TWI537285B - 抗-ｎｋｇ２ａ抗體與其用途 - Google Patents

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Description

抗－NKG2A抗體與其用途
本發明係關於抗－NKG2A抗體，尤其是鼠類抗－NKG2A抗體Z270之人源化版本，以及製造與使用此類抗體之方法。
CD94/NKG2A為一種於NK、NKT與T細胞之次組上發現之細胞毒性抑制受體，其將該等之殺死細胞之能力局限於表現CD94/NKG2A－配體HLA－E之細胞(參見，例如WO99/28748)。抑制CD94/NKG2A之抗體可增加腫瘤－專一性淋巴細胞對抗腫瘤細胞之細胞毒性活性。因此，於癌症患者體內抑制CD94/NKG2A而不會殺死CD94/NKG2A－表現細胞之治療性抗體，可能可控制腫瘤生長。此外，某些特定淋巴瘤(例如NK－淋巴瘤)特徵在於表現CD94/NKG2A。於此類患者，靶定並殺死CD94/NKG2A－表現性細胞之治療性抗體，可能可根除腫瘤細胞。抗－NKG2A抗體已被建議用於治療自體免疫或發炎性疾病(參見，例如，US20030095965A1、WO2006070286)。
各種抗CD94/NKG2A之抗體已經描述於技術領域中。例如，西弗里等人(Eur J Immunol 1996；26：2487－92)述及鼠類抗－NKG2A抗體Z270；卡瑞特羅等人(Eur J Immunol 1997；27：563－7)描述鼠類抗－NKG2A抗體Z199(現已市售可購自貝克曼庫特(Beckman Coulter),Inc.，產品編號IM2750，USA)；凡斯等人(J Exp Med 1999；190：1801－12)述及鼠類抗－NKG2－抗體20D5(現已市售可購自BD生物科學法明根(BD Biosciences Pharmingen)，目錄編號550518，USA)；及U.S.專利申請案20030095965描述鼠類抗體3S9，其據稱與NKG2A、NKG2C及NKG2E結合。
目前可利用之抗－CD94/NKG2A抗體為非人類來源，由於彼等之免疫原性而使其等不適用於大部分人類治療應用。雖然可利用簡單的人源化途徑(例如CDR－移植)，仍代表性地需要個別化之人源化，來獲得最適的經人源化變體，使免疫原性減至最低同時充分維持或增進功能性。於是，有對於適用於治療人類患者之抗－CD94/NKG2A抗體之需要。
本發明提供抗－NKG2A抗體，以及包含此類抗體之組成物，及製造與使用此類抗體之方法。於一項具體態樣，抗體為鼠類抗－NKG2A抗體Z270之人源化版本，於本文命名為"humZ270"。於另一項具體態樣，抗體為抗－NKG2A抗體之人源化版本，其具有實質上與Z270相同之可變重鏈(VH)及/或可變輕鏈(VL)功能域。
本發明提供此類抗體之例舉性互補性－決定區(complementarity－determining region，CDR)殘基與/或用於在框架區(FR)與/或中製造具有改良性質(例如較低免疫原性、增進的抗原－結合或其他功能特性、及/或改良的物理化學性質，例如較佳穩定性)的抗體之胺基酸取代之部位。於一方面，本發明提供其中至少一部份卡巴特(Kabat)CDR係與在人類受者(acceptor)序列中之相對應部分相同的人源化抗體。於一項具體態樣，人類受者框架序列並不包含任何胺基酸取代或回復突變。於另一項具體態樣，人類框架序列包含至少一處胺基酸取代。用於此類例舉性胺基酸取代之卡巴特位置包括位於VH功能域之框架區中的5、66、67、69、71、73與75，位於VL功能域之框架區中的46與48，及位於CDR－H2之60、63、64與65。
於其他方面，本發明提供包含此類抗體與載劑之醫藥組成物，及包含此類抗體共軛至細胞毒性或可偵測藥劑之免疫共軛物。
於其他方面，本發明提供編碼此類抗體之核酸與載體，及含有此類核酸與/或載體之宿主細胞。亦提供者係製造抗－NKG2A抗體之重組方法，其係藉由培養此類宿主細胞以使能製造該等核酸。
於其他方面，本發明提供包含含有此類抗－NKG2A抗體之容器與指示使用者於患者治療諸如癌症等之病症或病毒性疾病的說明書的製品。視需要地，該製品可包含另一含有另一種藥劑之容器，其中該說明書指示使用者以該抗體與該藥劑組合治療該病症。
本發明亦提供使用此類抗－NKG2A抗體於患者治療病症(例如癌症、病毒性疾病、發炎性病症或自體免疫病症)的方法，其視需要與另一種抗－癌症、抗－病毒性疾病藥劑或消炎藥劑結合。
 定義
術語“抗體”於本文係以最廣義使用，且特別包括全長單株抗體、多株抗體、多重特異性抗體(例如，雙特異性抗體)、及抗體片段，只要其等呈現所希望的生物活性。各種與製造抗體相關之技術係提供於，例如哈羅等人，抗體：實驗室手冊(ANTIBODIES：A LABORATORY MANUAL)，冷泉港實驗室出版(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，冷泉港，N.Y.(1988)。
“抗體片段”包含全長抗體之一部分，較佳係其抗原結合或可變區域。抗體片段之實例包括Fab、Fab'、F(ab)2 、F(ab’)2 、F(ab)3 、Fv(代表性地，抗體單臂之VL與VH功能域)、單鏈Fv(scFv)、dsFv、Fd片段(代表性地，VH與CH1功能域)及dAb(代表性地，VH功能域)片段；VH、VL、VhH與V－NAR功能域；小抗體(minibody)、二價抗體片段(diabodies)、三價抗體片段(triabodies)、四價抗體片段(tetrabodies)與kappa抗體片段(參見，例如愛爾等人，Protein Eng 1997；10：949－57)；駱駝IgG；IgNAR；及由抗體片段與一或多種經單離CDR或功能性抗原互補位所形成之多重特異性抗體片段，其中經單離CDR或抗原結合殘基或多肽可被結合或連接在一起而形成功能性抗體片段。各類型不同抗體片段已曾於(例如)合利格與胡得森Nat Biotechnol 2005；23,1126－1136；WO2005040219及已公開U.S.專利申請案20050238646與20020161201描述或回顧。
術語“抗體衍生物”用於本文包含全長抗體或抗體片段”較佳地包含至少其抗原－結合或可變區域，其中一或多個胺基酸係經化學修飾，例如藉由烷基化、PEG化、醯基化、酯類形成或醯胺形成或類似者，例如以用於將抗體連接至第二分子。此包括(但不限定於)PEG化抗體、半胱胺酸－PEG化抗體、及其變體。
“免疫共軛物”包含經結合或連接至第二藥劑(例如細胞毒性藥劑、可偵測劑等)之抗體衍生物。
“人源化”抗體為其含有極少的衍生自非－人類免疫球蛋白之序列之人類/非－人類嵌合型抗體。大部分，人源化抗體為其中源自接受者高可變區之殘基被源自具有所希望專一性、親和性、及能力之非人類物種(供者抗體)(例如小鼠、大鼠、兔子、或非人類靈長類)的高可變區之殘基置換之人類免疫球蛋白(接受者抗體)。於有些實例，人類免疫球蛋白之框架區(FR)係被相對應之非人類殘基置換。再者，人源化抗體可包含未存在於接受抗體，或供者抗體中之殘基。完成此等修飾以進一步改善抗體效能。一般，人源化抗體將實質上包含所有至少一個(且代表性地二個)功能域，其中全部或實質上全部高可變功能域環係相當於非人類免疫球蛋白的，且全部或實質上全部FR殘基為該等人類免疫球蛋白序列的。人源化抗體亦可視需要包含至少一部分免疫球蛋白恆定區(Fc)，代表性地為人類免疫球蛋白的。關於進一步詳情，參見例如瓊斯等人,自然(Nature)321：522－525(1986)；里奇曼等人,自然332：323－329(1988)；及普瑞斯塔,Curr.Op.Struct.Biol.2：593－596(1992)，WO 92/02190，US專利申請案20060073137及US專利案6,750,325、6,632,927、6,639,055、6,548,640、6,407,213、6,180,370、6,054,297、5,929,212、5,895,205、5,886,152、5,877,293、5,869,619、5,821,337、5,821,123、5,770,196、5,777,085、5,766,886、5,714,350、5,693,762、5,693,761、5,530,101、5,585,089、以及5,225,539。
術語“高可變區”當用於本文意指，負責抗原結合之抗體的胺基酸殘基。高可變區通常包含得自“互補性－決定區”或"CDR"之胺基酸殘基(輕鏈可變功能域中之殘基24－34(L1)、50－56(L2)與89－97(L3)，及重鏈可變功能域中之31－35(H1)、50－65(H2)與95－102(H3)；卡巴特等人1991，如前述)，及/或該等得自“高可變環”之殘基(輕鏈可變功能域中之殘基26－32(L1)、50－52(L2)與91－96(L3)，及重鏈可變功能域中之26－32(H1)、53－55(H2)與96－101(H3)；柯席特與雷斯特,J.Mol.Biol 1987；196：901－917)。代表性地，此區域中胺基酸殘基之編號，係藉由描述於卡巴特等人，如前述之方法完成。於本文，諸如“卡巴特位置”、“使用卡巴特編號”、“如卡巴特中編號之可變功能域殘基”及“根據卡巴特”意指此用於重鏈可變功能域或輕鏈可變功能域之編號系統。使用卡巴特編號系統，肽之正確線形胺基酸序列可含有相當於縮短或插入可變功能域之FR或CDR的較少或額外胺基酸。例如，重鏈可變功能域可包括在CDR H2之殘基52後之單一胺基酸插入(根據卡巴特之殘基52a)，及於重鏈FR殘基82後之插入殘基(例如，根據卡巴特之殘基82a、82b與82c等)。可藉由於具有“標準”以卡巴特編號序列之抗體序列的同源區域進行排比，而決定所給定抗體殘基之卡巴特編號。除非另行指定或與內文抵觸，所有位於本文所描述VL或VH序列中之胺基酸殘基位置係根據卡巴特編號。
“框架區”或"FR"殘基為該等除本文所定義之CDR以外的VH或VL殘基。
多肽之“變體”意指具有實質上與參考多肽(代表性地為天然或“親本”多肽)相同之胺基酸序列的多肽。多肽變體可擁有一或多處位於天然胺基酸序列中某些特定位置之胺基酸取代、刪除及/或插入。
“保守性”胺基酸取代為該等其中胺基酸殘基係以具有類似物理化學性質之側鏈的胺基酸殘基置換者。具有相似側鏈之胺基酸殘基家族為技術領域中已知，且包括具有鹼性側鏈(例如，賴胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈(例如，天冬胺酸、谷胺酸)、未帶電極性側鏈(例如，甘胺酸、天冬醯胺、谷胺醯胺、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、色胺酸)、非極性側鏈(例如，丙胺酸、纈胺酸、亮胺酸、異亮胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸)、貝他－分支側鏈(例如，蘇胺酸、纈胺酸、異亮胺酸)及芳族側鏈(例如，酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)之胺基酸。
術語“實質上相同”於兩種胺基酸序列之前後文中意指該等序列當以(例如)程式GAP或BEST－FIT，使用預設空隙加權最適排比時，共有至少約50、至少約60、至少約70、至少約80、至少約90、至少約95、至少約98或至少約99百分比序列同一性。於一項具體態樣，不相同之殘基位置差異在於保守性胺基酸取代。序列同一性代表性地係使用序列分析軟體測量。蛋白質分析軟體使用指定出各種取代、缺失或其他修飾(包括保守性胺基酸取代)之相似性測量值來配對相似之序列。例如，公開可用之GCG軟體含有可以預設參數使用之程式(例如"Gap"與"BestFit")來測定密切相關多肽(例如源自不同生物物種之同源多肽間，或野生型蛋白質與其突變型蛋白)間之序列同源性或序列同一性。參見，例如GCG第6.1版。多肽序列亦可使用FASTA或ClustalW，應用預設或所推薦參數比對。GCG第6.1版中之程式FASTA(例如，FASTA2與FASTA3)，提供質問與搜尋序列間最佳重疊區域之排比及百分比序列同一性(彼得森,Methods Enzymol.1990；183：63－98；彼得森,Methods Mol.Biol.2000；132：185－219)。當將一序列與含有許多得自各種生物之序列之資料庫比對時，或當推衍其時，較佳演算法為使用預設參數之電腦程式BLAST，特別是blastp。參見，例如亞舒爾等人,J.Mol.Biol.1990；215：403－410；亞舒爾等人,Nucleic Acids Res.1997；25：3389－402(1997)；各以引用方式納入本文。兩實質上相同胺基酸序列中之“相對應”胺基酸位置為該等藉由任一種本文所述及之蛋白質分析軟體(代表性地使用預設參數)排比者。
具有參考抗體(例如Z270)之“生物學特徵”的抗體，為擁有一或多種可分辨其與其他結合至相同抗原(例如，NKG2A)之抗體的抗體之生物學特徵者。例如，具有Z270之生物學特徵的抗體可阻斷NKG2A之活性並/或與Z270交叉－競爭與NKG2A之胞外功能域結合。
NKG2A(OMIM 161555，其完整揭示係以引用方式納入本文)為轉錄產物之NKG2群組之成員(霍欽斯等人(1991)J.Exp.Med.173：1017－1020)。NKG2A係由7段跨越25 kb之外顯子編碼，呈現某種差異剪接。NKG2A為經發現存在於NK細胞、α/β T細胞、γ/δ T細胞、與NKT之次組之表面之抑制性受體。類似於抑制性KIR受體，其於胞質功能域中擁有ITIM。如用於本文，“NKG2A”意指NKG2A基因或所編碼蛋白質之任何變體、衍生物或同功型。亦包含者為與野生型、全長NKG2A共有一或多種生物學特性或功能，且共有至少70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或以上之核酸或胺基酸同一性的任意核酸或蛋白質序列。人類NKG2A包含在3個功能域中之233個胺基酸，其中胞質功能域包含殘基1－70，跨膜區包含殘基71－93，及胞外區包含殘基94－233，序列如下：MDNQGVIYSDLNLPPNPKRQQRKPKGNKSSILATEQEITYAELNLQKASQDFQGNDKTYHCKDLPSAPEKLIVGILGIICLILMASVVTIVVIPSTLIQRHNNSSLNTRTQKARHCGHCPEEWITYSNSCYYIGKERRTWEESLLACTSKNSSLLSIDNEEEMKFLSIISPSSWIGVFRNSSHHPWVTMNGLAFKHEIKDSDNAELNCAVLQVNRLKSAQCGSSIIYHCKHKL(SEQ ID NO：11)。
NKG2C(OMIM 602891，其完整揭示係以參考方式納入本文)與NKG2E(OMIM 602892，其完整揭示係以參考方式納入本文)為轉錄產物之NKG2群組之其他二成員(吉藍克等人(1998)Immunogenetics 48：163－173)。NKG2C與NKG2E為經發現存在於NK細胞表面之活化性受體。
HLA－E(OMIM 143010，其完整揭示係以參考方式納入本文)為表現於細胞表面且藉由與衍生自第I類MHC分子以外之訊號序列的肽類結合而調節之非典型MHC分子。HLA－E與天然殺手(NK)細胞及有些專一性結合至CD94/NKG2A、CD94/NKG2B與CD94/NKG2C之T細胞結合(參見，例如布勞德等人(1998)Nature 391：795－799，其完整揭示係以參考方式納入本文)。HLA－E之表面表現足以保護標靶細胞免於被CD94/NKG2A＋NK、T或NKT細胞純系溶胞。如用於本文，“HLA－E”意指HLA－E基因或所編碼蛋白質之任何變體、衍生物或同功型。亦包含者為與野生型、全長HLA－E共有一或多種生物學特性或功能且共有至少70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或以上之核酸或胺基酸同一性的任意核酸或蛋白質序列。
當核酸與另一核酸序列放置成功能性關係時，其係“經可操作性連接”。例如，若前序列或分泌前導序列之DNA係經表現呈參與某多肽分泌之前蛋白質，則其係經可操作性連接至該多肽之DNA；若啟動子或增效子欲影響某編碼序列之轉錄，則其係經可操作性連接至該序列；或者若核糖體－結合部位所在位置係為有助於轉譯，則其經可操作性連接至某編碼序列。通常，“經可操作性連接”意指所連接之DNA序列係鄰接的且(於分泌前導序列之個案)鄰接且符合讀框。然而，增效子不需要係鄰接的。連接係藉由於方便的限制切位處接合而完成。若此類切位不存在，則根據習知慣例使用合成型寡核苷酸接頭或連接子。
“經單離”分子為其在其存在之組成物中關於其所屬之分子之類型為優勢物種之分子(亦即，其於組成物中組成至少約50%之該類型分子，且代表性地會於組成物中組成至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或以上之該分子物種，例如肽類)。一般，以所有存在組成物中之肽類物種而論或在所提出之用途的背景就至少關於實質上具活性的肽類物種而論，抗體分子之組成物會呈現對於抗體分子之98%、98%或99%均一性。
以本發明而論，“治療”意指預防、緩解、管理、治癒或減輕某疾病或病症之一或多種症狀或臨床上相關的表徵。例如，於其中疾病或病症之症狀或臨床上相關表徵尚未被鑑認出的患者之“治療”為預防性療法，於其中某疾病或病症之症狀或臨床上相關現象已被鑑認出的患者之“治療”通常不構成預防性療法。
發明之詳細敘述
本發明關於與NKG2A結合之抗體。於一方面，該抗體為抗體Z270(其為專一性結合NKG2A但不與人類NKG2C或NKG2E結合之鼠類單株抗體)之人源化版本。Z270可阻斷人類CD94/NKG2A之功能，且以濃度－依賴方式專一性地誘導由CD94/NKG2A－限制之淋巴細胞殺死細胞。
本發明提供(例如)humZ270變體，其中至少一部分VH CDR(例如CDR－H2)係與人類VH受者序列之相對應部分相同，而因此減低該人源化抗體之免疫原性。意外地，此等人源化變體在加強表現CD94/NKG2A之細胞毒性淋巴細胞的細胞毒性方面較鼠類或嵌合型Z270更有效。於其他方面，本發明提供具有包含相當於該等鼠類抗體Z270中的某些抗原－結合殘基之CDR，以及人類框架區序列的抗體。此等與其他方面係更詳細描述於下列段落及實施例中。
人源化抗－NKG2A抗體
用於將非人類抗體人源化之方法已經描述於技術領域中。通常，於人源化製程中，可將編碼鼠類抗體交互作用區域之核苷酸選殖至編碼人類IgG之cDNA－載體中，其可完成以使能產生由帶有有鼠類CDR之人類IgG骨架所組成的嵌合型抗體。此類嵌合型抗體相較於原始鼠類抗體可能呈現較低親和性、較低穩定性或其他不希望的性質，且亦可能具有免疫原性。因此，可能需要將嵌合型Ab中之個別胺基酸最適化，以獲得用於人類治療應用之高品質的功能性mAb。
代表性地，人源化抗體具有一或多個自非人類來源導入其中的胺基酸殘基。此等非人類胺基酸殘基往往稱作“輸入”殘基，其代表性地係採自“輸入”可變功能域。人源化基本上可依照溫特與其同僚(瓊斯等人,Nature,321：522－525(1986)；里奇曼等人,Nature,332：323－327(1988)弗赫耶等人,Science,239：1534－1536(1988))之方法，藉由將高可變區序列取代人類“受者”抗體之相對應序列而完成。於是，如此“人源化”抗體為其中實質上少於完整之人類可變功能域已被源自非人類物種之相對應序列取代的嵌合型抗體(U.S.Pat.No.4,816,567)。事實上，人源化抗體代表性為其中有些高可變區殘基且可能有些FR殘基係經來自囓齒類抗體中之類似部位的殘基取代之人類抗體。
另一種供製造人源化抗體之方法係描述於U.S.專利申請案公開號2003/0017534，其中人源化抗體及抗體製劑係從轉殖基因非人類動物製得。非人類動物經遺傳工程改造，而含有一或多種能夠於轉殖基因非人類動物中進行基因重排與基因轉變之人源化免疫球蛋白基因座，以產生多樣化人源化免疫球蛋白。
用於製造人源化抗體之人類可變功能域(輕鏈與重鏈)之選擇，對於減低抗原性而言非常重要。根據所謂的“最佳－配合(best－fit)”方法，係對已知人類可變功能域序列文庫或人類種系序列文庫篩選囓齒類抗體之可變功能域序列。然後可接受與囓齒類最接近之人類序列，作為人源化抗體之人類框架區(西蒙斯等人,J.Immunol.1993,151：2296以及下列；柯席亞等人,柯席亞與雷斯克,J.Mol.Biol 1987,196：901－917)。另一種方法使用衍生自輕或重鏈之特定次組所有人類抗體的共有序列之特別框架區。相同框架區可用於數種不同人源化抗體(卡特等人,PNAS USA,1992；89：4285，以及下列；普瑞斯塔等人,J Immunol 1993；151：2623，以及下列)。設計用以減低抗體分子於人類患者之免疫原性的其他方法，包括鑲飾抗體(veneered antibody)(參見，例如US專利6,797,492及U.S.專利申請公開案20020034765與20040253645)，及已藉由T－細胞表位分析與移除而修飾之抗體(參見，例如U.S.專利申請公開案20030153043與U.S.專利No.5,712,120)。
更重要的是，抗體被人源化同時須保留對抗原之高親和性及其他有利的生物特性。為達到此目的，根據較佳方法，係藉由親本及人源化序列之三維模型分析親本序列與各種概念上人源化產物的方法，製備得人源化抗體。三維免疫球蛋白模型係一般可得的且為熟習該項技術者所熟悉。說明並展示所選定候選免疫球蛋白序列的可能三維構型結構之電腦程式係可得的。檢視此等展示使能分析該等殘基於候選免疫球蛋白執行功能上所扮演之可能角色，亦即分析出左右候選免疫球蛋白與其抗原結合之能力的殘基。以此方式，FR殘基可自接受者與輸入序列選出並結合，以達到所希望抗體特徵，例如增加對於標靶抗原之親和性。通常，高可變區殘基係直接且最實質上地涉及影響抗原結合。
下述實施例1描述與NKG2A結合之例舉性人源化抗－NKG2A抗體之設計，且分析係(至少一部份)說明於圖1。如圖1所示，於一種本發明之humZ270抗體，CDR－H2之C－末部分(相當於Kabat殘基61－65)與人類受者序列之相對應部分相同。而且，如圖式說明所述，humZ270VL序列(SEQ ID NO：4)可視需要地包含位於所指示FR殘基L46與I48其中之一或二者的突變，且humZ270VH序列(SEQ ID NO：5)可視需要地包含位於所指示FR殘基V5、M69、T71、T73與T75其中之一或二者的突變，其胺基酸根據卡巴特編號。表1描述包含位於humZ270VH與humZ270VL FR序列中之例舉性人類－至－鼠類回復突變的例舉性humZ270VL及humZ270VH變體，以及FR突變之例舉性組合。於表1及本文其他地方中，胺基酸位置係根據卡巴特命名，其中humZ270VH功能域中之胺基酸V5、M69、T71、T73與T75相當於SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、或其他本文所述例舉性humZ270VH序列中的胺基酸V5、M70、T72、T74及T76。
表1 humZ270VL與humZ270VH變體包含存在於天然或共有humZ270VL(SEQ ID NO：4或6)與/或humZ270VH(SEQ ID NO：5、7或8)序列中之例舉性FR回復－突變。
