 자가면역 질환으로부터 선택된 질환을 겪고 있는 인간 환자를 치료하는 방법.

95. 암, 바이러스 질환, 염증 질환, 및 자가면역 질환으로부터 선택된 질환을 겪고 있는 인간 환자에 투여를 위한 의약의 제조시 실시 상태 1-75 중의 하나의 항체의 용도.

96. 암, 바이러스 질환, 염증 질환, 및 자가면역 질환으로부터 선택된 질환을 겪고 있는 인간 환자의 치료에 사용되는 실시 상태 1-75 중의 하나의 항체.

97. 환자가 편평 세포 암종, 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 급성 림프모구 백혈병, B-세포 림프종, T-세포 림프종, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 모발상 세포 림프종, 버케트 림프종, 다발성 골수종, 급성 또는 만성 골수성 백혈병, 전골수구성 백혈병, 섬유육종, 횡문근육종; 흑색종, 생식세포종, 기형암종, 신경모세포종, 신경아교종, 별아교세포종, 신경모세포종, 신경아교종, 신경집종; 섬유육종, 횡문근육종, 골육종, 흑색종, 색소성 건피증, 각질가시세포종, 생식세포종, 갑상선 소포 암, 기형암종, 방광, 유방, 결장, 신장, 간, 폐, 난소, 전립선, 췌장, 위, 자궁경부, 갑상선 또는 피부의 다른 암종, 림프구 계통의 다른 조혈 종양, 골수 계통의 다른 조혈 종양, 중간엽 기원의 다른 종양, 중추 또는 말초 신경계의 다른 종양, 또는 중간엽 기원의 다른 종양을 겪고 있는 것을 특징으로 하는 실시 상태 89-96 중의 하나의 방법, 용도 또는 항체.

98. 환자는 다발성 골수종, 비호지킨 림프종, 또는 급성 골수성 림프종을 겪고 있는 것을 특징으로 하는 실시 상태 97의 용도.

단행본, 특허 출원 및 특허를 포함하는 모든 참고자료는 본원에 참고자료로서 포함되어 있으며, 가가 참고자료는 개별적이며, 일체성을 지닌채 포함되어 있다.

모든 본원의 제목 및 소제목은 편의를 위한 것이며 어떠한 방식으로도 본 발명을 제한하는 것으로 해석해서는 아니된다.

달리 적시하지 않느다면 본 발명에 모든 가능한 이들의 변현에 있어서 상기 성분의 모든 조합이 포함된다.

본원에서 달리 분명하게 적시한 바 없다면, 본원의 용어 "또는" "및/또는"을 포함하는 것으로 사용되며, 따라서, 본 발명의 실시 상태 또는 특징을 포함하는 것으로 해서하여야 한다.

용어 "한" 및 "하나" 및 "그" 및 유사한 언급은 본원에서 달리 분명하게 적시한 바 없다면, 단수와 복수의 개념을 모두 포함하는 것을 의미한다.

본원의 값의 범위는 본원에서 달리 분명하게 적시한 바 없다면, 각 수치가 그 범위 내에 존재한다는 것을 의미하며, 각각의 별도의 값은 대응하는 근사값을 나타낸다(예컨대, 모든 정확한 예시적인 값이 특정 인자에 관하여 제공되거나 또는 적합한 경우 "약"으로 변형되어 측정이 대응하는 대략적 측정치를 제공한다고 간주된다).

본원의 모든 방법은 본원에서 달리 분명하게 적시한 바 없다면 적합한 순서로 수행될 수 있다.

본원의 모든 예, 또는 예시적인 언어(예컨대, "예컨대")는 달리 적시하지 않는다면 단지 본 발명의 예시를 위한것일 뿐이며, 본 발명의 범위를 제한하고자하는 것이 아니다. 명세서 내의 어떠한 단어도 어떠한 성분이 본 발명에 필수적이라고 해석해서는 아니된다.

본원에 업급된 특허 문헌의 인용 및 포함은 편의를 위한 것이며, 특허성 등을 반영한 것은 아니다.

