BRPI0712953B1 - Anticorpos anti-nkg2a, seu uso, e composição farmacêutica - Google Patents

Anticorpos anti-nkg2a, seu uso, e composição farmacêutica Download PDF

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Soren Berg Padkaer
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Abstract

anticorpos anti-nkg2a e suas utilizações. são aqui descritas anticorpos anti-nkg2a adequados à terapia humana, incluindo versões humanizadas do anticorpo anti-nkg2a z270 mu-rídeo, além de métodos e materiais relacionados para a produção e utilização destes anticorpos. também são descritas seqüências e sítios de regiões determinantes de complementaridade (cdrs) exemplares para retro- substituições de aminoácidos opcionais na região estrutural (fr) e/ou cdrs desses anticorpos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para ANTICORPOS ANTI-NKG2A, SEU USO, E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA. CAMPO DA INVENÇÃO [0001] A presente invenção refere-se aos anticorpos anti-NKG2A, em particular às versões humanizadas do anticorpo murino antiNKG2A Z270, além de métodos de produção e uso destes anticorpos. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [0002] CD94/NKG2A é um receptor inibidor de citotoxicidade encontrado em subconjuntos de células NK, NKT e T, que restringe sua morte de células que expressam o HLA-E CD94/NKG2A-ligante (veja, por exemplo, WO 99/28748). Os anticorpos que inibem CD94/NKG2A podem aumentar a atividade citolítica de linfócitos tumor-específicos contra células tumorais. Portanto, anticorpos terapêuticos que inibem CD94/NKG2A em pacientes com câncer, sem matar as células que expressam CD94/NKG2A, podem ser capazes de controlar o crescimento tumoral. Além disso, certos linfomas como, por exemplo, linfomas NK, são caracterizados por expressão de CD94/ NKG2A. Nesses pacientes, os anticorpos terapêuticos que se dirigem e matam células que expressam CD94/NKG2A podem ser capazes de erradicar as células tumorais. Também foi sugerido o uso de anticorpos anti-NKG2A no tratamento de doenças autoimunes ou inflamatórias (veja, por exemplo, U.S. 20030095965A1, WO 2006070286).
[0003] Vários anticorpos contra CD94/NKG2A foram descritos na técnica. Por exemplo, Sivori et al. (Eur. J. Immunol. 1996; 26: 2.487-92) referem-se ao anticorpo murino anti-NKG2A Z270; Carretero et al. (Eur. J. Immunol. 1997; 27: 563-7) descrevem o anticorpo anti-NKG2A murino Z199 (agora disponível comercialmente por Beckman Coulter, Inc., N° do Produto IM2750, EUA); Vance et al. (J. Exp. Med. 1999; 190: 1.801-12) referem -se ao anticorpo anti-NKG2 murino 20D5 (agora disponível comercialmente por BD Biosciences Pharmingen, N° de
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Catálogo 550518, EUA); e a publicação do pedido de patente U.S. 20030095965 descreve o anticorpo murino 3S9, que aparentemente se liga a NKG2A, NKG2C e NKG2E.
[0004] Os anticorpos anti-CD94/NKG2A disponíveis atualmente são de origem não humana, o que os torna inadequados para a maioria das aplicações terapêuticas em seres humanos em função de sua imunogenicidade. Embora estejam disponíveis abordagens de humanização simples como, por exemplo, enxerto de CDR, tipicamente são necessárias abordagens de humanização individualizadas para se obter uma variante humanizada ótima que minimize a imunogenicidade ao mesmo tempo em que retenha ou melhore suficientemente as propriedades funcionais. Consequentemente, há a necessidade de anticorpos anti-CD94/NKG2A que sejam adequados ao tratamento de pacientes humanos.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO [0005] A presente invenção fornece anticorpos anti-NKG2A, além de composições que compreendem estes anticorpos, e métodos de produção e utilização destes anticorpos. Em uma modalidade, o anticorpo é uma versão humanizada do anticorpo murino anti-NKG2A Z270, aqui denominada humZ270. Em outra modalidade, o anticorpo é uma versão humanizada de um anticorpo anti-NKG2A que possui domínios da cadeia pesada variável (VH) e/ou da cadeia leve variável (VL) substancialmente idênticos àqueles de Z270.
[0006] São fornecidos resíduos exemplares da região determinante de complementaridade (CDR) e/ou sítios para substituições de aminoácidos na região estrutural (FR) e/ou destes anticorpos para a produção de anticorpos que possuem propriedades aprimoradas como, por exemplo, menor imunogenicidade, propriedade de ligação de antígeno ou outras propriedades funcionais aprimoradas e/ou propriedades físico-químicas aprimoradas como, por exemplo, melhor estabili
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3/124 dade. Em um aspecto, a invenção fornece anticorpos humanizados nos quais pelo menos uma porção de uma CDR de Kabat é idêntica à porção correspondente na sequência receptora humana. Em uma modalidade, a sequência estrutural receptora humana não compreende nenhuma substituição de aminoácidos ou retromutações. Em outra modalidade, a sequência estrutural humana compreende pelo menos uma substituição de aminoácido. As posições de Kabat para essas substituições de aminoácidos exemplares incluem 5, 66, 67, 69, 71,73 e 75 na região estrutural do domínio de VH, 46 e 48 na região estrutural do domínio de VL, e 60, 63, 64 e 65 na CDR-H2.
[0007] Em outros aspectos, a invenção fornece composições farmacêuticas que compreendem esses anticorpos e um veículo, e imunoconjugados que compreendem estes anticorpos conjugados a um agente citotóxico ou detectável.
[0008] Em outros aspectos, a invenção fornece ácidos nucleicos e vetores que codificam esses anticorpos, e células hospedeiras que contêm esses ácidos nucleicos e/ou vetores. Também são fornecidos métodos recombinantes de produção de anticorpos anti-NKG2A por cultivo dessas células hospedeiras de tal forma que sejam produzidos ácidos nucleicos.
[0009] Em outros aspectos, a invenção fornece artigos manufaturados que compreendem um recipiente que compreende esses anticorpos anti-NKG2A e instruções que informam um usuário sobre o tratamento de um distúrbio como, por exemplo, câncer ou uma doença viral em um paciente. Opcionalmente, o artigo pode compreender outro recipiente que contém outro agente, em que as instruções informam o usuário sobre o tratamento do distúrbio com o anticorpo em combinação com o agente.
[00010] A invenção também fornece métodos de utilização desses anticorpos anti-NKG2A no tratamento de distúrbios como, por exem
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4/124 plo, câncer, uma doença viral, um distúrbio inflamatório ou um distúrbio autoimune em um paciente, opcionalmente em conjunto com outro agente anticâncer, doença anti-viral ou agente antiinflamatório. DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [00011] A figura 1 mostra um alinhamento de Z270VL e Z270VH com segmentos V e J de uma linhagem germinativa selecionada e sequências de humZ270VL1 (SEQ ID N°: 4) e humZ270VH1 (SEQ ID N°: 5) exemplares, com numeração de resíduos de aminoácidos de acordo com o esquema de Kabat (Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD). Os resíduos de máscara estão sombreados no esquema de Kabat; os resíduos da CDR são mostrados em negrito no esquema de Kabat; as diferenças de camundongo/linhagem germinativa estão sombreadas nas sequências VKI_02/JK4 (SEQ ID N°: 9) e VH1_18/JH6 (SEQ ID N°: 10); e os resíduos da retromutação potencial estão sombreados nas sequências de humZ270VH/VL. As retromutações potenciais identificadas na VL foram L46F e I48V. As retromutações potenciais identificadas na cadeia pesada foram V5Q, M69L, T71V, T73K e T75S. Também são mostradas as sequências de consenso de humZ270VL (humZ270VL1 cons; SEQ ID N°: 6) e humZ270VH1 (humZ270VH1 cons; SEQ ID N°: 7) resultantes. Em humZ270VL1 cons, o aminoácido na posição 46 é L ou F, e o aminoácido na posição 48 é I ou V. Em humZ270VH1 cons, o aminoácido na posição 5 é V ou Q; o aminoácido na posição 69 é M ou L; o aminoácido na posição 71 é T ou V; o aminoácido na posição 73 é T ou K; e/ou o aminoácido na posição 75 é T ou S. Em um humZ270VH1 alternativo, humZ270VH1cons2 (SEQ ID N°: 8), o aminoácido na posição 5 é V ou Q; o aminoácido na posição 60 é S ou A; o aminoácido na posição 63 é L ou F; o aminoácido na posição 64 é Q ou K; o aminoácido na posição 65 é G ou D; o aminoácido na posição
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5/124 é R ou K; o aminoácido na posição 67 é V ou A; o aminoácido na posição 69 é M ou L; o aminoácido na posição 71 é T ou V; o aminoácido na posição 73 é T ou K; e/ou o aminoácido na posição 75 é T ou
S.
[00012] A figura 2 mostra as CDRs de um anticorpo humZ270 exemplar, de acordo com as definições de Kabat. As diferenças, em comparação com CDRs de Z270 murino, são mostradas em negrito.
[00013] As figuras 3A-H mostram plasmídeos citados nos Exemplos. (A) Mapa do vetor pMD19-T para clonagem de TA. (B) Mapa do vetor de clonagem pJSV002 para expressão transitória. (C) A cadeia leve é inserida em pJSV002 com região constante capa murina. (D) Variante pJSV002-mIgG1 que contém a região constante de IgG1 murina. (E) H1 de Z270 pJSV002-mIgG1 que contém a região variável da cadeia pesada de Z270 e região constante da cadeia pesada de IgG1. (F) L11 de Z270 pJSV002-hCapa que contém região variável da cadeia leve e a região constante da cadeia capa humana. (G) pJSV002IgG4-S241P. (H) pJSV002-IgG4-S241P Z270H1.
[00014] A figura 4 mostra diferentes sequências derivadas ou baseadas em Z270, (A) a (J), SEQ ID Nos: 14-23, respectivamente. Veja os Exemplos 2-5 para mais detalhes.
[00015] A figura 5 mostra um design exemplar de um vetor para a expressão de cadeias pesadas de Z270 humanizado.
[00016] A figura 6 mostra um design exemplar de um vetor para a expressão de cadeias leves de Z270 humanizado.
[00017] A figura 7 mostra uma descrição exemplar de um procedimento para a expressão transitória de anticorpos Z270 humanizados em células HEK293.
[00018] A figura 8 mostra um ensaio Biacore exemplar para determinar a afinidade de ligação de humZ270 pelo antígeno.
[00019] A figura 9 mostra determinações de afinidade de Z270 quiPetição 870190106907, de 22/10/2019, pág. 10/136
6/124 mérico (A) e humZ270VL1/VH1 (B).
[00020] A figura 10 mostra determinação da afinidade de humZ270VL1/ VH1, que possui diferentes retromutações na cadeia leve ou na cadeia pesada. Z270 quimérico foi usado como comparação.
[00021] A figura 11 mostra a estratégia para enxerto de CDR padrão de CDRs de Z270 murino de Kabat H1-H3 em uma estrutura central receptora de cadeia pesada VH1_18/JH6, sem (humZ270H3) ou com (humZ270VH4) retromutações.
[00022] A figura 12 mostra um alinhamento entre constructos de humZ270VH em diferentes sequências receptoras humanas, todas com uma porção de CDR-H2 parcialmente humana.
[00023] A figura 13 mostra os resultados da avaliação da afinidade por Biacore de variantes de humZ270 VL1/VH1 e VH3-VH8, todos normalizados para a KD de hZ270VL1/VH1.
[00024] A figura 14 mostra os resíduos selecionados para mutagênese por varredura de alanina para identificar resíduos do paratopo críticos nos segmentos VL e VH de Z270.
[00025] A figura 15 mostra os resultados da avaliação da afinidade por Biacore de mutantes de alanina Z270VH, normalizados para a ligação de Z270 quimérico.
[00026] A figura 16 mostra os resultados da avaliação da afinidade por Biacore de mutantes de alanina Z270VL, normalizados para a ligação de Z270 quimérico.
[00027] A figura 17 mostra a ligação de diversas variantes de Z270 recombinante às células Ba/F3 que superexpressam estavelmente CD94/NKG2A ou CD94/NKG2C, com a utilização de citometria de fluxo.
[00028] A figura 18 mostra os resultados de um ensaio para avaliar a habilidade de Z270 recombinante, Z270 quimérico,
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7/124 humZ270VL1/VH1 e Z199 para induzir a morte de células LCL 721.221-Cw3 marcadas com 51Cr por células NKL CD94/NKG2A+, que mostram que humZ270VL1/VH1 foi mais eficiente na indução de morte.
[00029] A figura 19 mostra que humZ270VL1/VH1 se liga eficientemente às células Ba/F3-CD94/NKG2A de uma forma dependente da concentração (diamantes). No entanto, quando as células foram préincubadas com tetrâmeros de HLA-E, humZ270VL1/VH1 foi impedida de se ligar às células Ba/F3-CD94/NKG2A (quadrados).
[00030] A figura 20 mostra que duas preparações diferentes de humZ270VL1/VH1 e uma variante de humZ270 com uma mutação V5Q em VH se ligam às células que expressam CD94/NKG2A, mas não às que expressam CD94/NKG2C, embora a variante V5Q ligeiramente menos eficientemente.
DEFINIÇÕES [00031] O termo anticorpo é aqui usado em seu sentido mais amplo e inclui especificamente anticorpos monoclonais de comprimento total, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) e fragmentos de anticorpo, desde que exibam a atividade biológica desejada. Várias técnicas relevantes para a produção de anticorpos são fornecidas, por exemplo, em Harlow, et al., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1988).
[00032] Um fragmento de anticorpo compreende uma porção de um anticorpo de comprimento total, de preferência regiões de ligação de antígeno ou variáveis deste. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem fragmentos Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, F(ab)3, Fv (tipicamente os domínios de VL e VH de um braço simples de um anticorpo), Fv de cadeia simples (scFv), dsFv, fragmentos Fd (tipicamente o domínio de VH e CH1) e dAb (tipicamente um domínio de VH); domínios de VH,
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VL, VhH, e V-NAR; minibodies, diabodies, triabodies, tetrabodies e corpos capa (veja, por exemplo, Ill et al., Protein Eng. 1997; 10: 94957); IgG de camelo; IgNAR; e fragmentos multiespecíficos de anticorpo formados a partir de fragmentos de anticorpo, e uma ou mais CDRs isoladas ou um paratopo funcional, em que as CDRs isoladas ou os resíduos ou polipeptídeos de ligação de antígeno podem estar associados ou ligados em conjunto de modo a formar um fragmento funcional de anticorpo. Foram descritos ou revisados vários tipos de fragmentos de anticorpo, por exemplo, em Holliger e Hudson, Nat. Biotechnol. 2005; 23, 1.126-1.136; WO 2005040219, e Pedidos de Patente U.S. publicados 20050238646 e 20020161201.
[00033] O termo derivado de anticorpo, como aqui usado, compreende um anticorpo de comprimento total ou um fragmento de um anticorpo, que compreende, de preferência, pelo menos regiões de ligação de antígeno ou variáveis deste, em que um ou mais dos aminoácidos são modificados quimicamente, por exemplo, por alquilação, PEGuilação, acilação, formação de éster ou formação de amida, ou semelhantes, por exemplo, para ligação do anticorpo a uma segunda molécula. Isso inclui, sem limitação, anticorpos PEGuilados, anticorpos cisteína-PEGuilados, e variantes destes.
[00034] Um imunoconjugado compreende um derivado de anticorpo associado ou ligado a um segundo agente, por exemplo, um agente citotóxico, um agente detectável etc.
[00035] Um anticorpo humanizado é um anticorpo quimérico humano/não humano que contém uma sequência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Na maior parte, anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor) nas quais resíduos de uma região hipervariável do receptor são substituídos por resíduos de uma região hipervariável de uma espécie não humana (anticorpo doador) como, por exemplo, de camundongo, rato, coelho ou primata
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9/124 não humano, que possuem a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns casos, resíduos da região estrutural (FR) da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Além disso, anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ou no anticorpo doador. Essas modificações são feitas para refinar ainda mais o desempenho do anticorpo. Em geral, um anticorpo humanizado compreenderá substancialmente tudo de pelo menos um e, tipicamente, dois, domínios variáveis, em que todas, ou substancialmente todas, as alças hipervariáveis correspondem àquelas de uma imunoglobulina não humana, e todos, ou substancialmente todos, os resíduos FR são aqueles de uma sequência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado também pode opcionalmente compreender pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Para mais detalhe, veja, por exemplo, Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332: 323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992), WO 92/02190, Pedido de Patente U.S. 20060073137 e Patentes U.S. 6.750.325, 6.632.927, 6.639.055, 6.548.640,
6.407.213, 6.180.370, 6.054.297, 5.929.212, 5.895.205, 5.886.152,
5.877.293, 5.869.619, 5.821.337, 5.821.123, 5.770.196, 5.777.085,
5.766.886, 5.714.350, 5.693.762, 5.693.761, 5.530.101, 5.585.089 e
5.225.539.
[00036] O termo região hipervariável, quando aqui utilizado, refere-se aos resíduos de aminoácidos de um anticorpo que são responsáveis pela ligação de antígeno. A região hipervariável geralmente compreende resíduos de aminoácidos de uma região determinante de complementaridade ou CDR (resíduos 24-34 (L1), 50-56 (L2) e 8997 (L3) no domínio variável da cadeia leve e 31-35 (H1), 50-65 (H2) e 95-102 (H3) no domínio variável da cadeia pesada; Kabat et al. 1991,
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10/124 supra) e/ou aqueles resíduos de uma alça hipervariável (resíduos 2632 (L1), 50-52 (L2) e 91-96 (L3) no domínio variável da cadeia leve e 26-32 (H1), 53-55 (H2) e 96-101 (H3) no domínio variável da cadeia pesada; Chothia e Lesk, J. Mol. Biol. 1987; 196: 901-917). Tipicamente, a numeração dos resíduos de aminoácidos nessa região é realizada pelo método descrito em Kabat et al., supra. As frases posição de Kabat, com o uso da numeração de Kabat, numeração do resíduo do domínio variável como em Kabat e de acordo com Kabat aqui utilizadas referem-se a esse sistema de numeração para domínios variáveis da cadeia pesada ou domínios variáveis da cadeia leve. Com a utilização do sistema de numeração de Kabat, a sequência de aminoácidos linear real de um peptídeo pode conter menos aminoácidos ou aminoácidos adicionais que correspondem a um encurtamento, ou inserção, em uma FR ou CDR do domínio variável. Por exemplo, um domínio variável da cadeia pesada pode incluir uma única inserção de aminoácido (resíduo 52a de acordo com Kabat) após o resíduo 52 de CDR H2 e resíduos inseridos (por exemplo, resíduos 82a, 82b e 82c etc. de acordo com Kabat) após o resíduo 82 da FR da cadeia pesada. A numeração de resíduos de acordo com Kabat pode ser determinada para certo anticorpo por alinhamento em regiões de homologia da sequência do anticorpo com uma sequência numerada por Kabat padronizada. A menos que indicado de forma diferente ou que o contexto indique o contrário, a posição de todos os resíduos de aminoácidos em uma sequência de VL ou VH aqui descrita está de acordo com Kabat.
[00037] Resíduos da região estrutural ou FR são aqueles resíduos de VH ou VL diferentes das CDRs aqui definidas.
[00038] Uma variante de um polipeptídeo refere-se a um polipeptídeo que possui uma sequência de aminoácidos que é substancialmente idêntica a um polipeptídeo de referência, tipicamente um poli
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11/124 peptídeo nativo ou parente. A variante de polipeptídeo pode possuir uma ou mais substituições, eliminações e/ou inserções de aminoácidos em certas posições dentro da sequência de aminoácidos nativa. [00039] Substituições de aminoácidos conservadoras são aquelas nas quais um resíduo de aminoácido é substituído com um resíduo de aminoácido que possui uma cadeia lateral com propriedades físicoquímicas similares. Famílias de resíduos de aminoácidos que possuem cadeias laterais similares são conhecidas na técnica, e incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptofano), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina).
[00040] O termo substancialmente idênticas, no contexto de duas sequências de aminoácidos, significa que as sequências, quando otimamente alinhadas, por exemplo, pelos programas GAP ou BESTFIT com a utilização das ponderações de lacuna padronizadas, compartilham pelo menos cerca de 50, pelo menos cerca de 60, pelo menos cerca de 70, pelo menos cerca de 80, pelo menos cerca de 90, pelo menos cerca de 95, pelo menos cerca de 98, ou pelo menos cerca de 99 por cento de identidade de sequência. Em uma modalidade, as posições de resíduos que não sãa IDênticas diferem em substituições de aminoácidos conservadoras. A identidade de sequência é medida tipicamente com a utilização de um software de análise de sequências. O software de análise de proteínas combina sequências similares usando medidas de similaridade atribuídas a várias substituições, eliminaPetição 870190106907, de 22/10/2019, pág. 16/136
12/124 ções e outras modificações, incluindo substituições de aminoácidos conservadoras. Por exemplo, o software GCG disponível publicamente contém programas como, por exemplo, Gap e BestFit, que podem ser usados com parâmetros padronizados para determinar a homologia de sequência ou a identidade de sequência entre polipeptídeos intimamente relacionados como, por exemplo, polipeptídeos homólogos de diferentes espécies de organismos ou entre uma proteína do tipo selvagem e uma muteína desta. Veja, por exemplo, GCG Versão 6.1. As sequências de polipeptídeos também podem ser comparadas com a utilização de FASTA ou ClustalW, aplicando-se os parâmetros padronizados ou recomendados. Um programa em GCG Versão 6.1., FASTA (por exemplo, FASTA2 e FASTA3), fornece alinhamentos e percentual de identidade de sequência das regiões da melhor superposição entre as sequências examinadas e pesquisadas (Pearson, Methods Enzymol. 1990; 183: 63-98; Pearson, Methods Mol. Biol.
2000; 132: 185-219). Outro algoritmo preferido na comparação de uma sequência com uma base de dados contendo um número elevado de sequências de vários organismos, ou na sua dedução, é o programa de computador BLAST, especialmente blastp, com o uso dos parâmetros padronizados. Veja, por exemplo, Altschul et al., J. Mol. Biol. 1990; 215: 403-410; Altschul et al., Nucleic Acids Res. 1997; 25: 3.389-402 (1997); cada um deles aqui incorporado por referência. Posições de aminoácidos correspondentes em duas sequências de aminoácidos substancialmente idênticas são aquelas alinhadas por qualquer um dos softwares de análise de proteínas aqui mencionados, tipicamente com o uso dos parâmetros padronizados.
[00041] Um anticorpo que possui uma característica biológica de um anticorpo de referência, (por exemplo, Z270), é aquele que possui uma ou mais das características biológicas daquele anticorpo que o distinguem de outros anticorpos que se ligam ao mesmo antígeno (por exem
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13/124 plo, NKG2A). Por exemplo, um anticorpo com uma característica biológica de Z270 pode bloquear a ativação de NKG2A e/ou competir de forma cruzada com Z270 na ligação do domínio extracelular de NKG2A.
[00042] NKG2A (OMIM 161555, cuja descrição completa é aqui incorporada por referência) é um membro do grupo de transcritos de NKG2 (Houchins, et al. (1991) J. Exp. Med. 173: 1.017-1.020). NKG2A é codificada por 7 éxons que se estendem por 25 kb, que mostram alguma união diferencial. NKG2A é um receptor inibidor encontrado na superfície de subconjuntos de células NK, células T α/β, células T γ/δ e células NKT. Como receptores inibidores KIR, ela possui um ITIM em seu domínio citoplasmático. Como aqui usado, o termo NKG2A refere-se a qualquer variante, derivado ou isoforma do gene NKG2A ou proteína codificada. Também são englobadas quaisquer sequências de ácidos nucleicos ou de proteínas que compartilham uma ou mais propriedades biológicas ou funções com NKG2A do tipo selvagem, de comprimento total, e que compartilham pelo menos 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de nucleotídeos ou de aminoácidos. A NKG2A humana compreende 233 aminoácidos em 3 domínios, com um domínio citoplasmático que compreende os resíduos 1-70, uma região transmembrana que compreende os resíduos 71-93 e uma região extracelular que compreende os resíduos 94-233, da seguinte sequência:
MDNQGVIYSDLNLPPNPKRQQRKPKGNKSSILATEQEITYAELNLQKASQDFQGNDKTYHCKDLPSAPEKLIVGILGIICLILMASVVTIVVIPSTLIQRHNNSSLNTRTQKARHCGHCPEEWITYSNSCYYIGKERRTWEESLLACTSKNSSLLSIDNEEEMKFLSIISPSSWIGVFRNSSHHPWVTMNGLAFKHEIKDSDNAELNCAVLQVNRLKSAQCGSSIIYHCKHKL (SEQ ID N°: 11)
NKG2C (OMIM 602891, cuja descrição completa é aqui incorporada por referência) e NKG2E (OMIM 602892, cuja descrição
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14/124 completa é aqui incorporada por referência) são dois outros membros do grupo de transcritos de NKG2 (Gilenke, et al. (1998) Immunogenetics 48: 163-173). NKG2C e NKG2E são receptores de ativação encontrados na superfície de células NK.
[00043] HLA-E (OMIM 143010, cuja descrição completa é aqui incorporada por referência) é uma molécula MHC não clássica que é expressa na superfície celular e regulada pela ligação de peptídeos derivados da sequência sinalizadora de outras moléculas MHC da classe I. HLA-E se liga as células destruidoras naturais (NK) e a algumas células T, ligando-se especificamente a CD94/NKG2A, CD94/NKG2B e CD94/NKG2C (veja, por exemplo, Braud et al. (1998) Nature 391: 795-799, cuja descrição completa é aqui incorporada por referência). A expressão de superfície de HLA-E é suficiente para proteger as células-alvo da lise por clones de células CD94/NKG2A+ NK, T ou NKT. Como aqui usado, o termo HLA-E refere-se a qualquer variante, derivado ou isoforma do gene HLA-E ou proteína codificada. Também são englobadas quaisquer sequências de ácidos nucleicos ou de proteínas que compartilham uma ou mais propriedades biológicas ou funções com HLA-E do tipo selvagem, de comprimento total, e que compartilham pelo menos 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de nucleotídeos ou aminoácidos.
[00044] Um ácido nucleico está ligado operacionalmente quando ele está colocado em um relacionamento funcional com outra sequência de ácidos nucleicos. Por exemplo, o DNA para uma pré-sequência ou líder secretor está ligado operacionalmente ao DNA para um polipeptídeo caso ele seja expresso como uma pré-proteína que participa da secreção do polipeptídeo; um promotor ou intensificador está ligado operacionalmente a uma sequência codificadora caso ele afete a transcrição da sequência; ou um sítio de ligação de ribossomo está ligado operacionalmente a uma sequência codificadora caso esteja
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15/124 posicionado de forma a facilitar a tradução. Geralmente, ligado operacionalmente significa que as sequências de DNA que estão sendo ligadas são contíguas e, no caso de um líder secretor, contíguas e em fase de leitura. No entanto, intensificadores não precisam ser contíguos. A ligação é obtida por ligação em sítios de restrição convenientes. Caso tais sítios não existam, são usados adaptadores ou vinculadores de oligonucleotídeos sintéticos de acordo com a prática convencional.
[00045] Uma molécula isolada é uma molécula que é a espécie predominante na composição em que é encontrada com relação à classe de moléculas à qual pertence (ou seja, ela constitui pelo menos cerca de 50% do tipo de molécula na composição e, tipicamente, constituirá pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, ou mais da espécie de molécula, por exemplo, peptídeo, na composição). Comumente, uma composição de uma molécula de anticorpo exibirá 98%, 98% ou 99% de homogeneidade para as moléculas de anticorpo no contexto de todas as espécies de peptídeos presentes na composição, ou pelo menos com relação à espécie de peptídeo substancialmente ativa, no contexto do uso proposto.
[00046] No contexto da presente invenção, tratamento ou que trata refere-se à prevenção, ao alívio, ao gerenciamento, à cura ou à redução de um ou mais sintomas ou manifestações clinicamente relevantes de uma doença ou um distúrbio, a menos que definido de forma diferente pelo contexto. Por exemplo, o tratamento de um paciente no qual nenhum sintoma ou manifestação clinicamente relevante de uma doença ou distúrbio foi identificado, consiste em uma terapia preventiva ou profilática, enquanto o tratamento de um paciente no qual sintomas ou manifestações clinicamente relevantes de uma doença ou distúrbio foram identificados geralmente não constitui terapia preventiPetição 870190106907, de 22/10/2019, pág. 20/136
16/124 va ou profilática.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [00047] A presente invenção diz respeito a anticorpos que se ligam a NKG2A. Em um aspecto, o anticorpo é uma versão humanizada do anticorpo Z270, que é um anticorpo monoclonal murino que se liga especificamente a NKG2A, mas não a NKG2C ou NKG2E humana. Z270 pode bloquear a função de CD94/NKG2A humana, e especificamente induz morte de células por linfócitos restritos por CD94/NKG2A de uma forma dependente da concentração.
[00048] A invenção fornece, por exemplo, variantes de humZ270 nas quais pelo menos uma porção de uma CDR de VH como, por exemplo, a CDR-H2, é idêntica à porção correspondente da sequência receptora de VH humana reduzindo, dessa forma, a imunogenicidade do anticorpo humanizado. Surpreendentemente, estas variantes humanizadas podem ser mais eficazes na potencialização da citotoxicidade de um linfócito citotóxico que expressa CD94/NKG2A do que o Z270 murino ou uma forma quimérica de Z270. Em outros aspectos, a invenção fornece anticorpos que possuem CDRs que compreendem certos resíduos de ligação de antígeno que correspondem àqueles no anticorpo Z270 murino, e sequências estruturais humanas. Esses e outros aspectos serão descritos com mais detalhe nas seções seguintes e nos Exemplos.