於是，本發明提供由Z270融合瘤製造之抗－NKG2A抗體之人源化版本，以及與Z270共有生物學特徵及/或實際序列同一性之非人類抗體的人源化版本。於另一項具體態樣，單株抗體或其片段或衍生物能夠與非人類靈長類NKG2A結合。
本發明之人源化抗體包含經導入人類VH與VL功能域之非人類高可變區或CDR殘基。
於一方面，本發明提供一種包含源自鼠類抗體Z270之CDR的抗原結合殘基存在人類受者框架中的人源化抗體，其中CDR－H2之至少6個C－端胺基酸殘基與該等位於人類受者序列中的相同。此類人源化抗體在(例如)加強表現CD94/NKG2A之細胞毒性淋巴細胞(例如NK－cell、NKT－細胞、α/β T－細胞與/或γ/δ T－細胞，或表現CD94/NKG2A之細胞毒性淋巴細胞的族群)的細胞毒性方面可較原始鼠類Z270抗體或其嵌合型版本更有效。
本發明之具代表性抗體包含對應於Z270 CDR－H2與CDR－H3或其部分(其包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：5之殘基D52、D54、R94、F99、T(100C)及W(100F)，彼等已於實施例中顯示對抗原－結合很重要)之抗原結合殘基。視需要地，抗體亦包含VH殘基N35、Y53、E56、D98、V(100A)與L(100D)。
於另一方面，人源化抗體包含對應於SEQ ID NO：5之殘基31－35的CDR－H1序列及對應於SEQ ID NO：5之殘基95－102的CDR－H3序列，其中CDR－H2序列包含SEQ ID NO：5之殘基50－59。於此類人源化抗體，VH區域與SEQ ID NO：5可具有例如50%或以上之序列同一性，例如至少60%、至少70%、或至少75%序列同一性。具有此等序列之例舉性人源化VH功能域係描述於實施例及下文中。
於一項具體態樣，於此類人源化抗體，位於VH區域之位置5的胺基酸可為V或Q；於VH區域之位置69的胺基酸可為M或L；於VH區域之位置71的胺基酸可為T或V；於VH區域之位置73的胺基酸可為T或K；且/或於VH區域之位置75的胺基酸可為T或S。於另外之具體態樣，VH區域包含V5或Q5、M69或L69、T71或V71、T73或K71、及/或T75或S75殘基。於另一項具體態樣，於位置69之胺基酸為L。於另一項額外或另供選擇之具體態樣，於位置71之胺基酸為V。
人源化抗體可包含源自人類受者序列之VH人類受者框架，其選自(例如)VH1_18、VH5_a、VH5_51、VH1_f與VH1_46，且J－節段為JH6，例如VH1_18、VH5_a、VH5_51或VH1_f或技術領域中已知之其他人類種系VH框架序列。於一項具體態樣，VH節段為VH1_18。於一項特別具體態樣，VH區域包含SEQ ID NO：8之序列。於另一項特別具體態樣，VH區域包含SEQ ID NO：7之序列。例如，VH區域可包含SEQ ID NO：5之序列。
VL區域人類受者序列可為(例如)VKI_O2/JK4。於一項特別具體態樣，VL區域包含SEQ ID NO：4之序列。
於一方面，本發明之人源化抗體包含CDR－H2，其包含由SEQ ID NO：2之殘基50－59所組成的鼠類部分，該部分經由適宜FR序列連接至由SEQ ID NO：2之殘基95－102所組成的CDR－H3。
如本文所述，於一項具體態樣，人源化抗體於VH功能域中不包含FR取代。於另一項具體態樣，人源化抗體包含位於一或多處選自5、69、71、73與75之位置(利用根據卡巴特之可變功能域編碼系統)的VH功能域FR取代。於另一項具體態樣，人源化抗體包含位於位置5、69、71、73與75其中二或多處之VH功能域FR取代；而於其他具體態樣，係位於此等位置其中三、四或全部處。於另外且獨立之具體態樣，人源化抗體包含一位於選自5、69、71、73與75之位置的VH功能域FR取代。於其他分別且獨立之具體態樣，人源化抗體包含位於位置5與69、或5與71、或5與73、或5與75、或69與71、69與73、或69與75、或71與73、或71與75、或73與75、或5、69與71、或5、69與73、或5、69與75、或69、71與73、或69、71與75、或71、73與75、或5、69、71與73、或5、69、71與75、或5、71、73與75、或69、71、73與75、或5、69、71、73與75之VH功能域FR取代。相較於較多，較少框架取代可使免疫原性減至最低，但是對於某些應用結合效率可能是一項重要的考量。因此，較佳的取代為回復－突變，亦即，將位於人類FR中某特定位置之胺基酸以位於非人類供者FR中相對應位置之胺基酸置換的突變。因此，於分別且獨立之具體態樣，位於位置5之VH功能域胺基酸取代為V5Q，於位置69之胺基酸取代為M69L，於位置71之胺基酸取代為T71V，於位置73之胺基酸取代為T73K，且於位置75之胺基酸取代為T75S。於一項特別具體態樣，人源化抗體包含位於位置71之V及/或位於位置69之L。
本發明之人源化抗體亦包含併入人類VL功能域之非人類高可變區殘基。於一項具體態樣，人源化抗體於VL功能域中不包含FR取代。於另一項具體態樣，人源化抗體包含位於位置46與48其中一處之VL功能域FR取代，利用根據卡巴特之可變功能域編碼系統。於另一項具體態樣，人源化抗體包含位於位置46與48兩處之VL功能域FR取代。較佳的取代為回復－突變，亦即，將位於人類FR中某特定位置之胺基酸以位於非人類供者FR中相對應位置之胺基酸置換的突變。因此，於分別且獨立之具體態樣，位於位置46之VL功能域胺基酸取代為L46F，且於位置48之VL功能域胺基酸取代為I48V。
一種例舉性人源化抗體包含包含對應於SEQ ID NO：5或7之殘基31－35的CDR－H1序列、對應於SEQ ID NO：5或7之殘基50－66的CDR－H2序列、及對應於SEQ ID NO：5或7之殘基95－102的CDR－H3序列之VH功能域。人源化抗體於VH功能域中可進一步包含位於卡巴特位置5而為Q或V的胺基酸；位於卡巴特位置69而為M或L的胺基酸；位於卡巴特位置71而為T或V的胺基酸；位於卡巴特位置73而為T或K的胺基酸；及/或位於卡巴特位置75而為T或S的胺基酸。於一項具體態樣，VH功能域包含於至少一處位於選自由5、69、71、73與75所組成之群組之卡巴特位置的框架區取代，例如對應於表1所列之任一VH FR取代，或其組合。於一項具體態樣，VH功能域包含SEQ ID NO：7之序列。於另一項具體態樣，VH功能域包含SEQ ID NO：5之序列。
一種例舉性人源化抗體可亦或供選擇地包含包含對應於SEQ ID NO：4之殘基24－34的CDR－L1序列、對應於SEQ ID NO：4之殘基50－56的CDR－L2序列、及對應於SEQ ID NO：4之殘基89－97的CDR－L3序列之VL功能域。人源化抗體可進一步包含位於卡巴特位置46而為L或F的胺基酸及/或位於卡巴特位置48而為I或V的胺基酸。於一項具體態樣，VL功能域包含於至少一處位於選自46與48之卡巴特位置的框架區取代，例如對應於表1所列之任一VLFR取代，或其組合。於一項具體態樣，VL功能域包含SEQ ID NO：4之序列。於另一項具體態樣，VL功能域包含SEQ ID NO：6之序列。
於另一方面，本發明提供與人類NKG2A結合之人源化抗體，該抗體包含包含SEQ ID NO：5之序列的VH功能域，視需要地具有一或多處位於卡巴特位置5、69、71、73與/或75之FR取代。視需要之FR取代可選自(例如)V5Q、M69L、T71V、T73K與/或T75S，以及其任意組合。此類人源化抗體可亦或供選擇地包含包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列的VL功能域，視需要地具有一或多處位於卡巴特位置46與/或48之FR取代。視需要之FR取代可選自(例如)L46F與/或I48V。
視需要地，於一特別之方面，VH功能域包含一或多個CDR殘基之胺基酸修飾，例如，其中該等修飾實質上保持或增進抗體的親和性。例如，抗體變體可具有一、二、三或一至約七個位於前述VH CDR序列之胺基酸置換。
於一特別之方面，於人源化抗體VH CDR中與位於非人類供者VH CDR之相對應位置的胺基酸不同之胺基酸可經取代而改善人源化抗體之結合特性及/或穩定性。例如，可將一或多個此等胺基酸取代位於非人類供者VH CDR之相對應位置的胺基酸。於一項具體態樣，變異型抗體包含位於一或多處選自60、63、64與65之位置的CDRH2取代，根據卡巴特(相當於SEQ ID NO：5或7中之61、64、65及66)。於分別且獨立之具體態樣，抗體變體包含位於一處選自60、63、64與65之位置的CDRH2胺基酸取代。於其他分別且獨立之具體態樣，抗體變體包含位於位置60與63、或60與64、或60與65、或63與64、或63與65、或64與65、或60、63與64、或60、63與65、或60、64與65、或63、64與65、或60、63、64與65的CDRH2胺基酸取代。較佳的取代為回復－突變，亦即，將位於人源化CDR中某特定位置之胺基酸以位於非人類供者CDR中相對應位置之胺基酸置換的突變。因此，於分別且獨立之具體態樣，位於位置60之CDRH2胺基酸取代為A60S，位於位置63之胺基酸取代為L63F，位於位置64之胺基酸取代為Q64K，且位於位置65之胺基酸取代為G65D。於其中抗體變體包含一或多個CDRH2胺基酸取代A60S、L63F、Q64K與G65D之方面，抗體變體包含位於根據卡巴特之位置66與67的VH FR胺基酸取代，視需要地與一或多個先前所述之VH FR取代結合。較佳地，胺基酸取代為R66K與V67A。例如，於一項具體態樣，抗體包含包含對應於SEQ ID NO：5之殘基31－35的CDR－H1序列、對應於SEQ ID NO：5之殘基50－66的CDR－H2序列、及對應於SEQ ID NO：5之殘基95－102的CDR－H3序列之VH功能域，具有A60S、L63F、Q64K、G65D、R66K及V67A“回復－突變”，視需要與額外胺基酸修飾結合。
於另一特別之方面，本發明提供與人類NKG2A結合之人源化抗體，該抗體包含包含併入人類VH功能域之非人類CDR殘基的VH功能域，該VH功能域包含對應於SEQ ID NO：8之殘基31－35的CDR－H1序列、對應於SEQ ID NO：8之殘基50－66的CDR－H2序列、及對應於SEQ ID NO：8之殘基95－102的CDR－H3序列，其中位於卡巴特位置63、64、65、66與67之胺基酸分別為F、K、D、K、A。於一項具體態樣，VH功能域包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列。於另一項具體態樣，位於卡巴特位置60之殘基為A。於另一項具體態樣，位於卡巴特位置60之殘基為S，且人源化抗體包含Z270之CDR－H1、－H2與H3序列，且具有位於鄰接CDR－H2C－端之二胺基酸的FR回復－突變。本段落所描述之人源化抗體可進一步包含於其他殘基(例如)位於本文所述卡巴特位置5、69、71、73及/或75之FR回復－突變。
於另一方面，本發明提供一種其中位於VH區之卡巴特CDR全部皆衍生自鼠類Z270 VH(SEQ ID NO：2)的人源化抗體，其進一步包含S60A、F63L、K64Q與/或D65G突變。於一項具體態樣，人源化抗體包含所有突變S60A、F63L、K64Q與/或D65G。
人源化抗體(例如)除前述之VH功能域CDR之外，亦可包含包含對應於SEQ ID NO：6之殘基24－34的CDR－L1序列、對應於SEQ ID NO：6之殘基50－56的CDR－L2序列、及對應於SEQ ID NO：6之殘基89－97的CDR－L3序列之VL功能域。於一項具體態樣，人源化抗體之VL功能域包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列。於另一項具體態樣，人源化抗體之VL功能域包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列。視需要地，此類人源化抗體包含一或多個VLCDR殘基之胺基酸修飾，例如，其中該等修飾實質上保持或增進抗體的親和性。例如，抗體變體可具有一、二、三或一至約七個位於前述VL CDR序列之胺基酸取代。
本申請案亦預期與抗－NKG2A結合之親和性－成熟抗體，其含有可增進人源化抗體對於抗原之親和性的額外CDR或FR突變。用於製備此類親和性－成熟抗體之方法為技術領域中已知。親本抗體可為人源化抗體，例如包含SEQ ID NOS：4與5之VL/VH序列(視需要地具有一或多處如本文所述之CDRH2與/或FR取代)者，或包含SEQ ID NOS：6與7之分別共有VL/VH序列者。親和性－成熟抗體較佳地以相當或優於鼠類Z270者之親和性(例如至少約一、約二或約四－倍至約100－倍或約1000－倍增進之親和性)與－NKG2A結合，例如當使用如下所述之結合分析進行分析。
於另一方面，本發明提供其包含與Z270、humZ270、humZ270cons、及/或humZ270cons2之VH功能域(分別為SEQ ID NOS：2、5、7與8)具有至少約50%、至少約70%、至少約80%序列同一性(例如至少約85%、90%、95%、97%或以上同一性)的VH功能域之人源化抗體。於另一特別之方面，本發明提供一種與NKG2A結合之人源化抗體，其包含包含併入人類VH功能域之非人類CDR殘基的VH功能域，其中該VH功能域係與humZ270VH1(SEQ ID NO：5)至少約50%相同。於一項具體態樣，VH功能域係與SEQ ID NO：5至少約90%相同。例如，該人源化抗體可包含對應於SEQ ID NO：5之殘基31－35的CDR－H1序列、對應於SEQ ID NO：5之殘基50－66的CDR－H2序列、及對應於SEQ ID NO：5之殘基95－102的CDR－H3序列之VH功能域。該人源化抗體於VH功能域中可亦或供選擇地包含位於卡巴特位置5之Q或V，位於卡巴特位置69之M或L，位於卡巴特位置71之T或V，位於卡巴特位置73之T或K，及位於卡巴特位置75之T或S。
於另一方面，本發明提供一種亦或供選擇地包含與Z270、humZ270及/或humZ270cons之VL功能域(分別為SEQ ID NOS：1、4與6)具有至少約50%、至少約70%、至少約80%序列同一性(例如至少約85%、90%、95%、97%或以上同一性)的VL功能域的抗體分子。於另一特別之方面，本發明提供一種與NKG2A結合之人源化抗體，其包含包含併入人類VL功能域之非人類CDR殘基的VL功能域，其中該VL功能域係與SEQ ID NO：4至少約50%相同。於一項具體態樣，VL功能域係與SEQ ID NO：4至少約90%相同。例如，該人源化抗體可包含對應於SEQ ID NO：4之殘基24－34的CDR－L1序列、對應於SEQ ID NO：4之殘基50－56的CDR－L2序列、及對應於SEQ ID NO：4之殘基89－97的CDR－L3序列之VL功能域。該人源化抗體於VL功能域中可亦或供選擇地包含位於卡巴特位置46之L或F及/或位於卡巴特位置48之I或V。
於另一方面，本發明提供一種經單離人源化抗體，其與NKG2A專一性結合且其包含(a)Z270 VL(SEQ ID NO：1)、humZ270 VL(SEQ ID NO：4)或humZ270 VL cons(SEQ ID NO：6)之CDR－L1、CDR－L2與/或CDR－L3序列，或(b)Z270 VH(SEQ ID NO：2)、humZ270(SEQ ID NO：5)、humZ270 cons(SEQ ID NO：7)、或humZ270 cons2(SEQ ID NO：8)之CDR－H1、CDR－H2與/或CDR－H3序列。於另一方面，本發明提供一種其包含至少一源自Z270、humZ270或humZ270 cons之VH CDR之完整組的抗體分子，其中6個C－端胺基酸係與人類受者序列的相同。於一特別之方面，本發明提供一種其包含Z270、humZ270或humZ270 cons之CDR－H1、CDR－H2(或其N－端部分)、與CDR－H3及至少一些Z270、humZ270或humZ270 cons之CDR－L1、CDR－L2與CDR－L3的抗體分子。於一更特別之方面，本發明提供一種抗體分子，其中該抗體分子包含Z270、humZ270或humZ270 cons之CDR－L1、CDR－L2、與CDR－L3、CDR－H1、CDR－H2與CDR－H3，其中經由適宜的FR序列CDR－L1係連接至CDR－L2，CDR－L2係連接至CDR－L3，CDR－H1係連接至CDR－H2，且CDR－H2係連接至CDR－H3。
於一特別之方面，本發明提供包含humZ270、humZ270 cons、或humZ270 cons2之實質上全部VH與/或VL功能域的抗體分子。
根據本發明之人源化抗－NKG2A抗體可包含任何包含本文所述humZ270VH之全長或部分重鏈(HC)，且/或任何包含humZ270VH之全長或部分重鏈(HC)可與任何本文所述之humZ270VL組合，而產生供測試抗原結合、對CD94/NKG2A－表現細胞之功能性作用、及/或免疫原性的抗體或片段。
預期各種形式之人源化抗體。例如，人源化抗體可為抗體片段，例如Fab或本文所述之其他類型片段。或者，人源化抗體可為全長或完整的抗體，例如全長或完整的IgG1或IgG4抗體。於一項具體態樣，人源化抗體為全長IgG4抗體或其片段。
於一方面，本發明提供特徵為以下者之人源化抗體：a)與NKG2A專一性結合；b)不專一性結合至Fc受體；且c)當結合至位於人類NK細胞上之NKG2A時，促使該NK細胞在於標靶細胞表面攜帶有HLA－E之標靶人類細胞與該NK細胞接觸時將該標靶細胞溶胞。於一項具體態樣，人源化抗體包含已經修飾以防止與Fc受體結合之小鼠或人類IgG1恆定區，或人類IgG4恆定區。此類抗體，以及不與Fc受體結合之抗體片段，尤其可用於其中希望活化NK細胞(例如癌症、感染性疾病)，而不會導致NK細胞本身耗竭(可能藉由抗體依賴性細胞毒性所介導)之應用上，且可將其稱作“非－耗竭性”抗體。
於另一方面，人源化抗體包含與Fc受體結合之小鼠或人類IgG1恆定區，或已經修飾以與Fc受體結合或增加與Fc受體結合之人類IgG4恆定區，或人類IgG4恆定區。於另一項具體態樣，係將單株抗體或其片段連接至對該抗體欲結合之細胞具毒性之部分。此類抗體尤其可用於其中希望除盡NK細胞之應用，可用於諸如NK－LDGL(顆粒淋巴細胞之NK－類型淋巴增生性疾病；或者稱為NK－LGL)等特定應用上，且可將其稱作“耗竭性”抗體。
對於人源化抗體之重組製造，可將人源化VH與VL區域(或其變異型版本)根據標準重組方法選殖入編碼源自人類抗體之全長或經截短恆定區的表現載體中(參見，例如，山姆布魯克等人,分子選殖：實驗室手冊(Molecular Cloning：A Laboratory Manual),第2版,冷泉港實驗室,冷泉港,紐約,1989)。結果為產生表現及分泌所興趣人源化抗體分子(包含所選擇VH與VL區域及恆定區)之經轉染細胞系。編碼人類抗體恆定區之cDNA序列為已知。可(例如)經由GenBank取用之例舉性cDNA序列列示如下(各完整地以引用方式納入本文)：人類IgG1恆定重鏈區：GenBank寄存編號：J00228；人類IgG2恆定重鏈區：GenBank寄存編號：J00230；人類IgG3恆定重鏈區：GenBank寄存編號：X04646；人類IgG4恆定重鏈區：GenBank寄存編號：K01316；及人類kappa輕鏈恆定區：GenBank寄存編號：J00241。
若希望，亦可藉由已知方法將人源化抗體之類別“轉換”。例如，可將原始製造呈IgM分子之抗體類別轉換成IgG抗體。類別轉換技術亦可用於將一種IgG次類轉換成另一種，例如從IgG1轉換成IgG2。因此，本發明抗體之效應功能可藉由同種型轉換成(例如)IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE或IgM抗體而改變，以用於各種治療用途。
恆定區可根據已知方法進行進一步修飾。例如，於IgG4恆定區，可將殘基S241突變成脯胺酸(P)殘基以使能於鉸鏈區形成完整的雙硫鍵(參見，例如，安格爾等人,Mol Immunol.1993；30：105－8)。
抗體片段 本發明之人源化抗體可經製備成抗體片段，或可從人源化全長抗體製備得抗體片段。
已發展出各種用於製造人源化抗體之抗體片段的技術。傳統上，此等片段係經由全長抗體之蛋白分解衍生得(參見，例如，森本等人,生物化學與生物物理方法月刊(Journal of Biochemical and Biophysical Methods),24：107－117(1992)；及布瑞南等人,科學(Science),229：81(1985))。然而，此等片段現在可直接由重組宿主細胞製得。或者，可直接從大腸桿菌回收得Fab'－SH片段並化學地偶合而形成F(ab')2片段(卡特等人,生物/技術(Bio/Technology),10：163－167(1992))。根據另一方法，可直接從重組宿主細胞培養物回收得F(ab')2片段。其他用於製造抗體片段之技術對於熟習該項技術者會是顯而易知。於其他具體態樣，所選擇之抗體為單鏈Fv片段(scFv)。參見WO 1993/16185；U.S.Pat.No.5,571,894；及U.S.Pat.No.5,587,458。抗體片段亦可為“線形抗體”，例如如U.S.Pat.No.5,641,870中所述。此類線形抗體片段可為單特異性或雙特異性。
雙特異性抗體為對於至少兩種表位具有結合專一性之抗體。用於製造雙特異性抗體之方法為技術領域中已知，且全長雙特異性抗體之傳統生產通常係基於將兩種免疫球蛋白重鏈－輕鏈對共表現，其中該二鏈具有不同專一性(米爾斯坦等人,自然(Nature),305：537－539(1983))。於根據本發明之雙特異性抗體，至少一種結合表位係位於NKG2A蛋白質上。可將抗－NKG2A－結合“臂”與結合至位於白血球上之引發分子(例如T－細胞受體分子，例如CD2或CD3)、或對於IgG之Fc受體(Fc加瑪－R，例如Fc加瑪RI(CD64)、Fc－加瑪－RII(CD32)及Fc－加瑪－RIII(CD16))的“臂”組合，以致能使細胞防禦機制聚焦於NKG2A－表現細胞。雙特異性抗體可亦用於將細胞毒性劑局部化至表現NKG2A之細胞。此等抗體擁有NKG2A－結合臂及與細胞毒性劑(例如皂草素、抗－干擾素－阿伐、長春花鹼、蓖麻毒蛋白A鏈、甲胺蝶呤、或放射活性同位素半抗原)結合之臂。雙特異性抗體可經製備呈全長抗體或抗體片段(例如F(ab')2雙特異性抗體)。預期到包含具有二價以上之抗體。例如，可製備得三特異性抗體。圖特等人,J.Immunol,147：60(1991)。
本發明之代表性抗體、抗體片段及多特異性抗體包含包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：5之殘基D52、D54、R94、F99、T(100C)及W(100F)的CDR－H2與CDR－H3之部分，彼等已被顯示對於抗原結合很重要(參見實施例)。視需要地，人源化抗體片段及多特異性抗體亦包含Z270重鏈殘基N35、Y53、E56、D98、V(100A)及L(100D)。於一方面，本發明之人源化抗體片段或多特異性抗體包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：5之CDR－H2殘基50－59及CDR－H3殘基95－102。於一項具體態樣，人源化抗體片段或多特異性抗體不包含Z270 CDR－L1、CDR－L2及CDR－L3之一、二或全部。於一項額外或供選擇之具體態樣，抗體片段或多特異性抗體不包含Z270 CDR－H1。