성분 또는 인자에 대하여 예컨대 "포함하는", "보유하는", "포함하는" 또는 "함유하는"이라는 용어를 사용하여 본 발명의 특징 도는 실시 상태를 설명하는 것은 달리 분명하게 적시한 바 없다면 특정 성분으로 "구성되어" 있거나", "필수적으로 구성되어" 있거나 또는 "실질적으로 포함하는" 것을 의미한다(예컨대, 달리 분명하게 적시한 바 없다면, 조성물이 특정 성분을 포함한다고 한 경우 특정 성분으로 구성된 조성물을 설명하는 것으로 이해하여야한다).

이 발명은 범적으로 허용가능한 최대 범위에서 본 발명의 특징 또는 첨부한 청구항에서 언급된 본 발명의 대상의 모든 변형 및 동등물을 포함한다.

SEQUENCE LISTING <110> Novo Nordisk A/S <120> ANTI-NKG2A ANTIBODIES AND USES THEREOF <130> 7448.204-WO <160> 29 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Phe Leu Val 35 40 45 Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Thr Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 2 <211> 124 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Gln Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu 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<220> <221> UNSURE <222> (72)..(72) <223> Kabat position 71; Xaa is T or V <220> <221> UNSURE <222> (74)..(74) <223> Kabat position 73; Xaa is T or K <220> <221> UNSURE <222> (76)..(76) <223> Kabat position 75; Xaa is T or S <400> 7 Gln Val Gln Leu Xaa Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Ala Gln Lys Leu 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Xaa Thr Xaa Asp Xaa Ser Xaa Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Phe Asp Val Gly Thr Leu Tyr Trp Phe Phe 100 105 110 Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 115 120 <210> 8 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Humanized sequence <220> <221> UNSURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is V or Q <220> <221> UNSURE <222> (61)..(61) <223> Kabat position 60; Xaa is S or A <220> <221> UNSURE <222> (64)..(64) <223> Kabat position 63; Xaa is L or F <220> <221> UNSURE <222> (65)..(65) <223> Kabat position 64; Xaa is Q or K <220> <221> UNSURE <222> (66)..(66) <223> Kabat position 65; Xaa is G or D <220> <221> UNSURE <222> (67)..(67) <223> Kabat position 66; Xaa is R or K <220> <221> UNSURE <222> (68)..(68) <223> Kabat position 67; Xaa is V or A <220> <221> UNSURE <222> (70)..(70) <223> Kabat position 69; Xaa is M or L <220> <221> UNSURE <222> (72)..(72) <223> Kabat position 71; Xaa is T or V <220> <221> UNSURE <222> (74)..(74) <223> Kabat position 73; Xaa is T or K <220> <221> UNSURE <222> (76)..(76) <223> Kabat position 75; Xaa is T or S <400> 8 Gln Val Gln Leu Xaa Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Xaa Gln Lys Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Thr Xaa Asp Xaa Ser Xaa Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Phe Asp Val Gly Thr Leu Tyr Trp Phe Phe 100 105 110 Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 115 120 <210> 9 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 10 <211> 117 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr 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Arg His Cys Gly His Cys Pro Glu Glu Trp Ile Thr Tyr Ser Asn 115 120 125 Ser Cys Tyr Tyr Ile Gly Lys Glu Arg Arg Thr Trp Glu Glu Ser Leu 130 135 140 Leu Ala Cys Thr Ser Lys Asn Ser Ser Leu Leu Ser Ile Asp Asn Glu 145 150 155 160 Glu Glu Met Lys Phe Leu Ser Ile Ile Ser Pro Ser Ser Trp Ile Gly 165 170 175 Val Phe Arg Asn Ser Ser His His Pro Trp Val Thr Met Asn Gly Leu 180 185 190 Ala Phe Lys His Glu Ile Lys Asp Ser Asp Asn Ala Glu Leu Asn Cys 195 200 205 Ala Val Leu Gln Val Asn Arg Leu Lys Ser Ala Gln Cys Gly Ser Ser 210 215 220 Ile Ile Tyr His Cys Lys His Lys Leu 225 230 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 12 gccagtggat agacagatgg 20 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 13 gatggataca gttggtgcag c 21 <210> 14 <211> 381 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 14 atgagtgtgc ccactcaggt cctggggttg ctgctgctgt ggcttacagg tgccagatgt 60 gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgcat ctgtgggaga aactgtcacc 120 atcacatgtc gagcaagtga gaatatttac agttatttag catggtatca gcagaaacag 180 ggaaaatctc ctcagttctt ggtctataat gcaaaaacct tagcagaagg tgtgccatca 240 aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag ttttctctga agatcaacag cctgcagcct 300 gaagattttg ggagttatta ctgtcaacat cactatggta ctcctcggac gttcggtgga 360 ggcaccaagc tggaaatcaa a 381 <210> 15 <211> 127 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 15 Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr 1 5 10 15 Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn 35 40 45 Ile Tyr Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro 50 55 60 Gln Phe Leu Val Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn 85 90 95 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr 100 105 110 Gly Thr Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 115 120 125 <210> 16 <211> 432 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 16 atgggatgga gctatatcat cctcttcttg ttagcaacag ctacatgtgt ccactcccag 60 gtccaactgc agcagcctgg ggctgagctg gtgaggcctg gggcttcagt gaagctgtcc 120 tgcaaggctt ctggctacac gttcaccagc tactggatga actgggttaa gcagaggcct 180 gagcaaggcc ttcagtggat tggaaggatt gatccttacg atagtgaaac tcactacagt 240 caaaagttca aggacaaggc catattgact gtagacaaat cctccagcac agcctacatg 300 cgactcagca gcctgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtgcaag agggggctat 360 gatttcgacg taggaactct ctactggttc ttcgatgtct ggggcgcagg gaccacggtc 420 accgtctcct ca 432 <210> 17 <211> 144 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 17 Met Gly Trp Ser Tyr Ile Ile Leu Phe Leu Leu Ala Thr Ala Thr Cys 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu 50 55 60 Gln Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Ser 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Ile Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Arg Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Phe Asp Val Gly Thr Leu Tyr 115 120 125 Trp Phe Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210> 18 <211> 723 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Chimeric sequence <400> 18 gaattcgcca ccatgagtgt gcccactcag gtcctggggt tgctgctgct gtggcttaca 60 ggtgccagat gtgacatcca gatgactcag tctccagcct ccctatctgc atctgtggga 120 gaaactgtca ccatcacatg tcgagcaagt gagaatattt acagttattt agcatggtat 180 cagcagaaac agggaaaatc tcctcagttc ttggtctata atgcaaaaac cttagcagaa 240 ggtgtgccat caaggttcag tggcagtgga tcaggcacac agttttctct gaagatcaac 300 agcctgcagc ctgaagattt tgggagttat tactgtcaac atcactatgg tactcctcgg 360 acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaacgggctg atgctgcacc aactgtatcc 420 atcttcccac catccagtga gcagttaaca tctggaggtg cctcagtcgt gtgcttcttg 480 aacaacttct accccaaaga catcaatgtc aagtggaaga ttgatggcag tgaacgacaa 540 aatggcgtcc tgaacagttg gactgatcag gacagcaaag acagcaccta cagcatgagc 600 agcaccctca cgttgaccaa ggacgagtat gaacgacata acagctatac ctgtgaggcc 660 actcacaaga catcaacttc acccattgtc aagagcttca acaggaatga gtgttaggct 720 agc 723 <210> 19 <211> 1419 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Chimeric sequence <400> 19 gaattcgcca ccatgggatg gagctatatc atcctcttct tgttagcaac agctacatgt 60 gtccactccc aggtccaact gcagcagcct ggggctgagc tggtgaggcc tggggcttca 120 gtgaagctgt cctgcaaggc ttctggctac acgttcacca gctactggat gaactgggtt 180 aagcagaggc ctgagcaagg ccttcagtgg attggaagga ttgatcctta cgatagtgaa 240 actcactaca gtcaaaagtt caaggacaag gccatattga ctgtagacaa atcctccagc 300 acagcctaca tgcgactcag cagcctgaca tctgaggact ctgcggtcta ttactgtgca 360 agagggggct atgatttcga cgtaggaact ctctactggt tcttcgatgt ctggggcgca 420 gggaccacgg tcaccgtctc ctcagccaaa acgacacccc catctgtcta tccgctagcc 480 cctggatctg ctgcccaaac taactccatg gtgaccctgg gatgcctggt caagggctat 540 ttccctgagc cagtgacagt gacctggaac tctggatccc tgtccagcgg tgtgcacacc 600 ttcccagctg tcctgcagtc tgacctctac actctgagca gctcagtgac tgtcccctcc 660 agcacctggc ccagcgagac cgtcacctgc aacgttgccc acccggccag cagcaccaag 720 gtggacaaga aaattgtgcc cagggattgt ggttgtaagc cttgcatatg tacagtccca 780 gaagtatcat ctgtcttcat cttcccccca aagcccaagg atgtgctcac cattactctg 840 actcctaagg tcacgtgtgt tgtggtagac atcagcaagg atgatcccga ggtccagttc 900 agctggtttg tagatgatgt ggaggtgcac acagctcaga cgcaaccccg ggaggagcag 960 ttcaacagca