Anticorpos anti-NKG2A humanizados [00049] Foram descritos na técnica métodos para a humanização de anticorpos não humanos. Geralmente, em um processo de humanização, os nucleotídeos que codificam as regiões de interação de um anticorpo murino podem ser clonados em um vetor de cDNA que codifica IgG humana, o que pode ser feito de tal forma que seja gerado um anticorpo quimérico que consiste em uma estrutura principal de IgG humana que abriga CDRs murinas. Estes anticorpos quiméricos po
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17/124 dem exibir uma menor afinidade, menor estabilidade ou outras características indesejadas, em comparação com o anticorpo murino original, e também podem ser imunogênicos. Portanto, aminoácidos individuais no Ab quimérico podem ter que ser otimizados para a obtenção de um mAb funcional de alta qualidade para aplicações terapêuticas em seres humanos.
[00050] Tipicamente, um anticorpo humanizado possui um ou mais resíduos de aminoácidos nele introduzidos a partir de uma fonte que seja não humana. Esses resíduos de aminoácidos não humanos são frequentemente denominados resíduos importados, que são tipicamente retirados de um domínio variável importado. A humanização pode ser realizada basicamente seguindo o método de Winter et al. (Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1.534-1.536 (1988)), substituindo sequências da região hipervariável pelas sequências correspondentes de um anticorpo humano receptor. Consequentemente, estes anticorpos humanizados são anticorpos quiméricos (Patente U.S. N° 4.816.567) nos quais substancialmente menos de um domínio variável humano intacto foi substituído pela sequência correspondente de uma espécie não humana. Na prática, anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos nos quais alguns resíduos da região hipervariável e possivelmente alguns resíduos FR são substituídos por resíduos de sítios análogos em anticorpos de roedores.
[00051] Outro método para a produção de anticorpos humanizados é descrito na publicação do pedido de patente U.S. 2003/0017534, em que são produzidos anticorpos humanizados e preparações de anticorpo a partir de animais não humanos transgênicos. Os animais não humanos são projetados geneticamente para conter um ou mais locais de imunoglobulina humanizada que são capazes de passar por um rearranjo gênico e por uma conversão gênica nos animais não huma
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18/124 nos transgênicos, para a produção de imunoglobulinas humanizadas diversificadas.
[00052] A escolha de domínios variáveis humanos, tanto leves quanto pesados, para serem usados na produção dos anticorpos humanizados é muito importante para reduzir a antigenicidade. De acordo com o chamado método best-fit, a sequência do domínio variável de um anticorpo de roedor é testada contra uma biblioteca de sequências conhecidas do domínio variável humano ou contra uma biblioteca de sequências da linhagem germinativa humana. A sequência humana mais próxima daquela do roedor pode então ser aceita como uma região estrutural humana para o anticorpo humanizado (Sims et al., J. Immunol. 1993; 151: 2.296 et seq.; Chothia et al., Chothia e Lesk, J. Mol. Biol. 1987; 196: 901-917). Outro método utiliza uma região estrutural específica derivada da sequência de consenso de todos os anticorpos humanos de um subgrupo específico de cadeias leves ou pesadas. A mesma estrutura central pode ser usada para vários anticorpos humanizados diferentes (Carter et al., PNAS USA, 1992; 89: 4.285 et seq.; Presta et al., J. Immunol. 1993; 151: 2.623 et seq.). Outros métodos projetados para reduzir a imunogenicidade da molécula de anticorpo em um paciente humano incluem anticorpos embutidos (veja, por exemplo, a Patente U.S. 6.797.492 e publicações de Pedido de Patente U.S. 20020034765 e 20040253645) e anticorpos que foram modificados por análise e remoção de epitopo de célula T (veja, por exemplo, publicações de Pedido de Patente U.S. 20030153043 e Patente U.S. N° 5.712.120).
[00053] É importante ainda que os anticorpos sejam humanizados com retenção da alta afinidade pelo antígeno e de outras propriedades biológicas favoráveis. Para atingir esse objetivo, de acordo com um método preferido, os anticorpos humanizados são preparados por um processo de análise das sequências parentais e de vários produtos
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19/124 humanizados conceituais com a utilização de modelos tridimensionais das sequências parentais e humanizadas. Modelos tridimensionais de imunoglobulina são comumente disponíveis, e são familiares àqueles versados na técnica. Há programas de computador disponíveis que ilustram e exibem estruturas conformacionais tridimensionais prováveis de sequências de imunoglobulina candidatas selecionadas. A inspeção dessas exibições permite a análise do papel provável dos resíduos no funcionamento da sequência de imunoglobulina candidata, ou seja, a análise de resíduos que influenciam a habilidade da imunoglobulina candidata de se ligar ao seu antígeno. Dessa forma, resíduos FR podem ser selecionados e combinados a partir das sequências receptoras e importados de tal forma que as características desejadas do anticorpo, por exemplo, afinidade aumentada pelo(s) antígeno(s)alvo, sejam obtidas. Em geral, os resíduos da região hipervariável estão diretamente e mais substancialmente envolvidos na influência da ligação de antígeno.
[00054] O Exemplo 1 abaixo descreve o design de anticorpos humanizados anti-NKG2A exemplares que se ligam a NKG2A, e a análise é, pelo menos em parte, ilustrada na figura 1. Como mostrado na figura 1, em um anticorpo humZ270 da invenção, a porção do terminal C de CDR-H2 (que corresponde aos resíduos 61-65 de Kabat) é idêntica à porção correspondente da sequência receptora humana. Além disso, como descrito na legenda da figura, uma sequência de humZ270VL (SEQ ID N°: 4) pode opcionalmente compreender mutações em um ou em ambos os resíduos FR L46 e I48 indicados, e uma sequência de humZ270VH (SEQ ID N°: 5) pode opcionalmente compreender mutações em um ou mais dos resíduos FR V5, M69, T71, T73 e T75 indicados, com numeração de aminoácidos de acordo com Kabat. A Tabela 1 descreve variantes de humZ270VL e humZ270VH exemplares que compreendem retromutações humanas para murinas exemplares nas
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20/124 sequências FR de humZ270VH e humZ270VL, além de combinações exemplares de mutações de FR. Na Tabela 1 e em outras partes desse relatório descritivo, as posições de aminoácidos são designadas de acordo com Kabat, nas quais os aminoácidos V5, M69, T71, T73 e T75 no domínio de humZ270VH correspondem aos aminoácidos V5, M70, T72, T74 e T76 na SEQ ID N°: 5, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 8, ou outras sequências de humZ270VH exemplares aqui descritas.
Tabela 1 [00055] Variantes de humZ270VL e humZ270VH que compreendem retromutações de FR exemplares em sequências de humZ270VL (SEQ ID N°: 4 ou 6) e/ou humZ270VH (SEQ ID N°: 5, 7 ou 8) nativas ou de consenso.
Variantes de humZ270VL Variantes de humZ270VH
Nenhuma L46F I48V L46F e I48V Nenhuma V5Q M69L T71V T73K
T75S V5Q e M69L
V5Q e T71V V5Q e T73K V5Q e T75S M69L e T71V M69L e T73K M69L e T75S T71VeT73K T71VeT75S T73K e T75S V5Q, T73K e T75S V5Q, T71V e T75S V5Q, T71V e T73K V5Q, M69L e T75S V5Q, M69L e T73K V5Q, M69L e T71V T71V, T73K e T75S M69L, T73K e T75S M69L, T71V e T75S, M69L, T71V e T73K, V5Q, M69L, T71V e T73K, V5Q, M69L, T71V e T75S, V5Q, M69L, T73K e T75S, V5Q, T71V, T73K e T75S, M69L, T71V, T73K e T75S, V5Q, M69L, T71V, T73K e T75S
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21/124 [00056] Consequentemente, a presente invenção fornece versões humanizadas de um anticorpo anti-NKG2A produzidas pelo hibridoma de Z270, além de versões humanizadas de anticorpos não humanos que compartilham características biológicas e/ou identidade de sequência substancial com Z270. Em outra modalidade, o anticorpo monoclonal ou um fragmento ou derivado deste é capaz de se ligar a uma NKG2A de um primata não humano.
[00057] O anticorpo humanizado aqui usado compreende resíduos da região hipervariável ou da CDR não humana incorporados em domínios de VH e VL humanas.
[00058] Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo humanizado que compreende resíduos de ligação de antígeno das CDRs do anticorpo Z270 murino em uma estrutura central receptora humana, em que pelo menos os 6 resíduos de aminoácidos do terminal C da CDR-H2 são iguais àqueles na sequência receptora humana. Estes anticorpos humanizados podem ser mais eficazes do que o anticorpo murino Z270 original ou uma versão quimérica deste, por exemplo, na potencialização da atividade citotóxica de um linfócito citotóxico que expressa CD94/NKG2A como, por exemplo, uma célula NK, uma célula NKT, uma célula T α/β e/ou uma célula T γ/δ, ou de uma população de linfócitos citotóxicos que expressam CD94/NKG2A.
[00059] Anticorpos da invenção típicos compreendem resíduos de ligação de antígeno que correspondem as CDR-H2 e CDR-H3 de Z270 (ou a porções destas) que compreendem os resíduos D52, D54, R94, F99, T(100C) e W(100F) da SEQ ID N°: 2 ou SEQ ID N°: 5, os quais demonstraram nos Exemplos serem críticos para a ligação de antígeno. Opcionalmente, os anticorpos também compreendem os resíduos de VH N35, Y53, E56, D98, V(100A) e L(100D).
[00060] Em outro aspecto, um anticorpo humanizado compreende uma sequência de CDR-H1 que corresponde aos resíduos 31-35 da
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SEQ ID N°: 5 e uma sequência de CDR-H3 que corresponde aos resíduos 95-102 da SEQ ID N°: 5, em que a sequência de CDR-H2 compreende os resíduos 50-59 da SEQ ID N°: 5. Nesses anticorpos humanizados, a região VH pode ter, por exemplo, 50% ou mais de identidade de sequência para a SEQ ID N°: 5 como, por exemplo, pelo menos 60%, pelo menos 70% ou pelo menos 75% de identidade de sequência. Domínios de VH humanizados exemplares que possuem estas sequências serão descritos nos exemplos e abaixo.
[00061] Em uma modalidade, nesses anticorpos humanizados, o aminoácido na posição 5 da região VH pode ser V ou Q; o aminoácido na posição 69 da região VH pode ser M ou L; o aminoácido na posição 71 da região VH pode ser T ou V; o aminoácido na posição 73 da região VH pode ser T ou K; e/ou o aminoácido na posição 75 da região VH pode ser T ou S. Em modalidades separadas, a região VH compreende os resíduos V5 ou Q5, M69 ou L69, T71 ou V71, T73, ou K71 e/ou T75 ou S75. Em outra modalidade, o aminoácido na posição 69 é L. Em outra modalidade adicional ou alternativa, o aminoácido na posição 71 é V.
[00062] O anticorpo humanizado pode compreender uma estrutura central receptora humana de VH de uma sequência receptora humana selecionada, por exemplo, de VH1_18, VH5_a, VH5_51, VH1_f, e VH1_46, e o segmento J é JH6 como, por exemplo, uma VH1_18, VH5_a, VH5_51, ou VH1_f, ou outras sequências estruturais de VH de linhagem germinativa humana conhecidas na técnica. Em uma modalidade, o segmento VH é VH1_18. Em uma modalidade específica, região VH compreende a sequência da SEQ ID N°: 8. Em outra modalidade específica, a região VH compreende a sequência da SEQ ID N°:
7. Por exemplo, a região VH pode compreender a sequência da SEQ ID N°: 5.
[00063] A sequência receptora humana da região VL pode ser, por
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23/124 exemplo, VKI_O2/JK4. Em uma modalidade específica, a região VL compreende a SEQ ID N°: 4.
[00064] Em um aspecto, um anticorpo humanizado da invenção compreende uma CDR-H2 que compreende uma porção murina que consiste nos resíduos 50-59 da SEQ ID N°: 2, ligada a uma CDR-H3 que consiste nos resíduos 95-102 da SEQ ID N°: 2 por meio de sequências de FR adequadas.
[00065] Como aqui descrito, em uma modalidade, o anticorpo humanizado não compreende nenhuma substituição de FR no domínio de VH. Em outra modalidade, o anticorpo humanizado compreende uma substituição de FR no domínio de VH em uma ou mais posições selecionadas de 5, 69, 71, 73 e 75, utilizando o sistema de numeração do domínio variável de acordo com Kabat. Em outra modalidade, o anticorpo humanizado compreende substituições de FR do domínio de VH em duas ou mais das posições 5, 69, 71, 73 e 75; e em outras modalidades, em três, quatro ou todas essas posições. Em modalidades separadas e independentes, o anticorpo humanizado compreende uma substituição de FR no domínio de VH em uma posição selecionada de 5, 69, 71, 73 e 75. Em outras modalidades separadas e independentes, o anticorpo humanizado compreende substituições de FR do domínio de VH nas posições 5 e 69, ou 5 e 71, ou 5 e 73, ou 5 e 75, ou 69 e 71, 69 e 73, ou 69 e 75, ou 71 e 73, ou 71 e 75, ou 73 e 75, ou 5, 69 e 71, ou 5, 69 e 73, ou 5, 69 e 75, ou 69, 71 e 73, ou 69, 71 e 75, ou 71, 73 e 75, ou 5, 69, 71, e 73, ou 5, 69, 71 e 75, ou 5, 71, 73 e 75, ou 69, 71, 73 e 75, ou 5, 69, 71, 73 e 75. Menos, e não mais, substituições na estrutura podem minimizar a imunogenicidade, mas a eficácia de ligação pode ser uma consideração importante para algumas aplicações. Dessa forma, substituições preferidas são retromutações, ou seja, mutações que substituem um aminoácido em certa posição na FR humana com o aminoácido na posição correspondente
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24/124 em uma FR doadora não humana. Dessa forma, em modalidades separadas e independentes, a substituição de aminoácido do domínio de VH na posição 5 é V5Q, a substituição de aminoácido na posição 69 é M69L, a substituição de aminoácido na posição 71 é T71V, a substituição de aminoácido na posição 73 é T73K, e a substituição de aminoácido na posição 75 é T75S. Em uma modalidade específica, o anticorpo humanizado compreende uma V na posição 71 e/ou uma L na posição 69.
[00066] O anticorpo humanizado aqui utilizado também compreende resíduos da região hipervariável não humana incorporados em um domínio de VL humana. Em uma modalidade, o anticorpo humanizado não compreende nenhuma substituição de FR no domínio de VL. Em outra modalidade, o anticorpo humanizado compreende uma substituição de FR do domínio de VL em uma das posições 46 e 48, utilizando o sistema de numeração do domínio variável de acordo com Kabat. Em outra modalidade, o anticorpo humanizado compreende substituições de FR do domínio de VL de ambas posições, 46 e 48. Substituições preferidas são retromutações, ou seja, mutações que substituem um aminoácido em certa posição na FR humana com o aminoácido na posição correspondente em uma FR doadora não humana. Dessa forma, em modalidades separadas e independentes, a substituição de aminoácido do domínio de VL na posição 46 é L46F, e a substituição de aminoácido do domínio de VL na posição 48 é I48V.
[00067] Um anticorpo humanizado exemplar compreende um domínio de VH que compreende uma sequência de CDR-H1 que corresponde aos resíduos 31-35 das SEQ ID Nos: 5 ou 7, uma sequência de CDR-H2 que corresponde aos resíduos 50-66 das SEQ ID Nos: 5 ou 7 e uma sequência de CDR-H3 que corresponde aos resíduos 95-102 das SEQ ID Nos: 5 ou 7. O anticorpo humanizado pode ainda compreender um aminoácido na posição de Kabat 5 que é V ou Q, um amino
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25/124 ácido na posição de Kabat 69 que é M ou L, um aminoácido na posição de Kabat 71 que é T ou V, um aminoácido na posição de Kabat 73 é T ou K e/ou um aminoácido na posição de Kabat 75 que é T ou S, no domínio de VH. Em uma modalidade, o domínio de VH compreende uma substituição na região estrutural em pelo menos uma posição de Kabat selecionada do grupo que consiste em 5, 69, 71, 73 e 75, por exemplo, correspondendo a qualquer uma das substituições de FR de VH, ou combinações destas, listadas na Tabela 1. Em uma modalidade, o domínio de VH compreende a sequência da SEQ ID N°: 7. Em outra modalidade, o domínio de VH compreende a sequência da SEQ ID N°: 5.
[00068] Um anticorpo humanizado exemplar também pode compreender (ou alternativamente compreende) um domínio de VL que compreende uma sequência de CDR-L1 que corresponde aos resíduos 2434 da SEQ ID N°: 4, uma sequência de CDR-L2 que corresponde aos resíduos 50-56 da SEQ ID N°: 4 e uma sequência de CDR-L3 que corresponde aos resíduos 89-97 da SEQ ID N°: 4. O anticorpo humanizado pode ainda compreender um aminoácido na posição de Kabat 46 que é L ou F e/ou um aminoácido na posição de Kabat 48 que é I ou V. Em uma modalidade, o domínio de VL compreende uma substituição na região estrutural em pelo menos uma posição de Kabat selecionada de 46 e 48, por exemplo, correspondendo a qualquer uma das substituições de FR de VL, ou combinações destas, listadas na Tabela
1. Em uma modalidade, o domínio de VL compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 4. Em outra modalidade, o domínio de VL compreende a sequência da SEQ ID N°: 6.
[00069] Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo humanizado que se liga a NKG2A humana, o anticorpo compreendendo um domínio de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 5, opcionalmente com uma ou mais substituições de FR nas po
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26/124 sições de Kabat 5, 69, 71, 73 e/ou 75. As substituições de FR opcionais podem ser selecionadas, por exemplo, de V5Q, M69L, T71V, T73K e/ou T75S, além de qualquer combinação destas. Um anticorpo humanizado desse tipo também pode compreender (ou alternativamente compreende) um domínio de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 4, opcionalmente com uma ou mais substituições de FR nas posições de Kabat 46 e/ou 48. As substituições de FR opcionais podem ser selecionadas, por exemplo, de L46F e/ou I48V.
[00070] Opcionalmente, em um aspecto em particular, o domínio de VH compreende modificações de aminoácidos de um ou mais resíduos da CDR, por exemplo, em que as modificações essencialmente mantêm ou aumentam a afinidade do anticorpo. Por exemplo, o anticorpo variante pode ter uma, duas, três ou de uma a cerca de sete substituições de aminoácidos nas sequências de CDR de VH acima.
[00071] Em um aspecto em particular, os aminoácidos nas CDRs de VH do anticorpo humanizado que são diferentes dos aminoácidos nas posições correspondentes nas CDRs de VH doadoras não humanas podem ser substituídos para melhorar as propriedades de ligação e/ou a estabilidade do anticorpo humanizado. Por exemplo, um ou mais desses aminoácidos podem ser substituídos pelo aminoácido na posição correspondente(s) na CDR de VH doadora não humana. Em uma modalidade, o anticorpo variante compreende substituições de CDRH2 em uma ou mais posições selecionadas de 60, 63, 64, e 65, de acordo com Kabat (correspondendo às posições 61, 64, 65 e 66 na SEQ ID N°: 5 ou 7). Em modalidades separadas e independentes, o anticorpo variante compreende uma substituição de aminoácido de CDRH2 em uma posição selecionada de 60, 63, 64 e 65. Em outras modalidades separadas e independentes, o anticorpo variante compreende uma substituição de aminoácido de CDRH2 nas posições 60
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27/124 e 63, ou 60 e 64, ou 60 e 65, ou 63 e 64, ou 63 e 65, ou 64 e 65, ou 60, 63 e 64, ou 60, 63 e 65, ou 60, 64 e 65, ou 63, 64 e 65, ou 60, 63, 64 e 65. Substituições preferidas são retromutações, ou seja, mutações que substituem um aminoácido em certa posição na CDR humanizada com o aminoácido na posição correspondente em uma CDR doadora não humana. Dessa forma, em modalidades separadas e independentes, a substituição de aminoácido de CDRH2 na posição 60 é A60S, a substituição de aminoácido na posição 63 é L63F, a substituição de aminoácido na posição 64 é Q64K e a substituição de aminoácido na posição 65 é G65D. Em aspectos nos quais o anticorpo variante compreende uma ou mais das substituições de aminoácidos de CDRH2 A60S, L63F, Q64K e G65D, o anticorpo variante compreende as substituições de aminoácidos de FR de VH nas posições 66 e 67 de acordo com Kabat, opcionalmente em conjunto com uma ou mais das substituições de FR de VH descritas previamente. De preferência, as substituições de aminoácidos são R66K e V67A. Por exemplo, em uma modalidade, o anticorpo variante compreende um domínio de VH que compreende uma sequência de CDR-H1 que corresponde aos resíduos 31-35 da SEQ ID N°: 5, uma sequência de CDRH2 que corresponde aos resíduos 50-66 da SEQ ID N°: 5 e uma sequência de CDR-H3 que corresponde aos resíduos 95-102 da SEQ ID N°: 5, com retromutações A60S, L63F, Q64K, G65D, R66K e V67A, opcionalmente em conjunto com modificações de aminoácidos adicionais.
[00072] Em outro aspecto em particular, a invenção fornece um anticorpo humanizado que se liga a NKG2A humana, o anticorpo compreendendo um domínio de VH que compreende os resíduos da CDR não humana incorporados em um domínio de VH humana, o domínio de VH compreendendo uma sequência de CDR-H1 que corresponde aos resíduos 31-35 da SEQ ID N°: 8, uma sequência de CDR-H2 que
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28/124 corresponde aos resíduos 50-66 da SEQ ID N°: 8 e uma sequência de CDR-H3 que corresponde aos resíduos 95-102 da SEQ ID N°: 8, em que os aminoácidos nas posições de Kabat 63, 64, 65, 66 e 67 são F, K, D, K, A, respectivamente. Em uma modalidade, o domínio de VH compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 8. Em outra modalidade, o resíduo na posição de Kabat 60 é A. Em outra modalidade, o resíduo na posição de Kabat 60 é S, e o anticorpo humanizado compreende as sequências de CDR-H1, -H2 e H3 de Z270, com retromutações de FR nos dois aminoácidos adjacentes à extremidade do terminal C de CDR-H2. Os anticorpos humanizados descritos nessa seção podem ainda compreender retromutações de FR em outros resíduos, por exemplo, nas posições de Kabat 5, 69, 71, 73 e/ou 75, como aqui descrito.
[00073] Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo humanizado no qual todas as CDRs de Kabat na região VH derivam da Z270VH murina (SEQ ID N°: 2), compreendendo ainda mutações
S60A, F63L, K64Q e/ou D65G. Em uma modalidade, o anticorpo humanizado compreende todas as mutações S60A, F63L, K64Q e/ou D65G.
[00074] O anticorpo humanizado também pode compreender um domínio de VL que compreende uma sequência de CDR-L1 que corresponde aos resíduos 24-34 da SEQ ID N°: 6, uma sequência de CDR-L2 que corresponde aos resíduos 50-56 da SEQ ID N°: 6 e uma sequência de CDR-L3 que corresponde aos resíduos 89-97 da SEQ ID N°: 6, por exemplo, além do domínio de CDRs de VH descrito acima. Em uma modalidade, o domínio de VL do anticorpo humanizado compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 6. Em outra modalidade, o domínio de VL do anticorpo humanizado compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 4. Opcionalmente, um anticorpo humanizado desse tipo compreende modificações de aminoáci
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29/124 dos de um ou mais resíduos da CDR de VL, por exemplo, em que as modificações essencialmente mantêm ou aumentam a afinidade do anticorpo. Por exemplo, o anticorpo variante pode ter uma, duas, três ou de uma a cerca de sete substituições de aminoácidos nas sequências de CDR de VL acima.
[00075] O presente pedido também contempla anticorpos com afinidade amadurecida que se ligam a anti-NKG2A, que contêm CDR ou mutações de FR adicionais que aumentam a afinidade do anticorpo humanizado pelo antígeno. Métodos para a preparação destes anticorpos com afinidade maturada são conhecidos na técnica. O anticorpo parente pode ser um anticorpo humanizado, por exemplo, um que compreende as sequências de VL/VH das SEQ ID Nos: 4 e 5 (opcionalmente com uma ou mais das substituições de CDRH2 e/ou FR aqui descritas), ou um que compreende as sequências de consenso de VL/VH das SEQ ID Nos: 6 e 7, respectivamente. De preferência, o anticorpo com afinidade amadurecida se liga a NKG2A com uma afinidade comparável ou superior àquela do Z270 murino, por exemplo, com aumento da afinidade de pelo menos cerca de uma, cerca de duas ou cerca de quatro vezes até cerca de 100 vezes ou cerca de 1.000 vezes, por exemplo, avaliada por um ensaio de ligação como descrito abaixo.
[00076] Em outro aspecto, a invenção fornece anticorpos humanizados que compreendem um domínio de VH que possui pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos cerca de 85%, 90%, 95%, 97% ou mais de identidade) para o domínio de VH de Z270, humZ270, humZ270cons e/ou humZ270cons2 (SEQ ID Nos: 2, 5, 7 e 8, respectivamente). Em outro aspecto em particular, a invenção fornece um anticorpo humanizado que se liga a NKG2A, que compreende um domínio de VH que compreende os resíduos da CDR não
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30/124 humana incorporados em um domínio de VH humana, em que o domínio de VH é pelo menos cerca de 50% idêntico a humZ270VH1 (SEQ ID N°: 5). Em uma modalidade, o domínio de VH é pelo menos 90% idêntico a SEQ ID N°: 5. Por exemplo, o anticorpo humanizado pode compreender uma sequência de CDR-H1 que corresponde aos resíduos 31-35 da SEQ ID N°: 5, uma sequência de CDR-H2 que corresponde aos resíduos 50-66 da SEQ ID N°: 5 e uma sequência de CDRH3 que corresponde aos resíduos 95-102 da SEQ ID N°: 5. O anticorpo humanizado também pode compreender (ou alternativamente compreende) uma V ou Q na posição de Kabat 5, uma M ou L na posição de Kabat 69, uma T ou V na posição de Kabat 71, uma T ou K na posição de Kabat 73 e uma T ou S na posição de Kabat 75, no domínio de VH.
[00077] Em outro aspecto, a invenção fornece uma molécula de anticorpo que também (ou alternativamente) compreende um domínio de VL que possui pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 70%, ou pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos cerca de 85%, 90%, 95%, 97% ou mais de identidade) para o domínio de VL de Z270, humZ270 e/ou humZ270 cons (SEQ ID Nos: 1, 4 e 6, respectivamente). Em outro aspecto em particular, a invenção fornece um anticorpo humanizado que se liga a NKG2A, que compreende uma região VL que compreende os resíduos da CDR não humana incorporados em um domínio de VL humana, em que o domínio de VL é pelo menos 50% idêntico a SEQ ID N°: 4. Em uma modalidade, a região VL é pelo menos 90% idêntica a SEQ ID N°: 4. Por exemplo, o anticorpo humanizado pode compreender uma sequência de CDR-L1 que corresponde aos resíduos 24-34 da SEQ ID N°: 4, uma sequência de CDR-L2 que corresponde aos resíduos 50-56 da SEQ ID N°: 4 e uma sequência de CDR-L3 que corresponde aos resíduos 89-97 da SEQ ID N°: 4. O anticorpo humanizado também pode
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31/124 compreender (ou alternativamente compreende) uma L ou F na posição de Kabat 46 e/ou uma I ou V na posição de Kabat 48, no domínio de VL.
[00078] Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo humanizado isolado que se liga especificamente a NKG2A e que compreende: (a) sequências de CDR-L1, CDR-L2 e/ou CDR-L3 de VL de Z270 (SEQ ID N°: 1), VL de humZ270 (SEQ ID N°: 4) ou VL cons de humZ270 (SEQ ID N°: 6) ou (b) sequências de CDR-H1, CDR-H2 e/ou CDR-H3 de VH de Z270 (SEQ ID N°: 2), humZ270 (SEQ ID N°: 5), humZ270 cons (SEQ ID N°: 7), ou humZ270 cons2 (SEQ ID N°: 8). Em outro aspecto, a invenção fornece uma molécula de anticorpo que compreende pelo menos um conjunto completo de CDRs de VH de Z270, humZ270, ou humZ270 cons, em que os 6 aminoácidos do terminal C sãa IDênticos àqueles da sequência receptora humana. Em um aspecto em particular, a invenção fornece uma molécula de anticorpo que compreende CDR-H1, CDR-H2 (ou uma porção do terminal N desta) e CDR-H3 de Z270, humZ270 ou humZ270 cons, e pelo menos uma parte de CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 de Z270, humZ270 ou humZ270 cons. Em um aspecto mais específico, a invenção fornece uma molécula de anticorpo em que a molécula de anticorpo compreende CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 de Z270, humZ270 ou humZ270 cons, em que a CDR-L1 está ligada à CDR-L2, a CDR-L2 está ligada à CDR-L3, a CDR-H1 está ligada à CDR-H2 e a CDR-H2 está ligada à CDR-H3, por meio de sequências de FR adequadas.
[00079] Em um aspecto em particular, a invenção fornece moléculas de anticorpo que compreendem essencialmente todos os domínios de VH e/ou de VL de humZ270, humZ270 cons ou humZ270 cons2.