抗體衍生物 於本發明範圍內之抗體衍生物包括經共軛或共價結合至第二種藥劑之人源化抗體。
例如，於一方面，本發明提供包含經共軛或共價結合至細胞毒性劑之人源化抗體的免疫共軛物。術語“細胞毒性劑”用於本文為能夠殺死於其細胞表面上帶有NKG2A受體之細胞。可將任何類型具有細胞毒性或細胞抑制作用之部分共軛至本發明抗體以形成本發明之細胞毒性共軛物，並用以抑制或殺死特定NK受體表現性細胞，包括治療性放射性同位素、毒性蛋白質、毒性小分子(例如藥物)、毒素、免疫調制劑、激素、激素拮抗劑、酵素、寡核苷酸、酵素抑制劑、治療性放射性核素、血管生成抑制劑、化學治療藥物、長春花鹼、蒽環霉素(anthracyclin)、表鬼臼毒素(epidophyllotoxins)、紫杉烷、抗代謝物、烷化劑、抗生素、COX－2抑制劑、SN－38、抗有絲分裂素、抗血管生成與細胞凋亡劑，特別是多柔比星(doxorubicin)、甲胺蝶呤、紫杉醇、CPT－11、喜樹鹼、氮芥、吉西他濱、烷磺酸酯、亞硝基脲、三類、葉酸類似物、嘧啶類似物、嘌呤類似物、鉑配位錯合物、假單胞菌外毒素、蓖麻毒蛋白、5－氟尿苷、核酸酶(RNase)、DNase I、葡萄球菌內毒素－A、北美商陸木抗病毒蛋白、吉洛寧(gelonin)、白喉毒素、假單胞菌外毒素、與假單胞菌內毒素及其他(參見，例如Remington’s Pharmaceutical Sciences,19th Ed.(Mack Publishing Co.1995)；Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics(McGraw Hill,2001)；Pastan等人(1986)Cell 47：641；Goldenberg(1994)Cancer Journal for Clinicians 44：43；U.S.Pat.No.6,077,499；其等之完整揭示係以引用方式納入本文中)。應了解毒素可能為動物、植物、真菌或微生物來源，或可藉由化學合成從頭產生。
於另一項具體態樣，抗體係以放射性同位素(例如治療性放射性核素或適用於偵測目的之放射性核素)衍生化。可使用許多適宜的放射性同位素之任一種，包括(但不限定於)I－131、銦－111、鎦－171、鉍－212、鉍－213、砈－211、銅－62、銅－64、銅－67、釔－90、碘－125、碘－131、磷－32、磷－33、鈧－47、銀－111、鎵－67、鐠－142、釤－153、鋱－161、鏑－166、鈥－166、錸－186、錸－188、錸－189、鉛－212、鐳－223、錒－225、鐵－59、硒－75砷－77、鍶－89、鉬－99、銠－105、鈀－109、鐠－143、鉅－149、鉺－169、銥－194、金－198、金－199、與鉛－211。一般，放射性核素較佳地具有介於20至6,000 keV之蛻變能量範圍，較佳對於俄歇(Auger)發射體範圍介於60至200 keV，對於貝他發射體係介於100－2,500 keV，而對於阿伐發射體係介於4,000－6,000 keV。亦較佳地為實質上伴隨產生阿伐－粒子蛻變之放射性核素。
於其他具體態樣，第二種藥劑為可偵測性部分，其可為任何能被定量或定性觀察或測量之分子。可用於本發明共軛抗體之可偵測標記物實例為放射性同位素、螢光染料或互補結合對之一員，例如下列任意者之一員：抗原/抗體(針對NKG2A之抗體除外)；凝集素/碳水化合物；抗生物素蛋白/生物素；受體/配體；或分子上被印記之聚合物/印記分子系統。
第二種藥劑亦可或供選擇地為(例如)欲增加人源化抗體之循環半衰期的聚合物。例舉性聚合物及用於將此類聚合物接附至肽類之方法係經說明於(例如)U.S.Pat.Nos.4,766,106；4,179,337；4,495,2850及4,609,546。額外例舉性聚合物包括聚氧乙基化多醇類及聚乙二醇(PEG)部分(例如，全長抗體或抗體片段可經共軛至一或多種具有分子量約1,000至約40,000(例如約2000至約20,000，如3,000－12,000)之PEG分子)。
可將細胞毒性劑或其他化合物直接或間接地使用任一種許多可利用之方法連接至抗體。例如，可使用諸如N－琥珀醯基3－(2－吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)等交聯劑經由雙硫鍵形成，或經由抗體Fc區中之碳水化合物部分，將藥劑接附於已還原抗體組成的鉸鏈區(參見，例如余等人(1994)Int.J.Cancer 56：244；王,蛋白質共軛與交聯之化學(Chemistry of Protein Conjugation and Cross－linking)(CRC出版1991)；優培拉斯等人,"抗體藉由化學方法之修飾(Modification of Antibodiesby Chemical Methods)"於單株抗體：原理及應用(Monoclonal antibodies：principles and applications),柏奇等人(編著),第187－230頁(威利－里斯,Inc.1995)；普利斯,"合成型肽類－衍生抗體之製造與特徵化(Production and Characterization of Synthetic Peptide－Derived Antibodies)"於單株抗體：製造、改造及臨床應用(Monoclonal antibodies：Production,engineering and clinical application),里特等人(編著),第60－84頁(劍橋大學出版1995)，卡托爾等人(1989)今日化學(Chemistry today)7：51－58，迪普林諾等人(1993)J.Pharm.Sci 82：699－704；亞爾皮可等人(1997)生物共軛物化學(Bioconjugate Chernistry)8：3；萊斯弗德等人(1989)Antibody,Immunicon.Radiopharrn.2：217；其各完整地以引用方式納入本文)。
或者，可例如藉由重組技術或肽類合成，製得包含抗－NKG2A抗體與第二種(細胞毒性或其他)多肽藥劑之融合蛋白質。
結合分析
本發明提供與人類NKG2A結合之人源化抗體，特別是由Z270融合瘤製造之抗－NKG2A抗體之人源化版本。
許多種分析方法之任一種皆可用於分析抗體與人類NKG2A之結合。尤其，基於ELISA、放射免疫分析、西方轉漬法、BIACORE、及其他競爭分析之方法係是於使用，且為技術領域中已知。
例如，可使用簡單的結合分析，其中係將測試抗體於標靶蛋白質或表位(例如NKG2A或其部分)存在下進行培養，將未結合之抗體洗除，並使用(例如)放射性標記物、諸如質譜法等物理方法、或使用(例如)細胞螢光計量分析(如FACScan)偵測之直接或間接螢光標記評估已結合抗體之存在。此類方法為熟習該項技術者所熟知。任何高於對照組非專一性抗體所觀察到量之結合量指示該抗體專一性結合至該標靶物。
於此類分析，可將測試抗體與標靶細胞或人類NKG2A結合之能力與(陰性)對照組蛋白(例如，對抗於結構上不相關之抗原，或非－Ig肽或蛋白質而產生的抗體)之能力比較。使用任何適宜分析呈現相較於對照組蛋白具有增加25%、50%、100%、200%、1000%或以上親和性的與標靶細胞或人類NKG2A結合之抗體或片段，稱之與標靶物“專一性結合”或“專一性作用”，且較佳用於下述之治療方法。亦可評估測試抗體影響針對NKG2A之(陽性)對照組之抗體(例如Z270)或其衍生物之結合的能力。
人源化抗－NKG2A抗體可能或可能不與人類NKG2C結合，可能或可能不與人類NKG2E結合，或者可能或可能不與人類NKG2C及E任一者結合。於一項特別具體態樣，單株抗體或片段不與其他人類NKG2受體結合，特別是活化性受體NKG2C或NKG2E。本發明抗體之NKG2C－及NKG2E－結合特性，可於如前述類似之分析中進行評估，簡單地將NKG2A與所興趣分子交換。
於一方面，本發明提供與Z270共有生物學特徵及/或實質上序列同一性的非人類抗體之人源化版本。一種例舉性生物學特徵係結合至Z270表位，亦即NKG2A胞外功能域中Z270抗體與之結合的區域。為篩檢出與Z270表位結合之抗體，可完成例如經描述於抗體，實驗室手冊(Antibodies,A Laboratory Manual)，冷泉港實驗室出版，哈羅與大衛連恩編著(1988)之例常交叉－阻斷分析。
於一項例舉性交叉－阻斷或競爭分析，係將Z270(對照組)抗體與測試抗體混合(或預先吸附)，並加至含有NKG2A之樣本。於某些具體態樣，係將對照組抗體與各種不同量之測試抗體(亦即，1：10或1：100)在加至含有NKG2A之樣本前先預－混合一段時間。於其他具體態樣，係於暴露至抗原/標靶樣本期間，將對照組與各種量之測試抗體簡單地混合。只要能分辨已結合與自由態抗體(例如，藉由使用消除未結合抗體之分離或清洗技術)及對照組抗體與測試抗體(例如，藉由使用物種－或同功型－專一性次級抗體，藉由將對照組抗體專一性以可偵測標記物標定，或藉由使用區別不同化合物之物理方法例如質譜法)，吾人即能測定該測試抗體是否減低該對照組抗體與該抗原之結合，表示該測試抗體可辨識實質上與對照組相同的表位。於此分析，(經標定)對照組抗體於完全不相關抗體存在下之結合為對照組高值。對照組低值係藉由將經標定(陽性)對照組抗體(Z270)與未經標定之對照組抗體進行培養而獲得，其中將發生競爭並減低經標定抗體之結合。
於一項測試分析中，經標定抗體反應性於測試抗體存在下顯著減低指示可辨識相同表位之測試抗體，亦即為與經標定對照組抗體“交叉－反應”者。於介於約1：10至約1：100之對照組：測試抗體或化合物任何比例下，使經標定對照組與抗原/標靶物之結合減低至少50%或更佳地70%之任何測試抗體或化合物，被認為係結合至實質上與對照組相同之表位或決定基的抗體或化合物。較佳地，此類測試抗體或化合物會使對照組與抗原/標靶物之結合減低至少90%。雖然如此，於本發明可使用任何使對照組抗體或化合物之結合減低至可測量程度的抗體或化合物。
類似之交叉－阻斷分析亦可用於評估測試(人源化)抗體是否影響人類NKG2A之天然配體(HLA－E)與NKG2A之結合，其藉由將Z270與HLA－E之適宜形式交換。例如，為測定人源化抗－NKG2A抗體製劑是否減低或阻斷CD94/NKG2A與HLA－E之交互作用，可完成下列測試：將表現CD94/NKG2A之細胞系(例如Ba/F3－CD94/NKG2A、NKL或NK92)與漸增濃度之測試抗－NKG2A抗體於冰上培養30 min。然後將細胞與經PE－標定之HLA－E四聚體於冰上培養30分鐘，再次清洗，並於流式細胞計量儀(FACScalibur，貝克頓,迪金生(Beckton Dickinson))藉由標準方法分析HLA－E四聚體結合。於無測試抗體存在下，HLA－E四聚體可結合至該等細胞。於可阻斷CD94/NKG2A與HLA－E結合之抗體製劑存在下，有減低的HLA－E四聚體結合至該等細胞，而此類mAb經命名為“阻斷抗體”。
於本發明有些方面，例如若不希望殺死NKG2A－表現細胞，則本發明之人源化抗體較佳地不展示至Fc受體之實質上專一性結合。此類抗體可包含各種已知不與Fc受體結合之重鏈恆定區。一種此類實例為IgG4恆定區。或者，不包含恆定區之抗體片段(例如Fab或F(ab’)2片段)可用於避免Fc受體結合。可根據技術領域中已知之方法評估Fc受體結合，包括(例如)於BIACORE分析中測試抗體與Fc受體蛋白之結合。又，可使用其中Fc部分係經修飾以最小化或消除與Fc受體結合之任何其他抗體類型(參見，例如WO03101485，其揭示以引用方式納入本文)。諸如用於分析Fc受體結合之基於細胞之分析為技術領域中所熟知且經描述於(例如)WO03101485。
細胞毒性分析
若抗－NKG2A抗體減低或阻斷CD94/NKG2A與HLA－E之交互作用，則其可增加受CD94/NKG2A－限制之淋巴細胞的細胞毒性。此可藉由代表性細胞毒性分析(其實例描述於下文)進行評估。
某一抗體減低CD94/NKG2A－所介導訊號傳遞之能力可於標準4－小時試管內細胞毒性分析中測試，其使用(例如)表現CD94/NKG2A之NKL細胞，及表現HLA－E之標靶細胞。此類NKL細胞因為CD94/NKG2A辨識HLA－E，導致引發及傳播防止由淋巴細胞介導之細胞溶解的抑制性訊號傳遞，而不會有效地殺死表現HLA－E之標靶細胞。此項試管內分析可藉由技術領域中已熟知(例如描述於柯里根等人,編著,現今免疫學提案(Current Protocols in Immunology),格林柰出版Assoc.與威利國際科學,N.Y.,(1992,1993))之標準方法完成。於添加NKL細胞前，先將標靶細胞以51 Cr標定，然後殺死係以51 Cr從細胞至培養基之釋出(為殺死之結果)之比例估計。加入防止CD94/NKG2A與HLA－E結合之抗體會導致防止引發及傳播經由CD94/NKG2A之抑制性訊號傳遞。因此，添加此類藥劑會造成淋巴細胞所介導的殺死標靶細胞之增加。此步驟藉此鑑認出藉由(例如)阻斷配體結合而防止CD94/NKG2A－所誘發之負面傳訊的藥劑。於一種特別之51 Cr－釋出細胞毒性分析中，表現CD94/NKG2A之NKL效應細胞可殺死HLA－E－陰性LCL 721.221標靶細胞，但是較不有效殺死表現HLA－E之LCL 721.221－Cw3對照組細胞。相反地，缺少CD94/NKG2A之YTS效應細胞有效殺死該二細胞系。因此，由於經由CD94/NKG2A之HLA－E－所誘導的抑制性訊號傳遞，故NKL效應細胞較不有效地殺死HLA－E＋ LCL 721.221－Cw3細胞。當NKL細胞與根據本發明之阻斷性抗－CD94/NKG2A抗體於此類51 Cr－釋出細胞毒性分析中預先培養時，HLA－E－表現性LCL 721.221－Cw3細胞以抗體－濃度依賴方式，更有效地被殺死。
本發明抗體之抑制或增強活性，亦可以任一種其他許多方法分析，例如藉由其對於胞內游離態鈣之作用，例如經描述於席弗利等人,J.Exp.Med.1997；186：1129－1136(其揭示係以參考方式納入本文)。亦可使用基於細胞之細胞毒性分析，例如測量鉻釋出或其他用於評估該抗體刺激NK細胞殺死標靶細胞(例如P815、K562細胞)或之適當腫瘤細胞的能力之參數，來評估NK、T或NKT細胞活性，如席弗利等人,J.Exp.Med.1997；186：1129－1136；韋他里等人,J.Exp.Med.1998；187：2065－2072；派西諾等人J.Exp.Med.1998；188：953－960；柰里等人Clin.Diag.Lab.Immun.2001；8：1131－1135；潘迪等人J.Exp.Med.1999；190：1505－1516所揭示，其個別之完整揭示係以引用方式納入本文。
於一項具體態樣，抗體製劑造成CD94/NKG2A－限制之淋巴細胞的細胞毒性增加至少10%，較佳地NK細胞毒性增加至少40%或50%，或更佳地NK細胞毒性增加至少70%。
亦可使用細胞因子－釋出分析說明細胞毒性淋巴細胞之活性，其中係將NK細胞與抗體培養，以刺激NK細胞製造細胞因子(例如製造IFN－y與TNF－α)。於例舉性方法中，係藉由細胞表面與胞質內染色並於培養4天後以流式細胞分析法分析而評估由PBMC之IFN－y製造。簡言之，係將Brefeldin A(西格瑪亞德利奇(Sigma Aldrich))以終濃度為5 μg/ml加入進行最後4小時培養。然後將細胞與抗－CD3及抗－CD56 mAb培養，之後通透化(IntraPrepTM ；貝克曼庫特)並以PE－抗－IFN－y或PE－IgG1(法名根(Pharmingen))染色。得自經多株活化NK細胞之GM－CSF與IFN－y製造係使用ELISA於上清液中進行測量(GM－CSF：DuoSet Elisa,R&D Systems,明尼波里斯,MN，IFN－：OptElA組,法名根)。
於一特別之方面，本發明提供較其原始、非人源化及/或嵌合型版本更能夠或更有效於增加CD94/NKG2A－限制之淋巴細胞的細胞毒性、強化CD94/NKG2A－限制之淋巴細胞的細胞毒性活性、或者減低或抑制CD94/NKG2A－所介導之訊號傳遞的抗體。此類抗體可(例如)比其原始、非人源化及/或嵌合型版本更有能力或更有效至少2%，至少5%，至少10%，至少15%或至少20%。
重組方法
本發明亦提供編碼本文所述抗－NKG2A抗體之單離核酸，以及包含此類核酸之載體與宿主細胞。亦提供者為使用重組技術製造此類抗－NKG2A抗體之方法，例如培養包含此類核酸或載體之適宜宿主細胞以使能表現該核酸並製造人源化抗體。於培養前，可將宿主細胞(例如)以包含編碼重鏈可變功能域之核酸的載體與包含編碼輕鏈可變功能域之核酸的載體共－轉染。又，可使用已知技術將抗體從宿主細胞培養基回收及/或純化。可使用之載體、宿主細胞、及技術進一步描述於下文及實施例中。而且，用於表現人源化抗－NKG2A抗體之策略係列示於圖4－6。
通常，對於抗體之重組製造，係將編碼其之核酸單離出並插入供進一步選殖(DNA擴增)或表現之可複製載體中，代表性地經操作性連接至一或多種表現控制元件。編碼單株抗體之DNA係容易地使用習知程序單離出並定序(例如，藉由使用能夠專一性結合至編碼抗體重鏈與輕鏈之基因的寡核苷酸探針)。許多載體為已知且可利用。載體組成一般包括(但不限定於)下列一或多種：訊號序列、複製原點、一或多種標記基因、增效子元件、啟動子、與轉錄－終結序列。
訊號序列組成 本發明之抗－NKG2A抗體不僅可直接以重組方式製得，亦可製成具有異源性多肽之融合多肽，該異源性多肽較佳為訊號序列或於成熟蛋白質或多肽之N－端具有特定裂解部位的其他多肽。所選之異源性訊號序列較佳地為被宿主細胞辨識且加工(亦即，由訊號肽酶裂解)者。關於用於表現人源化抗－NKG2A抗體(例如人源化Z270抗體)之重與/或輕鏈的例舉性訊號序列，參見例如實施例2。
對於無法辨識及加工天然抗－NKG2A抗體訊號序列之原核宿主細胞，係將訊號序列以選自(例如)鹼性磷酸酶、青霉素酶、lpp、或熱安定性腸毒素II前導序列之群組之原核訊號序列取代。對於酵母分泌，可將天然訊號序列以(例如)酵母轉化酶前導序列、阿伐因子前導序列(包括酵母屬(Saccharomyces)與克魯維酵母屬(Kluyveromyces)阿伐因子前導序列)、酸－磷酸酶前導序列、白色念珠菌(C.albicans)葡糖澱粉酶前導序列、或揭示於WO 1990/13646之訊號序列取代。於哺乳動物細胞表現，可利用哺乳動物訊號序列以及病毒分泌前導序列，例如單純疱疹病毒gD訊號序列。
將對應此類前驅物區域之DNA以符合讀框方式，接合至編碼抗－NKG2A抗體之DNA。
複製起點組成 表現及選殖載體二者皆含有能夠使載體於一或多種所選宿主細胞中複製之核酸序列。一般，於選殖載體中此序列為能夠使載體獨立於宿主染色體DNA進行複製者，且包括複製起點或自主複製序列。此類序列對於各種細菌、酵母、及病毒為熟知。源自質體pBR322之複製起點適用於大部分革蘭氏陰性菌，2μ質體起點適用於酵母，而各種病毒起點(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV、EBV或BPV)適用於哺乳動物細胞之選殖載體，一般，複製起點組成對於哺乳動物表現載體並非必要(SV40起點僅因為其含有早期啟動子故可代表性地被使用)。
篩選基因組成 表現及選殖載體可含有篩選基因，亦稱作可篩選標記物。代表性之篩選基因係編碼(a)賦予對抗生素或其他毒素(例如苄青霉素、新霉素、甲胺蝶呤或四環菌素)之抗性，(b)補充營養缺陷，或(c)供給無法從複合培養基取得之重要營養物，例如編碼芽孢桿菌之D－丙胺酸消旋酶的基因。
一項篩選流程之實例使用阻止宿主細胞生長的藥物。該等經異源基因成功轉型之細胞產生賦予藥物抗性之蛋白質而因此在篩選攝生法中存活。此類顯性篩選之實例係使用藥物新霉素、霉酚酸(Mycophenolic acid)及潮霉素。
另一種用於哺乳動物細胞之適宜可篩選標記物的實例為該等使能鑑認出可勝任接收抗－NKG2A抗體－編碼核酸之細胞者，例如DHFR、胸苷激酶、金屬硫蛋白－I與－II(較佳為靈長類金屬硫蛋白基因)、腺苷脫胺酶、鳥胺酸去羧基酶等。
例如，首先藉由將所有轉型株培養於含有甲胺蝶呤(Mtx)(為DHFR之競爭性拮抗劑)之培養基中，而鑑認出經DHFR篩選基因轉型的細胞。當使用野生型DHFR時，適當的宿主細胞為DHFR活性缺陷之中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系。
或者，以編碼抗－NKG2A抗體、野生型DHFR蛋白質、及另一種可篩選標記物(例如胺基葡萄糖苷3'－磷酸轉移酶(APH))之DNA序列轉型或共－轉型的宿主細胞(特別是含有內源性DHFR之野生型宿主)，可藉由將細胞生長於含有對於該可篩選標記物之篩選藥劑之培養基中而篩選，該篩選標記物例如為胺基葡萄糖苷類抗生素，如肯那霉素、新霉素或G418，參見U.S.專利案號4,965,199。
適用於酵母之適宜篩選基因為存在酵母質體YRp7中的trp1基因(史汀坎布等人,N ature,282：39(1979))。trp1基因提供對於欠缺於色胺酸生長之能力的酵母突變株(例如ATCC No.44076或PEP4－1)之篩選標記物。瓊斯,Genetics,85：12(1977)。若酵母宿主細胞基因組中存在有trp1損傷，則提供藉由生長於無色胺酸存在下偵測轉型之有效環境。同樣，Leu2－缺陷型酵母菌株(ATCC 20,622或38,626)係由攜帶Leu2基因之已知質體補充。
此外，衍生自1.6－μm環狀質體pKD1之載體可用於轉型克魯維酵母。或者，用於大規模製造重組牛凝乳酶之表現系統係經報導用於乳酸克魯維酵母(K.lactis)(凡迪柏格,生物/技術(Bio/Technology),8：135(1990))。亦已經揭示用於藉由克魯維酵母菌之工業株分泌成熟重組人類血清白蛋白之適宜穩定多副本表現載體。弗利爾等人,生物/技術,9：968－975(1991)。
啟動子組成 表現及選殖載體通常含有可由宿主生物辨識且經可操作連接至抗－NKG2A抗體－編碼性核酸之啟動子。可與原核宿主使用之啟動子包括phoA啟動子、β－內醯胺酶與乳糖酶啟動子系統、鹼性磷酸酶、色胺酸(trp)啟動子系統、及雜合型啟動子，例如tac啟動子。然而，其他已知細菌啟動子係適宜的。用於細菌系統之啟動子亦會含有經可操作連接至編碼抗－NKG2A抗體之DNA的Shine－Dalgarno(S.D.)序列。
對於真核生物，各種動子序列係已知。實際上所有真核基因皆具有位於轉錄起始位點上游大約25至30個鹼基處之AT－富含區域。另一經發現於許多基因之轉錄起始位點上游70至80個鹼基處之序列為CNCAAT區域，其中N可為任意核苷酸。位於大多數真核基因之3'處為一段AATAAA序列，其可為用於添加聚－A尾部至編碼序列之3'端之訊號。所有此等序列皆經適宜地插入真核表現載體中。與酵母宿主使用之適宜啟動子序列包括3－磷酸甘油酸激酶或其他糖解酵素，例如烯醇酶、甘油醛－3－磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸去羧基酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖－6－磷酸異構酶、3－磷酸甘油酸異位酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸異構酶、磷酸葡萄糖異構酶、及葡萄糖激酶之啟動子。