ctttccgctc agtcagtgaa cttcccatca tgcaccagga ctggctcaat 1020 ggcaaggagt tcaaatgcag ggtcaacagt gcagctttcc ctgcccccat cgagaaaacc 1080 atctccaaaa ccaaaggcag accgaaggct ccacaggtgt acaccattcc acctcccaag 1140 gagcagatgg ccaaggataa agtcagtctg acctgcatga taacagactt cttccctgaa 1200 gacattactg tggagtggca gtggaatggg cagccagcgg agaactacaa gaacactcag 1260 cccatcatgg acacagatgg ctcttacttc gtctacagca agctcaatgt gcagaagagc 1320 aactgggagg caggaaatac tttcacctgc tctgtgttac atgagggcct gcacaaccac 1380 catactgaga agagcctctc ccactctcct ggtaaatga 1419 <210> 20 <211> 723 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Chimeric sequence <400> 20 gaattcgcca ccatgagtgt gcccactcag gtcctggggt tgctgctgct gtggcttaca 60 ggtgccagat gtgacatcca gatgactcag tctccagcct ccctatctgc atctgtggga 120 gaaactgtca ccatcacatg tcgagcaagt gagaatattt acagttattt agcatggtat 180 cagcagaaac agggaaaatc tcctcagttc ttggtctata atgcaaaaac cttagcagaa 240 ggtgtgccat caaggttcag tggcagtgga tcaggcacac agttttctct gaagatcaac 300 agcctgcagc ctgaagattt tgggagttat tactgtcaac atcactatgg tactcctcgg 360 acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaacggactg tggcggcgcc atctgtcttc 420 atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggtaccg ctagcgttgt gtgcctgctg 480 aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg 540 ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 600 agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 660 acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgttaggga 720 tcc 723 <210> 21 <211> 1434 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Chimeric sequence <400> 21 gaattcgcca ccatgggatg gagctatatc atcctcttct tgttagcaac agctacatgt 60 gtccactccc aggtccaact gcagcagcct ggggctgagc tggtgaggcc tggggcttca 120 gtgaagctgt cctgcaaggc ttctggctac acgttcacca gctactggat gaactgggtt 180 aagcagaggc ctgagcaagg ccttcagtgg attggaagga ttgatcctta cgatagtgaa 240 actcactaca gtcaaaagtt caaggacaag gccatattga ctgtagacaa atcctccagc 300 acagcctaca tgcgactcag cagcctgaca tctgaggact ctgcggtcta ttactgtgca 360 agagggggct atgatttcga cgtaggaact ctctactggt tcttcgatgt ctggggcgca 420 gggaccacgg tcaccgtctc ctcagctagc accaagggcc catccgtctt ccccctggcg 480 ccctgctcca ggagcacctc cgagagcaca gccgccctgg gctgcctggt caaggactac 540 ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc 600 ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc 660 tccagcagct tgggcacgaa gacctacacc tgcaacgtag atcacaagcc cagcaacacc 720 aaggtggaca agagagttga gtccaaatat ggtcccccat gcccaccatg cccagcacct 780 gagttcctgg ggggaccatc agtcttcctg ttccccccaa aacccaagga cactctcatg 840 atctcccgga cccctgaggt cacgtgcgtg gtggtggacg tgagccagga agaccccgag 900 gtccagttca actggtacgt ggatggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg 960 gaggagcagt tcaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac 1020 tggctgaacg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aaggcctccc gtcctccatc 1080 gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag ccccgagagc cacaggtgta caccctgccc 1140 ccatcccagg aggagatgac caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc 1200 taccccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag 1260 accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctacagcag gctaaccgtg 1320 gacaagagca ggtggcagga ggggaatgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg 1380 cacaaccact acacacagaa gagcctctcc ctgtctctgg gtaaatgagg atcc 1434 <210> 22 <211> 723 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Humanized sequence <400> 22 gaattcgcca ccatggacat gagggtcccc gctcagctcc tggggctcct gctactctgg 60 ctccgaggtg ccagatgtga catccagatg acccagtctc catcctccct gtctgcatct 120 gtaggagaca gagtcaccat cacttgccga gcaagtgaga atatttacag ttatttagca 180 tggtatcagc agaaaccagg gaaagcccct aagctcctga tctataatgc aaaaacctta 240 gcagaagggg tcccatcaag gttcagtggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 300 atcagcagtc tgcaacctga agattttgca acttactact gtcaacatca ctatggtact 360 cctcggacgt tcggcggagg gaccaaggtg gagatcaaac ggactgtggc ggcgccatct 420 gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gtaccgctag cgttgtgtgc 480 ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc 540 caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc 600 ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc 660 gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt 720 tag 723 <210> 23 <211> 1428 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Humanized sequence <400> 23 gaattcgcca ccatggactg gacctggagc atccttttct tggtggcagc agcaacaggt 60 gcccactccc aggttcagct ggtgcagtct ggagctgagg tgaagaagcc tggggcctca 120 gtgaaggtct cctgcaaggc ttctggttac acctttacca gctactggat gaactgggtg 180 cgacaggccc ctggacaagg gcttgagtgg atgggaagga ttgatcctta cgatagtgaa 240 actcactatg cacagaagct ccagggcaga gtcaccatga ccacagacac atccacgagc 300 acagcctaca tggagctgag gagcctgaga tctgacgaca cggccgtgta ttactgtgcg 360 agagggggct atgatttcga cgtaggaact ctctactggt tcttcgatgt ctggggccaa 420 gggacaacgg tcaccgtctc ttcagctagc accaagggcc catccgtctt ccccctggcg 480 ccctgctcca ggagcacctc cgagagcaca gccgccctgg gctgcctggt caaggactac 540 ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc 600 ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc 660 tccagcagct tgggcacgaa gacctacacc tgcaacgtag atcacaagcc cagcaacacc 720 aaggtggaca agagagttga gtccaaatat ggtcccccat gcccaccatg cccagcacct 780 gagttcctgg ggggaccatc agtcttcctg ttccccccaa aacccaagga cactctcatg 840 atctcccgga cccctgaggt cacgtgcgtg gtggtggacg tgagccagga agaccccgag 900 gtccagttca actggtacgt ggatggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg 960 gaggagcagt tcaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac 1020 tggctgaacg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aaggcctccc gtcctccatc 1080 gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag ccccgagagc cacaggtgta caccctgccc 1140 ccatcccagg aggagatgac caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc 1200 taccccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag 1260 accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctacagcag gctaaccgtg 1320 gacaagagca ggtggcagga ggggaatgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg 1380 cacaaccact acacacagaa gagcctctcc ctgtctctgg gtaaatga 1428 <210> 24 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Humanized sequence <400> 24 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Ser Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Phe Asp Val Gly Thr Leu Tyr Trp Phe Phe 100 105 110 Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 115 120 <210> 25 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Humanized sequence <400> 25 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Gln Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Ser Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Phe Asp Val Gly Thr Leu Tyr Trp Phe Phe 100 105 110 Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 115 120 <210> 26 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Humanized sequence <400> 26 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Phe Asp Val Gly Thr Leu Tyr Trp Phe Phe 100 105 110 Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 115 120 <210> 27 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Humanized sequence <400> 27 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Phe Asp Val Gly Thr Leu Tyr Trp Phe Phe 100 105 110 Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 115 120 <210> 28 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Humanized sequence <400> 28 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Ala Glu Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Gly Gly Tyr Asp Phe Asp Val Gly Thr Leu Tyr Trp Phe Phe 100 105 110 Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 115 120 <210> 29 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Humanized sequence <400> 29 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Phe Asp Val Gly Thr Leu Tyr Trp Phe Phe 100 105 110 Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 115 120