[00080] Um anticorpo humanizado anti-NKG2A de acordo com a invenção pode compreender qualquer cadeia pesada (HC) de compri
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32/124 mento total ou parcial que compreende uma humZ270VH aqui descrita e/ou qualquer HC de comprimento total ou parcial que compreende uma humZ270VH que pode ser combinada com qualquer humZ270VL aqui descrita, e o anticorpo ou fragmento resultante testado quanto à ligação de antígeno, aos efeitos funcionais sobre células que expressam CD94/NKG2A e/ou à imunogenicidade.
[00081] São contempladas várias formas do anticorpo humanizado. Por exemplo, o anticorpo humanizado pode ser um fragmento de anticorpo, por exemplo, um Fab ou outro tipo de fragmento aqui descrito. Alternativamente, o anticorpo humanizado pode ser um anticorpo de comprimento total ou intacto, por exemplo, um anticorpo IgG1 ou IgG4 de comprimento total ou intacto. Em uma modalidade, o anticorpo humanizado é um anticorpo IgG4 de comprimento total ou um fragmento deste.
[00082] Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo humanizado caracterizado por: a) se ligar especificamente a NKG2A; b) não se ligar especificamente a um receptor Fc; e c) quando ligado a NKG2A em uma célula NK humana, faz com que a referida célula NK lise uma célula humana-alvo que possui HLA-E na superfície da célula-alvo, quando a referida célula-alvo entrar em contato com a referida célula NK. Em uma modalidade, o anticorpo humanizado compreende uma região constante de IgG1 de camundongo ou humana que foi modificada para evitar a ligação a um receptor Fc, ou a uma região constante de IgG4 humana. Tais anticorpos, bem como fragmentos de anticorpo que não se ligam a um receptor Fc, são particularmente úteis em aplicações nas quais é desejado ativar células NK (por exemplo, câncer, doença infecciosa), sem levar à eliminação das próprias células NK, o que ocorreria caso fosse mediada por citotoxicidade celular dependente de anticorpo, e podem ser denominados anticorpos não eliminadores.
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33/124 [00083] Em outro aspecto, o anticorpo humanizado compreende uma região constante de IgG1 de camundongo ou humana que se liga a um receptor Fc, ou uma região constante de IgG1, 2, 3 ou 4 humana que foi modificada para se ligar a um receptor Fc ou aumentar a ligação a um receptor Fc, ou a uma região constante de IgG4 humana. Em outra modalidade, o anticorpo monoclonal ou um fragmento deste está ligado a uma porção que é tóxica para uma célula à qual o anticorpo está ligado. Tais anticorpos são particularmente úteis em aplicações nas quais é desejado eliminar uma célula NK, úteis em certas aplicações como, por exemplo, NK-LDGL (doença linfoproliferativa do tipo NK de linfócitos granulares; alternativamente denominada NKLGL), e podem ser denominados anticorpos eliminadores.
[00084] Para a produção recombinante de anticorpos humanizados, regiões VH e VL humanizadas, ou versões variantes destas, podem ser clonadas em vetores de expressão que codificam regiões constantes de comprimento total ou truncadas de um anticorpo humano, de acordo com métodos recombinantes padronizados (veja, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nova York, 1989). O resultado é uma linhagem de células transfectadas que expressa e secreta a molécula de anticorpo humanizado de interesse, que compreende as regiões VH e VL e regiões constantes selecionadas. São conhecidas sequências de cDNA que codificam as regiões constantes de anticorpos humanos. Sequências de cDNA exemplares disponíveis por meio, por exemplo, de GenBank, cada uma das quais incorporada por referência em sua totalidade, são as seguintes:
Região constante da cadeia pesada de IgG1 humana: N° de acesso no GenBank: J00228;
Região constante da cadeia pesada de IgG2 humana: N° de acesso no GenBank: J00230;
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Região constante da cadeia pesada de IgG3 humana: N° de acesso no GenBank: X04646;
Região constante da cadeia pesada de IgG4 humana: N° de acesso no GenBank: K01316; e
Região constante da cadeia leve capa humana: N° de acesso no GenBank: J00241.
[00085] Se desejado, a classe de um anticorpo humanizado também pode ser mudada por métodos conhecidos. Por exemplo, um anticorpo que foi produzido originalmente como uma molécula de IgM pode ter sua classe mudada para um anticorpo IgG. As técnicas de mudança de classe também podem ser usadas para converter uma subclasse IgG em outra, por exemplo, de IgG1 em IgG2. Dessa forma, a função efetora dos anticorpos da invenção pode ser alterada por mudança de isótipo para, por exemplo, um anticorpo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE ou IgM para vários usos terapêuticos.
[00086] A região constante pode ainda ser modificada de acordo com métodos conhecidos. Por exemplo, em uma região constante de IgG4, o resíduo S241 pode ser mutado para um resíduo de prolina (P) para permitir a formação de uma ponte dissulfeto completa na dobradiça (veja, por exemplo, Angal et al., Mol. Immunol. 1993; 30: 105-8). Fragmentos de anticorpos [00087] Os anticorpos humanizados da invenção podem ser preparados como fragmentos de anticorpo, ou fragmentos de anticorpo podem ser preparados a partir de anticorpos humanizados de comprimento total.
[00088] Foram desenvolvidas várias técnicas para a produção de fragmentos de anticorpo de anticorpos humanizados. Tradicionalmente, esses fragmentos eram derivados por meio de digestão proteolítica de anticorpos de comprimento total (veja, por exemplo, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 24: 107-117 (1992);
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35/124 e Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)). No entanto, esses fragmentos podem agora ser produzidos diretamente por células hospedeiras recombinantes. Alternativamente, fragmentos Fab'-SH podem ser recuperados diretamente de E. coli e acoplados quimicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Carter et al., Bio/ Technology, 10: 163-167 (1992)). De acordo com outra abordagem, fragmentos F(ab')2 podem ser isolados diretamente de cultura de célula hospedeira recombinante. Outras técnicas para a produção de fragmentos de anticorpo ficarão evidentes para aqueles versados na técnica. Em outras modalidades, o anticorpo de escolha é um fragmento Fv de cadeia simples (scFv). Veja WO 1993/16185; Patente U.S. N° 5.571.894; e Patente U.S. N° 5.587.458. O fragmento de anticorpo também pode ser um anticorpo linear, por exemplo, como descrito na Patente U.S. N° 5.641.870. Esses fragmentos de anticorpo linear podem ser monoespecíficos ou biespecíficos.
[00089] Anticorpos biespecíficos são anticorpos que possuem especificidades de ligação por pelo menos dois epitopos diferentes. Métodos para a produção de anticorpos biespecíficos são conhecidos na técnica, e a produção tradicional de anticorpos de comprimento total biespecíficos é normalmente baseada na coexpressão de dois pares de cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulina, em que as duas cadeias possuem especificidades diferentes (Millstein et al., Nature, 305: 537-539 (1983)). Nos anticorpos biespecíficos de acordo com a presente invenção, pelo menos um epitopo de ligação está na proteína NKG2A. O braço de ligação anti-NKG2A pode ser combinado a um braço que se liga a uma molécula desencadeante em um leucócito como, por exemplo, uma molécula receptora de célula T (por exemplo, CD2 ou CD3), ou receptores Fc para IgG (Fc-gama-R), por exemplo, Fc-gama-RI (CD64), Fc-gama-RII (CD32) e Fc-gama-RIII (CD16), de modo a concentrar os mecanismos de defesa celular na célula que ex
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36/124 pressa NKG2A. Anticorpos biespecíficos também podem ser usados para localizar agentes citotóxicos nas células que expressam NKG2A. Esses anticorpos possuem um braço de ligação de NKG2A e um braço que se liga ao agente citotóxico (por exemplo, saporina, anti-interferonalfa, alcaloide da vinca, cadeia de ricina A, metotrexato ou hapteno de isótopo radioativo). Anticorpos biespecíficos podem ser preparados como anticorpos de comprimento total ou fragmentos de anticorpo (por exemplo, anticorpos biespecíficos F(ab')2). Anticorpos com mais de duas valências são contemplados. Por exemplo, podem ser preparados anticorpos triespecíficos. Tutt et al., J. Immunol., 147: 60 (1991).
[00090] Anticorpos, fragmentos de anticorpo e anticorpos multiespecíficos da invenção típicos compreendem porções da CDR-H2 e CDR-H3 que consistem nos resíduos D52, D54, R94, F99, T(100C) e W(100F) da SEQ ID N°: 2 ou SEQ ID N°: 5, que demonstraram que são críticos para a ligação de antígeno (veja os Exemplos). Opcionalmente, os fragmentos de anticorpo humanizado e anticorpos multiespecíficos também compreendem os resíduos da cadeia pesada de Z270 N35, Y53, E56, D98, V(100A) e L(100D). Em um aspecto, um fragmento de anticorpo humanizado ou anticorpo multiespecífico da invenção compreende os resíduos 50-59 da CDR-H2 e os resíduos 95102 da CDR-H3 da SEQ ID N°: 2 ou SEQ ID N°: 5. Em uma modalidade, o fragmento de anticorpo humanizado ou o anticorpo multiespecífico não compreende uma, duas ou todas as CDR-L1, CDR-L2 e CDRL3 de Z270. Em uma modalidade adicional ou alternativa, o fragmento de anticorpo ou o anticorpo multiespecífico não compreende a CDRH1 de Z270.
Derivados de anticorpo [00091] Derivados de anticorpo dentro do escopo dessa invenção incluem anticorpos humanizados conjugados ou ligados covalentemente a um segundo agente.
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37/124 [00092] Por exemplo, em um aspecto, a invenção fornece imunoconjugados que compreendem um anticorpo humanizado conjugado ou ligado covalentemente a um agente citotóxico. O termo agente citotóxico, como aqui usado, é uma molécula que é capaz de matar uma célula que abriga um receptor de NKG2A em sua superfície celular. Qualquer tipo de porção com um efeito citotóxico ou citoinibidor pode ser conjugada aos presentes anticorpos para formar um conjugado citotóxico da presente invenção e para inibir ou matar células que expressam um receptor de NK específico, incluindo radioisótopos terapêuticos, proteínas tóxicas, pequenas moléculas tóxica, por exemplo, fármacos, toxinas, imunomoduladores, hormônios, antagonistas de hormônios, enzimas, oligonucleotídeos, inibidores de enzimas, radionuclídeos terapêuticos, inibidores da angiogênese, fármacos quimioterápicos, alcaloides da vinca, antraciclinas, epidofilotoxinas, taxanos, antimetabólitos, agentes alquilantes, antibióticos, inibidores de COX-2, SN-38, antimitóticos, agentes antiangiogênicos e apoptóticos, particularmente doxorrubicina, metotrexato, taxol, CPT-11, camptotecans, mostardas nitrogenadas, gencitabina, alquil sulfonatos, nitrosoureias, triazenos, análogos do ácido fólico, análogos de pirimidina, análogos de purina, complexos de coordenação de platina, exotoxina de Pseudomonas, ricina, abrina, 5-fluoruridina, ribonuclease (RNase), DNase I, enterotoxina-A estafilocócica, proteína antiviral da erva-dos-cancros, gelonina, toxina difterina, exotoxina de Pseudomonas e endotoxina de Pseudomonas e outros (veja, por exemplo, Remington’s Pharmaceutical Sciences, 19a Ed. (Mack Publishing Co. 1995); Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics (McGraw Hill, 2001); Pastan et al. (1986) Cell 47: 641; Goldenberg (1994) Cancer Journal for Clinicians 44: 43; Patente U.S. N° 6.077.499; cujas descrições integrais são aqui incorporadas por referência). Será observado que uma toxina pode ser de origem animal, de planta, fúngica ou miPetição 870190106907, de 22/10/2019, pág. 42/136
38/124 crobiana, ou pode ser criada de novo por síntese química.
[00093] Em outra modalidade, o anticorpo é derivatizado com um isótopo radioativo como, por exemplo, um radionuclídeo terapêutico ou um radionuclídeo adequado para fins de detecção. Qualquer um dentre diversos isótopos radioativos pode ser usado, incluindo, sem limitação, I-131, Índio-111, Lutécio-171, Bismuto-212, Bismuto-213, Astatínio-211, Cobre-62, Cobre-64, Cobre-67, Ítrio-90, Iodo-125, Iodo-131, Fósforo-32, Fósforo -33, Escândio-47, Prata-111, Gálio-67, Praseodímio-142, Samário-153, Térbio-161, Disprósio-166, Hólmio-166, Rênio186, Rênio-188, Rênio-189, Chumbo-212, Radio-223, Actínio-225, Ferro-59, Selênio-75, Arsênico-77, Estrôncio-89, Molibdênio-99, Ródio105, Paládio-109, Praseodímio-143, Promécio-149, Érbio-169, Irídio194, Ouro-198, Ouro-199 e Chumbo-211. Em geral, de preferência, o radionuclídeo possui uma queda de energia na faixa de 20 a 6.000 keV, de preferência nas faixas de 60 a 200 keV para um emissor Auger, 100-2,500 keV para um emissor beta e 4.000-6.000 keV para um emissor alfa. Também são preferidos radionuclídeos que decaem substancialmente com a geração de partículas alfa.
[00094] Em outras modalidades, o segundo agente é uma porção detectável, a qual pode ser qualquer molécula que possa ser quantitativa ou qualitativamente observada ou medida. Exemplos de marcadores detectáveis úteis nos anticorpos conjugados dessa invenção são radioisótopos, corantes fluorescentes ou um membro de um par de ligação complementar como, por exemplo, um membro de qualquer um de: sistemas de antígeno/anticorpo (diferente de um anticorpo para NKG2A), lectina/carboidrato; avidina/biotina; receptor/ligante; ou polímero molecularmente impresso/molécula de impressão.
[00095] O segundo agente também pode (ou alternativamente) ser um polímero, destinado a aumentar a meia-vida circulante do anticorpo humanizado, por exemplo. Polímeros e métodos exemplares para
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39/124 anexar estes polímeros aos peptídeos são ilustrados, por exemplo, nas Patentes U.S. Nos 4.766.106, 4.179.337, 4.495.285 e 4.609.546. Polímeros ilustrativos adicionais incluem porções de polióis polioxietilados e polietileno glicol (PEG) (por exemplo, um anticorpo de comprimento total ou fragmento de anticorpo pode ser conjugado a uma ou mais moléculas de PEG com um peso molecular entre cerca de 1.000 e cerca de 40.000 como, por exemplo, entre cerca de 2.000 e cerca de 20.000, por exemplo, cerca de 3.000-12.000).
[00096] Os agentes citotóxicos ou outros compostos podem ser ligados ao anticorpo direta ou indiretamente, com o uso de qualquer um entre diversos métodos disponíveis. Por exemplo, um agente pode ser anexado à região da dobradiça do componente do anticorpo reduzido por meio de formação de ligação dissulfeto, com o uso de reticuladores como, por exemplo, 3-(2-piridilditio)proprionato de N-succinila (SPDP), ou por meio de uma porção carboidrato na região Fc do anticorpo (veja, por exemplo, Yu et al. (1994) Int. J. Cancer 56: 244; Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking (CRC Press 1991); Upeslacis et al., Modification of antibodies by Chemical Methods, em Monoclonal antibodies: principles and applications, Birch et al. (eds.), páginas 187-230 (Wiley-Liss, Inc. 1995); Price, Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies, em Monoclonal antibodies: Production, engineering and clinical application, Ritter et al. (eds.), páginas 60-84 (Cambridge University Press 1995), Cattel et al. (1989) Chemistry today 7: 51-58, Delprino et al. (1993) J. Pharm. Sci. 82: 699-704; Arpicco et al. (1997) Bioconjugate Chemistry 8: 3; Reisfeld et al. (1989) Antihody, Immunicon. Radiopham. 2: 217; cujas descrições de cada um deles são aqui incorporadas por referência).
[00097] Alternativamente, pode ser criada uma proteína de fusão que compreenda o anticorpo anti-NKG2A e um segundo agente poli
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40/124 peptídico (citotóxico ou outro), por exemplo, por técnicas recombinantes ou por síntese peptídica.
Ensaios de ligação [00098] A presente invenção fornece anticorpos que se ligam a NKG2A humana, em particular versões humanizadas de um anticorpo anti-NKG2A produzidas pelo hibridoma de Z270.
[00099] Pode ser usado qualquer um dentre diversos ensaios para avaliar a ligação de um anticorpo a NKG2A humana. Protocolos baseados em ELISAs, radioimunoensaios, Western blotting, BIACORE e outros ensaios de competição, entre outros, são adequados ao uso e são bem-conhecidos na técnica.
[000100] Por exemplo, podem ser usados ensaios de ligação simples, nos quais um anticorpo de teste é incubado na presença de uma proteína ou epitopo-alvo (por exemplo, NKG2A ou uma porção desta), anticorpos não ligados são removidos por lavagem, e a presença de anticorpos ligados é testada com o uso, por exemplo, de marcadores radioativos, métodos físicos como, por exemplo, espectrometria de massa, ou marcadores fluorescentes diretos ou indiretos detectados com a utilização, por exemplo, de análise citofluorimétrica (por exemplo, FACScan). Tais métodos são bem-conhecidos por aqueles versados na técnica. Qualquer quantidade de ligação acima da quantidade observada com um controle, um anticorpo inespecífico, indica que o anticorpo se liga especificamente ao alvo.
[000101] Nestes ensaios, a capacidade do anticorpo de teste de se ligar à célula-alvo ou NKG2A humana podem ser comparada com a habilidade de uma proteína de controle (negativa), por exemplo, um anticorpo desenvolvido contra um antígeno estruturalmente não relacionado, ou um peptídeo ou proteína não Ig, para se ligar ao mesmo. Anticorpos ou fragmentos que se ligam às células-alvo ou a NKG2A com o uso de qualquer ensaio adequado com 25%, 50%, 100%,
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200%, 1.000%, ou mais de afinidade aumentada em relação à proteína de controle são ditos que se ligam especificamente a ou que interagem especificamente com o alvo, e são preferidos para uso nos métodos terapêuticos descritos abaixo. A capacidade de um anticorpo de teste de afetar a ligação de um anticorpo de controle (positivo) contra NKG2A, por exemplo, Z270, ou derivados deste, também pode ser avaliada.
[000102] Os anticorpos humanizados anti-NKG2A podem ou não se ligar a NKG2C humana, podem ou não se ligar a NKG2E humana, ou podem ou não se ligar a qualquer uma entre NKG2C e NKG2E humanas. Em uma modalidade específica, o anticorpo monoclonal, ou fragmento deste, não se liga a outros receptores de NKG2 humana, especificamente aos receptores de ativação de NKG2C ou NKG2E. As propriedades de ligação a NKG2C e a NKG2E-dos anticorpos da invenção podem ser avaliadas em ensaios similares àqueles descritos acima, trocando-se simplesmente NKG2A pela molécula de interesse.
[000103] Em um aspecto, a invenção fornece versões humanizadas de anticorpos não humanos que compartilham características biológicas e/ou identidade de sequência substancial com Z270. Uma característica biológica exemplar é a ligação ao epitopo de Z270, ou seja, à região no domínio extracelular de NKG2A à qual o anticorpo Z270 se liga. Para avaliação de anticorpos que se ligam ao epitopo de Z270, pode ser realizado um ensaio de bloqueio cruzado de rotina, por exemplo, aquele descrito em Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed. Harlow e David Lane (1988).
[000104] Em um ensaio de bloqueio cruzado ou de competição exemplar, o anticorpo Z270 (controle) e um anticorpo de teste são misturados (ou pré-adsorvidos) e aplicados a uma amostra que contém NKG2A. Em certas modalidades, seriam pré-misturados os anticorpos de controle com quantidades variáveis do anticorpo de teste (por
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42/124 exemplo, 1:10 ou 1:100) por um período de tempo, antes da aplicação da amostra que contém NKG2A. Em outras modalidades, o anticorpo de controle e quantidades variáveis do anticorpo de teste podem simplesmente ser misturados durante exposição à amostra de antígeno/alvo. Visto que se pode distinguir anticorpos ligados dos anticorpos livres (por exemplo, com o uso de técnicas de separação ou de lavagem para eliminar os anticorpos não ligados) e o anticorpo de controle do anticorpo de teste (por exemplo, com o uso de anticorpos secundários com especificidade de espécie ou de isótipo, marcando-se especificamente o anticorpo de controle com um marcador detectável, ou com a utilização de métodos físicos como, por exemplo, espectrometria de massa, para distinguir entre diferentes compostos), pode-se determinar se o anticorpo de teste reduz a ligação do anticorpo de controle para o antígeno, o que indica que o anticorpo de teste reconhece substancialmente o mesmo epitopo que o controle. Nesse ensaio, a ligação do anticorpo de controle (marcado) na presença de um anticorpo completamente irrelevante é o valor alto do controle. O valor baixo do controle deve ser obtido por incubação do anticorpo de controle marcado (Z270) (positivo) com anticorpo de controle não rotulado, em que ocorreria a competição e reduziria a ligação do anticorpo marcado.
[000105] Em um ensaio de teste, uma redução significativa na reatividade do anticorpo marcado na presença de um anticorpo de teste é indicativa de um anticorpo de teste que reconhece o mesmo epitopo, ou seja, um que reage de forma cruzada com o anticorpo marcado de controle. Qualquer anticorpo ou composto de teste que reduza a ligação do controle marcado com o antígeno/alvo em pelo menos 50% ou mais, de preferência 70%, em qualquer proporção de anticorpo ou composto de controle:de teste entre cerca de 1:10 e cerca de 1:100 é considerado como sendo um anticorpo ou composto que se liga a
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43/124 substancialmente ao mesmo epitopo ou determinante como o controle. De preferência, este anticorpo ou composto de teste reduzirá a ligação do controle ao antígeno/alvo em pelo menos 90%. No entanto, qualquer composto ou anticorpo que reduza a ligação de um anticorpo ou composto de controle em qualquer grau mensurável pode ser usado na presente invenção.
[000106] Ensaios de bloqueio cruzado similares também podem ser usados para avaliar se um anticorpo de teste (humanizado) afeta a ligação do ligante natural para NKG2A humana, HLA-E, a NKG2A, trocando-se Z270 por uma forma adequada de HLA-E. Por exemplo, para determinar se uma preparação de anticorpo humanizado anti-NKG2A reduz ou bloqueia interações CD94/NKG2A com HLA-E, o seguinte teste pode ser realizado: uma linhagem de células que expressam CD94/NKG2A, por exemplo, Ba/F3-CD94/NKG2A, NKL ou NK92, é incubada por 30 minutos no gelo, com concentrações crescentes de um anticorpo de teste anti-NKG2A. As células são então incubadas com tetrâmeros de HLA-E marcados com PE por 30 minutos no gelo, lavadas novamente, e a ligação do tetrâmero de HLA-E é analisada em um citômetro de fluxo (FACScalibur, Beckton Dickinson) por métodos padronizados. Na ausência de anticorpos de teste, o tetrâmero de HLA-E se liga as células. Na presença de uma preparação de anticorpo que bloqueie a ligação de CD94/NKG2A a HLA-E, há uma ligação reduzida de tetrâmeros de HLA-E às células, e estes mAbs são designados anticorpos de bloqueio.
[000107] Em alguns aspectos da invenção, por exemplo, quando não se deseja matar as células que expressam NKG2A, os anticorpos humanizados dessa invenção preferivelmente não demonstram ligação específica substancial aos receptores Fc. Estes anticorpos podem compreender regiões constantes de várias cadeias pesadas que sabidamente não se ligam aos receptores Fc. Um exemplo desse tipo é
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44/124 uma região constante de IgG4. Alternativamente, fragmentos de anticorpo que não compreendem regiões constantes como, por exemplo, fragmentos Fab ou F(ab')2, podem ser usados para evitar a ligação do receptor Fc. A ligação do receptor Fc pode ser avaliada de acordo com métodos conhecidos na técnica, incluindo, por exemplo, o teste da ligação de um anticorpo à proteína do receptor Fc em um ensaio BIACORE. Além disso, pode ser usado qualquer outro tipo de anticorpo no qual a porção Fc é modificada para minimizar ou eliminar a ligação aos receptores Fc (veja, por exemplo, WO 03101485, cuja descrição é aqui incorporada por referência). Ensaios como, por exemplo, ensaios baseados em células, para avaliar a ligação do receptor Fc são bemconhecidos na técnica, e são descritos, por exemplo, em WO 03101485.
Ensaios de citotoxicidade [000108] Caso um anticorpo anti-NKG2A reduza ou bloqueie as interações CD94/NKG2A com HLA-E, ele poderá aumentar a citotoxicidade de linfócitos restritos por CD94/NKG2A. Isso pode ser avaliado por um ensaio de citotoxicidade típico, cujos exemplos serão descritos abaixo.
[000109] A capacidade de um anticorpo de reduzir a sinalização mediada por CD94/NKG2A pode ser testada em um ensaio de citotoxicidade in vitro de 4 horas padronizado usando, por exemplo, células NKL que expressam CD94/NKG2A e células-alvo que expressam HLA-E. Essas células NKL não matam eficientemente alvos que expressam HLA-E porque CD94/NKG2A reconhece HLA-E, levando à iniciação e propagação de sinalização inibidora que evita a citólise mediada por linfócitos. Um ensaio de citotoxicidade in vitro desse tipo pode ser efetuado por métodos padronizados que são bemconhecidos na técnica, como descrito, por exemplo, em Coligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. e
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Wiley Interscience, N.Y. (1992, 1993). As células-alvo são marcadas com 51Cr, antes da adição de células NKL, e depois a morte é estimada como proporcional à liberação de 51Cr pelas células ao meio, em consequência de sua morte. A adição de um anticorpo que evita que CD94/NKG2A se ligue a HLA-E evita a iniciação e propagação da sinalização inibidora por meio de CD94/NKG2A. Portanto, a adição destes agentes resulta em aumentos na morte mediada por linfócitos das células-alvo. Dessa forma, essa etapa identifica agentes que evitam a sinalização negativa induzida por CD94/NKG2A, por exemplo, por bloqueio da ligação de ligante. Em um ensaio de citotoxicidade por liberação de 51Cr específico, células NKL efetoras que expressam CD94/NKG2A podem matar células LCL 721.221-alvo HLA-Enegativas, mas como menor eficiência do que células LCL 721.221Cw3 de controle que expressam HLA-E. Em contraste, células YTS efetoras desprovidas de CD94/NKG2A matam ambas as linhagens celulares eficientemente. Dessa forma, células NKL efetoras matam menos eficientemente células LCL 721.221-Cw3 HLA-E+ em função da sinalização inibidora induzida por HLA-E por meio de CD94/ NKG2A. Quando as células NKL são pré-incubadas com anticorpos de bloqueio anti-CD94/NKG2A de acordo com a presente invenção, por exemplo, em um ensaio de citotoxicidade por liberação de 51Cr, células LCL 721.221-Cw3 que expressam HLA-E são mortas mais eficientemente, de uma forma proporcional à concentração de anticorpo.
[000110] A atividade inibidora ou potencializadora de um anticorpo dessa invenção também pode ser avaliada por qualquer uma de diversas outras formas, por exemplo, por seu efeito sobre o cálcio intracelular livre como descrito, por exemplo, em Sivori et al., J. Exp. Med. 1997; 186: 1.129-1.136, cuja descrição é aqui incorporada por referência. A atividade de células NK, T ou NKT também pode ser avaliada com o uso de ensaios de citotoxicidade baseados em células, por
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46/124 exemplo, por medida da liberação de cromo ou outro parâmetro para avaliar a capacidade do anticorpo de estimular células NK na morte de células-alvo como, por exemplo, células P815, K562 ou células tumorais apropriadas, como descrito em Sivori et al., J. Exp. Med. 1997; 186: 1.129-1.136; Vitale et al., J. Exp. Med. 1998; 187: 2.065-2.072; Pessino et al. J. Exp. Med. 1998; 188: 953-960; Neri et al., Clin. Diag. Lab. Immun. 2001; 8: 1.131-1.135; Pende et al. J. Exp. Med. 1999; 190: 1.505-1.516, cujas descritos de cada um deles são aqui incorporadas por referência.
[000111] Em uma modalidade, uma preparação de anticorpo causa um aumento de pelo menos 10% na citotoxicidade de um linfócito restrito por CD94/NKG2A, de preferência, um aumento de pelo menos 40% ou 50% da citotoxicidade de NK ou, mais preferivelmente, um aumento de pelo menos 70% da citotoxicidade de NK.
[000112] A atividade de um linfócito citotóxico também pode ser abordada com o uso de um ensaio de liberação de citocina, em que as células NK são incubadas com o anticorpo para estimular a produção de citocina pelas células NK (por exemplo, produção de IFN-γ e TNFa). Em um protocolo exemplar, a produção de IFN-γ por PBMC é avaliada por coloração da superfície celular e intracitoplasmática e análise por citometria de fluxo após 4 dias em cultura. Resumidamente, é adicionada Brefeldina A (Sigma Aldrich) em uma concentração final de 5 pg/ml nas últimas 4 horas de cultura. As células são então incubadas com mAb anti-CD3 e anti-CD56, antes da permeabilização (IntraPrep®; Beckman Coulter) e coloração com PE-anti-IFN-γ ou PE-IgG1 (Pharmingen). GM-CSF e a produção de IFN-γ por células NK ativadas por anticorpo policlonal são medidas em sobrenadantes com o uso de ELISA (GM-CSF: DuoSet Elisa, R&D Systems, Minneapolis, MN, IFN-: conjunto OptEIA, Pharmingen).