其他酵母啟動子(其為具有額外受生長條件控制之轉錄優點的可誘導啟動子)為乙醇脫氫酶2、異細胞色素C、酸磷酸酶、與氮代謝相關之分解酵素、金屬硫蛋白、甘油醛－3－磷酸脫氫酶、及負責麥芽糖與半乳糖利用之酵素的啟動子區域。適用於酵母表現之載體與啟動子係進一步描述於EP73657。亦有利地將酵母啟動子與酵母增效子一起使用。
於哺乳動物宿主細胞中自載體之抗－NKG2A抗體轉錄係(例如)受得自諸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(例如腺病毒2)、牛乳頭瘤病毒、禽類肉瘤病毒、巨細胞病毒(CMV)、反轉錄病毒、B－型肝炎病毒、及最佳地係猴病毒40(SV40)之病毒基因組之啟動子、異源性哺乳動物啟動子(例如肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動子)、及熱休克啟動子控制，其條件為此類啟動子可與宿主細胞系統相容。
SV40病毒之早期與晚期啟動子係方便地以SV40限制片段之形式獲得，該片段亦含有SV40病毒之複製起點。人類巨細胞病毒之立即早期啟動子係方便地以HindIII E限制片段之形式獲得。一種用於使用牛乳頭瘤病毒作為載體於哺乳動物宿主表現DNA之系統，係經揭示於U.S.專利No.4,419,446。對此系統之修飾係描述於U.S.專利No.4,601,978。關於人類貝他－干擾素cDNA於源自單純疱疹病毒之胸苷激酶調控下在小鼠細胞中的表現，亦參見雷斯等人,自然,297：598－601(1982)。或者，可使用Rous肉瘤病毒長－末端重複片段作為啟動子。
增效子元件組成 編碼本發明抗－NKG2A抗體之DNA由高等真核細胞的轉錄往往可藉由將增效子序列插入載體中而增加。目前有許多增效子序列為已知源自哺乳動物基因(球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、α－胎蛋白與胰島素)。然而，代表性地，吾等會使用源自真核細胞病毒之增效子。實例包括位於複製起點之晚期側之SV40增效子(bp 100－270)、巨細胞病毒早期啟動子增效子、位於複製起點之晚期側之多瘤病毒增效子、及腺病毒增效子。關於用於活化真核啟動子之增效元件，亦參見洋尼弗,自然,297：17－18(1982)。增效子可經剪接至載體中，位於抗－NKG2A抗體－編碼序列之位置5'或3'處，但是較佳地係位於啟動子之5'側。
轉錄終結組成 用於真核宿主細胞(例如酵母、真菌、昆蟲、植物、動物、人類、或源自其他多核生物之核化細胞)的表現載體會亦含有終止轉錄及穩定mRNA所必需之序列。此類序列一般可得自真核或病毒DNA或cDNA之未轉譯區域的5'端(有時是3'端)。此等區域含有經轉錄呈編碼抗－NKG2A抗體之mRNA的未經轉譯部份中之聚腺苷化片段之核苷酸節段。一種可用之轉錄終結組成為牛生長激素聚腺苷化區域。參見WO 1994/11026及其中所揭示之表現載體。
宿主細胞之選擇及轉型組成 適用於選殖或表現本文載體中之DNA的宿主細胞為前述之原核細胞、酵母或高等真核細胞。適於本發明目的之原核細胞包括真細菌，例如革蘭氏－陰性或革蘭氏－陽性菌，例如腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，例如埃希氏菌屬(Escherichia)，如大腸桿菌、腸桿菌屬(Enterobacter)、歐文氏菌屬(Erwinia)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、變形菌屬(Proteus)、沙門氏桿菌屬(Salmonella)，如傷寒沙門氏桿菌(Salmonella typhimurium)、沙雷氏菌屬(Serratia)，如黏質沙雷氏菌(Serratia marcescans)、與志賀氏菌屬(Shigella)、以及芽孢桿菌屬(Bacilli)，例如枯草芽孢桿菌(B.subtilis)與地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)，例如，揭示於DD 266,710(公開日1989年四月12日)之地衣芽孢桿菌41 P、假單胞菌屬(Pseudomonas)，例如綠膿假單胞菌(P.aeruginosa)、與鏈黴菌屬(Streptomyce)。一種較佳之大腸桿菌選殖宿主為大腸桿菌294(ATCC 31,446)，雖然其他菌株例如大腸桿菌B、大腸桿菌X1776(ATCC 31,537)、及大腸桿菌W3110(ATCC 27,325)亦為適合。此等實例僅為例舉說明而非限制性。
除原核生物外，真核微生物(例如絲狀真菌或酵母菌)為適於抗－NKG2A抗體－編碼載體之選殖或表現宿主。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(或通用之烘焙酵母)為最常使用之低等真核宿主微生物。然而，許多其他屬、種、及品系為一般可取用且可用於本發明，例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克魯維酵母宿主(Kluyveromyces)，例如乳酸克魯維酵母(K.lactis)、脆壁克魯維酵母(K.fragilis)(ATCC 12,424)、保加利亞克魯維酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、威克米克魯維酵母(K.wickeramii)(ATCC 24,178)、瓦提克魯維酵母(K.waltii)(ATCC 56,500)、果德克魯維酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36,906)、耐熱克魯維酵母(K.thermotolerans)、與馬克斯克魯維酵母(K.marxianus)；yarrowia(EP 402,226)；巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)(EP 183,070)；念珠菌(Candida)；里斯木霉菌(Trichoderma reesia)(EP 244,234)；粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)；許旺酵母屬(Schwanniomyces)，例如許旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)；及絲狀真菌，例如脈孢菌(Neurospora)、青霉菌(Penicillium)、層壁黑粉菌(Tolypocladium)、及曲霉菌(Aspergillus)宿主，例如構巢曲霉(A.nidulans)與黑曲霉(A.niger)。
適於表現糖苷化抗－NKG2A抗體之適宜宿主細胞係衍生自多細胞生物。無脊椎生物細胞之實例包括植物與昆蟲細胞。已鑑定得許多桿狀病毒株與變體及源自諸如草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)(蛾類幼蟲)、埃及斑紋(Aedes aegypti)(蚊子)、白紋伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)、果蠅(Drosophila melanogaster)(果蠅)及家蠶(Bombyx mori)等相對應勝任之昆蟲宿主細胞。各種用於轉染之病毒株為公開可得，例如加州苜蓿夜蛾(Autographa californica)NPV之L－1變異株與家蠶NPV之Bm－5品系，且此等病毒可使用作為本文中根據本發明(特別是用於轉)之病毒。
亦可利用棉花、玉米、馬鈴薯、大豆、牽牛花、番茄、與煙草之植物細胞培養物作為宿主。
然而，最有興趣的係脊椎動物細胞，且於培養基(組織培養基)中增殖脊椎動物細胞已經成為一種例常程序。可利用之哺乳動物宿主細胞系實例為經SV40轉型之猴腎CV1細胞系(COS－7,ATCC CRL 1651)；人類胚胎腎(HEK)細胞系(293或經次選殖用以生長於懸浮培養物中之293細胞，葛拉漢等人,J.Gen Virol.,36：59(1977))；幼倉鼠腎細胞(BHK,ATCC CCL 10)；中國倉鼠卵巢細胞/－DHFR(CHO,幽勞布等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77：4216(1980)，包括DG44(幽勞布等人,Som.Cell and Mol.Gen.,12：555－566(1986))與DP12細胞系)；小鼠賽托利(sertoli)細胞(TM4，馬瑟,Biol.Reprod.,23：243－251(1980))；猴腎細胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲綠猴腎細胞(VERO－76,ATCC CRL－1587)；人類子宮頸癌細胞(HELA,ATCC CCL 2)；犬腎細胞(MDCK,ATCC CCL 34)；水牛鼠肝細胞(BRL 3A,ATCC CRL 1442)；人類肺細胞(W138,ATCC CCL 75)；人類肝細胞(Hep G2,HB 8065)；小鼠乳腫瘤(MMT 060562,ATCC CCL51)；TRI細胞(馬瑟等人,Annals N.Y.Acad.Sci.,383：44－68(1982))；MRC 5細胞；FS4細胞；與人類肝癌細胞系(Hep G2)。
將宿主細胞以前述用於製造抗－NKG2A抗體之表現或選殖載體轉型，並培養於經修飾以適用於誘導啟動子、篩選轉型株、或擴增編碼所希望序列之基因的習知營養培養基。
培養宿主細胞 用於製造本發明抗－NKG2A抗體之宿主細胞可培養於各種培養基中。市售可得之培養基(例如Ham's F10(西格馬Sigma)、極限基礎培養基(Minimal Essential Medium(MEM)，西格馬)、RPMI－1640(西格馬)、FreeStyleTM (吉布可(Gibco))、與杜氏修飾英格氏培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)，西格馬))適合用於培養宿主細胞。此外，可使用經描述於(例如)漢姆等人,Meth.Enz.58：44(1979)；巴尼斯等人,Anal.Biochem.,102：255(1980)；U.S.Pat.Nos.4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 1990/03430；WO 1987/00195；或U.S.Pat.Re.30,985之任何培養基作為供宿主細胞的培養基。若需要，任何此等培養基可以激素與/或其他生長因子(例如胰島素、轉鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽類(氯化鈉、鈣、鎂與磷酸鹽)、緩衝液(例如HEPES)、核苷酸(例如腺苷與胸苷)、抗生素(例如GENTAMYCIN.TM.藥物)、微量元素(經定義為通常係以終濃度介於微莫耳範圍存在之無機化合物)、及葡萄糖或相等能量來源補充。亦可熟習該項技術者已知之適當濃度包含其他必要之補充物。培養條件(例如溫度、pH值、以及類似者)為該等先前用於所選宿主細胞用以表現者，且對熟習該項技術者會係顯而易知。
抗－NKG2A抗體之純化 當使用重組技術時，抗體可於細胞內或周質空間中製造，或直接分泌至培養基內。若抗體係於細胞內產生，則作為第一步驟，係將顆粒碎片(宿主細胞或經溶胞的片段)藉由(例如)離心或過濾法去除。卡特等人,生物/技術,10：163－167(1992)描述用於分離經分泌至大腸桿菌周質空間中之抗體的製程。簡言之，係將細胞團於醋酸鈉(pH 3.5)、EDTA、與苯基甲基磺醯氟(PMSF)存在下融解歷時約30 min。可藉由離心將細胞碎片去除。若抗體係經分泌至培養基中，則通常首先使用市售可得之蛋白質濃縮濾器(AMICONTM 或MILLIPORE PELLICONTM 超過濾單元)將得自此類表現系統之上清液濃縮。為抑制蛋白分解，可將蛋白酶抑制劑(例如苯基甲基磺醯氟(PMSF))包括於前述任一步驟，且可包括抗生素以防止外來的污染。
從該等細胞製備得之抗體組成物可使用(例如)羥基磷灰石層析術、凝膠電泳術、透析、及親合性層析術純化，其中以親合性層析術為較佳之純化技術。蛋白質A作為親合性配體之適宜性係取決於任何存在於該抗體之免疫球蛋白Fc功能域的種類與同型。蛋白質A可用於純化基於人類加瑪1、加瑪、或加瑪4重鏈之抗體(林得馬克等人,J.Immunol.Meth.,62：1－13(1983))。蛋白質G被建議用於所有鼠類同型及用於人類y3(古斯等人,EMBO J.,5：15671575(1986))。親合性配體接附於其上之基質最常為瓊脂糖，但是可使用其他基。機械上穩定之基質(例如受控－孔洞玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯)允許較以瓊脂糖所達到者更快的流速及較短處理時間。若抗體包含CH3功能域，則可使用BAKERBOND ABXTM 樹脂(J.T.貝克(J.T.Baker),菲利斯堡,N.J.)純化。亦可利用其他用於蛋白質純化之技術，例如於離子交換管柱上之級分、乙醇沈澱、逆相HPLC、於矽石上之層析術、於肝素SEPHAROSETM 上之層析術、於陰離子或陽離子交換樹脂(例如聚天冬胺酸管柱)上之層析術、色譜聚焦、SDS－PAGE、與硫酸銨沈澱，其視所欲回收之抗體而定。
用於Z270或其人源化版本之例舉性基於蛋白質A的純化方法經描述於實施例6。
醫藥調配物
於一項具體態樣，本發明提供包含如本文所述抗體與一或多種載劑之醫藥組成物。
於是，本發明之一目的係提供包含以濃度從1 mg/ml至500 mg/ml存在之此類抗體的醫藥調配物，且其中該調配物具有為2.0至10.0之pH值。調配物可進一步包含緩衝液系統、防腐劑、張力劑、螯合劑、安定劑、與界面活性劑。於一項具體態樣，醫藥調配物為水性調配物，亦即包含水之調配物。如此調配物典型地係溶液或懸浮液。於另一項具體態樣，醫藥調配物為水性溶液。術語“水性調配物”係定義為包含至少50%w/w水之調配物。同樣，術語“水性溶液”係定義為包含至少50%w/w水之溶液，而術語“水性懸浮液”係定義為，包含至少50%w/w水之懸浮液。
於另一具體態樣，醫藥調配物為經冷凍乾燥之調配物，其於使用前由醫師或患者將溶劑與/或稀釋劑加入其中。
於另一具體態樣，醫藥調配物為未經預先溶解之可立即使用之乾燥調配物(例如，經冷凍乾燥或噴霧乾燥)。
於又一方面，醫藥調配物包含此類抗體之水溶液與緩衝液，其中該抗體係以濃度為或1 mg/ml以上存在，且其中該調配物具有為約2.0至約10.0之pH值。
於另一具體態樣，醫藥調配物之pH值範圍係選自約2.0至約10.0、約3.0至約9.0、約4.0至約8.5、約5.0至約8.0、及約5.5至約7.5所組成的列表。
於又一具體態樣，緩衝液係選自由醋酸鈉、碳酸鈉、檸檬酸鹽、甘胺醯甘胺酸、組胺酸、甘胺酸、賴胺酸、精胺酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸鈉、及參(羥甲基)－胺基甲烷、二(羥乙基)甘胺酸、麥黃酮(tricine)、蘋果酸、琥珀酸鹽、順丁烯二酸、反丁烯二酸、酒石酸、天冬胺酸、或其混合物所組成之群組。此等特別緩衝液之每一者構成本發明之供選擇的具體態樣。
於又一具體態樣，調配物進一步包含醫藥上可接受之防腐劑。防腐劑可選自(例如)由酚、o－甲酚、m－甲酚、p－甲酚、p－羥基苯甲酸甲酯、p－羥基苯甲酸丙酯、2－苯氧基乙醇、p－羥基苯甲酸丁酯、2－苯基乙醇、苯甲醇、氯丁醇、及硫柳汞、溴硝丙二醇(bronopol)、苯甲酸、亞胺基脲(imidurea)、氯己啶(chlorohexidine)、去氫醋酸鈉、氯甲酚、p－羥基苯甲酸乙酯、氯化苄乙氧銨(benzethonium chloride)、氯苯甘油醚(chlorphenesine)(3p－氯苯氧基丙－1,2－二醇)或其混合物。防腐劑可(例如)以為0.1 mg/ml至20 mg/ml、0.1 mg/ml至5 mg/ml、5 mg/ml至10 mg/ml或10 mg/ml至20 mg/ml之濃度存在。此等特別防腐劑之每一者構成本發明之供選擇的具體態樣。防腐劑於醫藥組成物之用途為熟習該項技術者所熟知。為方便起見，參照雷明頓：製藥科學與策略(Remington：The Science and Practice of Pharmacy )，第19版，1995。
於又一具體態樣，調配物進一步包含等張劑。等張劑可(例如)選自由鹽類(例如氯化鈉)、糖類或糖醇、胺基酸(例如L－甘胺酸、L－組胺酸、精胺酸、賴胺酸、異亮胺酸、天冬胺酸、色胺酸、蘇胺酸)、糖醇(例如甘油、1,2－丙二醇(丙二醇)、1,3－丙二醇、1,3－丁二醇)、聚乙二醇(例如PEG400)、或其混合物所組成之群組。可使用任何糖類，例如單－、雙－或多糖類，或水溶性葡聚糖，包括(例如)果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、葡聚糖、茁黴多醣(Pullulan)、糊精、環糊精、可溶性澱粉、羥乙基澱粉與羧甲基纖維素－Na。於一項具體態樣，糖類添加劑為蔗糖。糖醇係定義為具有至少一個－OH基之C4－C8碳氫化合物，且包括(例如)甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、半乳糖醇、甜醇、木糖醇與阿拉伯糖醇。於一項具體態樣，糖類添加劑為甘露糖醇。前述之糖類或糖醇可個別或組合使用。所使用之量無固定限制，只要糖類或糖醇可溶於液體製劑中且不會有害地影響使用本發明方法所達到的穩定作用。糖類或糖醇濃度可(例如)介於約1 mg/ml至約50 mg/ml。等張劑可以(例如)1 mg/ml至50 mg/ml、1 mg/ml至7 mg/ml、8 mg/ml至24 mg/ml、或25 mg/ml至50 mg/ml之濃度存在。此等特別等張劑之每一者構成本發明之供選擇的具體態樣。等張劑於醫藥組成物之用途為熟習該項技術者所熟知。為方便起見，參照雷明頓：製藥科學與策略，第19版，1995。
於又一具體態樣，調配物亦包含螯合劑。螯合劑可(例如)選自乙烯二胺四乙酸(EDTA)、檸檬酸、與天冬胺酸之鹽、及其混合物。螯合劑可以(例如)0.1 mg/ml至5 mg/ml、0.1 mg/ml至2 mg/ml、或2 mg/ml至5 mg/ml之濃度存在。此等特別螯合劑之每一者構成本發明之供選擇的具體態樣。螯合劑於醫藥組成物之用途為熟習該項技術者所熟知。為方便起見，參照雷明頓：製藥科學與策略，第19版，1995。
於又一具體態樣，調配物亦包含安定劑。安定劑於醫藥組成物之用途為熟習該項技術者所熟知。為方便起見，參照雷明頓：製藥科學與策略，第19版，1995。更具體地，本發明組成物可為經安定化之液體醫藥組成物，其治療上活性組成包括可能於以液體醫藥調配物形式儲放的期間呈現聚集物形成之多肽。“聚集物形成”意指於導致形成寡聚物(其可能保持可溶，或為從溶液沈澱出之大型可目見的聚集物)之多肽分子間的物理交互作用。“於儲放期間”意指液體醫藥組成物一旦經製備後，並未立即投藥予個體。而是，在製備後，將其包裝以呈液體形式、呈冷凍狀態、或呈用以稍後再重建成液體形式的乾燥形式或其他適於投藥予個體之形式儲存。“乾燥形式”意指液體醫藥組成物或調配物係藉由冷凍乾燥(亦即凍乾法；參見例如威廉斯與普利(1984)J.Parenteral Sci.Technol.38：48－59)、噴霧乾燥法(參見馬斯特(1991)於噴霧－乾燥手冊(Spray－Drying Handbook)(5th ed；龍曼科學與技術(Longman Scientific and Technical),伊賽茲,U.K.),pp.491－676；布洛海得等人(1992)Drug Devel.Ind.Pharm.18：1169－1206；及木門賽勒等人(1994)Pharm.Res.11：12－20)、或風乾法(卡本特與克魯威(1988)Cryobiology 25：459－470；及羅瑟(1991)Biopharm.4：47－53)乾燥。於液體醫藥組成物之儲放期間由多肽形成之聚集物可能有害地影響該多肽之生物活性，導致醫藥組成物的治療功效喪失。而且，聚集物形成可能造成其他問題，例如當含有該多肽之醫藥組成物係使用灌流系統進行投藥時會阻塞導管、薄膜或幫浦。
本發明之醫藥組成物可進一步包含其量足以減少於組成物之儲放期間由多肽造成之聚集物形成的胺基酸。“胺基酸基”意指胺基酸或胺基酸之組合，其中任何所給定之胺基酸係以其游離基形式或其鹽類形式存在。若使用胺基酸之組合所有胺基酸可以其游離基形式存在、全部可以其鹽類形式存在、或者有些可以其游離基形式存在而其他以其鹽類形式存在。於一項具體態樣，用於製備本發明組成物之胺基酸為該等具有帶電荷側鏈者，例如精胺酸、賴胺酸、天冬胺酸與谷胺酸。特定胺基酸(例如甲硫胺酸、組胺酸、咪唑、精胺酸、賴胺酸、異亮胺酸、天冬胺酸、色胺酸、蘇胺酸及其混合物)之任何立體異構物(亦即L、D或其混合物)或此等立體異構物之組合，可存在於本發明之醫藥組成物中，只要該特定胺基酸係以其游離基形式或其鹽類形式存在。於一項具體態樣，係使用L－立體異構物。本發明之組成物亦可以此等胺基酸之類似物調合。“胺基酸類似物”意指其可達成減低於本發明液體醫藥組成物儲放期間由多肽造成之聚集物形成的所希望功效之天然產生的胺基酸之衍生物。適宜之精胺酸類似物包括(例如)胺基胍、鳥胺酸與N－單乙基L－精胺酸，適宜之甲硫胺酸類似物包括乙硫胺酸與丁硫胺酸，而適宜之半胱胺酸類似物包括S－甲基L－半胱胺酸。如同其他胺基酸，胺基酸類似物係以其游離基形式或其鹽類形式併入組成物。於本發明之又一具體態樣，胺基酸或胺基酸類似物係以足以預防或延遲蛋白質聚集之濃度使用。
於本發明之又一具體態樣，可添加甲硫胺酸(或其他含硫胺基酸或胺基酸類似物)以當作用為治療劑之多肽係包含至少一個容易進行氧化之甲硫胺酸的多肽時，抑制甲硫胺酸殘基氧化成甲硫胺酸亞碸。“抑制”意指隨時間使甲硫胺酸已氧化物種之累積減至最少。抑制甲硫胺酸氧化可使多肽更能保持其適當的分子形式。可使用甲硫胺酸之任何立體異構物(L或D)或其組合。所欲添加之量應為足以抑制甲硫胺酸殘基氧化致使甲硫胺酸亞碸之量為管理機構所能接受者。代表性地，此意指該組成物含有不多於約10%至約30%甲硫胺酸亞碸。通常，此可藉由添加甲硫胺酸以使所添加之甲硫胺酸對甲硫胺酸殘基的比例為1：1至約1000：1(例如10：1至約100：1)而達成。
於又一具體態樣，調配物進一步包含選自高分子量聚合物或低分子量化合物之安定劑。於本發明之又一具體態樣，安定劑係選自聚乙二醇(例如PEG 3350)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷啶酮、羧基－/羥基纖維素或其衍生物(例如，HPC、HPC－SL、HPC－L與HPMC)、環糊精、含硫物質如單硫基甘油、硫基乙醇酸與2－甲基硫代乙醇、及不同的鹽類(例如氯化鈉)。此等特別安定劑之每一者構成本發明之供選擇的具體態樣。
醫藥組成物亦可包含額外安定劑，其進而增加其中所含具治療活性多肽之穩定性。本發明特別關注之安定劑包括(但不限定於)甲硫胺酸與EDTA，其保護多肽免於甲硫胺酸氧化，及非離子性界面活性劑，其保護多肽免於冷凍－融解或機械剪力相關之聚集。