Claims

뮤린 항체 Z270의 상보성-결정 영역(CDR)의 항원-결합 잔기 및 인간 수용체 프레임워크 서열을 포함하며, CDR-H2의 최소한 6개의 C-말단 아미노산 잔기가 가변 중쇄(VH) 도메인 인간 수용체 서열 내의 것과 동일한, NKG2A에 특이적으로 결합하는 항체.
제1항에 있어서, CD94/NKG2A-발현 세포독성 림프구의 세포독성 활성을 강화하는데 있어서 뮤린 항체 Z270 가변 경쇄(VL)(SEQ ID NO:1) 및 VH(SEQ ID NO:2) 서열을 포함하는 항체보다 더욱 효과적인 것을 특징으로 하는 항체.
제1항 또는 제2항에 있어서, SEQ ID NO:5의 잔기 31-35에 대응하는 CDR-H1 및 SEQ ID NO:5의 잔기 95-102에 대응하는 CDR-H3를 포함하며, CDR-H2는 SEQ ID NO:5의 잔기 50-59를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,

(a) VH 도메인 내의 위치 5의 아미노산은 V 또는 Q 이고;

(b) VH 도메인 내의 위치 69의 아미노산은 M 또는 L 이고;

(c) VH 도메인 내의 위치 71의 아미노산은 T 또는 V 이고;

(d) VH 도메인 내의 위치 73의 아미노산은 T 또는 K 이거나; 또는

(e) VH 도메인 내의 위치 75의 아미노산은 T 또는 S

인 것을 특징으로 하는 항체.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, VH 도메인 인간 수용체 프레임워크 서열은 어떠한 역돌연변이도 없는 것을 특징으로 하는 항체.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, VH 도메인은 SEQ ID NO:5의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO:4의 잔기 24-34에 대응하는 CDR-L1, SEQ ID NO:4의 잔기 50-56에 대응하는 CDR-L2, 및 SEQ ID NO:4의 잔기 89-97에 대응하는 CDR-L3를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, VL 도메인 인간 수용체 프레임워크는 SEQ ID NO:4를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
(a) SEQ ID NO:4의 잔기 24-34에 대응하는 CDR-L1;

(b) SEQ ID NO:4의 잔기 50-56에 대응하는 CDR-L2;

(c) SEQ ID NO:4의 잔기 89-97에 대응하는 CDR-L3;

(d) SEQ ID NO:5의 잔기 31-35에 대응하는 CDR-H1;

(e) SEQ ID NO:5의 잔기 95-102에 대응하는 CDR-H3; 및

(f) SEQ ID NO:5의 잔기 50-59에 대응하는 CDR-H2; 및

(g) 인간 수용체 프레임워크 서열;

을 포함하며, CDR-H2 내의 잔기 60-65는 VH 인간 수용체 서열의 것이고, 이 인체적응형 항체는 CD94/NKG2A-발현 NK 세포의 세포독성 활성을 강화하는데 있어서 SEQ ID NO:1에 대응하는 가변 경쇄(VL) 서열 및 SEQ ID NO:2에 대응하는 VH 서열을 포함하는 항체보다 더욱 효과적인, NKG2A에 특이적으로 결합하는 항체.
비인간 CDR 잔기 및 인간 VH 수용체 프레임워크 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 항체로서, VH 도메인이 SEQ ID NO:5의 잔기 31-35에 대응하는 CDR-H1, SEQ ID NO:5의 잔기 50-65에 대응하는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO:5의 잔기 95-102에 대응하는 CDR-H3를 포함하는, NKG2A에 특이적으로 결합하는 항체.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 IgG4 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 항체 절편 또는 다특이적 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
제1항 내지 제12항 중의 어느 한 항의 항 NKG2A 항체를 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하여 핵산을 발현시키고 항체를 생산하는 단계를 포함하는, 항-NKG2A 항체를 생산하는 방법.
제1항 내지 제12항 중의 어느 한 항의 항체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.
제14항의 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 암, 바이러스 질병, 염증 질환, 및 자가면역 질환으로부터 선택된 질환을 겪고 있는 인간 환자를 치료하는 방법.