[000113] Em um aspecto em particular, a invenção fornece anticor
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47/124 pos que são mais capazes, ou mais eficazes, no aumento da citotoxicidade de linfócitos restritos por CD94/NKG2A, potencializando a atividade citotóxica de um linfócito restrito por CD94/NKG2A, ou reduzindo ou inibindo a sinalização mediada por CD94/NKG2A, do que o anticorpo original, não humanizado, e/ou uma versão quimérica deste. Estes anticorpos podem ser, por exemplo, pelo menos 2%, pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15% ou pelo menos 20% mais capazes ou eficazes do que o anticorpo original, não humanizado, ou versão quimérica deste.
Métodos recombinantes [000114] A invenção também fornece ácidos nucleicos isolados que codificam os anticorpos anti-NKG2A aqui descritos, bem como vetores e células hospedeiras que compreendem estes ácidos nucleicos. Também são fornecidos métodos de produção destes anticorpos antiNKG2A com a utilização de técnicas recombinantes como, por exemplo, o cultivo de células hospedeiras adequadas que compreendem estes ácidos nucleicos ou vetores, de tal forma que o ácido nucleico seja expresso e o anticorpo humanizado produzido. Antes do cultivo, a célula hospedeira pode, por exemplo, ser co-transfectada com um vetor que compreende ácidos nucleicos que codificam um domínio variável da cadeia pesada e com um vetor que compreende ácido nucleico que codifica um domínio variável da cadeia leve. Adicionalmente, o anticorpo pode ser recuperado e/ou purificado da célula hospedeira cultura com o uso de técnicas conhecidas. Vetores, células hospedeiras e técnicas úteis são ainda descritos abaixo e nos Exemplos. Adicionalmente, estratégias para a expressão de anticorpos humanizados anti-NKG2A são ilustradas nas figuras 4-6.
[000115] Geralmente, para a produção recombinante do anticorpo, um ácido nucleico que o codifica é isolado e inserido em um vetor replicável para clonagem posterior (amplificação do DNA) ou para ex
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48/124 pressão, tipicamente ligado operacionalmente a um ou mais elementos de controle da expressão. O DNA que codifica o anticorpo monoclonal é facilmente isolado e sequenciado com o uso de procedimentos convencionais (por exemplo, pela utilização de sondas de oligonucleotídeos que são capazes de se ligar especificamente aos genes que codificam as cadeias leve e pesada do anticorpo). Muitos vetores são conhecidos e disponíveis. Os componentes do vetor geralmente incluem, sem limitação, um ou mais dos seguintes: uma sequência sinalizadora, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento intensificador, um promotor e uma sequência de terminação da transcrição.
Componente de sequência sinalizadora [000116] O anticorpo anti-NKG2A dessa invenção pode ser produzido de forma recombinante não apenas diretamente, mas também como um polipeptídeo de fusão com um polipeptídeo heterólogo, que é preferivelmente uma sequência sinalizadora ou outro polipeptídeo que possua um sítio de clivagem específico no terminal N da proteína ou polipeptídeo maduro. De preferência, a sequência sinalizadora heteróloga selecionada é uma que seja reconhecida e processada (ou seja, clivada por uma peptidase sinalizadora) pela célula hospedeira. Veja, por exemplo, o Exemplo 2 para sequências sinalizadoras exemplares para a expressão de cadeias pesadas e/ou leves humanizadas de anticorpos anti-NKG2A, por exemplo, anticorpos Z270 humanizados.
[000117] Para células hospedeiras procarióticas que não reconhecem e processam a sequência sinalizadora nativa do anticorpo antiNKG2A, a sequência sinalizadora é substituída por uma sequência sinalizadora procariótica selecionada, por exemplo, do grupo que consiste em fosfatase alcalina, penicilinase, lpp ou líderes termoestáveis de enterotoxina II. Para a secreção por leveduras, a sequência sinalizadora nativa pode ser substituída, por exemplo, pelo líder de inver
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49/124 tase de levedura, pelo líder do fator alfa (incluindo líderes do fator alfa de Saccharomyces e Kluyveromyces), pelo líder de fosfatase ácida, pelo líder de glicoamilase de C. albicans ou pelo sinal descrito em WO 1990/13646. Na expressão de célula mamífera, são disponíveis sequências sinalizadoras de mamíferos, além de líderes secretores virais, por exemplo, o sinal do gD do herpes simples.
[000118] O DNA para essa região precursora é ligado em estrutura de leitura ao DNA que codifica o anticorpo anti-NKG2A.
Origem do componente de replicação [000119] Ambos os vetores de expressão e os vetores de clonagem contêm uma sequência de ácidos nucleicos que permite que o vetor se replique em uma ou mais células hospedeiras selecionadas. Geralmente, em vetores de clonagem, essa sequência é aquela que permite que o vetor se replique independentemente do DNA cromossômico do hospedeiro, e inclui origens de replicação ou sequências autonomamente replicantes. Estas sequências são conhecidas por diversas bactérias, leveduras e vírus. A origem de replicação do plasmídeo pBR322 é adequada para a maioria das bactérias Gram-negativas, a origem de plasmídeo de 2 μ é adequada para leveduras, e várias origens virais (SV40, polioma, adenovírus, VSV, EBV ou BPV) são úteis para vetores de clonagem em células de mamíferos. Geralmente, o componente de origem de replicação não é necessário para vetores de expressão de mamíferos (a origem SV40 pode tipicamente ser usada somente por conter o promotor inicial).
Componente de gene de seleção [000120] Vetores de expressão e de clonagem podem conter um gene de seleção, também denominado marcador selecionável. Genes de seleção típicos codificam proteínas que: (a) conferem resistência a antibióticos ou a outras toxinas, por exemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato ou tetraciclina, (b) complementam deficiências auxotróficas,
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50/124 ou (c) fornecem nutrientes críticos não disponíveis por meios complexos, por exemplo, o gene que codifica D-alanina racemase para bacilos.
[000121] Um exemplo de um esquema de seleção utiliza um fármaco para interromper o crescimento de uma célula hospedeira. Aquelas células que são transformadas com sucesso com um gene heterólogo produzem uma proteína que confere resistência a fármaco e, dessa forma, sobrevivem ao regime de seleção. Exemplos desta seleção dominante usam os fármacos neomicina, ácido micofenólico e higromicina.
[000122] Outros exemplos de marcadores selecionáveis adequados para células de mamíferos são aqueles que permitem a identificação de células competentes para recolher o ácido nucleico que codifica o anticorpo anti-NKG2A, por exemplo, DHFR, timidina quinase, metalotioneína-I e -II, de preferência genes de metalotioneína de primata, adenosina desaminase, ornitina descarboxilase etc.
[000123] Por exemplo, células transformadas com o gene de seleção de DHFR são inicialmente identificadas por cultivo de todos os transformantes em um meio de cultura que contém metotrexato (Mtx), um antagonista competitivo de DHFR. Quando se emprega DHFR do tipo selvagem, uma célula hospedeira apropriada é a linhagem de células do ovário de hamster chinês (CHO) com deficiência na atividade de DHFR.
[000124] Alternativamente, células hospedeiras (particularmente hospedeiros do tipo selvagem que contêm DHFR endógeno) transformadas ou co-transformadas com sequências de DNA que codificam o anticorpo anti-NKG2A, a proteína DHFR do tipo selvagem e outro marcador selecionável como, por exemplo, aminoglicosídeo 3'fosfotransferase (APH), podem ser selecionadas por crescimento da célula em meio contendo um agente de seleção para o marcador sele
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51/124 cionável como, por exemplo, um antibiótico aminoglicosídico, por exemplo, canamicina, neomicina ou G418. Veja a Patente U.S. N° 4.965.199.
[000125] Um gene de seleção adequado para uso em levedura é o gene trp1 presente no plasmídeo de levedura YRp7 (Stinchcomb et al., Nature, 282: 39 (1979)). O gene trp1 fornece um marcador de seleção para uma cepa de mutante de levedura sem a capacidade de crescer em triptofano, por exemplo, ATCC N° 44076 ou PEP4-1 (Jones, Genetics, 85:12 (1977)). A presença da lesão de trp1 no genoma da célula hospedeira de levedura fornece, então, um ambiente eficaz para a detecção da transformação por crescimento na ausência de triptofano. Do mesmo modo, cepas de levedura deficientes em Leu2 (ATCC 20.622 ou 38.626) são complementadas por plasmídeos conhecidos que possuem o gene Leu2.
[000126] Além disso, vetores derivados do plasmídeo circular de 1,6 pm pKD1 podem ser usados para a transformação de leveduras Kluyveromyces. Alternativamente, um sistema de expressão para a produção em larga escala de quimosina recombinante de bezerro foi relatado para K. lactis (Van den Berg, Bio/Technology, 8: 135 (1990)). Também foram descritos vetores de expressão estáveis multicópias para a secreção de albumina sérica humana recombinante madura por cepas industriais de Kluyveromyces (Fleer et al., Bio/Technolog, 9: 968-975 (1991)).
Componente de promotor [000127] Vetores de expressão e de clonagem normalmente contêm um promotor que é reconhecido pelo organismo hospedeiro, e está ligado operacionalmente ao ácido nucleico que codifica o anticorpo anti-NKG2A. Promotores adequados ao uso com hospedeiros procarióticos incluem o promotor de phoA, sistemas promotores de βlactamase e lactose, fosfatase alcalina, um sistema promotor de tripto
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52/124 fano (trp) e promotores híbridos como, por exemplo, o promotor tac. No entanto, outros promotores bacterianos conhecidos são adequados. Promotores para uso em sistemas bacterianos também conterão uma sequência de Shine-Dalgarno (S.D.) ligada operacionalmente ao DNA que codifica o anticorpo anti-NKG2A.
[000128] Várias sequências promotoras são conhecidas para eucariotas. Praticamente todos os genes eucarióticos possuem uma região rica em AT localizada aproximadamente 25 a 30 bases acima do sítio onde a transcrição é iniciada. Outra sequência encontrada 70 a 80 bases acima do início de transcrição de muitos genes é uma região CNCAAT, em que N pode ser qualquer nucleotídeo. Na extremidade 3' da maioria dos genes eucarióticos genes está uma sequência AATAAA que pode ser o sinal para adição do tail poli-A à extremidade 3' da sequência codificadora. Todas essas são sequências inseridas adequadamente em vetores de expressão eucarióticos. Exemplos de sequências promotoras adequadas para uso com hospedeiros de levedura incluem os promotores para 3-fosfoglicerato quinase ou outras enzimas glicolíticas como, por exemplo, enolase, gliceraldeído-3fosfato desidrogenase, hexoquinase, piruvato descarboxilase, fosfofrutoquinase, glicose-6-fosfato isomerase, 3-fosfoglicerato mutase, piruvato quinase, triosefosfato isomerase, fosfoglicose isomerase e glicoquinase.
[000129] Outros promotores de levedura, que são promotores indutíveis que possuem a vantagem adicional de transcrição controlada pelas condições de crescimento, são as regiões promotoras para álcool desidrogenase 2, isocitocromo C, fosfatase ácida, enzimas de degradação associadas ao metabolismo do nitrogênio, metalotioneína, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase e enzimas responsáveis pela utilização de maltose e galactose. Vetores e promotores adequados para uso na expressão de levedura são ainda descritos em EP73657. In
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53/124 tensificadores de levedura também são vantajosamente usados com promotores de levedura.
[000130] A transcrição do anticorpo anti-NKG2A por vetores em células hospedeiras de mamíferos é controlada, por exemplo, por promotores obtidos a partir dos genomas de vírus como, por exemplo, o vírus do polioma, vírus da bouba aviária, adenovírus (por exemplo, Adenovírus 2), vírus do papiloma bovino, vírus do sarcoma aviário, citomegalovírus (CMV), um retrovírus, vírus da hepatite B e, principalmente, o Vírus Símio 40 (SV40), promotores mamíferos heterólogos, por exemplo, o promotor de actina ou um promotor der imunoglobulina, e promotores de choque térmico, desde que esses promotores sejam compatíveis com os sistemas da célula hospedeira.
[000131] Os promotores iniciais e tardios do vírus SV40 são obtidos convenientemente como um fragmento de restrição de SV40, que também contém a origem de replicação viral do SV40. O promotor inicial imediato do citomegalovírus humano é obtido convenientemente como um fragmento de restrição HindIII E. Um sistema para a expressão de DNA em hospedeiros mamíferos com o uso do vírus do papiloma bovino como vetor é descrito na Patente U.S. N° 4.419.446. Uma modificação desse sistema é descrita na Patente U.S. N° 4.601.978. Veja também Reyes et al., Nature, 297: 598-601 (1982) sobre a expressão de cDNA de interferon beta humano em células de camundongo sob o controle de um promotor de timidina quinase do vírus do herpes simples. Alternativamente, uma repetição terminal do terminal longo do vírus do sarcoma de Rous pode ser usada como o promotor. Componente do elemento intensificador [000132] A transcrição de um DNA que codifica o anticorpo antiNKG2A dessa invenção por eucariotas superiores é frequentemente aumentada por inserção de uma sequência intensificadora no vetor. Atualmente são conhecidas muitas sequências intensificadoras para
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54/124 genes mamíferos (globina, elastase, albumina, α-fetoproteína e insulina). Tipicamente, no entanto, pode-se usar um intensificador de um vírus de uma célula eucariótica. Exemplos incluem o intensificador de SV40 no lado tardio da origem de replicação (pb 100-270), o intensificador do promotor inicial de citomegalovírus, o intensificador de polioma no lado tardio da origem de replicação, e intensificadores de adenovírus. Veja também Yaniv, Nature, 297: 17-18 (1982) sobre elementos intensificadores para ativação de promotores eucarióticos. O intensificador pode ser unido no vetor em uma posição 5' ou 3' à sequência codificadora do anticorpo anti-NKG2A, mas está localizada preferivelmente em um sítio 5' do promotor.
Componente de terminação da transcrição [000133] Os vetores de expressão em células hospedeiras eucarióticas (por exemplo, de leveduras, de fungos, de insetos, de plantas, de animal, humanas ou células nucleadas de outros organismos multicelulares) também conterão sequências necessárias para a terminação da transcrição e para a estabilização do mRNA. Estas sequências são comumente disponíveis a partir da extremidade 5', ocasionalmente da extremidade 3', de regiões não traduzidas de DNAs ou cDNAs eucarióticos ou virais. Essas regiões contêm segmentos de nucleotídeos transcritos como fragmentos poliadenilados na porção não traduzida do mRNA que codifica o anticorpo anti-NKG2A. Um componente de terminação da transcrição útil é a região de poliadenilação do crescimento hormônio bovino. Veja WO 1994/11026 e o vetor de expressão nela descrito.
Seleção e transformação de células hospedeiras [000134] Células hospedeiras adequadas à clonagem ou expressão do DNA nos vetores aqui apresentados são as células procarióticas, de leveduras ou de eucariotas superiores descritas acima. Procariotas adequados para essa finalidade incluem eubactérias como, por exem
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55/124 plo, organismos Gram-negativos ou Gram-positivos, por exemplo, Enterobacteriaceae, por exemplo, Escherichia, por exemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por exemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por exemplo, Serratia marcescans, e Shigella, além de bacilos como, por exemplo, B. subtilis e B. licheniformis (por exemplo, B. licheniformis 41 P descrito em DD 266.710, publicado em 12 de abril de 1989), Pseudomonas, por exemplo, P. aeruginosa, e Streptomyces. Um hospedeiro de clonagem de E. coli preferido é E. coli 294 (ATCC 31.446), embora outras cepas como, por exemplo, E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31.537) e E. coli W3110 (ATCC 27.325) sejam adequadas. Esses exemplos são ilustrativos, e não limitantes.
[000135] Além dos procariotas, micróbios eucarióticos como, por exemplo, fungos filamentosos ou leveduras, são hospedeiros de clonagem ou expressão adequados para os vetores que codificam o anticorpo anti-NKG2A. Saccharomyces cerevisiae, ou a levedura de padaria comum, é a levedura mais comumente usada entre os microorganismos hospedeiros eucarióticos inferiores. No entanto, vários outros gêneros, espécies e cepas são comumente disponíveis e úteis nesse relatório descritivo, por exemplo, Schizosaccharomyces pombe; hospedeiros de Kluyveromyces como, por exemplo, K. lactis, K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906), K. thermotolerans e K. marxianus; Yarrowia (EP 402.226); Pichia pastoris (EP 183.070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244.234); Neurospora crassa; Schwanniomyces como, por exemplo, Schwanniomyces occidentalis; e fungos filamentosos como, por exemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, e hospedeiros de Aspergillus como, por exemplo, A. nidulans e A. niger.
[000136] Células hospedeiras adequadas à expressão de anticorpo
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56/124 anti-NKG2A glicosilado são derivadas de organismos multicelulares. Exemplos de células de invertebrados incluem células de plantas e insetos. Foram identificadas várias cepas de baculovírus e variantes e células hospedeiras de inseto permissivas correspondentes para hospedeiros como, por exemplo, Spodoptera frugiperda (lagarta), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca das frutas) e Bombyx mori. Diversas cepas virais para transfecção são disponíveis publicamente, por exemplo, a variante L-1 de Autographa californica NPV e a cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV, e esses vírus podem ser usados como o vírus do relatório descritivo de acordo com a presente invenção, particularmente para transfecção de células de Spodoptera frugiperda.
[000137] Culturas de células de plantas de algodão, milho, batata, soja, petúnia, tomate e tabaco também podem ser utilizadas como hospedeiros.
[000138] No entanto, o maior interesse tem sido em células de vertebrados, e a propagação de células de vertebrados em cultura (cultura de tecido) se tornou um procedimento de rotina. Exemplos de linhagens de células hospedeiras de mamíferos úteis são a linhagem de rim de macaco CV1 transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); a linhagem embrionária de rim humano (HEK) (células 293 ou 293 subclonadas para o crescimento em cultura em suspensão, Graham et al.,
J. Gen Virol., 36: 59 (1977)); células de rim de filhote de hamster (BHK, ATCC CCL 10); células do ovário de hamster chinês/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4.216 (1980), incluindo linhagens de células DG44 (Urlaub et al., Som. Cell e Mol. Gen., 12: 555-566 (1986)) e DP12); células de Sertoli de camundongo (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23: 243-251 (1980)); células de rim de macaco (CV1 ATCC CCL 70); células de rim macaco africano verde (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano
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57/124 (HELA, ATCC CCL 2); células de rim canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de fígado de rato búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células pulmonares humanas (W138, ATCC CCL 75); células hepáticas humanas (Hep G2, HB 8065); células de tumor mamário de camundongo (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383: 44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; e uma linhagem de hepatoma humano (Hep G2).
[000139] As células hospedeiras são transformadas com os vetores de expressão ou de clonagem descritos acima para a produção do anticorpo anti-NKG2A e cultivadas em meios nutrientes convencionais modificados da forma adequada à indução de promotores, à seleção de transformantes ou à amplificação dos genes que codificam as sequências desejadas.
Cultivo das células hospedeiras [000140] As células hospedeiras usadas para a produção do anticorpo anti-NKG2A dessa invenção podem ser cultivadas em diversos meios. Meios disponíveis comercialmente como, por exemplo, o F10 de Ham (Sigma), Meio Essencial Mínimo ((MEM), (Sigma)), RPMI1640 (Sigma), FreeStyle™ (Cibco) e Meio de Eagle Modificado por Dulbecco ((DMEM), Sigma) são adequados ao cultivo das células hospedeiras. Além disso, qualquer um dos meios descritos, por exemplo, em Ham et al., Meth. Enz. 58: 44 (1979); Barnes et al., Anal. Biochem., 102: 255 (1980); Patentes U.S. Nos 4.767.704, 4.657.866, 4.927.762, 4.560.655 ou 5.122.469; WO 1990/03430; WO 1987/00195; ou Patente U.S. Re. 30.985, pode ser usado como meios de cultura para as células hospedeiras. Qualquer um desses meios pode ser suplementado da forma necessária com hormônios e/ou outros fatores do crescimento (por exemplo, insulina, transferrina ou fator de crescimento epidérmico), sais (por exemplo, cloreto de sódio, cálcio, magnésio e fosfato), tampões (por exemplo, HEPES), nucleotídeos (por exemplo, adenosi
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58/124 na e timidina), antibióticos (por exemplo, o fármaco Gentamicina TM), microelementos (definidos como compostos inorgânicos normalmente presentes em concentrações finais na faixa micromolar), e glicose ou uma fonte de energia equivalente. Quaisquer outros suplementos necessários também podem ser incluídos em concentrações apropriadas que seriam conhecidas por aqueles versados na técnica. As condições de cultura como, por exemplo, temperatura, pH, e semelhantes, são aquelas usadas previamente com a célula hospedeira selecionada para a expressão, e ficarão evidentes para aqueles versados na técnica. Purificação do anticorpo anti-NKG2A [000141] Quando são utilizadas técnicas recombinantes, o anticorpo pode ser produzido intracelularmente ou no espaço periplasmático, ou diretamente secretado no meio. Caso o anticorpo seja produzido intracelularmente, como uma primeira etapa, os restos particulados, células hospedeiras ou fragmentos lisados, serão removidos, por exemplo, por centrifugação ou ultrafiltração. Carter et al., Bio/Technology, 10: 163167 (1992) descrevem um procedimento para o isolamento de anticorpos que são secretados no espaço periplasmático de E. coli. Resumidamente, a pasta de células é descongelada na presença de acetato de sódio (pH 3,5), EDTA e fluoreto de fenilmetilsulfonila (PMSF) ao longo de cerca de 30 minutos. Os restos celulares podem então ser removidos por centrifugação. Quando o anticorpo for secretado no meio, os sobrenadantes destes sistemas de expressão serão geralmente primeiro concentrados com o uso de um filtro de concentração de proteína disponível comercialmente, por exemplo, uma unidade de ultrafiltração AMICON™ ou MILLIPORE PELLICON™. Um inibidor de protease como, por exemplo, fluoreto de fenilmetilsulfonila (PMSF), pode ser incluído em qualquer uma das etapas anteriores para inibir a proteólise, e podem ser acrescentados antibióticos para evitar o crescimento de contaminantes imprevistos.
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59/124 [000142] A composição de anticorpo preparada a partir das células pode ser purificada usando, por exemplo, cromatografia em hidroxilapatita, eletroforese em gel, diálise e cromatografia por afinidade, com a cromatografia por afinidade sendo a técnica de purificação preferida. A adequabilidade da proteína A como ligante de afinidade depende da espécie e do isótipo de qualquer domínio Fc de imunoglobulina que está presente no anticorpo. A proteína A pode ser usada para a purificação de anticorpos que são baseados em cadeias pesadas humanas gama 1, gama ou gama 4 (Lindmark et al., J. Immunol. Meth., 62: 1-13 (1983)). A proteína G é recomendada para todos os isótipos de camundongo e para γ humana 3 (Guss et al., EMBO J., 5: 1.567-1.575 (1986)). A matriz à qual o ligante de afinidade está anexado é mais frequentemente agarose, mas outras matrizes são disponíveis. Matrizes mecanicamente estáveis como, por exemplo, vidro com controle de poros ou poli(estirenodivinil)benzeno, permitem taxas de fluxo mais rápidas e tempos de processamento mais curtos do que os que podem ser obtidos com agarose. Quando o anticorpo compreender um domínio de CH3, a resina BAKERBOND ABX™ (J. T. Baker, Phillipsburg,
N.J.) será útil para a purificação. Outras técnicas para a purificação de proteína como, por exemplo, fracionamento em uma coluna de troca iônica, precipitação de etanol, HPLC de fase reversa, cromatografia em sílica, cromatografia em heparina SEPHAROSE™, cromatografia em uma resina de troca aniônica ou catiônica (por exemplo, uma coluna de ácido poliaspártico), cromatofocalização, SDS-PAGE e precipitação de sulfato de amônio também são disponíveis, dependendo do anticorpo a ser recuperado.
[000143] Um método de purificação baseado na proteína A exemplar para Z270, ou versões humanizadas deste, é descrito no Exemplo 6. Formulações farmacêuticas [000144] Em uma modalidade, a presente invenção fornece uma
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60/124 composição farmacêutica que compreende anticorpos, como aqui descritos, junto com um ou mais veículos.
[000145] Consequentemente, um objetivo da invenção é o fornecimento de uma formulação farmacêutica que compreende um anticorpo desse tipo, que está presente em uma concentração de 1 mg/ml a 500 mg/ml, e em que a referida formulação possui um pH de 2,0 a 10,0. A formulação pode ainda compreender um sistema tampão, conservante(s), agente(s) de tonicidade, agente(s) quelante(s), estabilizantes e tensoativos. Em uma modalidade, a formulação farmacêutica é uma formulação aquosa, ou seja, uma formulação que compreende água. Uma formulação desse tipo é tipicamente uma solução ou uma suspensão. Em uma modalidade adicional, a formulação farmacêutica é uma solução aquosa. O termo formulação aquosa é definido como uma formulação que compreende pelo menos 50 %p/p de água. Da mesma forma, o termo solução aquosa é definido como uma solução que compreende pelo menos 50 %p/p de água, e o termo suspensão aquosa é definido como uma suspensão que compreende pelo menos 50 %p/p de água.
[000146] Em outra modalidade, a formulação farmacêutica é uma formulação liofilizada à qual o médico ou o paciente adiciona solventes e/ou diluentes, antes de sua utilização.
[000147] Em outra modalidade, a formulação farmacêutica é uma formulação seca (por exemplo, liofilizada ou seca por pulverização) pronta para uso, sem qualquer dissolução prévia.
[000148] Em um aspecto adicional, a formulação farmacêutica compreende uma solução aquosa de um anticorpo desse tipo, e um tampão, em que o anticorpo está presente em uma concentração de 1 mg/ml ou acima, e em que a referida formulação possui um pH de cerca de 2,0 a cerca de 10,0.
[000149] Em outra modalidade, o pH da formulação está na faixa se
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61/124 lecionada da lista que consiste em cerca de 2,0 a cerca de 10,0, cerca de 3,0 a cerca de 9,0, cerca de 4,0 a cerca de 8,5, cerca de 5,0 a cerca de 8,0, e cerca de 5,5 a cerca de 7,5.
[000150] Em uma modalidade adicional, o tampão é selecionado do grupo que consiste em acetato de sódio, carbonato de sódio, citrato, glicilglicina, histidina, glicina, lisina, arginina, di-hidrogenofosfato de sódio, hidrogeno fosfato dissódico, fosfato de sódio, e tris(hidroximetil)aminometano, bicina, tricina, ácido málico, succinato, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido aspártico ou misturas destes. Cada um desses tampões específicos constitui uma modalidade alternativa da invenção.
[000151] Em uma modalidade adicional, a formulação ainda compreende um conservante farmaceuticamente aceitável. O conservante pode ser selecionado, por exemplo, do grupo que consiste em fenol, ocresol, m-cresol, p-cresol, metil p-hidroxibenzoato, propil phidroxibenzoato, 2-fenoxietanol, butil p-hidroxibenzoato, 2-feniletanol, álcool benzílico, clorobutanol, e timerosal, bronopol, ácido benzóico, imidureia, clorexedina, desidroacetato de sódio, clorocresol, etil phidroxibenzoato, cloreto de benzetônio, clorfenesina (3pclorfenoxipropano-1,2-diol), ou misturas destes. O conservante pode estar presente, por exemplo, em uma concentração de 0,1 mg/ml a 20 mg/ml, de 0,1 mg/ml a 5 mg/ml, de 5 mg/ml a 10 mg/ml, ou de 10 mg/ml a 20 mg/ml. Cada um desses conservantes específicos constitui uma modalidade alternativa da invenção. O uso de um conservante em composições farmacêuticas é bem-conhecido por aqueles versados na técnica. Por conveniência, faz-se referência a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19a edição, 1995.
[000152] Em uma modalidade adicional, a formulação ainda compreende um agente isotônico. O agente isotônico pode ser selecionado, por exemplo, do grupo que consiste em um sal (por exemplo, cloreto
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62/124 de sódio), um açúcar ou álcool de açúcar, um aminoácido (por exemplo, L-glicina, L-histidina, arginina, lisina, isoleucina, ácido aspártico, triptofano, treonina), um alditol (por exemplo, glicerol (glicerina), 1,2propanodiol (propileno glicol), 1,3-propanodiol, 1,3-butanodiol) polietilenoglicol (por exemplo, PEG400), ou misturas destes. Qualquer açúcar, por exemplo, mono-, di-, ou polissacarídeos, ou glucanos hidrossolúveis, incluindo, por exemplo, frutose, glicose, manose, sorbose, xilose, maltose, lactose, sacarose, trehalose, dextrana, pululan, dextrina, ciclodextrina, amido solúvel, hidroxietilamido e carboximetilcelulose-Na, pode ser usado. Em uma modalidade, o aditivo de açúcar é sacarose. Álcool de açúcar é definido como um hidrocarboneto C4-C8 que possui pelo menos um grupo -OH e inclui, por exemplo, manitol, sorbitol, inositol, galactitol, dulcitol, xilitol e arabitol. Em uma modalidade, o aditivo de álcool de açúcar é manitol. Os açúcares ou os alcoóis de açúcar mencionados acima podem ser usados individualmente ou em combinação. Não há limite fixo para a quantidade usada, desde que o açúcar ou o álcool de açúcar seja solúvel na preparação líquida e não afete de forma adversa os efeitos estabilizantes obtidos com a utilização dos métodos da invenção. A concentração do açúcar ou do álcool de açúcar pode ser, por exemplo, entre cerca de 1 mg/ml e cerca de 150 mg/ml. O agente isotônico pode estar presente em uma concentração, por exemplo, de 1 mg/ml a 50 mg/ml, de 1 mg/ml a 7 mg/ml, de 8 mg/ml a 24 mg/ml ou de 25 mg/ml a 50 mg/ml. Cada um desses agentes isotônicos específicos constitui uma modalidade alternativa da invenção. O uso de um agente isotônico em composições farmacêuticas é bem-conhecido por aqueles versados na técnica. Por conveniência, faz-se referência a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19a edição, 1995.