於又一具體態樣，調配物進一步包界面活性劑。界面活性劑可(例如)選自清潔劑、經乙氧基化蓖麻油、聚甘油化甘油酯類、乙醯化單甘油酯、山梨聚糖脂肪酸酯、聚氧丙烯－聚氧乙烯嵌段聚合物(例如泊洛沙姆(poloxamer)，如PluronicF68、泊洛沙姆188與407、Triton X－100)、聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、聚氧乙烯與聚乙烯衍生物，例如烷基化與烷氧基化衍生物(吐溫類(tween)，例如Tween－20、Tween－40、Tween－80與Brij－35)、單甘油酯或其乙氧基化衍生物、二甘油酯或其聚乙烯衍生物、醇類、甘油、卵磷脂與磷脂質(例如磷脂醯絲胺酸、磷脂醯膽鹼、磷脂醯乙醇胺、磷脂醯肌醇、二磷脂醯甘油與神經鞘磷脂)、磷脂質衍生物(例如二棕櫚醯基磷脂酸)與溶血磷脂質衍生物(棕櫚醯基溶血磷脂醯基－L－絲胺酸與乙醇胺、膽鹼、絲胺酸或蘇胺酸之1－醯基－sn－甘油－3－磷酸酯)、及溶血磷脂醯與磷脂醯膽鹼之烷基、烷氧基(烷基酯)、烷氧基(烷基醚)－衍生物，例如溶血磷脂醯膽鹼之月桂醯基與肉豆蔻醯基衍生物、及極性頭部基團(亦即膽鹼、乙醇胺、磷脂酸、絲胺酸、蘇胺酸、甘油、肌醇)之修飾、與帶正電荷之DODAC、DOTMA、DCP、BISHOP、溶血磷脂醯絲胺酸與磷脂醯蘇胺酸、及甘油磷脂質(例如腦磷脂)、甘油糖脂類(例如吡喃半乳糖苷脂)、神經鞘糖脂類(例如神經醯胺、神經節苷脂)、十二烷醯基磷膽鹼、雞蛋溶血卵磷脂、褐霉酸(fusidic acid)衍生物－(例如牛磺二氫褐霉酸鈉等)、C6－C12長鏈脂肪酸(例如油酸與正辛酸)及其鹽類、醯基肉鹼與衍生物、賴胺酸、精胺酸、或組胺酸之Nα －醯基化衍生物，或賴胺酸或精胺酸之側鏈醯基化衍生物、包含賴胺酸、精胺酸或組胺酸與中性或酸性胺基酸之任意組合的二肽類之Nα －醯基化衍生物、包含一種中性胺基酸與二種帶電荷胺基酸之任意組合的三肽之Nα －醯基化衍生物、DSS(多庫酯(docusate)鈉，CAS登記編號[577－11－7])、多庫酯鈣，CAS登記編號[128－49－4])、多庫酯鉀，CAS登記編號[7491－09－0])、SDS(十二烷基硫酸鈉或月桂基硫酸鈉)、辛酸鈉、膽酸或其衍生物、膽汁酸與其鹽類及甘油或牛磺酸共軛物、烏索去氧膽酸、膽酸鈉、去氧膽酸鈉、牛磺膽酸鈉、甘膽酸鈉、N－十六烷基－N,N－二甲基－3－銨根－1－丙磺酸酯、陰離子性(烷基－芳基－磺酸酯)單價界面活性劑、兩性離子界面活性劑(例如N－烷基－N,N－二甲基銨根－1－丙磺酸酯、3－膽醯胺基－1－丙基二甲基銨根－1－丙磺酸酯)、陽離子性界面活性劑(四級銨鹼類)(例如溴化鯨臘基－三甲基銨、氯化鯨臘基吡錠)、非離子性界面活性劑(例如十二烷基β－D－吡喃葡萄糖苷)、波洛沙胺類(poloxamine，例如Tetronic’s)，其為衍生自順序添加環氧丙烷與環氧乙烷至乙烯二胺之四官能性嵌段共聚物，或者界面活性劑可選自咪唑啉衍生物或其混合物之群組。此等特別界面活性劑之每一者構成本發明之供選擇的具體態樣。
界面活性劑於醫藥組成物之用途為熟習該項技術者所熟知。為方便起見，參照雷明頓：製藥科學與策略，第19版，1995。
於又一具體態樣，調配物進一步包含蛋白酶抑制劑，例如EDTA(乙烯二胺四乙酸)與苄脒HCl，但亦可使用其他市售可得之蛋白酶抑制劑。蛋白酶抑制劑尤其可用於包含蛋白酶之酶原的醫藥組成物中，以抑制自我催化。
本發明之肽類醫藥調配物可能存在有其他成份。此類額外成份包括溼潤劑、乳化劑、抗氧化劑、填充劑、張力變更劑、螯合劑、金屬離子、油性載體、蛋白質(例如人類血清白蛋白、明膠或蛋白質)與兩性離子(例如胺基酸，如甜菜鹼、牛磺酸、精胺酸、甘胺酸、賴胺酸與組胺酸)。此類額外成份(當然)應不有害地影響本發明醫藥調配物之整體安定性。
含有根據本發明抗體之醫藥組成物可於數種部位(例如，於局部部位，例如，皮膚與黏膜部位)、於繞道吸收部位(例如於動脈、靜脈、心臟中投藥)、及於涉及吸收之部位(例如於皮膚內、於皮膚下、於肌肉或於腹腔內投藥)投藥予需要此類治療之患者。
根據本發明之醫藥組成物的投藥可透過數種投藥途徑，例如皮下、肌肉內、腹膜內、靜脈內、舌部、舌下、頰部、口內、口服、胃腸內、鼻部、肺部(例如經由支氣管與肺泡或其組合)、表皮、真皮、經皮、陰道、直腸、眼部(例如經由結膜)、尿道及非經腸道投藥予需要此類治療之患者。
本發明之組成物可以數種劑量形式投藥，例如呈溶液、懸浮液、乳液、微乳液、多重乳液、泡沫、藥膏、膏劑、軟膏、錠劑、塗層錠劑、洗液、膠囊(例如硬明膠膠囊與軟明膠膠囊)、栓劑、直腸膠囊、滴劑、凝膠、噴霧、粉末、氣溶膠、吸入劑、眼用滴劑、眼科軟膏、眼科洗液、陰道子宮托、陰道環、陰道軟膏、注射溶液、原位轉化(例如原位膠化、原位固定、原位沈澱、原位結晶)溶液、灌流溶液、與植入物。
本發明之組成物可例如經由共價、厭水性與靜電交互作用化合或接附於藥物載劑、藥物遞送系統及改良藥物遞送系統，以進一步增加抗體之安定性、增加生物可利用性、增加溶解度、減少有害作用、達到熟習該項技術者已熟知之生物時鐘療法、及增加患者順從性、或其任意組合。載劑、藥物遞送系統及改良藥物遞送系統之實例包括(但不限定於)聚合物，例如纖維素與衍生物、多糖類，例如葡聚糖與衍生物、澱粉與衍生物、聚(乙烯醇)、丙烯酸酯與甲基丙烯酸酯聚合物、聚乳酸與聚乙醇酸及其嵌段共聚物、聚乙二醇、載體蛋白質(例如白蛋白)、凝膠(例如熱膠化系統，例如技術領域中已熟知之嵌段共聚物系統)、微膠團、脂質體、微球體、奈米粒子、液態晶體與其分散液、L2相與其分散液(為習於液體－水系統中之相特性之領域的人士所熟知)、聚合微膠團、多重乳液、自我乳化、自我微乳化、環糊精與其衍生物及樹狀聚合物。
本發明之組成物可用於供使用(例如)定量吸入器、乾粉吸入器及噴霧器(所有皆為熟習該項技術者所熟知之裝置)之肺部投藥抗體的固體、半固體、粉末與溶液調配物中。
本發明之組成物亦可用於受控、持續、延長、及緩釋型藥物遞送系統之調配物。更具體地，但不限定於，組成物可用於非經腸道受控釋出與持續釋出系統(二系統皆導致許多投藥之多倍減少)，其為熟習該項技術者所熟知。甚至更佳地，其為經皮下投藥之受控釋出與持續釋出系統。無意限制本發明之範圍，可利用之受控釋出系統與組成物實例為水凝膠、油性凝膠、液態結晶、聚合微膠團、微球體、奈米粒子。
用於製造可用於本發明組成物之受控釋出系統的方法包括(但不限定於)結晶、縮合、共結晶、沈澱、共沈澱、乳化、分散、高壓均質化、封入膠囊、噴乾、微封入膠囊、凝聚(coacervation)、相分離、溶劑蒸發以製成微球體、擠壓及超臨界液體製程。一般參照醫藥受控釋出手冊(Handbook of Pharmaceutical Controlled Release)(威斯,D.L.,ed.馬瑟迪克,紐約,2000)及藥物與製藥科學(the Pharmaceutical Sciences)vol.99：蛋白質調配物與遞送(Protein Formulation and Delivery)(麥克奈里,E.J.,ed.馬瑟迪克,紐約,2000)。
非經腸道投藥可以注射器(視需要地為筆類注射器)之方式藉由皮下、肌肉內、腹膜內或靜脈內注射完成，或者，非經腸道投藥可以灌流幫浦之方式完成。另一種選擇為可為供以鼻部或肺部噴霧之形式投藥的溶液或懸浮液之組成物。又另一種選擇為，含有本發明抗體之醫藥組成物亦可經修改以用於經皮投藥，例如藉由無針注射或從貼布(視需要地為離子電泳貼布(iontophoretic patch))，或經黏膜(例如頰部)投藥。
抗體可經由肺部途徑於諸如溶液、懸浮液或乾粉之載體中使用任一類型適合肺部藥物遞送之已知裝置進行投藥。此等之實例包含(但不限定於)三種一般用於肺部藥物遞送之氣溶膠產生性類型，且可包括噴射或超音波噴霧器、定量吸入器、或乾粉吸入器(Cf.余J,秦YW.肺部藥物遞送：生理學與機械上之層面(Pulmonary drug delivery：Physiologic and mechanistic aspects)。Crit Rev Ther Drug Carr Sys 14(4)(1997)395－453)。
基於標準測試方法，粒子之氣動直徑(da )係定義為單位密度(1 g/cm3 )之參考標準球形粒子的幾何當量直徑。於最簡單情況下，對於球形粒子，da 係關於呈密度比值平方根之函數之參考直徑(d)，如下列方程式所述：
對於此關係之修正於非－球形粒子發生(參照愛得華DA,班澤布利亞A,藍格R，近年使用大、多孔吸入粒子於肺部藥物遞送之改進(Recent advances in pulmonary drug delivery using large,porous inhaled particles)，J Appl Physiol 84(2)(1998)379－385。術語“MMAD”與“MMEAD”已經詳細描述且於技術領域中為已知(參照愛得華DA,班澤布利亞A,藍格R，且代表氣動粒徑分布之中位數之測量值。近年使用大、多孔吸入粒子於肺部藥物遞送之改進，J Appl Physiol 84(2)(1998)379－385)。質量中位數氣動直徑(MMAD)與，質量中位數有效氣動直徑(MMEAD)係交互使用，為統計學參數，且以經驗描述氣溶膠顆粒之粒徑與其可能沈積於肺部之關係，與確實的形狀、粒徑或密度無關(參照愛得華DA,班澤布利亞A,藍格R，近年使用大、多孔吸入粒子於肺部藥物遞送之改進，J Appl Physiol 84(2)(1998)379－385)。MMAD通常係從以衝擊器(為一種測量空氣中粒子慣性行為之儀器)進行之測量計算得。
於又一具體態樣，調配物可藉由任意氣霧化技術(例如霧化)氣霧化，而達到氣溶膠顆粒小於10 μm，更佳地介於1－5 μm，且最佳地介於1－3 μm之MMAD。較佳粒徑係基於供遞送藥物至深層肺部(於該處蛋白質被最適吸收)之最有效粒徑(參照愛得華DA,班澤布利亞A,藍格R，近年使用大、多孔吸入粒子於肺部藥物遞送之改進，J Appl Physiol 84(2)(1998)379－385)。
包含抗體之肺部調配物的深層肺部沈積可視需要地藉由使用吸入技術之修改而最適化，例如(但不限定於)：緩慢吸入流動(例如30 L/min)、摒氣與行動之時間選擇。
術語“經安定化調配物”意指具有增加物理安定性、增加化學安定性、或增加物理及化學安定性之調配物。
術語蛋白質調配物之“物理安定性”用於本文意指該蛋白質因暴露至熱－機械應力及/或與造成不安定化之界面及表面(例如厭水性表面及界面)作用而形成其生物學上不活性、且/或不可溶聚集物的傾向。水性蛋白質調配物之物理安定性係藉由於將充滿於適宜容器(例如藥罐或藥瓶)中之調配物於不同溫度下暴露至機械/物理應力(例如攪動)達各種不同時間後以目測檢查及/或混濁度測量之方式評估。調配物之目測檢查係於具有黑色背景之明顯聚焦光線下完成。調配物之混濁度特徵在於將混濁度例如分為0至3等(顯示無混濁之調配物相當於目測分數0，而於日光下顯示可目見之混濁度的調配物相當於目測分數3)之目測分數。關於蛋白質聚集物，當於日光下顯現可目見之混濁度時，調配物被歸類為物理上不安定。或者，可藉由熟習該項技術者所熟知之簡單混濁度測量，來評估調配物之混濁度。水性蛋白質調配物之物理安定性亦可藉由使用分光試劑或蛋白質構型狀態之探針進行評估。探針較佳為優先地結合至蛋白質的非天然構型之小型分子。一種蛋白質結構之小分子分光探針實例為硫代黃素T(Thioflavin T)。硫代黃素T為已廣泛用於偵測澱粉狀蛋白原纖之螢光染料。有原纖及可能其他蛋白質組態存在下，硫代黃素T在結合至原纖蛋白質形式時，會於大約450 nm處產生新的激發最大值，及位於大約482 nm處之增強發散。未結合之硫代黃素T基本上於該等波長下無螢光產生。
其他小分子可用作為蛋白質結構從天然改變成非天然狀態之探針。例如優先結合至蛋白質所暴露出之厭水性膜片的“厭水性膜片”探針。厭水性膜片通常隱埋於天然狀態之蛋白質的四級結構內，但是當蛋白質開始展開或變性時被暴露出。此等小分子、分光探針之實例為芳族、厭水性染料，例如蒽(anthracene)、吖啶(acridine)、菲咯啉(phenanthroline)等。其他分光探針為金屬胺基酸錯合物，例如厭水性胺基酸(如苯丙胺酸、亮胺酸、異亮胺酸、甲硫胺酸、與纈胺酸、或類似者)之鈷金屬錯合物。
術語蛋白質調配物之“物理安定性”用於本文意指於蛋白結構中導致形成相較於天然蛋白結構具有可能較差生物功效及/或增加免疫原性質的化學降解產物之化學共價改變。視天然蛋白質之類型與本質及蛋白質所暴露之環境而定，可能形成各種化學降解產物。極可能無法完全免除化學降解，而於儲放及使用蛋白質調配物期間，往往觀察到化學降解產物之量增加，如熟習該項技術者所熟知。大多數蛋白質有去醯胺之傾向，其為一種其中谷胺醯胺基或天冬醯胺基殘基之側鏈醯胺基被水解形成游離態羧酸的過程。其他降解途徑涉及形成高分子量轉化產物之形成，其中二或多個蛋白質分子透過轉醯胺及/或雙硫化物交互作用彼此共價結合，而導致形成共價結合之二聚體、寡聚物與聚合物降解產物(蛋白質醫藥品之穩定性(Stability of Protein Pharmaceuticals ),愛爾恩.T.J.&受寧M.C.,Plenum Press,紐約1992 )。(例如甲硫胺酸殘基之)氧化可以化學降解之另一種變異型提起。蛋白質調配物之化學安定性可藉由於暴露至不同環境條件(往往可藉由例如增加溫度而加速降解產物之形成)後之各時間點，測量化學降解產物量來進行評估。通常係藉由依分子大小及/或電荷使用各種層析術技術(例如SEC－HPLC及/或RP－HPLC)分離降解產物，來測定個別降解產物的量。
因此，如前述所列示，“經安定化調配物”意指具有增加的物理安定性、增加的化學安定性、或增加物理及化學安定性之調配物。一般，調配物必須在使用及儲放(依從所建議之使用與儲放條件)期間安定，直到有效期限到達。
於本發明之一項具體態樣，包含抗體之醫藥調配物係穩定達6星期以上使用期及3年以上儲放期。
於本發明之另一項具體態樣，包含抗體之醫藥調配物係穩定達4星期以上使用期及3年以上儲放期。
於本發明之又一項具體態樣，包含抗體之醫藥調配物係穩定達4星期以上使用期及兩年以上儲放期。
於本發明之又另一項具體態樣，包含抗體之醫藥調配物係穩定達2星期以上使用期及兩年以上儲放期。
亦可藉衛其他已發展治療性單株抗體之檢視經驗來測定適宜之抗體調配物。數種單株抗體已顯示有效用於臨床病況，例如利妥希(Rituxan，利妥希瑪單抗(Rituximab))、賀希普丁(Herceptin，曲妥珠單抗(Trastuzumab))、索拉耳(Xolair，奧馬珠單抗(Omalizumab))、貝薩耳(Bexxar，托西莫單抗(Tositumomab))、坎培斯(Campath，阿來組單抗(Alemtuzumab))、澤瓦林(Zevalin)、洛可來姆(Oncolym)及類似之調配物可與本發明抗體一起使用。例如，單株抗體可以濃度為10 mg/mL於100 mg(10 mL)或500 mg(50 mL)單一使用小藥瓶中提供，於9.0 mg/mL氯化鈉、7.35 mg/mL檸檬酸鈉二水合物、0.7 mg/mL聚山梨酯80、與注射用滅菌水中調配供IV投藥。pH值係調整至6.5。於另一項具體態樣，抗體係於包含約20 mM Na－檸檬酸、約150 mM NaCl，pH值為約6.0之調配物中提供。
治療性應用
亦提供使用本文所述之抗－NKG2A抗體治療患者的方法。於一項具體態樣，本發明提供本文所述抗體用於製備供投藥予人類患者之醫藥組成物的用途。代表性地，患者罹患(或有危險罹患)癌症、病毒疾病、發炎病症或自體免疫病症。或者，本發明之抗體係用於改善患者骨髓移植。
例如，於一方面，本發明提供在有需要之患者中引發CD94/NKG2A－限制性淋巴細胞活性的方法，其包含將人類或人源化抗－NKG2A抗體投藥予該患者，該抗體會減低或防止HLA－E－介導之CD94/NKG2A受體活化。於一項具體態樣，該方法針對在具有其中所增加之NK、T與/或NKT細胞活性係有助益的疾病之患者內增加此類淋巴細胞之活性，其係涉及、影響或由容易被NK、T或NKT細胞溶胞之細胞引起，或其係導因於或特徵在於不充分的NK、T或NKT細胞活性，例如癌症、感染性疾病或免疫病症。
更具體地，本發明之方法與組成物係用於治療各種癌症與其他增生性疾病，包括(但不限定於)：癌包括膀胱癌、乳癌、結腸癌、腎癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰臟癌、胃癌、子宮頸癌、甲狀腺癌與皮膚癌(包括鱗狀細胞癌)；淋巴種系之造血腫瘤，包括白血病、急性淋巴細胞性白血病、慢性淋巴細胞性白血病、急性淋巴胚細胞性白血病、B－細胞淋巴瘤、T－細胞淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、非－霍奇金氏淋巴瘤、毛狀細胞淋巴瘤與布克(Burketts)氏淋巴瘤、及多發骨髓瘤；骨髓種系之造血腫瘤，包括急性與慢性骨髓性白血病、前髓細胞性白血病、與骨髓發育不良性徵候群；間質起源之腫瘤，包括纖維肉瘤與橫紋肌肉瘤；其他腫瘤，包括黑色素瘤、精原細胞瘤、畸形瘤、神經胚細胞瘤與神經膠瘤；中樞與周圍神經系統之腫瘤，包括星狀細胞瘤、神經胚細胞瘤、神經膠瘤、與神經鞘瘤(schwannoma)；間質起源之腫瘤，包括纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤、與骨肉瘤；及其他腫瘤包括黑色素瘤、著色性乾皮病、角化棘皮瘤、精原細胞瘤、甲狀腺濾泡癌與畸形瘤。
可根據本發明進行治療之特別病症包括淋巴種系之造血腫瘤，例如T－細胞與B－細胞腫瘤，包括(但不限定於)T－細胞病症，例如T－前淋巴細胞性白血病(T－PLL)，包括小細胞與腦狀(cerebriform)細胞類型；大粒狀淋巴細胞白血病(LGL)，較佳為T－細胞類型；賽塞利(Sezary)徵候群(SS)；成人T－細胞白血病淋巴瘤(ATLL)；T－NHL肝脾淋巴瘤；周邊/後－胸腺T細胞淋巴瘤(多形性與免疫胚細胞亞型)；血管免疫胚細胞T－細胞淋巴瘤；血管中心(angiocentric)(鼻部)T－細胞淋巴瘤；退行發育之(Ki 1＋)大細胞淋巴瘤；小腸T－細胞淋巴瘤；T－淋巴胚細胞性；淋巴瘤/白血病(T－Lbly/T－ALL)、多發性骨髓瘤。
其他亦可根據本發明進行治療之增生性病症，包括(例如)增生、纖維化(特別是肺部，但亦為其他纖維化類型，例如腎纖維化)、血管生成、牛皮癬、粥樣動脈硬化及血管內平滑肌增生，例如血管修復術後之狹窄或再狹窄。
於一特別的方面，本發明抗體係用於治療粒狀淋巴細胞之NK－類型淋巴增生性疾病(或者稱作NK－LGL)，其意指一類因NK細胞或顯示表面抗原表現之特徵組合(例如，CD3－、CD56＋、CD16＋等；參見例如羅藍(1993)血液(Blood)82：1)的類－NK細胞(亦即大狀淋巴細胞)之純系擴增所引起的增生性病症。構成此等病症的基礎之細胞增生可能具有多種影響，程度從有些患者觀察到之輕微症狀，至激進性、往往致死之疾病形式，稱為NK－LDGL白血病。此類病症之症狀可包括發燒、輕微中性細胞減少、血小板減少、貧血、淋巴細胞增多、脾腫大、肝腫大、淋巴結病、骨髓浸潤、及其他(參見，例如參貝羅等人(2003)血液102：1797；羅藍(1993)血液82：1；伊普林－柏內特等人(2004)Blood－2003－02－400)。
基於CD94/NKG2A抗體之治療法亦可用於治療或預防感染性疾病，包括較佳地任何因受病毒、細菌、原生動物、黴菌或真菌引起之感染症。此類病毒感染性生物包括(但不限定於)A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、流感、水痘、腺病毒、單純疱疹病毒I型(HSV－1)、單純疱疹病毒2型(HSV－2)、牛瘟、鼻病毒、埃可病毒(echovirus)、輪狀病毒、呼吸道融合病毒、乳頭瘤病毒、細胞巨大病毒、棘病毒(echinovirus)、蟲媒病毒(arbovirus)、漢他病毒、科薩奇病毒(coxsackie virus)、腮腺炎病毒、痲疹病毒、風疹病毒、脊髓灰質炎病毒與人類免疫缺陷病毒I型或2型(HIV－1、HIV－2)。細菌構成另一類較佳感染性生物，包括(但不限定於)下列：葡萄球菌屬(Staphylococcus)；鏈球菌屬(Streptococcus)，包括化膿鏈球菌(S.pyogenes )；腸球菌屬(Enterococcl)；芽孢桿菌屬，包括炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis )與乳酸芽孢桿菌(Lactobacillus)；利斯特氏菌屬(Listeria)；白喉棒狀桿菌(Corynebacterium diphtheriae )；加德納氏菌屬(Gardnerella)，包括陰道加德納氏菌(G.vaginalis )；諾卡氏菌屬(Nocardia)；鏈霉菌屬(Streptomyces)；普通高溫放線菌(Thermoactinomyces vulgaris )；密螺旋菌屬(Treponerna)；彎曲桿菌屬(Camplyobacter)；假單胞菌屬包括綠膿假單胞菌；軍團菌屬(Legionella)；奈瑟氏球菌屬(Neisseria)，包括淋病奈瑟氏球菌(N.gonorrhoeae )與腦膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitides )；黃桿菌屬(Flavobacterium)包括腦膜敗血性黃桿菌(F.meningosepticum )與氣味黃桿菌(F.odoraturn )；布魯氏菌屬(Brucella)；博德特氏菌屬(Bordetella)包括百日咳博德特氏菌(B.pertussis )與支氣管炎博德特氏菌(B.bronchiseptica )；埃希氏菌屬包括大腸桿菌；克雷伯氏菌屬；腸桿菌屬；沙雷氏菌屬，包括黏質沙雷氏菌與液化沙雷氏菌(S.liquefaciens )；愛德華氏菌屬(Edwardsiella)；變形菌屬包括奇異變形菌(P.mirabilis )與普通變形菌(P.vulgaris )；鏈桿菌屬(Streptobacillus)；立克次氏體科(Rickettsiaceae)，包括弗氏立克次氏體(R.fickettsfi )；衣原體屬(Chlamydia)包括鸚鵡熱衣原體(C.psittaci )與砂眼衣原體(C.trachornatis )；分枝桿菌屬(Mycobacterium)，包括結核分枝桿菌(M.tuberculosis )、胞內分枝桿菌(M.intracellulare )、弗氏分枝桿菌(M.folluiturn )、痲瘋分枝桿菌(M.laprae )、鳥分枝桿菌(M.avium )、牛分枝桿菌(M.bovis )、非洲分枝桿菌(M.africanum )、堪薩斯分枝桿菌M.kansasii )、胞內分枝桿菌(M.intracellulare )、與鼠痲瘋分枝桿菌(M.lepraernurium )；及諾卡氏菌屬(Nocardia)。原生動物可包括(但不限定於)立什曼原蟲屬(leishmania)、柯奇多蟲屬(kokzidioa)、與錐蟲屬(trypanosoma)。寄生蟲可包括(但不限定於)衣原體(chlamydia)與立克次氏體(rickettsia)。感染性疾病之完整列表可參見疾病管制中心之國家感染性疾病中心(NCID)網站(全球網路(www)網址cdc.gov/ncidod/diseases/)，該列表係以引用方式納入本文。所有此等疾病係使用本發明抑制性抗－CD94/NKG2A抗體進行治療之候選者。
於供選擇的方面，抗－NKG2A抗體係用於在(例如)罹患特徵在於在癌性細胞上表現CD94/NKG2A之癌症(例如NK－淋巴瘤)的患者體內靶定並殺死NKG2A－表現細胞。於一項具體態樣，人源化抗體係以包含人源化抗體與細胞毒性藥劑之免疫共軛物形式進行投藥。