[000153] Em uma modalidade adicional, a formulação também compreende um agente quelante. O agente quelante pode ser seleciona
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63/124 do, por exemplo, de sais de ácido etilenodiamina-tetra-acético (EDTA), ácido cítrico e ácido aspártico, e misturas destes. O agente quelante pode estar presente, por exemplo, em uma concentração de 0,1 mg/ml a 5 mg/ml, de 0,1 mg/ml a 2 mg/ml ou de 2 mg/ml a 5 mg/ml. Cada um desses agentes quelantes específicos constitui uma modalidade alternativa da invenção. O uso de um agente quelante em composições farmacêuticas é bem-conhecido por aqueles versados na técnica. Por conveniência, faz-se referência a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19a edição, 1995.
[000154] Em uma modalidade adicional da invenção, a formulação ainda compreende um estabilizante. O uso de um estabilizante em composições farmacêuticas é bem-conhecido por aqueles versados na técnica. Por conveniência, faz-se referência a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19a edição, 1995. Mais particularmente, as composições da invenção podem ser composições farmacêuticas líquidas estabilizadas cujos componentes terapeuticamente ativos incluem um polipeptídeo que possivelmente exibe formação de agregados durante o armazenamento em formulações farmacêuticas líquidas. O termo formação de agregados significa uma interação física entre as moléculas do polipeptídeo que resulta na formação de oligômeros, que podem permanecer solúveis, ou grandes agregados visíveis que se precipitam da solução. O termo durante o armazenamento significa uma composição farmacêutica líquida ou uma formulação que, uma vez preparada, não é administrada imediatamente a um indivíduo. Em vez disso, após a preparação, ela é embalada para armazenamento, em uma forma líquida, em um estado congelado ou em uma forma seca para reconstituição posterior em uma forma líquida ou em outra forma adequada à administração a um indivíduo. O termo forma seca significa que a composição farmacêutica líquida ou a formulação é seca por secagem por congelamento (ou seja, liofilização; veja, por
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64/124 exemplo, Williams e Polli (1984) J. Parenteral Sci. Technol. 38: 48-59), secagem por vaporização (veja Masters (1991) em Spray-Drying Handbook (5a edição; Longman Scientific e Technical, Essez, G.B.), pp. 491-676; Broadhead et al. (1992) Drug Devel. Ind. Pharm. 18: 1.169-1.206; e Mumenthaler et al. (1994) Pharm. Res. 11: 12-20) ou secagem ao ar (Carpenter e Crowe (1988) Cryobiology 25: 459-470; e Roser (1991) Biopharm. 4:47-53). A formação de agregados por um polipeptídeo durante o armazenamento de uma composição farmacêutica líquida pode afetar de forma adversa a atividade biológica daquele polipeptídeo, resultando em perda de eficácia terapêutica da composição farmacêutica. Além disso, a formação de agregados pode causar outros problemas como, por exemplo, bloqueio de sondas, membranas ou bombas quando a composição farmacêutica que contém polipeptídeo é administrada com o uso de um sistema de infusão.
[000155] As composições farmacêuticas da invenção podem ainda compreender uma quantidade de uma base de aminoácido suficiente para diminuir a formação de agregados pelo polipeptídeo durante o armazenamento da composição. O termo base de aminoácido significa um aminoácido ou uma combinação de aminoácidos, em que certo aminoácido está presente em sua forma de base livre ou em sua forma de sal. Quando for usada uma combinação de aminoácidos, todos os aminoácidos poderão estar presentes em suas formas de base livre, todos poderão estar presentes em suas formas de sal, ou alguns poderão estar presentes em suas formas de base livre, enquanto outros estarão presentes em suas formas de sal. Em uma modalidade, os aminoácidos a serem usados na preparação das composições da invenção são aqueles que carregam uma cadeia lateral com carga como, por exemplo, arginina, lisina, ácido aspártico e ácido glutâmico. Qualquer estereoisômero (ou seja, L, D ou uma mistura destes) de um aminoácido específico (por exemplo, metionina, histidina, imidazol, ar
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65/124 ginina, lisina, isoleucina, ácido aspártico, triptofano, treonina e misturas destes) ou combinações desses estereoisômeros, pode estar presente nas composições farmacêuticas da invenção, desde que o aminoácido específico esteja presente em sua forma de base livre ou em sua forma de sal. Em uma modalidade, é usado o L-estereoisômero. As composições da invenção também podem ser formuladas com análogos desses aminoácidos. O termo análogo de aminoácido significa um derivado do aminoácido de ocorrência natural que produz o efeito desejado de diminuição da formação de agregados pelo polipeptídeo durante o armazenamento das composições farmacêuticas líquidas da invenção. Análogos de arginina adequados incluem, por exemplo, aminoguanidina, ornitina e N-monoetil L-arginina; análogos de metionina adequados incluem etionina e butionina; e análogos de cisteína adequados incluem S-metil-L cisteína. Como ocorre com outros aminoácidos, os análogos de aminoácidos são incorporados nas composições em sua forma de base livre ou em sua forma de sal. Em uma modalidade adicional da invenção, os aminoácidos ou análogos de aminoácidos são usados em uma concentração que seja suficiente para evitar ou retardar a agregação da proteína.
[000156] Em uma modalidade adicional da invenção, pode ser adicionada metionina (ou outros aminoácidos sulfúricos ou análogos de aminoácidos) para inibir a oxidação de resíduos de metionina em sulfóxido de metionina, quando o polipeptídeo que atua como o agente terapêutico for um polipeptídeo que compreende pelo menos um resíduo de metionina suscetível a esta oxidação. O termo inibir significa o acúmulo mínimo de espécies oxidadas de metionina ao longo do tempo. A inibição da oxidação de metionina resulta em uma maior retenção do polipeptídeo em sua forma molecular adequada. Qualquer estereoisômero de metionina (L ou D), ou combinações destes, pode ser usado. A quantidade a ser adicionada deve ser uma quantidade
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66/124 suficiente para inibir a oxidação dos resíduos de metionina, de tal forma que a quantidade de sulfóxido de metionina seja aceitável pelas agências reguladoras. Tipicamente, isso significa que a composição não contém mais do que cerca de 10% a cerca de 30% de sulfóxido de metionina. Geralmente, isso pode ser obtido por adição de metionina, de tal forma que a proporção de metionina adicionada aos resíduos de metionina varie de cerca de 1:1 a cerca de 1.000:1, por exemplo, 10:1 a cerca de 100:1.
[000157] Em uma modalidade adicional, a formulação ainda compreende um estabilizante selecionado do grupo de polímeros de alto peso molecular ou compostos de baixo molecular. Em uma modalidade adicional da invenção, o estabilizante é selecionado de polietileno glicol (por exemplo, PEG 3350), álcool polivinílico (PVA), polivinilpirrolidona, carbóxi-/hidroxicelulose ou derivados desta (por exemplo, HPC, HPCSL, HPC-L e HPMC), ciclodextrinas, substâncias que contêm enxofre como, por exemplo, monotioglicerol, ácido tioglicólico e 2metiltioetanol, e diferentes sais (por exemplo, cloreto de sódio). Cada um desses estabilizantes específicos constitui uma modalidade alternativa da invenção.
[000158] As composições farmacêuticas também podem compreender agentes estabilizantes adicionais que aumentam ainda mais a estabilidade de um polipeptídeo terapeuticamente ativo nelas contido. Agentes estabilizantes de interesse particular para a presente invenção incluem, sem limitação, metionina e EDTA, que protegem o polipeptídeo contra a oxidação de metionina, e um tensoativo não iônico que protege o polipeptídeo contra a agregação associada ao congelamento-descongelamento ou cisalhamento mecânico.
[000159] Em uma modalidade adicional, a formulação ainda compreende um tensoativo. O tensoativo pode ser selecionado, por exemplo, de um detergente, óleo de rícino etoxilado, glicerídeos poliglicolizados,
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67/124 monoglicerídeos acetilados, ésteres de ácido graxo de sorbitano, polímeros em bloco de polioxipropileno-polioxietileno (por exemplo, poloxâmeros, tais como Pluronic® F68, poloxâmero 188 e 407, Triton X100), ésteres de ácido graxo de polioxietileno sorbitano, polioxietileno e derivados de polietileno, tais como derivados alquilados e alcoxilados (Tweens, por exemplo, Tween-20, Tween-40, Tween-80 e Brij-35), monoglicerídeos ou derivados etoxilados destes, diglicerídeos ou derivados de polioxietileno destes, alcoóis, glicerol, lectinas e fosfolipídeos (por exemplo, fosfatidil serina, fosfatidil colina, fosfatidil etanolamina, fosfatidil inositol, difosfatidil glicerol e esfingomielina), derivados de fosfolipídeos (por exemplo, ácido dipalmitoil fosfatídico) e lisofosfolipídeos (por exemplo, palmitoil lisofosfatidil-L-serina e 1-acil-sn-glicero-3fosfato ésteres de etanolamina, colina, serina ou treonina) e derivados de alquil, alcoxil (éster de alquila), alcóxi (éter de alquila) de lisofosfatidil e fosfatidilcolinas, por exemplo, derivados de lauroil e miristoil de lisofosfatidilcolina, dipalmitoilfosfatidilcolina, e modificações do grupo polar principal, ou seja, colinas, etanolaminas, ácido fosfatídico, serinas, treoninas, glicerol, inositol, e os DODAC, DOTMA, DCP, BISHOP, lisofosfatidilserina e lisofosfatidiltreonina, e glicerofosfolipídeos carregados positivamente (por exemplo, cefalinas), gliceroglicolipídeos (por exemplo, galactopiranosídeo), esfingoglicolipídeos (por exemplo, ceramidas, gangliosídeos), dodecilfosfocolina, lisolecitina de ovo de galinha, derivados do ácido fusídico (por exemplo, tauro-di-hidrofusidato de sódio etc.), ácidos graxos de cadeia longa e sais destes, C6-C12 (por exemplo, ácido oleico e ácido caprílico), acilcarnitinas e derivados, derivados Na-acilados de lisina, arginina ou histidina, ou derivados acilados de cadeia lateral de lisina ou arginina, derivados Na-acilados de dipeptídeos que compreendem qualquer combinação de lisina, arginina ou histidina e um aminoácido neutro ou ácido, derivado Na-acilados de um tripeptídeo que compreendem qualquer combinação de um
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68/124 aminoácido neutro e dois aminoácidos com carga, DSS (docusato sódico, registro no CAS N° [577-11-7], docusato cálcico, registro no CAS N° [128-49-4], docusato potássico, registro no CAS N° [7491-09-0]), SDS (dodecil sulfato de sódio ou lauril sulfato de sódio), caprilato de sódio, ácido cólico ou derivados deste, ácidos biliares e sais destes, e conjugados de glicina ou taurina, ácido ursodesoxicólico, colato de sódio, desoxicolato de sódio, taurocolato de sódio, glicocolato de sódio, N-Hexadecil-N,N-dimetil-3-amônio-1-propanossulfonato, tensoativos aniônicos (alquil-aril-sulfonatos) monovalentes, tensoativos zwitteriônicos (por exemplo, N-alquil-N,N-dimetilamônio-1-propanossulfonatos, 3colamido-1-propildimetilamônio-1-propanossulfonato, tensoativos catiônicos (bases de amônio quaternário) (por exemplo, brometo de cetiltrimetilamônio, cloreto de cetilpiridínio), tensoativos não iônicos (por exemplo, Dodecil β-D-glicopiranosídeo), poloxaminas (por exemplo, Tetronic's), que são copolímeros em bloco tetrafuncionais derivados da adição sequencial de óxido de propileno e óxido de etileno à etilenodiamina, ou o tensoativo pode ser selecionado do grupo de derivados de imidazolina, ou misturas destes. Cada um desses tensoativos específicos constitui uma modalidade alternativa da invenção.
[000160] O uso de um tensoativo em composições farmacêuticas é bem-conhecido por aqueles versados na técnica. Por conveniência, faz-se referência a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19a edição, 1995.
[000161] Em uma modalidade adicional, a formulação ainda compreende inibidores de protease como, por exemplo, EDTA (etilenodiamina tetra-acético ácido) e HCl de benzamidina, mas outros inibidores de protease disponíveis comercialmente também podem ser usados. O uso de um inibidor de protease é particularmente útil em composições farmacêuticas que compreendem zimógenos de proteases a fim de inibir a autocatálise.
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69/124 [000162] É possível que outros ingredientes possam estar presentes na formulação farmacêutica de peptídeo da presente invenção. Esses ingredientes adicionais podem incluir agentes umidificantes, emulsificantes, antioxidantes, agentes de volume, modificadores da tonicidade, agentes quelantes, íons metálicos, veículos oleaginosos, proteínas (por exemplo, albumina sérica humana, gelatina ou proteínas) e um zwitteríon (por exemplo, um aminoácido como betaína, taurina, arginina, glicina, lisina e histidina). Esses ingredientes adicionais, evidentemente, não devem afetar de forma adversa a estabilidade global da formulação farmacêutica da presente invenção.
[000163] As composições farmacêuticas que contêm um anticorpo de acordo com a presente invenção podem ser administradas a um paciente que necessita deste tratamento em varias localizações, por exemplo, em localizações tópicas, por exemplo, localizações cutâneas e mucosas, em localizações que evitam a absorção, por exemplo, a administração em uma artéria, em uma veia, no coração, e em localizações que envolvem absorção, por exemplo, a administração na pele, sob a pele, em um músculo ou no abdome.
[000164] A administração de composições farmacêuticas de acordo com a invenção pode ocorrer por meio de diversas vias de administração, por exemplo, por via subcutânea, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, lingual, sublingual, bucal, na boca, oral, no estômago e intestino, nasal, pulmonar, por exemplo, através dos bronquíolos e alvéolos, ou uma combinação destas, por via epidérmica, dérmica, transdérmica, vaginal, retal, ocular, por exemplo, através da conjuntiva, uretral e parenteral aos pacientes que necessitam deste tratamento.
[000165] As composições da presente invenção podem ser administradas em várias formas de dosagem, por exemplo, como soluções, suspensões, emulsões, microemulsões, emulsão múltipla, espumas,
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70/124 unguentos, pastas, emplastros, pomadas, comprimidos, comprimidos revestidos, enxágues, cápsulas, por exemplo, cápsulas de gelatina dura e cápsulas de gelatina macia, supositórios, cápsulas retais, gotas, géis, sprays, pó, aerossóis, inalantes, colírios, pomadas oftálmicas, enxágues oftálmicos, pessários vaginais, anéis vaginais, pomadas vaginais, solução para injeção, soluções que se transformam in situ, por exemplo, que se gelificam in situ, que se depositam in situ, que se precipitam in situ, que se cristalizam in situ, solução para infusão e implantes.
[000166] As composições da invenção podem ainda ser compostas, ou anexadas, por exemplo, por meio de interações covalentes, hidrofóbicas e eletrostáticas, por um veículo de fármaco, sistema de liberação de fármacos e sistema de liberação de fármacos avançado, a fim de aumentar ainda mais a estabilidade do anticorpo, aumentar a biodisponibilidade, aumentar a solubilidade, diminuir os efeitos adversos, obter cronoterapia, bem-conhecidos por aqueles versados na técnica, e aumentam a adesão do paciente, ou qualquer combinação destes. Exemplos de veículos, sistemas de liberação de fármacos e sistemas de liberação de fármacos avançados incluem, sem limitação, polímeros, por exemplo, celulose e derivados, polissacarídeos, por exemplo, dextrana e derivados, amido e derivados, poli(vinil álcool), polímeros de acrilato e metacrilato, polilático e poliglicólico ácido e copolímeros em bloco destes, polietileno glicóis, proteínas transportadoras, por exemplo, albumina, géis, por exemplo, sistemas de termogelificação, por exemplo, sistemas copoliméricos em bloco bem-conhecidos por aqueles versados na técnica, micelas, lipossomos, microesferas, nanoparticulados, cristais líquidos e dispersões destes, fase L2 e dispersões destas, bem-conhecidos por aqueles versados na técnica do comportamento de fase em sistemas de lipídeo-água, micelas poliméricas, emulsões múltiplas, autoemulsificantes, auto
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71/124 microemulsificantes, ciclodextrinas e derivados destas, e dendrímeros. [000167] As composições da presente invenção são úteis na formulação de sólidos, semissólidos, pós e soluções para administração pulmonar de um anticorpo, com a utilização, por exemplo, de um inalador de dose metrificada, inalador de pó seco e um nebulizador, todos sendo dispositivos bem-conhecidos por aqueles versados na técnica. [000168] As composições da presente invenção também são úteis na formulação de sistemas de liberação controlada, sustentada, prolongada, retardada e lenta de fármacos. Mais especificamente, sem limitação, as composições são úteis na formulação de sistemas de liberação parenteral controlada e sistemas de liberação sustentada (ambos os sistemas levando a uma redução de muitas vezes do número de administrações), bem-conhecidos por aqueles versados na técnica. Ainda mais preferivelmente, são usados sistemas de liberação controlada e sustentada administrados por via subcutânea. Sem limitar o escopo da invenção, exemplos de sistemas e composições de liberação controlada úteis são hidrogéis, géis oleaginosos, cristais líquidos, micelas poliméricas, microesferas e nanopartículas.
[000169] Os métodos para a produção de sistemas de liberação controlada úteis para as composições da presente invenção incluem, sem limitação, cristalização, condensação, cocristalização, precipitação, coprecipitação, emulsificação, dispersão, homogeneização em alta pressão, encapsulação, secagem por vaporização, microencapsulação, coacervação, separação de fases, evaporação de solventes para a produção de microesferas, extrusão e processos de líquidos supercríticos. Faz-se referência geral ao Handbook of Pharmaceutical Controlled Release (Wise, D.L., ed. Marcel Dekker, Nova York, 2000) e Drug and the Pharmaceutical Sciences, vol. 99: Protein Formulation and Delivery (MacNally, E.J., ed. Marcel Dekker, Nova York, 2000). [000170] A administração parenteral pode ser realizada por injeção
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72/124 subcutânea, intramuscular, intraperitoneal ou intravenosa, por meio de uma seringa, opcionalmente uma seringa do tipo caneta. Alternativamente, a administração parenteral pode ser realizada por meio de uma bomba de infusão. Uma opção adicional é uma composição que pode ser uma solução ou suspensão para a administração do composto de anticorpo na forma de um spray nasal ou pulmonar. Ainda como opção adicional, as composições farmacêuticas que contêm um anticorpo da invenção também podem ser adaptadas à administração transdérmica, por exemplo, por uma injeção sem agulha ou por um emplastro, opcionalmente um emplastro iontoforético, ou administração transmucosa, por exemplo, bucal.
[000171] O anticorpo pode ser administrado por meio da via pulmonar em um veículo, por exemplo, uma solução, suspensão ou pó seco, com o uso de tipos de dispositivos conhecidos adequados à liberação pulmonar de fármacos. Exemplos destes compreendem, sem limitação, os três tipos gerais de geração de aerossol para a liberação pulmonar de fármacos, e podem incluir nebulizadores de jato ou ultrassônico, inaladores de dose metrificada ou inaladores de pó seco (veja Yu J., Chien YW. Pulmonary drug delivery: Physiologic and mechanistic aspects. Crit. Rev. Ther. Drug Carr. Sys. 14(4) (1997) 395-453).
[000172] Com base na metodologia de teste padronizada, o diâmetro aerodinâmico (da) de uma partícula é definido como o diâmetro geométrico equivalente de uma partícula esférica padronizada de referência de densidade unitária (1 g/cm3). No caso mais simples, para partículas esféricas, o da está relacionado a um diâmetro de referência (d) como uma função da raiz quadrada da proporção da densidade, como descrito por:
da
P d \Pa
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73/124 [000173] Modificações para esse relacionamento ocorrem para partículas não esféricas (veja Edwards D.A., Ben-Jebria A., Langer R. Recent advances in pulmonary drug delivery using large, porous inhaled particles. J. Appl. Physiol. 84(2) (1998) 379-385). Os termos
MMAD e MMEAD são bem descritos e conhecidos na técnica (veja Edwards D.A., Ben-Jebria A., Langer R.), e representam uma medida do valor médio de uma distribuição aerodinâmica do tamanho de partícula (Recent advances in pulmonary drug delivery using large, porous inhaled particles. J. Appl. Physiol. 84(2) (1998) 379-385). O diâmetro aerodinâmico médio da massa (MMAD) e o diâmetro aerodinâmico médio eficaz da massa (MMEAD) são usados de forma intercambiável, e são parâmetros estatísticos que descrevem empiricamente o tamanho das partículas de aerossol em relação ao seu potencial para se depositar nos pulmões, independente do formato, tamanho ou densidade reais (veja Edwards D.A., Ben-Jebria A., Langer R. Recent advances in pulmonary drug delivery using large, porous inhaled particles. J. Appl. Physiol. 84(2) (1998) 379-385). O MMAD é normalmente calculado a partir da medida feita com impactadores, um instrumento que mede o comportamento inercial das partículas no ar.
[000174] Em uma modalidade adicional, a formulação pode ser aerossolizada por qualquer tecnologia de aerossolização conhecida como, por exemplo, nebulização, para obter um MMAD de partículas de aerossol de menos de 10 pm, mais preferivelmente entre 1-5 pm e principalmente, entre 1-3 pm. O tamanho de partícula preferido se baseia no tamanho mais eficaz para a liberação do fármaco às regiões profundas do pulmão, onda a proteína é otimamente absorvida (veja Edwards D.A., Ben-Jebria A., Langer A., Recent advances in pulmonary drug delivery using large, porous inhaled particles. J. Appl. Physiol. 84(2) (1998) 379-385).
[000175] A deposição nas regiões profundas do pulmão das formulaPetição 870190106907, de 22/10/2019, pág. 78/136
74/124 ções pulmonares que compreendem o anticorpo pode opcionalmente ser ainda mais otimizada pela utilização de modificações das técnicas de inalação, por exemplo, não limitadas a: fluxo de inalação lento (por exemplo, 30 l/min), prender a respiração, e tempo de estimulação.
[000176] O termo formulação estabilizada refere-se a uma formulação com estabilidade física aumentada, estabilidade química aumentada ou estabilidades física e química aumentadas.
[000177] O termo estabilidade física da formulação de proteína, como aqui usado, refere-se à tendência da proteína para formar agregados biologicamente inativos e/ou insolúveis da proteína em consequência da exposição da proteína a estresses termomecânicos e/ou à interação com interfaces e superfícies que sejam destabilizantes, por exemplo, superfícies e interfaces hidrofóbicas. A estabilidade física das formulações aquosas de proteína é avaliada por meio de inspeção visual e/ou medidas de turvação após exposição da formulação preenchida em recipientes adequados (por exemplo, cartuchos ou frascos) ao estresse mecânico/físico (por exemplo, agitação) em diferentes temperaturas por vários períodos de tempo. A inspeção visual das formulações é realizada em uma luz forte concentrada com um fundo escuro. A turvação da formulação é caracterizada por um ranking de classificação visual do grau de turvação, por exemplo, em uma escala de 0 a 3 (a formulação que não apresenta turvação corresponde a uma classificação visual de 0, e uma formulação que apresenta turvação visual na luz do dia corresponde à classificação visual 3). Uma formulação é classificada como fisicamente instável com relação à agregação de proteína quando ela mostra turvação visual na luz do dia. Alternativamente, a turvação da formulação pode ser avaliada por medidas simples da turvação bem-conhecidas por aqueles versados na técnica. A estabilidade física das formulações aquosas de proteína também pode ser avaliada com a utilização de um agente ou sonda
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75/124 espectroscópica do estado conformacional da proteína. A sonda é, de preferência, uma pequena molécula que se liga preferencialmente a uma conformação não nativa da proteína. Um exemplo de uma pequena sonda molecular espectroscópica da estrutura da proteína é Tioflavina T. A Tioflavina T é um corante fluorescente que foi usado amplamente para a detecção de fibrilas amiloides. Na presença de fibrilas, e talvez também de outras configurações de proteína, a Tioflavina T dá origem a um novo máximo de excitação em torno de 450 nm e uma emissão aumentada am torno de 482 nm, quando ligada a uma forma de fibrila da proteína. A Tioflavina T não ligada é essencialmente não fluorescente nos comprimentos de onda.
[000178] Outras pequenas moléculas podem ser usadas como sondas das mudanças na estrutura da proteína do estado nativo para estados não nativos. Por exemplo, as sondas de porção hidrofóbica que se ligam preferencialmente às porções hidrofóbicas expostas de uma proteína. As porções hidrofóbicas estão geralmente ocultas dentro da estrutura terciária de uma proteína em seu estado nativo, mas ficam expostas à medida que uma proteína começa a se desdobrar ou desnaturar. Exemplos dessas pequenas sondas moleculares espectroscópicas são corantes aromáticos, hidrofóbicos, por exemplo, antraceno, acridina, fenantrolina, ou semelhantes. Outras sondas espectroscópicas são formadas por complexos de metal-aminoácido, por exemplo, complexos metálicos de cobalto de aminoácidos hidrofóbicos como, por exemplo, fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina e valina, ou semelhantes.
[000179] O termo estabilidade química da formulação de proteína, como aqui usado, refere-se às mudanças químicas covalentes na estrutura da proteína que levam à formação de produtos da degradação química com menos potência biológica potencial e/ou propriedades imunogênicas aumentadas potenciais, comparada com a estrutura da
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76/124 proteína nativa. Podem ser formados vários produtos da degradação química, dependendo do tipo e da natureza da proteína nativa e do ambiente ao qual a proteína é exposta. A eliminação da degradação química pode, muito provavelmente, não ser evitada completamente, e quantidades crescentes de produtos da degradação química são frequentemente observadas durante o armazenamento e uso da formulação de proteína, como é bem-conhecido por aqueles versados na técnica. A maioria das proteínas possui uma tendência à desamidação, um processo no qual o grupo amida da cadeia lateral em resíduos glutaminila ou asparaginila é hidrolisado para formar um ácido carboxílico livre. Outras vias de degradações envolvem a formação de produtos de transformação de alto peso molecular, nos quais duas ou mais moléculas de proteína são ligadas covalentemente entre si por meio de interações de transamidação e/ou dissulfeto, levando à formação de produtos de degradação diméricos, oligoméricos e poliméricos ligados covalentemente (Stability of Protein Pharmaceuticals, Ahern. T.J. & Manning M.C., Plenum Press, Nova York 1992). A oxidação (de, por exemplo, resíduos de metionina) pode ser mencionada como outra variante da degradação química. A estabilidade química da formulação de proteína pode ser avaliada medindo-se a quantidade dos produtos da degradação química em vários momentos após a exposição a diferentes condições ambientais (a formação de produtos de degradação pode frequentemente ser acelerada, por exemplo, por aumento da temperatura). A quantidade de cada produto de degradação individual é frequentemente determinada por separação dos produtos de degradação, dependendo do tamanho e/ou da carga da molécula, com o uso de várias técnicas de cromatografia (por exemplo, SEC-HPLC e/ou RP-HPLC).
[000180] Desse modo, como exposto acima, uma formulação estabilizada refere-se a uma formulação com estabilidade física aumentada,
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77/124 estabilidade química aumentada ou estabilidade física e química aumentadas. Em geral, uma formulação devem ser estável durante o uso e armazenamento (em conformidade com as condições de uso e armazenamento recomendadas), até que seja atingido o prazo de validade.
[000181] Em uma modalidade da invenção, a formulação farmacêutica que compreende o anticorpo é estável por mais de 6 semanas de uso e por mais de 3 anos de armazenamento.
[000182] Em outra modalidade da invenção, a formulação farmacêutica que compreende o anticorpo é estável por mais de 4 semanas de uso e por mais de 3 anos de armazenamento.
[000183] Em uma modalidade adicional da invenção, a formulação farmacêutica que compreende o anticorpo é estável por mais de 4 semanas de uso e por mais de dois anos de armazenamento.
[000184] Ainda em uma modalidade adicional da invenção, a formulação farmacêutica que compreende o anticorpo é estável por mais de 2 semanas de uso e por mais de dois anos de armazenamento.
[000185] Formulações de anticorpo adequadas também podem ser determinadas examinando-se experiências com outros anticorpos monoclonais terapêuticos já desenvolvidos. Vários anticorpos monoclonais demonstraram que são eficientes em situações clínicas como, por exemplo, Rituxan (Rituximab), Herceptina (Trastuzumab) Xolair (Omalizumab), Bexxar (Tositumomab), Campath (Alemtuzumab), Zevalin, Oncolym e formulações similares podem ser usadas com os anticorpos dessa invenção. Por exemplo, pode ser fornecido um anticorpo monoclonal em uma concentração de 10 mg/ml em frascos de uso único de 100 mg (10 ml) ou 500 mg (50 ml), formulado para administração IV em cloreto de sódio 9,0 mg/ml, diidrato de citrato de sódio
7,35 mg/ml, polissorbato 80 0,7 mg/ml e água estéril para injeção. O pH é ajustado em 6,5. Em outra modalidade, o anticorpo é fornecido
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78/124 em uma formulação que compreende Na-Citrato a cerca de 20 mM, NaCI a cerca de 150 mM, em pH de aproximadamente 6,0.
Aplicações terapêuticas [000186] Também são fornecidos métodos para o tratamento de um paciente com a utilização de um anticorpo anti-NKG2A como aqui descrito. Em uma modalidade, a invenção fornece o uso de um anticorpo, como aqui descrito, na preparação de uma composição farmacêutica para administração a um paciente humano. Tipicamente, o paciente sofre de, ou apresenta risco para, câncer, uma doença viral, um distúrbio inflamatório ou um distúrbio autoimune. Alternativamente, o anticorpo da invenção é usado para melhorar o resultado de transplante de medula óssea em um paciente.
[000187] Por exemplo, em um aspecto, a invenção fornece um método de potencialização da atividade de linfócitos restritos por CD94/NKG2A em um paciente que necessita deste, que compreende a etapa de administração de um anticorpo anti-NKG2A humano ou humanizado ao referido paciente, cujo anticorpo reduz ou evita a ativação mediada por HLA-E do receptor de CD94/NKG2A. Em uma modalidade, o método dirigido ao aumento da atividade destes linfócitos em pacientes que possuem uma doença na qual a atividade aumentada de células NK, T e/ou NKT é benéfica, que envolve, afeta ou é causada por células suscetíveis à lise por células NK, T ou NKT, ou que é causada ou caracterizada por atividade insuficiente de células NK, T ou NKT como, por exemplo, câncer, uma doença infecciosa ou um distúrbio imune.
[000188] Mais especificamente, os métodos e as composições da presente invenção são utilizados para o tratamento de diversos cânceres e outras doenças proliferativas que incluem, sem limitação: carcinoma, incluindo o da bexiga, mama, cólon, rim, fígado, pulmão, ovário, próstata, pâncreas, estômago, cérvice, tireoide e pele, incluindo carci
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79/124 noma de célula escamosa; tumores hematopoiéticos de linhagem linfoide, incluindo leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfocítica crônica, leucemia linfoblástica aguda, linfoma de células B, linfoma de células T, linfoma de Hodgkins, linfoma não Hodgkins, linfoma de célula pilosa e linfoma de Burkitt e mieloma múltiplo; tumores hematopoiéticos de linhagem mieloide, incluindo leucemias mielógenas agudas e crônicas, leucemia promielocítica, e síndrome mielodisplásica; tumores de origem mesenquimal, incluindo fibrossarcoma e rabdomiossarcoma; outros tumores, incluindo melanoma, seminoma, teratocarcinoma, neuroblastoma e glioma; tumores do sistema nervoso central e periférico, incluindo astrocitoma, neuroblastoma, glioma e schwanomas; tumores de origem mesenquimal, incluindo fibrossarcoma, rabdomiossarcoma e osteossarcoma; e outros tumores, incluindo melanoma, xeroderma pigmentoso, ceratoacantoma, seminoma, câncer folicular da tireoide e teratocarcinoma.
[000189] Distúrbios específicos que podem ser tratados de acordo com a invenção incluem tumores hematopoiéticos de linhagem linfoide, por exemplo, tumores de célula T e de células B, incluindo, sem limitação, distúrbios de células T como, por exemplo, leucemia Tprolinfocítica (T-PLL), incluindo do tipo pequena célula e célula cerebriforme; leucemia de linfócito granular grande (LGL), de preferência do tipo célula T; síndrome de Sezary (SS); linfoma leucemia de célula T do adulto (ATLL); linfoma hepatoesplênico T-NHL; linfoma de células T periféricas/pós-tímicas (subtipos pleomórfico e imunoblástico); linfoma de células T angio-imunoblástico; linfoma de células T angiocêntrico (nasal); linfoma de célula grande anaplásico (Ki 1+); linfoma intestinal de células T; T-linfoblástico; linfoma/leucemia (T-Lbly/T-ALL), mieloma múltiplo.
[000190] Outros distúrbios proliferativos também podem ser tratados de acordo com a invenção, incluindo, por exemplo, hiperplasias, fibro
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80/124 se (especialmente pulmonar, mas também outros tipos de fibrose, por exemplo, fibrose renal), angiogênese, psoríase, aterosclerose e proliferação de músculo liso nos vasos sanguíneos, por exemplo, estenose ou re-estenose após angioplastia.
[000191] Em um aspecto em particular, os anticorpos da invenção são usados para o tratamento de doença linfoproliferativa do tipo NK de linfócitos granulares (alternativamente denominada NK-LGL), em referência a uma classe de distúrbios proliferativos que é causada pela expansão clonal de células NK ou células NK-like, ou seja, linfócitos granulares grandes que apresentam uma combinação característica de expressão de antígeno de superfície (por exemplo, CD3-, CD56+, CD16+ etc.; veja, por exemplo, Loughran (1993) Blood 82: 1). A proliferação celular subjacente a esses distúrbios pode ter efeitos variáveis, variando de sintomas leves observados em alguns pacientes até a forma agressiva, frequentemente fatal, da doença, denominada leucemia NK-LDGL. Os sintomas dessa classe de distúrbios podem incluir febre, neutropenia leve, trombocitopenia, anemia, linfocitose, esplenomegalia, hepatomegalia, linfadenopatia, infiltração da medula, e outros (veja, por exemplo, Zambello et al. (2003) Blood 102: 1.797;
Loughran (1993) Blood 82: 1; Epling-Burnette et al. (2004) Blood 200302-400).
[000192] O tratamento baseado no anticorpo CD94/NKG2A também pode ser usado para o tratamento ou prevenção de doenças infecciosas, incluindo, de preferência, quaisquer infecções causadas por uma infecção por vírus, bactérias, protozoários, bolores ou fungos. Esses organismos infecciosos virais incluem, sem limitação, hepatite do tipo A, hepatite do tipo B, hepatite do tipo C, influenza, varicela, adenovírus, herpes simples do tipo I (HSV-1), herpes simples do tipo 2 (HSV2), peste bovina, rinovírus, ecovírus, rotavírus, vírus sincicial respiratório, papiloma vírus, papiloma vírus, citomegalovírus, equinovírus, arbo
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81/124 vírus, huntavírus, vírus coxsackie, vírus da caxumba, vírus do sarampo, vírus da rubéola, vírus da pólio e o vírus da imunodeficiência humana do tipo I ou do tipo 2 (HIV-1, HIV-2). Bactérias constituem outra classe preferida de organismos infecciosos, incluindo, sem limitação, as seguintes: Estafilococos; Estreptococos, incluindo S. pyogenes; Enterococos; Bacilos, incluindo Bacillus anthracis e Lactobacillus; Listeria; Corynebacterium diphtheriae; Gardnerella, incluindo G. vaginalis; Nocardia; Streptomyces; Thermoactinomyces vulgaris; Treponema; Camphylobacter, Pseudomonas, incluindo P. aeruginosa; Legionella; Neisseria, incluindo N. gonorrhoeae e N. meningitidis; Flavobactéria, incluindo F. meningosepticum e F. odoratum; Brucela; Bordetela, incluindo B. pertussis e B. bronchiseptica; Escherichia, incluindo E. coli, Klebsiella; Enterobacter, Serratia, incluindo S. marcescens e S. liquefaciens; Edwardsiella; Proteus, incluindo P. mirabilis e P. vulgaris; Estreptobacilos; Rickettsiaceae, incluindo R. fickettsfi, Clamídia, incluindo C. psittaci e C. trachomatis; Micobactérias, incluindo M. tuberculosis, M. intracelulare, M. folluitum, M. laeprae, M. avium, M. bovis, M. africanum, M. kansasii, M. intracelulare e M. lepraernurium; e Nocardia. Protozoários podem incluir, sem limitação, leishmania, kokzidioa, e tripanossomo. Parasitas incluem, sem limitação, clamídia e rickétsia. Uma lista completa de doenças infecciosas pode ser encontrada na página da Internet do National Center for Infectious Disease (NCID) no Center for Disease Control (CDC) (endereço na Internet (www) cdc.gov/ncidod/diseases/), cuja lista é aqui incorporada por referência. Todas essas doenças são candidatas ao tratamento com o uso dos anticorpos inibidores anti-CD94/NKG2A da invenção.
[000193] Em um aspecto alternativo, os anticorpos anti-NKG2A são usados para se dirigir e matar células que expressam NKG2A, por exemplo, em um paciente que sofre de um câncer caracterizado pela expressão de CD94/NKG2A em células cancerosas, por exemplo, um
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82/124 linfoma de NK. Em uma modalidade, o anticorpo humanizado é administrado na forma de um imunoconjugado que compreende o anticorpo humanizado e um agente citotóxico.
[000194] Em um aspecto alternativo, os anticorpos anti-NKG2A são usados para tratar ou evitar um distúrbio autoimune ou inflamatório. Distúrbios autoimunes exemplares tratáveis com o uso dos presentes métodos incluem, entre outros, anemia hemolítica, anemia perniciosa, poliarterite nodosa, lúpus eritematoso sistêmico, granulomatose de Wegener, hepatite autoimune, doença de Behcet, doença de Crohn, cirrose biliar primária, escleroderma, colite ulcerativa, síndrome de Sjogren, diabetes melito do Tipo 1, uveíte, doença de Graves, doença de Alzheimer, tireoidite, miocardite, febre reumática, escleroderma, espondilite anquilosante, artrite reumatoide, glomerulonefrite, sarcoidose, dermatomiosite, miastenia gravis, polimiosite, síndrome de Guillain-Barré, esclerose múltipla, alopecia areata, pênfigo/penfigoide, penfigoide bolhoso, tireoidite de Hashimoto, psoríase e vitiligo.
[000195] Exemplos de distúrbios inflamatórios que podem ser tratados por esses métodos incluem, sem limitação, adrenalite, alveolite, angiocolecistite, apendicite, balanite, blefarite, bronquite, bursite, cardite, celulite, cervicite, colecistite, cordite, coclite, colite, conjuntivite, cistite, dermatite, diverticulite, encefalite, endocardite, esofagite, inflamação da trompa de Estáquio, fibrosite, foliculite, gastrite, gastrenterite, gengivite, glossite, hepatoesplenite, ceratite, labirintite, laringite, linfangite, mastite, otite média, meningite, metrite, mucite, miocardite, miosite, miringite (inflamação da membrana timpânica), nefrite, neurite, orquite, osteocondrite, otite, pericardite, peritendinite, peritonite, faringite, flebite, poliomielite, prostatite, pulpite, retinite, rinite, salpingite, esclerite, esclerocoroidite, escrotite, sinusite, espondilite, esteatite, estomatite, sinovite, inflamação da trompa da Eustáquio, tendinite, tonsilite, uretrite e vaginite.
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83/124 [000196] Também foi demonstrado que a morte por célula NK alorreativa de células dendríticas melhorou o resultado do enxerto de células hematopoiéticas em um transplante de medula óssea (L. Ruggeri et al., Science, 2002, 295: 2.097-2.100). Dessa forma, em outra modalidade, a invenção fornece um método para melhorar o resultado de enxerto de células hematopoiéticas em um paciente, que compreende a etapa de administração, ao referido paciente, de uma composição dessa invenção compreendendo um anticorpo de ativação. O melhor resultado do enxerto se manifesta por um dos seguintes aspectos: redução da incidência ou da gravidade da doença enxerto versus hospedeiro; sobrevida prolongada do enxerto ou uma redução ou eliminação dos sintomas da doença tratada pelo enxerto (por exemplo, um câncer hematopoiético). De preferência, esse método é usado no tratamento de leucemia.
Combinações [000197] Estão disponíveis diversos agentes terapêuticos para o tratamento de cânceres. As composições de anticorpo e os métodos da presente invenção também podem, dessa forma, ser combinados com quaisquer outros métodos geralmente empregados no tratamento da doença específica, particularmente um tumor, uma doença cancerosa ou outra doença ou distúrbio apresentado pelo paciente. Desde que uma abordagem terapêutica em particular não seja (inerentemente) sabidamente prejudicial à condição do paciente e não se contraponha significativamente ao tratamento baseado no anticorpo antiCD94/NKG2A, sua combinação com a presente invenção é contemplada.
[000198] Em relação ao tratamento de um tumor sólido, a presente invenção pode ser usada em combinação com abordagens clássicas como, por exemplo, cirurgia, radioterapia, quimioterapia, e semelhantes. Portanto, a invenção fornece terapias combinadas nas quais os
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84/124 anticorpos anti-CD94/NKG2A de acordo com a invenção são usados simultaneamente, antes ou depois de cirurgia ou radioterapia; ou são administrados aos pacientes simultaneamente, antes ou depois da administração de outro agente anticâncer. Deve-se assegurar que a cirurgia, a radioterapia ou o agente anticâncer em combinação com o agente ativo na composição dessa invenção exerce um efeito combinado vantajoso sobre o câncer.
[000199] Agentes anticâncer exemplares incluem agentes quimioterápicos, agentes hormonais, agentes antiangiogênicos, agentes antimetastáticos, anticorpos anticâncer (por exemplo, Rituximab), anticorpos contra moléculas inibidoras de KIR, inibidores do fator de crescimento, compostos promotores de apoptose, citocinas e outros agentes imunomoduladores, agentes direcionados ao tumor conjugados a toxinas ou radionuclídeos, compostos que interferem com a replicação de DNA, mitose e segregação cromossômica, e agentes que rompem a síntese e a fidelidade de precursores de polinucleotídeo.
[000200] Para distúrbios autoimunes ou inflamatórios, qualquer outro composto conhecido por ser eficaz para um ou mais tipos de distúrbios autoimunes ou inflamatórios, ou qualquer sintoma ou característica de distúrbios autoimunes ou inflamatórios, incluindo, entre outros, imunossupressores, por exemplo, azatioprina (por exemplo, Imuran), clorambucila (por exemplo, Leukeran), ciclofosfamida (por exemplo, Cytoxan), ciclosporina (por exemplo, Sandimune, Neoral), metotrexato (por exemplo, Rheumatrex), corticosteroides, prednisona (por exemplo, Deltasone, Meticorten), Etanercept (por exemplo, Enbrel), infliximab (por exemplo, Remicade), inibidores de TNF, FK-506, rapamicina, micofenolato mofetila, leflunomida, globulina antilinfócitos, desoxispergualina ou OKT.
[000201] Exemplos preferidos de compostos imunomoduladores incluem citocinas. Outros exemplos incluem compostos que possuem
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85/124 um efeito, de preferência um efeito de ativação ou potencialização da atividade de célula NK, ou de indução ou apoio à proliferação de células NK. Outros compostos para administração antes, simultaneamente ou depois das composições que compreendem os agentes da invenção são compostos adjuvantes (por exemplo, agentes antieméticos e analgésicos) e agentes antivirais.
[000202] Como será compreendido por aqueles versados na técnica, as doses apropriadas de agentes anticâncer se aproximarão daquelas já empregadas em terapias clínicas nas quais os agentes anticâncer são administrados isoladamente ou em combinação com outros agentes. Provavelmente ocorrerão variações na dosagem, dependendo da condição tratada. O médico responsável pela administração do tratamento será capaz de determinar a dose apropriada para o paciente individual.
Artigos manufaturados [000203] Em outra modalidade da invenção, é fornecido um artigo manufaturado contendo materiais úteis para o tratamento dos distúrbios descritos acima. Por exemplo, o artigo manufaturado pode compreender um recipiente que contém um anticorpo, como aqui descrito, junto com instruções que informam um usuário sobre o tratamento de um distúrbio como, por exemplo, um câncer ou uma doença viral em um mamífero com o anticorpo em uma quantidade eficaz. Em uma modalidade preferida, o mamífero é um ser humano. O artigo manufaturado tipicamente compreende um recipiente e um rótulo ou uma bula no recipiente ou a ele associado. Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas etc. Os recipientes podem ser formados por vários materiais como, por exemplo, vidro ou plástico. O recipiente contém uma composição que é eficaz para o tratamento da condição, e pode ter uma entrada de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bolsa de solução intravenosa ou um frasco
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86/124 que possui uma tampa perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). Pelo menos um agente ativo na composição é o anticorpo humanizado anti-NKG2A aqui descrito, ou um derivado de anticorpo (por exemplo, um imunoconjugado) que compreende um anticorpo humanizado desse tipo. O rótulo ou bula indica que a composição é usada para o tratamento da condição de escolha, por exemplo, câncer ou uma doença viral.
[000204] Além disso, o artigo manufaturado pode compreender: (a) um primeiro recipiente com uma composição nele contida, em que a composição compreende o anticorpo aqui descrito, e (b) um segundo recipiente com uma composição nele contida, em que a composição compreende um agente terapêutico diferente do primeiro anticorpo. O artigo manufaturado nessa modalidade da invenção pode ainda compreender uma bula que indica que a primeira e segunda composições podem ser usadas em combinação para tratar um câncer ou doença viral. Este agente terapêutico pode ser qualquer uma das terapias adjuvantes descritas na seção precedente (por exemplo, um agente quimioterápico, um agente antiangiogênico, um composto anti-hormonal, um cardioprotetor e/ou a regulados da função imune em um mamífero, incluindo uma citocina). Alternativa, ou adicionalmente, o artigo manufaturado pode ainda compreender um segundo (ou terceiro) recipiente, que compreende um tampão farmaceuticamente aceitável, por exemplo, água bacteriostática para injeção (BWFI), solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. Ele pode ainda incluir outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas.
Administração [000205] Como descrito acima, vários anticorpos monoclonais demonstraram que são eficientes em situações clínicas (como, por
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87/124 exemplo, Rituxan (Rituximab) e outros), e podem ser usados regimes de administração similares (ou seja, doses e/ou protocolos de administração) com os anticorpos dessa invenção. As posologias e dosagens para administração podem ser determinadas de acordo com métodos conhecidos para esses produtos, por exemplo, utilizando-se as instruções do fabricante. Por exemplo, uma preparação de anticorpo pode ser fornecida em uma concentração de 10 mg/ml em frascos de uso único de 100 mg (10 ml) ou 500 mg (50 ml). Uma faixa de dosagem adequada exemplar para um anticorpo da invenção pode ser entre cerca de 10 mg/m2 e 500 mg/m2. As quantidades e a posologia da injeção de anticorpos anti-NKG2A que, por exemplo, saturam as células por 24 horas, 48 horas, 72 horas ou uma semana ou um mês, podem ser determinadas levando-se em consideração a afinidade do anticorpo e seus parâmetros farmacocinéticos. No entanto, será observado que essas posologias são exemplares, e que a posologia e o esquema ideais e a tolerabilidade dos anticorpos devem ser determinados em experimentos clínicos.
Aplicações não terapêuticas [000206] Os anticorpos (por exemplo, os anticorpos humanizados anti-NKG2A) da invenção também possuem aplicações não terapêuticas.
[000207] Por exemplo, os anticorpos podem ser usados como agentes de purificação da afinidade. Nesse processo, os anticorpos são imobilizados em uma fase sólida como, por exemplo, uma resina SEPHADEX™ ou um papel de filtro, com a utilização de métodos bemconhecidos na técnica. O anticorpo imobilizado é colocado em contato com uma amostra que contém a proteína NKG2A (ou fragmento desta) a ser purificada e, posteriormente, o suporte é lavado com um solvente adequado que irá remover substancialmente todo o material na amostra, exceto a proteína NKG2A, que está ligada ao anticorpo imobiliza
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88/124 do. Finalmente, o suporte é lavado com outro solvente adequado como, por exemplo, tampão de glicina, pH 5,0, que irá liberar a proteína NKG2A do anticorpo.
[000208] Os anticorpos anti-NKG2A também podem ser úteis em ensaios diagnósticos para a proteína NKG2A, por exemplo, na detecção de sua expressão em células específicas, tecidos ou soro.
[000209] Para aplicações diagnósticas, o anticorpo tipicamente será marcado com uma porção detectável. Estão disponíveis vários marcadores que geralmente podem ser agrupados nas seguintes categorias:
(a) Radioisótopos, por exemplo, 35S, 14C, 125I, 3H e 131I. O anticorpo pode ser marcado com o radioisótopo com a utilização de técnicas descritas em Current Protocols in Immunology, Volumes 1 e 2, Coligen et al., Ed. Wiley-Interscience, Nova York, N.Y., Pubs. (1991), por exemplo, e a radioatividade pode ser medida com o uso de contagem de cintilação.
(b) Marcadores fluorescentes como, por exemplo, quelatos terrosos raros (quelatos de európio) ou fluoresceína e seus derivados, rodamina e seus derivados, dansil, Lissamina, ficoeritrina e vermelho Texas são disponíveis. Os marcadores fluorescentes podem ser conjugados ao anticorpo com o uso das técnicas descritas em Current Protocols in Immunology, supra, por exemplo. A fluorescência pode ser quantificada com a utilização de um fluorímetro.
(c) Vários marcadores enzima-substrato estão disponíveis, e a Patente U.S. N° 4.275.149 fornece uma revisão de alguns destes. A enzima geralmente catalisa uma alteração química do substrato cromogênico que pode ser medida com o uso de várias técnicas. Por exemplo, a enzima pode catalisar uma mudança de cor em um substrato, que pode ser medida por espectrofotometria. Alternativamente, a enzima pode alterar a fluorescência ou quimioluminescência do substrato. As técnicas para a quantificação de uma mudança de
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89/124 fluorescência são descritas acima. O substrato quimioluminescente se torna eletronicamente excitado por uma reação química, e pode então emitir luz que pode ser medida (com o uso de um quimioluminômetro, por exemplo) ou doa energia para um receptor fluorescente. Exemplos de marcadores enzimáticos incluem luciferases (por exemplo, luciferase de vaga-lume e luciferase bacteriana; Patente U.S. N° 4.737.456), luciferina, 2,3-di-hidroftalazinadionas, malato desidrogenase, urease, peroxidase como, por exemplo, peroxidase de raiz forte (HRPO), fosfatase alcalina, beta-galactosidase, glicoamilase, lisozima, oxidases de sacarídeo (por exemplo, glicose oxidase, galactose oxidase e glicose-
6-fosfato desidrogenase), oxidases heterocíclicas (por exemplo, uricase e xantina oxidase), lactoperoxidase, microperoxidase, e semelhantes. Técnicas para a conjugação de enzimas aos anticorpos são descritas em O'Sullivan et al., Methods for the Preparation of EnzymeAntibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, em Methods in Enzym. (Ed., J. Langone & H. Van Vunakis), Academic Press, Nova York, 73: 147-166 (1981).
[000210] Exemplos de combinações de enzima-substrato incluem, por exemplo:
(i) Peroxidase de raiz forte (HRPO) com hidrogênio peroxidase como substrato, em que a hidrogênio peroxidase oxida um corante precursor (por exemplo, ortofenileno diamina (OPD) ou cloridrato de 3,3',5,5'-tetrametil benzidina (TMB));
(ii) Fosfatase alcalina (AP) com fosfato de paranitrofenila como substrato cromogênico; e (iii) beta-D-galactosidase (beta-D-Gal) com um substrato cromogênico (por exemplo, p-nitrofenil-beta-D-galactosidase) ou substrato fluorogênico 4-metilumbeliferil-p-beta-galactosidase. [000211] Várias outras combinações de enzima-substrato são conhecidas por aqueles versados na técnica. Para uma revisão geral
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90/124 destas, veja as Patentes U.S. Nos 4.275.149 e 4.318.980.
[000212] Algumas vezes, o marcador é conjugado indiretamente ao anticorpo. Aqueles versados na técnica terão conhecimento de várias técnicas para essa finalidade. Por exemplo, o anticorpo pode ser conjugado à biotina, e qualquer uma das três categorias amplas de marcadores mencionadas acima pode ser conjugada à avidina, ou viceversa. A biotina se liga seletivamente à avidina e, dessa forma, o marcador pode ser conjugado ao anticorpo dessa forma indireta. Alternativamente, para se obter a conjugação indireta do marcador com o anticorpo, o anticorpo é conjugado com um pequeno hapteno (por exemplo, digoxina), e um dos diferentes tipos de marcadores mencionados acima é conjugado a um anticorpo anti-hapteno (por exemplo, anticorpo antidigoxina). Dessa forma, pode ser obtida a conjugação indireta do marcador com o anticorpo.
[000213] Em outra modalidade da invenção, o anticorpo anti-NKG2A não precisa ser marcado, e a sua presença pode ser detectada com a utilização de um anticorpo secundário marcado que se liga ao anticorpo de NKG2A.
[000214] Os anticorpos da presente invenção podem ser empregados em qualquer método de ensaio conhecido como, por exemplo, ensaios de ligação competitiva, ensaios em sanduíche diretos e indiretos e ensaios de imunoprecipitação. Zola, Monoclonal antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc. 1987).
[000215] Para imuno-histoquímica, a amostra do tumor pode ser fresca ou congelada, ou pode estar embebida em parafina e fixada com um conservante como, por exemplo, formalina.
[000216] Os anticorpos também podem ser usados para ensaios diagnósticos in vivo. Geralmente, o anticorpo é marcado com um radionuclídeo ou um indicador não radioativo detectável, por exemplo, por ressonância nuclear magnética ou por outros meios conhecidos na
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91/124 técnica. De preferência, o marcador é um marcador radioativo como, por exemplo, 125I , 131I, 67Cu, 99mTc ou 111In. O anticorpo marcado é administrado a um hospedeiro, de preferência através da corrente sanguínea, e a presença e localização do anticorpo marcado no hospedeiro são avaliadas. Essa técnica por imagens é usada adequadamente na detecção, preparação e tratamento de neoplasias. O radioisótopo é conjugado à proteína por qualquer meio, incluindo compostos quelantes de metal ou lactoperoxidase, ou técnicas de iodo para iodação.
[000217] Por questões de conveniência, os anticorpos da presente invenção podem ser fornecidos em um kit, ou seja, uma combinação de reagentes embalada em quantidades predeterminadas com instruções para a realização do ensaio diagnóstico. Quando o anticorpo for marcado com uma enzima, o kit incluirá substratos e cofatores necessários para a enzima (por exemplo, um precursor de substrato que fornece o cromóforo ou fluoróforo detectável). Além disso, podem ser incluídos outros aditivos como, por exemplo, estabilizantes, tampões (por exemplo, um tampão de bloqueio ou tampão de lise), e semelhantes. As quantidades relativas dos vários reagentes podem ser variadas amplamente para o fornecimento de concentrações em solução dos reagentes que otimizem substancialmente a sensibilidade do ensaio. Particularmente, os reagentes podem ser fornecidos como pós secos, normalmente liofilizados, incluindo excipientes que, após dissolução, fornecerão uma solução de reagente com a concentração apropriada. Depósitos [000218] O hibridoma de Z270 foi depositado em 22 de dezembro de 2005 na Collection Nationale de Culture de Micro-organismes, Institute Pasteur, 25, Rue du Docteur Roux, F-75725 Paris, França, sob o número de acesso I-3549.
EXEMPLOS
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92/124 [000219] Detalhes adicionais da invenção são ilustrados pelos Exemplos não limitantes que serão apresentados a seguir.
Exemplo 1 - Seleção de sequências parentes de humZ270VL e humZ270VH [000220] Esse Exemplo descreve a seleção de sequências parentes de humZ270VL e humZ270VH, além de retromutações opcionais para sequências variantes de h270VL e humZ270VH.
[000221] Como descrito no Exemplo 2, o hibridoma de Z270 foi clonado, e as sequências da cadeia VH e VL de Z270 do anticorpo correspondente foram determinadas como sendo:
Z270VL: DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYLAWYQQKQGKSPQFLVYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCQHHYGTPRTFGGGTKLEIK (SEQ ID N°: 1), com um resíduo de arginina (R) opcional na posição de Kabat 108.
Z270VH: QVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTSYWMNWVKQRPEQGLQWIGRIDPYDSETHYSQKFKDKAILTVDKSSSTAYMRLSSLTSEDSAVYYCARGGYDFDVGTLYWFFDVWGAGTTVTVS (SEQ ID N°: 2), com um resíduo de serina (S) no terminal C opcional.
[000222] Uma segunda cadeia leve, Z270VL-NB, também foi identificada. No entanto, essa era uma cadeia leve comum de mieloma.
Z270VL-NB:
NIVMTQSPKSMSMSVGERVTLTCKASENVVTYVSWYQQKPEQSPKLLIYGASNRYTGVPDRFTGSGSATDFTLTISSVQAEDLADYHCGQGYSYPYTFGGGTKLEIKRA (SEQ ID N°: 3), com um resíduo de arginina (R) opcional na posição de Kabat 108, e um resíduo de alanina (A) opcional na posição de Kabat 109.
[000223] A partir de uma análise das sequências de Z270 murino, as CDRs de acordo com as definições de Kabat foram determinadas como sendo:
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CDR-L1: RASENIYSYLA (resíduos 24-34 da SEQ ID N°: 1) CDR-L2: NAKTLAE (resíduos 50-56 da SEQ ID N°: 1) CDR-L3: QHHYGTPRT (resíduos 89-97 da SEQ ID N°: 1) CDR-H1: SYWMN (resíduos 31-35 da SEQ ID N°: 2) CDR-H2: RIDPYDSETHYSQKFKD (resíduos 50-66 da SEQ ID N°: 2)
CDR-H3: GGYDFDVGTLYWFFDV (resíduos 95-102 da SEQ ID N°: 2).
[000224] Foi construído um modelo 3D da estrutura da proteína usando MOE (Molecular Operating Environment; disponível em www.chemcomp. com) com modelos estruturais do Protein Database Bank (PDB): 1OPG e 1XF4. O PDB é descrito em Berman et al. (Nucl. Acids Res. 2000; 28: 235-242), e está disponível em www.rcsb.org/pdb. Com base em uma análise estatística de 201 complexos anticorpo-antígeno na base de dados PDB, os resíduos mais prováveis no paratope foram determinados como sendo:
Z270VL: resíduos 24-34, 49-56, 89-97 da SEQ ID N°: 1
Z270VH: resíduos 23-35, 49-58, 93-102 da SEQ ID N°: 2.
[000225] Utilizando-se MOE, resíduos que interagem (hidrofóbicos, ligação de hidrogênio ou carga) com o paratopo foram identificados, e o conjunto combinado de resíduos (paratopo + resíduos de interação) foi usado como a máscara de Z270.