於供選擇的方面，抗－NKG2A抗體係用於治療或預防自體免疫或發炎性病症。可使用本發明方法進行治療之例舉性自體免疫病症包括(尤其是)溶血性貧血、惡性貧血、結節狀多動脈炎、全身紅斑性狼瘡、韋氏(Wegener's)肉芽腫病、自體免疫肝炎、貝奇特氏(Behcet's)病、侷限性迴腸炎、原發性膽汁性肝變硬、皮硬化、潰瘍性結腸炎、斯耶格倫(Sjogren's)徵候群、糖尿病1型、眼色素層炎、格雷夫斯(Graves')病、阿滋海默氏(Alzheimer's)病、甲狀腺炎、心肌炎、風溼性熱、硬皮病、黏連性脊椎炎、類風溼性關節炎、腎小球性腎炎、類肉瘤病、皮肌炎、重症肌無力、多發性肌炎、Guillain－Barr症候群、多發性硬化、斑禿、天疱瘡/類天疱瘡(pemphigoid)、大泡性類天疱瘡、橋本(Hashimoto's)甲狀腺炎、牛皮癬與白斑病。
可使用本發明方法進行治療之例舉性發炎性病症包括(但不限定於)腎上腺炎、肺泡炎、血管膽囊炎、闌尾炎、龜頭炎、瞼炎(blepharitis)、支氣管炎、滑液囊炎、心炎、蜂窩組織炎、子宮頸炎、膽囊炎、聲帶炎、耳蝸炎、結腸炎、結膜炎、膀胱炎、皮膚炎、憩室炎、腦炎、心內膜炎、食管炎、耳咽管炎、纖維組織炎、濾泡炎、胃炎、胃腸炎、牙齦炎、舌炎、肝脾炎、角膜炎、迷路炎、喉炎、淋巴管炎、乳腺炎、中耳炎、腦膜炎、子宮炎、黏膜炎、心肌炎、肌炎(myosititis)、鼓膜炎、腎炎、神經炎、睪丸炎、骨軟骨炎、耳炎、心包炎、腱鞘炎(peritendonitis)、腹膜炎、咽炎、靜脈炎、脊髓灰白質炎、前列腺炎、牙髓炎、視網膜炎、鼻炎、輸卵管炎、鞏膜炎、鞏膜脈絡膜炎、陰囊炎、鼻竇炎、脊椎炎、脂肪組織炎、口炎(stornatitis)、滑膜炎、咽鼓管炎(syringitis)、腱炎、扁桃腺炎、尿道炎及陰道炎。
亦已顯示，同種異體反應性NK細胞殺死樹狀細胞，可增進骨髓移植中之造血細胞移植(L.魯格利等人,科學,2002,295：2097－2100)。因此，於另一項具體態樣，本發明提供一種增進患者造血細胞移植之方法，其包含對該患者投藥予本發明包含活化性抗體之組成物的步驟。於移植之增進係藉由減低移植物對宿主疾病之發生與嚴重度、延長移植物之壽命、或減少或消除由移植物治療之疾病(例如造血性癌症)的症狀之任一者來顯示。此方法較佳地用於治療白血病。
組合物 有許多種治療劑可用於治療癌症。因此，本發明之抗體組成物及方法亦可與任何其他一般用於治療特別疾病(尤其是腫瘤、癌症疾病、或其他患者所呈現之疾病或病症)的方法組合。只要特定之治療方法不已知對患者之病況本身有害，且不會明顯抵消基於抗－NKG2A抗體之治療，則可預期其與本發明之組合。
關於固體腫瘤治療，本發明可用於與傳統方法(例如手術、放射療法、化學療法、以及類似者)組合。於是本發明提供組合型療法，其中係將根據本發明之抗－CD94/NKG2A抗體與手術或放射治療同時、於之前或於之後使用；或與另一種抗癌劑投藥至患者同時、於之前或於之後投藥至患者。應確保與本發明組成物中之活性劑組合的手術、放射療法、或抗癌劑會對癌症呈現有益地組合功效。
抗癌劑之實例包括化學治療劑、激素藥劑、抗血管生成劑、抗轉移劑、抗癌症抗體(例如利妥希瑪單抗)、針對抑制性KIR－分子之抗體、生長因子抑制劑、凋亡－促進性化合物、細胞因子與其他免疫調制劑、共軛至毒素或放射性核素之腫瘤－靶定性劑、干擾DNA複製、有絲分裂與染色體分離之化合物、及破壞聚核苷酸前驅物合成與正確性之藥劑。
關於自體免疫或發炎性病症，任何其他已知對一或多種自體免疫或發炎性病症，或自體免疫或發炎性病症之任一症狀或特性有效的化合物(包括(尤其是)免疫抑制劑，例如硫唑嘌呤(azathioprine，如依木藍(Imuran))、氯氨布西(chiorambucil，如Leukeran)、環磷醯胺(如安道生(Cytoxan))、環孢霉素(如環孢靈(Sandimmune)、新環孢素(Neoral))、氨甲蝶呤(Rheumatrex)、皮質類固醇、潑泥松(prednisone，如去氫可地松(Deltasone)、強的松(Meticorten))、依他習布(Etanercept，如恩貝爾(Enbrel))、英夫單抗(infliximab，如雷米卡得(Remicade))、TNF抑制劑、FK－506、雷帕霉素(raparnycin)、霉酚酸莫非提耳(mofetil)、來氟洛米(leflunomide)、抗－淋巴細胞球蛋白、去氧斯潘格寧(deoxyspergualin)或OKT。
免疫調制性化合物之較佳實例包括細胞因子。其他實例包括具有功效(較佳為具有活化或啟發NK細胞活性之功效，或誘導或支持NK細胞增生之功效)的化合物。其他供於包含本發明藥劑之組成物之前、同時或之後進行投藥的化合物為附屬化合物(例如止吐劑與鎮痛劑)及抗病毒劑。
如熟習該項技術者所瞭解，抗癌劑之適當劑量會接近於已被使用於其中抗癌劑係單獨或與其他藥劑組合投藥之臨床療法的劑量。劑量變化同樣會依所欲治療之病況而定。施予治療之醫師會能決定對於各別個體之適當劑量。
製品 於本發明之另一具體態樣，係提供含有可用於治療前述病症之材料的製品。例如，製品可包含含有本文所述抗體與指示使用者以有效量之抗體治療哺乳動物中諸如癌症或病毒性疾病等病症之說明書的容器。於較佳具體態樣，哺乳動物為人類。製品代表性地包含容器與在容器上或與其結合之標籤或包裝插入物。適宜之容器包括(例如)瓶子、小藥瓶、注射器等。容器可由各種材料例如玻璃或塑膠製成。容器裝載供有效治療該病況之組成物，且可具有滅菌取用口(例如，該容器可為具有可由皮下注射針刺穿之塞子的靜脈內溶液袋或小藥瓶)。組成物中至少一種活性劑係本發明之人源化抗－NKG2A抗體，或包含此類人源化抗體之抗體衍生物(例如免疫共軛物)。標籤或包裝插入物指示該組成物係用於治療所選擇之病況，例如癌症或病毒性疾病。
而且，製品可包含(a)具有內含於其中之組成物的第一容器，其中該組成物包含本文所述之抗體，及(b)具有內含於其中之組成物的第二容器，其中該組成物包含該第一抗體以外之治療劑。本發明此具體態樣之製品可進一步包含指示第一與第二組成物可組合使用於治療癌症或病毒性疾病的包裝插入物。此類治療劑可為前段所述之任一種附屬治療劑(例如，化學治療劑、抗－血管生成劑、抗激素化合物、心臟保護劑、及/或哺乳動物免疫功能調節劑，包括細胞因子)。或者(或額外地)，製品可進一步包含包含醫藥上可接受緩衝液(例如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸鹽緩衝食鹽水、林格氏溶液及右旋糖溶液)之第二(或第三)容器。可進一步包括其他從商業及使用者觀點之所欲材料，包括其他緩衝液、稀釋劑、過濾器、針、及注射器。
投藥 如上所述，數種單株抗體已顯示有效用於臨床狀況(例如，Rituxan(利妥希瑪單抗)及其他)，且類似投藥攝生法(亦即劑量與/或投藥程序)可與本發明之抗體使用。投藥時間表與劑量可根據用於此等產物之已知方法(例如使用製造商的說明書)來決定。例如，抗體製劑可以濃度為10 mg/mL在100 mg(10 mL)或500 mg(50 mL)單次使用小藥瓶中提供。本發明抗體之例舉性適宜劑量範圍可介於10 mg/m2 與500 mg/m2 。可考量抗體親和性及其藥物動力學參數，決定(例如)飽和細胞達24小時、48小時、72小時或一週或一個月之抗－NKG2A抗體之注射量與時間表。然而，應了解此等時間表為例舉性且必須由臨床試驗決定抗體之最適時間表與療程及耐受性。
非－治療性應用
本發明之抗體(例如人源化抗－NKG2A抗體)亦具有非－治療性應用。
例如，抗體可用作為親和性－純化劑。於此方法，係將抗體使用技術領域中所熟知之方法固定於諸如SEPHADEXTM 樹脂或濾紙之固相上。經固定之抗體與含有欲純化之NKG2A蛋白質(或其片段)的樣本接觸，並於其後將撐體以可實質上去除樣本中所有除NKG2A蛋白質(其與經固定之抗體結合)以外的物質之適宜溶劑清洗。最後，將撐體以另一種會將NKG2A蛋白質從抗體釋放出之適宜溶劑(例如甘胺酸緩衝液，pH 5.0)沖洗。
抗－NKG2A抗體亦可用於NKG2A蛋白質之診斷分析，例如偵測其於特定細胞、組織或血清中之表現。
關於診斷應用，代表性地將抗體以可偵測部份標定。有許多標記可利用，其一般可分類成下列群組：(a)放射性同位素，例如35 S、14 C、125 I、3 H及131 I。可使用描述於例如免疫學現今提案(Current Protocols in Immunology),卷1與2，柯利根等人編著，威利－國際科學,紐約,N.Y.,Pubs.(1991)之技術，將抗體以放射性同位素標定並可使用閃爍計數測量放射活性。
(b)有螢光標記，例如稀土螯合物(銪螯合物)或可利用螢光素與其衍生物、羅丹明(rhodamine)與其衍生物、丹磺醯基(dansyl)、麗絲胺(Lissamine)、藻紅素與德克薩斯紅(Texas Red)可利用。可使用於例如於免疫學現今提案(如前述)所揭示之技術，將螢光標記共軛至抗體。螢光可使用螢光計定量。
(c)有各種酵素－受質標記物可利用，且U.S.Pat.No.4,275,149提供某些此等之回顧。酵素一般催化顯色受質之化學改變，其可使用各種技術測量。例如，酵素可催化受質之顏色變化，其可以分光光度分析地測量。或者，酵素可改變受質之螢光或化學發光。用於定量螢光變化之技術如前所述。化學發光受質係經由化學反應變為電子激發態，然後可發散可被測量(例如使用化學發光計)之光或供給能量予螢光受者。酵素標記之實例包括螢光素酶(例如，螢火蟲螢光素酶與細菌螢光素酶；U.S.Pat.No.4,737,456)、螢光素、2,3－二氫酞二酮、蘋果酸酯脫氫酶、脲酶、過氧化酶，例如辣根過氧化酶(HRPO)、鹼性磷酸酶、貝他－半乳糖苷酶、葡糖澱粉酶、溶菌酶、糖類氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶、與葡萄糖－6－磷酸酯脫氫酶)、雜環氧化酶(例如脲酶與黃嘌呤氧化酶)、乳過氧化酶、微過氧化酶、以及類似者。用於將酵素共軛至抗體之技術，係描述於O'蘇利文等人,"用以製備供用於酵素免疫分析之酵素－抗體共軛物(Methods for the Preparation of Enzyme－Antibody Conjugates foruse in Enzyme Immunoassay)"於Methods in Enzym.(Ed.,J.朗根& H.凡弗納奇斯),學院出版,紐約,73：147－166(1981)。
酵素－受質組合之實例包括(例如)：(i)辣根過氧化酶(HRPO)以過氧化氫酶作為受質，其中過氧化氫酶氧化染料前驅物(例如，鄰苯二胺(OPD)或3,3',5,5'－四甲基聯苯胺氫氯化物(TMB))；(ii)鹼性磷酸酶(AP)以對－硝基苯基磷酸酯作為顯色受質；及(iii)貝他－D－半乳糖苷酶(貝他－D－Gal)以顯色受質(例如，p－硝基苯基－貝他－D－半乳糖苷酶)或螢光產生受質4－甲基繖柳基(umbelliferyl)－p－貝他－半乳糖苷酶。
有許多其他酵素－受質組合對熟習該項技術者為可利用的。關於此等之一般回顧，參見U.S.Pat.Nos.4,275,149與4,318,980。
有時，係將標記間接與抗體共軛。熟習該項技術者會知道各種達成此之技術。例如，可將抗體共軛至生物素，且前述三大類標記中任一種可與抗生物素蛋白共軛，或反之亦然。生物素選擇性地與抗生物素蛋白結合，且因此標記可以此間接方式與抗體共軛。或者，為達成標記與抗體之間接共軛，遂將抗體與小半抗原(例如地高辛(digoxin))共軛並將前述不同類標記中任一種與抗－半抗原抗體(例如，抗－地高辛抗體)共軛。因此，可達成標記與抗體之間接共軛。
於本發明之另一具體態樣，抗－NKG2A抗體不需要被標定，且其存在可使用結合至NKG2A抗體之經標定次級抗體偵測。
本發明之抗體可用於任何已知之分析方法，例如競爭性結合分析、直接與間接夾層分析、及免疫沈澱分析。索拉，單株抗體：技術手冊(Zola,Monoclonal Antibodies：A Manual of Techniques),pp.147－158(CRC出版,Inc.1987)。
關於免疫組織化學，腫瘤樣本可為新鮮或冷凍或可包埋於石蠟中並例如以諸如福馬林等防腐劑固定。
抗體亦可用於活體內診斷分析。一般，係將抗體以放射性核素標定或可藉由(例如)核磁共振或技術領域中已知之其他方法偵測之非放射性指示劑標定。較佳地，標記為放射性標記，例如125 I、131 I、67 Cu、99m Tc或111 In。經標定之抗體較佳地經由血流投藥予宿主，並分析經標定抗體於宿主中之存在與位置。此顯像技術適合用於偵測、定期與治療腫瘤。將放射性同位素藉由任何方法(包括金屬螯合化合物或乳過氧化酶，或用於碘化之1,3,4,6－四氯－3α ,6α －二苯甘脲(iodogen)技術)共軛至蛋白質。
為方便起見，本發明之抗體可於套組中提供，亦即預定量試劑與用以執行該診斷分析之說明書的經包裝組合。若抗體以酵素標定，則套組會包括該酵素所需要之受質與輔因子(例如，提供可偵測發色團或螢光團之受質前驅物)。此外，可包括其他添加物，例如安定劑、緩衝液(例如封阻緩衝液或溶解緩衝液)以及類似物。各種試劑之相對量可廣泛變化以提供實質上使分析靈敏度最適化之試劑溶液。尤其，試劑可呈包括賦形劑之乾粉形式(通常係經凍乾)提供，包括於溶解時會提供具有最適濃度之試劑溶液。
寄存
Z270融合瘤於2005年十二月22日寄存於國家微生物培養物收藏所，巴斯德研究所,25,Rue du Docteur Roux,F－75725巴黎,法國(Collection Nationale de Culture de Microorganismes,Institute Pasteur,25,Rue du Docteur Roux,F－75725 Paris,France)，寄存編號I－3549。
實施例
藉由下列非限制性實施例，例舉說明本發明之進一步細節。
實施例1 －親本humZ270VL與humZ270VH序列之篩選
本實施例描述親本humZ270VL與humZ270VH序列之篩選，以及對於變異型h270VL與humZ270VH序列之視需要回復突變。
如實施例2所述，係選殖得Z270融合瘤，並測定出相對應抗體之Z270VH與VL鏈序列為下列：Z270VL：DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYLAWYQQKQGKSPQFLVYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCQHHYGTPRTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO：1)，具有視需要之精胺酸(R)殘基位於卡巴特位置108。
Z270VH：QVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTSYWMNWVKQRPEQGLQWIGRIDPYDSETHYSQKFKDKAILTVDKSSSTAYMRLSSLTSEDSAVYYCARGGYDFDVGTLYWFFDVWGAGTTVTVS(SEQ ID NO：2)，具有視需要之C－端絲胺酸(S)殘基。
亦鑑定出第二輕鏈，Z270VL－NB。然而，此為共通的骨髓瘤輕鏈。
Z270VL－NB：NIVMTQSPKSMSMSVGERVTLTCKASENVVTYVSWYQQKPEQSPKLLIYGASNRYTGVPDRFTGSGSATDFTLTISSVQAEDLADYHCGQGYSYPYTFGGGTKLEIKRA(SEQ ID NO：3)，具有位於卡巴特位置108之視需要精胺酸(R)殘基，及位於卡巴特位置109之視需要丙胺酸(A)殘基。
從鼠類Z270序列之分析，測定得根據卡巴特定義之CDR為：CDR－L1：RASENIYSYLA(SEQ ID NO：1之殘基24－34)CDR－L2：NAKTLAE(SEQ ID NO：1之殘基50－56)CDR－L3：QHHYGTPRT(SEQ ID NO：1之殘基89－97)CDR－H1：SYWMN(SEQ ID NO：2之殘基31－35)CDR－H2：RIDPYDSETHYSQKFKD(SEQ ID NO：2之殘基50－66)CDR－H3：GGYDFDVGTLYWFFDV(SEQ ID NO：2之殘基95－102)。
使用MOE(分子操作環境(molecular Operating Environment)；可於www.chemcomp.com取得)，以來自蛋白質數據庫(Protein Database Bank，PDB)：1OPG與1XF4之結構模板建立3D蛋白質結構模型。PDB係描述於柏曼等人(Nucl Acids Res 2000；28：235－242)，且可於www.rcsb.org/pdb取得。基於PDB數據庫中201抗體－抗原複合體之統計分析，決定出位於抗原互補位中最可能的殘基係：Z270VL：SEQ ID NO：1之殘基24－34、49－56、89－97Z270VH：SEQ ID NO：2之殘基23－35、49－58、93－102。
使用MOE，鑑認出與抗原互補位交互作用(厭水性、氫結合或電荷)之殘基，並採用組合之殘基組(抗原互補位＋交互作用殘基)作為Z270之遮罩(mask)。
以Z270VL或Z270VH搜尋種系V數據庫(V－鹼基(V－base)；可於vbase.mrc－cpe.cam.ac.uk/取得)，得到下列可能的框架模板(E－值示於括弧中)：重鏈：VH1_46(2e－036)、VH1_f(2e－035)、VH1_02(3e－035)、VH1_18(4e－035)、VH1_03(6e－035)；與輕鏈：VKI_O2(1e－039)、VKI_O12(1e－039)、VKI_L12(9e－038)、VKI_L8(9e－038)、VKI_A20(9e－038)。
以該遮紹搜尋種系數據庫，得到下列可能的框架模板(E－值示於括弧中)：重鏈：VH5_a(4e－013)、VH5_51(3e－011)VH1_f(1e－010)、VH1_18(2e－010)、VH1_46(4e－010)；與輕鏈：VKI_L9(2e－012)、VKI_O2(3e－012)、VKI_O12(3e－012)、VKI_L24(2e－011)、VKI_A20(2e－011)。
待以人力檢視排列比對與命中後，選出VH1_18與VKI_O2作為人類骨架。選擇JH6與JK4作為種系J－節段。
現在依下列規則設計人源化：．採用位於遮罩外部之殘基為人類。．採用位於遮罩內部及卡巴特CDR內部之殘基為鼠類。．採用位於遮罩內部及卡巴特CDR外部，具有小鼠/種系共有序列之殘基為共有序列。．採用位於遮罩內部及卡巴特CDR外部，具有小鼠/種系差異之殘基為可能回復突變之標的。
Z270VL與Z270VH之分析係說明於圖1，其中遮罩殘基為該等於卡巴特結構中加陰影者；CDR殘基係以粗體字顯示於卡巴特結構中；而小鼠/種系差異係加陰影表示於VKI_02/JK4與VH1_18/JH6序列中。Z270VL與humZ270VL1，及humZ270VL1 cons可視需要地包含位於卡巴特位置108之精胺酸(R)殘基。
得到所成之序列，humZ270VL1與humZ270VH1，具有如人類之可能之回復－突變殘基。
人源化Z270抗體根據卡巴特定義之CDR係列示於圖2。humZ270 CDR中，僅CDR－H2序列與相對應之鼠類CDR不同，差異在於4個位置。然而，實際上，此意指卡巴特CDR－H2殘基60－65與人類受者序列相同，提供更人類之分子及較少之免疫原性危險。於圖2，差異係以粗體字表示。
實施例2 －Z270 IgG1 VH與VL區域之選殖
本實施例描述鼠類Z270VH與VL區域之選殖及定序。
供總體RNA萃取之Z270融合瘤細胞培養物。 將Z270融合瘤培養於RPMI 1640(Hyclone Cat# SH30011.04)加10% FCS(Biochrom Cat#S0115)中。收取5x106 至1x107 細胞用於總體RNA萃取。
抗體製造之Z270融合瘤細胞培養物。 修改一週批份培養策略以適用於製造Z270 mAb。培養基為具有10% FCS之RPMI 1640。每7天收取上清液。於CL－1000培養瓶(INTEGRA生物科學(INTEGRA Biosciences),Item No.90005,Lot No.08541150)之培養室中的起始細胞密度為2x106 細胞/ml。於培養期間，定期檢查細胞密度與存活率。於CL－1000培養瓶中培養3天後，密度超過1x107 且存活率為約85%。於接著之4天中，細胞密度介於1.5－2.5x107 細胞/ml之間變化且存活率逐漸減至60~70%。於第7天收集上清液並使用還原性SDS－PAGE以定量對照組(A－TNP 20050118 2mg/ml)估計抗體濃度。
Z270總體RNA萃取。 此係使用TRIZOL試劑(因維托金(Invitrogen)，Cat.No.15596－026)，根據製造商之指示說明完成。
5’－RACE(cDNA末端之快速擴增)。 程序係修改得自製造商Clontech關於使用SMARTTM RACE cDNA擴增套組(SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit,Catalog no.634914)之說明而得，並使用下列基因專一性引子(Gene－Specific Primer，GSP)之設計：GSP1：用於擴增IgG1重鏈可變區RacePrimerheavy：5’－GCCAGTGGATAGACAGATGG－3’(SEQ ID NO：12)GSP2：用於擴增IgG1 Kappa鏈可變區RacePrimerkappa：5’－GATGGATACAGTTGGTGCAGC－3’(SEQ ID NO：13)。
於第一股cDNA合成、RACE、及1.5%瓊脂凝膠上分析所成之樣本後，將RACE DNA條帶切出並以凝膠純化套組(奎爾金(QIAGEN)QIAquick Cat#28706)純化，然後使用DNA接合套組(Cat#D6022，購自TAKARA)Ver.2.0藉由TA選殖法選殖入pMD－19(圖3A)。將陽性選殖株送去DNA定序。
以如圖4A－D(其中粗體字表示訊號肽序列)中所示，數個輕鏈與重鏈的純株被定序出具有相同序列：Z270VL cDNA：(SEQ ID NO：14)Z270VL蛋白質(SEQ ID NO：15)Z270 VH cDNA(SEQ ID NO：16)Z270 VH蛋白質(SEQ ID NO：17)。
實施例3 －鼠類IgG1輕鏈與重鏈選殖入pJSV002
為測試抗體親合性及將其用於陽性對照組，遂將Z270抗體輕鏈與重鏈插入pJSV002，呈鼠類抗體IgG1。pJSV002為一種可與HEK293 6E細胞組合使用以用於Z270暫時表現之暫時表現載體(圖3B)。
將Z270 VL與IgG1恆定區選殖入pJSV002之EcoRI與Nhe I切位中。所產生之質體如圖3C所示。於兩端具有EcoRI與Nhe I(大寫字母)之所插入序列係列示於圖4E(SEQ ID NO：18)。
將H1可變區與IgG1恆定區選殖入pJSV002－mIgG1－變體之EcoRI與Nhe I切位中(圖3D)。pJSV002－mIgG1－變體含有鼠類IgG1重鏈恆定區(圖3E)。插入序列係介於EcoRI與Nhe I(gctagc)切位之間，其中以小寫表示之限制切位及鼠類IgG1重鏈恆定區係列示於圖4F(SEQ ID NO：19)。
實施例4 －嵌合型Z270抗體之質體構築