[000226] A pesquisa nas bases de dados de linhagem germinativa V (V-base; disponível em vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) com a Z270VL e Z270VH gerou os seguintes modelos potenciais da estrutura central (valor E fornecido entre parênteses):
Cadeia pesada: VH1_46 (2e-036), VH1_f (2e-035), VH1_02 (3e-035), VH1_18 (4e-035), VH1_03 (6e-035); e
Cadeia leve: VKI_O2 (1e-039), VKI_O12 (1e-039), VKI_L12 (9e-038), VKI_L8 (9e-038), VKI_A20 (9e-038).
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94/124 [000227] A pesquisa das bases de dados de linhagem germinativa com a máscara gerou os seguintes modelos potenciais da estrutura central (valor E fornecido entre parênteses):
Cadeia pesada: VH5_a (4e-013), VH5_51 (3e-011) VH1_f (1e-010), VH1_18 (2e-010), VH1_46 (4e-010): e
Cadeia leve: VKI_L9 (2e-012), VKI_O2 (3e-012), VKI_O12 (3e-012), VKI_L24 (2e-011), VKI_A20 (2e-011)
Após inspeções manuais dos alinhamentos e dos hits, VH1_18 e VKI_O2 foram selecionadas como as plataformas humanas. JH6 e JK4 foram escolhidas como segmentos J da linhagem germinativa.
[000228] A humanização foi agora projetada com as seguintes regras:
- Resíduos fora da máscara são considerados humanos.
- Resíduos dentro da máscara e dentro da CDR de Kabat são considerados murinos.
- Resíduos dentro da máscara e fora da CDR de Kabat com consenso de camundongo/linhagem germinativa são considerados a sequência de consenso.
- Resíduos dentro da máscara e fora da CDR de Kabat com diferença de camundongo/linhagem germinativa são sujeitos a retromutações potenciais.
[000229] A análise é ilustrada na figura 1 para Z270VL e Z270VH, onde os resíduos da máscara são aqueles sombreados no esquema de Kabat; resíduos da CDR são mostrados em negrito no esquema de Kabat; e diferenças de camundongo/linhagem germinativa estão sombreadas nas sequências VKI_02/JK4 e VH1_18/JH6 . Z270VL e humZ270VL1, e humZ270VL1 cons podem opcionalmente compreender um resíduo de arginina (R) na posição de Kabat 108.
[000230] As sequências resultantes, humZ270VL1 e humZ270VH1,
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95/124 são apresentadas com os resíduos da retromutação potencial como humanos.
[000231] As CDRs de um anticorpo Z270 humanizado de acordo com as definições de Kabat são mostradas na figura 2. Das CDRs de humZ270, somente a sequência de CDR-H2 era diferente daquela da CDR murina correspondente, diferindo em 4 posições. No entanto, na verdade, isso significa que aos resíduos 60-65 da CDR-H2 de Kabat eram idênticos à sequência receptora humana, fornecendo uma molécula mais humana e um risco menor de imunogenicidade. Na figura 2, as diferenças são indicadas em texto em negrito.
Exemplo 2 - Clonagem de regiões VH e VL de IgG1 Z270 [000232] Esse Exemplo descreve a clonagem e sequenciamento de regiões VH e VL de Z270 murino.
[000233] Cultura de célula de hibridoma de Z270 para extração de RNA total.
[000234] O hibridoma de Z270 foi cultivado em RPMI 1640 (N° de Catálogo Hyclone SH30011.04) mais10% de FCS (N° de Catálogo Biochrom S0115). 5 x 106 a 1 x 107 células foram coletadas para extração de RNA total.
[000235] Cultura de célula de hibridoma de Z270 da produção de anticorpo. A estratégia de cultura em batelada de uma semana foi adotada para a produção do mAb Z270. O meio de cultura foi RPMI 1640 com 10% de FCS. O sobrenadante foi coletado a cada 7 dias. A densidade celular de partida na câmara de cultura do frasco CL-1000 (INTEGRA Biosciences, Item N° 90005, Lote N° 08541150) foi de 2 x 106 células/ml. Durante a cultura, a densidade e a viabilidade celular foram verificadas regularmente. Após cultura de 3 dias em um frasco CL1000, a densidade estava acima de 1 x 107 e a viabilidade era de cerca de 85%. Nos 4 dias seguintes, a densidade celular variou entre 1,5 - 2,5 x 107 células/ml, e a viabilidade diminuiu gradualmente até
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60~70%. No 7° dia, o sobrenadante foi coletado, e SDS-PAGE redutor foi usado para estimar a concentração de anticorpo com um controle de quantificação (A-TNP 20050118 2 mg/ml).
[000236] Extração de RNA total de Z270. Isso foi feito com o uso do reagente TRIZOL Invitrogen, N° de Catálogo 15596-026, de acordo com as instruções do fabricante.
[000237] 5’-RACE (amplificação rápida de extremidades de cDNA). Foi adaptado um protocolo a partir das instruções do fabricante para uso do produto denominado Kit de Amplificação de cDNA SMART™ RACE por Clontech, N° de Catálogo 634914, com o seguinte design de Iniciadores Gene-Específicos (GSPs):
GSP1 para amplificação de região variável da cadeia pesada de IgG1
RacePrimerheavy: 5’-GCCAGTGGATAGACAGATGG-3’ (SEQ ID N°: 12)
GSP2: para amplificação da região variável da cadeia capa de IgG1
RacePrimerkappa: 5’-GATGGATACAGTTGGTGCAGC-3’ (SEQ ID N°: 13).
[000238] Após a síntese da cDNA da primeira fita, RACE e análise das amostras resultantes em um gel de agarose 1,5%, a banda de DNA de RACE foi recortada e purificada com kit de purificação em Gel (QIAGEN QIAquick N° de Catálogo 28706), e depois clonada em pMD19 com o uso do Kit de Ligação de DNA (N° de Catálogo D6022 de TAKARA) Ver. 2.0 por clonagem de TA (Figura 3A). Os clones positivos foram enviados para sequenciamento de DNA.
[000239] Vários clones de cadeia leve e cadeia pesada foram sequenciados com sequência idêntica, com mostrado na figura 4A-D (com o texto em negrito indicando sequências peptídicas sinalizadoras):
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97/124 cDNA de VL de Z270: (SEQ ID N°: 14) proteína de VL de Z270 (SEQ ID N°: 15) cDNA de VH de Z270 (SEQ ID N°: 16) proteína de VH de Z270 (SEQ ID N°: 17).
Exemplo 3 - Clonagem de cadeia leve e cadeia pesada de IgG1 murina em pJSV002 [000240] A fim de testar a afinidade do anticorpo e usá-lo para controle positivo, a cadeia leve e cadeia pesada do anticorpo Z270 são inseridas em pJSV002 como anticorpo IgG1 murino. pJSV002 é um vetor de expressão transitória que pode ser usado em combinação com células HEK293 6E para expressão transitória de Z270 (Figura 3B).
[000241] A VL de Z270 e a região constante de IgG1 são clonadas em sítios EcoRI e Nhe I de pJSV002. O plasmídeo resultante é como exibido na figura 3C. A sequência inserida com EcoRI e Nhe I (letras maiúsculas) em ambas as extremidades é mostrada na figura 4E (SEQ ID N°: 18).
[000242] A região variável de H1 e a região constante de IgG1 são clonadas em sítios EcoRI e Nhe I de pJSV002-mIgG1-variante (Figura 3D). A pJSV002-mIgG1-variante contém região constante da cadeia pesada de IgG1 murina (Figura 3E). A sequência inserida está entre os sítios EcoRI e Nhe I (gctagc), com os sítios de restrição e a região constante de IgG1 murina indicados em letras minúsculas, e é mostrada na figura 4F (SEQ ID N°: 19).
Exemplo 4 -Constructos de plasmídeo para anticorpo Z270 quimérico [000243] A fim de testar a afinidade do anticorpo e usá-lo como controle positivo, a cadeia leve e a cadeia pesada do anticorpo murino Z270 são inseridas em pJSV002 como anticorpo humano quimérico IgG4 S241P. O anticorpo contém região variável murina e região constante de IgG4 humana com uma mutação S241P na cadeia pesada.
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98/124 [000244] Para expressão do anticorpo Z270 quimérico (chimZ270), a sequência de Z270VL e a região constante da cadeia leve (capa) humana são inseridas em sítios EcoR I e BamH I de pJSV002 (Figura 3F). É usada a sequência mostrada na figura 4G, em que letras maiúsculas indicam sítios de restrição (SEQ ID N°: 20).
[000245] A VH de Z270 e a região constante da cadeia pesada humana são inseridas em sítios EcoR I e Nhe I de pJSV002-IgG4-S241P (Figuras 3G e 3H). É usada a sequência mostrada na figura 4H, com a sequência inserida real estando entre os sítios Eco RI e Nhe I (gctagc), em que as letras maiúsculas indicam sítios de restrição (SEQ ID N°: 21).
Exemplo 5 - Expressão de Z270 humanizado [000246] De acordo com a estratégia de humanização de Z270 descrita no Exemplo 1, as CDRs da cadeia leve de Z270 são enxertadas no modelo VKI_02/JK4 para preparar humZ270VL1. A sequência mostrada na figura 4I resultada síntese da sequência entre os sítios EcoRI e KasI e de sua inserção em pJSV002-hCapaC (com região constante Capa humana em pJSV002), com sequências codificadoras de CDR em letras maiúsculas e sítios de restrição em com texto em negrito (SEQ ID N°: 22).
[000247] Para humanização da cadeia pesada, CDRs da cadeia pesada de Z270 (opcionalmente com CDR-H2 otimizada) são enxertadas no modelo VH1_18/JK6 para preparar humZ270VH1. A sequência entre os sítios EcoRI e NheI é sintetizada e clonada em pJSV002-hIgG4 S241P (região constante de IgG4 humana S241P em pJSV002, figura 3G), com sequências codificadoras de CDR em letras maiúsculas e sítios de restrição em texto em negrito (Figura 4J, SEQ ID N°: 23).
[000248] Os constructos mutados são clonados da mesma forma em pJSV002, com a região constante de IgG4 S241P e região constante da cadeia Capa humana correspondentes, com as seguintes combina
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99/124 ções de retromutações estruturais em cada um de humZ270VL e humZ270VH:
humZ270VL: Wt (ou seja, no retromutação), L46F, I48V, L46F_I48V humZ270VH: Wt (ou seja, sem retromutação), V5Q, M69L,
T71V, T73K, T75S, V5Q_M69L, V5Q_T71V, V5Q_T73K, V5Q_T75S,
M69L_T71V, M69L_T73K,
T73K_T75S, M69L_T71V_T73K_T75S, V5Q_M69L_T73K_T75S, V5Q_M69L_T71V_T73K, M69L_T71V_T75S, V5Q_T71V_T75S,
V5Q_M69L_T73K, V5Q_M69L_T71V. Um design
M69L_T75S, T71V_T73K, T71V_T75S,
V5Q_M69L_T71V_T73K_T75S,
V5Q_ T71V_T73K_T75S,
V5Q_M69L_T71V_ T75S,
M69L_T73K_T75S,
V5Q_T73K_T75S,
V5Q_M69L_T75S, de vetor exemplar
T71V_T73K_T75S,
M69L_T71V_T73K,
V5Q_T71V_T73K, para a cadeia pesada (HC) é ilustrado na figura 5, e um design de vetor exemplar para a cadeia leve (LC) é fornecido na figura 6.
[000249] Os plasmídeos são transfectados em HEK293 6E para expressão transitória, usando 293fectina. Materiais: Células: células HEK
293 6E (293-6E) crescem em fase de crescimento exponencial (0,8 a
1,2 x 106 células/ml). Meio de cultura: FreeStyleTM (N° de Catálogo 12338-018 de Gibco); 25 pg/ml de Geneticina 418 (N° de Catálogo
10131-019 de Gibco); plurônico F-68 0,1% (N° de Catálogo 24040-032 de Gibco). Meio de transfecção: Opti-MEM (N° de Catálogo 51985-026 de Gibco); 293fectina (N° de Catálogo 12347019 de Invitrogen). DNA de plasmídeo: DNA de plasmídeo purificado de interesse (veja acima). [000250] Contagem de células e transfecção. Dois dias antes da transfecção, o volume necessário para se obter 7,5 x 106 células é transferido em um frasco de 125 ml, e meio Freestyle fresco é adicio nado até completar 30 ml (a densidade celular final deve ser de 0,25 x
106 células/ml). Dois dias mais tarde (no dia da transfecção), a densi
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100/124 dade celular deve estar entre 1 e 1,2 x 106 células/ml. Alternativamente, um dia antes da transfecção, o volume necessário para se obter 1,5 x 107 células é transferido em um frasco de 125 ml, e meio Freestyle fresco é adicionado até completar 30 ml (a densidade celular final deve ser de 0,50 x 106 células/ml). Vinte e quatro horas mais tarde (no dia da transfecção), a densidade celular deve estar entre 0,9 e 1,2 x 106 células/ml.
[000251] Preparação de complexos de 293fectina-DNA. Para preparar a solução de DNA, 30 pg de DNA são diluídos em um volume total de 1 ml de Opti-MEM. Para preparar a solução de 293fectina, 40 pl são diluídos em 960 pl de Opti-MEM. Após incubação por 5 minutos em temperatura ambiente, a solução de 293fectina e a solução de DNA são misturadas, e depois incubadas por 25 minutos em temperatura ambiente. As células são então transfectadas com 2 ml da mistura de 293fectina-DNA, e incubadas a 37°C em uma incubadora umidificada (agitadora orbital) contendo 5% de CO2 por 4 a 6 dias. A figura 7 ilustra um procedimento geral para a expressão transitória em células HEK293 como, por exemplo, células HEK693 6E.
Exemplo 6 - Purificação de IgG1 por cultura de hibridoma de Z270 [000252] O anticorpo IgG1 Z270 é purificado do líquido da cultura de célula de hibridoma de Z270 por adição da amostra em uma coluna HiTrap de Proteína A da HP (1 ml) equilibrada em NaCl a 3 M, Tris a 50 mM, pH 8,5, em uma taxa de fluxo de 1,0 ml/min, e eluindo o anticorpo com o uso de ácido cítrico a 25 mM, ácido cítrico sódico a 4,5 mM, pH 3,0.
Exemplo 7 - Quantificação e determinação da afinidade do anticorpo [000253] Plasmídeos contendo construções de expressão de cadeia leve e cadeia pesada equivalente são misturadas em pares, e os plasmídeos são usados para transfectar células HEK6E. O sobrenadante do meio de cultura é então coletado.
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101/124 [000254] Para quantificar o anticorpo IgG1 (ou IgG4) de camundongo, uma placa de ELISA é revestida com anticorpo de captura anticamundongo de cabra específico para Fc de IgG1 poli (ou IgG4). O sobrenadante da expressão do anticorpo é aplicado, seguido por HRPanticorpo secundário capa ou Fab poli anticamundongo de caba. O substrato de HRP é aplicado, e a conversão detectada a OD450.
[000255] Para analisar a ligação de antígeno dos anticorpos Z270 humanizados, é usado o seguinte ensaio Biacore, ilustrado na figura 8. O antígeno-anticorpo de captura é imobilizado em um chip Biacore. O antígeno e o sobrenadante da cultura são aplicados. As taxas on e off são analisadas para calcular a afinidade.
Exemplo 8 -Análise Biacore de variantes quiméricas, humanizadas e de retromutação de Z270
Materiais e métodos [000256] Z270 quimérico e humZ270 em estruturas centrais receptoras de cadeia leve VKI_O2/JK4 e de cadeia pesada VH1_18/JH6 foram produzidos de acordo com os métodos descritos nos Exemplos 4 e 5. As propriedades de ligação de antígeno de variantes Z270 quimérico, humZ270 e de retromutação foram alisadas em um Biacore T100 (Biacore AB, Uppsala, Suécia). O antígeno, que estava na forma de um constructo de cadeia simples NKG2A-CD94-mFc, foi imobilizado covalentemente no chip sensor CM5 (Biacore AB, Uppsala, Suécia) por meio de grupos amina, usando cloridrato de 1-etil-3-(3dimetilaminopropil) carbodi-imidaa (EDC) e N-hidroxissuccinimida (NHS). O nível de imobilização foi direcionado para 300 RU. As variantes do anticorpo Z270 foram diluídas até uma série de concentrações (0,157, 0,313, 0,625, 1,25, 2,5 nM) no tampão de execução HBS-EP (HEPES a 10 mM, pH 7,4, NaCl a 150 mM, EDTA a 3 mM, Tween 20 0,005% (v/v)). Todas as amostras foram então injetadas sobre o antígeno imobilizado por 2 minutos, na taxa de fluxo de 40 ql/min. Subse
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102/124 quentemente, o tampão de execução foi injetado por 3 minutos a 40 μΙ/min para análise de dissociação do anticorpo. Após cada execução, o tampão de regeneração (NaOH a 10 mM, NaCl a 500 mM) era injetado (30 segundos, 10 μ^π) para remover completamente os anticorpos restantes do antígeno. Os dados foram avaliados com o software de avaliação Biacore T100.
Resultados [000257] A afinidade de humZ270 foi determinada como 67 pM. Esse valor de KD era maior do que aquele do Z270 quimérico (50 pM) (Figura 9 e Tabela 2). A introdução de retromutações ao humZ270 nas estruturas centrais receptoras de cadeia leve VKI_O2/JK4 e de cadeia pesada VH1_18/JH6 não aumentaram substancialmente sua afinidade (Figura 10).
Tabela 2
Z270 quimérico humZ270
ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M) Chi2 (RU2) ka (1/Ms) Kd (1/s) KD (M) Chi2 (RU2)
7,970E+6 3,972E-4 4,983E-11 0,0968 7,492E+6 4,982E-4 6,650E-11 0,044
Exemplo 9 - Geração de humZ270 com CDR-H2 de comprimento total [000258] Em uma estratégia alternativa, mostrada na figura 11, foi investigado se as CDRs de Kabat de comprimento total (incluindo a CDR-H2 de comprimento total) resultariam em um aumento da afinidade de humZ270 em estruturas centrais receptoras de cadeia leve VKI_O2/JK4 e de cadeia pesada VH1_18/JH6. humZ270VH3 (SEQ ID N°: 24) acompanha diretamente as diferença nas definições de CDR, resultando basicamente em um anticorpo Z270 humanizado enxertado com CDR de Kabat. humZ270VH4 (SEQ ID N°: 25) acompanha a observação de que K38, Q46, W47, I48, G49, Y59, Q61, K62, K66, e A67 estão próximos às cadeias laterais de S60, F63, K64, D65, resultando em um anticorpo Z270 humanizado enxertado com CDR com retromutações R38K, E46Q, M48I, R66K e V67A.
Exemplo 10 - Geração de humZ270 em outras estruturas centrais re
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103/124 ceptoras humanas [000259] Foram feitos diversos constructos humanizados diferentes com diferentes sequências estruturais receptoras de cadeia pesada humana para explorar a escolha da estrutura central.
[000260] A figura 12 mostra um alinhamento entre os diferentes constructos humanizados Z270VH preparados. humZ270VH5 (SEQ ID N°: 26) é baseada em VH5_a, humZ270VH6 (SEQ ID N°: 27) é baseada em VH5_51, humZ270VH7 (SEQ ID N°: 28) é baseada em VH1_f, e humZ270VH8 (SEQ ID N°: 29) é baseada em VH1_46, todas com um segmento J JH6. Os 6 resíduos de aminoácidos do terminal C da CDR-H2 de Kabat de todos os constructos humanizados eram idênticos à estrutura central receptora humana.
[000261] Utilizando-se o programa de alinhamento VectorNTI, foram obtidas as seguintes identidades de sequência entre humZ270VH1 e humZ270VH5, -6, -7 e -8: 78,2% (VH1 vs. VH5), 79,0% (VH1 vs. VH6), 88,7% (VH1 vs. VH7), e 96,0% (VH1 vs. VH8).
Exemplo 11 - Análise Biacore de diferentes variantes de humZ270 [000262] Foram analisadas as afinidades de variantes de huZ270, todas compreendendo uma sequência de humZ270VL1, mas com diferentes estratégias empregadas para humanização da sequência de VH.
Materiais e métodos [000263] Foi usado um Biacore T100 (Biacore AB, Uppsala, Suécia). O antígeno de CD94/NKG2A foi usado na forma de um constructo de cadeia simples NKG2A-CD94-mFc, imobilizado covalentemente no chip sensor CM5 (Biacore AB, Uppsala, Suécia) por meio de grupos amina, usando cloridrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimidaa (EDC) e N-hidroxissuccinimida (NHS). O nível de imobilização foi direcionado para 300 RU. As variantes do anticorpo humZ270 foram diluídas até uma série de concentrações (0,157, 0,313, 0,625,
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1,25, 2,5 nM) no tampão de execução HBS-EP. Todas as amostras foram então injetadas sobre o antígeno imobilizado por 2 minutos, na taxa de fluxo de 40 pl/min. Subsequentemente, o tampão de execução foi injetado por 3 minutos a 40 pl/min para análise de dissociação do anticorpo. Após cada execução, o tampão de regeneração (NaOH a 10 mM, NaCl a 500 mM) era injetado (40 segundos, 10 pl/min) para remover completamente os anticorpos restantes do antígeno. Os dados foram avaliados com o software de avaliação Biacore T100. O valor de KD de cada variante foi dividido por aquele de huZ270 com uma cadeia pesada humZ270VH1 para obter a mudança relativa de KD. Resultados e conclusões [000264] Os resultados são mostrados na figura 13, em que o valor de KD de cada variante foi normalizado para aquele de huZ270, com uma cadeia pesada de humZ270VH1 para obter a mudança relativa da KD. Como mostrado na figura 13, não houve diferenças significativas entre as variantes enxertadas com CDR (VH3, VH4) e a variante de humZ270 que compreende menos resíduos murinos no segmento de CDR-H2 (humZ270VL1/ VH1). Também não houve diferenças substanciais entre as variantes com CDR-H2 humanizada em diferentes estruturas centrais receptoras humanas. Como um anticorpo humZ270 mais humano possui o benefício de um risco menor para uma resposta imunogênica em pacientes humanos, as variantes com CDR-H2 humanizada como, por exemplo, VH1, VH5, VH6 e VH7, podem ser escolhidas para aplicações terapêuticas, sem o comprometimento de uma afinidade significativamente menor, quando comparadas com um anticorpo humZ270 com enxerto de CDR padronizado, e com uma probabilidade menor de uma resposta imunológica do hospedeiro. Exemplo 12 - Identificação de resíduos críticos em Z270VL e VH [000265] A fim de identificar o paratopo de Z270, foi realizada a mutagênese por varredura de alanina nas CDRs do anticorpo murino. Fo
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105/124 ram selecionados os seguintes aminoácidos para mutagênese de alanina (Figura 14):
Z270VL: R24A, S26A, E27A, N28A, Y30A, S31A, N50A, K52A, T53A, E56A, Y92A, T94A
Z270VH: K23A, S25A, T28A, T30A, S31A, N35A, D52A, Y53A, D54A, S55A, E56A, R94A, D98A, F99A, D100A, V(100A)A,
T(100C)A, L(100D)A, W(100F)A, D101A.
Materiais e métodos [000266] As propriedades de ligação de antígeno dos mutantes de alanina foram analisadas em um Biacore T100 (Biacore AB, Uppsala, Suécia). O antígeno, na forma de sc-NKG2A-CD94-mFc, foi imobilizado covalentemente no chip sensor CM5 (Biacore AB, Uppsala, Suécia) por meio de grupos amina, usando cloridrato de 1-etil-3-(3dimetilaminopropil) carbodi-imidaa (EDC) e N-hidroxissuccinimida (NHS). O nível de imobilização foi direcionado para 300 RU. Mutantes de alanina de Z270 purificados foram diluídos até 0,75 nM ou 1,5 nM no tampão de execução HBS-EP. Todas as amostras foram então injetadas sobre o antígeno imobilizado por 3 minutos, na taxa de fluxo de 10 pl/min. Subsequentemente, o tampão de execução foi injetado por 1 minuto a 10 pl/min para análise da estabilidade da ligação do anticorpo. Após cada execução, o tampão de regeneração (NaOH a 10 mM, NaCl a 500 mM) era injetado (35 segundos, 10 pl/min) para remover completamente os anticorpos restantes do antígeno. Os dados foram avaliados com o software de avaliação Biacore T100. A ligação relativa de cada mutante foi calculada dividindo-se seu nível de ligação (RU) obtido por Biacore por aquele do chimZ270.
Resultados e conclusões [000267] Como mostrado na figura 15, os mutantes de alanina Z270VH D52A, D54A, F99A, T(100C)A e W(100F)A perderam completamente suas propriedades de ligação de antígeno. O mutante de caPetição 870190106907, de 22/10/2019, pág. 110/136
106/124 deia pesada R94 manteve em torno de 20% da capacidade de ligação de antígeno. Os níveis relativos de ligação de mutantes de cadeia pesada N35A, Y53A, E56A, D98A, V(100A)A e L(100D)A estavam entre 40-70% (Figura 1). Consequentemente, os aminoácidos D52, D54,
R94, F99, T(100C) e W(100F) nas CDR-H2 e CDR-H3 da cadeia pesada de Z270 são os resíduos críticos para o reconhecimento do antígeno. Enquanto isso, os aminoácidos N35, Y53, E56, D98, V(100A) e L(100D) na cadeia pesada afetam moderadamente a ligação de antígeno. Curiosamente, todos os mutantes de alanina da cadeia leve de Z270 retêm propriedades de ligação de antígeno comparáveis àquelas do Z270 quimérico (Figura 16). Portanto, nenhum aminoácido na cadeia leve de Z270 contribui significativamente para o reconhecimento de antígeno.
Exemplo 13 - HumZ270 se liga especificamente às células que expressam CD94/NKG2A [000268] A potência e a especificidade da ligação de humZ270 a CD94/ NKG2A foram testadas em citometria de fluxo, por análise da ligação de Z270 do tipo selvagem (recZ270), Z270 quimérico com IgG4 humana (chimZ270) ou Z270 humanizado (humZ270VL1/VH1) produzidos por células HEK293 às células Ba/F3 que superexpressam estavelmente CD94/NKG2A ou CD94/NKG2C. Para essa finalidade, células Ba/F3-CD94/NKG2A e C foram incubadas com várias concentrações de variantes de Z270 em meio de cultura de tecido contendo 2% de FCS, por pelo menos 30 minutos no gelo. Subsequentemente, as células foram lavadas, e as células incubadas em meio similar com anticorpos secundários conjugados a APC, novamente por pelo menos 30 minutos no gelo. Após lavagem duas vezes com PBS gelado, a ligação dos mAbs às células foi visualizada com a utilização de um FACSarray de BD Biosciences.
[000269] Como mostrado na figura 17, todas as variantes de Z270 se
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107/124 ligam de uma forma dose-dependente às células Ba/F3-CD94/NKG2A, mas não às células Ba/F3-CD94/NKG2C. Dessa forma, todas as variantes se ligam especificamente a NKG2A, com humZ270 ligando-se com eficácia similar a NKG2A que chimZ270, enquanto recZ270 se liga ligeiramente mais eficientemente.
Exemplo 14 - humZ270 induz morte de células-alvo HLA-E+ por células que expressam NKL CD94/NKG2A [000270] Foi investigada a capacidade de recZ270, chimZ270, humZ270VL1/ VH1 e Z199 de induzir morte de células LCL 721.221Cw3 marcadas com 51Cr por células NKL CD94/NKG2A+. Nesse ensaio, células-alvo LCL 721.221-Cw3 (HLA-E+) marcadas com 51Cr foram incubadas com células NKL em uma incubadora umidificada contendo 5% de CO2 por 4 horas a 37°C (proporção E:T = 6:1), na presença ou ausência de várias concentrações de mAbs anti-NKG2A. A morte das células-alvo foi analisada medindo-se a quantidade de 51Cr no meio de cultura de tecido liberada pelas células-alvo em consequência de sua morte.
[000271] Na figura 18, é mostrado que concentrações crescentes de anticorpo anti-NKG2A induziram a morte de células LCL 721.221-Cw3 por células NKL. Z199, chimZ270 e recZ270 foram igualmente eficientes, enquanto humZ270 induziu mais mortes de células LCL 721.221Cw3 por células NKL. Dessa forma, humZ270 pode bloquear eficientemente a função inibidora de CD94/NKG2A em linfócitos citotóxicos que expressam CD94/NKG2A como, por exemplo, subconjuntos de células NK, células NKT, células T α/β e células T γ/δ, e foi mais eficiente do que outras variantes recombinantes testadas.
Exemplo 15 - humZ270 é um antagonista competitivo de CD94/NKG2A [000272] Para testar se humZ270VL1/VH1 evita que o ligante (ou seja HLA-E) se ligue a CD94/NKG2A, foi analisado se humZ270 poderia evitar a ligação de tetrâmeros de HLA-E às células Ba/F3 que supe
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108/124 rexpressam CD94/NKG2A (Ba/F3-CD94/NKG2A). Para isso, Ba/F3CD94/NKG2A foram incubadas com: 1) várias concentrações de humZ270 ou 2) incubadas inicialmente com uma concentração de saturação de tetrâmeros de HLA-E (4,7 pg/ml), e a seguir incubadas com várias concentrações de humZ270. Todas as incubações foram realizadas em meio de cultura de tecido contendo 2% de FCS, no gelo. Subsequentemente, as células foram incubadas com anticorpos secundários conjugados a APC específicos para Abs de camundongo, e analisadas por citometria de fluxo usando um FACSarray de BD Biosciences.
[000273] Como mostrado na figura 19, humZ270 se liga eficientemente às células Ba/F3-CD94/NKG2A de uma forma concentraçãodependente (diamantes). No entanto, quando as células foram préincubadas com tetrâmeros de HLA-E, humZ270 foi impedido de se ligar às células Ba/F3-CD94/NKG2A. Dessa forma, HumZ270 e HLA-E se ligam a epitopos sobrepostos em CD94/NKG2A. Portanto, o efeito inibidor de CD94/NKG2A de humZ270 em ensaios de citotoxicidade de NK é provavelmente consequência da prevenção da capacidade de HLA-E na indução de sinais negativos aos linfócitos citotóxicos por meio de CD94/NKG2A. Dessa forma, humZ270 pode ser considerado um antagonista competitivo de CD94/NKG2A.
Exemplo 16 - humZ270 se liga especificamente a CD94/NKG2A [000274] A especificidade e a eficácia de humZ270VL1/VH1, e de diversas variantes de humZ270VL1/VH1 com retromutações nas regiões variáveis leves (VL) ou nas regiões variáveis pesadas (VH) foram testadas quanto à ligação a CD94/NKG2A por citometria de fluxo. Para isso, células Ba/F3-CD94/ NKG2A foram incubadas com humZ270L46F (VL), humZ270-I48V (VL), humZ270-L46F/I48V (VL), humZ270V5Q (VH), humZ270-M69L (VH), humZ270-T71V (VH), humZ270T73K (VH), humZ270-T75S (VH), humZ270Petição 870190106907, de 22/10/2019, pág. 113/136
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V5Q/M69L/T71V/T73K/T75S (VH), humZ270-M69L/T71V/T73K/T75S (VH) ou dois lotes diferentes de humZ270VL1/VH1, sem retromutações (DK e CHN). Para essa finalidade, células Ba/F3CD94/NKG2A ou C foram incubadas com diversas concentrações das variantes de humZ270 em meio de cultura de tecido contendo 2% de FCS, por pelo menos 30 minutos no gelo. As células foram então lavadas, e incubadas em meio similar com anticorpos secundários conjugados a APC específicos para anticorpos humanos, novamente por pelo menos 30 minutos no gelo. Após lavagem duas vezes com PBS gelado, a ligação de anticorpos secundários às células foi visualizada com a utilização de um FACSarray de BD Biosciences.
[000275] Todas as variantes se ligaram especificamente a CD94/NKG2A, e não a CD94/NKG2C. Todas as variantes se ligaram com eficácia similar à CD94/NKG2A, com exceção das variantes que contêm a mutação V5Q (VL), que se ligou ligeiramente menos eficientemente (veja a figura 20).
MODALIDADES EXEMPLARES [000276] Os parágrafos seguintes descrevem modalidades exemplares da invenção.
1. Anticorpo que se liga especificamente a NKG2A, que compreende os resíduos de ligação de antígeno das regiões determinantes de complementaridade (CDRs) do anticorpo Z270 murino e sequências estruturais receptoras humanas, em que pelo menos os 6 resíduos de aminoácidos do terminal C da CDR-H2 são iguais àqueles na sequência receptora humana pesada variável (VH).
2. Anticorpo da modalidade 1, que é mais eficaz do que um anticorpo que compreende sequências variáveis leves (VL) e VH do anticorpo Z270 murino na potencialização da atividade citotóxica de um linfócito citotóxico que expressa CD94/NKG2A.
3. Anticorpo da modalidade 1, que é mais eficaz do que um
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110/124 anticorpo que compreende sequências variáveis leves (VL) e VH do anticorpo Z270 murino na neutralização da atividade inibidora de um receptor de CD94/NKG2A expresso na superfície de um linfócito citotóxico.
4. Anticorpo da modalidade 1, que é mais eficaz do que um anticorpo que compreende sequências variáveis leves (VL) e VH do anticorpo Z270 murino na redução da inibição mediada por CD94/NKG2A da atividade citotóxica de um linfócito citotóxico que expressa CD94/NKG2A.
5. Anticorpo da modalidade 1, que é mais eficaz do que um anticorpo que compreende sequências variáveis leves (VL) e VH do anticorpo Z270 murino na indução da morte de uma célula-alvo que expressa Cw3 por um linfócito citotóxico que expressa CD94/NKG2A.
6. Anticorpo de qualquer uma das modalidades 2-5, em que o linfócito citotóxico que expressa CD94/NKG2A é uma célula NK, uma célula NKT, uma célula T α/β ou uma célula T γ/δ.
7. Anticorpo da modalidade 6, em que o linfócito citotóxico que expressa CD94/NKG2A é uma célula NK.
8. Anticorpo de qualquer uma das modalidades 1-7, em que o anticorpo domínio de VH compreende os resíduos D52, D54, F99, T(100C) e W(100F) das CDRs da VH do anticorpo Z270 murino.
9. Anticorpo da modalidade 8, em que o anticorpo domínio de VH ainda compreende os resíduos N35, Y53, E56, D98, V(100A) e L(100D) das CDRs da VH do anticorpo murino Z270.
10. Anticorpo de qualquer uma das modalidades 1-9, que compreende uma CDR-H1 que corresponde aos resíduos 31-35 da SEQ ID N°: 5 e uma CDR-H3 que corresponde aos resíduos 95-102 da SEQ ID N°: 5, em que a CDR-H2 compreende os resíduos 50-59 da SEQ ID N°: 5.
11. Anticorpo de qualquer uma das modalidades 1-10, em
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111/124 que o domínio de estrutura central receptora humana de VH possui 70% ou mais de identidade de sequência para a SEQ ID N°: 5.
12. Anticorpo de qualquer uma das modalidades 1-11, em que o segmento da VH da estrutura central receptora humana de VH é VH1_18, VH5_a, VH5_51, VH1_f ou VH1_46, e o segmento J é JH6.
13. Anticorpo da modalidade 12, em que o segmento da VH é VH1_18, VH5_a, VH5_51 ou VH1_f.
14. Anticorpo da modalidade 13, em que o segmento da VH é VH1_18.
15. Anticorpo de qualquer uma das modalidades 1-14, em que a sequência receptora humana do domínio de VH não possui nenhuma retromutação.
16. Anticorpo de qualquer uma das modalidades 1-14, em que:
(a) o aminoácido na posição 5 do domínio de VH é V ou Q;
(b) o aminoácido na posição 69 do domínio de VH é M ou L;
(c) o aminoácido na posição 71 do domínio de VH é T ou V;
(d) o aminoácido na posição 73 do domínio de VH é T ou K; or (e) o aminoácido na posição 75 do domínio de VH é T ou S.
17. Anticorpo da modalidade 16, em que o aminoácido na posição 69 é L.
18. Anticorpo da modalidade 16, em que o aminoácido na posição 71 é V.
19. Anticorpo de qualquer uma das modalidades 1-15, em que o domínio de VH compreende a sequência da SEQ ID N°: 5.
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20. Anticorpo de qualquer uma das modalidades 1-19, que compreende uma CDR-L1 que corresponde aos resíduos 24-34 da SEQ ID N°: 4, uma CDR-L2 que corresponde aos resíduos 50-56 da SEQ ID N°: 4 e uma CDR-L3 que corresponde aos resíduos 89-97 da SEQ ID N°: 4.
21. Anticorpo da modalidade 20, em que a sequência receptora humana do domínio de VL não possui nenhuma retromutação.
22. Anticorpo de qualquer uma das modalidades 20-21, em que a estrutura receptora humana do domínio de VL é de VKI_O2/JK4.
23. Anticorpo de qualquer uma das modalidades 20-22, em que a estrutura receptora humana do domínio de VL compreende a SEQ ID N°: 4.
24. Anticorpo humanizado ou fragmento de anticorpo que se liga especificamente a NKG2A, que compreende:
(a) uma CDR-L1 que corresponde aos resíduos 24-34 da SEQ ID N°: 4;
(b) uma CDR-L2 que corresponde aos resíduos 50-56 da SEQ ID N°: 4;
(c) uma CDR-L3 que corresponde aos resíduos 89-97 da SEQ ID N°: 4;
(d) uma CDR-H1 que corresponde aos resíduos 31-35 da SEQ ID N°: 5;
(e) uma CDR-H3 que corresponde aos resíduos 95-102 da SEQ ID N°: 5; e (f) uma CDR-H2 que compreende os resíduos 50-59 da SEQ ID N°: 5; e (g) sequências estruturais receptoras humanas;
em que os resíduos 60-65 na CDR-H2 são da sequência receptora humana de VH, e em que o anticorpo humanizado é mais eficaz do que um
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113/124 anticorpo que compreende uma sequência leve variável (VL) que corresponde a SEQ ID N°: 1 e uma sequência de VH que corresponde a SEQ ID N°: 2 na potencialização da atividade citotóxica de uma célula NK que expressa CD94/NKG2A.
25. Anticorpo humanizado que se liga a NKG2A humana, o anticorpo compreendendo um domínio de VH que compreende os resíduos da CDR não humana e uma estrutura receptora de VH humana, o domínio de VH compreendendo uma CDR-H1 que corresponde aos resíduos 31-35 da SEQ ID N°: 5, uma CDR-H2 que corresponde aos resíduos 50-65 da SEQ ID N°: 5 e uma CDR-H3 que corresponde aos resíduos 95-102 da SEQ ID N°: 5.
26. Anticorpo humanizado da modalidade 25, em que a estrutura central receptora de VH humana não compreende nenhuma retromutação.
27. Anticorpo humanizado da modalidade 25, em queo aminoácido na posição de Kabat 5 do domínio de VH é V ou Q.
28. Anticorpo humanizado da modalidade 25, em queo aminoácido na posição de Kabat do domínio de VH 69 é M ou L.
29. Anticorpo humanizado da modalidade 25, em queo aminoácido na posição de Kabat 71 do domínio de VH é T ou V.
30. Anticorpo humanizado da modalidade 25, em queo aminoácido na posição de Kabat 73 do domínio de VH é T ou K.
31. Anticorpo humanizado da modalidade 25, em queo aminoácido na posição de Kabat 75 do domínio de VH é T ou S.
32. Anticorpo humanizado da modalidade 25, em queo domínio de VH compreende uma substituição na região estrutural em pelo menos uma posição de Kabat selecionada do grupo que consiste em 5, 69, 71, 73 e 75.
33. Anticorpo humanizado da modalidade 32, em que o domínio de VH compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID
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N°: 5, com substituições na estrutura de acordo com qualquer uma das seguintes opções:
(a) nenhuma (b)V5Q (c)M69L (d)T71V (e)T73K (f)T75S (g) V5Q eM69L (h) V5Q eT71V (i) V5Q eT73K (j) V5Q eT75S (k) M69L eT71V (l) M69L eT73K (m) M69L eT75S (n) T71V e T73K (o) T71V e T75S (p) T73K e T75S (q) V5Q, T73K eT75S (r) V5Q, T71V eT75S (s) V5Q, T71V eT73K (t) V5Q, M69L eT75S (u) V5Q, M69L eT73K (v) V5Q, M69L eT71V (w) T71V, T73K eT75S (x) M69L, T73K eT75S (y) M69L, T71V eT75S, (z) M69L, T71V e T73K, (aa) V5Q, M69L, T71V e T73K, (bb) V5Q, M69L, T71V e T75S,
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115/124 (cc) V5Q, M69L, T73K e T75S, (dd) V5Q, T71V, T73K e T75S, (ee) M69L, T71V, T73K e T75S, e (ff) V5Q, M69L, T71V, T73K e T75S.
34. Anticorpo humanizado de qualquer uma das modalidades 25-32, que compreende um domínio de VL que compreende os resíduos da CDR não humana incorporados em uma estrutura central receptora de VL humana, o domínio de VL compreendendo uma CDRL1 que corresponde aos resíduos 24-34 da SEQ ID N°: 4, uma CDRL2 que corresponde aos resíduos 50-56 da SEQ ID N°: 4 e uma CDRL3 que corresponde aos resíduos 89-97 da SEQ ID N°: 4.
35. Anticorpo humanizado da modalidade 34, em que a estrutura receptora de VL humana não compreende nenhuma retromutação.
36. Anticorpo humanizado da modalidade 34, em que o aminoácido na posição de Kabat 46 do domínio de VL é L ou F.
37. Anticorpo humanizado da modalidade 34, em que o aminoácido na posição de Kabat 48 do domínio de VL é I ou V.
38. Anticorpo humanizado da modalidade 34, em que o domínio de VL compreende uma substituição na região estrutural em pelo menos uma posição de Kabat selecionada de 46 e 48.
39. Anticorpo humanizado da modalidade 38, em que o domínio de VL compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 4, com substituições na estrutura de acordo com qualquer uma das seguintes opções:
(a) Nenhuma (b) L46F (c) I48V (d) L46 e I48V.
40. Anticorpo humanizado que se liga a NKG2A humana, o
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116/124 anticorpo compreendendo um domínio de VH que compreende os resíduos da CDR não humana incorporados em um domínio de VH humana, o domínio de VH compreendendo uma substituição na região estrutural em pelo menos uma posição de Kabat na SEQ ID N°: 7 selecionada do grupo que consiste em 5, 69, 71, 73 e 75.
modalidade
41. Anticorpo humanizado dendo uma substituição V5Q.
42. Anticorpo humanizado dendo uma substituição M69L.
43. Anticorpo humanizado dendo uma substituição T71V.
44. Anticorpo humanizado dendo uma substituição T73K.
45. Anticorpo humanizado dendo uma substituição T75S.
46. Anticorpo humanizado da da da da da da
40, compreenmodalidade modalidade modalidade modalidade modalidade
40,
40,
40,
40,
40, compreencompreencompreencompreencompreendendo um domínio de VL que compreende os resíduos da CDR não humana incorporados em um domínio de VL humana, o domínio de VL compreendendo uma substituição na região estrutural em pelo menos uma posição de Kabat na SEQ ID N°: 6 selecionada de 46 e 48.
47. Anticorpo humanizado da modalidade 40, compreendendo uma substituição L46F.
48. Anticorpo humanizado da modalidade 40, compreendendo uma substituição I48V.
49. Anticorpo humanizado de qualquer uma das modalidades 40-48, compreendendo uma CDR-H1 que corresponde aos resíduos 31-35 da SEQ ID N°: 5, uma CDR-H2 que corresponde aos resíduos 50-66 da SEQ ID N°: 5 e uma CDR-H3 que corresponde aos resíduos 95-102 da SEQ ID N°: 5.
50. Anticorpo humanizado de qualquer uma das modalidaPetição 870190106907, de 22/10/2019, pág. 121/136
117/124 des 40-49, que compreende um domínio de VH que compreende a sequência da SEQ ID N°: 7.
51. Anticorpo humanizado de qualquer uma das modalidades 40-50, compreendendo uma CDR-L1 que corresponde aos resíduos 24-34 da SEQ ID N°: 6, uma CDR-L2 que corresponde aos resíduos 50-56 da SEQ ID N°: 6 e uma CDR-L3 que corresponde aos resíduos 89-97 da SEQ ID N°: 6.
52. Anticorpo humanizado de qualquer uma das modalidades 40-52, compreendendo um domínio de VL que compreende a sequência da SEQ ID N°: 6.
53. Anticorpo humanizado que se liga a NKG2A humana, o anticorpo compreendendo um domínio de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 5, opcionalmente com uma ou mais substituições de FR nas posições de Kabat 5, 69, 71, 73 e/ou 75.
54. Anticorpo humanizado da modalidade 53, em que as substituições de FR opcionais são V5Q, M69L, T71V, T73K e/ou T75S.
55. Anticorpo humanizado da modalidade 52, compreendendo ainda um domínio de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 4, opcionalmente com uma ou mais substituições de FR nas posições de Kabat 46 e/ou 48.
56. Anticorpo humanizado da modalidade 55, em que as substituições de FR opcionais são L46F e/ou I48V.
57. Anticorpo humanizado que se liga a NKG2A, compreendendo um domínio de VH que compreende os resíduos da CDR não humana incorporados em um domínio de VH humana, em que o domínio de VH é pelo menos 50% idêntico a SEQ ID N°: 5.
58. Anticorpo humanizado da modalidade 46, em que o domínio de VH é pelo menos 90% idêntico a SEQ ID N°: 5.
59. Anticorpo humanizado de qualquer uma das modalidades 57 e 58, compreendendo uma CDR-H1 que corresponde aos resí
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118/124 duos 31-35 da SEQ ID N°: 5, uma CDR-H2 que corresponde aos resíduos 50-66 da SEQ ID N°: 5 e uma CDR-H3 que corresponde aos resíduos 95-102 da SEQ ID N°: 5.
60. Anticorpo humanizado de qualquer uma das modalidades 57-59, compreendendo uma V ou Q na posição de Kabat 5, uma M ou L na posição de Kabat 69, uma T ou V na posição de Kabat 71, uma T ou K na posição de Kabat 73 e uma T ou S na posição de Kabat 75, no domínio de VH.
61. Anticorpo humanizado de qualquer uma das modalidades 57-60, compreendendo um domínio de VL que compreende os resíduos da CDR não humana incorporados em um domínio de VL humana, em que o domínio de VL é pelo menos 50% idêntico a SEQ ID N°: 4.
62. Anticorpo humanizado de qualquer uma das modalidades 57-61, compreendendo um domínio de VL pelo menos 90% idêntico a SEQ ID N°: 4.
63. Anticorpo humanizado de qualquer uma das modalidades 57-62, compreendendo uma sequência de CDR-L1 que corresponde aos resíduos 24-34 da SEQ ID N°: 4, uma sequência de CDR-L2 que corresponde aos resíduos 50-56 da SEQ ID N°: 4 e uma sequência de CDR-L3 que corresponde aos resíduos 89-97 da SEQ ID N°: 4.
64. Anticorpo humanizado de qualquer uma das modalidades 57-63, compreendendo uma L ou F na posição de Kabat 46 e/ou uma I ou V na posição de Kabat 48.
65. Anticorpo humanizado que se liga a NKG2A humana, o anticorpo compreendendo um domínio de VH que compreende os resíduos da CDR não humana incorporados em um domínio de VH humana, o domínio de VH compreendendo uma CDR-H1 que corresponde aos resíduos 31-35 da SEQ ID N°: 8, uma CDR-H2 que corresponde aos resíduos 50-66 da SEQ ID N°: 8, e uma CDR-H3 que corres
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119/124 ponde aos resíduos 95-102 da SEQ ID N°: 8, em que os aminoácidos nas posições de Kabat 63, 64, 65, 66 e 67 são F, K, D, K, A, respectivamente.
66. Anticorpo humanizado da modalidade 65, em que o aminoácido na posição de Kabat 60 é A.
67. Anticorpo humanizado de qualquer uma das modalidades 65 e 66, em que o domínio de VH compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 8.
68. Anticorpo humanizado de qualquer uma das modalidades 65-67, compreendendo ainda um domínio de VL que compreende uma CDR-L1 que corresponde aos resíduos 24-34 da SEQ ID N°: 6, uma CDR-L2 que corresponde aos resíduos 50-56 da SEQ ID N°: 6 e uma CDR-L3 que corresponde aos resíduos 89-97 da SEQ ID N°: 6.
69. Anticorpo humanizado de qualquer uma das modalidades 65-68, em que o domínio de VL compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 6.
70. Versão humanizada de um anticorpo anti-NKG2A produzido pelo hibridoma de Z270.
71. Anticorpo de qualquer uma das modalidades 1-70, que é um anticorpo multiespecífico ou um fragmento de anticorpo.
72. Anticorpo da modalidade 71, que é um fragmento de anticorpo selecionado de um Fab, a Fab', um F(ab)2, um F(ab% um F(ab)3, um Fv, um Fv de cadeia simples, um dsFv, um fragmento Fd, um fragmento dAb, um minibody, um diabody, um triabody, um tetrabody, um corpo capa; uma IgG de camelo; uma IgNAR; e um fragmento multiespecífico de anticorpo.
73. Anticorpo da modalidade 72, que é um anticorpo biespecífico.
74. Anticorpo de qualquer uma das modalidades 1-70, que é um anticorpo IgG4 de comprimento total ou fragmento deste.
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75. Anticorpo da modalidade 74, em que o domínio constante da cadeia pesada compreende uma mutação S241P.
76. Acido nucleico isolado que codifica o anticorpo de qualquer uma das modalidades precedentes.
77. Vetor que compreende o ácido nucleico da modalidade 76.
78. Célula hospedeira compreendendo o vetor da modalidade 76.
79. Método de produção de um anticorpo que compreende o cultivo da célula hospedeira da modalidade 78, de tal forma que o ácido nucleico seja expresso e o anticorpo produzido.
80. Método da modalidade 79, compreendendo ainda a recuperação do anticorpo da cultura da célula hospedeira.
81. Método da modalidade 79 em que, antes do cultivo, a célula hospedeira é co-transfectada com um vetor que compreende um ácido nucleico que codifica um domínio variável da cadeia pesada e com um vetor que compreende ácido nucleico que codifica um domínio variável da cadeia leve.
82. Imunoconjugado que compreende um anticorpo de acordo com qualquer uma das modalidades 1-75 e um segundo agente.
83. Imunoconjugado da modalidade 82, em que o segundo agente é um agente citotóxico.
84. O Imunoconjugado da modalidade 82, em que o segundo agente é uma molécula de PEG.
85. Composição farmacêutica que compreende o anticorpo de qualquer uma das modalidades 1-75 ou o imunoconjugado de qualquer uma das modalidades 82-84, e um veículo.
86. Composição farmacêutica da modalidade 74, compreendendo um tampão selecionado de citrato, fosfato, e uma combinação destes, que possui um pH de cerca de 6,0 a cerca de 7,5.
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87. Artigo manufaturado compreendendo um recipiente que contém o anticorpo de qualquer uma das modalidades 1-75, e instruções que informam um usuário sobre o tratamento de um distúrbio selecionado de um câncer, uma doença viral, um distúrbio inflamatório e um distúrbio autoimune, em um mamífero, com o anticorpo em uma quantidade eficaz.
88. Artigo da modalidade 87, em que o mamífero é um ser humano.
89. Anticorpo de qualquer uma das modalidades 1-75 para uso na neutralização da atividade inibidora de um receptor de CD94/NKG2A expresso na superfície de um linfócito citotóxico em um paciente humano.
90. Anticorpo de qualquer uma das modalidades 1-75 para uso na redução da inibição mediada por CD94/NKG2A da atividade de citotoxicidade de um linfócito citotóxico que expressa CD94/NKG2A em um paciente humano.
91. Anticorpo de qualquer uma das modalidades 1-75 para uso na potencialização da atividade citotóxica de um linfócito citotóxico que expressa CD94/NKG2A em um paciente humano.
92. Anticorpo de qualquer uma das modalidades 1-75 para uso na indução da morte de uma célula-alvo que expressa Cw3 por um linfócito citotóxico que expressa CD94/NKG2A em um paciente humano.
93. Anticorpo de qualquer uma das modalidades 89-92, em que o linfócito citotóxico que expressa CD94/NKG2A é uma célula NK, uma célula NKT, uma célula T α/β ou uma célula T γ/δ.
94. Método de tratamento de um paciente humano que sofre de um distúrbio selecionado de um câncer, uma doença viral, um distúrbio inflamatório e um distúrbio autoimune, que compreende a administração da composição farmacêutica de qualquer uma das mo
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122/124 dalidades 85-86.
95. Uso do anticorpo de qualquer uma das modalidades 175 na preparação de um medicamento para administração a um paciente humano que sofre de um distúrbio selecionado de um câncer, uma doença viral, um distúrbio inflamatório e um distúrbio autoimune.
96. Anticorpo de qualquer uma das modalidades 1-75 para uso no tratamento de um paciente humano que sofre de um distúrbio selecionado de um câncer, uma doença viral, um distúrbio inflamatório, e um distúrbio autoimune.
97. Método, o uso ou o anticorpo de qualquer uma das modalidades 89-96, em que o paciente sofre de carcinoma de célula escamosa, leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda, linfoma de células B, linfoma de células T, linfoma de Hodgkins, linfoma não Hodgkins, linfoma de célula pilosa, linfoma de Burkitt, mieloma múltiplo, leucemias mielógenas agudas ou crônicas, leucemia promielocítica, fibrossarcoma, rabdomiossarcoma; melanoma, seminoma, teratocarcinoma, neuroblastoma, glioma, astrocitoma, neuroblastoma, glioma, schwanomas; fibrossarcoma, rabdomiossarcoma, osteossarcoma, melanoma, xeroderma pigmentoso, ceratoacantoma, seminoma, câncer folicular da tireoide, teratocarcinoma, outros carcinomas da bexiga, mama, cólon, rim, fígado, pulmão, ovário, próstata, pâncreas, estômago, cérvice, tireoide ou pele, outros tumores hematopoiéticos de linhagem linfoide, outros tumores hematopoiéticos de linhagem mieloide, outros tumores de origem mesenquimal, outros tumores do sistema nervoso central ou periférico ou outros tumores de origem mesenquimal.
98. Uso de acordo com a modalidade 97, em que o paciente sofre de mieloma múltiplo, linfoma não Hodgkins ou linfoma mielógenas aguda.
[000277] Todas as referências, incluindo publicações, pedidos de
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123/124 patentes e patentes, aqui citadas são aqui incorporadas por referência, no mesmo grau como se cada referência fosse individual e especificamente indicada para ser incorporada por referência, e fosse aqui apresentada em sua totalidade.
[000278] Todos os títulos e subtítulos são aqui usados apenas por conveniência, e não devem ser considerados de forma alguma como limitantes da invenção.
[000279] Qualquer combinação dos elementos descritos acima em todas as variações possíveis destes é englobada pela invenção, a menos que aqui indicado de forma diferente ou de outro modo nitidamente contraindicado pelo contexto.
[000280] A menos que expressamente indicado de forma diferente ou nitidamente contraindicado pelo contexto, o termo ou é aqui usado no sentido inclusivo e/ou e, consequentemente, como fornecendo implicitamente suporte a uma modalidade ou aspecto no qual o termo deva ser interpretado no sentido exclusivo de esse ou aquele.
[000281] Os termos um/uma e o/a e referentes similares usados no contexto de descrever a invenção devem ser considerados como englobando tanto o singular quanto o plural, a menos que aqui indicado de forma diferente ou nitidamente contraindicado pelo contexto.
[000282] A citação nesse pedido de faixas de valores visa servir como um método abreviado para se referir individualmente a cada valor separado que caia dentro da faixa, a menos que aqui indicado de forma diferente, e cada valor separado é incorporado no relatório descritivo como se fosse aqui citado individualmente. A menos que definido de forma diferente, todos os valores exatos aqui fornecidos são representativos de valores aproximados correspondentes (por exemplo, todos os valores exemplares exatos fornecidos com relação a um fator ou medida em particular podem ser considerados como fornecendo também uma medida aproximada correspondente, modificada por
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124/124 cerca de, quando apropriado).
[000283] Todos os métodos aqui descritos podem ser realizados em qualquer ordem adequada, a menos que aqui indicado de forma diferente ou nitidamente contraindicado pelo contexto.
[000284] O uso de qualquer e todos os exemplos, ou de linguagem exemplar (por exemplo, tal como) aqui fornecido, visa simplesmente melhor iluminar a invenção, e não impõem uma limitação ao escopo da invenção, a menos que indicado de forma diferente. Nenhuma linguagem no relatório descritivo deve ser considerada como indicando que qualquer elemento seja essencial à prática da invenção, a menos que seja explicitamente estabelecido.
[000285] A citação e incorporação nesse relatório descritivo de documentos de patente é feita apenas por conveniência, e não reflete qualquer visão de validade, possibilidade de patentear e/ou aplicabilidade desses documentos de patente.
[000286] A descrição aqui feita de qualquer aspecto ou modalidade da invenção com a utilização de termos como que compreende, que possui, que inclui ou que contém, com referência a um elemento ou a elementos, visa apoiar um aspecto ou modalidade similar da invenção que consiste em, consiste essencialmente em ou que compreende substancialmente aquele elemento ou elementos em particular, a menos que definido de forma diferentes ou nitidamente contraindicado pelo contexto (por exemplo, uma composição aqui descrita como compreendendo um elemento em particular deve ser entendida como também descrevendo uma composição que consiste naquele elemento, a menos que definido de forma diferentes ou nitidamente contraindicado pelo contexto).
[000287] Essa invenção inclui todas as modificações e equivalentes do assunto em questão citados nos aspectos ou reivindicações aqui apresentados no grau máximo permitido pelas leis aplicáveis.

Claims (6)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Anticorpo que se liga especificamente a NKG2A, caracterizado pelo fato de que compreende resíduos de ligação a antígeno das regiões determinantes de complementaridade (CDRs) do anticorpo murino Z270 e sequências estruturais aceptoras humanas, em que o domínio de VH compreende a sequência de SEQ ID NO: 5, e em que a estrutura central aceptora humana do domínio de VL compreende a SEQ ID NO: 4.
  2. 2. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é mais eficaz do que um anticorpo que compreende sequências da região variável leve (VL) (SEQ ID NO: 1) e VH (SEQ ID NO: 2) do anticorpo murino Z270 na potencialização da atividade citotóxica de um linfócito citotóxico que expressa CD94/NKG2A.
  3. 3. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que é um anticorpo IgG4.
  4. 4. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, caracterizado pelo fato de que é um fragmento de anticorpo ou um anticorpo multiespecífico.
  5. 5. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1-4 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
  6. 6. Uso de um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que é na preparação de uma composição farmacêutica para tratamento de câncer, doença viral, distúrbio inflamatório e distúrbio autoimune.
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