為測試抗體親合性及將其用於陽性對照組，遂將鼠類Z270抗體輕鏈與重鏈插入pJSV002，呈人類嵌合型抗體IgG4 S241P。該抗體含有鼠類可變區與人類IgG4恆定區，於重鏈中帶有S241P突變。
對於嵌合型Z270抗體(chimZ270)之表現，係將Z270VL序列與人類輕鏈(kappa)恆定區插入pJSV002之EcoRI與BamH I切位中(圖3F)。使用列示於圖4G之序列，其中大寫字母表示限制切位(SEQ ID NO：20)。
將Z270VH與人類重鏈恆定區插入pJSV002－IgG4－S241P之EcoRI與Nhe I切位中(圖3G與3H)。使用列示於圖4H之序列，其中真正的插入序列係介於EcoRI與Nhe I(gctagc)切位之間，其中大寫字母表示限制切位(SEQ ID NO：21)。
實施例5 －人源化Z270之表現
根據實施例1所述之Z270人源化策略，將Z270輕鏈CDR植入VKI_02/JK4模板中以製備humZ270VL1。圖4I所列示之序列係由合成介於EcoRI與KasI切位間之序列並將其插入pJSV002－hKappaC(具有pJSV002中之人類Kappa恆定區)中而產生，其中CDR－編碼序列以大寫表示而限制切位以粗體字表示(SEQ ID NO：22)。
對於重鏈之人源化，係將Z270重鏈CDR(視需要地具有經最適化的CDR－H2)植入VH1_18/JK6模板中以製備humZ270VH1。合成介於EcoRI與Nhe I切位間之序列並將其選殖入pJSV002－hIgG4 S241P(pJSV002中之人類IgG4 S241P恆定區，圖3G)，其中CDR－編碼序列以大寫表示而限制切位以粗體字表示(圖4J，SEQ ID NO：23)。
將經突變之構體同樣地選殖入具有相對應IgG4 S241P恆定區與人類Kappa鏈恆定區之pJSV002中，其中各humZ270VL及humZ270VH中框架回復突變之組合如下：humZ270VL：Wt(亦即無回復突變)、L46F、I48V、L46F_I48V humZ270VH：Wt(亦即無回復突)、V5Q、M69L、T71V、T73K、T75S、V5Q_M69L、V5Q_T71V、V5Q_T73K、V5Q_T75S、M69L_T71V、M69L_T73K、M69L_T75S、T71V_T73K、T71V_T75S、T73K_T75S、V5Q_M69L_T71V_T73K_T75S、M69L_T71V_T73K_T75S、V5Q_T71V_T73K_T75S、V5Q_M69L_T73K_T75S、V5Q_M69L_T71V_T75S、V5Q_M69L_T71V_T73K、T71V_T73K_T75S、M69L_T73K_T75S、M69L_T71V_T75S、M69L_T71V_T73K、V5Q_T73K_T75S、V5Q_T71V_T75S、V5Q_T71V_T73K、V5Q_M69L_T75S、V5Q_M69L_T73K、V5Q_M69L_T71V。圖5例舉說明用於重鏈(HC)之例舉性載體設計，而圖6提供用於輕鏈(LC)之例舉性載體設計。
將質體使用293fectin轉染至HEK293 6E供暫時表現。材料：細胞：HEK 293 6E(293－6E)細胞係於對數生長期生長(0.8至1.2x106 細胞/ml)。培養基：FreeStyleTM(Cat.No.12338－018，購自Gibco)；25 μg/ml Geneticin 418(Cat.No.10131－019，購自Gibco)；0.1% pluronic F－68(Cat.No.24040－032，購自Gibco)。轉染培養基：Opti－MEM(Cat.No.51985－026，購自Gibco)；293fectin(Cat.No.12347019，購自因維托金)。質體DNA：經純化之所興趣之質體DNA(參見上述)。
細胞計數與接種。 於轉染前兩天，將可給予7.5x106 細胞之所需體積轉移至125 ml培養瓶中，並將新鮮的Freestyle培養基加入達全部體積為30 ml(最終細胞密度應為0.25x106 細胞/ml)。兩天後(轉染日)，細胞密度應介於1至1.2x106 細胞/ml。或者，在轉染前一天，將給予1.5x107 細胞之所需體積轉移至125 ml培養瓶中，並將新鮮的Freestyle培養基加入，達全部體積為30 ml(最終細胞密度應為0.50x106 細胞/ml)。24小時後(轉染日)，細胞密度應介於0.9至1.2x106 細胞/ml。
293fectin－DNA複合體製備。 為製備DNA溶液，係將30 μg DNA以總體積為1 ml Opti－MEM稀釋。為製備293fectin溶液，係將40 μl於960 μl Opti－MEM稀釋。待於室溫下培養5分鐘後，將293fectin溶液與DNA溶液混合，然後於室溫下培養25分鐘。接著將細胞以2 ml 293fectin－DNA混合物轉染，並於37℃下於含有5% CO2之溼潤培養箱(軌道搖晃器)中培養4至6天。圖7列示供於HEK293細胞(例如HEK693 6E細胞)中暫時表現之一般程序。
實施例6 －從Z270融合瘤培養物純化IgG1
IgG1 Z270抗體係藉由以下方法從Z270融合瘤細胞培養液純化：將樣本以流速：1.0 ml/min加至以3M NaCl 50mM Tris pH8.5平衡之HiTrap Protein A HP(1 ml)管柱上，並使用25mM檸檬酸,4.5mM檸檬酸鈉pH3.0溶析出抗體。
實施例7 －抗體定量及親和性測定
將含有輕鏈與同等重鏈表現構體之質體配對混合，並將質體用於轉染HEK6E細胞。然後收集培養基上清液。
為定量小鼠IgG1(或IgG4)抗體量，將ELISA平盤以山羊多株抗小鼠IgG1(或IgG4)Fc專一性捕捉抗體塗覆。加樣抗體表現上清液，隨後加入HRP－山羊多株抗小鼠kappa或Fab次級抗體。將HRP受質投入，並於OD450下偵測轉變。
為分析人源化Z270抗體之抗原結合，係使用下列Biacore分析(例舉說明於圖8)。抗原捕捉抗體被固定於Biacore晶片上。加入抗原與培養物上清液。分析接上－與解離－比例以計算親和性。
實施例8 －Z270抗體之嵌合型、人源化、及其回復突變變體之Biacore分析
材料與方法根據實施例4與5所述之方法製得在VKI_O2/JK4輕鏈與VH1_18/JH6重鏈受者框架中的嵌合型Z270及humZ270。嵌合型Z270、humZ270及回復突變變體之抗原結合特性係於Biacore T100(Biacore AB,Uppsala,瑞典)上分析。將呈單鏈NKG2A－CD94－mFc構體形式之抗原，其使用1－乙基－3－(3－二甲基胺基丙基)羰二亞胺鹽酸鹽(EDC)與N－羥基琥珀醯亞胺(NHS)經由胺基團共價固定於感應器CM5晶片(Biacore AB,Uppsala,瑞典)上。固定化程度瞄準300 RU。將Z270抗體變體於執行緩衝液HBS－EP(10 mM HEPES pH 7.4,150 mM NaCl,3 mM EDTA,0.005%(v/v)Tween－20)中稀釋至一濃度系列(0.157、0.313、0.625、1.25、2.5 nM)。然後將所有樣本以流速為40 ul/min注射通過該經固定抗原達2分鐘。接著，將執行緩衝液以40 ul/min注射歷時3分鐘以用於抗體解離分析。於每次執行後，注射再生緩衝液(10 mM NaOH,500 mM NaCl)(30秒，10 ul/min)以將殘餘之抗體從抗原完全去除。數據係以Biacore T100評估軟體評估。
結果humZ270之親和性經測定為67 pM。此KD值較嵌合型Z270(50 pM)的高(圖9及表2)。將回復突變導入在VKI_O2/JK4輕鏈與VH1_18/JH6重鏈受者框架中之humZ270並未實質上增進其親和性(圖10)。
實施例9 －產生具有全長CDR－H2之humZ270
於供選擇的策略(列示於圖11)，係研究全長卡巴特CDR(包括全長CDR－H2)是否會導致在VKI_O2/JK4輕鏈與VH1_18/JH6重鏈受者框架中之humZ270的親和性增強。humZ270VH3(SEQ ID NO：24)直接採用CDR定義間之差異，基本上產生植入卡巴特CDR之人源化Z270抗體。humZ270VH4(SEQ ID NO：25)採用K38、Q46、W47、I48、G49、Y59、Q61、K62、K66與A67位於靠近S60、F63、K64、D65側鏈之觀察結果，而產生具有R38K、E46Q、M48I、R66K與V67A之CDR－植入人源化Z270抗體。
實施例10 －產生在其他人類受者框架中之humZ270
製得許多具有不同人類重鏈受者框架序列之不同人源化構體以探究框架選擇。
圖12列示所製備得不同人源化Z270VH構體間之排比。humZ270VH5(SEQ ID NO：26)係基於VH5_a，humZ270VH6(SEQ ID NO：27)係基於VH5_51，humZ270VH7(SEQ ID NO：28)係基於VH1_f，而humZ270VH8(SEQ ID NO：29)係基於VH1_46，所有皆具有JH6 J－節段。所有人源化構體之卡巴特CDR－H2的6個C－端胺基酸殘基皆與人類受者框架相同。
使用排比程式VectorNTI，獲得下列humZ270VH1與humZ270VH5、－6、－7及－8間之序列同一性：78,2%(VH1 vs.VH5)、79,0%(VH1 vs.VH6)、88,7%(VH1 vs.VH7)及96,0%(VH1 vs.VH8)。
實施例11 －不同humZ270變體之Biacore分析
分析所有皆包含humZ270VL1序列但使用不同策略用於VH序列人源化的huZ270變體之親和性。
材料與方法使用Biacore T100(Biacore AB,Uppsala,瑞典)。以單鏈NKG2A－CD94－mFc構體之形式使用CD94/NKG2A抗原，其使用1－乙基－3－(3－二甲基胺基丙基)羰二亞胺鹽酸鹽(EDC)與N－羥基琥珀醯亞胺(NHS)經由胺基團共價固定於感應器CM5晶片(Biacore AB,Uppsala,瑞典)上。固定化程度瞄準於300 RU。將humZ270抗體變體於執行緩衝液HBS－EP中稀釋至一濃度系列(0.157、0.313、0.625、1.25、2.5 nM)。然後將所有樣本以流速為40 ul/min注射通過該經固定抗原達2分鐘。接著，將執行緩衝液以40 ul/min注射歷時3分鐘以用於抗體解離分析。於每次執行後，注射再生緩衝液(10 mM NaOH,500 mM NaCl)(40秒，10 ul/min)以將殘餘之抗體從抗原完全去除。數據係以Biacore T100評估軟體評估。將各變體之KD值除以具有humZ270VH1重鏈之huZ270的KD值以獲得相對KD倍數變化。
結果與討論結果列示於圖13，其中將各變體之KD值對具有humZ270VH1重鏈之huZ270的KD值正常化，以獲得KD之相對變化。如圖13所示，CDR－植入變體(VH3、VH4)與於CDR－H2節段中包含較少鼠類殘基之humZ270變體(humZ270VL1/VH1)間並無顯著差異。於存在不同人類受者框架中之“人源化－CDR－H2”變體間，亦無實質上差異。因為較人類humZ270抗體在人類患者中具有較低致免疫反應危險之助益，故可選擇人源化－CDR－H2變體(例如VH1、VH5、VH6與VH7)用於治療應用，而相較於標準CDR－植入humZ270抗體無需妥協顯著較低的親和性，且具有較低宿主免疫反應的可能性。
實施例12 －鑑定於Z270VL與VH中之決定性殘基
為鑑定出Z270之抗原互補位，遂對鼠類抗體之CDR進行丙胺酸掃描誘變。選擇下列胺基酸進行丙胺酸掃描誘變(圖14)：Z270VL：R24A、S26A、E27A、N28A、Y30A、S31A、N50A、K52A、T53A、E56A、Y92A、T94AZ270VH：K23A、S25A、T28A、T30A、S31A、N35A、D52A、Y53A、D54A、S55A、E56A、R94A、D98A、F99A、D100A、V(100A)A、T(100C)A、L(100D)A、W(100F)A、D101A。
材料與方法於Biacore T100(Biacore AB,Uppsala,瑞典)上分析丙胺酸突變型之抗原結合特性。將呈sc－NKG2A－CD94－mFc形式之抗原，其使用1－乙基－3－(3－二甲基胺基丙基)羰二亞胺鹽酸鹽(EDC)與N－羥基琥珀醯亞胺(NHS)經由胺基團共價固定於感應器CM5晶片(Biacore AB,Uppsala,瑞典)上。固定化程度瞄準300 RU。將經純化之Z270丙胺酸突變型於執行緩衝液HBS－EP中稀釋至0.75 nM或1.5 nM。然後將所有樣本以流速為10 ul/min注射通過該經固定抗原達3分鐘。接著，將執行緩衝液以10 ul/min注射歷時1分鐘，以用於抗體結合安定性分析。於每次執行後，注射再生緩衝液(10 mM NaOH,500 mM NaCl)(35秒，10 ul/min)以將殘餘之抗體從抗原完全去除。數據係以Biacore T100評估軟體進行評估。經由將各突變型從Biacore獲得之結合度(RU)，除以由chimZ270所得者計算突變型之相對結合。
結果與討論如圖15所示，Z270丙胺酸突變型D52A、D54A、F99A、T(100C)A及W(100F)A，完全喪失其抗原結合特性。重鏈突變型R94保留20%左右的抗原結合能力。重鏈突變型N35A、Y53A、E56A、D98A、V(100A)A、及L(100D)A之相對結合度係介於40－70%(圖1)。於是，位於Z270重鏈CDR－H2與CDR－H3中之胺基酸D52、D54、R94、F99、T(100C)、及W(100F)為辨識該抗原之決定性殘基。同時，重鏈中之胺基酸N35、Y53、E56、D98、V(100A)及L(100D)溫和地影響抗原結合。有趣地，所有Z270輕鏈丙胺酸突變型皆保留與嵌合型Z270相當的抗原結合特性(圖16)。因此，Z270輕鏈中無胺基酸明顯對抗原辨識有貢獻。
實施例13 －HumZ270專一性地與表現CD94/NKG2A之細胞結合
於流式細胞儀中，藉由分析HEK293細胞所製造之野生型Z270(recZ270)、具有人類IgG4之嵌合型Z270(chimZ270)或人源化Z270(humZ270VL1/VH1)與穩定過度表現CD94/NKG2A或CD94/NKG2C的Ba/F3細胞之結合，測試HumZ270與CD94/NKG2A結合之強度及專一性。為此目的，遂將Ba/F3－CD94/NKG2A和－C細胞與各種濃度之Z270培養於含有2% FCS之組織培養基中，於冰上達至少30分鐘。接著清洗細胞，並將細胞與經APC共軛之次級Ab培養於類似培養基中，再次於冰上達至少30分鐘。經兩次以冰凍PBS清洗後，使用BD生物科學FACSarray顯現mAb與細胞之結合。
如圖17所示，所有Z270變體皆以劑量－依賴方式結合至Ba/F3－CD94/NKG2A細胞，但不結合至Ba/F3－CD94/NKG2C細胞。因此所有變體皆專一性地與NKG2A結合，其中humZ270對NKG2A具有與chimZ270類似的結合效能，而recZ270稍微更有效地結合。
實施例14 －HumZ270誘導由表現CD94/NKG2A之NKL細胞殺死HLA－E＋標靶細胞
研究recZ270、chimZ270、humZ270VL1/VH1及Z199誘導由CD94/NKG2A＋NKL細胞殺死經51 Cr－標定之LCL 721.221－Cw3細胞的能力。於此項分析中，係將經51 Cr－標定之LCL 721.221－Cw3標靶細胞(HLA－E＋)與NKL細胞，在有或無各種濃度之抗－NKG2A mAb存在下，於37℃(E：T比例＝6：1)下培養於含有5% CO2之溼潤化培養箱中達4小時。藉由測量組織培養基中51 Cr之量(由標靶細胞在殺死後立即釋放出)分析標靶細胞之殺死。
於圖18，顯示漸增濃度之抗－NKG2A抗體誘導由NKL細胞殺死LCL 721.221－Cw3細胞。Z199、chimZ270與recZ270效力相同，而humZ270誘發較高的藉由NKL細胞之LCL 721.221－Cw3細胞之殺死。因此，humZ270可有效阻斷CD94/NKG2A對CD94/NKG2A－表現性細胞毒性淋巴細胞(例如NK－細胞、NKT－細胞、α/β T－細胞與γ/δ T－細胞之次組)之抑制性功能，且較所測試之其他重組變體更有效。
實施例15 －HumZ270為競爭性CD94/NKG2A拮抗劑
為測試humZ270VL1/VH1是否防止配體(亦即HLA－E)與CD94/NKG2A結合，吾等遂分析humZ270是否能防止HLA－E四聚體結合至CD94/NKG2A過度表現性Ba/F3細胞(Ba/F3－CD94/NKG2A)。為此，將Ba/F3－CD94/NKG2A1)各種濃度之humZ270與培養，或2)首先與飽和濃度之HLA－E四聚體(4.7 μg/ml)培養然後與各種濃度之humZ270培養。所有培養皆於含有2% FCS之組織培養基中於冰上進行。接著，將細胞與對小鼠Ab具專一性的經APC－共軛之次級抗體培養，並使用BD生物科學FACSarray藉由流式細胞儀分析。
如圖19所示，humZ270有效地以濃度依賴方式與Ba/F3－CD94/NKG2A細胞結合(菱形)。然而，當細胞與HLA－E四聚體預先培養時，humZ270被防止結合至Ba/F3－CD94/NKG2A細胞。因此humZ270及HLA－E與位於CD94/NKG2A上之重疊抗原表位結合。因此，於NK－細胞毒性分析中humZ270之CD94/NKG2A－抑制功效似乎是防止HLA－E經由CD94/NKG2A誘導對細胞毒性淋巴細胞之負面訊號的能力。就其本身而論，humZ270可被視為競爭性CD94/NKG2A拮抗劑。
實施例16 －humZ270專一性地結合至CD94/NKG2A
於流式－細胞儀中測試humZ270VL1/VH1及各種具有位於可變輕鏈(VL)或可變重鏈(VH)區域之回復突變的humZ270VL1/VH1變體與CD94/NKG2A結合之專一性與效率。為此，將Ba/F3－CD94/NKG2A細胞與humZ270－L46F(VL)、humZ270－I48V(VL)、humZ270－L46F/I48V(VL)、humZ270－V5Q(VH)、humZ270－M69L(VH)、humZ270－T71V(VH)、humZ270－T73K(VH)、humZ270－T75S(VH)、humZ270－V5Q/M69L/T71V/T73K/T75S(VH)、humZ270－M69L/T71V/T73K/T75S(VH)或兩批不具有回復突變之humZ270VL1/VH1(“DK”與“CHN”)培養。為此目的，係將Ba/F3－CD94/NKG2A或－C細胞與各種濃度之humZ270於冰上於含有2% FCS之組織培養基中，培養達至少30分鐘。然後將細胞清洗，並於類似培養基中與對人類抗體具專一性的經APC共軛次級抗體於冰上培養再至少30分鐘。經兩次以冰凍PBS清洗後，使用BD生物科學FACSarray顯現次級抗體與細胞之結合。
所有變體皆以劑量－依賴方式結合至CD94/NKG2A，但不結合至CD94/NKG2C細胞。所有變體皆以相似之效率結合至CD94/NKG2A，惟含有V5Q(VL)突變之變體例外，其結合效率稍微較差(圖20)。
例舉性具體態樣
以下段落描述本發明之例舉性具體態樣。
1.一種專一性結合NKG2A之抗體，其包含源自鼠類抗體Z270之互補性－決定區(CDR)的抗原結合殘基與人類受者框架序列，其中CDR－H2之至少6個C－端胺基酸殘基與該等在可變重鏈(VH)人類受者序列中的相同。
2.具體態樣1之抗體，其在加強表現CD94/NKG2A之細胞毒性淋巴細胞的細胞毒性活性方面，較包含鼠類抗體Z270可變輕鏈(VL)與VH序列之抗體更有效。
3.具體態樣1之抗體，其在中和被表現於細胞毒性淋巴細胞表面之CD94/NKG2A受體的抑制活性方面，較包含鼠類抗體Z270可變輕鏈(VL)與VH序列之抗體更有效。
4.具體態樣1之抗體，其在減低表現CD94/NKG2A之細胞毒性淋巴細胞的CD94/NKG2A－所介導抑制作用方面，較包含鼠類抗體Z270可變輕鏈(VL)與VH序列之抗體更有效。
5.具體態樣1之抗體，其在誘發藉由表現CD94/NKG2A之細胞毒性淋巴細胞殺死Cw3－表現性標靶細胞方面，較包含鼠類抗體Z270可變輕鏈(VL)與VH序列之抗體更有效。
6.具體態樣2－5中之任一者的抗體，其中表現CD94/NKG2A之細胞毒性淋巴細胞為NK細胞、NKT細胞、α/β T－細胞或γ/δ T－細胞。
7.具體態樣6之抗體，其中表現CD94/NKG2A之細胞毒性淋巴細胞為NK細胞。
8.具體態樣1－7中之任一者的抗體，其中該抗體VH功能域包含源自鼠類抗體Z270之VHCDR的殘基D52、D54、F99、T(100C)與W(100F)。
9.具體態樣8之抗體，其中該抗體VH功能域進一步包含源自鼠類抗體Z270之VHCDR的殘基N35、Y53、E56、D98、V(100A)與L(100D)。
10.具體態樣1－9中之任一者的抗體，其包含對應於SEQ ID NO：5之殘基31－35的CDR－H1及對應於SEQ ID NO：5之殘基95－102的CDR－H3，其中CDR－H2包含SEQ ID NO：5之殘基50－59。
11.具體態樣1－10中之任一者的抗體，其中VH功能域人類受者框架與SEQ ID NO：5具有70%或以上之序列同一性。
12.具體態樣1－11中之任一者的抗體，其中該VH人類受者框架之VH節段為VH1_18、VH5_a、VH5_51、VH1_f或VH1_46，且J－節段為JH6。
13.具體態樣12之抗體，其中該VH節段為VH1_18、VH5_a、VH5_51或VH1_f。
14.具體態樣13之抗體，其中該VH節段為VH1_18。
15.具體態樣1－14中之任一者的抗體，其中該VH功能域人類受者框架不含任何回復突變。
16.具體態樣1－14中之任一者的抗體，其中(a)位於該VH功能域之位置5的胺基酸為Q或V；(b)位於該VH功能域之位置69的胺基酸為M或L；(c)位於該VH功能域之位置71的胺基酸為T或V；(d)位於該VH功能域之位置73的胺基酸為T或K；或者(e)位於該VH功能域之位置75的胺基酸為T或S。
17.具體態樣16之抗體，其中位於位置69的胺基酸為L。
18.具體態樣16之抗體，其中位於位置71的胺基酸為V。
19.具體態樣1－15中之任一者的抗體，其中該VH功能域包含SEQ ID NO：5之序列。
20.具體態樣1－19中之任一者的抗體，其包含對應於SEQ ID NO：4之殘基24－34的CDR－L1、對應於SEQ ID NO：4之殘基50－56的CDR－L2、及對應於SEQ ID NO：4之殘基89－97的CDR－L3之VL功能域。
21.具體態樣20之抗體，其中該VL功能域人類受者序列不含任何回復突變。
22.具體態樣20－21中之任一者的抗體，其中該VL功能域人類受者框架係於源自VKI_O2/JK4。
23.具體態樣20－22中之任一者的抗體，其中該VL功能域人類受者框架包含SEQ ID NO：4。
24.一種專一性結合NKG2A之人源化抗體或抗體片段，其包含(a)對應於SEQ ID NO：4之殘基24－34的CDR－L1；(b)對應於SEQ ID NO：4之殘基50－56的CDR－L2；(c)對應於SEQ ID NO：4之殘基89－97的CDR－L3；(d)對應於SEQ ID NO：5之殘基31－35的CDR－H1；(e)對應於SEQ ID NO：5之殘基95－102的CDR－H3；與(f)對應於SEQ ID NO：5之殘基50－59的CDR－H2；及(g)人類受者框架序列；其中位於CDR－H2之殘基60－65係源自VH人類受者序列，且其中該人源化抗體在加強表現CD94/NKG2A之NK細胞的細胞毒性活性方面，較包含對應於SEQ ID NO：1之可變輕鏈(VL)與對應於SEQ ID NO：2之VH序列的抗體更有效。
25.一種結合人類NKG2A之人源化抗體，該抗體包含包含非人類CDR殘基與人類VH受者框架的VH功能域，該VH功能域包含對應於SEQ ID NO：5之殘基31－35的CDR－H1、對應於SEQ ID NO：5之殘基50－665的CDR－H2、及對應於SEQ ID NO：5之殘基95－102的CDR－H3序列。
26.具體態樣25之人源化抗體，其中該人類VH受者框架不含任何回復突變。
27.具體態樣25之人源化抗體，其中該位於VH功能域之卡巴特位置5的胺基酸為Q或V。
28.具體態樣25之人源化抗體，其中該位於VH功能域之卡巴特位置69的胺基酸為M或L。
29.具體態樣25之人源化抗體，其中該位於VH功能域之卡巴特位置71的胺基酸為T或V。
30.具體態樣25之人源化抗體，其中該位於VH功能域之卡巴特位置73的胺基酸為T或K。
31.具體態樣25之人源化抗體，其中該位於VH功能域之卡巴特位置75的胺基酸為T或S。
32.具體態樣25之人源化抗體，其中該VH功能域包含於至少一個選自5、69、71、73與75所組成之群組之卡巴特位置的框架區取代。
33.具體態樣32之人源化抗體，其中該VH功能域包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列，其具有根據下列選擇任一者之框架取代：(a)無(b)V5Q(c)M69L(d)T71V(e)T73K(f)T75S(g)V5Q與M69L(h)V5Q與T71V(i)V5Q與T73K(j)V5Q與T75S(k)M69L與T71V(l)M69L與T73K(m)M69L與T75S(n)T71V與T73K(o)T71V與T75S(p)T73K與T75S(q)V5Q、T73K與T75S(r)V5Q、T71V與T75S(s)V5Q、T71V與T73K(t)V5Q、M69L與T75S(u)V5Q、M69L與T73K(v)V5Q、M69L與T71V(w)T71V、T73K與T75S(x)M69L、T73K與T75S(y)M69L、T71V與T75S、(z)M69L、T71V與T73K、(aa)V5Q、M69L、T71V與T73K,(bb)V5Q、M69L、T71V與T75S,(cc)V5Q、M69L、T73K與T75S,(dd)V5Q、T71V、T73K與T75S,(ee)M69L、T71V、T73K與T75S、與(ff)V5Q、M69L、T71V、T73K與T75S。
34.具體態樣25－32之任一者之人源化抗體，其包含包含併入人類VL受者框架之非人類CDR殘基的VL功能域，該VL功能域包含對應於SEQ ID NO：4之殘基24－34的CDR－L1、對應於SEQ ID NO：4之殘基50－56的CDR－L2、及對應於SEQ ID NO：4之殘基89－97的CDR－L3。
35.具體態樣34之人源化抗體，其中該人類VL受者體框架不包含任何回復突變。
36.具體態樣34之人源化抗體，其中該位於VL功能域之卡巴特位置46之胺基酸為L或F。
37.具體態樣34之人源化抗體，其中該位於VL功能域之卡巴特位置48之胺基酸為I或V。
38.具體態樣34之人源化抗體，其中該VL功能域包含於至少一個選自46與48之卡巴特位置的框架區取代。
39.具體態樣38之人源化抗體，其中該VL功能域包含SEQ ID NO：4之序列，其具有根據下列選擇任一者之框架取代：(a)無(b)L46F(c)I48V(d)L46與I48V。
40.一種與人類NKG2A結合之人源化抗體，該抗體包含包含併入人類VH功能域之非人類CDR殘基的VH功能域，該VH功能域包含於至少一個選自5、69、71、73與75之SEQ ID NO：7中之卡巴特位置的框架區取代。
41.具體態樣40之人源化抗體，其包含V5Q取代。
42.具體態樣40之人源化抗體，其包含M69L取代。
43.具體態樣40之人源化抗體，其包含T71V取代。
44.具體態樣40之人源化抗體，其包含T73K取代。
45.具體態樣40之人源化抗體，其包含T75S取代。
46.具體態樣40之人源化抗體，其包含包含併入人類VL功能域之非人類CDR殘基的VL功能域，該VL功能域包含於至少一個選自46與48之SEQ ID NO：6中之卡巴特位置的框架區取代。
47.具體態樣40之人源化抗體，其包含L46F取代。
48.具體態樣40之人源化抗體，其包含I48V取代。
49.具體態樣40－48中之任一者的抗體，其包含對應於SEQ ID NO：5之殘基31－35的CDR－H1、對應於SEQ ID NO：5之殘基50－66的CDR－H2、及對應於SEQ ID NO：5之殘基95－102的CDR－H3。
50.具體態樣40－49中之任一者的抗體，其包含包含SEQ ID NO：7之序列之VH功能域。
51.具體態樣40－50中之任一者的抗體，其包含對應於SEQ ID NO：6之殘基24－34的CDR－L1、對應於SEQ ID NO：6之殘基50－56的CDR－L2、及對應於SEQ ID NO：6之殘基89－97的CDR－L3。
52.具體態樣40－49中之任一者的抗體，其包含包含SEQ ID NO：6之序列之VL功能域。
53.一種與人類NKG2A結合之人源化抗體，該抗體包含包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列的VH功能域，視需要地具有一或多個位於卡巴特位置5、69、71、73與/或75之FR取代。
54.具體態樣53之人源化抗體，其中該視需要之FR取代為V5Q、M69L、T71V、T73K及/或T75S。
55.具體態樣52之人源化抗體，其進一步包含包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列的VL功能域，視需要地具有一或多個位於卡巴特位置46與/或48之FR取代。
56.具體態樣55之人源化抗體，其中該視需要之FR取代係L46F及/或I48V。
57.一種結合NKG2A之人源化抗體，其包含包含併入人類VH功能域之非人類CDR殘基的VH功能域，其中該VH功能域與SEQ ID NO：5至少50%相同。
58.具體態樣46之人源化抗體，其中該VH功能域與SEQ ID NO：5至少90%相同。
59.具體態樣57或58中之任一者的抗體，其包含對應於SEQ ID NO：5之殘基31－35的CDR－H1、對應於SEQ ID NO：5之殘基50－66的CDR－H2、及對應於SEQ ID NO：5之殘基95－102的CDR－H3。
60.具體態樣57－59中之任一者的抗體，其於VH功能域中包含位於卡巴特位置5的V或Q、位於卡巴特位置69的M或L、位於卡巴特位置71的T或V、位於卡巴特位置73的T或K與位於卡巴特位置75的T或S。
61.具體態樣57－60中之任一者的抗體，其包含包含併入人類VL功能域之非人類CDR殘基的VL功能域，其中該VL功能域係與SEQ ID NO：4至少50%相同。
62.具體態樣57－61中之任一者的抗體，其包含與SEQ ID NO：4至少90%相同之VL功能域。
63.具體態樣57－62中之任一者的抗體，其包含對應於SEQ ID NO：4之殘基24－34的CDR－L1、對應於SEQ ID NO：4之殘基50－56的CDR－L2、及對應於SEQ ID NO：4之殘基89－97的CDR－L3序列。
64.具體態樣57－63中之任一者的抗體，其包含位於卡巴特位置46之L或F及/或位於卡巴特位置48之I或V。
65.一種結合NKG2A之人源化抗體，該抗體包含包含併入人類VH功能域之非人類CDR殘基的VH功能域，該VH功能域包含對應於SEQ ID NO：8之殘基31－35的CDR－H1、對應於SEQ ID NO：8之殘基50－66的CDR－H2、對應於SEQ ID NO：8之殘基95－102的CDR－H3，其中位於卡巴特位置63、64、65、66與67之胺基酸分別為F、K、D、K、A。
66.具體態樣65之人源化抗體，其中位於卡巴特位置60之殘基為A。
67.具體態樣65與66中之任一者之人源化抗體，其中該VH功能域包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列。
68.具體態樣65－67中之任一者之人源化抗體，其進一步包含包含對應於SEQ ID NO：6之殘基24－34的CDR－L1、對應於SEQ ID NO：6之殘基50－56的CDR－L2、及對應於SEQ ID NO：6之殘基89－97的CDR－L3序列之VL功能域。
69.具體態樣65－68中之任一種人源化抗體，其中該VL功能域包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列。
70.一種由Z270融合瘤製造之抗－NKG2A的人源化版本。
71.具體態樣1－70中之任一者的抗體，其為多特異性抗體或抗體片段。
72.具體態樣71之抗體，其為選自Fab、Fab'、F(ab)2 、F(ab’)2 、F(ab)3 、Fv、單鏈Fv、dsFv、Fd片段、dAb片段、小抗體、二價抗體片段、三價抗體片段、四價抗體片段、kappa抗體片段、駱駝IgG、IgNAR及多重特異性抗體片段之抗體片段。
73.具體態樣71之抗體，其為雙特異性抗體。
74.具體態樣1－70中之任一者的抗體，其為全長IgG4抗體或其片段。
75.具體態樣74之抗體，其中重鏈恆定功能域包含S241P突變。
76.一種編碼前述任一具體態樣之抗體的單離核酸。
77.一種包含具體態樣76之核酸的載體。
78.一種包含具體態樣76之核酸的宿主細胞。
79.一種製造抗體之方法，其包含培養具體態樣78之宿主細胞，以表現該核酸並製造該抗體。
80.具體態樣79之方法，其進一步包含從宿主細胞培養物回收該抗體。
81.具體態樣79之方法，其中於培養前，將宿主細胞以包含編碼可變重鏈功能域之核酸的載體與以包含編碼可變輕鏈功能域之核酸的載體共－轉感染。
82.一種包含根據具體態樣1－75中之任一者的抗體與第二藥劑之免疫共軛物。
83.具體態樣82之免疫共軛物，其中該第二藥劑為細胞毒性藥劑。
84.具體態樣82之免疫共軛物，其中該第二藥劑為PEG－分子。
85.一種包含具體態樣1－75中之任一者的抗體或具體態樣82－84中之任一者的免疫共軛物及載劑的醫藥組成物。
86.具體態樣74之醫藥組成物，其包含選自檸檬酸鹽、磷酸鹽及其組合之緩衝液，具有pH值介於約6.0至約7.5。
87.一種包含含有具體態樣1－75中之任一者的抗體與指示使用者以有效量抗體於哺乳動物治療選自癌症、病毒性疾病、發炎病症及自體免疫病症之病症的說明書之容器的製品。
88.具體態樣87之製品，其中該哺乳動物為人類。
89.具體態樣1－75中之任一者的抗體用於在人類患者中中和被表現於細胞毒性淋巴細胞表面之CD94/NKG2A受體的抑制活性之用途。
90.具體態樣1－75中之任一者的抗體用於減低表現CD94/NKG2A之細胞毒性淋巴細胞的細胞毒性活性之CD94/NKG2A－所介導抑制作用之用途。
91.具體態樣1－75中之任一者的抗體用於在人類患者中加強表現CD94/NKG2A之細胞毒性淋巴細胞的細胞毒性活性之用途。
92.具體態樣1－75中之任一者的抗體用於誘發藉由表現CD94/NKG2A之MKL細胞之Cw3－表現性標靶細胞的殺死之用途。
93.具體態樣89－92中之任一者之用途，其中表現CD94/NKG2A之細胞毒性淋巴細胞為NK細胞、NKT細胞、α/β T－細胞或γ/δ T－細胞。
94.一種治療罹患選自癌症、病毒性疾病、發炎病症及自體免疫病症之病症的人類患者之方法，其包含投藥具體態樣85－86中之任一者之醫藥組成物。
95.具體態樣1－75中之任一者的抗體用於製備供投藥予罹患選自癌症、病毒性疾病、發炎病症、及自體免疫病症之病症的人類患者之醫藥組成物的用途。
96.具體態樣1－75中之任一者的抗體用於治療罹患選自癌症、病毒性疾病、發炎病症、及自體免疫病症之病症的人類患者之用途。
97.具體態樣89－96中之任一種方法或用途，其中該患者罹患鱗狀細胞癌、白血病、急性淋巴細胞性白血病、急性淋巴胚細胞性白血病、B－細胞淋巴瘤、T－細胞淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、非－霍奇金氏淋巴瘤、毛狀細胞淋巴瘤、布克(Burketts)氏淋巴瘤、多發性骨髓瘤、急性與慢性骨髓性白血病、前髓細胞性白血病、纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤；黑色素瘤、精原細胞瘤、畸形瘤、神經胚細胞瘤、神經膠瘤、星狀細胞瘤、神經胚細胞瘤、神經膠瘤、神經鞘瘤(schwannoma)；纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤、骨肉瘤、黑色素瘤、著色性乾皮病、角質棘皮瘤、精原細胞瘤、甲狀腺濾泡癌、畸形瘤，其他膀胱癌、乳癌、結腸、腎癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰臟癌、胃癌、子宮頸癌、甲狀腺癌或皮膚癌、其他淋巴種系之造血腫瘤、其他骨髓種系之造血腫瘤、其他間質起源之腫瘤、其他中樞與周圍神經系統之腫瘤、或其他間質起源之腫瘤。
98.具體態樣97中之用途，其中該患者罹患多發性骨髓瘤、非－霍奇金氏淋巴瘤或急性骨髓性白血病。本文所引述之任何所有文獻，包括公開案、專利申請案及專利案，係以引用方式納入本文，至與每個文獻係各別且特別地被指示以引用方式併入及以其全文提出時相同的程度。
所有標題與次標題皆僅為方便而用於本文，且不應被理解為以任何方式限制本發明。
前述元件以其所有可能變化之任意組合係包含於本發明，除非於本文中另行指示，或不然與內文明顯抵觸。
除非明白指示或與內文明顯抵觸，術語“或”係以“及/或”之總括意義用於本文，且(於是)作為暗示性提供其中該術語係用於闡釋“這或那”之排他意義的具體態樣或方面之的支持。
術語“一種”與“該”及類似引述用於描述本發明之內文中，應理解為涵括單數與負數，除非於本文中另行指示，或不然與內文明顯抵觸。
除非另行指示，本文中數值範圍之引用僅提供作為各別參考落於該範圍內之每一分別數值的速記方法，且每一分別數值若其各別引用於本文，則將其納入本說明書中。除非另行指示，本文中所提供之所有精確數值係相對應約略值之代表值(例如，所有關於某特別因素或測量所提供之精確例舉性數值，可被認為亦提供相當的近似測量值，若適當以“約”修飾)。
所有於本文所述之方法可以任何適宜順序完成，除非於本文中另行指示，或不然與內文明顯抵觸。
所有於本文提供之任一及全部實施例，或例舉性語言(例如“例如”)之用途僅欲較佳闡述本發明，而無意限制本發明之範圍，除非另行指示。說明書中無任何語言應被理解為指示任一元件為實施本發明所必要，除非已明確設定。
本文中專利文件之引用及納入僅為方便所為，而不反映此等專利文件之任何有效性、可專利性及/或可實施性的觀點。
本文中對於本發明任一方面或具體態樣有關某(些)元件所使用諸如“包含”、“具有”、“包括”或“含有”之描述，係欲提供對於本發明“由...組成”、“實質上由...組成”或“實質上包含”該(等)特別元件之類似方面或具體態樣的支持，除非另行指示或明顯與內文抵觸(例如，本文所述之組成物當包含某特別元件時應被子理解為亦描述一種由該元件所組成之組成物，除非另行指示或明顯與內文抵觸)。
本發明包括所有於本發明各方面或申請專利範圍描述之標的之修飾及同等物至可應用法律所允許之最大範圍。
圖1列示具有所選擇種系V－與J－節段之Z270VL及Z270VH與例舉性humZ270VL1(SEQ ID NO：4)及humZ270VH1(SEQ ID NO：5)序列之排比，其中胺基酸殘基編號係根據卡巴特圖表(kabat scheme，卡巴特等人，1991，免疫學所興趣之蛋白質序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，5th Ed.公眾健康服務，國家健康機構(Public Health Service,National Institutes of Health)，Bethesda，MD.)的。遮蔽(Mask)殘基係於卡巴特圖中加陰影；CDR殘基係於卡巴特圖中以粗體字表示；鼠類/種系差異係於VKI_02/JK4(SEQ ID NO：9)與VH1_18/JH6(SEQ ID NO：10)序列中加陰影；而可能之回復－突變殘基係於humZ270VH/VL序列中加陰影。所鑑定於VL中之可能回復－突變為L46F與I48V。所鑑定於重鏈中之可能回復－突變為V5Q、M69L、T71V、T73K與T75S。亦列示者為所產生之humZ270VL共有序列(“humZ270VL1 cons；”SEQ ID NO：6)及humZ270VH1(“humZ270VH1 cons；”SEQ ID NO：7)共有序列。於humZ270VL1 cons中，位置46上之胺基酸為L或F，而位置48上之胺基酸為I或V。於humZ270VH1 cons，位置5上之胺基酸為V或Q；位置69上之胺基酸為M或L；位置71上之胺基酸為T或V；位置73上之胺基酸為T或K；且/或位置75上之胺基酸為T或S。於供選擇之humZ270VH1(humZ270VH1 cons2(SEQ ID NO：8))中，位置5上之胺基酸為V或Q；位置60上之胺基酸為S或A；位置63上之胺基酸為L或F；位置64上之胺基酸為Q或K；位置65上之胺基酸為G或D；位置66上之胺基酸為R或K；位置67上之胺基酸為V或A；位置69上之胺基酸為M或L；位置71上之胺基酸為T或V；位置73上之胺基酸為T或K；且/或位置75上之胺基酸為T或S。
圖2列示例舉性humZ270抗體之CDR，根據卡巴特定義。相較於鼠類Z270 CDR之差異係以粗體字表示。
圖3A－H列示實施例中所引述之質體。(A)用於TA選殖之pMD19－T載體圖譜。(B)用於暫時表現之pJSV002選殖載體圖譜。(C)輕鏈係插入具有鼠類kappa恆定區之pJSV002中。(D)含有鼠類IgG1恆定區之pJSV002－mIgG1變體。(E)含有Z270重鏈可變區與IgG1重鏈恆定區之pJSV002－mIgG1 Z270 H1。(F)含有輕鏈可變區與人類kappa鏈恆定區之pJSV002－hKappa Z270 L11。(G)pJSV002－IgG4－S241P。(H)pJSV002－IgG4－S241P Z270H1。
圖4列示衍生自或基於Z270之不同序列，(A)至(J)分別為SEQ ID NOS：14－23。細節參見實施例2－5。
圖5列示用於人源化Z270重鏈之表現之載體之例舉性設計。
圖6列示用於人源化Z270輕鏈之表現之載體之例舉性設計。
圖7列示用於人源化Z270抗體於於HEK293細胞中之暫時表現之程序之例舉性概述。
圖8列示用於測定humZ270對抗原之結合親和性的例舉性Biacore分析。
圖9列示嵌合型Z270(A)及humZ270VL1/VH1(B)之親和性測定。
圖10列示於輕鏈或重鏈具有不同回復－突變之humZ270VL1/VH1的親和性測定。嵌合型Z270係用作為比較。
圖11列示將鼠類Z270卡巴特CDRH1－H3以標準CDR－嫁接至VH1_18/JH6重鏈受者框架(無(humZ270H3)或有(humZ270VH4)回復－突變)中之策略。
圖12列示不同人類受者序列中humZ270VH構體之排比，全部皆具有部分人類之CDR－H2部份。
圖13列示humZ270變體VL1/VH1與VH3－VH8之Biacore親和性評估結果，全部皆對hZ270VL1/VH1之KD正常化。
圖14列示所選擇用於鑑定Z270VL與VH節段中決定性抗原互補位殘基之丙胺酸－掃描誘變的殘基。
圖15列示Z270VH丙胺酸突變型之Biacore親和性評估結果，對嵌合型Z270之結合正常化。
圖16列示Z270VL丙胺酸突變型之Biacore親和性評估結果，對嵌合型Z270之結合正常化。
圖17列示各種重組型Z270變體與穩定過度表現CD94/NKG2A或CD94/NKG2C之Ba/F3細胞的結合，使用流式細胞測量術。
圖18列示評估重組型Z270、嵌合型Z270、humZ270VL1/VH1及Z199誘導由CD94/NKG2A＋NKL細胞殺死經51 Cr－標定LCL 721.221－Cw3細胞之能力的分析結果，顯示humZ270VL1/VH1於誘導殺死方面較有效。
圖19列示humZ270VL1/VH1以濃度依賴方式有效結合Ba/F3－CD94/NKG2A細胞(菱形)。然而，當細胞以HLA－E四聚體預先培養時，會防止humZ270VL1/VH1結合至Ba/F3－CD94/NKG2A細胞(方形)。
圖20列示兩種humZ270VL1/VH1與於VH具有V5Q突變之humZ270變體的不同製劑可結合至CD94/NKG2A－表現細胞，但不與CD94/NKG2C－表現細胞結合，雖然V5Q－變體稍微較不有效。
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Claims (9)

  1. 一種專一性結合NKG2A之抗體，其包含對應於SEQ ID NO：4之殘基24-34的CDR-L1、對應於SEQ ID NO：4之殘基50-56的CDR-L2、對應於SEQ ID NO：4之殘基89-97的CDR-L3、對應於SEQ ID NO：5之殘基31-35的CDR-H1、對應於SEQ ID NO：5之殘基95-102的CDR-H3、及包含SEQ ID NO：5之殘基50-59的CDR-H2；且包含人類受者框架序列，其中CDR-H2之至少6個C-端胺基酸殘基與該等在可變重鏈(VH)功能域人類受者序列中者相同，其中該VH功能域人類受者框架與SEQ ID NO：5具有70%或以上之序列同一性且無任何回復-突變，且其中該等胺基酸之位置係根據卡巴特(Kabat)。
  2. 根據申請專利範圍第1項之抗體，其中該VL功能域包含SEQ ID NO：4之序列且該VH功能域包含SEQ ID NO：5之序列。
  3. 根據申請專利範圍第2項之抗體，其會加強CD94/NKG2A-表現性細胞毒性淋巴細胞的細胞毒性活性，其中該CD94/NKG2A-表現性細胞毒性淋巴細胞為NK細胞、NKT細胞、α/β T-細胞、或γ/δ T-細胞。
  4. 根據申請專利範圍第3項之抗體，其中該CD94/NKG2A-表現性細胞毒性淋巴細胞為NK細胞。
  5. 根據申請專利範圍第1、2、3和4項中任一項之抗體，其為IgG4抗體。
  6. 根據申請專利範圍第1、2、3和4項中任一項之抗體， 其為抗體片段或多特異性抗體。
  7. 根據申請專利範圍第5項之抗體，其為抗體片段或多特異性抗體。
  8. 一種製造抗NKG2A抗體之方法，其包含培養包含編碼根據申請專利範圍第1-7項中任一項之抗NKG2A抗體的核酸的宿主細胞以表現該核酸並製造該抗體。
  9. 一種醫藥組成物，其包含根據申請專利範圍第1-7項中任一項之抗體及醫藥上可接受之載劑。
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